DE19526174C2

DE19526174C2 - Mittel gegen Tumorwachstum

Info

Publication number: DE19526174C2
Application number: DE1995126174
Authority: DE
Inventors: Friedhelm Prof Dr Herrmann; Marion Brach; Michael Kiehntopf
Original assignee: BRACH MARION PRIV DOZ DR
Current assignee: BRACH MARION PRIV DOZ DR
Priority date: 1995-07-18
Filing date: 1995-07-18
Publication date: 1998-02-26
Anticipated expiration: 2015-07-19
Also published as: WO1997004006A1; DE19526174A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel gegen Tumorwachstum, welches die Resistenz von Tumorzellen gegenüber verschiedenen Therapieformen auf hebt. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin, die pharmazeutische und die biotechnische Industrie.

Es ist bekannt, daß Tumorzellen gegen die durch Chemo-, Glukokortikoid- oder Strahlentherapie induzierte Apoptose resistent werden können. Maßgeblich verantwortlich für diesen Effekt ist das Anti-Apoptose-Protein Bcl-2 (Sentman et al, Cell 67: 879, 1991; Mÿashita et al, Blood 81: 151, 1993; Zhong et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 4533, 1993).

Man hat versucht, Bcl-2-vermittelte Resistenz gegenüber Chemotherapie-induzierter Apoptose durch spezifische Unterdrückung der Translation des Bcl-2 Transkriptes in das Bcl-2 Protein mittels Antisense-Oligonukleotiden aufzuheben. Auf Grund der langen Halbwertszeit von Bcl-2 ist dies jedoch nur sehr unzufriedenstellend, mit geringer Spezifität möglich und erfordert eine lange Exposition der Tumorzellen mit den Antisense-Oligonukleotiden (Reed et al, Canc. Res 50: 6565, 1995; Campos et al,. Blood 84: 595, 1994). Damit eignet sich diese Verfahrensweise nicht für eine Applikation am Patienten, etwa für die Knochenmarksaufreinigung, die nur eine kurzfristige ex vivo Kultivierung der zur Transplantation vorgesehenen Zellen (bis zu 48 Stunden) erlaubt.

Es wurden kürzlich zwei Regionen sowohl in Bcl-2 als auch in einem anderen Protein, E1B, welches ebenfalls Apoptose verhindert, identifiziert (Boyd et al, Cell 79: 341, 1994; Tarodi et al, Virology 201: 404, 1994). Diese Regionen sind homolog, und sie sind in der Lage, Protein-Protein Interaktionen von Bcl-2 bzw. E1B mit putativen Effektor-Molekülen, Nip 1, 2 und 3 genannt, zu vermitteln (gezeigt in vitro im Yeast-Two Hybrid- System). Mutationen innerhalb dieser Domänen im E1B Protein, die die Interaktion von E1B mit Nip aufheben, verhindern auch die anti-apoptotische Wirkung von E1B in zellulären Systemen (Subdramarian et al, Gene 124: 173, 1993). Die funktionelle Bedeutung dieser Regionen in Bcl-2 Protein ist dagegen nicht bekannt. Zudem ist unklar, ob diese Regionen notwendig und ausreichend für die anti-apoptotische Wirkung beider Proteine sind.

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Resistenz von Tumorzellen gegenüber verschiedenen Therapieformen zu vermindern bzw. ganz aufzuheben. Aufgabe der Erfindung ist die Entwicklung eines entsprechenden Mittels, das u. a. auch zur Reinigung von Knochenmarkspräparationen bei Transplantationen eingesetzt werden kann.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit einem Mittel gemäß den Ansprüchen 1-4 gelöst. Dieses Mittel enthält als Wirkstoff ein zellpermeables Peptid, das Anti-Apoptose-Proteine, insbesondere das Protein Bcl-2, blockiert. Dieses Peptid entspricht den Aminosäuresequenzen, die die Interaktion mit Nip-Proteinen entsprechen. Es besteht aus einer die Zellpermeabilität bedingenden Signalsequenz und einer den zwei Interaktions-Domänen aus Bcl-2 entsprechenden Funktionssequenz. Die Signalsequenz hat eine Länge von 17 Aminosäuren, die Funktionssequenz hat eine Länge von 9 bzw. 10 Aminosäuren. Konkrete Beispiele sind die Proteine FP1 mit der Sequenz ERQIKIWFQNRRMKWKK-RRYRRDFAEM und FP2 mit der Sequenz ERQIKIWFQNRRMKWKK-AAPAPGIFS.

Gegenstand der Erfindung sind auch andere Peptide, die die Funktionssequenzen RRYRRDFAEM oder AAPAPGIFS umfassen, z. B. eine Kombination dieser Funktionssequenzen mit anderen Signalsequenzen, die ebenfalls eine Zellpermeabilität bedingen. Das gilt auch für Peptide, die nur Teile dieser Funktionssequenzen umfassen, bevorzugt für Peptide mit 7 bis 9 übereinstimmenden Aminosäuren. Aber auch bei einer geringeren Übereinstimmung ist im Regelfalle noch eine Wirksamkeit des Mittels gegeben; als Minimum müssen 3 Aminosäuren mit den Funktionssequenzen übereinstimmen.

Die erfindungsgemäßen Peptide haben weitreichende Anwendungsmöglichkeiten zur Verbesserung der Ansprechrate von Tumorzellen auf verschiedene Therapieformen. Sie eignen sich nicht nur für einen ex vivo/in vitro-Einsatz (beispielsweise beim Purging), sondern auch nach Stabilisierung für eine in vivo Applikation.

Es sind die ersten zellgängigen Peptide, die geeignet sind, zellgängiges Verhalten zu modulieren, indem sie Protein-Protein-Interaktionen unterbinden. Die Befunde sind der erste in vivo Hinweis auf die funktionelle Bedeutung bestimmter Regionen von Bcl-2 für seine Anti-Apoptose-Wirkung.

Das hier erstmals aufgezeigte Prinzip läßt sich auf eine Vielzahl anderer Anwendungsmöglichkeiten übertragen. So lassen sich mit den neuen zellgängigen Peptiden prinzipiell viele Formen der Protein-Protein-Interaktion blockieren, die zelluläres Verhalten, etwa in Antwort auf Wachstumsfaktoren oder verursacht durch aktivierte Onkogene, beeinflussen.

Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele und Abbildungen näher erläutert werden. In diesen Beispielen wurden die erfindungsgemäßen Peptide FP1 und FP2 verglichen

- mit Peptiden, die nur die Signalsequenz enthalten (SP)
- mit Peptiden, bei denen die Signalsequenz an solche Aminosäuren aus dem Bcl-2 Protein fusioniert wurde, die für die Interaktion mit Nip-Proteinen nicht notwendig sind (Kontrollpeptid KP) und
- mit Peptiden, die die Bcl-2 homologe Domäne des Funktionspeptids 1 repräsentieren, nicht aber an das Signalpeptid gekoppelt sind (FP-SP).

Abbildung 1

Die Zugabe aller Peptide ist dosisabhängig (bis zu 100 µg/ml) per se nicht toxisch in Zellen, die kein Bcl-2 exprimieren (humane Bcl-2 negative Tumorzell-Linie Karpas).

Abbildung 2A

Granulozyten-Makrophagen stimulierender Faktor verhindert die konstitutive Apoptose von Blut-Neutrophilen (Brach et al., Blood 80: 2920, 1992). In Anwesenheit der Funktionspeptide (FP 1, FP 2), nicht aber in Anwesenheit des Kontrollpeptides (KP), ist GM-CSF nicht mehr in der Lage, die konstitutive Apoptose von Blut- Neutrophilen zu verhindern.

Abbildung 2B

Die Zugabe aller Peptide beeinflußt nicht den spontanen Apoptose-Verlauf von Bcl-2 negativen Blut-Neutrophilen. Die zu verabreichende Dosierung ist per se nicht toxisch und somit für eine ex vivo/in vitro Vorgehensweise (z. B. Knochenmarkspurging von Myelom-Patienten) realisierbar.

Abbildung 3

In Anwesenheit der Funktionspeptide (FP1, FP2) werden Bcl-2 exprimierende Tumorzellen per se dosisabhängig apoptotisch, nicht jedoch in Anwesenheit von Signalpeptid (SP), Kontrollpeptid (KP) oder Funktionspeptid - Signalpeptid (FP-SP) allein. Der funktionell relevante Teil des Peptides wird ohne Vorschaltung der Signalsequenz (Funktionspeptid 1-SP) nicht von Zellen aufgenommen und entfaltet intrazellulär keine Wirkung (keine Apoptose von Bcl-2 exprimierenden Tumorzellen).

Abbildung 4

In Anwesenheit des Funktionspeptides (FP 1) erfolgt zusammen mit Dexamethason synergistische Induktion von Apoptose in Tumorzellen. In Anwesenheit der Kontrollpeptide (Signalpeptid oder Kontrollpeptid) sind diese Tumorzellen resistent gegenüber Dexamethason induizierter Apoptose.

5. Der funktionell relevante Teil des Peptides wird ohne Vorschaltung der Signalsequenz nicht von Zellen aufgenommen und entfaltet intrazellulär keine Wirkung (keine Apoptose von Bcl-2 exprimierenden Tumorzellen).

Befunde in allgemeiner Form

Erstmals wurden hier zellgängige Peptide entwickelt, die geeignet sind, zelluläres Verhalten zu modulieren, indem sie Protein-Protein-Interaktionen unterbinden. Die Befunde sind der erste in vivo Hinweis auf die funktionelle Bedeutung bestimmter Regionen von Bcl-21 für seine Anti-Apoptose-Wirkung. Die entwickelten Peptide erlauben eine Sensitivierung von Tumorzellen für Chemotherapie.

Auswirkungen

Die Peptide haben weitreichende Implikation zur Verbesserung der Ansprechrate von Tumorzellen auf Therapie. Sie eignen sich für einen ex vivo/in vitro-Einsatz (beispielsweise beim Purging), denkbar ist aber auch eine Stabilisierung für eine in vivo Applikation.

Das hier erstmals aufgezeigte Prinzip läßt sich auf eine Vielzahl anderer Anwendungsmöglichkeiten übertragen. So lassen sich mit zellgängigen Peptiden prinzipiell viele Formen der Protein-Protein-Interaktion blockieren, die zelluläres Verhalten, etwa in Antwort auf Wachstumsfaktoren oder aber verursacht durch aktivierte Onkogene, beeinflussen.

Claims

1. Mittel gegen Tumorwachstum, enthaltend als Wirkstoff ein zellpermeables Peptid, das das Anti-Apoptose-Protein Bcl-2 blockiert und aus einer die Zellpermeabilität bedingenden, 17 Aminosäuren großen Signalsequenz und einer 9 bzw. 10 Aminosäuren großen, den Bcl-2-Domänen entsprechenden Funktions sequenz besteht.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Sequenz enthält: ERQIKIWFQ-NRRMKWKK-RRYRRDFAEM (FP1).

3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Sequenz enthält: ERQIKIWFQNRRMKWKK-AAPAPGIFS (FP2).

4. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Peptid enthält, das die Funktionssequenzen RRYRRDFAEM oder AAPAPGIFS umfaßt.

5. Zellpermeables Peptid mit der Eigenschaft, daß es das Anti-Apoptose-Protein Bcl-2 blockiert und aus einer die Zellpermeabilität bedingenden, 17 Aminosäuren großen Signal sequenz und einer 9 bzw. 10 Aminosäuren großen, den Bcl-2-Domänen entsprechenden Funktionssequenz besteht.

6. Zellpermeables Peptid nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch folgende Sequenz: ERQIKIWFQNRRMKWKK-RRYRRDFAEM (FP1).

7. Zellpermeables Peptid nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch folgende Sequenz: ERQIKIWFQNRRMKWKK-AAPAPGIFS (FP2).

8. Zellpermeables Peptid nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch die Funktionssequenzen RRYRRDFAEM oder AAPAPGIFS.