KR20050042788A - 유전자 요법에 유용한 ｅＮＯＳ 돌연변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전자 요법에 유용한 내피 산화질소 신타제 (eNOS) 폴리펩티드 돌연변이체 및 상기 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 포유동물 eNOS의 기능성 도메인에 상응하는 아미노산 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 제공한다. 보다 특히, 본 발명은 포유동물 세포에서 인산화되는 칼모듈린-결합 부위의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체에 관한 것이며, 여기서 변이는 인산화 자리에서의 단일 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 Ala 또는 Asp로의 아미노산 치환은 아니다. 본 발명은 또한 상기 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체 및 폴리뉴클레오티드를 사용하는 예방법, 진단법 및 치료법에 관한 것이다.

Description

유전자 요법에 유용한 ｅＮＯＳ 돌연변이체 {eNOS MUTANTS USEFUL FOR GENE THERAPY}

본 발명은 유전자 요법에 유용한 내피 산화질소 신타제 (eNOS) 폴리펩티드 돌연변이체 및 상기 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 포유동물 eNOS의 기능성 도메인에 상응하는 아미노산 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 제공한다. 보다 특히, 본 발명은 포유동물 세포에서 인산화되는 칼모듈린-결합 부위의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체에 관한 것이며, 여기서 변이는 인산화 자리에서의 단일 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 Ala 또는 Asp로의 아미노산 치환은 아니다. 본 발명은 또한 상기 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체 및 폴리뉴클레오티드를 사용하는 예방법, 진단법 및 치료법에 관한 것이다.

내피 산화질소 신타제 (eNOS, 또한 ecNOS 또는 NOS3로 불려짐), 및 eNOS 효소 활성에 의해 생성되는 산화질소 (NO)는, 예를 들어 혈관신생, 혈관확장, 면역 조절, 혈소판 응집의 억제, 및 평활근의 이완을 비롯한 각종 생리학적 과정에서 중요한 역할을 한다. eNOS 활성의 조절은 각종 2차 메신저 분자의 참가 및 폴리펩티드 상의 다양한 기능적 영역과 그의 상호 작용에 관련된다 (예를 들어, 문헌 [Marletta, M. Trends in Biochem. Sciences (2001) 26:519-521] 참조).

eNOS의 각종 기능성 도메인의 기능 및 위치는 익히 특징규명되어 있고, N-말단에서 C-말단으로 이어진 미리스토일화에 대한 컨센서스 부위; 팔미토일화에 대한 부위; 옥시게나제 도메인; 칼모듈린-결합 부위 및 리덕타제 도메인을 포함한다 (예를 들어, 도 1 참조; 또한 예를 들어, 문헌 [Stuehr, D.J. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. (1997) 37:339-359] 참조). 다양한 종에 대한 eNOS의 비교는 각각의 기능성 도메인 내에서 높은 정도의 서열 동일성을 나타낸다. 또한, 다수의 기능성 도메인에 대한 컨센서스 서열이 공지되어 있다. 각종 생물학적 자극 (예를 들어, 세포내 자극)에 대한 반응으로, 야생형 eNOS는 시험관내 또는 생체내에서, 칼모듈린-결합 부위 및 리덕타제 도메인 내의 아미노산 잔기에서 인산화 또는 탈인산화된다. 또한, 이들 부위의 인산화 수준은 eNOS 효소 활성의 조절에 기여한다 (예를 들어, 문헌 [Fulton et al. Nature (1999) 399:597-601] 참조). 인간 야생형 eNOS (서열 1)에서, 인간 야생형 eNOS (서열 1)의 리덕타제 도메인에 위치한 아미노산 잔기 Ser-1177의 아미노산 치환은 인산화 (및, 결과적으로 eNOS 활성의 활성화를 위함)를 방지하고, 구조적으로 활성이 되도록한다 (예를 들어, WO 00/62605 참조). 상응하는 아미노산 잔기의 아미노산 치환이 다른 종의 eNOS들에서 일어날때 유사한 결과가 나타난다 (예를 들어, WO 00/62605 참조).

칼모듈린 (CaM) 및 칼슘 (Ca⁺⁺)의 복합체는 eNOS 칼모듈린-결합 부위에 효율적으로 결합하고, eNOS 활성을 자극시킬 수 있다 (예를 들어, NO 생성). 또한, eNOS에 대한 CaM-Ca⁺⁺ 복합체의 결합은 칼모듈린-결합 부위 내의 특정 아미노산 잔기의 인산화 수준에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, Thr-495가 인산화된 경우, 칼모듈린-결합은 억제되고(거나) eNOS의 칼모듈린 활성의 Ca⁺⁺ 의존성이 억제될 수 있다. 예를 들어, 특정 키나제 억제제에 의해, 또는 Thr-495를 Ala로의 치환에 의해 Thr-495에서의 인산화가 방지되는 경우, eNOS 활성을 자극시킬 수 있다 (예를 들어, Busse et al. 참조).

내피 NO 신타제는 본원에 기재된 바와 같이 각종 활성과 관련되어 있고, 이들 eNOS 폴리펩티드의 이상 발현 및(또는) 이상 활성, 및(또는) 이들 효소에 의해 생성되는 NO의 이상량은 각종 질환 상태와 관련되어 있다. 따라서, 세포에서의 eNOS 폴리펩티드 수준 및 활성의 조정은 명백히 유용한 치료 표적의 일례가 된다.

[발명의 요약]

본 발명은 유전자 요법에 유용한 단리되는 내피 산화질소 신타제 (eNOS) 폴리펩티드 돌연변이체, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 그의 변이체를 제공한다. 특히, 본 발명은 포유동물 eNOS의 기능성 도메인에 상응하는 아미노산 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 제공하며, 여기서, 하나 이상의 돌연변이는 포유동물 세포에서 인산화되는 칼모듈린-결합 부위의 아미노산 잔기에 상응하는 위치이며, 인산화 자리에서의 단일 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 Ala 또는 Asp로의 아미노산 치환은 아니다.

한 측면에서, 본 발명은 인간 eNOS 폴리펩티드, 바람직하네는 서열 1에 의해 코딩되는 인간 eNOS의 위치 495에 상응하는 위치에서 돌연변이를 갖는 단리된 인간 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 제공하며, 여기서 변이는 칼모듈린-결합 부위의 인산화 자리에서의 단일 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 Ala 또는 Asp로의 아미노산 치환은 아니다. 특정 측면에서, 위치 495에 상응하는 돌연변이는 Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Met, Ser, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, 또는 His로의 아미노산 치환이고, 바람직하게는 Val, Leu, 또는 Ile로의 치환이며, 가장 바람직하게는 Val로의 치환이다. 특정 측면에서, eNOS 폴리펩티드 돌연변이체가 하나 이상의 돌연변이를 갖는 경우, 위치 495에 상응하는 돌연변이는 바람직하게는 Ala 또는 Val로의 아미노산 치환이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 포유동물 세포에서 인산화되는, 포유동물 eNOS의 칼모듈린-결합 부위의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 돌연변이를 갖는 단리된 인간 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 제공하며; 또한 포유동물 세포에서 인산화되는, 포유동물 eNOS의 리덕타제 도메인의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 측면에서, 칼모듈린-결합 도메인의 변이는 인간 eNOS의 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서, Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Met, Ser, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, 또는 His로의 아미노산 치환, 바람직하게는 Val, Leu, 또는 Ile로의 치환, 가장 바람직하게는 Val로의 치환이며; 리덕타제 도메인의 돌연변이는 인간 eNOS의 아미노산 1177에 상응하는 위치에서, 바람직하게는 Asp로의 아미노산 치환이다. 특정 측면에서, eNOS 폴리펩티드 돌연변이체가 하나 이상의 돌연변이를 갖는 경우, 위치 495에 상응하는 돌연변이는 바람직하게는 Ala 또는 Val로의 아미노산 치환이다. 바람직하게는, 인간 eNOS는 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 포유동물 세포에서 인산화되는, 포유동물 eNOS의 칼모듈린-결합 부위의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 돌연변이를 갖는 단리된 인간 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 제공하고, 포유동물 eNOS의 미리스토일화 부위의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 측면에서, 칼모듈린-결합 도메인의 변이는 인간 eNOS의 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서이며, Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Met, Ser, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, 또는 His로의 아미노산 치환, 바람직하게는 Val, Leu, 또는 Ile로의 치환, 가장 바람직하게는 Val로의 치환이며; 미리스토일화의 돌연변이는 인간 eNOS의 아미노산 2에 상응하는 위치에 존재하고, Ala로의 아미노산 치환이다. 상기 측면에서, eNOS 폴리펩티드 돌연변이체가 하나 이상의 돌연변이를 갖는 경우, 위치 495에 상응하는 돌연변이는 보다 바람직하게는 Ala 또는 Val로의 아미노산 치환이다. 바람직하게는, 인간 eNOS는 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 1) 포유동물 세포에서 인산화되는, 포유동물 eNOS의 칼모듈린-결합 부위의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 돌연변이; 2) 또한, 포유동물 eNOS의 미리스토일화 부위의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 돌연변이; 및 3) 포유동물 세포에서 인산화되는, 포유동물 eNOS의 리덕타제 도메인의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 단리된 인간 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 제공한다. 특정 측면에서, 특정 측면에서, 칼모듈린-결합 도메인의 변이는 인간 eNOS의 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서이며, Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Met, Ser, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, 또는 His로의 아미노산 치환, 바람직하게는 Val, Leu, 또는 Ile로의 치환, 가장 바람직하게는 Val로의 치환이며; 미리스토일화의 돌연변이는 인간 eNOS의 아미노산 2에 상응하는 위치에 존재하고, Ala로의 아미노산 치환이며; 리덕타제 도메인의 돌연변이는 인간 eNOS의 아미노산 1177에 상응하는 위치에 존재하고, 바람직하게는 Asp로의 아미노산 치환이다. 상기 측면에서, eNOS 폴리펩티드 돌연변이체가 하나 이상의 돌연변이를 갖는 경우, 위치 495에 상응하는 돌연변이는 보다 바람직하게는 Ala 또는 Val로의 아미노산 치환이다. 바람직하게는, 인간 eNOS는 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS이다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 인산화는 참조 eNOS 폴리펩티드와 비교하여 증가되거나 또는 감소된다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 Ca++ 의존성은 참조 eNOS 폴리펩티드와 비교하여 상기 폴리펩티드의 Ca++ - 칼모듈린 매개 자극 중 감소된다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 참조 eNOS 폴리펩티드와 비교하여 증가된 활성을 갖는다.

한 측면에서, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 참조 eNOS 폴리펩티드와 비교하여 NO 생성이 증가된다.

한 측면에서, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 참조 eNOS 폴리펩티드와 비교하여 리덕타제 활성이 증가된다.

한 측면에서, 참조 eNOS 폴리펩티드는 인간 eNOS의 아미노산 서열로부터 유래되며, 서열 1에 의해 코딩되는 인간 eNOS이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 야생형 또는 돌연변이체 eNOS 폴리펩티드의 아미노산 서열과 실질적으로 상동한 아미노산 서열을 갖는 단리된 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 야생형 eNOS 또는 돌연변이체 eNOS 폴리펩티드의 아미노산 서열과 95 내지 99％ 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단리된 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 제공한다. 바람직하게는, 개시 eNOS 폴리펩티드는 인간 eNOS 폴리펩티드이고, 가장 바람직하게는 인간 야생형 eNOS이거나 또는 이로부터 유래된 것으로, 예를 들어 서열 1에 의해 코딩되는 인간 eNOS이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 벡터를 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 조절 서열과 작동가능하게 결합되어 코딩된 폴리펩티드가 세포에서 발현된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 결합 파트너를 제공한다. 한 측면에서, 상기 결합 파트너는 폴리펩티드이다. 추가 측면에서, 상기 결합 파트너는 항체 또는 항원-특이적 단편이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에게 투여하는 것을 포함하는, 세포에서 eNOS 활성을 조정하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 세포에게 투여하는 것을 포함하는, 세포에서 eNOS 활성을 조정하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 이상 eNOS 활성과 관련되어 있는 상태를 진단하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 1) 환자 세포를 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 것; 2) 상태를 표시하는 eNOS 활성의 수준을 검출하는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 이상 eNOS 활성과 관련되어 있는 상태를 치료하는 예방 또는 치료 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 치료가 필요한 환자에게 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 이상 eNOS 활성과 관련되어 있는 상태를 치료하는 예방 또는 치료 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 치료가 필요한 환자에게 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유효량을 투여하여, 상기 폴리펩티드 돌연변이체를 환자에서 발현시키는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 예방 및 치료 방법은 또한 치료가 필요한 환자에게, eNOS 폴리펩티드 돌연변이체 또는 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여하기 전, 동안, 후에 하나 이상의 혈관형성 인자를 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 상기 및 기타 목적, 그의 다양한 특징 뿐만 아니라 본 발명 자체는, 첨부된 도면과 함께 본 명세서를 읽을 때, 하기 상세한 설명으로부터 보다 충분히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 포유동물 eNOS의 다양한 기능성 도메인을 나타내는 도해이다. 기능성 도메인은, 이에 한정되지는 않지만 예를 들어 (N-말단으로부터 C-말단으로 진행하여) 미리스토일화에 대한 컨센서스 부위; 팔미토일화에 대한 2개의 부위; 옥시다제 도메인; (예를 들어 인간 eNOS의 Thr-495의) 인산화에 대한 컨센서스 서열을 포함하는 칼모둘린 결합 부위 (예를 들어, 인간 eNOS의 아미노산 494 내지 517); 및 리덕타제 도메인을 포함한다. 인간 eNOS 폴리펩티드의 기능성 도메인은 예를 들어 자기억제 루프 및 헴-결합 부위를 포함한다.

도 2는, 서열 1 (WT)에 의해 코딩된 야생형 인간 eNOS와 비교하여, 단일 또는 이중 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체에 의하여 HEK 293 세포에서 NO 생성의 자극을 나타내는 막대그래프이다. 단일 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는, 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Thr-495에 상응하는 위치에서, Asp(T495D), Ala(T495A) 또는 Val(T495V)로의 아미노산 치환을 갖는다. 이중 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 Ser-1177에 상응하는 위치에서 Asp으로의 제1 아미노산 치환, 및 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Thr-495에 상응하는 위치에서 Asp(T495D + S1177D), Ala(T495AV + S1177D) 또는 Val(T495V + S1177D)으로의 제2 아미노산 치환을 갖는다.

도 3은, 서열 1에 의해 코딩된 야생형 인간 eNOS (야생형)에 비교하여, 단일 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체에 의해 인간 대동맥 내피 세포 (HAEC)에서의 NO 생성 자극을 나타내는 막대그래프이다. 단일 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Thr-495에 상응하는 위치에서 Asp (T495D), Ala (T495A) 또는 Val (T495V)으로의 아미노산 치환을 갖는다.

본 발명은 유전자 요법에 유용한 내피 산화질소 신타제 (eNOS) 폴리펩티드 돌연변이체, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 그의 변이체를 제공한다. 특히, 본 발명은 포유동물 eNOS의 기능성 도메인에 상응하는 아미노산 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 제공하며, 여기서 하나 이상의 돌연변이는 포유동물 세포에서 인산화되는 칼모듈린-결합 부위의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 존재하고; 칼모듈린-결합 부위의 인산화 부위에서의 단일 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 Ala 또는 Asp로의 아미노산 치환은 아니다.

본 발명은 인간 eNOS의 칼모듈린-결합 부위의 Thr-495 잔기의 특정한 아미노산 치환 단독으로 (여기서, Ala 또는 Asp로의 아미노산 치환은 아님), 또는 Ser-1177에서의 제2 돌연변이와 함께 야생형 인간 eNOS와 비교하여 세포에서 eNOS 활성 (예를 들어 NO 생성)이 증가하였으며 (예를 들어, 실시예 2 참조); 유전자 요법에서 상기 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 사용함으로써 eNOS 활성과 관련된 상태를 개선시킬 수 있는 것 (미국 특허 출원 제 60/403,637호에 기재된 바와 같으며, 이는 본원에 참조로 인용되어 있음)을 밝혀냈다.

결과적으로, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 및 방법은 세포에서 eNOS 활성의 수준을 조정하는데 사용됨으로써 eNOS 활성과 관련된 질환 및 상태를 치료하기 위한 신규한 치료 접근법을 제공할 수 있다. 예를 들어, 이러한 신규 접근법은 예를 들어, 1) 혈관신생의 자극; 2) 미세혈관 기능장애의 개선; 3) 존재하는 혈관의 혈관운동 (혈관확장)의 회복; 및 4) 존재하는 측부의 개조/성숙 (동맥 형성)을 비롯한 다중 메카니즘을 통한 위급한 사지 허혈 (CLI)의 기초 병태생리학을 표적으로 한다. 피부 및 근육 둘다로의 혈류 및 산소 전달의 개선의 결과가 안정시 통증을 개선시키고 허혈성 궤양을 치유할 것으로 기대된다.

더욱이, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 돌연변이체 eNOS 효소의 특이적 활성이 충분히 더 높기 때문에 야생형 eNOS보다 효과적일 수 있다. 또한, eNOS 폴리펩티드의 활성은 칼슘에 의해 엄격하게 조절되고, oxLDL 및 연령에 관용적일 수 있다. 결과적으로, 성장 인자와 비교하여, "과잉투여"에 의한 독성은 유전자 요법 적용에서 본 발명의 eNOS 조성물을 사용하여 무시할 수 있었다.

본원에 인용된 참조문헌은 그 전체가 참조로 인용되어 있다.

정의

본원에서 사용된 바와 같이, 기술적 및 과학 용어는, 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 당업자에게 알려진 다양한 방법을 참조한다. 참조되는 이러한 공지된 방법들을 설명하는 공보 및 기타 자료들은, 마치 이들이 완전히 설명된 것처럼, 그 전체내용이 참조문헌으로 포함된다. 재조합 DNA 기술의 일반적인 원리를 설명하는 표준 참조문헌은 문헌 [Sambrook,J. 등 (1989) Molecular Cloning,: A Laboratory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, N.Y.; McPherson, M.J.,Ed. (1991) Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; Jones, J. (1992) Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Science Publications, Oxford: Austen, B.M. and Westwood, O.M.R.(1991) Protein Targeting and Secretion, IRL Press, Oxford]을 포함한다. 본 발명을 수행하는데 있어서 당업자에게 공지된 임의의 적절한 자료 및(또는) 방법이라도 사용될 수 있으나; 바람직한 자료 및(또는) 방법이 여기에 설명된다. 하기 설명 및 실시예에서 언급된 물질, 시약 등은 달리 지시되지 않는다면 상업적 공급처로부터 입수가능하다.

본원에서 사용된 바와 같이, "폴리펩티드"란, 전장 단백질 또는 그의 단편, 또는 펩티드를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 관한 "변형체"란, 각각 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 비교하여 (예를 들어, 야생형 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 비교하여), 1차, 2차 또는 3차 구조에서 변할 수도 있는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들어, 아미노산 또는 핵산 서열은, 참조 아미노산 또는 핵산 서열과 상이한 돌연변이 또는 변형을 함유할 수도 있다. 특정 실시양태에서, eNOS 변형체는 상이한 이소형 또는 다형태성일 수도 있다. 변형체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 단리되거나 생성된 천연-발생, 합성, 재조합, 또는 화학적-변형된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 관한 "돌연변이"는, 각각 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 비교하여 (예를 들어, 야생형 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 비교하여), 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 1차, 2차 또는 3차 구조에 대한 천연-발생, 합성, 재조합 또는 화학적 변화 또는 차이점을 의미한다. 이러한 돌연변이를 갖는 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 단리되거나 생성될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "eNOS 폴리펩티드 돌연변이체" 또는 그의 문법상의 균등물 (예를 들어, eNOS 돌연변이체, 돌연변이체 eNOS, eNOS 돌연변이체 폴리펩티드, 돌연변이체 eNOS 폴리펩티드)은, 포유동물 eNOS의 기능성 도메인 내의 위치에 상응하는 아미노산 잔기에서 1개 이상의 변이 또는 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 또는 단편 또는 그의 변형체를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 돌연변이는 인간 eNOS (서열 1)의 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환이고, 여기에서 아미노산 치환은 칼모듈린-결합 부위의 인산화 부위에서 일어나는 단일 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드의 Als 또는 Asp로의 치환은 아니다. eNOS 폴리펩티드 돌연변이체가 하나 이상의 돌연변이를 갖는 경우, 위치 495에 상응하는 돌연변이는 바람직하게는 Ala 또는 Val로의 아미노산 치환이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 활성은 참조 eNOS 폴리펩티드와 비교하여 증가하거나 감소한다.

본원에서 사용된 바와 같이, eNOS 폴리펩티드의 "기능성 도메인"은 eNOS 활성과 관련된 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기, 부위 또는 영역이고, 예를 들어 이에 한정되지는 않지만 단백질-결합 도메인 (예를 들어, 칼모둘린-결합 도메인, 키나아제-결합 도메인, 또는 리간드-결합 도메인), 인산화 부위, 미리스토일화 부위, 리덕타제 도메인 또는 활성 부위를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이 "eNOS 활성"이란, 이에 한정되지는 않지만 NO 생성, 칼모둘린-결합, 혈관신생 자극, 미세혈관 기능부전 개선, 존재하는 혈관의 혈관운동(혈관확장) 활성 회복, 존재하는 측부의 개조/성숙 (동맥형성)에 기여를 포함하여, 세포 내에서 효소와 관련된 활성을 의미한다. eNOS 활성은 폴리펩티드와 관련된 임의의 기타 생물학적 또는 세포내 활성일 수도 있고, 보다 특별하게는, 임의의 이러한 활성은 eNOS의 기능성 도메인과 관련된다. eNOS 활성은 효소와 관련된 활성의 조정일 수도 있고, 이에 한정되지는 않지만 예를 들어 상기 기재되거나 당업계에 공지된 eNOS 활성의 조정을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, eNOS 활성에 관련된 "조정"이란, 이러한 활성의 증가, 저하, 유도 또는 억제를 의미한다. 특정 실시양태에서, eNOS 활성의 이러한 증가, 저하, 유도 또는 억제는 참조 분자, 예를 들어 eNOS 야생형 또는 변이체 폴리펩티드에 관련된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "질환", "상태" 또는 "장애"란, 상태를 개선시키기 위해 eNOS 활성이 조정될 수 있는 환자의 세포, 조직 또는 기관에서의 바람직하지 못한 상태를 의미한다. 내피 NOS는, 이에 한정되지는 않지만 예를 들어 혈관신생, 혈관확장, 면역 조절, 혈소판 응집 억제, 및 평활근의 이완을 포함한 다양한 생리학적 과정에 관여된다. 즉, 치료가 필요한 환자의 세포, 조직 또는 기관에서 eNOS 활성을 조정하는 것은 본원에 기재된 바와 같이 질환, 상태 또는 장애를 개선시킬 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이 "환자"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.

eNOS 폴리펩티드 돌연변이체

본 발명은 유전자 요법에 유용한 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 그의 변이체를 제공한다. 특히, 본 발명은 포유동물 eNOS의 기능성 도메인에 상응하는 아미노산 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 제공하며, 여기서 하나 이상의 돌연변이는 포유동물 세포에서 인산화되는 칼모듈린-결합 부위의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 존재하고; 칼모듈린-결합 부위의 인산화 부위에서의 단일 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 Ala 또는 Asp로의 아미노산 치환은 아니다. 특정 바람직한 실시양태에서, eNOS 폴리펩티드 돌연변이체가 하나 이상의 돌연변이를 갖는 경우, 위치 495에 상응하는 돌연변이는 바람직하게는 Ala 또는 Asp로의 아미노산 치환이다.

포유동물 eNOS 폴리펩티드의 기능성 도메인은 잘 특징규명되어 있고, 예를 들어, N-말단에서 C-말단에 이르는, 미리스토일화에 대한 컨센서스 부위; 팔미토일화에 대한 부위; 인산화에 대한 컨센서스 서열 (예를 들어, 인간 eNOS의 Thr-495)을 포함하는 칼모듈린-결합 부위 (예를 들어, 인간 eNOS의 아미노산 494-517); 리덕타제 도메인 및 인산화에 대한 컨센서스 서열 (예를 들어, 인간 eNOS의 Ser-1177)을 포함한다. 이들 부위의 위치 및 특징은 익히 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Stuehr, D.J. Annu . Rev. Pharmacol . Toxicol. (1997) 37:339-359] 참조) (도 1). 한 실시양태에서, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 칼모듈린-결합 도메인 내에서, 바람직하게는 Thr-495에서 및 리덕타제 도메인 내에서, 바람직하게는 Ser-1177에서 하나 이상의 돌연변이를 가지며, 여기서 Thr-495에서의 변이는 칼모듈린-결합 부위의 인산화 부위에서 단일 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체에서의 Ala 또는 Asp로의 아미노산 치환은 아니다.

한 실시양태에서, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 인간 eNOS의 Thr-495 잔기에 상응하는 위치에서 제1 변이를 가지며, 여기서 상기 변이는 칼모듈린-결합 부위의 인산화 부위에서 단일 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체에서의 Ala 또는 Asp로의 아미노산 치환은 아니다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 인간 eNOS의 Thr-495 잔기에 상응하는 위치에서 제1 변이; 및 인간 eNOS의 Ser-1177에 상응하는 위치에서 제2 변이를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 인간 eNOS의 Thr-495 잔기에 상응하는 위치에서 제1 변이; 인간 eNOS의 Ser-1177에 상응하는 위치에서 제2 변이; 및 인간 eNOS의 Gly-2에 상응하는 위치에서 제3 변이를 갖는다.

본 발명의 변이는 예를 들어, 1개 이상의 아미노산 첨가, 치환, 결실, 삽입, 변형, 역위, 융합 또는 절단, 또는 임의의 이들의 조합을 비롯한 임의의 각종 형태일 수 있으며, 합성적으로, 화학적으로, 재조합적으로 또는 공지된 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 바람직한 실시양태에서, 인간 eNOS의 Thr-495에 상응하는 위치에서의 변이는 Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Met, Ser, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, 또는 His로의 아미노산 치환이고, 바람직하게는 Val, Leu, 또는 Ile로의 아미노산 치환이고, 가장 바람직하게는 Val로의 아미노산 치환이며; 인간 eNOS의 Ser-1177에 상응하는 위치에서의 변이는 바람직하게는 Asp 및 Ala로의 아미노산 치환이며; 인간 eNOS의 Gly-2에 상응하는 위치에서의 변이는 Ala로의 아미노산 치환이다. 특정 바람직한 실시양태에서, eNOS 폴리펩티드 돌연변이체가 하나 이상의 돌연변이를 갖는 경우, 위치 495에 상응하는 돌연변이는 바람직하게는 Ala 또는 Val로의 아미노산 치환이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 Thr-495 부위에서의 변이 (하기에서 볼드체로 나타냄)에 더하여, 칼모듈린-결합 부위, DPWKGSAAKGTGITRKKTFKEVANAVKISASLMGTVMAKRVKATI (서열 1, 아미노산 478-522)에서 하나 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함한다. 다른 종의 비교되는 서열은 인산화 부위에 대한 N-말단인 특정 잔기에서 약간 상이할 수 있다. 상기 모티프의 각각의 아미노산은 개별적으로 임의의 다른 19개의 천연 아미노산, 또는 비-천연 아미노산으로 바꿀 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 변이는 보존적인 것, 예를 들어, Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Asp/Glu, Lys/Arg, Asp/Gln, Thr/Ser 또는 Phe/Trp/Tyr은 아니다. 한 실시양태에서, eNOS 폴리펩티드에서 개시하여 (개시 폴리펩티드) 제1 변이를 칼모듈린-결합 도메인의 인산화 부위에 상응하는 위치에 도입시키고, 참조 eNOS 폴리펩티드 (예를 들어, 개시 폴리펩티드 또는 야생형 eNOS 폴리펩티드를 비롯한 다른 eNOS 폴리펩티드)와 비교하여 폴리펩티드 돌연변이체에 대한 eNOS 활성을 분석한다. 예를 들어, 단일 돌연변이체는 개시 eNOS 폴리펩티드와 비교하여, 보다 높은 양의 eNOS 활성 (예를 들어, NO 생성)을 나타내는 것으로 선택할 수 있다. 제1 변이를 생성시키고, 특징규명한 후에, 상기 방법을 이중 변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드를 생성시키기 위해 반복할 수 있으며, 본원에 기재된 바와 같은 추가 변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 생성시키기 위해 추가로 반복할 수 있다. 임의의 수의 변이는 공지된 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다.

폴리펩티드 돌연변이체를 생성시키는 방법 (예를 들어, 이들을 코딩하는 핵산의 변이)은 당업계에 표준적이며 익히 공지되어 있다. 이들 방법은 예를 들어, 상동 재조합, 부위-지정 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 및 PCR-기반 돌연변이유발 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, CSH Press (1989); Kunkel et al. (1985) PNAS 82, 488-492]; 및 [Lee et al. (2001) J. Biol. Chem. Dec 21;276(51):47930-6] 참조)을 포함한다. 상기 변이를 위한 출발 물질은 예를 들어, 임의의, 예를 들어 인간, 마우스, 기니 피그, 개, 소, 돼지, 토끼, 래트, 양, 말, 비-인간 영장류, 또는 다른 동물로부터의 eNOS cDNA일 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 참조 eNOS 폴리펩티드와 비교하여, eNOS 활성 (예를 들어, NO 생성)의 증가 또는 감소를 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 하나 이상의 eNOS 활성의 증가 또는 감소를 나타낼 수 있으며, 활성의 증가 또는 감소 수준은 참조 eNOS 폴리펩티드에 상대적이다. 본 발명의 변이된 폴리펩티드는 표준 분석법을 이용하여, 본원에 기재된 임의의 eNOS 활성에 대해 분석함으로써 특징규명할 수 있다.

예를 들어, 시험관내 또는 생체내에서, 각종 자극에 대한 반응으로 eNOS는 특정 키나제 또는 포스파타제에 의해, 예를 들어 인간 eNOS의 Thr-495 및(또는) Ser-1177 (또는, 다른 종의 경우 필적되는 잔기에서)에서 인산화되거나 또는 탈인산화된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 증가된 NO 생성, eNOS의 CaM 결합 부위에 대한 CaM의 증가된 결합 또는 친화력을 나타내고(거나), eNOS의 Ca⁺⁺ CaM-매개된 활성에 대한 감소된 의존성을 나타낸다. 상기 효소에 의해 생성되는 NO에 의해 간접적으로 매개되는 활성을 포함하여, 본원에 기재되어 있고 당업계에 공지되어 있는 임의의 이들 및 다른 eNOS 활성은 본 발명의 eNOS 조성물 및 방법에 의해 조정될 수 있는 활성이다.

eNOS는 예를 들어, 혈관 내피, 심장 근육세포, 혈액 혈소판, 및 각종 유형의 면역 시스템 세포 (예를 들어, T-세포, 호중구 및 단핵구)에서 발견되며, L-Arg를 NO (다수의 생리 반응에서 조절 기능에 관련되어 있고(거나) 그 기능을 담당하는 기체성 메신저 분자)로 전환시킨다. 또한, eNOS는 칼모듈린에 결합하고, 이는 Ca⁺⁺과 결합하여 eNOS 효소 활성을 활성화시킨다. 다양한 eNOS-결합된 활성은 상기 효소에 의해 생성되는 NO에 의해 직접 및(또는) 간접적으로 매개되는 이들 활성을 포함한다. 상기 eNOS 활성은 예를 들어, 혈관신생의 자극 (정상 또는 손상, 예를 들어 허혈의 결과로 인함); 혈관확장의 자극; 측부 혈관 발달의 자극; 말초 사지 혈류의 증진; 사지 괴사 (예를 들어, 위험한 사지 허혈, 또는 CLI)의 억제; 상처 치유의 증대; 평활근 수축의 억제; 혈소판 부착 및 응집의 억제 또는 방지 (이는 예를 들어, 혈전 형성의 억제를 유도할 수 있음); 심혈관계에 대한 증가된 HDL의 보호 효과의 조정; 내피 세포 증식 및 이동의 자극; 백혈구 활성 및 부착, 케모카인 발현 또는 평활근 증식의 억제; 심근 수축의 억제; 면역 반응의 조절; 및 슈퍼옥사이드 음이온의 제거를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 및 다른 eNOS 활성에 대한 분석 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다.

예를 들어, eNOS 폴리펩티드의 인산화 및(또는) 그 정도를 분석하는 표준 방법은 (예를 들어 이. 콜리 (E. coli)에서 재조합적으로 생산되거나 또는 천연원으로부터 부분 또는 전체 정제된) 단백질을 AMP-활성화된 키나제 (AMPK) 또는 프로테인 키나제 C (PKC)와 같은 키나제, 또는 포스파타제와 함께 인큐베이션 하는 시험관내 방법을 포함한다. 이어서, eNOS 폴리펩티드, 또는 그의 트립신 분해물을 표준 방법, 예를 들어 겔 전기영동 또는 자가방사선기록법과 결합된 컬럼 크로마토그래피 또는 주어진 포스포펩티드에 특이적인 항체로의 이뮨노 블롯을 이용하여 분석할 수 있다. 이들 및 다른 분석법의 경우, 예를 들어 WO00/28076; WO00/62605; WO00/62605, 문헌 [Michell et al. (2001) The Journal of Biological Chemistry 276, 17,625-628]; 및 [Fleming et al. (2001) Circulation Research 88, 68e-75e]를 참조한다.

시험관내 및 생체내에서 eNOS의 발현에 직접 또는 간접적으로 의존하는 다양한 활성을 측정하기 위한 다른 방법은 하기를 포함한다: (1) 칼모듈린 (CaM)의 존재 또는 부재하에서 L-[³H]-시트룰린 생성 측정 (예를 들어, 문헌 [Balligand et al. (1995) J. Biol . Chem. 270, 14,582-586]; [Bredt et al. (1990) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 87, 682-685]; 및 [Fleming et al. (2001) Circulation Research 88, 68e-75e] 참조). 예를 들어, 재조합 eNOS는 CaM과 함께 발현시킬 수 있고 (예를 들어, 문헌 [Rodriguez-Crespo et al. (1996) Arch. Biochem . Biophys. 336, 151-156] 참조), 다양하게 EGTA를 첨가하여 분석할 수 있다 (예를 들어, WO00/28076에 기재된 바와 같음); (2) 칼모듈린에 결합력 측정 (예를 들어, 문헌 [Fleming et al. (2001) Circulation Research 88, 68e-75e]에 기재된 바와 같음); (3) 무손상 세포에서 cGMP의 시간 의존성 및 N^ω-니트로-L-아르기닌-민감성 축적 측정 (예를 들어, 문헌 [Fleming et al. (1998) Circ . Res. 82, 686-695] 참조); (4) NADPH-의존성 리덕타제, 시토크롬 c 리덕타제 활성, 또는 2,6-디클로로페놀린도페놀 (DCIP) 환원과 같은 리덕타제 활성 측정 (예를 들어, WO00/62605; WO00/62605; 문헌 [Martasek et al. (1999) Methods Enzymol. 301, 70-78]; [Masters et al. (1967) Methods Enzymol. 10, 565-573] 참조); (5) 평활근 수축에 대한 효과 측정 (예를 들어, 문헌 [Furchgott 및 Zawadzki (1980) Nature 288: 373-376] 참조); (6) 혈소판 기능에 대한 효과 측정; (7) 화학발광법 또는 헤모글로빈 포획법에 의해 측정되는 세포로부터의 NO 방출 측정 (예를 들어, WO00/62605; WO00/62605; 문헌 [Sessa (1995) J. Biol . Chem. 270, 17641-644]; [Kelm et al. (1988) Biochem . Biophys . Res. Commun. 154, 236-244] 참조); (8) 측부 혈관-의존성 허혈성 사지에서의 증가된 모세관 밀도 또는 혈관운동 재활성에 의해 입증된 바와 같이, 사지 괴사의 억제 측정 (예를 들어, 문헌 [Murohara et al. (1998) J. Clin . Invest., 101, 2567-2568] 참조); (9) 상처 치유, 내피 세포 이동, 증식 또는 분화의 증진 측정 (예를 들어, 문헌 [Lee et al., (1999) Am J. Physiol . 277, H 1600-1608] 참조); 또는 (10) 발기부전의 측정. eNOS 활성 (예를 들어, NO 생성)에 대한 측정법을 예시하는 본원의 실시예를 또한 참조한다.

eNOS 활성을 시험하는 동물 모델은 표준적이며 당업계에 익히 공지되어 있다. 혈관신생 및 혈관재형성을 시험하는 경우, 문헌 [Murohara et al. (1998 ibid); Couffinhal et al. (1998); Am J. Pathol 152, 1667-1669; Couffinhal et al., (1999) Circulation 99, 3188-3198]; 및 본원의 실시예를 참조한다. 상기 분석법은 예를 들어, 수술 후사지 허혈의 마우스 및 토끼 모델 (여기서, eNOS 넉아웃 마우스에서 수술을 수행함)을 포함한다. 후사지 혈류 및 모세관 밀도 측정 방법은 또한 익히 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Murohara et al. (ibid); Couffinhal et al. (1998); Am J. Pathol 152, 1667-1669; Couffinhal et al., (1999) Circulation 99, 3188-3198; 및 본원의 실시예 참조).

본 발명의 eNOS 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 또는 반-합성 폴리펩티드, 또는 그의 조합물, 바람직하게는 재조합 폴리펩티드일 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 단리된 형태로 제공되며, 예를 들어 균질성을 위해 정제할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련된 경우, 용어 "단리된"은 물질을 본래의 환경 (이것이 자연적으로 일어나는 경우, 자연 환경)으로부터 제거하여, 이것이 자연적으로 결합되어 있는 하나 이상의 다른 성분으로부터 단리 또는 분리하는 것을 의미한다. 예를 들어, 자연 생물 숙주에 존재하는 자연 발생 폴리펩티드는 단리되지 않지만, 자연계에 함께 존재하는 물질의 일부 또는 전체로부터 분리된 동일 폴리펩티드는 단리된다. 상기 폴리펩티드는 조성물의 일부이고, 상기 조성물이 그의 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 단리될 수 있다.

본 발명의 eNOS 폴리펩티드의 단편 또는 변이체는 바람직하게는 실질적으로 하나 이상의 eNOS 활성을 보유한다. 상기 eNOS 활성은 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 것일 수 있고, 항체와 반응하는 능력을 갖는 것, 즉 에피토프를 가진 펩티드, 특히 본 발명의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 갖는 것을 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드 단편은 예를 들어 유전자 요법에 유용한, 본 발명에 적합한 임의의 사이즈일 수 있다. 상기 단편은 최소의 특이적인 에피토프 (예를 들어, 약 6개의 아미노산)에서 대략 전장의 유전자 산물 (예를 들어, 전장의 폴리펩티드보다 작은 단일 아미노산)에 이르는 사이즈 범위일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 최소 약 10개, 25개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 800개, 1000개, 또는 1200개의 아미노산을 포함할 수 있다.

예를 들어 전장의 폴리펩티드를 제조하기 위한 중간체로서, 펩티드 합성에 의한 상응하는 전장의 폴리펩티드를 제조하기 위해; 항체 또는 항원-결합 단편의 생성을 유도하기 위해; 공용 데이타베이스의 프로빙을 위한 "조회 서열 (query sequence)"로서; 기타를 위해 본 발명의 폴리펩티드의 단편을 사용할 수 있다.

더욱이, 본 발명의 변이를 포함하는 폴리펩티드 단편은 eNOS 안타고니스트로서 사용할 수 있다. 임의의 특정 메카니즘과 결합되는 것을 원하지 않으면서, 상기 돌연변이체-함유 펩티드 단편, 특히 야생형 eNOS의 칼모듈린에 대한 친화력 또는 결합력과 비교하여 증가된 친화력 또는 결합력을 나타내는 것이 작용하여 세포에서 칼모듈린을 "빨아들여 제거하고", 따라서 세포에서 eNOS의 칼모듈린-유도된 활성을 억제할 수 있는 것을 제시한다. 억제율은 부분 내지 완전 억제에 이를 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 변이체 (예를 들어, 칼모듈린-결합 도메인의 Thr-495 부위 및(또는) 다른 부위에서 이미 변경된 인간 eNOS 폴리펩티드의 변이체)는 예를 들어, (i) 1개 이상의 아미노산 잔기가 보존적 또는 비-보존적 아미노산 잔기로 치환된 것 및 상기 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 코딩되거나 코딩되지 않은 것일 수 있는 것, 또는 (ii) 1개 이상의 아미노산 잔기가 치환체 기를 포함하는 것, 또는 (iii) 폴리펩티드가 또 다른 화합물, 예를 들어 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합된 것, 또는 (iv) 주로 형질전환된 세포와 같은 세포로부터 분비되기 쉬운 단백질의 유전자 처리된 형태를 제조하기 위한 목적의 경우, 추가 아미노산을 폴리펩티드, 예를 들어 리더 또는 분비 서열, 또는 폴리펩티드의 정제에 사용하는 서열에 융합시킨 것일 수 있다. 추가 아미노산은 이종원으로부터 유래될 수 있거나, 또는 천연 유전자에 내인성일 수 있다.

상기 유형 (i)에 속하는 변이체 폴리펩티드는 예를 들어, 뮤테인, 폴리펩티드 돌연변이체 및 유도체를 포함한다. 변이체 폴리펩티드는 예를 들어 1개 이상의 첨가, 치환, 결실, 삽입, 역위, 융합 및 절단, 또는 임의의 이들의 조합에 의해 아미노산 서열에서 상이할 수 있다. 예를 들어, 당업자에게 익히 공지되어 있는 보존적 아미노산 치환은 일반적으로 단백질 기능의 변화를 초래하지는 않는다.

상기 유형 (ii)에 속하는 변이체 폴리펩티드는 예를 들어, 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 공지된 폴리펩티드 변형은 글리코실화, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유결합적 부착, 헴 잔기의 공유결합적 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유결합적 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유결합적 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유결합적 부착, 가교 결합, 사이클화, 디술피드 결합 형성, 탈메틸화, 공유결합적 가교 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마 카르복실화, 글리코실화, GPI 고정기 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 분해 작용, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 단백질로의 운반-RNA 매개된 아미노산의 첨가, 예를 들어 아르기닐화, 및 유비퀴틴화를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 변형은 당업자에게 익히 공지되어 있고, 과학 문헌에 매우 상세하게 기재되어 있다. 특히 몇가지의 일반적인 변형, 예를 들어 글리코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 히드록실화 및 ADP-리보실화는 다수의 기본 텍스트, 예를 들어 문헌 [Proteins--Structure and Molecular Properties, 2nd ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993)]에 기재되어 있다. 다수의 상세 개관, 예를 들어 문헌 [Wold, F., Posttranslationail Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York 1-12 (1983)]; [Seifter et al. (1990) Meth . Enzymol . 182:626-646] 및 [래트tan et al. (1992) Ann. N.Y. Acad . Sci . 663:48-62]이 상기 주제에 있어 이용가능하다.

유형 (iii)에 속하는 변이체 폴리펩티드는 당업계에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어 페길화 또는 다른 화학적 변형을 포함한다.

상기 유형 (iv)에 속하는 변이체 폴리펩티드는 예를 들어, 활성 성숙 폴리펩티드를 생성시키기 위해 프로단백질 일부의 분해에 의해 활성화시킬 수 있는 프레단백질 (preprotein) 또는 프로단백질을 포함한다. 변이체는 각종 하이브리드, 키메라 또는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 상기 변이체의 전형적인 예는 본원의 다른 곳에서 논의된다.

변이체의 다수의 기타 유형은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 익히 공지된 바와 같이 폴리펩티드는 항상 전적으로 선형은 아니다. 예를 들어, 폴리펩티드는 유비퀴틴화의 결과로서 분지형일 수 있고, 이들은 일반적으로 자연 작용 사건 및 자연 발생이 아닌 인간 조작에 의해 일어난 사건을 포함하여 후-번역 사건의 결과로서 분지형과 함께 또는 없이 환형일 수 있다. 환형, 분지형 및 분지 환형 폴리펩티드는 비-번역 자연 작용 및 합성 방법에 의해 합성될 수 있다.

변형 또는 변이는 펩티드 백본, 아미노산 측쇄 및 아미노산 또는 카르복실 말단을 포함하는 폴리펩티드 어느 곳에서나 발생할 수 있다. 동일 유형의 변형은 주어진 폴리펩티드의 여러 부위에서 동일 또는 다양한 정도로 존재할 수 있다. 또한, 주어진 폴리펩티드는 1가지 유형 이상의 변형을 함유할 수 있다. 공유결합적 변형에 의한 폴리펩티드의 아미노기 또는 카르복실기, 또는 둘다의 차단은 자연 발생 및 합성 폴리펩티드에 주로 존재한다. 예를 들어, 단백질분해 작용 이전의 이. 콜리에서 제조된 폴리펩티드의 아미노말단 잔기는 종종 N-포르밀메티오닌이다. 상기 변형은 단백질 제조 방법의 기능일 수 있다. 예를 들어, 재조합 폴리펩티드의 경우, 상기 변형은 숙주 세포 후번역 변형 능력 및 폴리펩티드 아미노산 서열의 변형 신호에 의해 결정된다. 따라서, 글리코실화가 필요한 경우, 폴리펩티드는 글리코실화 숙주, 일반적으로 진핵 세포에서 발현시킬 수 있다. 곤충 세포는 종종 포유동물 세포와 같이 동일한 후번역 글리코실화를 수행하며, 상기의 이유로, 곤충 세포 발현 시스템은 글리코실화의 본래 패턴을 갖는 포유동물 단백질을 효율적으로 발현시키기 위해 발전시켜 왔다. 유사한 고찰이 다른 변형에 적용된다.

변이체 폴리펩티드는 하나 이상의 eNOS 활성의 증가 또는 감소를 나타낼 수 있으며, 여기서 상기의 eNOS 활성의 증가 또는 감소는 참조 eNOS 폴리펩티드의 활성 수준에 상대적이다.

언급한 바와 같이, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 칼모듈린-결합 도메인의 Thr-495 잔기 및(또는) 다른 부위에 더하여 1개 이상의 아미노산을 변형시킨 돌연변이체를 포함한다. 즉, 추가 돌연변이가 eNOS 폴리펩티드의 다른 기능성 도메인에 존재한다. 예를 들어, 하나 이상의 돌연변이는 1개 이상의 촉매성 도메인 (예를 들어, 옥시다제 또는 리덕타제 도메인), 또는 조절 영역 (예를 들어, 미리스토일화 부위, 자가억제 루프, 또는 분자의 C-말단 근처에 존재하는 Ser 인산화 부위, 또는 본원의 다른 곳에 기재된 임의의 기능성 도메인)에 도입시킬 수 있다. 추가 변이는 본원에 기재된 임의의 유형의 돌연변이일 수 있다.

예시적인 추가 돌연변이는 예를 들어 인간 eNOS의 잔기 1177에서의 Ser 인산화 부위의 또 다른 아미노산, 예를 들어 Asp로의 치환, 또는 인간 eNOS의 미리스토일화 부위에서의 돌연변이, 예를 들어 잔기 2의 Ala의 또 다른 아미노산, 예를 들어 Gly로의 치환 (예를 들어, 문헌 [Sessa et al., (1993). Circulation Research 72, 921-924] 참조)을 포함한다.

미리스토일화 부위의 돌연변이된 eNOS 폴리펩티드는 막 보다는 세포의 세포질 내에 위치할 수 있다. 상기 돌연변이체는 eNOS NO 생성을 하향조절하는 병리학적 자극에 저항할 수 있다. 상기 외부 병리학적 자극이 존재하는 죽상경화증, 말초 사지 허혈, 또는 CLI와 같은 상태의 치료에 있어 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체 (또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 사용하기에 이러한 특성이 유리할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 인간 eNOS 폴리펩티드는 Thr-495에서의 위치에 상응하는 아미노산 치환 (예를 들어, Ala, Val, Leu 또는 Ile로의, 바람직하게는 Ala 또는 Val로의 치환); 및(또는) Ser-1177에서의 위치에 상응하는 아미노산 치환 (예를 들어, 바람직하게는 Asp로의 치환); 및(또는) 위치 Gly-2에 상응하는 아미노산 치환 (예를 들어, Ala로의 치환)을 포함하며, 여기서 이중 또는 삼중 돌연변이체는 참조 eNOS 폴리펩티드 (예를 들어, 야생형 eNOS, 또는 다른 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체)와 비교하여 보다 큰 eNOS 활성을 나타낸다.

본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 또한 본 발명의 야생형 eNOS 폴리펩티드 또는 돌연변이체 eNOS 폴리펩티드에 대해 다양한 정도의 서열 상동성 (동일성)을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 본 발명의 eNOS 폴리펩티드에 대해 실질적으로 상동성이거나, 또는 그것에 대해 실질적인 서열 상동성 (서열 동일성)을 나타낸다. 따라서, 본 발명 내에서 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 그의 단편은, 야생형 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대해 적어도 약 65 내지 70％ 서열 상동성(동일성), 바람직하게는 약 70 내지 75％, 75 내지 80％, 80 내지 85％ 또는 85 내지 90％ 서열 상동성(동일성), 및 가장 바람직하게는 약 90 내지 95％ 또는 95 내지 99％ 서열 상동성(동일성)을 나타내는 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 본 발명은 또한 낮은 정도의 서열 동일성을 갖지만, eNOS에 의해 나타나는 하나 이상의 기능 또는 활성을 수행하기에 충분한 유사성을 가진 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명에 따라, 용어 "퍼센트 동일성" 또는 "퍼센트 동일한"은, 서열에 관련될 때, 설명되거나 청구된 서열("참조 서열")과 비교되어지는 서열("비교 서열")의 정렬 후에, 그 서열을 청구되거나 설명된 서열과 비교하는 것을 의미한다. 이어서, 하기 식에 따라서 퍼센트 동일성을 결정한다.

퍼센트 동일성 = 100 [1-(C/R)]

상기 식에서, C는 참조 서열과 비교 서열 사이의 차이점의 수/참조 서열과 비교 서열 사이의 정렬의 길이이고, 여기에서 (i) 비교 서열 내에 상응하는 정렬된 염기 또는 아미노산을 갖고 있지 않은 참조 서열 내의 각각의 염기 또는 아미노산, 및 (ii) 참조 서열 내의 각각의 간격, 및 (iii) 비교 서열 내의 정렬된 염기 또는 아미노산과 다른 참조 서열 내의 각각의 정렬된 염기 또는 아미노산이 차이점을 구성하며; R은 참조 서열 내의 염기 또는 아미노산의 수/비교 서열과의 정렬 길이이고, 참조 서열에서 발생된 간격은 염기 또는 아미노산으로 세어진다.

상기 계산된 퍼센트 동일성이 규정된 퍼센트 동일성보다 적은 정렬이 존재할 수도 있긴 하지만, 비교 서열과 참조 서열 사이에서 상기 계산된 퍼센트 동일성이 규정된 최소 퍼센트 동일성과 같거나 보다 큰 정렬이 존재한다면, 비교 서열은 참조 서열에 대해 규정된 최소 퍼센트 동일성을 갖는다.

바람직한 실시양태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 30％ 이상, 바람직하게는 40％ 이상, 보다 바람직하게는 50％ 이상, 보다 더 바람직하게는 60％ 이상, 보다 더 바람직하게는 70％, 80％ 또는 90％ 이상이다 (예를 들어, 본원에서 91개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열에 대한 제2 서열을 정렬시키는 경우, 30개 이상, 바람직하게는 35개 이상, 보다 바람직하게는 45개 이상, 보다 더 바람직하게는 55개 이상, 보다 더욱 바람직하게는 65개, 70개, 80개 및 90개 이상의 아미노산 잔기를 정렬시킴).

퍼센트 동일성 또는 퍼센트 상동성을 위해 여기에 기재된 설명은 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 동일하게 적용되기 위한 것이다.

서열의 비교 및 2개 서열 사이의 퍼센트 동일성 및 유사성 결정은 수학적 연산방식을 사용하여 달성될 수 있다 [Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.,ed. 및 Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed. Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., 및 Griffin, H.G., eds. Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G.,Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov,M. 및 Devereux,J., eds. M.Stockton Press, New York, 1991].

이러한 수학적 알고리듬의 바람직한 비-제한적 예는 문헌 [Karlin 등 (1993), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:5873-5877]에 기재되어 있다. 이러한 알고리듬은 문헌 [Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 것과 같이 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버젼 2.0)에 포함된다. BLAST 및 갭트 (Gapped) BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 매개변수(예를 들어 NBLASST)를 사용할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 서열 비교를 위한 매개변수를 점수=100, 단어길이(wordlength)-12로 설정할 수 있거나, 또는 바꿀 수 있다 (예를 들어 W=5 또는 W=20).

바람직한 실시양태에서, 문헌 [Needleaman 등, (1970) J.Mol.Biol. 48:444-453]의 알고리듬을 사용하여 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성을 결정하며, 상기 알고리듬은 BLOSUM 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 간격 가중치 (gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치(length weight)를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램 내에 혼입된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은, GAP 프로그램 I GCG 소프트웨어 패키지 (Devereux 등, (1984), Nucleic Acids Res. 12(1): 387)를 사용하여 NW Sgapdna CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 간격 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 결정된다.

서열 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리듬의 다른 바람직한 비-제한적 예는, 마이어스 및 밀러 (Myers and Miller) CABIOS(1989)의 알고리듬이다. 이러한 알고리듬은 CGC 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0)내에 혼입된다. 아미노산 서열 비교를 위해 ALIGN 프로그램을 사용할 때, PAM 120 가중치 잔여 표, 12의 간격 길이 페널티 및 4의 간격 페널티를 사용할 수 있다. 서열 분석을 위한 추가의 알고리듬이 당 기술에 공지되어 있으며, 문헌 [Torellis 등(1994) Comput.Appl.BioSci. 10: 3-5]에 기재된 것과 같은 ADVANCE 및 ADAM 및 문헌 [Pearson 등 (1988) PNAS 85:2444-8]에 기재된 FASTA를 포함한다.

본 발명에 따르면, 단백질 서열에 관련될 때, 용어 "실질적으로 상동성"은 아미노산 서열이 약 90 내지 95％ 이상, 또는 97 내지 99％ 이상, 또는 그 이상 동일함을 의미한다. 실질적으로 상동성인 아미노산 서열은, 고 엄격성 조건하에서 본 발명의 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 핵산 서열에 혼성화되는 핵산 서열, 또는 그의 일부에 의해 코딩될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "고 엄격성" 조건은 예를 들어, 약 5×SSC, 0.5％ SDS, 100㎍/ml 변성 연어 정자 DNA 및 50％ 포름아미드를 함유하는 혼성화 용액 중에서, 42℃에서, 블롯을 긴 폴리뉴클레오티드 프로브와 함께 밤새(예를 들어 12시간 이상) 배양함을 의미한다. 예를 들어 5％ bp 미만의 불일치가 가능한 고 엄격성 조건하에서 블롯을 세척할 수 있고 (예를 들어, 0.1×SSC 및 0.1％ SDS 중에서 65℃에서 30분 동안 2회 세척), 이에 의해 예를 들어 95％ 이상의 서열 동일성을 가진 서열을 선택할 수 있다.

고 엄격성 조건의 기타 비-제한적인 예는 30mM NaCl 및 0.5％ SDS를 함유하는 수성 완충액 중에서 65℃에서 최종 세척을 포함한다. 고 엄격성 조건의 다른 예는 7％ SDS, 0.5M NaPO₄, pH 7, 1mM EDTA 중에서 50℃에서 예를 들어 밤새 하이브리드형성한 다음, 42℃에서 1％ SDS 용액으로 한번 이상 세척한다. 고 엄격성 세척이 5％ 미만의 불일치를 가능하게 하는 반면, 감소 또는 저 엄격성 조건은 20％ 이하의 뉴클레오티드 불일치를 가능하게 할 수 있다. 저 엄격성에서의 하이브리드형성은, 낮은 포름아미드 조건, 낮은 온도 및(또는) 낮은 염 농도 뿐만 아니라 장기간의 배양 시간을 사용하는 것 이외에는 상기와 같이 달성될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 (및 폴리뉴클레오티드)에 관하여 사용된 바와 같이, 용어 단편은 보다 큰 서열의 서브세트 (즉, 보다 큰 서열 내의 잔기의 연속 또는 불연속 서열)인 서열을 의미한다.

본 발명의 폴리펩티드는 임의의 종의 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 기니 피그, 토끼, 농장 동물, 예를 들어 소, 양 또는 돼지, 애완 동물, 예를 들어 개, 말, 비-인간 영장류 또는 기타 동물, 또는 인간의 세포 및 조직으로부터 유래된 것일 수 있으나, 바람직하게는 인간 세포로부터 유래된 것이다. 상기 eNOS의 서열은 다수의 종, 예를 들어 인간 (Janssens et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 14,519-522), 소 (미국 특허 제5,498,539호의 서열 2)에 대해 공지되어 있다. 예를 들어, 개 (진뱅크 ACCESSION AF143503) 및 기니 피그 (진뱅크 ACCESSION AF146041)를 참조한다.

임의의 주어진 포유동물에서, eNOS 폴리펩티드는 각종 조직에서 발견할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 조직 또는 세포내 위치를 측정하는 방법은 표준적이며, 예를 들어 면역조직화학의 표준 방법을 포함한다. eNOS 폴리펩티드는 예를 들어 혈관 내피세포, 심근 세포, 혈액 혈소판, 및 면역 시스템의 각종 세포, 예를 들어 T-세포, 호중구, 및 단핵구에서 발견된다.

eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드

본 발명은 또한 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 그의 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 중단없이 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. "중단없이 코딩하는" 폴리뉴클레오티드란, 인트론 또는 기타 비코딩 서열에 의해 중단되는 ORF에 비교하여, 연속되는 개방 판독 프레임("ORF")을 가진 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 재조합 폴리뉴클레오티드, 천연 뉴클레오티드, 또는 합성 또는 반-합성 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 조합일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 올리고머 및 핵산은 상호교환가능하다. 따라서, "폴리뉴클레오티드"는 전장 폴리뉴클레오티드의 단편, 예를 들어 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자"는 폴리펩티드 사슬을 생성하는데 관련된 DNA의 단편을 의미하고; 이것은 코딩 영역 앞과 뒤의 영역 (리더 및 트레일러) 뿐만 아니라 각각의 코딩 단편(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함할 수도 있다. 본 발명은 본 발명의 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 유전자 (예, 게놈 클론)를 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 재조합 폴리뉴클레오티드, 천연 폴리뉴클레오티드, 또는 합성 또는 반-합성 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합일 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 RNA, PNA 또는 DNA, 예를 들어 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 또는 반-합성 DNA 또는 이들의 조합일 수도 있다. DNA는 삼중, 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수도 있다. 이것은 헤어핀 또는 기타 2차 구조를 포함할 수 있다. RNA는 mRNA, 폴리아데닐화 RNA, 전체 RNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA 등을 포함한다. 또한, DNA/RNA 이중나선이 본 발명에 포함된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 그의 단편은 본 발명에 상용적인 임의의 크기, 예를 들어 프로브로 사용되는 경우 바람직한 특이성을 달성하기에 효과적인 임의의 크기일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 가장 작은 특이적 프로브 (예를 들어, 약 10 내지 12개의 뉴클레오티드)에서 예를 들어 게놈 서열의 일부인 융합 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 경우의 전장 cDNA보다 더 큰 사이즈의 범위에 이를 수 있으며; 단편은 예를 들어 전장 cDNA보다 작은 한 뉴클레오티드만 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 다수의 폴리뉴클레오티드는 약 8개, 10개, 12개, 14개 또는 15개 이상의 연속 뉴클레오티드, 예를 들어 약 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 단편은 예를 들어 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이 혼성화 프로브로서 사용할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 단편은 또한 카세트 돌연변이유발을 위한 개시점으로 유용할 수 있다. 카세트 돌연변이유발 (예를 들어, [Lee et al. (2001) supra] 참조)은 동시에 다수의 돌연변이를 서열로 도입시킬 수 있게 한다. 이어서, 개별 클론이 발현되고, 스크리닝 방법에 의해 바람직한 표현형이 선택되고, 산물을 시퀀싱한다. 예를 들어, 전장 eNOS 돌연변이체는 이. 콜리에서 발현되고, 돌연변이체는 칼모듈린 친화성 컬럼 상에서 흡착에 의해 선별되고, 용출되고, 이어서 웨스턴 블롯팅한다. 이어서, 결합한 돌연변이체의 서열을 표준 시퀀싱 프로토콜을 이용하여 결정할 수 있다. 유사하게는, 돌연변이된 서열을 예를 들어 파지 표현형에 대한 에피토프로서 모티프를 발현하는 발현 시스템에 도입시킬 수 있다. 파지는 칼모듈린 친화성 컬럼에 결합하여, 선택되고, 시퀀싱될 수 있다. 펩티드 라이브러리 접근법은 또한 eNOS 칼모듈린-결합 도메인의 서열이 전체 합성을 개선할 수 있는 바와 같이 사용할 수 있다.

예를 들어, (i) 1개 이상의 뉴클레오티드가 또 다른 뉴클레오티드로 치환되거나 달리 돌연변이된 것, 또는 (ii) 1개 이상의 뉴클레오티드가 변형되며, 예를 들어 치환체 기를 포함하는 것, 또는 (iii) 폴리뉴클레오티드가 또 다른 화합물, 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 반감기를 증가시키는 화합물과 융합된 것, 또는 (iv) 추가의 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 리더 또는 분비 서열을 코딩하는 서열, 또는 폴리펩티드의 정제에 사용되는 서열에 공유결합적으로 결합된 것을 포함하여 다수 유형의 폴리뉴클레토티드의 변이체가 본 발명에 포함된다. 추가 뉴클레오티드는 이종원으로부터 유래될 수 있거나, 또는 천연 유전자에 내인성일 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 야생형 eNOS의 서열에 의해 포함되는 서열을 코딩하는 천연 또는 비-천연-발생 대립형질 변이체인 코딩 서열을 가질 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립형질 변이체는 1개 이상의 뉴클레오티드를 치환, 결실 또는 첨가하여 일반적으로 코딩된 폴리펩티드의 기능을 실질적으로 변형시키는 폴리뉴클레오티드의 변형이다.

코딩 서열 또는 조절 서열에 위치해 있는 기타 변이체 서열은 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 생성, 또는 기능 또는 활성에 영향을 끼칠 수 있다 (예를 들어 증진시키거나 감소시킴).

상기 유형(ii)에 속하는 폴리뉴클레오티드 변형체는 예를 들어 검출 마커의 부착 (아비딘, 비오틴, 방사능 원소, 형광 꼬리 및 염료, 에너지 전달 라벨, 에너지-방출 라벨, 결합 파트너 등)과 같은 변형, 또는 발현, 흡수, 분류, 표지화, 혼성화, 검출 및(또는) 안정성을 개선시키는 잔기를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 또한 바람직한 방법에 따라 고체 지지체, 예를 들어 니트로셀룰로스, 자성 또는 파라자성 미세구체 (예를 들어 미국 특허 제5,411,863호; 미국 특허 제5,543,289호에 기재된 바와 같음; 예를 들어 센자성, 초자성, 파라자성, 초파라자성, 이온 옥시드 및 다당류), 나일론, 아가로스, 디아조트화 셀룰로스, 라텍스 고체 미세구체, 폴리아크릴아미드 등에 부착시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,470,967호; 제5,476,925호; 제5,478,893호를 참조한다.

상기 유형(iii)에 속하는 폴리뉴클레오티드 변형체는 예를 들어 폴리 A⁺ 꼬리, 5'캡 구조, 및 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 이노신, 티오뉴클레오티드 등을 포함한다.

상기 유형(iv)에 속하는 폴리뉴클레오티드 변형체는 예를 들어 각종 키메라, 하이브리드 또는 융합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 코딩 서열을 포함할 수 있고, 동일한 판독 프레임에 융합된 추가의 비-천연 발생 또는 이종 코딩 서열 (예를 들어, 리더, 시그날, 분비, 표지, 효소, 형광, 항생물질 내성 및 기타 또는 진단 펩티드를 코딩하는 서열); 또는 코딩 서열 및 비-코딩 서열, 예를 들어 5' 또는 3' 말단에 존재하거나 코딩 서열에 분산된 비번역 서열, 예를 들어 인트론을 포함할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명은 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체에 대한 코딩 서열이 융합 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 제조하기 위한 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 이종 폴리펩티드 서열)에 의해 코딩되는 또 다른 폴리펩티드 서열에 대한 동일한 판독틀에 융합시킨 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 방식으로 융합시킬 수 있는 폴리펩티드 서열은 예를 들어 숙주 세포로부터 폴리펩티드의 발현 및 분비를 돕는 리더 서열이며, 이는 세포로부터 폴리펩티드의 전달을 제어하는 분비 서열 및(또는) 폴리펩티드를 세포막에 부착시키는 것을 촉진시키는 막횡단 앵커 (anchor) 서열로 작용한다. 리더 서열을 갖는 폴리펩티드는 프레단백질이며, 폴리펩티드의 성숙한 형태로 형성시키기 위해 숙주 세포에 의해 분해되는 리더 서열을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 성숙한 단백질에 더하여 추가 N-말단 아미노산 잔기가 존재하는 프레단백질을 코딩할 수 있다. 프로서열을 갖는 성숙 단백질은 프로단백질이며, 일반적으로 단백질의 불활성 형태이고, 프로서열이 분해되면 활성 단백질로 된다.

본 발명의 방법에서 사용된 폴리뉴클레오티드 변형체는 본 발명의 폴리펩티드의 동정 및(또는) 정제를 위한 마커 서열에 프레임으로 융합된 코딩 서열을 가질 수도 있다. 마커 서열은 예를 들어 세균 숙주의 경우에 마커에 융합된 성숙한 폴리펩티드의 정제를 제공하기 위한 헥사-히스티딘 꼬리 (예를 들어, pQE-9 벡터에 의해 공급됨)일 수 있거나, 또는 포유동물 숙주, 예를 들어 COS-7 세포가 사용될 때 예를 들어 마커 서열이 헤마글루티닌(HA) 꼬리일 수도 있다. HA 꼬리는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응한다 [Wilson, I. 등, Cell, 37:767 (1984)].

다른 유형의 폴리뉴클레오티드 변형체가 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드들은 원하는 목적, 예를 들어 RNAse H와 같은 뉴클레아제에 대한 내성, 개선된 생체내 안정성 등에 의존하여 다양한 공지된 결합, 예를 들어 에스테르, 술파메이트, 술파미드, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸포스포네이트, 카르바메이트 등을 통해 연결될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,378,825호 참조. 원하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 6-메르갑토구아닌, 8-옥소-구아닌 등이 혼입될 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 야생형 eNOS 폴리펩티드에 대해 또는 다른 유기체로부터의 폴리펩티드(오르소로그(ortholog))에 대해 실질적인 상동성을 갖는 한, 다른 유기체의 유전자 좌로부터 유래된 코딩 서열을 가질 수도 있다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 원하는 방법에 따라 표지화될 수 있다. 예를 들어, ³²P, ³⁵S, ³H 또는 ¹⁴C와 같은 방사능 트레이서를 사용하여 폴리뉴클레오티드를 표지화할 수 있다. 예를 들어 방사능표지 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 키나아제 (포스파타제에 의한 탈인산화반응과 함께 또는 이것 없이), 또는 리가제 (표지화되는 말단에 의존하여)를 사용하여 3' 또는 5'말단에서 말단 표지화와 같은 방법에 따라 방사능표지화를 수행할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 면역학적 성질(항원, 합텐), 특정 시약에 대한 특이적 친화성 (리간드), 검출가능한 효소 반응을 완결시킬 수 있는 성질 (효소 또는 조효소, 효소 기질, 또는 효소 반응에 관련된 기타 물질), 또는 특징적인 물리적 성질, 예컨대 형광 또는 바람직한 파장의 빛의 방출 또는 흡수 등을 가진 잔기와 조합하는, 비-방사능 표지화를 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 약 65 내지 100％ (예를 들어, 약 70 내지 75％, 80 내지 85％, 90 내지 95％ 또는 97 내지 99％)의 서열 동일성을 가지며, 본 발명의 야생형 eNOS 또는 돌연변이체 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상동성이거나, 또는 이에 고 엄격성의 조건하에서 혼성화되는 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 서열에 관련되는 경우, 용어 "실질적으로 상동성"은 뉴클레오티드 서열이 본 발명의 야생형 또는 돌연변이체 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 90 내지 95％ 또는 97 내지 99％ 이상 동일하다는 것을 의미한다.

eNOS 폴리펩티드의 발현 및 eNOS 활성에 대한 분석

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 첨가된 벡터를 함유하는 재조합 작제물에 관한 것이다. 상기 작제물은 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함하며, 여기에 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 정방향 또는 역방향으로 삽입한다.

다수의 적합한 벡터가 당업자에게 공지되어 있으며, 다수가 시판되고 있다. 하기 벡터는 예로서 제공된다; 세균성: pQE70, pQE60, pQE-9 (퀴아젠 (Qiagen)), pBS, pD10, 파지스크립트 (phagescript), psiX174, pBluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (스트라타젠 (Stratagene)); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (파마시아 (Pharmacia)); 진핵 세포성: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (스트라타젠) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (파마시아). 그러나, 임의의 다른 플라스미드 또는 벡터도 이들이 숙주 내에서 복제가능하고 생존가능하다면 사용할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터이며, 여기에 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 mRNA 합성을 지시하는 적합한 발현 제어 (조절) 서열(들) (예를 들어, 프로모터 및(또는) 인핸서)과 효과적으로 결합한다. 적합한 발현 제어 서열, 예를 들어, 원핵 또는 진핵 세포 또는 그들의 바이러스의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 공지된 조절가능 프로모터 또는 조절 서열은 원핵세포 (예를 들어, 세균), 효모, 식물, 포유동물 세포 또는 기타 세포에서의 발현을 위해 선택할수 있다. 바람직한 발현 제어 서열은 고도-발현 유전자, 예를 들어 3-포스포글리세레이트 키나제 (PGK), α-인자, 산 포스파타제, 또는 열 쇼크 단백질 등과 같은 해당 효소를 코딩하는 오페론으로부터 유래된다. 상기 발현 제어 서열은 선별 마커가 있는 CAT (클로람페니콜 트랜스퍼라제) 벡터 또는 기타 벡터를 사용하여 임의의 바람직한 유전자로부터 선택할 수 있다. 상기 선택에 대한 2종의 적합한 벡터는 pKK232-8 및 pCM7이다.

사용할 수 있는 특정 명칭의 세균성 프로모터는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 (lambda) P_R, P_L 및 trp를 포함한다. 진핵세포 프로모터는 CMV 이미디어트 어얼리, HSV 티미딘 키나제, 어얼리 및 레이트 SV40, 아데노바이러스 프로모터, 레트로바이러스로부터의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인-I을 포함한다. 적합한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업계의 통상적인 기술 수준 내에서 만족스럽게 수행된다.

고도의 진핵세포에 의한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 발현 벡터에 삽입함으로써 증가시킬 수 있다. 인핸서는 그의 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용하는 통상적으로 약 10 내지 300 bp의 DNA 시스-작용 요소이다. 대표적인 예는 복제 기점 염기쌍 100 내지 270의 최측근 상의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 전기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 최측근 상의 폴리요마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다.

일반적으로, 재조합 발현 벡터는 또한 복제 기점을 포함한다. 발현 벡터는 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위, 전사 종료 서열, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수여자 부위, 및(또는) 5' 플랭킹 또는 비-전사 서열을 포함한다. SV40 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위로부터 유래된 DNA 서열은 필수 비전사 유전자 요소를 제공하기 위해 사용할 수 있다. 상기 벡터는 또한 발현을 증폭시키기 위해 적합한 서열을 포함한다. 또한, 발현 벡터는 바람직하게는 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위한 표현형 특징, 예를 들어 진핵 세포 배양의 경우, 디히드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성, 또는 이. 콜리의 경우, 테트라싸이클린 또는 암피실린 내성을 제공하기 위한 1개 이상의 선별 마커 유전자를 함유한다.

다수의 적합한 발현 벡터는 당업자에게 공지되어 있으며, 다수는 시판되고 있다. 적합한 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열, 예를 들어 SV40의 유도체; 세균성 플라스미드; 파지 DNA; 바큘로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드 및 파지 DNA의 조합물로부터 유래된 벡터, 바이러스 DNA, 예를 들어 백시니아, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, TMV, 계두 바이러스, 및 슈도레이비스를 포함한다. 그러나, 임의의 기타 벡터는 이들이 숙주 내에서 복제가능하고 생존가능하다면 사용할 수 있다. 원핵 및 진핵 숙주에 사용하기 위해 적합한 클로닝 및 발현 벡터는 예를 들어, 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)], [Wu et al, Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, New York, NY, 1997)], [Recombinant Gene Expression Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 62, (Tuan, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1997)], 및 [Current Protocols in Molecular Biology, (Ausabel et al, Eds.,), John Wiley & Sons, NY (1994-1999)]에 기재되어 있다. 유전자 요법의 방법에 적합한 벡터 및 조직 특이적 조절 서열의 추가의 논의는 본원의 하기에 기재되어 있다.

적합한 DNA 서열은 임의의 각종 절차에 의해 벡터로 삽입할 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 당업계에 공지된 표준 절차에 의해 적합한 제한 효소 부위(들)에 삽입된다. 본원에서 논의되는 상기 및 다른 분자 생물학적 기술에 대한 표준 절차는 다수의 용이하게 이용가능한 출처, 예를 들어, 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)]에서 발견된다. 또한, 예를 들어 아데노바이러스 유전자 전달 비히클의 제작에 유용한 구조 재조합 기술에 대해서는 문헌 [Graham et al. (1988) Virology 63, 614-617]을 참조한다. 경우에 따라, 적합한 단계에서 발현 벡터 내에 이종 구조 서열이 번역 개시 및 종료 서열, 이종 구조 서열, 및 바람직하게는 번역된 단백질을 세포주강 또는 세포외 매질로의 분비를 지시할 수 있는 리더 서열과 함께 회합된다.

본 발명은 상기한 것과 같이 작제물로 형질전환/형질감염/형질도입시킨 숙주 세포, 및 상기 세포의 자손에 관한 것이며, 여기서 특히 상기 세포는 예를 들어 eNOS 활성을 조정하는 작용제를 규명하기 위한 eNOS 활성의 분석, 및(또는) 본 발명의 폴리펩티드의 제조 (예를 들어, 예비 제조)에 사용할 수 있는 안정한 세포주가 된다.

적합한 숙주의 대표적인 예로서, 하기를 언급할 수 있다: 세균성 세포, 예를 들어 이. 콜리, 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium); 진균성 세포, 예를 들어 효모; 곤충 세포, 예를 들어 드라소필라 (Drosophila) S2 및 스포도스테라 (Spodoptera) Sf9 (및 기타 곤충 발현 시스템); 포유동물 세포, 예를 들어 CHO, COS (예를 들어, 문헌 [Gluzman, Cell, 23:175 (1981)]에 기재된 원숭이 신장 섬유모세포의 COS-7 세포주), C127, 3T3, CHO, 헬라 (HeLa), BHK 또는 보우즈 흑색종 (Bowes melanoma) 세포주를 비롯한 동물 세포; 식물 세포. 적합한 숙주의 선택은 본원의 교시를 기초로 하여 당업자의 지식 내에서 고려될 것이다. 추정 조정 작용제를 시험하는데 사용되는 세포주는 통상적으로 가변하는 eNOS 활성의 표시에 대한 NO 수준이 모니터링되는 포유동물 세포이다.

작제물의 숙주로의 도입 (또는 전달)은 예를 들어, 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포펙션, 유전자 총 (gene gun), 또는 일렉트로포레이션 (electroporation) (문헌 [Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)])에 의해 수행할 수 있다.

적합한 세포 밀도에 대해 적합한 숙주 균주의 형질전환 및 숙주 균주의 성장을 수행하여, 적합한 방법 (예를 들어, 온도 변이 또는 화학적 유도), 경우에 따라 추가 기간 동안 배양된 세포에 의해 선택된 프로모터를 유도할 수 있다. 유전자조작 숙주 세포는 프로모터를 활성화시키고 (경우에 따라), 형질변환체를 선별하거나 또는 본 발명의 유전자를 증폭시키기 위해 경우에 따라 변형시킨 표준 영양 배지 중에서 배양할 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 사용된 이전의 조건일 수 있으며, 당업자에게 명백할 것이다.

세포는 통상적으로 원심분리하여 수확하고, 물리적 또는 화학적 방법에 의해 분쇄시키고, 생성된 조 추출물을 추가 정제를 위해 보존할 수 있다. 별도로, 이종 폴리펩티드가 숙주 세포로부터 배양액으로 분비되는 경우, 배양액의 상등액을 단백질 공급원으로 사용할 수 있다. 단백질 발현에 사용된 미생물 세포는 동결-융해 사이클링, 소니케이션, 기계적 분쇄, 또는 세포 용혈제의 사용을 포함하는 임의의 표준 방법에 의해 분쇄시킬 수 있다.

황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피 등을 비롯한 표준 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 상기 폴리펩티드를 회수하여 정제할 수 있다. 단백질 리폴딩 단계는 경우에 따라 성숙 단백질의 원심분리를 완료시에 사용할 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는 최종 정제 단계에 사용할 수 있다.

원핵 또는 진핵 숙주로부터 재조합적으로 폴리펩티드를 제조하기 위해 상기 방법에 더하여, 본 발명의 폴리펩티드는 천연원으로부터 제조할 수 있거나, 또는 화학적 합성 절차 (예를 들어, 합성 또는 반-합성)에 의해, 예를 들어 표준 펩티드 합성기로 제조할 수 있다. 세포-유리 번역 시스템은 또한 본 발명의 DNA 작제물로부터 유래된 RNA를 사용하여 상기 단백질을 제조하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 단백질은 또한 트랜스제닉 동물 또는 식물에서 발현되고, 이들로부터 단리 및(또는) 정제할 수 있다. 상기 트랜스제닉 유기체를 제조하고 사용하기 위한 절차는 당업계에 표준적이다. 상기 절차 중 일부는 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.

물론, 재조합 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 전달 비히클 (예를 들어, 유전자 요법에 사용하기 위한 바이러스성 전달 비히클)은 표준 방법에 의해 또한 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 eNOS 돌연변이체 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스를 제조하기 위해서, 감염된 세포를 원심분리하고 용출시킬 수 있으며, 세포 용출물은 바람직하지 않은 오염물, 예를 들어 세포 성분으로부터 바이러스를 단리 (예를 들어, 정제, 분리)하기 위하여 추가로 처리할 수 있다. 아데노바이러스를 정제하기 위한 표준 절차 중에, 예를 들어 세포 파편을 제거하고(거나) 바이러스를 농축하기 위한 원심 분리 또는 팽창 베드 흡착 크로마토그래피, 사이즈 배제 크로마토그래피, 이온 교환 (예를 들어, DEAE) 크로마토그래피, 초원심분리, 초여과 등이 있다.

본원에 개시되는 본 발명은 비-인간 트랜스제닉 동물의 게놈 내에 1개 이상의 카피의 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비-인간 트랜스제닉 동물에 관한 것이다. 본 발명의 트랜스제닉 동물은 그의 게놈 내에 다중 카피의 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 1개의 카피의 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 함유할 수 있으며, 그러나 여기서 상기 유전자는 트랜스제닉 동물의 세포의 일부, 또는 전체에서 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 발현 (바람직하게는 과다발현)을 지시하는 프로모터 (예를 들어, 조절가능 프로모터)와 연결되어 있지는 않다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 발현은 혈관 조직에서 선택적으로 일어난다. 본 발명의 eNOS 돌연변이체가 바람직한 위치에서 선택적으로 발현되는 것을 보증할 수 있는 조절 서열, 예를 들어 조직 특이적 프로모터 또는 인핸서는 당업계에 익히 공지되어 있다. 상기 조절 요소 중 일부는 본원의 다른 곳에서 논의된다. 예를 들어 드로소필라, 씨. 엘레강스, 제브라피시 및 효모를 비롯한 각종 비-인간 트랜스제닉 유기체가 본 발명에 포함된다. 본 발명의 트랜스제닉 동물은 바람직하게는 포유동물, 예를 들어, 소, 염소, 양, 토끼, 비-인간 영장류, 또는 래트, 가장 바람직하게는 마우스이다.

트랜스제닉 동물의 제조 방법은 당업계의 그러한 기술 내에서 능숙하게 수행되며, 예를 들어 이종 재조합 돌연변이유발법 (예를 들어, ENU, 문헌 [Rathkolb et al., Exp. Physiol., 85(6):635-644, 2000]), 및 테트라싸이클린-조절 유전자 발현 시스템 (예를 들어, 미국 특허 제6,242,667호; 문헌 [Wu et al, Methods in Gene Biotechnology, CRC 1997,pp.339-366]; [Jacenko, O., Strategies in Gene래트ing Transgenic Animals, in Recombinant Gene Expression Protocols, Vol. 62 of Methods in Molecular Biology, Humana Press, 1997, pp 399-424] 참조).

트랜스제닉 유기체는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 공급원을 제공하기에, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현 및(또는) 활성을 조정하는 작용제를 규명하고(거나) 특징규명하기에 유용하다. 트랜스제닉 동물은 또한 예를 들어 본 발명의 돌연변이체 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현에 관련된 질환 상태를 위한 모델로서 유용하다.

본 발명은 또한 트랜스제닉 비-인간 동물에 관한 것이며, 여기서 이의 게놈은 상기 폴리펩티드에 대해 코딩하는 다른 포유동물 유전자를 대신하여 본원에 개시되는 돌연변이체 eNOS에 대해 코딩하는 1개 이상의 유전자를 함유한다. eNOS 유전자를 넉아웃시키는 방법 및 이를 돌연변이체 유전자로 대치시키는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, eNOS 유전자가 넉아웃된 마우스의 설명의 경우, 문헌 [Murohara 1998 ibid] 참조). 바람직하게는, 트랜스제닉 동물은 마우스 또는 래트이다.

상기 방법에 더하여, 트랜스제닉 동물 (또는 트랜스유전자를 삽입하여 상기 넉아웃된 유전자를 대치시킨 넉아웃 동물)은 예를 들어 재조합 유전자의 단일-세포 배아의 전핵으로의 전핵 주입법, 인조 효모 염색체의 배아 줄기 세포로의 도입법, 유전자 표적화 방법, 배아 줄기 세포 방법론, 클로닝 방법, 핵 전달 방법을 비롯한 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호; 동 제4,873,191호; 동 제4,873,316호; 동 제5,082,779호; 동 제5,304,489호; 동 제5,174,986호; 동 제5,175,384호; 동 제5,175,385호; 동 제5,221,778호; 문헌 [Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 77:7380-7384, 1980]; [Palmiter et al., Cell, 41:343-345, 1985; Palmiter et al., Ann. Rev. Genet., 20:465-499, 1986]; [Askew et al., Mol. Cell. Bio., 13:4115-4124, 1993; Games et al. Nature, 373:523-527, 1995]; [Valancius and Smithies, Mol. Cell. Bio., 11:1402-1408, 1991]; [Stacey et al., Mol. Cell. Bio., 14:1009-1016, 1994]; [Hasty et al., Nature, 350:243-246, 1995]; [Rubinstein et al., Nucl. Acid Res., 21:2613-2617,1993]; [Cibelli et al., Science, 280:1256-1258, 1998]을 참조한다. 리콤비나제 절단 시스템에 대한 예로서, 예를 들어 미국 특허 제5,626,159호, 동 제5,527,695호, 및 동 제5,434,066호를 참조한다. 또한, 문헌 [Orban, P.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6861-6865 (1992)]; [O'Gorman, S., et al., Science, 251:1351-1355 (1991)]; [Sauer, B., et al., 폴리뉴클레오티드 Research, 17(1):147-161 (1989)]; [Gagneten, S. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25:3326-3331]; [Xiao and Weaver (1997) Nucl. Acids Res. 25:2985-2991]; [Agah, R. et al. (1997) J. Clin. Invest. 100:169-179]; [Barlow, C. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25:2543-2545]; [Araki, K. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25:868-872]; [Mortensen, R. N. et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:2391-2395] (G418 에스컬레이션 방법); [Lakhlani, P. P. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:9950-9955] ("힛 앤드 런" ("hit and run"); [Westphal and Leder (1997) Curr. Biol. 7:530-533] (트랜스포손-생성 "넉-아웃" 및 "넉-인"; [Templeton, N. S. et al. (1997) Gene Ther. 4:700-709] (예를 들어, 선별 마커 없이 고빈도의 상동 재조합 사건을 허용하면서 효과적인 유전자를 표적화하는 방법); PCT 국제 출원 WO 93/22443 (기능적으로-분쇄된)을 참조한다.

트랜스제닉 동물을 생성시키는 경우, 비-인간 포유동물, 예를 들어 마우스 (예를 들어, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1986), 돼지 (예를 들어, Hammer et al., Nature, 315:343-345, 1985), 양 (예를 들어, Hammer et al., Nature, 315:343-345, 1985), 소, 래트, 또는 영장류 (또한, 예를 들어, 문헌 [Church, 1987, Trends in Biotech. 5:13-19]; [Clark et al., Trends in Biotech. 5:20-24, 1987)]; 및 [DePamphilis et al., BioTechniques, 6:662-680, 1988)]를 비롯한 트랜스제닉 동물을 생성시키기 위해 본 발명의 eNOS 폴리뉴클레오티드를 임의의 비-인간 동물에 도입시킬 수 있다. 트랜스제닉 동물은 미국 특허 제5,994,618호에 기재된 방법 및 본원에 기재된 임의의 용도에 이용되는 방법으로 생성 (또는 증식)시킬 수 있다

eNOS 폴리펩티드 결합 파트너

본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체, 또는 그의 변이체, 또는 그를 발현하는 세포는 또한 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체에 특이적으로 결합하는 특이적 결합 파트너, 예를 들어 단백질 및 핵산에 대해 분석하는데 사용할 수 있다. 상기 결합 파트너는 예를 들어 키나제, 포스파타제, 및 칼모듈린을 포함한다. 또한, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 특이적 항체, 또는 항원-결합 단편 등을 생성시키는 면역원으로서 사용할 수 있다. 본원에 기재되어 있고 당업계에 공지된 표준 방법은 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 상기 특이적 결합 파트너에 대해 분석하는데, 및 이를 단리하는데 사용할 수 있다.

"특이적" 항체 또는 항원-결합 단편은 본 발명의 eNOS, 또는 그의 단편 또는 변이체, 특히 본 발명의 돌연변이된 서열에 선별적으로 (선택적으로) 결합하는 것을 의미한다. 폴리펩티드에 항체 "특이적"은 상기 항체가 폴리펩티드 내에 또는 이를 포함하는 아미노산의 정의된 서열을 인식하는 것을 의미한다.

본 발명의 항체는 예를 들어, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 본 발명은 또한 키메라, 재조합, 단쇄, 및 부분적으로 또는 완전히 인간화된 항체, 뿐만 아니라 Fab 단편, 또는 Fab 발현 라이브러리의 생성물, 및 그의 단편을 포함한다. 상기 항체는 IgM, IgG, 아형, IgG2A, IgG1 등일 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 절차는 상기 항체 및 단편을 생성시키는데 사용할 수 있다.

본 발명의 서열에 상응하는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 예를 들어 폴리펩티드의 동물로의 직접 주입에 의해, 또는 폴리펩티드를 동물, 예를 들어 염소, 토끼, 마우스, 닭 등, 바람직하게는 비-인간에 투여함으로써 수득할 수 있다. 따라서, 이렇게 수득한 항체는 폴리펩티드 자체와 결합할 것이다. 상기 방식으로, 심지어 폴리펩티드의 단지 한 단편을 코딩하는 서열을 전체의 본래 폴리펩티드와 결합하는 항체를 생성시키는데 사용할 수 있다. 따라서, 상기 항체는 상기 폴리펩티드를 발현하는 조직으로부터 폴리펩티드를 단리하는데 사용할 수 있다. 항체는 또한 나출형 (naked) DNA를 투여함으로써 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,703,055호; 동 제5,589,466호; 및 동 제5,580,859호를 참조한다.

모노클로날 항체의 제조를 위해, 지속적인 세포주 배양에 의해 생성되는 항체를 제공하는 임의의 기술을 사용할 수 있다. 예로는 예를 들어, 하이브리도마 기술 (Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마 (trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), 및 인간 모노클로날 항체를 생성시키는 EBV-하이브리도마 기술 (Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 포함한다.

단쇄 항체의 생성에 대해 설명된 기술 (예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호)은 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 생성물에 대한 단쇄 항체를 생성시키기 위해 채택할 수 있다. 또한, 트랜스제닉 동물은 본 발명의 부분적으로 또는 완전히 인간화된 항체를 발현시키는데 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 예를 들어 앱타머 (aptamer) 및 PNA를 포함하는 기타 특이적 결합 파트너에 관한 것이다.

eNOS 폴리펩티드 돌연변이체 및 상기 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 진단, 예방, 및 치료 용도

내피 NO 신타제는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 각종 기능 및 활성과 관련되어 있으며; 및 이들 eNOS 폴리펩티드의 이상 발현 및(또는) 활성, 및(또는) 이들 효소에 의해 생성되는 이상량의 NO는 각종 질환 상태와 관련되어 있다. 결과적으로, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체 및 폴리뉴클레오티드, 및 그의 변이체는 상기 상태를 개선시키기 위해 세포에서 eNOS 활성을 조정하는데 사용할 수 있다.

특정 실시양태에서, eNOS의 증가된 발현 및(또는) 활성, 및 eNOS에 의한 NO 생성에 있어서의 동시 증가는 예를 들어 바람직하지 않은 세포 증식, 종양 성장 또는 각종 신생물성 질환을 허용하는 바람직하지 않은 혈관신생과 관련되어 있다. NO 생성의 증가와 관련된 상태 중에, 예를 들어 각종 신생물성 질환 (발암, 종양 발생 및 전이 증식을 비롯함), 방사선 또는 화학요법에 대한 악성 신생물성 종양의 내성, 전이성 또는 전이되지 않는 방광암 (낭선암종), 혈관육종, 및 증식성 망막변증이 있다.

특정 실시양태에서, eNOS의 감소된 발현 및(또는) 활성, 및 eNOS에 의한 NO 생성량의 동시 감소는 각종 상태, 예를 들어 질환 상태, 예를 들어 과다 혈관수축 및(또는) 부적합한 혈관확장에 관련된 상태, 예를 들어 말초 사지 허혈, 말초 동맥 폐쇄성 질환 (PAOD) 및 위급한 사지 허혈 (CLI), 죽상경화증 또는 혈관 혈전증; 심근 허혈, 예를 들어 혈류-제한 심동맥협착증으로부터 야기된 심근 허혈; 예를 들어, 풍선 혈관 성형술에 따른 재협착; 고혈압, 폐 고혈압, 폐쇄 기도 질환, 이식 죽상경화증, 동맥류, 고콜레스테롤혈증, 노화, 염증, 흡연의 영향, 울혈성 심부전, 임신 중독증, 당뇨병, 결손 혈관신생 질환, 레이노 현상 (Raynaud's phenomenon), 프린쯔메탈 협심증 (심혈관연축), 뇌혈관연축, 용혈성-요독증, 발기 기능장애, 및 불량한 상처 치유와 관련된다.

비정상적으로 적은 양의 NO와 관련된 기타 상태는 심부전증, 심대상부전증, 허혈성 심근병증, 확장성 또는 이식후 심근병증, 협심증 (불안정한 앙기나를 비롯함), 관상동맥연축, 이식후 심근병증, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 고트리글리세라이드혈증, 당뇨병 (인슐린-의존성 또는 비의존성)의 혈관 부작용, 만성 신부전증 (요독증), 각종 기원의 내피세포 기능장애 (죽상경화증, 흡연-중독, X 증후군, 비만, 고혈압, 이상지질혈증, 인슐린 내성), 전신 또는 자가 면역 혈관염, 고호모시스틴혈증, 버거씨 혈관염, 혈전-색전성 질환, 심부 또는 표부 정맥 혈전증, 혈관 영역의 동맥 부전증으로 인한 죽상경화증 (뇌허혈 또는 심허혈을 비롯한 허혈), 폐 동맥 고혈압, 부작용 또는 혈액 투석 또는 복막 투석을 포함한다.

불충분한 NO는 또한 자궁 평활근의 바람직하지 않은 수축 또는 경부의 이완과 관련되며; 따라서, 본 발명의 돌연변이체 eNOS의 투여는 자궁에의 투여에 의해 조기 분만을 방지하는데 유용하거나, 또는 경부에의 투여에 의해 분만을 자극하거나 유도하는데 유용하다. 불충분한 NO로 특징지워지는 기타 상태는 전자간증, 월경곤란증 및 요실금을 포함한다.

본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 투여는 또한 면역 반응 조정에 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 eNOS 폴리뉴클레오티드는 T-세포, 혈소판, 호중구, 단핵구, 또는 그들의 활성을 조절하는 NK 세포에 도입시킬 수 있다. 상기 절차에 의해 이로울 수 있는 질환 상태는 예를 들어, 죽상경화증, 염증성 질환, 또는 자가면역 질환을 포함한다.

임의의 특정 이론 또는 메카니즘과 결합되는 것을 원하지 않으면서, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체가 글루코스 및 지방산 대사 둘다를 촉진시킴으로써, 뿐만 아니라 단핵구로의 개선된 영양 및 산소 공급에 의해 허혈성 심질환의 치료에 유용한 것으로 제안한다.

본 발명은 시험관내 또는 생체내에서 (예를 들어, 세포-기반 분석법으로 또는 동물 모델에서) eNOS 폴리펩티드의 합성 및(또는) 활성을 조정하는 그러한 작용제를 규명하기 위한 스크리닝제의 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 돌연변이체 eNOS 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 변이체를 사용할 수 있다. 상기 합성 및(또는) 활성를 억제하는 작용제 (안타고니스트)는 예를 들어 환자의 세포에서 NO 수준의 감소 및 이로 말미암은 생리학적 변화를 야기시킬 수 있다. 상기 합성 및(또는) 활성을 증진시키는 작용제 (아고니스트)는 예를 들어 대상체 세포 내에서 NO 수준을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 예를 들어 칼모듈린 및(또는) 칼슘 농도의 기능으로서 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 인산화 또는 활성을 증가시키거나 감소시키는 그의 능력, 또는 본원에서 논의되는 임의의 eNOS 활성을 조정하는 그의 능력에 대한 추정 조정제를 시험하는 것을 포함하는, eNOS 발현의 조정제를 규명하는 방법에 관한 것이다. 상기 활성을 조정하는 분석 방법은 표준적이며 당업자에게 익히 공지되어 있다.

eNOS 발현 및(또는) 활성을 억제하는 작용제는 eNOS의 과다발현 또는 증가된 활성과 관련된 상태의 증상을 치료, 예방 및(또는) 개선시키는데 유용할 수 있으며; 상기 활성을 증진시키는 작용제는 eNOS의 불충분발현 또는 감소된 활성과 관련된 상태의 증상을 치료, 예방 및(또는) 개선시키는데 유용할 수 있다. eNOS 폴리펩티드의 억제제 (예를 들어, eNOS 활성 또는 발현의 억제제)는 예를 들어 eNOS의 과다생성 또는 증가된 활성과 관련되어 있으며 본원의 다른 곳에 기재된 임의의 상태를 치료하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 eNOS 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 돌연변이체의 자극제는 예를 들어 eNOS의 불충분생성 또는 감소된 활성과 관련되어 있으며 본원의 다른 곳에 기재된 임의의 상태를 치료하는데 사용할 수 있다.

잠재적 안타고니스트 또는 아고니스트에 대해 분석하는 경우, eNOS와 관련된 각종 기능 및(또는) 효소 활성을 사용할 수 있다. 전형적인 기능 및 활성은 본원의 다른 곳에서 논의된다. 분석은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 수행할 수 있으며, 임의의 적합한 세포 또는 조직을 사용하여 수행할 수 있다. 생체내 분석에서 예를 들어 이미 설명한 바와 같은 트랜스제닉 마우스, 또는 본원에서 논의되는 돌연변이체 인간 eNOS를 코딩하는 인간 유전자가 상기 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 다른 마우스 유전자를 대신하여 존재하는 인간화된 마우스를 사용하여 수행할 수 있다.

본원에 기재된 임의의 분석법은 물론 추정의 억제제 또는 자극제의 제조, 규명 및 특징규명할 수 있는 바와 같이, 임의의 각종 고처리량 방법론을 적용한다. eNOS 발현 또는 활성을 조정하는 그의 능력을 기준으로 하여 규명된 작용제는 또한 기타 eNOS 야생형 또는 돌연변이체 폴리펩티드를 조정하는데 유요하고(거나) 하나 이상의 eNOS 활성과 관련된 질환 상태를 진단하거나 또는 치료하기에 유용할 수 있다.

본 발명의 잠재적 조정제, 예를 들어 억제제 또는 활성제는 예를 들어 화학적 소화합물 (예를 들어, 무기 또는 유기 분자), 폴리펩티드, 펩티드 또는 펩티드 폴리펩티드 돌염변이체, 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 등을 포함한다. 기타 억제 물질 또는 자극 물질은 세포에 들어가서 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열에 이웃한 DNA에 직접적으로 결합함으로써 그의 발현을 감소시켜 NO의 세포내 수준을 감소시키거나, 또는 그의 발현을 증가시켜 NO의 세포내 수준을 증가시킬 수 있다.

본 발명은 NO의 변하는 수준과 관련된 실질적이거나 잠재적인 질환 또는 상태 (예를 들어, eNOS 생성 또는 활성에 의해 매개되거나 또는 이와 관련된 질환 또는 상태)를 가졌거나, 또는 그럴 위험이 있을 것으로 여겨지는 동물 (예를 들어, "치료가 필요한 환자")에서 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 양 (그의 존재 또는 부재, 또는 정량), 또는 그의 활성 수준을 측정함으로써 상기 질환 또는 상태를 진단하거나 또는 단계를 파악하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 이를 앓고 있는 동물에서의 질환 진단 방법, 또는 이를 앓을 위험이 있는 동물에서의 민감성 진단 방법을 제공하며, 여기서 상기 질환은 예를 들어 세포, 조직 또는 기관에서의 NO 수준의 바람직하지 않은 증가 또는 감소를 야기시키는 본 발명의 돌연변이의 특정 세포, 조직 또는 기관의 존재와 관련되며, 바람직하게는 상기 동물은 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 상기 진단 방법은 본원의 다른 곳에 기재된 임의의 분석법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 방법에서 본 발명의 항체 또는 항원-특이적 단편에 기초한 방법을 사용하여 돌연변이된 폴리펩티드를 검출할 수 있다. 면역학적 분석법은 예를 들어 ELISA, RIA 및 FACS 분석법을 포함한다. 진단 목적을 위해 샘플을 분석하는 경우, 샘플은 혈액, 요, 타액, 조직 생검 및 부검 물질을 포함하여 (그러나, 이에 제한되지는 않음) 환자로부터 임의의 적합한 세포, 조직, 기관 또는 체액으로부터 수득할 수 있다.

본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 검출은, 또한 예를 들어 돌연변이를 포함하는 이러한 세포를 규명하기 위하여 상기 돌연변이체를 가진 플라스미드로 형질감염시킨 세포를 스크리닝하는 경우, 조사 목적에 유용할 수 있다

본 발명에 따라, 항체 또는 항원-결합 단편은 키트에 존재할 수 있으며, 여기서 키트는 예를 들어 1종 이상의 항체 또는 항원-결합 단편, 바람직한 완충액, 검출 조성물, 대조군으로 사용할 단백질 (예를 들어, 본 발명의 eNOS 돌연변이체)를 포함한다.

폴리뉴클레오티드와 관련된 분석법은 샘플 중의 본 발명의 돌연변이체 eNOS 핵산의 존재 또는 부재를 측정하고(거나) 이를 정량분석하는데 사용할 수 있다. 상기 분석법은 진단, 예후, 조사 또는 법의학 목적에 사용할 수 있다. 상기 분석법은 예를 들어 막-기반, 용액-기반, 또는 칩-기반일 수 있다.

써던 블롯 분석법, 노던 블롯 분석법, 중합효소 연쇄 반응 ("PCR") (예를 들어, 문헌 [Saiki et al., Science, 241:53, 1988]; 미국 특허 제4,683,195호, 동 제4,683,202호, 및 동 제6,040,166호; 문헌 [PCR Protocols: A Guide to Methods 및 Applications, Innis et al., eds., Academic Press, New York, 1990]), 역전사 중합효소 연쇄 반응 ("RT-PCR"), 앵커드 PCR (anchored PCR), cDNA 말단의 급속 증폭 ("RACE") (예를 들어, 문헌 [Schaefer in Gene Cloning 및 Analysis: Current Innovations, Pages 99-115, 1997]), 리가제 연쇄 반응 ("LCR") (EP 320 308), 한-방향 PCR (Ohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:5673-5677, 1989), 인덱싱 (indexing) 방법 (예를 들어, 미국 특허 제5,508,169), 계내 혼성화, 차별 표시법 (예를 들어, 문헌 [Liang et al., Nucl. Acid. Res., 21:3269-3275, 1993]; 미국 특허 제5,262,311호, 동 제5,599,672호 및 동 제5,965,409호; WO97/18454; 문헌 [Prashar and Weissman, Proc. Natl. Acad. Sci., 93:659-663], 및 미국 특허 제6,010,850호 및 동 제5,712,126호; 문헌 [Welsh et al., Nucleic Acid Res., 20:4965-4970, 1992], 및 미국 특허 제 5,487,985호) 및 기타 RNA 핑거프린트법, 증폭에 기반한 핵산 서열법 ("NASBA") 및 기타 증폭 시스템에 기반한 전사법 (other transcription based amplification systems) (예를 들어, 미국 특허 제5,409,818호 및 동 제5,554,527호; WO 88/10315), 폴리뉴클레오티드 어레이법 (예를 들어, 미국 특허 제5,143,854호, 동 제5,424,186호; 동 제5,700,637호, 동 제5,874,219호, 및 동 제6,054,270호; PCT WO 92/10092; PCT WO 90/15070), Q베타 레플리카제법 (QBeta Replicase) (PCT/US87/00880), 스트랜드 디스플레이스먼트 앰플리케이션법 (Strand Displacement Amplification) ("SDA"), 리페어 체인 리액션 (Repair Chain Reaction) ("RCP"), 뉴클레아제 검출법, 감산-기반법, 또는 급속-스캔™ (Rapid-Scan™)을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 분석 형태를 사용할 수 있다.

추가의 유용한 방법은 예를 들어 주형-기반 증폭법 (Template-based amplification method), 경쟁적 (competitive) PCR (예를 들어, 미국 특허 제5,747,251호), 산화환원-기반 분석법 (redox-based assay) (예를 들어, 미국 특허 제5,871,918호), 택만-기반 분석법 (Taqman-based assay) (예를 들어, 문헌 [Holland et al., Proc. Natl. Acad, Sci., 88:7276-7280, 1991]; 미국 특허 제5,210,015호 및 동 제5,994,063호), 실시간 형광-기반 모니터링 (real-time fluorescence-based monitoring) (예를 들어, 미국 특허 제5,928,907호), 분자 에너지 전위 수준(molecular energy transfer label) (예를 들어, 미국 특허 제5,348,853호, 동 제5,532,129호, 동 제5,565,322호, 동 제6,030,787호, 및 동 제6,117,635호; 문헌 [Tyagi and Kramer, Nature Biotech., 14:303-309, 1996])을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 계내 혼성화, 면역세포화학, MACS, FACS, 유속 세포분석법 등을 비롯한 유전자 또는 단백질 발현의 단일 세포 분석에 적합한 임의의 방법을 사용할 수 있다. 단일 세포 분석을 위해, 발현 산물은 항체, PCR, 또는 핵산 증폭의 다른 유형을 사용하여 측정할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Brady et al., Methods Mol. & Cell. Biol. 2, 17-25, 1990]; [Eberwine et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 3010-3014, 1992]; 미국 특허 제5,723,290호). 이들 및 다른 방법은 예를 들어 인용된 참조문헌에 기재된 바와 같이 통상적으로 수행할 수 있다.

본 발명은 또한 동물로부터의 세포에서 폴리뉴클레오티드의 양을 측정하는 것을 포함하는, 이를 앓고 있는 동물에서의 질환을 진단하거나 이를 앓을 위험이 있는 동물에서의 질환에 대한 민감성을 진단하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 질환은 예를 들어 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현과 관련되며, 여기서 동물은 바람직하게는 포유동물이고, 가장 바람직하게는 인간이다. 본원에 기재된 임의의 방법, 또는 당업계에 공지된 다른 방법이 상기 폴리뉴클레오티드의 존재를 측정하고(거나) 이를 정량하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 부분 또는 전체의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들어 상기 질환을 앓을 위험이 있거나 또는 이 질환을 가졌을 것으로 여겨지는 동물의 게놈을 프로빙하기 위해, 또는 예를 들어 돌연변이를 포함하는 이러한 세포를 동정하기 위해 상기 돌연변이체를 가진 플라스미드로 형질감염시킨 세포를 스크리닝하는 경우, 조사 목적으로 상기 돌연변이체 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위해 사용할 수 있는 30 내지 45개 이상의 뉴클레오티드인 프로브를 발생시키기 위한 참조물로서 작용시킬 수 있다.

상기 유형의 혼성화 프로브는 7개 또는 8개 이상의 염기, 보다 바람직하게는 약 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 염기, 및 가장 바람직하게는 약 30개 이상의 염기를 가지며, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 서열의 일부 또는 전체에 대해 약 65 내지 100％ 서열 동일성을 나타낸다. 혼성화 프로브는 선택된 폴리뉴클레오티드에 또는 이에 대해 특이적이다. 어구 폴리뉴클레오티드 "에 대해 특이적" 또는 "에 특이적"은 프로브가 샘플에서 하나 이상의 표적 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 존재를 확인하기 위해 사용할 수 있다는 기능적인 의미를 갖는다. 프로브는 이것이 백그라운드 노이즈 ("비-특이적 결합") 상에서 폴리뉴클레오티드를 검출하는데 사용할 수 있다는 의미에서 특이적이다.

본 발명에 따라, 폴리뉴클레오티드는 키트에 존재할 수 있으며, 여기서 키트는 예를 들어 1개 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 혼성화 프로브), 바람직한 완충액 (예를 들어, 인산염, Tris 등), 검출 조성물, 대조군으로 사용되는 RNA 또는 cDNA (예를 들어, 본 발명의 돌연변이체를 포함함), 라이브러리 등을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 바와 같은 방사능 또는 비-방사능 표지로 표지되어 있거나 표지되어 있지 않을 수 있다.

본 발명은 또한 예를 들어 eNOS의 생성 및(또는) 활성에 영향을 미치는 작용제를 투여함으로써, 또는 본 발명의 돌연변이체 eNOS 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 작용제를 투여함으로써 본원에 기재된 질환 또는 상태를 매개하거나 또는 이에 관련된 eNOS를 대항하는 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 상기 치료는 상기 질환 또는 상태를 억제시키거나 개선시킬 수 있다.

상기 작용제는 표준 절차에 의해 이를 필요로 하는 환자에게 투여할 수 있다. 적합한 전달 경로는 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 정맥내, 근육내, 복강내, 진피내, 동맥내 및 경구 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

상기 작용제는 표준 방법론에 따라 제약상 허용되는 부형제, 담체 등을 포함하는 제약 조성물로 제제화시킬 수 있다. 작용제의 세포막 통과 전달을 증진 (관통을 촉진)시키거나 분해를 방지하는 제형 및 부형제는 또한 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 전달 비히클 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 생체외 전달을 위함)은 예를 들어 리포좀 매개 형질감염 (예를 들어, 여기서 리포좀은 SF-chol 또는 DC-chol과 같은 콜레스테롤 유도체를 함유하는 음이온성 리포좀임); 리포펙타민으로의 형질 감염 등을 비롯한 임의의 각종 표준 절차에 의해 표적 세포로 전달할 수 있다. 전형적인 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,656,565호; 문헌 [Mannino et al. (1988) BioTechniques 6, 682-690] 및 이의 참조문헌; 및 [Gao et al. (1991) Biochem Biophys Res Comm 179, 280-285]에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, eNOS 활성과 관련된 상태를 앓고 있는 환자에게 투여하는 작용제를 질환 상태가 발현되는 부위에 국소적으로 투여한다. 상기 국소 전달은 예를 들어 비-질환 관련된 세포 또는 조직에서 NO 유도로부터 야기된 원하지 않는 효과 (예를 들어 부작용)를 피할 수 있다.

예를 들어, 분자는 심근 세포 골격근 세포를 비롯한 심장 또는 골격 근육에 직접적으로 전달할 수 있다. 예를 들어 트랜스유전자가 고효능 치료를 가능케하는 정도로 발현되기에 충분한 양의 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 투시 유도하에서 표준 경피 카테터 기반 방법을 이용하여 직접 관상내 (또는 이식관) 주입에 의해 심근에 전달할 수 있다. 주입은 관상 동맥의 루멘 (동맥 루멘 내 약 1 cm)으로 깊숙히 이루어질 수 있으며 (이식관), 바람직하게는 측부 혈관의 성장이 개별 환자에서 고도로 다양함으로 주입은 관상 동맥 둘다에서 이루어질 수 있다. 관상 카테터에 의해 관상 동맥의 루멘으로 직접 상기 물질을 주입함으로써, 유전자를 효율적으로 표적화하고, 주입하는 동안 재조합 벡터 또는 폴리펩티드의 손실을 최소화하는 것이 가능하다. 상기 방식으로 전달하는 경우, 유전자 발현은 간세포에서 일어나지 않으며, 바이러스 RNA는 관상내 주입 후에 임의의 시간에 요에서 발견될 수 있다. 임의의 각종 관상 카테터, 또는 예를 들어 층상 관류 카테터는 본 발명에서 사용할 수 있다. 또한, 당업자에게 공지된 다른 기술은 본 발명의 돌연변이체 eNOS를 동맥 벽으로 전달하기 위해 사용할 수 있다. 또한, 문헌 [Giordano et. al., (1994) Clin Res 42, 123A]을 참조한다.

말초 혈관 질환, 즉 다리로의 불충분한 혈액 공급에 의해 특징지워지는 질환의 치료를 위해, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 넙다리 동맥 또는 동맥의 인접 부분에 삽입된 카테터에 의해 전달되고, 이에 의해 넙다리 동맥으로부터 혈류를 받는 골격 근육 세포로의 전달에 영향을 끼칠 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,792,453호를 참조한다.

본 발명의 작용제는 또한 표준 절차를 이용하여 뇌 또는 척수, 자궁 또는 경부 (예를 들어, 크림 또는 좌제로), 또는 임의의 바람직한 위치로 직접적으로 전달할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 치료용 분자 (예를 들어, 본 발명의 돌연변이체 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)는 표준 절차을 이용하여 전신적으로 투여하나, 변형되어 이들이 흥미있는 세포, 조직 또는 기관을 표적한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 프로모터 또는 인핸서 요소와 같은 조직-특이적 조절 요소의 제어하에서 위치할 수 있다.

예를 들어, 아데노바이러스 작제물과 같은 작제물 내에 좌심실 미오신 경쇄-2 (MLC[2V]) 또는 미오신 중쇄 (MHC)를 본 발명의 eNOS 유전자와 같은 트랜스유전자와 융합함으로써, 트랜스유전자 발현이 심실 심근 세포에 한정된다. lacZ를 가진 MLC[2V] 및 MHC 프로모터에 의해 제공되는 유전자 발현의 효율 및 특이성의 정도는 재조합 아데노바이러스 시스템을 이용하여 측정된다. 심장-특이적 발현은 문헌 [Lee et al. (J. Biol. Chem. 267:15875-15885 (1992))]에 보고되어 있다. MLC[2V] 프로모터는 250 bp로 이루어져 있고, 예를 들어 아데노바이러스-5 패키징 컨스트레인트 (adenoviral-5 packaging constraint) 내의 전기에 고정되어 있다. 전사의 활발한 프로모터로 공지된 상기 미오신 중쇄 프로모터는 합당한 별도의 심장-특이적 프로모터를 제공하며, 300 bp 미만으로 이루어져 있다. 골격 근육 특이적 프로모터도 또한 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hauser et al.(2000) Mol. Therapy 2:16-26]; [Li et al. (1999) Nature Biotech. 17:241-245]; 및 특허 WO 99/02737 참조). 평활근 세포 프로모터, 예를 들어 SM22 알파 프로모터 (Kemp et al., (1995) Biochem J 310 (Pt3):1037-43) 및 SM 알파 액틴 프로모터 (Shimizu et al. (1995) J Biol Chem 270(13):7631-43)가 또한 이용가능하다. 상기 조직 특이적 프로모터를 이용하고, 생체내로 트랜스유전자를 전달함으로써, 예를 들어 심근 세포 단독으로 (심장 내의 내피 세포, 평활근 세포, 및 섬유모세포에서의 발현을 수반하지 않고) 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 적합한 발현을 제공할 수 있다.

심근 세포 또는 골격 근육에 제한된 발현은 또한 임상적 심근 허혈 또는 사지 허혈의 치료를 위한 유전자 전달의 유용성을 고려할 때 잇점을 갖는다. 심장 또는 골격 근육에 발현을 제한함으로써, 망막과 같은 조직에서 혈관신생의 잠재적인 해로운 효과를 피한다. 또한, 심장 세포 중 근육 세포는 세포가 급속히 전환되지 않기 때문에 가장 오랜 동안 트랜스유전자 발현을 제공하며; 따라서, 내피 세포에서 발생할 수 있는 바와 같이 발현이 세포 분열 및 사멸에 의해 감소될 수 없다.

내피세포-특이적 프로모터는 상기, 또는 다른 목적을 위해 이미 이용가능하다. 내피세포 특이적 프로모터의 예는 Tie-2 프로모터 (Schlaeger et al. (1997) Proc Natl Acad Sci 1;94(7):3058-63), 엔도텔린 프로모터 (Lee et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:10446-10450), 및 eNOS 프로모터 [(Zhang et al. (1995) J Biol. Chem 270(25):15320-6) 및 (Bu and Quertermous (1997) J. Biol. Chem. 272:32613-32622)]를 포함한다.

본 발명의 한 실시양태에서, eNOS 폴리펩티드 돌연변이체, 또는 그의 변이체를 상기 치료가 필요한 환자에게 투여하고, 상기 폴리펩티드는 예를 들어 환자의 세포, 조직, 또는 기관에서 NO의 비정상적으로 낮은 수준을 포함하여 eNOS의 감소 또는 이상 발현, 또는 활성을 보상할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 전달하는 것을 포함하는, 환자의 결손 내인성 혈관신생으로 인한 허혈성 질환, 구체적으로 말초 혈관 질환, 심근 허혈 또는 위급한 사지 허혈 (CLI)에서 측부 혈관 발생을 자극시키는 방법에 관한 것이다.

바람직한 실시양태에서, eNOS 폴리펩티드 돌연변이체는 세포 안으로 들어가는 그의 능력을 증진시키기 위해 변형시킨다. 예를 들어, 흥미있는 폴리펩티드의 N-말단에서의 HIV-TAT 폴리펩티드의 융합 폴리펩티드 YGRKKRRQRRR (또한, 단백질 형질도입 도메인, PTD로 칭함)은 이. 콜리에서 제조할 수 있으며 변성 단백질 형태로 정제할 수 있다. 상기 융합 폴리펩티드 (예를 들어, PTD-eNOS)는 치료를 위해 환자에게 도입시킬 수 있다. 변성 전장 단백질을 세포로 형질도입시키는 방법은 기술적으로 설명되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Nature Medicine (1998) Vol. 4(12):1449)] 참조).

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 돌연변이체 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 전달하는 것을 포함하는, eMOS의 이상적으로 낮은 활성 또는 적은 양을 갖는 세포 또는 조직에 의해 특징지워지는 상태를 치료하는 방법, 즉 유전자 요법에 관한 것이며, 여기서 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 유전자 전달 비히클로 전달한다. 상기 방법은 본원의 다른 곳에 기재된 임의의 상태를 치료하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 돌연변이체 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스유전자를 전달하는 것을 포함하는, 환자의 결손 내인성 혈관신생으로 인한 허혈성 질환, 구체적으로 말초 혈관 질환 및(또는) 심근 허혈에서 측부 혈관 발생을 자극시키는 방법에 관한 것이다.

유전자 전달 비히클은 바이러스 또는 비-바이러스 기원일 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Jolly, Cancer Gene Therapy 1:51-64 (1994) Kimura, Human Gene Therapy 5:845-852 (1994)]; [Connelly, Human Gene Therapy 1:185-193 (1995)]; 및 [Kaplitt, Nature Genetics 6:148-153 (1994)] 참조). 예를 들어, 본 발명의 치료적 코딩 서열을 비롯한 작제물 전달용 유전자 치료 비히클은 국소적으로 또는 전신적으로 투여할 수 있다. 이들 작제물은 바이러스 또는 비-바이러스 벡터 접근법을 이용할 수 있다. 상기 코딩 서열의 발현은 내인성 포유동물 또는 이종 프로모터를 이용하여 유도할 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구조적이거나 조절할 수 있다.

본 발명은 제작되어 흥미있는 선택된 핵산 분자를 가지고 있거나 발현하는 재조합 레트로바이러스를 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 레트로바이러스 벡터는 EP 0 415 731; WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; 미국 특허 제5,219,740호; WO 93/11230; WO 93/10218; 문헌 [Vile and Hart, Cancer Res. 53:3860-3864 (1993)]; [Vile and Hart, Cancer Res. 53:962-967 (1993)]; [Ram et al., Cancer Res. 53:83-88 (1993)]; [Takamiya et al., J. Neurosci . Res. 33:493-503 (1992)]; [Baba et al., J. Neurosurg. 79:729-735 (1993)]; 미국 특허 제4,777,127호; 영국 특허 제2,200,651호, EP 0 345 242 및 WO 91/02805에 기재된 것을 포함한다.

상기의 레트로바이러스 벡터 작제물과 함께 사용하기에 적합한 패키징 세포주는 용이하게 제조할 수 있으며 (예를 들어, PCT 출원 WO 95/30763 및 WO 92/05266), 재조합 벡터 입자의 제조를 위한 생성자 세포주 (또한, 벡터 세포주라 칭함)를 제조하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 패키징 세포주는 인간 (예를 들어, HT1080 세포) 또는 밍크 모세포주로부터 제조하여 살아남을 수 있는 재조합 레트로바이러스가 인간 혈청에서 불활성이 되게 제조할 수 있다.

본 발명은 또한 알파 바이러스-기본 벡터를 사용한다. 이러한 벡터는 예를 들어 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 셈리키(Semliki) 포레스트 바이러스 (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버(Ross River) 바이러스 (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네주엘란 말 뇌염 바이러스 (ATCC VR-923; ATCC VR-1250, ATCC VR-1249; ATCC VR-532)를 포함한 다양한 종류의 알파 바이러스로부터 구성될 수 있다. 이러한 벡터 체계의 대표적인 예는 미국 특허 제5,091,309호; 5,217,879호; 및 5,185,440호; 및 PCT 공보 번호 WO 92/10578호; WO 94/21792호; WO 95/27069호; WO 95/27044호; 및 WO 95/07994호에 기재된 것을 포함한다.

본 발명의 유전자 전달 비히클은 또한 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터와 같은 파르보바이러스를 사용할 수 있다. 대표적인 예는 WO 93/09239호 (Srivastava), 문헌 [Samulski 등, J.Vir. 63:3822-3828 (1989); Mendelson 등, Virol. 166: 154-165 (1988)]; 및 [Flotte 등, PNAS 90:10613-10617 (1993)]에 개시된 AAV 벡터를 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 각종 변형된 아데노바이러스 벡터 (예를 들어, Ad5 또는 Ad2), 특히 비-복제 벡터 및(또는) 헬퍼 비의존성 바이러스가 당업계에 익히 공지되어 있다. 아데노바이러스 벡터의 대표적인 예는 문헌 [Berkner, Biotechniques 6:616]; [Rosenfeld 등, Science 252: 431-434 (1991)]; WO 93/19191; [Kolls 등, PNAS 215-219 (1994)]; [Kass-Eisler 등, PNAS 90:11498-11502 (1993)]; [Guzman 등 Circulation 88:2838-2848 (1993)]; [Guzman 등, Cir.Res. 73:1202-1207 (1993)]; [Zabner 등, Cell 75:207-216 (1993)]; [Li 등, Hum.Gene Ther. 4:403-409 (1993)]; [Cailaud 등, Eur.J.Neurosci. 5:1287-1291 (1993)]; [Vincent 등, Nat.Genet. 5:130-134 (1993)]; [Jaffe 등, Nat.Genet. 1:372-378 (1992)]; 및 [Levrero 등, Gene 101:195-202 (1992)]에 기재된 것을 포함한다. 본 발명에서 사용가능한 일례의 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655호에 기재된 것을 포함한다. 문헌 [Curiel, Hum.Gene Ther.3: 147-154 (1992)]에 기재된 바와 같이, 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 사용될 수도 있다.

사멸되는 아데노바이러스 단독에 연결되거나 연결되지 않은 다가양이온성 축합 DNA (예를 들어 [Curiel, Hum. Gene Ther. 3:147-154 (1992)]참조); 리간드-결합 DNA (예를 들어, [Wu, J.Biol.Chem. 264:16985-16987 (1989)]참조); 진핵 세포 전달 비히클 세포 (예를 들어, 미국 일련번호 08/240,030 (1994년 5월 9일 출원) 및 미국 일련번호 08/404,796); 광중합된 히드로겔 물질의 침착; 손으로 잡고 쓰는 유전자 전달 입자 총 (예를 들어 미국 특허 제5,149,655호에 기재됨); 이온화 방사선 (미국 특허 제5,206,152호 및 WO 92/11033에 기재됨); 핵 전하 중화 또는 세포 막과의 융합을 포함한, 다른 유전자 전달 비히클 및 방법이 사용될 수 있다. 추가의 접근법이 문헌 [Philip, Mol.Cell Biol. 14:2411-2418 (1994)] 및 [Woffendin, Proc.Natl.Acad.Sci. 91:1581-1585 (1994)]에 기재되어 있다.

나출형 DNA를 사용할 수도 있다. 일례의 나출형 DNA 도입 방법이 WO 90/11092호 및 미국 특허 제5,580,859호에 기재되어 있다. 생체분해성 라텍스 비드를 사용하여 섭취 효율을 개선시킬 수 있다. 비이드에 의한 엔도사이토시스 개시 후에, DNA 코팅된 라텍스 비이드가 세포내에 효율적으로 수송된다. 소수성을 증가시키고 이에 의해 엔도솜의 붕괴 및 세포질 내로의 DNA 방출을 촉진하기 위해, 비이드 처리에 의해 방법을 보다 개선시킬 수도 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포좀이 예를 들어 미국 특허 제5,422,120호, PCT 특허 출원 WO 95/13796호, WO 94/23697호 및 WO 91/14445호 및 EP 0 524 968호에 기재되어 있다.

또한, 사용하기에 적합한 비-바이러스성 전달 방법은 문헌 [Woffendin 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91(24): 11581-11585 (1994)]에 기재된 접근법과 같은 기계적 전달 시스템을 포함한다. 또한, 코딩 서열 및 그의 발현 생성물은 광중합된 히드로겔 물질의 침착을 통해 전달될 수 있다. 코딩 서열의 전달을 위해 사용될 수 있는 다른 통상적인 유전자 전달 방법은 예를 들어 손으로 잡고 쓰는 유전자 전달 입자 총(예를 들어 미국 특허 제5,149,655호에 기재됨)의 사용; 및 전달된 유전자를 활성화시키기 위한 이온화 복사선의 사용 (예를 들어 미국 특허 제5,206,152호 및 PCT 특허 출원 WO 92/11033호에 기재됨)을 포함한다.

치료가 필요한 환자에게 폴리뉴클레오티드를 전달하는 유전자 요법은 생체내 (환자에게 직접 폴리뉴클레오티드를 투여함) 또는 생체외 (예를 들어, 치료해야 할 환자로부터 취한 세포, 또는 치료해야 할 환자로부터 유래하지 않은 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입시키고, 이어서 환자에게 형질감염시킨 세포를 도입시키는 세포-기반 치료법)에서 수행할 수 있다.

본 발명의 돌연변이체 eNOS 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 단독으로, 또는 eNOS의 투여 전, 동안, 후에 예를 들어 FGF, HGF, VEGF 및 bFGF, 특히 VEGF 또는 bFGF를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 작용제와 함께 투여할 수 있다. 상기 성장 인자를 제조하고, 투여하고 이의 투여 효과를 시험하는 방법은 표준적이다. 예를 들어 문헌 [Papapetropoulos et al., (1997) J Clin Invest 100, 3131-3139], [Brock et al., (1991) Am J Pathol 138, 213-221], 및 [Ku et al., (1993) Am J Physiol. 265, H 586-592] 및 이의 참조문헌을 참조한다. 상기 성장 인자는 표준 절차를 이용하여 적합한 표현 벡터 (독립적이거나,또는 본 발명의 eNOS 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 벡터로)로 클로닝할 수 있다. VEGF로의 근육내 유전자 요법에 의해 혈관신생을 유도하는 방법의 경우, 예를 들어, 문헌 [Rivard et al., (1999) Am J Pathol 154, 355-363]을 참조한다.

상기 및 하기 실시예에서, 모든 온도는 섭씨 온도로 정정되지 않은 채로 나타내며; 달리 지시하지 않는다면, 모든 부 및 백분율은 중량부 및 중량％이다.

하기 샘플은 예시하기 위해 제공되며 임의의 방식으로 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다.

실시예 1: eNOS 폴리펩티드 돌연변이체 및 재조합 플라스미드 및 바이러스 벡터

시험관내 및 생체내에서, 세포에서 eNOS 야생형 및 폴리펩티드 변이체의 플라스미드 벡터 전달 및 발현을 위하여, 단일 또는 이중 변이체를 가진 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 플라스미드 벡터를 생성하였다. eNOS 폴리뉴클레오티드 서열에서 직접적으로 쿤켈(Kunkel) 부위특이적 돌연변이유발을 사용하여 변이체를 생성하였다 [Kunkel, T.A.PNAS 1985; 82:488-492]. 서열결정에 의해 돌연변이를 입증하였다. 야생형 변이체 작제물의 cDNA를 플라스미드 벡터, p셔틀(Shuttle)-CMV 내에 클론화하여, CMV 발현 카세트 내에 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 위치시켰다. 그 결과, 이러한 작제물에서 폴리뉴클레오티드가 CMV 프로모터에 작동적으로 연결되고, 그 결과 프로모터가 세포에서 코딩된 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 발현을 진행시켰다.

단일 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체에서, 인간 eNOS의 칼모둘린 결합 부위에서 위치 495에 상응하는 Thr (도 1 참조)을 Ala, Asp 또는 Val (각각 변이체 T495A, T495D, T495V로 명명됨)으로 치환하였다. 이중 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체에서, 위치 1177에 상응하는 Ser을 Asp로 치환하고, 추가로 위치 495에 상응하는 Thr을 Ala, Asp 또는 Val (각각 T495A+S1177D, T495D + S1177D, T495V + S1177D로 명명됨)으로 치환하였다. 이러한 돌연변이는 서열결정에 의해 입증되었고, HEK 293 세포에서 NO 생성을 증가시키는 능력에 대해 시험하였다 (실시예 2 및 도 2).

상기 기재된 단일 및 이중 돌연변이를 갖는 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 아데노바이러스 벡터를 문헌 [He 등 (1998) PNAS 95(5), 2509-2514]에 기재된 방법에 따라 생성하고, 시험관내 및 생체내에서 세포 내에 eNOS 야생형 및 폴리펩티드 변이체의 바이러스 벡터 전달을 위해 사용하였다. eNOS 폴리펩티드 돌연변이체(상기 기재됨)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 보유한 p셔틀 벡터를, E1 및 E3-결실된 Ad5 게놈을 함유한 플라스미드와 함께, 이.콜리 BJ5183 내에 동시-형질전환하였다. 아데노바이러스 벡터 주쇄는 아데노바이러스 5로부터 유래되었다. 이러한 벡터 주쇄에서, 아데노바이러스 서열의 E1 영역을 뉴클레오티드 454 및 3333 사이에서 결실시키고, 부분 E3 결실 (뉴클레오티드 30004 내지 30750)을 645bp 외래 DNA로 대체하였다. 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 발현을 위하여 CMV 프로모터 (-632 내지 +7에서) 및 SV 40 폴리아데닐화 시그날이 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되도록, E1-결실 부위에서 폴리뉴클레오티드를 삽입할 수 있다.

이어서, eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 선택하고, 제한 엔도뉴클레아제 분석에 의해 확인하였다. 상응하는 바이러스를 플라스미드로부터 잘라낸 재조합 아데노바이러스 게놈과 함께 293 세포의 형질감염에 의해 구제하였으며, 이어서 바이러스를 293 세포에서 증폭시키고, 표준 CsCl 구배 정제에 의해 정제하고, HAEC에서 NO 생성을 위한 시험에 사용하였다 (실시예 3 및 도 3).

추가로, eNOS 폴리펩티드 돌연변이체 NOS1177D (Sessa 등, 예일 유니버시티(Yale University)에 의해 제공됨)는 서열 1의 리덕타제 도메인에서 아미노산 잔기 1177에 상응하는 위치에서 Asp으로의 아미노산 치환을 갖는다. 세포에서 이러한 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 활성을 시험하기 위하여, 이러한 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 아데노바이러스 주쇄 (실시예 1에서 상기 기재됨) 내에 E1 위치가 결실된 위치에서 삽입하였다. 얻어진 재조합 벡터 Ad5NOS1177D는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체 NOS1177D를 코딩한다. 재조합 벡터 Ad5NOS1177D를 팩키징 세포 내에 형질감염하였으며, 얻어진 바이러스를 플라그 정제하고, 2회 증폭시켰다. 3L-생체반응기에서 HEK293 세포의 대규모 감염을 접종하기 위하여 제2 증폭으로부터의 바이러스를 사용하였다. 얻어진 바이러스를 2회의 CsCl 구배 분리에 의해 정제하고, 10mM 트리스 pH 8.0, 2mM MgCl₂ 및 4％ 슈크로스에 대해 투석하였다. HAEC에서 NO 생성을 시험하기 위하여 분취량의 정제된 재조합 바이러스를 사용하였다 (실시예 3, 5 및 7 참조).

Ad5EGFP는 대조군이고, 리포터 유전자, 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 아데노바이러스 벡터이다. 이것은 콜레트럴 테라퓨틱스(Collateral Therapeutics)에 의해 제조된 다음, HEK293 세포에서 증폭되고 FPLC에 의해 정제되었다. 정제된 바이러스를 PBS pH 7.2 및 2％ 슈크로스에 대해 투석하였다. 분취량의 정제된 대조 바이러스를 이후의 실험을 위한 대조로서 사용하기 위하여 -80℃에서 보관하였다 (실시예 5 및 7 참조).

실시예 2: HEK 293 세포에서 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 활성 검출 및 측정

HEK 293 세포에서 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 활성을 시험하고 측정하기 위하여, eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 플라스미드 벡터(실시예 1에 기재됨)를 사용하여, HEK 293 세포에서 폴리펩티드 변이체를 전달하고 발현하였다. 먼저,10％ FBS (세라케어), 2mM 추가의 L-글루타민 및 50㎍/ml 겐타마이신을 함유하는 생육 배지(알파 MEM (기브코 12561-056))의 웰 당 2ml 중에서 HEK 293 세포를 6-웰 플레이트에 도말하였다. 세포가 약 75％ 융합성일 때, 이들을 T495A, Thr495D 또는 T495V eNOS 폴리펩티드 돌연변이체 (실시예 1에서 상기 기재됨)를 코딩하는 플라스미드 셔틀 벡터 또는 야생형 인간(WT) eNOS (서열 1) 또는 양쪽 모두로 형질감염하였다.

WT eNOS 또는 돌연변이체 eNOS를 코딩하는 플라스미드 셔틀 벡터 8㎍, 60㎕ 리포펙타민 2000 (인비트로겐) 및 200 I 옵티멤(OptiMEM) (기브코)를 혼합하고, 실온에서 30분간 배양한 후에, HEK 293 세포를 함유한 각각의 웰에 111㎕의 혼합물 + 420㎕ 옵티멤을 첨가함으로써 형질감염을 수행하였다. 37℃에서 2.5시간동안 배양한 후에, 2ml의 생육 배지를 각각의 웰에 첨가하였다.

2일 후에 (세포를 37℃, 5％ CO₂에서 배양함), 화학발광을 사용하여 세포에 의한 NO 생성을 측정한 후에, 세포를 용해시키고, 하기 기재된 바와 같이 ELISA 분석을 사용하여 용해물을 eNOS 단백질 함량에 대해 분석하였다. 상이한 플라스미드 사이의 형질감염 효능에서의 변동을 보정하기 위하여, eNOS 단백질의 양으로 NO 생성을 표준화하였다.

NO 생성의 측정

배지를 제거하고, 각각의 웰을 2ml NO 분석장치 완충액 (5mM Na HEPES, 140mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgCl₂, 10mM 글루코스, 10mM CaCl₂, 5mM L-아르기닌, pH 7.5)로 2회 세척하였다. 이어서, 완충액을 100U/ml 초과산화물 디스뮤타제 및 40ng/ml VEGF를 함유하는 1ml의 NO 분석장치 완충액으로 대체하였다. 웰을 파라핀으로 덮고, 37℃에서 30분동안 배양한 후에, 제조업자의 지시에 따라 NO의 측정을 위하여, 세포 위의 완충액 0.8ml를 시에멘스 NOA280 화학발광 검출기 내에 주입하였다. 인증된 NO 기체를 표준으로 사용하였다. NO 측정을 완결한 후에, 세포 위의 남은 완충액을 제거하고, 세포를 0.6ml 용해 완충액 (0.5％ NP-40, 50mM 트리스-HCl pH7.5, 1㎍/ml 펩스타틴 A, 1 ㎍/ml 류펩틴, 5 ㎍/ml 아프로티닌, 24 ㎍/ml 페파블록 SC (뵈링거 만하임))에 용해시키고, -20℃에서 보관하였다.

eNOS 단백질의 측정:

96-웰 ELISA 플레이트 (코스타 3590)를 50mM Na 탄산염 완충액 pH 9.5중의 5㎍/ml의 코팅 항체 (토끼 폴리클로날 항-eNOS) 웰 당 100㎕로 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 키홀 림페트 헤모시아닌에 결합된 인간 eNOS의 잔기 599 내지 614에 상응하는 펩티드로 면역화된 토끼로부터 폴리클로날 항체(바브코)를 수집하고, 단백질 G 세파로스(아머샴)를 사용하여 정제하였다. 플레이트를 PBS+0.01％ 트윈 20 중에서 0.5％ I-블록 (트로픽스)의 200㎕/웰로 차단하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 플레이트를 웰 당 350㎕의 PBS+0.5ml/L 트윈 20으로 3회 세척하였다. eNOS를 함유하는 HEK 293 세포 용해물을 플레이트에 첨가하고, 용해 완충액으로 60㎕/웰의 최종 부피까지 5-배 또는 10-배 희석하고, 실온에서 1.5 내지 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 웰 당 350㎕의 PBS + 0.5ml/L 트윈 80으로 3회 세척하였다.

참조문헌 2에 기재된 것과 같이 유로피움-표지화된 검출 항체, 모노클로날 항-eNOS 항체 (형질도입 랩 N30020)를 다음과 같이 첨가하였다: 왈락 분석 완충액(왈락/퍼킨엘머(Wallac/PerkinElmer) 1244-111)중의 125ng/ml 유로피움-표지화 항체, 100㎕/웰. 플레이트를 실온에서 1.5시간동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 웰당 350㎕의 PBS+0.5 ml/L 트윈 20으로 3회 세척하였다. 왈락 증진 용액 (왈락/퍼킨엘머 1244-105)을 첨가하였다, 100㎕/웰. 플레이트를 플레이트 밀봉제로 덮고 4℃에서 밤새 보관한 다음, 10분동안 혼합한 후에 플레이트를 왈락 1420 빅터(VICTOR)² 다표지 카운터 (퍼킨엘머 라이프 사이언스)에서 판독하고, 615nm에서 시간-분해 형광을 검출하였다 [Aberie S 등, Nitric Oxide 1, 226 (1997); Meurer J 등, Methods in Enzymology 359, 433-444 (2002)].

결과는, eNOS 폴리펩티드 돌연변이체가 HEK 293 세포에서 NO의 생성을 자극하고, 단일 돌연변이체 T495A 및 T495V 및 이중 변이체 T495A+S1177D 및 T495A+S1177D가 야생형 eNOS에 비교하여 증가된 수준의 NO 생성을 자극한다는 것을 나타낸다 (도 2).

실시예 3: HAE 세포에서 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 검출 및 측정

웰 당 350,000개 인간 대동맥 내피 세포(HAEC)를 10％ FBS를 함유하는 4ml의 EGM 성장 배지(캠브렉스) 중에 6 웰 플레이트에 도말하였다. 세포를 5％ CO₂중에서 37℃에서 배양하였다. 그 다음날, 야생형 또는 돌연변이체 eNOS(Thr495Ala, Thr495Asp, Thr495Val 또는 Ser1177Asp)를 코딩하는 아데노바이러스 (웰 당 2×10⁷ 총 바이러스 입자, 웰 당 약 2×10⁷ 감염성 입자)를 각각의 웰에 첨가하였다. 바이러스로 4시간 배양 후에, 배지를 제거하고, 0.1％ 젤라틴 및 30μM 세피아프테린 (시그마)로 보충된 2ml의 EBM 성장 배지(캠브렉스)로 대체하였다. 20시간 후에, 화학발광을 사용하여 세포에 의한 산화질소 생성을 측정한 후, 세포를 용해시키고 용해물을 하기 기재된 바와 같이 ELISA를 사용하여 eNOS 단백질 함량에 대해 분석하였다. 상이한 eNOS 돌연변이체를 보유하는 상이한 아데노바이러스 작제물에 의한 형질감염 효능 차이의 결과로서, 발현 수준에서의 변동을 보정하기 위하여, 산화질소 생성을 eNOS 단백질의 양으로 표준화하였다.

결과는, eNOS 폴리펩티드 돌연변이체가 HEK 293 세포에서 NO의 생성을 자극하고, 야생형 eNOS에 비교하여 단일 돌연변이체 T495A 및 T495D가 증가된 수준의 NO 생성을 자극한다는 것을 나타낸다 (도 3). 이 연구의 결과는, NO 방출을 자극하기 위하여 세포가 VEGF로 자극되는 반면 실시예 2에 기재된 연구에서 칼슘 이오노포어가 사용된다는 점에서, 실시예 2에 기재된 것과 상이하다. 또한, 아데노바이러스 감염은 플라스미드 DNA로의 형질감염에 비교하여 세포당 더 많은 eNOS 단백질 (더 많은 산화질소)을 생성하였다. 그 결과, 이 연구에서 eNOS의 과다 발현이 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체에 대해 관찰되는 NO 활성의 수준에 기여할 수도 있다.

인간 대동맥 내피 세포는 내인성 야생형 eNOS를 함유하지만, 과다-발현된 돌연변이체 eNOS로부터 생성된 NO의 양은 내인성 eNOS의 수준의 약 20배이다. 실시예 2 및 3에 기재된 데이타에서, 산화질소 생성을 eNOS 단백질의 양으로 표준화하고, 따라서 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체가 동일한 범위에서 활성을 갖는다. 아데노바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터 및 상이한 세포 유형을 사용하여 상이한 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체들 사이에서 검출된 NO 생성의 수준은, 보조인자 이용가능성과 같은 세포에서의 다른 제한 인자에 기인할 수 있다.

따라서, HAEC에서 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체를 보다 시험하면, 상이한 세포 유형에서 eNOS 발현 및 활성의 효과를 보다 명료하게 할 수 있다.

실시예 4: 상이한 NOS 이소형의 결정을 위한 마우스 골격근 용해물의 웨스턴 블롯

eNOS의 상이한 이소형은 웨스턴 블롯 분석법을 이용하여 검출할 수 있고, 당업계에 공지된 표중 방법에 의해 단리할 수 있다. 상기 실시예에서, 마우스 골격근 용해물을 상이한 마우스 eNOS 이소형을 검출하는데 사용하였다.

SDS-PAGE:

각각의 샘플에 대하여, 30㎕의 근육 균질화물을 100mM 디티오트레이톨을 함유하는 10㎕ 4× 샘플 완충액 (인비트로겐 목록 번호 NP0007)에 첨가하였다. 100℃에서 7 내지 8분동안 가열한 후에, 각각의 샘플을 10％ 트리스-글리신 SDS-PAGE 겔(BMA PAGEr 목록 번호 59102)에 부하하였다. 필요한 경우에, 재조합 인간 eNOS를 함유하는 (40㎕의 1× 샘플 완충액 중의) 1㎕의 HEK 세포 용해물을 포지티브 대조로서 첨가하였다. 미리염색된 단백질 마커 (10㎕의 인비트로겐 LC5725)를 겔의 하나의 레인에 부하하였다. 버렉스(Berlex) 매질 준비 부서에 의해 제공된 1× 래믈리 주행 완충액(Laemmli Running Buffer)중에서 130V (일정 전압)에서 1.5시간동안 겔을 주행시켰다.

니트로셀룰로스 상으로의 블롯팅:

노벡스/인비트로겐 장치(장치를 전달 완충액에 미리 침지하였다)를 사용하여, 20V(일정)에서 2시간동안 니트로셀룰로스 상에 단백질을 전달하였다 (전달 완충액 = 100ml 10× 전달 완충액, 버렉스 매질 준비에 의해 제공됨 + 200ml 메탄올 + 700ml H₂O). 블롯팅 후에, 니트로셀룰로스를 20ml TBS + 5％ 탈지 건조유 중에서 4℃에서 밤새 저장하였다 (TBS=0.02M 트리스-HCl, 0.12M NaCl, pH 7.5).

항체를 사용한 단백질 검출 (모든 단계는 실온에서 수행됨):

블롯을 제1 항체 (항-eNOS 또는 항-bNOS 마우스 모노클로날 BD/TBS 중에 1:2000으로 희석된 형질도입 랩 + 0.1％ 트윈 20 + 5％ 탈지 건조유) 중에 1시간 15분동안 배양하였다. 이어서, 블롯을 다음과 같이 세척하였다: TBS + 0.1％ 트윈 20중에서 1회 10분 및 2회 5분 세척. 이어서, 제2 항체 (퍼옥시다제-접합 염소 항-마우스 IgG, 케미콘 인터내셔날 AP308P 또는 로셰 1814168, TBS + 0.1％ 트윈 20 + 5％ 탈지 건조유 중에 1:3000으로 희석됨)에서 1시간동안 블롯을 배양하였다. 상기 기재된 바와 같이 세척하고 추가로 TBS (트윈 부재)에서 5분 세척한 후에, 블롯을 ECL 시약 중에서 1시간동안 배양하였다 (아머샴 파마시아 RPN 2106). 이어서, 블롯을 사란 랩(Saran Wrap)으로 덮고, 아머샴 파마시아 하이퍼필름 ECL (RPN 1674A)에 대해 1 내지 5분간 노출시키고, 필름을 현상하였다.

본 출원은 제2002년 8월 16일에 출원된 미국 가출원 제60/403,638호를 우선권으로 주장하며, 이는 본원에 참조로 인용되어 있다.

<110> Blasko, Eric Kauser, Katalin Parkinson, John <120> eNOS Mutants Useful for Gene Therapy <130> 53035AWOM1 <150> US 60/403,638 <151> 2002-08-16 <160> 8 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1203 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Glu Pro Gly Pro Pro Cys Gly 1 5 10 15 Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Cys Gly Lys Gln Gly Pro Ala 20 25 30 Thr Pro Ala Pro Glu Pro Ser Arg Ala Pro Ala Ser Leu Leu Pro Pro 35 40 45 Ala Pro Glu His Ser Pro Pro Ser Ser Pro Leu Thr Gln Pro Pro Glu 50 55 60 Gly Pro Lys Phe Pro Arg Val Lys Asn Trp Glu Val Gly Ser Ile Thr 65 70 75 80 Tyr Asp Thr Leu Ser Ala Gln Ala Gln Gln Asp Gly Pro Cys Thr Pro 85 90 95 Arg Arg Cys Leu Gly Ser Leu Val Phe Pro Arg Lys Leu Gln Gly Arg 100 105 110 Pro Ser Pro Gly Pro Pro Ala Pro Glu Gln Leu Leu Ser Gln Ala Arg 115 120 125 Asp Phe Ile Asn Gln Tyr Tyr Ser Ser Ile Lys Arg Ser Gly Ser Gln 130 135 140 Ala His Glu Gln Arg Leu Gln Glu Val Glu Ala Glu Val Ala Ala Thr 145 150 155 160 Gly Thr Tyr Gln Leu Arg Glu Ser Glu Leu Val Phe Gly Ala Lys Gln 165 170 175 Ala Trp Arg Asn Ala Pro Arg Cys Val Gly Arg Ile Gln Trp Gly Lys 180 185 190 Leu Gln Val Phe Asp Ala Arg Asp Cys Arg Ser Ala Gln Glu Met Phe 195 200 205 Thr Tyr Ile Cys Asn His Ile Lys Tyr Ala Thr Asn Arg Gly Asn Leu 210 215 220 Arg Ser Ala Ile Thr Val Phe Pro Gln Arg Cys Pro Gly Arg Gly Asp 225 230 235 240 Phe Arg Ile Trp Asn Ser Gln Leu Val Arg Tyr Ala Gly Tyr Arg Gln 245 250 255 Gln Asp Gly Ser Val Arg Gly Asp Pro Ala Asn Val Glu Ile Thr Glu 260 265 270 Leu Cys Ile Gln His Gly Trp Thr Pro Gly Asn Gly Arg Phe Asp Val 275 280 285 Leu Pro Leu Leu Leu Gln Ala Pro Asp Glu Pro Pro Glu Leu Phe Leu 290 295 300 Leu Pro Pro Glu Leu Val Leu Glu Val Pro Leu Glu His Pro Thr Leu 305 310 315 320 Glu Trp Phe Ala Ala Leu Gly Leu Arg Trp Tyr Ala Leu Pro Ala Val 325 330 335 Ser Asn Met Leu Leu Glu Ile Gly Gly Leu Glu Phe Pro Ala Ala Pro 340 345 350 Phe Ser Gly Trp Tyr Met Ser Thr Glu Ile Gly Thr Arg Asn Leu Cys 355 360 365 Asp Pro His Arg Tyr Asn Ile Leu Glu Asp Val Ala Val Cys Met Asp 370 375 380 Leu Asp Thr Arg Thr Thr Ser Ser Leu Trp Lys Asp Lys Ala Ala Val 385 390 395 400 Glu Ile Asn Val Ala Val Leu His Ser Tyr Gln Leu Ala Lys Val Thr 405 410 415 Ile Val Asp His His Ala Ala Thr Ala Ser Phe Met Lys His Leu Glu 420 425 430 Asn Glu Gln Lys Ala Arg Gly Gly Cys Pro Ala Asp Trp Ala Trp Ile 435 440 445 Val Pro Pro Ile Ser Gly Ser Leu Thr Pro Val Phe His Gln Glu Met 450 455 460 Val Asn Tyr Phe Leu Ser Pro Ala Phe Arg Tyr Gln Pro Asp Pro Trp 465 470 475 480 Lys Gly Ser Ala Ala Lys Gly Thr Gly Ile Thr Arg Lys Lys Thr Phe 485 490 495 Lys Glu Val Ala Asn Ala Val Lys Ile Ser Ala Ser Leu Met Gly Thr 500 505 510 Val Met Ala Lys Arg Val Lys Ala Thr Ile Leu Tyr Gly Ser Glu Thr 515 520 525 Gly Arg Ala Gln Ser Tyr Ala Gln Gln Leu Gly Arg Leu Phe Arg Lys 530 535 540 Ala Phe Asp Pro Arg Val Leu Cys Met Asp Glu Tyr Asp Val Val Ser 545 550 555 560 Leu Glu His Glu Thr Leu Val Leu Val Val Thr Ser Thr Phe Gly Asn 565 570 575 Gly Asp Pro Pro Glu Asn Gly Glu Ser Phe Ala Ala Ala Leu Met Glu 580 585 590 Met Ser Gly Pro Tyr Asn Ser Ser Pro Arg Pro Glu Gln His Lys Ser 595 600 605 Tyr Lys Ile Arg Phe Asn Ser Ile Ser Cys Ser Asp Pro Leu Val Ser 610 615 620 Ser Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Ser Ser Asn Thr Asp Ser Ala Gly 625 630 635 640 Ala Leu Gly Thr Leu Arg Phe Cys Val Phe Gly Leu Gly Ser Arg Ala 645 650 655 Tyr Pro His Phe Cys Ala Phe Ala Arg Ala Val Asp Thr Arg Leu Glu 660 665 670 Glu Leu Gly Gly Glu Arg Leu Leu Gln Leu Gly Gln Gly Asp Glu Leu 675 680 685 Cys Gly Gln Glu Glu Ala Phe Arg Gly Trp Ala Gln Ala Ala Phe Gln 690 695 700 Ala Ala Cys Glu Thr Phe Cys Val Gly Glu Asp Ala Lys Ala Ala Ala 705 710 715 720 Arg Asp Ile Phe Ser Pro Lys Arg Ser Trp Lys Arg Gln Arg Tyr Arg 725 730 735 Leu Ser Ala Gln Ala Glu Gly Leu Gln Leu Leu Pro Gly Leu Ile His 740 745 750 Val His Arg Arg Lys Met Phe Gln Ala Thr Ile Arg Ser Val Glu Asn 755 760 765 Leu Gln Ser Ser Lys Ser Thr Arg Ala Thr Ile Leu Val Arg Leu Asp 770 775 780 Thr Gly Gly Gln Glu Gly Leu Gln Tyr Gln Pro Gly Asp His Ile Gly 785 790 795 800 Val Cys Pro Pro Asn Arg Pro Gly Leu Val Glu Ala Leu Leu Ser Arg 805 810 815 Val Glu Asp Pro Pro Ala Pro Thr Glu Pro Val Ala Val Glu Gln Leu 820 825 830 Glu Lys Gly Ser Pro Gly Gly Pro Pro Pro Gly Trp Val Arg Asp Pro 835 840 845 Arg Leu Pro Pro Cys Thr Leu Arg Gln Ala Leu Thr Phe Phe Leu Asp 850 855 860 Ile Thr Ser Pro Pro Ser Pro Gln Leu Leu Arg Leu Leu Ser Thr Leu 865 870 875 880 Ala Glu Glu Pro Arg Glu Gln Gln Glu Leu Glu Ala Leu Ser Gln Asp 885 890 895 Pro Arg Arg Tyr Glu Glu Trp Lys Trp Phe Arg Cys Pro Thr Leu Leu 900 905 910 Glu Val Leu Glu Gln Phe Pro Ser Val Ala Leu Pro Ala Pro Leu Leu 915 920 925 Leu Thr Gln Leu Pro Leu Leu Gln Pro Arg Tyr Tyr Ser Val Ser Ser 930 935 940 Ala Pro Ser Thr His Pro Gly Glu Ile His Leu Thr Val Ala Val Leu 945 950 955 960 Ala Tyr Arg Thr Gln Asp Gly Leu Gly Pro Leu His Tyr Gly Val Cys 965 970 975 Ser Thr Trp Leu Ser Gln Leu Lys Pro Gly Asp Pro Val Pro Cys Phe 980 985 990 Ile Arg Gly Ala Pro Ser Phe Arg Leu Pro Pro Asp Pro Ser Leu Pro 995 1000 1005 Cys Ile Leu Val Gly Pro Gly Thr Gly Ile Ala Pro Phe Arg Gly 1010 1015 1020 Phe Trp Gln Glu Arg Leu His Asp Ile Glu Ser Lys Gly Leu Gln 1025 1030 1035 Pro Thr Pro Met Thr Leu Val Phe Gly Cys Arg Cys Ser Gln Leu 1040 1045 1050 Asp His Leu Tyr Arg Asp Glu Val Gln Asn Ala Gln Gln Arg Gly 1055 1060 1065 Val Phe Gly Arg Val Leu Thr Ala Phe Ser Arg Glu Pro Asp Asn 1070 1075 1080 Pro Lys Thr Tyr Val Gln Asp Ile Leu Arg Thr Glu Leu Ala Ala 1085 1090 1095 Glu Val His Arg Val Leu Cys Leu Glu Arg Gly His Met Phe Val 1100 1105 1110 Cys Gly Asp Val Thr Met Ala Thr Asn Val Leu Gln Thr Val Gln 1115 1120 1125 Arg Ile Leu Ala Thr Glu Gly Asp Met Glu Leu Asp Glu Ala Gly 1130 1135 1140 Asp Val Ile Gly Val Leu Arg Asp Gln Gln Arg Tyr His Glu Asp 1145 1150 1155 Ile Phe Gly Leu Thr Leu Arg Thr Gln Glu Val Thr Ser Arg Ile 1160 1165 1170 Arg Thr Gln Ser Phe Ser Leu Gln Glu Arg Gln Leu Arg Gly Ala 1175 1180 1185 Val Pro Trp Ala Phe Asp Pro Pro Gly Ser Asp Thr Asn Ser Pro 1190 1195 1200 <210> 2 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Ala Lys Gly Thr Gly Ile Thr Arg Lys Lys Thr Phe Lys Glu Val 1 5 10 15 Ala Asn Ala Val Lys Ile Ser Ala Ser Leu Met Gly Thr Val Met Ala 20 25 30 Lys Arg Val Lys Ala 35 <210> 3 <211> 37 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 3 Ala Thr Lys Gly Ala Gly Ile Thr Arg Lys Lys Thr Phe Lys Glu Val 1 5 10 15 Ala Asn Ala Val Lys Ile Ser Ala Ser Leu Met Gly Thr Leu Met Ala 20 25 30 Lys Arg Val Lys Ala 35 <210> 4 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Thr Asn Gly Thr Pro Thr Lys Arg Arg Ala Ile Gly Phe Lys Lys 1 5 10 15 Leu Ala Glu Ala Val Lys Phe Ser Ala Lys Leu Met Gly Gln Ala Met 20 25 30 Ala Lys Arg Val Lys Ala 35 <210> 5 <211> 38 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 5 Gly Thr Asn Gly Thr Pro Thr Lys Arg Arg Ala Ile Gly Phe Lys Lys 1 5 10 15 Leu Ala Glu Ala Val Lys Phe Ser Ala Lys Leu Met Gly Gln Ala Met 20 25 30 Ala Lys Arg Val Lys Ala 35 <210> 6 <211> 37 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 6 Asp Glu Lys Leu Arg Pro Arg Arg Arg Glu Ile Arg Phe Thr Val Leu 1 5 10 15 Val Lys Ala Val Phe Phe Ala Ser Val Leu Met Arg Lys Val Met Ala 20 25 30 Ser Arg Val Arg Ala 35 <210> 7 <211> 37 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Asn Glu Lys Leu Arg Pro Arg Arg Arg Glu Ile Arg Phe Arg Val Leu 1 5 10 15 Val Lys Val Val Phe Phe Ala Ser Met Leu Met Arg Lys Val Met Ala 20 25 30 Ser Arg Val Arg Ala 35 <210> 8 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Glu Lys Arg Arg Pro Lys Arg Arg Glu Ile Pro Leu Lys Val Leu 1 5 10 15 Val Lys Ala Val Leu Phe Ala Cys Met Leu Met Arg Lys Thr Met Ala 20 25 30 Ser Arg Val Arg Val 35

Claims (42)

1. 하나 이상의 돌연변이가

   i) 포유동물 세포에서 인산화되는 칼모듈린-결합 도메인 내의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 존재하며;

   ii) eNOS 폴리펩티드 돌연변이체가 하나의 돌연변이를 가지고, 상기 하나의 돌연변이가 상기 위치에 존재하는 경우, Ala 또는 Asp로의 아미노산 치환은 아니며,

   포유동물 eNOS의 기능성 도메인에 상응하는 아미노산 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 단리된 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
2. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 잔기가 인간 eNOS의 아미노산 잔기 495인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
3. 제2항에 있어서, 상기 인간 eNOS의 아미노산 서열이 서열 1인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
4. 제3항에 있어서, 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서의 상기 돌연변이가 Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Met, Ser, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, 또는 His로의 아미노산 치환인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
5. 제4항에 있어서, 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서의 상기 돌연변이가 Val, Leu, 또는 Ile로의 아미노산 치환인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
6. 제5항에 있어서, 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서의 상기 돌연변이가 Val로의 아미노산 치환인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
7. 제3항에 있어서, 상기 칼모듈린-결합 도메인 이외의 하나 이상의 기능성 도메인에서 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
8. 제7항에 있어서, 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서의 상기 돌연변이가 Ala, Val, Leu, 또는 Ile로의 아미노산 치환인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
9. 제8항에 있어서, 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서의 상기 돌연변이가 Ala 또는 Val로의 아미노산 치환인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
10. 제9항에 있어서, 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서의 상기 돌연변이가 Val로의 아미노산 치환인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
11. 제8항에 있어서, 상기 인간 eNOS의 미리스토일화 부위에 상응하는 아미노산 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
12. 제11항에 있어서, 상기 인간 eNOS의 아미노산 잔기 2에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
13. 제12항에 있어서, 아미노산 잔기 2에 상응하는 위치에서의 상기 돌연변이가 Ala로의 아미노산 치환인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
14. 제8항에 있어서, 상기 인간 eNOS의 리덕타제 부위에 상응하는 아미노산 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
15. 제14항에 있어서, 상기 인간 eNOS의 아미노산 잔기 1177에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
16. 제15항에 있어서, 상기 인간 eNOS의 아미노산 잔기 1177에 상응하는 위치에서의 상기 돌연변이가 Asp로의 아미노산 치환인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
17. 제16항에 있어서, 상기 폴리펩티드 돌연변이체가 상기 인간 eNOS의 아미노산 잔기 2에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 추가로 포함하는 것이고, 상기 돌연변이가 Ala로의 아미노산 치환인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
18. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드 돌연변이체의 인산화가 참조 eNOS 폴리펩티드와 비교하여 증가되거나 또는 감소된 것인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
19. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 참조 eNOS 폴리펩티드와 비교하여 칼모듈린에 대해 증가된 결합 친화력을 갖는 것인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
20. 제1항에 있어서, Ca++ 의존성이 참조 eNOS 폴리펩티드와 비교하여 상기 폴리펩티드의 Ca++-칼모듈린 매개된 자극에서 감소된 것인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
21. 제1항에 있어서, 참조 eNOS 폴리펩티드와 비교하여 증가된 eNOS 활성을 갖는 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
22. 제21항에 있어서, 상기 활성이 NO의 생성인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
23. 제21항에 있어서, 상기 활성이 리덕타제 활성인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
24. 제18항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 참조 폴리펩티드의 아미노산 서열이 인간 eNOS의 아미노산 서열이거나, 이로부터 유래된 것인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
25. 제24항에 있어서, 상기 참조 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열 1이거나, 이로부터 유래된 것인 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
26. 상기 폴리펩티드 돌연변이체의 아미노산 서열이 제1항의 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체의 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 것인 단리된 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
27. 상기 폴리펩티드 돌연변이체의 아미노산 서열이 제26항의 상기 폴리펩티드 돌연변이체의 아미노산 서열과 95 내지 99％ 서열 동일성을 갖는 것인 단리된 eNOS 폴리펩티드 돌연변이체.
28. (누락)
29. 제1항의 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
30. 하나 이상의 조절 서열과 작동가능하게 결합된 제29항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
31. 제1항의 폴리펩티드 돌연변이체를 포함하는 제약 조성물.
32. 제29항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물.
33. 제1항의 폴리펩티드 돌연변이체의 결합 파트너.
34. 제33항에 있어서, 상기 결합 파트너가 폴리펩티드인 결합 파트너.
35. 제34항에 있어서, 상기 결합 파트너가 항체 또는 항원-특이적 항체 단편인 결합 파트너.
36. 제1항의 폴리펩티드 돌연변이체를 세포에 투여하는 것을 포함하는, 상기 세포에서 eNOS 활성을 조정하는 방법.
37. 제29항의 폴리뉴클레오티드를 세포에 투여하여 상기 폴리펩티드 돌연변이체를 상기 세포에서 발현시키는 것을 포함하는, 상기 세포에서 eNOS 활성을 조정하는 방법.
38. i) 환자의 세포를 제29항의 상기 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 것;

    ii) 이상 eNOS 활성에 관련된 상태의 지표인 eNOS 활성의 수준을 검출하는 것

    을 포함하는, 상기 의학적 상태의 진단 방법.
39. 이상 eNOS 활성에 관련된 상태의 치료가 필요한 환자에게 제1항의 상기 폴리펩티드 돌연변이체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 상태를 치료하는 예방적 또는 치료적 방법.
40. 이상 eNOS 활성에 관련된 상태의 치료가 필요한 환자에게 제1항의 상기 폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유효량을 투여하여 상기 폴리펩티드 돌연변이체를 상기 환자에서 발현시키는 것을 포함하는, 상기 상태를 치료하는 예방적 또는 치료적 방법.
41. 제39항에 있어서, 상기 환자에게 하나 이상의 혈관형성 인자를 상기 폴리펩티드 돌연변이체의 투여 전, 동안, 또는 후에 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
42. 제40항에 있어서, 상기 환자에게 하나 이상의 혈관형성 인자를 상기 폴리뉴클레오티드의 투여 전, 동안, 또는 후에 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.