KR100737945B1 - 유전자 치료 및 치료 스크리닝에 유용한 ｅＮＯＳ 돌연변이 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Akt 의존성 인산화의 부위에서 구조적 변경을 포함하는 새로운 NOS 변이체 또는 돌연변이체에 관한 것이다. 변경된 NOS 단백질 또는 펩티드, 특히 인간 eNOS 단백질 또는 펩티드, Akt 단백질 또는 폴리펩티드 및 그들의 인코딩 핵산 분자는 혈관형성술 후 재협착, 고혈압, 아테로마성 동맥경화, 심부전, 당뇨병, 그리고 혈관형성 결여를 갖는 질환을 포함하는 질병을 치료하기 위한 유전자 치료제로 유용하다. NOS 단백질 및 펩티드는 또한 NOS 활성을 조정하는 약제에 대해 스크리닝하는 방법에 유용하다.

NOS 돌연변이, eNOS, 유전자 치료

Description

유전자 치료 및 치료 스크리닝에 유용한 ｅＮＯＳ 돌연변이{eNOS MUTATIONS USEFUL FOR GENE THERAPY AND THERAPEUTIC SCREENING}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 본 명세서에 온전히 참고용으로 편입되어 있는, 1999년, 4월 16일자로 출원된 미국 가출원 번호 60/129,550호의 이점을 주장한다.

연방정부의 지원에 대한 시인

본 발명은 하기 연방 보조금(federal grant monies)에 의해 자금을 제공받은 연구로부터 일부 기인하였다: HL 57665 및 HL 61371.

기술 분야

본 발명은 Akt 의존형 인산화 부위에서 구조 변경을 포함하는 신규한 NOS 변이체 또는 돌연변이체에 관한 것이다. 변경된 NOS 단백질 또는 펩티드 및 그들의 인코딩된 핵산 분자는 혈관형성술 후 재협착(post angioplasty restenosis), 고혈압, 아테로마성 동맥경화(atherosclerosis), 심부전, 당뇨병, 그리고 혈관형성 결여(defective angiogenesis)를 갖는 질환을 포함하는 질병 치료를 위한 유전자 치료제로 유용하다.

아테로마성 동맥경화 및 혈관혈전증(vascular thrombosis)은 이환율(罹患率) 및 사망률의 주요 원인이며, 관상동맥 질환, 심근경색, 및 발작으로 이끈다. 아테로마성 동맥경화는 혈관을 정렬시키는 내피의 변질과 함께 시작한다. 내피의 변질은 결국, 일부, 산화된 저밀도 지단백(LDL) 콜레스테롤의 섭취에 의해 야기된 내피의 손상(lesion)이 발생하게 될 수도 있다. 이와 같은 손상으로 인한 파열은 혈관의 혈전증 및 폐색(occlusion)에 이르게 할 수 있다. 관상 동맥의 경우, 복합 손상으로 인한 파열은 심근경색의 발생을 재촉할 수 있고, 한편, 경동맥의 경우에는, 잇따라 발작이 일어날 수도 있다.

아테로마 동맥경화성 관상 심질환(atherosclerotic coronary heart disease)에서, 내피의 기능장애는 산화질소와 같은 혈관확장 물질의 생산을 감소시킬 수 있다. 심근 허혈(myocardial ischemia)은 자동조절성 혈관확장이 방해될 때, 흐름을 제한하는 관상동맥 협착증(coronary arterial stenosis)에 의해서 또는 내피의 기능장애에 의해서 일어난다. 두 가지 경우 모두, 동맥혈류량은 증가하는 산소 요구량에 비례하여 더 증가할 수 없게 된다. 다른 상황들 중에서, 심근 허혈은 산소 요구량이 일정하지만 관상동맥 경련, 관상동맥 내강의 지름을 감소시키는 기초 아테로마 동맥경화성 플라크(plaque)의 빠른 진화, 및/또는 혈소판 응집체(platelet aggregates)에 의해 막힌 간헐성 미소혈관을 통해 성립된 관혈류량의 일차 감소가 있을 때 일어날 수 있다.

벌룬 혈관형성술(balloon angioplasty)은 보통 플라크로 좁아진 혈관을 다시 벌리는데 사용된다. 비록 벌룬 혈관형성술이 혈관을 벌리는 확률이 높긴 하지만, 이 방법은 수행 중에 종종 내피를 벗겨 혈관을 다치게 한다. 이러한 상해는 혈관 의 평활근 세포를 손상 지역으로 이동 및 확산시켜 근육 내막 과형성 또는 재협착으로 알려져 있는, 손상(lesion)이 된다. 이러한 새로운 손상은 환자의 심각한 부위에서의 혈관형성술 후 삼 내지 육 개월 이내에 증상을 재발시킨다.

아테로마 동맥경화, 혈전증 및 재협착증에 있어서, 또한 정상적인 혈관기능이 상실되어 혈관은 확장하기보다는 오히려 수축하는 경향이 있게 된다. 과다한 혈관 수축은 혈관 내강을 더 좁게 하여 혈액의 흐름을 제한한다. 이는 협심증(angina)(심장 동맥이 관여되는 경우라면), 또는 일시적인 뇌허혈(즉, "경미한 발작", 뇌혈관이 관여되는 경우라면)과 같은 증상을 일으킬 수 있다. 이러한 비정상적인 혈관 기능(과다한 혈관수축 또는 부적절한 혈관확장)은 또한 다른 질병 상태에서도 발생한다. 고혈압(높은 혈액 압력)은 혈관벽, 특히 보다 작은 순환 혈관의 두꺼워짐 뿐만 아니라, 과다한 혈관수축에 의해서도 야기된다. 이러한 과정은 폐혈관에 악영향을 줄뿐만 아니라 폐(허파)고혈압을 일으킬 수 있다. 과다한 혈관수축, 또는 부적절한 혈관확장과 관련된 것으로 알려진 다른 이상으로는 이식 아테로마 동맥경화(transplant atherosclerosis), 울혈성 심부전(congestive heart failure), 임신 중독증(toxemia of pregnancy), 레이노 현상(Raynaud's phenomenon), 프린즈메탈형 협심증(Prinzmetal's angina)(관상혈관경련), 뇌혈관경련(cerebral vasospasm), 용혈성 요독증(hemolytic-uremia) 및 성교불능(impotence)이 포함된다.

초기 "내피 유래 이완 인자"(endothelium derived relaxing factor: EDRF)로 불리던, 내피에 의해 방출된 물질은 이들 병리학적 진행들을 억제하는데 중요한 역 할을 한다. EDRF는 현재 산화질소(NO)인 것으로 알려져 있다. NO는 혈관 평활근의 이완, 혈소판 응집의 억제, 유사분열유발(mitogenesis)의 억제, 혈관 평활근의 확산, 그리고 백혈구 부착을 포함하여, 인간 생리학에서 많은 역할을 한다. NO는 가장 유력한 내인성 혈관확장제이고, 관 동맥(conduit arteries)에서 운동유발 혈관확장에 큰 책임이 있기 때문에, NO 합성의 증대는 또한 정상적인 개인들과 혈관 질병을 가진 개인들의 운동 능력을 향상시킬 수 있다.

내피의 산화질소 신타아제(endothelial nitric oxide synthase: eNOS)는 체혈압의 유지, 혈관 리모델링 및 혈관형성에 책임이 있는 산화질소 신타아제(NOS) 동형(isoform)이다(Shesely et al., 1996; Huang et al., 1995; Rudic et al., 1998; Murohara et al., 1998). NO의 내피 생산 결여는 아테로마 동맥경화 및 혈관 손상의 초기에 계속되는 특징이기 때문에, eNOS는 혈관의 유전자 치료를 위해 매력적인 대상이라고 판명되었다. eNOS 활성의 조절은 매우 막연한 가운데, eNOS가 다양한 형태의 세포 자극에 반응하여 인산화된다는 것이 공지되어 있긴 하지만(Michel et al., 1993; Garcia-Cardena et al., 1996; Corson et al., 1996), 산화질소(NO) 생산의 조절에서의 인산화 및 책임있는 키나아제(들)의 역할에 대해서는 이전에 밝혀져 있지 않았다.

A. 일반적인 설명

본 발명은, 어느 정도, 세린/트레오닌 단백질 키나아제, Akt(단백질 키나아제 B)가 세린 1179(인간 eNOS에서 세린 1177)상에서 eNOS를 직접 인산화할 수 있 고, 돌연변이 eNOS(S1179A)가 Akt 인산화 및 활성에 내성이 있는 반면 NO 생산을 유도하는 효소를 활성화할 수 있다는 발견에 기초된 것이다. 더욱이, 아데노바이러스 매개 유전자를 사용하여 전달 활성화 Akt는 내피 세포로부터의 기초 NO 방출을 증가시키고 활성 결핍 Akt는 VEGF 자극된 NO 생산을 감소시킨다. 따라서, eNOS는 가스성 제2 메신저, NO의 방출에 대해 Akt를 통한 신호 형질도입을 연결하는 새로이 기술된 Akt 기질이다. 본 발명은 또한, 어느 정도, 돌연변이 eNOS, 예를 들어, S1179D가 NO 생산 속도의 증가 및 환원효소 활성의 증가를 보여주는 발견에 기초한다.

본 발명은 NOS 폴리펩티드 또는 단백질 및 그들의 인코딩 분리 핵산 분자(encoding isolated nucleic acid molecules)를 포함하며, 여기서 상기 NOS 폴리펩티드 또는 단백질은 소 eNOS의 잔기 1179, 인간 eNOS의 잔기 1177, 쥐 nNOS의 잔기 1412 또는 인간 nNOS의 잔기 1415에 해당하는 치환된 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직한 치환은 아스파르트산과 글루탐산을 포함해서, 음전하를 띤 R기를 갖는 아미노산을 포함한다.

본 발명은 또한 NOS 폴리펩티드 또는 단백질 및 그들의 인코딩 분리 핵산 분자를 포함하며, 여기서 상기 NOS 폴리펩티드 또는 단백질은 소 eNOS의 잔기 1179, 인간 eNOS의 잔기 1177, 쥐 nNOS의 잔기 1412 또는 인간 nNOS의 잔기 1415에 해당하는 치환된 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직한 치환은 알라닌과 같은 음전하를 띠지 않은 R기를 갖는 아미노산을 포함한다.

본 발명은 본 발명의 NOS 폴리펩티드 또는 Akt 폴리펩티드를 코딩하는 트랜 스진(transgene)을 운반하는(delivering) 단계를 포함하는, 환자에게서 내인성 혈관형성 결여를 갖는 허혈 질환, 특히 말초 혈관 질환 및/또는 심근 허혈에 있어서, 부행 혈관 발생(collateral vessel development)을 자극하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 NOS 폴리펩티드를 발현하는 인간을 제외한 트랜스진 동물을 더 포함한다.

마지막으로, 본 발명은 (a) 정제된 NOS, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS, 또는 NOS, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS를 발현하는 세포, 및 Akt를 약제(agent)에 노출시키는 단계; 및 (b) NOS, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS의 Akt 조절 활성을 측정하는 단계를 일반적으로 포함하는 NOS의 Akt 조절 활성을 조정하는 약제를 동정하는 방법을 포함한다.

NO 생산이 eNOS의 Akt 의존성 인산화에 의해 조절된다는 실증은 NO의 합성 또는 생물학적 활성에 기능장애와 관련된 심장혈관 질환에 내피 기능을 향상시키는데 겨냥된 유전자 치료에 사용되기 위한 새로운 구성적 활성 eNOS 돌연변이를 제공한다. 그와 같은 질환은 심근 경색, 당뇨병 및 혈관형성 결여에 따른 질병을 포함하여, 혈관형성술 후 재협착, 고혈압, 아테로마성 동맥경화, 심부전을 포함한다. 이러한 발견은 또한 NO의 합성 또는 생물학적 활성에 기능장애와 관련된 질병을 치료하기에 알맞은 약제의 설계에 유용한 새로운 치료 대상을 제공한다.

본 발명은 또한 질병 치료를 겨냥한 유전자 치료에 사용되기 위한 쥐 nNOS의 잔기 1412 또는 인간 nNOS의 잔기 1415에 해당하는 치환된 아미노산을 갖는 새로운 구성 활성 nNOS 돌연변이체를 제공한다.

B. 특정 실시양태

NOS 돌연변이 단백질 또는 폴리펩티드의 생산

본 발명은 NOS 단백질 또는 폴리펩티드, NOS 단백질의 대립형질 변이체(allelic variants), 그리고 NOS 단백질의 보존성 아미노산 치환체를 제공하는바, 상기 모두는 Akt 매개 인산화 부위인 세린 잔기의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 (1) 세린에서 알라닌과 같은 다른 아미노산으로의 잔기 1177의 돌연변이(Janssens et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:14519-14522, 이는 본 명세서에 온전히 참고용으로 편입되어 있음)를 포함하고, Akt 매개 인산화에 내성이 있는 인간 eNOS 단백질과; (2) 세린에서 알라닌과 같은 다른 아미노산으로의 잔기 1179의 돌연변이(미국 특허 제5,498,539호의 SEQ ID NO:2, 상기 특허는 본 명세서에 온전히 참고용으로 편입되어 있음)를 포함하고, Akt 매개 인산화에 내성이 있는 소 eNOS 단백질과; (3) 세린에서 알라닌과 같은 다른 아미노산으로의 잔기 1415의 돌연변이를 포함하고, Akt 매개 인산화에 내성이 있는 인간 nNOS 단백질과; (4) 세린에서 알라닌과 같은 다른 아미노산으로의 잔기 1412의 돌연변이를 포함하는 쥐 nNOS 단백질과; (5) 세린에서 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 음전하를 띤 R기를 포함하는 아미노산으로의 잔기 1177의 돌연변이를 포함하고, 구성적으로 활성이며 NO 생산의 증가 및 환원효소 활성의 증가를 나타내는 인간 eNOS 단백질과; (6) 세린에서 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 음전하를 띤 R기를 포함하는 아미노산으로의 잔기 1179의 돌연변이를 포함하고, 구성적으로 활성이며 NO 생산의 증가 및 환원효소 활성의 증가를 나타내는 소 eNOS 단백질과; (7) 세린에서 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 음전하를 띤 R기를 포함하는 아미노산으로의 잔기 1415의 돌연변이를 포함하고, 구성적으로 활성이며 NO 생산의 증가 및 환원효소 활성의 증가를 나타내는 인간 nNOS 단백질과; (8) 세린에서 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 음전하를 띤 R기를 포함하는 아미노산으로의 잔기 1412의 돌연변이를 포함하고, 구성적으로 활성이며 NO 생산의 증가 및 환원효소 활성의 증가를 나타내는 쥐 nNOS 단백질과; (9) 인간 eNOS에서 위치 1177 또는 소 eNOS에서 위치 1179, 쥐 nNOS에서 위치 1412, 및 인간 nNOS에서 위치 1415의 세린에 해당하는 위치에서 세린 이외의 아미노산을 포함하도록 변형되고, Akt 인산화에 내성이거나, 구성적으로 활성이거나, NO 생산의 증가 및 환원효소 활성의 증가를 나타내는 인간, 소 또는 쥐 이외의 종으로부터 나온 NOS 단백질을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. NOS 돌연변이체는 또한 인산화 모티프 RXRXXS/T에서 다른 아미노산들을 돌연변이시킴으로써 생산될 수도 있다.

본 발명은 NO 생산 및 환원효소 활성의 증가를 나타내고 Akt 매개 인산화 부위에서의 세린 잔기에 돌연변이를 포함하는, 구성적으로 활성인 NOS 폴리펩티드, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS를 제공한다. 또한 당업자의 기술의 범위 내에서 NO 생성 및 환원효소 활성의 증가를 나타내는 이들 NOS 폴리펩티드의 치환, 결실 및 삽입 돌연변이체와 같은 보존적 변이체를 얻는다. 여기에 사용된 것과 같은, 보존적 변이체란 NO를 생성하기 위해 구성적으로 활성인 NOS, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS의 활성 또는 구성적으로 활성인 NOS, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS의 환원효소 활성에 악영향을 주지 않는 아미노산 서열에서의 변경을 말한다. 치환, 삽입 또는 결실은 변경된 서열이 구성적 NOS의 활성에 영향을 줄 때, 구성적으로 활성인 NOS 폴리펩티드에 악영향을 주어, NO의 생산량이 증가되지 않고, 야생형 NOS와 비교해서 증가된 환원효소 활성을 갖지 않는 것을 말한다. 예를 들어, 구성 NOS의 전체 전하, 구조 또는 소수성/친수성은 구성적 NOS의 활성에 악영향을 주지 않고 변경될 수 있다. 따라서, NOS 폴리펩티드의 아미노산 서열은, 예를 들어 폴리펩티드를 더욱 소수성 또는 친수성으로 만들기 위해, NOS의 활성에 악영향을 주지 않으면서 변경될 수 있다.

여기에 사용된, "구성적으로 활성인" NOS의 돌연변이체 또는 변이체는, 본래의 출처로부터 변형되거나 분리된 것으로, NOS 단백질, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS를 말하고, 이것은 인간 NOS에서 잔기 1177 또는 소 NOS에서 잔기 1179에 해당하는 아미노산 잔기에서 인산화되지 않은 형태로 세린을 함유한 천연 NOS보다 더 높은 속도로 NO를 생산한다. 바람직한 구성적으로 활성인 변이체는, 인간 eNOS에서 위치 1177 또는 소 NOS에서 위치 1179에서의 세린에 해당하는 아미노산 잔기에서, 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 음전하를 띤 R기를 갖는 아미노산을 포함한다.

본 발명은 NOS 단백질 또는 폴리펩티드, NOS 단백질의 대립형질 변이체, 그리고 소 eNOS의 잔기 1177, 인간 eNOS의 잔기 1179, 쥐 nNOS의 잔기 1412, 및 인간 nNOs의 잔기 1415에 해당하는 치환된 아미노산 잔기를 포함하는 NOS 단백질의 보존적 아미노산 치환체를 제공하고, 상기 치환된 아미노산 잔기는 알라닌과 같은 음전하를 띠지 않은 R기를 포함한다.

본 발명의 NOS 단백질, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS 단백질은 분리된 형태로 있을 수 있다. 여기에서 사용된 것처럼, 단백질은 물리, 기계 또는 화학적인 방법이 사용되어 일반적으로 단백질과 관련된 세포 성분에서 단백질을 제거할 때 분리되는 것을 말한다. 당업자는 분리된 단백질을 얻기 위한 표준 정제 방법을 쉽게 이용할 수 있다.

또한 소 eNOS에서 잔기 1179, 인간 eNOS에서 잔기 1177, 쥐 nNOS에서 잔기 1412, 또는 인간 nNOS에서 잔기 1415에 해당하는 Akt 인산화 부위에 걸쳐 있는 NOS 펩티드가 본 발명에 포함된다. 펩티드는 인산화 부위에서 세린을 포함할 수도 있고, 바람직하게는, 소 eNOS에서 잔기 1179, 인간 eNOS에서 잔기 1177, 쥐 nNOS에서 잔기 1412, 또는 인간 nNOS에서 잔기 1415에 해당하는 위치에서 세린의 치환체를 포함할 수도 있다. 상기 치환체는 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은, 인산화 부위에서 세린과 흡사한 R기를 갖는 아미노산을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 치환체는 또한 알라닌과 같은 음성이 아닌 R기를 갖는 아미노산을 포함한다. 상기 부위에 걸쳐 있는 펩티드는 길이로 약 3, 5, 7, 10, 12, 15, 17, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 아미노산일 수도 있다.

본 발명의 NOS 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 인간 eNOS에서 위치 1177, 소 eNOS에서 위치 1179, 쥐 nNOS에서 잔기 1412, 또는 인간 nNOS에서 잔기 1415에서의 세린에 해당하는 세린을 인코딩하는 뉴클레오티드 트리플렛(triplet)을 대체하거나 변경하기 위해 변형된 NOS cDNA로부터의 재조합 발현을 포함하여, 이용가능한 어떤 수단에 의해서도 제조될 수 있다. 세린 잔기를 인코딩하는 뉴클레오티드 트리플렛을 돌연변이시키기 위해, 동종 재조합, 부위 특이적 돌연변이유발 또는 PCR 돌연변이유발과 같은, 이용가능한 어떤 기술이라도 사용될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 참고). 출발물질 cDNAs는 인간 및 소 eNOS cDNAs 또한 토끼, 쥐, 뮤린(murine), 돼지, 양, 말 그리고 인간을 제외한 영장류 종들을 포함해서, 그러나 이에 제한되는 것은 아닌, 다른 동물종의 eNOS 단백질을 인코딩하는 cDNAs포함한다.

여기서 사용된, 본 발명의 NOS 단백질 또는 폴리펩티드, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자는 상기 핵산 분자가 핵산의 원료에서 다른 폴리펩티드를 인코딩하는 오염 핵산과 실질적으로 분리될 때 "분리된"이라고 말해진다.

본 발명은 또한 인코딩 핵산 분자의 단편을 제공한다. 여기서 사용된 것처럼, 인코딩 핵산 분자의 단편은 서열을 인코딩하는 전체 단백질의 작은 부분을 말한다. 상기 단편의 크기는 의도된 용도에 의해 측정될 것이다. 예를 들어, 단편이 단백질의 활성 부분을 코딩하기 위해 선택된다면, 단편은 Akt 인산화 부위를 포함해서, 단백질의 기능적인 영역을 인코딩하기에 충분히 커야할 것이다. 단편이 핵산 프로브 또는 PCR 프라이머로서 사용될 것이라면, 그 때의 단편 길이는 NOS Akt 인산화 부위에 걸쳐 있거나 근접하는 영역에 프로빙(probing)/프라이밍(priming) 동안 비교적 소수의 거짓 포지티브(false positives)를 얻도록 선택된다.

폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)을 위한 프로브 또는 특정 프라이머로서 사용되 는, 또는 본 발명의 유전자 서열 인코딩 단백질을 합성하기 위해 사용되는 본 발명의 인코딩 핵산 분자의 단편(즉, 합성 올리고뉴클레오티드)은 화학적 기술, 예를 들어, Matteucci, et al. 1981 J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191의 포스포트리에스테르(phosphotriester) 방법에 의해 또는 자동 합성법을 사용하여 쉽게 합성될 수 있다. 부가하여, 보다 큰 DNA 분절(segment)은 유전자의 다양한 모듈식 분절을 한정하는 일군의 올리고뉴클레오티드의 합성법과 같은 공지된 방법과, 뒤이어서 완전히 변경된 유전자를 만들기 위한 올리고뉴클레오티드의 결찰(ligation)에 의해서 쉽게 제조될 수 있다.

본 발명의 인코딩 핵산 분자는 진단 및 프로브(probe) 목적을 위한 검출가능한 라벨을 포함하도록 추가로 변경될 수도 있다. 상기 다양한 라벨은 당업계에 공지되어 있고 여기에 개시된 인코딩 분자와 함께 쉽게 이용될 수 있다. 적당한 라벨은 비오틴, 방사선 동위원소에 의해 라벨링된 뉴클레오티드 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 당업자는 라벨링된 인코딩 핵산 분자를 얻기 위해서 어떠한 공지 라벨이라도 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 상기와 같은 NOS 코딩 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자(rDNAs)를 제공한다. 여기서 사용된 것처럼, rDNA 분자는 분자 조작(manipulation)을 거친 DNA 분자이다. rDNA 분자를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning(1989)을 참고한다. 바람직한 rDNA 분자에서, 코딩 DNA 서열은 발현 조절 서열 및/또는 벡터 서열과 기능적으로 연결되어 있다.

본 발명의 단백질 군의 인코딩 서열 중 하나가 기능적으로 연결되어 있는 벡터 및/또는 발현 조절 서열의 선택은 당업계에 공지되어 있는 것처럼, 소정의 기능 특성, 예를 들어, 단백질 발현과 형질전환될 숙주 세포에 직접적으로 의존한다. 본 발명에 의해 예상된 벡터는 적어도 rDNA 분자에 포함된 구조 유전자의 복제 또는 숙주 염색체로의 삽입과, 바람직하게는 발현에도 역시 관여할 수 있다.

기능적으로 연결된 단백질 인코딩 서열의 발현을 조절하기 위해 사용된 발현 조절 요소는 당업계에 공지되어 있고, 유도가능 프로모터, 구성 프로모터, 분비 신호, 다른 조절 요소를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 유도가능 프로모터가 숙주 세포의 매질에서 영양물에 반응하는 것과 같이, 쉽게 조절된다.

하나의 실시양태에서, 코딩 핵산 분자를 함유하는 벡터는 원핵생물 복제단위(prokaryotic replicon), 즉, 형질전환된 박테리아 숙주 세포와 같은, 원핵 숙주 세포에서 염색체이외의 재조합 DNA 분자의 자율 복제와 유지에 관여할 수 있는 능력을 갖는 DNA 서열을 포함할 것이다. 그와 같은 복제단위는 당업계에서 공지되어 있다. 부가하여, 원핵생물 복제단위를 포함하는 벡터는 또한 그 발현이 약물 내성과 같은 검출가능한 마커를 제공하는 유전자를 포함할 수도 있다. 전형적인 박테리아 약물 내성 유전자는 암피실린 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 제공하는 것들이다.

원핵생물 복제단위를 포함하는 벡터는 또한 E. coli와 같은 박테리아 숙주 세포에서 코딩 유전자 서열의 발현(전사 및 번역)에 관여할 수 있는 원핵생물 또는 박테리오파지 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 RNA 폴리머라아제의 결합 및 발생을 위한 전사를 가능하게 하는 DNA 서열에 의해 형성된 발현 조절 요소이다. 박테리아 숙주와 공존할 수 있는 프로모터 서열은 전형적으로 본 발명의 DNA 분절의 삽입을 위해 알맞은 제한 부위를 포함하는 플라스미드 벡터에서 제공된다. 전형적인 벡터 플라스미드는 Biorad Laboratories(Richmond, CA)로부터 입수가능한 pUC8, pUC9, pBR322 및 pBR329, 그리고 Pharmacia, Piscataway, N.J.로부터 입수가능한 pPL 및 pKK223이다.

진핵세포와 공존할 수 있는 발현 벡터, 바람직하게는 척추동물 세포와 공존할 수 있는 발현 벡터는 또한 코딩 서열을 포함하는 rDNA 분자를 형성하는데 사용될 수 있다. 진핵 세포 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 몇 군데 상업용 출처로부터 입수가능하다. 전형적으로, 소정의 DNA 분절의 삽입을 위해 알맞은 제한 부위를 포함하는 벡터가 제공된다. 전형적인 벡터는 pSVL 및 pKSV-10(Pharmacia), pBPV-1/pML2d(International Biotechnologies, Inc.), pTDT1(ATCC, #31255) 및 유사한 진핵 발현 벡터이다.

본 발명의 rDNA 분자를 구성하기 위해 사용된 진핵 세포 발현 벡터는 추가로진핵 세포에서 유효한 선택가능 마커, 바람직하게는 약물 내성 선택 마커를 포함할 수도 있다. 바람직한 약물 내성 마커는 그 발현이 네오마이신 내성을 나타내는 유전자, 즉, 네오마이신 인산전이효소 (neo) 유전자이다(Southern et al.(1982) J. Mol. Anal. Genet. 1;327-341). 다르게는, 선택가능 마커는 별개의 플라스미드 상에 존재할 수 있고, 두개의 벡터가 숙주 세포의 동시 형질감염(co-transfection)에 의해 도입되고, 선택가능 마커에 대한 적절한 약물에 배양시킴으로써 선택된다.

본 발명은 본 발명의 NOS 단백질, 바람직하게 eNOS 또는 nNOS 단백질을 인코딩하는 핵산 분자로 형질전환되거나 또는 형질감염된 숙주 세포를 추가로 제공한다. 상기 숙주 세포는 원핵 세포이거나 진핵 세포일 수 있다. 본 발명의 단백질의 발현에 유용한 진핵 세포는 세포주(cell line)가 세포 배양법과 어울리고 발현 벡터의 전파 및 유전자 산물의 발현과 어울릴 수 있는 한 제한되지는 않는다. 바람직한 진핵 숙주 세포는 효모, 곤충 및 포유류 세포, 바람직하게는 마우스(mouse), 쥐(rat), 원숭이 또는 인간 세포주로부터의 것과 같은 척추동물 세포를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 진핵 숙주 세포는 ATCC로부터 CCL61로 입수가능한 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포, ATCC로부터 CRL 1658로 입수가능한 NIH 스위스 마우스 배(Swiss mouse embryo) 세포 NIH/3T3, 아기 햄스터 신장 세포(baby hamster kidney cells: BHK), 그리고 유사한 진핵 조직 배양 세포주를 포함한다. 어떠한 원핵세포 숙주도 본 발명의 단백질을 코딩하는 rDNA 분자를 발현하는데 사용될 수 있다. 바람직한 원핵 세포 숙주는, 특히 구성적으로 활성인 NOS 돌연변이체에 대해서, E. coli이다.

적당한 세포 숙주가 본 발명의 rDNA 분자로 형질전환되거나 또는 형질감염되는 것은 통상적으로 사용된 벡터의 형태와 사용된 숙주 시스템에 의존하는 공지된 방법에 의해 달성된다. 원핵 숙주 세포의 형질전환에 관하여, 전기영동 및 염처리 방법이 통상적으로 사용되며, 예를 들어, Cohen et al.,(1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110; 및 Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mammal, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1982)를 참고한다. rDNA를 포함하는 벡터를 이용한 척추동물 세포의 형질전환에 대해서는, 전기영동, 양이온성 지질 또는 염처리 방법이 통상적으로 사용되며, Graham et al.(1983) Virol. 52:456; Wigler et al.,(1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1373-76를 참고한다. 성공적으로 형질전환되거나 형질감염된 세포, 즉, 본 발명의 rDNA 분자를 포함한 세포는 선택가능 마커에 대한 선택을 포함한 공지 기술에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 rDNA 도입의 결과로 나온 세포는 클로닝되어 단일 콜로니를 생산할 수 있다. 이들 콜로니로부터 나온 세포는 수확되고, 용해될 수 있으며, 그들의 DNA 함량은 Southern(1975) J. Mol. Biol. 98:503 또는 Berent et al.(1985) Biotech. 3:208에 의해 기술된 것과 같은 방법이나, 면역학적 방법을 통해 분석된 세포로부터 생산된 단백질을 사용하여 rDNA의 존재에 대해 검사될 수 있다.

본 발명은 추가로 여기에 개시된 핵산분자를 사용하여 본 발명의 NOS 단백질, 바람직하게는 eNOS 단백질 또는 nNOS 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 일반적인 조건에서, 단백질의 재조합 형태의 생산은 전형적으로 다음 단계를 수반한다. 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 먼저 얻어진다. 만약 코딩 서열이 인트론(introns)에 의해서 이어진다면, 그것은 전적으로 어떠한 숙주에서의 발현에도 적당하다. 핵산 분자는 이어서 단백질 개방형 읽기 구조(protein open reading frame)를 포함하는 발현 단위를 형성하기 위해, 상술된 것처럼, 적당한 제어 서열과 사용가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 발현 단위는 적당한 숙주를 형질전환 시키거나 또는 형질감염시키기 위해 사용되고 형질전환되거나 또는 형질감염된 숙주는 재조합 단백질의 생산을 허용하는 조건하에서 배양된다. 선택적으로 재조합 단백질은 배지 또는 세포로부터 분리되며; 단백질의 회수 및 정제는 불순물을 견딜 수 있는 경우에 필요하지 않을 수도 있다.

하기의 각 단계는 다양한 방법으로 행해질 수 있다. 예를 들어, 소정의 코딩 서열은 게놈 단편으로부터 얻어질 수도 있고 적당한 숙주에 직접 사용될 수도 있다. 다양한 숙주에 사용가능한 발현 벡터의 구축은 위에 설명된 것처럼 적절한 복제단위와 제어 서열을 사용하여 달성된다. 제어 서열, 발현 벡터, 및 형질전환 또는 형질감염 방법은 유전자를 발현시키기 위해 사용된 숙주 세포의 형태에 의존하고, 앞에서 상세히 설명되었다. 적절한 제한 부위는, 만약 정상적으로 이용될 수 없다면, 상기 벡터내로 삽입시키기 위한 절개 유전자(excisable gene)를 제공하도록 코딩 서열의 말단에 첨가될 수 있다. 당업자는 재조합 단백질을 생산하기 위해 당업계에 공지된 어떤 숙주/발현 시스템이라도 본 발명의 핵산 분자와 같이 사용하도록 쉽게 적응시킬 수 있다.

유전자 치료

가장 적절한 운반 경로를 이용하여 적당한 유전자 발현 시스템을 겸비한 어떤 적절한 유전자 운반 시스템이 본 발명에 의해 성취된다. 예를 들어, 본 발명의 NOS 돌연변이 또는 변이 유전자, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS 돌연변이 또는 변이 유전자, 또는 Akt 유전자는, 생체 외 또는 생체 내로 인코딩된 단백질의 생산에 관여하도록, 심장근세포(및 골격근세포)를 포함하여, 심장(또는 골격근)으로 전달될 수도 있다. 특히 유용한 것은 인간 Akt 유전자 및 NOS 돌연변이체, 바람직하게는 인간 eNOS에서 세린 1177에 해당하는 위치에서, 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 음전하를 띤 R기를 가진 아미노산을 포함하는, 인간 eNOS가 유용하다. NOS 돌연변이 또는 변이 유전자를 투여하는 경로는 혈관내 주사, 근육내 주사, 복막내 주사, 피부내 주사 및 동맥내 주사를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

아데노바이러스 유전자 운반 시스템은 몇 가지 이점을 제공한다: 아데노바이러스는 (ⅰ) 비교적 큰 DNA 삽입물을 수용할 수 있고; (ⅱ) 높은 역가로 성장될 수 있으며; (ⅲ) 광범위한 포유류 세포 형태를 감염시킬 수 있고; (ⅳ) 다른 프로모터를 포함한 다수의 이용가능한 벡터로 사용될 수 있다. 또한, 아데노바이러스는 혈류에 적당하기 때문에, 정맥주사에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 운반 벡터는 헬퍼 비의존형 복제 결여 인간 아데노바이러스(helper-independent replication deficient human adenovirus) 5이지만, 다른 운반 수단이 이용가능하고 사용될 수도 있으며, 핵산을 직접 당해 세포에 운반하는 것을 포함한다(Sawa et al.(1998) Gene Ther. 5(11): 1472-80; Labhasetwar et al.(1998) J. Pharm. Sci.87(11):1347-50; Lin et al.(1997) Hypertension 30:307-313; Chen et al.(1997) Circ. Res. 80(3):327-335; Channon et al.(1996) cardiovasc. Res. 32:962-972; Harv Heart Lett.(1999) 9(8):5-6; 및 Nabel et al.(1999) Nat. Med. 5(2):141-2를 참고한다).

아데노바이러스 5 시스템을 이용하여, 60%이상의 형질감염 빈도가 생체 내에서 한번의 관상동맥 주사에 의해 나타났다(Giordano 및 Hammond(1994) Clin. Res. 42:123A). 비복제 재조합 아데노바이러스 벡터는 특히 관상동맥 내피 및 심장근세포를 형질감염시키는데 유용하여, 관상동맥 주사 후에 아주 효과적으로 형질감염된다. 비복제 재조합 아데노바이러스 벡터는 또한 말초 혈관 시스템의 소정 세포를 형질감염시키는데 유용하다(본 명세서에 참고용으로 완전하게 편입된, 미국 특허 제5,792,453호를 참조한다).

본 발명에서 사용된 아데노바이러스 벡터는 Graham et al.(1988) Virology 163:614-617에 개시되어 있는 구조 재조합 기술(rescue recombination technique)에 의해 구축될 수 있다. 간단하게 설명하자면, eNOS 트렌스진이 프로모터, 폴리링커 및 E1A/E1B 유전자가 제거된 일부 근접 아데노바이러스 서열(partial flanking adenoviral sequences)을 포함하는 셔틀 벡터(shuttle vector)내에서 클로닝된다. 셔틀 벡터로서는, 바이러스 복제에 필수인 초기 단백질 인코딩 E1A 및 E1B 서열을 제외한 인간 아데노바이러스 5 게놈(Virology 163:614-617, 1988)의 좌측 말단 부분을 코딩하는 플라스미드 pAC1(Virology 163:614-617, 1988)(또는 유사체(analog)) 및 폴리링커, CMV 프로모터 및 E1A/E1B 유전자가 제거된 일부 아데노바이러스 서열이 옆에 위치된 SV40 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal)을 포함한 플라스미드 ACCMVPLPA(J. Biol.Chem. 267:25129-25134, 1992)를 예로 들 수 있다. 플라스미드 pAC1 또는 ACCMVPLA의 사용은 클로닝 공정을 촉진한다. 셔틀 벡터는 이어서 293 세포들 안에서, 너무 길어서 단백질막으로 싸이기(encapsidated) 어려운 전체 인간 아데노바이러스 5 게놈을 포함하는 플라스미드로 동시 형질감염된다. 동시 형질감염은 인산칼슘 침강 또는 리포펙션(lipofection)에 의해 수행될 수 있다(Biotechniques 15:868-872, 1993). 플라스미드 JM17은 암피실린 내성에 대한 유전자를 포함하는 벡터 pBR322의 일부를 더해서 전체 인간 아데노바이러스 5 게놈을 인코딩한다(4.3 kb). 비록 JM17이 성숙한 바이러스 입자를 만들기 위해 모든 아네노바이러스 단백질을 인코딩한다해도, 그것은 너무 길어서 단백질막으로 싸이기 어렵다(야생형의 경우 36kb에 대해 40kb). 동시 형질감염된 세포의 작은 서브세트(subset)에서, 플라스미드 pAC1과 같은 셔틀 벡터를 함유하는 트랜스진과 플라스미드 pJM17과 같은 전체 아데노바이러스 5 게놈을 갖는 플라스미드 사이의 구조 재조합은 E1A/E1B 서열이 부족하고, 해당 트랜스진을 포함하지만 재조합 동안 pBR322 서열과 같은 부가 서열을 이차적으로 잃음에 따라, 단백질막으로 싸이기에 충분한 정도로 작아지는 재조합 게놈을 제공한다. 아데노바이러스 HCMVSP1lacZ(Clin. Res. 42:123A, 1994)를 인코딩하는 CMV 증식형 베타-갈락토시다아제(CMV driven beta-galactosidase)는 X-gal 처리를 사용하여 유전자 전달의 효율을 평가하는데 사용될 수 있다.

다른 실시양태에서, 유전자 인코딩 NOS, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS는 약해지거나 결여된 DNA 바이러스를 통해 생체 내로 도입될 수도 있으며, 상기 바이러스는 예를 들어 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 파필로마바이러스(papillomavirus), 엡스테인 바르 바이러스(EBV), 아데노바이러스 및 아데노-수반 바이러스(AAV)와 같으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전적으로 또는 거의 전적으로 바이러스 유전자가 부족한 결핍 바이러스가 바람직하다. 결핍 바이러스는 세포 안으로 도입된 후 전염성이 없다. 생명에 관계된 결핍성 벡터(defective, vital vectors)의 사용은 특정 국부 지역의 세포에 투여를 가능하게 하여, 상기 벡터가 다른 세포를 감염시킬 수 있다는 사실에 관계없다. 따라서, 특정 유전자 자리, 예를 들어, 뇌 또는 척수에서의 특정 유전자 자리가 벡터로 명확하게 표적화된다. 특정 실시양태에서, 결핍 헤르페스 바이러스 1(HSV1) 벡터가 사용될 수도 있다(Kaplitt et al.(1991) Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330). 또 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 Stratford-Perricaudet et al.(J. Clin. Invest 90:626-630(1992))에 의해 개시된 벡터와 같은, 약해진 아데노바이러스 벡터이다. 또 다른 실시양태에서, 벡터는 결핍 아데노 수반 바이러스 벡터이다(Samulski et al.(1987) J. Virl. 61:3096-3101; Samulski et al.(1989) J. Virol. 63:3822-3828).

본 발명은 또한 세포 관상동맥, 또는 대퇴골 동맥으로 트랜스진을 운반함으로써 뿐만 아니라, 예를 들어 조직 특이적 프로모터의 사용에 의해서도 세포 표적화(cell targeting)의 이용을 생각하고 있다. 예를 들어, 좌심실 미오신 경쇄-2(MLC[2V]) 또는 미오신 중쇄(MHC)의 조직 특이적 전사 조절 서열을 아데노바이러스의 구조 안에 있는 본 발명의 NOS 유전자와 같은 트랜스진에 융합함으로써, 트랜스진 발현은 심실근세포에 제한된다. lacZ에 따른 MLC[2V] 및 MHC 프로모터에 의한 특이성 정도 및 유전자 발현의 효율이 본 발명의 재조합 아데노바이러스 시스템을 사용하여 측정되었다. 심장 특이적 발현은 Lee et al.(J. Biol. Chem. 267:15875-15885(1992))에 의해 이미 보고되었다. MLC[2V] 프로모터는 250bp로 구성되어 있고, 아데노바이러스-5 패키징 구속(packaging constraints) 안에 쉽게 적 응된다. 미오신 중쇄 프로모터는 전사의 강한 프로모터라고 공지되어 있는 것으로, 적당한 대체 심장 특이적 프로모터를 제공하며 300bp 미만으로 구성되어 있다. SM22 알파 프로모터(Kemp et al.,(1995) Biochem J 310(Pt 3):1037-43) 및 SM 알파 액틴 프로모터(Shimizu et al.(1995) J Biol Chem 270(13):7631-43)와 같은 평활근 세포 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 트로포닌(troponin)-C 프로모터와 같은 다른 프로모터는, 매우 효과적이고 충분히 작지만, 적당한 조직 특이성이 부족하다. MLC[2V] 또는 MHC 프로모터를 사용하고 생체 내로 트랜스진을 운반함으로써, 심장 근세포만이(심장 내에서의 내피 세포, 평활근 세포, 및 섬유아세포에서 부수적인 발현이 없음) NOS 단백질의 적당한 발현을 제공할 것이다.

심장 근세포에 한정하는 발현은 또한 임상적 심근 허혈의 치료를 위한 유전자 전달의 유용성에 관해 이점을 갖는다. 발현을 심장에 한정함으로써, 망막과 같은 비 심장 조직에서 혈관형성에 대한 잠재적으로 해로운 효과를 피한다. 부가하여, 심장의 세포들에 관해, 근세포는 세포들이 빠른 회전을 거치지 않기 때문에 가장 긴 트랜스진 발현을 제공할 수도 있고; 발현은 따라서 내피 세포에서 일어나기도 하지만 세포 분할 및 사망에 의해 감소되지 않기도 한다. 내피 특이적 프로모터는 이미 이러한 목적을 위해 이용되고 있다. 내피 특이적 프로모터의 예로는 Tie-2 프로모터(Schlaeger et al.(1997) Proc Natl Acad Sci 1;94(7):3058-63), 엔도테린 프로모터(endothelin promoter)(Lee et al.(1990) J. Biol. Chem. 265:10446-10450), 및 eNOS 프로모터(Zhang et al.(1995) J Biol. Chem 270(25):15320-6)가 포함된다.

본 발명은 심장 질환의 치료에 관하여, 높은 역가의 벡터를 가지고 관상내(intracoronary) 또는 근육내 주사에 의해 심장을 표적화하는 것을 포함하고, 현재 모든 세포 형태를 형질감염시키는 것이 바람직하다. 발기 장애와 같은 질환 및 심근 경색, 심근 허혈, 심부전, 재협착, 스텐트 협착증(stent stenosis), 혈관형성 후 협착증, 및 바이패스 이식 부전을 포함한 심장혈관 질환은 NOS 트랜스진, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS 트랜스진을 사용하여 기술된 것처럼 치료될 수도 있다.

성공적인 재조합 벡터는 표준 방법에 따라 플라크 정제될 수 있다. 그 결과로 만들어진 바이러스 벡터는 바람직하게는 약 10¹⁰-약 10¹² 바이러스 입자/ml 범위의 역가가 되도록 인 트랜스(in trans)로 E1A 및 E1B 기능을 제공하는 293 세포들 위에서 번식된다. 세포들은 80% 합류점(confluence)으로 감염되고 48시간 후에 수확된다. 냉동-해동을 3회 반복한 후에 세포 부스러기가 원심분리에 의해 펠릿화되고 바이러스는 CsCl 구배 초원심분리(gradient ultracentrifugation)에 의해 정제된다(이중 CsCl 구배 초원심분리가 바람직함). 생체 내 주사 전에, 바이러스 군체(viral stock)는 G25 세파덱스(Sephadex)와 같은 세파로오스 칼럼(Sepharose columns)을 통해 겔 여과에 의해 탈염된다. 산물은 이어서 30 미크론 필터를 통해 여과되고, 그에 따라 여과되지 않은 바이러스의 관상내 주사의 해로운 영향(생명을 위협하는 심장 부정맥)을 줄이고 유효한 유전자 전달을 촉진한다. 그 결과의 바이러스 군체는 10¹⁰-10¹² 바이러스 입자/ml 범위에서 최종 바이러스 역가를 갖는다. 재조합 아데노바이러스는 야생형 (잠재적으로 반복성이 있는) 바이러스가 아닌 것으로 고도로 정제되어야 한다. 불순한 구조물은 숙주 동물에서 격렬한 면역 반응을 야기할 수 있다. 이러한 관점에서, 번식 및 정제는 예를 들어 적절한 프라이머를 사용한 PCR로 성공적인 재조합을 확인하고, 두 번의 플라크 정제와, 이중 CsCl 구배 초원심분리를 행함으로써 오염물질 및 야생형 바이러스를 차단하도록 수행될 수도 있다. 부가적으로, 환자에게 아데노바이러스 벡터를 주사함으로써 야기된 심장 부정맥과 관련되는 문제는 관상내 주사전에 적절한 크기의 필터를 통한 재조합 아데노바이러스의 여과에 의해 회피될 수 있다. 이러한 전략은 또한 유전자 전달 및 발현을 실질적으로 향상시키는 것으로 보인다.

바이러스 군체는 예를 들어, 필요할 때 살린과 같은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 주사용 제조품의 형태일 수 있다. 주사용 제조품에서 벡터의 최종 역가는 효과적인 유전자 전달을 가능하게 하는 약 10⁷-약 10¹³ 바이러스 입자의 범위에 있는 것이 바람직하다. 다른 약학적 담체, 제형화 및 투여량은 하기에 기술되어 있다. 아데노바이러스 트랜스진 구조물은 매우 효과적인 치료가 가능한 정도로 트랜스진이 발현되기에 충분한 양으로, 형광투시 안내 하에 표준 경피 카테테르 법(standard percutaneous catheter based methods)을 이용하여 직접적인 관상내(또는 이식 혈관) 주사에 의해서 심근에 운반된다. 관상 동맥(또는 이식 혈관)의 내강 안으로 깊이 주사되고(동맥 내강속 약 1cm), 부행 혈관의 성장이 각 환자 내에서 심하게 변할 수 있기 때문에, 바람직하게는 관상 동맥 모두에 주사된다. 상기 물질을 직접 관상 카테테르에 의해 관상 동맥의 내강 안으로 주사함으로써, 상기 유전자를 상당히 효과적으로 표적화할 수 있고, 주사하는 동안 근위 대동맥에 대해서 재조합 벡터의 손실을 최소화할 수 있다. 이러한 방식으로 운반될 때 유전자 발현은 간실질세포(hepatocyte)에서 발생하지 않고 바이러스 RNA는 관상내 주사후에는 계속 소변에서 발견될 수 없다. 예를 들어, 다양한 관상 카테테르, 또는 스택 관류 카테테르(Stack perfusion catheter)가 본 발명에서 사용될 수 있다. 부가하여, 당업자에게 공지되어 있는 다른 기술도 NOS 유전자, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS을 동맥벽으로 전달하기 위해 사용될 수 있다.

말초 혈관 질병, 다리에 불충분한 혈액을 공급하는 것을 특징으로 하는 질병의 치료를 위해, 본 발명의 NOS, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS, 펩티드 또는 단백질을 발현시키는 재조합 아데노바이러스는 대퇴골 동맥 또는 동맥들의 근접부 안으로 삽입된 카테테르에 의해 운반될 수도 있고, 그에 따라 대퇴골 동맥으로부터 나온 혈액을 받는 골격근의 세포 안으로 유전자를 전달한다.

본 발명의 NOS, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS, 또는 Akt 단백질을 인코딩하는 핵산 또는 트랜스진은 먼저 환자의 세포를 포함하여, 내피 또는 혈관 평활근 세포로 생체 외로 전달되는 경우에서, DNA는 직접적으로 세포로 형질감염될 수 있다(참고 미국 특허 제5,658,565호). 일반적으로, 표적 세포를 형질감염시키기 위해서, 본 발명의 Akt 또는 NOS를 인코딩하는 DNA 서열 또는 그의 생물학적으로 활성인 단편을 포함하는 플라스미드 벡터는 표적 세포의 리포솜 매개 형질감염에 활용될 수도 있다. 이들 소포의 불침투성과 연결된, 리포솜의 안정성은 리포솜을 치료 학적 DNA 서열의 운반을 위한 유용한 비히클(vehicle)로 만든다(검토를 위해, Mannino and Gould-Forgerite(1988) BioTechniques 6(7):682-690를 참고한다). 리포솜은 융합에 의해 많은 세포 형태에 흡수되는 것으로 공지되어 있다. 일 실시양태에서, SF-chol 또는 DC-chol과 같은, 양이온 콜레스테롤 유도체를 포함하는 양이온 리포솜이 활용될 수도 있다. DC-chol 분자는 Gao and Huang(Biochem, Biophys. Res. Comm. 179:280-285, 1991)에 의해 기술된 바와 같이 삼차 아미노기, 중간 길이 스페이서 암(medium length spacer arm) 그리고 카바모일 링커 결합(carbamoyl linker bond)을 포함한다.

리포솜 기술의 사용에 관한 다른 실시양태에서, 생물학적 활성 NOS 단백질 단편, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS 단백질 단편을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 바이러스 또는 비바이러스 계통의 벡터는 리포펙타민(lipofectamine)에 따른 표적 세포의 형질감염에 의해 표적 세포로 운반된다(Bethesda Research Laboratory). 리포펙타민은 다양성 지질 2,3 디올레일옥시-N-[2(스페르미네카르복시미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나미니움트릭 플루오로아세테이트(polycationic lipid 2,3 dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxymido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminiumtric fluroacetate: DOPSA)와 중성 지질 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(neutral lipid dioleoly-phosphatidylethanolamine: DOPE)의 3:1 리포솜 형성물이다.

유전자 운반에 대한 다른 비바이러스 모드는 (a) 노출된 DNA의 직접 주사; (b) 인산칼슘[Ca₃(PO₄)₂] 매개 세포 형질감염; (c) 전기영동에 의한 포유류 숙주 세 포 형질감염; (d) DEAE-덱스트란 매개 세포 형질감염; (e) 폴리브렌 매개 운반(polybrene mediated delivery); (f) 프로토플라스트 융합(protoplast fusion); (g) 마이크로주사(microinjection); 및 (h) 포유류 숙주로 다시 전달된 유전적으로 처리된 세포를 이용한, 폴리리신 매개 형질전환을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

트랜스게닉 동물의 생산

여기에 설명된 바와 같은, 돌연변이 NOS 유전자, 바람직하게는 돌연변이 eNOS 또는 nNOS 유전자를 포함하는 트랜스게닉 동물은 또한 본 발명에 포함된다. 트랜스게닉 동물은 재조합, 외인성 또는 클로닝된 유전 물질이 실험에 의해서 동물안으로 전달된 유전적으로 변경된 동물이다. 그러한 유전 물질은 종종 "트랜스진"으로 불린다. NOS의 형태인 경우에, 트랜스진의 핵산 서열은 특정 핵산 서열이 달리 정상적으로 발견되지 않는 게놈의 유전자 자리에서, 또는 트랜스진에 대한 정상적인 유전자 자리에서 혼합될 수도 있다. 트랜스진은 동일한 종의 게놈으로부터 또는 표적 동물의 종과 다른 종의 게놈으로부터 유래된 핵산 서열로 이루어질 수 있다.

용어 "생식 세포 트랜스게닉 동물(germ cell line transgenic animal)"은 유전 변화 또는 유전 정보가 생식 세포(germ line cell) 안으로 도입되어, 그에 따라 유전 정보를 자손에 전달하는 트랜스게닉 동물의 능력을 제공하는 트랜스게닉 동물을 말한다. 만약 상기 자손이 사실상 약간의 또는 모든 상기 변화 또는 유전 정보를 갖는다면, 그 또한 트랜스게닉 동물이다.

변화 또는 유전 정보는 수용자(recipient)가 속하는 동물의 종과 무관하거나, 단지 특정 개별 수용자와 무관할 수도 있고, 또는 수용자가 이미 지니고 있는 유전 정보일 수도 있다. 마지막 경우에, 변화되거나 도입된 유전자는 본래의 유전자와 다르게 발현될 수도 있다.

트랜스게닉 동물은 형질감염, 전기영동, 마이크로주사, 배 간세포에서의 유전자 표지화 및 재조합 바이러스 및 레트로바이러스 감염을 포함하여 다양한 다른 방법에 의해서 생산될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 제4,736,866호; 미국 특허 번호 제5,602,307호; Mullins et al.(1993) Hypertension 22(4):630-633; Brenin et al.(1997) Surg. Oncol. 6(2)99-110; Tuan(ed.), Recombinant Gene Expression Protocols, Methods in Molecular Biology No. 62, Humama Press(1997)를 참고한다).

다수의 재조합 또는 트랜스진 마우스가 생산되었으며, 활성화된 온코진 서열을 발현시키는 것(미국 특허 번호 제4,736,866호); 유인원 SV 40 T-항원을 발현시키는 것(미국 특허 번호 제5,728,915호); 인터페론 조절 인자 1(IRF-1)의 발현이 부족한 것(미국 특허 번호 제5,731,490호); 도파민 장애(dopaminergic dysfunction)를 나타내는 것(미국 특허 번호 제5,723,719호); 혈압 조절에 참여하는 적어도 하나의 인간 유전자를 발현시키는 것(미국 특허 번호 제5,731,489호); 자연스럽게 발생한 알츠하이머병에서 존재하는 상태와 큰 유사함을 나타내는 것(미국 특허 번호 제5,720,936호); 세포 유착(cellular adhesion)을 조정할 수 있는 능력이 감소된 것(미국 특허 번호 제5,602,307호); 소의 성장 호르몬 유전자를 소유 한 것(Clutter et al.(1996) Genetics 143(4):1753-1760); 또는 완전한 인간 항체 반응을 발생시킬 수 있는 것(McCarthy(1997) The Lancet 349(9049):405)이 포함된다.

마우스와 쥐는 최고의 트랜스게닉 실험을 위해 선택되는 동물이지만, 어떤 경우에는 다른 동물 종을 사용하는 것이 바람직하거나 심지어는 필수적이다. 트랜스게닉 과정은 양, 염소, 돼지, 개, 고양이, 원숭이, 침팬지, 햄스터, 토끼, 소 및 기니 피그를 포함한, 다양한 뮤린이외의 동물에서 성공적으로 이용되었다(예를 들어, Kim et al.(1997) Mol. Reprod. Dev. 46(4):515-526; Houdebine(1995) Reprod. Nutr. Dev. 35(6):609-617; Petters(1994) Reprod. Fertil. Dev. 6(5):643-645; Schnieke et al.(1997) Science 278(5346):2130-2133; 및 Amoah(1997) J. Aimal Science 75(2):578-585를 참고한다).

핵산 단편을 재조합에 알맞는 포유류 세포내로 도입시키는 방법은 다중 핵산 분자의 동시 형질전환에 유리한 방법에 의해서 가능하다. 트랜스게닉 동물을 생산하는 상세한 과정은 당업자라면 미국 특허 번호 제5,489,743호 및 미국 특허 번호 제5,602,307호에서의 개시내용을 포함하여, 쉽게 이용할 수 있을 것이다. 또한, NOS 트랜스게닉 동물의 생산은 상당히 개발되어 있다. 예를 들어, 야생형 eNOs를 유도 발현시키거나 과다 발현시키는 트랜스게닉 마우스가 생산되었다(Ohashi et al.(1998) J. Clin. Invest. 102(12):2061-71; 및 Drummond et al.(1998) J. Clin. Invest. 102(12):2033-4를 참고한다). 이들 방법을 본 발명의 NOS 돌연변이체를 발현시키는 트랜스게닉 마우스를 생산하는데 사용할 수도 있다.

치료학적 스크리닝 분석

eNOS의 인산화가 그의 활성을 조절한다는 발견은 Akt 조절된 NOS, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS, 활성 또는 발현을 조정하는 약제를 동정할 수 있도록 스크리닝 분석의 발전을 가능하게 한다. 생체 내 트랜스게닉 동물 분석, 생체 외 단백질계 분석, 세포 배양 분석 및 고 처리량 포맷을 포함하여, 어떠한 이용가능한 포맷이라도 사용될 수 있다.

화합물의 라이브러리를 시험하는 많은 약물 스크리닝 프로그램에서는, 정해진 시간에 조사된 화합물의 수를 최대화하기 위해 고 처리량 분석이 바람직하다. 정제 또는 반정제 단백질로 유도될 수 있는 것과 같은, 무세포계에서 수행된 분석은 테스트 화합물에 의해 매개되는 분자 표적물에서의 빠른 발생(development) 및 비교적 용이한 변화 검출을 가능하게 하기 위해 초래될 수 있다는 점에서 종종 "일차" 스크린(primary screens)으로 장려될 수 있다. 더욱이, 테스트 화합물의 세포 독성 및/또는 생물학적이용가능성(bioavailability)의 효과는 생체 외 시스템에서, 일반적으로 무시될 수 있고, 그 대신 분석은 예를 들어 분사 사이에 결합의 억제에 있어서 명백할 수 있는 주로 분자 표적물에 대한 약물의 효과에 주로 집중된다.

세포 또는 조직 배양 기초의 분석이 예를 들어 COS-7 세포(100 mm 접시)를 평판시키고 인산칼슘을 사용하여 NOS(7.5-30 mg) 및 Akt(1 mg) 플라스미드로 형질감염시킴으로써 행해질 수도 있다. 모든 형질감염을 균형잡기 위해서, β-갈락토시다아제 cDNA에 대한 발현 벡터가 동시형질감염될 수도 있다. 형질감염이 있은 지 24시간 내지 48시간 후, 적당한 단백질(40-80mg)의 발현은 eNOS mAb(9D10, Zymed), HA mAb(12CA5, Boehringer Mannheim), iNOS pAb(Zymed Laboratories) 또는 nNOS mAb(Zymed Laboratories)를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인될 수도 있다.

형질감염이 있은 지 24시간 내지 48시간 후, 기술된 것처럼(Sessa et al., 1995), NO 특이적 화학발광에 의해서, 아질산염(NO₂ ^-), 수용액에서 안정한 NO 생산물(stable breakdown product of NO)의 측정을 위해 배지를 처리할 수도 있다. 배지에서 단백질을 제거시키고(deproteinized), NO₂ ^-를 함유한 시료는 요오드 나트륨을 함유한 빙초산에서 환류된다. 이러한 조건하에서, NO₂ ^-는 NO 분석기(Sievers, Boulders, CO)에서 오존으로 반응된 후 화학발광 검출기에 의해 정량화된 NO로 양적인 면에서 감소된다. 모든 실험에서, 대조물은 NOS 저해제의 사용에 의해 NO₂ ^- 방출을 저해함으로써 제조될 수 있다. 부가하여, β-갈락토시다아제 cDNA로 형질감염된 세포로부터의 NO₂ ^- 방출은 혈청 또는 배지에서 발견된 NO₂ ^- 의 배경 레벨을 위해 대조물에서 뺄 수도 있다. COS에서 cGMP 축적은 또한 설명된 것처럼 NO 생산에 대해 생물학적분석(bioassay)으로 사용될 수도 있다. 다른 포멧에서, ³H-L-아르기닌에서 ³H-L-시트룰린(citrulline)으로의 전환이 이미 설명되어진 것처럼(Garcia-Cardena et al., 1998), COS 세포 또는 내피 세포 여액(lysates)에서 NOS 활성을 측정하는데 사용될 수도 있다.

생체 내 인산화 연구에 대해서, COS 세포는 야생형 또는 S635(대조물), 소 1179A, D 또는 E eNOS, 인간 1177D 또는 E eNOS, 쥐 1412D 또는 E nNOS, 인간 1415D 또는 E nNOS 및 HA-Akt에 대한 cDNA로 밤새 형질감염시킬 수도 있다. 형질감염이 있은 지 36시간 후, 세포들은 3시간 동안 80 μCi/ml의 ³²P 오르토인산으로 보충된 투석 혈청이 풍부한 무인산염 둘베코의 최소한의 필수 배지(dialyzed serum replete, phosphate-free Dulbecco's minimum essential medium) 안에 놓이게 된다. 세포 일부(cell aliquot)는 1시간 동안 그리고 라벨링 동안 무인산염 배지에서 워트만닌(wortmannin)(500nM)으로 전처리될 수도 있다. 이어서 여액이 수확되고, NOS는 용해되어 이전에 설명되어 있는 것처럼 ADP 세파로오스 친화성 크로마토그래피에 의해 부분적으로 정제되었으며 NOS내로의 ³²P 통합은 SDS-PAGE(7.5%) 후 방사선자동사진술에 의해 시각화되었고 NOS 단백질의 양은 NOS에 대한 웨스턴 블로팅에 의해 확인되었다.

생체 외 인산화 연구에 대해서, E. coli로부터 정제된 재조합 NOS, 다른 재료원으로부터 정제된 eNOS, 또는 Akt 인산화 부위에 걸쳐있는 NOS 펩티드는 형질감염된 COS 세포로부터 면역침강된 야생형 또는 키나아제 불활성 Akt로 배양된다. 간단히 설명하면, NOS 단백질 또는 펩티드는 실온에서 20분 동안 HEPES(20mM, pH=7.4), MnCl₂(10mM), MgCl₂(10mM) 및 면역침강된 Akt를 함유한 완충액에서, ³² P g- ATP(2 ml, 특이 활성도 3000Ci/mmol), ATP(50mM), DTT(1mM)로 배양된다.

야생형 및 돌연변이 NOS의 생체 외 인산화를 조사하는 실험에서, 바큘로바이러스(baculovirus) 감염된 SF9 세포로부터 정제된 재조합 Akt(1mg)는 야생형, S1179A 소 eNOS, S1177A 인간 eNOS, S1179D 또는 E 소 eNOS, S1177D 또는 E 인간 eNOS, S1412D 또는 E 쥐 nNOS, 또는 S1415D 또는 E 인간 nNOS로 상기한 바와 같은 조건을 필수적으로 사용하여 배양된다. 단백질은 SDS-PAGE 및 ³²P 통합에 의해 분해될 수도 있고 단백질의 양은 상기한 바와 같은 쿠마시에 염색에 의해 측정될 수도 있다.

Akt 의존성 인산화 또는 NOS, 바람직하게는 eNOS 또는 nNOS의 활성화를 분석하는 상기 스크리닝 분석은 매우 다양한 약제에 대해 스크리닝하기 위해서 사용될 수도 있다. 예를 들어, 소 eNOS에서 세린 1179, 인간 eNOS에서 잔기 1177, 쥐 nNOS에서 잔기 1412, 또는 인간 nNOS에서 잔기 1415에 해당하는 아미노산에서 NOS의 탈인산화를 저해하는 약제(포스파타아제 저해제)는 유용한 치료 분자일 수 있다. 유사하게, Akt를 활성화하거나 eNOS상의 Akt 인산화 부위와 흡사한 약제는 유용한 치료 분자일 수 있다.

상기 방법으로 분석된 약제는 임의로 선택되거나 또는 합리적으로 선택 또는 설계될 수 있다. 여기에 사용된 것처럼, 약제는 본 발명의 단백질만의 또는 그 관련 기질, 결합 파트너 등과의 연합(association)에 관여된 특정 서열을 고려하지 않고 약제가 임의로 선택될 때 임의로 선택된 것을 말하는 것이다. 임의 선택된 약제의 예는 화학 라이브러리 또는 펩티드 조합 라이브러리, 또는 생물의 성장 브로스(growth broth) 이용이다.

여기에 사용된 것처럼, 약제는 목적 부위의 서열 및/또는 약제의 작용과 관계된 그의 형상을 고려하는 임의가 아닌 것을 기본으로 하여 선택될 때 합리적으로 선택되거나 설계된 것을 말하는 것이다. 예를 들어, 합리적으로 선택된 펩티드 약제는 NOS에서 그 아미노산 서열이 Akt 인산화 부위와 유사한 펩티드일 수 있고, 특히 NOS 인산화 상태와 흡사한 펩티드 또는 작은 분자일 수 있다.

본 발명의 약제는 예를 들어, 펩티드, 작은 분자, 비타민 유도체, 또한 탄수화물일 수 있다. 당업자라면 본 발명의 약제의 구조적 성질에 관해 제한이 없다는 것을 쉽게 알 수 있을 것이다.

본 발명의 펩티드 약제는 당업계에 공지되어 있는 것처럼, 표준 고체상(또는 용액상) 펩티드 합성법을 사용하여 제조될 수 있다. 부가하여, 이들 펩티드를 인코딩하는 DNA는 상업적으로 이용가능한 올리고뉴클레오티드 합성 수단을 이용하여 합성될 수 있으며 표준 재조합 생산 시스템을 이용하여 재조합으로 생산될 수 있다. 만약 비유전자 인코딩 아미노산이 포함될 것이라면 고체상 펩티드 합성을 이용한 생산이 필요하게 된다.

본 발명의 다른 부류의 약제는 본 발명의 단백질의 임계 위치와 면역반응하는 항체이다. 항체 약제는 항원 영역으로서, 항체에 의해 표적화되도록 의도된 단백질의 부분들을 포함하는, 펩티드를 이용한 적당한 포유류 피검체의 면역화에 의해 얻어진다.

eNOS 활성을 조정하는 것으로 동정된 약제의 이용

소 eNOS에서 세린 1179, 인간 eNOS에서 잔기 1177, 쥐 nNOS에서 잔기 1412, 또는 인간 nNOS에서 잔기 1415에 해당하는 아미노산에서 NOS의 탈인산화를 저해하는 약제(포스파타아제 저해제)와 같은 본 발명의 약제, 그리고 또한 Akt를 활성화시키거나 또는 NOS상에서 Akt 인산화 부위와 흡사한 약제는 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복막내, 경피(transdermal), 또는 구강 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여되는 양은 수용자의 나이, 건강 및 체중, 공동 치료의 종류, 만약 있다면, 치료의 빈도수, 그리고 원하는 효과의 성질에 의존적일 것이다. 아래에 기술되어 있는 것처럼, 그러한 약제를 투여하는데 쉽게 적응될 수 있는 많은 방법들이 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 약제를 함유한 조성물을 제공한다. 개개의 요구가 다르지만, 각 성분의 유효량에 대한 최적 범위의 측정은 당업계의 기술 내에서 한다. 전형적인 투여는 0.1 내지 100mg/kg 체중을 포함하고, 바람직한 투여량은 0.1 내지 10 mg/kg 체중을 포함한다. 가장 바람직한 투여량은 0.1 내지 1mg/kg 체중을 포함한다.

약리학적으로 활성인 약제에 부가하여, 본 발명의 조성물은 작용 부위로 운반하기 위해 상기 활성 화합물을 가공하여 약학적으로 사용될 수 있는 제조물로 만드는 작업을 촉진하는 보조제 및 부형제를 포함하는 적당한 약학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수도 있다. 비경구 투여에 적당한 제형은 수용성 형태의 활성 화합물, 예를 들어 수용성 염의 수용액을 포함한다. 부가하여, 적절한 유성 주사 현탁액으로서 활성 화합물의 현탁액이 투여될 수도 있다. 적당한 친유성 용매(lipophilic solvents) 또는 비히클은 지방유(fatty oils), 예를 들어, 참깨 기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸 올레산염 또는 트리글리세라이드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시킨 물질을 포함할 수도 있고, 예를 들어, 소디움 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 및/또는 덱스트란을 포함한다. 선택적으로, 현탁액은 또한 안정화제를 포함할 수도 있다. 리포솜은 또한 세포 안으로 운반하기 위한 약제를 단백질막으로 싸기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 전신 투여를 위해 약학적 제형은 장내, 비경구 또는 국부 투여에 대해 제형화될 수 있다. 사실, 세 종류의 제형화 모두가 활성 구성요소의 전신 투여를 동시에 달성하기 위해 사용될 수 있다.

경구 투여에 적당한 제형은 경질 또는 연질의 젤라틴 캡슐, 알약, 코팅된 정제를 포함하는, 정제, 엘릭서제(elixirs), 현탁액, 시럽 또는 흡입약 및 그의 통제된 방출 형태(controlled release forms)를 포함한다.

본 발명의 방법을 실행하는데 있어서, 본 발명의 화합물은 단독이나 조합으로, 또는 다른 치료 또는 진단 약제와 함께 사용될 수 있다. 어떤 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 항응혈제(anticoagulant agents), 혈전용해제(thrombolytic agents), 또는 혈소판 응집 저지제, 조직 플라스미노겐 활성제, 우로키나아제(urokinase), 프로우로키나아제(prourokinase), 스트렙토키나아제, 헤파린, 아스피린, 또는 와파린(warfarin)을 포함하는 다른 항혈전제(antithrombotics)와 같은 일반적으로 허용되는 의료 관례에 따르는 이들 조건에 대해 전형적으로 처방된 다른 화합물과 함께 동시투여될 수도 있다. 본 발명의 화합물은 보통 인간, 양, 말, 소, 돼지, 개, 고양이, 쥐 및 마우스와 같은 포유류에서 생체 내, 또는 생체 외에서 활용될 수 있다.

도 1a-1b는 야생형 Akt이지만, 키나아제 불활성은 아닌 Akt는 세포막 관련 eNOS를 발현하는 세포로부터의 NO 방출을 증가시키는 것이다. 도 1a에서, COS 세포는 Akt 또는 키나아제 불활성 Akt(K179M)의 존재 또는 부재중에, eNOS에 대한 플라스미드로 형질감염되었고, NO의 생산(NO₂ ^-로서 분석됨)은 화학발광에 의해 측정되었다. 도 1b에서, COS 세포는 상기와 같은 다양한 NOS 플라스미드로 형질감염되었다. 도 1a와 도 1b에서 모두, NO₂ ^- 생산에 대한 값은 β-갈락토시다아제 cDNA로만 형질감염된 세포로부터 얻어진 레벨에서 뺀 것이었다. 삽입그림은 전체 세포 여액에서 단백질의 발현을 보여준다. 데이터는 평균±SEM이고, n=3-7 실험들; *는 p<0.05를 나타낸다.

도 2a-2d는 생체 외(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 활성 Akt에 의한 eNOS의 인산화이다. 도 2a에서, COS 세포는 HA-Akt 또는 HA-Akt(K179M)로 형질감염되었고, 여액은 면역침강(immunoprecipitated)되고 기질로서 히스톤 2B(25mg) 또는 재조합 eNOS(3mg)과의 시험관내 키나아제 반응에 놓여졌다. 상단 패널은 ³²P의 기질로의 통합(incorporation)을 나타낸 것이고 하단 패널은 겔의 쿠마시에 염색(Coomassie staining)에 의한 기질의 양을 나타낸 것이다. 도 2b에서 ³²P로 라벨링된 야생형 또는 eNOS(eNOS S635/1179)의 이중 세린 돌연변이체는 형질감염된 COS로부터 친화성(affinity) 정제되고 방사선자동사진술(상부 패널) 또는 웨스턴 블로팅(Western blotting)(하부 패널)을 거쳤다. 도 2b의 그래프 데이터는 겔에서의 특수한 항원에 반응하는 eNOS의 양에 대해 상대적인 라벨링된 단백질의 양을 반영한다. 도 2c에서, 라벨링된 eNOS는 트립신 및 RP-HPLC에 의해 분리된 펩티드로 소화되었다. 상부 크로마토그램은 라벨링되지 않은 합성 포스포펩티드(phosphopeptide) 표준(하부 크로마토그램)과 같이 이동하는 주요 라벨링된 트립신 펩티드를 보여준다. 삽입그림들은 라벨링된 펩티드의 선형 모드 MS(상단) 및 포스포펩티드 표준과 동일한 매스 이온(mass ions)에 의하여 보여준다. 도 2d에서, 재조합 야생형 eNOS 또는 eNOS S1179A는 정제되고 동일한 양(2.4mg)이 방법들에서 개시된 것처럼 재조합 Akt와 시험관내 키나아제 반응에 놓여졌다. 도 2d에서의 상단 패널은 ³²P의 eNOS로의 통합을 나타낸 것이고 하단 패널은 겔의 쿠마시에 염색에 의한 기질의 양을 보여준다. 그래프 데이터(n=3)는 시험관내 키나아제 반응에서 eNOS의 양(쿠마시에)에 대해 상대적인 라벨링된 eNOS의 양을 반영한다.

도 3은 세린 1179가 Akt 자극 NO 방출에 대해 기능적으로 중요하다는 증거이다. COS 세포는 Akt의 존재 또는 부재중에, 야생형 eNOS 또는 eNOS 돌연변이체에 대한 플라스미드로 형질감염되었고, 단백질의 발현과 NO의 생산(NO₂ ^-로서 분석됨)이 측정되었다. 흥미롭게도, A로의 S1179 돌연변이를 갖는 구조는 Akt에 의해 활성화되지 않았고 D로의 S1179의 돌연변이는 기능을 얻게 되었다. A에서, 데이터는 4-7번 실험에 대한 평균±SEM이고; *는 상당한 차이(p<0.05)를 나타낸다.

도 4a-4c는 Akt가 내피 세포에서 NO의 기초적이고 자극된 생산을 조절하는 것이다. 도 4a에서, BLMVEC는 아데노바이러스 구조(컨트롤로서 β-gal, myr Akt 및 AA-Akt)로 감염되었고 24시간 동안 생산된 NO₂ ^-의 양이 측정되었다(n=3). 삽입그림은 eNOS와 Akt의 발현을 도시하고 있다. 도 4b에서, 아데노바이러스로 감염된 BLMVEC로부터의 여액은 다양한 농도의 유리 칼슘으로 배양되었고 NOS 활성이 측정되었다(n=3 실험). 도 4c에서, BLMVEC는 상기와 같이 아데노바이러스로 감염된 다음 30분 동안 VEGF(40 ng/ml)로 자극되었고 NO₂ ^- 방출이 화학발광에 의해 정량화되었다. 데이터는 기초 레벨을 뺀 후의 NO₂ ^-의 VEGF 자극 방출로 표시되었다. 데이터는 평균±SEM, n=4이고; *는 상당한 차이(p<0.05)를 나타낸다.

도 5a 및 5b는 야생형과 eNOS S1179D의 순도 및 다이머/모노머 비율이다. a와 b에서, SDS-PAGE 분석이 쿠마시에 블루로 염색된 7.5% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 행해졌다. 분자량 표준(레인 1) 및 그들의 크기가 kDA 단위로 왼쪽에 표시되어 있다. 야생형 eNOS(레인 2) 및 eNOS S1179D(레인 3)(각 1㎍)는 화살촉 모양으 로 나타낸 것처럼 분해되었다. b에서, 단백질(각 2㎍)은 4℃에서 행해진 SDS-PAGE 상에서 분해되었다. 레인 1에서는 분자량 표준이었다. 야생형 및 eNOS S1179D의 비 샘플은 레인 2 및 3에서, 각각 분해되었다. 레인 4에서, 야생형 eNOS는 SDS 시표 완충액에서 끓여졌다.

도 6a와 6b에서 eNOS S1179D는 야생형 eNOS 보다 높은 NO 생산 속도(a) 및 환원효소 활성(b)을 갖는다. a에서, 야생형(●) 및 S1179D(○) eNOS로부터 발생된 NO의 속도는 L-아르기닌 농도의 함수로서, 헤모글로빈 포획 분석(hemoglobin capture assay)을 사용하여 측정되었고, 데이터는 이중 상호 도표(double reciprocal plot)로 나타내어져 있다. b에서, DCIP 및 시토크롬 c 분석이 CaM의 존재 또는 부재중에 행해졌다. 값은 평균±S.E.이고, n=4-6 측정이다. 적어도 세 개의 효소 조제품으로 유사한 결과들이 얻어졌다. 야생형과 S1179D eNOS 사이의 상당한 차이(p<0.05)는 별표로 나타내어져 있다.

도 7a 및 7b에서 NOS 활성(a) 및 NADPH-의존성 환원효소(b)는 야생형 효소와 비교할 때 eNOS S1179D에 대해서 증가된다. 헤모글로빈 포획(a) 및 NADPH-의존성 시토크롬 c 환원(b) 분석이 야생형과 S1179D eNOS 양쪽 모두에 대해 행해졌다. a에서, NO 생산 속도는 모든 NOS 보조인자(야생형(채워진 기호) 및 S1179D(비어있는 기호) eNOS)의 존재하에 측정되었다. 시토크롬 c 환원의 속도는 120nM 칼모듈린의 존재(채워진 기호) 또는 부재(비어있는 기호)하에서 아르기닌 및 야생형(원형) 및 S1179D(삼각형)에 대해 BH4(a)의 부재하에서 수행되었다. 값은 평균 ±S.E.이고, 적어도 세 개의 효소 조제품으로부터 n=3-6 측정들이다.

도 8a-8d에서 NOS의 칼모듈린- 및 칼슘-의존성 활성 및 환원효소 활성이 S1179D eNOS에 대해 약간 증진되었다. 칼모듈린-의존성 헤모글로빈 포획(a) 및 시토크롬 c 환원(b)이 야생형(채워진 기호)과 S1179D eNOS(비어있는 기호) 모두에 대해 수행되었다. 헤모글로빈 포획법에 의해 검출된 NO 생산의 속도는 모든 NOS 보조인자의 존재하에 있는 반면, 시토크롬 c 환원은 아르기닌 및 BH4의 부재중에 수행되었다. c와 d에서, 같은 실험이 점차 증가하는 농도의 자유 칼슘의 존재하에서 수행되었다. c와 d에서의 삽입그림은 NO 생산 및 시토크롬 c 분석 모두에서 S1179D와 야생형 eNOS의 칼슘-의존성 회전(turnover)을 나타내고 있다. 최대 회전율은 야생형과 S1179D eNOS, 각각에 대해 다음과 같았다: a 22 및 43 min^-1; b, 620 및 1400 min1; c, 58 및 100min1; 그리고 d, 1930 및 3810min^-1. 값은 평균 ±S.E.이고, 적어도 세 개의 효소 조제품으로부터 n=3-6 측정이다.

도 9a 및 9b에서 NOS의 EGTA-초기 불활성화는 S1179D eNOS에서 감소된다. 헤모글로빈 포획(a) 및 환원 효소 분석(b)이 하기의 변경에 따라 앞서 개시된 것처럼 수행되었다. 반응은 1분 동안 모니터되어 초기 속도를 측정하였고; 이어서 EGTA는 반응 혼합물에 첨가되었으며, 상기 속도는 추가 1분 동안 모니터되었다. 상기 반응에서 자유 칼슘 농도는 200μM이었고, 첨가된 EGTA의 양은 최종 농도가 0, 200, 400 및 600 μM인 킬레이터(chelator)가 되도록 하였다. 특이적 활성은 야생형과 S1179D eNOS에 대해 100%로 정상화된다. 값은 평균±S.E.이고, 적어도 세 개의 효소 조제품으로부터 n=3-6 측정이다. nd는 야생형 eNOS에 대해 검출 활 성 없음을 나타낸다.

하기 실시예들은 본 발명의 바람직한 실시양태를 구체적으로 지적하고, 어떤 식으로든지 개시내용의 나머지를 한정하는 것으로 해석되는 것은 아니다. 다른 포괄적인 형태는 당업자라면 분명히 알 것이다.

실시예

하기 과정은 실시예 1-2에서 채용되었다.

세포 형질감염: pcDNA3에서 소 eNOS, 인간 iNOS, 쥐 nNOS cDNAs 및 pCMV6에서 HA-태그된 야생형 Akt, Akt(K179M) 또는 myr-Akt가 표준 클로닝법에 의해 생성되었다. pcDNA3에서의 myr-nNOS는 PCR에 의해서 생성되어, nNOS 코딩 서열의 제2 아미노산에 대한 프레임에서 융합된 eNOS N-미리스토일레이션(myristoylation) 공통(consensus) 부위(MGNLKSVG, SEQ ID NO:1)를 포함하는 새로운 아미노 말단을 혼합하였다. COS 세포에서 예비 실험에서, 이러한 구축물은 ³H-미리스트산(myristic acid)의 통합을 바탕으로 N-미리스토일레이션되었고, 반면 본래의 nNOS는 그렇게 처리되지 않고 세포의 막 부분에서 표적화된 전체 단백질의 약 60%가 되었으며, 반면 nNOS의 단지 5-10% 만이 COS 세포에서 막에 연결되었다. eNOS에서 추정 Akt 인산화 부위의 돌연변이는 제조사의 지시에 따라 속성 변화 부위 관련 돌연변이유발법(Quick Change site-directed mutagenesis) 키트(kit)(Stratagene)를 사용하여 생성되었다. 모든 돌연변이체는 DNA 시퀀싱에 의해 입증되었다. COS-7 세포는 평 판화되었고(100mm 접시) 인산칼슘을 이용하여 NOS(7.5-30mg) 및 Akt(1mg) 플라스미드로 형질감염되었다. 모든 형질감염을 균형잡기 위해서, β-갈락토시다아제 cDNA에 대한 발현 벡터가 사용되었다. 형질감염이 있은 지 24시간 내지 48시간 후, 적당한 단백질(40-80mg)의 발현이 eNOS mAb(9D10, Zymed), HA mAb(12CA5, Boehringer Mannheim), iNOS pAb(Zymed Laboratories) 또는 nNOS mAb(Zymed Laboratories)를 이용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다.

형질감염된 COS 세포로부터의 NO 방출: 형질감염이 있은 지 24시간 내지 48시간 후, 배지는 기술된 것처럼(Sessa et al., 1995) NO 특이적 화학발광에 의해서, 아질산염(NO₂ ^-), 수용액에서 안정한 NO 생산물(stable breakdown product of NO)의 측정을 위해 처리되었다. 배지는 단백질이 제거되었고(deproteinized), NO₂ ^-를 함유한 시료는 요오드 나트륨을 함유한 빙초산에서 환류되었다. 이러한 조건하에서, NO₂ ^-는 NO 분석기(Sievers, Boulders, CO)에서 오존으로 반응된 후 화학발광 검출기에 의해 정량화된 NO로 양적인 면에서 감소되었다. 모든 실험에서, NO₂ ^- 방출은 NOS 저해제에 의해 저해될 수 있었다. 부가하여, β-갈락토시다아제 cDNA로 형질감염된 세포로부터의 NO₂ ^- 방출은 혈청 또는 배지에서 발견된 NO₂ ^-의 배경 레벨을 위해 대조물에서 뺐다. 몇몇 실험에서, COS에서의 cGMP 축적은 설명된 것처럼 NO 생산에 대해 생물학적분석으로 사용되었다.

NOS 활성 분석: ³H-L-아르기닌에서 ³H-L-시트룰린(citrulline)으로의 전환은 Garcia-Cardena et al.(1998)에 의해 이미 설명된 것처럼 COS 세포 또는 내피 세포 여액에서 NOS 활성을 측정하는데 사용되었다.

생체 내 및 생체 외 인산화 연구: 생체 내 인산화 연구에 대해서, COS 세포는 야생형 또는 S635, 1179A eNOS 및 HA-Akt에 대한 cDNA로 밤새 형질감염시켰다. 형질감염이 있은 지 36시간 후, 세포들은 3시간 동안 80 μCi/ml의 ³²P 오르토인산으로 보충된 투석 혈청이 풍부한 무인산염 둘베코의 최소한의 필수 배지 안에 놓였다. 어떤 세포들은 1시간 동안 그리고 라벨링 동안 무인산염 배지에서 워트만닌(wortmannin)(500nM)으로 전처리되었다. 여액이 수확되었고, eNOS는 용해되어 이전에 설명된 것처럼 ADP 세파로오스 친화성 크로마토그래피에 의해 부분적으로 정제되었으며 eNOS내로의 ³²P 통합은 SDS-PAGE(7.5%) 후 방사선자동사진술에 의해 시각화되었고 eNOS 단백질의 양은 eNOS에 대한 웨스턴 블로팅에 의해 확인되었다. 생체 외 인산화 연구에 대해서, E. coli로부터 정제된 재조합 eNOS이 형질감염된 COS 세포로부터 면역침강된 야생형 또는 키나아제 불활성 Akt로 배양되었다. eNOS는 실온에서 20분 동안 HEPES(20mM, pH=7.4), MnCl₂(10mM), MgCl₂(10mM) 및 면역침강된 Akt를 함유한 완충액에서, ³²P g-ATP(2 ml, 특이 활성도 3000Ci/mmol), ATP(50mM), DTT(1mM)로 배양되었다.

야생형 및 돌연변이 eNOS의 생체 외 인산화를 조사하는 실험에서, 바큘로바이러스(baculovirus) 감염된 SF9 세포로부터 정제된 재조합 Akt(1mg)는 상기한 바와 같은 조건을 필수적으로 사용하여 야생형 또는 S1179A eNOS(2.4mg, E coli로부터 정제됨)로 배양되었다. 단백질은 SDS-PAGE 및 ³²P 통합에 의해 분해되었고 단백질의 양은 상기한 바와 같은 쿠마시에 염색에 의해 측정되었다.

라벨링된 eNOS 펩티드를 동정하는 연구에서, 면역침강된 Akt는 상기한 바와 같이 재조합 eNOS배양되었다. 상기 시료는 SDS-PAGE상에서 퍼졌고, eNOS 밴드가 겔에서 분류되었으며, 그 결과로 나온 트립신 단편이 RP-HPLC에 의해 정제되었다. 펩티드 질량 및 ³²P 통합이 조사되었고, 튀어나온 라벨링된 피크가 또한 질량 분석법에 의해 분석되었다. 다른 실험에서, 잠재력이 있는 Akt 인산화 부위에 해당하는 펩티드가 합성되었고, HPLC에 의해서 정제되었으며 질량 분석법에 의해 입증되었다(W.M.Keck Biotechnology Resource Center, Yale University School of Medicine). 야생형 펩티드는 1174RIRTQSFSLQERHLRGAVPWA1194(SEQ ID NO:2)이었으며, 돌연변이 펩티드는 S1179가 알라닌으로 변한 것을 제외하고는 똑같았다. 시험관내 키나아제 반응은 본질적으로 상술된 바와 같으며 재조합 Akt(1mg)로 펩티드(25mg)를 배양시켰다. 반응은 이어서 포스포셀룰로오스 필터상에서 여과되고 혼합된 인산염의 양을 세렌코브 계산(Cerenkov counting)에 의해 측정되었다.

내피 세포에서 아데노바이러스 감염 및 NO 방출: 소의 폐 미소혈관 내피 세포(BLMVEC)가 100mm 접시(기초 NO 방출 및 NOS 활성 분석을 위해)나 또는 C6 웰 플 레이트(자극된 NO를 위해)에서 이미 설명된 것처럼(Garcia-Cardena et al., 1996a) 배양되었다. BLMVEC는 4시간 동안 β-갈락토시다아제 29를 포함하는 200 MOI의 아데노바이러스, HA-태그된 불활성 인산화 돌연변이 Akt(AA-Akt; Alessi et al., 1996) 또는 카르복실 말단 HA-태그된 구성적으로 활성인 Akt(myr-Akt)로 감염되었다. 바이러스는 제거되었고 세포는 18시간 동안 완전한 배지에서 회수를 위해 남겨졌다. β-갈락토시다아제 바이러스를 사용한 예비 실험에서, 이들 조건은 100%의 배양물을 감염시키기에 최적이었다. 기초 NO 생산의 측정을 위해 배지는 바이러스로 초기 감염한지 24시간 후 NO 방출을 위해 수집되었다. 자극된 NO 방출을 측정하기 위해, 세포들이 이어서 무혈청 배지로 세정한 다음 30분 동안 VEGF(40ng/ml)로 자극시켰다. 몇몇 실험에서는 NOS의 인산칼슘 의존도가 아데노바이러스 감염한지 24시간 후에 측정되었다. 감염된 세포는 1% NP40을 포함한 NOS 분석 완충액, 그리고 활성을 위해 사용된 세척용액 물질에서 용해되었다. 여액은 EGTA 완충처리된 칼슘으로 배양되어 배양물에서 적절한 양의 유리 칼슘을 얻었다.

통계: 데이터는 평균 ±SEM으로 표시되어 있다. 비교는 적당한 경우에 포스트-hoc 테스트(post-hoc test)와 함께 두개의 꼬리가 있는 스튜던트의 t-테스트(two-tailed, Student's t-test) 또는 ANOVA를 사용하여 이루어졌다. 차이는 p<0.05로 상당하다고 간주되었다.

실시예 1: Akt가 eNOS로부터 NO 생산을 조정한다

PI-3 키나아제의 하류방향 대사인자(downstream effector), Akt가 NO의 생산에 직접 영향을 미칠수 있다는 가능성을 조사하기 위해, COS-7 세포(NOS를 발현시 키지 않음)는 eNOS와 야생형 Akt(HA-Akt), 또는 키나아제 불활성 Akt(HA-Akt K179M)로 동시형질감염되었고 아질산염(NO₂ ^-)의 축적이 NO 특이적 화학발광에 의해 측정되었다. eNOS의 형질감염은 NO₂ ^- 축적의 증가와, 야생형 Akt, 그러나 키나아제 불활성 변이체는 아닌 것의 동시형질감염에 의해 현저하게 증대된 효과를 가져온다(도 1a). 동일한 결과는 생물학적으로 활성인 NO에 대한 생물학적분석으로서 cGMP를 사용하여 얻어진다. 이러한 실험 조건하에서, Akt는 포스포-Akt 특이 Ab(세린 473으로 인식되고; 도시되지 않았음)를 사용한 웨스턴 블로팅 및 Akt 활성 분석에 의해 측정된 바와 같이 촉매작용적으로 활성이었다(도 2a 참고). 구성상 활성인 형태의 Akt(myr-Akt)의 형질감염은 cGMP 축적(COS 세포에서 분석됨)을 5.5±0.8에서 11.6±0.9 pmol cGMP/mg 단백질까지(각각, eNOS 단독으로 또는 eNOS와 myr-Akt로 감염시킨 세포에서) 증가시키는 반면 키나아제 불활성 Akt는 cGMP 축적에 영향을 주지 않는다(5.8±0.8 pmol cGMP, n=4 실험들). 삽입그림에서 도시된 것처럼, 동일 레벨의 eNOS 및 Akt가 COS 세포 여액에서 발현되었다는 것은 Akt가 eNOS를 조정하여 기본 조건하에서 NO 생산을 증가시킨다는 것을 나타내는 것이다.

eNOS는 골지(Golgi) 영역과 내피 세포의 플라즈마 막 안에서 표적화된 이중 아실레이트화된 말초 막 단백질(dually acylated peripheral membrane protein)이고(Liu et al., 1997; Garcia-Cardena et al., 1996a; Shaal et al., 1996) 분류가 길항근 공격(agonist challenge)에 반응하는 NO의 효과적인 생산을 위해 요구된다(Sessa et al., 1995; Liu et al., 1996; Kantor et al., 1996). Akt에 의한 eNOS 활성이 막 분류를 요구하는지를 검사하기 위해, COS-7 세포가 Akt에 대한 cDNA로 동시형질감염되었고 eNOS의 미리스토일레이션, 팔미토일레이션 결함 돌연변이체(myristoylation, palmitoylation defective mutant)(G2A eNOS) 및 NO의 방출이 정량화되었다. 도 1b에 도시된 것처럼, Akt는 아실레이션되지 않은 형태의 eNOS를 활성화시키지 않는다는 것은 막에 대한 양 단백질의 분류가 그 기능적 상호작용을 위해 요구된다는 것을 나타내는 것이다(Downward et al., 1998). 다음으로, Akt가 구조적으로 유사하지만 별개의 용해성 NOS 동형인, 신경(neuronal) 및 유발(inducible) NOS(nNOS 및 iNOS, 각각)을 활성화시킬 수 있는지가 검사되었다. Akt와 nNOS 및 iNOS의 동시 형질감염이 NO 방출을 추가로 증가시키지 않았다는 것은 eNOS에 대한 Akt의 특이성을 보여주는 것이다. 하지만, 생물학적 막과의 상호작용을 증대시키기 위해서, nNOS에 N-미리스토일레이션 부위를 첨가하는 것은, eNOS로 보여준 것과 유사한 방법으로 nNOS의 Akt 자극이란 결과를 가져오고, 양쪽 동형은 막이 고정되었을 때 Akt 키나아제에 의한 활성화에 민감할 수도 있다는 것을 나타낸다.

실시예 2: eNOS 돌연변이의 생산

상기 실험들은 아마도 eNOS의 인산화에 의한 Akt가 원 세포로부터 NO 방출을 조정할 수 있다는 것을 내포한다. 사실, 두 개의 추정 Akt 인산화 모티프(RXRXXS/T)는 eNOS에 존재하고(소 eNOS에서 세린 635 및 1179 또는 인간 eNOS에서 세린 633 및 1177) 한 개의 모티프는 nNOS에 존재하고(쥐에서 세린 1412 및 인간 nNOS에서 1415) 명백하지 않은 모티프가 iNOS에서 발견되었다. eNOS가 생체 외 Akt 인산화에 대한 잠재력 있는 기질인지를 검사하기 위해, COS 세포는 HA-Akt 또는 HA-Akt(K179M)로 형질감염되었고 키나아제 활성은 기질로서 재조합 eNOS를 사용하여 평가되었다. 도 2a에 도시된 것처럼, 활성 키나아제는 히스톤 2B와 eNOS(각각, 69.3±2.9와 115.4±3.8 pmol의 ATP/nmol 기질, n=3)를 인산화시키는 반면, 불활성 Akt는 히스톤이나 eNOS 인산화를 현저하게 증가시키지 않는다. eNOS에서 추정의 Akt 인산화 부위가 ³²P의 통합에 대해 책임이 있는지를 밝히기 위해서, 두개의 세린은 알라닌 잔기로 돌연변이 되었고 야생형 및 돌연변이 eNOS 인산화를 자극할 수 있는 Akt의 능력은 원래의 COS 세포에서 검사되었다. 형질감염된 세포는 ³²P-오르토인산염으로 라벨링되었고, eNOS는 ADP-세파로오스 친화성 크로마토그래피에 의해 부분적으로 정제되었으며, 인산화 상태 및 단백질 레벨이 정량화되었다. 도 2b에 도시된 것처럼, Akt의 동시 발현은 자극된 세포에 비해 eNOS의 인산화를 2배로 증대시킨다. 워트만닌으로 eNOS/Akt 형질감염된 세포의 전처리는 인산화에서의 Akt 유도 증가를 없앴다. 더욱이, 세린 635 및 1179에서 알라닌 잔기로의 돌연변이는 eNOS의 Akt 의존성 인산화를 없앴고, 이러한 사실은 이들 잔기가 원래의 세포에서 잠재력 있는 인산화 부위로 쓰일 수 있음을 나타낸다.

Akt에 의해 인산화된 잔기를 직접 동정하기 위해, 야생형 eNOS는 면역정제된 Akt로 배양되었고 인산화 부위는 HPLC와 그 후 MALDi-질량 분석법(MALDi-MS)에 의해 측정되었다. 도 2c에 도시된 것처럼, 일차 ³²P 라벨링된 트립신 포스포펩티드는 합성 포스포펩티드(위치 1179에 포스포세린을 가진 아미노산 1177-1185)와 동시 용출하고 선형 모드 MS에 의해 측정된 것과 동일한 매스 이온을 갖는다. 리플렉트론(reflectron) 모드 MALDi-MS 모니터링을 이용하여, 라벨링된 트립신 펩티드와 표준 포스포펩티드는 HP₃O₄의 손실을 보여주었으며, 이는 트립신 펩티드가 인산화되었음을 보여준다. 부가하여, S1179의 A로의 돌연변이는 야생형 단백질과 비교하여 eNOS의 Akt-의존성 인산화를 상당히 감소시킨다(도 2d). 동일한 결과가 재조합 Akt(0.22±0.02 nmol 인산염/mg을 혼합시킨 알라닌 돌연변이 펩티드와 비교하여 24.6±3.7 nmol 인산염/mg을 혼합시킨 야생형 펩티드; n=5)에 대한 기질로서 야생형 또는 eNOS S1179A로부터 유래된 펩티드(아미노산 1174-1194)를 활용하여 얻어졌다. 일괄하여, 이들 데이터는 eNOS가 Akt에 대한 기질임을 보여주고 인산화의 일차 부위는 세린 1179(인간 eNOS에서 세린 1177)임을 보여준다.

다음으로 세린 635에서 추정의 Akt 인산화 부위 및 세린 1179에서 확인된 부위의 기능적인 의미를 검사하였다. 이중 돌연변이 eNOS S635/1179A로의 COS 세포의 형질감염은 Akt 의존성 NO 방출을 없앤다. 세린 635의 알라닌으로의 돌연변이는 NO 방출을 감소시키지 않지만 eNOS S1179A는 eNOS의 Akt 의존 활성화를 없앤다(도 3). 이들 결과는 세린 1179가 NO 방출에 대해 기능적으로 중요함을 나타낸다. 인산염의 첨가에 의해 공급된 음 전하를 대신하기 위한 세린 1179의 아스파르트산(eNOS S1179D)으로의 돌연변이는 Akt(인간 eNOS에서 S1177D)에 의해 유도된 활성화 상태와 부분적으로 흡사하다. 모든 부위 관련 돌연변이체는 충분히 발현되었고(삽입그림 웨스턴 블롯 참고) 세포 여액에서 NOS 촉매 활성을 유지하였다(eNOS로만 형질감염된 COS 세포에서, NOS 활성은 각각 야생형, S1179A, S635, 1179A 및 eNOS S1179D를 발현하는 COS 세포의 여액로부터 85.3±27.0, 71.9±2.9, 80.8±23.2 및 131.8±36.7 pmol 생성된 L-시트룰린/mg 단백질이었음, n=3 실험들).

Akt가 내피 세포로부터 NO 발생을 매개하는지를 검사하기 위해서, 소의 폐 미소혈관 내피 세포(BLMVEC)는 활성화된 Akt(myr-Akt), 활성화 결핍 Akt(AA-Akt) 또는 대조물로서 β-갈락토시다아제를 발현하는 아데노바이러스로 감염되었고 NO의 축적이 측량되었다. 도 4a에 도시된 것처럼, myr-Akt는 BLMVEC로부터 기초 NO 생산을 자극하는 반면, β-갈락토시다아제 또는 활성화 결핍 Akt로 감염된 세포는 검출 한계에 가까운 낮은 레벨의 NO를 방출시켰다. COS 세포에서의 유사한 결과들과 공동으로 이들 데이터는 eNOS의 Akt 인산화가 칼슘의 나머지 레벨에서 NO 생산을 조절하기에 충분하다는 것을 나타낸다. 사실, myr-Akt 감염된 BLMVEC로부터의 여액에서 측정된 NOS 활성은 고정된 칼모듈린(calmodulin) 농축물에서 분석된, 칼슘에 의한 활성화에 대한 효소 민감성이 β-갈락토시다아제 바이러스로 감염된 BLMVEC에서 보여진 NOS 활성에 비해 증대됨을 나타내고 있다(도 4b). 흥미롭게도, 활성화 결핍 Akt로 감염된 세포에서 NOS 활성의 칼슘 민감성은 myr-Akt 및 β-갈락토시다아제 감염 세포 모두에 비해서 크게 억제되었다.

VEGF를 이용한 내피 세포의 처리는 Akt 23을 활성화시키는 것으로 공지되어 있고 기구를 통한 NO의 방출은 PI-3 키나아제의 저해제에 의해 부분적으로 방해된 다(Papapetropoulos et al., 1997). NO 방출과 활성화에 대한 길항근으로서 VEGF 사이의 기능적 연결을 검사하기 위해, BLMVEC는 myr-Akt, AA-Akt 또는 β-갈락토시다아제에 대한 아데노바이러스로 감염되었고 VEGF 자극된 NO 방출이 정량화되었다. 도 4c에 도시된 것처럼, myr-Akt에 따른 내피 세포의 감염은 VEGF 증식형 NO 생산을 증대시키지만 AA-Akt는 NO 방출을 감소시킨다. 이들 결과는 Akt가 내피 세포에서 기초적인 및 자극된 NO 생산 모두에 요구된 신호 형질도입 이벤트에 참여한다는 것을 암시한다.

집합적으로 이들 데이터는 Akt가 세린 1179(인간 eNOS에서 세린 1177) 상에서 eNOS를 인산화시킬 수 있고 그러한 인산화가 NO를 생성할 수 있는 효소의 능력을 증대시킨다는 것을 보여준다.

실시예 3

재료 및 방법

eNOS 구축물 및 단백질 정제 - 플라스미드 pCW에서 야생형 소 eNOS가 E. coli BL21 세포에서 groELS로 이미 설명된 것처럼(Martasek et al., 1996) 발현되었다. E. coli에서 발현을 위한 S1179D 돌연변이 eNOS는 다음과 같이 생성되었다. pcDNA 3에서의 eNOS S1179D(Fulton et al., 1999)가 XhoⅠ/XbaⅠ로 소화되었고, pCW에서 eNOS의 동일 부위안으로 서브크로닝되었으며, groELS로 동시 발현되었다. 재조합 eNOS의 분리가 하기와 같이 변경하면서, 이미 보고된 것처럼(Roman et al., 1995; Martasek et al., 1999) 수행되었다. eNOS는 10ml NADPH나 10mM 2'-AMP와 함께 2'5'-ADP 세파로오스로부터 용출되었다. eNOS의 양은 0.1 μM^-1cm^-1의 힘(heme) 함량에 대한 소멸 계수(extinction coefficient)와 함께, 409-412 nm의 피크 흡광도를 이용하여 정량화되었다. eNOS의 순도는 7.5% SDS-PAGE와 그 다음 쿠마시에 염색에 의해 측정되었다. 저온 SDS-PAGE는 시료가 끓지 않았고 전기영동법이 4℃로 얼음/물의 슬러리에서 행해진 것을 제외하고는, 똑 같이 수행되었다(Klatt et al., 1995). NOS 보조인자(L-아르기닌, 칼모듈린 및 NADPH)가 적정된 실험에서, 그것들은 효소의 정제 및 저장으로부터 생략되고 하기에 설명된 것처럼 배양되었다.

NOS 활성에 대한 분석 - NO 생산이 설명된 것처럼(Kelm et al., 1988) 헤모글로빈 포획 분석에 의해 측정되었다. 간단히 말하면, 반응 혼합물이 HEPES 완충액(50mM), pH 7.4에서 eNOS(0.5-2.5 ㎍), 옥시헤모글로빈(8 μM), L-아르기닌(100 μM), BH₄(5 μM), CaCl₂(120 μM), 칼모듈린(120-200 μM) 및 NADPH(100 μM)를 포함하였다. eNOS에 대한 칼슘 EC50 값의 측정에 있어서, 상기 반응 혼합물은 다음과 같이 변경되었다: MOPS 완충액(10mM, pH 7.6), KCl(100ml) 및 CaM(250nM)로 치환되었다. 이들 조건하에서, 유리 칼슘은 Kd가 2.2 ×10^-8 M로, WinMAXC 프로그램, 버전 1.8(Stanford University)을 사용하여 계산되었다. 정확한 유리 칼슘 농도는 적당한 비율의 10 mM K₂EGTA 및 10 mM CaEGTA 군체 용액들(Molecular Probes)을 혼합함으로써 달성되었다. NOS 활성은 2분에 걸쳐 401 nm에서 선형성에 대해 모니터 되었고, NO 생산은 60 mM^-1cm^-1의 소멸 계수를 이용하여 흡광도 변화를 기초로 계산되었다. 모든 반응은 23℃에서 수행되었고, 각 데이터 점은 3-8 번의 관찰을 나타낸다. 276 nm에서의 0.0033 μM^-1cm^-1의 소멸 계수가 칼모듈린 농도를 측정하기 위해서 사용되었다. 이러한 방법을 이용한 NO의 생산은 니트로-L-아르기닌(1 mM)의 첨가에 의해 완전히 차단되었다. eNOS의 불활성이 반응 혼합물에 EGTA(200-800 μM) 첨가에 의해 측정되었을 때, 킬레이터는 NADPH에 의한 반응 개시 1분 후 첨가되었다. NADPH-시토크롬 c 환원효소 활성이 검사되었을 때 동일한 조건이 사용되었다. 이들 반응은 eNOS(0.5㎍)을 가진 0.5-mL 체적에서 CaM(120nM) 및 CaCl₂(200μM)를 포함하였다.

L-아르기닌에서 L-시트룰린으로의 전환이 Bredt et al.(1990)에 의해 이미 설명되어진 바와 같이 분석되었다. 간단히 말하면, eNOS(0.25-2 ㎍)은 23℃에서 3-10분 동안 하기 반응 혼합물에서 배양되었다: 50-100 ㎕의 최종 반응 체적으로 3 pmol의 L-[3H]아르기닌(55 Ci/mmol), 10-300 μM 아르기닌, 1mM NADPH, 120-200 nM 칼모듈린, 2mM CaCl2, 및 30 μM BH4. 반응은 2 mM EGTA 및 EDTA를 포함해서, 0.5ml의 20mM HEPES, pH 5.5의 첨가에 의해 종결되었다. 반응 혼합물은 Dowex AG50WX8 위에 놓여졌고, 통과물(flow-through)이 패커드 1500 액체 신틸레이션 분석기(Packard 1500 liquid scintillation analyzer)로 계산되었다.

환원효소 활성에 대한 분석 - NADPH-시토크롬 c 환원효소 활성 및 2,6-디클로로페놀린도페놀(DCIP) 환원이 Martasek et al.(1999) 및 Master et al.(1967)에 의해 이미 설명된 것처럼 시토크롬 c 및 DCIP 양쪽 모두에 대해 0.021 μM^-1cm^-1의 소멸 계수를 이용하여 550 nm에서의 흡광도 변화로 측정되었다. 간단하게 말하면, 반응 혼합물(1ml)은 시토크롬 c(90μM); DCIP(36μM), pH 7.6의 HEPES 완충액(50mM), NaCl(250mM), NADPH(100μM), 칼모듈린(120nM) 및 CaCl2(200μM); 또는 지적된 바와 같은 다른 물질을 포함하였다. 반응은 eNOS의 첨가 후 60초 동안(23℃에서) 모니터되었다. 환원 효소 활성의 불활성화가 EGTA(200-800μM)의 첨가에 의해 측정되었을 때, 반응 개시 1분 후에 킬레이터가 첨가되었고 추가 1분 동안 모니터되었다. 반응은 pH 7.6의 HEPES 완충액(50 mM), CaM(120nM), 및 CaCl₂(200μM)를 포함하였고 NADPH(100 μM)로 개시되었다. 헤모글로빈 포획 실험에 사용된 조건과 흡사하도록 eNOS의 EGTA 불활성화를 검사한 실험에서는 어떠한 NaCl도 첨가되지 않았다. NOS 저해제의 첨가는 시토크롬 c 환원의 속도에 영향을 주지 않았다(도시되지 않았음). eNOS에 대한 칼슘 EC50의 측정이 헤모글로빈 포획 분석에 대해 상기 기술된 것처럼 수행되었다.

데이터 분석 및 통계 - 모든 데이터는 평균 ±S.E.로 표현되었다. 적어도 3번의 측정이 각 데이터 집합에 대해 최소 세 개의 다른 일단의 효소를 가지고 행해졌다. 야생형 및 돌연변이 효소가 동시에 제조품들 사이의 활성 변화를 조절하기 위해 정제되었다. 통계적인 의미가 스튜던트 t 테스트를 이용하여 측정되었고, p<0.05는 통계적으로 상당하다고 간주되었다.

결과

eNOS의 발현 및 정제 - 야생형과 S1179D eNOS 모두는 발현되었고 E. coli로부터 정제되었다. 1.6리터의 배양물에서, 대략 2.5-4.0 mg의 eNOS가 전형적으로 2'5'-ADP 세파로오스 4B 크로마토그래피를 이용하여 회수되었다. 도 5a에 도시된 것처럼, 양쪽 효소는 쿠마시에 염색을 기초로 >90% 순수하였다. 이들 결과는 나란히 제조된 야생형과 S1179D eNOS 양쪽 모두에 대한 일곱 개의 독립적인 조제품들로부터 도시된 것처럼, 전형적이다. 양쪽 효소는 저온 SDS-PAGE에 의해 도시된 것처럼, 주로 이합체 형태로 존재하였다(도 5b).

eNOS S1179D는 야생형 eNOS 보다 더 큰 NO 신타아제 및 환원효소 활성을 갖는다 - 다음으로, 야생형과 S1179D eNOS의 활성은 NO 생산 속도를 측정함으로써 비교되었다. S1179D eNOS는 야생형 효소와 비교할 때 보다 큰 회전을 나타내었다(84±6 대 27±1 min^-1, n=6 효소의 별도 쌍을 이룬 조제품). L-아르기닌에 의한 Km값은 야생형 및 S1179D eNOS에 대해서 유사하였다(도 6a, 각각 1.8 대 2.5 μM; 표 1 참고).

환원효소 도메인에서 옥시제나아제 도메인으로 흐르는 전자의 속도는 NOS 촉매현상에 중요하기 때문에, S1179D eNOS 활성의 증가는 그것이 환원효소 활성을 증대시키는데 기여하는지를 측정하기 위해 검사되었다. DCIP와 시토크롬 c 환원이 모두 검사될 때, 야생형 eNOS와 비교해서 S1179D의 경우에 상당한 활성 증가가 관찰되었다(도 6b). 더욱이, 이러한 증가는 양쪽 효소에 대한 전체 활성을 증가시킨 CaM의 존재에 의해서 강조되었다. 기초 시토크롬 c 환원은 CaM의 부재중에서, 야생형 eNOS와 비교해서 S1179D의 경우에 4배 더 높았다. CaM 자극된 시토크롬 c 환원의 크기는 S1179D eNOS의 경우에 보다 더 컸지만(야생형 및 S1179D eNOS에 대해 749±35 대 1272±55 min^-1); CaM에 의한 자극의 레벨은 S1179D eNOS에 대해 단지 3배인 것에 비교해서 야생형 eNOS에 대해서는 8배였다.

다음으로, S1179D eNOS가 시토크롬 c를 줄일 수 있는, 야생형 eNOS보다 더 수퍼옥사이드(superoxide)를 생산하는지가 측정되었다. 예상된 바와 같이, CaM의 부재중에 수퍼옥사이드 디스무타아제 저해 시토크롬 c 환원(superoxide dismutase inhibitable cytochrome c reduction)이 발견되지 않았고(수퍼옥사이드 음이온 생성 지수로), 야생형 eNOS(86±6 대 95±88 min^-1)에 대해 그리고 S1179D eNOS(278±9 대 288±7 min^-1, n=3-5)에 대해서 앞서 보고된 바와 같다. 하지만, CaM의 존재중에는, 수퍼옥사이드 디스무타아제가 야생형(610±51 대 866±8 min^-1) 및 S1179D(1179±43 대 1518±19 min^-1) eNOS 양쪽 모두의 경우에 대해 시토크롬 c 환원의 속도를 감소시켰다. 수퍼옥사이드 디스무타아제의 존재중에서 시토크롬 c 활성의 상대적 감소는 양쪽 효소가 유사하였고(야생형의 경우 30% 그리고 S1179D eNOS의 경우 22%), 야생형 eNOS와 비교해서 증대된 S1179D의 환원효소 활성은 효소의 탈공역(uncoupling)으로 인한 것이 아니라는 것을 나타낸다.

NADPH-의존 NO 형성 및 환원효소 활성은 야생형 및 S1179D eNOS의 경우에 다 르지 않다 - NADPH 결합 부위가 eNOS에서 Ser-1179의 바로 가까이에 놓여 있기 때문에 NO 생산 및 시토크롬 c 환원의 NADPH 의존도가 검사되었다. S1179D eNOS는 CaM의 존재중에 분석된, NO 생산을 기초로 야생형 효소보다 더 높은 최대 회전수(k_cat)를 가졌다(도 7a). 증가된 k_cat는 야생형 eNOS와 비교하여 S1179D eNOS의 경우 4배 증가된 Km과 관련되었다. CaM의 부재중에서 NADPH 의존성 시토크롬 c 환원에 대한 k_cat는 야생형 eNOS보다 eNOS S1179D의 경우에서 더 컸다(각각, 290 대 70 min^-1; 도 7b). CaM의 존재중에서, 시토크롬 c 환원에 대한 k_cat는 야생형 eNOSdp 비해 S1179D의 경우에 상당히 더 높았다(각각 840 대 460 min^-1). NADPH에 대한 Km 값은 CaM의 부재 또는 존재 중에 변하지 않았다(CaM의 부재 및 존재중에서 각각 야생형 eNOS의 경우에는 0.40 및 0.75 μM 그리고 S1179D eNOS의 경우에는 2.0과 1.9μM).

CaM에 대한 EC50 값은 야생형 및 S1179D eNOS 사이에서 변경되지 않았다 - S1179D eNOS의 증가된 활성이 CaM에 대한 효소의 친화성 변경에 공헌되었음을 판단하기 위해서, CaM 농도의 함수로서 과다한 모든 NOS 보조인자의 존재중에 분석된 NOS 활성 및 시토크롬 c 환원의 동역학이 검사되었다. NOS 활성의 CaM 활성화에 대한 k_cat는 야생형의 경우 22 min^-1이었고 S1179D eNOS의 경우 43min^-1이었다. k_cat의 차이에 대해 정상화한, 데이터의 변환은 S1179D eNOS의 경우 곡선에서 좌측으로 약간의 변화를 그러나 CaM에 대한 EC50의 근소한 차이를 드러냈으며, 포스포-eNOS 에 대해 보고된 데이터(Mitchell et al., 1999)와 일치하였다. EC50값은 야생형의 경우 8nM 및 S1179D eNOS의 경우 7nM이었다(도 8a). NADPH 매개 시토크롬 c 환원이 측정되었다. 시토크롬 c 환원의 CaM 활성화에 대한 k_cat는 야생형 효소와 비교해서 S1179D eNOS의 경우에 약 2배 더 높았다(각각 S1179D와 야생형 eNOS에 대해 1140 및 620 min^-1). k_cat의 차이에 대해 정상화된 데이터의 변환은 야생형과 S1179D eNOS 사이에서 CaM에 대한 EC50 값의 작은 차이를 드러냈다(21 대 13 nM; 도 8B).

eNOS의 칼슘 활성화 및 불활성화에 대한 비교 - 이전의 실험들에 있어서, eNOS의 "확실한 칼슘 감수성"이 대부분 포스포-eNOS 또는 S1179D eNOS를 발현하는 세포에서 증대되었음을 보여주었고, 이는 인산화가 칼슘/CaM 활성화의 친화성을 변화시킴을 나타내었다(Dimmeler et al., 1999; Fulton et al., 1999). 도 8c에 도시된 것처럼, 최대 활성의 차이에 대해 정상화한 후, 칼슘 의존도는 S1179D eNOS의 경우에 약간 증가되었다(p<0.05, 변이도의 양방향 분석). 야생형과 S1179D eNOS의 칼슘에 대한 EC50 값도 약간 차이가 났고,(각각, 310과 250 nM 칼슘) NO 생산에 의해 측정된 바와 같았다(250 nM CaM의 존재중에). 도 8c의 삽입그림에 도시된 것처럼, 유리 칼슘의 농도의 증가는 사실 야생형 효소로 도시된 것보다 더 큰 정도로 S1179D eNOS 회전을 증대시키는 것이었다. 더욱이, 시토크롬 c 환원을 분석하는 칼슘에 대한 EC50은 NO 생산을 측정하여 얻어진 것과 유사였다(도 8d; 각각 야생형과 S1179D eNOSdp 대해 290과 220 nM). 다시, S1179D eNOS 회전의 칼슘 활성화에 대한 Vmax는 야생형 보다 더 컸다(도 4d, 삽입그림).

S1179D eNOS의 불활성이 야생형 효소의 것보다 차이가 나는지를 검사하기 위해, 칼슘과 EGTA의 킬레이션(chelation) 후 eNOS 활성의 쇠퇴가 측정되었다. 이들 실험에서, 모든 NOS 보조 인자가 칼슘(200 μM)의 존재중에서 첨가되었고, NO 생산은 1분 동안 조사된 다음, 상이한 농도의 EGTA가 첨가되었으며 추가 1분 동안 조사되었다. 도 9a에 도시된 것처럼, 야생형 및 S1179D eNOS에 EGTA의 첨가는 농도 의존 방식으로 NO 생산을 감소시켰다. 하지만, S1179D eNOS로부터의 NO 생산은 EGTA의 첨가에 대해 덜 민감하였다. 즉, 야생형 eNOS 활성은 S1179D eNOS 활성보다 낮은 EGTA 농도에서 더 빨리 감소하였다. 효소 사이의 활성에 대한 큰 차이는 400 μM EGTA에서 보였다. 더욱이, 600 μM EGTA에서, 야생형 eNOS의 경우에 아무런 활성도 검출되지 않았으나, S1179D eNOS의 경우에 나머지 활성은 여전히 검출되었다. 유사한 결과가 시토크롬 c 환원을 이용하여 얻어졌고(도 9b), 현저한 활성 차이가 반응에 첨가된 400과 600 μM 킬레이터로 보여졌다. 하지만, EGTA의 가장 높은 농도에서, 나머지 환원효소 활성은 야생형과 S1179D eNOS 양쪽 모두에 대해서 발견되었다.

요약하면, 소의 내피 산화질소 신타아제(eNOS)는 직접 단백질 키나아제 Akt에 의해 세린 1179에서 인산화되고(Fulton et al., 1999), 인간 내피 산화질소 신타아제는 직접 단백질 키나아제 Akt에 의해 세린 1177에서 인산화된다(Dimmeler et al., 1999). 소 eNOS에서 잔기 1179의 음 전하를 띤 아스파르트산염으로의 돌연변 이는 산화질소(NO) 생산을 길항근 공격의 부재하에, 본질적으로 증가시킨다.

앞의 검토와 실시예는 단지 바람직한 실시양태를 상세히 설명하기 위해 존재하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 당업자에게는 다양한 변형예와 등가예가 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 분명하다. 위아래 모든 참조 문헌, 논문 및 특허들은 본 명세서에 완전히 참조용으로 편입되어 있다.

참조문헌

전체 인용문이 본문에 제공되지 않은 부가의 참조문헌은 본 명세서에 완전히 편입되어 있다.

Claims (43)

1. 활성 NOS 폴리펩티드, NO 생산 속도가 증가된 NOS 폴리펩티드, 및 환원효소 활성이 증가된 NOS 폴리펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 NOS 폴리펩티드는 NOS 폴리펩티드의 공통 서열 모티프 RXRXXS/T에서 S/T에 해당하는 아미노산 잔기의 치환을 더 함유하는 NOS 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산 분자.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 NOS 폴리펩티드는 소 eNOS의 잔기 1179, 인간 eNOS의 잔기 1177, 쥐 nNOS의 잔기 1412, 또는 인간 nNOS의 잔기 1415에 해당하는 치환된 아미노산 잔기를 포함하는 분리된 핵산 분자.
3. 제 2 항에 있어서, 소 eNOS의 잔기 1179, 인간 eNOS의 잔기 1177, 쥐 nNOS의 잔기 1412, 또는 인간 nNOS의 잔기 1415에 해당하는 치환된 아미노산 잔기는 아스파르트산, 글루탐산 또는 알라닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 분리된 핵산 분자.
4. 제 2 항에 있어서, 소 eNOS의 잔기 1179, 인간 eNOS의 잔기 1177, 쥐 nNOS의 잔기 1412, 또는 인간 nNOS의 잔기 1415에 해당하는 세린은 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기로 치환된 분리된 핵산 분자.
5. 제 2 항에 있어서, 상기 치환된 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산 또는 알라닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 분리된 핵산 분자.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 분리된 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩티드.
7. 활성 NOS 폴리펩티드, NO 생산 속도가 증가된 NOS 폴리펩티드, 및 환원효소 활성이 증가된 NOS 폴리펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 NOS 폴리펩티드는 NOS 폴리펩티드의 공통 서열 모티프 RXRXXS/T에서 S/T에 해당하는 아미노산 잔기의 치환을 더 함유하고 치환된 아미노산 잔기는 소 eNOS의 잔기 1179, 인간 eNOS의 잔기 1177, 쥐 nNOS의 잔기 1412, 또는 인간 nNOS의 잔기 1415인 분리된 NOS 폴리펩티드.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 NOS 폴리펩티드는 소 eNOS의 잔기 1179, 인간 eNOS의 잔기 1177, 쥐 nNOS의 잔기 1412, 또는 인간 nNOS의 잔기 1415에 해당하는 치환된 아미노산 잔기를 포함하는 NOS 폴리펩티드.
9. 제 8 항에 있어서, 치환된 아미노산이 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기로 치환된 활성 eNOS인 NOS 폴리펩티드.
10. 제 7 항의 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진을 유효성분으로 포함하는 관상 부행 혈관 발생(coronary collateral vessel development)을 촉진하기 위한 약제학적 조성물.
11. 제 10 항에 있어서,

    상기 트랜스진은 심실 근세포 특이적 프로모터(ventricular myocyte-specific promoter), 평활근 세포 특이적 프로모터, 또는 내피 세포 특이적 프로모터로부터 발현되는 약제학적 조성물.
12. 제 11 항에 있어서,

    상기 심실 근세포 특이적 프로모터는 심실 미오신 경쇄(ventricular myosin light chain)-2 또는 미오신 중쇄(myosin heavy chain) 프로모터의 서열을 갖는 약제학적 조성물.
13. 제 7 항의 펩티드를 코딩하는 트랜스진을 유효성분으로 포함하는, 말초-혈관 결여 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
14. 제 7 항의 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진을 유효성분으로 포함하는, 심근 허혈을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 트랜스진의 발현은 심장 근세포에 한정되는 약제학적 조성물.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 트랜스진의 발현은 심실 근세포에 한정되는 약제학적 조성물.
17. 제 10 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스진은 복제-결함이 있는 벡터에 의해 인코딩되는 약제학적 조성물.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 복제 결함이 있는 벡터는 아데노바이러스인 약제학적 조성물.
19. 제 10 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스진은 생체 외에서 세포로 형질감염되는 약제학적 조성물.
20. 제 19 항에 있어서, 상기 형질감염된 세포가 환자에게 운반되는 약제학적 조성물.
21. 제 7 항의 폴리펩티드를 발현시키는 인간을 제외한 트랜스게닉 동물.
22. (a) NOS를 발현시키는 세포를 약제에 노출시키는 단계; 및

    (b) NOS의 Akt 조절 활성을 측정하고, 그에 따라서 NOS의 Akt 조절 활성을 조정하는 약제를 동정하는 단계

    를 포함하는, NOS의 Akt 조절 활성을 조정하는 약제를 동정하는 방법.
23. 제 22 항에 있어서, 단계 (b)가 소 eNOS의 잔기 1179, 인간 eNOS의 잔기 1177, 쥐 nNOS의 잔기 1412, 또는 인간 nNOS의 잔기 1415에 해당하는 아미노산 잔기에서 NOS의 인산화 상태를 결정하는 것을 포함하는 방법.
24. 제 23 항에 있어서, NOS는 상기 약제에 의해 활성화되는 방법.
25. 제 24 항에 있어서, 상기 약제는 공통 Akt 인산화 부위에서 eNOS의 인산화를 자극하는 방법.
26. 제 25 항에 있어서, 상기 약제는 소 eNOS의 잔기 1179, 인간 eNOS의 잔기 1177, 쥐 nNOS의 잔기 1412, 또는 인간 nNOS의 잔기 1415에 해당하는 아미노산 잔기의 탈인산화를 저해하는 방법.
27. 제 22 항에 있어서, 단계 (b)는 NO 생산의 측정을 포함하는 방법.
28. 제 27 항에 있어서, NO는 아질산염 농도 또는 ³H-L-아르기닌에서 ³H-L-시트룰린(citrulline)으로의 전환을 측정함으로써 검출되는 방법.
29. (a) Akt 및 NOS 단백질 또는 펩티드를 약제에 노출시키는 단계; 및

    (b) NOS의 활성을 측정하는 단계

    를 포함하는, eNOS의 Akt 조절 활성을 조정하는 약제를 동정하는 생체 외 방 법.
30. 제 29 항에 있어서, NOS 활성은 NOS의 Akt 의존성 인산화 상태를 결정함으로써 측정되는 방법.
31. 제 30 항에 있어서, NOS 펩티드는 SEQ ID NO:2를 포함하는 방법.
32. 제 30 항에 있어서, 단계(b)에서 NOS의 활성은 환원효소 활성인 방법.
33. 제 30 항에 있어서, 단계(b)에서 NOS의 활성은 NOS에 의한 NO의 생산인 방법.
34. 잔기 1179에 해당하는 치환된 아미노산 잔기를 포함하는 소 eNOS, 잔기 1177에 해당하는 치환된 잔기를 포함하는 인간 eNOS, 잔기 1412에 해당하는 치환된 잔기를 포함하는 쥐 nNOS, 및 잔기 1415에 해당하는 치환된 잔기를 포함하는 인간 nNOS로 이루어지는 군으로부터 선택된 NOS 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산 분자로서, 치환된 아미노산 잔기가 아스파르트산, 글루탐산 또는 알라닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 R 기를 포함하는 분리된 핵산 분자.
35. 제 34 항에 있어서, 상기 치환된 아미노산 잔기는 알라닌인 분리된 핵산 분자.
36. 잔기 1179에 해당하는 치환된 아미노산 잔기를 포함하는 소 eNOS, 잔기 1177에 해당하는 치환된 잔기를 포함하는 인간 eNOS, 잔기 1412에 해당하는 치환된 잔기를 포함하는 쥐 nNOS, 및 잔기 1415에 해당하는 치환된 잔기를 포함하는 인간 nNOS로 이루어지는 군으로부터 선택되는 분리된 NOS 폴리펩티드로서, 치환된 아미노산 잔기가 아스파르트산, 글루탐산 또는 알라닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 R 기를 포함하는 분리된 NOS 폴리펩티드.
37. 제 36 항에 있어서, 상기 치환된 아미노산 잔기는 알라닌인 NOS 폴리펩티드.
38. 제 11 항에 있어서, 상기 내피 세포 특이적 프로모터는 Tie-2 프로모터, 엔도테린 프로모터, 또는 eNOS 프로모터인 약제학적 조성물.
39. 제 11 항에 있어서, 상기 평활근 세포 프로모터는 SM22 프로모터 또는 SM 알파 액틴 프로모터인 약제학적 조성물.
40. 제 7 항의 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진을 유효성분으로 포함하는 심장혈관 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
41. 제 40 항에 있어서, 상기 심장혈관 질환은 심부전, 심근경색, 재협착, 혈관형성술후 협착증, 스텐트 협착증 및 바이패스 이식 부전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
42. 제 7 항의 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진을 유효성분으로 포함하는 발기 장애(erectile dysfunction)를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
43. 제 10 항, 제 13 항, 제 14 항, 제 40 항 및 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스진은 혈관내, 근육내, 피부내, 복막내, 또는 동맥내로 운반되어 사용되어지는 약제학적 조성물.

Images