JP2002511764A

JP2002511764A - Ｐａｋキナーゼ遺伝子およびポリペプチドならびにそれらの使用方法

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Publication number: JP2002511764A
Application number: JP50900299A
Authority: JP
Inventors: フイールド，ジエフリー; タン，イー; チエン，ツンシユアン; チエルノフ，ジヨナサン; ギブズ，ジヤクスン・ビー
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド; ユニバーシテイ・オブ・ペンシルバニア; フオツクス・チエイス・キヤンサー・センター
Priority date: 1997-07-11
Filing date: 1998-07-10
Publication date: 2002-04-16
Also published as: AU8395998A; WO1999002701A1; CA2294752A1; EP1007693A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般には、Pakキナーゼ遺伝子の構築、およびそのような遺伝子にコードされるポリペプチドに関する。より詳しくは、本発明は、キナーゼドメインを含有し実質的に触媒的に不活性であるPakキナーゼポリペプチド(Pak1^R299、Pak1^L83,L86、Pak1^L83,L86,R299などのPakキナーゼ突然変異体を含むが、これらに限定されるものではない)をコードする単離された核酸分子に関する。本発明はまた、これらの単離された核酸分子にコードされるポリペプチド、およびこれらのポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。本発明はまた、動物細胞のトランスフォーメーション（特に、Ras癌遺伝子の活性に媒介されるもの）の抑制方法、および本発明の突然変異Pakキナーゼ遺伝子を使用する、動物（特にヒト）における身体的障害（癌および神経学的障害、例えば神経繊維腫症を含む）の治療または子防方法に関する。本発明はまた、Pakキナーゼの活性をモジュレーションする化合物の同定方法、および新規Pakキナーゼ標的の同定方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】PAK キナーゼ遺伝子およびポリペプチドならびにそれらの使用方法発明の背景発明の分野本発明は、分子生物学、癌生物学および医学治療学の分野におけるものである。本発明は、一般には、Pakキナーゼ遺伝子の構築、およびそのような遺伝子にコードされるポリペプチドに関する。より詳しくは、本発明は、単離されたPak キナーゼ核酸分子およびポリペプチド（特に、該Pakキナーゼがキナーゼドメインを含み、該Pakキナーゼが実質的に触媒的に不活性であるもの）に関する。本発明はまた、動物細胞のトランスフォーメーション（特に、Ras癌遺伝子の活性に媒介されるもの）の抑制方法、および本発明のPakキナーゼ遺伝子を使用する、動物における身体的障害（神経繊維腫症および癌を含む）の治療または予防方法に関する。本発明はまた、Pakキナーゼの活性をモジュレーションする化合物の同定方法、およびこれらの方法により同定された化合物、およびPakキナーゼが作用する標的の同定方法に関する。関連技術低分子量Gタンパク質Ras中の突然変異は腫瘍の約20％に見出され、そのため、それは、ヒトの癌に最も頻繁に付随する癌遺伝子の１つとなっている。Rasは、細胞の増殖および分化の調節において中心的な役割を果たす。これは、少なくとも２つの異なる経路を介して達成される。第１は、転写を調節するよう形質膜から核にシグナルを伝達するマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)カスケードの刺激である(Barbacid，M.，Ann．Rev．Biochem．56:779-827(1987);Ginty ，D.D.ら，Cell 77:713-725(1994);Lowy，D.R.およびWillumsen，B.R.，Ann．Re v．Biochem．62:851-891(1993);Marshall，C.J.，Cell 80:179-185(1995))。第２の経路は、アクチン細胞骨格の調節を含み、膜ラッフリングを引き起こす（Ba r-Sagi，D.およびFeramisco，J.R.，Science 233:1061-1068(1986);Hall，A.，A nnu．Rev．Cell．Biol．10:31-54(1994)）。 MAPキナーゼカスケードの成分は、十分に特徴づけられている。増殖因子受容体は、Rasグアニンヌクレオチド交換因子SOSを膜にリクルートし、ついでそれはヌクレオチド交換を介して Rasを活性化する。Rasは、活性化されるとRaf-1タンパク質キナーゼに結合しそれを活性化し、今度はこれがMEKキナーゼMEK1およびMEK2をリン酸化し活性化する。該MEKキナーゼは、MAPキナーゼERK1およびERK2をリン酸化し活性化し、ついでこれは転写因子をリン酸化し活性化して前初期遺伝子の発現を引き起こす（Eg an，S.E.およびWeinberg，R.A.，Nature 365:781-783(1993);Hill，C.S.およびT riesman，R.，Cell 80:199-211(1995);Marshall，C.J.，Cell 80:179-185(1995) ）。腫瘍原性Rasは、野生型Rasと、その固有のGTPアーゼ活性を減少させる点突然変異において異なっている。これは、該突然変異Rasを主としてGTP結合型にし、したがってヌクレオチド交換の増殖因子刺激かなくてもそれを活性化する（Bo guski，M.S.およびMcCormick，F.，Nature 366:643-654(1993)）。アクチン細胞骨格のRas調節は、Rafとの相互作用を必要としない。なぜなら、 Rafと相互作用しない突然変異Rasタンパク質であっても、細胞骨格変化を誘導するからである(Joneson，T.ら，Science 271:810-812(1996))。該細胞骨格経路は完全に明らかにされているわけではないが、それは、RhoファミリーであるCdc42 、Rac(Rac1およびRac2)およびRho(RhoA、RhoB およびRhoC)からのRas関連低分子量Gタンパク質の協同作用を必要とする。Cdc42 、RacおよびRhoはそれぞれ、Swiss 3T3繊維芽細胞中にマイクロインジェクションされると特異的アクチン構造を誘導する。すなわち、Cdc42は微小突起および糸状仮足を誘導し、Racは膜ラッフリングを引き起こし、Rhoはストレスファイバーおよびフォーカルアドヒージョンを誘導する。Rasタンパク質のマイクロインジェクションは膜ラッフリングを誘導し、該ラッフリングは、Racにおけるドミナントネガティブ突然変異により阻止される。このことは、アクチン細胞骨格の Ras調節がRasにより媒介されることを示している。さらに、該アクチン細胞骨格事象は、Cdc42活性化Rac、ついでRac活性化Rhoのカスケード中に順序づけられうる（Nobes，C.D．およびHall，A.，Cell 81:3-62(1995)）。また、Rhoファミリーのメンバーは、ERKキナーゼカスケードに類似したもう１つのMAPキナーゼカスケードを介して転写を調節する（Coso，O.A.ら，Cell 81:1 137-1146(1995):Minden，A.ら，Cell 81:1147-1157(1995);Minden，A.ら，Scien ce 266:1719-1723(1994)）。RacおよびCdc42は、Pakと称されるタンパク質キナーゼに結合しそれを活性化し、ついでそれは、 MEKK、SEKおよびJunキナーゼ（JNK）または関連p38キナーゼよりなると考えられるカスケード（これは完全には明らかにされていない）を活性化する（Bagrodia ，S.ら，J．Biol．Chem．270:27995-27998(1995);Frost，J.A.ら，Mol．Cell．B iol．16:3707-3713(1996);Manser,E.ら，Nature 367:40-46(1994);Polverino,A. ら,J.Biol．Chem．270:26067-26070(1995);Yan，M.ら，Nature 372:789-800(199 4)）。Junキナーゼは、c-junなどの転写因子をリン酸化する。また、多数の細胞系において、RasはJNKを活性化する（Hibi，M.ら，Genes Dev 7:2135-2148(1993 )）。JNKのRas活性化はRacおよびCdc42のドミナントネガティブ突然変異により抑制され、このことは、RacおよびCdc42がJNKのRas活性化を媒介することを示唆している（Minden，A.ら，Cell 81:1147-1157(1995)）。 RacおよびRhoはRasトランスフォーメーションに必須であることが、いくつかの観点からの研究において示唆されている。Racのドミナントネガティブ突然変異はRasトランスフォーメーションを抑制し、GTPアーゼ欠損RacおよびRhoは共に、繊維芽細胞を弱くトランスフォームしうる。さらに、活性化されたRacおよびR hoは共に、部分的に活性化されたRaf突然変異体によるトランスフォーメーションを劇的に促進しうる（Prendergast，G.C.ら，Oncogene 10:2289-2296(1995):Qui，R.G.ら，Nature 374:457-459(1995)）。O st、Ect2、Db1およびTiam-1を含むいくつかの癌遺伝子は、Rhoファミリーメンバーに特異的なグアニンヌクレオチド交換因子である(Quilliam，L.A.ら，BioEssa ys 17:395-404(1995))。Rhoファミリーメンバーは、腫瘍中に活性化形態で頻繁に見出されるわけではないが、それらは、細胞をトランスフォームすることが可能であり、多くの場合、Ras/Rafシグナリング経路と協同して細胞をトランスフォームしうることが、これらの観察から示される。タンパク質キナーゼのPakファミリーのメンバーは、GTP結合型RacおよびCdc42 により調節され、アクチンおよびJNKの両方のシグナリングを媒介するエフェクターの候補である(Lim，L.ら，Eur．J．Biochem．242:171-185(1996);Manser，E .ら，Nature 367:40-46(1994);Sells，M.A.およびChernoff，J.，Cell．Biol．7 :162-167(1997))。３つのPakキナーゼ（Pak1、Pak2およびPak3）が、哺乳類において見出されている。それらはすべて、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharo myces cerevisiae）のSTE20遺伝子と関連しており、それはCdc42ホモログにより調節される（Bagrodia，S.ら，J．Biol．Chem．270:22731-22737(1 995);Leberer,E.ら，EMBO J．11:4815-4824(1992);Marcus，S．ら，Proc．Nat． Acad．Sci．（USA）92:6180-6184(1995);Ottilie，S.ら，EMBO J．14:5908-5919 (1995);Ramer，S.W.およびDavis，R.W.，Proc．Nat．Acad．Sci．（USA）90:452 -456(1993)）。GTP結合型RacおよびCdc42は共に、p21結合ドメイン（PBD）と称されるPakのN末端付近の保存領域に対する直接結合を介してキナーゼ活性を刺激する。PBDドメインと相同な領域が、Rac/Cdc42にインビトロで結合する他のタンパク質(例えば、Ste20)中に見出される(Burbelo，P.D.ら，J．Biol．Chem．270: 29071-29074(1995))。発明の概要本発明は、一般には、Pakキナーゼ遺伝子、およびそのような遺伝子にコードされるポリペプチドに関する。より詳しくは、本発明は、突然変異Pakキナーゼ（これは、突然変異Pak1キナーゼ、突然変異Pak2キナーゼまたは突然変異Pak3キナーゼであることが可能である）をコードするポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子、特に、Pakキナーゼがキナーゼドメインを含み該Pakキナーゼが実質的に触媒的に不活性であるものに関する。好ましいそのような核酸分子は、キナーゼドメイン中に１以上の突然変異（これらは、１以上のヌクレオチドの欠失、置換または挿入であることが可能である）を含むPakキナーゼをコードする。特に好ましい核酸分子は、該突然変異Pakキナーゼのアミノ酸残基約260〜アミノ酸残基約520、アミノ酸残基約270〜アミノ酸残基約516、アミノ酸残基約290〜アミノ酸残基約400、アミノ酸残基約295〜アミノ酸残基約350、アミノ酸残基約297〜アミノ酸残基約300、アミノ酸残基約299〜アミノ酸残基約300のアミノ酸残基の伸長内の１以上のアミノ酸残基をコードする１以上のコドンに叉はアミノ酸残基299をコードするコドンに該突然変異が存在する核酸分子である。そのような１つの実施形態においては、該突然変異は、該突然変異Pakキナーゼ中のアミノ酸残基299におけるリシン残基からアルギニン残基への置換である。特に好ましい具体例には、Pak1^R299および Pak1^L83,L86,R299と称される突然変異Pakキナーゼが含まれる。本発明はまた、前記の単離された核酸分子のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでなる核酸分子を提供する。本発明はまた、前記核酸分子を含んでなるベクター（特に発現ベクター）および宿主細胞に関する。本発明はまた、単離されたPakキナーゼポリペプチドの製造法であって、該ポリペプチドの発現を可能にするのに十分な条件下で前記宿主細胞を培養し、該Pa kキナーゼポリペプチドを単離することを含んでなる製造法に関する。本発明はまた、これらの製造法により製造されたPakキナーゼポリペプチド、およびキナーゼドメインを含み実質的に触媒的に不活性な単離されたPakキナーゼポリペプチドに関する。好ましいそのような核酸分子は、キナーゼドメイン内に１以上の突然変異（これらは、１以上のヌクレオチドの欠失、置換または挿入であることが可能である）を含むPakキナーゼをコードする。特に好ましいPakキナーゼポリペプチドは、該突然変異Pakキナーゼのアミノ酸残基約260〜アミノ酸残基約520 、アミノ酸残基約270〜アミノ酸残基約516、アミノ酸残基約290〜アミノ酸残基約400、アミノ酸残基約295〜アミノ酸残基約350)アミノ酸残基約297〜アミノ酸残基約300、アミノ酸残基約299〜アミノ酸残基約300のアミノ酸残基の伸長内の１以上のアミノ酸残基に又はアミノ酸残基299に該突然変異が存在するPakキナーゼポリペプチドである。そのような１つの実施形態においては、該突然変異は、該突然変異Pakキナーゼポリペプチド中のアミノ酸残基299におけるリシン残基からアルギニン残基への置換である。特に好ましい具体例には、Pak1^R299およびPak1^L83,L86,R299と称される突然変異Pakキナーゼポリペプチドが含まれる。本発明はまた、Pakキナーゼポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体の製造法であって、１以上の前記の単離されたPakキナーゼポリペプチドで動物を免疫し、Pakキナーゼポリペプチドに特異的に結合する抗体を該免疫化動物から単離することを含んでなる製造法に関する。本発明はまた、これらの製造法により製造された単離された抗体（これは、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であることが可能であり、検出可能な様態で標識され及び／又は固体支持体上に固定化されていることが可能である）に関する。本発明はまた、Ras癌遺伝子を含む細胞中の該Ras癌遺伝子の活性の抑制方法、および細胞のトランスフォーメーションの抑制方法であって、１以上の前記の単離された核酸分子の有効量を該細胞中に導入することを含んでなる方法に関する。本発明では、これらの方法において使用する単離された核酸分子は、ベクターまたはビリオン（これは、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来することが可能である）中に含有されていることが可能である。これらの方法で使用するのに好ましい細胞には、動物細胞、例えば哺乳動物細胞、特にヒト細胞が含まれる。他の好ましい細胞には、Rasでトランスフォームした癌細胞などの癌細胞が含まれる。本発明はまた、１以上の前記の単離された核酸分子とその医薬上許容される担体または賦形剤とを含んでなる医薬組成物を提供する。本発明はさらに、Pakキナーゼの活性をモジュレーションする化合物の同定方法、およびこれらの方法により同定された化合物に関する。本発明はさらに、１以上のそのような化合物とその医薬上許容される担体または賦形剤とを含んでなる医薬組成物に関する。本発明はまた、Pakキナーゼが作用する標的の同定方法を提供する。本発明はまた、動物における癌、神経学的障害などの身体的障害を治療または予防するための療法であって、１以上の前記の単離された核酸分子の有効量を該動物中に導入すること又は１以上の前記の医薬組成物の有効量を該動物に投与することを含んでなる方法に関する。本療法により治療されうる動物には、哺乳動物、特にヒトが含まれる。これらの方法により治療または予防されうる癌には、癌腫、肉腫、（特に神経繊維肉腫）、黒色腫および白血病、特にRas関連癌が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの方法により治療または予防されうる神経学的障害には神経繊維腫症が含まれるが、これに限定されるものではない。本発明の以下の図面および説明ならびに請求の範囲を考慮すれば、本発明の他の好ましい実施形態が当業者に明らかとなろう。図面の説明図 1A〜1C 本研究で使用するPak突然変異体の特徴づけ。Mycタグ付きPak1および示されている突然変異体をCOS細胞中にトランスフェクトし、ついでキナーゼ活性およびR ac/Cdc42結合に関してアッセイした。（A）上：種々のPak突然変異体のキナーゼ活性。抗myc抗体9E10で免疫沈降させ、示されている場合にはGST- Cdc42またはGST Rac1と共に沈殿物をインキュベートすることにより、活性を測定した（ミエリン塩基性タンパク質を基質として使用した）。下：本研究で用いるp21結合ドメイン（PBD）、キナーゼドメインおよび突然変異を示すPak1の地図。(B)Cdc42およびRac結合。示されているトランスフェクト化細胞からの〜50μg の抽出物を、グルタチオンビーズおよびGTPまたはGDP-Sに結合した〜50μgの精製GST Cdc42またはGST Racと混合することにより、Pak1およびPak1^R299に対するCdc42およびRac結合を測定した。（C）PBDドメイン突然変異体に対するCDC42/ Rac結合。３つの独立した実験において、同様の結果を得た。A、BおよびC項においては、同じ抽出物を使用した。図 2A〜2D （A）フォーカスアッセイにおけるK-rasトランスフォーメーションに対するPa k1およびPak1^R299の効果。Rat-1繊維芽細胞を10μgの示されているプラスミドでトランスフェクトし、クリスタルバイオレットで染色してフォーカスを可視化した(「材料および方法」に記載のとおりに行なった)。（B）トランスフォーメーションに対するPak1およびPak^R299の効果。10個（A）および３個（B）を超える独立した実験において、同様の結果を得た。（C）NIH 3T3細胞のRas EJトランスフォーメーションに対するPak^R299の効果。示されている場合には5ngのRasおよび2.5μgのPak^R299で細胞をトランスフェクトした。全DNA濃度を担体DNAで13μgとした。（D）Pak、RafおよびRas発現のウエスタンブロット。Rat-1細胞をK-rasまたはv-rafおよび種々のPak-1発現プラスミドでコトランスフェクトした。抽出物を調製し、それぞれの50μgを12 ％ゲル上で移動させ、抗K-ras（Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz ，CAからの抗体F234）、抗Pak（抗mycエピトープ抗体9E10）または抗Raf-1（San ta Cruz Biotechnology，Inc.からの抗体C12）でプローブするウエスタンブロット上で試験した。強化（enhanced）化学発光により検出を行なった。２つの独立した実験において、同様の結果を得た。図 3A〜3G 軟寒天アッセイにおけるK-rasトランスフォーメーションに対するPak1およびP ak1^R299の効果。細胞を図１に記載のとおりにトランスフェクトし、ついで軟寒天上にプレーティングした。（A〜F）コロニーの代表的顕微鏡像。（G）該軟寒天アッセイの定量。５つを超える独立した実験において、同様の結果が認められた。図 4A〜4C Rat-1細胞におけるPak1の安定発現。Rat-1細胞をpCDNAおよび種々のPak1発現プラスミドでコトランスフェクトした。G418耐性コロニーを単離し、細胞系に増殖させ、以下に記載のとおりに試験した。（A）Pak1構築物上のMycタグを認識する抗体9E10でプローブしたRat-1細胞由来の10μlの抽出物のウエスタンブロット。Pak1は、〜65kDaのバンドとして認められる。（B）安定な細胞系およびH-ras トランスフォーム化細胞系の増殖速度。（C）1％血清中での細胞の増殖。２つを超える独立した実験において、同様の結果を得た。図 5 Pak1およびPakl突然変異体を発現するRat-1細胞の顕微鏡写真。図 6A〜6C 安定細胞系のRasトランスフォーメーション。示されている量のK-rasを安定細胞系中にトランスフェクトし、（A）フォーカスアッセイおよび（B）軟寒天コロニーアッセイにおいて、トランスフォーメーションを得点化した。（C）Pak1突然変異体を発現するRat-1細胞のRafトランスフォーメーション。コロニーを、それらが〜 50μM以上（Rasトランスフォーメーションの場合）または〜20μM以上（Rafトランスフォーメーションの場合）の場合に計数した。該安定細胞系と親Rat-1細胞との間に、トランスフェクション効率における相違は何ら検出されなかった。３個を超える独立した実験において、同様の結果を得た。図 7A〜7D JNK1およびp38活性化に対するPak突然変異体の効果。Rat-1細胞を、HA-JNK（A 、BおよびC）またはHA-p38（D）のいずれかと、示されているタンパク質をコードするプラスミドとでコトランスフェクトした。倍率は、ホスホイメージャー(p hosphoimager)分析で測定した場合のPcmv6のレーンで生じたものに対する基質リン酸化の増加倍率を意味する。各パネルの下には、示されているとおりのHA-JNK またはHA-p38の発現を示すウエスタンブロツトのパネルを記載する。図 8 ERK1活性化に対するPak突然変異体の効果。Rat-1細胞を、HA-ERKと該試験DNA とでコトランスフェクトした。倍率は、ホスホイメージャー分析で測定した場合のpCMV6のレーンで生じたものに対する基質リン酸化の増加倍率を意味する。各パネルの下には、HA-ERKの発現を示すウエスタンブロットを記載する。図 9 PakキナーゼでトランスフェクトしたST88-14神経繊維肉腫細胞による軟寒天コロニー形成の写真。Pak1キナーゼ突然変異体Pak1^R299、Pak1^L83,L86およびPak1^L ^83,L86,R299 はST88-14細胞のトランスフォーメーションを逆転させることが認められる。図 10 シュワン細胞を、示されているプラスミドでトランスフェクトし、軟寒天上にプレーティングし、ついでチアゾリルブルー［3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド；Sigma］で染色してコロニーを可視化した。該データは、プレート当たりのコロニー数として記載されている。誤差に関する棒線は、標準偏差を示す。示されているデータは、４つの独立した実験を代表するものである。図 11Aおよび11B JNKおよびERKの活性化に対するPakの効果。シュワン細胞をJNKまたはERKのいずれかと、示されているタンパク質をコードするプラスミドとでコトランスフェクトした。倍率は、ホスホイメージャー分析で測定した場合のpcmv6のレーンで生じたものに対する基質リン酸化の増加倍率を意味する。各パネルの下には、示されているとおりのHA-JNKまたはHA-ERK の発現を示すウエスタンブロットを記載する。MBP（ミエリン塩基性タンパク質）。示されているデータは、３つの独立した実験の代表的なゲルである。発明の詳細な説明核酸分子特に示さない限り、本発明のDNA分子を配列決定することにより決定したすべてのヌクレオチド配列は、当業者には通常の方法（Sanger，F.,およびCoulson， A.R.，J．Mol．Biol．94:444-448(1975);Sanger，F.ら，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 74:5463-5467(1977)）に従うジデオキシシークエンシングなどの手動DNA 配列決定、または例えばApplied Biosystems Automated Sequenatorを該製造業者の指示に従い使用することによる自動シークエンシングを用いて決定した。本発明で決定したDNA分子にコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、前記のとおりに決定したDNA配列の概念的翻訳により推定した。したがって、これらのアプローチにより決定された任意のDNA配列に関して当技術分野においては公知のとおり、本発明で決定した任意のヌクレオチド配列は、いくつかの誤りを含んでいる可能性がある。そのような方法により決定したヌクレオチド配列は、典型的には、配列決定されたDNA分子の実際のヌクレオチド配列と少なくとも約90％同一、より典型的には、少なくとも約95％〜少なくとも約99.9％同一である。また、当技術分野においては公知のとおり、実際の配列と比較した場合の、決定したヌクレオチド配列中の単一の挿入または欠失は、該ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、そのため、そのような挿入または欠失の部位から開始する決定ヌクレオチド配列にコードされる推定アミノ酸配列は、配列決定したDNA分子に実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なることになる。特に示さない限り、本発明で記載する各「ヌクレオチド配列」は、デオキシリボヌクレオチド（A、G、CおよびTと略称される）の配列として与えられている。しかしながら、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」は、DN A分子またはポリヌクレオチドに関してはデオキシリボヌクレオチドの配列であると意図され、また、RNA分子またはポリヌクレオチドに関しては、特定されているデオキシリボヌクレオチド配列中の各チミジンデオキシリボヌクレオチド（T）がリボヌクレオチドウリジン（U）で置換されたリボヌクレオチド（ A、G、CおよびU）の対応配列であると意図される。例えば、デオキシリボヌクレオチドの略語を用いて記載するヌクレオチド配列を有する突然変異PakキナーゼR NA分子は、該ヌクレオチド配列の各デオキシリボヌクレオチドA、GまたはCが対応リボヌクレオチドA、GまたはCで置換され各デオキシリボヌクレオチドTがリボヌクレオチドUで置換されている配列を有するRNA分子を示すと意図される。野生型Pakキナーゼのヌクレオチド配列は当技術分野で公知である（例えば、O sada，Sら，Mol．Cell．Biol．12:3930-3938(1992);Bagrodia，S.ら，J．Biol． Chem．270:22731-22737(1995);Burbelo，P.D.ら，J．Biol．Chem．270:29071-29 074(1995);Manser，E.ら，Nature 367:40-46(1994);Sells，M.A.ら，Curr．Biol ．7:202-210(1997);Martin，G.S.ら，EMBO J．14:1970-1978(1995);Brown，J.L. ，Curr．Biol．6:598-605(1996)を参照されたい。これらの開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）。これらの配列および本明細書に記載の情報を用いて、Pakキナーゼポリペプチド（これは、突然変異Pakキナーゼ、突然変異Pak キナーゼの断片または野生型Pakキナーゼの断片であることが可能である）をコードする本発明の核酸分子を、標準的なクローニングおよびスクリーニング法（例えば、mRNAを出発物質として使用してcDNAをクローニングする方法）を用いて得ることができる。本発明で用いる「突然変異Pakキナーゼポリペプチド」は、対応する野生型の触媒的に活性なPakキナーゼのヌクレオチド配列からのヌクレオチド配列中に１以上の突然変異を含むポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドまたはその断片を意味する。例えば、本発明でPak1^R299と称される突然変異Pakキナーゼは、野生型Pak1キナーゼの299位のリシン残基がアルギニン残基により置換された突然変異Pak1キナーゼである。したがって、Pak1^R299をコードする対応核酸分子は、該ポリペプチド中の299位においてリシンではなくアルギニンをコードするコドンを含む。同様に、本発明においてPak1^L83,L86と称される突然変異Pakキナーゼは、野生型Pak1キナーゼ中の83および86位のヒスチジン残基が共にロイシン残基で置換された突然変異Pak1キナーゼである。したがって、Pak1^L83,L86をコードする対応核酸分子は、該ポリペプチド中の83および86位においてヒスチジンの代わりにロイシンをコードするコドンを含む。したがって、本発明のPakキナーゼ核酸分子およびポリペプチドは、Pak1キナーゼ、Pak2キナーゼおよびPak3キナーゼを含む（これらに限定されるものではない）Pakキナーゼフアミリーのいずれかのメンバーの類似体または突然変異体であることが可能である。本発明で用いる好ましいクローニングおよびスクリーニング方法には、後記実施例に記載のプライマーなどのプライマーを使用する逆転写PCR（RT-PCR）などのPCRに基づくクローニング方法が含まれる。本発明の核酸分子は、mRNAなどのRNAの形態、またはクローニングにより得た又は合成的に製造した例えばcDNAおよびゲノムDNAを含むDNAの形態であることが可能である。該DNAは、二本鎖または一本鎖であることが可能である。一本鎖DNA またはRNAは、センス鎖としても公知のコード鎖であることが可能であり、あるいはそれは、アンチセンス鎖とも称される非コード鎖であることが可能である。「単離（された）」核酸分子は、その天然環境から取り出された核酸分子、DNAまたはRNAを意味する。例えば、ベクター中に含有されている組換えDNA分子は、本発明の目的においては、単離されているとみなされる。単離されたDNA分子の別の例には、異種宿主細胞中に維持された組換えDNA分子、および溶液から精製（部分的または実質的に）されたDNA分子（この場合、それが組換えDNA技術により産生されたか合成化学技術により産生されたかには無関係である）が含まれる。単離されたRNA分子には、本発明のDNA分子のインビボまたはインビトロRNA転写産物が含まれる。本発明の核酸分子には更に、後記のプロモーター、エンハンサーなどの調節DN A配列（これは異種調節配列であることが可能である）に作動的に結合した１以上のPakキナーゼDNA配列を含む遺伝的構築物が含まれる。この場合、これらのDN A配列が宿主細胞［好ましくは、細菌、真菌（酵母を含む）、植物または動物（昆虫または哺乳動物を含む）細胞］中で発現されると、１以上のPakキナーゼポリペプチドが産生される。そのような構築物においては、該調節配列は、本明細書に記載のPakキナーゼポリペプチドまたはその変異体、前駆体、断片もしくは誘導体のいずれかをコードするポリヌクレオチドに作動的に結合していることが可能である。本発明で用いる、核酸分子またはポリペプチドの「一部（部分）」または「断片」なる語は、後記において特に示さない限り、指示されているポリヌクレオチドまたはポリペプチドの、少なくとも15個（より好ましくは少なくとも20個）の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドのセグメントを意味する。本発明の単離された核酸分子には、キナーゼドメインを含み実質的に触媒的に不活性であるPakキナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子が含まれる。本発明で用いる「キナーゼドメイン」なる語は、Pakキナーゼ標的（例えば、ミエリン塩基性タンパク質）のリン酸化の触媒に関与するPak キナーゼ酵素部分を意味する。例えば、野生型Pak1においては、該キナーゼドメインは、該ポリペプチドのアミノ酸残基約270〜516に位置する（図1Aを参照されたい）。本発明で用いる「実質的に触媒的に不活性」なる語は、該Pakキナーゼまたは突然変異Pakキナーゼが、野生型Pakキナーゼポリペプチド（例えば、Pak1 キナーゼ、Pak2キナーゼまたはPak3キナーゼの野生型）により触媒されるリン酸化のレベルの約50%、 40%、30%、20%、10%、5%、１%、0.1%または0.01%以下のレベルで、Pakキナーゼ標的（例えば、ミエリン塩基性タンパク質）をリン酸化することを意味する。実際には、Pakキナーゼまたは突然変異Pakキナーゼが、野生型Pakキナーゼポリペプチドにより触媒されるリン酸化のレベルの50%、40%、30%、20%、10%、5%、1% 、0.1%または0.01%以下のレベルでPakキナーゼ標的をリン酸化するか否かは、当業者によく知られている多数のリン酸化アッセイ（例えば、後記実施例で詳しく説明するもの）により判定することができる。本発明の好ましい核酸分子は、実質的に触媒的に不活性なPakキナーゼをコードする。そのような核酸分子は、例えば、キナーゼドメイン中に１以上の突然変異（これらは、１以上のヌクレオチドの欠失、置換または挿入、特に、１以上のヌクレオチドの置換または挿入であることが可能である）を含む突然変異Pakキナーゼをコードすることが可能である。特に好ましい核酸分子は、アミノ酸残基約270〜約516に伸長するキナーゼドメイン（図1Aを参照されたい）内の１以上のアミノ酸残基をコードする１以上のコドンに該突然変異が存在する核酸分子であり、例えば、該突然変異Pakキナーゼのアミノ酸残基約260〜アミノ酸残基約520、アミノ酸残基約270〜アミノ酸残基約516、アミノ酸残基約2 90〜アミノ酸残基約400、アミノ酸残基約295〜アミノ酸残基約350、アミノ酸残基約297〜アミノ酸残基約300、アミノ酸残基約299〜アミノ酸残基約300のアミノ酸残基の伸長をコードする１以上のコドンに又はアミノ酸残基299をコードするコドンに該突然変異が存在する核酸分子を含む。より好ましくは、第１突然変異が野生型Pakキナーゼポリペプチドの299位のリシン残基（L299）の置換突然変異である単離された核酸分子である。好ましいそのような置換には、アルギニン、ヒスチジンなどの塩基性アミノ酸によるL299の置換が含まれる。特に好ましいそのような実施形態においては、該突然変異は、Pakキナーゼ中のL299からアルギニン残基への置換であり、その一例は、Pak1^R299と称される突然変異Pak1キナーゼである。もちろん、他の突然変異を該キナーゼドメインまたは他のドメイン（例えば、該ポリペプチドのアミノ酸残基約75〜132に位置するRac-およびCdc42- 結合ドメイン（PBD）；図1Aを参照されたい）内に作製することが可能である。ただし、それらが、前記のとおりに実質的に触媒的に不活性な突然変異Pakキナーゼを与える場合に限られる。例えば、本発明はまた、キナーゼドメインを含み実質的に触媒的に不活性なPak1^L83,L86,R299と称されるPak1 キナーゼ突然変異体を与えるように野生型Pak1キナーゼのPBD中のアミノ酸83および86位のヒスチジン残基がロイシン残基で置換され該L299が前記のとおりにアルギニンで置換された突然変異Pak1キナーゼを提供する。本発明の突然変異Pak キナーゼ核酸分子およびポリペプチドを製造するために該Pakキナーゼのキナーゼおよび／または他のドメイン中のそのような突然変異を作製するための方法には、部位特異的突然変異誘発（Sambrook，J.ら，Molecular Cloning:a Laborato ry Manual，第２版，Cold Spring Harbor，New York:Cold Spring Harbor Labor atory Press(1989)）および部位排除（site-elimination）突然変異誘発（後記実施例およびDeng，W.P.およびNickoloff，J.A.，Anal．Biochem．200:81-88（1 992）に詳細に記載されているもの）ならびに当業者によく知られている他の方法が含まれる。本発明はまた、単離された核酸分子であって、前記配列と実質的に異なる配列を含むが、遺伝暗号の縮重のために、キナーゼドメインを含む実質的に触媒的に不活性なPakキナーゼポリペプチドを依然としてコードしている核酸分子を含む。遺伝暗号は当技術分野においてよく知られているため、過度な実験を行なうことなく前記の縮重変異体を製造することは当業者には常套的なものである。 Pakキナーゼポリペプチドをコードする本発明の核酸分子には、成熟ポリペプチドのみのアミノ酸配列をコードするもの；該成熟ポリペプチドのコード配列および追加的コード配列、例えばリーダーまたは分泌配列、例えばプレまたはプロまたはプレプロタンパク質配列をコードするもの；例えばイントロンおよび非コード5'および3'配列、例えば転写される非翻訳領域（UTR）、または転写（例えば、リボソーム-または転写因子-結合部位の付与を介したもの）、mRNAプロセシング(例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル)およびmRNAの安定性において何らかの役割を果たしうる他の5'フランキング配列を含む追加的な非コード配列を伴い前記の追加的コード配列を伴う又は伴わない該成熟ポリペプチドのコード配列；調節DNA配列（特に、異種調節DNA配列、例えば、プロモーターまたはエンハンサー）に作動的に結合した成熟Pakキナーゼポリペプチドのコード配列；および追加的な機能を付与するアミノ酸をコードする１以上のコード配列に結合した成熟Pakキナーゼポリペプチドのコード配列を含めることができるが、これらに限定されるものではない。したがって、該ポリペプチドをコードする配列をマーカー配列と融合させること、例えば該融合ポリペプチドの精製を促進するペプチドをコードするマーカー配列と融合させることが可能である。本発明のこの態様の或る実施形態においては、該マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、pQEベクター（Qiagen，Inc .）中に与えられるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであることが可能であり、それらの多くは商業的に入手可能である。例えばGentzら，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 86:821-824(1989)に記載されているとおり、ヘキサヒスチジンは、該融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。「HA」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する、精製に有用なもう１つのペプチドであり、これはWilsonら，Cell 37:767(1984)に記載されている。Pakキナーゼの精製の促進のための更にもう１つの有用なマーカーペプチドは、pGEX融合ベクターにコードされるグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)である(例えば、Winnacker，From Genes to Clones，New York:VCH Publishers，pp．451-4 81(1987)を参照されたい)。後記のとおり、他のそのような融合タンパク質には、NまたはC末端において免疫グロブリンFcと融合したPakキナーゼが含まれる。本発明はさらに、本発明のPakキナーゼポリペプチドの一部、類似体または誘導体をコードする、本発明の核酸分子の変異体に関する。天然（自然）対立遺伝子変異体などの変異体は天然に生じうる。「対立遺伝子変異体」は、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替的形態の１つを意味する（Lewin，B.編，Genes II，John Wiley & Sons，New York(1985)）。非天然に生じる変異体は、当技術分野で公知の突然変異誘発技術を用いて産生させることができる。そのような変異体には、ヌクレオチドの置換、欠失または付加により生じるものが含まれる。該置換、欠失または付加には１以上のヌクレオチドが関与しうる。該変異体は、コード領域、非コード領域またはそれらの両方において改変されていてもよい。該コード領域における改変は、同類または非同類アミノ酸置換、欠失または付加を与えうる。これらのうちで特に好ましいのは、Pakキナーゼタンパク質またはその一部の構造、特性および活性を改変しないサイレント置換、付加および欠失である。これに関しては、同類置換も特に好ましい。実際問題として、いずれかの特定の核酸分子が例えば本発明の単離された核酸分子の１以上のヌクレオチド配列と同一であるか否かは、FASTA(Heidelberg，Ge rmany)、BLAST(Washington，DC)またはBESTFIT（Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Researc h Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711）（これは、２つの配列間の相同性が最良のセグメントを見出すために局所ホモロジーアルゴリズム（SmithおよびWaterman，Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)）を用いるものである］などの公知のコンピュータープログラムを使用して簡便に判定することができる。ある特定の配列が例えば本発明の単離された核酸分子と同一であるか否かを判定するためにFASTA、BLAST、BESTFITまたは他のいずれかの配列アライメントプログラムを使用する場合には、参照ヌクレオチド配列の全長にわたり同一性の割合（％）が算出されるようにパラメーターを設定する。もう１つの態様において、本発明は、前記の本発明の単離された核酸分子中のポリヌクレオチドの実質的に全部または前記突然変異ヌクレオチドの領域を含むその断片にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、50％ホルミアミド、5×SSC（1×SSC=150mM NaCl，15mMクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト液、10％デキストラン硫酸および20g/ml変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中、42℃で一晩のインキュベーション、およびそれに続く、0.1×SSC中、約65℃における該フィルターの洗浄を意味する。あるポリヌクレオチドの「断片」にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、少なくとも約10ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約15〜20ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約30ヌクレオチド、より一層好ましくは約30〜50 ヌクレオチドの該参照ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）を意味する。ハイブリダイズするこれらのポリヌクレオチドは、通常のDNAハイブリダイゼーション技術に従う診断用プローブとして、または例えばSambrook，J.ら，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，第２版，Col d Spring Harbor，New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）(その全体の開示を参照により本明細書に組み入れることとする)に記載のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による標的配列の増幅用のプライマーとして有用である。ベクターおよび宿主細胞本発明はまた、後記で詳しく説明する調節DNA配列に作動的に結合した本発明の単離された核酸分子またはその断片を含む遺伝的構築物、これらの遺伝的構築物または本発明の単離されたDNA分子を含むベクター、およびこれらのベクターを含む宿主細胞に関する。また、本発明は、これらのベクターおよび宿主細胞を使用する組換え技術によるPakキナーゼポリペプチドまたはその断片の製造に関する。本発明の遺伝的構築物または単離されたDNA分子または断片を含むベクターは、感染、形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質転換などのよく知られた技術を用いて宿主細胞中に導入することができる。該ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクターであることが可能であり、好ましくは、後記の発現ベクターである。レトロウイルスベクターは、複製可能型または複製欠損型であることが可能である。後者の場合、ウイルスの増殖は、一般には、相補宿主細胞においてのみ生じることとなる。該ポリヌクレオチドは、宿主中での増殖に関する選択マーカーを含有するベクターに結合させることができる。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物などの沈殿物として又は荷電脂質(例えば、LIPOFECTAMINE^TM;Life Te chnologies，Inc.;Rockville，Maryland)との複合体として又はウイルス(例えば、アデノウイルス；米国特許第5,547,932号および第5,521,291号を参照されたい )もしくはウイルス成分（例えば、ウイルスカプシドペプチド）との複合体として、哺乳動物または鳥類細胞中に導入する。該ベクターがウイルスである場合には、それを、適当なパッケージング細胞系を使用してインビトロでパッケージングし、ついで宿主細胞中に導入することができる。関心のあるポリヌクレオチドに対するシス作用性制御領域を含むベクターが好ましい。宿主中へ導入されると、適当なトランス作用性因子が宿主により、相補ベクターにより、または該ベクター自体により供給されうる。これに関する或る好ましい実施形態においては、該ベクターは、誘導可能および／または細胞型特異的でありうる特異的発現をもたらす。そのような発現ベクターのうちで特に好ましいのは、操作が容易な環境因子（例えば、温度および栄養添加物）により誘導可能な発現ベクターである。本発明において有用な発現ベクターには、染色体、エピソームおよびウイルスに由来するベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオフアージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス）に由来するベクター、およびそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミドおよびファジミド）が含まれる。１つの実施形態においては、本発明の単離された核酸分子またはその断片を、適当な調節配列、好ましくはプロモーター、例えば、少数の例を挙げると、ファージλPLプロモーター、T3、T7およびSP6フアージ由来のプロモーター、大腸菌（E．coli）lac、trpおよびtacプロモーター、SV40初期および後期プロモーターならびにレトロウイルスLTRおよびその誘導体のプロモーターに作動的に結合させることができる。他の適当なプロモーターは当業者に公知であろう。該発現構築物は更に、転写の開始、終結のための部位、および転写領域中においては翻訳のためのリボソーム結合部位を含有する。該構築物により発現される成熟転写産物のコード部分は、好ましくは、該ポリペプチドの翻訳開始部位に転写開始コドン（AUG）を、そして該ポリペプチドの翻訳終結部位に適切に位置する終結コドン（UAA、UGAまたは UAG）を含む。前記のとおり、該発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーを含む。そのようなマーカーは、真核細胞培養ではジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）またはネオマイシン（neo）耐性遺伝子を、そして大腸菌（E．coli）および他の細菌の培養ではテトラサイクリン（tet）またはアンピシリン（amp）耐性遺伝子を含む。適当な宿主の代表例には、細菌細胞、例えばエシェリキア・スピーシーズ（Escherichia spp.）細胞（特に大腸菌（E．coli））、バシラス・スピーシーズ（Bacillus spp.）細胞（特にビー・セレウス（B．cereus）、ビー・サチリス（B．subtilis）およびビー・メガテリウム（B．megaterium））、ストレプトマイセス・スピーシーズ（Streptomyces spp.）細胞、サルモネラ・スピーシーズ（Salmonella spp.）（特にエス・ティフィムリウム（S．typhimuriu m））およびザントモナス・スピーシーズ（Xanthomonas spp.）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞、例えばサッカロミセス・スピーシーズ（Saccharomyces spp.）細胞；昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Drosophila）S2、スポドプテラ（Spodoptera）Sf9またはSf21細胞およびトリコプルサ・ハイ-ファイブ（Trichoplusa High-Five）細胞；他の動物細胞（特に哺乳動物細胞、特にヒト細胞）、例えばCHO、COS、VERO、Hela、Bo wes黒色腫細胞およびHepG2および他の肝細胞系；および高等植物細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。前記宿主細胞についての適当な培地および条件は、当技術分野において公知である。細菌中で使用するのに好ましいベクターには、Qiagenから入手可能なpQE70、p QE60およびpQE-9；Stratageneから入手可能なpBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18AおよびpNH46A；Invitrogenから入手可能なpcDNA3；およびPharmaciaから入手可能なpGEX、pTrxfus、pTrc99a 、pET-5、pET-9、pKK223-3、pKK233-3、pDR540およびpRIT5が含まれる。好ましい真核ベクターとしては、Stratageneから入手可能なpWLNEO、pSV2CAT、pOG44、 pXT1、pBKおよびpSG；およびPharmaciaから入手可能なpSVK3、pBPV、pMSGおよび pSVL が挙げられる。他の適当なベクターは当業者に容易に認められるあろう。本発明での使用に適した公知細菌プロモーターには、大腸菌（E．coli）lac1 およびlacZプロモーター、T3、T7およびSp6ファージプロモーター、gptプロモーター、λPRおよびPLプロモーターならびにtrpプロモーターが含まれる。適当な真核プロモーターには、CMV前初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、レトロウイルスLTRのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（RSV）のもの）およびメタロチオネインプロモーター（例えば、マウスメタロチオネイン-Iプロモーター）が含まれる。宿主細胞中への該構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、 DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、カチオニック脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、核酸でコートされた微粒子の射撃などの方法で行なうことができる。そのような方法は、多数の標準的な実験マニュアル（例えば、Davisら，Basic Methods in Molecular Biology( 1986)）に記載されている。いくつかの実施形態においては、本発明の単離されたポリヌクレオチドを、同種または異種の調節遺伝子配列（例えば、エンハンサー、プロモーターまたはリプレッサー）であることが可能な調節遺伝子配列に結合させて、遺伝的構築物を形成させることができる。本発明のこの態様の遺伝的構築物は、調節DNA配列に作動的に結合したPakキナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものばかりでなく、Pakキナーゼをコードしていないが「標的化断片」を含有するポリヌクレオチド断片に作動的に結合した１以上の調節配列を含む構築物も包含すると意図される（「標的化断片」は、宿主細胞の腫瘍原性トランスフォーメーションによりPakキナーゼ遺伝子が活性となりうる該宿主細胞中への導入に際して該遺伝的構築物を天然Pakキナーゼ遺伝子座に標的化するのに十分なPakキナーゼヌクレオチド配列部分を意味する）。これらの構築物を、前記のとおりにベクター中に挿入し、該ベクターを、前記の方法のいずれかにより、該標的遺伝子を含むゲノムを有する宿主細胞中に導入することができる。ついで、本発明のPakキナーゼポリヌクレオチドは、相同組換えにより宿主細胞ゲノム中に組込まれることとなる。標的化Pakキナーゼポリヌクレオチド断片に結合した同種または異種調節配列を含む構築物の場合には、該調節配列は、Rasでトランスフォームした宿主細胞中のPakキナーゼ遺伝子座に標的化されることとなり、触媒的に活性なPakキナーゼ遺伝子の該宿主細胞中での発現を抑制または阻害し（すなわち「ノックアウト」する）（これが生じるのは、調節配列が例えばリプレッサーを含む場合である。そうでない場合には、それが該天然調節配列中に組込まれて該発現を阻害または抑制する）、それにより、触媒的に活性なPakキナーゼ遺伝子発現のレベルを減少させることとなる。あるいは、そのような遺伝子標的化は、調節配列の不存在下に前記Pakキナーゼ標的化断片を含む遺伝的構築物を使用して行なうことができる。そのようなアプローチは、例えば、１以上のPakキナーゼ遺伝子中の点突然変異を修復または導入するのに用いることができる（他の哺乳類遺伝子中の点突然変異を修復または導入するためのそのようなアプローチの使用の説明に関しては、Steeg，C.M.ら，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 87(12):4680-4684（1990）を参照されたい）。遺伝子構築物を製造し、関心のある遺伝子を相同組換えを介して宿主細胞中に導入し、該コード化ポリペプチドを製造するための方法は、一般的には、米国特許第5,57 8,461号、WO 94/12650（米国特許出願第07/985,586号）、 WO 93/09222(米国特許出願第07/911,535号)およびWO 90/14092（米国特許出願第 07/353,909号）（それらの開示の全体を明示的に本明細書に組み入れることとする）に記載されている。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列を該ベクター中に挿入することにより増強することができる。エンハンサーは、与えられた宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増強するように作用する、DNAのシス作用性要素（通常は、約10〜300bp）である。エンハンサーには、例えば、複製起点の後期側（bp100〜270）に位置するSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。本発明の翻訳されたPakキナーゼポリペプチドを小胞体内腔、細胞周辺腔または細胞外環境中に分泌させるために、適当な分泌シグナルを該発現ポリペプチドに組込むことができる。該シグナルは、該ポリペプチドに対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。該Pakキナーゼポリペプチドは、融合タンパク質などの修飾形態として本発明の宿主細胞により発現させることが可能であり、分秘シグナルだけでなく、追加的な異種機能的領域を含むことが可能である。例えば、追加的なアミノ酸（特に荷電アミノ酸）の領域を該ポリペプチドのN 末端に付加して、精製中または後続の取扱いおよび保存中における宿主細胞内での安定性および持続性を改善することができる。また、ペプチド部分を該ポリペプチドに付加して、精製を促進することができる。そのような領域は、該ポリペプチドの最終的な調製の前に除去することができる。ポリペプチドに対するペプチド部分の付加により分秘または排泄を引き起こすこと、安定性を改善すること、および精製を促進することは、とりわけ、当技術分野でよく知られており通常の技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質を安定化するのに有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、EP 0 464533は、免疫グロブリン分子の定常（Fc）領域の種々の部分と別のヒトタンパク質またはその一部とを含む融合タンパク質を開示している。多くの場合、融合タンパク質のFc部分は、治療および診断での使用に非常に好都合であり、したがって例えば薬物動態学的特性の改善をもたらす（EP 0 232262）。一方、いくつかの用途には、記載されている有利な方法で該融合タンパク質を発現させ検出し精製した後で該Fc部分を除去しうることが望ましいかもしれない。このことは、治療、診断または更には製造における使用をFc部分が妨げることが判明している場合（例えば、該融合タンパク質を、抗体の調製のための免疫化用の抗原として使用する場合）に当てはまる。該Pakキナーゼポリペプチドは、硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、固定化されたCdc42および／またはRacに対する結合を介するもの。ただし、Cdc42および／またはRacに対する結合能を減少させる突然変異をPBD中に有するPakキナーゼ突然変異体、例えばPak1^L83,L86およびPak1^L83,L86,R299の場合は例外である）およびヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーを含む良く知られている方法により組換え細胞培養から回収し、精製することができる。最も好ましくは、精製に高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）を使用する。本発明のポリペプチドには、自然に精製された産物、化学合成法の産物、および原核または真核宿主（例えば、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物、鳥類および高等植物細胞を含む）から組換え技術により得た産物が含まれる。組換え製造法において用いる宿主に応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化体または非グリコシル化体となりうる。さらに、本発明の突然変異Pakキナーゼポリペプチドはまた、開始修飾メチオニン残基（いくつかの場合には、宿主媒介過程の結果生じるもの）を含むことが可能である。Pak キナーゼポリペプチドおよび断片本発明は更に、前記の単離された核酸分子にコードされるアミノ酸配列を有する単離されたPakキナーゼポリペプチドを提供する。本発明で用いる「ペプチド」および「オリゴペプチド」なる語は同義とみなされ（一般に認識されているとおりである）、ペプチド結合で連結された少なくとも２個のアミノ酸の鎖を示すことを要する文脈において各用語を互換的に使用することができる。本発明において、「ポリペプチド」なる語は、10個以上のアミノ酸残基を含む鎖を示すものとして使用する。当技術分野において一般に認識されているとおり、すべてのオリゴペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、本発明においては、左から右に、アミノ末端からカルボキシ末端への方向で表記されている。本発明のPakキナーゼポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、該ポリペプチドの構造または機能に有意な影響を及ぼすことなく様々に変更することが可能である、と当業者に認められるであろう。配列におけるそのような相違が予想される場合には、タンパク質上には構造および活性を決定する臨界領域が存在しうることを念頭におくべきである。一般には、同様の機能を果たす残基を使用する場合に限り、三次構造を形成する残基を置換することが可能である。他の場合において、改変が該ポリペプチドの非臨界領域において生じる場合には、残基の型は何ら重要ではない。したがって、本発明は更に、前記のPakキナーゼポリペプチドに対する実質的な構造的相同性もしくはその活性を示す又はPakキナーゼポリペプチドの領域（例えば、後記の部分）を含むPakキナーゼポリペプチドの変異体または突然変異体（例えば、対立遺伝子変異体など）を含む。そのような変異体または突然変異体は、欠失、挿入、逆位、反復および型置換（例えば、ある残基を別の親水性残基で置換すること。ただし、通例、強い疎水性のものを強い親水性のもので置換することはしない）を含むことが可能である。小さな変化またはそのような「中性的な（neutral）」アミノ酸の置換は、一般には、活性にほとんど影響を及ぼさないであろう。典型的な同類置換としては、脂肪族アミノ酸Ala、Val、LueおよびIleの間での互いの置換；ヒドロキシル化残基SerとThrとの交換；酸性残基AspとGluとの交換；アミド化残基AsnとGlnとの置換；塩基性残基LysとArgとの交換；および芳香族残基PheとTyrとの置換が挙げられる。したがって、本発明のPakキナーゼポリペプチドの断片、誘導体または類似体は、（i）該アミノ酸残基の１以上が同類または非同類アミノ酸残基（好ましくは同類アミノ酸残基）で置換されており、そのような置換アミノ酸残基が遺伝暗号によりコードされうるか又は該遺伝暗号によりコードされないアミノ酸（例えば、デスモシン、シトルリン、オルニチンなど）でありうるもの、（ii）該アミノ酸残基の１以上が、該アミノ酸の通常の「R」基のほかに置換基（例えば、ホスファート、ヒドロキシル、スルファートまたは他の基）を含むもの、（iii）該成熟ポリペプチドが別の化合物（例えば、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物、例えばポリエチレングリコール）と融合しているもの、または（iv）該成熟ポリペプチドに、追加的なアミノ酸［例えば、免疫グロブリンFc領域ペプチド、リーダーまたは分秘ペプチド配列、該成熟ポリペプチドの精製に使用する配列（例えば、GST）またはプロタンパク質配列］が融合しているものであることが可能である。そのような断片、誘導体および類似体は、本発明に含まれると意図され、本明細書の教示および発明時における技術水準から理解される当業者の通常の技術の範囲内であると意図される。本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、好ましくは、実質的に精製されている。Pakキナーゼポリペプチドの組換え生産体は、Smi thおよびJohnson，Gene 67:31-40(1988)に記載の１工程法により実質的に精製することができる。本発明で用いる「実質的に精製（されている）」なる語は、Pa kキナーゼポリペプチドの調製物のうち、混入タンパク質（すなわち、Pakキナーゼタンパク質以外のもの）の少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98 %または99%が該調製物から除去されているものを意味する。本発明のPakキナーゼポリペプチドには、突然変異Pakキナーゼポリペプチドキナーゼであることが可能な、ドメインを含み実質的に触媒的に不活性である該ポリペプチドが含まれる（「キナーゼドメイン」および「実質的に触媒的に不活性」なる語は前記と同意義を有する）。本発明の好ましい突然変異Pakキナーゼポリペプチドには、そのキナーゼドメイン中に１以上の突然変異（これは、１以上のアミノ酸の欠失、置換または挿入、特に、１以上のアミノ酸の置換または挿入であることが可能である）を含むものが含まれる。特に好ましいそのような突然変異Pakキナーゼポリペプチドは、該突然変異が、アミノ酸残基約270〜約516に伸長するキナーゼドメイン（図1Aを参照されたい）内の１以上のアミノ酸残基に存在するもの（例えば、該突然変異が、該ポリペプチドのアミノ酸残基約260〜アミノ酸残基約520、アミノ酸残基約270〜アミノ酸残基約516、アミノ酸残基約290〜アミノ酸残基約400、アミノ酸残基約2 95〜アミノ酸残基約350、アミノ酸残基約297〜アミノ酸残基約300、アミノ酸残基約299〜アミノ酸残基約300の１以上のアミノ酸残基、またはアミノ酸残基299 に存在するものを含む）である。より好ましいのは、該突然変異が野生型Pakキナーゼポリペプチドの299位のリシン残基（L299）の置換突然変異である突然変異Pakキナーゼポリペプチドである。好ましいそような置換には、アルギニン、ヒスチジンなどの塩基性アミノ酸によるL299の置換が含まれる。特に好ましいそのような実施形態においては、該突然変異は、Pakキナーゼ中のL299からアルギニン残基への置換であり、その一例は、Pak1^R299と称される突然変異Pak1キナーゼである。前記のとおり、もちろん、他の突然変異を該キナーゼドメインまたは他のドメイン（例えば、PBD）内に作製することが可能である。ただし、これは、該突然変異が、実質的に触媒的に不活性なPakキナーゼを与える場合に限られる。したがって、本発明はまた、キナーゼドメインを含み実質的に触媒的に不活性なPak1^L83,L86,R299と称される突然変異Pak1キナーゼを提供する。本ポリペプチドはまた、少なくとも30アミノ酸、より好ましくは少なくとも50アミノ酸を有する前記ポリペプチドの一部または断片を含む。本発明のポリペプチドは、当業者によく知られた方法によりSDS-PAGEゲル上または分子ふるいケル濾過カラム上で分子量マーカーとして使用することができる。また、後記で詳しく説明するとおり、本発明のポリペプチドは、Pakキナーゼタンパク質発現を検出するためのアッセイ、Pakキナーゼまたは突然変異Pakキナーゼタンパク質の機能を阻害しうるアンタゴニストとして、またはPakキナーゼタンパク質またはその変異体、突然変異体もしくは誘導体の単離に有用なポリクローナルおよびモノクローナル抗体を産生させるのに使用することができる。当業者には認められるとおり、本発明のPakキナーゼポリペプチドおよびその断片は、当技術分野においてよく知られている通常の技術により固体支持体上に固定化することかできる。「固体支持体」は、ペプチドを固定化することができる任意の固体支持体を意味する。そのような固体支持体には、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリビニルクロリド、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セフアロース、寒天、デンプン、ナイロン、ビーズおよびマイクロタイタープレートが含まれるが、これらに限定されるものではない。固体支持体に対する本発明のペプチドの結合は、該ペプチドの一方または両方の末端を該支持体に結合させることにより行なうことができる。また、結合は、該ペプチド中の１以上の内部部位で行なうこともできる。また、本発明では複数の結合（該ペプチドの内部および末端の両方）を用いることが可能である。結合は、第１級アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル（SH）基などのアミノ酸連結基を介したもの、またはスペーサーを介した臭化シアン（CNBr）連結などの化学連結基によることが可能である。非共有結合には、該ポリペプチドに対するアフィニティータグ配列、例えば、GST（Smith，D.B.およびJohnson，K.S.，Gene 67:31(1988)）、ポリヒスチジン（Hochuli，E.ら，J．Chromatog．411:77(1987)）またはビオチンの付加を用いることができる。そのようなアフィニティータグは、該ポリペプチドを該支持体に可逆的に結合させるのに用いることができる。そのような固定化されたポリペプチドまたは断片は、例えば、後記のとおりPakキナーゼポリペプチドに対する抗体の単離に有用かもしれない。また、当業者には認められるとおり、本発明のPakキナーゼポリペプチドおよびその断片を免疫グロブリン（Ig）の定常ドメイン部分と一緒にして、キメラまたは融合ポリペプチドを得ることができる。これらの融合ポリペプチドは、精製を促進し、インビボにおける半減期の増加を示す（EP 0.394 827;Trauneckerら，Nature 331:84-86(1988)）。Pak キナーゼに対する抗体本発明のPakキナーゼポリペプチドは、当技術分野でよく知られた方法に従いP akキナーゼポリペプチドに対する抗体を産生させるのに使用することができる。例えば、Sutcliffe,J.G.ら，Science 219: 660-666(1983);Wilsonら，Cell 37:767(1984)およびBittle，F.J.ら，J．Gen．V irol．66:2347-2354(1985)を参照されたい。Pakキナーゼポリペプチドに特異的な抗体は、本発明の無傷ポリペプチドまたはその１以上の抗原性ポリペプチド断片に対して産生させることができる。これらのポリペプチドまたは断片は、動物の系（例えば、ウサギまたはマウス）に担体タンパク質（例えば、アルブミン）と共に、あるいはそれが十分な長さ（少なくとも約25アミノ酸）である場合には担体無しで提示することができる。本発明で用いる「抗体」（Ab）なる語は、後記の特定の文脈の場合を除き、「ポリクローナル抗体」または「モノクローナル抗体」（mAb）なる語と互換的に使用することができる。本発明で用いるこれらの用語は、Pakキナーゼポリペプチドまたはその一部に特異的に結合しうる無傷分子および抗体断片（抗体フラグメント）（例えば、FabおよびF(ab')₂断片）を包含する意である。FabおよびF(a b')₂断片は、無傷抗体のFc断片を欠き、より迅速に循環から除かれ、無傷抗体より低い非特異的組織結合性を有するかもしれない（Wahlら，J．Nucl．Med． 24:316-325(1983)）。本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであることが可能であり、種々の方法のいずれかにより製造することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、標準的な方法（例えば、Harlow，E.およびLane，D.，Antibodies:a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY:Cold Spring Harbor Labor atory Press(1988);Kaufman，P.B.ら，Handbook of Molecular and Cellul ar Methods in Biology and Medicine,Boca Raton，Florida:CRC Press ，pp.468-469(1995)を参照されたい）に従い、本発明の１以上のPakキナーゼポリペプチドまたはその一部で動物を免疫することにより製造することができる。１つの好ましい方法においては、本発明の抗体はモノクローナル抗体（またはPa kキナーゼポリペプチドに結合するその断片）である。そのようなモノクローナル抗体は、当技術分野でら，Eur．J．Immunol．6:292(1976);Hammerlingら，Monoclonal Antibodies a nd T-Cell Hybridomas，New York:Elsevier，pp.563-681(1981);Kaufman，P. B.ら，Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine，Boca Raton，Florida :CRC Press，pp.444-467(1995)）を用いて製造することができる。別法として、Pakキナーゼポリペプチドまたはその断片に結合しうる抗体を、抗イディオタイプ抗体の使用を介した２工程法で製造することができる。そのような方法は、抗体自体が抗原であるということ、したがって第２の抗体に結合する抗体を得ることが可能であるということを利用する。この方法に従い、Pakキナーゼポリペプチドに特異的な抗体を使用して動物（好ましくはマウス）を免疫する。ついで、そのような動物の脾細胞を使用してハイブリドーマ細胞を得、該ハイブリドーマ細胞をスクリ−ニングして、該Pakキナーゼポリペプチド特異的抗体に対する結合能が該Pakキナーゼポリペプチド抗原により遮断されうる抗体を産生するクローンを同定する。そのような抗体は、該Pakキナーゼポリペプチド特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、さらなるPakキナーゼポリペプチド特異的抗体の生成を誘導するために動物を免疫するのに使用することができる。本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、本抗体をキメラ抗体として製造することができる。本発明によれば、そのようなキメラ抗体は、第１の種からの抗原結合ドメイン（すなわち、Pakキナーゼに対する抗体結合の領域）と、第２の種からの１以上の定常領域とを含むことが可能である（キメラ抗体の製造法に関する米国特許第4,816,567号を参照されたい。その開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）。本発明の抗体のFab、F(ab')₂および他の断片は、本明細書に開示する方法に従い使用することができると理解されるであろう。そのような断片は、典型的には、パパイン（Fab断片を得る場合）またはペプシン(F(ab')₂断片を得る場合）などの酵素を使用するタンパク質分解切断により製造する。あるいは、Pakキナーゼタンパク質結合断片を、組換えDNA技術の適用または合成化学的方法により製造することができる。本発明のPakキナーゼタンパク質特異的抗体は、検出可能に標識することができる（最も好ましくは酵素、放射性同位体、非放射性同位体、蛍光、毒素、化学発光または核磁気共鳴（NMR）コントラスト剤標識）。これらの各標識型の適当な具体例は当業者によく知られている。標識を抗体に結合させるための典型的な技術は、例えば、Kennedyら，Clin．Chim．Acta 70:1-31(1976)およびSchur sら，Clin．Chim．Acta 81:1-40（1977）(それらの方法のすべてを参照により本明細書に組み入れることとする)に記載されている。本発明の追加的な好ましい実施形態においては、前記のとおりに製造した抗体を、共有的または非共有的に固体支持体上に固定化することができる。「固体支持体」は、抗体を固定化することができる任意の固体支持体を意味し、例えば、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリビニルクロリド、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、デンプン、ナイロン、ビーズ（ガラス、ラテックス、磁性（常磁性および超常磁性を含む）ビーズを含む）およびマイクロタイタープレートを含むが、これらに限定されるものではない。固体支持体に対する本発明の抗体の結合は、該抗体の一方または両方の末端を該支持体に結合させることにより行なうことができる。また、結合は、該抗体中の１以上の内部部位で行なうこともできる。また、本発明では複数の結合（該抗体の内部および末端の両方）を用いることが可能である。結合は、第１級アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル（SH）基などのアミノ酸連結基を介したもの、またはスペーサーを介した臭化シアン（CNBr）連結などの化学連結基によることが可能である。非共有結合には、該抗体に対するアフィニティータグ配列、例えば、GST（Smith，D.B.および Johnson，K.S.，Gene 67:31(1988)）、ポリヒスチジン（Hochuli，E.ら，J．Chr omatog．411:77(1987)）またはビオチンの付加を用いることができる。あるいは、間接的カップリング剤、例えば、抗体のFc領域に結合するプロテインAまたはプロテインG（例えばSigma Chemical Co.，St．Louis，Missouriから商業的に入手可能）を該固体支持体に結合させ、固定化プロテインAまたはプロテインGを含有する固体支持体と該抗体との単なるインキュベーションにより本発明の抗体をそれに結合させることができる。そのようなアフィニティータグは、本発明の抗体を該支持体に可逆的に結合させるのに用いることができる。用途本発明の単離されたPakキナーゼ核酸分子、ポリペプチドおよび抗体は、例えば産業的、臨床的および研究的場面における種々の方法に有用である。これらの用途には、当業者によく知られている標準的な免疫学的技術に従う、単離された細胞または組織による又は動物中の細胞および組織によるPakキナーゼの発現または産生の測定における、本発明の抗Pakキナーゼ抗体の使用が含まれる。また、本核酸分子、特に、実質的に触媒的に不活性なPakキナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子は、細胞、特に動物細胞（例えば、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞）または癌細胞の腫瘍原性トランスフォーメーション（特に、Ras媒介トランスフォーメーション）を抑制または逆転させるための方法において使用することができる。同様に、本核酸分子、特に、実質的に触媒的に不活性なPakキナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子は、動物（好ましくは、ヒトなどの哺乳動物）における或る障害、例えば癌（Ras依存性癌、癌腫、肉腫、（特に神経繊維肉腫）、黒色腫および白血病を含むが、これらに限定されるものではない）および神経学的障害（神経繊維腫症を含むが、これに限定されるものではない）の治療方法において使用することができる。特に、本発明のPakキナーゼ核酸分子、ポリペプチドおよび抗体は、突然変異ras癌遺伝子を有する癌、チロシンキナーゼ活性の上昇により特徴づけられる癌およびNF-1に関連した癌を含む改変したRas機能を有する癌および癌細胞の治療に有用である。さらに詳しくは、本発明のPakキナーゼ核酸分子、ポリペプチドおよび抗体は、突然変異ras癌遺伝子を有する癌の治療に有用である。さらに、本核酸分子、ポリペプチドおよび抗体は、Pakキナーゼの活性をモジュレーションする化合物の同定、およびPakキナーゼの新規標的の同定に使用することができる。Pakキナーゼ活性の抑制化合物は、前記の用途を有する。細胞トランスフォーメーションの抑制および逆転本発明の単離された核酸分子、特に、実質的に触媒的に不活性なPakキナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子は、インビトロまたはインビボにおける細胞のトランスフォーメーションを抑制または逆転させる方法において使用することができる。１つの好ましいそのような態様においては、本発明の核酸分子を、細胞の腫瘍原性トランスフォーメーション(例えば、Ras癌遺伝子および他のウイルスまたは細胞性癌遺伝子により誘導されるもの)を抑制または逆転させるために使用することができる。同様に、本発明の核酸分子は、Ras癌遺伝子などの癌遺伝子の活性を該癌遺伝子を含む細胞において抑制するように設計された方法において使用することができる。本発明のこの態様の方法は、インビトロ、インビボまたはエクスビボ（exvivo ）（すなわち、動物の体から摘出された組織切片であって、細胞トランスフォーメーションを、又は該癌遺伝子の活性を抑制するように処理した後に該動物中に戻すことが可能な又は可能でない組織切片における）のいずれであるかにかかわらず、細胞におけるトランスフォーメーションを抑制または逆転させるように設計された１以上の工程を含むことが可能である。本発明の１つの好ましいそのような実施形態においては、本発明の前記の単離された核酸分子の１以上を含む組成物を細胞中に導入して、該細胞のトランスフォーメーションまたは該細胞中での腫瘍原性活性を抑制することが可能である。このアプローチでは、前記の単離された核酸分子の１以上を、処理する細胞中への該核酸分子の導入に適したベクターまたはビリオン中に組込んで、トランスフェクションベクターを形成させることが可能である。この目的に適したベクターまたはビリオンには、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスに由来するものが含まれる。本発明の１以上のPakキナーゼコード核酸分子を含むトランスフェクションベクターの形成のための技術は、当技術分野においてよく知られており、一般的には、"Working Toword Human Gene Therapy,"第28章，Recombinant DNA ，第２版，Watson，J.D.ら編，New York:Scientific American Books，pp.567-5 81(1992)およびそれに引用されている参照文献に記載されている。もう１つのアプローチにおいては、単離された核酸分子を、当業者によく知られた他の方法（例えば、エレクトロポレーション、形質導入、形質転換、リン酸カルシウム処理、低張穿孔（hypotonic poration）、リシーリング（resealing）などを含む）により該細胞中に導入することができる。前記のアプローチを行なうことにより、実質的に不活性なPakキナーゼタンパク質の発現のレベルを処理細胞において増加させ、それにより該細胞のトランスフォーメーションを抑制または逆転させたり、該細胞中の腫瘍原性活性を抑制する。本発明のこの態様で使用するための組成物は、所望により更に、該組成物中に含まれる単離された核酸分子との併用に適した医薬上許容される担体または賦形剤などの１以上の追加的化合物を含んでいてもよい。「医薬上許容される担体または賦形剤」は、任意のタイプの無毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化物質または製剤補助剤を意味する。また、該担体は、薬学分野でよく知られている、等張性および化学的安定性を増加させる物質などの少量の添加剤を含有することが可能である。したがって、本発明はまた、本発明の１以上の単離された核酸分子とその医薬上許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。トランスフォーメーションを抑制または逆転させるため又は腫瘍原性活性を抑制するために本発明方法により処理しうる細胞には、マウス、ラット、サル、霊長類、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギおよび特にヒトを含む哺乳動物から得た細胞が含まれる。任意の哺乳動物細胞を前記方法により処理することができるが、これらの方法は、癌細胞の治療に特に適している。本発明の方法により有利に治療される腫瘍または癌細胞の型には、癌腫細胞（特に、肝臓癌細胞、卵巣癌細胞、乳癌細胞、子宮頚癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、胃癌細胞、膀胱癌細胞、精巣癌細胞、結腸直腸癌細胞、膵臓癌細胞、口腔癌細胞、扁平上皮細胞癌細胞、頭部および頚部癌細胞、および奇形癌）、肉腫細胞（特にカポジ肉腫細胞、繊維肉腫細胞、神経繊維肉腫細胞および骨肉腫細胞）、黒色腫細胞および白血病細胞が含まれる。治療用途また、本発明の単離された核酸分子、特に、実質的に触媒的に不活性なPakキナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子は、例えば、障害（例えば、癌または神経学的障害）に罹患した又はその素因を有する動物における該障害の治療または予防方法において治療的に使用することができる。そのようなアプローチにおいては、該治療の目的は、該障害の素因を有する動物における該障害の発生または進行を遅らせ又は抑制すること、および／または該障害に罹患した動物における該障害を治療し又は該障害の寛解を誘導することにある。本発明の第１のそのような態様においては、身体的障害に罹患した又はその素因を有する動物を、実質的に触媒的に不活性なPakキナーゼポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む１以上の本発明の単離された核酸分子を該動物中に導入することにより治療することができる。このアプローチは、一般的には「遺伝子治療」として公知であり、該動物の細胞における実質的に触媒的に不活性なPakキナーゼ遺伝子の発現のレベルを増加させて、それにより該発生を抑制し又は遅らせ、あるいは該身体障害を治療し又は該障害の寛解を誘導するように計画する。同様の遺伝子治療アプローチは、哺乳動物の障害、例えば、嚢胞性繊維症（Drumm，M.L.ら，Cell 62:1227-1233(1990);Gregory，R.J.ら，Nature 347:358-363(1990);Rich，D.P.ら，Nature 347:358-363(1990)）、ゴーシェ病（Sorge，J.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:906-909(1987);Fink ，J.K．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:2334-2338(1990)）、ある種の形態の血友病（Bontempo，F.A.ら，Blood 69:1721-1724(1987);Palmer，T.D．ら，Bl ood 73:438-445(1989);Axelrod，J.H.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:5173 -5177(1990);Armentano，D.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:6141-6145(199 0)）および筋ジストロフィー（Partridge，T.A.ら，Nature 337176-179(19899； Law，P.K.ら，Lancet336:114-115(1990);Morgan，J.E.ら，J.Cell Biol．111:24 37-2449(1990))の治療において、あるいは転移黒色腫（Rosenberg，S.A．ら，Sc ience 233:1318-1321(1986);Rosenberg，S.A.ら,，N．Eng．J．Med．319:1676-1 680(1988);Rosenberg，S.A.ら，N．Eng．J．Med．323:570-578(1990)）などの或る種の癌の他の治療において有効または有望であることが判明している。好ましいそのような方法においては、１以上の本発明の単離された核酸分子、または１以上の本発明の単離された核酸分子を含む１以上の前記医薬組成物を、該身体的障害に罹患している又は該障害の素因を有する動物中に導入または投与する。そのような単離された核酸分子は、処理する動物の細胞または組織中への該核酸分子の導入に適したベクターまたはビリオン中に組込んで、トランスフェクションベクターを形成させることが可能である。この目的に適したベクターまたはビリオンには、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスに由来するものが含まれる。あるいは、本発明の核酸分子を、ウイルス（例えば、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス）またはウイルス成分（例えば、ウイルスカプシドタンパク質）との分子コンジュゲートに複合化することができる。そのようなベクターまたはビリオンの形成のための技術は、前記で一般的に記載したとおりである。また、遺伝子治療ベクターを構築するための、およびそれを治療目的で罹患動物中に導入するための一般的な方法は、前記刊行物（それらの開示の全体を特に本明細書に組み入れることとする）に記載されている。１つのそのような一般的方法においては、本発明の単離された核酸分子を含むベクターを、罹患動物の細胞または組織中に、好ましくは、注射、吸入、摂取または導入（溶液を介した粘膜に対するもの）により直接導入する。そのようなアプローチは、一般に、「インビボ」遺伝子治療と称される。あるいは、細胞、組織または器官（特に、癌細胞または腫瘍を含有するもの）を、罹患動物から摘出し、培養内に配置する（これは、当業者によく知られている方法に従い行なう）。ついで、単離されたポリヌクレオチドを細胞または組織中に導入するための前記で一般的に記載されている方法のいずれかにより、本発明のPakキナーゼポリヌクレオチドを含むベクターを、これらの細胞または組織中に導入することができる。ついで、本発明のPakキナーゼポリヌクレオチドの取込みが可能となるのに十分な時間が経過した後、該細胞または組織を罹患動物中に再導入することができる。本発明のPakキナーゼ遺伝子の導入は、罹患動物の体外で行なうため、このアプローチは、一般に、「エクスビボ（ex vivo）」遺伝子治療と称される。インビボおよびエクスビボのどちらの遺伝子治療においても、本発明の単離された核酸分子を調節DNA配列（これは、プロモーターもしくはエンハンサー、または異種調節DNA配列、例えば、異なる遺伝子、細胞または生物に由来するプロモーターまたはエンハンサーであることが可能である）に作動的に結合させて、前記のとおりに遺伝的構築物を形成させることが可能である。ついで、この遺伝的構築物をベクター中に挿入することが可能であり、ついでこのベクターを、インビボ遺伝子治療アプローチにおいては罹患動物中に直接導入し、エクスビボアプローチにおいては罹患動物の細胞または組織中に導人する。もう１つの好ましい実施形態においては、本発明の遺伝的構築物は、ウイルス（例えば、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス）またはウイルス成分（例えば、ウイルスカプシドタンパク質）との分子コンジュゲートとして、インビボまたはエクスビボのいずれかで動物の細胞または組織中に導入することができる。これらのアプローチは、（a）実質的に触媒的に不活性なPakキナーゼをコードする遺伝子の、宿主細胞ゲノム中へのランダムな挿入、または（b）実質的に触媒的に不活性なPakキナーゼをコードする遺伝子の、該細胞の核内への取込み（この場合、それは染色体外遺伝的要素として存在することが可能である）を介して、治療された動物による実質的に触媒的に不活性なPakキナーゼの産生の増加をもたらす。遺伝子治療のそのような方法およびアプローチの一般的な説明は、例えば、米国特許第5,578,461号、WO 94/12650およびWO 93/09222に記載されている。動物に１以上の前記医薬組成物を投与することにより身体的障害を治療または予防するには、個々の患者の臨床状態、該組成物の運搬部位、投与方法、投与計画、および当業者に公知の他の要因を考慮して優良医学的規範（good medical p ractice）に合致した方法で、該組成物を製剤化し投与すべきである。したがって、本発明の目的における本発明の医薬組成物または単離された核酸分子の「治療的に有効な量」は、そのような考慮事項により決定される。適当な用量を選択する際の鍵要因は、例えば、実質的に触媒的に不活性なPakキナーゼの発現のレベルの増加による測定、あるいは細胞トランスフォーメーションまたは該身体的障害もしくはその症状の逆転または抑制の判定による測定で得られる結果である。治療効果の判定のその他の有用な尺度は当業者に公知である。変化を観察するのに必要な治療期間、および応答が生じる治療後の間隔は、所望の効果に応じて様々となりうる。そのような方法において使用するための医薬組成物は、本発明の単離された核酸分子の１以上を含み、所望により、前記のとおりのその医薬上許容される担体または賦形剤を含んでいてもよい。本発明の単離された核酸分子および医薬組成物は、身体的障害の進行または発生を遅らせたり抑制したりそれに罹患した動物においてはその寛解を誘導するというそれらの意図される目的を果たす任意の手段により投与することができる。例えば、投与は、経口、眼、耳、直腸、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、膣内、局所（散剤、軟膏剤、滴剤または経皮パッチによるもの）、頬、鞘内または頭蓋内経路で、経口または鼻スプレーとして又は点眼剤もしくは点耳剤として行なうことができる。本発明で用いる「非経口」なる語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与方法を意味する。投与量は、被投与者の年齢、健康状態および体重、併用療法を行なっている場合はその種類、治療頻度、および所望の効果の性質に左右されるであろう。個々の要件は動物によって様々となりうるが、各成分の有効量の最適範囲の決定は、通常の知識を有する臨床医の能力の範囲内に含まれる。本組成物はまた、徐放系により投与することができる。徐放組成物の適当な具体例には、成形品の形態の半透性ポリマーマトリックス、例えばフィルムまたはマイクロカプセルが含まれる。徐放マトリックスには、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号;EP 0 058 481)、L-グルタミン酸とγ-エチル-L- グルタマートとのコポリマー（Sidman，U.ら，Biopolymers 22:547-556(1983)）、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリラート)(Langer，R.ら，J．Biomed．Mat．R es．15:167-277(1981);Langer，R.，Chem．Tech．12:98-105(1982))、エチレンビニルアセタート（Langerら，同誌）およびポリ-D-ヒドロキシ酪酸（EP 0 133 988）が含まれる。また、徐放組成物には、当技術分野において十分に記載されている種々の方法（米国特許第4,485,045号および第4,544,545号；Epsteinら，P roc．Natl．Acad．Sci．(USA)82:3688-3692(1985);Hwangら，Proc．Natl．Acad ．Sci．(USA)77:4030-4034(1980);EP 0 036 676;EP 0 052 322;EP 0 088 046;EP 0 102 324;EP 0 142 641;EP 0 143 949;DE 3,218,121およびJP 83-118008を参照されたい）のいずれかにより製造可能な、リポソームに捕捉された本発明の核酸分子が含まれる。１つの実施形態における非経口投与の場合には、本発明の単離された核酸分子は、注射可能な単位投与形（溶液、懸濁液または乳液）中の所望の純度で、医薬上許容される担体（すなわち、用いる投与量および濃度において被投与者に無毒性であり、他の製剤成分に適合するもの）と該核酸分子とを混合することにより製剤化することができる。例えば、該製剤は、好ましくは、酸化剤や、核酸分子に有害であることが知られている他の化合物を含まない。一般には、該製剤は、本発明の単離された核酸分子を液体担体または微細化固体担体またはその両方と均一かつ十分に接触させることにより製造する。ついで、必要に応じて、該生成物を所望の製剤に成形する。好ましくは、該担体は非経口担体であり、より好ましくは、被投与者の血液と等張な溶液である。そのような担体ビヒクルには、例えば、水、食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液が含まれる。不揮発性油、オレイン酸エチルなどの非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本発明で有用である。本発明の単離された核酸分子を含む治療用組成物は、通常、単回または複数回投与容器（例えば、封管アンプルまたはバイアル）中に、あるいは水溶液として保存することができる。本発明のこれらの治療方法により、種々の身体的障害を動物において治療し、予防し、または治癒させることができる。そのような障害には、癌および神経学的障害が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの方法により適切に治療または予防される癌には、Ras関連癌、癌腫、肉腫、（神経繊維肉腫を含む）、黒色腫および白血病、特に前記のものが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの方法により適切に治療または予防される神経学的障害には、神経繊維腫症が含まれるが、これに限定されるものではない。本発明の方法は、任意の動物における、好ましくは哺乳動物における、最も好ましくはヒトにおける身体障害の治療または予防に特によく適している。該アプローチには無関係に、本発明の治療方法の使用は、治療された動物の細胞および組織による実質的に触媒的に不活性なPakキナーゼの産生の増加をもたらして、該身体障害の発生または進行を遅らせ又は抑制し、あるいは該身体障害を寛解または治癒させるであろう。Pak キナーゼ活性のモジュレーターの同定前記の単離された核酸分子、ポリペプチドおよび抗体はまた、Pakキナーゼの活性をモジュレーション（すなわち、抑制または活性化）する化合物の同定を可能にする方法において使用することができる。本発明のこの態様で用いるPakキナーゼの「活性」は、Pakキナーゼ酵素の生理的機能を意味し、種々の標的（例えば、Cdc42/Rac、ATPなど）の結合性、触媒活性（例えば、種々の生理的および非生理的標的のリン酸化など）、細胞内シグナリングおよび直接的または間接的でありうる他の機能を含むが、これらに限定されるものではない。本発明のこの態様による方法は、（a）本発明の１以上のPakキナーゼポリペプチドと、Pakキナーゼの活性をモジュレーションする能力に関して試験しようとする化合物とを接触させ、(b)該Pakキナーゼの活性に対する該化合物の効果を判定することなどの１以上の工程を含むことが可能である。そのような方法により試験されうる化合物には、ペプチド（ポリペプチドおよびタンパク質、酵素、酵素複合体、抗体、ペプチドホルモン、サイトカインなどを含む）、ステロイド、有機および無機化合物など（これらは天然物であっても合成物であってもよい）が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの方法により同定された化合物は、１以上のそのような化合物とその医薬上許容される担体または賦形剤（この担体または賦形剤は、前記の１以上を含むことが可能である）とを含む医薬組成物を製造するために使用することができる。ついで、そのような医薬組成物を、１以上の本発明医薬組成物の有効量を動物に投与することを含む該動物（好ましくは哺乳動物、例えばヒト）における障害の治療または予防方法において使用することかできる。有効に治療または予防されうる障害には、前記のものが含まれる。実際には、試験する化合物がPakキナーゼをモジュレーションするか否かの判定は、当技術分野において公知の種々の方法により行なうことができる。そのような方法は、インビトロまたはインビボで行なうことができ、例えば、試験する化合物の存在下および不存在下にPakキナーゼがCdc42/Racに結合する能力を測定すること、試験する化合物の存在下および不存在下にPakキナーゼがミエリン塩基性タンパク質をリン酸化する能力を測定することなどを含むことが可能である。そのような結合およびキナーゼアッセイは、当技術分野で公知であり、後記実施例に詳細に記載されている。他の好ましいアッセイ方法は、当業者によく知られているであろう。そのような試験の結果を分析する場合には、測定したPakキナーゼ活性の増加を誘導する試験化合物を「Pakキナーゼアクチベーター」（または「正のモジュレーター」）と称することが可能である。同様に、測定したPakキナーゼ活性の減少を誘導する（または該活性を抑制する）試験化合物を「Pakキナーゼインヒビター」（または「負のモジュレーター」）と称することが可能である。Pak キナーゼ標的の同定本発明の核酸分子、ポリペプチドおよび抗体はまた、Pakキナーゼの新規標的の同定方法において使用することができる。本発明で用いる、Pakキナーゼの「標的」は、インビトロまたはインビボでPakキナーゼが作用する（すなわち、結合する、酵素的に修飾（例えばリン酸化）するなど）分子、複合体、細胞小器官、細胞構造体などを意味する。そのような標的は、典型的には、細胞に由来することが可能であり、細胞内の、例えば細胞質、核、細胞小器官または膜の構成成分または構造体、例えばタンパク質（サイトゾルまたは膜結合性）、細胞骨格要素、二次メッセンジャー分子、受容体、酵素複合体などであることが可能である。本発明の実施においては、そのような標的は、細胞抽出物またはホモジネート中、全細胞調製物中または単個細胞浮遊液中などに含有されていてもよい。本方法により同定されるPakキナーゼ標的は、例えば前記の動物（哺乳動物、例えばヒトを含む）における種々の障害の診断、治療または予防方法、またはそのような診断および治療方法において有用な化合物および組成物の同定方法において使用することができる。本発明のこの態様による方法は、（a）本発明の１以上のPakキナーゼポリペプチドと、Pakキナーゼ標的の含量に関して試験しようとする組成物とを接触させ、（b）該組成物の成分の１以上に対する該Pakキナーゼの活性を判定して、Pak キナーゼポリペプチドが作用する成分を同定することなどの１以上の工程を含むことが可能である。前記のとおり、潜在的Pakキナーゼ標的に関するPakキナーゼの活性の測定は、例えば、該標的に対するPakキナーゼの結合性、またはPakキナーゼにより誘導される該標的における構造的変化もしくはコンホメーション変化を測定することにより行なうことができる。そのような測定は、直接的または間接的アッセイにより行なうことができる。Pakキナーゼと推定Pakキナーゼ標的との相互作用をアッセイする直接的方法には、例えば、本発明のPakキナーゼが細胞成分または構造体に直接結合する能力の測定が含まれる。そのような直接的方法は、該Pakキナーゼおよび／または該細胞成分または構造体を検出可能に標識することにより（例えば、放射能標識、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識など）促進することができる。あるいは、そのようなキナーゼ-標的相互作用は、当技術分野で公知の種々の方法により間接的に測定することができる。例えば、酵母ツー・ハイブリッド系（Yeast Two-Hybrid sys tem）（Golemis，E.A.ら，Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel ，F.M.ら編，New York:John Wiley & Sons，Inc.，pp.20.1.1-20.1.28(1996)を参照されたい）などを用いて、または本発明の抗Pakキナーゼ抗体（これは、エピトープ-タグ付き抗体であってもよい）を用いて、Pakキナーゼ分子上の潜在的標的結合部位を連続的にマスクし、それにより該Pakキナーゼに結合する標的を同定することができる。キナーゼ-標的相互作用を測定するのに適した他の方法は、当業者によく知られているであろう。 Pakキナーゼが標的に作用する能力の測定方法には、例えば、Pakキナーゼが該標的に結合する又はそれをリン酸化する能力のアッセイを含めることが可能である。そのようなアッセイは、前記において及び後記実施例において詳細に記載されている。本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体を有利に使用することが可能な、Pakキナーゼ標的の同定に適した他の方法は、当業者に明らかであろう。本明細書に記載の方法および用途に対する他の適当な修飾および応用は明らかなものであり、本発明またはその任意の実施形態の範囲から逸脱することなくそれらを行なうことが可能である、と関連技術分野の当業者に容易に認められるであろう。以上において本発明を詳しく説明してきたが、以下の実施例を参照することにより本発明はより明瞭に理解されるであろう。これらの実施例は、単なる例示として本明細書に記載されており、本発明を限定するものではない。実施例材料および方法各実施例においては、一般に、以下の材料および方法を用いた。プラスミド mycタグ付きPak1およびRak1^R299の発現にCMVプロモーターを使用するcDNA発現プラスミド［プラスミドpCMV6M(pCMV5の修飾体)に基づくもの］は、既に記載されている(Sells，M.A.ら，Current Biol．7:202-210(1997))。Pak1^L83,L86およびPak1^L83, ^L86,R299 は、所望の突然変異を導入するためにユニーク部位排除（unique-site- elimination）突然変異誘発プロトコールを用いて構築した（Deng，W.P.およびN ickoloff，J.A.，Analyt．Biochem．200:81-88(1992)）。レトロウイルスベクター（ネオマイシン耐性）pZIP-NeoSV(x)1を使用するヒトH-rasおよびK-ras4B発現系を、既に記載されているとおりに調製した（Oldham，S.M.ら，Proc．Nat．Aca d．Sci．(USA)93:6924-6928(1996)）。該挿入遺伝子の発現は、モロニー長末端反復プロモーターから調節される。v-raf発現プラスミドは、既に記載されている（Kohl，N.E.ら，Science 260:1934-1937(1993)）。プラスミドpGEX-2Tに基づくGST-Rac1およびGST-Cdc42細菌発現ベクターは、既に記載されているとおりに調製した（例えば、K．Shinjoら，Proc．Nat．Acad．Sci．(USA)878:9853-9857( 1990)）。細胞培養およびトランスフォーメーションアッセイ Rat-1細胞は、Merckの株コレクションからのものであり、既に記載されている（Kohl，N.E.ら，Science 260:1934-1937(1993)）。NIH3T3細胞は、American Ty pe Culture Collection(ATCC CRL-1658)，Rockville，MDから入手した。10％ウシ胎仔血清（Sigma，St．Louis，MO）、ペニシリン（100単位/ml）およびストレプトマイシン（100mg/ml）で補足された、Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)から購入した高グルコース(4.5g/リットル)のMediatechダルベッコ変法イーグル基礎培地（DMEM）中で、Rat-1細胞を増殖させ、37℃および5% CO₂/95%空気で維持した。DNAのトランスフェクションを、リン酸カルシウム沈殿技術により行なった。2 0μgの全DNA(10μgの各試験DNA、また、単一プラスミドを試験する場合には、10 μgのpUC19プラスミド)を、0.5mlの0.25M CaCl₂および0.5mlの2×BES緩衝食塩水（BBS）と短時間で混合し、室温で10〜20分間インキュベートした。ついで該混合物を、25〜50％コンフルエントの新鮮にフィードされた100mmディッシュの細胞に滴下し、穏やかに回転させ、37℃、5%CO₂で18〜24時間インキュベートした。細胞を増殖培地で２回洗浄し、再フィードし、24〜48時間インキュベートし、ついで100mmディッシュ中に1：5に分割した。トランスフェクション後の培養物に新鮮な増殖培地を週２回フィードした。トランスフェクションの14〜18日後に、10％酢酸/10％メタノール溶液中で固定し、10％エタノール中の0.4％クリスタルバイオレットで該ディッシュを染色することにより、細胞フォーカスを評価した。軟寒天アッセイを、既に記載されているとおりに行なった（Cox，A.D.およびDer，C.J.，Methods Enz．238:277-294(1994) ）。トランスフェクション後の10³個の細胞を、60mmディッシュ上にプレーティングした。12〜15日後、位相差を用いるNikon DIAPhot顕微鏡下でコロニーを検査した。 Pak1,Pak1^R299、Pak1^L83,L86,R299およびPak1^L83,L86を発現する安定なRat-1 細胞系を樹立するために、各構築物をpCDNA3と共にRat-1細胞中にコトランスフェクトした。該トランスフェクト化細胞を、400μg/mlのGeneticin(G418)（GIBC O/BRL，Grand Island，NY）を含有する増殖培地中で選択した。強化化学発光キット（Amersham，Arlingtown Heights，II）において概説されている方法と共に抗mycタグ付きモノクローナル抗体9E10（Calbiochem，Cambridge，MA）を用いる G418選択細胞ライセートのウエスタンブロット（免疫ブロット）分析により、タンパク質の発現レベルを測定した。対照としてのpRSV-β-galと共に、試験するPakおよびRas試験プラスミドでRat -1細胞をトランスフェクトすることにより、トランスフェクション効率アッセイを行なった。トランスフェクションの48時間後、培養細胞をPBSでリンスし、ついで2％ホルムアルデヒドおよび0.2％グルタルアルデヒドを含有するPBS中、4℃で５分間固定した。ついで該細胞をPBSで洗浄し、PBS中の1mg/mlの4-Cl-5-Br-3-インドリル-β-ガラクトシダーゼ（X-gal）、5mMフェリシアン化カリウムおよび2mM MgCl₂を含有する組織化学反応混合物を重層した。ついで、18〜24時間インキュベートした後、細胞をPBSでリンスし、2％ホルムアルデヒドおよび0.2％グルタルアルデヒドを含有するPBS中で15分間固定した。細胞を顕微鏡下で検査し、それらが青変していれば、LacZに関して陽性であると評価した。トランスフェクション効率は5〜10 ％であり、この研究で使用したプラスミドのいずれによっても影響を受けなかった。Rac/Cdc42 結合およびキナーゼアッセイ Pak1に関する生化学的アッセイを、PakプラスミドでトランスフェクトしたCOS 細胞からの抽出物上で行なった。COS-7細胞のリポフェクタミン（Lipofectamine ）媒介一過性トランスフェクションを、製造業者のプロトコール（Life Technol ogies，Inc.，Gaithersburg，MD）に従い行なった。トランスフェクションの18 〜24時間前に、2〜3×10⁵個のCOS細胞を35mmディッシュ上にプレーティングした。合計1.5μgのDNAおよび10μlのリポフェクタミン試薬を、1mlのDMEMを含有（血清の不存在下）するプレートに加えた。５時間後、20％ウシ胎仔血清を含有する1mlのDMEMを加えた。18〜24時間後、該培地を、1 0％ウシ胎仔血清を含有する新鮮なDMEMと交換した。DNAの添加の48〜72時間後、トランスフェクト化COS細胞を冷リン酸緩衝食塩水で洗浄し、40mM Hepes（pH7.4 ）、1% NonidetP-40、100mM NaCl）1mM EDTA、25mM NaF、1mMオルトバナジウム酸ナトリウム、10μg/ml Leupeptin、10μg/mlアプロチニン中で細胞溶解し、12 ,000×g、4℃で25分間遠心分離した（Bagrodia，S.ら，J．Biol．Chem．270:227 31-22737(1995)）。タンパク質濃度は5.3〜7.2mg/mlであった。 Pakキナーゼアッセイは、COS細胞からの免疫沈降物上で以下のとおりに行なった。抽出物を、抗体9E10およびプロテインAビーズと共に4℃で２時間インキュベートした。沈降物を溶解バッファーで３回洗浄した。免疫沈降物を2×リン酸化バッファー（10mM MgCl₂，40mM Hepes，pH7.4）で２回洗浄し、示されている場合には、可溶性GTP結合GST-Cdc42、GST-Rac1（〜5μgのタンパク質）および5μg のミエリン塩基性タンパク質（Sigma）と共に氷上で５分間インキユベートした。10Ciの(γ-³²P)ATP（3000Ci /mmol）および20μM ATP（最終濃度）を加えることによりキナーゼアッセイを開始し、ついで22℃で10分間インキュベートした（Bagrodia，S.ら，J．Biol．Che m．270:22731-22737(1995)）。反応を、2×SDSサンプルバッファーの添加により停止させ、95℃に加熱し、該産物をSDS-PAGE(12%ゲル)上で分離し、オートラジオグラフィーにより可視化した。このアッセイ法の変形も可能である。例えば、Pakを大腸菌（E．coli）または Sf9細胞中で組換え的に発現させ、ついで精製することが可能であろう。そのような場合には、該精製Pakタンパク質を免疫沈降させる必要がなく、溶液中にPak を存在させることなく該アッセイを行なうことが可能であり、酸沈殿／シンチレーションカウントにより又はシンチレーション近接（proximity）アッセイにより産物の単離が可能となる。Pakキナーゼの追加的な生理的タンパク質基質またはそれらの基質の断片を使用することも可能であろう。すべての場合において、 Pakキナーゼの抑制を試験するために試験化合物を該反応混合物に加えることが可能であろう。そのような抑制は、Pakキナーゼ活性自体の直接的な抑制によるか、またはPakキナーゼの刺激に必要なCdc42/Racに対するPak結合の抑制による可能性があるであろう。 RacおよびCdc42結合アッセイを行なうために、50μgの精製GST-Cdc42またはGS T-Rac1を、溶解バッファーと共に室温で15分間インキュベートしていずれかのヌクレオチドを遊離させ、溶解バッファーで洗浄し、ついで1mM GDP-βS［グアノシン-5'-O-(2-チオジホスファート)］またはGTP（10mM MgCl₂を含有する溶解バッファー中）と共に室温で30分間インキュベートし、ついで10mM MgCl₂を含有する溶解バッファーで洗浄して未結合ヌクレオチドを除去した。つぎに、該タンパク質を、10μlのCOS細胞ライセートおよびグルタチオンビーズ（10mM MgCl₂で補足されたもの）と共に4℃で1.5時間インキュベートした（Bagrodia，S.ら，J．B iol．Chem．270:22731-22737(1995)）。沈殿物を、10mM MgCl₂を含有する溶解バッファーで３回洗浄した。結合タンパク質をSDSサンプルバッファー中で溶出し、12％SDS-PAGEおよびウエスタンブロット法に付し、抗mycエピトープモノクローナル抗体9E10でPak1に関してプローブした。JNK およびMAP/JERKキナーゼアッセイ Rat-1細胞のトランスフェクションを、前記のトランスフォーメーションアッセイと同様に行なった。5μgのDNA（1μgのHA-JNK1、HA-ERK1 またはHA-p38;2μgの各試験DNA;単一プラスミドを試験する場合には、2μgのpUC 19プラスミド）を、0.125mlの0.25M CaCl₂および0.125ml 2×BES緩衝食塩水と混合し、室温で10〜20分間インキュベートした。ついで該混合物を、50〜60％コンフルエントの新鮮にフィードされた35mmディッシュの細胞に滴下し、穏やかに混合し、18〜24時間インキュベートした。ついで該細胞を増殖培地で２回洗浄し、再フィードし、24〜48時間インキュベートした。つぎに、トランスフェクト化Ra t-1細胞を冷PBSで２回洗浄し、溶解バッファー中で細胞溶解し、12,000×g、4℃ で30分間遠心分離した。抽出物をHA-抗体（12CA5）およびプロテインAビーズと共に4℃で3〜3.5時間インキュベートした。沈殿物を溶解バッファーで３回洗浄し、2×リン酸化バッファーで２回洗浄した。ついで該沈殿物を5gのGST-c-jun（ Junキナーゼの場合）、MBP（ERXの場合）またはGST-ATF2（p38キナーゼの場合）、10Ciの(γ-³²P)ATP（3000Ci/nmol）および20μM ATP（最終濃度）と共に30℃ で30分間インキュベートした。混合物を溶解バッファーで３回、2×リン酸化バッファーで２回洗浄した。2×SDSサンプルバッファーを加え95℃に加熱することにより、反応を停止させた。すべての実験は少なくとも２回行ない、同様の結果を得た。実施例 1 Pak 突然変異体の構築および特徴づけ本研究では、４個のmycタグ付きPak突然変異体を構築し、特徴づけ、ついで更なる実験に使用した。まず第１のものは、リシン299をアルギンに変換し酵素を触媒的に不活性にするPak1^R299であった（Sells，M.A.ら，Current Biol．7:202 -210(1997);Zhang，S．ら，J．Biol．Chem．270:23934-23936(1995)）。これは、該発現ベクターでトランスフェクトしたCOS細胞からの抽出物上でキナーゼアッセイを行なうことにより確認した（図1A）。Pak1でトランスフェクトした細胞からの抗Pak免疫沈降物はミエリン塩基性タンパク質を効率的にリン酸化したか、Pak1^R299でトランスフェクトした細胞においては、キナーゼ活性は検出されなかった。発現は、ウエスタンブロットを抗体9E10（これは、該アミノ末端上のmy cタグを認識する）でプローブすることにより確認した（図1Bおよび1C）。試験したもう１つの突然変異体は、Cdc42/Rac結合ドメイン内の高度に保存されているヒスチジンがロイシンで置換されたPak1^L83, ^L86 であった。この突然変異体は、Cdc42にもRacにも結合しなかった。結合アッセイは、適当なRacまたはCdc42GST融合タンパク質で沈殿させPak1に関して該沈殿物を抗体9E10でウエスタンブロッティングすることにより行なった（図1Bおよび1C）。また、Pak1^L83,L86は、オーバーレイ（overlay）アッセイおよび酵母ツーハイブリッド（two hybid）アッセイにおいて、RacにもCdc42にも結合しなかった（データは示していない）。図１に示す他の突然変異タンパク質については後記で検討する。実施例 2 キナーゼ欠損PakはRasトランスフォーメーションを抑制する RasトランスフォーメーションにおけるPakの役割を試験するために、本発明者らは、Rat-1繊維芽細胞を使用してヒトK-ras4B（K-ras）によるコトランスフェクション実験を行なった。14〜18日後に該細胞を固定し染色（クリスタルバイオレットによる）したところ、予想どおり、K-rasのみでトランスフェクトしたプレート中には100個を超えるフォーカスが認められた。しかしながら、該トランスフェクションにPak1^R299発現プラスミドを含めた場合には、該プレート中に約 90％少ないフォーカスが認められた（図2A）。野生型Pak1または該ベクタープラスミドは、K-rasトランスフォーメーションを抑制しなかった。Pak1^R299がRat-1 細胞のトランスフォーメーションの非特異的インヒビターであるか否かを試験するために、本発明者らは、v-Rafによるコトランスフェクション実験を行なった（図2B）。本発明者らは、Pak1^R299がRafトランスフォーメーションを抑制しないことを見出した。興味深いことに、該抑制はRat-1細胞に特異的であった。なぜなら、Rat-1細胞の代わりにNIH 3T3細胞を使用した場合には、抑制が認められなかったからである（図2C）。PakがRasまたはRaf発現のレベルを改変するか否かを試験するために、本発明者らは、トランスフェクト化細胞からの抽出物を調製し、Ras、RafおよびPakに関してウエスタンブロットを行なった。該突然変異P akはいずれも、RasまたはRafの発現に影響を及ぼさなかった（図2D）。したがって、Pak1^R299は、Rafによるトランスフォーメーションに影響を及ぼしたりRas発現に影響を及ぼすことなくRat-1細胞のRasトランスフォーメーションを特異的に抑制する。また、本発明者らは、K-rasおよびPak-1プラスミドでコトランスフェクトした後の軟寒天上での増殖を評価することによりトランスフォーメーションを判定した。本発明者らは、K-ras トランスフェクションによる軟寒天プレート上に多数のコロニーを観察した。また、フォーカスアッセイにおいて認められるとおり、本発明者らは、細胞をPak1^R299 でコトランスフェクトした場合には、非常に少数のコロニーを観察した（図 3）。さらに、Pak1^R299の存在下で認められる希少コロニーのほとんどは、K-ras 単独の場合に認められるものより実質的に小さかった。該フォーカスアッセイの場合と同様に、突然変異Pak1^R299の代わりに野生型Pak1を使用した場合や、Rat- 1細胞の代わりにNIH 3T3細胞を試験した場合には、抑制は認められなかった(NIH 3T3細胞に関してはデータを示していない)。典型的には、等しい濃度のK-rasおよびPak1 DNAを細胞中にトランスフェクトした場合には、トランスフォーメーションは、フォーカスアッセイにおいては約90％、軟寒天アッセイにおいては約95 ％抑制された（図3G）。本発明者らは、Pak1^R299がK-rasおよびH-rasによるトランスフォーメーションを抑制するがRafによるトランスフォーメーションは抑制しないことを見出した（H-rasに関してはデータを示していない）。本発明者らはさらに、Pak1およびPak1^R299を発現する安定な細胞系を使用して Ras、RafおよびPakの間の相互作用について検討した。本発明者らは、Rat-1細胞をプラスミドpCDNA3でコトランスフェクトし、Geneticin（G418）耐性細胞系を選択した。本発明者らは、PakのN末端に融合したMycタグに関してウエスタンブロットをプローブすることにより、野生型および突然変異Pakの発現を試験し（図4A）、該安定細胞系のそれぞれが、比較しうるレベルで65kDaの新規タンパク質を発現することを見出した。Pak1発現は増殖速度の僅かな促進を引き起こし、一方、Pak1^R299発現は増殖速度の若干の抑制を引き起こしたが、これらの相違は実験誤差の許容範囲内であった（図4B）。 Pak1突然変異体を発現する細胞系はいずれも、1％血清中（図4C）においても軟寒天上（データは示していない）においても増殖しなかった。Pak1およびPak1^R2 ⁹⁹ の安定発現は、細胞の形態に影響を及ぼした。Pak1を発現する細胞は伸長したが、Pak1^R299細胞は、繊維芽細胞に特徴的な紡錘体の形状を喪失した（図5A〜C ）。Pak1^L83,L86およびPak1^L83,L86,R299もまた、細胞形態の変化を引き起こしたが、その程度は、より低いものであった（図5D〜E）。安定発現のための細胞系を樹立した後、本発明者らは、フォーカスアッセイおよび軟寒天コロニーアッセイの両方を用いる Rasトランスフォーメーションアッセイにおいてそれを試験した。該コトランスフェクション実験から予想されるとおり、Pak1を発現する細胞は対照細胞と同程度に効率的にトランスフォームするが、Pak1^R299を発現する細胞は、K-rasトランスフォーメーションに対して高度に抵抗性であることを、本発明者らは見出した（図6）。用量反応実験において、本発明者らは、Rat-1細胞または野生型Pak1 を発現するRat-1細胞と比較して、Pak1^R299を発現する細胞をトランスフォームするには約10〜100倍多くのK-rasが必要であることを確認した。フォーカス形成（図6A）および軟寒天アッセイ（図6B）の両方において、同様の用量反応曲線を得た。前記のフォーカスアッセイから予想されるとおり、すべての細胞系がRaf により効率的にトランスフォームされた（図6C）。野生型および突然変異Pak1の発現はトランスフェクション効率に影響を及ぼさなかった（データは示していない）。実施例 3 機能的Cdc42/Rac結合ドメインはRas抑制に必要とされない RacはRasトランスフォーメーションに必須であるため、該ドミナントネガティブPak1突然変異体は、RacまたはCdc42を不活性複合体中に隔離することにより、Rasトランスフォーメーションを抑制すると考えられた。このメカニズムを検討するために、本発明者らは、キナーゼ活性を欠損しておりCdc42にもRacにも結合しないPak1突然変異体を試験した。突然変異体Pak1^L83,L86,R299は、キナーゼドメイン中の元のR299の置換と共に、保存されている83位および86位のヒスチジンからロイシンへの置換を有する（図1）。この新たな突然変異は、RacおよびCdc42結合に必要十分な領域であるp21結合ドメイン（PBD）内に存在する。トランスフェクト化COS細胞からの抽出物のウエスタンブロットは、他の突然変異体に匹敵するレベルでの発現を証明した。また、直接測定の場合には、RacまたはCdc42結合は検出されなかった（図1C）。本発明者らは、Pak1^L83,L86,R299突然変異体が、元のPak1^R299と同程度にRas抑制において強力であることを見出した（図3）。用量反応実験においては、Pak1^L83,L ^86,R299 を発現する細胞は、Pak1^R299を発現する細胞と同程度にK-rasトランスフォーメーションに対して抵抗性であった（図6）。本発明者らはまた、RasによってもCdc42によってもそれ以上は促進されない過剰活性（hyperactive）のキナーゼを発現するPak1^L83,L86を試験した。また、Pak3のPBD中の他の保存残基内での突然変異は、過剰活性をもたらす（Bagrodia，S.ら，J．Biol．C hem．270:27995-27998(1995)）。K-rasまたはRafトランスフォーメーションに対する効果は、Pak1^L83,L86では認められなかった。このことは、Rasトランスフォーメーションにおけるその必須の役割にもかかわらず、構成的に活性なPak1が癌遺伝子ではないらしいこと、およびそれが、トランスフォームする細胞において RasまたはRafと協同しないらしいことを示唆している（データは示していない）。実施例 4 Ras 抑制はJNKからは脱共役しているがMAPKシグナリングからは脱共役していない RacおよびRasのシグナリング経路がPakにより影響を受けるか否かを検討するために、本発明者らは、Rat-1細胞におけるJNKおよびMAPキナーゼ活性化に対するPakの効果を測定した。本発明者らは、Racと共にHAタグ付きJNKおよび前記の種々のPak構築物をコトランスフェクトし、該HA抗体でJNKを免疫沈降させ、GST- Jun融合タンパク質のリン酸化を測定した（図7A）。該活性化Rac^L61は、該活性化Pak1^L83,L86と同様に、JNK活性をベクター対照に対して約40倍促進した（図7A 、レーン3、 7、8）。Pak1、Pak1^R299またはPak1^L83,L86,R299による促進は認められなかった（図7A）レーン1、2および9）。突然変異PakがRacによる活性化を抑制するか否かを試験するために、本発明者らは、それらをRac^L61と共にコトランスフェクトした。活性Pak1構築物（Pak1およびPak1^L83,L86）をRac^L61と共にコトランスフェクトした場合には、何ら変化が認められなかった。本発明者らは、Pak1^R299構築物がJNK活性を〜75％抑制することを見出したが、Pak1^L83,L86,R299構築物では、抑制は認められなかった（レーン5および6）。また、JNKの代わりにp38キナーゼを試験した場合（図7D）、およびRat-1細胞の代わりにCOS-7細胞を使用した場合（データは示していない）に、同様のレベルの活性化が認められた。同様に、Pak1^R299はJNKのRas活性化を抑制するが、Pak1^L83,L86,R299はそれを抑制しないことを、本発明者らは見出した（図7B）。RafによるJNKの刺激は認められなかった(図7C)。これらの観察は、RasからRacを経てPak/p38への活性化モデルを支持し、Pak突然変異体がRasトランスフォーメーションを抑制するのにJNK抑制が必須でないことを示唆している。 Pak1がMAPK/ERKキナーゼ経路と相互作用するか否かを判定するために、本発明者らは、Rat-1細胞をHAタグ付きERK1、K-rasおよび前記の種々のPak構築物でコトランスフェクトし、ERK1をHA抗体で免疫沈降させ、ミエリン塩基性タンパク質のリン酸化を測定した（図8）。K-Rasは、ERK活性をベクター対照に対して約35倍促進した（図8A、レーン8、9）。Pak1、Pak1^R299、Pak1^L8 ^3,L86 およびPak1^L83,L86,R299による促進は、それらの単独においてもRac^L61の存在下においても認められなかった（図8A、レーン1〜7；図8B、レーン1〜2）。突然変異体PakがRasによる活性化を抑制するか否かを試験するために、本発明者らは、それらをK-rasと共にコトランスフェクトした。活性Pak1構築物（Pak1およびPak1^L83,L86）をK-rasと共にコトランスフェクトした場合には、変化は認められなかった（図8B、レーン3および5）。本発明者らは、Pak1^R299構築物がERK 活性化を約50％抑制し、Pak1^L83,L86,R299もまたERK活性化を同程度で抑制することを見出した（図8B、レーン4および6）。本発明者らはまた、COS-7細胞において実験を行なった場合に、同様のレベルの活性を認めた（データは示していない）。これらの突然変異体がRaf活性化をも抑制するか否かを試験するために、本発明者らは、ERKキナーゼのRaf活性化に対するそれらの効果を測定した。該Pak構築物のいずれも、ERKのRaf活性化を抑制しなかった（図8C）。これらの観察は、ドミナントネガティブPak1突然変異体が、MAP/ERKキナーゼカスケードを妨げることによりRasトランスフォーメーションを抑制しうることを示唆している。実施例 5 シュワン細胞のトランスフォーメーションおよび神経繊維腫症におけるPakキナーゼの役割神経繊維腫症１型（NF1）は、NF1遺伝子の喪失により生じる一般的な常染色体優性疾患である。該疾患は、神経繊維腫、カフェオレ斑およびいくつかの場合には神経繊維肉腫により臨床的に特徴づけられる。シュワン細胞は、NF1患者において損なわれる一次細胞であると考えられている。NF1がコードするタンパク質であるニューロフィブロミンは、Ras癌遺伝子の負の調節因子であり、したかってニューロフィブロミンの喪失は、活性化Rasレベルの上昇を引き起こす。Rasによる細胞トランスフォーメーションはRacを必要とし、Racのエフェクターの候補体はPakキナーゼである。シュワン細胞のトランスフォーメーションにおけるPakキナーゼの役割を研究するために、Rat-1ラットシシュワン細胞系由来の細胞をPak1 で又はPak1またはRacのドミナントネガティブ突然変異体でトランスフェクトし、Rasトランスフォーメーションアッセイにおいて試験した。RacおよびPak1（Pa k1^R299）のドミナントネガティブ突然変異体は、Rat-1細胞のRasによるトランスフォーメーションを特異的に抑制し、典型的には75〜90％少ないトランスフォーム化コロニーがコトランスフェクト化細胞から認められた（図10）。さらに、Ra cに結合しない突然変異体であるPak1^L83,L86,R299もまた、トランスフォーメーションを抑制した（図10）。これらの結果は、Rasトランスフォーメーションに必要な、Rac以外の追加的なタンパク質に、Pakが結合することを示唆している。 Rasは、MAP/ERKカスケードと、JNK/SAPKの活性化につながる関連カスケードとを活性化することが知られている。JNKの活性化は、RacおよびPakを介して生じる。トランスフォーメーションを抑制するのにいずれのシグナリング経路がPak1 により使用されるのかを検討するために、Pak1ドミナントネガティブ突然変異体の効果を、JNKおよびERKのRas活性化に関して試験した。驚くべきことに、トランスフォーメーションの抑制は、ERKの抑制と相関したが、JNKの抑制とは相関しなかった（図11Aおよび11B ）。このことは、PakとERKとの機能的関連性を示唆している。神経繊維肉腫のモデル系としてのRatシュワン細胞の用途は、Pak1のドミナントネガティブ突然変異体がNF1患者からの神経繊維肉腫細胞系ST88-14の腫瘍形成性復帰を引き起こすという観察により実証された。総合すると、これらの結果は、RacおよびPakが、神経繊維肉腫および神経繊維腫症の患者を治療するための治療剤を設計するための有望な薬理学的標的となりうることを示唆している。全般的な考察本結果は、Pak1が、RacおよびCdc42に加えて、Rasシグナリング経路の必須成分と相互作用することを示している。触媒的に不活性なPak1突然変異体は、Ras トランスフォーメーションに関する２つの十分に確立されたアッセイであるフォーカスアッセイおよび軟寒天アッセイの両方において、Rat-1繊維芽細胞のRasトランスフォーメーションを抑制した。野生型Pak1も過剰活性突然変異体も、細胞をトランスフォームせず、また、RasまたはRafのトランスフォーメーション頻度に有意な影響を及ぼすこともなかった。これらの研究を拡張するために、種々の細胞系を調べて、いずれがPak^R299抑制に感受性であるかを判定した。Pak^R299 は、NIH 3T3細胞のRasトランスフォーメーションに影響を及ぼさないが、Rat-1 ラットシュワン細胞系のRasトランスフォーメーションを抑制することが判明した（Peden，K.W.C.ら，Exp．Cell．Res．185:60-72(1989);未公開の観察）。したがって、ドミナントネガティブPak1は、Rat-1細胞においてはRasを抑制するが、NIH 3T3細胞においては抑制しない（とはいえ、この観察は、Rat-1細胞に特有なものではない）。ほとんどの生物における主要なRasシグナリング経路は、MAPキナーゼカスケードである（Marshall，C.J.，Cell 80:179-185(1995)）。MAPキナーゼのRas活性化を抑制するPak1突然変異体だけがトランスフォーメーションを抑制するため、本結果は、MAP抑制についての役割がPak1抑制に関連していることを裏付けるものである。Pak1^R299は、JNK活性化およびMAP活性化の両方を抑制するが、Pak1^L8 ^3,L86,R299 は、JNKまたはp38活性化を抑制することなくトランスフォーメーションを抑制するため、本研究の結果は、JNK抑制がRas抑制に必ずしも必要でないことを示唆している。興味深いことに、JNKをRac^L61と同程度に活性化するPak1^L83 ^,L86 によるMAPキナーゼの活性化は、検出されていない。また、Pak1^L83,L86が単独で又はRas、RacまたはRafと協同して細胞をトランスフォームしうるという証拠は得られていない。したがって、Rasトランスフォーメーションの非常に強力な抑制にもかかわらず、構成的に活性なPak は癌遺伝子ではない。いくつかの可能性が、これらの観察を説明しうる。Pakは、必須成分を活性化することなく該必須成分に結合しうる。あるいは、Pakは、MAPシグナリングのRa s活性化に要求されるかもしれないが、限定的量（limiting amount）で存在しないかもしれない。最高レベルのJNKおよびp38活性化がRac^L61単独で得られるという観察から、細胞中のPakレベルの飽和に関する証拠が示唆される。すなわち、R ac1とPak1またはPak1^L83,L86とのコトランスフェクションは、それ以上にJNKまたはp38を促進しないのである（図7）。また、Pakを介するMAPの活性化は、トランスロケーションおよび酵素活性化を必要とするかもしれない。最近、PDGF受容体の活性化がSH2ドメイン結合部位を介して膜にアダプタータンパク質Nckをリクルートすることが示された。Nckは今度は、Pakに結合し、該複合体を該膜にトランスロケートするそのSH3ドメインの１つを介してPakを活性化する。興味深いことに、JNK/p38およびMAPは、Pakトランスロケーションにより活性化された（Galisteo，M.L.ら，J．Biol．Chem．271:20997-21000(1996);Lu ，W.ら，Current Biol．7:85-94(1997)）。したがって、PakのトランスロケーションはMAPの活性化に重要と考えられ、それは、過剰活性キナーゼPak1^L83,L86が MAPを活性化しない理由を説明するかもしれない。また、Rho、RacおよびCdc42が MAPシグナリングにおいて示唆されている。なぜなら、それらはいずれも単独ではMAPを活性化しないが、それらすべては活性化Rafと共に相乗的に作用してMAP を活性化するからである（Frost，J.A.ら，Mol．Cell．Biol．16:3707-3713(199 6)）。本データは、Rasトランスフォーメーションにおいて極めて重要な役割を果たすこの受容体/Nck/Rac/Pak/MAP経路に合致する。 Pak1^R299の発現またはPakのN末端半分の発現は、コトランスフェクション実験においてJNKのRacおよびCdc42活性化を抑制する（図7）。さらに、PakのN末端半分は、ERKキナーゼ活性化を抑制する（Frost，J.A.ら，Mol．Cell．Biol．16:37 07-3713(1996)）。抑制のメカニズムは、PBDドメインを介するRacおよびCdc42の隔離（sequestering）を介したものであると提案されている。また、これらの同じ突然変異体はJNK活性化を抑制し、そのため、JNKシグナリングが必要か否かの判定が妨げられた。本研究の結果は、突然変異PakがERKおよびJNKの両方を抑制することを証明している。さらに、それは、R ac/Cdc42の隔離がJNK抑制のためのみに要求される（すなわち、ERK抑制には、Ra c/Cdc42隔離もJNK抑制も要求されない）ことを示唆している。 Ras-Raf-MEK-ERKシグナリング経路は、多数の細胞型において確立されているが、トランスフォーメーションにつながる他の経路かほとんどの細胞に存在し、いくつかの細胞においては、別の経路がRas-Raf経路より優勢となりうる。Rasシグナリングが概ねRaf非依存的である細胞には、NIH 3T3繊維芽細胞、ラット腸上皮細胞およびWistarラット甲状腺細胞の或る種の系が含まれる（Al-Alawi，N.ら，Mol．Cell．Biol．15:1162-1168(1995);Khosravi-Far，R.ら，Mol．Cell．Bio l．16:3923-3933(1996);Oldham，S.M．ら，Proc．Nat．Acad．Sci．（USA）93:6 924-6928(1996)）。これらの各細胞において、Rasは、Raf活性化に非依存的に有糸分裂シグナルを伝達する。本研究において使用するRat-1細胞はRasおよびRaf の両方によりトランスフォームされうるため（図2および6）、それらはRafに非依存的ではない。しかしながら、これらの細胞はPak抑制に感受性であるため、Raf非依存的トランスフォーメーションに関する主要な役割が存在するかもしれない。RasトランスフォーメーションがRaf活性化から脱共役している益々多数の実験系が、別のRas経路の成分が新規抗腫瘤薬の可能な標的であると示唆している。別のRasトランスフォーメーションシグナルを媒介するのにJNKが関与している可能性は、RasがJNKを促進しドミナントネガティブRac突然変異体かRasトランスフォーメーションを抑制するという観察により支持される。しかしながら、いくつかのグループは最近、PAKと相互作用せずその後にJNKを活性化しないRac突然変異体を構築した（Joneson，T.ら，Science 274:1374-1376(1996);Lamarche，N .ら，Cell 67:519-529(1996);Westwick，J.K.ら，Mol．Cell．Biol．17:1324-13 35(1997)）。これらの同じグループは、それらの突然変異Racタンパク質が尚も細胞をトランスフォームし膜ラッフリングを引き起こすことを見出した。したがって、PakおよびJNK活性化はRacトランスフォーメーションに要求されない。Ras トランスフォーメーションにおけるJNKの役割を検討するように計画された研究においては、SEKのドミナントネガティブ突然変異体は、JNK活性化およびRasトランスフォーメーションを抑制するが、MAPのRas活性化を抑制しないことが判明した。このことは、RasトランスフォーメーションにおけるJNKに関する非常に重要な役割を示唆している（Clark，G.J.ら，J．Biol．Chem．272:1677-1681(1997)）。したがって、JNK活性化はRacトランスフォーメーションに必須ではないが、それは、Rasトランスフォーメーションには必須であるらしい。本研究において、MAP 抑制はドミナントネガティブPak突然変異体と相関しておりJNK抑制はそれと相関していないが、これらの結果は、Rasトランスフォーメーションにおける必須の役割からJNKを必ずしも除外するものではない。なぜなら、JNK活性化を抑制した唯一の突然変異体であるPak1^R299はまた、ERK活性化を抑制したからである。この可能性は、MAPを除いてJNKの役割を検討するための本研究におけるPak突然変異体の使用を妨げた。 RasがPakと連絡するメカニズムは、おそらく、GTP結合型Rasにより活性化されるエフェクターを介して作動するのであろう。しかし、該関連タンパク質は未だ同定されていない。Raf が、該関連エフェクターの有力な候補である。なぜなら、Rasトランスフォーメーションを抑制したすべての突然変異体はまた、MAPキナーゼ活性化を抑制したからである。Rafが実際に抑制部位であるならば、該抑制は、活性化突然変異体v -Rafにより迂回される。Pakドミナントネガティブ突然変異体が阻害しうる他の潜在的Rasエフェクターには、Ral GDS、Rin1およびホスファチジル-イノシトール-3-OHキナーゼが含まれ、これらはすべて、Ras-GTPに結合する（Han，L.およびColicelli，J.，Mol．Cell．Biol．15:1318-1323(1995);Hofer，F.ら，Proc． Natl．Acad．Sci．（USA）91:11089-11093(1994);Marshall，M.S.，FASEB J．9: 1311-1318(1995);Rodriguez-Viciana，P.ら，Nature 30:527-532(1994)）。もう１つの潜在的標的はp190Rho GAPである。なぜなら、それはRas GAPと会合するからである（その会合は、JNKのRas活性化を媒介すると提案されている）（Clark ，G.J.ら，J．Biol．Chem．272:1677-1681(1977);Westwick，J.K.ら，Mol．Cell ．Biol．17:1324-1335(1997)）。該ドミナントネガティブPak突然変異体が細胞の形状に及ぼす影響（図5）は、アクチン細胞骨格もまた、PakによるRasトランスフォーメーションの抑制にかかわっている可能性があることを示唆している（Sells，M.A.ら，Current Biol．7:202-210(1997)）。キナーゼ欠損/PBDドメイン突然変異Pakが尚もRasトランスフォーメーションを抑制するという本観察は、Pakが、PBDドメインを介するCdc42/Rac隔離に無関係にRasシグナリング経路と相互作用することを示唆している。少なくとも以下の２つのメカニズムがこれらの観察を説明しうる：（１）Pak1上のRac/Cdc42に対する複数の結合部位、および（２）Rasシグナリングに要求される他のタンパク質とPakとの新たな相互作用。 Rafは、複数の結合部位を有する低分子量Gタンパク質エフェクターの一例である。Raf上の２つの部位がRasと結合する。すなわち、その第１部位は一次（prim ary）結合部位であるらしく、第２部位は、Rasが該第１部位に結合した後に脱マスクされるにすぎない不可解な部位である（Brtva，T.R.ら，Ras．J．Biol．Che m．270:9809-9812(1995);Drugan，J.K.ら，J．Biol．Chem．271:233-237(1996); Hu，C.D.ら，The J．Biol．Chem．270:30274-30277(1995);Zhang，X.F.ら，Natu re 364:308-313(1993)）。Pak1^L83,L86およびPak1^L83,L86,R299に対するRac/Cdc 42結合は検出できなかったが、RacおよびCdc42に対する複数の結合部位がPak1上に存在するという可能性が依然として存在する。RacとRhoとのキメラを使用する最近の研究は、Rac上の２つの部位がPak結合および膜ラッフリングに要求されることを見出している。第１部位（アミノ酸30〜40）はRas上の主要エフェクター領域と等価であり、一方、第２部位(アミノ酸143〜175)は、Ra sの公知エフェクター領域に対応しない(Diekmann，D.ら，EMBO J．14:5297-5305 (1995))。Rac上にはPakに対する２つのエフェクター領域が存在するため、おそらく、Pak上にはRacおよびCdc42に対する複数の結合部位が存在するであろう。しかしながら、Pak1^L83,L86突然変異体によるRac/Cdc42結合は検出されなかったため、Pak上の一次Rac結合部位はPBDドメインであると考えられる。第２のRac結合部位が存在するならば、それは十中八九、単独での有意な結合を支持するものではない。 PakがRasを抑制しうるもう１つのメカニズムは、RacおよびCdc42とは異なるRa sトランスフォーメーションに必須の他のタンパク質を隔離することによるものである。そのような因子は、Pak^R299の場合には非生産的相互作用を引き起こす、C末端中のキナーゼドメインと相互作用しうる。また、Rasに結合しないドミナントネガティブRaf突然変異も構築されており、これはおそらく、下流のキナーゼであるMEKを隔離することにより作用するのであろう（Brtva，T.R. ら，Ras．J．Biol．Chem．270:9809-9812(1995);Van Aelst，L.ら，Proc．Natl ．Acad．Sci．（USA）90:6213-6217(1993)）。同様に、Pak^R299は、MEKKまたはS EKなどの下流キナーゼを隔離しうる。タンパク質-タンパク質相互作用のための他の潜在的部位は、Pak1のN末端に見出され、酸性領域およびSH3ドメインに結合するいくつかのプロリンリッチ領域を含む（Galisteo，M.L.ら，J．Biol．Chem ．271:20997-21000(1996);Sells，M.A.およびChernoff，J.，Cell．Biol．7:162 -167(1997)）。 Pak1の生理的標的の同定は、Ras抑制のメカニズムを解明しうる。哺乳類Pakキナーゼのタンパク質-タンパク質相互作用は十分には理解されていないが、酵母P akホモログであるSte20pは、Cdc42に加えて、接合シグナリング複合体の他のいくつかの成分（Ste5pおよびBemlpを含む）と相互作用する（Leeuw，T.ら，Scien ce 270:1210-1212(1995)）。Ste5pおよびBemlpのホモログは、哺乳類においては未だ同定されていない。以上、理解が明瞭となるよう例示および実施例により本発明を十分にかなり詳しく説明してきたが、本発明またはそのいずれかの具体的な実施形態の範囲に影響を及ぼすことなく条件、製剤化および他のパラメーターの広範かつ均等な範囲内で本発明を修飾または変更することにより本発明を実施することが可能であること、およびそのような修飾または変更は、添付する請求の範囲の範囲内に含まれると意図されることが、当業者には明らかであろう。本明細書中に挙げた全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明に関連した技術分野の当業者の技術水準を示すものであり、各個の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に組み入れられると明示的かつ個別的に示されているのと同程度に、それらを参照により本明細書に組み入れることとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ 9/12 Ａ６１Ｋ 37/52 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (71)出願人フオツクス・チエイス・キヤンサー・センターアメリカ合衆国、ペンシルバニア・19111、フイラデルフイア、ビユローム・アベニユー・7701 (72)発明者フイールド，ジエフリーアメリカ合衆国、ペンシルバニア・19104、フイラデルフイア、マーケツト・ストリート・3700、スイート・300 (72)発明者タン，イーアメリカ合衆国、ペンシルバニア・19104、フイラデルフイア、マーケツト・ストリート・3700、スイート・300 (72)発明者チエン，ツンシユアンアメリカ合衆国、ペンシルバニア・19104、フイラデルフイア、マーケツト・ストリート・3700、スイート・300 (72)発明者チエルノフ，ジヨナサンアメリカ合衆国、ペンシルバニア・19111、フイラデルフイア、ビユローム・アベニユー・7701 (72)発明者ギブズ，ジヤクスン・ビーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】 1. Pakキナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子であって、該Pakキナーゼポリペプチドがキナーゼドメインを含み、該Pakキナーゼポリペプチドが実質的に触媒的に不活性であることを特徴とする核酸分子。 2. 該Pakキナーゼが突然変異Pakキナーゼまたはその断片である、請求項１に記載の核酸分子。 3. 該キナーゼドメインが１以上の突然変異を含む、請求項１に記載の核酸分子。 4. 該突然変異が１以上のヌクレオチドの置換または挿入を含む、請求項３に記載の核酸分子。 5. 第１突然変異が、該Pakキナーゼ中のアミノ酸残基299をコードするコドンに存在する、請求項４に記載の核酸分子。 6. 該第１突然変異が、該Pakキナーゼ中のアミノ酸残基299におけるアルギニン残基の置換である、請求項５に記載の核酸分子。 7. 該PakキナーゼがPak1^R299またはPak1^L83,L86,R299である、請求項６に記載の核酸分子。 8. 請求項１に記載の単離された核酸分子のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子。９．請求項１に記載の核酸分子を含んでなる発現ベクター。 10．請求項９に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。 11．単離されたPakキナーゼポリペプチドの製造法であって、該ポリペプチドの発現を可能にするのに十分な条件下で請求項10に記載の宿主細胞を培養し、該ポリペプチドを単離することを含んでなる製造法。 12．請求項11に記載の製造法により製造された単離されたPakキナーゼポリペプチド。 13．キナーゼドメインを含んでなり、実質的に触媒的に不活性である単離されたPakキナーゼポリペプチド。 14．該キナーゼドメインが１以上の突然変異を含む、請求項13に記載のポリペプチド。 15．該突然変異が１以上のアミノ酸の置換または挿入を含む、請求項14に記載のポリペプチド。 16．第１突然変異が、該突然変異Pakキナーゼ中のアミノ酸残基299に存在する、請求項14に記載のポリペプチド。 17．該第１突然変異が、該Pakキナーゼ中のアミノ酸残基299におけるアルギニン残基の置換である、請求項16に記載のポリペプチド。 18．該PakキナーゼがPak1^R299またはPak1^L83,L86,R299である、請求項17に記載のポリペプチド。 19． Ras癌遺伝子を含む細胞中の該Ras癌遺伝子の活性の抑制方法であって、該方法が、Pakキナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む１以上の単離された核酸分子の有効量を該細胞中に導入することを含んでなり、該Pak キナーゼポリペプチドがキナーゼドメインを含み、該Pakキナーゼポリペプチドが実質的に触媒的に不活性であることを特徴とする方法。 20．細胞のトランスフォーメーションの抑制方法であって、該方法が、Pakキナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む１以上の単離された核酸分子の有効量を該細胞中に導入することを含んでなり、該Pakキナーゼポリペプチドがキナーゼドメインを含み、該Pakキナーゼポリペプチドが実質的に触媒的に不活性であることを特徴とする方法。 21．動物における身体的障害の治療または予防方法であって、該方法が、Pak キナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む１以上の単離された核酸分子の有効量を該動物中に導入することを含んでなり、該Pakキナーゼポリペプチドがキナーゼドメインを含み、該Pakキナーゼポリペプチドが実質的に触媒的に不活性であることを特徴とする方法。 22．前記の単離されたポリヌクレオチドがベクターまたはビリオン中に含有されている、請求項19に記載の方法。 23．該細胞が哺乳動物細胞である、請求項19に記載の方法。 24．該哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項23に記載の方法。 25．該細胞が癌細胞である、請求項19に記載の方法。 26．該癌細胞が、Rasでトランスフォームした癌細胞である、請求項25に記載の方法。 27．該キナーゼドメインが１以上の突然変異を含む、請求項19に記載の方法。 28．該突然変異が１以上のアミノ酸の置換または挿入を含む、請求項27に記載の方法。 29．第１突然変異が該Pakキナーゼのアミノ酸残基299に存在する、請求項27に記載の方法。 30．該第１突然変異が、該Pakキナーゼ中のアミノ酸残基299におけるアルギニン残基の置換である、請求項29に記載の方法。 31．該PakキナーゼがPak1^R299またはPak1^L83,L86,R299である、請求項30に記載の方法。 32． Ras癌遺伝子を含む細胞中の該Ras癌遺伝子の活性の抑制方法であって、請求項13に記載の１以上のPakキナーゼポリペプチドの有効量を該細胞中に導入することを含んでなる方法。 33．細胞のトランスフォーメーションの抑制方法であって、請求項13に記載の１以上のPakキナーゼポリペプチドの有効量を該細胞中に導入することを含んでなる方法。 34．動物における身体的障害の治療または予防方法であって、請求項13に記載の１以上のPakキナーゼポリペプチドの有効量を該動物中に導入することを含んでなる方法。 35．請求項１に記載の１以上の単離された核酸分子とその医薬上許容される担体または賦形剤とを含んでなる医薬組成物。 36．動物における身体的障害の治療または予防方法であって、請求項35に記載の医薬組成物の有効量を該動物に投与することを含んでなる方法。 37．該動物が哺乳動物である、請求項36に記載の方法。 38．該哺乳動物がヒトである、請求項37に記載の方法。 39．該身体的障害が癌または神経学的障害である、請求項36に記載の方法。 40．該癌が癌腫、肉腫、黒色腫または白血病である、請求項39に記載の方法。 41．該肉腫が神経繊維肉腫である、請求項40に記載の方法。 42．該身体的障害がRas関連癌である、請求項36に記載の方法。 43．該身体的障害が神経繊維腫症である、請求項36に記載の方法。 44． Ras癌遺伝子を含む細胞中の該Ras癌遺伝子の活性の抑制方法であって、Pa kキナーゼの活性を抑制する１以上の化合物の有効量を該細胞中に導入することを含んでなる方法。 45．細胞のトランスフォーメーションの抑制方法であって、Pakキナーゼの活性を抑制する１以上の化合物の有効量を該細胞中に導入することを含んでなる方法。 46．動物における身体的障害の治療または予防方法であって、 Pakキナーゼの活性を抑制する１以上の化合物の有効量を該動物中に導入することを含んでなる方法。 47．該細胞が哺乳動物細胞である、請求項44に記載の方法。 48．該哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項47に記載の方法。 49．該細胞が癌細胞である、請求項44に記載の方法。 50．該癌細胞が、改変したRas機能を有する癌細胞である、請求項49に記載の方法。 51．該癌細胞が、突然変異ras癌遺伝子を有する癌、上昇したチロシンキナーゼ活性により特徴づけられる癌細胞、およびNF-1に関連した癌細胞から選ばれる、請求項50に記載の方法。 52．該癌細胞が、突然変異ras癌遺伝子を有する癌細胞である、請求項51に記載の方法。 53．該癌細胞が、Rasでトランスフォームした癌細胞である、請求項49に記載の方法。