CN1691958A - 用于基因治疗的eNOS突变体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于基因治疗的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)多肽突变体，及编码这种多肽突变体的多核苷酸。特别地，本发明提供了这样的eNOS多肽，其在相应于哺乳动物eNOS的一个功能域的一个氨基酸序列中有一或多个突变。更特别地，本发明提供了这样的eNOS多肽，其在钙调蛋白结合位点中的一个在哺乳动物细胞中是磷酸化的氨基酸残基的位置有至少一个突变，其中在所述磷酸化位点有一个单突变的eNOS多肽突变体中所述突变不是一个氨基酸被取代为Ala或Asp；本发明还提供了编码这种多肽突变体的多核苷酸。本发明还提供了使用这种eNOS多肽突变体和多核苷酸的预防、诊断和治疗方法。

Description

用于基因治疗的eNOS突变体

本申请要求申请日为2002年8月16日的美国临时申请系列号60/403,638的优先权，该申请引入本文作参考。

发明领域

本发明涉及用于基因治疗的内皮型—氧化氮合酶(eNOS)多肽突变体及编码这种多肽突变体的多核苷酸。特别地，本发明提供了eNOS多肽突变体，其在相应于哺乳动物eNOS的一个功能域的氨基酸序列中有一或多个突变。更特别地，本发明涉及这样的eNOS多肽突变体，其在相应于钙调蛋白结合位点中的一个在哺乳动物细胞中是磷酸化的氨基酸残基的位置有至少一个突变，其中在所述磷酸化位点有一个单突变的eNOS多肽突变体中所述突变不是一个氨基酸被取代为Ala或Asp。本发明还提供了使用这种eNOS多肽突变体和多核苷酸的预防、诊断和治疗方法。

发明背景

内皮型一氧化氮合酶(eNOS，也称为ecNOS或NOS3)及由eNOS酶活性产生的氧化氮(NO)在众多生理学过程中起重要作用，所述生理学过程包括例如血管发生、血管舒张、免疫调节、血小板聚集的抑制及平滑肌的松弛。eNOS活性的调节包括多种第二信使分子的参与及其与多肽上不同的功能区域的相互作用(见例如Marletta，M.Trends in Biochem.Sciences(2001)26：519-521)。

eNOS的不同功能域的功能和位置已被充分鉴定，包括例如从N末端至C末端为一个豆蔻酰化共有位点、棕榈酰化的位点、加氧酶结构域、钙调蛋白结合位点及还原酶结构域(见例如图1，也见例如Stuehr，D.J.Annu.Rev.Pharmnacol.Toxicol.(1997)37：339-359)所述)。来自不同物种的eNOS序列的对比示出在每个功能域内的高度序列相同性。另外，已知许多功能域的共有序列。在应答各种生物学刺激(例如细胞刺激)中，野生型eNOS的钙调蛋白结合位点和还原酶结构域内的氨基酸残基通过许多特异性激酶或磷酸酶在体外或体内被磷酸化或去磷酸化。另外，这些位点的磷酸化水平有助于调节eNOS酶活性(见例如Fulton et al.Nature(1999)399：597-601)。在人野生型eNOS(SEQ ID NO：1)中，位于人野生型eNOS(SEQ ID NO：1)的还原酶结构域中的氨基酸残基Ser-1177的丝氨酸取代产生一种对磷酸化(继而对eNOS活性的激活)有抗性的或者是组成型活性的eNOS多肽(见例如WO 00/62605)。在其它物种的eNOS中产生相应氨基酸残基的一个取代时可见相似的结果(见例如WO 00/62605所述)。

一种钙调蛋白(CaM)和钙(Ca⁺⁺)的复合物可以有效结合eNOS钙调蛋白结合位点，并刺激eNOS活性(例如NO产生)。另外，CaM-Ca⁺⁺复合物与eNOS的结合可通过钙调蛋白结合位点内一个特殊氨基酸残基的磷酸化水平而实现。例如，当Thr-495被磷酸化时，钙调蛋白结合可被抑制和/或eNOS的钙调蛋白激活的Ca⁺⁺依赖性可被抑制。如果在Thr-495的磷酸化被阻止，例如通过特异性激酶抑制剂或通过将Thr-495改变为Ala而进行阻止，则可刺激eNOS活性(见例如Busse等所述)。

内皮NO合酶参与本文所述的许多活性，而且这些eNOS多肽的异常表达和/或活性和/或由这些酶产生的NO的异常数量与许多疾病病症相关。因此，细胞中eNOS多肽水平及活性的调节明显代表一种有用的治疗靶。

发明概述

本发明提供了用于基因治疗的分离的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)多肽突变体、编码这种多肽的多核苷酸及其变体。特别地，本发明提供了这样的eNOS多肽突变体，其在相应于哺乳动物eNOS一个功能域的氨基酸序列中有一或多个突变，其中至少一个突变在相应于钙调蛋白结合位点中的一个在哺乳动物细胞中是磷酸化的氨基酸残基的位置，而且在所述磷酸化位点有一个单突变的eNOS多肽突变体中所述突变不是一个氨基酸被取代为Ala或Asp。

一方面，本发明提供了一种分离的人eNOS多肽突变体，其在相应于人eNOS多肽的优选由SEQ ID NO：1编码的人eNOS的第495位的位置有一个突变，其中在钙调蛋白结合位点的磷酸化位点有一个单突变的eNOS多肽突变体中所述突变不是一个氨基酸被取代为Ala或Asp。在一些方面，相应于第495位的突变是一个氨基酸被取代为Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Met、Ser、Cys、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg或者His，优选被取代为Val、Leu或Ile，最优选被取代为Val。在一些方面，在eNOS多肽突变体有一个以上突变的情况中，相应于第495位的突变优选是一个氨基酸被取代为Ala或Val。

另一方面，本发明提供了一种分离的人eNOS多肽突变体，其在相应于哺乳动物eNOS的钙调蛋白结合位点中的一个在哺乳动物细胞中是磷酸化的氨基酸残基的位置有至少一个突变；及在相应于哺乳动物eNOS的还原酶结构域中的一个在哺乳动物细胞中是磷酸化的氨基酸残基的位置进一步包含至少一个突变。在一些方面，钙调蛋白结合结构域中的突变是在相应于人eNOS的第495位氨基酸残基的位置，而且是一个氨基酸被取代为Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Met、Ser、Cys、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg或His，优选被取代为Val、Leu或Ile，最优选被取代为Val；还原酶结构域中的突变是在相应于人eNOS的第1177位氨基酸残基的位置，而且优选是一个氨基酸被取代为Asp。在一些方面中，在eNOS多肽突变体有一个以上突变的情况中，相应于第495位的突变优选是一个氨基酸被取代为Ala或Val。优选地，人eNOS是由SEQ ID NO：1编码的人eNOS。

另一方面，本发明提供了一种分离的人eNOS多肽突变体，其在相应于哺乳动物eNOS的钙调蛋白结合位点中的一个在哺乳动物细胞中是磷酸化的氨基酸残基的位置有至少一个突变，而且在相应于在哺乳动物eNOS的豆蔻酰化位点的一个氨基酸残基的位置进一步包含至少一个突变。在一些方面，钙调蛋白结合结构域中的突变是在相应于人eNOS的第495位氨基酸残基的位置，而且是一个氨基酸被取代为Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr Trp、Met、Ser、Cys、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg或His，优选被取代为Val、Leu或Ile，最优选被取代为Val；豆蔻酰化位点的突变是在相应于人eNOS的第2位氨基酸残基的位置，而且是一个氨基酸被取代为Ala。在这一方面，当eNOS多肽突变体有一个以上突变时，相应于第495位的突变是一个氨基酸更优选地被取代为Ala或Val。优选地，人eNOS是由SEQ ID NO：1编码的人eNOS。

另一方面，本发明提供了一种分离的eNOS多肽突变体，其包含：1)在相应于哺乳动物eNOS的钙调蛋白结合位点中的一个在哺乳动物细胞中是磷酸化的氨基酸残基的位置的至少一个突变；2)进一步包含在相应于哺乳动物eNOS的豆蔻酰化位点的一个氨基酸残基的位置的至少一个突变；3)在相应于哺乳动物eNOS的一个还原酶结构域中的一个在哺乳动物细胞中是磷酸化的氨基酸残基的位置进一步包含一个突变。在一些方面，钙调蛋白结合结构域中的突变是在相应于人eNOS的第495氨基酸残基的位置，而且是一个氨基酸被取代为Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Met、Ser、Cys、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg或His，优选被取代为Val、Leu或Ile，最优选被取代为Val；在豆蔻酰化位点的突变是在相应于人eNOS的第2位氨基酸残基的位置，而且是一个氨基酸被取代为Ala；还原酶结构域中的突变是在相应于人eNOS的第1177位氨基酸的位置，而且优选是一个氨基酸被取代为Asp。在这一方面，当eNOS多肽突变体有一个以上突变时，相应于第495位的突变优选是一个氨基酸被取代为Ala或Val。优选地，人eNOS是由SEQ ID NO：1编码的人eNOS。

另一方面，本发明的eNOS多肽突变体的磷酸化与参考eNOS多肽相比增加或降低。

另一方面，本发明的eNOS多肽突变体与参考eNOS多肽相比在多肽的Ca⁺⁺-钙调蛋白介导的刺激中的Ca⁺⁺依赖性降低。

另一方面，本发明的eNOS多肽突变体与参考eNOS多肽相比活性增加。

一方面，本发明的eNOS多肽突变体与参考eNOS多肽相比NO的产生增加。

一方面，本发明的eNOS多肽突变体与参考eNOS多肽相比还原酶活性增加。

一方面，所述参考eNOS多肽是或衍生自人eNOS、优选由SEQ IDNO：1编码的人eNOS的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供了一种分离的eNOS多肽突变体，其具有与野生型或突变的eNOS多肽的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列。一方面，本发明提供了一种分离的eNOS多肽突变体，其具有与野生型eNOS或本发明的突变的eNOS多肽的氨基酸序列有95-99％序列相同性的氨基酸序列。优选地，起始eNOS多肽是人eNOS多肽，最优选是或衍生自人野生型eNOS多肽，例如由SEQ ID NO：1编码的人eNOS。

另一方面，本发明提供了一种编码本发明的eNOS多肽突变体的多核苷酸。一方面，本发明提供了一种具有编码本发明eNOS多肽突变体的多核苷酸的重组载体，其中所述多核苷酸可操纵地与至少一个调节序列连接，由此所述编码的多肽在细胞中表达。

另一方面，本发明提供了一种包含本发明的eNOS多肽突变体的药物组合物。另一方面，本发明提供了一种包含编码本发明的eNOS多肽突变体的多核苷酸的药物组合物。

另一方面，本发明提供了本发明的eNOS多肽突变体的一种结合配偶体(binding partner)。一方面，所述结合配偶体是一种多肽。在另一方面，所述结合配偶体是一种抗体或抗原特异性片段。

另一方面，本发明提供了一种调节细胞中eNOS活性的方法，所述方法包括给予细胞编码本发明的eNOS多肽突变体的一种多核苷酸。另一方面，本发明提供了一种调节细胞中eNOS活性的方法，所述方法包括给予细胞本发明的eNOS多肽突变体。

另一方面，本发明提供了一种诊断与异常eNOS活性相关的病症的方法，所述方法包括：1)将患者的细胞与编码本发明的eNOS多肽突变体的多核苷酸接触，2)检测指示病症的eNOS活性的水平。

另一方面，本发明提供了一种预防或治疗与异常eNOS活性相关的病症的方法，所述方法包括给予需要治疗的患者有效量的本发明的eNOS多肽突变体。

另一方面，本发明提供了一种治疗或预防与异常eNOS活性相关的病症，其中所述方法包括给予需要治疗的患者有效量的编码本发明的eNOS多肽突变体的多核苷酸，由此所述多肽突变体在患者体内表达。

另一方面，本发明的预防和治疗方法进一步包括在给予eNOS多肽突变体或编码eNOS多肽的多核苷酸之前、期间或之后给予需要治疗的患者一或多种血管生成因子。

附图简述

当与附图一起阅读时，从以下的描述种可以更充分理解本发明的前述或其它方面、其各种特征以及发明本身。

图1是例证了哺乳动物NOS的各种功能域的图。所述功能域包括但非限于例如(从N末端至C末端)豆蔻酰化的一个共有位点、两个棕榈酰化位点、一个氧化酶结构域、一个钙调蛋白结合位点(例如人eNOS的第494-517位氨基酸)，其包含用于磷酸化的一个共有序列(例如人eNOS的Thr-495)、及一个还原酶结构域。NOS多肽的功能域还包括例如一个自身抑制环和一个血红素结合部位。

图2是例证了具有单突变或双突变的eNOS多肽突变体与由SEQID NO：1编码的野生型人eNOS(WT)相比，在HEK293细胞中对NO产生的刺激作用的柱状图。有单突变的eNOS突变体在相应于由SEQ IDNO：1编码的人eNOS的Thr-495的位置有一个氨基酸被取代为Asp(T495D)、Ala(T495A)或Val(T495V)。具有双突变的eNOS多肽突变体在相应于由SEQ ID NO：1编码的人eNOS的Ser-1177的位置有被取代为Asp的第一个氨基酸取代，在相应于由SEQ ID NO：1编码的人eNOS的Thr-495的位置有第二个氨基酸取代，被取代为Asp(T495D+S1177D)、Ala(T495A+S1177D)或Val(T495V+S1177D)。

图3是例证了具有一个单突变的eNOS突变体与由SEQ ID NO：1(野生型)编码的野生型eNOS相比，在人动脉内皮细胞(HAEC)中对NO产生的刺激作用的柱状图。具有单突变的eNOS多肽突变体在相应于由SEQ ID NO：1编码的人eNOS的Thr-495的位置有一个氨基酸被取代为Asp(T495D)、Ala(T495A)或Val(T495V)。

发明详述

本发明提供了用于基因治疗的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)多肽突变体、编码这些多肽的多核苷酸及其变体。特别地，本发明提供了在相应于哺乳动物eNOS的功能域的氨基酸序列中有一或多个突变的eNOS多肽突变体，其中至少一个突变在相应于钙调蛋白结合位点中的一个在哺乳动物细胞中是磷酸化的氨基酸残基的位置；而且在钙调蛋白结合位点的磷酸化位点有一个单突变的eNOS多肽突变体中所述突变不是一个氨基酸被取代为Ala或Asp。

本发明人已经揭示了在人eNOS的钙调蛋白结合位点中Thr-495残基的特定氨基酸取代单独(其中不是取代为Ala或Asp)或与在Ser-1177的第二个突变组合，与野生型人eNOS相比可提高细胞中eNOS活性(例如NO产生)(见例如实施例2所述)；在基因治疗中使用这种eNOS多肽突变体可改善与eNOS活性相关的病症(如美国专利申请系列No.60/403,637所述，在此并入参考)。

因此，本发明的eNOS多肽和方法可用于调节细胞中eNOS活性水平，从而提供一种治疗与eNOS活性相关的疾病和病症的新治疗方法。例如，这种新方法通过多重机制靶向重症肢体缺血(CLI)潜在的病理学，所述多重机制包括例如1)血管发生的刺激；2)微血管功能紊乱的改善；3)现有血管的血管收缩(血管扩张)活性的恢复；及4)现有侧支的重塑/成熟(动脉发生)。预期血流和氧输送至皮肤和肌肉的改善能减轻静息痛及治愈局部缺血溃疡。

另外，本发明的eNOS多肽突变体由于具有明显较高的突变体eNOS酶比活性而比野生型eNOS更有效。另外，eNOS多肽的活性可以受钙的严格调节及对oxLDL和年龄有抗性。因此，与生长因子相反，由于“给药量过多”所引起的毒性在使用本发明的eNOS组合物的基因治疗中是可以忽略的。

在此引用的参考文献以其全文并入参考。

定义

在此所用的技术和学术术语除非特别说明均具有本领域技术人员通常已知的含义。在此所引用的参考文献是本领域技术人员所已知的各种方法学。阐述这些已知方法学的出版物及其它材料在此以其全文并入参考。阐述重组DNA技术的一般原理的标准参考书包括Sambrook，J.，et al.(1989)Molecular Cloning，：A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Planview，N.Y.；McPherson，M.J.，Ed.(1991)DirectedMutagenesis：A Practical Approach，IRL Press，Oxford；Jones，J.(1992)AminoAcid and Peptide Synthesis，Oxrord Science Publications，Oxford；Austen，B.M.and Westwood，O.M.R.(1991)Protein Targeting and Secretion，IRL Press，Oxford。可以利用本领域技术人员已知的任何合适的材料和/或方法进行本发明；然而，优选的材料和/或方法本文进行了描述。在下文描述和实施例中提及的材料、试剂等除非特别说明均可得自商业来源。

如本文所用，术语“多肽”是指全长蛋白质或其片段，或肽。

如本文所用，针对多肽或多核苷酸提及的术语“变体”是指一种多肽或多核苷酸，其与参考多肽或多核苷酸相比(例如与野生型多肽或多核苷酸相比)分别在一级、二级或三级结构中有变化。例如，所述氨基酸或核酸序列可含有与参考氨基酸或核酸序列不同的一个突变或修饰。在一些实施方案中，eNOS变体可以是一种不同的同种型或多态性。变体可以是使用本领域熟知的方法分离或产生的天然发生的、合成的、重组的或化学修饰的多肽或多核苷酸。

如本文所用，针对多肽或多核苷酸提及的术语“突变”是指分别与参考多肽或多核苷酸相比(例如与野生型多肽或多核苷酸相比)，多肽或多核苷酸的一级、二级或三级结构存在一种天然发生的、合成的、重组的或化学的改变或者差异。具有这种突变的多肽和多核苷酸可以使用本领域熟知的方法分离或产生。

如本文所用，术语“eNOS多肽突变体”(例如eNOS突变体、突变体eNOS、eNOS突变多肽、突变体eNOS多肽)是指一种eNOS多肽或其变体，其在相应于哺乳动物eNOS的一个功能域中一个位置的氨基酸残基具有至少一个变化或突变。在一个优选的实施方案中，所述突变是在相应于人eNOS的第495位氨基酸残基的位置有一个氨基酸取代，其中在钙调蛋白结合位点的磷酸化位点有一个单突变的eNOS多肽突变体中所述氨基酸取代不是被取代为Ala或Asp。在其它优选的实施方案中，当eNOS多肽突变体有一个以上的突变时，相应于第495位的突变优选是一个氨基酸被取代为Ala或Val。

在另一个优选的实施方案中，eNOS多肽突变体与参考eNOS多肽相比活性增加或降低。

如本文所用，术语eNOS多肽的“功能域”是多肽中的与eNOS活性相关的任何氨基酸残基、位点或区域，包括但非限于例如蛋白质结合结构域(例如钙调蛋白结合结构域、激酶结合结构域或配体结合结构域)、磷酸化位点、豆蔻酰化位点、还原酶结构域或激活位点。

如本文所用，术语“eNOS活性”是指与细胞中所述酶相关的任何活性，包括但非限于例如NO产生、钙调蛋白结合、刺激血管发生、改善微血管功能紊乱、恢复现有血管的血管收缩(血管舒张)活性、帮助现有侧支的重塑/成熟(动脉发生)。eNOS活性也可以是与所述多肽相关的任何其它生物学或细胞活性，更特别地，可以是与eNOS的功能域相关的任何这种活性。eNOS活性也可以是与所述酶相关的活性的调节，包括但非限于例如在此描述的或本领域已知的任何eNOS活性的调节。

如本文所用，针对eNOS活性所提及的术语“调节”是指这种活性的增加、降低、诱导或抑制。在一些实施方案中，eNOS活性的这种增加、降低、诱导或抑制是相对于一种参考分子例如eNOS野生型或突变体多肽而言的。

如本文所用，术语“疾病”、“病症(condition)”、“障碍(disorder)”是指在患者的细胞、组织或器官中一种不合需要的状况，其中通过调节eNOS活性可以改善所述状况。内皮NOS参与许多生理学过程，包括但非限于血管发生、血管舒张、免疫调节、抑制血小板聚集及松弛平滑肌。因此，调节需要治疗的患者的细胞、组织或器官中eNOS活性可以改善本文所述的疾病、病症或障碍。

如本文所用，术语“患者”是哺乳动物，优选是人。

eNOS多肽突变体

本发明提供了用于基因治疗的eNOS多肽突变体、编码这种多肽的多核苷酸、及其变体。特别地，本发明提供了这样的eNOS多肽突变体，其在相应于哺乳动物eNOS的一个功能域的氨基酸序列中有一或多个突变，在此至少一个突变是在相应于钙调蛋白结合位点中的一个在哺乳动物细胞中是磷酸化的氨基酸残基的位置；而且在所述磷酸化位点有一个单突变的eNOS多肽突变体中所述突变不是一个氨基酸被取代为Ala或Asp。在一些优选的实施方案中，当eNOS多肽突变体有一个以上突变时，相应于第495位的突变优选是一个氨基酸被取代为Ala或Val。

哺乳动物eNOS多肽的功能域已经充分鉴定，包括例如从N末端至C末端为一个豆蔻酰化共有位点、棕榈酰化位点、钙调蛋白结合位点(例如人eNOS的第494-517位氨基酸)，其包含进行磷酸化的一个共有序列(例如人eNOS的Thr-495)、一个还原酶结构域和一个进行磷酸化的共有序列(例如人eNOS的Ser-1177)。这些位点的位置和特性已经熟知(见例如Stuehr，D.J.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.(1997)37：339-359)(图1)。在一个实施方案中，本发明的eNOS多肽突变体在钙调蛋白结合结构域、优选在Thr-495以及在还原酶结构域、优选在Ser-1177内有一或多个突变，其中在钙调蛋白结合位点的磷酸化位点有一个单突变的eNOS多肽突变体中所述Thr-495的突变不是氨基酸被取代为Ala或Asp。

在一个实施方案中，本发明的eNOS多肽突变体在相应于人eNOS的Thr-495残基的位置有第一个突变，其中在钙调蛋白结合位点的磷酸化位点有一个单突变的eNOS多肽突变体中该突变不是一个氨基酸被取代为Ala或Asp。在另一个实施方案中，本发明的eNOS多肽突变体在相应于人eNOS的Thr-495残基的位置有第一个突变；在相应于人eNOS的Ser-1177残基的位置有第二个突变。在另一个实施方案中，本发明的eNOS多肽突变体在相应于人eNOS的Thr-495残基的位置有第一个突变；在相应于人eNOS的Ser-1177残基的位置有第二个突变；在相应于人eNOS的Gly-2残基有第三个突变。

本发明的突变可以是任何类型，包括例如一或多个氨基酸添加、取代、缺失、插入、修饰、翻转、融合或截短，或者这些类型的组合，且可以是经合成方法、化学方法、重组方法或通过已知方法产生的。在本发明的eNOS多肽突变体的优选实施方案中，在相应于人eNOS的Thr-495的位置的突变是氨基酸被取代为Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Met、Ser、Cys、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg或His，优选取代为Val、Leu或Ile，最优选取代为Val；在相应于人eNOS的Ser-1177的位置的突变优选是氨基酸被取代为Asp，优选被取代为Ala；在相应于人eNOS的Gly-2的位置的突变是一个氨基酸被取代为Ala。在一些优选的实施方案中，当eNOS多肽突变体有一个以上突变时，相应于第495位的突变是氨基酸优选地被取代为Ala或Val。

在一个实施方案中，本发明的eNOS多肽突变体除了在Thr-495位点有一个突变之外(用黑体表示)，在钙调蛋白结合位点还有一或多个额外的突变氨基酸残基，

DPWKGSAAKGTGITRKKTFKEVANAVKISASLMGTVMAKRVKATI(SEQ ID NO：1，第478-522位氨基酸)。在其它物种中相对应的序列可略有不同，特别是在N末端磷酸化位点的残基略有不同。这个基序中每个氨基酸均可以个别地改变为任何其它19种天然氨基酸，或者改变为非天然的氨基酸。在一些实施方案中，所述突变不是保守突变，例如Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asp/Gln、Thr/Ser或Phe/Trp/Tyr。在一个实施方案中，从一个eNOS多肽开始(起始多肽)，在相应于钙调蛋白结合结构域的磷酸化位点的位置导入第一个突变，并将该多肽突变体与参考eNOS多肽(例如起始多肽或其它eNOS多肽，包括野生型eNOS多肽)对比分析eNOS活性。例如，可以选择与起始eNOS多肽相比呈现较高量的eNOS活性(例如NO产生)的单突变体。在已经产生所述第一个突变并鉴定之后，可重复该程序以产生有双突变的eNOS多肽，并可以进一步重复以产生具有本文所述额外突变的eNOS多肽突变体。使用已知方法可以产生任何数目的突变。

产生多肽突变体的方法(例如突变编码多肽的核酸)是本领域的标准技术而且是熟知的。这些方法包括例如同源重组、定点诱变、盒式诱变及基于PCR的诱变(见例如Sambrook et al.，Molecular Cloning，CSH Press(1989)；Kunkel et al.(1985)PNAS 82，488-492和Lee et al.(2001)J.Biol.Chem.Dec 21；276(51)：47930-6)。这种突变的起始材料可以是例如来自例如任何人、小鼠、豚鼠、狗、牛、猪、兔、大鼠、绵羊、马、非人灵长类动物或其它动物的eNOS cDNA。

在优选的实施方案中，本发明的eNOS多肽突变体与参考eNOS多肽相比呈现eNOS活性增加或降低(例如NO产生)。在另一个实施方案中，本发明的eNOS多肽突变体可以呈现一或多种eNOS活性增加或降低，所述活性水平的增加或降低是针对参考eNOS多肽而言。本发明的突变多肽可以通过使用标准试验分析本文所述任何eNOS活性而鉴定。

例如，在应答各种体外或体内刺激(例如细胞刺激)时，eNOS通过特异性激酶或磷酸酶在例如人eNOS的Thr-495和/或Ser-1177(或者在其它物种的相应残基)磷酸化或去磷酸化。在优选的实施方案中，本发明的eNOS多肽突变体呈现NO产生增加、CaM对eNOS的CaM结合位点的结合和亲和性增加，和/或呈现对CaM介导的eNOS激活的Ca⁺⁺依赖性降低。本文描述的及本领域已知的任何这些及其它eNOS活性，包括由所述酶产生的NO间接介导的活性，均是可以通过本发明的eNOS组合物和方法调节的活性。

eNOS在例如血管内皮、心肌细胞、血小板、各种类型的免疫系统细胞(例如T细胞、中性粒细胞和单核细胞)中发现，并将L-Arg转变为NO，NO是参与和/或在许多生理应答中起调节功能的一种气态信使分子。另外，eNOS结合与Ca⁺⁺缀合的钙调蛋白，激活eNOS酶活性。各种eNOS相关的活性包括由所述酶产生的NO直接或间接介导的活性。这种eNOS活性包括但非限于例如刺激血管发生(正常的或例如由于局部缺血所致削弱的)、刺激血管舒张、刺激侧支血管发生、增强外周肢体血流、抑制肢体坏死(例如在重症肢体缺血或CLI中)、增强伤口愈合、抑制平滑肌收缩、抑制或防止血小板吸附和聚集(这可以导致例如抑制血栓形成)、介导升高的HDL对心血管系统的保护作用、刺激内皮细胞增殖和迁移、抑制白细胞激活和附着，趋化因子表达或平滑肌增殖、抑制心肌梗塞、调节免疫应答、及清除超氧化物阴离子。分析这些及其它eNOS活性的方法是本领域技术人员熟知的。

例如，分析eNOS多肽磷酸化和/或磷酸化程度的标准方法包括一种体外方法，其中将蛋白质(例如在大肠杆菌中重组产生的或者部分或完全从天然原料中纯化的蛋白质)与一种激酶如AMP激活的激酶(AMPK)或蛋白激酶C(PKC)或者与一种磷酸酶一起温育。然后可以使用标准方法分析eNOS多肽或其胰蛋白酶消化产物，所述标准方法如凝胶电泳或与放射自显影结合的柱层析或者用特异于给定磷酸肽的抗体免疫印迹。这些及其它分析参见例如WO00/28076、WO00/62605、WO00/62605、Michell et al.(2001)The Journal of Biological Chemistuy 276，17，625-628及Fleming et al.(2001)Circulation Research 88，68e-75e等所述。

体内或体外测定直接或间接依赖于eNOS表达的各种活性的其它方法包括如下方法：(1)在存在或无钙调蛋白(CaM)的情况下测定L-[³H]-瓜氨酸的产生(见例如Balligand et al.(1995)J.Biol.Chem.270，14，582-586；Bredtet al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，682-685及Fleming et al.(2001)Circulation Research 88，68e-75e)。例如可以将重组eNOS与CaM共表达(见例如Rodriguez-Crespo et al.(1996)Arch.Biochem.Biophys.336，151-156))，并在存在不同量添加的EGTA的情况下进行分析(例如WO00/28076所述)；(2)测定与钙调蛋白的结合能力(例如Fleming et al.(2001)CirculationResearch 88，68e-75e所述)；(3)在完整的细胞中测定cGMP的时间依赖性和N^ω-硝基-L-精氨酸-敏感性积聚(见例如Fleming et al.(1998)Circ.Res.82，686-695所述)；(4)测定还原酶活性，例如NADPH-依赖性还原酶，细胞色素C还原酶活性，或者2，6-二氯酚靛酚(DCIP)还原(见例如WO00/62605；WO00/62605；Martasek et al.(1999)Methods Enzymol.301，70-78；Masters etal.(1967)Methods Enzymol.10，565-573所述)；(5)测定对平滑肌收缩的作用(见例如Furchgott and Zawadzki(1980)Nature 288：373-376所述)；(6)测定对血小板功能的作用；(7)测定细胞中NO的释放(作为亚硝酸盐NO₂ ^-进行分析)，通过化学发光或通过血红蛋白捕获而确定(见例如WO00/62605、WO00/62605、Sessa(1995)J.Biol.Chem.270，17641-644、Kelm et al.(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.154，236-244所述)；(8)测定肢体坏死的抑制，通过在侧支血管依赖性局部缺血肢体中毛细管密度增加或血管收缩反应而确定(见例如Murohara et al.(1998)J.Clin.Invest.，101，2567-2568)；(9)测定伤口愈合、内皮细胞迁移、增殖或分化的增强(见例如Lee et al.，(1999)Am J.Physiol.277，H 1600-1608)；或者(10)测定勃起功能障碍。也参见本文的实施例，其举例说明了eNOS活性(例如NO产生)的分析。

测试eNOS活性的动物模型是本领域标准使用并熟知的。例如为测试血管发生和血管再形成，见Murohara等(1998，同前)、Couffinhal et al.(1998)；Am J.Pathol 152，1667-1669、Couffinhal et al.，(1999)Circulation 99，3188-3198及本发明实施例所述。这种模型包括例如经手术形成的小鼠和大鼠后肢局部缺血模型，例如手术是在eNOS剔除小鼠中进行的。测定后肢血流和毛细管密度的方法也是熟知的(见例如Murohara et al.(同前)、Couffinhal et al.(1998)；Am J.Pathol 152，1667-1669、Couffinhal et al.，(1999)Circulation 99，3188-3198及本发明实施例所述)。

本发明的eNOS多肽可以是一种重组多肽、天然多肽或者合成或半合成的多肽，或者其组合，优选是一种重组多肽。

本发明的多肽优选是分离的形式，而且可以是纯化为例如同质性的。术语“分离的”当例如针对多肽或多核苷酸时，是指该材料是从其原始环境中分离的(例如如果其是天然发生的则是从天然环境分离的)，及是从其天然相关的至少一种其它成分中分离的。例如，在其天然活宿主中存在的天然发生的多肽不是分离的，但从天然系统中的一些或全部共存材料中分离出的则是分离的。这种多肽可以是一种组合物的一部分，如果这种组合物不是其天然环境的一部分，则所述多肽仍是分离的。

本发明的eNOS多肽的片段或变体优选基本保留至少一种eNOS活性。这种eNOS活性可以例如是任何本文所述的那些活性，包括具有与抗体反应的能力，即具有一种携带表位的肽，尤其包含一或多个本发明的突变的肽。

本发明多肽片段的大小可以是任何与本发明目的例如用于基因治疗相应的大小。所述片段的大小范围可以从最小的特异性表位(例如大约6个氨基酸)至接近全长的基因产物(例如比全长多肽短一个氨基酸)。例如，本发明的多肽可以包含至少大约10、25、50、100、200、300、400、500、600、800、1000或1200个氨基酸。

本发明的多肽片段可用于例如通过肽合成方法生产相应的全长多肽，例如作为生产全长多肽的中间体；用于诱导抗体或抗原结合片段的产生；作为“查询序列”用于探查公共数据库，等等。

另外，包含本发明突变的多肽片段可用作eNOS拮抗剂。不希望受任何特定机制的限制，预期这种含有突变的肽片段，特别是与野生型eNOS相比与钙调蛋白的亲和性或结合增加的肽片段，可以在细胞中“吸收(sopup)”钙调蛋白，由此抑制细胞中钙调蛋白诱导的eNOS的激活。抑制程度可以为部分抑制至完全抑制。

本发明多肽的变体(例如人eNOS多肽的变体，其在钙调蛋白结合结构域中的Thr-495位点和/或其它位点已经被改变)可以是例如(i)其中一或多个氨基酸残基用一种保守或非保守的氨基酸残基取代(优选用保守的氨基酸残基取代)，而且这种取代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的氨基酸残基，或者(ii)其中一或多个氨基酸残基包含一个取代基，或者(iii)其中所述多肽与另一种化合物融合，如与提高所述多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合，或者(iv)其中额外的氨基酸与多肽融合，所述额外的氨基酸如一种前导或分泌序列或者用于纯化多肽的序列，通常用于产生一种遗传工程化形式的能从细胞如转化的细胞中分泌的蛋白质。所述额外的氨基酸可以来自异源来源或者可以是天然基因内源的。

属于上述类型(i)的变体多肽包括例如突变蛋白、多肽突变体和衍生物。变体多肽的氨基酸序列由于例如一或多个添加、取代、缺失、插入、翻转、融合及截短或者任何这些突变的组合而不同。例如，本领域技术人员熟知的保守氨基酸取代通常不引起蛋白质功能改变。

属于上述类型(ii)的变体多肽包括例如修饰的多肽。已知的多肽修饰包括但非限于糖基化、乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素共价附着、血红素部分的共价附着、核苷或核苷衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联形成、胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶解、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化(selenoylation)、硫化、转移RNA介导的向蛋白质中添加氨基酸如精氨酰化、及遍在蛋白化。

这些修饰是为本领域技术人员所熟知的，并且已经在科学文献中详细描述。一些特别常见的修饰例如糖基化、脂质附着、硫化、谷氨酸残基的γ-羧化，羟化及ADP-核糖基化在许多基础教材中已经描述，如Proteins--Structure and Molecular Properties，2nd ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman andCompany，New York(1993)。对这个主题可获得许多详细综述，例如Wold，F.，Posttranslationail Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York 1-12(1983)、Seifter et al.(1990)Meth.Enzymol.182：626-646及Rattan et al.(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62。

属于上述类型(iii)的变体多肽是本领域熟知的，包括例如PEG化或其它化学修饰。

属于上述类型(iv)的变体多肽包括例如通过裂解蛋白原(proprotein)部分可被激活以产生一种活性的成熟多肽的前蛋白(preprotein)或蛋白原。变体包括许多杂合体、嵌合体或融合多肽。这种变体的典型实例在本文另处论述。

本领域技术人员已知许多其它类型的变体。例如，如本领域所熟知的，多肽不总是完全线性的。例如，多肽由于遍在蛋白化的结果可以分支，及通常由于翻译后事件的结果可以是有或无分支的环形，所述翻译后事件包括天然加工事件及通过非天然发生的人工操纵所致事件。环形的、分支的及分支的环形多肽可以通过非翻译天然加工及通过合成方法合成。

修饰和变化可以在多肽的任何部位发生，包括在肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。在一个给定多肽的几个位点可以存在相同或不同程度的相同类型的修饰。另外，一个给定多肽可以含有一种类型以上的修饰。通过共价修饰而阻断多肽中氨基或羧基基团或这两个基团在天然发生的和合成的多肽中是常见的。例如，在大肠杆菌中在蛋白酶解之前产生的多肽的氨基末端残基通常是N-甲酰甲硫氨酸。修饰可以依蛋白质产生方式而确定。例如，就重组多肽而言，修饰可以通过宿主细胞翻译后修饰能力和多肽氨基酸序列中的修饰信号而确定。因此，当希望糖基化时，多肽可以在糖基化宿主通常在真核细胞中表达。昆虫细胞通常携带与哺乳动物细胞相同的翻译后糖基化，为此已经揭示了昆虫细胞表达系统以有效表达具有天然糖基化模式的哺乳动物蛋白质。针对其它修饰有相似的考虑。

变体多肽可呈现一或多种eNOS活性增加或降低，其中eNOS活性的增加或降低是相对于参考eNOS多肽的活性水平而言。

如所提及的，本发明的eNOS多肽突变体包括这样的突变体，其中除了钙调蛋白结合结构域中Thr-495残基和/或其它位点之外有一或多个氨基酸被修饰，即所述额外突变位于eNOS多肽的其它功能域。例如，可以在一或多个催化结构域(例如氧化酶或还原酶结构域)或者调节区域(例如豆蔻酰化位点，自体抑制环，或位于分子C末端区域附近的Ser磷酸化位点，或者在本文另处描述的任何功能域)导入一或多个突变。额外的突变可以是本文所述的任何类型的突变。

额外突变例如包括在人eNOS的第1177残基位的Ser磷酸化位点用另一种氨基酸如Asp取代(见例如WO00/62605)，或者在人eNOS的豆蔻酰化位点的突变，如在第2残基位的Ala用另一种氨基酸如Gly取代(见例如Sessa et al.，(1993).Circulation Research 72，921-924)。

在豆蔻酰化位点突变的eNOS多肽可以位于细胞质而不是细胞膜中。这种突变对病原刺激(例如oxLDL)有抗性(与野生型eNOS相比)，其负调节eNOS NO产生。这个性质对eNOS多肽突变体(或编码其的多核苷酸)在治疗存在这种外部病原刺激的病症如动脉硬化、周围肢体局部缺血或CLI等中的应用有利。

在一个优选的实施方案中，本发明的eNOS多肽在相应于Thr-495的位置包含一个氨基酸取代(例如取代为Ala、Val、Leu或Ile，优选取代为Ala或Val)；和/或在相应于Ser-1177的位置包含一个氨基酸取代(例如优选取代为Asp)；和/或在相应于Gly-2的位置包含一个氨基酸取代(例如取代为Ala)，其中双突变体或三突变体与参考eNOS多肽(例如野生型eNOS或其它eNOS多肽突变体)相比呈现更高的eNOS活性。

本发明的eNOS多肽突变体还包括与野生型eNOS或本发明的突变的eNOS多肽有不同程度的序列同源性(相同性)的多肽。在一个实施方案中，所述多肽与本发明的eNOS多肽基本同源，或者与其序列基本同源(序列相同性)。因此本发明的多肽及其片段可含有与野生型eNOS或本发明突变的eNOS多肽有至少大约65-70％的序列同源性(相同性)，优选大约70-75％、75-80％或80-85％、85-90％序列同源性(相同性)，最优选有大约90-95％或95-99％序列同源性(相同性)。本发明还包含这样的多肽，其具有较低程度的序列相同性，但具有足够相似性以呈现一或多种eNOS活性。

根据本发明，术语“相同性百分比”当针对序列而言时，是指一个序列与一种请求保护的或描述的序列相比较，这种比较是在待比较的序列(“比较序列”)与所述或所请求保护的序列(“参照序列”)进行比对排列之后进行的。随后相同性百分比通过下式确定：

相同性百分比＝100[1-(C/R)]

其中C是在参照序列和比较序列之间进行比对的长度内参照序列和比较序列之间的差异的数目，其中(i)在比较序列中没有相应比对的碱基或氨基酸的参照序列中的每个碱基或氨基酸、(ii)参照序列中的间隔以及(iii)与比较序列中的比对的碱基或氨基酸不同的参照序列中的每一个比对的碱基或氨基酸组成一个差异；R是在与比较序列进行比对的长度内的参照序列的碱基或氨基酸数目，参照序列中产生的任何间隔也被计为一个碱基或氨基酸。

如果在比较序列和参照序列之间存在着这样的比对，其按如上所述计算的相同性百分比与规定的最低相同性百分比大约相等或者大于规定的最低相同性百分比，则比较序列具有规定的与参照序列的最低相同性百分比，尽管也可能存在上述计算相同性百分比低于规定的相同性百分比的比对。

在一个优选的实施方案中，为比较目的而比对的参照序列的长度至少为参照序列长度的30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、还更优选地至少60％、还更优选地至少70％、80％或90％(例如，当将第二个序列与具有91个氨基酸残基的本文的氨基酸序列比对时，至少30个、优选地至少35个、更优选地至少45个、还更优选地至少55个、还更优选地至少65、70、80和90个氨基酸残基被进行比对)。

本文中对于相同性百分比或同源性百分比的描述同样地适用于核苷酸或氨基酸序列。

两个序列之间的比较和相同性和相似性百分比的确定可以使用数学算法完成(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversity Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and GenomeProjects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，l994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；以及Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。

这种数学算法的一种优选的非限制性例子如Karlin et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877所述。这种算法被编入Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402所述的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序(例如NBLASST)的默认参数。在一个实施方案中，进行序列比较的参数可以设置成score＝100，wordlength-12，或者可以变化(例如W＝5 or W＝20).

在一个优选的实施方案中，两个氨基酸序列之间的相同性百分比用Needleman et al.(1970)(J.Mol.Biol.48：444-453)算法，该算法已经编入GCG软件包的GAP程序中，其使用BLOSUM62矩阵或PAM250矩阵，gap weight为16，14，12，10，8，6或4，length weight为1，2，3，4，5或6。在另一个优选的实施方案中，两个核苷酸序列之间的相同性百分比用GCG软件包中的GAP程序(Devereux et al.(1984)Nucleic Acids Res.12(1)：387)确定，使用NWSgapdna.CMP矩阵，gap weight为40，50，60，70或80，length weight为1，2，3，4，5或6。

用于序列比较的算法的另一个优选的非限制性例子是Myers andMiller，CABIOS(1989)的算法，这种算法被编入ALIGN程序(版本2.0)，其是CGC序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列，可以使用PAM120 weight residue table，gap length penalty为12，gappenalty为4。用于序列分析的其它算法是本领域已知的，并包括如Torellis et al.(1994)Comput.Appl.Biosci.10：3-5所述的ADVANCE和ADAM；以及Pearson et al.(1988)PNAS 85：2444-8所述的FASTA。

根据本发明，术语“基本上同源的”当指蛋白质序列时，是指氨基酸序列至少约90-95％或97-99％或更高程度地相同。基本上同源的氨基酸序列可以由与编码本发明的突变多肽的序列的核酸序列或其部分在高严格条件下杂交的核酸序列编码。

如本文所用，“高严格”条件是指，例如，在含有例如约5X SSC，0.5％SDS，100ug/ml变性鲑精DNA和50％甲酰胺的杂交溶液中，将印迹与一种长多核苷酸探针在42℃保温过夜(例如至少12小时)。印迹可以在允许例如低于5％bp错配的高严格条件下洗涤(例如在65℃在0.1×SSC和0.1％SDS中洗涤2次，每次30分钟)，从而选择具有例如95％或更高序列相同性的序列。

高严格条件的其它非限制性实例包括在65℃在含有30mM NaCl和0.5％SDS的水性缓冲液中最后洗涤。高严格条件的另一个实例在50℃在7％SDS、0.5M NaPO₄，pH7、1mM EDTA中杂交过夜，随后在42℃用1％SDS溶液洗涤一或多次。而高严格洗涤可以允许低于5％错配，降低的或低严格条件可允许最多20％核苷错配。低严格杂交可以如上述完成，但使用较低的甲酰胺条件、较低温度和/或较低的盐浓度，以及较长的保温时间。

针对本发明的多肽(和多核苷酸)所应用的术语“片段”是指较大序列的一部分这样的一个序列(即在较大的序列内一个连续的或不间断的残基序列)。

本发明的多肽可以源自哺乳动物的任何物种的细胞和组织，所述动物例如是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、家畜如牛、绵羊或猪、宠物如狗、马、非人灵长类动物、或其它动物、或人，但优选源自人体细胞。已知许多物种的eNOS序列，例如人(Janssens et al.(1992)J.Biol.Chem.267，14，519-522)、牛(USP 5,498,539的SEQ ID NO：2)、狗(genbank ACCESSIONAF143503)和豚鼠(genbank ACCESSION AF146041)。

在任何给定的哺乳动物中，可在许多组织中发现eNOS多肽。确定这种多肽的组织或细胞定位的方法是本领域的标准方法，包括例如免疫组织化学的标准方法。eNOS多肽见于例如血管内皮、心肌细胞、血小板及各种免疫系统细胞如T细胞、中性粒细胞和单核细胞。

编码eNOS多肽突变体的多核苷酸

本发明还包括编码本发明eNOS多肽突变体的多核苷酸及其片段。本发明还包括不间断地编码eNOS多肽突变体的多核苷酸。多核苷酸“不间断地编码”是指一种多核苷酸，其与被内含子或其它非编码序列中断的ORF相比具有一个连续的开放读框(ORF)。

本发明的多核苷酸可以是一种重组多核苷酸、天然多核苷酸或者合成或半合成的多核苷酸，或者其组合。如本文所用，术语多核苷酸、寡核苷酸、寡聚物和核酸是可互换的术语。因此，“多核苷酸”可涵盖全长多核苷酸的片段，如寡核苷酸。

如本文所用，术语“基因”是指参与产生多肽链的一个DNA节段；其可包含在编码区前和后的区域(前导序列和尾随序列)，以及在各个编码节段(外显子)之间的插入序列(内含子)。当然，cDNA没有相应的内含子。本发明包括编码本发明多肽的分离的基因(例如基因组克隆)。

本发明的多核苷酸可以是RNA、PNA或DNA，例如cDNA、基因组DNA、及合成或半合成的DNA，或其组合。所述DNA可以是三链、双链或单链DNA，如果是单链DNA则可以是编码链或非编码(反义))链。其可以包含发夹或其它二级结构。所述RNA包括寡聚物(包括具有有义或反义链的那些寡聚物)、mRNA、聚腺苷酰化的RNA、总RNA、单链或双链RNA，等等。本发明还包含DNA/RNA双链体。

本发明的多核苷酸及其片段的大小可以是任何与本发明目的相应的大小，例如当用作探针时有效达到希望的特异性的任何希望的大小。例如在融合多核苷酸或作为基因组序列一部分的多核苷酸的情况中，多核苷酸的大小范围可以例如从最小的特异性探针(例如大约10-12个核苷酸)至超过全长cDNA；片段的长度可以大如例如比全长cDNA短一个核苷酸。例如，本发明的多核苷酸可包含至少大约8、10、12、14或15个连续的核苷酸，例如大约15个连续的核苷酸。

如在本文另处所论述的，本发明的多核苷酸片段可用作例如杂交探针。多核苷酸的片段也可以用作盒式诱变的起始点。盒式诱变(见例如Leeet al.(2001)，如前述)允许在同一时间在序列中导入许多突变。然后可以表达各个克隆，并通过筛选方法选择希望的表型并对产物测序。例如，全长eNOS突变体可以在大肠杆菌中表达，通过在钙调蛋白亲和柱上的吸附选择突变体，洗脱然后进行Western印迹。然后使用标准测序方案确定结合的突变体的序列。相似地，可将突变的序列导入一个表达系统，该系统在例如噬菌体展示上将该基序表达作一个表位。噬菌体可以与钙调蛋白亲和柱结合、被选择并测序。也可以使用一种肽文库方案，因为eNOS钙调蛋白结合结构域的序列适应全合成。

本发明涵盖多核苷酸的许多类型的变体，这些变体包括例如如下变体：(i)其中一或多个核苷酸被另一个核苷酸取代，或者其是另外突变的；或者(ii)其中一或多个核苷酸被修饰，例如包括一个取代基团；或者(iii)其中所述多核苷酸与另一种化合物融合，如与提高多核苷酸半衰期的化合物融合；或者(iv)其中额外的核苷酸与多核苷酸共价结合，这种序列编码一个前导或分泌序列或者用于纯化所述多肽的一个序列。所述额外的核苷酸可以来自异源来源，或者可以是天然基因内源的。

本发明的多核苷酸可以有一个编码序列，其是野生型eNOS序列涵盖的编码序列的天然或非天然发生的等位基因变体。如本领域所已知的，等位基因变体是多核苷酸序列的一种变化的形式，其可具有一或多个核苷酸的取代、缺失或添加，一般基本上不改变所编码的多肽的功能。

位于编码序列或调节序列中的其它变体序列可影响(例如增强或降低)本发明的eNOS多肽突变体的产生或其功能或活性。

属于上述类型(ii)的多核苷酸变体包括例如修饰，如可检测标记(抗生物素蛋白、生物素、放射性元素、荧光标记和染料、能量转移标记、发射能量的标记、结合配偶体等)的附着，或改善表达、摄取、编目(cataloging)、标记、杂交、检测和/或稳定性的基序的附着。根据希望的方法多核苷酸也可以附着于固体支持物，例如硝化纤维素、磁性或顺磁性微球体(例如U.S.Pat.No.5,411,863、U.S.Pat.No.5,543,289所述；例如包含铁磁性、超磁性、顺磁性、超顺磁性、氧化铁和多糖微球体)、尼龙、琼脂糖、重氮化纤维素、乳胶固体微球、聚丙烯酰胺，等等。见例如U.S.Pat.Nos.5,470,967、5,476,925、5,478,893所述。

属于上述类型(iii)的多核苷酸变体是本领域熟知的，包括例如各种长度的聚A+尾、5’帽结构，及核苷酸多肽突变体，例如肌苷、硫代核苷酸等。

属于上述类型(iv)的多核苷酸包括例如各种嵌合、杂合或融合多核苷酸。例如，本发明的多核苷酸可包含一个编码序列和额外的非天然发生的或异源编码序列(例如编码前导、信号、分泌、定向、酶促、荧光、抗生素抗性及其它功能性或诊断性肽的序列)；或者包含一个编码序列和非编码序列，例如在5’或3’末端的未翻译的序列，或者分散于编码序列中，如内含子。

更特别地，本发明包括这样的多核苷酸，其中eNOS多肽突变体的编码序列在同一读框与由所述多核苷酸编码的另一个多肽序列(例如一个异源多肽序列)融合，产生一种融合的eNOS多肽突变体。可以这种方式融合的多肽序列是例如有助于一种多肽从宿主细胞中表达和分泌的序列，是一个前导序列，其作为控制多肽从细胞和中转运的一个分泌序列和/或促进多肽与细胞膜吸附的跨膜锚序列。具有前导序列的多肽是一种前蛋白，可以通过宿主细胞裂解前导序列以形成成熟形式的多肽。所述多核苷酸也可以编码一种蛋白原，其是成熟蛋白质加上额外的N末端氨基酸残基。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白质是蛋白原，而且通常是失活形式的蛋白质，一旦该原序列被裂解，则保留活性蛋白。

本发明的多核苷酸也可以具有在框内与一个标记序列融合的编码序列，这使得可以鉴别和/或纯化本发明的多肽。所述标记序列可例如是6-组氨酸标记(例如由pQE-9载体提供)，以便在细菌宿主中纯化与该标记融合的成熟多肽；或者例如当使用哺乳动物宿主如COS-7细胞时，所述标记序列可以是血凝素(HA)标记。HA标记相应于衍生自流感血凝素蛋白的一个表位(见例如Wilson，I.，et al.，Cell，37：767(1984)所述)。

本领域技术人员显而易见其它类型的多核苷酸变体。例如，根据希望的目的例如核酸酶如RNAse H抗性、改良的稳定性，多核苷酸的核苷酸可以通过各种已知键例如酯、sulfamate，sulfamide，硫代磷酸酯，氨基磷酸酯、甲基膦酸酯，氨基甲酸酯等连接(见例如U.S.Pat.No.5,378,825)。可以掺入任何希望的核苷酸或核苷酸多肽突变体，例如6-巯基鸟嘌呤、8-氧-鸟嘌呤。

本发明的多核苷酸还可具有衍生自生物体另一遗传基因座的编码序列，只要其与哺乳动物野生型eNOS多肽或来自另一种生物体的该多肽基本同源(例如直向同源)即可。

本发明的多核苷酸可以根据任何希望的方法标记。例如本发明的多核苷酸可以使用放射性示踪物如³²P、³⁵S、³H或¹⁴C标记。所述放射性标记可以根据任何方法进行，例如在3’或5’末端使用放射标记的核苷酸、多核苷酸激酶(用或没有用磷酸酶去磷酸)或连接酶(根据进行标记的多核苷酸的末端)进行末端标记。也可以使用一种非放射性标记，将本发明的多核苷酸与具有如下性质的残基组合，所述性质为免疫学性质(抗原、半抗原)、对某些试剂的特异性亲和性(配体)、能使可检测的酶反应进行完全的性质(酶或辅酶、酶底物或参与酶促反应的其它物质)、或者特征性物理性质如荧光或在希望的波长发射光线或吸收光线，等等。

本发明的多核苷酸可包含一种序列，其与编码野生型eNOS或本发明突变的eNOS多肽的核苷酸序列有至少大约65-100％(例如至少大约70-75％、80-85％、90-95％或97-99％)序列相同性，或者与其基本同源，或者在高严格杂交条件下与其杂交。

术语“基本同源”当就多核苷酸序列而言时是指所述核苷酸序列与编码野生型或本发明突变的eNOS多肽的多核苷酸具有至少大约90-95％或97-99％或更多相同性。

eNOS多肽的表达及eNOS活性分析

本发明还涉及含有载体和本发明多核苷酸的重组构建体。这种构建体包含一个载体如质粒或病毒载体，其中已经以正向或反向插入了本发明的一个多核苷酸序列。

本领域技术人员已知大量合适的载体，许多是可以商购的。例如如下载体：细菌：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、pTRC99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；真核生物：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。然而，可使用任何其它质粒或载体，只要其在宿主中可复制及存活。

在一个优选的实施方案中，所述载体是一种表达载体，其中已经插入了本发明的一个多核苷酸序列，其与指导mRNA合成的一个合适的表达控制(调节)序列(例如启动子核/或增强子)可操纵地连接。可以选择已知控制原核细胞或真核细胞或其病毒的合适的表达控制序列，例如可调节的启动子或调节序列，以在原核生物(例如细菌)、酵母、植物、哺乳动物细胞或其它细胞中表达。优选的表达控制序列衍生自高表达的基因，例如衍生自编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶或热激蛋白等的操纵予。这种表达控制序列可以例如使用CAT(氯霉素转移酶)载体或具有可选择标记的其它载体选自任何希望的基因。用于这种选择的两种合适的载体是pKK232-8和pCM7。

可以使用的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、PR，、PL和trp。真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV激酶、早期和晚期SV40、腺病毒启动子、来自逆转录病毒的LTR及小鼠金属硫蛋白-I。合适载体和启动子的选择在本领域熟练技术员的水平范围内。

通过高等真核细胞对编码本发明多肽的DNA的转录可以通过在表达载体中插入一个增强子序列而提高。增强子是DNA的顺式作用元件，通常为大约10-300bp，其作用于启动子以提高其转录。代表性的实例包括在复制起点晚期侧100-270碱基对处，巨细胞早期启动子增强子，在复制起点晚期侧的多形瘤增强子及腺病毒增强子。

通常地，重组表达载体也包括复制起点。表达载体可含有翻译起始的核糖体结合位点，转录终止序列、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点，和/或5’侧翼或未转录的序列。衍生自SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列可用于提供需要的未转录的遗传元件。载体也可包括扩增表达的合适序列。另外，表达载体优选含有一或多个可选择的标记基因以提供选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或者如在大肠杆菌中四环素或氨苄青霉素抗性。

本领域技术人员已知大量合适的表达载体，许多是可以商购的。合适的载体包括染色体、非染色体及合成的DNA序列，例如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；衍生自质粒与噬菌体DNA，病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、腺伴随病毒、TMV、禽痘病毒和假狂犬病病毒组合的载体。然而，可以使用任何其它载体，只要其在宿主中可复制及可存活即可。用于原核及真核宿主的合适的克隆和表达载体见例如如下文献所述Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)、Wu et al，Methods in GeneBiotechnology(CRC Press，New York，NY，1997)，Recombinant GeneExpression Protocols，in Methods in Molecular Biology，Vol.62，(Tuan，ed.，Humana Press，Totowa，NJ，1997)及Current Protocols in Molecular Biology，(Ausabel et al，Eds.，)，John Wiley & Sons，NY(1994-1999)。下文进一步描述了适于基因治疗方法的载体和组织特异性调节序列。

合适的DNA序列可通过许多方法插入载体中。一般通过本领域已知的标准方法将DNA序列插入合适的限制性内切酶位点。这种及其它分子生物学技术的标准程序见于许多易于获得的来源，例如Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)。也见于Graham et al.(1988)Virology 63，614-617所述的用于构建例如腺病毒基因输送载体的拯救重组技术。如果需要，将一个异源结构序列以与翻译起始和终止序列、优选能指导翻译的蛋白质分泌入壁膜间隙或胞外基质的前导序列、合适的状态装配在表达载体中。

本发明还涉及用上述那些构建体转化/转染/转导的宿主细胞，涉及所述细胞的子代，尤其在这种细胞产生一种稳定的细胞系的情况中，该细胞系可用于分析eNOS活性例如以鉴别调节eNOS活性的制剂和/或用于生产本发明的多肽(例如制备生产)。

可以提及的合适的宿主的代表性实例是：细菌细胞，例如大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；真菌细胞，例如酵母；昆虫细胞如果蝇S2和Spodoptera Sf9(及其它昆虫表达系统)；动物细胞，包括哺乳动物细胞如CHO、COS(例如Gluzman，Cell，23：175(1981)所述的猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系)、C127、3T3、CHO、HeLa、BHK或Bowes黑素瘤细胞系；植物细胞。合适宿主的选择确信在本领域技术人员的学术范围内。用于测试推定的调节因子的细胞系通常是哺乳动物细胞，监测其NO水平以表示不同的eNOS活性。

将一种构建体导入(或输送至)宿主细胞可以通过例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂染、基因枪或电穿孔而实现(Davis，L，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。

在转化进合适的宿主菌株及在宿主菌株生长至合适的细胞密度之后，如果需要则选择的启动子可以通过合适的方式诱导(例如温度改变或化学诱导)，并将细胞再培养一段时间。可将工程化的宿主细胞在经修饰的适于激活启动子(如果需要)、选择转化体或扩增本发明基因的标准营养培养基中培养。培养条件如温度、pH等可以是先前选择用于表达的宿主细胞使用的那些条件，而且是本领域熟练的技术人员熟知的。

细胞可以典型地通过离心收获、通过物理或化学方式破坏，并保留所得粗提物以进一步纯化。或者，当一种异源多肽从宿主细胞中分泌进培养液中时，培养液的上清可用作蛋白质的来源。用于蛋白质表达的微生物细胞可以通过任何方法破坏，所述方法包括冷冻-解冻循环、超声、机械破坏或使用细胞裂解剂。

所述多肽可以通过标准方法从重组细胞培养物中回收和纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水性相互作用层析、亲和性层析、羟磷灰石层析和凝集素层析等。如果需要，蛋白质再折叠步骤可用于完成成熟蛋白质的构型。最后的纯化步骤可应用高效液相层析(HPLC)。

除了上述从原核或真核宿主中重组生产多肽之外，本发明的多肽可以从天然来源中制备，或者可以通过化学合成方法制备(例如合成或半合成)，例如使用标准肽合成仪制备。也可以使用无细胞的翻译系统以使用衍生自本发明的DNA构建体的RNA产生这种蛋白质。本发明的蛋白质也可以在转基因动物或植物中表达，及从中分离和/或纯化。生产和使用这种转基因生物体的程序是本领域的标准程序。在本文另处描述了一些这种程序。

当然，重组多核苷酸、包含这种多核苷酸的载体和转移载体(例如用于基因治疗的病毒转移载体)也可以通过标准方法制备。例如，为制备腺病毒，例如包含本发明重组eNOS突变多核苷酸的腺病毒，可将感染的细胞离心并裂解，并将细胞裂解物进一步处理以从不需要的污染物如细胞成分中分离(例如纯化、分离)病毒。纯化腺病毒的标准程序是例如离心或膨胀床吸附层析以除去细胞碎片和/或浓缩病毒、大小排阻层析、离子交换(例如DEAE)层析、超速离心、超滤、等等。

本发明还涉及一种非人转基因动物，在其基因组内包含编码本发明多肽的多核苷酸的一或多个拷贝。本发明的转基因动物在其基因组内可含有编码本发明多肽的多核苷酸的多个拷贝，或者编码这种多肽的基因的一个拷贝，但其中所述基因与一个启动子(例如可调节启动子)连接，这将指导eNOS多肽突变体在所述转基因动物的一些或全部细胞中表达(优选过表达)。在一个优选的实施方案中，本发明的eNOS多肽突变体的表达优先在血管组织中发生。可保证本发明的eNOS突变体优先在希望的部位表达的调节序列，如组织特异性启动子或增强子，是本领域熟知的。一些这种调节元件在本文另处加以论述。本发明涵盖了许多非人转基因生物体，包括例如果蝇、C.elegans、zebrafish和酵母。本发明的转基因动物优选是哺乳动物，例如牛、山羊、绵羊、兔、非人灵长类动物或大鼠，最优选是小鼠。

生产转基因动物的方法是为本领域技术人员所熟知的，包括例如同源重组、诱变(例如ENU，Rathkolb et al.，Exp.Physiol.，85(6)：635-644，2000)，及四环素调节的基因表达系统(见例如U.S.Pat.No.6,242,667；Wu et al，Methods in Gene Biotechnology，CRC 1997，pp.339-366；Jacenko，O.，Strategies in Generating Transgenic Animals，in Recombinant Gene ExpressionProtocols，Vol.62 of Methods in Molecular Biology，Humana Press，1997，pp399-424)。

转基因生物体用于例如提供本发明的多核苷酸或多肽的来源，或者鉴别和/或鉴定调节这种多核苷酸或多肽表达和/或活性的制剂。转基因动物也用作与例如本发明的突变的多核苷酸或多肽的表达相关的病症的模型。

本发明还涉及一种转基因非人动物，其基因组包含编码本文所述突变的eNOS的一或多个基因以代替另外的编码述多肽的哺乳动物基因。剔除eNOS基因并将其用一个突变基因置换的方法是已知的(见例如Murohara1998(如前述)描述了一种小鼠，其中已经剔除了eNOS基因)。优选地，所述转基因动物是小鼠或大鼠。

除了上述方法之外，转基因动物(或者剔除动物，其中插入一个转基因以置换剔除的基因)可以根据已知方法制备，包括例如通过将重组基因原核注射入单细胞胚胎的原核中，将一种人工酵母染色体掺入胚胎干细胞中，基因定向方法，胚胎干细胞方法学，克隆方法，核转移方法。也见例如U.S.Patent Nos.4,736,866、4,873,191、4,873,316、5,082,779、5,304,489、5,174,986、5,175,384、5,175,385、5,221,778；Gordon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，77：7380-7384，1980；Palmiter et al.，Cell，41：343-345，1985；Palmiter et al.，Ann.Rev.Genet.，20：465-499，1986；Askew et al.，Mol.Cell.Bio.，13：4115-4124，1993；Games et al.Nature，373：523-527，1995；Valancius and Smithies，Mol.Cell.Bio.，11：1402-1408，1991；Stacey et al.，Mol.Cell.Bio.，14：1009-1016，1994；Hasty et al.，Nature，350：243-246，1995；Rubinstein et al.，Nucl.Acid Res.，21：2613-2617，1993；Cibelli et al.，Science，280：1256-1258，1998所述。重组酶切割系统的指导见例如U.S.Pat.Nos.5,626,159、5,527,695和5,434,066所述。也见Orban，P.C.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：6861-6865(1992)；O′Gorman，S.，et al.，Science，251：1351-1355(1991)；Sauer，B.，et al.，Polynucleotides Research，17(1)：147-161(1989)；Gagneten，S.et al.(1997)Nucl.Acids Res.25：3326-3331；Xiaoand Weaver(1997)Nucl.Acids Res.25：2985-2991；Agah，R.et al.(1997)J.Clin.Invest.100：169-179；Barlow，C.et al.(1997)Nucl.Acids Res.25：2543-2545；Araki，K.et al.(1997)Nucl.Acids Res.25：868-872；Mortensen，R.N.et al.(1992)Mol.Cell.Biol.12：2391-2395(G418 escalation方法)；Lakhlani，P.P.et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：9950-9955(“hit and run”)；Westphal and Leder(1997)Curr.Biol.7：530-533(转座子产生的“剔除”和“敲入(knock-in)”)；Templeton，N.S.et al.(1997)Gene Ther.4：700-709(用于有效基因靶向的方法，使得可以发生高频率同源重组事件，例如无需选择标记)；PCT国际公开WO 93/22443(功能性破坏)所述。

为产生转基因动物，本发明的eNOS多核苷酸可以导入任何非人动物中以产生转基因动物，所述非人动物包括非人哺乳动物，例如小鼠(例如Hogan et al.，Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1986)、猪(例如Hammer et al.，Nature，315：343-345，1985)、羊(例如Hammer et al.，Nature，315：343-345，1985)、牛、大鼠或灵长类动物(例如Church，1987，Trends inBiotech.5：13-19；Clark et al.，Trends in Biotech.5：20-24，1987及DePamphilis et al.，BioTechniques，6：662-680，1988所述)。转基因动物可以通过U.S.Pat.No.5,994,618所述的方法产生(或增殖)，并用于本发明所述的任何用途。

eNOS多肽结合配偶体

本发明的eNOS多肽突变体或其变体，或者表达它们的细胞，也可以用于分析特异性结合配偶体，例如特异性结合本发明eNOS多肽突变体的蛋白质和核酸。这种结合配偶体包括例如激酶、磷酸酶和钙调蛋白。另外，本发明的eNOS多肽突变体可用作免疫原以产生特异性抗体或抗原结合片段。可以使用本文所述或本领域已知的标准方法分析并分离eNOS多肽突变体的这种特异性结合配偶体。

“特异性”抗体或抗原结合片段是指选择性(优先)结合本发明eNOS或其片段或变体，特别是结合本发明突变的序列的抗体或抗原结合片段。“特异于”多肽的抗体是指该抗体识别所述多肽内的或多肽包含的一个限定的氨基酸序列。

本发明的抗体可例如是多克隆或单克隆抗体。本发明还包括嵌合的、重组的、单链的及部分或完全人源化的抗体，以及Fab片段，或者Fab表达文库的产物，及其片段。所述抗体可以是IgM、IgG、亚型、IgG2A、IgG1、等。可以使用本领域已知的各种方法产生这种抗体和片段。

针对相应于本发明一个序列的多肽产生的抗体可以例如通过如下方法获得，直接将该多肽注射入动物中，或者将该多肽给予动物如山羊、兔、小鼠、鸡等，优选给予非人动物。如此获得的抗体然后自身结合所述多肽。以这种方式，即使只编码本发明多肽一个片段的序列也可以用于产生结合完整天然多肽的抗体。这种抗体然后可用于从表达该多肽的组织中分离该多肽。抗体也可以通过给予裸DNA而产生。见例如USP No.5,703,055、5,589,466和5,580,859所述。

为制备单克隆抗体，可以使用通过连续细胞系培养产生抗体的任何技术。产生人单克隆抗体的所述技术例如包括杂交瘤技术(Kohler and Milstein，1975，Nature，256：495-497)、三瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor et al.，1983，Immunology Today 4：72)及EBV-杂交瘤技术(Cole，et al.，1985，inMonoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。

生产单链抗体的技术(例如U.S.Patent 4,946,778所述)可适于生产本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。另外，转基因动物可用于表达本发明的免疫原性多肽的部分或完全人源化的抗体。

本发明还涉及其它特异性结合配偶体，包括例如适体(aptamers)和PNA。

eNOS多肽突变体及编码这种eNOS多肽的多核苷酸的诊断、预防和治疗应用

内皮NO合酶参与许多功能和活性，例如本文所述的功能和活性；这些eNOS多肽的异常表达和/或活性，和/或由这些酶产生的NO的异常数量，与许多疾病相关。因此，本发明的eNOS多肽突变体和多核苷酸及其变体可用于调节细胞中eNOS活性，以改善这种病症。

在一些实施方案中，eNOS的表达和/或活性增加及随之eNOS产生的NO量的增加与例如不利的血管发生相关，不利的血管发生例如导致不利的细胞增殖、肿瘤生长或各种致瘤性疾病。与NO产生增加相关的病症是例如各种致瘤性疾病(包括癌发生、肿瘤发生及转移癌增殖)、恶性肿瘤对放疗或化疗的抗性、膀胱癌转移或否(cystadenocarcinoma)、血管肉瘤和增殖性视网膜病。

在一些实施方案中，eNOS的表达和/或活性降低及伴随的eNOS产生的NO量的降低与许多疾病相关，例如与过度血管收缩和/或不充分的血管舒张相关的病症，所述病症例如周围肢体缺血、周围动脉闭塞性疾病(PAOD)和重症肢体缺血(CLI)、动脉硬化或血管血栓症；心肌缺血，如由于冠状动脉狭窄引起的血流受限所致；再狭窄，例如在球囊血管成形术后；高血压，肺动脉高压，阻塞性呼吸道疾病，移植动脉硬化，主动脉瘤，高胆固醇血症，衰老，炎症，吸烟的后果、充血性心力衰竭，妊娠毒血症，糖尿病，血管发生缺陷疾病，Raynaud′s现象，Prinzmetal′s绞痛(冠状动脉痉挛)，脑血管痉挛，溶血性尿毒症，勃起功能障碍及伤口愈合不佳。

与NO的异常低量相关的其它病症包括心功能不全、心衰、缺血性心肌病、扩张性心肌病或移植后心肌病、心绞痛(包括不稳定性心绞痛)、冠状动脉痉挛、移植后冠心病、高胆固醇血症、高血脂、高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia)、糖尿病(胰岛素依赖型或非依赖型)的血管副作用、慢性肾功能不全(尿毒症)的血管副作用、各种缘由的内皮功能失调(动脉硬化、烟瘾、X综合征、肥胖、高血压、血脂异常(dyslipidemia)、胰岛素抗性)、系统或自身免疫性脉管炎、高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia)、buerger angeitis、血管栓塞疾病(thrombo-embolicdisease)、深或浅静脉血栓、血管区内动脉不足的动脉硬化(局部缺血，包括脑缺血或冠状动脉缺血)、肺动脉高压、血液透析或腹膜透析的副作用。

NO的量不足还与不希望的子宫平滑肌收缩或子宫颈松弛相关；由此本发明突变的eNOS用于例如给予子宫而预防先兆流产，或者给予子宫颈而刺激或诱导分娩。与NO的量不足相关的其它病症包括子痫前期(preeclampsia)、痛经和尿失禁。

给予本发明的eNOS多肽突变体还用于调节免疫应答。例如，本发明的eNOS多肽可以导入T细胞、血小板、中性粒细胞、单核细胞或NK细胞以调节其活性。通过这种措施可受益的病症包括例如动脉硬化、炎症疾病或自身免疫疾病。

不希望限于任何特殊理论或机制，预期本发明的eNOS多肽突变体通过促进糖和脂肪酸的代谢以及改善肌细胞的营养和氧供给而有益于治疗缺血性心脏病。

本发明提供了在体外或体内(例如在基于细胞的分析或在动物模型内)筛选物质的方法，以鉴别调节eNOS多肽的合成和/或活性的那些物质。这种方法可应用本发明突变的eNOS多肽或多核苷酸或其变体。抑制这种合成和/或活性的物质(拮抗剂)可例如导致患者细胞内NO水平降低及因此引起生理学改变。增强这种合成和/或活性的物质(激动剂)可例如提高受影响的细胞内NO的水平。例如，本发明涉及鉴别eNOS表达的调节剂的方法，包括测试推定的调节剂增加或降低本发明eNOS多肽突变体的例如作为钙调蛋白和/或钙离子浓度函数的磷酸化或活性的能力，或者调节本文所述的任何eNOS活性的能力。监测这种活性的分析方法是本领域中的标准方法而且是为技术人员熟知的。

抑制eNOS表达和/或活性的物质可用于治疗、预防和/或改善与eNOS过表达或活性增加相关的病症；增强这种活性的物质可用于治疗、预防和/或改善与eNOS的表达低下或活性降低相关的病症。eNOS多肽的抑制剂(例如eNOS活性或表达的抑制剂)可用于治疗在本文另处描述的与eNOS的过表达或活性增加相关的任何病症。本发明的eNOS多核苷酸或多肽突变体的刺激剂可用于例如治疗在本文另处描述的与eNOS的表达低下或活性降低相关的任何病症。

在潜在的拮抗剂或激动剂的分析试验中，可应用与eNOS相关的各种功能/或酶活性。典型的功能和活性在本文另处揭示。可在体外、来自体内(ex vivo)或在体内进行分析，并可以使用任何合适的细胞或组织进行。体内分析可使用例如已经描述的转基因小鼠或者一种人源化小鼠进行，所述人源化小鼠中存在编码所述突变的人eNOS的一种人类基因以代替编码这种多肽突变体的小鼠基因。

本文所述的任何分析当然可以适应于各种高通量方法学，可以产生、鉴别和鉴定推定的抑制剂或刺激剂。基于其调节eNOS表达或活性的能力而鉴别的物质也可以用于调节其它eNOS野生型或突变的多肽，和/或用于诊断或治疗与一或多种eNOS活性相关的病症。

本发明的潜在的调节剂例如抑制剂或激活剂包括例如小的化合物(例如非有机或有机分子)、多肽、肽或肽多肽突变体、多核苷酸、特异性结合本发明多肽的抗体，等等。其它抑制剂或刺激剂可以进入细胞并直接结合与编码本发明多肽的序列相邻的DNA，从而降低其表达并因此降低胞内NO的水平，或者提高其表达并因此提高胞内NO的水平。

本发明提供了一种诊断或确定包含NO水平变化的实际或潜在疾病或病症的阶段的方法(例如所述疾病或病症是由eNOS的产生或活性介导的或与之相关)，所述方法通过确定怀疑具有这种疾病或病症或者处于这种危险之中的动物体(例如需要治疗的患者)内本发明的eNOS多肽突变体的量(例如存在与否，或数量)或者其活性水平而进行。例如，本发明提供了一种诊断患病动物的疾病的方法，或者一种诊断处于患病危险中的动物对所述疾病的易感性的方法，其中所述疾病与例如特定的细胞、组织或器官中存在本发明的突变相关，这导致细胞、组织或器官中NO水平的不利地增加或降低，其中所述动物是哺乳动物，更优选是人。这种诊断方法可应用在本文另处描述的任何分析试验。例如，可以使用基于本发明的抗体或抗原特异性片段的方法检测突变的多肽。免疫学分析包括例如ELISA、RIA和FACS分析。当为了诊断而分析样品时，样品可得自患者的任何合适的细胞、组织、器官或体液，包括但非限于血液、尿液、唾液、组织活检和尸检材料。

本发明的eNOS多肽突变体的检测也可用于研究目的，例如筛选已经用携带这种突变体的质粒转染的细胞以鉴别携带所述突变的那些细胞的研究中。

根据本发明，抗体或抗原结合片段可存在于一个试剂盒中，该试剂盒包含例如一或多个抗体或抗原结合片段，一种希望的缓冲液，检测组合物，用作对照的蛋白质(例如本发明的eNOS突变体)。

包含多核苷酸的分析可用于确定样品中本发明的突变的eNOS核酸的存在与否和/或对其定量。这种分析可用于例如诊断、预测、研究或法医学目的。所述分析可例如是基于膜、基于溶液或基于芯片的分析。

可以使用任何合适的分析形式，包括但非限于Southern印迹分析，Northern印迹分析，聚合酶链反应(PCR)(例如Saiki et al.，Science，241：53，1988；U.S.Pat.Nos.4,683,195、4,683,202和6,040,166；PCR Protocols：AGuide to Methods and Applications，Innis et al.，eds.，Academic Press，NewYork，1990所述)，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)，锚式PCR，cDNA末端快速扩增(RACE)(例如Schaefer，Gene Cloning and Analysis：CurrentInnovations，Pages 99-115，1997)，连接酶链反应(LCR)(EP 320 308)，限性(one-sided)PCR(Ohara et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，86：5673-5677，1989)，指示(indexing)方法(例如U.S.Pat.No.5,508,169)，原位杂交，示差展示(例如Liang et al.，Nucl.Acid.Res.，21：3269-3275，1993；U.S.Pat.Nos.5,262,311、5,599,672和5,965,409；WO97/18454；Prashar andWeissman，Proc.Natl.Acad.Sci.，93：659-663及U.S.Pat.Nos.6,010,850和5,712,126；Welsh et al.，Nucleic Acid Res.，20：4965-4970，1992和U.S.Pat.No.5,487,985)及其它RNA指纹法技术，基于核酸序列的扩增(NASBA)及其它基于转录的扩增系统(例如U.S.Pat.Nos.5,409,818和5,554,527；WO88/10315)，多核苷酸阵列(例如U.S.Pat.Nos.5,143,854，、5,424,186、5,700,637、5,874,219和6,054,270；PCT WO 92/10092；PCT WO90/15070)，Qbeta复制酶(PCT/US87/00880)，链置换扩增(SDA)，修复链反应(RCR)，核酸酶保护分析，基于扣除的方法(subtraction-basedmethos)或Rapid-Scan^TM。

其它有用的方法包括但非限于例如基于模板的扩增方法，竞争PCR(例如U.S.Pat.No.5,747,251)，基于氧化还原反应的分析(例如U.S.Pat.No.5,871,918)，基于Taqman的分析(例如Holland et al.，Proc.Natl.Acad，Sci.，88：7276-7280，1991；U.S.Pat.Nos.5,210,015和5,994,063)，基于实时(real-time)荧光的监测(例如U.S.Pat.5,928,907)，分子能量转移标记(例如U.S.Pat.Nos.5,348,853、5,532,129、5,565,322、6,030,787和6,117,635；Tyagi and Kramer，Nature Biotech.，14：303-309，1996)。可以使用适于基因或蛋白质表达的单细胞分析的任何方法，包括原位杂交、免疫细胞化学、MACS、FACS、流式细胞计量术，等等。为进行单细胞分析，表达产物可以使用抗体、PCR或其它类型的核酸扩增方法测定(例如Brady et al.，Methods Mol.& Cell.Biol.2，17-25，1990；Eberwine et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.，89，3010-3014，1992；U.S.Pat.No.5,723,290)。这些及其它方法可常规进行，如引用的参考文献所述进行。

本发明还提供了诊断患病动物的疾病的方法，或者诊断处于患病危险中的动物对该疾病的易感性的方法，其中所述疾病与例如编码eNOS多肽的多核苷酸的表达相关，所述方法包括确定来自该动物的细胞中所述多核苷酸的量，其中所述动物优选是哺乳动物，最优选是人。可以使用本文所述的及本领域已知的任何分析方法确定这种多核苷酸的存在与否和/或对其定量。

编码部分或全部本发明eNOS多肽突变体的多核苷酸序列可作为开发探针的参考，例如30-45个或更长的核苷酸可用于例如探查怀疑处于患病危险中的或患病动物的基因组；或者用于检测这种突变的多核苷酸以进行研究，例如在筛选已经用携带这种突变体的质粒转染的细胞以鉴别包含所述突变的那些细胞的研究中。

这种类型的杂交探针优选有至少7或8个碱基，更优选有大约10、11、12、13、14或15个碱基，最优选有至少大约30个碱基，并呈现与编码本发明的eNOS多肽突变体的部分或全部序列有大约65-100％的相同性。杂交探针特异于所选择的多肽。术语“特异于”一种多核苷酸是指探针可用于鉴别样品中一或多种靶基因或多核苷酸的存在情况。该探针是特异的是指其可用于在背景干扰(非特异性结合)之上检测多核苷酸。

根据本发明，多核苷酸可以存在于一个试剂盒中，其中所述试剂盒包含例如一或多种多核苷酸(如杂交探针)，一种希望的缓冲液(例如磷酸盐缓冲液，Tris，等等)，检测组合物，用作对照的RNA或cDNA(例如包含本发明的突变体)，文库，等等。所述多核苷酸可以是用本领域已知的放射性或非放射性标记进行标记或是未标记的。

本发明还涉及抗击本文所述的eNOS介导的或与之相关的疾病或病症的治疗或预防方法，所述方法是例如给予影响eNOS的产生和/或活性的物质，或者给予一种如本发明的突变的eNOS多肽或多核苷酸的物质。这种治疗可抑制或改善这种疾病或病症。

这种物质可通过标准程序给予需要治疗的患者。合适的给予途径是本领域技术人员熟知的，包括但非限于血管内、肌内、腹膜内、皮内、动脉内、和口服途径。

这种物质可使用标准方法配制为包含药物可接受的赋形剂、载体等的药物组合物。增强物质穿过细胞膜转移(促进渗透)或者防止降解的配方和赋形剂是本领域技术人员所熟知的。例如，一种输送载体(就体内或来自体内转移而言，例如多核苷酸)可以通过任何标准方法输送至靶细胞，所述方法包括例如脂质体介导的转染，其中脂质体例如是含有胆固醇衍生物如SF-chol或DC-chol的阳离子脂质体；脂转染胺转染，等等。典型的方法例如USP 5,656,565；Mannino et al.(1988)Bio Techniques 6，682-690及本文的参考文献以及Gao et al.(1991)Biochem Biophys Res Comm 179，280-285所述。

在一个实施方案中，给予患有与eNOS活性相关的病症的患者的物质是局部给予表现疾病病症的部位。这种局部给予可避免由NO在非疾病相关的细胞或组织中引起的不必要的作用(例如副作用)。

例如，分子可直接给予心脏或骨骼肌，包括心肌细胞和骨骼肌细胞。本发明的多肽或多核苷酸可通过直接冠脉内(或经导管)注射而输送至心肌组织，使用标准的基于经皮导管方法在荧光镜引导下，例如在足以使转基因表达至达到高效治疗的程度的量进行。所述注射可深入冠状动脉(或导管)内腔(例如在动脉内腔内大约1cm)，优选在两侧冠状动脉内进行，因为侧支血管的生长在各个患者体内是高度变化的。通过冠状动脉导管直接将材料注射入冠状动脉的内腔中，可以有效定向基因，及在注射期间最小程度地损失最接近主动脉的重组载体或多肽。当以这种方式输送时，基因表达在肝细胞中不发生，而且在冠脉内注射后的任何时间均不能发现病毒RNA。本发明可使用任何冠脉导管或者例如Stack灌注导管。另外，可以使用本领域技术人员已知的其它技术将本发明的突变的eNOS转移至动脉壁。也见于Giordano et.al.，(1994)Clin Res 42，123A所述。

为治疗外周血管疾病，特征在于腿部血供不足的疾病，本发明的多核苷酸可以通过插入股动脉近端部分的导管输送，从而实现转移进接受股动脉血供的骨骼肌细胞中。见例如USP 5,792,453所述。

本发明的药物也可以使用标准方法直接转移进脑或脊髓，子宫或子宫颈(例如以乳液或形式)，或者任何希望的部位。

在另一个实施方案中，治疗分子(例如本发明突变的多肽或多核苷酸)是使用标准方法系统地给予的，但该标准方法经改良以便其定向于感兴趣的细胞、组织或器官。例如，多核苷酸可以置于组织特异性调节元件的控制下，如启动子或增强子元件。

例如通过将左心室肌球蛋白轻链-2(MLC[2V])或肌球蛋白重链的组织特异性转录控制序列与一种转基因如本发明的eNOS基因在一个构建体如腺病毒构建体内融合，则转基因表达限于心室心肌细胞。由MLC[2V]和MHC启动子及lacZ提供的基因表达的效力和特异性的程度已经使用重组腺病毒系统确定。心脏特异性表达已经由Lee等报道(J.Biol.Chem.267：15875-15885(1992))。MLC[2V]启动子由250bp组成，并易于适合例如腺病毒-5包装限制。肌球蛋白重链启动子，已知是强转录启动子，提供了另一种合理的心脏特异性启动子并由少于300bp组成。也可以使用骨骼肌特异性启动子(见例如Hauser et al.(2000)Mol.Therapy 2：16-26；Li et al.(1999)Nature Biotech.17：241-245；及Patent WO 99/02737所述)。也可利用平滑肌细胞启动子如SM22α启动子(Kemp et al.，(1995)Biochem J 310(Pt3)：1037-43)和SMα肌动蛋白启动子(Shimizu et al.(1995)J Biol Chem270(13)：7631-43)。通过使用这种组织特异性启动子及在体内输送转基因，确信心肌细胞单独(即在内皮细胞、平滑肌细胞和心脏内的成纤维细胞中不伴随表达)即能提供本发明的eNOS多肽突变体的足够的表达。

限于心肌细胞或骨骼肌细胞的表达对基因转移在治疗临床心肌缺血或外周缺血的用途中也有益处。通过限于心脏或骨骼肌表达，可避免血管发生在如视网膜的组织中的潜在有害作用。另外，在心脏的细胞中，肌细胞可能提供最长时间的转基因表达，因为该细胞不进行快速更新，因此表达不会如内皮细胞那样由细胞分裂和死亡而导致降低。

用于这种或其它目的的内皮特异性启动子是可以获得的。内皮特异性启动子的实例包括Tie-2启动子(Schlaeger et al.(1997)Proc Natl Acad Sci1；94(7)：3058-63)，内皮缩血管肽启动子(Lee et al.(1990)J.Biol.Chem.265：10446-10450及eNOS启动子(Zhang et al.(1995)J Biol.Chem270(25)：15320-6和Bu and Quertermous(1997)J.Biol.Chem.272：32613-32622)。

在本发明的一个实施方案中，将eNOS多肽突变体或其变体给予需要这种治疗的患者，这种多肽可例如补偿eNOS的降低或异常的表达或活性，包括例如患者的细胞、组织或器官中异常低水平的NO。在另一个实施方案中，本发明的方法涉及特别是在周围血管疾病，心肌缺血或重症肢体缺血(CLI)患者中一种刺激内源性血管发生不足的缺血性疾病中侧支血管发生的方法，所述方法包括给予本发明的eNOS多肽突变体。

在一个优选的实施方案中，对eNOS多肽突变体进行修饰以增强其进入细胞的能力。例如，在感兴趣的多肽的N末端融合HIV-TAT多肽的一种融合多肽YGRKKRRQRRR(也称为蛋白质转导结构域，PTD)可以在大肠杆菌中产生，并纯化变性形式的蛋白质。可以将这种融合多肽(例如PTD-eNOS)导入患者中以进行治疗。将变性的全长蛋白质转导入细胞中的方法在本领域已经有描述(见例如Nature Medicine(1998)Vol.4(12)：1449所述)。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种治疗特征在于细胞或组织具有异常eNOS低活性或低量的病症，所述方法包括给予一种编码本发明突变的eNOS多肽的多核苷酸，即一种基因治疗方法，其中本发明的多核苷酸在一种基因输送载体中被输送。这种方法可用于治疗在本文另处描述的任何病症。例如，本发明涉及一种特别是在周围血管疾病和/或心肌缺血患者中刺激内源血管发生不足的缺血性疾病中侧支血管发生的方法，所述方法包括给予编码本发明突变的eNOS多肽的一种转基因。

所述基因输送载体可以是病毒或非病毒来源的(通常见Jolly，CancerGene Therapy 1：51-64(1994)Kimura，Human Gene Therapy 5：845-852(1994)；Connelly，Human Gene Therapy 1：185-193(1995)和Kaplitt，Nature Genetics6：148-153(1994)所述)。用于输送构建体包括例如本发明的治疗性编码序列的基因治疗载体可以局部或系统地给予。这些构建体可利用病毒或非病毒载体方案。这种编码序列的表达可以使用内源哺乳动物或异源启动子诱导。编码序列的表达可以是组成型或可调节的。

本发明可应用重组逆转录病毒，构建这种重组逆转录病毒以携带或表达一种选择的感兴趣的核酸分子。可应用的逆转录病毒载体包括EP 0 415731；WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；U.S.Patent No.5,219,740、WO 93/11230、WO 93/10218；Vile and Hart，CancerRes.53：3860-3864(1993)；Vile and Hart，Cancer Res.53：962-967(1993)；Ram et al.，Cancer Res.53：83-88(1993)；Takamiya et al.，J.Neurosci.Res.33：493-503(1992)；Baba et al.，J.Neurosurg.79：729-735(1993)；U.S.PatentNo.4,777,127；GB Patent No.2,200,651；EP 0 345 242及WO 91/02805中描述的那些载体。

适于与上述逆转录病毒载体构建体一起使用的包装细胞系可易于制备(见例如PCT出版物WO 95/30763和WO 92/05266所述)，并用于产生生产细胞系(也称为载体细胞系)以生产重组载体颗粒。在本发明优选的实施方案中，包装细胞系是从人体(如HT1080细胞)或水貂亲代细胞系中产生的，从而允许在人血清中可不被失活的重组逆转录病毒的产生。

本发明的方法也可以应用基于α病毒的载体，其作为基因输送的载体。这种载体可以从各种α病毒中构建，包括例如Sindbis病毒载体、Semliki森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、Ross River病毒(ATCCVR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCCVR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532)。这种载体系统的代表性实例包括如U.S.Patent Nos.5,091,309、5,217,879和5,185,440；及PCT出版物Nos.WO 92/10578、WO 94/21792、WO 95/27069、WO 95/27044和WO95/07994所述那些载体系统。

本发明的基因输送载体也可使用细小病毒如腺伴随病毒(AAV)载体。代表性实例包括由Srivastava在WO 93/09239中、Samulski et al.，J.Vir.63：3822-3828(1989)、Mendelson et al.，Virol.166：154-165(1988)及Flotte etal.，P.N.A.S.90：10613-10617(1993)中揭示的AAV载体。

在一个优选的实施方案中，使用腺病毒载体。本领域熟知许多修饰的腺病毒载体(例如Ad5或Ad2的修饰的载体)，特别是非复制性载体和/或不依赖辅助病毒的病毒。腺病毒载体的代表性实例包括由Berkner，Biotechniques 6：616-627(Biotechniques)；Rosenfeld et al.，Science 252：431-434(1991)；WO 93/19191；Kolls et al.，P.N.A.S.215-219(1994)；Kass-Eisler et al.，P.N.A.S.90：11498-11502(1993)；Guzman et al.，Circulation88：2838-2848(1993)；Guzman et al.，Cir.Res.73：1202-1207(1993)；Zabneret al.，Cell 75：207-216(1993)；Li et al.，Hum.Gene Ther.4：403-409(1993)；Cailaud et al.，Eur.J.Neurosci.5：1287-1291(1993)；Vincent et al.，Nat.Genet.5：130-134(1993)；Jaffe et al.，Nat.Genet.1：372-378(1992)及Levreroet al.，Gene 101：195-202(1992)所述的那些载体。本发明中可应用的腺病毒基因治疗载体的实例还包括在WO 94/12649、WO 93/03769、WO93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984和WO 95/00655中所述的那些载体。可以应用给予与如Curiel，Hum.Gene Ther.3：147-154(1992)所述灭活腺病毒连接的DNA。

还可以应用其它基因输送载体和方法，包括与灭活腺病毒单独连接或不连接的聚阳离子浓缩DNA，例如Curiel，Hum.Gene Ther.3：147-154(1992)所述；配体连接的DNA，例如见Wu，J.Biol.Chem.264：16985-16987(1989)所述；真核细胞输送载体，例如见1994年5月9日提请的U.S.Serial No.08/240,030，及U.S.Serial No.08/404,796所述；光聚水凝胶材料的沉积；手持基因转移粒子枪，如U.S.Patent No.5,149,655所述；致电离辐射，如U.S.Patent No.5,206,152及WO 92/11033所述；核电荷中和或与细胞膜融合。另外的方法见Philip，Mol.Cell Biol.14：2411-2418(1994)核Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.91：1581-1585(1994)所述。

也可以应用裸DNA。裸DNA导入方法的实例见WO 90/11092和U.S.Patent No.5,580,859所述。使用生物可降解的乳胶珠可改善摄取效力。DNA包被的乳胶珠在胞吞开始后被有效运至细胞中。所述方法可以通过对所述珠进行处理而加以改良以提高疏水性及从而促进内体的破坏和DNA释放入细胞质中。可作为基因输送载体的脂质体见U.S.Patent No.5,422,120，PCT Patent Publication Nos.WO 95/13796、WO 94/23697和WO 91/14445，及EP No.0 524 968所述。

适于使用的其它非病毒输送包括机械输送系统，如Woffendin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(24)：11581-11585(1994)所述的方案。另外，这种编码序列和表达产物可以通过光聚水凝胶材料的沉积而输送。可用于输送编码序列的其它基因输送的标准方法包括例如使用手持基因转移粒子枪，如U.S.Patent No.5,149,655所述；使用致电离辐射以激活转移的基因，如U.S.Patent No.5,206,152和PCT Patent Publication No.WO92/11033所述。

将多核苷酸给予需要治疗的患者的基因治疗方法可以在体内(为患者直接给予多核苷酸)或来自体内(基于细胞的治疗，包括将所述多核苷酸导入细胞，如取自进行治疗的患者的细胞，或者不是取自进行治疗的患者的细胞，然后将该转染的细胞导入患者体内)进行。

本发明的突变的eNOS多肽或多核苷酸可以单独给予或者在给予eNOS之前、期间或之后与其它药剂组合给予，所述其它药剂例如血管发生因子，包括但非限于FGF、HGF、VEGF和bFGF，尤其是VEGF或bFGF。制备、给予及测试这种生长因子的方法是本领域中的标准方法。见例如Papapetropoulos et al.，(1997)J Clin Invest 100，3131-3139，Brock etal.，(1991)Am J Pathol 138，213-221和Ku et al.，(1993)Am J Physiol.265，H586-592所述。可以使用标准程序将这种生长因子克隆入合适的表达载体中(单独或克隆入表达本发明eNOS多核苷酸的载体中)。见例如Rivardet al.，(1999)Am J Pathol 154，355-363描述的一种通过使用VEGF进行肌内基因治疗而诱导血管发生的方法。

在前述和如下的实施例中，所有温度均设定为摄氏度，除非特别说明，所有部分和百分比均是就重量而言。

如下实施例只是例证了本发明而无限制本发明之意。

实施例

实施例1：eNOS多肽突变体及重组质粒和病毒载体

产生编码具有单氨基酸取代或双氨基酸取代的eNOS多肽的质粒载体，以用于在细胞中进行体外和体内的eNOS野生型和多肽突变体的质粒载体输送以及表达。使用Kunkel定点诱变(Kunkel，T.A.PNAS 1985；82：488-492)直接在eNOS多核苷酸序列中产生突变体。通过测序证实突变。将野生型突变构建体的cDNA克隆入质粒载体pShuttle-CMV中，编码eNOS多肽的多核苷酸置于CMV表达盒内。因此在这些构建体中，多核苷酸可操纵地与一个CMV启动子连接，由此该启动子驱动所编码的eNOS多肽突变体在细胞中的表达。

在具有单氨基酸取代的eNOS多肽突变体中，相应于人eNOS的钙调蛋白结合位点中第495位的Thr(见图1)被取代为Ala、Asp或Val(分别称为突变体T495A、T495D、T495V)。在具有双氨基酸取代的eNOS多肽突变体中，相应于第1177位的Ser被取代为Asp，相应于第495位的Thr被取代为Ala、Asp或Val(分别称为T495A+S1177D、T495D+S1177D、T495V+S1177D)。这些突变通过测序并测试HEK 293细胞中NO的产生而证实(实施例2和图2)。

如He et al(1998)PNAS 95(5)，2509-2514所述产生编码上述具有单突变或双突变的eNOS多肽的腺病毒载体，以用于在细胞中进行体外和体内的eNOS野生型和多肽突变体的病毒载体输送。携带编码eNOS多肽突变体的多核苷酸的pShuttle载体(如上述)，与含有缺失E1和E3的Ad5基因组的一个质粒共转化进大肠杆菌BJ5183中。该腺病毒载体的主链衍生自腺病毒5。在这个载体主链中，腺病毒序列的E1区域在核苷酸454-3333之间缺失，部分E3缺失(核苷酸30004-30750)由645bp的外源DNA置换。在E1缺失位置可以插入一个多核苷酸，由此CMV启动子(在-632至+7)和SV40聚腺苷酸化信号可操纵地与该多核苷酸连接以表达由该多核苷酸编码的多肽。

然后选择编码eNOS多肽突变体的所得重组腺病毒质粒，并通过限制性内切酶分析而证实。相应的病毒通过用从该质粒切下的重组腺病毒基因组转染293细胞而拯救，然后将该病毒在293细胞中扩增，通过标准CsCl梯度纯化方法纯化，并用于测试HAEC中NO的产生(实施例3和图3)。

另外，eNOS多肽突变体NOS1177D(由Sessa et al.，Yale University提供)在相应于SEQ ID NO：1所示还原酶结构域中第1177位氨基酸残基的位置有一个氨基酸取代，被取代为Asp。为测试这种eNOS多肽突变体在细胞中的活性，将编码这个突变体的多核苷酸插入在腺病毒主链中缺失E1位置的部位(如实施例1上文所述)。所得的重组载体Ad5NOS1177D编码eNOS多肽突变体NOS1177D。将该重组载体Ad5NOS1177D转染进包装细胞中，并将所得病毒进行噬斑纯化，以及进行两轮扩增。来自第二次扩增的病毒用于在3L生物反应器中接种大规模感染的HEK293细胞。然后将所得病毒通过两次CsCl梯度分离而纯化，并用10mM Tris pH8.0，2mM MgCl₂和4％蔗糖透析。将纯化的重组病毒的等份也用于测试在HAEC中NO的产生(见实施例3，5和7)。

Ad5EGFP是一种对照物，是编码报道基因——绿色荧光蛋白(GFP)——的一种腺病毒载体，由Collateral Therapeutics制备，然后在HEK293细胞中扩增并通过FPLC纯化。经纯化的病毒然后用PBS pH7.2和2％蔗糖透析。将纯化的对照病毒的等份在-80℃贮存以在随后的实验中用作对照(见实施例5和7)。

实施例2：在HEK 293细胞中eNOS多肽突变体的检测及活性测定

为测试和测定在HEK 293细胞中eNOS多肽突变体的活性，将编码eNOS多肽突变体的质粒载体(如实施例1所述)用于输送及在HEK 293细胞中表达该多肽突变体。首先将HEK 293细胞铺板于6孔平板中，每孔中有含有10％FBS(SeraCare)、2mM额外的L-谷胺酰胺和50μg/ml庆大霉素的2ml生长培养基(Alpha MEM(Gibco 12561-056)。当细胞为大约75％铺满时，将它们用一种质粒穿梭载体转染，所述载体编码T495A、Thr495D或T495V eNOS多肽突变体(如实施例1所述)，或者编码野生型人(WT)eNOS(SEQ ID NO：1)，或者编码这两者。

转染如下进行：将8μg编码WT eNOS或突变的eNOS的质粒穿梭载体、60μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)和200l OptiMEM(Gibco)混和，在室温保温30分钟后，将111μl该混合物加上420μl OptiMEM加入含有HEK 293细胞的每个孔中。在37℃保温2.5小时后，向每个孔中加入2ml生长培养基。

两天后(在37℃、5％CO₂下保温细胞)，使用化学发光方法测定细胞产生的NO量，之后将细胞裂解并如下述使用ELISA分析裂解物的eNOS蛋白含量。将NO产量根据eNOS蛋白质的量归一化，以校正不同质粒之间转染效力中的差异。

NO产量的测定

除去培养基，并将每个孔均用2ml NO分析缓冲液(5mM NaHEPES，140mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl₂，10mM葡萄糖，10mM CaCl₂，5mM L-精氨酸，pH7.5)洗涤两次。然后将该缓冲液用含有100U/ml超氧化物歧化酶和40ng/ml VEGF的1ml NO分析缓冲液置换。将孔用石蜡膜覆盖，在37℃保温30分钟后，将细胞上的0.8ml缓冲液注射入Siemens NOA280化学发光检测仪中，根据厂商指导测定NO产量。真正的NO气用作标准。在完成NO测定后，除去细胞上剩余的缓冲液，并将细胞在0.6ml裂解缓冲液(0.5％NP-40，50mM Tris-HCl pH7.5，1μg/ml胃蛋白酶抑制剂A，1μg/ml亮抑蛋白酶肽，5μg/ml抑酶肽，24μg/ml Pefabloc SC(Boehringer Mannheim))中裂解，并在-20℃贮存。

eNOS蛋白质的测定：

将96孔ELISA平板(Costar 3590)每孔用100μl的于50mM碳酸钠缓冲液pH9.5中的5μg/ml包被抗体(兔多克隆抗eNOS)包被，并在4℃保温过夜。从用与匙孔嘁血蓝蛋白偶联的相应于人eNOS的第599-614位残基的肽免疫的兔中收集多克隆抗体(Babco)，使用蛋白质G琼脂糖凝胶(Amersham)纯化。将平板用在PBS+0.01％Tween 20中的200μl/孔的0.5％I-Block(Tropix)封闭，在4℃保温过夜。然后将平板用每孔350μl的PBS+0.5ml/L Tween 20洗涤3次。将含有eNOS的HEK 293细胞裂解物加入该平板中，用裂解缓冲液稀释5或10倍至终体积为60μl/孔，在室温保温1.5-2小时。然后将平板用每孔350μl的PBS+0.5ml/L Tween 20洗涤3次。

如下加入检测抗体，该检测抗体是如参考文献2所述用铕标记的一种单克隆抗eNOS抗体(Transduction Labs N30020)：于Wallac分析缓冲液(Wallac/PerkinElmer 1244-111)中的125ng/ml铕标记的抗体，100μl/孔。将平板在室温保温1.5小时。然后将平板用每孔350μl的PBS+0.5ml/LTween 20洗涤3次。加入Wallac增强溶液(Wallac/PerkinElmer 1244-105)，100μl/孔。将平板用平板密封器覆盖并在4℃贮存过夜，然后在混和10分钟后，将该平板在Wallac 1420 VICTOR²多标记计数器(PerkinElmer Life Sciences)中读数，在615nm监测时间分辨荧光(Aberle S.et al.，Nitric Oxide 1，226(1997)；Meurer J et al.，Methods in Enzymology 359，433-444(2002)。

结果表明eNOS多肽突变体刺激HEK 293细胞中NO的产生，而且单突变体T495A和T495V及双突变体T495A+S1177D和T495A+S1177D与野生型eNOS相比刺激增加水平的NO的产生(图2)。

实施例3：在HAE细胞中eNOS多肽突变体的检测及活性的测定

在含有10％FBS的4ml的EGM生长培养基(Cambrex)中以350,000个人主动脉内皮细胞(HAEC)/孔铺板6孔平板中。将细胞在37℃，5％CO₂条件下培养。第二天向每个孔中加入编码野生型或突变的eNOS(Thr495Ala，Thr495Asp，Thr495Val或Ser1177Asp)的腺病毒(2×10⁹个总病毒颗粒/孔，大约2×10⁷个感染性颗粒/孔)。在与该病毒保温4小时后，除去培养基并用补加了0.1％明胶和30μM墨蝶呤(Sigma)的2mlEBM生长培养基(Cambrex)置换。20小时后，使用化学发光方法测定由细胞产生的NO，之后将细胞裂解并使用ELISA分析裂解物的eNOS蛋白质含量。将NO产量根据eNOS蛋白质的量归一化，以校正由于用携带不同eNOS突变体的不同腺病毒构建体的转染效力中的不同所致表达水平中的变化。

结果表明eNOS多肽突变体刺激HEK 293细胞中NO的产生，单突变体T495A和T495D与野生型eNOS相比刺激升高水平的NO的产生(图3)。这项研究的结果与实施例2所述结果不同，在此项研究中是用VEGF刺激细胞以刺激NO释放，而在实施例2所述研究中使用钙离子载体。另外，腺病毒感染与用质粒DNA转染相比每个细胞产生更多的eNOS(及更多的NO)。因此，这项研究中eNOS的过表达可能有助于用eNOS多肽突变体所观测到的NO活性水平。

人主动脉内皮细胞含有内源的野生型eNOS，但从过表达的突变体eNOS中产生的NO的量是内源eNOS产生的NO量的大约20倍。在实施例2和3所述的数据中，将NO产量根据eNOS的量归一化，因此eNOS多肽突变体具有相同范围内的活性。很可能的是使用腺病毒载体和质粒载体，由不同的eNOS多肽突变体产生的NO的检测水平之间的不同是由于细胞中其它限制因素所致，如辅助因子的有效性所致。

因此，在HAEC中进一步测试eNOS多肽突变体可进一步阐明在不同类型的细胞中eNOS的表达和活性。

实施例4：用于确定不同eNOS同种型的小鼠骨骼肌裂解物的Westerm印迹

eNOS的不同同种型可以使用Western印迹分析检测，并通过本领域已知的标准方法分离。在这个实施例中，使用小鼠骨骼肌裂解物检测不同的小鼠eNOS同种型。

SDS-PAGE：

针对每个样品，将30μl肌组织匀浆加入含有100mM二硫苏糖醇的10μl 4x样品缓冲液(Invitrogen Cat.No.NP0007)中。在100℃加热7-8分钟后将每个样品加样于10％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶(BMA PAGErCat.No.59102)中。如果需要，加入含有重组人eNOS的1μl的HEK细胞裂解物(于40μl的1x样品缓冲液中)作为阳性对照。将预染色的蛋白质标记(10μl的Invitrogen LC5725)也加样于该凝胶的一条泳道中。将凝胶电泳在由Berlex media prep department提供的1x Laemmli电泳缓冲液中，在130V(恒定电压)电泳1.5小时。

在硝化纤维素上印迹：

在20V(恒定电压)电压下使用Novex/Invitrogen装置(将该装置预先在转移缓冲液中浸泡)，在2小时内将蛋白质移至硝化纤维素上。(转移缓冲液＝由Berlex media prep提供的100ml 10x转移缓冲液+200ml甲醇+700ml H₂O)。在印迹后，将硝化纤维素在4℃，在20ml TBS+5％脱脂乳粉中贮存过夜。(TBS＝0.02M Tris-HCl，0.12M NaCl，pH7.5)。

使用抗体对蛋白质的检测(所有步骤均在室温进行)：

将印迹在第一抗体(于TBS+0.1％Tween 20+5％脱脂乳粉中1∶2000稀释的抗eNOS或抗bNOS小鼠单克隆抗体BD/Transduction Labs)中保温1小时15分钟。然后将印迹如下洗涤：在TBS+0.1％Tween 20中洗涤一次10分钟及两次5分钟。然后将印迹在第二抗体(过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG，Chemicon Intl.AP308P或Roche 1814168，于TBS+0.1％Tween20+5％脱脂乳粉中稀释1∶3000)中保温1小时。在如上述洗涤之后，加上额外在TBS(无Tween)中洗涤5分钟后，将印迹在ECL试剂(AmershamPharmacia RPN2106)中保温1分钟。然后将印迹用Saran Wrap覆盖并曝光于Amersham Pharmacia Hyperfilm ECL(RPN 1674A)1-5分钟，显色胶片。

                         序列表

<110>舍林股份公司

<120>用于基因治疗的eNOS突变体

<130>53035AWOM1

<150>US 60/403,638

<151>2002-08-16

<160>8

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1203

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

Met Gly Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Glu Pro Gly Pro Pro Cys Gly

1               5                   10                  15

Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Cys Gly Lys  Gln Gly Pro Ala

             20                  25                  30

Thr Pro Ala Pro Glu Pro Ser Arg Ala Pro Ala Ser Leu Leu Pro Pro

         35                  40                  45

Ala Pro Glu His Ser Pro Pro Ser Ser Pro Leu Thr Gln Pro Pro Glu

     50                  55                  60

Gly Pro Lys Phe Pro Arg Val Lys Asn Trp Glu Val Gly Ser Ile Thr

 65                  70                  75                  80

Tyr Asp Thr Leu Ser Ala Gln Ala Gln Gln Asp Gly Pro Cys Thr Pro

                 85                  90                  95

Arg Arg Cys Leu Gly Ser Leu Val Phe Pro Arg Lys Leu Gln Gly Arg

            100                 105                 110

Pro Ser Pro Gly Pro Pro Ala Pro Glu Gln Leu Leu Ser Gln Ala Arg

        115                 120                 125

Asp Phe Ile Asn Gln Tyr Tyr Ser Ser Ile Lys Arg Ser Gly Ser Gln

    130                 135                 140

Ala His Glu Gln Arg Leu Gln Glu Val Glu Ala Glu Val Ala Ala Thr

145                 150                 155                 160

Gly Thr Tyr Gln Leu Arg Glu Ser Glu Leu Val Phe Gly Ala Lys Gln

                165                 170                 175

Ala Trp Arg Asn Ala  Pro Arg Cys Val Gly Arg Ile Gln Trp Gly Lys

            180                 185                 190

Leu Gln Val Phe Asp Ala Arg Asp Cys Arg Ser Ala Gln Glu Met Phe

        195                 200                 205

Thr Tyr Ile Cys Asn His Ile Lys Tyr Ala Thr Asn Arg Gly Asn Leu

    210                 215                 220

Arg Ser Ala Ile Thr Val Phe Pro Gln Arg Cys Pro Gly Arg Gly Asp

225                 230                 235                 240

Phe Arg Ile Trp Asn Ser Gln Leu Val Arg Tyr Ala Gly Tyr Arg Gln

                245                 250                 255

Gln Asp Gly Ser Val Arg Gly Asp Pro Ala Asn Val Glu Ile Thr Glu

            260                 265                 270

Leu Cys Ile Gln His Gly Trp Thr Pro Gly Asn Gly Arg Phe Asp Val

        275                 280                 285

Leu Pro Leu Leu Leu Gln Ala Pro Asp Glu Pro Pro Glu Leu Phe Leu

    290                 295                 300

Leu Pro Pro Glu Leu Val Leu Glu Val Pro Leu Glu His Pro Thr Leu

305                 310                 315                 320

Glu Trp Phe Ala Ala Leu Gly Leu Arg Trp Tyr Ala Leu Pro Ala Val

                325                 330                 335

Ser Asn Met Leu Leu Glu Ile Gly Gly Leu Glu Phe Pro Ala Ala Pro

            340                 345                 350

Phe Ser Gly Trp Tyr Met Ser Thr Glu Ile Gly Thr Arg Asn Leu Cys

        355                 360                 365

Asp Pro His Arg Tyr Asn Ile Leu Glu Asp Val Ala Val Cys Met Asp

    370                 375                 380

Leu Asp Thr Arg Thr Thr Ser Ser Leu Trp Lys Asp Lys Ala Ala Val

385                 390                 395                 400

Glu Ile Asn Val Ala Val Leu His Ser Tyr Gln Leu Ala Lys Val Thr

                405                 410                 415

Ile Val Asp His His Ala Ala Thr Ala Ser Phe Met Lys His Leu Glu

            420                 425                 430

Asn Glu Gln Lys Ala Arg Gly Gly Cys Pro Ala Asp Trp Ala Trp Ile

        435                 440                 445

Val Pro Pro Ile Ser Gly Ser Leu Thr Pro Val Phe His Gln Glu Met

    450                 455                 460

Val Asn Tyr Phe Leu Ser Pro Ala Phe Arg Tyr Gln Pro Asp Pro Trp

465                 470                 475                 480

Lys Gly Ser Ala Ala Lys Gly Thr Gly Ile Thr Arg Lys Lys Thr Phe

                485                 490                 495

Lys Glu Val Ala Asn Ala Val Lys Ile Ser Ala  Ser Leu Met Gly Thr

            500                 505                 510

Val Met Ala Lys Arg Val Lys Ala Thr Ile Leu Tyr Gly Ser Glu Thr

        515                 520                 525

Gly Arg Ala Gln Ser Tyr Ala Gln Gln Leu Gly Arg Leu Phe Arg Lys

    530                 535                 540

Ala Phe Asp Pro Arg Val Leu Cys Met Asp Glu Tyr Asp Val Val Ser

545                 550                 555                 560

Leu Glu His Glu Thr Leu Val Leu Val Val Thr Ser Thr Phe Gly Asn

                565                 570                 575

Gly Asp Pro Pro Glu Asn Gly Glu Ser Phe Ala Ala Ala Leu Met Glu

            580                 585                 590

Met Ser Gly Pro Tyr Asn Ser Ser Pro Arg Pro Glu Gln His Lys Ser

       595                 600                 605

Tyr Lys Ile Arg Phe Asn Ser Ile Ser Cys Ser Asp Pro Leu Val Ser

    610                 615                 620

Ser Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Ser Ser Asn Thr Asp Ser Ala Gly

625                 630                 635                 640

Ala Leu Gly Thr Leu Arg Phe Cys Val Phe Gly Leu Gly Ser Arg Ala

                645                 650                 655

Tyr Pro His Phe Cys Ala Phe Ala Arg Ala Val Asp Thr Arg Leu Glu

            660                 665                 670

Glu Leu Gly Gly Glu Arg Leu Leu Gln Leu Gly Gln Gly Asp Glu Leu

        675                 680                 685

Cys Gly Gln Glu Glu Ala Phe Arg Gly Trp Ala Gln Ala Ala Phe Gln

    690                 695                 700

Ala Ala Cys Glu Thr Phe Cys Val Gly Glu Asp Ala Lys Ala Ala Ala

705                 710                 715                 720

Arg Asp Ile Phe Ser Pro Lys Arg Ser Trp Lys Arg Gln Arg Tyr Arg

                725                 730                 735

Leu Ser Ala Gln Ala Glu Gly Leu Gln Leu Leu Pro Gly Leu Ile His

            740                 745                 750

Val His Arg Arg Lys Met Phe Gln Ala Thr Ile Arg Ser Val Glu Asn

        755                 760                 765

Leu Gln Ser Ser Lys Ser Thr Arg Ala Thr Ile Leu Val Arg Leu Asp

    770                 775                 780

Thr Gly Gly Gln Glu Gly Leu Gln Tyr Gln Pro Gly Asp His Ile Gly

785                 790                 795                 800

Val Cys Pro Pro Asn Arg Pro Gly Leu Val Glu Ala Leu Leu Ser Arg

                805                 810                 815

Val Glu Asp Pro Pro Ala Pro Thr Glu Pro Val Ala Val Glu Gln Leu

            820                 825                 830

Glu Lys Gly Ser Pro Gly Gly Pro Pro Pro Gly Trp Val Arg Asp Pro

        835                 840                 845

Arg Leu Pro Pro Cys Thr Leu Arg Gln Ala Leu Thr Phe Phe Leu Asp

    850                 855                 860

Ile Thr Ser Pro Pro Ser Pro Gln Leu Leu Arg Leu Leu Ser Thr Leu

865                 870                 875                 880

Ala Glu Glu Pro Arg Glu Gln Gln Glu Leu Glu Ala Leu Ser Gln Asp

                885                 890                 895

Pro Arg Arg Tyr Glu Glu Trp Lys Trp Phe Arg Cys Pro Thr Leu Leu

            900                 905                 910

Glu Val Leu Glu Gln Phe Pro Ser Val Ala Leu Pro Ala Pro Leu Leu

        915                 920                 925

Leu Thr Gln Leu Pro Leu Leu Gln Pro Arg Tyr Tyr Ser Val Ser Ser

    930                 935                 940

Ala Pro Ser Thr His Pro Gly Glu Ile His Leu Thr Val Ala Val Leu

945                 950                 955                 960

Ala Tyr Arg Thr Gln Asp Gly Leu Gly Pro Leu His Tyr Gly Val Cys

                965                 970                 975

Ser Thr Trp Leu Ser Gln Leu Lys Pro Gly Asp Pro Val Pro Cys Phe

            980                 985                 990

Ile Arg Gly Ala Pro Ser Phe Arg Leu Pro Pro Asp Pro Ser Leu Pro

        995                 1000                1005

Cys Ile  Leu Val Gly Pro Gly  Thr Gly Ile Ala Pro  Phe Arg Gly

    1010                 1015                 1020

Phe Trp  Gln Glu Arg Leu His  Asp Ile Glu Ser Lys  Gly Leu Gln

    1025                 1030                 1035

Pro Thr  Pro Met Thr Leu Val  Phe Gly Cys Arg Cys  Ser Gln Leu

    1040                 1045                 1050

Asp His  Leu Tyr Arg Asp Glu  Val Gln Asn Ala Gln  Gln Arg Gly

    1055                 1060                 1065

Val Phe  Gly Arg Val Leu Thr  Ala Phe Ser Arg Glu  Pro Asp Asn

    1070                 1075                 1080

Pro Lys  Thr Tyr Val Gln Asp  Ile Leu Arg Thr Glu  Leu Ala Ala

    1085                 1090                 1095

Glu Val  His Arg Val Leu Cys  Leu Glu Arg Gly His  Met Phe Val

    1100                 1105                 1110

Cys Gly  Asp Val Thr Met Ala  Thr Asn Val Leu Gln  Thr Val Gln

    1115                 1120                 1125

Arg Ile  Leu Ala Thr Glu Gly  Asp Met Glu Leu Asp  Glu Ala Gly

    1130                 1135                 1140

Asp Val  Ile Gly Val Leu Arg  Asp Gln Gln Arg Tyr  His Glu Asp

    1145                 1150                 1155

Ile Phe  Gly Leu Thr Leu Arg  Thr Gln Glu Val Thr  Ser Arg Ile

    1160                 1165                 1170

Arg Thr  Gln Ser Phe Ser Leu  Gln Glu Arg Gln Leu  Arg Gly Ala

    1175                 1180                 1185

Val Pro  Trp Ala Phe Asp Pro  Pro Gly Ser Asp Thr  Asn Ser Pro

    1190                 1195                 1200

<210>2

<211>37

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Ala Ala Lys Gly Thr Gly Ile Thr Arg Lys Lys Thr Phe Lys Glu Val

1               5                   10                  15

Ala Asn Ala Val Lys Ile Ser Ala Ser Leu Met Gly Thr Val Met Ala

            20                  25                  30

Lys Arg Val Lys Ala

        35

<210>3

<211>37

<212>PRT

<213>Bos taurus

<400>3

Ala Thr Lys Gly Ala Gly Ile Thr Arg Lys Lys Thr Phe Lys Glu Val

1               5                   10                  15

Ala Asn Ala Val Lys Ile Ser Ala Ser Leu Met Gly Thr Leu Met Ala

            20                  25                  30

Lys Arg Val Lys Ala

        35

<210>4

<211>38

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>4

Gly Thr Asn Gly Thr Pro Thr Lys Arg Arg Ala Ile Gly Phe Lys Lys

1               5                   10                  15

Leu Ala Glu Ala Val Lys Phe Ser Ala Lys Leu Met Gly Gln Ala Met

            20                 25                 30

Ala Lys Arg Val Lys Ala

        35

<210>5

<211>38

<212>PRT

<213>Rattus rattus

<400>5

Gly Thr Asn Gly Thr Pro Thr Lys Arg Arg Ala Ile Gly Phe Lys Lys

1               5                   10                  15

Leu Ala Glu Ala Val Lys Phe Ser Ala Lys Leu Met Gly Gln Ala Met

            20                 25                 30

Ala Lys Arg Val Lys Ala

        35

<210>6

<211>37

<212>PRT

<213>Rattus rattus

<400>6

Asp Glu Lys Leu Arg Pro Arg Arg Arg Glu Ile Arg Phe Thr Val Leu

1               5                   10                  15

Val Lys Ala Val Phe Phe Ala Ser Val Leu Met Arg Lys Val Met Ala

            20                  25                  30

Ser Arg Val Arg Ala

        35

<210>7

<211>37

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>7

Asn Glu Lys Leu Arg Pro Arg Arg Arg Glu Ile Arg Phe Arg Val Leu

1               5                   10                  15

Val Lys Val Val Phe Phe Ala Ser Met Leu Met Arg Lys Val Met Ala

            20                  25                  30

Ser Arg Val Arg Ala

        35

<210>8

<211>37

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>8

Asp Glu Lys Arg Arg Pro Lys Arg Arg Glu Ile Pro Leu Lys Val Leu

1               5                   10                  15

Val Lys Ala Val Leu Phe Ala Cys Met Leu Met Arg Lys Thr Met Ala

             20                 25                 30

Ser Arg Val Arg Val

        35

Claims (41)

1.一种分离的eNOS多肽突变体，其在相应于哺乳动物eNOS的一个功能域的氨基酸序列中有一或多个突变，其中至少一个所述突变：

i)在相应于钙调蛋白结合结构域中的一个在哺乳动物细胞中是磷酸化的氨基酸残基的位置发生；及

ii)不是一个被取代为Ala或Asp的氨基酸取代，其中所述eNOS多肽突变体有一个突变且所述一个突变是在所述位置。

2.权利要求1的eNOS多肽突变体，其中所述氨基酸残基是人eNOS的第495位氨基酸残基。

3.权利要求2的eNOS多肽突变体，其中所述人eNOS的氨基酸序列是SEQ ID NO：1。

4.权利要求3的eNOS多肽突变体，其中在相应于第495位氨基酸残基位置的所述突变是一个氨基酸被取代为Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Met、Ser、Cys、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg或His。

5.权利要求4的eNOS多肽突变体，其中在相应于第495位氨基酸残基的位置的所述突变是一个氨基酸被取代为Val、Leu或Ile。

6.权利要求5的eNOS多肽突变体，其中在相应于第495位氨基酸残基的位置的所述突变是一个氨基酸被取代为Val。

7.权利要求3的eNOS多肽突变体，其中所述多肽突变体在除了所述钙调蛋白结合结构域之外的一或多个功能域中还进一步包含至少一个突变。

8.权利要求7的eNOS多肽突变体，其中在相应于第495位氨基酸残基的位置的所述突变是一个氨基酸被取代为Ala、Val、Leu或Ile。

9.权利要求8的eNOS多肽突变体，其中在相应于第495位氨基酸残基的位置的所述突变是一个氨基酸被取代为Ala或Val。

10.权利要求9的eNOS多肽突变体，其中在相应于第495位氨基酸残基的位置的所述突变是一个氨基酸被取代为Val。

11.权利要求8的eNOS多肽突变体，其中所述多肽突变体在相应于所述人eNOS的豆蔻酰化位点的氨基酸序列中进一步包含至少一个突变。

12.权利要求11的eNOS多肽突变体，其中所述多肽突变体在相应于所述人eNOS的第2位氨基酸残基的位置包含一个突变。

13.权利要求12的eNOS多肽突变体，其中在相应于第2位氨基酸残基的位置的所述突变是一个氨基酸被取代为Ala。

14.权利要求8的eNOS多肽突变体，其中所述多肽突变体在相应于所述人eNOS的还原酶位点的氨基酸序列中进一步包含至少一个突变。

15.权利要求14的eNOS多肽突变体，其中所述多肽突变体在相应于所述人eNOS的第1177位氨基酸残基的位置包含一个突变。

16.权利要求15的eNOS多肽突变体，其中在相应于所述人eNOS的第1177位氨基酸残基的位置的所述突变是一个氨基酸被取代为Asp。

17.权利要求16的eNOS多肽突变体，其中所述多肽突变体进一步在相应于所述人eNOS的第2位氨基酸残基的位置包含一个突变，所述突变是一个氨基酸被取代为Ala。

18.权利要求1的eNOS多肽突变体，其中所述多肽突变体的磷酸化与一参考eNOS多肽相比增加或降低。

19.权利要求1的eNOS多肽突变体，其中所述多肽与参考eNOS多肽相比对钙调蛋白的结合亲和性提高。

20.权利要求1的eNOS多肽突变体，其中所述多肽与参考eNOS多肽相比在Ca⁺⁺-钙调蛋白介导的刺激中对Ca⁺⁺依赖性降低。

21.权利要求1的eNOS多肽突变体，其中所述多肽突变体与参考eNOS多肽相比eNOS活性增加。

22.权利要求21的eNOS多肽突变体，其中所述活性是NO的产生。

23.权利要求21的eNOS多肽突变体，其中所述活性是还原酶活性。

24.权利要求18、19、20、21、22或23的eNOS多肽突变体，其中所述参考多肽的氨基酸序列是人eNOS的氨基酸序列或衍生自人eNOS的氨基酸序列。

25.权利要求24的eNOS多肽突变体，其中所述参考多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO：1或衍生自SEQ ID NO：1。

26.一种分离的eNOS多肽突变体，其中所述多肽突变体的氨基酸序列与权利要求1的eNOS多肽突变体的氨基酸序列基本同源。

27.一种分离的eNOS多肽突变体，其中所述多肽突变体的氨基酸序列与权利要求26的所述多肽突变体的氨基酸序列有95-99％序列相同性。

29.一种编码权利要求1的多肽突变体的分离的多核苷酸。

30.一种重组载体，其包含可操纵地与至少一个调节序列连接的权利要求29的多核苷酸。

31.一种包含权利要求1的多肽突变体的药物组合物。

32.一种包含权利要求29的多核苷酸的药物组合物。

33.权利要求1的多肽突变体的一种结合配偶体。

34.权利要求33的结合配偶体，其中所述结合配偶体是一种多肽。

35.权利要求34的结合配偶体，其中所述结合配偶体是一种抗体或抗原特异性抗体片段。

36.一种调节细胞中eNOS活性的方法，所述方法包括给予所述细胞权利要求1的多肽突变体。

37.一种调节细胞中eNOS活性的方法，所述方法包括给予所述细胞权利要求29的多核苷酸，由此所述多肽突变体在所述细胞中表达。

38.一种诊断与异常eNOS活性相关的病症的方法，所述方法包括：

i)将患者的细胞与权利要求29的所述多核苷酸接触；及

ii)检测作为所述病症指示的eNOS活性水平。

39.一种预防或治疗与异常eNOS活性相关的病症的方法，所述方法包括给予需要治疗的患者有效量的权利要求1的所述多肽突变体。

40.一种预防或治疗与异常eNOS活性相关的病症的方法，所述方法包括给予需要治疗的患者有效量的编码权利要求1的所述多肽突变体的多核苷酸，由此所述多肽突变体在所述患者中表达。

41.权利要求39的方法，其中所述方法进一步包括在所述给予患者所述多肽突变体之前、期间或之后，进一步给予一或多种血管生成因子。

42.权利要求40的方法，其中所述方法进一步包括在所述给予患者所述多核苷酸之前、期间或之后，进一步给予一或多种血管生成因子。

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