JP2795657B2 - Ａｃｓｆおよびａｃｓｆアンタゴニストの製造方法および組成物 - Google Patents

Ａｃｓｆおよびａｃｓｆアンタゴニストの製造方法および組成物

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、ポリペプチドACSF（アデニル酸シクラーゼ
刺激因子）、およびインビボでACSFの活性に拮抗する物
質に関する。特に、本発明は、ACSFをコードしているDN
A、およびそのようなDNAを用いてACSFおよびそのポリペ
プチドアンタゴニスト（アミノ酸配列変異体および選択
したACSFエピトープに対して指向性である抗体を含む）
を製造する方法に関する。また、本発明は、特に種々の
新生物に付随する過カルシウム血症を治療するためのAC
SFアンタゴニスト（拮抗物質）を含有する治療組成物に
関する。
種々の癌、最も一般的には乳癌、肺癌および皮膚癌
が、非転移性の骨破壊および血清過カルシウム血症（悪
性の体液性過カルシウム血症、またはHHM）と臨床的に
関連しているが、この現象はこれらの癌に限定されるも
のでは決してない。HHMの原因であると従来考えられて
いた腫瘍細胞から放出される可溶性因子には、形質転換
成長因子、副甲状腺ホルモン、プロスタグランジン、お
よびその他の比較的その特徴がわかっていない因子が含
まれる。この対象に関する広範囲な概説については、マ
ンディーら［Mundy et al.,New England Journal of Me
dicine 310:1718（1984）］を参照。さらに最近になっ
て、ネズミ腫瘍、ラットライディヒ細胞およびヒトHHM
腫瘍から部分的に精製された物質に関する報告が為され
たが、この物質は副甲状腺ホルモン（PTH）受容体を刺
激し、アデニル酸シクラーゼ活性を発揮し、PTHアンタ
ゴニストNle8、18、Tyr34−ウシPTH（３−34）アミドに
よって阻害され、そして30〜40kDの範囲の分子量を有し
ている［ロダンら（Rodan et al.,J.Clin.Invest. 72:
1511（1983））；ストリューラーら（Strewler et al.,
J.Clin.Invest. 71:769（1983））；スチュワートら
（Stewart et al.,Clin.Res. 32:410A（1984））；メ
レンジノら（Merendino et.al.,Science 231:388（198
6））；インソグナら（Insogna et al.,Endocrinology
120:2183（1987）；スチュワートら（Stewart et a
l.,J.Bone and Mineral Research 1:267（1986））；
およびバーチスら（Burtis et al.,Endocrinology 11
8:1982（1986））］。これら因子のアミノ酸配列データ
はこれらの著者によって開示されておらず、また、候補
因子の多数は分子レベルで説明されていなかった。
本願出願日の時点で未公表の研究において、マーチン
（T.J.Martin）らはHHM偏平上皮癌（BEN）細胞抽出物か
らACSFを均質になるまで精製し、この因子のアミノ末端
のアミノ酸配列を次のように決定した： 不確定の残基はアステリスクで示している。
この配列からの最初の17残基に基づくペプチド類似体
を合成した:Ala−Val−Ser−Glu−His−Gln−Leu−Glu
−His−Asn−Cys｛［Glu8、Asn10、Cys11］ACSF（１−1
1）｝、Ala−Val−Ser−Glu−His−Gln−Leu−Leu−His
−Asn−Lys−Gly−Lys−Ser−Ile−Gln｛［Asn10］ACSF
（１−16）｝、および［Asn10、Tyr17］ACSF（１−1
7）。類似体［Glu8、Asn10、Gys11］ACSF（１−11）お
よび［Asn10］ACSF（１−16）はアデニル酸シクラーゼ
検定において不活性であり、PTHそれ自体またはBEN細胞
由来の培養液の作用に拮抗しなかった。大豆トリプシン
阻害物質とコンジュゲートさせた［Glu8、Asn10、Cy
s11］ACSF（１−11）を用いてウサギをACSFに対して免
疫し、得られた抗血清を放射免疫検定に用いた。
HHMに苦しんでいる患者を治療するためには、ACSFの
アンタゴニストを得る必要がある。ACSFの完全なアミノ
酸配列を得るためにACSFをコードしているDNAを得るの
が本発明の第１の目的である。これにより、組換え細胞
の培養においてACSFおよびACSFアンタゴニストを製造す
るのが容易になる。さらに、ACSFのＣ−末端配列はACSF
のこの領域に特異的な抗体を製造することを可能にし、
それによってACSFの免疫検定を改善する。これらおよび
本発明の他の目的は本明細書全体を検討することによっ
て明らかとなろう。
発明の要約 本発明の目的は、ACSFをコードしている核酸を得、こ
の核酸で宿主細胞を形質転換し、そして宿主細胞を培養
してACSFを培養液中に発現させることによって達成され
る。細胞培養液からACSFを回収するのが好ましい。
厳格性（ストリンジェンシー）の低い条件下でACSFを
コードしているDNAとハイブリダイズする核酸を用意す
る。ACSFをコードしているかもしれないし、またコード
していないかもしれないこの核酸をプローブに用いてcD
NAライブラリー、mRNA調製物、またはゲノムDNAライブ
ラリー中のACSFをコードしている核酸を同定する。
本当にACSFをコードしている核酸を、ハイブリダイズ
させる核酸と同じ目的でプローブとして用いる。ウイル
スまたはプラスミドなどの発現ベクター中に挿入し、続
いて細菌、酵母または哺乳動物細胞などの宿主細胞中に
トランスフェクションし、そしてこの形質転換体をACSF
の発現のために培養するとACSFの発現を可能にする別の
機能を提供する。
本発明の範囲内に含まれるのはACSFアンタゴニストで
ある。そのようなアンタゴニストには、ACSFの生物学的
活性を中和することができる抗体（ポリクローナルまた
はモノクローナル）、アンタゴニストアミノ酸配列変異
体、または患者においてインビボで中和抗体を生成させ
ることができるACSF免疫原が含まれる。
治療用のACSFアンタゴニスト組成物も提供されるが、
これはHHMの治療に有用である。これらの組成物には、
所望により、TGF−αアンタゴニスト、EGFアンタゴニス
トおよびPTHアンタゴニストなどの追加の治療物質が含
まれる。
ACSFのＣ−末端は本明細書中に記載されている。この
領域は、PTHとのいかなる相同配列をも有していないア
ミノ酸配列を含んでいる。このACSFのＣ−末端領域は、
PTHと交差反応しない抗体、従ってACSFの免疫検定にお
いて、特にＮ−末端エピトープとＣ−末端エピトープに
対する抗体を用いるサンドイッチ型の免疫検定において
特に有用な抗体を製造するのに有用である。また、Ｃ−
末端領域に対する抗体は、HHMまたは同様の後遺症を有
する症状の治療にも有用であろう。
図面の簡単な説明 第１図は、ACSFのアミノ酸配列に従って構築した２種
類の72merのプローブ（brf.1およびbrf.2）のヌクレオ
チド配列（上段）を、対応するACSF cDNAの配列（下
段）と比較して示すものである。相同なヌクレオチドは
アステリスクを付して目立つようにした。
第２図は、ACSFクローンbrf.52のヌクレオチドおよび
アミノ酸配列である。いくつかの制限酵素切断部位が示
されている。
第３図は、ヒトACSFのアミノ酸配列と、３種の動物種
のPTHおよびヒトPTHのそれを比較するものである。完全
に相同な残基を箱で囲んだ。
第４図は、ACSFの発現ベクターの適切な構築方法を示
すものである。簡単に説明すると、ACSF遺伝子をλクロ
ーンbrf.52から回収し、クローニングベクターpUC119に
継ぎ合わせる。クローンした遺伝子を回収し、Ｎ−末端
をコードしているオリゴヌクレオチドとともに発現ベク
ターpCIS2.8c24D中に連結して、発現ベクターpCIS2.BRF
1.1を構築する。
第５図は、発現ベクターpCIS2.BRF1.1の構造を示すも
のである。
第６図は、BEN細胞cDNAにおいて同定された部分的な
ヌクレオチド配列およびポリペプチドのアミノ酸配列で
あり、ACSFと相同な領域を含んでいる。
発明の詳細な説明 本発明のために、ACSFとは、生物学的に活性であり、
かつ第２図に示したアミノ酸配列を有している一群のタ
ンパク質またはポリペプチド、並びに、第２図の配列の
置換、削除または挿入変異体であるタンパク質またはポ
リペプチドであって、PTHまたはその既知のアゴニスト
またはアンタゴニスト類似体を除くものと定義する。
構造的には第２図の配列は、31残基のシグナル、これ
に続く５残基の塩基性プロ配列、および完全なACSF配列
からなるプレACSFを示している。完全なACSFは３つの主
領域を含んでいる。これらの最もＮ−末端側、即ち、お
よび残基１から残基83までにわたるＮ−末端領域と呼ば
れる領域は、一部がPTHに相同である配列を含んでお
り、従ってACSFのPTH受容体結合機能を含んでいるであ
ろう。これに続くＣ−末端方向に、およそ残基84から10
8までにわたる塩基性ペプチドと呼ばれる塩基性の高い
領域があり、そして最後に、およそ残基109から141まで
にわたってＣ−末端ペプチドがある。このＣ−末端ペプ
チドは、PTH活性に起因しないHHMの１またはそれ以上の
作用、例えば血漿1,25−ジヒドロキシビタミンＤの減
少、カルシウムの消化管吸着、および腎臓細管のカルシ
ウム再吸着、並びに骨形成障害の原因であることもあ
る。
生物学的に活性とは、ACSFタンパク質またはポリペプ
チドが第２図のアミノ酸配列を有するACSFの少なくとも
１つの既知または固有の活性を発揮する性質を有する
か、または、そのような活性を有していないときには、
（ａ）該活性に対してアンタゴニスト的に作用するか、
または（ｂ）第２図の配列を有するACSFに対して生成さ
せた抗体と交差反応することができることを意味する。
抗−ACSF抗体を生成させる能力を別にすると、既知の
ACSFの生物学的活性には、１またはそれ以上のアデニル
酸シクラーゼ刺激活性、PTH受容体結合活性、および骨
再吸収活性が含まれる。好ましくは、ACSFは骨芽細胞様
の細胞における環状AMPの用量依存性の生成を用いる生
物学的な系で検定され、一方、アンタゴニストは過カル
シウム血症を示すBEN細胞を有するヌードマウスにおい
て、またはラットのライディヒ細胞モデルにおいて最も
直接的に検定される。検定を行うことが可能ないくつか
の方法が存在するが、これには骨芽細胞様の細胞の膜ホ
モジネート中のアデニル酸シクラーゼ活性の直接測定、
および無傷細胞によって生成される環状AMPの検定が含
まれる。簡単で便利なように、そして極めて多数の試料
の検定を容易にするため、培養培地で被験試料を数段階
に希釈し、UMR106−01［マーチンら（Martin et al.,Na
ture 260:436（1976））］細胞を対照および試験培地
を入れた12ウェルのプラスチック皿中で複製培養物とし
て増殖させ、3H−アデニンとともに２時間プレインキュ
ベートすることによって細胞のATPプールを3Hでラベル
し、細胞を簡単に洗浄し、次いで1mMのイソブチルメチ
ルキサンチン、ホスホジエステラーゼ阻害物質を加える
ことによって応答を検定する。10分後に反応を停止さ
せ、ダウエックス（Dowex）（登録商標）および中性ア
ルミナの連続クロマトグラフィーでインキュベート物か
ら3H−環状AMPを精製する。細胞は、環状AMP生成の用量
依存性の増加を伴ってPTHおよびＥシリーズのプロスタ
グランジン（主にPGE2）に応答する。この検定でのPTH
に対する応答（PGE2に対する応答を除く）は、PTHのペ
プチドアンタゴニスト［クボタら（Kubota et al.,J.En
docrinology 108:261（1986））］または合成ヒトPTH
（１−34）に対して調製されたPTHに対する他の抗血清
との試料の前インキュベートによって阻害される。
第２図の配列の置換、削除、または挿入変異体は１ま
たはそれ以上の次の活性、即ちACSFアンタゴニスト、AC
SFアゴニスト、または抗−ACSF交差反応性を有している
であろう。第２図で示されるヒトACSF配列の動物類似体
（例えば、ウシまたはブタACSF）、およびこのようなAC
SFの種変異体のアレル変異体はACSF活性を有しているで
あろうが、通常、自体既知の方法に従って、上記のイン
ビトロまたはインビボ生物検定でそれぞれの構築物をス
クリーニングすること、または構築物を免疫検定プロト
コールで用いてそのACSF交差反応性を測定することが必
要であろう。
ACSFアンタゴニストおよびアゴニスト活性は、候補の
連続希釈を第２図の完全配列を有するACSFを含む培養培
地で行うことを除き、ACSFと同じ方法によるUMR細胞生
物検定で測定するのが好ましい。アンタゴニストは試験
細胞におけるACSF媒介のcAMP生成を抑制するその能力に
よって同定され、アゴニストはその刺激作用によって同
定される。
また、第２図のACSFに対する免疫化によってウサギに
生成させた抗血清と免疫学的に交差反応性であるACSF変
異体もACSF免疫原として有用であろう。ACSF免疫原は、
第２図のACSFと交差反応する抗血清をウサギにおいて生
成させるその能力によって同定される。通常の免疫化プ
ロトコールを用い、フロインド完全アジュバント中の候
補調製物をウサギに皮下接種し、次に、同じ投与経路で
フロインド不完全アジュバント中の連続ブースターを接
種する。ACSFを明ばんと配合するか、またはそれをグル
タルアルデヒドで架橋して、検出可能な力価を有する応
答を生じさせることが必要となろう。最初の接種後の最
初の月の終わりに、およびそれに続く２カ月のそれぞれ
の終わりに動物を抗−ACSFについて検定する。
通常、ACSFのアミノ酸配列変異体は、第２図に示した
残基番号に基づくと、次の成熟ACSF配列内のアミノ酸残
基の置換、削除、または挿入によって特徴付けられる：
即ち、１−34、50、53、79、および81−141。
挿入は、示した残基のＮまたはＣ−末端ペプチジル結
合のいずれかに隣接して導入され、好ましくは対で導入
される。通常、挿入は１〜約30残基の範囲であろうが、
２が好ましい挿入である。しかし、免疫原性の配列の挿
入が所望であるときには、この挿入はその目的に適した
あらゆる大きさのものであってよく、100残基を越える
ことも多い。通常、ACSF免疫原は挿入変異体であり、免
疫原性の配列がACSFまたは標的エピトーブを有するその
フラグメントのＮまたはＣ末端に導入される。例えば、
大腸菌（E.coli）のtroD、trpEまたはブドウ球菌のプロ
テインＡ遺伝子の免疫原性フラグメントをコードしてい
るDNAをその５′または３′末端で、ACSFをコードして
いるDNAの５′または３′末端に連結し、組換え細胞培
養物中で発現させてACSF免疫原を調製する。例えば、塩
基性ペプチドおよびＣ−末端ペプチドを含有している領
域をＮ−末端残基のところで免疫原性ポリペプチド（通
常は細菌性のポリペプチド）のＣ−末端残基に結合させ
て、ACSFのＣ−末端領域に対する抗体を生成させうる免
疫原を調製する。同様に、ACSFの約84から107にわたる
残基のＮ−末端にシグナル配列を挿入すると（場合によ
っては、ACSFの残基１〜83から106までの削除を伴っ
て）組換え細胞培養物からACSFのＣ−末端領域を分泌さ
せるのに有用であろう。をコードしているDNAの発現 アルカリホスファターゼまたはST−IIエンテロトキシン
の配列、または酵母α因子シグナル、［V2GGS3］ACSF
（１−141）；［V2SS3］ACSF（１−141）；［V2EKA3］A
CSF（１−141）；［G123PPD124］ACSF（３−141）；［S
130FYT131］ACSF（３−141）；［R139DYR140］ACSF（３
−141）；［V2AGS3］ACSF（１−141）；［T132KKK
S133］ACSF（１−141）；［S3EEE4］ACSF（１−34）；
［E4IH5］ACSF（１−34）；［E4IH5DQ6］ACSF（１−3
4）；および［P44DN45］ACSF（１−141）に対して、こ
のような変異体は、ACSFアゴニストまたはアンタゴニス
ト活性を示さない程度で、ACSFに対する抗体と交差反応
し、従ってACSFの免疫原として、またはACSF免疫検定に
おいて標準もしくは対照として用いるのに有用となろ
う。多数の変異体が置換、削除および挿入の組合せを含
んでいることは明らかであろう。
また、ACSFの削除変異体は本明細書中の組換え法によ
って調製することができる。削除変異体ACSF（１−83）
およびACSF（１−34）はPTH活性を有している。その他
の削除変異体には、ACSF（１−84、109−141）、ACSF
（１−34、40−141）、ACSF（１−50、60−141）、ACSF
（１−75、84−141）、ACSF（１−109）、ACSF（３−3
4）、ACSF（４−34）、ACSF（５−34）、ACSF（６−3
4）、およびACSF（３−124）が含まれる。好ましい削除
はおよその残基１−35および85−141のもの、またはそ
の範囲内のものである（通常、34以降のACSF残基は削除
変異体中に依存しているであろう）。このような変異体
はACSFエピトーブを含有しているので、ACSFに対するア
ゴニストまたはアンタゴニストではない程度に、ACSFに
対する抗体と交差反応するであろう。さらに、ACSFから
の削除であってその場所にPTH由来の類似配列が挿入さ
れているもの、例えばPTH（７−34）ACSF（35−141）あ
るいはPTH（３−34）ACSF（35−141）が含まれる。
最も普通にはACSFの変異体は置換変異体であり、ACSF
中の少なくとも１つの残基が削除され、別の残基がその
位置に挿入されているものであろう。通常、置換は次の
表に従って行われる： 第１表のものより保存性が少ない置換を選択すること
によって、即ち、（ａ）置換領域におけるポリペプチド
骨格の構造、例えばシートまたは螺旋の立体配座、
（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、また
は（ｃ）側鎖の大きさ、を維持するその作用がもっと有
意に異なっている残基を選択することによって、機能ま
たは免疫学的な独自性の実質的な変換が行われる。通
常、ACSFの性質に最大の変化をもたらすと予想される置
換は、（ａ）親水性の残基（例えば、セリルまたはトレ
オニル）が、疎水性の残基（例えば、ロイシル、イソロ
イシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル）に
代えて（または、によって）置換されているもの；
（ｂ）プロリンが他のいずれかの残基に代えて（また
は、によって）置換されているもの；（ｃ）電気陽性の
側鎖を有する残基（例えば、リジル、アルギニルまたは
ヒスチジル）が、電気陰性の残基（例えば、グルタミル
またはアスパルチル）に代えて（または、によって）置
換されているもの；または（ｄ）大きな側鎖を有する残
基（例えば、フェニルアラニン）が、そのような側鎖を
有さない残基（例えば、グリシン）に代えて（または、
によって）置換されているものであろう。
代表的な置換変異は、残基１−９、12−15、20、23−
28、31−32、49−50、53、59−61、79−82、86−98、10
4−105、115、118、120、123、127−133、および139−1
40のいずれかに導入されるが、１−９および109−141が
好ましい。その例には、［MY1］ACSF（１−141）、［MP
1］ACSF（１−141）、［MG1］ACSF（１−141）、［F2］
ACSF（１−141）、［Y2］ACSF（１−141）、［H2］ACSF
（１−141）、［D3］ACSF（１−141）、［Y3］ACSF（１
−141）、［H3］ACSF（１−141）、［K20］ACSF（１−1
41）、［E19］ACSF（１−141）、［V21］ACSF（１−14
1）、［D20］ACSF（１−141）、［Y24］ACSF（１−14
1）、［K25］ACSF（１−141）、［E25］ACSF（１−14
1）、［M31］ACSF（１−141）、［Y34］ACSF（３−14
1）、［I8、I18、Y34］ACSF（３−141）、［I8、I18、Y
34］ACSF（３−34）、［D79］ACSF（１−141）、
［P98］ACSF（１−141）、［P105］ACSF（１−141）、
［Y90］ACSF（１−141）、［W89］ACSF（１−141）、
［H96］ACSF（１−141）、［F110］ACSF（106−141）、
［Y117］ACSF（106−141）、［D122］ACSF（106−14
1）、［K125］ACSF（106−141）、［Y132］ACSF（106−
141）、［A133］ACSF（106−141）、および［D141］ACS
F（106−141）が含まれる。これらの変異体はACSFのエ
ピトープを含んでおり、従ってこれらが保持しているこ
ともあるアゴニストまたはアンタゴニスト活性にかかわ
らず免疫原または免疫検定試薬として有用となろう。
ほとんどの削除および挿入、並びに特に置換は、ACSF
分子の性質に激変をもたらさないであろう。しかし、置
換、削除または挿入の正確な効果をそれを行う前に予測
することが困難であるとき、例えばPTH受容体結合領域
または免疫エピトープを修飾するときには、通常のスク
リーニング検定によってその効果を評価するのは当業者
の認識するところであろう。例えば、変異体は通常、天
然のACSFをコードしている核酸の部位特異的な突然変異
誘発、組換え細胞培養での変異核酸の発現、および所望
により、細胞培養物からの精製（例えば、少なくとも１
つの残存免疫エピトープによって変異体を吸着させるた
めのウサギポリクローナル抗−ACSFカラムへの免疫アフ
ィニティー吸着による）によって調製される。これとは
異なり、低分子量の変異体（例えば、約50以下の残基を
有する変異体）はインビトロ合成法によって調製するの
が好都合である。この方法は非天然のアミノ酸（例え
ば、Ｄ−アミノ酸）をACSF配列中に導入する機会を与え
る。次いで、合成変異体、細胞溶解液または精製された
ACSF変異体の活性を、目的の性質に対して適切なスクリ
ーニング検定で調べる。例えば、ある抗体に対する親和
性などのACSFの免疫学的性質の変化は競合型の免疫検定
で測定する。インビボでのACSFの機能がさらにわかった
ときには、他の検定がスクリーニングに有用となるであ
ろうが、アデニル酸シクラーゼ刺激活性の変化は生物検
定で測定する。その他のACSFの性質、例えば酸化還元も
しくは熱安定性、pI、疎水性、タンパク質加水分解に対
する感受性、または担体と、もしくはマルチマーに集合
する傾向などの修飾は当業者には周知の方法によって検
定される。
ACSF分子の共有結合修飾が本発明の範囲内に含まれ
る。このような修飾は、回収したタンパク質の標的アミ
ノ酸残基を、選択した側鎖または末端残基と結合させる
ことができる有機誘導化試薬と反応させることによっ
て、または選択した組換え宿主細胞中で機能する翻訳後
修飾の機序を利用することによって、コードされた分子
中に導入される。得られた共有結合誘導体は、生物学的
活性にとって重要な残基を同定することを目的とする計
画において、または免疫原として有用である。例えば、
ニンヒドリンと反応させた後のタンパク質の生物学的活
性の完全な不活性化は、少なくとも１つのアミノ基がそ
の活性に必須であることを示唆し、その後、選択した条
件下で修飾された個々の残基が修飾アミノ酸残基を含む
ペプチドフラグメントの単離によって同定される。
システイニル残基は、最も普通にはα−ハロアセテー
ト類（および対応のアミン類）、例えばヨウ化酢酸また
はヨウ化アセトアミドと反応させてカルボキシメチルま
たはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。また、シス
テイニル残基は、プロモトリフルオロアセトン、α−ブ
ロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロ
アセトールホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド類、
３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル−２−
ピリジルジスフィド、ｐ−クロロマーキュリベンゾエー
ト、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノールまた
はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−1,3−ジア
ゾールとの反応によって誘導体化される。真正のACSFは
システイン残基を欠いているので、有機誘導体化は、挿
入または置換システイン含有のACSF変異体、例えば免疫
原性ペプチドに対する架橋を容易にするためにＮまたは
Ｃ−末端システインが挿入さえたACSFまたはそのフラグ
メントに対してのみ適用が可能である。
ヒスチジル残基はpH5.5〜7.0でのジエチルピロカーボ
ネートとの反応によって誘導体化にするのが好ましい
が、これはこの試薬がヒスチジル側鎖に対して比較的特
異的であるからである。パラ−ブロモ−フェナシル ブ
ロミドも有用である；この反応は0.1Mカコジル酸ナトリ
ウム中、pH6.0で行うべきである。
リジニルおよびアミノ末端残基はコハク酸またはその
他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの試薬によ
る誘導体化はリジニル残基の電荷を逆にする作用を有し
ている。αアミノを含有している残基を誘導体化するの
に適したその他の試薬には、メチル、ピコリンイミデー
トなどのイミドエステル類；ピリドキサル ホスフェー
ト；ピリドキサル；水素化ホウ素類；トリニトロベンゼ
ンスルホン酸;O−メチルイソ尿素;2,4−ペンタンジオ
ン；およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触
媒の反応が含まれる。
アルギニル残基はいくつかの通常の試薬、例えばフェ
ニルグリオキサル、2,3−ブタンジオン、1,2−シクロヘ
キサンジオンおよびニンヒドリンなどのいずれかとの反
応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、
グアニジン官能基の高いpKaの故に反応をアルカリ条件
で行うことを必要とする。さらに、これら試薬はリジン
の基、並びにアルギニンのε−アミノ基と反応すること
もある。
チロシル残基自体の特異的な修飾が、芳香族ジアゾニ
ウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって
チロシル残基にスペクトル標識を導入するのに特別の興
味を持って、広範囲に研究された。最も普通には、Ｎ−
アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを用い
てＯ−アセチル チロシン種および３−ニトロ誘導体を
それぞれ得る。125Iまたは131Iを用いてチロシル残基を
ヨウ素化し、放射免疫検定で用いるためのラベルされた
タンパク質を調製するが、この目的のためにはクロラミ
ンＴ法が自体広く採用される。
カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）
は、カルボジイミド類（Ｒ′−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ′）、例
えば１−シクロヘキシル−３−（２−モリホリニル−
（４）−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３
−（４−アゾニア−4,4−ジメチルペンチル）−カルボ
ジイミドなどとの反応によって選択的に修飾される。さ
らに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウ
ムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタ
ミニル残基に変換されるが、これは核酸を突然変異させ
てアスパラギンおよびグルタミンをコードさせる別法で
ある。
二官能性試薬による誘導体化は、タンパク質と免疫原
性ポリペプチドとの分子間集合体を調製するのに、並び
に、抗体のアフィニティー精製または検定で用いるため
の水不溶性の支持体マトリックスまたは表面にタンパク
質を架橋させるのに有用である。さらに、鎖内架橋の研
究は立体配座構造の直接的な情報を与えるのであろう。
通常用いられる架橋剤には、1,1−ビス（ジアゾアセチ
ル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル類、例えば４−アジ
ドサリチル酸とのエステル類、ホモ二官能性イミドエス
テル類、例えば3,3′−ジチオビス（スクシンイミジル
−プロピオネート）などのジスクシンイミジルエステル
類、および二官能性のマレイミド類、例えばビス−Ｎ−
マレイミド−1,8−オクタンが含まれる。メチル−３−
［（ｐ−アジド−フェニル）ジチオ］プロピオイミデー
トなどの誘導体化試薬は、光の存在下で架橋を形成させ
ることができる光活性化しうる中間体を与える。
さらに、米国特許No.3.969,287;3,691,016;4,195,12
8;4,247,642;4,229,537および4,330,440に記載されてい
る反応性基質、および臭化シアン活性化した炭水化物な
どの反応性の水不溶性マトリックスがタンパク質の固定
化に用いられる。
ある種の翻訳後の誘導体は、発現されたポリペプチド
に及ぼす組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミ
ニルおよびアスパラギニル残基は翻訳後に脱アミド化さ
れて対応のグルタミルおよびアスパルチル残基になるこ
とが多い。別法によれば、これらの残基は穏やかな酸性
条件下で脱アミドされる。これら残基のいずれの形態も
本発明の範囲内に入る。
その他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンのヒ
ドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキ
シル基のホスホリル化、リジン、アルギニンおよびヒス
チジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［クレイトン（T.
E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Prope
rties,W.H.Freeman ＆ Co.,San Francisco pp.79−86
（1983））］、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびあ
る場合にはＣ−末端カルボキシルのアミド化が含まれ
る。
ACSFは組換え細胞培養中での合成によって調製するの
が好ましい。そうするためには、第１にACSFをコードし
ている核酸を入手することが必要である。最終的に決定
されるACSFをコードしているヒトcDNAの配列は第２図に
示されている。このDNAが同定されたときには、ヒトDNA
のゲノムライブラリーへの核酸ハイブリダイゼーション
によって、または、別の動物種のACSFをコードしている
DNAを得るのが所望であるときには、放射ホスホリル化
したλBRF52cDNAを用いる核種の細胞由来のDNAライブラ
リーのハイブリダイゼーションによって、上記核酸を得
るのは当業者には自明のことである。標的DNAに対して
完全に相同であるが、または相同性が高い相補体である
極めて長い合成プローブの調製を第２図が可能にしてい
るので、ここでのハイブリダイゼーション分析は簡単な
ことである。
ACSF核酸の供給源として選択したゲノムライブラリー
またはcDNAがACSFの部分的なクローンだけを含んでいる
こともありうる。これらの部分的なクローンおよびフラ
グメントは、部分的なクローンを重なり合い部分中の選
択した制限部位で切断し、所望のフラグメントをそれぞ
れ回収し、そして適切な順序および配向でそれらを連結
することによって、完全長さのACSF DNAに容易に組み立
てられる。必要なら、失われた配列を供給するためにオ
リゴヌクレオチドを調製する。
次いで、ACSFをコードしている核酸を、さらにクロー
ニングするための、または発現させるための複製可能な
ベクターに連結する。ベクターは適合宿主細胞と共同し
て２つの機能を発揮するのに有用である（宿主−ベクア
ー系）。機能の１つは、ACSFをコードしている核酸のク
ローニングを容易にすること、即ち必要量の核酸を生産
させることである。他の機能はACSFを発現させることで
ある。これら機能の１つまたは両方はベクター−宿主系
によって行われる。ベクターはそれらに行わせる機能、
並びに、クローニングまたは発現用に選択した宿主細胞
に依存して異なった成分を含有しているであろう。
それぞれのベクターは上に記したようにACSFをコード
している核酸を含有しているであろう。通常、これはア
ミノ末端が分泌シグナルに結合している成熟ACSFをコー
ドしているDNAであろう。この分泌シグナルは、通常イ
ンビボでヒト細胞からACSFを分泌させるACSFプレ配列で
あるのが好ましい。しかし、適当な分泌シグナルには、
動物ACSF由来のシグナル、PTHシグナル、ウイルス性シ
グナル、または同一もしくは関連の種の他の分泌ポリペ
プチド由来のシグナルも含まれる。
発現およびクローニングベクターは、１またはそれ以
上の選択した宿主細胞中でのベクターの複製を可能にす
る核酸配列を含んでいる。通常、クローニングベクター
においては、この配列は宿主染色体には依存せずにベク
ターの複製を可能にする配列であり、複製起源または自
律的に複製する配列を含んでいる。このような配列は種
々の細菌、酵母およびウイルスについても周知である。
よく知られているプラスミドpBR322由来の複製起源がほ
とんどのグラム陰性細菌に適しており、酵母に対しては
２μプラスミド起源が、そして種々のウイルス性起源
（SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBPV）
が哺乳動物細胞中のクローニングベクターに有用であ
る。起源は哺乳動物発現ベクターには必要ではない。ほ
とんどの発現ベクターは「シャトル（往復）」ベクター
である：即ち、少なくとも一群の生物中で複製が可能で
あり、発現のために別の生物中にトランスフェクション
することができる。例えば、ベクターを大腸菌中でクロ
ーンし、次に同じベクターを、発現宿主細胞染色体とは
独立して複製することができないものであっても、発現
用に酵母または哺乳動物細胞中にトランスフェクション
する。
また、DNAは宿主ゲノム中への挿入によってクローン
される。これは、バシラス種を用い、例えばバシラスの
ゲノムDNA中に見い出される配列に相補性であるDNA配列
をベクター中に含ませることによって容易に行われる。
このベクターを用いてバシラスをトランスフェクション
すると、ゲノムとACSF DNAの挿入体による相同組換えが
起こる。しかし、DNAの切り出しには制限酵素消化が必
要であるので、ACSFをコードしているゲノムDNAの回収
は外部で複製されたベクターのそれよりも複雑である。
発現およびクローニングベクターは選択遺伝子（選択
マーカーとも呼ばれる）を含んでいるべきである。これ
は、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増
殖に必要なタンパク質をコードしている遺伝子である。
この遺伝子の存在は、ベクターを欠いているすべての宿
主細胞が形質転換宿主を越える増殖または複製の利益を
受けないことを確実なものにする。通常の選択遺伝子
は、（ａ）抗生物質またはその他の毒素、例えばアンピ
シリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラ
サイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）
栄養要求欠損を補足するタンパク質、または（ｃ）コン
プレックス培地から入手できない必須栄養物質を供給す
るタンパク質、例えばバシラスのためのＤ−アラニン
ラセマーゼをコードしている遺伝子、をコードしてい
る。
酵母で用いるのに適した選択遺伝子は、酵母プラスミ
ドYRp7中に存在しているtrp1遺伝子である［スティンク
コンブら（Stinchcomb et al.,1979,Nature 282:3
9）；キングスマンら（Kingsman et al.,1979,Gene 7:
141）；またはチェンバーら（Tschemper et al.,1980,G
ene 10:157）］。このtrp1遺伝子は、トリプトファン
中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばATCC
No.44076またはPEP4−１［ジョーンズ（Jones,1977,Ge
netics 85:12］の選択マーカーを与える。次いで、酵
母宿主細胞ゲノム中のtrp1欠損の存在は、トリプトファ
ンの非存在下での増殖による形質転換の検出に有効な環
境を与える。同様に、Leu2欠損酵母株（ATCC 20,622ま
たは38,626）は、Leu2遺伝子を有する既知のプラスミド
によって補足される。
哺乳動物細胞に適した選択マーカーの例は、ジヒドロ
葉酸還元酵素（DHFR）、チミジンキナーゼおよびハイグ
ロマイシンまたはネオマイシンに対する耐性をコードし
ている遺伝子である。これらのマーカーは、ACSFの核酸
の取込みに対してコンピテントである細胞の同定を可能
にする。哺乳動物細胞形質転換体を、マーカーを取込ん
だために形質転換体だけが唯一生存に適応する選択圧下
に置く。選択圧は、培地中の選択物質の濃度を連続的に
変化させ、それによって選択遺伝子とACSFをコードして
いるDNAの両方の増幅が導かれる条件下で形質転換体を
培養することによって課される。増幅とは、増殖に必須
であるタンパク質を産生することが強く要求されている
遺伝子が組換え細胞の代々の世代の染色体内に直列で反
復される過程である。増加量のACSFが増幅されたDNAか
ら合成される。
例えば、DHFR選択遺伝子で形質転換された細胞は、始
めにヒポキサンチン、グリシン、およびチミジンを欠く
培養培地ですべての形質転換体を培養することによって
同定する。この場合の適切な宿主細胞は、アーラウブお
よびチャシン［Urlaub and Chasin,1980,Proc.Natl.Acs
d.Sci.USA 77:4216］の記載のように調製し、増殖させ
た、DHFR活性を欠くチャイニーズ・ハムスター卵巣（CH
O）セルラインである。特に有用なDHFRは、MTXに対して
耐性が高い突然変異DHFRである（EP 117,060A）。この
選択物質は、内生のDHFRの存在にもかかわらず、その他
のあらゆる適切な宿主、例えばATCC No.CCL61 CHO−K1
とともに用いることができる。次に、DHFRを不活性化す
る物質（メトトレキセートまたはMTX）に暴露すること
によって、DHFRとACSFコード化DNAを増幅する。連続回
の逐次増大するMTX濃度で増殖することができる細胞だ
けを選択することによって、細胞がさらにDNAを必要と
した結果、すべての外来性DNAが増幅されるのを確実な
ものにする。本発明の範囲内に含まれるのは、ネオマイ
シンによるneo遺伝子形質転換体の最初の選択、それに
続くDHFR増幅マーカー遺伝子の増幅である。
組換え脊椎動物細胞培養におけるハイブリッド受容体
の合成に適合させるのに適したその他の方法、ベクター
および宿主細胞は、ゲシングら［M.J.Gething et al.,N
ature 293:620−625（1981）］；マンテイら［N.Mante
i et al.,Nature 281:40−46］；およびレビンソンら
［A.Levinson et al.,EP 117,060A and 117,058A］が記
載している。ACSFの哺乳動物細胞培養発現に特に有用な
出発プラスミドはpE342.HBV E400.D22（EP 117,058A）
である。
クローニングベクターとは異なり、発現ベクターは、
宿主生物によって認識され、そしてACSFの核酸に機能的
に結合したプロモーターを含有しているべきである。プ
ロモーターは、その支配下にある核酸の転写および翻訳
をコントロールする、構造遺伝子の開始コドンの上流
（通常、約100〜1000bp以内）に位置している翻訳され
ない配列である。これらは普通２つの群、即ち誘導性お
よび構成性に分けられる。誘導性のプロモーターは、培
養条件のある変化、例えば栄養素の存在もしくは非存在
または温度の変化に応答してそれらの支配下でDNAから
増大レベルの転写を開始させるプロモーターである。天
然の塩基性ペプチド領域を含むACSFのあらゆる細菌性の
タンパク質加水分解は、誘導性プロモーターを用いてAC
SF遺伝子の転写をコントロールすることによって減少す
るであろう。現時点では、多種の可能性ある宿主細胞に
よって認識される多数のプロモーターが周知である。こ
れらのプロモーターは、制限酵素消化によってこれらを
これらの元の遺伝子から取り、次いでACSFの開始コドン
の５′に挿入することによって、ACSFをコードしている
DNAに機能的に結合させる。これは、ゲノムACSFプロモ
ーターが哺乳動物組換え細胞培養において使用すること
ができないと言うものではない。しかし、一般にヘテロ
ローガスなプロモーターは、一層高い転写および一層高
い発現ACSF収量を与えることになる。
核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に置かれ
たときに機能的に結合される。例えば、プレ配列または
分泌リーダーのDNAは、それがポリペプチドの分泌に関
係するプレタンパク質として発現されるならばポリペプ
チドのDNAに機能的に結合しており；プロモーターまた
はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼすな
らば暗号配列に機能的に結合しており；また、リボソー
ム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されて
いるならば暗号配列に機能的に結合している。通常、機
能的に結合するとは、結合されるDNA配列群が近接して
おり、分泌リーダーの場合には近接してリーディング相
内にあることを意味する。結合は都合のよい制限部位で
のライゲート（連結）によって行う。そのような部位が
存在しないときには、常法に従って合成オリゴヌレオチ
ド アダプターまたはリンカーを用いる。
原核性宿主で用いるのに適したプロモーターには、β
−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系［チャ
ンら（Chang et al.,1978,Nature 275:615）；および
ゲデルら（Goeddel et al.,1979,Nature 281:544］、
アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プロ
モーター系［ゲデル（Goeddel,1980,Nucleic Acids Re
s. 8:4057）およびEPO出願公開No.36,776］、およびta
cプロモーターなどのハイブリッドプロモーター［デボ
アーら（H.de Boar et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 80:21−25］が含まれる。しかし、その他の既知の
細菌性のプロモーターも適している。これらのヌクレオ
チド配列は公表されており、従ってこれを、あらゆる必
要な制限部位を供給するためのリンカーまたはアダプタ
ーを用いて、ACSFをコードしているDNAに機能的に連結
することができる［シーベンリストら（Siebenlist et
al.,1980,Cell 20:269］。また、細菌性の系で用いる
ためのプロモーターは、ACSFをコードしているDNAに機
能的に結合させたシャイン−ダルガルノ（S.D.）配列を
含有している。
酵母宿主で用いるのに適した促進配列には、３−ホス
ホグリセレート キナーゼ［ヒッツェマンら（Hitzeman
et al.,1980,J.Biol.Chem. 255:2073）］、またはそ
の他のグルコース分解酵素［ヘスら（Hess et al.,196
8,J.Adv.Enzyme Reg. 7:149）およびホランド（Hollan
d,1978,Biochemistry 17:4900）］、例えばエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート デヒドロ
ゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート、デカルボキシ
ラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホ
スフェート イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート
ムターゼ、ピルベート キナーゼ、トリオセホスフェー
ト イソメラーゼ、ホスホグルコース イソメラーゼ、
およびグルコキナーゼなどのプロモーターが含まれる。
増殖条件によってコントロールされる転写の別の利点
を有している誘導性プロモーターであるその他の酵母プ
ロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチ
トクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関与する
分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３
−ホスフェート デヒドロゲナーゼ、並びにマルトース
およびガラクトース利用に関与する酵素群のプロモータ
ー領域である。酵母発現において用いるのに適したベク
ターおよびプロモーターはヒッツェマンら［Hitzeman e
t al.;EP 73,657A］がさらに開示している。また、酵母
エンハンサーを酵母プロモーターとともに用いるのが有
利である。
哺乳動物宿主細胞中のベクターからのACSFの転写は、
ポリオーマ、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、
レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましく
はサルウイルス40（SV40）などのウイルスのゲノムか
ら、または例えばアクチンプロモーターなどのヘテロロ
ーガスな哺乳動物プロモーターから得られるプロモータ
ーによってコントロールされる。SV40ウイルスの初期お
よび後期プロモーターは、SV40のウイルス性複製起源を
も含有するSV40制限フラグメントとして好都合に得られ
る［フィアーズら（Fiers et al.,1978,Nature 273:11
3］。また、宿主細胞またはその関連種由来のプロモー
ターが本発明において有用であるのは勿論である。
高等真核生物によるACSFをコードしているDNAの転写
は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによ
って増大する。エンハンサーは、通常約10〜300bpのヌ
クレオチド配列であり、プロモーターに作用してその転
写を増強するが、その配向および位置には比較的無関係
に作用する。現在では多数のエンハンサー配列が哺乳動
物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−
フェトプロテインおよびインスリン）から既知となって
いる。しかし、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを
用いるのが普通である。その例には、SV40の複製起源の
後期側のエンハンサー（bp100〜270）、サイトメガロウ
イルスの初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマの
複製起源の後期側のエンハンサー、およびアデノウイル
スのエンハンサーが含まれる。エンハンサーはベクター
のACSFをコードしている配列の５′または３′の位置に
継ぎ合わせてよいが、プロモーターの５′の位置に設置
するのが好ましい。
また、真核宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動
物、ヒト、またはその他の多細胞生物由来の有核細胞）
で用いる発現ベクターは、転写の終止およびmRNAの安定
化に必要な配列をも含んでいるであろう。通常、このよ
うな配列は真核性またはウイルス性のDNAまたはcDNAの
５′および時には３′非翻訳化領域から得ることができ
る。これらの領域は、ACSFをコードしているmRNAの非翻
訳化部分においてポリアデニル化されたセグメントとし
て転写される領域を含んでいる。また、３′非翻訳化領
域は転写終止部位をも含んでいる。
本発明のベクターのクローニングまたは発現に適した
宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核細胞であ
る。原核生物にはグラム陰性またはグラム陽性生物、例
えば大腸菌またはバシラスが含まれる。好ましいクロー
ニング宿主は大腸菌294（ATCC 31,446）であるが、その
他のグラム陰性またはグラム陽性原核生物、例えば大腸
菌Ｂ、大腸菌X1776（ATCC 31,537）、大腸菌W3110）ATC
C 27,325）、シュードモナス種、またはセラッチア・マ
ルセサンス（Serratia Marcesans）も適している。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核性微
生物もACSFをコードしているベクターに適した宿主であ
る。サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces ce
revisiae）または普通のパン酵母が、低級真核宿主微生
物の中で最も普通に用いられる。しかし、その他多数の
属、種、および株が普通に用いられ、本発明にとって有
用である。
ACSFの発現用に好ましい宿主細胞は多細胞生物由来の
細胞である。原則的には、多細胞生物由来のあらゆる真
核細胞が脊椎動物あるいは非脊椎動物培養物由来を問わ
ず使用可能であるが、哺乳動物由来の細胞が好ましい。
これら細胞の培養物中での増殖は自体周知である［Tiss
ue Culture,Academic Press,Kruse and Patterson,edit
ors（1973）を参照］。有用な哺乳動物宿主セルライン
の例は、VEROおよびHeLa細胞、チャイニーズハムスター
卵巣セルライン、WI38、BHK、COS−７、MDCKセルライ
ン、およびヒト胚腎セルライン293である。
宿主細胞を上記の発現またはクローニングベクターで
形質転換し、プロモーターの誘導または増幅遺伝子を含
む形質転換体の選択に適するように修飾された通常の栄
養培地で培養する。温度、pHなどの培養条件は、クロー
ニングまたは発現のために選択した宿主細胞でこれまで
用いられている条件が適当であり（それぞれの場合に応
じて）、当業者には明らかであろう。
ACSFは分泌タンパク質として培養培地から回収するの
が好ましいが、分泌シグナルなしで直接発現されるとき
には宿主細胞溶菌液から回収することもできる。第１段
階として、培養培地または溶菌液を遠心して個々の細胞
残骸を除去する。完全長さのACSFを、例えば塩基性緩衝
液を用いるカチオン交換樹脂溶離法による吸着、抗−AC
SF免疫アフィニティーカラムへの吸着とpH5〜６の緩衝
液によるそれからの溶離によって、不純な可溶性タンパ
ク質から精製する。別の方法としては、不純物を除去す
るためのレクチンアフィニティーカラムおよびアニオン
交換カラムでのクロマトグラフィーなどの他の方法が、
ACSF含有の培地または細胞抽出物の最初の精製に用いら
れる。塩基性のペプチド領域が削除されているACSF変異
体は免疫アフィニティーまたは疎水性アフィニティーク
ロマトグラフィーによって回収するのが最もよい。
天然のACSFはある条件のもとで集合する傾向を有して
いるので、少量のノニオン系界面活性剤［例えば、ツイ
ーン（Tween）またはポリエチレングリコール］を分離
中に加えることによってマルチマーの集合状態を安定化
させるのが有用であろう。また、PMSFなどのプロテアー
ゼ阻害物質は精製中のタンパク質加水分解を阻害するの
に有用であり、抗生物質を含有させて外来不純物の増殖
を防止してもよい。
天然のACSFに適した精製方法が、組換え細胞培養物中
で発現れたときのACSFまたはその変異体の性質を変化さ
せるもととなる修飾を必要とすることもあることは当業
者の認めるところであろう。適切な精製法は特定の組換
えACSFの性質に依存しており、当業者には明らかであろ
う。
ACSFはナトリウム、カリウム、リン酸、塩酸などのイ
オンとの非毒性塩として調製される。通常、ACSFはリン
酸緩衝食塩水中で保存されるか、または糖アルコール類
（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、モノサ
ッカリド類（例えば、グルコース、マンノース、ガラク
トースまたはフルクトース）、オリゴサッカリド類（例
えば、マルトース、ラクトースまたはスクロース）、お
よびタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）を含む
賦形剤の存在下に凍結乾燥してもよい。
また、上記の賦形剤は水溶液保存したときの不活性化
または沈澱に対するACSFの安定性に寄与することもあ
り、通常の他の安定剤とともに用いられることもある。
そのような安定剤には、キレート化試薬（例えば、EDT
A）、酸性アミノ酸、およびノニオン系界面活性剤（例
えば、ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリ
コールとポリプロピレングリコールのブロックコポリマ
ー）が含まれる。
ACSFアンタゴニスト、ACSFの中和抗体、または中和抗
体を生成しうる免疫原は、HHMを改善するためにヒトま
たは動物に投与され、また、ケラチノサイトの過増殖を
特徴とする疾患（例えば、乾癬）の治療にその用途を有
していることもある。治療用ACSF組成物は、薬理学的に
許容しうる担体中に治療学的有効量をACSF抗体、アンタ
ゴニストまたは免疫原を含んでいる。選択される用量、
担体および投与経路は、各種因子の中で、特にアンタゴ
ニストまたは免疫原の選択、患者の状態、標的の疾患、
望ましい投与経路、および選択したACSF変異体の活性に
依存するであろう。これは、治療過程の中で医師によっ
て容易に決定およびモニターされる。
ACSFの注入または注射のための担体は、滅菌等張水溶
液、例えば注射用食塩水または５％デキストロースであ
る。これらの調製物は、鼻内、皮下、静脈内、腹腔内、
またはその他の通常の投与経路で注射または注入され
る。
また、ACSFは持続放出担体中に加えられる。適当な例
には、一定の形状を有する半透過性の高分子マトリック
ス（例えば、座剤またはマイクロカプセル）が含まれ
る。移植可能な持続放出マトリックスには、Ｌ−グルタ
ミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー［シ
ドマンら（U.Sidman et al.,1983,Biopolymers 22
（１）:547−556）］、ポリ（２−ヒドロキシエチルメ
タクリレート）［ランガーら（R.Langer et al.,1981,
J.Biomed.Mater.Res. 15:167−277）およびランガー
（R.Langer,1982,Chem.Tech. 12:98−105）］、エチレ
ンビニルアセテート［ランガーら（R.Langer et al.;同
上）］、またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸
［EP 133,988A］が含まれる。また、持続放出ACSF組成
物にはリポソームによって捕捉されたACSFが含まれる。
ACSFを含有するリポソームは自体既知の方法によって調
製される［DE 3,218,121A;エプスタインら（Epstein et
al.,1985,Proc.Natl.Acsd.Sci.USA 82:3688−369
2）；ワンら（Hwang et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 77:4030−4034）;EP 52322A;EP 36676A;EP 88046
A;EP 143949A;EP 142641A;日本特許出願83−118008;米
国特許4,485,045および4,544,545;およびEP 102,324
A］。通常、リポソームは小さい（約200〜800Å）単一
膜型のものであり、脂質含量は約30モル％コレステロー
ル以上であり、この選択した割合はACSF漏出の最適速度
に調節されている。
ACSFに対して生成させたポリクローナルのウサギまた
はネズミ抗血清は、免疫アフィニティー精製またはACSF
のELISA検定におけるACSFに用いられ、そして放射テク
ネチウムまたはその他同等の媒体でラベルされたときに
はACSF分泌腫瘍のイメージングに用いられる。また、そ
のような抗体は腫瘍細胞標的化の細胞毒でラベルされ
る。ACSFの唯一のＣ−末端に特異的な抗体は次のように
調製される：即ち、動物を免疫原性ACSFコンジュゲート
（例えば、本明細書の他の箇所に記載したような組換え
細胞培養物で調製された免疫原融合物）に対して免疫
し、次いで、他のACSFエピトープに指向性の抗体を吸着
させるために抗血清を固定化ACSF（１−84）のカラムに
通し、残存する抗体を125I−ACSFとともにインキュベー
トしてＣ−末端エピトープを未吸着抗体中の抗−ACSF抗
体に結合させ、そして125I−ACSFの結合量を測定するこ
とにより（例えば、プロテインＡセファロースへの吸着
によって）、抗−Ｃ末端ペプチド力価の存在をスクリー
ニングすることによって調製される。別法では、動物を
Ｃ−末端ペプチドに対して免疫し、抗血清を回収する。
いずれの場合にも、モノクローナル抗体がＣ−末端ペプ
チドに対する力価を示す動物のＢ細胞から産生される。
Ｃ−末端特異的な抗体が利用できると、サイドイッチ型
免疫検定または競合型免疫検定（PTHが干渉しない）の
作成が可能になる。サンドイッチ型検定は、ACSFの残基
１−84の間に位置するエピトープにだけ結合しうる第１
の抗体およびACSFの残基85−141の間に位置するエピト
ープにだけ結合しうる第２の抗体を得、第１または第２
の抗体のいずれか１つを固定化し、固定化抗体と被験試
料を接触させてACSFをそれに吸着させ、結合したACSFを
洗浄し、結合したACSFを第１または第２の抗体の残りの
１つ（残りの抗体は検出可能な基でラベルされている）
と接触させて結合ACSFをラベルし、そして結合または遊
離のラベルの量を測定することからなる方法である。
実施例を簡単にするため、頻繁に出てくる方法の一部
は簡略して表現されている。
「プラスミド」は、小文字ｐ、それに先立つおよび／
またはそれに続く大文字、および／または数字で表す。
本発明の出発プラスミドは、市販品から入手可能である
か、制限のない状態でだれでも入手可能であるか、また
はそのような入手可能なプラスミドから公知の方法に従
って構築することができる。さらに、その他の等価なプ
ラスミドが当分野で知られているが、これらは当業者に
は明らかであろう。
DNAの「消化」とは、DNA中のある位置にだけ作用する
酵素によるDNAの触媒的切断を意味する。そのような酵
素は制限酵素と呼ばれ、そのそれぞれが特異的である部
位は制限部位と呼ばれている。本発明で用いられる多種
の制限酵素は市販品から入手可能であり、酵素供給元に
よって確立された反応条件、補助因子、およびその他の
必要条件を用いた。通常、制限酵素は、それぞれの制限
酵素が最初に得られた微生物を示す大文字とそれに続く
他の文字、およびそれに続く特定の酵素を示す数字から
なる短縮形で表される。通常、約１μγのプラスミドま
たはDNAフラグメントを約20μｌの緩衝液中、約２単位
の酵素とともに用いる。特定の制限酵素のための適切な
緩衝液および基質量は製造元によって指定されている。
通常は37℃で約１時間のインキュベート時間を用いた
が、供給元の指図に従って変えることもある。インキュ
ベートの後、タンパク質をフェノールおよびクロロホル
ムによる抽出によって除去し、消化した核酸をエタノー
ルによる沈澱によって水性分画から回収する。頻繁なこ
とではないが、制限酵素による消化に続いて末端５′ホ
スフェートの細菌性アルカリホスファターゼ加水分解を
行って、DNAフラグメントの２つの制限切断末端が「環
状化」または閉じた環を形成すること（別のDNAフラグ
メントの制限部位への挿入を妨げる）を防止する。特に
記載がなければ、プラスミドの消化に続いて５′末端の
脱ホスホリル化を行うことはない。脱ホスホリル化の方
法および試薬は通常のものである［マニアティスら（T.
Maniatis et al.,1982,Molecular Cloning,pp.133−13
4）］。
制限消化物からのあるDNAフラグメントの「回収」ま
たは「単離」とは、電気泳動によるポリアクリルアミド
またはアガロースゲルでの消化物の分離、その移動度と
既知分子量のマーカーDNAフラグメントの移動度の比較
による目的フラグメントの同定、目的のフラグメントを
含有しているゲル切片の取り出し、およびゲルからのDN
Aの分離を意味する。この方法は広く知られている。例
えば、ロウンら［R.Lawn et al.,1981,Nucleic Acids R
es. 9:6103−6114］およびゲデルら［D.Goeddel et a
l.,1980,Nucleic Acids Res. 8:4057］を参照。
「形質転換」または「トランスフェクション」とは、
DNAが染色体外要素または染色体組込み体として複製可
能なようにDNAを生物中に導入することを意味する。特
に記さなければ、本発明で大腸菌の形質転換に用いる方
法はマンデルら［Mandel et al.,1970,J.Mol.Biol. 5
3:154］のCaCl2法である。
「ライゲート（連結）」とは、２つの２本鎖核酸フラ
グメントの間でホスホジエステル結合を形成させる過程
を指す［マニアティスら、同上、146頁］。特に記さな
ければライゲートは、ライゲートしようとする0.5μｇ
のほぼ等しい量のDNAフラグメントに対して10単位のT4
DNAリガーゼ（「リガーゼ」）を用い、既知の緩衝液お
よび条件を用いて行われる。
実施例１ Ｎ−末端のタンパク質配列データに基づいて合成した
オリゴヌクレオチドを用いてプローブしたBEN細胞mRNA
のcDNAライブラリーからACSFのクローンを単離した。メ
ッセンジャーRNAは、BEN細胞からLiCl沈澱およびオリゴ
−dTセルロースクロマトグラフィーによって精製した。
このRNAから、オリゴ−dTでプライムされたcDNAクロー
ンのライブラリーをλgt10ベクター中に生成させた。２
μｇのポリＡ＋RNAから、300ngの２本鎖cDNAを合成し
た。約1ngのこのcDNAから1,000,000以上のクローンを得
た。このクローンの一部を、２種類の72−merオリゴヌ
クレオチドプローブbrf.1およびbrf.2（第１図）の混合
物を用いてスクリーニングした。これらプローブのコド
ンの選択は、哺乳動物コドンの頻度表（brf.1）またはP
THの相同なアミノ酸において用いられるコドン（brf.
2）のどちらかに基づいた。オリゴヌクレオチドは32Pで
末端標識化し、20％ホルムアミド、5xSSC中、42℃でcDN
Aクローンのライブラリーとハイブリダイズさせ、そし
て1xSSC中、42℃で洗浄した。スクリーニングした250,0
00のクローンから６つのポジティブなクローンを同定し
た。これら３つのクローンについて決定したDNA配列を
第２図に示す。
brf.2プローブとハイブリダイズするポジティブなク
ローンを調べている間に、部分クローンλ57は、ACSFの
Ｎ−末端に対する相同性が著しいポリペプチドをコード
しているが、相同領域のACSF C−末端は似ていないこと
を発見した。さらに、λ57ポリペプチドの相同領域から
Ｃ−末端までの距離は、PTHに比べ１残基短いだけであ
る。ACSFとの一層の相同性を示す完全クローンの配列の
決定は、ACSF、PTHおよびこの別のポリペプチドがすべ
てPTH−受容体活性ホルモン群の一員であることを示唆
するものであろう。
ACSFのDNA配列は、換算された分子量が16kDの141アミ
ノ酸の成熟タンパク質を予想させる。これは、SDSゲル
電気泳動により精製BEN細胞タンパク質について測定さ
れた18−19kDの分子量とほぼ同じである。この予想配列
は過剰の塩基性残基（29K＋RVS20D＋Ｅ）を含んでお
り、これはACSFの塩基性pIを説明するものである。この
配列は、成熟タンパク質中にシステインが存在しないこ
と、および可能性あるＮ−結合グリコシル化部位（NXS/
T）が存在しないことを予想させる。ACSF配列はPTHとの
ある限定された相同性を示すが、その大部分はＮ−末端
の15アミノ酸に限られる（第３図）。
アミノ酸88から108に至るACSF配列は、多数の塩基性
残基を含んでおり、１個の前駆体から２個のペプチドを
放出するタンパク質切断の領域であろう。この場合、ペ
プチド１〜87は、RTH1〜34が活性であるのと同じように
アデニル酸シクラーゼ刺激活性を有しているものと予想
される。残基109〜141を含む第２の機能は新規に同定さ
れたホルモンであろう。
予想の成熟タンパク質にはメチオニンで始まる36アミ
ノ酸配列が先行する。この配列はPTHのプレプロ配列と
は少しの相同性しか有していないが、類似したプレプロ
構造を有している。予想の成熟ACSF配列には、PTHの６
アミノ酸プロ配列と同様、多数の塩基性残基を有する５
アミノ酸のプロ配列が先行する。この推定のプロ配列に
は、細胞からの分泌のためのシグナル配列に予想される
ような荷電した残基と境界を接している疎水性アミノ酸
の核（コア）を有する31アミノ酸配列が先行する。提案
した開始ATGの周囲のDNA配列は、タンパク質翻訳の開始
に対して見い出されるコンセンサス配列に適合する。
実施例２ クローンしたACSFを、哺乳動物細胞から活性なタンパ
ク質を分泌させるための哺乳動物発現ベクター中に継ぎ
合わせる。第４図はこの発現ベクターpCIS2.BRF1.1を構
築するために行った工程を示すものである。このベクタ
ーは、サイトロメガロウイルスプロモーター、免疫グロ
ブリンスプライス部位、およびSV40初期ポリアデニル化
シグナルならびにDHFR転写単位（哺乳動物細胞中での安
定な発現および増幅のための）を含んでいる。この構築
は、一次cDNAクローンλBRF.52由来の1341bpの挿入体を
pUC119中にサブクローンしてpBRF.52を得ることによっ
て行った。このサブクローンのDNA配列を決定し、完全
長さのACSFを同定した後、暗号領域の大部分を932bpのH
gaI−DraIフラグメントで単離した。これとは別に、哺
乳動物発現ベクターpCIS2.8c24DをCalIおよびHpaIで切
断し、5340bpのフラグメントを単離した。これら２種類
のフラグメントおよび第４図に示した２本鎖オリゴヌク
レオチドを一緒にライゲートして（オリゴヌクレオチド
の５′末端にリン酸を付加した後）、pCIS2.BRF1.1（第
５図）を得た。オリゴヌクレオチド挿入体のDNA配列を
配列決定によって確認した。
ACSF発現プラスミドpCIS2.BRF1.1を、ACSFの発現のた
めリン酸カルシウム法によって哺乳動物細胞中にトラン
スフェクションした。COS−７サル腎細胞または293ヒト
腎細胞は一時的な発現に適しており、293ヒト腎細胞ま
たはCHO（DHFR-）チャイニーズハムスター卵巣細胞は、
NEO同時形質転換およびG418選択（293細胞）を用いる、
また栄養選択（CHO細胞）による安定な発現に適してい
る。ACSFはこれらの細胞から分泌され、プロ配列が除去
されて活性なACSFが得られる。発現されたACSFの活性
を、骨芽細胞様セルラインUMR−106におけるcAMPレベル
の刺激に対する培養物上清の検定によって測定する。発
現された物質は、BEN細胞から分泌された天然分泌につ
いて用いられる方法に類似するHPLC法によって精製す
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/74 33/74 Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＹＮ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＤ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 39/395 ＡＢＹ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＤ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 サバ，ラリー・ジョン オーストラリア国ビクトリア、イース ト・キュー、キャンベル・ストリート16 番 (72)発明者 ウッド，ウィリアム・アイ アメリカ合衆国カリフォルニア94402、 サン・マテオ、タリータウン1400番 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ 78（1981） Ｐ．7365− 7369 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下のタンパク質（Ａ）または（Ｂ）をコ
    ードする核酸。 （Ａ）そのアミノ酸配列が、以下の図 のアミノ酸残基１〜141であるタンパク質。 （Ｂ）（Ａ）で定義されたアミノ酸配列中のアミノ酸の
    置換、削除または挿入により（Ａ）のタンパク質より誘
    導され、アデニル酸シクラーゼ刺激因子（ACSF）活性を
    有するタンパク質（ACSF変異体と言う）。
  2. 【請求項２】ACSFをコードしている請求項１記載の核
    酸。
  3. 【請求項３】約80〜530塩基である請求項１記載の核
    酸。
  4. 【請求項４】DNAであり、かつ染色体中のACSFの暗号領
    域と通常は境界を接している他のタンパク質をコードし
    ているゲノム配列を含まない請求項１記載の核酸。
  5. 【請求項５】請求項１に記載の核酸を含有している複製
    可能なベクター。
  6. 【請求項６】核酸が誘導性プロモーターの支配下にある
    請求項５記載のベクター。
  7. 【請求項７】請求項１に記載の核酸を含有しているベク
    ターを含んでいる細胞培養物。
  8. 【請求項８】細胞が原核生物、酵母、または多細胞生物
    から得られるものである請求項７記載の細胞培養物。
  9. 【請求項９】多細胞生物由来の細胞が哺乳動物のもので
    ある請求項８記載の細胞培養物。
  10. 【請求項１０】請求項１に記載の核酸を得、該核酸をプ
    ロモーターの転写支配下に複製可能なベクター中に挿入
    し、該ベクターをプロモーターの支配下に核酸を転写す
    ることができる宿主細胞中にトランスフェクションし、
    該細胞を培養して細胞培養物中にACSFまたはその変異体
    を蓄積させ、そして細胞培養物からACSFを回収すること
    からなるACSFまたはその変異体の製造方法。
  11. 【請求項１１】ACSFまたはその変異体を培養培地から、
    または宿主細胞のペリプラズムから回収する請求項10記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】ACSFまたはその変異体をカチオン交換樹
    脂による吸着によって回収する請求項10記載の方法。
  13. 【請求項１３】（１）請求項１に記載の図Ａに示すアミ
    ノ酸配列のアミノ酸残基106〜109から141よりなるACSF
    のＣ−末端ペプチド、請求項１に記載の図Ａに示すアミ
    ノ酸配列のアミノ酸残基81〜88から106〜109よりなるAC
    SFの塩基性ペプチド、またはACSFのＣ−末端および塩基
    性ペプチドの両方を含むACSF領域、および （２）生理学的に受容し得る賦形剤、担体および／また
    は希釈剤 を含有し、無傷のACSFを含有しない組成物。
  14. 【請求項１４】免疫原性ポリペプチドにコンジュゲート
    した、請求項１に記載の図Ａに示すアミノ酸配列のアミ
    ノ酸残基106〜109から141よりなるACSFのＣ−末端ペプ
    チド。
  15. 【請求項１５】免疫原性ポリペプチドがＣ−末端ペプチ
    ドのアミノまたはカルボキシ末端に結合している請求項
    14記載のＣ−末端ペプチド。
  16. 【請求項１６】（１）請求項１に記載の図Ａに示すアミ
    ノ酸配列のアミノ酸残基81〜88から106〜109よりなるAC
    SFの塩基性ペプチド、および請求項１に記載の図Ａに示
    すアミノ酸配列のアミノ酸残基106〜109から141よりな
    るACSFのＣ−末端ペプチドからなる群から選ばれるACSF
    領域に結合しうる抗体、および （２）生理学的に受容し得る賦形剤、担体および／また
    は希釈剤 を含有する組成物。
  17. 【請求項１７】PTHと交差反応しうる抗体を含まない請
    求項16記載の組成物。
  18. 【請求項１８】ACSFの残基１〜84の間に位置するエピト
    ープに結合しうる抗体を含まない請求項16記載の組成
    物。
  19. 【請求項１９】抗体が検出可能な基でラベルされている
    か、または水不溶性の支持体に固定されている請求項16
    記載の組成物。
  20. 【請求項２０】ACSFの、請求項１に記載の図Ａに示すア
    ミノ酸配列のアミノ酸残基１〜84の間に位置するエピト
    ープにだけ結合しうる第１の抗体、およびACSFの、請求
    項１に記載の図Ａに示すアミノ酸配列のアミノ酸残基85
    〜141の間に位置するエピトープにだけ結合しうる第２
    の抗体を得、第１または第２の抗体のいずれか一方を固
    定し、固定された抗体と被験試料を接触させてACSFをそ
    れに吸着させ、結合したACSFを洗浄し、結合したACSFを
    検出可能な基でラベルされた第１または第２の抗体の残
    る一方と接触させて結合ACSFをラベルし、その後に結合
    または遊離のラベルの量を測定することからなる被験試
    料中のACSFの測定方法。
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