DE10147088A1 - Verwendung von Wirksubstanzen zur Prophylaxe und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit Zellwachstumsstörungen einhergehen und Testsystem zum Auffinden solcher Wirksubstanzen - Google Patents

Verwendung von Wirksubstanzen zur Prophylaxe und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit Zellwachstumsstörungen einhergehen und Testsystem zum Auffinden solcher Wirksubstanzen

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DE10147088A1 DE2001147088 DE10147088A DE10147088A1 DE 10147088 A1 DE10147088 A1 DE 10147088A1 DE 2001147088 DE2001147088 DE 2001147088 DE 10147088 A DE10147088 A DE 10147088A DE 10147088 A1 DE10147088 A1 DE 10147088A1
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Wilfried Rossoll
Michael Anton Sendtner
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Abstract

Ein Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung mindestens einer Wirksubstanz zur Prophylaxe und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit Zellwachstumsstörungen einhergehen, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirksubstanz(en) die Aktivität mindestens einer Kinase des COP9/Signalosom-Komplexes modulieren.

Description

  • Die Erfindung betrifft die Verwendung mindestens einer Wirksubstanz, die mindestens eine Kinase des COP9/Signalosom-Komplexes moduliert, zur Therapie und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, die mit Zellwachstumsstörungen einhergehen sowie ein Testsystem zum Auffinden solcher Wirksubstanzen.
  • Differenzierungs-, Teilungs- und Aktivierungsprozesse in einer Zelle werden gesteuert über die Aktivierung und Inaktivierung regulatorischer Proteine. Ein wesentlicher Mechanismus der Aktivierung und Inaktivierung solcher Proteine ist deren Phosphorylierung und Dephosphorylierung durch Kinasen und Phosphatasen. Kinasen stellen die wesentlichen Komponenten der unterschiedlichen Signalübertragungswege von der Zellmembran zum Zellkern dar und leiten des weiteren die Inaktivierung von Proteinen, ihre Ausschleusung aus dem Zellkern und ihren proteolytischen Abbau in den Proteasomen des Zytoplasmas und des Zellkerns ein.
  • Als eine solche in die Regulierungsprozesse eingreifende Kinase ist beispielsweise die Nemo-like Kinase (Nlk) bekannt. Die Nlk ist als Bestandteil des TAK1- Nlk-MAPK-Signalübertragungsweg beschrieben worden (Brott et al., PNAS USA 95, 963-968, 1998). In diesem Signalübertragungsweg aktiviert die Transforming Growth Sector Activated Kinase 1 (TAK1) die Nlk, welche wiederum den T-Cell Factor (TCF)/Lymphoid Enhancer Factor (LEF) phosphoryliert. Durch diese Phosphorylierung wird eine Komplexbildung von TCF mit β-Catinin inhibiert und die Bindung von TCF/β-Catininkomplexe an die DNA sowie deren Transkriptionsaktivität gehemmt. Eine inhibitorische Wirkung der Nlk für die Transkriptionsaktrivität des TCF/LIF-Komplexes des TAK1-Nlk-MAPK-Signalübertragungsweges ist damit bekannt (Ishitani et al., Nature 399, 798-802, 1999).
  • Desweiteren erfolgt durch die Nlk eine Hemmung des durch Wnt induzierten Signalübertragungsweges. Eine Inaktivierung kann hierbei durch den proteolytischen Abbau der durch Nlk phosphorylierten Proteine in den Proteasomen erfolgen. Durch den verstärkten Abbau dieser phosphorylierten Proteine (Transkriptionsfaktoren) können je nach deren Promoterspezifität Differenzierungsprozesse in der Zelle moduliert werden.
  • Das COP9/Signalosom der Säugetierzelle stellt einen Proteinkomplex dar, der in solche Signalübertragungswege auf unterschiedliche Weise eingreift. Eine besondere Funktion des COP9/Signalosom-Komplexes scheint seine Beteiligung am zellulären Abbau von Proteinen zu sein (Schwechheimer und Deng Semin., Cell Dev. Biol. 11, 495-503, 2000). Der COP9/Signalosom-Komplex besteht aus mindestens 8 Untereinheiten (CSN1-CSN8) und besitzt Kinaseaktivität (Seeger et al., FASEB J, 12, 469-478, 1998). Die Funktionen einiger dieser Untereinheiten sind beschrieben worden:
  • Die Überexpression der Untereinheit CSN1
    • - inhibiert die Kinaseaktivität von JNK und die Aktivität des Jun/Fos (AP-1)- Transkriptionskomplexes (Tsuge et al., JMB 305, 1-9, 2001).
  • Die Überexpression der Untereinheit CSN2
    • - verstärkt die Transkriptionsaktivität von AP-1 durch Phosphorylierung und Aktivierung von c-Jun (Naumann et al., J Biol Chem, 274 (50), 35297-35300, 1999),
    • - verstärkt die Funktion des freien (nicht hormon-gebundenen) Thyroidhormonrezeptus als Repressor der Transkription (Lee et al., Mol. Endocrinol. 9, 243-254, 1995).
  • Weiterhin stellt die Untereinheit CSN2 vermutlich das Thyroid hormone receptorinteracting protein 15 (Trip 15) dar, welches an das Interferon consensus sequencebinding protein (ICSBP) bindet und dieses phosphoryliert. Diese Phosphorylierung ist notwendig für die Bindung des ICSBP an den Interferon Regulatory Factor-1 (IRF-1) und die dadurch bewirkte Repression der Trankriptionsaktivität (Cohen et al., J Biol Chem, 275 (50), 39081-39089, 2000).
  • Die Untereinheit CSN5 besitzt vielfältige Funktionen:
    • - als "Jun-activation domain-binding protein-1" (JAB-1) stabilisiert CSN5 die Interaktion des c-Jun-Proteins im AP-1 mit dem AP-1-Promoter-Element. Es assoziiert zugleich mit der zytoplasmatischen Domäne des Intergrins LFA-1. Wenn dieses Intergrin an Komponenten der extrazellulären Matrix bindet, wird CSN5 freigesetzt und erhält die Möglichkeit, in den Kern zu penetrieren, um hier die AP-1-Promoteraktivität zu verstärken (Blanschi et al., Nature 401, 617-621, 2000).
    • - CSN5 ist mitbeteiligt an der Phosphorylierung und Translokation des p27- Proteins in das Zytoplasma und dem dortigen proteolytischen Abbau in den Proteasomen. P27 inhibiert die Komplexe der Cycline EA mit cdk2 und cdk1. Eine Verminderung von p27 führt zu Aktivierung des Zellzyklusses in der G1- Phase.
    • - CSN5 wirkt auf den Progesteron-Rezeptor und den Steroid Receptor Coactivator-1 (SRC-1), stabilisiert die Komplexe zwischen beiden sowie deren DNA-Bindung (Chaochereao et el., J Biol Chem 275, 8540-8548, 2000).
    • - CSN5 potenziert die Aktivität einer Reihe von Transkriptionsfaktoren, von denen bekannt ist, dass sie mit SRC-1 assoziieren (Chaochereao et el., J Biol Chem 275, 8540-8548, 2000).
    • - CSN5 ist beteiligt an dem Proteinabbau des Choriogonadotropin-Rezeptors.
    • - CSN5 ist beteiligt an der Komplexbildung zwischen Bcl-3 und NFkB und damit an der Modulation der NFkB-Funktion.
    • - CSN5 bindet an p53, induziert dessen Phosphorylierung und proteolytischen Abbau (Bech-Otschir et al., Embo J 20, 1630-1639, 2001).
  • Die Untereinheit CSN6 ist identisch mit dem menschlichen HIV-1 Vpr interacting protein (VIP) (Mahalingam et al., PNAS 95, 3419-3424). Eine Überexpression des Vpr verursacht eine Rückverteilung des CSN6 vom Kern in die Kernperipherie und eine Blockade der Zellteilung am G2-/M-Phasenübergang.
  • Bislang ist nicht bekannt, ob die jeweiligen CSN-Proteine die ihnen zugesprochene Funktion allein oder im Komplex als COP9/Signalosom ausüben. Beobachtet wurde, dass die Untereinheiten CSN1 und CSN8 in Säugetierzellen lediglich komplexiert im COP9/Signalosom vorliegen, während die Untereinheiten CSN4 und CSN5 sowohl als Monomere als auch komplexiert im COP9/Signalosom vorliegen (Wei und Deng, Trends in Genetics 15, 98-103, 1999; Karniol et al., FEBS Lett. 439, 173-179, 1998).
  • Weiterhin ist zum großen Teil unbekannt, wie die CSN-Proteine ihre Funktion im einzelnen ausüben. Elektronenmikroskopische und biochemische Untersuchungen zeigten, dass die Untereinheiten CSN2 und CSN7 in phosphoryilierter Form vorliegen, dass diese Phosphorylierung jedoch nicht für die Kinaseaktivität des COP9/Signalosomkomplexes erforderlich ist (Kapelari et al., J Mol Biol 300, 1169-1178, 2000).
  • Aufgrund der zahlreichen offenen Fragen, die die Funktion sowie Funktionsmechanismen der CSN-Proteinen sowie des COP9/Signalosom-Komplexes insgesamt betreffen, besteht ein großer Bedarf, Kenntnisse über weitere Einzelheiten zu erlangen, um mit geeigneten Wirksubstanzen unterschiedlichste Erkrankungen, die mit Zellwachstumsstörungen einhergehen, behandeln zu können.
  • Solche Erkrankungen können beispielsweise im Zusammenhang stehen mit
    • - unkontrollierter bzw. unerwünschter Zellproliferation, beispielsweise bei Tumorerkrankungen, Leukämien, Autoimunerkrankungen, Rheumatoide Erkrankungen, Hauterkrankungen, insbesondere Psoriasis, Organabstoßungen oder Immunreaktionen, oder
    • - unkontrolliertem Zelltod, beispielsweise bei viralen und bakteriellen Infektionserkrankungen, Alzheimer, Creutzfeld-Jakob-Syndrom, Multiple Sklerose, Morbus Parkinson, Spinale Muskelatrophien, Diabetische Neuropathien, Amyotrophe Lateralsklerose oder Cerebrale Ischaemie.
  • Von besonderem Interesse ist die Beantwortung der Frage, welche Bausteine des COP9/Signalosom-Komplexes über welche biochemischen Mechanismen die Funktion regulatorischer Proteine modulieren und ihren Abbau verursachen oder verhindern.
  • Mit vorliegender Erfindung wurde nun überraschenderweise gefunden, dass die vorab bereits als Bestandteil des TAK1-Nlk-MAPK-Signalübertragungsweges beschriebe Nlk, auch Bestandteil des COP9/Signalosom-Komplexes ist.
  • Es wurde weiterhin überraschenderweise gefunden, dass die Nlk auch für das COP9/Signalosom eine inhibitorische Kinaseaktivität aufweist, die in der Phosphorylierung einer Reihe von Transkriptionsfaktoren, beispielsweise c-Jun, besteht und eine Inaktivierung dieser Transkriptionsfaktoren zur Folge hat.
  • Ferner wurde überraschenderweise gefunden, dass Nlk solche Serine des c-Jun phosphoryliert, die sich an anderen Positionen befinden als diejenigen Serine, die durch die Kinasen JNK oder ERK phosphoryliert werden (Guerrini et al., J Neurosci 17, 6057-6063, 1997; Schmidt-Ullrich et al., Development 122, 2117-2128, 1996).
  • Überraschenderweise wurde weiterhin gefunden, dass Nlk im COP9/Signalosom die Aktivität des Transkriptionsfaktorkomplexes AP-1 deutlich vermindert. Diese Repression der Transkriptionsaktivität durch Nlk war nicht auf AP-1 beschränkt, sondern konnte ebenfalls für andere Transkriptionsfaktoren, beispielsweise NFkb, bewiesen werden.
  • Weiterhin wurde mit vorliegender Erfindung gefunden, dass Nlk mit den Untereinheiten CSN7a und CSN7b des COP9/Signalosoms verbunden ist, jedoch keine direkte Verbindung mit der CSN5-Untereinheit eingeht.
  • Die überraschende Erkenntnis der vorliegenden Erfindung, dass COP/Signalosome sowie die daran assoziierte Nlk entscheidend an der Modulierung der Aktivität von Proteinen, welche die Zellproliferation, die Zelldifferenzierung sowie den Zelltod kontrollieren, beispielsweise NFkBAP-1, TCF/LEF, p27, p53, Vpr, ICSBP und SRC-1, beteiligt sind, eröffnet neue Möglichkeiten für den Einsatz von Wirksubstanzen zur Prophylaxe und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit Zellwachstumsstörungen, wie sie bereits vorangehend beispielsweise aufgeführt worden sind, einhergehen.
  • Ein weiterer Hinweis insbesondere auf Erkrankungen des Nervensystems besteht darin, dass Nlk besonders stark im Hirngewebe exprimiert wird (Brott et al., PNAS USA 95, 963-968, 1998). Es ist daher anzunehmen, dass Veränderungen von Nlk in COP9/Signalosome der Nervenzellen zu einer erheblichen Beeinflussung der Funktion, Differenzierung und des Überlebens von Nervenzellen führt.
  • Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung mindestens einer Wirksubstanz zur Prophylaxe und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit Zellwachstumsstörungen einhergehen, wobei die Wirksubstanz(en) die Aktivität mindestens einer Kinase des COP9/Signalosom-Komplexes modulieren.
  • Die Modulation mindestens einer Kinase stellt gemäß der vorliegenden Erfindung eine Hemmung oder Verstärkung der Aktivität der Kinase dar.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei der modulierten Kinase um die Nlk-Kinase.
  • Wirksubstanzen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Substanzen, die in der Lage sind, mindestens eine Kinase des COP9/Signalosom-Komplexes zu modulieren. Hierbei kann es sich um Wirksubstanzen handeln, die Kinasen in ihrer Aktivität hemmen oder verstärken, beispielsweise durch Phosphorylierung oder Dephosphorylierung.
  • Weiterhin sind als Wirksubstanzen im Sinne dieser Erfindung Derivate der Wirksubstanzen zu verstehen, die beispielsweise durch enzymatische Spaltung, in eine erfindungsgemäße aktive Wirksubstanz umgewandelt werden sowie auch Vorstufen von Wirksubstanzen, die metabolisch in eine erfindungsgemäß aktive Substanz umgewandelt werden.
  • Bevorzugt ist bzw. sind die verwendete Wirksubstanz(en) ausgewählt aus nachfolgenden Wirksubstanzen:
    • - Kinase-inhibierende Derivate des 4H-1-Benzopyran, beispielsweise in EP 0 137 193 und EP 366 061 offenbart. Die Struktur-Wirkungsbeziehung für diese Derivate wurde beispielsweise von Sedlacek et al. (Int. J Oncol 9: 1143-1168, 1996) beschrieben.
    • - Flavopiridolderivate, beispielsweise Kim et al., (J Med Chem 43(22): 4126-4134, 2000), offenbart, insbesondere Thio-Flavopiridol und Oxy- Flavopiridol.
    • - 2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4-oxo-4H-(1)benzopyran, beispielsweise von Ebendal (WO 00/50030) offenbart;
    • - 7,12-Dihydro-indolo (3,2-d)(1) Benzazepin-6(5H)-one (NSC 664704 Sausville et al. Pharmacol. Ther. 82(2-3), 285-292, 1999);
    • - Phosphokinaseinhibitoren, beispielsweise 7OH-Staurosporine und ihre Phosphokinase inhibierenden Derivate, Butyrolactone, Roscovitine, Purvalanol A, Emodin, Anilinoquin-azoline (PD-168393 und PD 169414), PD 184352 (Duesbery et al., Nature Medicine 5(7), 736-737, 1999) und Phenylamino-pyrimidine (STI 571, CGP 78850, CP 358774, CP59326 und CGP 60474)), Trioylimidazole (1-779450) (Meijer et al., Parmacol. Ther. 82(2-3), 297-284, 1999; Sedlacek et al., Int J Oncol 9, 1143-1168, 1996; Sedlacek Drug 59(3), 435-476, 2000);
    • - Paullone (Zaharevitz et al., Cancer Res. 59, 2566-2569, 1999);
    • - SB203580 [4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)- 1H-imidazol, (Ishikawa et al., J Neurochem 75(2), 494-502, 2000, Harada und Sugimoto, Jpn J Pharmacol 79(3), 369-378, 1999)];
    • - U0126 [1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2aminophenylthio) butadien] (Favata et al., J Biol Chem 273(29), 18623-18632, 1998; DeSilva et al., J Immunol 160, 4175-4181, 1998)];
    • - PD098059 [2-2'-amino-3'-methoxyphenyl)-oxanaphtalen-4-on)], (Dudley et al., PNAS USA 92, 7686-7686, 1995);
    • - PD184352 [2-(2-chlor-4-jod-phenylamino)-N-cyclopropylmethoxy-3,4- difluorbenzamid], (Sebolt-Leopold et al., Nature Med 5, 810-816, 1999);
    • - 3-Aminomethylen-indolin-Derivate (Heckel et al., DE 9 24 401, Eberlein et al., DE 8 44 003; WO 00/018734);
    • - CEP-1347 (KT7515) bis-ethylthiomethyl (Maroney et al., J Neurochem 73(5), 1901-1912, 1999);
    • - Tetrapyrrolische Makrocyclen, beispielsweise 5,10,15,20- Tetraarylporphyrin und 5,10,15-Triarylcorrol (Aviezer et al., WO 00/27379);
    • - Pyrimidonderivate (Ando et al., WO 00/018758);
    • - Antisense-Oligonukleotide, welche sich spezifisch an die DNA-Sequenz oder m-RNA Sequenz kodierend für Nlk anlagern und deren Transkription oder Translation inhibieren,
    • - Antikörper- oder Antikörperfragmente, spezifisch für Nlk,
    • - Fusionsproteine, enthaltend mindestens ein Antikörperfragment, beispielsweise ein Fv-Fragment, welche die Kinaseaktivität der Nlk inhibieren,
    • - Gen für Nlk, eingefügt in ein Plasmid und vermischt mit einer die Zelltransfektion unterstützenden Substanz, beispielsweise kationische Lipide oder kationische Polymere,
    • - Gen für Nlk, eingefügt in einen Vektor,
    • - Gen für Nlk mit eingefügter negativ dominanter Mutation,
    • - Antisense-Oligonukleotide, welche sich spezifisch an die DNA-Sequenz oder m-RNA Sequenz kodierend für Nlk anlagern und deren Transkription oder Translation inhibieren,
    • - Antikörper- oder Antikörperfragmente, spezifisch für Nlk und/oder
    • - Fusionsproteine, enthaltend mindestens ein Antikörperfragment, beispielsweise ein Fv-Fragment, welche die Kinaseaktivität der Nlk inhibieren.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Testsystem zum Auffinden von Wirksubstanzen, welche die Aktivität mindestens einer Kinase des COP9/Signalosom-Komplexes modulieren, enthaltend:
    • a) mindestens eine Probe, enthaltend mindestens einen COP9/Signalosom-Komplex und
    • b) mindestens ein Mittel zur Bestimmung der Aktivität mindestens einer Kinase des COP9/Signalosom-Komplexes.
  • Bevorzugt ist eine Probe im Sinne der vorliegenden Erfindung beispielsweise mindestens eine Zelle enthaltend mindestens einen COP9/Signalosom-Komplex, wobei die Aktivität der jeweiligen Kinase(n), vorzugsweise Nlk, moduliert wird.
  • Die Zellen umfassen beispielsweise pro- und eukaryotische Zellen, insbesondere Zellen, die als Wildtyp-Zellen mindestens eine aktive Kinase des COP9/Signalosoms, vorzugsweise Nlk, exprimieren.
  • In Zellen, die als Wildtyp-Zellen nicht oder nur in geringerem Maße die jeweilige(n) aktive(n) Kinase(n) des COP9/Signalosoms exprimieren, kann durch dem Fachmann bekannte Methoden eine Expression erreicht werden. Solche Methode umfassen beispielsweise Infektion, Transfektion oder Transformation von Zellen mit Vektoren, die Nukleinsäuren enthalten, die für die jeweilige(n) aktive(n) Kinase(n) des COP9/Signalosoms, vorzugsweise Nlk, oder Teile davon kodieren.
  • Zellen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Zellen aus unterschiedlichen Organen und Geweben, beispielsweise Zellen der Blut- und Lymphgefäße oder Zellen, die Körperhöhlen auskleiden. Ebenfalls umfasst sind Zellkulturen, insbesondere eukaryotische Zellkulturen, beispielsweise
    • - 293-, 293T- und 293T7-Zellkulturen aus Homo sapiens,
    • - B82-, NIH 3T3-, L929-Zellkulturen aus Mus musculus,
    • - BHK-Zellkulturen aus Cricetus cricetus,
    • - CHO-Zellkulturen aus Cricetulus griseus,
    • - MDCK-Zellkulturen aus Canis familiaris,
    • - Vero-, COS-1- und COS-7-Zellkulturen aus Cercopithecus aethiops
    • - und/oder
    • - primäre Embryo-Fibroblasten aus Gallus gallus (CEF cells).
  • Eine Probe kann ebenfalls mindestens ein Zellextrakt, mindestens eine Proteinmischung und/oder mindestens eine Mischung, enthaltend mindestens einen COP9/Signalosom-Komplex, vorzugsweise Nlk, sein.
  • Desweiteren umfaßt der Begriff Probe auch Zellextrakte, die beispielsweise aus einer der vorangehend aufgeführten Zellen mit dem Fachmann bekannten Standardverfahren gewonnen werden können. Hierfür geeignete Verfahren umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, "freeze thawing", "sonification" oder "Frenchpressing". Gegebenenfalls kann ein solcher Zellextrakt in weiteren Schritten aufgearbeitet bzw. aufgereinigt werden. Bevorzugte Schritte umfassen beispielsweise Präzipitations- oder Filtrationsverfahren und/oder chromatographische Verfahrensschritte. Geeignete chromatographische Verfahren sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise Anionen- bzw. Kationenaustauschchromatographie, Affinitätschromoatographie und/oder Größenausschlußchromatographie.
  • Desweiteren kann die Probe auch eine Mischung gereinigter oder rekombinanter Proteine enthaltend mindestens einen COP9/Signalosom-Komplex, vorzugsweise Nlk, und/oder eine Proteinmischung sein, die zusätzlich weitere Komponenten enthält, beispielsweise Mittel, die für die Bestimmung der Aktivität der Kinase(n), vorzugsweise Nlk, des COP9/Signalosom-Komplexes verwendet werden können.
  • Vorzugsweise ist eine Probe im Sinne der vorliegenden Erfindung ein isolierter COP9/Signalosom-Komplex, wobei die Aktivität der jeweiligen Kinase(n), vorzugsweise Nlk, moduliert wird.
  • Mittel zur Bestimmung der Aktivität von mindestens einer Kinase, vorzugsweise der Nlk, des COP9/Signalosom-Komplexes sind beispielsweise Substrate der Kinase(n), Puffer, Detergentien, Proteaseinhibitoren, NTPs und/oder geeignete Metallionen.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Testsystem wobei die Probe
    • a) mindestens ein Gen, kodierend für mindestens eine negative Mutante mindestens einer Kinase und/oder
    • b) mindestens eine negative Mutante mindestens einer Kinase enthält.
  • Eine in dieser Ausführungsform verwendete Probe ist beispielsweise eine Zelle, die eine reduzierte oder keine Aktivität einer Kinase, vorzugsweise Nlk-Aktivität, des COP9/Signalosom-Komplexes aufweist. Dies kann beispielsweise erreicht werden, durch das Einführung einer negativen, insbesondere einer dominant negativen, Mutation.
  • Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden von mindestens einer Wirksubstanz zur Prophylaxe und/oder Therapie von Zellwachstumsstörungen, die auf mindestens eine Kinase des COP9/Signalosom- Komplexes derart einwirkt, dass das Zellwachstum moduliert wird, enthaltend folgende Schritte:
    • a) Inkontaktbringen mindestens einer Probe mit mindestens einer potentiellen Wirksubstanz, und
    • b) Bestimmen der Aktivität mindestens einer Kinase des COP9/Signalosom- Komplexes.
  • Inkontaktbringen im Sinne der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise durch Zugabe der Wirksubstanzen in das Nährmedium einer Zellkultur oder durch lokale oder systemische Verabreichung der Wirksubstanzen in einen Organismus erfolgen.
  • Das Inkontaktbringen einer Probe mit mindestens einer potentiellen Wirkssubstanz umfaßt ferner beispielsweise jede Form des Mischens, wobei sowohl die Probe zu der potentiellen Wirksubstanz hinzugefügt werden kann als auch die potentielle Wirksubstanz zur Probe. Die Probe und/oder die potentielle Wirksubstanz können dabei jeweils als Feststoff, Lösung, Suspension, Aufschlemmung oder an eine feste Phase gebunden vorliegen. Wenn es sich bei der Probe, die mit potentiellen Wirksubstanz(en) in Kontakt gebracht werden, um Zellen handelt, umfaßt der Schritt des Inkontaktbringens auch im Stand der Technik bekannte Verfahren, die das Einführen von Substanzen in intakte Zellen erlauben, wie beispielsweise Infektion, Transfektion und/oder Transformation. Diese Verfahren sind besonders bevorzugt, wenn es sich bei der potentiellen Wirksubstanz um nackte DNA, Viren, Viroide, Virosomen und/oder Liposomen handelt, wobei die Liposomen oder Virosomen auch geeignet sind, neben einem potentiell wirksamen Nukleinsäuremolekül weitere potentielle Wirksubstanzen mit der Probe in Kontakt zu bringen. Dem Fachmann sind eine Reihe weiterer Methoden bekannt, die dazu dienen, potentielle Wirksubstanzen in Zellen einzuführen.
  • Das Bestimmen der Aktivität mindestens einer Kinase, vorzugsweise Nlk, des COP9/Signalosom-Komplexes in der Probe ist durch eine Reihe direkter und indirekter Nachweisverfahren möglich. Die jeweils geeigneten Verfahren hängen von der Natur der Probe ab. In Zellen wird die Aktivität der Kinase(n), vorzugsweise Nlk, zum einem durch die Menge der in der Zelle exprimierten Kinase(n) bestimmt und zum anderen durch die Menge der aktivierten Kinase(n). Die Aktivierung der Transkription der die Kinase(n), insbesondere Nlk, kodierenden Gene kann beispielsweise durch die Bestimmung der Menge der Kinasen-mRNA erfolgen. Im Stand der Technik bekannte Standardverfahren zur Bestimmung der mRNA Menge umfassen beispielsweise DNA-Chip-Hybridisierung, RT-PCR, "Primer"-Extension und "RNA-Protection". Desweiteren kann die Bestimmung der Kinase-Aktivität, die auf der Induktion oder Repression der Transkription des (der) jeweiligen Kinase-Gens(e) beruht auch durch die Kopplung des Kinase- Promotors an geeignete Reportergenkonstrukte erfolgen. Der Nachweis der Steigerung der Expression der Kinasen kann jedoch auch auf Proteinebene erfolgen, wobei in diesem Fall die Menge des Proteins beispielsweise durch gegen die Kinase(n) gerichtete Antikörper nachgewiesen wird. Die Änderung der Aktivität der Kinase(n) kann jedoch auch auf verstärkte oder erniedrigte Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung der Kinase(n) zurückgeführt werden. Die Änderung der Phosphorylierung der Kinase(n) kann beispielsweise durch Antikörper nachgewiesen werden, die gegen phosphorylierte Aminosäuren gerichtet sind.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Prophylaxe und/oder Therapie von Zellwachstumsstörungen, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Wirksubstanz und gegebenenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe.
  • Vorzugsweise wird die Wirksubstanz gemäß vorliegender Erfindung für die lokale oder systemische Verabreichung in einen Organismus mit Hilfe der dem Fachmann geläufigen Methoden und Hilfs- und/oder Zusatzstoffen zu einem Arzneimittel zubereitet.
  • Ein Arzneimittel der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise bei Erkrankungen, die mit Zellwachstumsstörungen einhergehen, verwendet.
  • Geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe, die beispielsweise der Stabilisierung oder Konservierung des Arzneimittels oder Diagnostikums dienen, sind dem Fachmann allgemein bekannt (siehe z. B. Sucker H et al. (1991) Pharmazeutische Technologie, 2. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart). Beispiele für solche Hilfs- und/oder Zusatzstoffe sind physiologische Kochsalzlösungen, Ringer-Dextrose, Dextrose, Ringer-Laktat, entmineralisiertes Wasser, Stabilisatoren, Antioxidantien, Komplexbildner, antimikrobielle Verbindungen, Proteinaseinhibitoren und/oder inerte Gase.
  • Die lokale Verabreichung kann beispielsweise auf die Haut, auf die Schleimhaut, in eine Körperhöhle, in ein Organ, in ein Gelenk oder in das Binde- oder Stützgewebe erfolgen. Die systemische Verabreichung erfolgt vorzugsweise in den Blutkreislauf, in die Peritonealhöhle oder in die Bauchhöhle.
  • Die Arzneimittelzubereitung enthaltend die erfindungsgemäße Wirksubstanz richtet sich nach der Art der Wirksubstanz und der Art ihrer Verabreichung und kann beispielsweise eine Lösung, eine Suspension, eine Salbe, ein Puder, eine Sprayform oder eine andere Inhalationszubereitung darstellen. Vorzugsweise werden Nukleotidsequenzen mit dem Fachmann bekannten Methoden in einen viralen Vektor oder ein Plasmid eingefügt und mit Hilfsstoffen für die Zelltransfektion versetzt. Zu diesen Hilfsstoffen gehören beispielsweise kationische Polymere oder kationische Lipide. Antisense-Oligonukleotide werden mit den dem Fachmann geläufigen Methoden derivatisiert, um sie vor dem enzymatischen Abbau durch DNAsen oder RNAsen zu schützen.
  • Die Wirksubstanz gemäß der Erfindung kann in Form eines Salzes, Esters, Amids oder als eine Vorstufe vorliegen, wobei vorzugsweise nur Modifikationen der Wirksubstanz verwendet werden, die keine übermäßige Toxizität, Irritationen oder allergische Reaktionen am Patienten auslösen.
  • Die Wirksubstanz wird unter sterilen Bedingungen, mit einem, dem Fachmann bekanntem, physiologisch akzeptablen Trägerstoff und möglichen Preservativen, Puffern oder Treibmitteln, je nach Bedarf, vermischt.
  • Bevorzugt wird die erfindungsgemäße Wirksubstanz in einer einmaligen Dosis, besonders bevorzugt in mehreren Dosen verabreicht, wobei die einzelnen Dosen die maximal tolerable Dosis (MTD) der jeweiligen Wirksubstanz für den Menschen nicht übersteigt. Vorzugsweise wird eine Dosis gewählt, welche die Hälfte der MTD beträgt. Beispielsweise liegt für die Infusion von Flavopiridol die MTD beim Tumorpatienten bei 50 mg/m2/dx3 (Senderowicz et al J Clin Oncol 16(9): 2986-2999,1998). Für die Anwendung am Menschen im Sinne der vorliegenden Erfindung ist Flavopiridol somit in einer täglichen Dosis von 0,1-50 mg/m2, vorzugsweise von 5-30 mg/m2, besonders bevorzugt von 25 mg/m2 zu verabreichen. Die Tagesdosis kann einmalig am Tag oder in mehreren Teilportionen aufgeteilt über den Tag hinweg, vorzugsweise in etwa gleichen Zeitabständen verabreicht werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Verabreichung entweder lokal oder systemisch, nur an einem Tag oder über mehrere Tage täglich oder an jedem zweiten oder dritten Tag über mehrere Wochen erfolgen, bis eine therapeutische Wirkung sichtbar wird.
  • Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines erfindungsgemäßen Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von Zellwachstumsstörungen, welches das Zellwachstum fördert oder hemmt.
  • Die nachfolgenden Beispiele zu dieser Erfindung zeigen, dass Nlk assoziiert mit dem COP9/Signalosom-Komplex eine wichtige Rolle bei der Koordination der Signalübertragungswege von Wnt, NFkB, AP1, Thyroid Hormon Rezeptor und wahrscheinlich auch von Zellzyklus-Regulatoren in Neuronen und Gliazellen spielen.
    • Beispiel 1 Nachweis von Nlk im COP9/Signalosom-Komplex
  • In einem Hefe 2-Hybrid-Screen (GAL 4 based Matchmaker 2 Hybrid 2 system, (Fa. Clontech, Erembodegen, Belgien) mit Nlk wurde die Signalosom- Untereinheit CSN7a als Interaktionspartner von Nlk identifiziert. Hierzu wurde eine Genbibliothek, isoliert aus postnatalem Mäusehirn (Fa. Clontech, Erembodegen, Belgien), nach Bindungspartnern von Nlk untersucht. Dazu wurde eine Nlk splicing-Variante verwendet, der die Region fehlte, welche für die Alaninreichen N-terminalen 101 Aminosäuren kodiert (Garcia-Fernandez et al., Biochem Biophys Res Commun 196, 396-401, 1993). Die cDNA für diese Nlk-Variante wurde mit der GAL4 DNA-Bindedomäne fusioniert und diente als Köder.
  • 50 mM 3-AT wurde LEU-TRP-HIS-Medium zugesetzt um die Reportergenaktivierung durch den Köder zu hemmen.
  • In diesem 2-Hybrid-Screen konnte CSN7a als Bindeprotein für Nlk isoliert und identifiziert werden.
  • Ein cDNA-Klon für das gesamte CSN7a wie auch für das verwandte CSN7b und für Csn5 wurde mit Hilfe der RT-PCR aus RNA-Extrakten von Mäusehirn isoliert (Wei et al., Curr Biol 8, 919-922, 1998).
  • Haemagglutinin (HA) oder FLAG markierte Nlk, Csn7a, Csn7b und Csn5 Proteine wurden mit Hilfe der RT-PCR und der Verwendung folgender Primer kloniert: HA-CSN7a Hin:
    ATAGGTACCACCATGTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCATGAGT GCGGAGGTGAAGGTG
    Rück:
    ATAGAATTCAGTTCGACTTGGACCAAATCTTG HA-CSN7b Hin:
    ATAGGATCCACCATGTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCATGGCA GGTGAACAGAAACCCTCAAG
    Rück:
    ATAGAATTCCTAGTGGCGGCTGGAGACCAG FLAG-Nlk Hin:
    CTCGGATCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATGTTAAA CCCTGGGCAACAACAGC
    Rück:
    ATAGGATCCACAGTCACTCCCACACCAGAGG CSN5 Hin:
    ATATGGATCCACCATGTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCATGGC AGCTTCCGGGAG
    Rück:
    CTATGAATTCGTACTTGGTGGTAACTAAGCAACG
  • Für die Klonierung einer Kinase negativen Nlk-Mutante, bei welcher das ATP- bindende Lysin (K84R) gegen Arginin ausgetauscht wurde, wurden folgende Primer verwendet:
    Hin:
    ATGGAAAGAGAGTAGCACTCAGAAAGATGCCCAACGTCTTCCAGAAT
    Rück:
    CTGGAAGACGTTGGGCATCTTTCTGAGTGCTACTCTCTTTCCATCTC
  • cDNA, kodierend für FLAG-markierte Wildtyp-Nlk, FLAG markierte K84R mutierte Nlk, und HA-markierte CN7a, CSN7b, und CSN5 wurden in pcDNA3- Expressionsvektoren (Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) eingefügt und HEK293-Zellen mit diesen Expressionsvektoren mit Hilfe von Lipofectamin 2000 (Fa. Life Technologies, Burlington, Kanada) cotransfiziert.
  • Co-Immunpräzipitationsexperimente mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern spezifisch für FLAG (Fa. Sigma, Deisenhofen, Deutschland) und nachfolgende Western Blot Analysen zum Nachweis von HA-markierten COP9/Signalosom- Komponenten zeigten, dass in HEK293-Zellen sowohl das Wildtyp-Nlk als auch die K84R mutierte Nlk mit den Untereinheiten CSN7a und CSN7b, jedoch nicht mit der Untereinheit CSN5 interagieren.
  • Mit einem polyklonalem Antikörper gegen die COP9/Signalosom-Untereinheit CSN1, der den gesamten Komplex präzipitiert (Fa. Affiniti Mamhead, Exeter, UK; Staub et al., Plant Cell 8, 2047-2056, 1996; Karniol et al., FEBS Lett. 439, 173-179, 1998) konnte die aktive Nlk co-immunpräzipitiert werden. Da CSN1 nur im Komplex und nicht frei in der Zelle vorkommt, zeigte dies eine direkte Assoziation von Nlk mit dem COP9/Signalosom.
    • Beispiel 2 Aktivität der Nlk im COP9/Signalosom-Komplex auf Transkriptions- faktoren
  • Zur Charakterisierung der Kinaseaktivität von COP9/Signalosomen wurden Immunkomplex-Kinase-Assays mit Nlk durchgeführt.
  • HEK293-Zellen wurden mit Expressionsvektoren, kodierend für die FLAG- markierte Wildtyp-Nlk und für die FLAG-markierte Enzym-defiziente K84R Nlk- Mutante transfiziert. Die exprimierten Proteine wurden in anti-CSN1 Immunprezipitaten nachgewiesen. Derartige Immunprezipitate der transfizierten Zellen wie auch von Kontrollzellen wurden mit den Proteinsubstraten c-jun (Fa. Promega, Madison, USA) oder GST-c-jun (Fa. Santa Cruz, Santa Cruz, USA) inkubiert. Nach Inhibition der Enzymreaktion durch Zugabe von SDS Puffer und sofortiger Erhitzung wurden die Proteine mit Hilfe der SDS-PAGE abgetrennt, auf Nitrozellulosemembrane aufgetragen und dort mit Hilfe von polyklonalen Antikörpern gegen c-jun (Ser 63), gegen c-jun (Ser 73) (Fa. NEB, Beverly, USA) und gegen CSN1 und monoklonale Antikörper gegen FLAG praezipitiert und mit einem Peroxydase markierten Zweitantikörper (Fa. Jackson) oder mit dem ECL Chemiluminescence Reagenz (Fa. Amersham, Buckinghamshire, UK) nachgewiesen.
  • Bei diesen Untersuchungen ergab sich, dass Nlk die c-Jun (jedoch nicht deren N- terminales Fragment, Aminosäuren 1-79) phosphorylieren kann. Die Westernblot- Experimente mit den Phospho-spezifischen Antikörpern zeigten, dass die Phosphorylierung nicht die Aminosäuren Serin 63 und Serin 73 betreffen, welche vorwiegend durch JNK zur Aktivierung phosphoryliert werden (Guerrini et al., J. Neurosci 17, 6057-6063, 1997; Schmidt-Ullrich et al., Development 122, 2117-2128, 1996).
  • Zum Nachweis der Aktivität von Nlk auf verschiedene Signalwege wurden Reportergen-Assays durchgeführt. Dazu wurde Wildtyp oder die negative Mutante von Nlk mit unterschiedlichen Reportergenkonstrukten in HEK293-Zellen co- exprimiert. Sowohl bei einem Reportergen für die durch Wnt induzierten Transkriptionsfaktoren TCF/LEF als auch bei Reportergenen für AP-1 und NFkB und den Thyroidhormon-Rezeptor, zeigte sich eine inhibitorische Wirkung durch die aktive Nlk. Im Gegensatz hierzu reduzierte die Kinase-negative Mutante K84R Nlk nicht die AP-1, TCF/LEF und NFkB induzierbare Reportergenexpression und hatte statt dessen besonders bei AP-1 und NFkB-Reportergenkonstrukten eine stark stimulierende Wirkung.
    • Beispiel 3 Nichtzelluläres und zelluläres Testsystem, enthaltend COP9/Signalosom-Komplexe mit aktiver Nlk oder mit negativ mutierter Nlk
  • In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält die Probe Zellen, Zellextrakte oder Proteinmischungen welche Nlk, auch Teile davon oder zur Kontrolle negativ mutierte Nlk, beinhalten. Beispiele für die Herstellung derartiger Zellen, Zellextrakte oder Proteinmischungen sind bereits in Beispiel 1 ausführlich beschrieben worden. Ein Beispiel für negativ mutiertes Nlk ist die im Beispiel 1 bereits beschriebene K84R-Mutante des Nlk, welche keine Kinaseaktivität mehr aufweist.
  • Derartige Zellen, Zellextrakte oder Proteinmischungen werden mit der zu prüfenden Substanz in beliebigen Konzentrationen vermischt. Nach einer Inkubationszeit von 10 Sekunden bis zu 24 Stunden wird die Aktivität der Nlk bestimmt.
  • In einer Ausführungsform wird die Aktivität von Nlk durch die Phosphorylierung von geeigneten Substraten, beispielsweise c-Jun, bestimmt.
  • In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Aktivität von Nlk indirekt durch die Messung der Aktivierung von Zielgenen über Reportergen-Assays bestimmt. Dabei befinden sich geeignete Reportergene, beispielsweise Luciferase, SEAP oder GFP, unter der Kontrolle von Promotoren, die der Regulation durch Transkriptionsfaktoren unterliegen, welche direkt oder indirekt durch Nlk reguliert werden. Hierzu gehören AP-1, NFkB, Thyroidhormon- Rezeptor und TCF/LEF.
  • In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Aktivität von Nlk durch Veränderung der Differenzierung von Zellen, insbesondere von neuronalen Zellen Gliazellen, deren Vorläufer oder auch neuralen Stammzellen, beispielsweise morphologisch in der Zellkultur und unter dem Mikroskop bestimmt werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Aktivität von Nlk durch Veränderung der Überlebensrate von Zellen bestimmt werden.
    • Beispiel 4
  • Testsystem bestehend aus Zellen, in welchen das Gen für Nlk entfernt wurde oder Extrakten daraus
  • In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht das Testsystem aus Zellen, in welchen das Gen für Nlk entfernt oder inhibiert wurde. Dies ermöglicht die Prüfung von Wirksubstanzen, welche Erkrankungen von Säugetieren verhindern oder vermindern können.
  • Die Entfernung des Gens für Nlk in embryonalen Zellen oder in Gewebezellen wird beispielsweise mit Hilfe der Einführung von Anti-sense Oligonukleotiden für Nlk und der hierdurch bedingten Blockade der Transskription und/oder Translation des Genes für Nlk durchgeführt.
  • Ein Beispiel für die Hemmung der zellulären Nlk ist die Einführung und Überexpression von Kinase negativen Mutanten des Nlk Genes.

Claims (12)

1. Verwendung mindestens einer Wirksubstanz zur Prophylaxe und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit Zellwachstumsstörungen einhergehen, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirksubstanz(en) die Aktivität mindestens einer Kinase des COP9/Signalosom-Komplexes modulieren.
2. Verwendung mindestens einer Wirksubstanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation eine Hemmung oder Verstärkung ist.
3. Verwendung mindestens einer Wirksubstanz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Kinase um die Nlk- Kinase handelt.
4. Verwendung mindestens einer Wirksubstanz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirksubstanz(en) aus nachfolgenden Wirksubstanzen ausgewählt ist bzw. sind:
Kinase-inhibierende Derivate des 4H-1-Benzopyran,
Flavopiridolderivate,
2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4-oxo-4H-(1)-benzopyran,
7,12-Dihydro-indolo (3,2-d)(1) Benzazepin-6-(5H)-on,
OH-Staurosporine und/oder ihre Phosphokinase-inhibierenden Derivate,
Butyrolacton,
Roscovitin,
Purvalanol A,
Emodin,
Anilino-quinazolin,
Phenylaminopyrimidin,
Trioylimidazole,
Paullon,
4-(4-Fluorphenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(pyridyl)-1H-imidazol,
1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio)-butadien,
2-(2-amino-3'-methoxyphenyl)-oxanaphtalen-4-on,
2-(2-chlor-4-jod-phenylamino)-N-cyclopropylmethoxy-3,4- difluor-benzamid,
bis-ethylthiomethyl,
Tetrapyrrolische Makrocyclen,
Pyrimidonderivate,
Gen für Nlk, eingefügt in ein Plasmid oder einen Vektor,
Gen für Nlk mit eingefügter negativ dominanter Mutation,
Antisense-Oligonukleotide, welche sich spezifisch an die DNA-Sequenz oder m-RNA Sequenz kodierend für Nlk anlagern und deren Transkription oder Translation inhibieren,
Antikörper- oder Antikörperfragmente, spezifisch für Nlk und/oder
Fusionsproteine, enthaltend mindestens ein Antikörperfragment, welche(s) die Kinaseaktivität der Nlk inhibiert bzw. inhibieren.
5. Testsystem zum Auffinden von Wirksubstanzen, welche die Aktivität mindestens einer Kinase des COP9/Signalosom-Komplexes modulieren, enthaltend:
a) mindestens eine Probe, enthaltend mindestens einen COP9/Signalosom- Komplex und
b) mindestens ein Mittel zur Bestimmung der Aktivität mindestens einer Kinase des COP9/Signalosom-Komplexes.
6. Testsystem nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Zelle ist, enthaltend mindestens einen COP9/Signalosom-Komplex, wobei die Aktivität der jeweiligen Kinase(n) moduliert wird.
7. Testsystem nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ein isolierter COP9/Signalosom-Komplex ist, wobei die Aktivität der jeweiligen Kinase(n) moduliert wird.
8. Testsystem nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Kinase um die Nlk-Kinase handelt.
9. Testsystem nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe
a) mindestens ein Gen, kodierend für mindestens eine negative Mutante mindestens einer Kinase und/oder
b) mindestens eine negative Mutante mindestens einer Kinase enthält.
10. Verfahren zum Auffinden von mindestens einer Wirksubstanz zur Prophylaxe und/oder Therapie von Zellwachstumsstörungen, die auf mindestens eine Kinase des COP9/Signalosom-Komplexes derart einwirkt, dass das Zellwachstum moduliert wird, enthaltend folgende Schritte:
a) Inkontaktbringen mindestens einer Probe nach einem der Ansprüche 5 bis 9 mit mindestens einer potentiellen Wirksubstanz, und
b) Bestimmen der Aktivität mindestens einer Kinase des COP9/Signalosom- Komplexes.
11. Arzneimittel zur Prophylaxe und/oder Therapie von Zellwachstumsstörungen, enthaltend mindestens eine Wirksubstanz nach Anspruch 4 und gegebenenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe.
12. Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels nach Anspruch 11 zur Prophylaxe und/oder Therapie von Zellwachstumsstörungen, welches das Zellwachstum fördert oder hemmt.
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