ES2327815T3 - 18477, proteina quinasa humana y usos de la misma. - Google Patents
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Abstract
Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una proteína quinasa seleccionada entre: a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID NO: 1, o el inserto de ADNc del plásmido depositado con ATCC como Accession Number PTA-1775; b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO: 2; y c) el complemento de a).
Description
18477, proteína quinasa humana y usos de la
misma.
La invención se refiere a un nuevo ácido
nucleico de proteína quinasa y a secuencias de polipéptidos. También
se proporcionan vectores, células anfitrionas y procedimientos
recombinantes para hacer y usar las nuevas moléculas.
El fosfato estrechamente asociado con una
molécula, por ejemplo, una proteína, se conoce desde el pasado siglo
diecinueve. Desde entonces, se ha encontrado una gran variedad de
enlaces covalentes de fosfato con proteínas. El más común se
refiere a la esterificación de fosfato con serina, treonina y
tirosina enlazándose en menores cantidades con lisina, arginina,
histidina, ácido apártico, ácido glutámico y cisteina. La presencia
de moléculas fosforiladas, por ejemplo proteínas, implica la
existencia de una o más quinasas, por ejemplo, proteínas quinasas,
capaces de hidrolizar diferentes moléculas fosforiladas, por
ejemplo, residuos de aminoácidos fosforilados en proteínas.
Las proteínas quinasas juegan roles críticos en
la regulación de los cambios bioquímicos y morfológicos asociados
con el crecimiento y la división celular (D'Urso y colaboradores
(1990) "Science" 250:786-791; Birchmeier y
colaboradores (1993) "Bioessays" 15:185-189).
Sirven como receptores del factor del crecimiento y como
transductores de señales y se han visto implicadas en la
transformación y malignidad celular. (Hunter y asociados. (1192)
"Cell" 70:375-387; Posada y colaboradores
(1992) "Mol. Biol. Cell" 3:583-592; Hunter y
colaboradores (1194) "Cell" 79:573-582). Por
ejemplo, las proteínas quinasa han demostrado que participan en la
transmisión de las señales procedentes de los receptores del factor
del crecimiento (Strugill y colaboradores (1998) "Nature"
344:715-718; Gómez y colaboradores (1991)
"Nature" 353:170-173), en el control de la
entrada en mitosis de las células (Nurse (1990) "Nature"
344:503-508; Maller (1991) "Curr. Opin. Cell
Biol." 3:269-275) y en la regulación del
agrupamiento de la actina (Husain-Chishti y
colaboradores (1988) "Nature" 334:718-721.
Las proteínas quinasas puede dividirse en
diferentes grupos basándose bien en la similitud de la secuencia de
aminoácido o bien en la especificidad para los residuos de
serina/treonina o de tirosina. También se ha descrito un pequeño
número de quinasas de doble especificidad. Dentro de la amplia
clasificación, las quinasas pueden subdividirse además en familias
cuyos miembros comparten un mayor grado de identidad de la secuencia
de aminoácidos de dominio catalítico y también tienen propiedades
bioquímicas similares. La mayoría de los miembros de las familias
de la proteína quinasa comparten características estructurales fuera
del dominio de la quinasa que reflejan sus particulares roles
celulares. Estos incluyen dominios reguladores que controlan la
actividad o interacción de la quinasa con otras proteínas (Hanks y
colaboradores (1988) "Science" 241:42-52).
Las quinasas reguladas por señales
extracelulares/proteínas quinasas asociadas con microtúbulos
(Erk/MAPK) y las quinasas dirigidas por ciclinas (Cdk) representan
dos grandes familias de quinasas de serina-treonina.
Consulte Songyang y colaboradores (1996) "Mol. Cell. Biol."
16:6486-6493). Ambos tipos de quinasas funcionan en
el crecimiento de las células, en la división de las células y en la
diferenciación de las células, en respuesta a estímulos
extracelulares. Los miembros de la familia Erk/MAPK son
participantes críticos en las vías de señalización extracelular.
Los activadores anteriores así como los componentes de Erk/MAPK son
fosforilados después del contacto de las células con factores del
crecimiento u hormonas o después de los estresores, por ejemplo, el
calor, la luz ultravioleta y las citoquinas inflamatorias. Estas
quinasas transportan mensajes que han sido transmitidos desde la
membrana de plasma hasta el citoplasma mediante quinasas anteriores
al interior del núcleo donde fosforilan los factores de
transcripción y efectúan la modulación de la transcripción de genes
(Karin y asociados (1995) "Curr. Biol."
5:747-757). Los substratos de la familia Erk/MAPK
incluyen c-fos, c-jun, APF2 y los
miembros Elk1, Sap1a y c-Ets-1 de la
familia ETS (citados por Brott y colaboradores (1998) "Proc. Natl
Acad. Sci. USA" 95:963-968.
Las Cdk regulan la transición entre etapas
sucesivas del ciclo de las células. La actividad de estas moléculas
es controlada por eventos de fosforilación y mediante la asociación
con la ciclina. La actividad de las Cdk es negativamente regulada
por la asociación de pequeñas moléculas inhibidoras (Dynlacht,
(1997) "Nature" 389:148 - 152). Las dianas de la Cdk incluyen
varios activadores transcripcionales tales como p110Rb, p107 y
factores de transcripción tales como p53, E2F y ARN polimerasa II,
así como varias proteínas citoesqueletales y proteínas de
señalización citoplásmica (citadas anteriormente en Brott y
colaboradores).
Se ha aislado una proteína en la
Drosophilia, denominada nemo, que tiene homología con
las Erk/MAPK y las Cdk. Se ha informado (Brott y colaboradores,
antes citado) de un homólogo mamífero de nemo, designado
NLK. Esta proteína quinasa se autofosforila y se localiza en una
gran extensión en el núcleo. Esta proteína mostró homología para
ambas familias de quinasas (Erk/MAPK y Cdk). No posee el motivo
característico TXY de fosforilación de las MAPK en el dominio VIII
conservado de la quinasa. En cambio exhibe la secuencia TQE que se
parece a la secuencia THE hallada en algunas Cdk.
Más recientemente, se demostró que la NLK podría
regular las proteínas que contienen el dominio HMG relacionadas con
POP-1. La proteína de señalización Wnt regula
factores de transcripción que contienen dominios de grupos de alta
movilidad (HMG) para dirigir decisiones sobre el destino celular en
el desarrollo de los animales. En el C. elegans, el represor
POP-1 que contiene el dominio del HMG distingue el
destino de las células hijas anteriores del de las células hijas
posteriores a través del desarrollo. La señalización de Wnt regula
la actividad de POP-1 en las células hijas
posteriores, por ejemplo, E. Meneghini y colaboradores, (1999)
"Nature" 399:793-797 muestran que los genes
MOM-4 y LIT-1 eran también
necesarios para regular POP-1 no sólo en E sino en
otras células hijas posteriores. MOM-4 y
LIT-1 son homólogos de los componentes mamíferos de
la vía de la proteína quinasa de activación mitogénica (MAPK) de la
TAK-1 (que transforma la quinasa
beta-activada del factor del crecimiento y la
quinasa similar a nemo (NLK), respectivamente).
MOM-4 y TAK-1 enlazan proteínas
relacionadas que promueven su actividad de quinasa. Los autores del
informe concluyeron que la vía relacionada con la MAPK coopera con
la transducción de la señal de Wnt para regular la actividad de
POP-1.
En un informe adicional del mismo grupo
(Ishitani y colaboradores, (1999) "Nature"
399:798-802) se mostraba que la vía relacionada con
la TAK -1-NLK-MAPK contrarresta la
señalización entre la beta-catenina y el factor de
transcripción del TCF. La vía de señalización de Wnt regula los
procesos de desarrollo a través de un complejo de
beta-catenina y la familia del factor de las
células T/factor potenciador linfoide (TCF/LEF) de los factores de
transcripción de grupos de alta movilidad. Wnt estabiliza la
beta-catenina que luego se une al TCF y activa la
transcripción de los genes. Esta vía de señales se conserva en los
vertebrados, Drosoplilia y C. elegans. En C.
elegans, MOM-4 y LIT-1 regulan
la señalización de Wnt durante la embriogénesis.
MOM-4 es homólogo de la TAK-1 (una
quinasa activada mediante la transformación del factor beta del
crecimiento). LIT-1 es homólogo de la proteína
quinasa quinasa quinasa de activación mitogénica (MAP3K) y de la
quinasa similar a NEMO (NLK) relacionada con la quinasa MAP (MAPK)
en las células de los mamíferos. Esto eleva la posibilidad de que
TAK-1 y NLK estén relacionadas en la señalización de
Wnt en células de los mamíferos. Los autores informaron que la
activación de la TAK-1 estimula la actividad de la
NLK y regula la activación transcripcional intermediada por la
beta-catenina y el TCF. La inyección de NLK suprimió
la inducción de la duplicación de ejes mediante
beta-catenina micro-inyectada en
embriones de Xenopus. Se mostró que la NLK fosforila los
factores TCF/LEF en inhibe la interacción del complejo
beta-catenina-TCF con el ADN.
Consecuentemente, se demostró que la vía similar a
TAK-1-NLK-MAPK
regula negativamente la vía de señalización de Wnt.
Las proteínas quinasas juegan roles críticos en
el crecimiento celular. Por lo tanto, los nuevos polinucleótidos y
proteínas de la proteína quinasa son útiles para modular el
crecimiento, la diferenciación y/o el desarrollo celular. También,
las quinasas tales como 18477 pueden ser importantes en la
carcinogénesis y en la tumorogénesis.
Se suministran moléculas aisladas de ácido
nucleico que se corresponden con secuencias de ácido nucleico de
proteínas quinasas. Adicionalmente, se incluyen secuencias de
aminoácidos que se corresponden con los polinucleótidos. En
particular, la presente invención suministra una molécula aislada de
ácido nucleico que codifica las secuencias de aminoácidos mostradas
en la SEQ ID NO: 2 o las secuencias de polinucleótidos que codifican
la secuencia de aminoácidos depositada en un anfitrión bacteriano
ATCC Accession Number PTA-1775. Además se
suministran péptidos de quinasa que tienen secuencias de
aminoácidos codificadas por las moléculas de ácido nucleico aquí
descritas.
La presente invención también suministra
vectores y células anfitrionas para la expresión recombinante de
las moléculas de ácido nucleico aquí descritas, así como
procedimientos para hacer dichos vectores y células anfitrionas y
para utilizarlos para la producción mediante técnicas recombinantes
de los polipéptidos o los péptidos de la invención.
Las moléculas de quinasa de la presente
invención son útiles para modular el crecimiento celular y/o las
vías metabólicas celulares particularmente para regular una o más
proteínas involucradas en el crecimiento y el metabolismo.
Consecuentemente, en un aspecto, esta invención suministra moléculas
aisladas de ácido nucleico que codifican proteínas de quinasa, así
como fragmentos de ácido nucleico adecuados como iniciadores o
sondas de hibridización para la detección de ácidos nucleicos que
codifican quinasa.
Otro aspecto de esta invención se refiere a una
proteína y a un polipéptido de quinasa aislados o recombinantes.
Las proteínas y polipéptidos de quinasa preferidos poseen al menos
una actividad biológica que posee la quinasa que se produce de
forma natural.
Se suministran anticuerpos que se unen
selectivamente a un polipéptido de quinasa. Dichos anticuerpos son
útiles en la detección de un polipéptido de quinasa así como en la
modulación del crecimiento y el metabolismo celular.
En otro aspecto, la presente invención
suministra un procedimiento para detectar la presencia de la
actividad o la expresión de la quinasa en una muestra biológica
poniendo en contacto la muestra biológica con un agente capaz de
detectar un indicador de la actividad de la quinasa de forma que se
detecte la presencia de la actividad de la quinasa en la muestra
biológica.
En otro aspecto más, la invención suministra un
procedimiento para modular la actividad de la quinasa que comprende
la puesta en contacto de una célula con un agente que module (inhiba
o estimule) la actividad o expresión de la quinasa de forma que se
module la actividad de la expresión de la quinasa en la célula. En
una realización, el agente es un anticuerpo que se une
específicamente a la proteína de quinasa. En otra realización, el
agente modula la expresión de la proteína de quinasa mediante la
modulación de la transcripción de un gen de la quinasa, el corte y
el empalme de un ARNm quinasa o la traducción de un ARNm quinasa. En
otra realización adicional, el agente es una molécula de ácido
nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que es de sentido
contrario a la cadena codificante del ARNm quinasa o del gen de la
quinasa.
En una realización, los procedimientos de la
presente invención se utilizan para tratar a un sujeto que tiene
una afección que se caracteriza por una actividad de la proteína
quinasa o una expresión de ácido nucleico aberrantes mediante la
administración al sujeto de un agente que es un modulador de la
quinasa. En una realización, el modulador de la quinasa es una
proteína de quinasa. En otra realización, el modulador de la quinasa
es una molécula de ácido nucleico de quinasa.
En otro aspecto, la invención suministra un
procedimiento para identificar un compuesto que se une o modula la
actividad de una proteína de quinasa. En general, dichos
procedimientos comprenden la detección de una actividad biológica
de una proteína de quinasa en la presencia y en la ausencia de un
compuesto de ensayo y la identificación de aquellos compuestos que
alteran la actividad de la proteína de quinasa.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de
las reivindicaciones.
Las figuras 1A, 1B y 1C muestran la secuencia de
nucleótidos 18477 (SEQ ID NO: 6) y la secuencia de aminoácido
deducida (SEQ ID NO: 2).
La figura 2 muestra la expresión de 18477 y de
la ciclina B1 en células sincronizadas WI-38 a lo
largo de un transcurso de tiempo de 27 horas.
La figura 3 muestra la expresión de 18477 en
tejidos humanos normales.
La figura 4 muestra los datos de expresión de
Taqman para 18477 en diferentes líneas de células
Xeno-amigas.
La figura 5 muestra la expresión de 18477 y de
la ciclina B1 en líneas celulares del colon.
La figura 6 muestra la predicción PSORT de
localización de proteínas. La predicción es para una localización
nuclear con un potencial motivo de diana vacuolar.
Las moléculas aisladas de ácido nucleico de la
presente invención codifican un polipéptido de proteína quinasa
eucariótica. Las proteínas quinasa eucarióticas (descritas, por
ejemplo, por Hanks y asociados (1995) "FASEB J." 9:
576-596) son enzimas que pertenecen a una familia
extensiva de proteínas que comparten un núcleo catalítico
conservado común para las proteínas quinasas tanto de
serina/treonina como de tirosina. Hay un número de regiones
conservadas en el dominio catalítico de las proteínas quinasa. Una
de estas regiones, situada en la extremidad del terminal N del
dominio catalítico, es una extensión rica en glicina de residuos en
la proximidad de un residuo de lisina, que ha manifestado estar
implicada en la unión de ATP. Otra región, situada en la parte
central del dominio catalítico, contiene un residuo de ácido
aspártico conservado que es importante para la actividad catalítica
de la enzima (Knighton y asociados (1991) "Science" 253:
407-414). Para esta región se han descrito dos
patrones de signatura: uno específico para las serina/treonina
quinasas y uno para las tirosina quinasas.
Los polipéptidos de la proteína quinasa
eucariótica pueden incluir una de las siguientes secuencias de
consenso (SEQ ID NOS: 3, 4 y 5, respectivamente):
La presente invención se basa, al menos en
parte, en la identificación de un nuevo ácido nucleico de proteína
quinasa y en moléculas de polipéptido que pueden jugar un rol, o una
función, en la señalización de las vías asociadas con el
crecimiento celular y/o las vías metabólicas celulares y/o una
infección viral productiva. Estas vías metabólicas y del
crecimiento se describen en Lodish y colaboradores (1995)
"Molecular Cell Biology" (Scientific American Books Inc., New
York, N.Y.) y "Stryer Biochemistry", (W. H. Freeman, New
York).
La proteína quinasa 18477 puede modular la
fosforilación en una amplia variedad de tejidos y células que
incluyen, aunque no en sentido limitativo, muestras clínicas
tumorales de islotes, piel, endotelio, mama, colon, hígado,
cerebro, corazón, riñón, músculos esqueletales, traquea, aorta,
tejido adiposo, intestino delgado, testículo, placenta, hígado
fetal, corazón fetal, cuello uterino, timo, amígdalas, ganglio
linfático y pulmón. Además, la quinasa está regulada por el ciclo
celular en células WI-38 (G2/M). Se han utilizado
datos de Taqman para confirmar datos de expresión de matriz que
muestran la expresión de 18477 regulada en la fase
S-G2/M de células WI-38
sincronizadas. El gen ha demostrado ser similar a la CEK1 (S.
pombe) y la proteína de supresión tumoral, papiloma (D.
melanogaster). La CEK1 ha sido relacionada en progresión de
anafase con la levadura de fisión. El papiloma es un homólogo de la
quinasa humana de distrofia miotónica y es necesario para el control
de la forma y la proliferación celular. El gen ha sido mapeado en
el cromosoma humano 10 con un cromosoma sintético mo 18. GAAT13D02
(5cR) D10S593 (12.6cR) son marcadores flanqueantes. Las
mutaciones/loci próximos incluyen el adenocarcinoma 1 de la
próstata humana; el SCIDA, inmunodeficiencia severa combinada, tipo
ATHABASCAN; IDDM10, diabetes mellitas, dependiente de la insulina,
10; RDPA, enfermedad de REFSUM con pipecolicacidemia aumentada;
OB10, obesidad, susceptibilidad a, sobre el cromosoma 10; ratón: AX,
ataxia, TW, "twirler"; LAH, cabello lanceolado; NIDD2,
diabetes mellitas 2 no dependiente de la insulina. Los genes
conocidos próximos incluyen MGA1, DNMT2, CREM y CACNB2.
Además, las quinasas de la presente invención
son dianas de medicamentos descritos pro Goodman y Gilman (1996)
"Pharmacological Basis of Therapeutics" (9ª edición) Hartman
& Limbard Editors.
Las quinasas de la invención contienen dominios
o motivos, identificados por procedimientos rutinarios de
exploración de la homología, por ejemplo, en ProDom, Pfam Prosite,
MEMSAT y PSORT. Dicho análisis ha identificado un dominio de
proteína quinasa eucariótica para las quinasas de la presente
invención.
En la figura 6 se muestra la predicción PSORT de
localización de la proteína para la proteína quinasa 18477 y se
predice la localización nuclear con un motivo de localización
vacuolar potencial. Un análisis de patrones en Prosite muestra una
signatura del sitio activo de proteína quinasa de serina/treonina.
Una búsqueda de dominios completos en Pfam muestra una alta
puntuación para los dominios de la proteína quinasa eucariótica y
alguna homología con el dominio del terminal C de la proteína
quinasa.
El término "quinasa" incluye una proteína,
un polipéptido u otra molécula no proteinácea que sea capaz de
modular su propio estado de fosforilación o el estado de
fosforilación de una proteína, un péptido u otra molécula diferente
no proteinácea. Sin embargo, el término "quinasa", cuando se
refiere a las proteínas o a los polipéptidos de la invención, se
refiere a una proteína quinasa, ya que las quinasas de la invención
son proteína quinasas.
Las quinasas pueden tener una especificidad (es
decir, una especificidad para fosforilar) para residuos de
serina/treonina, residuos de tirosina o residuos tanto de
serina/treonina como de tirosina, por ejemplo las quinasas de doble
especificidad. Tal como aquí se denominan, las quinasas, tales como
las proteínas quinasas, incluyen preferiblemente un dominio
catalítico de aproximadamente 200-400 residuos de
aminoácidos de longitud, preferiblemente aproximadamente
200-300 residuos de aminoácidos de longitud o más
preferiblemente aproximadamente 250-300 residuos de
aminoácidos de longitud, que incluye preferiblemente
5-20, más preferiblemente 5-15 o más
preferiblemente 11 motivos altamente conservados o sus dominios
separados por secuencias de aminoácidos con conservación reducida o
mínima. La especificidad de una quinasa para la fosforilación bien
de tirosina o bien de serina/treonina puede predecirse mediante la
secuencia de dos de los subdominios (VIb y VIII) en los cuales se
conservan diferentes residuos en cada clase (según se describe, por
ejemplo, por Hanks y colaboradores (1998) "Science" 241:
42-52. Estos subdominios también se describen aquí
con mayor detalle.
Las quinasas juegan un rol en las vías de
señalización asociadas con el crecimiento celular. Por ejemplo, las
proteínas quinasas están involucradas en la regulación de la
transmisión de señales desde receptores celulares, por ejemplo, los
receptores del factor de crecimiento, en la entrada en mitosis de
las células y en la regulación de la función del citoesqueleto, por
ejemplo, el agrupamiento de la actina.
Ensayos para la medición de la actividad de la
quinasa son bien conocidos en la técnica dependiendo de la quinasa
en particular. Protocolos de ensayo específicos están disponibles en
fuentes estándar conocidas por aquellos expertos en la materia. Por
ejemplo, consulte "Kinases" en Ausubel y colaboradores, eds.
(1994-1998) "Current Protocols in Molecular
Biology" (3) y en las referencias aquí citadas;
http://www.sdsc.edu/Kinases/pkr/pkprotocols.html; y
http://www.sdsc.edu/Kinases/pkr/pkprotocols/tyr.synpepassay.html
La inhibición o sobreestimulación de la
actividad de las quinasas involucradas en las vías de señalización
asociadas con el crecimiento celular pueden tender a perturbar el
crecimiento celular, lo que a su vez tiende a producir enfermedades
relacionadas con el crecimiento celular. Según aquí se utiliza, una
"enfermedad relacionada con el crecimiento celular" incluye
una enfermedad, afección o estado caracterizado por una
desregulación, por ejemplo, una sobrerregulación o una
subregulación, del crecimiento celular. La desregulación del
crecimiento celular puede ser debida a la desregulación de la
proliferación celular, de la progresión del ciclo celular, de la
diferenciación celular y/o de la hipertrofia celular. Ejemplos de
enfermedades relacionadas con el crecimiento celular, incluyen
enfermedades cardiovasculares tales como la insuficiencia cardíaca,
la hipertensión, la fibrilación atrial, la cardiomiopatía dilatada,
la cardiomiopatía idiopática o la angina; las enfermedades
proliferativas o las enfermedades diferenciativas tales como el
cáncer, por ejemplo, el melanoma, el cáncer de próstata, el cáncer
cervical, el cáncer de mama, el cáncer de colon o el sarcoma.
También se incluyen las enfermedades asociadas con células o
tejidos viralmente infectados. Las composiciones son útiles para le
tratamiento de una infección viral, tal como una infección de un
virus de ADN, incluyendo, aunque no en sentido limitativo, el
HBV.
La proteína quinasa 18477 se expresa en muestras
clínicas tumorales de isletas, piel, endotelio, mama, colon,
hígado, cerebro, corazón, riñón, mama, colon, músculo esqueletal,
tráquea, aorta, tejido adiposo, intestino delgado, testículo,
placenta, hígado fetal, corazón fetal, cuello uterino, timo,
amígdala, ganglio linfático y pulmón. La expresión del gen es
particularmente relevante en la progresión del ciclo celular y en la
diferenciación celular, y consecuentemente, es particularmente
relevante para el desarrollo, la diferenciación y la carcinogénesis.
18477 es una quinasa regulada por el ciclo celular. Se ha
comprobado que se reduce 2-5 veces en tumores de
colon 9/11 en comparación con tejidos normales del colon (figura 5).
El gen se expresa en muestras clínicas de tumores que incluyen,
aunque no en sentido limitativo, mama, colon y pulmón. Muchos genes
regulados por el ciclo celular pueden considerarse protooncogenes.
Los genes regulados por el ciclo celular controlan la proliferación
celular. Así, la modulación de estos genes y sus actividades
reguladoras pueden permitir el control de la proliferación y la
invasión de células tumorales. Consecuentemente, la invención
presentada se refiere a procedimientos y composiciones para la
modulación, diagnosis y tratamiento de enfermedades asociadas con
los tejidos en los cuales se expresa el gen, y particularmente, en
la carciogénesis especialmente en mama, colon y pulmón.
La presente invención se basa, al menos en
parte, en la identificación de una nueva proteína quinasa y de las
moléculas de ácido nucleico que la codifican, que comprenden una
familia de moléculas que tienen ciertas características
estructurales y funcionales conservadas. El término "familia"
cuando se refiere a la proteína y a las moléculas de ácido nucleico
de la invención tiene la intención de significar dos o más proteínas
de ácido nucleico que tienen un dominio o motivo estructural común
y que tienen suficiente identidad de la secuencia de nucleótidos o
de aminoácidos, según aquí se define. Los miembros de dicha familia
pueden producirse de forma natural o no natural y pueden ser bien
de la misma o bien de diferentes especies. Por ejemplo, una familia
puede contener una primera proteína de origen humano así como otras
proteínas distintas de origen humano o, alternativamente, puede
contener homólogos de origen no humanos. Los miembros de una familia
también pueden tener características funcionales comunes.
La invención se refiere a una molécula de ácido
nucleico de proteína quinasa, preferiblemente una molécula de
proteína quinasa humana, identificada basándose en un motivo de
consenso o característica de dominio de la proteína de la familia
de proteínas de la proteína quinasa.
El gen de quinasa de la invención se identificó
en bibliotecas de ADNc humano. Los clones, a los cuales se dirige
la presente invención, contienen un trascripto que tiene una
secuencia de ADNc correspondiente que se pone en manifiesto en la
SEQ ID NO: 1. Este trascripto tiene un marco abierto de lectura de
nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que se pone
de manifiesto en la SEQ ID NO: 2, respectivamente.
Un plásmido que contiene el inserto de ADNc de
18477 se depositó en la American Type Cultura Collection (ATCC),
10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, el 19 de abril de
2000, y se le asigno el Accesión Number PTA-1775.
Este depósito se mantendrá bajo los términos del tratado de Budapest
sobre el reconocimiento internacional de Depósito de
microorganismos para propósitos de procedimiento de patente. Este
depósito se efectuó simplemente para comodidad de aquellos expertos
en la materia.
Los polipéptidos de quinasa preferidos de la
presente invención tienen una secuencia de aminoácidos idéntica a
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o de uno de sus
dominios.
Consecuentemente, otra realización de la
invención se refiere a proteínas y polipéptidos de quinasa aislados
que tienen actividad de proteína de quinasa. Según se utiliza aquí
de forma intercambiable, una "actividad de proteína de
quinasa", "actividad biológica de una proteína de quinasa" o
"actividad funcional de una proteína de quinasa" se refiere a
una actividad ejercida por una proteína, polipéptido o molécula de
ácido nucleico de quinasa sobre una célula sensible a la quinasa
según se determina in vivo o in vitro, de acuerdo con
técnicas de ensayo estándar. Una actividad de quinasa puede ser una
actividad directa, tal como la autofosforilación o una asociación
con o una actividad enzimática sobre una segunda proteína, tal como
sobre c-fos, c-jun, APF2, y los
miembros Elkl, Sapla y c-Ets de la familia ETS, u
otros factores de transcripción, dianas de la función o de la
interacción de Cdk, tales como la ciclina, las moléculas pequeñas
inhibidoras analizadas en Dynlacht, anteriormente, y en Nigg
((1995) "Bioessays" 17: 471-480), coactivadores
transcripcionales tales como p110Rb y p107 y factores de
transcripción tales como p53, E2F, y ARN polimerasa II, proteínas
citoesqueletales y proteínas de señalización citoplásmica como las
anteriormente citadas en Brott y colaboradores, factores TCF/LEF,
POP-1 y otras proteínas que contienen el dominio
HMG, o una actividad indirecta, tal como una actividad de
señalización celular intermediada por las vías Wnt o MAPK, por
ejemplo, tal como se analizó anteriormente. En una realización
preferida, la actividad de la quinasa incluye al menos una o más de
las siguientes actividades: (1) la modulación (estimulación y/o
potenciación o inhibición) de la proliferación, el crecimiento y/o
el metabolismo celular (por ejemplo, en aquellas células en las
cuales se expresa la secuencia, incluyendo células infectadas por
virus); (2) la regulación de la transmisión de señales desde los
receptores celulares, por ejemplo, los receptores del factor del
crecimiento; (3) la modulación de la entrada en mitosis de las
células; (4) la modulación de la diferenciación celular; (5) la
modulación de la muerte de las células y (6) la regulación de la
función del citoesqueleto, por ejemplo, el agrupamiento de la
actina.
Una molécula de ácido nucleico o proteína de
quinasa "aislada" o "purificada", o una parte
biológicamente activa de las mismas, está substancialmente libre de
otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante
técnicas recombinantes, o substancialmente libre de precursores
químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza
químicamente. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está
libre de secuencias (preferiblemente secuencias que codifican
proteínas) que planteen de forma natural el ácido nucleico (es
decir, las secuencias situadas en los extremos 5' y 3' del ácido
nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el
ácido nucleico. Para los propósitos de la invención, cuando se
utiliza "aisladas" para referirse a moléculas de ácido
nucleico se excluyen los cromosomas aislados. Por ejemplo, en varias
realizaciones, la molécula aislada de ácido nucleico de quinasa
puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1
kb, 0,5 kb o 0,1 kb de las secuencias de nucleótidos que flanquean
de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico
de la célula de la cual se deriva el ácido nucleico. Una proteína de
quinasa que está substancialmente libre de material celular incluye
preparaciones de proteína de quinasa que tienen menos de
aproximadamente un 30%, un 20%, un 10% o un 5% (de su peso en seco)
de proteína diferente a la quinasa (también denominada de ahora en
adelante "proteína contaminante"). Cuando la proteína de
quinasa o una de sus partes biológicamente activa se produce de
forma recombinante, preferiblemente, el medio de cultivo representa
menos de aproximadamente el 30%, el 20%, el 10% o el 5% del volumen
de la preparación de la proteína. Cuando se produce la proteína de
quinasa mediante síntesis química, preferiblemente las preparaciones
de la proteína tienen menos de aproximadamente un 30%, un 20%, un
10% o un 5% (del peso en seco) de precursores químicos o productos
químicos diferentes a la quinasa.
En las siguientes subsecciones se describen con
mayor detalle diferentes aspectos de la invención.
Un aspecto de la invención pertenece a una
molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína de quinasa así como una
molécula de ácido nucleico suficiente para su utilización como
sonda de hibridización para identificar ácidos nucleicos que
codifican quinasa (por ejemplo, ARNm de quinasa) y fragmentos para
su uso como iniciadores de PCR para la amplificación o mutación de
las moléculas del ácido nucleico de la quinasa. Tal como aquí se
utiliza, el término "molécula de ácido nucleico" tiene la
intención de incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN
genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo ARNm) y análogos del ADN
o del ARN generados usando análogos de nucleótidos. Las moléculas de
ácido nucleico pueden ser de cadena simple o de cadena doble,
preferiblemente son ADN de cadena doble.
Una secuencia de nucleótidos que codifica la
proteína de quinasa de la presente invención incluye la secuencia
que se manifiesta en la SEQ ID NO: 1 y el complemento de la misma.
Por "complemento" se entiende una secuencia de nucleótidos que
es suficientemente complementaria para dar una secuencia de
nucleótidos tal que pueda hibridizarse en la secuencia de
nucleótidos dada para formar así un dúplex estable. La
correspondiente secuencia de aminoácidos para la proteína de
quinasa codificada por la secuencia de nucleótidos se pone de
manifiesto en la SEQ ID NO: 2.
Puede utilizarse un fragmento de una secuencia
de nucleótidos de quinasa como sonda de hibridización o iniciador
de PCR utilizando procedimientos analizados más adelante.
Las secuencias de nucleótidos de quinasa de la
invención pueden utilizarse como sondas y/o iniciadores para
identificar y/o clonar homólogos de la quinasa en otros tipos de
células, por ejemplo, a partir de otros tejidos, así como homólogos
de la quinasa a partir de otros mamíferos. Dichas sondas pueden
utilizarse para detectar trascriptos o secuencias genómicas que
codifican las mismas o idénticas proteínas. Estas sondas pueden
utilizarse como parte de un equipo de prueba de diagnóstico para
identificar células o tejidos que expresen mal una proteína de
quinasa, tal como mediante la medición de los niveles de un ácido
nucleico que codifica la quinasa en una muestra de células de un
sujeto, por ejemplo, detectando los niveles de ARNm de la quinasa o
determinando si ha mutado o se eliminado un gen de quinasa
genómico.
De esta forma, procedimientos tales como la PCR,
hibridización y similares pueden utilizarse para identificar dichas
secuencias que tienen substancialmente identidad con las secuencias
de la invención. Consulte, por ejemplo, Sambrook y colaboradores
(1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2ª edición,
Cold Spring Harbor Laboratory Press; Plainview, NY) e Innis y
colaboradores (1990) "PCR Protocols: A Guide to Methods and
Applications" (Academia Press, NY). Las secuencias de nucleótidos
de quinasa basadas en su identidad de secuencia para las secuencias
de nucleótidos de quinasa aquí manifestadas o para fragmentos y
variantes de los mismos están comprendidas por la presente
invención.
En un procedimiento de hibridización, puede
utilizarse toda o parte de una secuencia conocida de nucleótidos de
quinasa para detectar ADNc o bibliotecas genómicas. Procedimientos
para la construcción de dichos ADNc y bibliotecas genómicas son
generalmente conocidos en la técnica y se presentan en Sambrook y
colaboradores (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"
(2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Plainview, NY).
Las denominadas sondas de hibridización pueden ser fragmentos de ADN
genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros
oligonucleótidos, y pueden estar etiquetados con un grupo detectable
tal como P^{32}, o cualquier otro marcador detectable, tal como
otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un
cofactor enzimático. Pueden hacerse sondas para hibridización
etiquetando oligonucleótidos sintéticos basados en las secuencias
conocidas de nucleótidos de quinasa aquí presentadas. Adicionalmente
también pueden utilizarse iniciadores degenerados diseñados sobre
la base de residuos conservados de nucleótidos o aminoácidos en una
secuencia conocida de nucleótidos de quinasa o en una secuencia
codificada de aminoácidos. La sonda comprende típicamente una
región de secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones
rigurosas hasta al menos aproximadamente 12, preferiblemente
aproximadamente 25, más preferiblemente aproximadamente 50, 75, 100,
125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 ó 400 nucleótidos consecutivos de
una secuencia de nucleótidos de quinasa de la invención o un
fragmento o variante de la misma. La preparación de sondas para la
hibridización es generalmente conocida en la técnica y se presenta
en Sambrook y colaboradores (1989) "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual" (2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory
Press; Plainview, NY).
Tal como aquí se utiliza, el término "se
hibridiza bajo condiciones rigurosas" tiene la intención de
describir condiciones para la hibridización y el lavado bajo las
cuales las secuencias de nucleótidos que tengan al menos un 60%, un
65%, un 70%, preferiblemente un 75% de identidad con cada una de las
otras permanecen hibridizadas entre sí. Dichas condiciones
rigurosas son conocidas por aquellos expertos en la materia y pueden
encontrarse en "Current Protocols in Molecular Biology" (John
Wiley & Sons, New York (1989)), 6.3.1-6.3.6. Un
ejemplo preferido no limitativo de condiciones rigurosas de
hibridización es la hibridización en 6X del cloruro de
sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguida por uno
o más lavados en 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 50-65ºC. En
otra realización preferida, condiciones rigurosas comprenden la
hibridización en 6X de SSC a 42ºC, seguida por el lavado de 1X de
SSC a 55ºC. Preferiblemente, una molécula aislada de ácido nucleico
que se hibridiza bajo condiciones rigurosas en una secuencia de
quinasa de la invención se corresponde con una molécula de ácido
nucleico que se produce de forma natural. Tal como aquí se utiliza,
una molécula de ácido nucleico "que se produce de forma
natural" se refiere a una molécula de ARN o de ADN que tiene una
secuencia de nucleótidos que se produce en la naturaleza (por
ejemplo, codifica una proteína natural).
Así, además de la secuencias de nucleótidos de
quinasa aquí presentadas, las moléculas aisladas de ácido nucleico
de la invención también comprenden secuencias de ADN homólogo
identificadas y aisladas a partir de células y/u organismos
mediante hibridización con las secuencias completas o parciales
obtenidas a partir de la secuencia de nucleótidos de quinasa aquí
presentada.
La invención también comprende moléculas de
ácido nucleico que forman estructuras helicoidales triples. Por
ejemplo, la expresión del gen de la quinasa puede ser inhibida
mediante el reconocimiento de las secuencias de nucleótidos
complementarias a la región reguladora del gen de la quinasa en
células diana. Consulte de forma general, Helene (1991)
"Anticancer Drug Des." 6(6): 569; Helene (1992) Ann.
N.Y. Acad. Sci. 660: 27; y Maher (1992) "Bloassays"
14(12): 807.
En realizaciones preferidas, las moléculas de
ácido nucleico de la invención pueden modificarse en el grupo de
base, en el grupo de azúcar o en el esqueleto de fosfato para
mejorar, por ejemplo, la estabilidad, la hibridización o la
solubilidad de la molécula. Por ejemplo, puede modificarse el
esqueleto de fosfato de desoxirribosa de los ácidos nucleicos para
generar ácidos nucleicos peptídicos (consulte Hyrup y colaboradores
(1996) "Bioorganic & Medicinal Chemistry" 4:5). Según aquí
se utilizan, los términos "ácidos nucleicos peptídicos" o PNA
se refieren a copias gemelas del ácido nucleico, por ejemplo copias
gemelas del ADN, en las cuales el esqueleto de fosfato de
desoxirribosa se sustituye por un esqueleto pseudo peptídico y
solamente se conservan cuatro nucleobases naturales. El esqueleto
neutro de los PNA ha demostrado que permite la hibridización
específica en ADN y ARN bajo condiciones de baja fuerza iónica. La
síntesis de oligómeros del PNA puede realizarse usando protocolos
estándar de síntesis peptídica de fase sólida según se describe en
Hyrup y colaboradores (1996) supra;
Perry-O'Keefe y colaboradores (1996) "Proc. Natl.
Acad Sci. USA" 93: 14670.
Los PNA de una molécula de quinasa pueden
utilizarse en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Los PNA
puede utilizarse como agentes antisentido o antígenos para la
modulación específica de la secuencia de la expresión genética, por
ejemplo, induciendo la detención de la transcripción o traducción o
inhibiendo la replicación. Los PNA de la invención también pueden
utilizarse, por ejemplo, en el análisis de mutaciones simples de
pares de bases en un gen, por ejemplo, mediante el pinzamiento de la
PCR dirigido por el PNA, como enzimas de restricción artificial
cuando se utiliza en combinación con otras enzimas, por ejemplo, S1
nucleasas (Hyrup (1996), supra) o como sondas o iniciadores
para secuenciación e hibridización del ADN (Hyrup (1996), supra;
Perry-O'Keefe y colaboradores (1996),
supra).
En otra realización, pueden modificarse los PNA
de una molécula de quinasa, por ejemplo, para mejorar la
estabilidad, especificidad o captación celular, uniendo un grupo
lipófilo u otros grupos cooperantes al PNA, mediante la formación
de quimeras de PNA-ADN, o mediante el uso de
liposomas u otras técnicas de administración de medicamentos
conocidas en la técnica. La síntesis de quimeras de
PNA-ADN puede realizarse según se describe en Hyrup
(1996), supra; Finn y colaboradores (1996) "Nucleic Acids
Res." 24(17): 3357-63; Mag y colaboradores
(1989) "Nucleic Acids Res." 17: 5973; y Peterser y
colaboradores (1975) "Bioorganic Med. Chem. Lett." 5: 1119.
Las proteínas de quinasa están también incluidas
dentro de la presente invención. Por "proteína de quinasa" se
quiere dar a entender una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos manifestada en la SEQ ID NO: 2.
Puede utilizarse un péptido de quinasa aislado
de la invención como un inmunógeno para generar anticuerpos que se
unan a las proteínas de quinasa usando técnicas convencionales para
la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Puede
utilizarse la proteína de quinasa de longitud completa o,
alternativamente, la invención suministra fragmentos peptídicos
antigénicos de la proteína de quinasa para uso como inmunógenos. El
péptido antigénico de la proteína de quinasa comprende al menos 8,
preferiblemente 10, 15, 20 ó 30 residuos de la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 y comprende un epítopo de
una proteína de quinasa, de tal forma que un anticuerpo levantado
contra el péptido forme un complejo inmune específico con la
proteínas de quinasa. Los epítopos preferidos comprendidos por el
péptido antigénico son regiones de una proteína de quinasa que
están situadas sobre la superficie de la proteína, por ejemplo,
regiones hidrófilas.
Consecuentemente, otro aspecto de la invención
pertenece a los anticuerpos antiquinasa policlonales y monoclonales
que se unen a una proteína de quinasa. Los anticuerpos policlonales
antiquinasa pueden prepararse inmunizando un sujeto adecuado (por
ejemplo, un conejo, una cabra, un ratón u otro mamífero) con el
inmunógeno de la quinasa. El título del anticuerpo antiquinasa en
el sujeto inmunizado puede monitorizarse a lo largo del tiempo
mediante técnicas convencionales, tal como un ensayo de
inmunosorbente unido a la enzima (ELISA) usando proteína de quinasa
inmovilizada. En un período de tiempo adecuado después de la
inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de anticuerpos
antiquinasa están en lo más alto, pueden obtenerse células
productoras de anticuerpos a partir del sujeto y utilizarse para
preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales,
tal como la técnica del hibridoma originalmente descrita por Kohler
y Milstein (1975) "Nature" 256: 495-497, la
técnica del hibridoma de las células B humanas (Kozbor y
colaboradores (1983) "Immunol. Today" 4: 72), la técnica del
hibridoma EBV (Cole y colaboradores (1985) "in Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy", ed. Reisfeld and Sell (Alan R.
Liss, Inc., New York, NY), pág. 77-96) o técnicas de
trioma. La tecnología para producir hibridomas es bien conocida
(consulte de forma general Coligan y colaboradores, eds. (1994)
"Current Protocols in Immunology" (John Wiley & Sons, Inc.
New York, NY); Gafre y colaboradores (1977) "Nature" 266:
55052; Kenneth (1980) "in Monoclonal Antibodies: A New Dimension
in Biological Analyses" (Plenum Publishing Corp., NY; y Lemer
(1981) "Yale J. Biol. Med.", 54: 387-402).
Alternativamente a la preparación de hibridomas
que segregan anticuerpos monoclonales, puede identificarse un
anticuerpo antiquinasa monoclonal y aislarse mediante la detección
de una biblioteca de inmunoglobulina combinatorial recombinante
(por ejemplo, una biblioteca de expresión de fagos de anticuerpos)
con una proteína de quinasa para aislar así los miembros de la
biblioteca de la inmunoglobulina que se unen a la proteína de
quinasa. Los equipos para generar y detectar bibliotecas de
expresión de fagos están comercialmente disponibles (por ejemplo,
el Recombinant Phage Antibody Sistem, de Pharmacia, núm. de
Catálogo 27-9400-01; y el
SurfZAP & Phage Display Kit de Stratagene, núm.
de Catálogo 240612). Adicionalmente, pueden encontrarse ejemplos de
procedimientos y reactivos particularmente adecuados para su uso en
la generación y detección de bibliotecas de expresión de
anticuerpos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. núm. 5.223.409; en
las publicaciones de PCT núm. WO 92/18619; WO 91/17271; WO
92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690 y WO
90/02809; en Fuchs y colaboradores (1991) "Bio/Technology" 9:
1370 -1372; Hay y colaboradores (1992) "Hum. Antibod.
Hybridomas" 3: 81-85; Huse y colaboradores (1989)
"Science" 246: 1275-1281; Griffiths y
colaboradores (1993) "EMBO J." 12:
725-734.
725-734.
Adicionalmente, dentro del alcance de la
invención están anticuerpos antiquinasa recombinantes, tales como
anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden
partes tanto humanas como no humanas que pueden hacerse mediante
técnicas convencionales de ADN recombinante. Dichos anticuerpos
monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse mediante
técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo
utilizando los procedimientos descritos en las publicaciones del PCT
núm. WO 86101533 y WO 87/02671; en las solicitudes de patentes
europeas núm. 184.187, 171.492, 125.023 y 173.494; en las patentes
de EE.UU. núm. 4.816.567 y 5.225.539; en las solicitud de patente
europea 125.023; en Better y colaboradores (1988) "Science"
240: 1041-1043; Liu y colaboradores (1987) "Proc.
Natl. Acad. Sci USA" 84: 3439-3443; Liu y
colaboradores (1987) "J. Immunol" 139:
3521-3526; Sun y colboradores (1987) "Proc. Natl.
Acad. Sci USA" 84: 214-218; Nishimura y
colaboradores (1987) "Canc. Res." 47: 999-1005;
Word y colaboradores (1985) "Nature" 314:
446-449; Shaw y colaboradores (1988) "J. Natl
Cancer Inst." 80: 1553-1559; Morrison (1985)
"Science" 229: 1202 -1207; Oi y colaboradores (1986)
"Bio/Techniques" 4: 214; Jones y colaboradores (1986)
"Nature" 321: 552-525; Verhoeyan y
colaboradores (1988) "Science" 239: 1534; y Beidler y
colaboradores (1988) "J. Immunol" 141:
4053-4060.
Los anticuerpos completamente humanos son
particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de
pacientes humanos. Dichos anticuerpos pueden producirse utilizando
ratones transgénicos que sean incapaces de expresar genes de
cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina endógena, pero que
puedan expresar genes humanos de cadena pesada y ligera. Consulte,
por ejemplo, Lonberg y Huszar (1995) "Int. Rev. Immunol" 13:
65-93; y las patentes de EE.UU. núm. 5.625.126;
5.633.425; 5.569.825; 5.661.016 y 5.545.806. Además pueden
contactarse empresas tales como Abgenix, Inc. (Freemont,CA), para
el suministro de anticuerpos dirigidos contra un antígeno
seleccionado que utilizan una tecnología similar a la anteriormente
descrita.
Los anticuerpos completamente humanos que
reconocen un epítopo seleccionado pueden generarse usando una
técnica denominada "selección guiada". En esta aproximación un
anticuerpo monoclonal no humano seleccionado por ejemplo un
anticuerpo de murina, se utiliza para guiar la selección de un
anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo. Esta
tecnología es descrita por Jespers y colaboradores (1994)
"Bio/Technology" 12: 899 - 903.
Puede utilizarse un anticuerpo antiquinasa, por
ejemplo un anticuerpo monoclonal para aislar proteínas de quinasa
mediante técnicas convencionales, tales como la cromatografía de
afinidad o la inmunoprecipitación. Un anticuerpo antiquinasa puede
facilitar la purificación de proteína de quinasa natural a partir de
células y de la proteína quinasa recombinantemente producida,
expresada en las células anfitrionas. Además, puede utilizarse un
anticuerpo antiquinasa para detectar proteína de quinasa (por
ejemplo, en un lisado celular o en sobrenadante de células). Para
evaluar la abundancia y patrón de expresión de la proteína de
quinasa. Los anticuerpos antiquinasa pueden utilizarse
diagnósticamente para monitorizar los niveles de proteína en un
tejido como parte de un procedimiento de estudio clínico, por
ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento
dado. La detección puede facilitarse mediante el acoplamiento del
anticuerpo con una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias
detectables incluyen diferentes enzimas, grupos prostéticos,
materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales
bioluminiscentes y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas
adecuadas incluyen la peroxidasa de rábano, la fosfatasa alcalina,
la \beta-galactosidasa o la acetilcolinesperasa;
ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen
estreptavidina/ biotina y avidin/biotina; ejemplos de materiales
fluorescentes adecuados incluyen la umbeliferona, fluoresceína, la
fluoresceína isotiocianato, la rodamina, la diclorotriacilamina
fluoresceína, el cloruro de dansilo o la ficoeritrina; ejemplo de
material luminiscente incluye el luminol; ejemplos de materiales
bioluminiscentes incluyen la luciferasa, la luciferina y la
aequorina; y ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen
el I^{125}, I^{131}, S^{35} o H^{3}.
Además, un anticuerpo (o un fragmento del mismo)
puede conjugarse con una molécula terapéutica tal como una
fitotoxina, un agente terapéutico o un ión metálico radioactivo. Una
citotoxina o un agente citotóxico incluyen cualquier agente que sea
perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen taxol,
citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina,
mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina,
colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracina diona,
mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D;
1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína,
tetracaína, lidocaína, propanolol y puromicina o sus análogos u
homólogos. Los agentes terapéuticos incluyen, aunque no en sentido
limitativo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato,
6-mecaptopurina, 6-tioguanina,
citarabina, 5-fluorouracil de carbacina), agentes
alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil,
melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida,
busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y
cis-diclorodiamina de platino (II) (DDO) (cispatin),
antraciclinas (por ejemplo, daunorumicina (inicialmente
daunomicina) y doxorubicina), antibióticos (por ejemplo,
dactinomicina (inicialmente actinomicina), bleomicina, mitramicina
y antramicina (AMC)), y agentes antimicóticos (por ejemplo,
vincristina y vinblastina). Los conjugados de la invención pueden
utilizarse para modificar una respuesta biológica dada, la molécula
del medicamento no se construye con las limitaciones de los agentes
terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la molécula del
medicamento puede ser una proteína o un polipéptido que posea una
actividad biológica deseable. Dichas proteínas pueden incluir, por
ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de
pseudomonas o toxina de difteria; una proteína tal como el factor de
necrosis tumoral, -alfa.-interferona, .beta.-interferona, el factor
del crecimiento de los nervios, el factor de crecimiento derivado
de las plaquetas, activador plasminogénico del tejido o
modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo,
linfoquinas, interleuquina-1
("IL-1"), interleuquina-2
("IL-2"), interleuquina-6
("IL-6"), factor de estimulación de la colonia
de macrofase de granulocitos ("GM-CSF"), factor
de estimulación de la colonia de granulocitos
("G-CSF") u otros factores del crecimiento.
Son bien conocidas las técnicas para conjugar
dicha molécula terapéutica con anticuerpos (consulte, por ejemplo,
Arnon y colaboradores "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting
of Drugs in Cancer Therapy", en "Monoclonal Antibodies and
Cancer Therapy", Reisfeld y colaboradores (editores), pág.
243-56 (Alan R. Liss. Inc. 1985); Hellstrom y
colaboradores, "Antibodies for Drug Delivery", en "Controlled
Drug Delivery" (2ª edición), Robinson y colaboradores
(Editores), pág. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987);
Torpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy:
A Review", en "Monoclonal Antibodies '84: Biological and
Clinical Applications", Pinchera y colaboradores (editores),
pág. 475-506 (1985); "Análisis, Results, and
Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody
in Cancer Therapy", en "Monoclonal Antibodies for Cancer
Detection and Therapy", Baldwin y colaboradores (editores), pág.
303-16 (Academia Press 1985), y Torpe y
colaboradores, "The Preparation and Cytotoxic Properties of
Antibody-Toxin Conjugates", "Immunol. Rev.",
62: 119-58 (1982). Alternativamente, puede
conjugarse un anticuerpo con un segundo anticuerpo para formar un
heteroconjugado de anticuerpos según se describe por Segal en la
patente de EE.UU. núm. 4.676.980.
Otro aspecto de la invención se refiere a
vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un
ácido nucleico que codifica una proteína de quinasa (o una parte de
la misma). "Vector" se refiere a una molécula de ácido
nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido
unida, tal como un "plásmido", un bucle de ADN circular de
doble cadena, dentro del cual pueden ligarse segmentos de ADN
adicionales, o un vector viral, en el que segmentos de ADN
adicionales pueden ligarse dentro del genoma viral. Los vectores
son útiles para la replicación autónoma en una célula anfitriona o
pueden integrarse dentro del genoma de una célula anfitriona
después de su introducción dentro de la célula anfitriona y de esta
forma se replican junto con el genoma anfitrión (por ejemplo,
vectores de mamífero no eposomático). Los vectores de expresión son
capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están
operativamente unidos. En general, los vectores de expresión de
utilidad en las técnicas de ADN recombinante toman a menudo la forma
de plásmidos (vectores). No obstante, la invención se dirige a
incluir dichas otras formas de vectores de expresión, tal como
vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación
defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), que efectúan
funciones equivalentes.
Los vectores de expresión recombinantes de la
invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma
adecuada para la expresión del ácidos nucleicos en una célula
anfitriona. Esto significa que los vectores de expresión
recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras,
seleccionadas sobre la base de las células anfitrionas a usar para
la expresión, operativamente unidas a la secuencia de ácido nucleico
a expresar. "Operativamente unida" tiene la intención de
significar que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a
la secuencia o secuencias reguladoras de forma que se permita la
expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un
sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula
anfitriona cuando se introduce el vector dentro de la célula
anfitriona). El término "secuencia reguladora" tiene la
intención de incluir promotores, potenciadores y otros elementos de
control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación).
Consulte por ejemplo, Goeddel (1990) "Gene Expresión Technology:
Methods in Enzymology" 185 (Academic Press, San Diego,
California). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que
dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos
en muchos tipos de células anfitrionas y aquellas que dirigen la
expresión de la secuencia de nucleótidos solamente en ciertas
células anfitrionas (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas
para el tejido). Los expertos en la materia apreciarán que el
diseño del vector de expresión puede depender de factores tales
como la elección de la célula anfitriona a transformar, el nivel
deseado de expresión de proteína. Los vectores de expresión de la
invención pueden introducirse dentro de células anfitrionas para así
producir proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de
fusión, codificados por ácidos nucleicos según aquí se describe
(por ejemplo, proteína de quinasa, formas mutantes de proteína de
quinasa, proteínas de fusión, etc.).
Los vectores de expresión recombinantes de la
invención, pueden estar diseñados para la expresión de proteína de
quinasa en células anfitrionas procarióticas o eucarióticas. La
expresión de proteínas en procariotos a menudo se lleva a cabo en
E. Colli con vectores que contienen promotores constitutivos
o inducibles que dirigen la expresión de proteínas bien de fusión o
bien de no fusión. Los vectores de fusión añaden un número de
aminoácidos a una proteína codificada en los mismos, habitualmente
en el terminal amino de la proteína recombinante. Vectores típicos
de expresión de fusión incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith y
Jonson (1988) "Gene" 67: 31-40), pMAL (New
England Biolabs, Beverly, MA), y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, New
Jersey) que funden glutationa S-transferasa (GST),
proteína de unión de maltosa E o proteina A, respectivamente, con
la proteína recombinante diana. Ejemplos de vectores de expresión de
E. colli inducibles de no fusión adecuados incluyen pTRc
(Amann y colaboradores (1988) "Gene" 69:
301-315) y pET 11d (Studier y colaboradores (1990)
en "Gene Expresión Thechnology: Methods in Enzymology" 185
(Academia Press, San Diego, California), pág.
60-89). Estrategias para maximizar la expresión de
proteínas recombinantes en E. Colli pueden encontrarse en
Gottesman (1990) en "Gene Expresión Technology: Methods in
Enzymology" 185 (Academia Press, San Diego, California), pág.
119-128) y Wada y colaboradores (1992) "Nucleic
Acids res." 20: 2111-2118. La expresión de los
genes diana a partir del vector pTrc se apoya en la transcripción
del ARN polimerasa anfitrión a partir de un promotor de fusión
trp-lac híbrido.
Células anfitrionas eucarióticas adecuadas
incluyen células de insectos (ejemplos de vectores de baculovirus
disponibles para la expresión de proteínas en células cultivadas de
insectos (por ejemplo, células Sf 9) incluyen las series pAc (Smith
y colaboradores (1983) "Mol. Cell Biol." 3:
2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989)
"Virology" 170: 31-39)); células de levadura
(ejemplos de vectores para su expresión en levaduras S.
cerevisiae incluyen pYepSecl (Baldari y colaboradores (1987)
"EMBO J." 6: 229-234), pMFa (Kurjan y
Herskowitz (1982) "Cell" 30: 933-943), pJRY88
(Schultz y colaboradores (1987) "Gene" 54:
113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego,
California), y pPicZ (Invitrogen Corporation, San Diego,
California); o células de mamíferos (vectores de expresión en
mamíferos incluyen pCDM8 (Seed (1987) "Nature" 329.840) y
pMT2PC (Kaufman y colabores (1987) "EMBO J" 6:
187-195)). Células de mamíferos adecuados incluyen
células del ovario del hámster chino (CHO) o COS. En las células de
mamíferos, las funciones de control de los vectores de expresión a
menudo son proporcionadas por elementos reguladores virales. Por
ejemplo, los promotores habitualmente utilizados se derivan del
polioma, del adenovirus 2, del citomegalovirus y del Simian Virus
40. Para obtener información sobre otros sistemas de expresión
adecuados para células tanto procarióticas como eucarióticas,
consulte los capítulos 16 y 17 de Sambrook y colaboradores (1989)
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2ª edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Consulte,
Goeddel (1990) "Gene Expression Technology: Methods in
Enzymology" 185 (Academic Press, Dan Diego, California).
Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede
transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo, usando
secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7.
Los términos "célula anfitriona" y
"célula anfitriona recombinante" se usan aquí de forma
intercambiable. Debe entenderse que dichos términos se refieren no
solo a la célula sujeto particular sino a la progenie o potencial
progenie de dicha célula. Ya que se pueden producir ciertas
modificaciones en las generaciones sucesivas debido tanto a
mutaciones como influencias medio ambientales, dicha progenie, de
hecho puede no ser idéntica a la célula padre, pero todavía está
incluida dentro del alcance del término según aquí se utiliza.
En una realización, el vector de expresión es un
vector de expresión recombinante de mamífero que comprende
elementos reguladores específicos para el tejido que dirigen la
expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula
en particular. Promotores adecuados específicos para el tejido
incluyen el promotor de la albúmina (específico para el hígado);
Pinkert y colaboradores (1987) "Genes Dev." 1:
268-277), promotores específicos del tejido
linfoide (Calame y Eaton (1988) "Adv. Immunol" 43:
235-275), promotores particulares de los receptores
de las células T (Winoto y Baltimore (1989) "EMBO J." 8:
729-733) e inmunoglobulinas (Banerji y
colaboradores (1983) "Cell" 33: 729-740; Queen
y Baltimore (1983) "Cell" 33: 741-748;
promotores específicos para las neuronas (por ejemplo, el promotor
del neurofilamento); Byme y Ruddle (1989) "Proc. Natl. Acad. Sci.
USA" 86: 5473-5477), promotores específicos para
el páncreas (Edlund y colaboradores (1985), "Science" 230:
912-916) y promotores específicos para las glándulas
mamarias (por ejemplo, el promotor del suero de la leche); Patente
de EE.UU. num. 4.873.316 y publicación de Solicitud de Patente
Europea num. 264.166). También se incluyen promotores regulados por
la forma de desarrollo, por ejemplo los promotores homeóticos de la
murina (Kessel y Gruss (1990) "Science" 249:3
74-379), el promotor de la
\alpha-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989)
"Genes Dev." 3: 537-546), y similares.
La invención suministra además un vector de
expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de la
invención clonada dentro del vector de expresión en una orientación
antisentido. Esto es, la molécula de ADN está operativamente unida
a una secuencia reguladora de manera que permita la expresión
(mediante la transcripción de la molécula de ADN) de una molécula
de ARN que sea antisentido para el ARNm de la quinasa. Pueden
seleccionarse secuencias reguladoras operativamente unidas a un
ácido nucleico clonado en la orientación antisentido para dirigir
la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una
variedad de tipos de células, por ejemplo, promotores y/o
potenciadotes virales, o las secuencias reguladoras pueden
seleccionarse para dirigir la expresión constitutiva directa
específica para el tejido o específica para el tipo de célula de ARN
antisentido. El vector de expresión antisentido puede tener la
forma de un plásmido recombínate, fagómido o virus atenuado en el
cual se producen ácidos nucleicos antisentido bajo el control de una
región reguladora de alta eficacia, cuya actividad puede
determinarse por el tipo de célula dentro de la cual se introduce el
vector. Para un análisis de la regulación de la expresión de genes
usando genes antisentido consulte Weintraub y colaboradores (1986)
"Reviews-Trenes in Genetics", vol
1(1).
El ADN del vector puede introducirse dentro de
células procarióticas o eucarióticas por medio de técnicas
convencionales de transformación o transfección. Según aquí se
utilizan, los términos "transformación" y "transfección"
tienen la intención de referirse a una variedad de técnicas
reconocidas para la introducción de ácido nucleico extraño (por
ejemplo, ADN) dentro de una célula anfitriona, incluyendo la
coprecipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, la
transfección intermediada por DEAE destrán, la lipofección o la
electroporación. Pueden encontrarse procedimientos adecuados para
la transformación o transfección de células anfitrionas en Sambrook
y colaboradores (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"
(2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva
York) y otros manuales de laboratorio.
Para la transfección estable en células de
mamífero, se sabe, que dependiendo del vector de expresión y de la
técnica de transfección utilizada, solamente una pequeña fracción de
células puede integrar el ADN extraño dentro de su genoma. Para
identificar y seleccionar estas células integrantes, se introduce un
gen que codifique un marcador seleccionable (por ejemplo, para la
resistencia a los antibióticos) generalmente dentro de las células
anfitrionas junto con el gen de interés. Los marcadores
seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren
resistencia a medicamentos, tales como G418, higromicina y
metotrexato. Puede introducirse un ácido nucleico que codifique un
marcador seleccionable dentro de la célula anfitriona sobre el mismo
vector que el que codifica una proteína de quinasa o puede
introducirse sobre un vector separado. Las células establemente
transfectadas con ácido nucleico introducido pueden identificarse
mediante selección medicamentosa (por ejemplo, las células que
tengan incorporado el gen del marcador seleccionable sobrevivirán,
mientras que las otras morirán).
Una célula anfitriona de la invención, tal como
una célula anfitriona procariótica o eucariótica en un cultivo,
puede utilizarse para producir (es decir, expresar) proteína de
quinasa. Consecuentemente, la invención suministra además
procedimientos para producir proteína de quinasa usando las células
anfitrionas de la invención. En una realización, el procedimiento
comprende el cultivo de la célula anfitriona de la invención, dentro
de la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante
que codifica una proteína de quinasa, en un medio adecuado de forma
que se produzca proteína de quinasa. En otra realización, el
procedimiento comprende además el aislamiento de la proteína de
quinasa del medio o de la célula anfitriona.
Las células anfitrionas de la invención también
pueden utilizarse para producir animales transgénicos no humanos.
Por ejemplo, en una realización, una célula anfitriona de la
invención es un ovocito no humano fertilizado o una célula madre
embriónica no humana dentro de la cual se ha introducido una
secuencia codificante de la quinasa. Dichas células anfitrionas
pueden utilizarse entonces para crear animales transgénicos no
humanos en los cuales se han introducido secuencias exógenas de
quinasa dentro de su genoma o animales homólogos recombinantes en
los cuales se han alterado secuencias endógenas de quinasa. Dichos
animales son útiles para estudiar la función y/o la actividad de
los genes y proteínas de quinasa y para identificar y/o evaluar
moduladores de la actividad de la quinasa. Según aquí se utiliza,
"animal transgénico" es un animal no humano, preferiblemente
un mamífero, más preferiblemente un roedor, tal como una rata o un
ratón, en el cual una o más de las células del animal incluye un
transgen. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates,
ovejas, perros, vacas, cabras, gallinas, anfibios, etc. no humanos.
Un transgen es un ADN exógeno que se integra dentro del genoma de
una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico y
que permanece en el genoma del animal maduro, dirigiendo así la
expresión de un producto de gen codificado en uno o más tipos de
células o de tejido del animal transgénico. Según aquí se utiliza,
un "animal homólogo recombinante" es un animal no humano,
preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ratón, en el
cual un gen endógeno de la quinasa se ha alterado mediante
recombinación homóloga entre el gen endógeno y una molécula de ADN
exógeno introducida dentro de una célula del animal, por ejemplo,
una célula embriónica de un animal no humano, antes del desarrollo
del animal.
Un animal transgénico no humano de la invención
puede crearse introduciendo ácido nucleico que codifique quinasa
dentro del pronúcleo macho de un ovocito fertilizado, por ejemplo,
mediante microinyección, infección retroviral y permitiendo que el
ovocito se desarrolle en un animal hembra sustituto
pseudoembarazado. La secuencia de ADNc de la quinasa puede
introducirse como un transgen dentro del genoma del animal no
humano. Alternativamente, puede aislarse el gen de la quinasa
basándose en la hibridización y utilizarse como un transgen. También
pueden incluirse secuencias intrónicas y señales de poliadenilación
en el transgen para incrementar la eficacia de la expresión del
transgen. Una secuencia reguladora específica para el tejido puede
estar operativamente unida al transgen de la quinasa para dirigir
la expresión de la proteína de quinasa en células particulares.
Procedimientos para generar animales transgénicos no humanos por
medio de manipulación embrionaria y microinyección, particularmente
animales tales como ratones, se han convertido en habituales en la
técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. núm.
4.736.866, 4.870.009 y 4.873.191 y en Hogan (1986) "Manipulating
the Mouse Embryo" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, Nueva York, 1986). Se utilizan procedimientos
similares para la producción de otros animales transgénicos. Un
animal transgénico fundador puede identificarse basándose en la
presencia del transgen de la quinasa en su genoma y/o en la
expresión de ARNm de quinasa en tejidos o células de los animales.
Entonces puede utilizarse un animal transgénico fundador para
engendrar animales adicionales que lleven el transgen. Además, los
animales transgénicos no humanos, que lleven un transgen que
codifica el gen de la quinasa, pueden engendrarse además en otros
animales transgénicos no humanos que lleven otros transgenes.
Para crear un animal homólogo recombinante no
humano, se prepara un vector que contiene al menos una parte de un
gen de la quinasa o un homólogo del gen dentro del cual se ha
introducido una eliminación, una adición o una sustitución para
alterar así, por ejemplo perturbar funcionalmente, el gen de la
quinasa. En una realización preferida, el vector está diseñado de
forma que después de la recombinación homóloga, el gen endógeno de
la quinasa sea funcionalmente interrumpido (es decir, no codifique
más una proteína funcional; dichos vectores también son denominados
como vectores "knock out"). Alternativamente, el vector puede
diseñarse de forma que, después de la recombinación homóloga el gen
endógeno de la quinasa se mute o se altere de cualquier otra manera
pero codifique aún la proteína funcional (por ejemplo, la región
reguladora superior puede alterarse para alterar así la expresión
de la proteína endógena de la quinasa). En el vector de
recombinación homóloga, la parte alterada del gen de la quinasa
está flanqueada en sus extremos 5' y 3' por ácido nucleico
adicional del gen de la quinasa para permitir que se produzca la
recombinación homóloga entre el gen exógeno de la quinasa soportado
por el vector y un gen endógeno de la quinasa en una célula madre
embriónica no humana. El ácido nucleico flanqueante adicional de la
quinasa es de una longitud suficiente para asegurar el éxito de la
recombinación homóloga con el gen endógeno. Típicamente, se
incluyen varias kilobases del ADN flanqueante (en ambos extremos 5'
y 3') en el vector (consulte, por ejemplo, Thomas y Capecchi (1987)
"Cell" 51: 503 para una descripción de los vectores de
recombinación homóloga). El vector se introduce dentro de una línea
de células madre humanas embriónicas (por ejemplo, mediante
electroporación) y se seleccionan las células en las cuales el gen
de la quinasa introducido se ha recombinado de forma homóloga con
el gen endógeno de la quinasa (consulte, por ejemplo, Li y
colaboradores (1992) "Cell" 69: 915. Las células seleccionadas
se inyectan entonces dentro de un blastocisto de un animal no
humano (por ejemplo, un ratón) para formar quimeras de agregación
(consulte, por ejemplo, Bradley (1987) "Teratocarcinomas and
Embryonic Stem Cells: A Practical Approach". Editorial Robertson
(IRL, Oxford), pág. 113-152. Entonces puede
implantarse un embrión quimérico en un animal hembra sustituto no
humano pseudoembarazado y llevarse a término el embrión. La progenie
que alberga el ADN homólogamente recombinado en sus células germen
puede utilizarse para engendrar animales en los cuales todas las
células del animal contienen el ADN homólogamente recombinado
mediante la transmisión de la línea germinal del transgen.
Procedimientos para construir vectores de recombinación homóloga y
animales recombinantes homólogos se describen adicionalmente en
Bradley (1991) "Current Opinión in BIO/Technology" 2:
823-829 y en las publicaciones PCT núm. WO 90/11354,
WO 91/01140, WO 92/0968 y WO 93/04169.
En otra realización, pueden producirse los
animales transgénicos no humanos que contienen los sistemas
seleccionados que permiten la expresión regulada del transgen. Un
ejemplo de tal sistema es el sistema de recombinasa cre/loxP
del bacteriofago P1. Para la descripción del sistema de recombinasa
cre/loxP, consulte, por ejemplo, Lakso y colaboradores
(1992) "Proc. Nat. Acad. Sci. USA" 89:
6232-6236. Otro ejemplo de un sistema recombinante
es el sistema de recombinasa FLP Saccharomyces cerevisiae
(O'Gorman y colaboradores (1991) "Science" 251:
1351-1355). Si se utiliza un sistema de recombinasa
cre/loxP para regular la expresión del transgen, se
necesitan animales que contengan transgenes que codifiquen tanto la
recombinasa Cre como una proteína seleccionada. Dichos
animales pueden obtenerse a través de las construcciones de animales
transgénicos "dobles", por ejemplo, apareando dos animales
transgénicos, uno que contenga un transgen que codifique una
proteína seleccionada y el otro que contenga un transgen que
codifique una recombinasa.
Clones de los animales transgénicos no humanos
aquí descritos pueden producirse también de acuerdo con los
procedimientos descritos en Wilmut y colaboradores (1997)
"Nature" 385: 810-813 y las publicaciones PCT
núm. WO 97/07688 y WO 97/07669.
En general, los procedimientos para la
producción de animales transgénicos no humanos incluyen la
introducción de una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la
presente invención, la secuencia de ácido nucleico es capaz de
expresar la proteína en un animal transgénico, dentro de una célula
en cultivo o in vivo. Cuando se introduce in vivo, el
ácido nucleico se introduce dentro de un organismo intacto de manera
que uno o más tipos de células y, consecuentemente, uno o más tipos
de tejido, expresen el ácido nucleico que codifica la proteína.
Alternativamente, el ácido nucleico puede introducirse virtualmente
dentro de todas las células en un organismo transfectando una
célula en un cultivo, tal como una célula madre embriónica no
humana, según se ha descrito aquí para la producción de animales
transgénicos no humanos, y esta célula puede utilizarse para
producir un organismo transgénico completo. Según se ha descrito, en
una realización adicional, la célula anfitriona puede ser un
ovocito fertilizado. Entonces se permite el desarrollo en dichas
células en un animal hembra sustituto para producir el organismo
transgénico.
Las moléculas de ácido nucleico de quinasa, las
proteínas de quinasa y los anticuerpos antiquinasa (también aquí
denominados "compuestos activos") de la invención pueden
incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para su
administración. Dichas composiciones comprenden típicamente la
molécula de ácido nucleico, la proteína o el anticuerpo y el
excipiente farmacéuticamente aceptable. Según se utiliza aquí la
frase "excipiente farmacéuticamente aceptable" tiene la
intención de incluir cualquier solvente, medio de dispersión,
revestimiento, agente antibacteriano y agente antifungal, agentes
isotónicos y de retardo de la absorción y similares, compatibles
con la administración farmacéutica. El uso de dichos medios y
agentes para las substancias farmacéuticamente activas es bien
conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio
o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se
contempla su uso en las composiciones. También pueden incorporarse
compuestos suplementariamente activos en las composiciones.
Las composiciones de la invención son útiles
para el tratamiento de las enfermedades aquí analizadas. Las
composiciones son suministradas en cantidades terapéuticamente
efectivas. Por "cantidades terapéuticamente efectivas" se
tiene la intención de referirse a una cantidad suficiente para
modular la respuesta deseada. Según se definió aquí, una cantidad
terapéuticamente efectiva de una proteína o un polipéptido (es
decir, una dosificación eficaz) oscila entre 0,001 y 30 mg/kg del
peso del cuerpo, preferiblemente aproximadamente entre 0,01 y 25
mg/kg del peso del cuerpo, más preferiblemente aproximadamente
entre 0,1 y 20 mg/kg del peso del cuerpo incluso más
preferiblemente aproximadamente entre 1 y 10 mg/kg, entre 2 y 9
mg/kg, entre 3 y 8 mg/kg, entre 4 y 7 mg/kg o entre 5 y 6 mg/kg del
peso del cuerpo.
Los expertos en la materia apreciarán que
ciertos factores pueden influenciar la dosificación requerida para
tratar de forma efectiva a un sujeto, incluyendo, aunque no en
sentido limitativo, la severidad de la enfermedad o dolencia, los
tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto y
otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto
con una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína,
polipéptido o anticuerpo pude incluir un tratamiento simple o,
preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un
ejemplo preferido, el sujeto se trata con anticuerpo, proteína o
polipéptido en la banda de entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg del
peso del cuerpo, una vez por semana, durante aproximadamente entre 1
y 10 semanas, preferiblemente entre 2 y 8 semanas, más
preferiblemente aproximadamente entre 3 y 7 semanas e incluso más
preferiblemente durante aproximadamente 4, 5 ó 6 semanas. También
se apreciará que la dosificación efectiva de anticuerpo, proteína o
polipéptido usado en el tratamiento puede aumentar o disminuir a lo
largo del curso de un tratamiento en particular. Los cambios de la
dosificación resultarán y serán evidentes a partir de los resultados
de pruebas de diagnóstico tales como las aquí descritas.
Una composición farmacéutica de la invención se
formula para que sea compatible con su forma de administración.
Ejemplos de formas de administración incluyen parenteral, por
ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo,
la inhalación), transdérmica (tópica), transmucosal y administración
rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación
parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes
componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, una
solución salina, aceites fijos, glicoles de polietileno, glicerina,
glicol de polipropileno u otros solventes sintéticos; agentes
antibacterianos tales como el alcohol de bencilo o parabenos de
metilo; antioxidantes tales como el ácido ascórbico o el bisulfito
de sodio; agentes quelantes, tales como el ácido
etilenodiaminotetracético; amortiguadores, tales como acetatos,
citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tal
como el cloruro de sodio o la dextrosa. Puede ajustarse el pH con
ácidos o bases, tales como el ácido hidroclórico o el hidróxido de
sodio. La preparación parenteral puede estar encerrada en ampollas,
jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o
plástico.
Las composiciones farmacéuticas para su uso
inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (en las que el
agua es el soluble) o dispersiones y polvo estéril para la
preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables
estériles. Para la administración intravenosa, los excipientes
adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua
bacteriostática, Cremophor EL® (BASF; Parsippany, NJ) o solución
salina amortiguada con fosfato (PBS). En todos los casos, la
composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta la extensión de
que exista la capacidad de administración mediante jeringas. Debe
ser estable bajo condiciones de fabricación y mantenimiento y debe
conservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales
como las bacterias y los hongos. El excipiente debe ser un solvente
o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol,
poliol (por ejemplo, glicerol, glicol de polipropileno y glicol de
polietileno líquido y sustancias similares) y sus mezclas
adecuadas. La fluidez adecuada puede mantenerse, mediante el uso de
un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del
tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante
el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de los
microorganismos puede conseguirse mediante diferentes agentes
antibacterianos y antifungales, por ejemplo, parabenos,
clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En
muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo
azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de
sodio en la composición. La absorción prolongada de las
composiciones inyectables puede efectuarse incluyendo en la
composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo,
monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones estériles inyectables pueden
prepararse incorporando el compuesto activo (por ejemplo, una
proteína de quinasa o un anticuerpo antiquinasa) en la cantidad
requerida en un solvente adecuado con uno o una combinación de los
ingredientes anteriormente enumerados, seguida por una
esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan
incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contenga
un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos
seleccionados entre los anteriormente enumerados. En el caso de
polvo estéril para la preparación de soluciones estériles
inyectables, los procedimientos de preparación preferidos son el
secado por vacío y el secado por congelación, que da como resultado
un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado
adicional a partir de una solución previamente filtrada y
esterilizada de los
mismos.
mismos.
Las composiciones orales incluyen generalmente
un diluyente inerte y un excipiente comestible. Pueden encerrarse
en cápsulas de gelatina o comprimirse en forma de comprimidos. Para
el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto
activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de
comprimidos, tabletas o cápsulas. Las composiciones orales también
pueden prepararse usando un excipiente fluido para su uso como
colutorio en el que el compuesto en el excipiente fluido se aplica
oralmente, se agita y se expectora o se traga. Pueden incluirse
como parte de la composición agentes de unión farmacéuticamente
compatibles y/o materiales coadyuvantes. Los comprimidos, píldoras,
cápsulas, tabletas y similares pueden contener cualquiera de los
siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un
amalgamador, tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto
o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente
desintegrador, tal como el ácido algínico, Primogel o almidón de
maíz; un lubricante, tal como el estearato de magnesio o Sterotes;
un deslizante, tal como dióxido de silicio coloidal; un agente
endulzante, tal como sucrosa o sacarina; o un agente saborizante,
tal como peppermint, salicilato de metilo o saborizante de naranja.
Para su administración mediante inhalación, los compuestos son
administrados en forma de aerosol desde un envase o dispensador a
presión que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal
como dióxido de carbono, o desde un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser
mediante un medio transmucosal o transdérmico. Para la
administración transmucosal o transdérmica, se utilizan en la
formulación penetrantes adecuados para la barrera a penetrar.
Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e
incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosal,
detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La
administración transmucosal puede realizarse a través del uso de
aerosoles nasales o supositorios. Para la administración
transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos,
salvas, geles o cremas tal como generalmente se conoce en la
técnica. Los compuestos también pueden prepararse en forma de
supositorios (por ejemplo, con bases convencionales para
supositorios, tales como mantequilla de coco y otros glicéridos) o
enemas de retención para administración rectal.
En una realización, los compuestos activos se
preparan con excipientes que protegerán el compuesto contra la
rápida eliminación del cuerpo, tales como formulaciones de
liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de
administración microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros
biodegradables biocompatibles, tales como el acetato de etileno
vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno,
poliortoésteres y ácido poliláctico. Procedimientos para la
preparación de tales formulaciones serán evidentes para aquellos
expertos en la materia. Los materiales también pueden obtenerse
comercialmente en Alza Corporation y Nova Pharmeceuticals, Inc.
Como excipientes farmacológicamente aceptables también pueden
utilizarse las suspensiones liposomales (incluyendo los liposomas
dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales para
antígenos virales). Estas pueden prepararse de acuerdo con los
procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por
ejemplo, tal como se describe en la patente de EE.UU. núm.
4.522.811.
Es especialmente ventajoso formular las
composiciones orales o parenterales en forma de dosis unitarias para
facilitar las dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar,
conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto
activo que se calcula que produce el efecto terapéutico deseado en
asociación con el excipiente farmacéutico requerido. Dependiendo
del tipo y severidad de la enfermedad, entre aproximadamente 1
\mug/kg y aproximadamente 15 mg/kg (por ejemplo, entre 0,1 y 20
mg/kg) de anticuerpo es una dosis candidata inicial para su
administración a un paciente, bien sea, por ejemplo, mediante uno o
más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una
dosis diaria típica podría oscilar entre aproximadamente 1\mug/kg
y aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores
antes mencionados. Para administraciones repetidas a lo largo de
varios días o mayores períodos, dependiendo del estado, el
tratamiento se mantiene hasta que se produce la supresión de los
síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de
dosificación pueden ser útiles. El proceso de esta terapia se
monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. Un
régimen de dosificación ejemplar se presenta en el documento WO
94/04188. Las especificaciones para las formas unitarias de
dosificación de la invención vienen dictadas y son directamente
dependientes de las características únicas del compuesto activo y
del efecto terapéutico particular a conseguir y de las limitaciones
inherentes en la técnica de composición de dicho compuesto activo
para el tratamiento de individuos.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
pueden insertarse dentro de vectores y usarse como vectores de
terapia genética. Los vectores de terapia genética pueden
administrarse a un sujeto, por ejemplo, mediante inyección
intravenosa, administración local (patente de EE.UU. núm. 5.328.470)
o mediante inyección esterotáctica (consulte, por ejemplo, Chen y
colaboradores (1994) "Proc. Natl. Acad. Sci USA" 91:
3054-3057). La preparación farmacéutica del vector
de terapia genética puede incluir el vector de terapia genética en
un diluyente aceptable o puede comprender una matriz de liberación
lenta en la cual está embebido el vehículo de administración
genética. Alternativamente, cuando el vector completo de
administración genética puede producirse intacto a partir de
células recombinantes, por ejemplo los vectores retrovirales, la
preparación farmacéutica puede incluir una o más células que
producen el sistema de administración genética.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar
incluidas en un envase, paquete o dispensador junto con las
instrucciones para su administración.
Las moléculas de ácido nucleico, las proteínas,
los homólogos de las proteínas y los anticuerpos aquí descritos
pueden usarse en uno o más de los siguientes procedimientos: (a)
pruebas de selección; (b) pruebas de detección (por ejemplo, mapeo
cromosómico, tipificación de tejidos, biología forense); (c)
medicina predictiva (por ejemplo, pruebas de diagnóstico, pruebas
de pronóstico, ensayos clínicos de monitorización y farmacogenómica)
y (d) métodos de tratamiento (por ejemplo, terapéutico y
profiláctico). Las moléculas aisladas de ácido nucleico de la
invención pueden usarse para expresar proteína de quinasa (por
ejemplo, por medio de una vector de expresión recombinante en una
célula anfitriona en aplicaciones de terapia genética), para
detectar ARNm de quinasa (por ejemplo, en una muestra biológica) o
una lesión genética en una gen de quinasa y para modular la
actividad de la quinasa. Además, las proteínas de quinasa pueden
usarse para seleccionar medicamentos o compuestos que modulen el
crecimiento y/o el metabolismo celular así como para tratar
enfermedades caracterizadas por una producción insuficiente o
excesiva de proteína de quinasa o por la producción de formas de
proteína de quinasa que tienen una actividad reducida o aberrante
en comparación con la proteína quinasa de tipo salvaje. Además, los
anticuerpos anti-quinasa de la invención pueden
usarse para detectar proteínas aisladas de quinasa y modular la
actividad de la quinasa.
La invención suministra un procedimiento
(también aquí denominado "prueba de selección") para
identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes candidatos
o de ensayo (por ejemplo, peptidomiméticos, moléculas pequeñas u
otros medicamentos) que se unen a las proteínas de quinasa o tienen
efecto estimulante o inhibidor, por ejemplo, sobre la actividad de
la quinasa.
Los compuestos de ensayo de la presente
invención pueden obtenerse usando cualquiera de las numerosas
aproximaciones de los procedimientos de bibliotecas combinatoriales
conocidos en la técnica incluyendo bibliotecas de fase sólida o de
fase de solución paralelas y espacialmente direccionables,
procedimientos de bibliotecas sintéticas que requieren
deconvolución, el procedimiento de bibliotecas
"one-bead one-compound" y
procedimientos de bibliotecas sintéticas que usan selección de
cromatografía por afinidad. La aproximación de bibliotecas
biológicas se limita a las bibliotecas de péptidos, mientras que
las otras cuatro aproximaciones son aplicables a bibliotecas de
péptidos, oligómeros no peptídicos o moléculas pequeñas de los
compuestos (Lam (1997) "Anticancer Drug Des." 12: 145).
Ejemplos de procedimientos para la síntesis de
bibliotecas moleculares pueden encontrase en la técnica, por
ejemplo, DeWitt y colaboradores (1993) "Proc. Natl. Acad. Sci.
USA" 90: 6909; Erb y colaboradores (1994) "Proc. Natl. Acad.
Sci. USA" 91: 11422; Zuckermann y colaboradores (1994) "J. Med
Chem." 37: 2678; Cho y colaboradores (1993) "Science" 261:
1303; Carrell y colaboradores (1994) "Angew. Chem. Ed. Engl."
33: 2059; Carrell y colaboradores (1994) "Angew. Chem. Ed.
Engl." 33: 2061 y Gallop y colaboradores (1994) "J. Med
Chem." 37:1233.
Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse
en solución (por ejemplo, Houghten (1992) "Bio/Techniques" 13;
412-421, o en microesferas (Lam (1991) "Nature"
354: 82-84), chips (Fodor (1993) "Nature" 364:
555-556), bacterias (patente de EE.UU. núm.
5.223.409), esporas (patentes de EE.UU. núm. 5.571.698, 5.403.484 y
5.223.409), plásmidos (Cull y asociados (1992) "Proc. Natl. Acad.
Sci. USA" 89: 1865-1869 o fago (Scott y Smith
(1990) "Science" 249: 386-390; Devlin (1990)
"Science" 249: 404-406; Cwirla y colaboradores
(1990) "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 87:
6378-6382 y Felici (1991) "J. Mol. Biol." 222:
301-310).
Puede lograrse la determinación de la capacidad
para unirse a la proteína de quinasa del compuesto de ensayo, por
ejemplo, acoplando el compuesto de ensayo con un radioisótopo o una
etiqueta enzimática de forma que pueda determinarse la unión del
compuesto de ensayo con la proteína de quinasa o con una parte
biológicamente activa de la misma detectando el compuesto
etiquetado en un complejo. Por ejemplo, los compuesto de ensayo
pueden estar etiquetados con I^{125}, S^{35}, C^{14} o
H^{3}, bien directa o indirectamente, y detectarse el
radioisótopo mediante recuento directo de la emisión de radio o
mediante recuento por centelleo. Alternativamente los compuestos de
ensayo pueden ser enzimáticamente etiquetados, por ejemplo, con
peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina o luciferasa, y detectarse
la etiqueta enzimática mediante la determinación de la conversión de
un substrato adecuado en producto.
De forma similar, se puede determinar la
capacidad de la proteína de quinasa para unirse o interactuar con
una molécula diana de la quinasa. Por "molécula diana" se
entiende una molécula con la cual se une o interactúa de forma
natural la proteína de quinasa. En una realización preferida, la
capacidad de la proteína de quinasa para unirse o interactuar con
una molécula diana de la quinasa puede monitorizarse monitorizando
la actividad de la molécula diana. Por ejemplo, la actividad de la
molécula diana puede monitorizarse detectando la inducción de una
segundo mensajero celular de la diana (por ejemplo, Ca^{2+},
diacilglicerol, IP3, etc.), detectando la actividad
catalítica/enzimática de la diana sobre un substrato adecuado,
detectando la inducción de un gen reportero (por ejemplo, un
elemento regulador sensible a la quinasa operativamente unido a un
ácido nucleico que codifique una marcador detectable, por ejemplo,
luciferasa) o detectando una respuesta celular, por ejemplo, una
infección viral, una diferenciación celular o una proliferación
celular. Los eventos bioquímicos, los substratos y las moléculas
efectoras incluyen, aunque no en sentido limitativo, aquellos
anteriormente analizados, incluyendo aquellas funciones mostradas
en las figuras y las funciones relacionadas con la NLK, incluyendo
las funciones similares a las de MAPK/Erk y Cdk.
En otra realización adicional, un ensayo de la
presente invención es un ensayo libre de células que comprende la
puesta en contacto de una proteína quinasa con un compuesto de
ensayo y la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo
para unirse a la proteína de quinasa. La unión del compuesto de
ensayo con la proteína de quinasa puede determinarse bien directa o
bien indirectamente según se describió anteriormente. En una
realización preferida, el ensayo incluye la puesta en contacto de la
proteína de quinasa con un compuesto conocido que se una a la
proteína de quinasa para formar una mezcla de ensayo, la puesta en
contacto de la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo y la
determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para unirse
preferentemente con la proteína de quinasa en comparación con el
compuesto conocido.
En otra realización, un ensayo es un ensayo
libre de células que comprende la puesta en contacto de proteína de
quinasa con un compuesto de ensayo y la determinación de la
capacidad del compuesto de ensayo para modular (por ejemplo,
estimular o inhibir) la actividad de la proteína quinasa o de una
parte biológicamente activa de la misma. La determinación de la
capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de una
proteína de quinasa puede lograrse, por ejemplo, determinando la
capacidad de la proteína de quinasa para unirse a una molécula
diana de quinasa según se determinó anteriormente para la
determinación de la unión directa. En una realización alternativa,
la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para
modular la actividad de una proteína de quinasa puede lograrse
determinando la capacidad de la proteína de quinasa para modular
adicionalmente una molécula diana de quinasa. Por ejemplo, puede
determinarse la actividad catalítica/enzimática de la molécula
diana sobre un substrato adecuado, tal como se describió
previamente.
En otra realización adicional, el ensayo libre
de células comprende la puesta en contacto de la proteína de
quinasa con un compuesto conocido que se una a una proteína de
quinasa para formar una mezcla de ensayo, la puesta en contacto de
la mezcla de ensayo con un compuesto de prueba y la determinación de
la capacidad del compuesto de prueba para unirse o modular
preferentemente la actividad de una molécula diana de la
quinasa.
En los ensayos antes mencionados, puede ser
deseable inmovilizar bien una proteína de quinasa o bien su molécula
diana para facilitar la separación de las formas complejas de las
no complejas de una o de ambas proteínas, así como adaptar la
automatización del ensayo. En una realización, puede suministrarse
una proteína de fusión que añada un domino que permita que una o
ambas proteínas se unan a una matriz. Por ejemplo, las proteínas de
fusión de
glutadiona-S-transferasa/quinasa o
las proteínas de fusión de
glutadiona-S-transferasa/diana
pueden ser absorbidas sobre microesferas de glutadiona sefarosa.
(Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microconcentración
derivadas de la glutadiona, que se combinan entonces con el
compuesto de ensayo o con el compuesto de ensayo y bien con la
proteína diana no absorbida o bien con la proteína de quinasa, y la
mezcla se incuba bajo condiciones propicias para la formación de
complejos (por ejemplo, condiciones fisiológicas para la sal y el
pH). Después de la incubación, se lavan las microesferas o los
pocillos de la placa de microconcentración para eliminar cualquier
componente no enlazado y se mide la formación de complejo bien
directa o bien indirectamente, por ejemplo, tal como se describió
previamente. Alternativamente, los complejos pueden disociarse de
la matriz y determinarse el nivel de unión o de actividad de la
quinasa usando técnicas convencionales.
En los ensayos de selección de la invención
pueden usarse también otras técnicas para inmovilizar proteínas
sobre matrices. Por ejemplo, bien la proteína de quinasa o bien su
molécula diana pueden inmovilizarse utilizando la conjugación de
biotina y estreptavidina. Pueden prepararse moléculas de quinasa o
moléculas diana biotiniladas a partir de biotina
NHS-(N-hidroxi-succinimida) usando
procedimientos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, el equipo
de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL) e inmovilizarse en
los pocillos de las placas de 96 pocillos revestidos de
estreptavidina (Pierce Chemicals). Alternativamente, pueden
obtenerse anticuerpos reactivos con una proteína de quinasa o con
las moléculas diana pero que no interfieren con la unión de la
proteína de quinasa con su molécula diana a partir de los pocillos
de la placa y de la proteína diana o de quinasa no enlazada
atrapada en los pocillos mediante conjugación de anticuerpos.
Procedimientos para detectar dichos complejos incluyen, además de
aquellos descritos anteriormente para los complejos inmovilizados
por GST, la inmunodetección de complejos usando anticuerpos
reactivos con la proteína de quinasa o la molécula diana, así como
los ensayos de enlace enzimático que se apoyan en la detección de la
actividad enzimática asociada con la proteína de quinasa o la
molécula diana.
En otro aspecto adicional de la invención, las
proteínas de quinasa pueden usarse como "proteínas cebo" en un
ensayo de dos híbridos o un ensayo de tres híbridos (consulte, por
ejemplo, la patente de EE.UU. núm. 5.283.317; Zervos y
colaboradores (1993) "Cell" 72: 223-232; Madura
y colaboradores (1993) "J. Biol. Chem."268: 12046 - 12054;
Bartel y colaboradores/1993) "Bio/Technicques" 14:
920-924; Iwabuchi y colaboradores (1993)
"Oncogene" 8: 1693-1696 y la publicación PCT
núm. WO 94/10300), para identificar otras proteínas que se unen o
interactúan con la proteína de quinasa ("proteínas de unión con
la quinasa" o "quinasa-bp") y modulan la
actividad de la quinasa. Dichas proteínas de unión con la quinasa
es probable que estén también involucradas en la propagación de
señales por las proteínas de quinasa, por ejemplo, como elementos
superiores o inferiores de una vía de señalización.
La presente invención se refiere además a nuevos
agentes identificados mediante los ensayos de selección
anteriormente descritos y a los usos de los mismos para
tratamientos como los que aquí se describen
Partes o fragmentos de las secuencias de ADNc
aquí identificadas (y las correspondientes secuencias de los genes
completos) pueden utilizarse de muchas maneras como reactivos de
polinucleótidos. Por ejemplo, estas secuencias pueden usarse para:
(1) efectuar el mapeo de sus respectivos genes sobre un cromosoma;
(2) identificar un individuo a partir de una muestra biológica
diminuta (tipificación de tejidos) y (3) ayudar en la identificación
forense de una muestra biológica. Estas aplicaciones se describen
en las siguientes subsecciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias aisladas, completas o parciales,
de los genes de quinasa de la invención pueden usarse para efectuar
el mapeo de sus respectivos genes de quinasa sobre un cromosoma,
facilitando así la localización de las regiones de los genes
asociadas con una enfermedad genética. Puede utilizarse el análisis
por ordenador de las secuencias de quinasa para seleccionar
rápidamente los iniciadores de la PCR (preferiblemente, con una
longitud de 12-25 bp) que no se extiendan más de un
exón en el ADN genómico, simplificando así el proceso de
amplificación. Entonces pueden utilizarse estos iniciadores para la
detección por PCR de híbridos de células somáticas que contengan
cromosomas humanos individuales. Solamente esos híbridos que
contienen el gen humano que se corresponde con las secuencias de la
quinasa darán como resultado un fragmento amplificado.
Los híbridos de células somáticas se preparan
fundiendo células somáticas de diferentes mamíferos (por ejemplo,
células humanas y de ratón). Como híbridos de células humanas y de
ratón crecen y se dividen, gradualmente pierden los cromosomas
humanos en orden aleatorio, pero conservan los cromosomas del ratón.
Usando un medio en el que las células de ratón no puedan crecer
(porque carecen de una enzima particular), pero en el que sí pueden
crecer las células humanas, se conservará el cromosoma humano que
contiene el gen que codifica la enzima necesaria. Utilizando
diferentes medios, pueden establecerse paneles de líneas de células
híbridas. Cada línea de células de un panel contiene bien un
cromosoma humano único o bien un pequeño número de cromosomas
humanos y un conjunto completo de cromosomas del ratón, permitiendo
el mapeo sencillo de genes individuales para cromosomas humanos
específicos (D'Eustachio y colaboradores (1983) "Science" 220:
919-924). También pueden producirse híbridos de
células somáticas que contienen solamente fragmentos de cromosomas
humanos usando cromosomas humanos con traslocaciones y
eliminaciones.
Otras estrategias de mapeo que pueden utilizarse
similarmente para mapear una secuencia de quinasa en su cromosoma
incluyen la hibridización in situ (descrita en Fan y
colaboradores (1990) "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 87:
6223-27), la predetección con cromosomas etiquetados
clasificados por el flujo y la preselección mediante hibridización
en bibliotecas de ADNc específicas para el cromosoma. Además, puede
usarse la hibridización in situ por fluorescencia (FISH) de
una secuencia de ADN en una extensión cromosómica de metafase para
suministrar una ubicación cromosómica precisa en un solo paso. Para
revisar esta técnica, consulte Verma y colaboradores (1988)
"Human cromosomes: A manual of basic techniques" (Pergamon
Press, NY). La técnica FISH puede utilizarse con una secuencia de
ADN corta de hasta 500 ó 600 bases. Sin embargo, los clones más
largos de 1.000 bases tienen una mayor probabilidad de unirse a una
única ubicación cromosómica con una intensidad de señal suficiente
para la detección simple. Preferiblemente, 1.000 bases y más
preferiblemente 2.000 bases, serán suficientes para obtener buenos
resultados en un periodo de tiempo razonable.
Los reactivos para el mapeo de cromosomas pueden
usarse individualmente para marcar un cromosoma único o un sitio
único sobre ese cromosoma o pueden utilizarse paneles de reactivos
para macar múltiples sitios y/o múltiples cromosomas. Los reactivos
que se corresponden con las regiones no codificantes de los genes
son los realmente preferidos para propósitos de mapeo. Es más
probable que se conserven las secuencias codificantes dentro de
familias de genes, aumentando así las oportunidades de hibridización
cruzada durante el mapeo cromosómico.
Una vez mapeada una secuencia en una ubicación
cromosómica precisa, puede correlacionarse la posición física de la
secuencia sobre el cromosoma con los datos del mapa genético. Dichos
datos se encuentran, por ejemplo, en "V. McKusick, Mendelian
inheritance in man", disponible en línea a través de la
"Johns Hopkins University Welch Medical Library". Entonces
puede identificarse la relación entre los genes y la enfermedad,
mapeada para la misma región cromosómica, a través del análisis de
los enlaces (herencia compartida de genes físicamente adyacentes),
descrito, por ejemplo, por Egeland y colaboradores (1987)
"Nature" 325: 783-787.
Además, pueden determinarse las diferencias en
las secuencias de ADN entre individuos afectados y no afectados con
una enfermedad asociada con el gen de la quinasa. Si se observa una
mutación en algunos o en todos los individuos afectados pero no en
los individuos no afectados, entonces es probable que la mutación
sea el agente causante de la enfermedad en particular. La
comparación entre individuos afectados y no afectados generalmente
comprende buscar primero en los cromosomas alteraciones
estructurales tales como eliminaciones o translocaciones que sean
visibles a partir de extensiones de cromosomas o detectables usando
la PCR basándose en esa secuencia de ADN. Finalmente, puede
realizarse la secuenciación completa de los genes de diferentes
individuos para confirmar la presencia de una mutación y para
diferenciar las mutaciones de los polimorfismos.
Las secuencias de quinasa de la presente
invención también pueden usarse para identificar individuos a partir
de muestras biológicas diminutas. El ejército de los EE.UU., por
ejemplo, está considerando el uso del polimorfismo de longitud de
fragmentos de restricción (RFLP) para la identificación de su
personal. En esta técnica, un ADN genómico de un individuo se
digiere con una o más enzimas de restricción y se estudia sobre un
Southern Blot para dar como resultado bandas de identificación
únicas. Las secuencias de la presente invención son útiles como
marcadores adicionales de ADN para RFLP (esto se describe en la
patente de EE.UU. 5.272.057).
Además, las secuencias de la presente invención
pueden utilizarse para suministrar una técnica alternativa para
determinar base por base la secuencia real de ADN de partes
seleccionadas del genoma de un individuo. Así, las secuencias de
quinasa de la invención pueden usarse para preparar dos iniciadores
de la PCR a partir de los extremos 5' y 3' de las secuencias. Estos
iniciadores pueden usarse entonces para amplificar el ADN de un
individuo y posteriormente secuenciarlo.
Los paneles de las correspondientes secuencias
de ADN de individuos, preparados de esta forma, pueden proporcionar
identificaciones únicas de individuos, ya que cada individuo tendrá
un conjunto único de secuencias de ADN debido a las diferencias
alélicas. Las secuencias de quinasa de la invención únicamente
representan partes del genoma humano. Las variaciones alélicas se
producen en algún grado en las regiones codificantes de estas
secuencias y en un mayor grado en las regiones no codificantes. Se
estima que la variación alélica entre individuos humanos se produce
con una frecuencia de aproximadamente una vez por cada 500 bases.
Cada una de las secuencias aquí descritas puede, en algún grado,
utilizarse como estándar con el cual puede compararse el ADN de un
individuo para propósitos de identificación.
En la biología forense también pueden usarse
técnicas de identificación basadas en el ADN. De esta manera, puede
utilizarse la tecnología de la PCR para amplificar secuencias de ADN
tomadas de muestras biológicas muy pequeñas, por ejemplo, cabello,
piel o fluidos corporales, por ejemplo, sangre, saliva o semen
hallados en el lugar del crimen. La secuencia amplificada puede
compararse entonces con un estándar permitiendo así la
identificación del origen de la muestra biológica.
Las secuencias de la presente invención puede
usarse par suministrar reactivos de polinucleótidos, por ejemplo,
iniciadores de la PCR orientados hacia lugares específicos del
genoma humano, lo cual puede mejorar la fiabilidad de las
identificaciones forenses basadas en el ADN suministrando, por
ejemplo, otro "marcador de identificación" que es único para
un individuo en particular. Según se mencionó anteriormente, puede
utilizarse información de secuencias de base real para la
identificación como una alternativa precisa a los patrones formados
mediante fragmentos generados por enzimas de restricción. Las
secuencias dirigidas a una región no codificante de la SEQ ID NO: 1
son particularmente adecuadas para este uso ya que los mayores
números de polimorfismos se producen en la región no codificante,
facilitando la diferenciación de individuos mediante el uso esta
técnica. Ejemplos de reactivos de polinucleótidos incluyen la
secuencia de la quinasa o una parte de la misma, por ejemplo,
fragmentos derivados de una región no codificante de la SEQ ID NO: 1
que tengan una longitud de al menos 20 ó 30 bases.
Las secuencias de quinasa aquí descritas pueden
utilizarse además para suministrar reactivos de polinucleótidos,
por ejemplo, sondas etiquetadas o etiquetables que pueden
utilizarse, por ejemplo, en una técnica de hibridización in
situ, para identificar un tejido específico. Esto puede ser muy
útil en los casos en los que el patólogo forense se encuentra con
un tejido de origen desconocido. Pueden usarse paneles de dichas
sondas de quinasa para identificar tejidos por especies y/o por
tipo de órgano.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención pertenece también al campo
de la medicina predictiva en la cual se utilizan pruebas de
diagnóstico, pruebas de pronóstico, farmacogenómica y ensayos
clínicos de monitorización para propósitos (predictivos) de
pronóstico para tratar profilácticamente a un individuo. Estas
aplicaciones se describen en las siguientes subsecciones.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
pruebas de diagnóstico para detectar la proteína y/o la expresión
del ácido nucleico de la quinasa así como la actividad de la
quinasa, en el contexto de una muestra biológica. Un procedimiento
ejemplar para detectar la presencia o ausencia de proteína de
quinasa en una muestra biológica comprende la obtención de una
muestra biológica de un sujeto de estudio y la puesta en contacto
de la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de
detectar la proteína o el ácido nucleico de la quinasa (por
ejemplo, el ARNm o el ADN genómico) que codifica la proteína de la
quinasa de manera que se detecte la presencia de la proteína de
quinasa en la muestra biológica. Los resultados obtenidos con una
muestra biológica del sujeto de estudio pueden compararse con los
resultados obtenidos con una muestra biológica de un sujeto de
control.
Un agente preferido para detectar el ARNm o el
ADN genómico de la quinasa es una sonda etiquetada de ácido
nucleico capaz de hibridizarse con el ARNm o el ADN genómico de la
quinasa. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un
ácido nucleico de quinasa de longitud completa o parcial, tal como
el ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o una parte del mismo, tal
como una molécula de ácido nucleico de al menos 15, 30, 50, 100,
250 ó 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridizarse
específicamente bajo condiciones estrictas con el ARNm o el ADN
genómico de la quinasa. Aquí se describen otras sondas adecuadas
para su uso en las pruebas de diagnóstico de la invención.
Un agente preferido para detectar proteína de
quinasa es un anticuerpo capaz de unirse a la proteína de quinasa,
preferiblemente un anticuerpo con una etiqueta detectable. Los
anticuerpos pueden ser policlonales o más preferiblemente
monoclonales. Puede utilizarse un anticuerpo intacto o un fragmento
del mismo (por ejemplo, Fab o F(abN)_{2}). El
término "etiquetado", con respecto a la sonda o al anticuerpo,
tiene la intención de incluir el etiquetado directo de la sonda o
del anticuerpo acoplando (es decir, enlazando físicamente) una
substancia detectable en la sonda o el anticuerpo, así como el
etiquetado indirecto de la sonda o del anticuerpo mediante
reactividad con otro reactivo que esté directamente etiquetado.
Ejemplo de etiquetado indirecto incluyen la detección de un
anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario
fluorescentemente etiquetado y etiquetando el extremo libre de una
sonda de ADN con biotina de manera que pueda detectarse con
estreptavidina fluorescentemente etiquetada.
El término "muestra biológica" tiene la
intención de incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados
a partir de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos
biológicos presentes dentro de un sujeto. Esto es, el procedimiento
de detección de la invención puede usarse para detectar ARNm,
proteína o ADN genómico de la quinasa en una muestra in
vitro así como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in
vitro para la detección de ARNm de quinasa incluyen ensayos de
inmunosorbentes enlazados de enzimas (ELISA), ensayos Western
Blots, inmunoprecipitaciones y e inmunofluorescencia. Las técnicas
in vitro para la detección de ADN genómico de la quinasa
incluyen las hibridizaciones Southern. Además, las técnicas in
vivo para la detección de la proteína de quinasa incluyen la
introducción dentro de un sujeto de un anticuerpo etiquetado de
quinasa. Por ejemplo, un anticuerpo puede etiquetarse con un
marcador radioactivo cuya presencia y localización en el sujeto
pueden detectarse mediante técnicas convencionales para la formación
de imágenes.
En una realización, la muestra biológica
contiene moléculas de proteínas del sujeto de estudio.
Alternativamente, la muestra biológica puede contener moléculas de
ARNm del sujeto de estudio o moléculas de ADN genómico del sujeto
de estudio. Las muestras biológicas pueden obtenerse de la sangre,
del plasma, de células o del tejido del sujeto.
La invención también comprende equipos para
detectar la presencia de proteínas de quinasa en una muestra
biológica (una muestra de ensayo). Dichos equipos pueden usarse
para determinar si un sujeto padece o está en riesgo de desarrollar
una enfermedad asociada con la expresión aberrante de la proteína de
quinasa. Por ejemplo, el equipo puede comprender un compuesto o
agente etiquetado capaz de detectar proteína o ARNm de la quinasa
en una muestra biológica y medios para determinar la cantidad de
proteína de quinasa en la muestra (por ejemplo, un anticuerpo
anti-quinasa o una sonda de oligonucleótidos que se
una al ADN que codifica una proteína quinasa, por ejemplo, SEQ ID
NO: 1). Los equipos también pueden incluir instrucciones para
observar si el sujeto de estudio padece o está en riesgo de
desarrollar una enfermedad asociada con la expresión aberrante de
secuencias de quinasa si la cantidad de proteína o de ARNm de
quinasa está por encima o por debajo de un nivel normal.
Para los equipos basados en anticuerpos, el
equipo puede comprender, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo (por
ejemplo, unido a un soporte sólido) que se una a la proteína de
quinasa; y, opcionalmente, (2) un segundo anticuerpo diferente que
se una a la proteína de quinasa o al primer anticuerpo y que esté
conjugado con un agente detectable. Para los equipos basados en
oligonucleótidos, el equipo puede comprender, por ejemplo (1) un
oligonucleótido, por ejemplo, un oligonucleótido detectablemente
etiquetado, que se hibridice con una secuencia de ácido nucleico de
quinasa o (2) un par de iniciadores útiles para amplificar una
molécula de ácido nucleico de la quinasa.
El equipo también puede comprender, por ejemplo,
un agente neutralizador, un conservante o un agente estabilizador
de proteínas. El equipo puede comprender también los componentes
necesarios para detectar el agente detectable (por ejemplo, una
enzima o un substrato). El equipo también puede contener una muestra
de control o una serie de muestras que puedan ser analizadas y
comparadas con la muestra de ensayo contenida. Cada componente del
equipo está habitualmente encerrado dentro de un envase individual y
la totalidad de los diferentes envases están dentro de un paquete
único junto con las instrucciones para observar si el sujeto de
estudio padece o está en riesgo de desarrollar una enfermedad
asociada con la expresión aberrante de proteínas de quinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos aquí descritos pueden además
utilizarse como pruebas de diagnóstico o de pronóstico para
identificar sujetos que padecen o están en riesgo de desarrollar una
enfermedad o una afección asociada con la proteína quinasa, la
expresión del ácido nucleico de la quinasa o la actividad de la
quinasa. Las pruebas de pronóstico pueden utilizarse para
propósitos predictivos para el tratamiento profiláctico de un
individuo antes de la aparición de una enfermedad caracterizada o
asociada con la proteína quinasa, la expresión del ácido nucleico
de la quinasa o la actividad de la quinasa.
Así, la presente invención suministra un
procedimiento en el cual se obtiene una muestra de ensayo de un
sujeto y se detecta una proteína o un ácido nucleico (por ejemplo,
ARNm o ADN genómico) de la quinasa, en el que se diagnostica la
presencia de la proteína o el ácido nucleico de la quinasa en un
sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o
una afección asociada con la expresión o la actividad aberrante de
la quinasa. Según aquí se utiliza, una "muestra de ensayo" se
refiere a una muestra biológica obtenida de un sujeto de interés.
Por ejemplo, una muestra de ensayo puede ser una muestra de fluido
biológico, de células o de tejido.
Además del uso de las pruebas de pronóstico aquí
descritas, la presente invención suministra procedimientos para
determinar si se puede administrar un agente específico (por
ejemplo, un agonista, un antagonista, un peptidomimético, una
proteína, un péptido, una ácido nucleico, una molécula pequeña u
otro candidato a medicamento) a un sujeto para tratar de forma
eficaz una enfermedad o afección asociada con una actividad o una
expresión aberrante de la quinasa. De esta forma, se obtiene una
muestra de ensayo y se detecta una proteína o un ácido nucleico de
la quinasa. La presencia de la proteína o del ácido nucleico de la
quinasa sirve como diagnóstico para un sujeto al que se puede
administrar el agente para tratar la enfermedad asociada con la
expresión o la actividad aberrante de la quinasa.
Los agentes o moduladores que tienen efectos
estimuladores o inhibidores sobre la actividad de la quinasa (por
ejemplo, la expresión de genes de la quinasa) tal como los
identificados mediante un ensayo de detección aquí descrito, pueden
ser administrados a individuos para tratar (profiláctica o
terapéuticamente) enfermedades asociadas con una actividad
aberrante de la quinasa así como para modular el crecimiento, la
diferenciación y/o el metabolismo celular. En conjunción con dicho
tratamiento, puede considerarse la farmacogenómica (es decir, el
estudio de la relación entre un genotipo de un individuo y la
respuesta de ese individuo a un compuesto o medicamento extraño)
del individuo. Las diferencias en el metabolismo de los agentes
terapéuticos pueden dar como resultado la toxicidad severa o el
fallo terapéutico alterando la relación entre la dosis y la
concentración en sangre del medicamento farmaceúticamente activo.
De esta forma, la farmacogenómica del individuo permite la
selección de agentes eficaces (por ejemplo, medicamentos) para
tratamientos profilácticos o terapéuticos basados en la
consideración del genotipo de individuo. Dicha farmacogenómica puede
usarse además para determinar las dosis y regímenes terapéuticos
adecuados. Consecuentemente, puede determinarse la actividad de la
proteína de quinasa, la expresión del ácido nucleico de la quinasa
o el contenido de mutaciones de los genes de la quinasa en un
individuo para así seleccionar el agente o agentes adecuados para el
tratamiento profiláctico o terapéutico del individuo.
La farmacogenómica tiene relación con las
variaciones hereditarias clínicamente significativas en la respuesta
a los medicamentos debido a la disposición modificada a los
medicamentos y a la acción anómala en las personas afectadas,
Consulte, por ejemplo, Linder (1997) "Clin. Chem."
43(2): 254-266. En general, pueden
diferenciarse dos tipos de condiciones farmacogenéticas. Las
condiciones farmacogenéticas transmitidas como un factor simple que
alteran el modo en el que los medicamentos actúan sobre el cuerpo se
denominan "acción alterada del medicamento". Las condiciones
genéticas transmitidas como factores simples que alteran el modo en
el que el cuerpo actúa sobre los medicamentos se denominan
"metabolismo alterado del medicamento". Estas condiciones
farmacogenéticas pueden producirse bien como defectos raros o bien
como polimorfismos. Por ejemplo, la carencia de
glucosa-6-fosfato dehidrogenasa
(G6PD) es una enzimopatía comúnmente heredada en la que la principal
complicación clínica es la hemólisis después de la ingesta de
medicamentos oxidantes (antipalúdicos, sulfonamidas, analgésicos,
nitrofuranos) y el consumo de alubias.
Como realización ilustrativa, la actividad de
las enzimas de metabolización de los medicamentos es el principal
determinante tanto de la intensidad como de la acción del
medicamento. El descubrimiento de los polimorfismos genéticos de
las enzimas de metabolización de los medicamentos (por ejemplo, la
N-acetiltransferasa 2 (NAT2) y las enzimas CYP2D6 y
CYP2C19 del citocromo P450) ha proporcionado una explicación de
porqué algunos pacientes no obtienen los efectos esperados de los
medicamentos o muestran una respuesta exagerada a los medicamentos
y una seria toxicidad después de tomar la dosis habitual y segura de
un medicamento. Estos polimorfismos se expresan en dos fenotipos en
la población, el metabolizante extensivo (EM) y el metabolizante
pobre (PM). La prevalencia del PM es diferente entre diferentes
poblaciones. Por ejemplo, el gen que codifica la CYP2D6 es
altamente polifórmico y se han identificado algunas mutaciones en el
PM, que conducen a la ausencia de CYP2D6 funcional. Los
metabolizantes pobres de la CYP2D6 y de la CYP2C19 experimentan con
bastante frecuencia una respuesta exagerada a los medicamentos y
efectos secundarios cuando reciben dosis estándar. Si un metabolito
es la molécula terapéuticamente activa, un PM no mostrará respuesta
terapéutica, como se ha demostrado para el efecto analgésico de la
codeína intermediado por su metabolito, la morfina, formado por la
CYP2D6. El otro extremo son los metabolizantes denominados
ultra-rápidos que no responden a las dosis estándar.
Recientemente, se ha identificado que la base molecular del
metabolismo ultra-rápido es debida a la
amplificación genética de la CYP2D6.
Así, puede determinarse la actividad de la
proteína de quinasa, la expresión de ácido nucleico de la quinasa o
el contenido de mutaciones de los genes de la quinasa en un
individuo para así seleccionar el agente o agentes adecuados para
el tratamiento terapéutico o profiláctico del individuo. Además
pueden utilizarse estudios farmacogenéticos para aplicar la
genotipificación de alelos polimórficos que codifican las enzimas de
metabolización de los medicamentos para la identificación de un
fenotipo de respuesta a los medicamentos de un individuo. Este
conocimiento, cuando se aplica a la dosificación o selección de
medicamentos, puede evitar reacciones adversas o fallos
terapéuticos y mejorar de esta manera la eficacia terapéutica o
profiláctica cuando se trata un sujeto con un modulador de la
quinasa, tal como un modulador identificado por uno de los ensayos
ejemplares de detección aquí descritos.
La monitorización de la influencia de los
agentes (por ejemplo, medicamentos, compuestos) sobre la expresión
o actividad de los genes de la quinasa (por ejemplo, la capacidad de
modular la proliferación y/o diferenciación celular aberrante)
puede aplicarse no sólo en la detección básica de medicamentos sino
también en ensayos clínicos. Por ejemplo, la efectividad de un
agente, según se determina mediante un ensayo de detección según
aquí se describe, para aumentar o reducir la expresión de genes de
quinasa, los niveles de proteínas o la actividad de las proteínas,
puede monitorizarse en ensayos clínicos de sujetos que exhiban
expresión de genes de quinasa, niveles de proteínas o actividad de
proteínas amplificados o reducidos. En dicho trastorno de la
proliferación celular, pude utilizarse como marcador del crecimiento
y diferenciación celular.
Por ejemplo, y no a modo de limitación, pueden
identificarse los genes que son modulados en las células mediante
el tratamiento con un agente (por ejemplo, un compuesto, un
medicamento o una pequeña molécula) que module la actividad de la
quinasa (por ejemplo, según se identifica mediante un ensayo de
detección aquí descrito). Así, para estudiar el efecto de los
agentes sobre trastornos de la proliferación celular, por ejemplo,
en un ensayo clínico, pueden aislarse células y prepararse y
analizarse el ARN para buscar los niveles de expresión de los genes
de la quinasa y otros genes implicados en el trastorno. Los niveles
de expresión de los genes (es decir, el patrón de expresión de los
genes) pueden identificarse mediante un análisis de transferencia
Northern o RT-PCR, según aquí se describe, o
alternativamente midiendo la cantidad de proteína producida,
mediante uno de los procedimientos aquí descritos, o midiendo los
niveles de actividad de los genes de la quinasa. De esta manera, el
patrón de expresión de los genes puede servir como marcador,
indicativo de la respuesta fisiológica al agente de las células.
Consecuentemente, este estado de respuesta puede determinarse
antes, y en diferentes puntos durante el tratamiento del individuo
con el agente.
En una realización preferida, la presente
invención suministra un procedimiento para monitorizar la
efectividad del tratamiento de un sujeto con un agente (por
ejemplo, un agonista, un antagonista, un peptidomimético, una
proteína, un péptido, un ácido nucleico, una molécula pequeña u otro
medicamento candidato identificado mediante los ensayos de
detección aquí descritos), que comprende los pasos de (1) obtener
una muestra de preadministración de un sujeto antes de la
administración del agente; (2) detectar el nivel de expresión de una
proteína, ARNm o ADN genómico de la quinasa en la muestra de
preadministración; (3) obtener una o más muestras de
postadministración del sujeto; (4) detectar el nivel de expresión o
de actividad de la proteína, ARNm o ADN genómico de la quinasa en
las muestras de postadministración; (5) comparar el nivel de
expresión o de actividad de la proteína, ARNm o ADN genómico de la
quinasa en la muestra de preadministración con la proteína, ARNm o
ADN genómico de la quinasa en la muestra o muestras de
postadministración y (6) alterar consecuentemente la administración
del agente al sujeto para provocar el efecto deseado, es decir, por
ejemplo, un aumento o reducción de la expresión o la actividad de
la proteína de la quinasa.
La presente invención suministra un agente
terapéutico para uso en el tratamiento tanto profiláctico como
terapéutico de una enfermedad o de un trastorno asociado con la
expresión o la actividad aberrante de la quinasa en un sujeto en
riesgo o susceptible de dicho trastorno. Adicionalmente, las
composiciones de la invención encuentran uso en el tratamiento de
los trastornos aquí descritos. "Tratamiento" se define aquí
como la aplicación o administración de un agente terapéutico a un
paciente, o a la aplicación o administración de un agente
terapéutico a un tejido aislado o a una línea celular de un
paciente que tiene una enfermedad, un síntoma de enfermedad o una
predisposición hacia dicha enfermedad, con el propósito de curar,
sanar, aliviar, paliar, alterar, remediar, mejorar o afectar la
enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición hacia
la enfermedad. Un "agente terapéutico" incluye, aunque no en
sentido limitativo, moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos,
ribozimas, y oligonucleótidos antisentido.
En una aspecto, la invención suministra un
agente para uso en la prevención en un sujeto de una enfermedad o
estado asociado con una expresión o actividad aberrante de la
quinasa mediante la administración al sujeto de una agente que
module la expresión de la quinasa o al menos una actividad del gen
de la quinasa. Los sujetos con riesgo de enfermedad provocada o
participada por una expresión o actividad aberrante de la quinasa
pueden identificarse, por ejemplo, mediante cualquier combinación
de pruebas de diagnóstico o pronóstico según aquí se describe. La
administración de un agente profiláctico puede producirse antes de
la manifestación de los síntomas característicos de una aberración
de la quinasa, de manera que se evite la enfermedad o trastorno, o
alternativamente se retrase su progresión. Dependiendo del tipo de
aberración de la quinasa puede utilizarse, por ejemplo, un agente
agonista de la quinasa o antagonista de la quinasa para el
tratamiento del sujeto. El agente apropiado puede determinarse
basándose en los ensayos de detección aquí descritos.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
agente para uso en la modulación de la expresión o actividad de la
quinasa para propósitos terapéuticos. El uso modulador de la
invención comprende la puesta en contacto de una célula con un
agente que module una o más de las actividades de la actividad de la
proteína de quinasa asociada con la célula. Un agente que module la
actividad de la proteína quinasa puede ser un agente como el aquí
descrito, tal como un ácido nucleico o una proteína, un ligando
consanguíneo de producción natural de una proteína de quinasa, un
péptido, un peptidomimético de la quinasa u otra molécula pequeña.
En una realización, el agente estimula una o más de las actividades
biológicas de la proteína de quinasa. Ejemplos de dichos agentes
estimuladores incluyen la proteína de quinasa activa y una molécula
de ácido nucleico que codifica una proteína de quinasa que ha sido
introducido en la célula. En otra realización, el agente inhibe una
o más de las actividades biológicas de la proteína de quinasa.
Ejemplos de dichos agentes inhibidores incluyen moléculas de ácido
nucleico antisentido de quinasa y anticuerpos
anti-quinasa.
Estos procedimientos moduladores pueden
realizarse in vitro (por ejemplo, cultivando la célula con el
agente) o, alternativamente, in vivo (por ejemplo,
administrado el agente a un sujeto). Como tal, la presente
invención suministra un agente para uso en el tratamiento de un
individuo afectado por una enfermedad o afección caracterizada por
la expresión o la actividad aberrante de una proteína o una molécula
de ácido nucleico de quinasa. En una realización, el uso comprende
la administración de un agente (por ejemplo, un agente identificado
por un ensayo de detección aquí descrito) o una combinación de
agentes que module (por ejemplo, que aumente o que reduzca) la
expresión o actividad de la quinasa. Otra realización comprende una
proteína o una molécula de ácido nucleico de quinasa para uso como
terapia para compensar la expresión o actividad aberrante o reducida
de la quinasa.
La estimulación de la actividad de la quinasa es
deseable en situaciones en la cuales una proteína de quinasa está
anormalmente reducida y/o en las que una actividad incrementada de
la quinasa probablemente tendrá un efecto beneficioso. A la
inversa, la inhibición de la actividad de la proteína quinasa es
deseable en situaciones en las cuales la actividad de la quinasa
está anormalmente aumentada y/o en las que una actividad reducida
de la quinasa probablemente tendrá un efecto beneficioso.
Todas las publicaciones y solicitudes de patente
mencionadas en la memoria técnica son indicativas del nivel de los
expertos en la materia a la cual pertenece esta invención.
Aunque la anterior invención se ha descrito con
algún detalle por medio de ilustraciones y ejemplos para propósitos
de mayor claridad y mejor comprensión, será obvio que pueden
practicarse ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de
las reivindicaciones adjuntas.
Aquellos expertos en la materia reconocerán, o
serán capaces de establecer, utilizando nada más que experimentación
rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones aquí descritas
específicas de la invención. Dichos equivalentes están destinados a
ser incluidos por las siguientes reivindicaciones.
<110> Meyers, Rachel
\hskip1cmKapeller-Libermann, Rosanna
\hskip1cmRory, A.J. Curtis
\hskip1cmWilliamson, Mark
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> 18477, PROTEÍNA QUINASA HUMANA Y
USOS DE LA MISMA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 35800/208928
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3864
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (913) ... (3552)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (3864)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 879
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de consenso para la
proteína quinasa eucariótica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)... (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 1 también podría ser
Isoleucina o Valina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3) ... (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 3 es cualquier
aminoácido excepto Prolina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5) ... (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 5 es cualquier
aminoácido excepto Prolina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6) ... (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 6 podría ser también
Tirosina, Triptófano, Metionina, Glicina, Serina, Treonina,
Aspargina
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipo Histidina
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7) ... (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 7 podría ser también
Glicina o Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8) ... (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 8 es cualquier aminoácido
excepto Prolina o Triptófano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9) ... (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 9 podría ser también
Isoleucina, Valina, Cisteína, Alanina o Treonina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10) ... (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 10 es cualquier
aminoácido excepto Prolina o Ácido aspártico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12) ... (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 12 podría ser también
Serina, Treonina, Alanina, Cisteína, Leucina, Isoleucina, Valina,
Metionina, Fenilalanina o Tirosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13) ... (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Posición 13 "Xaa" se refiere a
cualquier sitio entre los residuos 5 y 18 (cualquier aminoácido)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14) ... (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 14 podría ser también
Isoleucina, Valina, Metionina, Fenilalanina, Tirosina, Triptófano,
Cisteína, Treonina, Alanina o Arginina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15) ... (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 15 podría ser también
Isoleucina, Valina o Prolina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16) ... (16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 16 podría ser también
Isoleucina, Valina, Metionina, Fenilalanina, Alanina, Glicina,
Cisteína, Lisina o Arginina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11) ... (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de consenso para la
proteína quinasa eucariótica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ...(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 1 podría ser también
Isoleucina, Valina, Metionina, Fenilalanina, Tirosina o Cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3) ... (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 3 podría ser también
Tirosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6) ... (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 6 podría ser también
Isoleucina, Valina, Metionina, Fenilalanina o Tirosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11) ... (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 11-13
podría ser también triple Isoleucina, Valina, Metionina,
Fenilalanina, Tirosina o Cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) ...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4) ... (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8) ... (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de consenso para la
proteína quinasa Eucariótica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)... (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 1 podría ser también
Isoleucina, Valina, Metionina, Fenilalanina, Tirosina o Cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3) ... (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 3 podría ser también
Tirosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6) ... (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 6 podría ser también
Isoleucina, Valina, Metionina, Fenilalanina o Tirosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7) ... (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 7 podría ser también
Serina, Treonina, Alanina, o Cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)... (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 11-13
podría ser también triple Isoleucina, Valina, Metionina,
Fenilalanina, Tirosina
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipo Cisteína
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) ...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4) ... (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8) ... (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3003
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (52) ... (2688)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
Claims (25)
1. Una molécula aislada de ácido nucleico que
codifica una proteína quinasa seleccionada entre:
- a)
- una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID NO: 1, o el inserto de ADNc del plásmido depositado con ATCC como Accession Number PTA-1775;
- b)
- una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO: 2; y
- c)
- el complemento de a).
2. La molécula aislada de ácido nucleico de la
reivindicación 1, que se selecciona entre:
- a)
- un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID NO: 1, o el inserto de ADNc del plásmido depositado con ATCC como Accession Number PTA-1775 o su complemento; y
- b)
- una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO: 2.
3. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, que además comprende secuencias de ácido nucleico
de vectores.
4. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, que además comprende secuencias de ácido nucleico
que codifican un polipéptido heterólogo.
5. Una célula anfitriona que contiene la
molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.
6. La célula anfitriona de la reivindicación 5
que es una célula anfitriona de mamífero.
7. La célula anfitriona de la reivindicación 5
que es una célula anfitriona de mamífero no humano.
8. Un polipéptido aislado que tiene actividad de
proteína quinasa seleccionado entre:
- a)
- un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que consta de la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID NO: 1 o del inserto de ADNc del plásmido depositado con ATCC como Accession Number PTA-1775; y
- b)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO: 2.
9. El polipéptido aislado de la reivindicación 8
que está codificado por la molécula de ácido nucleico que consta de
la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID NO: 1 o del inserto de ADNc
del plásmido depositado con ATCC como Accession Number
PTA-1775.
10. El polipéptido aislado de la reivindicación
8 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO: 2.
11. El polipéptido de la reivindicación 8 que
comprende además secuencias de aminoácidos heterólogos.
12. Un anticuerpo que se une específicamente al
polipéptido que consta de la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID
NO: 2.
13. Un procedimiento para producir un
polipéptido que tiene actividad de proteína quinasa, seleccionándose
el polipéptido entre:
- a)
- un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que consta de la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID NO: 1 o del inserto de ADNc del plásmido depositado con ATCC como Accession Number PTA-1775; y
- b)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO: 2; que comprende el cultivo de la célula anfitriona de la reivindicación 7 bajo condiciones en las que se exprese una molécula de ácido nucleico que codifiqua dicho polipéptido.
14. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 13 en el que dicho polipéptido está codificado por
la molécula de ácido nucleico que consta de la secuencia de
nucleótidos de SEQ. ID NO: 1 o del inserto de ADNc del plásmido
depositado con ATCC como Accession Number
PTA-1775.
\newpage
15. El procedimiento de la reivindicación 13 en
el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de
SEQ. ID NO: 2.
16. Un procedimiento para detectar la presencia
de un polipéptido de la reivindicación 8 en una muestra, que
comprende:
- a)
- el contacto de la muestra con un anticuerpo de la reivindicación 12; y
- b)
- la determinación de si el anticuerpo se une con el polipéptido en la muestra.
17. Un equipo para llevar a cabo el
procedimiento de la reivindicación 16 que comprende el anticuerpo de
la reivindicación 12 e instrucciones para su uso.
18. Un procedimiento para detectar la presencia
de una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 en una
muestra, que comprende los pasos de:
- a)
- poner en contacto la muestra con una sonda o un iniciador de ácido nucleico que se hibridice selectivamente con la molécula de ácido nucleico; y
- b)
- determinar si la sonda o el iniciador de ácido nucleico se une a una molécula de ácido nucleico en la muestra.
19. El procedimiento de la reivindicación 18, en
el que la muestra comprende moléculas de ARNm y se pone en contacto
con una sonda de ácido nucleico.
20. Un procedimiento para identificar un
compuesto que se una a un polipéptido de la reivindicación 8 que
comprende los pasos de:
- a)
- poner en contacto un polipéptido o una célula que exprese un polipéptido de la reivindicación 8 con un compuesto de ensayo; y
- b)
- determinar si el polipéptido se une al compuesto de ensayo.
21. El procedimiento de la reivindicación 20, en
el que la unión del compuesto de ensayo con el polipéptido se
detecta mediante un procedimiento seleccionado entre:
- a)
- la detección de la unión detectando directamente la unión del compuesto de ensayo/el polipéptido; y
- b)
- la detección de la unión usando un ensayo de unión de competición.
22. Un procedimiento para identificar un
compuesto que module la actividad de un polipéptido de la
reivindicación 8 que comprende:
- a)
- poner en contacto un polipéptido de la reivindicación 8 con un compuesto de ensayo; y
- b)
- determinar el efecto del compuesto de ensayo sobre la actividad del polipéptido para identificar así un compuesto que modula la actividad del polipéptido.
23. Un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 8 para su uso en el tratamiento del cáncer de
colon.
24. Una secuencia de nucleótidos de acuerdo con
la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento del cáncer de
colon.
25. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 12 para su uso en el tratamiento del cáncer de
colon.
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