KR20210113491A - N-아세틸글루코사민 키나아제를 이용한 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물의 스크리닝 방법 및 n-아세틸글루코사민을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

N-아세틸글루코사민 키나아제를 이용한 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물의 스크리닝 방법 및 n-아세틸글루코사민을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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문일수
이현숙
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최호진
라주다시
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Abstract

본 발명은 N-아세틸글루코사민 키나아제를 이용한 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물의 스크리닝 방법 및 N-아세틸글루코사민을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 헌팅턴병 및 파킨슨병 등의 퇴행성 뇌질환의 치료제로 활용하기 위한 후보물질을 선별하는 도구로써 유용하게 활용될 수 있으며, 세포내 응집체 형성을 억제하므로, 헌팅턴병 및 파킨슨병의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

N-아세틸글루코사민 키나아제를 이용한 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물의 스크리닝 방법 및 N-아세틸글루코사민을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Screening Method of Neurodegenerative Disease Therapeutic Composition using N-acetylglucosamine Kinase and Composition for preventing, improving or treating neurodegenerative diseases comprising N-acetylglucosamine Kinase}
본 발명은 N-아세틸글루코사민 키나아제를 이용한 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물의 스크리닝 방법 및 N-아세틸글루코사민을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
우리나라의 노령화 인구의 증가로 인하여, 지난 50여년 동안 사망의 주된 원인이 되었던 급성 전염성 질병보다는 만성 퇴행성 질환이 더욱 큰 문제로 대두되고 있다. 이러한 퇴행성 질환 중에서도 특히 퇴행성 뇌질환은 노인 질환의 발병 순위 1위를 차지할 정도로 높은 비중을 차지하고 있다. 퇴행성 뇌질환에는 대표적으로 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 및 루게릭병으로 잘 알려진 근위축성 측삭경화증(ALS; Amyotrophic Lateral Sclerosis) 등이 있다.
헌팅턴병은 불수의(involuntary) 비정상 운동, 인지력 저하, 정서적 및 정신적 장애를 특징으로 하는 유전적 신경퇴행성 질환으로, 한쪽 부모에게서 비정상적 상염색체 우성 유전자를 받을 경우 발병한다. 헌팅턴병은 전형적으로 35 내지 45세에서 발병하고, 첫 번째 임상 증상이 나타난 후 15 내지 20년 이내에 사망으로 진행되며, 선조체(striatum, 줄무늬체)를 포함한 뇌의 여러 영역에서 헌팅틴(HTT) 유전자의 CAG 반복의 확장에 의해 유발되는 것으로 알려져 있다. 헌팅턴병의 최초 동물모델인 독소모델은 헌팅턴병 환자의 뇌에서 특징지어졌던 2가지 증상인 미토콘드리아 기능 장애(mitochondrial dysfunction) 및 흥분독성(excitotoxicity)의 역할을 규명하였다. 그러나, 이러한 모델이 헌팅턴병의 생리를 반복하는지 여부는 여전히 불분명하다. 헌팅턴병의 형질전환 마우스 모델은 마우스 게놈에 청소년(juvenile) 헌팅턴병 환자의 HTT 유전자 단편을 도입함으로써 생성되었다. 그러나, 형질전환 모델은 다양한 표현형을 가지며, 선조체에서의 심각한 신경성 퇴행(neuronal degeneration) 및 수명 감소와 같은 헌팅턴병 병리의 주요 특징을 재현하지 못하며, 동물 계통을 유지하기가 어려워 높은 비용이 소요되는 등의 문제점이 있다.
파킨슨병은 팔, 다리 또는 전신의 근육이 경련 또는 경직되며 중심을 잡지 못하는 퇴행성 신경질환이다. 이와 같은 증상은 뇌신경세포의 문제로 신경전달물질인 도파민 분비에 이상이 생기면서, 뇌의 특정 신경세포가 점차 파괴되어 발생한다. 파킨슨병의 전형적인 증상은 경련, 근육 경직 및 동작이 느려지는 증상 등을 포함하는 운동장애이다. α-시뉴클레인의 응집 및 루이체의 발현은 파킨슨 질환의 주요 병리로써 이 퇴행성 질환의 발병 원인에 대한 이해뿐만 아니라 치료제 개발을 위한 타겟 질병 단백질로서 연구되어 왔다. 기존에 밝혀진 주요 연구결과들이 제시해 주는 것은 α-시뉴클레인의 올리고머/피브릴 형성을 막음으로써 신경세포 독성을 제어할 수 있다는 사실이며, 다른 하나는 α-시뉴클레인의 집적체가 미토콘드리아의 기능 이상을 유발함으로써 신경세포 기능 이상 및 사멸을 일으킨다는 것이다. 기존에 개발된 집적체 형성 억제 효과가 있는 화합물(콩고 레드(Congo red), α토코페롤, 포르피린(Porphyrins), 리파마이신(Rifamycin), 커큐민(Curcumin), 에피갈로카테킨(Epigallocatechin))들은 주로 재조합 α-시뉴클레인 단백질의 인 비트로 인큐베이션을 통한 아밀로이드 형성 반응을 기반으로 발굴되었다. 이러한 분석방법의 문제점은 실험 조건 및 재조합 α-시뉴클레인의 순도에 따라 α-시뉴클레인이 아밀로이드 형성을 이루는데 시간이 일정하지 않을 뿐만 아니라 대체적으로 상당한 시일(5 내지 7일)이 걸리기 때문에 대단위 화합물 스크리닝에는 적합하지 않다는 것이다.
N-아세틸글루코사민 키나아제(N-acetylglucosamine kinase; GlcNAc kinase; NAGK)는 1970년에 처음 발견되었으며, N-아세틸글루코사민 키나아제의 mRNA 및 단백질은 다양한 세포주와 조직에서 발현된다. NAGK는 β6βαβαβ 배열을 갖는 두 개의 도메인으로 구성된 V자형 접힘(V-shaped fold)을 특징으로 하며, 당질 키나아제(sugar kinase), 열충격단백질(heat shock protein) 70 및 액틴 수퍼패밀리(actin superfamily)에 속한다. 상기 도메인이 기질에 결합함에 따라 두 도메인 사이의 틈새 각도가 감소하는 구조 변화가 발생한다.
NAGK는 GlcNAc 재활용경로(recycling salvage pathway)에서 GlcNAc를 인산화시켜 GlcNAc-6 인산염을 생산하는 것으로, GlcNAc-6-phosphate는 이후 N-/O-glycans, 당지질(glycolipids) 및 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans)의 합성에 이용되는 UDP-GlcNAc을 생산하는데 사용되는 것으로 알려져 있다. 다만, NAGK와 퇴행성 뇌질환과의 관련성에 대해서는 전혀 보고된 바가 없다.
이에, 본 발명자는 퇴행성 뇌질환과 NAKG의 관련성 및 이를 이용하여 기존의 퇴행성 뇌질환의 치료제 스크리닝 방법 대비 효과적인 스크리닝 방법 및 퇴행성 뇌질환 치료제를 개발하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 특허등록 제10-1888785호
본 발명의 하나의 목적은 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계; 상기 후보물질과 접촉된 세포의 N-아세틸글루코사민 키나아제(N-acetylglucosamine kinase; NAGK)의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 후보물질을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 N-아세틸글루코사민 키나아제의 발현수준을 억제하는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인간을 제외한 동물에 후보물질을 투여하는 단계; 상기 후보물질이 투여된 상기 동물의 뇌세포에서 N-아세틸글루코사민 키나아제(N-acetylglucosamine kinase; NAGK)의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 후보물질을 투여하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 N-아세틸글루코사민 키나아제의 발현수준을 억제하는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 N-아세틸글루코사민 키나아제를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 N-아세틸글루코사민 키나아제를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계; 상기 후보물질과 접촉된 세포의 N-아세틸글루코사민 키나아제(N-acetylglucosamine kinase; NAGK)의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 후보물질을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 N-아세틸글루코사민 키나아제의 발현수준을 증가시키는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 첫 번째 단계는 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계이다.
본 발명의 후보물질은 퇴행성 뇌질환 환자에 적용하여 퇴행성 뇌질환에 의한 환자의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 이와 같은 특성을 나타내는 물질은 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "접촉"은 이의 일반적인 의미이며, 하나 이상의 물질 및/또는 세포가 다른 물질 및/또는 세포에 영향을 줄 수 있을 정도로 가까운 거리에 위치하는 것을 의미한다. 접촉은 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 시험관 또는 다른 컨테이너에서 하나 이상의 물질과 세포를 합한 것을 포함한다. 또한, 접촉은 세포 또는 in situ에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 세포 내에서 발현시킴으로써 세포 및/또는 세포 용해물에 발현된 폴리펩티드가 영향을 주는 것을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 세포는 HEK293T일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 퇴행성 뇌질환은 헌팅턴병 또는 파킨슨병일 수 있다.
세포 내에서 NAGK의 외인성 발현에 의하여 헌팅턴병과 관련있는 돌연변이 헌팅틴(mHtt) 응집체 및 파킨슨병과 관련있는 알파-시뉴클레인 응집체의 형성이 감소하므로, 세포 내에서 NAGK의 발현을 증가시키는 후보물질을 헌팅턴병 및 파킨슨병에 대해 치료 효과를 나타내는 물질로 선별할 수 있다.
본 발명의 두 번째 단계는 상기 후보물질과 접촉된 세포의 N-아세틸글루코사민 키나아제의 발현수준을 측정하는 단계이다.
N-아세틸글루코사민 키나아제의 발현수준을 측정하는 방법은 당업계에서 단백질의 발현을 측정하는데 일반적으로 사용되는 방법이면 제한없이 사용될 수 있다. 이와 같은 방법에는 예를 들어, 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray) 또는 노던 블롯팅(northern blotting)을 통한 N-아세틸글루코사민 키나아제의 mRNA 발현수준을 측정하는 방법이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 마지막 단계는 후보물질을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 N-아세틸글루코사민 키나아제의 발현수준을 증가시키는 후보물질을 선별하는 것이다.
후보물질을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 N-아세틸글루코사민 키나아제의 발현수준을 억제하는 물질이면 후보물질로 선별할 수 있으나, N-아세틸글루코사민 키나아제의 발현수준을 음성 대조군에 비해 20% 이상 억제하는 후보물질이 바람직하며, N-아세틸글루코사민 키나아제의 발현수준을 음성 대조군에 비해 40% 이상 억제 억제하는 후보물질이 가장 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 질병 또는 장애의 개선을 지칭한다. 이에는 질병 또는 장애 및 이로부터 비롯된 증상의 완화, 치유 및 예방을 포함하며, 환자를 고통스럽게 하는 소정의 질환에 대한 전 스펙트럼의 치료를 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 인간을 제외한 동물에 후보물질을 투여하는 단계; 상기 후보물질이 투여된 상기 동물의 뇌세포에서 N-아세틸글루코사민 키나아제(N-acetylglucosamine kinase; NAGK)의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 후보물질을 투여하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 N-아세틸글루코사민 키나아제의 발현수준을 증가시키는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 전술한 내용과 중복되는 부분은 전술한 의미와 동일한 의미로 사용될 수 있다.
본 발명에서, "투여"는 동물의 뇌실에 후보물질을 직접 처리하여 이루어질 수 있고, 경구투여, 정맥투여 등 체내 소화계 및/또는 순환계를 경유하여 이루어지는 방법일 수 있으며, 당업계에서 치료 물질을 체내에 적용하는 일반적인 방법을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동물은 마우스일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 N-아세틸글루코사민 키나아제를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 약제의 제조에 통상적으로 이용되는 것으로써, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington: the science and practice of pharmacy 22nd edition (2013)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 퇴행성 뇌질환에 대한 예방 또는 치료 활성을 나타내는 물질과 함께 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물치료 및/또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 1000㎎/㎏일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 N-아세틸글루코사민 키나아제를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로써 N-아세틸글루코사민 키나아제 외에, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다. 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어, 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 향미제로써 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 N-아세틸글루코사민 키나아제 외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액 및/또는 감초 추출액 등이 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
N-아세틸글루코사민 키나아제를 이용한 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물의 스크리닝 방법 및 N-아세틸글루코사민을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 따르면, 헌팅턴병 및 파킨슨병 등의 퇴행성 뇌질환의 치료제로 활용하기 위한 후보물질을 선별하는 도구로써 유용하게 활용될 수 있으며, 세포내 응집체 형성을 억제하므로, 헌팅턴병 및 파킨슨병의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1 내지 도 4는 헌팅턴병 세포 모델에서 NAGK의 외인성 발현에 따른 mHtt 응집체의 형성 억제를 나타낸 그림 및 그래프이다.
도 5 내지 도 8은 파킨슨병의 세포 모델에서 NAGK의 외인성 발현에 따른 α- 시뉴클레인(α-syn) 응집체의 형성 억제를 나타낸 그림 및 그래프이다.
도 9 내지 도 13은 Q74 응집체 형성에 대한 shRNA, NAGKA-small domain(NAGK-Ds) 및 NAGK 점돌연변이 D107A(NAGK-D107A)의 효과를 나타낸 그림 및 그래프이다.
도 14 내지 도 17은 NAGK의 과발현에 따른 small hairpin RNA(shRNA) 효과의 역전을 나타낸 그림 및 그래프이다.
도 18 내지 도 20은 헌팅턴병 세포에서, 외인성 NAGK 발현에 따른 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS) 감소 및 미토콘드리아의 건강한 형태를 유지한 결과를 나타낸 그림 및 그래프이다.
도 21 및 도 22는 마우스 뇌에서, 외인성 NAGK 발현에 따른 mHtt 응집 억제 효과를 나타낸 그림 및 그래프이다.
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 외인성 NAGK 발현에 따른 mHtt 응집을 억제 효과 확인
1-1. HEK293T 세포에서 mHtt 응집 억제 효과 확인
돌연변이 헌팅틴(mHtt) 응집체 형성에 대한 N-아세틸글루코사민 키나아제(N-acetylglucosamine kinase; NAGK)의 억제 효과를 조사하였다.
구체적으로, 응집체 형성을 용이하게 하기 위하여 HEK293T 세포를 pEGFP-mHtt(pQ74)로 형질도입한 후, 세포를 배양하여 EGFP-태그된 mHtt(Q74) 단백질을 발현시켰다. 24시간 후, 라이브 이미징으로 응집체 형성을 확인하였다.
그 결과, 형질도입된 세포에서 가장 밝은 녹색 형광 응집체가 나타나기 시작하여 시간이 지남에 따라 확대된 것으로 확인되었다. 또한, 배양 72시간 후, Q74는 핵 및 세포질에서 다양한 크기의 응집체를 형성한 것으로 확인되었다(도 1, Q74).
Q74 응집체 형성에 대한 NAGK의 효과를 관찰하기 위하여, HEK293T 세포를 pQ74 및 pDsRed2-NAGK로 공동-형질도입하였다(도 1, pQ74 + pDsRed2-NAGK). 72시간 동안 배양한 후, 배양물을 GFP 및 RFP에 대한 항체로 이중 면역염색하여 녹색 형광 Q74 및 적색 형광 DsRed2-NAGK 단백질을 각각 나타냈으며, 핵은 DAPI로 대조 염색하였다.
그 결과, DsRed2 단백질의 공동-발현된 HEK293T 세포 대비 DsRed2-NAGK 단백질의 공동-발현된 HEK293T 세포에서 Q74 응집체가 현저히 감소한 것으로 확인되어, pDsRed2-NAGK의 Q74 응집체 형성 억제 효과가 확인되었다.
또한, NAGK가 적색 형광 단백질 DsRed2로 태그되었기 때문에, 대조군으로써 pQ74 및 pDsRed2로 세포를 공동-형질도입하고(도 1, pQ74 + pDsRed2), 72시간 동안 세포를 배양하였다.
그 결과, DsRed2 대조군 단백질은 pQ74 단독과 비교하여 응집체 형성이 약간 감소하였으나, 그 효과는 유의하지 않은 것으로 확인되었다(도 2).
상기 DsRed2 단백질의 효과를 제거하기 위하여, Myc-DDK-태그된 NAGK-발현 플라스미드(pDDK-NAGK)를 pQ74와 HEK293T 세포에 공동-형질도입하였다. 여기서, DDK는 서열 모티프 DYKDDDDK를 갖는 FLAG-태그 에피토프이다.
그 결과, 상기 DDK-NAGK 플라스미드 또한 Q74 응집체 형성을 유의하게 억제한 것으로 확인되었으며, 통계 분석(도 2)에 따르면, DsRed2-NAGK(p <0.001) 또는 DDK-NAGK(p <0.01)의 외인성 발현에 의하여, DsRed2 대조군 대비 응집체를 함유하는 세포의 백분율이 유의하게 감소된 것으로 확인되었다.
1-2. 흰쥐 래트 대뇌피질 뉴런에서 mHtt 응집 억제 효과 확인
헌팅턴병이 특히 인간 뇌의 피질과 선조체에 영향을 미치기 때문에, 피질 뉴런에서도 실시예 1-1과 같은 효과가 나타나는지 조사하였다.
구체적으로, DIV 2의 래트 배아(E19) 대뇌피질 유래 뉴런을 pQ74과 pDsRed2-NAGK 또는 pDsRed2(대조군)와 함께 배양 및 공동-형질도입하였다. 72시간 동안 배양한 후, 배양물을 항-GFP 및 -RFP 항체로 이중 염색하고, 핵을 DAPI로 대조염색하였다(도 3 및 도 4).
그 결과, pQ74과 pDsRed2-NAGK로 공동-형질도입된 뉴런에서는 Q74 응집체가 거의 관찰되지 않았으나, pQ74과 pDsRed2로 공동-형질도입된 뉴런에서는 큰 Q74 응집체가 나타난 것으로 확인되었다(도 4). 통계 분석에 따르면, DsRed2-NAGK의 외인성 발현에 의하여, DsRed2 대조군과 대비 응집체를 함유하는 뉴런의 백분율이 유의하게 감소된 것으로 확인되었다(도 4).
실시예 2. 외인성 NAGK 발현에 따른 α-syn 응집 억제 효과 확인
실시예 1에서 확인된 응집체 형성 억제 효과가 NAGK의 일반적인 기능에 기인한 것인지 확인하기 위하여, 파킨슨병의 신경 병리학적 특징인 알파-시뉴클레인(alpha-synuclein, α-syn) 응집체를 조사하였다.
구체적으로, 37℃에서 재조합 단백질이 노화(aged)될 때, 야생형 단백질보다 더 빠르게 응집 단백질을 생성하는 A53T 미스센스 돌연변이를 갖는 α-syn 유전자(SNCA)를 사용하였다. HEK293T 세포를 pHM6-알파시뉴클레인-A53T(pα-syn A53T) 플러스 pDsRed2-NAGK 또는 대조군으로써 pDsRed2로 공동-형질도입 하였다. 배양 72시간 후, 배양물을 항-α-syn 및 항-RFP 항체로 이중 염색한 다음 DAPI로 염색하였다(도 5 및 도 6).
그 결과, 대조군(도 5, pα-syn A53T + pDsRed2)에서는 형질도입된 세포의 핵(녹색 화살촉) 및 세포질 영역(백색 화살촉)에서 큰 응집체가 나타난 반면, pα-syn A53T 및 pDsRed2-NAGK로 공동 형질도입된 세포 및 대부분의 pα-syn A53T 형질도입된 세포에서는 이와 같은 응집이 나타나지 않은 것으로 확인되었다(도 5, pα-syn A53T + pDsRed2-NAGK). 또한, 외인성 DsRed2-NAGK는 대조군 DsRed2와 비교하여 응집-양성 세포의 백분율을 유의하게(p <0.01) 감소시켰다(도 6).
또한, 유사한 효과가 뉴런 세포에서 발생하는지 여부를 조사하였다.
구체적으로, DIV 2의 1차 랫트 피질 세포를 pα-syn A53T와 pDsRed2-NAGK 또는 pDsRed2로 공동-형질도입 하였다. 배양 72시간 후, 배양물을 항-α-syn 및 항-RFP 항체로 이중 표지하였다(도 7 및 도 8).
그 결과, pDsRed2-NAGK로 공동-형질도입된 뉴런에서는 응집체가 형성되지 않았으나, pDsRed2로 공동-형질도입된 대조군 뉴런에서는 다수의 큰 응집체가 형성된 것으로 확인되었다(도 7). 또한, 응집체 양성 뉴런의 백분율은 pDsRed2보다 pDsRed2-NAGK로 공동-형질 감염된 뉴런에서 현저하게(p <0.01) 낮은 것으로 확인되었다(도 8).
실시예 3. NAGK의 shRNA 또는 작은 도메인에 의한 Q74 응집체 증가 및 키나아제-비활성 NAGK에 의한 응집체 억제 효과 확인
3-1. NAGK의 shRNA 또는 작은 도메인에 의한 Q74 응집체 증가 확인
NAGK는 N-말단 작은 도메인(small domain)과 C-말단 큰 도메인(large domain)으로 되어 있다. NAGK의 응집체 생성 억제 효과를 확인하기 위하여, 짧은 헤어핀(short hairpin, sh) RNA 벡터(sh-NAGK), 및 shNAGK와 유사한 영향을 나타내는 작은 도메인(NAGK-Ds)만을 갖는 결실 돌연변이체 NAGK를 사용하여 NAGK의 기능을 억제하여, mHtt의 응집에 대한 NAGK의 기능 손실 효과를 조사하였다.
구체적으로, sh-NAGK 및 NAGK-Ds의 효과를 확인하기 위하여, pQ74, pDsRed2, 및 shRNA 벡터(pSh-NAGK), 또는 염기서열 불일치(pMismatch) 대조군 벡터를 HEK293T 세포에 삼중 공동-형질도입 하였다. 72시간 동안 배양한 후, 세포를 GFP 및 RFP에 대한 항체로 이중 면역염색하였고, DAPI로 핵을 대조염색하였다. Q74 응집체는 pMismatch 벡터보다(도 9, pQ74 + pMismatch + pDsRed2) pSh-NAGK 벡터(도 9, pQ74 + pSh-NAGK + pDsRed2)가 형질도입된 HEK293T 세포에서 더 많이 관찰되었다.
또한, pQ74, pDsRed2 및 pEGFP-NAGK-Ds(pNAGK-Ds)로 삼중 공동-형질도입된 HEK293T 세포에서 Q74 응집이 더 많이 나타난 것으로 확인되었다(도 9, pQ74 + pNAGK-Ds + pDsRed2). 통계 분석에 따르면, pSh-NAGK 벡터 및 pNAGK-Ds는 응집체 양성 세포의 백분율을 유의하게(p <0.001) 증가시킨 것으로 확인되었다(도 10). 특히, NAGK-Ds에 의한 응집체 양성 세포의 증가는 NAGK-Ds의 지배적 음성 기능(dominant-negative function)에 의한 효과로, NAGK의 응집체 형성 억제 활성이 기존에 알려진 NAGK의 키나아제 활성이 아닌 구조적 기능임이 확인되었다.
3-2. 키나아제-비활성 NAGK에 의한 응집체 억제 효과 확인
NAGK의 응집체 형성 억제 활성이 기존에 알려진 NAGK의 키나아제 활성이 아니라 구조적 기능임을 확인하기 위하여 키니아제 효소활성이 비활성화된 NAGKD107A(D107A)가 응집 형성 억제 활성을 나타내는지 조사하였다.
구체적으로, pQ74, pDsRed2 및 pEGFP- NAGKD107A(D107A)로 HEK293T 세포를 삼중 공동-형질도입하였다. 72시간 동안 배양한 세포를 배양한 다음, Q74 및 DsRed2를 나타내기 위하여 각각 GFP 및 RFP에 대한 항체로 이중 염색하고, DAPI 염색을 수행하였다.
그 결과, D107A의 외인성 발현은 Q74 응집체의 형성을 억제한 것으로 확인되었다(도 9, pQ74 + pD107A + pDsRed2). 통계 분석에 따르면, pD107A에 의한 응집체 형성의 억제 효과는 야생형 NAGK(pDsRed2-NAGK)와 유사한 것으로 확인되었고, 응집체-양성 세포의 백분율이 pMismatch + pDsRed2 벡터로 형질도입된 것 대비 현저히(p <0.001) 낮은 것으로 확인되었다(도 10).
또한, 배양 2일차(DIV 2) 래트 대뇌피질 뉴런에서도 Q74 응집체의 형성 억제 활성이 확인되었다. 즉, pSh-NAGK 또는 pNAGK-Ds 벡터로 형질도입된 뉴런에서 더 많은 응집체가 나타났으며(도 12), 통계 분석 결과, pSh-NAGK 벡터와 pNAGK-DS는 모두 응집체-양성 뉴런의 백분율을 유의하게(p <0.001) 증가시킨 것으로 확인되었다(도 13).
반면, DIV 2에 형질도입되고 72시간 후 지시된 항체로 염색된 래트 피질 뉴런에서, D107A의 외인성 발현에 의하여 Q74 응집이 유의하게(p <0.001) 억제된 것으로 확인되었다(도 12, pQ74 + pD107A + pDsRed2). 또한, pMismatch 플러스 pDsRed2 벡터로 형질도입된 대조군 세포와 비교하여, pD107A 및 야생형 NAGK(pDsRed2-NAGK)에서 응집체-양성 세포의 백분율이 유의하게(p <0.001) 감소된 것으로 확인되었다(도 13).
3-3. 직경에 따른 응집체 억제 효과 확인
NAGK의 효과를 보다 정확하게 분석하기 위하여, 직경에 따라 응집체를 소(≤0.8㎛), 중(0.8-1.5㎛) 또는 대(≥1.5㎛)로 분류한 다음, pQ74 및 다양한 조합으로 형질도입된 HEK293T 세포(n=320)에서, 응집체를 계수하였다.
그 결과, pMismatch + pDsRed2 벡터 대조군 대비, pSh-NAGK 및 pNAGK-DS는 중대형 응집체의 비율을 유의하게(p <0.001) 증가시킨 것으로 확인되었으며, pDsRed2-NAGK 및 pD107A는 중대형 응집체의 비율을 유의하게(p <0.001) 감소시킨 것으로 확인되엇다. 반면, pDsRed2-NAGK와 pD107A에서의 차이 및 pSh-NAGK와 pNAGK-Ds에서의 차이는 유의하지 않은 것으로 확인되었다(도 11). 한편, 공동-형질도입 후, 작은 응집체의 비율간의 차이는 나타나지 않았으며, 이를 통하여 NAGK는 소형 응집체의 제거에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다
실시예 4. NAGK의 외인성 발현에 따른 shRNA의 효과의 소거 확인
shRNA의 효과가 NAGK 과발현에 의해 소거될 수 있는지 조사하였다.
구체적으로, pQ74, pSh-NAGK 벡터, 및 pDsRed2-NAGK 또는 대조군으로써 pDsRed2으로 HEK293T 세포를 삼중 공동-형질도입하였다. 72시간 동안 배양한 후, 세포를 GFP 및 RFP에 대한 항체로 이중염색하고, 핵을 DAPI로 대조염색하였다.
그 결과, pQ74, pSh-NAGK 벡터 및 pDsRed2로 삼중 공동-형질도입된 HEK293T 세포는 더 큰 Q74 응집체를 나타낸 반면(도 14), pDsRed2 대신 pDsRed2-NAGK와 동시 형질도입된 세포는 응집체-양성 세포의 백분율이 현저히(p <0.01) 감소한 것으로 확인되었다(도 15). 일차 래트 피질 뉴런을 사용하여 수행된 실험에서도 유사한 결과가 확인되었다. pDsRed2-NAGK 형질도입에 의하여 Q74 응집체의 형성이 감소되었고(도 16), 응집체를 함유하는 세포의 비율이 현저하게(p <0.01) 감소된 것으로 확인되었다(도 17).
이와 같은 결과를 통하여, 외인성 NAGK의 과발현에 의하여 shRNA의 효과가 소거된 것으로 확인되었다.
실시예 5. NAGK의 외인성 발현에 따른 ROS 생성 억제 효과 및 미토콘드리아의 가늘고 긴 형태 유지 효과 확인
5-1. NAGK의 외인성 발현에 따른 미토콘드리아의 가늘고 긴 형태 유지 효과 확인
헌팅턴병(HD) 세포 모델 및 환자에서, 미토콘드리아 형태 변형(mitochondrial morphology shift)은 건강한 망상/분기된(reticular/ramified) 형태로부터 기능 장애를 갖는 구형으로 진행한다. 따라서, HD 세포 모델에서 미토콘드리아 형태에 미치는 NAGK의 효과를 조사하였다.
구체적으로, pQ74, pCMV6-Myc-DDK-NAGK(pDDK-NAGK) 및 pMitoTimer로 HEK293T 세포를 공동-형질도입하였다. pMitoTimer는 새로 합성될 때, 미토콘드리아-표적화 GFP를 암호화하고, 산화될 때 비가역적으로 적색 형광으로 변한다. 24시간 동안 배양한 후, 세포를 GFP 및 RFP에 대한 항체로 이중 면역염색하였다. 그 후, z-축을 따라 일련의 광학적으로 해부된 미토콘드리아 이미지를 획득하였다.
그 결과, 필라멘트성 미토콘드리아 형태는 주로 가늘고 긴 형태로 나타나는 것으로 확인되었다(도 18). pMitoTimer 및 pQ74로 형질도입된 대조군 세포에서의 미토콘드리아 형태는 주로 단편화되거나 구형인 것으로 확인되었다(도 19). 반면, DDK-NAGK의 외인성 발현된 세포에서, 필라멘트성 미토콘드리아의 현저한 증가(p <0.01) 및 단편화된 또는 구형 미토콘드리아의 현저한 감소(p <0.001)가 확인되었다(도 19).
5-2. NAGK의 외인성 발현에 따른 ROS 생성 억제 효과 확인
ROS 과잉 생산으로 인한 미토콘드리아 기능 장애는 헌팅턴병을 유발하는 것으로 알려져 있고, 폴리 (Q) 돌연변이는 뉴런 및 비-뉴런 세포에서 ROS 수준을 증가시키는 것에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다.
따라서, ROS 수준에 대한 NAGK의 효과를 관찰하기 위하여, HEK293T 세포를 pQ74로 형질도입하거나, 또는 pQ74 및 pDDK-NAGK로 공동-형질도입하였다. 24시간 동안 배양한 후, 배양물을 CellROX Deep Red(Invitrogen)로 처리하여 세포 간 ROS 수준을 측정하였다.
그 결과, 공동-형질 도입된 세포는 pQ74 형질 도입된 세포 대비 현저하게(p <0.001) 낮은 형광 수준을 나타낸 것으로 확인되어(도 20), NAGK의 외인성 발현에 따른 ROS 생성이 억제되는 것으로 확인되었다.
실시예 6. 마우스 뇌에서, NAGK의 외인성 발현에 따른 mHtt 응집 감소 효과 확인
신생아 설치류를 사용하는 in vivo 전기천공법(electroporation)은 시간과 비용 효과적인 생체 내 모델로 알려져 있다. 따라서, 마우스 뇌에서 NAGK의 외인성 발현에 따른 mHtt 응집 감소 효과를 확인하기 위하여, in vivo 전기천공법을 사용하여 mHtt 응집체의 형성억제에서 NAGK의 역할을 분석하였다.
구체적으로, in vivo 전기천공법을 사용하여 pQ74 단독, 또는 pDsRed2 또는 pDsRed2-NAGK와 조합된 pQ74를 산후 1일(P1) 마우스의 우측 뇌실에 전기천공하여 도입하고 즉시 어미에게 돌려보냈다. 전기천공을 위한 선조체(striatal)를 표적화하기 위하여 핀셋형 전극의 양극을 위해 머리의 등측에 위치시켰다.
그 결과, mHtt 발현 녹색 형광 세포는 전기 천공 후 2일째에 선조체 영역에서 주로 발견되었고(도 21, 상부 패널), pQ74 전기천공된 세포의 약 44%가 응집-양성인 것으로 확인되었다(도 22, pQ74). 반면, mHtt 응집체를 포함하는 세포의 백분율은 pQ74 + pDsRed2-NAGK 전기천공된 뇌에서 25%인 것으로 확인되었다(도 21 및 도 22). 또한, 이와 같은 감소는 pQ74(p <0.001) 및 pDsRed2(p <0.01) 전기천공된 뇌(도 22)와 비교하여 유의미한 것으로 나타나, NAGK는 mHtt 응집체의 감소를 촉진시키는 것으로 확인되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (7)

  1. 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계;
    상기 후보물질과 접촉된 세포의 N-아세틸글루코사민 키나아제(N-acetylglucosamine kinase; NAGK)의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 후보물질을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 N-아세틸글루코사민 키나아제의 발현수준을 증가시키는 후보물질을 선별하는 단계
    를 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물 스크리닝 방법.
  2. 인간을 제외한 동물에 후보물질을 투여하는 단계;
    상기 후보물질이 투여된 상기 동물의 뇌세포에서 N-아세틸글루코사민 키나아제(N-acetylglucosamine kinase; NAGK)의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 후보물질을 투여하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 N-아세틸글루코사민 키나아제의 발현수준을 증가시키는 후보물질을 선별하는 단계
    를 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물 스크리닝 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 HEK293T인 것인 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물 스크리닝 방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 동물은 마우스인 것인 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물 스크리닝 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 헌팅턴병 또는 파킨슨병인 것인 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물 스크리닝 방법.
  6. N-아세틸글루코사민 키나아제를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. N-아세틸글루코사민 키나아제를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101888785B1 (ko) 2017-02-24 2018-08-14 성균관대학교산학협력단 퇴행성 뇌질환 치료제 스크리닝 방법 및 이를 위한 키트

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