CN1219055C

CN1219055C - 一种高效表达抗癌基因的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒及其用途

Info

Publication number: CN1219055C
Application number: CNB028138198A
Authority: CN
Inventors: 张琪; 钱其军; 吴孟超; 岑信棠
Original assignee: 钱其军
Priority date: 2001-07-12
Filing date: 2002-07-12
Publication date: 2005-09-14
Anticipated expiration: 2022-07-12
Also published as: US7491525B2; WO2003006640A1; CN1195056C; CN1526012A; US20050048466A1; CN1339584A

Abstract

本发明提供一类能高效表达抗癌基因的肿瘤细胞内特异性增殖的重组病毒及其增殖方法。该重组病毒的至少一个病毒增殖必需基因的转录受端粒酶启动子的有效控制，使其选择性地在具有端粒酶活性的肿瘤细胞内增殖，而在无端粒酶活性的正常细胞内基本不增殖，同时其基因组中还插入了肿瘤治疗基因，使肿瘤治疗基因在肿瘤细胞内高效表达，从而通过病毒及抗癌基因双重作用，特异性杀灭肿瘤细胞。这种重组病毒可用于治疗多种肿瘤。

Description

一种高效表达抗癌基因的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒及其用途

发明领域

本发明一般地涉及重组病毒。更具体地说，本发明涉及一种高效表达肿瘤治疗基因，且在肿瘤细胞内特异性增殖的病毒及其用途。

背景技术

恶性肿瘤严重危及人类的生命健康。目前对恶性肿瘤的常规治疗仍为手术及放、化疗，这种常规治疗对极大多数肿瘤的疗效仍不十分理想，对于极大多数化疗药物而言，其治疗指数仍较低，即其治疗剂量与毒性剂量较为接近。故这种治疗方案通常伴有明显的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制等。因此，研究选择性杀灭肿瘤细胞而不影响正常细胞的方法对肿瘤治疗非常重要，这种选择性杀灭肿瘤细胞的方法主要依赖于肿瘤细胞的特异性标记，其疗效也决定于该肿瘤标记是否严格限制于肿瘤细胞内。

端粒是真核细胞保护染色体末端的结构，正常细胞每分裂一次，端粒就会缩短，即端粒减少50～200个核苷酸，当端粒缩短至一定程度，会导致细胞死亡。而当细胞发生恶变时，其端粒酶被激活，使肿瘤细胞分裂所致端粒的缩短进一步延长，从而维持染色体的稳定，使细胞逃逸死亡而获得永生，最终导致肿瘤细胞不断增殖，因此端粒酶激活在肿瘤细胞发生及发展过程中起关键作用。端粒酶在大约90％肿瘤细胞均阳性，而极大多数正常细胞端粒酶均为阴性，因此端粒酶可作为肿瘤细胞一种特征性标记。到目前为止，人的端粒酶由三个部分组成，1.RNA组份(hTERC)，它作为端粒重复合成的内源性模板；2.端粒酶结合蛋白(TEP1)；3.端粒酶催化亚基(telomerase catalytic subunit，简写hTERT)，也有人称为端粒酶逆转录酶基因(telomerase reversetranscriptase gene)。RNA组份和端粒酶催化亚基是端粒酶活性所必需的成份。最近研究表明端粒酶催化亚基(hTERT)在端粒酶活性中起决定作用，在极大多数肿瘤细胞或肿瘤细胞株中端粒酶催化亚基呈高水平表达，而正常细胞中不表达或低水平表达。因此端粒酶催化亚基启动子在极大多肿瘤细胞内呈激活状态。

目前针对端粒酶为靶点的肿瘤治疗已有多方面研究，1.以抑制端粒酶活性为目标的肿瘤治疗法；2.以端粒酶启动子(端粒酶催化亚基基因启动子和/或端粒酶RNA组份基因启动子)控制细胞凋亡基因或自杀基因的肿瘤基因治疗。3.以端粒酶催化亚基基因启动子控制的肿瘤增殖病毒的治疗。

以上治疗仍存在着明显问题，首先，约有10％左右的人类肿瘤端粒酶阴性，它们依靠非端粒酶依赖机制(Alternativelengthening of telemere，简称ALT)维持端粒的长度，尤其值得注意的是由于肿瘤细胞的高度异质性，即使某一肿瘤病人的肿瘤细胞的端粒酶阳性，这并不意味着该病人的所有肿瘤细胞端粒酶阳性，它也存在着非端粒酶依赖机制，因此单独针对端粒酶的肿瘤治疗方案不足以杀灭所有肿瘤细胞，如有研究表明应用端粒酶抑制剂抑制端粒酶活性可导致肿瘤细胞中非端粒酶依赖机制(ALT)进一步加强，从而不能有效杀灭肿瘤细胞。其次，在人类生殖细胞、造血干细胞及胃肠道的憩室细胞端粒酶阳性，因此，针对端粒酶为靶点的肿瘤治疗可能会导致上述细胞毒性。

肿瘤基因治疗是近十年兴起的新的临床研究，其结果表明：肿瘤的基因治疗方案是非常安全的，但其抗肿瘤效应也非常低，甚至无任何治疗作用。尽管原因是多方面的，但最主要原因是目前基因治疗的载体系统在体内存在着转染率低、抗癌基因表达量低及不能靶向肿瘤细胞等缺点，从而不能将抗癌基因转染给足够的肿瘤细胞，并使之高效表达，这严重阻碍着肿瘤基因治疗在临床中的疗效。如何提高基因治疗载体系统的转染率、抗癌基因的表达量及靶向肿瘤细胞的特异性，成为肿瘤基因治疗的关键。

近年来，由于病毒学、分子生物学及肿瘤学的飞速发展，人们已完成了多个病毒全部基因组的测序工作，并对其基因的结构及其功能进行了较为详细的研究，能有效地对病毒基因进行改造。改造后的病毒对肿瘤细胞的感染、复制增殖和溶解细胞的能力有效增强，而对正常细胞这种能力减弱甚至消失，因此这种病毒能在肿瘤细胞内进行选择性复制，当病毒感染肿瘤细胞后可数千倍甚至数百万倍增加病毒的数量，从而裂解肿瘤细胞，释放出新的病毒，再次感染肿瘤细胞，再次复制增殖，直至将全部肿瘤细胞杀灭，由于这种病毒不能在正常细胞内增殖，故对正常细胞影响不太，这种肿瘤细胞特异性增殖病毒被称为肿瘤增殖病毒，目前已有近十种肿瘤增殖病毒进入临床试验。

但单独应用肿瘤增殖病毒治疗仍有局限性，首先，肿瘤形成的机制非常复杂，异质性非常强，病人与病人之间，肿瘤与肿瘤之间，同一肿瘤不同肿瘤细胞之间均存在明显差异，就端粒酶而言，某一肿瘤病人的肿瘤细胞的端粒酶阳性，这并不意味着该病人的所有肿瘤细胞端粒酶阳性，因此利用某一肿瘤机制而增殖的病毒不足以杀灭所有肿瘤细胞。其次，肿瘤组织中的物理因素如纤维化、混入正常细胞以及坏死区域也可能限制病毒扩散。再次，某此肿瘤的病毒受体(如柯萨奇病毒受体)表达不充分限制病毒对其感染。第四，病人的免疫反应限制病毒增殖和播散。目前，美国ONYX药物公司尝试单独应用E1b 55kDa蛋白缺失型病毒(ONYX-O15)治疗肿瘤，其临床有效率只有15-20％(Nemunaitis，J.等人，癌症研究(Cancer Res.)，2000，60(22)：6359；US 567因7178：US 5801029)。

因此，本领域非常需要更有效，更具特异性，而对正常组织的副作用减至最小的肿瘤治疗方法。

发明概述

本发明提供了一种重组病毒，其特征在于该病毒的至少一个病毒增殖必需基因的转录受端粒酶基因启动子的有效控制；并且该病毒基因组中还包含可治疗肿瘤的基因的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述端粒酶基因启动子是下述之一：端粒酶催化亚基基因启动子，端粒酶RNA组份基因启动子。

本发明采用的端粒酶催化亚基基因启动子在转录起始位点下游添加多个拷贝的E-盒核苷酸序列：5’cacgtg 3’(SEQ ID NO：27)。

本发明提供的重组病毒还可以：

1)有其它增殖必需基因的转录受肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的有效控制；和/或

2)有至少一种其它增殖必需区蛋白功能缺失，但仍能在肿瘤细胞内特异性增殖。

本发明还提供了利用本发明的重组病毒治疗哺乳动物尤其是人类肿瘤的方法，其包括如下步骤：1)将该病毒体外或体内感染肿瘤细胞，2)使病毒基本上限于肿瘤细胞内选择性复制及增殖，导致在肿瘤细胞内编码抗癌基因的核苷酸序列拷贝数增加及抗癌基因表达量增加；由此抑制肿瘤形成、生长及转移。适当地，本发明所述方法还包括在本发明所述病毒感染肿瘤细胞之前、同时和/或之后施用化学抗肿瘤药物。

本发明还涉及所述重组病毒用于抑制肿瘤细胞的生长的用途。

本发明还涉及所述重组病毒在制备可用于治疗肿瘤的药物中的用途。

附图简述

图1是各种病毒QW1(Adv-hTERTp-E1a)，QW2(Adv-hTER-Ep-E1a)，QW3(Adv-hTERT-Ep-E1a-HRE-E1b)和QW2-endostatin(Adv-hTERT-Ep-E1a-endostatin)的结构示意图。其中，QW1(Adv-hTERTp-E1a)是端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的减毒增殖腺病毒，QW2(Adv-hTER-Ep-E1a)是端粒酶催化亚基基因启动子及其下游加入了3个E-盒序列控制E1A表达的减毒增殖腺病毒，QW3(Adv-hTERT-Ep-E1a-HRE-E1b)是端粒酶催化亚基基因启动子及其下游加入了3个E-盒序列控制E1A表达及缺氧作用元件(HRE)联合基础人巨细胞启动子控制E1B表达的减毒增殖腺病毒，QW2-endostatin(Adv-hTERT-Ep-E1a-endostatin)是携带内皮抑素基因的端粒酶催化亚基基因启动子及其下游加入了3个E-盒序列控制E1A表达的减毒增殖腺病毒。

图2显示了QW1、QW2及QW3在正常及肿瘤细胞株中48小时的增殖倍数。

图3显示了端粒酶催化亚基基因启动子及其下游加入了3个E-盒序列控制E1A表达的减毒增殖腺病毒(QW2)在正常及肿瘤细胞株中E1A表达情况。

图4显示了野生型5型腺病毒(WAd5)及携带人内皮抑素基因的端粒酶催化亚基基因启动子及其下游加入了3个E-盒序列控制E1A表达的减毒增殖腺病毒(QW2-endostatin)在正常及肿瘤细胞株中48小时增殖倍数的比较。

图5显示了携带人内皮抑素基因的非增殖型腺病毒(Ad-endostatin)及携带人内皮抑素基因的端粒酶催化亚基基因启动子及其下游加入了3个E-盒序列控制E1A表达的减毒增殖腺病毒(QW2-endostatin)在肿瘤细胞株中内皮抑素表达情况的比较。

图6显示了端粒酶催化亚基基因启动子及其下游加入了3个E-盒序列控制E1A表达的减毒增殖腺病毒(QW2)、携带人内皮抑素基因的非增殖型腺病毒(Ad-endostatin)及携带人内皮抑素基因的端粒酶催化亚基基因启动子及其下游加入了3个E-盒序列控制E1A表达的减毒增殖腺病毒(QW2-endostatin)对SCID小鼠体内苏植人肝癌Hep3B细胞的治疗效果的比较。

发明详述

如上文所述，本发明涉及一种重组病毒，其特征在于该病毒的至少一个病毒增殖必需基因的转录受端粒酶基因启动子的有效控制；并且该病毒基因组中还包含可治疗肿瘤的基因的核苷酸序列。

大约90％肿瘤细胞具有端粒酶活性，而极大多数正常细胞端粒酶均为阴性，这表明端粒酶可作为肿瘤细胞一种特征性标记，到目前为止，人的端粒酶由三个部分组成，1.RNA组份(hTERC)，它作为端粒重复合成的内源性模板；2.端粒酶结合蛋白(TEP1)；3.端粒酶催化亚基(telomerase catalytic subunit，简写TERT)，也有人称为端粒酶逆转录酶基因(telomerase reversetranscriptase gene)。RNA组份和端粒酶催化亚基是端粒酶活性所必需的成份。最近研究表明端粒酶催化亚基(hTERT)在端粒酶活性中起决定作用，在极大多数肿瘤细胞或肿瘤细胞株中端粒酶催化亚基呈高水平表达，而正常细胞中不表达或低水平表达。因此端粒酶催化亚基启动子及端粒酶RNA组份基因启动子在极大多肿瘤细胞内呈激活状态。

人与鼠的TERT基因的顺式作用元件最近均已被克隆出来，其序列GC含量高，缺少TATA和CAAT盒，但含有多个转录因子的结合位点，包括转录激活因子Myc、SP1和转录抑制因子Mad1、p53、MZF2等结合位点。通过对人的TERT基因(hTERT)启动子5’端进行截短，构建不同长度的启动子缺失突变体，来研究该启动子的活性，结果发现，在转录起始位点上游存在一个至少181bp的启动子核心区域，这个区域对保持该启动子的活性很重要。hTERT基因启动子核心区域内含有E-box(CACGTG)和SP1结合位点。虽然SP1转录因子在端粒酶阴性的体细胞中表达上调，它与其结合位点的结合对hTERT基因转录的起始有促进作用，但相比之下，调节hTERT基因转录表达的主要决定因素是与E-盒(E-box)结合的因子，如Myc、Mad1等。Myc蛋白的高表达，可以明显提高hTERT基因启动子的活性，从而促进基因转录和增强端粒酶活性。除转录起始位点上游的E-box(-187bp～-182bp)以外，在hTERT基因转录起始位点下游、翻译起始位点之前还存在一个E-box(+22bp～+27bp)，这个下游的E-box可以被Myc和Mad1结合，分别发挥激活和抑制hTERT基因转录活性的作用。最新的研究认为，hTERT基因启动子转录起始位点下游的E-box序列，是端粒酶阴性细胞负向调节机制的靶向位点，我们发现在转录起始位点下游添加E-box序列拷贝数，可以明显抑制端粒酶阴性细胞的hTERT基因启动子活性，而在端粒酶阳性的细胞中，E-box序列即有可能转变为能被激活因子如Myc家族成员USF(Upstreamstimulatory factor)结合、并激活hTERT基因转录的正向调节位点。同样通过启动子5’端序列截短构建不同的缺失突变体的实验还发现：在hTERT基因启动子核心序列上游还存在一个沉默子(Silencer)，约400bp(-776bp～-378bp)，其间含有多个MZF2(Myeloid-specific zinc finger protein 2)结合单元(Motif)。对这些位点引入突变，结果引起hTERT基因转录的激活，而MZF2的过度表达及与其结合单元的相互作用则可以引起hTERT基因转录的下调和端粒酶活性的降低。实验证明hTERT基因启动子核心序列上游存在的沉默子是hTERT基因的负向调节区，MZF2是hTERT基因的负向调节因子。MZF2不仅在骨髓细胞中表达，在不同组织来源的细胞系中也有表达，表示MZF2对hTERT基因的负向调节功能具有普遍性。这样看来，hTERT基因的表达和端粒酶的活性被多种因素包括激活因子和抑制因子所牢牢控制，其调控的主要部位位于hTERT基因转录的启动子结构区。

基因转录激活的调节受反式作用因子(如转录因子)与顺式作用元件相互作用的影响。当缺乏或出现某些转录因子时会影响基因的转录水平。端粒酶催化亚基启动子及端粒酶RNA组份基因启动子在具有端粒酶活性的细胞内特异性激活，从而使该启动子控制的基因产生转录。本发明应用端粒酶催化亚基启动子或端粒酶RNA组份基因启动子控制病毒增殖及复制的必需基因，从而使病毒增殖必需基因只能在上述具有端粒酶活性的细胞中表达，导致病毒只能在上述病毒具有端粒酶活性的细胞内增殖，而在上述无端粒酶活性的细胞内基本不增殖。这种修饰后的病毒载体可被用于在某些细胞混合物中杀灭具有端粒酶活性的特殊靶细胞，通过给予修饰后的病毒能选择性地在该种靶细胞中增殖，从而使这种靶细胞被增殖的病毒选择性的杀灭；在体外培养或在动物体内通过将修饰后的病毒与细胞复合物混合，病毒只能在靶细胞增殖，也就是说除了靶细胞，其它细胞不能被这种病毒杀死。由于病毒在靶细胞内增殖及扩增，从而使混合细胞中的该靶细胞被杀灭，一旦靶细胞被破坏，病毒不再能够再增殖。

本发明采用的端粒酶催化亚基基因启动子可在转录起始位点下游添加多个拷贝的E-盒核苷酸序列(SEQ ID NO：27)。

本发明所述病毒增殖必需区依所采用的病毒不同而不同，但容易为本领域技术人员知晓。本发明所述“病毒至少有一个病毒增殖必需基因的转录受端粒酶基因启动子的有效控制”是指病毒增殖必需基因与端粒酶基因启动子在病毒基因组中的相对位置，依所用病毒的不同可以是多种多样的，只要该增殖必需基因的转录能够受到端粒酶基因启动子有效控制即可。在一个实施方案中，本发明所述病毒中包含的端粒酶基因启动子可以在病毒增殖必需基因的转录起始位点之前适当的位置。在本发明的另一个实施方案中，端粒酶基因启动子可以替代病毒自身的启动子。在本发明的另一个实施方案中，本发明所述病毒还可以是在病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间区域包含至少一种端粒酶基因启动子的重组病毒。

本发明提出的能特异性杀灭具有端粒酶活性肿瘤细胞的增殖型重组病毒，它至少有一个病毒增殖所必需的基因的表达受端粒酶启动子控制。它由在病毒增殖必需基因的转录起始位点与编码起始位点之间区域插入端粒酶启动子而构成。该端粒酶启动子特异性在具有端粒酶活性的肿瘤细胞内激活，产生转录活性，而在无端粒酶活性正常细胞内基本不激活，不能产生转录活性。该端粒酶启动子至少含有以下序列之一：端粒酶逆转录酶基因启动子，端粒酶RNA组份基因启动子。上述病毒增殖所必需的为病毒早期表达基因，如单纯疱疹病毒早早期表达基因ICE4。

本发明中，上述病毒可以采用腺病毒。其病毒增殖必需基因可以是以下一个腺病毒的早期表达基因：E1A、E1B、E2、E4，也可以是晚期表达基因。

人类腺病毒有6个不同亚属，分为A、B、C、D、E及F。它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病史并不相同。腺病毒基因分为两类，早期基因与晚期基因，早期基因包括E1A、E1B、E2、和E4。

E1A基因在病毒感染后即表达(0-2小时)，是最早表达腺病毒蛋白，它作为反式激活转录调节因子，是其它病毒早期基因蛋白表达所必需的，同时它反式激活其它病毒启动子。因此，缺乏E1A基因的表达，腺病毒DNA复制的必需基因产物不能产生，腺病毒不能有效复制及增殖。

E1B基因的转录受E1A蛋白的激活，其蛋白功能是晚期病毒基因mRNA从细胞核转运到细胞浆中所必需的，E1B基因表达缺失可导致病毒后期基因表达不佳及不能关闭宿主细胞蛋白的合成。

E4基因位于病毒基因组的右未端，其开放阅读框3(ORF3)和ORF6能提高腺病毒主要晚期基因mRNA的水平。缺乏ORF3及ORF6蛋白功能，其病毒滴度比野生滴度低10⁶倍。

在又一个实施方案中，本发明提供了在病毒基因组中插入有选自下述的肿瘤治疗基因的重组病毒：(1)抑癌基因；(2)血管抑制基因；(3)细胞因子基因；(4)前药转换酶基因；及(5)细胞凋亡基因。

在本发明的一个实施方案中，本发明提供的上述重组病毒携带的肿瘤治疗基因为抑癌基因。抑癌基因能抑制肿瘤细胞生长，抑癌基因可以选自，但不限于：P53、Rb、NF1、VHL及APC。

在本发明的一个实施方案中，本发明提供的上述重组病毒携带的肿瘤治疗基因为血管抑制基因。血管抑制基因抑制肿瘤新生血管形成，可阻断肿瘤细胞的营养供应，从而导致肿瘤细胞因营养不足而死亡，肿瘤明显萎缩乃至完全消褪。同时抑制肿瘤新生血管的形成，也达到阻断肿瘤转移的通路的目的。血管抑制基因可以选自，但不限于：内皮抑素基因，血管生成抑素基因，为血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-4结构、Kringle1-5结构、Kringle1-3结构及Kringle1-3加上Kringle5结构、干扰素-α基因、干扰素-β基因、干扰素-γ基因、血小板反应蛋白基因、血小板因子4基因、纤溶酶原激活因子抑制剂(PAI)基因、白细胞介素-12及纤维结合素基因。任选地，血管抑制基因中可以含有编码分泌型信号肽的核苷酸序列。该分泌型信号肽可以是外源的也可以是内源的，可以选自，但不限于：血管生成抑制因子自身信号肽，M-成瘤蛋白信号肽，免疫球蛋白K链信号肽。

在本发明的一个实施方案中，本发明提供的重组病毒携带的肿瘤治疗基因为细胞因子基因。细胞因子基因具有激活免疫细胞，增加造血功能等。所述细胞因子基因可以选自，但不限于：白细胞介素2、白细胞介素12、粒-单集落刺激因子、肿瘤坏死因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、Light及Flt3配体。

在本发明的一个实施方案中，本发明提供的上述重组病毒携带的肿瘤治疗基因为前药转换酶基因。前药转换酶基因可使无毒性药物转变成毒性药物，从而增强对肿瘤细胞的杀伤。所述前药转换酶基因可以选自，但不限于：单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶、水痘-带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶及大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶。

在本发明的一个实施方案中，本发明提供的上述重组病毒携带的肿瘤治疗基因为细胞凋亡基因。细胞凋亡基因可导致真核细胞凋亡。所述细胞凋亡基因可以选自，但不限于：ICE、capase-3、capase-8、capase-9。

随着病毒在肿瘤细胞内复制，肿瘤治疗基因拷贝数增加，使肿瘤细胞高效表达肿瘤治疗基因。

本发明提供的重组病毒还可以：

本发明所述病毒增殖必需区依所采用的病毒不同而不同，但容易为本领域技术人员知晓。本领域技术人员知晓，所述“病毒增殖必需基因的转录受肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的有效控制”是指病毒增殖必需基因与肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件在病毒基因组中的相对位置，依所用病毒的不同可以是多种多样的，只要该增殖必需基因的转录能够受到肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的有效控制即可。在一个实施方案中，本发明所述病毒中包含的肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件可以在病毒增殖必需基因的转录起始位点之前适当的位置。在本发明的另一个实施方案中，肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件可以替代病毒自身的启动子。在本发明的另一个实施方案中，本发明所述病毒还可以是在病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间区域包含至少一种肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的重组病毒。

在一个实施方案中，所述重组病毒是单纯疱疹病毒，其病毒增殖必需基因含有早早期表达基因ICP4。在又一实施方案中，所述重组病毒是腺病毒，其病毒增殖必需基因可以是以下腺病毒早期表达基因：E1A、E1B、E2、E4，也可以是腺病毒的晚期表达基因。

在一个具体的实施方案中，本发明所述重组病毒中的顺式作用元件可以选自，但不限于：缺氧反应元件，细胞S期特异性启动子(E2F启动子)，甲胎蛋白增强子及启动子，癌胚抗原增强子及启动子，酪氨酸酶增强子及启动子，尿激酶纤维蛋白激活剂增强子及启动子，ErbB2增强子及启动子，ErbB3增强子及启动子，ErbB4增强子及启动子，DF3乳腺癌相关抗原增强子，前列腺素特异性抗原增强子及启动子，腺血管舒缓素增强子及启动子，EB病毒中的Orip，EB病毒Orip中的FR增强子，EB病毒BamHI C-启动子。

缺氧反应元件(HRE)

肿瘤细胞不断增殖，其不断增多的肿瘤细胞数导致细胞耗氧量不断增加，因此在实体瘤中普遍存在着缺氧状态，极大多数实体瘤细胞均高效表达转录因子-缺氧诱导因子1α(HIF-1α)，该转录因子可与缺氧反应元件(hypoxia-response element，HRE)结合，促进其转录，因此在实体瘤中缺氧反应元件(HRE)可激活其转录水平，HRE可来源于血管生长因子基因的启动子、促红细胞生成素基因的启动子、葡萄糖载体蛋白1基因的启动子、血红素加氧酶基因的启动子和诱导型一氧化氧合酶基因的启动子等。

细胞S期特异性启动子(E2F-1启动子)，

E2F-1基因的表达同细胞周期相关，它是广泛表达的生长调控基因，在细胞S期呈现出峰值转录活性。RB蛋白及RB家族的其它成员，可与E2F-1组成特异性复合体，遇制其激活转录的能力。因而，E2F-1受到RB的下调控。在多种肿瘤细胞中，由于Rb/P16INK4α/cyclin D信号转导途径异常，从而导致E2F-1基因高表达，因此E2F-1顺式作用元件在极大多数肿瘤细胞处于激活状态。

甲胎蛋白(AFP)增强子及启动子

甲胎蛋白是一癌胚蛋白，它主要限于内胚层起源的分化组织(如卵黄囊、胎肝、内脏等)。它的表达水平随组织及发育阶段而有较大的变化。AFP在临床受到关注的原因是因为在大多数肝癌病人AFP血浆浓度增高，一些疾病晚期的病人AFP血浆浓度也升高。病人血浆中AFP增高是由肝细胞癌的AFP表达引起的，在肝癌周围的正常组织未出现AFP的表达。因此，表达AFP基因是肝癌细胞的特性。

据已出版的报道，AFP转录顺式作用元件对产生AFP的细胞相关的细胞蛋白(如转录因子及共同因子)敏感，例如AFP结合蛋白。转录顺式作用元件中至少需包含一个AFP启动子和一个AFP增强子。源自AFP基因的细胞特异性转录顺式作用元件已被鉴定。在5’端距转录起始点上游近的序列中含有AFP调控区(包括启动子、假定沉默子及增强子)。

在AFP调控区中，人AFP增强子位于-3954到-3335之间，人AFP启动子位于-174到+29(均相对于转录起始点)。并置这两种元件可产生一有全面功能的AFP转录顺式作用元件。Ido等描述了在肝癌细胞中特异表达的一长约259bp启动子片段。(nt-230到+29)。AFP增强子位于-3954到-3335之间，包含两个区，分别命名为A和B。启动子区包含了典型的TATA盒和CAAT盒。AFP转录调控元件最好要包含一个增强子区。当然，AFP的转录顺式作用元件含有两个增强子就更好。

关于AFP的转录顺式作用元件可以包含任何数目的结构元件，而不是限于一个启动子，一个增强子；它可以是一个AFP增强子同AFP启动子；或一个AFP启动子同一个异种增强子；或异种启动子同AFP增强子；或前述元件的多重组合。AFP的转录顺式作用元件中的启动子和增强子同编码利益基因的序列可以以任何方向及距离存在，只要元件内AFP细胞特异性转录活性存在。目前构建的腺病毒载体还可包含一个AFP的转录调控元件内源性沉默子，该元件亦可删除。

癌胚抗原(CEA)增强子及启动子

CEA是一大小为18000道尔顿、与肿瘤相关的糖蛋白抗原，主要出现在胃肠道内胚层生发的肿瘤，如结直肠癌、胃癌、胰腺癌，在一些其他腺癌如乳腺癌、肺癌亦有表现。由于在大多数CEA阳性肿瘤的病人循环中可以检测到CEA，因而CEA在临床上受到关注。在肺癌，约50％的病例可在循环中检测到CEA，在腺癌CEA的浓度超过20ng/L，近50％的胃癌患者血清CEA阳性。

CEA的5’端序列中呈现出细胞特异性活性。CEA启动子区，位于该基因5’端距转录起点上游的头424个核苷酸，通过在产生CEA细胞比非产生CEA的Hela细胞株表现出更高的启动子活性而展示出它的细胞特异性。另外，细胞特异性增强子区也被发现，可参阅PCT/GB/02456。CEA启动子、假定沉默子及增强子元件似乎包含在距起始转录点14.5Kb的区域中。对CEA基因5’端区域进一步研究发现，距转录起始点上游的两个区(-13.6到-10.7Kb，-6.1KbA到-4.0Kb)，当它们同多聚体化启动子相连时，可使报告基因在产生CEA的Lovo及SW1463细胞株的表达增高且具特异性。Richard等也将启动子定位于距转录起始点-90bp到+69bp之间的区域，其中-41bp到-18bp之间的序列对表达来说是必需的。PCT/GB/02546描述了一系列5’端呈现细胞特异性的片段，包括如下序列：nt-299到nt+69；nt-90到nt+69；nt-13600到-nt10600，nt-6100到nt-3800(均相对于转录起始点而言)。另外，通过CEA基因中的-402到+69的片段也可使相连基因具有组织特异性转录活性。

这里所提及的用到载体上的CEA的顺式作用元件来自哺乳动物细胞，包括但不局限于人类细胞。因此，只要载体中必需功能区存在，任何一种CEA的顺式作用元件皆可被利用。

酪氨酸酶增强子及启动子

人酪氨酸酶基因在黑色素细胞特异性表达的顺式作用元件。该元件含有一长约20bp名为酪氨酸酶远端元件(TDE)的序列，包含-CATGTG序列，位于距转录起始点的-1874到-1835之间。一包含人酪氨酸酶基因从-209到+61间序列的启动子，被发现可以引导基因在黑色素细胞的特异性表达。与此相似，小鼠酪氨酸酶5’端也有类似的一段序列登录基因库。小鼠的TRP-1基因的最小启动子已被识别，包括对于转录起始点-44到+107之间的序列。

在一些实例中，来自人酪氨酸酶基因5’端的序列的黑色素细胞特异性的转录调控元件包含了相对于转录起始点-231到+65，或含有-1956到-1716之间的序列。黑色素细胞特异性的转录调控元件还可以包括以上两个并置的序列。据报道，距人酪氨酸酶转录起始点-1956到-1716间的序列能协同同种或异种启动子所启动的可操作连接报告基因在黑色素细胞特异性表达。因而，在一些实例中，黑色素细胞特异性的转录调控元件包含了异种启动子及通过操作与之相连的从-1956到-1716间的序列。

尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)增强子及启动子

uPA蛋白及其受体uPAR，在大多数常见肿瘤中有表达，且在肿瘤的转移过程中发挥着重要的作用。它们涉及乳腺癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、子宫癌。有关uPA及uPAR的转录顺式作用元件的序列已得到广泛的研究。

ErbB2增强子及启动子

其为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动子。C-erbB2/neu基因为一转化基因，它编码一185KD的同上皮生长因子受体相关的跨膜蛋白。在人类，C-erbB2/neu蛋白在胎儿发育过程中表达；在成人，这种蛋白用免疫组化的方法在许多正常组织上皮难以检测到。C-erbB2/neu基因的扩增及过度表达，同人类的许多肿瘤相关，如乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、胃癌及肺癌。在乳腺癌及卵巢癌，C-erbB2/neu蛋白过度表达的后果已得到充分的研究。C-erbB2/neu蛋白在20∽40％的乳腺癌及30％的卵巢癌中过度表达，它同这两种类型疾病较差的预后相关。

人、大鼠、小鼠的C-erbB2/neuTREs已被识别且表现出针对表达C-erbB2/neu细胞的特异性转录活性。

ErbB3增强子及启动子，其为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动子。

ErbB4增强子及启动子，其为乳腺癌及胃癌细胞特异性激活增强子及启动子。

DF3乳腺癌相关抗原(MUC1)增强子

其为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动子。MUC1基因的蛋白产物(已知的有粘蛋白、MUC1蛋白、表皮涎素、多形表皮粘蛋白或PEM；EMA；DF3抗原；NPGP；PAS-O或CA15.3抗原)通常在胃、胰腺、肺、气管、肾脏、子宫、唾液腺、乳腺的腺体及管道的上皮细胞的顶端表达。在人类约75∽90％的乳腺癌中可发现粘蛋白的过度表达。粘蛋白的表达调控同乳腺癌的分化程度有一定关系。

MUCI基因在人乳腺癌细胞株MCF-7和2R-75-的过度表达似乎发生在转录水平上。MUCI基因的调控序列，包括距离转录起始点上游0.9Kb的序列已被克隆，其中包含的一顺式作用元件似乎同细胞特异性转录相关。

MUC1-的转录顺式作用元件从哺乳动物细胞取得，包括但不限于人类细胞，当然优先在人类细胞表达。MUC1的转录顺式作用元件包含MUCI基因5’端的全部0.9Kb的序列。MUCI的转录顺式作用元件也可包含了同启动子相连的如下序列(均相对于MUCI转录起始点而言)：-725到+31，nt-743到nt+33，nt-750到nt+33及nt-598到+485等。

前列腺素特异性抗原增强子及启动子

该前列腺素特异性抗原增强子位于前列腺素特异性抗原起始转录位点的nt-5322～nt-3739，启动子位于前列腺素特异性抗原起始转录位点的nt-540～nt+12，该增强子与启动子特异性激活于前列腺细胞及前列腺癌细胞。

腺血管舒缓素增强子及启动子

其可被特异性激活于前列腺细胞及前列腺癌细胞。

爱泼斯坦氏-巴尔氏病毒(Epstein-Barr virus，按常规简称为EB病毒)中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒BamHI C-启动子、EB病毒中的Orip联合EB病毒BamHI C-启动子、EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或SV40基本启动子、在EB病毒感染或潜伏感染细胞中特异性激活的顺式作用元件。

在一个实施方案中，本发明提供了重组病毒，其基因组中至少有一个病毒增殖必需基因的转录受端粒酶基因启动子的有效控制，且另有其它的病毒增殖必需基因的蛋白功能缺失，但仍能在肿瘤细胞内特异性增殖。其中所述蛋白功能缺失可以是通过对编码基因的点突变、删除、插入突变实现的，也可以是天然突变产生的。

在本发明的一个实施方案中，所述病毒是一种重组腺病毒，其中该腺病毒E1B 55Kda基因通过点突变、缺失突变、插入突变，导致E1B 55Kda蛋白质功能异常。

在本发明的又一个实施方案中，所述病毒是一种重组腺病毒，其中该腺病毒E1B 19kDa基因通过点突变、缺失突变、插入突变，导致E1B 19kDa蛋白质功能异常。

在本发明的一个实施方案中，所述病毒是一种重组腺病毒，其中该腺病毒E1A基因通过点突变、缺失突变、插入突变而导致E1A蛋白质功能异常。

在本发明的一个实施方案中，所述病毒是重组单纯疱疹病毒，其ICP6基因通过点突变、缺失突变、插入突变而导致ICP6蛋白质功能异常。

在本发明的又一个实施方案中，所述病毒是重组单纯疱疹病毒，其中该腺病毒双拷贝ICP34.5基因通过点突变、缺失突变、插入突变而导致双拷贝ICP34.5蛋白质功能异常。

本发明还提供了本发明重组病毒的增殖方法，包括将重组病毒(如重组腺病毒)感染端粒酶阳性的宿主细胞，从而使重组病毒特异性地在端粒酶阳性的宿主细胞中增殖。

使用只能在具有端粒酶活性的特殊靶细胞内增殖的腺病毒，可以在靶细胞中特异性增殖腺病毒并导致细胞死亡。在体外培养或在动物体内通过将修饰后的腺病毒与细胞复合物混合，腺病毒只能在具有端粒酶活性的细胞内增殖，也就是说除了具有端粒酶活性的细胞外，其他细胞不能被这种腺病毒杀死，由于腺病毒在具有端粒酶活性的细胞内增殖及扩增，从而使混合细胞中具有端粒酶活性的细胞被杀灭，一旦该具有端粒酶活性的细胞被破坏，腺病毒不再能够再增殖。

本发明提出上述重组病毒实际应用。例如将该重组病毒(如重组腺病毒)用于体外感染具有端粒酶活性的肿瘤细胞，导致细胞毒性。将重组病毒(例如重组腺病毒)用于抑制具有端粒酶活性的肿瘤细胞生长。将重组病毒(例如重组腺病毒)用于体内选择性杀灭具有端粒酶活性的肿瘤细胞。

重组病毒向靶细胞的送递有多种方式，包括但不限于脂质体，本领域熟知的常规转染方法(如磷酸钙沉淀或电穿孔)，直接注射，及静脉内灌注。送递方法主要取决于特定重组病毒(包括其形态)以及靶细胞的类型和位置(即细胞在体外还是在体内)。

若使用包装的重组病毒，则其可在适当的生理学上可接受载体中以剂量约10⁴至约10¹⁴给予。感染复数通常范围是约0.001至100。若所给予的是多核苷酸(即未包装成病毒)，则其剂量可以是约0.01μg至约1000μg。具体的给药量可根据该病毒的有关常识(可方便地得自如已公布的文献)而定，亦可凭经验确定。重组病毒的给予可以是一次，也可以是多次，这取决于其目的用途和宿主的免疫应答能力，还可多重地同时注射给药。若不期望产生免疫应答，则可用各种免疫抑制剂减少免疫应答，以便能重复给药而不产生强免疫应答。

本发明还包括内含本文所述重组病毒的组合物，如药物组合物。这类组合物可体内给药。优选地，这些组合物更进一步包含药物学上可接受的赋形剂。这些可包含有效量的本发明重组病毒于药物学上可接受的赋形剂中的组合物适于以单位剂量形式、无菌的胃肠道外溶液或悬浮液、无菌的非胃肠道外溶液或口服液或悬浮液，水包油或油包水乳液等全身性给药于个体。非胃肠道外和胃肠道外药物送递配方为本领域已知，可参见Remington’s药物科学，18版，Mack Publishing(1990)。药物组合物还包括本发明重组病毒的冻干形式和/或重建形式(包括包装成病毒的那些)。

本发明还提供治疗方法，其中将有效量的本文所述重组病毒施用于个体。应用重组病毒的治疗方法可用于肿瘤(如肝细胞癌)患者。还可用于肿瘤高危人群，如那些有此类病的家族史和/或有已切除或以其它形式(如化疗)治疗过的疾病的个体。决定是否适于施用本发明的重组病毒将特别依据可评估的临床参数，如血清学指标及组织活检样品的组织学检查。通常施用含重组病毒的药物组合物。药物组合物如上述。

重组病毒的用量取决于多种因素，如具体的重组病毒类型，给药途径，个体的身体状况，疾病发展程度，所用的具体肿瘤治疗基因。

若施用包装的重组病毒，则用量为约10⁴至约10¹⁴，优选约10⁴至约10¹²，更优选约10⁴至约10¹⁰。若施用多核苷酸，则用量为约0.01μg至约100μg，优选0.1μg至约500μg，更优选约0.5μg至约200μg。可同时或先后施用不止一种重组病毒。通常是周期性给药，同时监控任何反应。可经如肿瘤内、静脉内或腹膜内给药。

本发明的重组病毒可单独使用，也可与其它活性剂(如化疗剂，例如顺铂、5-氟脲嘧啶、丝裂霉素C、碳铂、环磷酰胺等)联合使用，它们可促进达到所期望的目的。

与现有的肿瘤治疗方法相比，本发明具有如下有益效果：

本发明采用端粒酶启动子控制至少一个病毒增殖必需基因的转录，并同时将抗癌基因插入病毒基因组中，成功实现了病毒在端粒酶阳性的肿瘤细胞内特异性复制和增殖，形成高浓度病毒，直接破坏肿瘤细胞，同时在肿瘤细胞内随病毒复制而实现所携带的肿瘤治疗基因大量表达，产生协同作用，进一步杀灭端粒酶阴性的肿瘤细胞。本发明还利用肿瘤激活的顺式作用元件控制病毒另一增殖必需基因或通过基因突变使病毒必需基因功能缺失，使病毒不能在人类生殖细胞、造血干细胞及胃肠道的憩室细胞中增殖及复制，从而进一步减少对正常细胞的毒性。同时本发明也比单纯采用肿瘤基因治疗及特异性增殖病毒方法进行治疗更为有效。

具体实施方式

人类腺病毒有6个不同亚属，分为A、B、C、D、E及F。它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病性史并不相同。本发明以腺病毒C亚属中的5型(Ad5)作为例证，对本发明加以进一步具体说明，但不限于该例证。本发明构建手段均是现有技术人员能够实现。

实施例1：携带端粒酶催化亚基基因启动子的克隆载体的构建。

自新鲜的正常人肝组织中抽提基因组DNA，应用巢式多聚酶链反应(PCR)技术扩增端粒酶催化亚基基因启动子(方法参见PCRProtools Current Methods and Applications，White BA主编，Humana Press Inc.1993年出版-文献1)，在启动子5’端入EcoRI、Not I及Bgl I三个酶切位点，在启动子3’端加入Swa I、BamH I两个酶切位点。

引物1：5’CGG GCT CCC AGT GGA TTC 3’(SEQ ID NO：1)

引物2：5’AAC GTG GCC AGC GGC AGC ACC TC 3’(SEQ ID NO：2)

引物3：5’GGA ATT CGC GGC CGC AGA TCT CAC AGA CGC CCAGGA ACC 3’(SEQ ID NO：3)

引物4：5’CGG GAT CCA TTT AAA TTG GCC GGG GCC AGG GCTTC 3’(SEQ ID NO：4)

引物1与引物2进行第一次PCR扩增，回收370bp片段，再用引物3与引物4对370片段进行第二次PCR扩增，回收270bp片段，应用EcoR I+BamH I对酶切，将该基因插入pUC19载体(购于美国ATCC公司)中进行测序，其测序结果见下：5’

gaattcgcgg ccgcagatct cacagacgcc caggaccgcg cttcccacgt

ggcggaggga ctggggaccc gggcacccgt cctgcccctt caccttccag

ctccgcctcc tccgcgcgga ccccgccccg tcccgacccc tcccgggtcc

ccggcccagc cccctccggg ccctcccagc ccctcccctt cctttccgcg

gccccgccct ctcctcgcgg cgcgagtttc aggcagcgct gcgtcctgct

gcgcacgtgg gaagccctgg ccccggccaa tttaaatgga tcc 3’(SEQ IDNO：5)

结果表明端粒酶催化亚基基因启动子正确，将其命名为pUC-hTERTp。

合成含有3×E-box的连接头

引物5：5’TCG AGG ACG CAC GTG GGC GCA CGT GGG CGC ACGTGG GAT TTA AAT A 3’(SEQ ID NO：6)

引物6：5’AGC TTA TTT AAA TCC CAC GTG CGC CCA CGT GCGCCC ACG TGC GCC T 3’(SEQ ID NO：7)

将引物5与引物6进行变性，复性，应用磷酸激酶进行磷酸化，将其插入pUC-hTERTp中Xho I与Hind III酶切位点(方法参见分子克隆实验指南第二版，J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社.1996年出版-文献2)。将该质粒进行测序，其测序结果见下：5’

gaattcgcgg ccgcagatct cacagacgcc caggaccgcg cttcccacgt

ggcggaggga ctggggaccc gggcacccgt cctgcccctt caccttccag

ctccgcctcc tccgcgcgga ccccgccccg tcccgacccc tcccgggtcc

ccggcccagc cccctccggg ccctcccagc ccctcccctt cctttccgcg

gccccgccct ctcctcgcgg cgcgagtttc aggcagcgct gcgtcctgct

gcgcacgtgg gaagccctgg ccccggccac tcgacgcacg tgggcgcacg

tgggcgcacg tgggatttaa ataagct 3’(SEQ ID NO：8)

结果表明端粒酶催化亚基基因启动子正确，将其命名为pUC-hTERT-Ep，该端粒酶催化亚基基因启动子含有人端粒酶催化亚基基因启动子中nt-213至nt+47以及在其下游加入了3个E-box序列，并在整个启动子的上游序列中加入了Not I与Bgl II酶切位点，在整个启动子的下游序列中加入了Swa I酶切位点。

例2：可携带抗癌基因的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的减毒增殖腺病毒载体的构建。

pXC.1载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。在该载体中552bp处创立7个新的、唯一的酶切位点，分别为Age I、Bst BI、Not I、SpeI、Sal I、Xho I和Swa I，该位点位于E1A起始密码前12bp，其方法采用定位突变双次PCR技术(方法参见前述文献1)。其引物分别为

引物7：5’-引物(含有EcoR I酶切位点)5’TTC AAG AATTCT CAT GTT TG 3’(SEQ ID NO：9)

引物8：3’-引物(在5’端加入ATT TAA ATC TCG AGT CGACAC TAG TGC GGC CGC TTC GAA CCG GT)5’ATT TAA ATC TCG AGTCGA CAC TAG TGC GGC CGC TTC GAA CCG GTG TCG GAG CGG CTC GGA3’(SEQ ID NO：10)

引物9：5’-引物(在5’端加入ACC GGT TCG AAG CGG CCG CACTAG TGT CGA CTC GAG ATT TAA ATC CGG)5’ACC GGT TCG AAG CGGCCG CAC TAG TGT CGA CTC GAG ATT TAA ATC CGG TGA CTG AAA ATGAGA CAT ATT A 3’(SEQ ID NO：11)

引物10：3’-引物(含有Xba I酶切位点)5’TTC TCT AGA CACAGG TGA TG 3’(SEQ ID NO：12)

采用定位突变双次PCR技术，PCR产物片段插入pGEM-T-easy载体中(方法参见Promega公司操作说明书)，命名为pGEM-T-E1a。将该片段进行DNA测序，其测序结果显示：在pXC.1质粒bp552位点中插入TTC GAA GCG GCC GCA CTA GTG TCG ACT CGA GAT TTAAAT CCG GT，从而产生7个新的Age I、Bst BI、Not I、Spe I、Sal I、Xho I和Swa I酶切位点，其它序列与pXC.1相同。应用EcoR I与Xba I双酶切pGEM-T-E1A及pXC.1质粒，将pGEM-T-E1A中切出片段插入pXC.1质粒中EcoR I及Xba I位点中，使pXC.1中552插入一个TTC GAA GCG GCC GCA CTA GTG TCG ACT CGA GATTTA AAT CCG GT，从而产生7个Age I、Bst BI、Not I、Spe I、Sal I、Xho I和Swa I酶切位点，该位点位于E1A起始密码前12bp，将该质粒命名为pQW1。

pUC-hTERTp用Not I+Swa I酶切，其酶切片段分别插入pQW1质粒中Not I+Swa I酶切位点中，分别应用引物4及7进行PCR扩增，扩出1310bp，这表明端粒酶催化亚基基因启动子已正向插入pQW1质粒Not I+Swa I位点，即腺病毒5型E1A起始密码子上游区12bp处，命名为pQW-hTERTp。pUC-hTERT-Ep用Not I+Swa I酶切，其酶切片段分别插入pQW1质粒中Not I+Swa I酶切位点中，分别应用引物6及7进行PCR扩增，扩出1352bp，这表明端粒酶催化亚基基因启动子加转录位点后3个E-盒序列已正向插入pQW1质粒Not I+Swa I位点，即腺病毒5型E1A起始密码子上游区12bp处，命名为pQW-hTER-Ep。

例3.可携带抗癌基因的端粒酶催化亚基基因启动子及缺氧元件分别控制E1A及E1B表达的减毒增殖腺病毒载体的构建。

缺氧作用元件(HRE)联合基础人巨细胞启动子(mini-CMVp)由5个拷贝的HRE及基础人巨细胞启动子组成。其缺氧作用元件(HRE)来源于血管内皮生长因子的启动子序列，其5个拷贝的HRE的核苷酸序列如下：5’

CCA CAG TGC ATA CGT GGG CTC CAA CAG GTC CTC TT CCA CAGTGC ATA CGT GGG CTC CAA CAG GTC CTC TT CCA CAG TGC ATA CGTGGG CTC CAA CAG GTC CTC TT CCA CAG TGC ATA CGT GGG CTC CAACAG GTC CTC TT CCA CAG TGC ATA CGT GGG CTC CAA CAG GTC CTCTT 3’(SEQ ID NO：13)

基础人巨细胞启动子(mini-CMVp)的序列如下：

5’GGT AGG CGT GTA CGG TGG GAG GTC TAT ATA AGC AGA GCTCGT TTA GTG AAC CGT CAG ATC 3’(SEQ ID NO：14)

缺氧作用元件(HRE)联合基础人巨细胞启动子(mini-CMVp)含有以上两个序列，并在5’-未端与3’-未端分别加入Spe I酶切位点，缺氧作用元件(HRE)联合基础人巨细胞启动子(mini-CMVp)由上海中能博彩生物科技有限公司进行全长基因合成。经测序正确，命名为pMD-HRE，其核苷酸序列如下：5’

ACTAGTCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGT 3’(SEQ ID NO：15)

在pQW-hTER-Ep质粒中使其缺失E1B启动子，该启动子位于pQW-hTER-Ep质粒中nt1926-nt2043位置(即在5型腺病毒的nt1595-nt1713位置)，将该位置缺失并创立1个新的、唯一的SpeI酶切位点，该位点位于E1B起始密码前4bp，其方法采用定位突变双次PCR技术(方法参见前述文献1)。其引物分别为

引物11：5’TCA CCT GTG TCT AGA GAA TGC 3’(SEQ ID NO：16)

引物12：5’CTC CCA AGC CTC CAT ACT AGT TTA AAC ATT ATCTCA CCC TTT A 3’(SEQ ID NO：17)

引物13：5’ACT AGT ATG GAG GCT TGG GAG TGT TTG 3’(SEQID NO：18)

引物14：5’GGC CAG AAA ATC CAG CAG GTA 3’(SEQ ID NO：19)

PCR产物片段插入pGEM-T-easy载体中(方法参见Promega公司操作说明书)，命名为pGEM-T-E1B。将该片段进行DNA测序，其测序结果显示：在pQW-hTER-Ep质粒nt1926-nt2043位点缺失并插入产生1个新的Spe I酶切位点，其它序列与pQW-hTER-Ep相同。应用Kpn I与Xba I双酶切pGEM-T-E1B及pQW-hTER-Ep质粒，将pGEM-T-E1B中切出片段插入pQW-hTER-Ep质粒中Kpn I及Xba I位点中，使在pQW-hTER-Ep质粒nt1926-nt2043位点缺失并插入产生1个新的Spe I酶切位点，该位点位于E1B起始密码前4bp，将该质粒命名为pQW2-Spe。

将pMD-HRE用Spe I酶切，回收含有缺氧作用元件(HRE)联合基础人巨细胞启动子(mini-CMVp)片断，将其插入pQW2-Spe质粒中的Spe I酶切位点。应用PCR技术分别验证其插入的正反方向

引物15：5’AGG TCT ATA TAA GCA GAG CTC 3’(SEQ ID NO：20)

用引物14及引物15进行PCR，其PCR产物长度为518bp，这表明缺氧作用元件(HRE)联合基础人巨细胞启动子(mini-CMVp)正向插入E1B上游区，命名pQW-hTERT-Ep-HRE。

例4.端粒酶催化亚基基因启动子控制的减毒增殖腺病毒的重组。

293细胞株购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达5型腺病毒E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率。将含有5型腺病毒左臂的质粒联合含有5型腺病毒右臂的质粒共转染293细胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。我们将pQW-hTERTp、pQW-hTERT-Ep及Adv-hTERT-Ep-HRE分别与含有5型腺病毒右臂的质粒pBHGE3通过Lipofectamine共转染至293细株，其具体方法参见GIBCO BRL公司的操作说明。pBGHE3购于加拿大Microbix Biosystems Inc.(Ontario)，pBGHE3含有5型腺病毒右臂，含有E3区。共转染后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，即得E1A受端粒酶催化亚基基因启动子控制的腺病毒，分别命名为Adv-hTERTp-E1a、Adv-hTERT-Ep-E1a及Adv-hTERT-Ep-E1a-HRE-E1b，分别记为QW1、QW2及QW3，见附图1。

由上述方法构建的重组病毒的列表如下：

病毒	名称	含Ad5左臂质粒	含Ad5右臂质粒
病毒	名称	含Ad5左臂质粒	含Ad5右臂质粒	Adv-hTERTp-E1aAdv-hTERT-Ep-E1aAdv-hTERT-Ep-E1a-HRE-E1b	QW1QW2QW3	pQW-hTERTppQW-hTERT-EppQW-hTERT-Ep-HRE	PBHGE3PBHGE3PBHGE3

腺病毒在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒(具体方法参见前述文献2出版)。

Adv-hTERTp-E1a(QW1)为5型腺病毒，在E1A转录起始位点与编码起始位点之间插入端粒酶催化亚基基因启动子，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。

Adv-hTERT-Ep-E1a(QW2)为5型腺病毒，在E1A转录起始位点与编码起始位点之间插入端粒酶催化亚基基因启动子及3个拷贝的E-盒，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。

Adv-hTERT-Ep-E1a-HRE-E1b(QW3)为5型腺病毒，在E1A转录起始位点与编码起始位点之间插入端粒酶催化亚基基因启动子及3个拷贝的E-盒，缺失E1B的启动子，并在E1B上游区插入5个拷贝的缺氧作用元件联合基础CMV启动子，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。

例5：端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的减毒增殖腺病毒在正常细胞及肿瘤细胞株的复制情况比较

正常细胞株肺成纤维细胞MAC-5及IMR-90均为端粒酶阴性，肿瘤细胞株包括：肝癌细胞株Hep GII及Hep3B，乳腺癌细胞株MRD-231，肺癌细胞株A549，黑色素瘤细胞株A375，结肠细胞株HT29，胰腺癌细胞株Panc-1，子宫颈癌细胞株Hela，鼻咽癌细胞株CNE-2及胃癌细胞株SGC7901，上述细胞除了鼻咽癌细胞株CNE-2及胃癌细胞株SGC7901购于中国科学院上海细胞所细胞库，其余细胞株购于美国ATCC公司，上述肿瘤细胞株的端粒酶均阳性。将上述细胞株按5×10⁵细胞/孔铺在6-孔板中，在37℃孵箱5％CO2培养，第二天换无血清液体1ml，然后，分别加入病毒Adv-hTERTp-E1a(QW1)、Adv-hTERT-Ep-E1a(QW2)或Adv-hTERT-Ep-E1a-HRE-E1b(QW3)，其病毒量为2.5×10⁶/孔，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将病毒洗去，与加入5％胎牛血清的培养液培养，分别在0小时及48小时收集，冻融三次，用TCID50法来检测病毒滴度(方法参见美国Qbiogene公司的AdEasyTM操作手册)，其结果见附图2，可见在正常细胞中的病毒复制能力Adv-hTERT-Ep-E1a-HRE-E1b(QW3)病毒小于Adv-hTERT-Ep-E1a(QW2)病毒小于Adv-hTERTp-E1a(QW1)病毒；而在肿瘤细胞中病毒复制能力Adv-hTERT-Ep-E1a-HRE-E1b(QW3)病毒、Adv-hTERT-Ep-E1a(QW2)病毒与Adv-hTERTp-E1a(QW1)病毒相似。

应用蛋白印迹杂交技术(Western blot)观察Adv-hTERT-Ep-E1a(QW2)(具体方法参见文献2)在正常细胞株中肺成纤维细胞MAC-5及IMR-90中E1A均不表达，而在肿瘤细胞株A549、Hep 3B及Panc-1中E1A则高效表达，见附图3。

例6.携带人内皮抑素(endostatin)基因的E1区缺失的腺病毒载体的构建

pCA13载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pCA13含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1区342至3523bp片段，在E1缺失区插入了人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)及SV40 poly A加尾信号。应用多聚酶链反应(PCR)技术人内皮抑素(endostatin)基因，自新鲜的正常人肝组织中抽提总RNA，以随机引物作逆转录反应，再扩增人内皮抑素(endostatin)基因，并用两次多聚酶链反应(PCR)技术(方法参见文献1)在基因前加入M-成瘤蛋白(Oncostatin-M)信号肽及信号肽前、基因结尾引入EcoR I和Xba I两个酶切位点。

引物16：5’GGG GAA TTC ACC ATG GGG GTA CTG CTC ACA CAGAGG ACG CTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTC 3’(SEQID NO：21)

引物17：5’CTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTC CTG TTT CCAAGC ATG GCG AGC CAC CGC GAC TTC CAG 3’(SEQ IDNO：22)

引物18：5’GCT CTA GAC TAT TAC TTG GAG GCA GTC ATG AAGCTG TTC TCA ATG CAT AGC ACG ATG TAG GCG TG 3’(SEQID NO：23)

引物17与引物18进行第一次PCR扩增，回收615bp片段，再用引物16与引物18对615bp片段进行第二次PCR扩增，回收647bp片段，应用EcoR I+Xba I对酶切，将该基因插入pbluescript IIKS(+)载体(购于美国ATCC公司)中进行测序，其测序结果见下：5’

GAATTCACCATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTAACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTATGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAGTAATAGTCTAG 3’(SEQ ID NO：24)

将其EcoR I+Xba I切下，定向插入pCA13载体EcoR I+Xba I中，命名pCA13-human endostatin。

例7：携带内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的腺病毒载体的构建：

应用Bgl II分别酶切pCA13-human endostatin，分别回收1237bp(含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40 poly A加尾信号)，将其插入pUC-hTERTp中Bgl II酶切位点，应用PCR技术分别验证其插入的正反方向：其端粒酶催化亚基基因启动子3’-端引物

引物19：5’TGG CCG GGG CCA GGG CTT C 3’(SEQ ID NO：25)

引物20：人内皮抑素3’-引物(位于M-成瘤蛋白信号肽及人内皮抑素基因中577-600bp)5’AGC ACG ATG TAG GCG TGA TGG C3’(SEQ ID NO：26)

其引物19与引物20能扩增到1108bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40 poly A加尾信号正向插入pUC-hTERT-Ep BglII酶切位点。命名为pUC-hTERT-Ep-endostatin。

应用Not I和Swa I双酶切pUC-hTERT-Ep-endostatin，回收片段，插入pQW-hTERT-Ep中Not I和Swa I酶切位点，命名为pQW-hTERT-Ep-endostatin。

例8：携带内皮抑素的增殖缺陷型腺病毒与携带内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的腺病毒的重组。

293细胞株购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达5型腺病毒E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率。将含有5型腺病毒左臂的质粒联合含有5型腺病毒右臂的质粒共转染293细胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。我们将pCA13-endostatin和pQW-hTERT-Ep-endostatin分别与含有5型腺病毒右臂的质粒pBHGE3通过Lipofectamine共转染至293细株，其具体方法参见GIBCO BRL公司的操作说明。pBGHE3及pBHG10购于加拿大Microbix Biosystems Inc.(Ontario)，pBGHE3含有5型腺病毒右臂，含有E3区；pBGH10含有5型腺病毒右臂，但缺失E3区。共转染后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，即得携带内皮抑素的增殖缺陷型腺病毒和携带人内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A的增殖腺病毒，并分别命名为Ad-endostatin与Adv-hTERT-Ep-E1a-endostatin，分别记为Ad-endostatin与QW2-endostatin。

由上述方法构建的重组病毒的列表如下：

病毒	名称	含Ad5左臂质粒	含Ad5右臂质粒
病毒	名称	含Ad5左臂质粒	含Ad5右臂质粒	Ad-endostatinAdv-hTERT-Ep-E1a-endostatin	Ad-endostatinQW2-endostatin	PCA13-endostatinPQW-hTERT-Ep-endostatin	PBHGE3PBHGE3

腺病毒在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒(具体方法参见前述文献2出版)。Ad-endostatin为E1区缺陷的携带人endostatin的非增殖5型腺病毒，即传统的腺病毒载体系统携带人的endostatin。Adv-hTERT-Ep-E1a-endostatin(QW2-endostatin)为5型腺病毒，在E1A转录起始位点与编码起始位点之间插入端粒酶催化亚基基因启动子，并在端粒酶催化亚基基因启动子上游区新建一个Bgl II酶切位点，在该酶切位点中反向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40 poly A加尾信号基因序列，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。

例9：携带内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的腺病毒体外在具有端粒酶活性的肿瘤细胞中增殖、复制及高效表达人内皮抑素。

正常细胞株肺成纤维细胞MAC-5及IMR-90均为端粒酶阴性，肿瘤细胞株包括：肝癌细胞株Hep GII及Hep3B，乳腺癌细胞株MRD-231，肺癌细胞株A549，黑色素瘤细胞株A375，结肠细胞株HT29，胰腺癌细胞株Panc-1，子宫颈癌细胞株Hela，鼻咽癌细胞株CNE-2及胃癌细胞株SGC7901，将上述细胞株按5×10⁵细胞/孔铺在6-孔板中，在37℃孵箱5％CO2培养，第二天换无血清液体1ml，然后，分别加入野生型5型腺病毒(WAd5)、携带内皮抑素的增殖缺陷型腺病毒(Ad-endostatin)或携带内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的腺病毒(Adv-hTERT-Ep-E1a-endostatin，QW2-endostatin)，其病毒量为2.5×10⁶/孔，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将病毒洗去，与加入5％胎牛血清的培养液培养，分别在0小时及48小时收集，冻融三次，用TCID50法来检测病毒滴度(方法参见美国Qbiogene公司的AdEasy^TM操作手册)，其结果见附图4，可见野生型5型腺病毒(WAd5)在正常细胞及肿瘤细胞均复制及增殖，携带内皮抑素的增殖缺陷型腺病毒(Ad-endostatin)在正常细胞及肿瘤细胞均不复制及增殖，携带内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的腺病毒(Adv-hTERT-Ep-E1a-endostatin，QW2-endostatin)则只在端粒酶阳性的肿瘤细胞内增殖与复制而在端粒酶阴性的正常细胞基本不复制。

将胰腺癌细胞株Panc-1及胃癌细胞株SGC7901按1×10⁵细胞/孔铺在6-孔板中，在37℃孵箱5％CO2培养，第二天换无血清液体1ml，然后，分别加入携带内皮抑素的非增殖腺病毒(Ad-endostatin)或携带内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的腺病毒(Adv-hTERT-Ep-E1a-endostatin，QW2-endostatin)，其病毒量为5×10⁵/孔，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将病毒洗去，与加入5％胎牛血清的培养液培养，分别在0天、3天及7天收集细胞上清，QW2-endostatin的内皮抑素的表达量QW2-endostatin明显高于非增殖腺病毒(Ad-endostatin)，见图5。

将肿瘤细胞株Hep 3B及正常人成纤维细胞分别感染重组腺病毒QW2-endostatin，MOI为1，37℃孵育1小时，感染后7天收集细胞，应用QIAamp DNA Blood mini kit(德国QIAGEN公司)提取病毒DNA，方法参见QIAGEN公司操作说明。将上述提取的QW2-endostatin DNA分别应用Bgl II酶切，用1％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用³²P分别标记人内皮抑素cDNA片段(EcoR I与Xba I双酶切pCA13-human endostatin，回收637bp)作为探针，进行souther blot杂交，以pCA13-human endostatin作为人内皮抑素拷贝数对照(方法参见文献2)，QW2-endostatin在肿瘤细胞株Hep 3B及正常人成纤维细胞的每个细胞人内皮抑素拷贝数分别为2×10⁴及＜10。

例10：携带内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的腺病毒在裸鼠体内治疗移植肿瘤

将4-5周龄的SCID小鼠皮下接种细胞株Hep 3B细胞1×10⁷，两周后给予端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的增殖腺病毒(QW2)、携带内皮抑素非增殖型腺病毒(Ad5-endostatin)或携带内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的增殖腺病毒(QW2-endostatin)治疗，每次2×10⁸pfu，共5次，结果见图6，其未治疗组4周后肿瘤体增加3倍以上，而治疗组则肿瘤增加不明显，其疗效QW2-endostatin优于QW2及Ad5-endostatin。

SEQUENCE LISTING

<110>Qian，Qijun

<120>一种高效表达抗癌基因的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒及其用途

<130>

<160>27

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

cgggctccca gtggattc 18

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>2

aacgtggcca gcggcagcac ctc 23

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>3

ggaattcgcg gccgcagatc tcacagacgc ccaggaacc 39

<210>4

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>4

cgggatccat ttaaattggc cggggccagg gcttc 35

<210>5

<211>293

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>5

gaattcgcgg ccgcagatct cacagacgcc caggaccgcg cttcccacgt ggcggaggga 60

ctggggaccc gggcacccgt cctgcccctt caccttccag ctccgcctcc tccgcgcgga 120

ccccgccccg tcccgacccc tcccgggtcc ccggcccagc cccctccggg ccctcccagc 180

ccctcccctt cctttccgcg gccccgccct ctcctcgcgg cgcgagtttc aggcagcgct 240

gcgtcctgct gcgcacgtgg gaagccctgg ccccggccaa tttaaatgga tcc 293

<210>6

<211>43

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>6

tcgaggacgc acgtgggcgc acgtgggcgc acgtgggatt taaata 46

<210>7

<211>43

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>7

agcttattta aatcccacgt gcgcccacgt gcgcccacgt gcgcct 46

<210>8

<211>327

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>8

gaattcgcgg ccgcagatct cacagacgcc caggaccgcg cttcccacgt ggcggaggga 60

ctggggaccc gggcacccgt cctgcccctt caccttccag ctccgcctcc tccgcgcgga 120

ccccgccccg tcccgacccc tcccgggtcc ccggcccagc cccctccggg ccctcccagc 180

ccctcccctt cctttccgcg gccccgccct ctcctcgcgg cgcgagtttc aggcagcgct 240

gcgtcctgct gcgcacgtgg gaagccctgg ccccggccac tcgacgcacg tgggcgcacg 300

tgggcgcacg tgggatttaa ataagct 327

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>9

ttcaagaatt ctcatgtttg 20

<210>10

<211>60

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>10

atttaaatct cgagtcgaca ctagtgcggc cgcttcgaac cggtgtcgga gcggctcgga 60

<210>11

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>11

accggttcga agcggccgca ctagtgtcga ctcgagattt aaatccggtg actgaaaatg 60

agacatatta 70

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>12

ttctctagac acaggtgatg 20

<210>13

<211>175

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>13

ccacagtgca tacgtgggct ccaacaggtc ctcttccaca gtgcatacgt gggctccaac 60

aggtcctctt ccacagtgca tacgtgggct ccaacaggtc ctcttccaca gtgcatacgt 120

gggctccaac aggtcctctt ccacagtgca tacgtgggct ccaacaggtc ctctt 175

<210>14

<211>60

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>14

ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc 60

<210>15

<211>247

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>15

actagtccac agtgcatacg tgggctccaa caggtcctct tccacagtgc atacgtgggc 60

tccaacaggt cctcttccac agtgcatacg tgggctccaa caggtcctct tccacagtgc 120

atacgtgggc tccaacaggt cctcttccac agtgcatacg tgggctccaa caggtcctct 180

tggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat 240

cactagt 247

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>16

tcacctgtgt ctagagaatg c 21

<210>17

<211>43

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>17

ctcccaagcc tccatactag tttaaacatt atctcaccct tta 43

<210>18

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>18

actagtatgg aggcttggga gtgtttg 27

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>19

ggccagaaaa tccagcaggt a 21

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>20

aggtctatat aagcagagct c 21

<210>21

<211>63

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>21

ggggaattca ccatgggggt actgctcaca cagaggacgc tgctcagtct ggtccttgca 60

ctc 63

<210>22

<211>60

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>22

ctgctcagtc tggtccttgc actcctgttt ccaagcatgg cgagccaccg cgacttccag 60

<210>23

<211>65

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>23

gctctagact attacttgga ggcagtcatg aagctgttct caatgcatag cacgatgtag 60

gcgtg 65

<210>24

<211>641

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>24

gaattcacca tgggggtact gctcacacag aggacgctgc tcagtctggt ccttgcactc 60

ctgtttccaa gcatggcgag ccacagccac cgcgacttcc agccggtgct ccacctggtt 120

gcgctcaaca gccccctgtc aggcggcatg cggggcatcc gcggggccga cttccagtgc 180

ttccagcagg cgcgggccgt ggggctggcg ggcaccttcc gcgccttcct gtcctcgcgc 240

ctgcaggacc tgtacagcat cgtgcgccgt gccgaccgcg cagccgtgcc catcgtcaac 300

ctcaaggacg agctgctgtt tcccagctgg gaggctctgt tctcaggctc tgagggtccg 360

ctgaagcccg gggcacgcat cttctccttt aacggcaagg acgtcctgag gcaccccacc 420

tggccccaga agagcgtgtg gcatggctcg gaccccaacg ggcgcaggct gaccgagagc 480

tactgtgaga cgtggcggac ggaggctccc tcggccacgg gccaggcctc ctcgctgctg 540

gggggcaggc tcctggggca gagtgccgcg agctgccatc acgcctacat cgtgctatgc 600

attgagaaca gcttcatgac tgcctccaag taatagtcta g 641

<210>25

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>25

tggccggggc cagggcttc 19

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>26

agcacgatgt aggcgtgatg gc 22

<210>27

<211>6

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>6

cacgtg 6

Claims

1.一种重组病毒，其特征在于该病毒的至少一个病毒增殖必需基因的转录受端粒酶基因启动子的有效控制；并且该病毒基因组中还包含肿瘤治疗基因的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于所述端粒酶基因启动子是下述之一：端粒酶催化亚基基因启动子，端粒酶RNA组份基因启动子。

3.根据权利要求2所述的重组病毒，其特征在于所述端粒酶基因启动子是端粒酶催化亚基基因启动子。

4.根据权利要求3所述的重组病毒，其特征在于所述端粒酶催化亚基基因启动子的转录起始位点下游添加了SEQ ID NO：27所示的多个拷贝的E-盒核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于所述重组病毒为腺病毒，并且至少一个所述腺病毒增殖必需基因是选自下述的腺病毒早期表达基因：E1A，E1B，E2，E4。

6.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于所述重组病毒为腺病毒，并且至少一个所述腺病毒增殖必需基因是腺病毒晚期表达基因。

7.根据权利要求7所述的重组病毒，其特征在于所述肿瘤治疗基因选自：抑癌基因、血管抑制基因、细胞因子基因，前药转换酶基因或细胞凋亡基因。

8.根据权利要求7所述的重组病毒，其特征在于所述的抑癌基因是：P53、P21、Rb、NF1、VHL及APC；所述的血管抑制基因是：内皮抑素基因，血管生成抑素基因，血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-4结构、Kringle1-5结构、Kringle1-3结构、Kringle1-3加上Kringle5结构、干扰素-α基因、干扰素-β基因、干扰素-γ基因、血小板反应蛋白基因、血小板因子4基因、纤溶酶原激活因子抑制剂(PAI)基因、白细胞介素-12及纤维结合素基因；所述的细胞因子基因是：白细胞介素2、白细胞介素12、粒-单集落刺激因子、肿瘤坏死因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、Light及Flt3配体；所述的前药转换酶基因是：单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶、水痘-带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶及大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶；所述的细胞凋亡基因是：ICE、capase-3、capase-8、capase-9。

9.根据权利要求8所述的重组病毒，其特征在于所述的血管抑制基因中含有编码分泌型信号肽的序列。

10.根据权利要求9所述的重组病毒，其特征在于所述分泌型信号肽是下述中的任何一种：血管生成抑制因子自身信号肽，M-成瘤蛋白信号肽，免疫球蛋白K链信号肽。

11.根据权利要求1-10任一项所述的重组病毒，其特征在于所述病毒中：

1)另一个增殖必需基因的转录受肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的有效控制；和/或

2)至少一种增殖必需区的蛋白功能缺失，并且该重组病毒能在肿瘤细胞内特异性增殖。

12.根据权利要求11所述的重组病毒，其特征在于所述病毒的另一个增殖必需基因的转录受至少一种肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的有效控制，其中所述顺式作用元件选自：缺氧反应元件，细胞S期特异性启动子，甲胎蛋白增强子及启动子，癌胚抗原增强子及启动子，酪氨酸酶增强子及启动子，尿激酶纤维蛋白激活剂增强子及启动子，ErbB2增强子及启动子，ErbB3增强子及启动子，ErbB4增强子及启动子，DF3乳腺癌相关抗原增强子，前列腺素特异性抗原增强子及启动子，腺血管舒缓素增强子及启动子，EB病毒中的Orip，EB病毒Orip中的FR增强子，EB病毒BamHI C-启动子。

13.根据权利要求11所述的重组病毒，其特征在于所述病毒是一种重组腺病毒，其中该腺病毒的E1B55Kda、E1B19Kda和/或E1A基因编码的相应蛋白功能缺失。

14.根据权利要求11所述的重组病毒，其特征在于所述病毒是一种重组单纯疱疹病毒，该单纯疱疹病毒中ICP6、双拷贝ICP34.5基因编码的相应蛋白功能缺失。

15.根据权利要求1-14任一项所述的重组病毒的增殖方法，其特征在于将重组病毒体外感染具有端粒酶活性的肿瘤细胞，从而在具有端粒酶活性的肿瘤细胞内增殖。

16.权利要求1-14任一项所述的重组病毒的应用，其特征在于将该重组病毒用于体外感染具有端粒酶活性的肿瘤细胞，导致具有端粒酶活性的肿瘤细胞毒性。

17.根据权利要求1-14任一项所述的重组病毒用于体外抑制肿瘤细胞的生长的用途。

18.根据权利要求1-14所述的重组病毒在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

19.一种药物组合物，其包含权利要求1-14任一项所述的重组病毒以及药学上可接受的载体。