DE69637104T2 - Heilmittel für arthrosis deformans und entzündliche gelenkerkrankungen - Google Patents

Heilmittel für arthrosis deformans und entzündliche gelenkerkrankungen Download PDF

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Description

  • Diese Erfindung betrifft ein Parathyroid-Hormon-related Peptid (PTHrP) oder eine von PTHrP abgeleitete Substanz, die entweder eine vorbeugende oder therapeutische Wirkung auf Osteoarthritis und andere Erkrankungen, welche die Zerstörung und Degeneration von Gelenkknorpelgewebe nach sich ziehen, hat.
  • Osteoarthritis zieht den Kollaps der Gelenkknorpeloberfläche und das sich ergebende Wachstum von neuem Knorpel an den Gelenkrändern, Gelenkdeformation und Verlust der Compliance, welche sich schließlich als Entzündung der Synovialhaut des Gelenks manifestieren werden, nach sich. Osteoarthritis gliedert sich in zwei Arten, primäre und sekundäre. Die sekundäre Osteoarthritis weist prädisponierende Gründe, wie Trauma und Infektion, auf, die zur Degeneration von Knorpel führen, bei der primären Osteoarthritis kann allerdings kein prädisponierender Grund identifiziert werden. Die Hauptläsion der Osteoarthritis ist die Degeneration von Gelenkknorpel, und sie kann der endogenen Degeneration von Gelenkknorpel und der mechanischen Belastung des Gelenks zugeschrieben werden; in vielen Aspekten bleibt der Mechanismus ihrer Ätiologie jedoch unbekannt. Bei Osteoarthritis treten zwei pathologische Hauptphänomene auf. In dem einen Fall verursacht beschleunigte Kalzifikation von subchondralem Knochen das Verengen der Gelenkspalten und die Zerstörung des Knochengewebes (Rollet, A. J., Arthritis Rheum. 12, 152–163, 1969); in dem anderen Fall verursacht synoviale Entzündung entweder die Zerstörung oder Degeneration des knorpeligen Gewebes (Huskisson, R. C. et al., Ann. Rheum. Dis. 38, 423–428, 1979; Campion, G. V. et al., Seimnars in Arthritis and Rheumatism 17, 232–245, 1988).
  • Bei der entzündlichen Osteoarthritis tritt eine wahrnehmbare Abnahme von Proteoglycanen (eine Matrixkomponente des knorpeligen Gewebes) auf Grund Substanzen, wie IL-1, das von Synovialgewebe hergestellt wird, auf (Tyler, J. A., Biochem. J. 225, 493–507, 1985); zusätzlich wird die Herstellung von Proteoglycanen durch Chondrocyten suprimiert (Ratcliffe, A., Biochem. J. 238, 571–580, 1986). Als ein Ergebnis würde die Knorpelmatrix abnehmen (Pettipher, E. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8749–8753, 1986), um einen allmählichen Verlust der Gelenkknorpelschicht zu verursachen.
  • Der Knorpel in dem Gelenkgewebe wird als Dauerknorpel klassifiziert, was von einem gewachsenen Knorpel, der eine wichtige Rolle beim Skelettwachstum spielt, grundsätzlich unterschieden wird. Gewachsene Chondrocyten, die typischerweise im Epiphysenfugenknorpel auftreten, gehen durch die Stadien Wachstum, Differenzierung und Kalzifikation, bis sie durch Knochen ersetzt sind, wobei sie ihre physiologische Funktion erfüllen. Im Gegensatz dazu werden Gelenkknorpelzellen normalerweise nicht kalzifiziert; dies ist, weil die Kalzifikation vom Auftreten in Gelenkknorpelzellen umgebungsbedingt stark unterdrückt wird und weil er nicht kalzifiziert wird, behält der Gelenkknorpel die Elastizität, um dadurch als ein tragendes Kissen zu dienen und eine hohe Mobilität am Gelenk zu sichern. Es ist jedoch bekannt, dass die Elastizität der Gelenkknorpeloberfläche bei Osteoarthritis abnimmt (Myers, E. R. et al., Trans. Orthop. Res. USA 231, 1986). Man glaubt, dass dies dem Reißen von Kollagenfasern im knorpeligen Gewebe zuzuschreiben ist (Stockwell, R. A. et al., J. Anat. 136, 425–439, 1982). Der Mechanismus, durch den Kalzifikation im Gelenkknorpel supprimiert wird, ist nicht klar, allerdings findet Kalzifikation nicht statt, wenn isolierte Gelenkknorpelzellen kultiviert werden. Höchst wahrscheinlich existiert der starke Suppressor der Gelenkknorpelkalzifikation in der Matrix, welche die Chondrocyten umgibt (Iwamoto, M. et al, J. Biol. Chem. 266, 461–467, 1991; Pacifici, M. et al., Exp. Cell Res. 192, 266–270, 1991).
  • Zwischen den kalzifizierenden Chondrocyten und den Gelenkknorpelzellen können weitere Unterschiede festgestellt werden. Der kalzifizierende Knorpel weist eine hohe Aktivität der alkalischen Phosphatase auf (Robinson, R., Biochem. J. 17, 286–293, 1923; All, S. Y., in "Cartilage" (B. K. Hall, Hrsg.), Bd. 1, S. 343–378, Academic Press, New York) auf, wobei nur ein Hundertstel der Aktivität durch das Gelenkknorpelgewebe gezeigt wird (Iwamoto, M. et al., J. Biol. Chem. 266, 461–467, 1991). Die Knorpelmatrix enthält Kollagen des Typs X und dieses tritt in einem kalzifizierten knorpeligen Gewebe auf (Capasso, O. et al., Exp. Cell Res., 142, 197–206, 1982), im Gelenkknorpel ist sein Auftreten allerdings beschränkt. Es ist vorgeschlagen worden, dass diese Marker mit der Kalzifikation von Chondrocyten in Verbindung gebracht werden (Kato, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9552–9556, 1988; Kwan, A. P. L. et al., J. Cell Biol. 109, 1849–1856, 1989). Bei Osteoarthritis weisen Gelenkknorpelzellen eine höhere Aktivität der alkalischen Phosphatase als normale Gelenkknorpelzellen auf (Mokondjimobe, E. et al., 39, 759–762, 1991) und es ist in einer Studie unter Verwendung von menschlichem Gelenkknorpelgewebe festgestellt worden, dass ein osteoarthritisches Gewebe höhere Aktivität der alkalischen Phosphatase aufweist (Einhorn, T. A. et al., J. Orthop. Res. 3, 160–169, 1985). Gleichermaßen ist gezeigt worden, dass das Auftreten von Kollagen des Typs X in dem knorpeligen Gewebe von Patienten mit Osteoarthritis hoch ist (Hoyland, J. A. et al., Bone Miner. 15, 151–164, 1991). Auf diesen Befunden beruhend, wird spekuliert, dass die Kalzifikation des knorpeligen Gewebes oder subchondraler Knochen bei Osteoarthritis den Veränderungen in den Kennzeichen der Gelenkknorpelzellen zuzuschreiben ist, nämlich der Produktion von alkalischer Phosphatase und dem Auftreten von Kollagen des Typs X.
  • Die derzeit praktizierten Therapieschemata gegen Osteoarthritis sind nicht mehr als nosotrop oder indirekt, wie durch Schutztherapie, Verabreichung entzündungshemmender Mittel oder Hyaluronsäure und chirurgische Behandlungen beispielhaft gezeigt wird, und es gibt keinen etablierten therapeutischen Ansatz, der gut als "ätiotrop" beschrieben werden kann.
  • Der Zweck der Erfindung ist es, Arzneimittel bereitzustellen, die nicht nur als Vorbeugungsmittel für Osteoarthritis oder andere Erkrankungen, welche die Zerstörung und Degeneration des Gelenkknorpelgewebes nach sich ziehen, dienen, sondern ebenfalls als ätiotrope und direkte Therapeutika für derartige Erkrankungen.
  • WO 92/10511 offenbart Carboxylterminale Fragmente von PTHrP und deren Verwendung bei der Behandlung von Osteoporose, Paget-Krankheit, humoraler Hypercalcämie bei bösartigen Tumoren und metastatischen Knochenerkrankungen.
  • JP-02-207099 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von PTHrP und eines Heilmittels zur Behandlun von Hypercalcämie, Osteoporose und anderen Erkrankungen mit krankhaftem Calciummetabolismus.
  • JP-63-060940 stellt ein Katarakt-Vorbeugungsmittel oder -Heilmittel bereit, indem eine von PTHrP abgeleitete Substanz als Wirkstoff verwendet wird.
  • WO 94/08613 beschreibt die Verwendung von PTHrP zur Vorbeugung und Therapie von Fehl- und Frühgeburt.
  • WO 88/09376 betrifft therapeutische Zusammensetzungen, die einen ACSF-Antagonisten, besonders zur Behandlung humoraler Hypercalcämie bei Malignom, enthalten.
  • EP 0 451 867 beschreibt die Verwendung von PTHrP-Derivaten zur Behandlung von Hypercalcämie, Osteoporose, Hyperparathyroidismus und renaler Osteodystrophie.
  • In Genes & Development, Band 8, Nr. 3, Seiten 277 bis 289 wird die letale Skelettdysplasie durch gezielte Störung des Gens für das Parathyroid-Hormon-related Pepid behandelt.
  • Kurz gesagt, die vorliegende Erfindung betrifft Vorbeugungsmittel oder Therapeutika für Erkrankungen, welche die Zerstörung und Degeneration von Gelenkknorpelgewebe nach sich ziehen, wobei die Vorbeugungsmittel und Therapeutika ein PTH-related Peptid (PTHrP) oder eine von einem PTHrP abgeleitete Substanz als Wirkstoff enthalten.
  • Das in der Erfindung Anwendung findende Parathyroid-Hormon-related Peptid (PTHrP) umfasst natives PTHrP, mit Verfahren der Gentechnik erzeugtes PTHrP und chemisch synthetisiertes PTHrP und kann beispielhaft durch PTHrP aus Mensch, Rind oder Schwein, das aus 141 Aminosäuren besteht, gezeigt werden, wobei menschliches PTHrP bevorzugt wird. Der Begriff "von PTHrP abgeleitete Substanz" bedeutet partielle Peptide der vorstehend aufgelisteten PTHrPe, sowie Peptide, die durch partielle Modifikation von einzelnen Aminosäuren des PTHrP oder partiellen Peptiden davon durch Substitution, Deletion oder Addition erhalten werden und welche dieselbe Aktivität aufweisen. Beispiele für partielle Peptide von PTHrP schließen 1-34PTHrP, 1-84PTHrP, 3-141PTHrP, 7-141PTHrP, 35-141PTHrP, 85-141PTHrP, 107-141PTHrP, 107-140PTHrP, 1-87PTHrP, 3-87PTHrP, 7-87PTHrP, 1-111PTHrP, 3-111PTHrP und 7-111PTHrP ein, wobei menschliches 1-34PTHrP und menschliches 1-84PTHrP bevorzugt werden.
  • Das 1-34PTHrP bezeichnet ein partielles Peptid von PTHrP, welches aus 34 Aminosäuren besteht, die vom N-Terminus von PTHrP aus abgezählt werden. Die Anzahl zu substituierender, zu deletierender oder hinzuzufüngender Aminosäurereste ist nicht auf einen besonderen Wert beschränkt, solange die von der vorliegenden Erfindung beabsichtigte Aktivität beibehalten wird. Erkrankungen, welche die Zerstörung und Degeneration des Gelenkknorpelgewebes nach sich ziehen, schließen Osteoarthritis und rheumatoide Arthritis ein, wobei Osteoarthritis bevorzugt wird.
  • Wie schon erwähnt, ist von Kollagen des Typs X und von alkalischer Phosphatase bekannt, dass sie entscheidende Substanzen sind, die während der Kalzifikation von Knorpel oder subchondraler Knochen auftreten, und dass das Supprimieren des Auftretens von Kollagen des Typs X und der Herstellung von alkalischer Phosphatase zum Zweck der Linderung von Osteoarthritis wirksam ist. Weitere Befunde bei Osteoarthritis sind die Abnahme der Fähigkeit der Gelenkknorpelzellen, die Matrix zu synthetisieren und die Deformierung von knorpeligem Gewebe durch Matrixabbau; in Anbetracht dessen ist ein bevorzugtes Osteoarthritis-Therapeutikum ein Arzneimittel, welches die Synthese von Proteoglycanen, bei denen es sich um eine Komponente der Knorpelmatrix handelt, nicht stört, sondern beschleunigt. Es ist unnötig zu sagen, dass das bevorzugte Arzneimittel keine unpassende Wirkung auf das Wachstum und die Differenzierung von Chondrocyten verursachen sollte, wie durch das Stören ihres Wachstums.
  • Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen PTHrP gegen die Erkrankungen, welche die Zerstörung und Degeneration von Gelenkknorpelgewebe nach sich ziehen, kann durch die folgenden Verfahren verifiziert werden.
  • Die Wirkung auf das Wachstum von Chondrocyten, die Wirkung auf das Auftreten von Kollagen des Typs X, das ein entscheidender Marker bei der Degeneration von knorpeligem Gewebe ist, die Produktion von alkalischer Phosphatase und die darauf folgende Kalzifikation, sowie die Wirkung auf das Auftreten von Kollagen des Typs II, das eine Komponente der Knorpelmatrix ist, kann durch ein Experiment zum Kultivieren von in einem Zentrifugenröhrchen gewachsener Chondrocyten eines jungen Kaninchens (Kato, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9552–9556, 1988; Iwamoto, M. et al., Develop. Biol. 136, 500–506, 1989) und durch ein System zur ebenen Kultivierung von gewachsenen Chondrocyten (Shimomura, Y. et al., Calcif. Tissue Res. 19, 179–187, 1975) verifiziert werden. Besonders in dem Fall des Kultivierens in einem Zentrifugenröhrchen wuchsen und differenzierten die Knorpelzellen, um in etwa 20 Tagen kalzifiziert zu werden (Kato, Y. et al., Proc. Natl. Sci. Acad. USA 85, 9552–9556, 1988). Zusätzlich, wenn Gelenkknorpelzellen in einem ähnlichen Kultursystem kultiviert wurden, wurde die Entwicklung hoher Aktivität der alkalischen Phosphatase von Kalzifikation begleitet (Pacifici, M. et al., Exp. Cell Res. 192, 266–270, 1991). Es ist deshalb zu verstehen, dass diese Kultivierungssysteme Modelle sind, die beim Evaluieren der Wirksamkeit von Arzneimitteln gegen die Entwicklung krankhafter Kennzeichen durch Gelenkknorpelzellen bei Osteoarthritis experimentell nützlich sind.
  • Die Wirkung von PTHrP auf die Matrix von Chondrocyten kann unter Verwendung der Synthese von Proteoglycanen der Knorpelmatrix als Marker verifiziert werden. Ein anwendbares experimentelles Modell ist so, dass es dem PTHrP ermöglicht wird, auf kultivierte Chondrocyten während der Matrixsynthese zu wirken, wobei die Aufnahme von 35S-Schwefelsäure in die Matrix als Marker verwendet wird.
  • Um die vorstehend beschriebenen Wirkungen von PTHrP zu charakterisieren, muss die Gegenwart von PTHrP-Rezeptoren in Chondrocyten verifiziert werden. Tatsächlich ist gezeigt worden, dass die Gegenwart von PTH-Rezeptoren in Chondrocyten für die Entwicklung verschiedener Wirkungen von PTH auf Chondrocyten entscheidend ist (Lee, K. et al., Endocrinology, 134, 441–450, 1994).
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein Elektropherogramm, das die Gegenwart eines PTHrP-Rezeptors in Chondrocyten zeigt;
  • 2 ist ein Graph, der die Aktivität von PTHrP bei der Förderung der Synthese von Proteoglycanen, welche die Hauptkomponente der Knorpelmatrix sind, zeigt;
  • 3 ist ein Graph, der die Wirkung von PTHrP auf das Wachstum von Chondrocyten zeigt;
  • 4 ist ein Graph, der die Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen PTHrP und dem Wachstum von Chondrocyten zeigt;
  • 5 ist ein Graph, der zeigt, wie die ALP Aktivität von Chondrocyten über die Zeit hinweg anstieg und wie wirksam PTHrP beim Supprimieren dieses Phänomens war;
  • 6 ist ein Graph, der zeigt, dass PTHrP beim Kontrollieren der ALP Aktivität auf eine dosisabhängige Weise wirksam war;
  • 7 ist ein Graph, der die Fähigkeit von Chondrocyten zeigt, über die Zeit hinweg kalzifiziert zu werden, und wie wirksam PTHrP beim Supprimieren dieses Phänomens war;
  • 8 ist ein Graph, der zeigt, dass PTHrP beim Kontrollieren der Kalzifikation auf eine dosisabhängige Art und Weise wirksam war; und
  • 9 ist ein Satz von Elektropherogrammen, der die Wirkung von PTHrP auf die Expression der mRNA von Kollagenen des Typs X und II zeigt.
  • DIE BESTE ART ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
  • Neben Injektionen, die durch herkömmliche pharmazeutische Formulierungsverfahren für Peptide hergestellt werden, kann das erfindungsgemäße Arzneimittel Darreichungsformen annehmen, die für das Erreichen einer Lokalisierung und langandauernden Wirkung gedacht sind, wie durch die Abgrenzung in Mikrokapseln oder die Aufnahme in Gelbögen. Im Fall von Lösungen, werden vorzugsweise geeignete Proteine oder Antihaftmittel zugegeben.
  • Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann auf verschiedenen Wegen, wie subcutan, peroral, percutan, intrarectal und topisch, verabreicht werden, wobei die topische Verabreichung bevorzugt wird. Besonders bevorzugt wird die topische Verabreichung durch Injektion in die Gelenkspalte oder die betroffene Stelle.
  • Die erfindungsgemäße PTHrP-Dosis variiert mit der Erkrankung für welche sie angezeigt ist, mit deren Symptomen und dergleichen; bei einem Spiegel im Gewebe ist die Dosis von 10–20 bis 10–5 M, vorzugsweise von 10–15 bis 10–7 M.
  • (Beispiele)
  • Erfindungsgemäße Beispiele werden nachstehend beschrieben. Das in den Beispielen verwendete PTHrP war das menschliche, vom Peptide Research Laboratory gekaufte 1-34PTHrP.
  • (Beispiel 1)
  • In den folgenden Beispielen wurden gewachsene Chondrocyten aus der subchondralen Knochen- zu Knochen-Übergangszone von 4 Wochen alten Kaninchen nach dem Verfahren von Shimomura et al. (Shimomura, Y. et al., Calcif. Tissue Res. 19, 179–187, 1975) abgetrennt. Die abgetrennten Chondrocyten wurden nach dem Verfahren von Iwamoto et al. (Iwamoto, M. et al. Dev. Biol. 136, 500–507, 1989) und dem Verfahren von Kato et al. (Kato, Y. et al., Endocrinology, 127, 114–118, 1990) kultiviert. Es wird ausdrücklich angemerkt, dass die abgetrennten Chondrocyten in einem Eagel minimal-essentiellem Medium (MEM) suspendiert wurden, um eine Konzentration von 8 × 104 Zellen/ml in Gegenwart von 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 50 μg/ml Ascorbinsäure zu geben und dann in 1 ml Portionen in 15 ml Zentifugenröhrchen aus Plastik (Corning) beimpft wurden. Nach einer 5 Min. langen Zentrifugation (bei 1.500 Upm) wurden die Zellen in einem CO2-Gasinkubator mit einer Temperatureinstellung von 37°C kultiviert. Beginnend am 6. Tag der Kultivierung wurde jeden zweiten Tag ein Wechsel des Mediums durchgeführt. Die Gegenwart von PTHrP-Rezeptoren in den Chondrocyten wurde durch SDS Gelelektrophorese verifiziert. Es wird ausdrücklich angemerkt, dass die 14 Tage lang kultivierten Chondrocyten homogenisiert und mit 125I markiertem PTHrP 5 Std. lang inkubiert wurden. Die PTHrP-Bindung an die Rezeptoren wurde mit DSS vernetzt, mit einer SDS-Pufferlösung solubilisiert und auf einem SDS Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurde eine Autoradiographie auf die gewohnte Art und Weise durchgeführt. Als eine Kontrolle wurde PTHrP im Überschuss zugegeben, um die Bindung von 125I markiertem PTHrP an die Rezeptoren zu verhindern, und das ungebundene PTHrP wurde durch das gleiche Verfahren elektrophoretisch aufgetrennt und einer Autoradiographie unterzogen.
  • Die Ergebnisse werden in 1 gezeigt. Die durch 125I markierte PTHrP-Bindung mit den Rezeptoren wurde auf eine Stelle nahe einem Molekulargewicht von 76 kDa (siehe die linke Spur in 1) elektrophoretisch aufgetrennt, und die Bindung wurde durch die Zugabe von PTHrP im Überschuss vollständig verhindert (siehe die rechte Spur in 1). Dieses deutet auf die folgenden Möglichkeiten hin: in den Chondrocyten existieren PTHrP Rezeptoren, wobei PTHrP mit der Zwischenform davon die folgenden Wirkungen verwirklichen können.
  • (Beispiel 2)
  • Wie in Beispiel 1 wurden gewachsene Chondrocyten aus der subchondralen Knochen- zu Knochen-Übergangszone von 4 Wochen alten Kaninchen nach dem Verfahren von Shimomura et al. (Shimomura, Y. et al., Calcif. Tissue Res. 19, 179–187, 1975) abgetrennt. Die abgetrennten Chondrocyten wurden in einem Eagel minimal-essentiellem Medium (MEM) suspendiert, das 10% fötales Rinderserum und 50 μg/ml Ascorbinsäure enthält, und in eine Kulturplatte mit 96 Vertiefungen in einer Konzentration von 5000 Zellen pro Vertiefung beimpft. Sobald die Zellen konfluent wurden, wurde PTHrP zugegeben und einen Tag später wurde 1 μCi 33S-Schwefelsäure pro Vertiefung zugegeben, gefolgt von einer 17 Stunden langen Inkubation. Die Menge der im Überstand der Kulturlösung hergestellten Knorpelmatrix wurde mit dem Verfahren von Kato et al. (Kato, Y. et al., Endocrinology 122, 1991–1997, 1988) gemessen. Kurz gesagt, es wurde die Quanität von in Proteoglycanen aufgenommener 33S-Schwefelsäure gemessen.
  • Die Ergebnisse werden in 2 gezeigt, welche als eine Dosis-Wirkungskurve für PTHrP über einen Bereich von 10–10 bis 10–6 M angesehen werden kann. Offensichtlich beschleunigte PTHrP die Aufnahme von 35S-Schwefelsäure in Proteoglycane in einer dosisabhängigen Art und Weise und bei 106 M zeigte es eine Fähigkeit, Matrix zu synthetisieren, die etwa 3 mal so groß war wie die der Kontrolle. Dieses zeigt die Fähigkeit von PTHrP an, die Proteoglycanherstellung und somit die normale Differenzierung von Chondrocyten zu fördern.
  • (Beispiel 3)
  • Wie in Beispiel 1 wurden Chondrocyten in einem Zentrifugenröhrchen kultiviert. Am 8. Tag der Kultivierung wurde 10–7 M PTHrP zugegeben, und die Kultivierung wurde 28 Tage lang fortgesetzt. Nach der Kultivierung wurden die Zellen in geeigneten Abständen solubilisiert und die zeitabhängigen Änderungen des DNA Gehalts wurden gemessen. In einem anderen Experiment wurde PTHrP bei variierenden Konzentrationen von 10–10 bis 10–7 M zugegeben, und der DNA Gehalt wurde am 21. Tag der Kultivierung gemessen.
  • Die zeitabhängigen Änderungen im DNA Gehalt der Chondrocyten werden in 3 gezeigt, und Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen PTHrP und dem DNA Gehalt wird in 4 gezeigt. Offensichtlich stieg der DNA Gehalt der Kontrollgruppe mit der Zeit, was ein zufriedenstellendes Wachstum von Chondrocyten im Zentrifugenröhrchen anzeigt. Der DNA Gehalt der Chondrocyten wurde durch die Zugabe von PTHrP überhaupt nicht beeinflusst. Dies zeigt, dass PTHrP ein Arzneimittel ist, das keine ungünstigen Wirkungen auf das Wachstum von Chondrocyten verursacht.
  • (Beispiel 4)
  • Wie in Beispiel 1 wurden Chondrocyten in einem Zentrifugenröhrchen kultiviert. Am 8. Tag der Kultivierung wurde 10–7 M PTHrP zugegeben, und die Kultivierung wurde für einen Zeitraum von bis zu 28 Tagen fortgesetzt. Am 21. Tag der Kultivierung wurde eine PTHrP freie Gruppe angesetzt und mit der PTHrP behandelten Gruppe verglichen. In einem weiteren Experiment wurde PTHrP in variierenden Mengen von 10–10 bis 10–7 M zugegeben, und die Dosis-Wirkungsbeziehung wurde mit der Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP Aktivität) verifiziert. Zur Messung der ALP Aktivität wurden Chondrocytencluster in 0,2% Triton X-100 homogenisiert, bei 12.000 × g 15 min lang zentrifugiert, und der Überstand wurde mit dem Verfahren von Bessey et al. (Bessey, O. A. et al., J. Biol. Chem. 164, 321–329, 1946) untersucht. Um den Verlauf der Kalzifikation zu erforschen, wurden 0,5 μCi 45Ca in geeigneten Abständen zugegeben und seine Aufnahme in die Chondrocyten nach 24 Std., sowie der Ca-Spiegel am 28. Tag der Kultivierung wurden gemessen.
  • 5 zeigt die zeitabhängige Wirkung von PTHrP auf die ALP Aktivität und 6 zeigt die Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen der ALP Aktivität und PTHrP am 21. Tag seiner Zugabe. Offensichtlich wurde die ALP Aktivität auf die Chondrocyten nach der Zugabe von PTHrP supprimiert, und diese Wirksamkeit von PTHrP dauerte so lange wie es wirkte (siehe die PTHrP behandelte Gruppe in 5). Die Wirkung war reversibel und die ALP Aktivität wurde auf den Spiegel der Kontrollgruppe zurückgesetzt, nachdem das PTHrP am 21. Tag der Kultivierung aus der Kulturlösung entfernt wurde (siehe PTHrP freie Gruppe in 5). Die Wirkung war dosisabhängig und bei Konzentrationen über 10–9 M begann das PTHrP, die ALP Aktivität zu supprimieren und bei 10–8 M wurde die ALP Aktivität fast vollständig supprimiert (siehe 6). Das PTHrP supprimierte darauf folgend ebenfalls die Kalzifikation. Bei 10–7 M supprimierte PTHrP die Aufnahme von 45Ca in die Chondrocyten (siehe die PTHrP behandelte Gruppe in 7) und diese Wirkung verschwand bald nach dem Entfernen von PTHrP (siehe die von PTHrP freie Gruppe in 7). Die Kalzifikation supprimierende Wirkung von PTHrP war dosisabhängig und bei höheren Konzentrationen als 10–8 M wurde die Kalzifikation vollständig supprimiert (siehe 8). Diese Ergebnisse zeigen, dass PTHrP als ein Therapeutikum für Osteoarthritis wirksam ist.
  • (Beispiel 5)
  • Wie in Beispiel 1 wurden gewachsene Chondrocyten aus der subchondralen Knochen- zu Knochen-Übergangszone von 4 Wochen alten Kaninchen nach dem Verfahren von Shimomura et al. (Shimomura, Y. et al., Calcif. Tissue Res. 19, 179–187, 1975) abgetrennt. Die abgetrennten Chondrocyten wurden in einem Eagel minimal-essentiellem Medium (MEM), das 10% fötales Rinderserum und 50 μg/ml Ascorbinsäure enthielt, suspendiert und auf 3,5 cm Petrischalen, die mit Kollagen des Typs I beschichtet waren, beimpft, wobei jede Vertiefung 5000 Zellen enthielt. Nach einer 30 Tage langen Kultivierung ließ man für die letzten 6 Tage 10–8 und 10–7 M PTHrP aktiv werden. RNA wurde aus den kultivierten Zellen mit dem CsTFA Verfahren (Smale und Sasse, Anal. Biochem. 203, 352–356, 1992) präpariert, durch Elektrophorese abgetrennt und danach auf eine Membran übertragen. Die Membran, auf welche die RNA übertragen worden war, wurde mit einer 32P markierten cDNA-Sonde für Kollagene des Typs X und II hybridisiert.
  • Die Ergebnisse werden in 9 gezeigt; das linke Elektropherogramm macht die Expression der mRNA von Kollagen des Typs II sichtbar, und das rechte Elektropherogramm zeigt die Expression der mRNA von Kollagen des Typs X. Offensichtlich hatte PTHrP keine Wirkungen auf die Expression der mRNA von Kollagen des Typs II, wenn es in einer Konzentration von 10–8 oder 10–7 M zugegeben wurde; andererseits hemmte das PTHrP die Expression der mRNA von Kollagen des Typs X auf eine dosisabhängige Art und Weise bedeutsam. Diese Befunde zeigen, dass PTHrP die Expression der mRNA von Kollagen des Typs X, welches an Kalzifikation eng beteiligt ist, spezifisch supprimiert (d. h. supprimierte die Kalzifikation des Knorpels stark), aber dass die Herstellung von Kollagen des Typs II, welches eine Matrixkomponente ist, nicht nachteilig beeinflusst wird.
  • INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
  • Das erfindungsgemäße Arzneimittel, dass das PTHrP als einen Wirkstoff enthält, ist nicht nur beim Vermeiden von Erkrankungen, wie Osteoarthritis, welche die Zerstörung und Degeneration von Gelenkknorpelgewebe nach sich ziehen, nützlich, sondern auch beim Bereitstellen einer ätiotropen und direkten Therapie für derartige Erkrankungen.

Claims (6)

  1. Verwendung eines Parathyroid-Hormon-related Peptids (PTHrP) oder einer von PTHrP abgeleiteten Substanz zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen, welche die Zerstörung und Degeneration von Gelenkknorpelgewebe nach sich ziehen.
  2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei ein Parathyroid-Hormon-related Peptid (PTHrP) als Wirkstoff verwendet wird.
  3. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei eine von einem Parathyroid-Hormon-related Peptid (PTHrP) abgeleitete Substanz als Wirkstoff verwendet wird.
  4. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Erkrankung, welche die Zerstörung und Degeneration von Gelenkknorpelgewebe nach sich zieht, Osteoarthritis ist.
  5. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zerstörung und Degeneration von Gelenkknorpel die Kalzifikation von Knorpel und subchondraler Knochen nach sich zieht.
  6. Medikament zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen, die die Zerstörung und Degeneration von Gelenkknorpelgewebe nach sich ziehen, wobei das Medikament menschliches PTHrP beinhaltet.
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