JPH02504467A - リン脂質アンカードメインとの新規融合ポリペプチドの合成のための核酸および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リン脂質アンカードメインとの新規融合ポリペプチドの合成のための核酸および 方法 本出願は、組換え細胞培養物中での崩壊促進因子（以下、ＤＡＦと短縮して記す ）の生産に関する。特に、医薬または診断の用途に適したＤＡＦの大スケールで の製造に関する。

体液性免疫応答の標的となる抗原細胞は補体活性化と呼ばれる過程によって溶解 される。この過程は、抗体とその抗原の結合によって開始される一連のまたはカ スケードとしてのタンパク質加水分解活性で構成される。補体の活性化に関与す る成分は多数かつ複雑であるが、本発明の目的にとって最も重要なものはＣ４ｂ およびＣ３ｂである。補体活性化における鍵となる過程において、これら２つの タンパク質は標的細胞の表面に共有結合し、次いでこのカスケードの増幅酵素で あるＣ３およびＣ５コンバーターゼ（転換酵素）の集合のためのアンカーとして 働く。

補体の活性化は標的にだけ焦点が当てられるものでなければならず、宿主細胞上 で起こってはならない。しかし、補体活性化の過程において、多数の形成期ｃ４ ｂおよびＣ３ｂフラグメントが液相中に放出される。大部分は水と反応するが、 一部は偶然によってすぐ近くの宿主細胞に結合することがあり、その損傷を導（ 。この理由および可能性あるその他の理由により、結合ならびに遊離のＣ３ｂお よびＣ４ｂフラグメントの活性は、血清および膜タンパク質の複雑な系による厳 格な制御下にある。

４ｂおよびＣ３ｂの活性の調節は液相フラグメントの制御とは異なっていること が示唆される。前者の機能は主として２種類の膜タンパク質、即ちＣ３ｂ／Ｃ４ ｂ受容体（ＣＲＩ）およびＤＡＦによって制御される。ＣＲＩはＣ３およびＣ５ コンバーターゼコンプレツクス中のＣ４ｂおよびＣ３ｂからＣ２および因子Ｂを 解離させ、血清酵素Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂインアクチベータ−（１）によるＣ３ｂの切 断（ＭＰｒｏｃ、　？１ａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　７６　： 　５８６７　；　Ｍｅｄｉｃｕｓ、　ｅｔ　ａｌ、　＋　１９８Ｌ@Ｅｕｒ、　 Ｊ。

１ｉ＋１ｕｎｏ１．　邂：　４６５　：およびＲｏｓｓ、ｅｔ　ａｌ、、　１１ Ｂ２．　Ｊ、Ｉａ＋ｍｕｎｏ１．１２９：　２０５１）およびＣ４ｂの切断（Ｍ ｅｄｏｆ、ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｊ、ＥｘＰ、Ｍｅｄ、　１５９：　１ ６６９；　ｌ１ｄａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８１．　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１ ５３：　１１３８）を促進する。また、ＤＡＦもＣ３コンバーターゼからのＣ２ および因子Ｂの崩壊解離を増強することが示された（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ−Ｗｅ ｌｌｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、　１９８２．　Ｊ。

Ｉｍ＋ｎｕｎｏ１．１２９　：　２０５およびＰａｎｇｂｕｒｎ、Ｍ、に、ｅｔ 　ａｌ、、　１９８３．　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ。

１５７　：　１９７１）。この２種類の勝因子の調節活性における見かけ上の重 複の理由、およびこれらのコンバーターゼ制御におけるそれぞれの役割はわかっ ていない。ＣＲＩの異常は、欠損性の免疫複合体の処理に関連した症状である全 身性のエリテマトーデス（ＳＬＥ）において見い出され（Ｍｉｙａｋａｗａ、Ｙ 、ｅｔ　ａｌ、＋　１９８１．　Ｌａｎｃｅｔ　３　：　４９３　；　ｌ１ｄａ 。

Ｋ、ｅｔ　ａｌ、、　１９８Ｌ　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１５５：　１４２７； Ｗｉｌｓｏｎ、Ｊ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、　１９８２、　Ｎ、Ｅｎｇｌｊ、１４ｅ ｄ、　３０７　：　９８１　；　Ｔａｙｌｏｒ、Ｒ，Ｐ、ｅｔ　ａｔ、、　１９ ８３．　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｔ　２６：　７３６）、ＤＡＦの異常は 、血球の溶解に対する高められた感受性に関連した症状である発作性夜間血色素 尿症（ＰＮＨ）において見い出された（ＰａｎｇｂｕｒｎＪ、に、ｅｔ　ａｌ、 ＋　１９８３．　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１５７ＤＡＦは、ヒト赤血球支質（ス トロマ）のプール抽出物から銀染色の５ＤＳ−ＰＡＧＥによって単一の７０Ｋｄ バンドまで精製されたと報告されている（Ｍｅｄｏｆ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８ ４．　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１６０：　１５５ｇ）。

この分子は疎水性であり、分子ふるいクロマトグラフィーによって測定すると、 ＞１５０Ｋｄのマルチマーを形成する傾向にある。精製したＤＡＦは赤血球と再 結合することもある。少ない数のＤＡＦ分子（＜１００）だけが、活性化された 補体の溶血作用に有意の効果を有していた。Ｍｅｄｏｆらは、ＤＡＦは本質的に 細胞膜内でのみ機能することができると結論し、それがＰＮＨの患者由来の細胞 膜における欠損をインビトロで除く可能性を与えるものであることを示唆した。

ＤＡＦを得るための既存の方法は工業生産に対しては満足できるものではない。

赤血球は極めて少量のＤＡＦＬか含んでいない。さらに、血液は、ウィルスやそ の他の生物学的に活性な成分を含んでおり、これらは投与を受けた者あるいは使 用者に望ましくない反応の危険を与える。

赤血球ＤＡＦは固有の膜結合した形態に限定され、存在するであろうあらゆる天 然アレルを含む。ＤＡＦアゴニストもしくはアンタゴニストとして機能すること ができるか、または他の望ましい特徴（例えば、Ｃ−末端脂質が存在しないこと 、プロテアーゼに対する耐性、もしくは標的細胞の膜にＤＡＦを放出する能力な ど）を示すアミノ酸およびグリコジル化変異体を合成するための方法が必要とさ れている。

従って、本発明の目的は、治療学的に許容しうる供給源から工業的な量でＤＡＦ を製造することにある。

さらに、他のヒトタンパク質に全く汚染されない供給源からヒトＤＡＦを得るこ とも目的の１つである。

また、別の目的はＤＡＦのアミノ酸配列およびグリコジル化変異体を作成するこ とである。

本発明のその他の目的は本明細書全体から明らかとなるであろう。

！−−カ 本発明の目的は、組換え細胞培養においてＤＡＦを発現させることによって、即 ち基本的には、ＤＡＦをコードしている核酸を得、このＤＡＦをコードしている 核酸で宿主細胞を形質転換し、そしてこの細胞を培養して宿主細胞培養物中にＤ ＡＦを発現させることからなる方法によって達成される。

本発明の方法は、アミノ酸配列変異体およびグリフシル化変異体を含む新しい形 態のＤＡＦの製造を可能にする。アミノ酸配列変異体は、１またはそれ以上のＤ ＡＦアミノ酸残基の削除、置換および挿入からなる。また、ＤＡＦは、異種の組 換え細胞培養でのＤＡＦの発現産物として得られ、天然ＤＡＦに随伴するグリコ ジル化を伴わない形態で発現される（グリコジル化を全く伴っていないものを含 む）。組換え細胞培養物の成分としてあらゆる形態にあるＤＡＦが新規である。

ＤＡＦ　ｍＲＮＡの細胞プロセッシングを研究している際に、膜結合型のＤＡＦ （＋ＤＡＦ）がインビボで発現される唯一の形態ではないことを予想外に見い出 した。事実、５ＤＡＦと呼ぶ別の形態のｐＡＦが存在する。この形態は、最後の ３′イントロンがスプライスされていないｍＲＮＡ種によってコードされており 、ｍＤＡＦとは全（異なるアミノ酸配列Ｃ−末端〜残基３２７が得られることに なる。

この新規な５ＤＡＦのＣ−末端はインビボでのタンパク質の血流中（ここで生物 学的に活性であることもある）への分泌を導くものと仮定されているが、これは 、イントロンの存在が最後のエクソンのリープインク・フレーム（読み枠）を変 え、ホスファチジルイノシトール（＋ａＤＡＦの膜アンカー）の結合を指令する 「シグナル」を削除するためである。この新規形態のＤＡＦは、本発明の先駆的 な研究が行われるまでは正しく理解されていなかったものであり、抗原的に別個 のＣ−末端を含有している点においてｍＤＡＦとは異なっている。

ある個体における症状が、ＤＡＦ遺伝子のいずれかを発現することができないこ と、あるいはホスファチジルイノシトールアンカーを結合させるための翻訳後プ ロセッシングができないことに由来するのか否かを決定するのは現在可能である ことから、５ＤＡＦはＰＮＨの診断に有用である。

また新規な核酸も提供されるが、これには次のものが含まれる：（１）ゲノムＤ ＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含む、ＤＡＦをコードしていると同定された細胞 遊離型の核酸；（２）非翻訳化介在配列（イントロン）または周辺のゲノムＤＮ Ａを含まない、ＤＡＦをコードしているＤ　Ｎ　Ａ　；および（３）ＤＡＦをコ ードしている核酸の供給源にホモローガスな他のあらゆるタンパク質をコードし ている核酸を含まない、ＤＡＦをコードしている核酸。また、本発明の範囲内に 含まれるのは、ＤＡＦをコードしてはいないがＤＡＦをコードしている核酸とハ イブリダイズすることができる核酸である。

ＤＡＦをコードしている核酸は、組換え細胞培養におけるＤＡＦの発現において 、またはＤＡＦをコードしている核酸の存在について被験試料を検定するのに有 用である。ラベルしたＤＡＦをコードしている核酸またはハイブリダイズする核 酸がそのような検定で用いるために供される。

組換えのＤＡＦは治療学的に許容しうる担体中に配合され、ＰＮＨまたは炎症性 もしくは細胞溶解性自己免疫疾患の治療のために投与される。標的細胞の表面で の補体活性化を阻害するために標的細胞にＤＡＦを放出するＤＡＦフンシュゲー トまたは融合体を調製する。このコンジユゲートまたは融合体は異型移植拒絶ま たは自己免疫疾患を改善するために有用である。

ｍＤＡＦのグリコホスホ脂質膜アンカードメイン、またはグリフホスホ脂質によ って同じようにアンカーされる他のタンパク質由来の機能的に等価なドメインを 、膜アンカードメインの供給源とは異種のタンパク質またはそのようなタンパク 質のマルチマー、例えばホルモン、抗原（特に、感染性生物由来の抗原）、アレ ルゲン、免疫グロブリン、酵素、受容体などに融合させる。このアンカー融合体 を、それを発現する組換え細胞と組合せて用いるか、または回収して治療学的組 成物に製剤化するか、診断検定の成分として用いるか、またはアフィニティー精 製法において用いる。この融合体は異種ポリペプチドのＣ−末端のところでアン カードメインに融合シタ異種のポリペプチドを含有しており、それは後にそのＣ −末端カルボキシルのところでグリコホスホ脂質によって共有結合置換される。

図面の簡単な説明 第１　ａ〜ｌ　ｆ図は、クローンλ３３（残基１のＨｉｎｄｌｌｌｗ＞位まで） 、およびλ４７　（Ｈ１ｎｄｌｌｌから３゛末端まで）のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列を 示すものである。イントロンが除去された箇所は星印で示す。可能性の高いホス ファチジルイノシトール誘導体化の部位はＣｙｓ、、。であり、Ｃ−末端疎水性 領域は残基３３１−３４７から延びている。アミノ酸残基はＡｓｐ’の成熟アミ ノ末端から数を付した。

第２ａ〜２ｇ図は、ヒト５ＤＡＦをフードしているクローンλ３３（残基＋１の Ｈｉｎｄｌ１１部位まで）、およびλ４１　（）（ｉｎｄｌｌｌから３゛末端ま で）のｃＤＮＡ配列を示すものである。５ＤＡＦをコードしているｃＤＮＡ中の スプライスされていないイントロンは囲んで示した。

制限酵素部位は通常の短縮形を用いて示した。ＤＡＦと予想される種のそれぞれ について予想アミノ酸配列を、それぞれの分泌リーダーおよび成熟Ｎ−末端（矢 印で示す）とともに示す。

第３図は、実施例３で調製したｇＤ−１／ＤＡＦ融合タンパク賞中に存在するＨ ＳＶＩ糖タンパク質Ｄ（ｇＤ−１）およびＤＡＦの領域を示す模式図である。断 端を切り取った（分泌型）ｇＤ−１を、天然（膜）ｇＤ−１０４）から作成した 。これはアミノ酸１〜３００からなり、疎水性のシグナル配列（残基１〜２５； 斜線部分で示す）を含んでいる。

疎水性膜スパニング（ｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメイン（残基３４０〜３６０：斜線 部）およびＣ−末端疎水性ドメイン（残基３６１〜３９３）は除去した。切り取 りの位置（残基３００）は破線で示した。切り取ったｇＤ−１を膜ＤＡＦの残基 ３１１に融合させた。このｇＤ−１／ＤＡＦ融合体は、ｃＤＮＡ配列から予想さ れる膜ＤＡＦの最後の３７残基（残基３１１〜３４７）を含有しており、Ｃ−末 端疎水性領域（残基３３１〜３４７；黒塗りで示す）含んでいる。

詳細な説明 ＤＡＦとは、第１図または第２図に示されているブレまたは成熟アミノ酸配列を 有するあらゆる分子、並びに、それらの第１図または第２図の天然ＤＡＦと共通 の生物学的活性を示すことができるアミノ酸配列またはグリコジル化変異体（天 然のアレルを含む）であると定義される。以下においては、特に記述がなければ ＤＡＦなる用語はこのいずれかの形態またはその両者を意味するものとする。天 然のＤＡＦとは、血清、血球またはその他の動物体液もしくは組織から得られる ＤＡＦである。ＤＡＦの生物学的な活性は、ｌ）天然ＤＡＦの少なくとも１つの エピトープとの免疫学的な交差反応性、または２）天然ＤＡＦと質的に共通する 少なくとも１つのホルモン、調節もしくはエフェクター機能の保持、のいずれか として定義される。アンタゴニストまたはアゴニスト活性を有するＤＡＦのアミ ノ酸配列変異体が含まれるので、アミノ酸配列変異体はいずれかのＤＡＦの免疫 モジュレータ−活性を示すことを必要とせずにＤＡＦの定義の範囲内に入る。例 えば、ある変異体はアンタゴニストとして作用し、天然ＤＡＦを競争的に阻害す るが、それでも免疫モジニレ−ター活性それ自体は有していないこともある。こ れとは具なり、有していないときであっても、それが天然のＤＡＦに対して生成 させた抗体と交差反応することができるなら、定義の範囲内に入る。

今のところ知られているＤＡＦの免疫モジュレータ−活性の例はＣ４ｂ２ａ機能 的活性の阻害である（Ｍｅｄｏｆ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４；同上）。

ＤＡＦのアミノ酸反配列変異体には、第１図または第２図に示したプレまたは成 熟Ｄ　Ａ、　Ｆ配列中の残基の削除、挿入または置換が含まれる。通常、アミノ 酸配列の削除は約１〜１０残基の範囲内であり、普通は連続している。通常、連 続削除は偶数の残基で行われるが、１個のまたは奇数の削除も本発明の範囲内に 含まれる。代表的な削除は、［デスＣｙｓｓ３ｏ］成熟ｍＤＡＦ、［デスＣＹＳ ｓｓｏ−Ｔ　ｈｒｓ４ｔＥ成熟ｍＤＡＦ、［デスＴ　ｈｒｔ−Ｇ　１ｙｓｔｔコ 成熟５ＤＡＦである。特に重要な削除は＋ｎＤＡＦからのＣｙｓ、、。−Ｔ　ｈ ｒｓｉｑである。これは、膜アンカ一部位およびトランスメンプラン領域を削除 するものであり、５ＤＡＦと同様に分泌されるが、５ＤＡＦの特有の抗原決定基 を全（有さない分子が得られることになる。

また、挿入は、変異が成熟ＤＡＦ配列の範鴫にあるときに偶数の残基で行うのが 好ましく、通常、挿入は１〜５残基の範囲内であろう。しかし、挿入には、ＤＡ Ｆのアミノもしくはカルボキシ末端への、または１残基から実質的に制限されな い長さのポリペプチドまでの融合が含まれる。１個の末端挿入の例は、Ｎ−末端 のメチオニルを有する成熟ＤＡＦである。この変異体は、組換え細胞の培養にお けるＤＡＦの直接発現、即ち成熟ＤＡＦの細胞膜結合もしくは分泌させるための シグナル配列を伴わない発現のための人工物である。

末端挿入の他の例には、１）組換え宿主かろの成熟ＤＡＦの分泌を容易にするた めの、成熟ＤＡＦのＮ−末端への異種シグナル配列の融合、２）免疫原性ポリペ プチド、例えば細菌性ポリペプチド、例えば大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ｔｒｐ遺伝 子座によってフードされている酵素あるいはβ−ラクタマーゼなどの融合、およ び３）細胞表面結合物質、例えばホルモン、成長因子あるいは抗体などとの融合 が含まれる。

細胞表面結合物質との融合体は組換え法によって製造されることを必要とせず、 ホスファチジルイノシトール基を含むＤＡＦとの共有または非共有結合の産物で あってもよい。例えば、抗体または可変領域を有するそのフラグメントを、ＤＡ ＦのＣ−末端に共有結合させるか、またはそれとの融合体として組換え細胞培養 において発現させる。異型移植拒絶の改善のためには、ＤＡＦを異型移植のＨＬ Ａ抗原に特異的な抗体に結合させる。抗体とＤＡＦは、例えばＥＰ１７０、６９ ７Ａの方法によって共有結合されるが、タンパク質を結合させるための他の方法 が当業者には普通に知られている。免疫原の融合は、抗−ＤＡＦ抗体を得るため のワクチンとして適している免疫原性のＤＡＦを調製する際に有用である。これ らは診断試薬の調製に有用である。代表的な挿入体には、［Ｔｈｒｓｔｓ　Ｌｅ ｕ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓｓ＊ｏｌ成熟Ｄ　Ａ　Ｆ　ｓ　［Ａ　ｒｇ＋　ｏ。Ｈｉｓ　 Ａ　ｒＬｏｏ］成熟ＤＡＦ％　［ＬｙＳ＋ｚｓ　Ｇｉｎ　ＬｙＳ＋ｘ＠　Ｇ　Ｉ ｎ　ＬｙＳｒｔｒ］成熟ＤＡＦ、　［ＰｒＯ＋＋＋ｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ ＋ｓ＊コ成熟Ｄ　Ａ　Ｆ　、　［Ｐ　ｒｏｔ＊ｔ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇ１ｕｔ＋ ｓｌ成熟ＤＡＦ、　［Ｔｂｒｔｓ＊Ｓ　ｅｒ　Ｓ　ｅｒ　Ｔｈｒｔｓｓ］成熟Ｄ ＡＦ、および［ＧＩＹｓ＋ａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　’ｒｈｒｓ＋、コ成熟ＤＡＦが 含まれる。

第３の群の変異体は、ＤＡＦ分子中の少なくとも１つの残基が除去され、その位 置に別の残基が挿入されているものである。通常、そのような置換は次の表に従 って行われる。

元の残基　　　　　　　　　　　　　　　　置換例Ａ　ｌａ　　　　　　　　　 　　　　　　　　　ｇｌｙ　；　ｓｅｒＡｒｇ　　　　　　　　　　　　　　　 　　　１ｙｓＡ　ｓｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｇｉｎ　；　ｈｉ ｓＡ　ｓｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｇｌｕＣｙｓ　　　　　　　 　　　　　　　　　　　５ｅｒＧｌｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　ａ ｓｎＨｉｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　ａｓｎ　：　ｇｉｎＩ　ｌｅ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｌｅｕ　；　ｖａｌＬ　ｅｕ　　　　　 　　　　　　　　　　　　　ｉｌｅ　；　ｖａｔＬ　ｙｓ　　　　　　　　　　 　　　　　　　　ａｒｇ　；　ｇｉｎ　；　ｇｌｕＭｅｔ　　　　　　　　　　 　　　　　　　　ｍｅｔ　；　ｌｅｕ　：　ｔｙｒＴ　Ｙｒ　　　　　　　　　 　　　　　　　　　ｔｒｐ　；　ｐｈｅＶａｌ　　　　　　　　　　　　　　　 　　　ｉｃｅ；　ｌｅｕ第１表のものより保存性が少ない置換を選択することに よって、即ち、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えばシ−ト または螺旋の立体配座、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、また は（ｃ）側鎖の大きさ、を維持するその作用がもつと有意に異なっている残基を 選択することによって、機能または免疫学的な独自性の実質的な変換が行われる 。通常、ＤＡＦの性質に最大の変化をもたらすと予想される置換は、（ａ）親水 性の残基（例えば、セリルまたはトレオニル）が、疎水性の残基（例えば、ロイ シル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル）に代えて（ま たは、によって）置換されているもの：（ｂ）システィンまたはプロリンが他の いずれかの残基に代えて（または、によって）置換されているもの；（Ｃ）電気 陽性の側鎖を有する残基（例えば、リジル、アルギニルまたはヒスチジル）が、 電気陰性の残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）に代えて（または、 によって）置換されているもの；または（ｄ）大きな側鎖を有する残基（例えば 、フェニルアラニン）が、そのような側鎖を有さない残基（例えば、グリシン） に代えて（または、によって）置換されているものであろう。

代表的な置換ＤＡＦは、［ｃ　ｙｓ、、。→Ｍｅｔ］成熟！ＩＤＡＦ、［Ｃ）’ ａｓｓ。

−＋Ｓｅｒ］成熟ｍＤ　Ａ　Ｆ　、　［Ｃｙｓｔ−＋　Ｓ　ｅｒ］成熟ｍＤ　Ａ 　Ｆ　ｓ　［Ｌｙｓ＋ｔｓ　Ｌｙｓｅｔｓ→Ｇｉｎ］成熟ＤＡＦ、［Ｇ　ｂ＋４ ａ→Ｐ　ｒｏコ成熟Ｄ　Ａ　Ｆ　、　［Ｉ　ｂｌ＋４＊→Ｍｅｔ］成熟ＤＡＦ、 ［Ｐｈｅ＋ａｓ””Ｔ）’ｒコ成熟ＤＡＦ、［Ｐ　ｒｏ＋ｓｔ−、Ｇ　ｌｙコ成 熟ＤＡＦ、［１１ｅｔ＋＋＋−”Ｌｅｕｌ成熟ＤＡＦ、　［Ａｓｎｔｓ。ＡＳｎ ｔｓｔ＝ＡｓｐＡｓｐｌ成熟ＤＡＦ、［０１ｕｔ３ｓ→Ａ　ｓｉｌ＋］成熟ＤＡ Ｆ、［Ｓ　ｅｒｔａａ−Ｔｙｒ］成熟ＤＡＦ、［Ｖａｌｔ＠５＝Ｐｈｅ］成熟Ｄ ＡＦ、［Ｌ）’５ｔａｓ→Ｇ１ｎ〕成熟ＤＡ　Ｆ　、　［Ｔ　Ｍｔｓ＊→Ｓ　ｅ ｒ］成熟ＤＡＦ、および［Ｌｅｕａｔ＊→Ｓｅｒコ成熟ＤＡＦである。

上記の変異体は５ＤＡＦまたはｍＤＡＦのどちらにおいても行われる。以下に挙 げる変異体は特有の５ＤＡＦ　Ｃ−末端において行われる：　［Ｌｙｓｓｓｔ→ Ｇ　Ｉｎ］成熟５ＤＡＦ、［Ｃｙｓｓｓｓ−Ｓｅｔ］成熟５ＤＡＦ。

［Ａｒｇｓ＊４−Ｈｉｓ］成熟ｓ　Ｄ　Ａ　Ｆ　ｓおよび［Ｌ　ｅｕ４０ｓ　Ｐ 　ｈｅａｏ＊　Ｌ　ｅｕ＊ｏｓ→Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ］成熟５ＤＡＦ０本明 細書に記載した変異体は前もって決定したＤＡＦ変異体であるので、本発明の目 的のためには、あらゆる天然のアレルはＤＡＦ変異体の範囲内に含まれない。

ｍＤＡＦのＣ−末端ドメインは、翻訳後プロセッシングの間にリン脂質（通常は グリコホスホ脂質）が結合する部位（「リン脂質アンカードメイン」と呼ぶ）を 含んでいる。このドメインは約２０〜３０の残基を含み、リン脂質はＣ−末端残 基のカルボキシルに共有結合する。このドメインまたはそれを含有するｍＤＡＦ のあらゆるフラグメントは、膜−結合の形態を作るのが望ましい他のあらゆるポ リペプチドとの融合体として得られる。発現した融合体について用いるときの「 リン脂質アンカードメイン」は、後記でさらに詳しく説明するように、翻訳後に 修飾された融合体についてであることは理解されよう。例えば、普通は分泌され るホルモンは、組換え細胞培養において、ｍＤＡＦのリン脂質アンカードメイン とのＣ−末端融合のプレタンパク質として産生される。分泌される代わりに、こ の融合体は細胞膜まで運搬され、ホスファチジーフリンアンカーのためにそこに 留どまったままになる。このような組換え細胞は、ホルモンまたは他の選択した ポリペプチドのための免疫原またはワクチンとして有用である。また、膜におい てポリペプチドをキレート化すると、それが培養培地中に希釈されることから保 護される。最後に、Ｃ−末端脂質を有する融合ポリペプチドは、その末端脂質が 微量滴定管または試験管の表面などへの吸着のための都合の良い部位を与えるの で、ポリペプチドまたはその抗体の診断検定において有用である。

リン脂質アンカーで置換されたＣ−末端ドメインを含んでいる他のタンパク質が 知られている。このようなタンパク質には次のものが含まれる：　Ｔｈｙ−１［ Ｌｏｗ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　３１ｇ　＋　６２　 （１９８５）Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６０　：　１４５４７　（１９８５）コ 、アセチルコリンエステラーゼ［Ｆｕチジルイノシトール（ＰＩ）およびエタノ ールアミンを含有するＤＡＦアンカーの結合は、４ＤＡＦからの１７−３ｉＣ− 末端残基のタンパク質加水分解除去に続いて起こることは明らかである［Ｌｏ％ 、　Ｍ、　Ｇ、　。

Ｊ、Ｂｉｏｅｈｅｔ　２４４　：　１−１３　（１９８７）およびＣｒｏｓｓ、 　Ｇ、　Ａ、　Ｍ、　、　Ｃｅ１ｌ　４８　：　１７９−１８１　（１９８７） ］。

所望のポリペプチドとリン脂質アンカードメインの融合体を作成するため、通常 はそのようなアンカーを有するポリペプチドのＣ−末端の約３０〜５０残基をコ ードしているＤ　Ｎ　Ａを、所望のポリペプチドをコードしているＤＮＡに、ま たはその適当なフラグメントマルチマーもしくはアミノ酸配列変異体に連結する 。アンカー認識部位をコードしているＤＮＡを所望のタンパク質のＣ−末端に挿 入する。このアンカー認識部位は、アンカードメイン、並びに融合体からプロセ ッシングされるアンカードメインのＣ−末端に位置する短い約１０〜２０残基の 疎水性配列を含んでいる。当業者には周知の常法によってこれを行う。例えば、 選択したリン脂質アンカー認識部位をコードしているＤ　Ｎ　Ａは、インビトロ での方法によって、または天然のアンカーされるタンパク質をコードしているｃ 　Ｄ　Ｎ　ＡもしくはゲノムＤＮＡから適当なフラグメントを得ることによって 合成される。アンカードメインはＣ−末端疎水性ドメインがら上流の約２０〜４ ０残基中に見い出されるので、疎水性ドメイン並びにその上流の約２０〜４０残 基をコードしているＤ　Ｎ　Ａを用いるべきである。

ＤＡＦに加えて多数のタンパク質がグリコホスホ脂質アンカーを含んでいること が知られており、それらのアミノ酸配列（異種の融合においてアンカーとして用 いられるＣ−末端の約２０〜５０残基を含む）が知られている。その例には次の ものが含まれる：アセチおよびＭ、Ｇ、Ｌｏｖ　ｅｔ　ａｌ、、ＴｌＢ５１１　 ：　２１２−２１５　（Ｉｎ２）を参照。

ある場合には、例えば異種ポリペプチドのＣ−末端が立体的に自由であるべき免 疫エピトープまたは活性部位を含んでいるときには、異種ポリペプチドのＣ−末 端とリン脂質アンカードメインの間にスペーサーポリペプチドを導入するのが望 ましいであろう。最も望ましくは、これはアンカードメイン供与ポリペプチド由 来の別の配列、例えばアンカードメインのＮ−末端の約１０〜５０残基であるが 、人工の配列であってもよい。

リン脂質アンカードメインをコードしているＤＮＡから帰属させたアミノ酸配列 は、荷電していない疎水性残基（ロイシン、グリシン、トレオニン、バリン、メ チオニン、イソロイシンおよび／またはフェニルアラニン）を含有する約１０〜 ２０残基のＣ−末端配列を除いて配列の相同性をわずかしか示さないか、または 全く示さない。

しかし、これにもかかわらず、リン脂質アンカードメインは疎水性配列のすぐＮ −末端の領域内に含まれ、これに基づいて容易に同定することができる。当業者 ならリン脂質アンカードメインの任意の配列を精製することができよう。

上記のように、リン脂質アンカードメインに結合させるべきポリペプチドの実体 および性質は限定されない。それらの選択は、意図している治療または診断目的 に依存するであろう。必要とされるのは、融合したポリペプチドが、リン脂質ア ンカードメインとのハイブリッドとして発現される前の未融合のポリペプチドの 所望の生物学的な活性を示すことだけである。このポリペプチドは約４残基がら 数千までのどんな長さのものであってもよく、酵素、ホルモン、抗原などが含ま れる。

これら融合体のための発現宿主は、リン脂質認識部位をプロセッシングすること ができ、リン脂質をアンカードメインに結合させることができる細胞である。そ のような細胞は好ましくは本明細書の他の箇所に記載したような哺乳動物の継続 セルラインであり、最も好ましくはＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞である。

融合ポリペプチドは、上記の免疫原の用途には、それを産生ずる細胞とともに、 即ち発現宿主から回収することなく使用される。他の場合、例えば診断キットの 製造に関連して融合体を疎水性の親和マトリックスに吸着させる際には、融合体 をその使用の前に発現宿主から回収する。これまでｍＤＡＦまたは他のアンカー されたポリペプチドが単離されてきた方法と実質的に同じ方法で細胞膜抽出物を 調製することによって、融合体を宿主の細胞膜から回収する。また、受容体など の膜アンカーされたポリペプチドの調製物を得るための他の方法が知られており 、本明細番に記載した融合体の回収に用いるのに適している。通常は、宿主細胞 膜を細胞質から分離し、ノニオン系デタージェントで可溶化し、そして融合体を 免疫アフィニティー、基質または配位子アフィニティーカラムによる吸着によっ て回収する。この融合体は、異種のポリペプチドとグリコホスホ脂質アンカード メインを、Ｃ−末端結合したグリコホスホ脂質とともに含有するポリペプチドと して回収されるであろう。この融合タンパク質は、融合体のプロセッシングおよ びグリコホスホ脂質による置換の前に存在するＣ−末端疎水性配列を含まない形 態で回収されるであろうことに注意すべきである。

宿主の細胞膜を含まない精製された融合体は治療組成物として有用である。例え ば、ウロキナーゼまたは組織プラスミノーゲン活性化因子などのプラスミノーゲ ン活性化因子酵素を含む融合体をグリコホスホ脂質アンカードメインに融合させ 、治療組成物として、心筋梗塞または望ましくない血餅を伴う他の疾患を有する 患者に投与する。好ましくは、酵素はそのＣ−末端がグリコホスホ脂質アンカー ドメインのＮ−末端に融合される。「グリフホスホ脂質アンカードメイン」がア ミノ酸残基ならびにＣ−末端アミノ酸残基のカルボ牛シル基で置換されたグリコ ホスホ脂質の両者を含むことは理解されよう。この融合させたプラスミノーゲン 活性化因子は、プラスミノーゲンの活性化に最も効果的である血球および血管系 に入れられ、分解過程、例えば肝臓または牌臓によって為される分解などによる 血流からの除去を受けず、従って、酵素の半減期を長くし、一層直接的に所望の 治療部位を標的とさせることができる。

これらの利点を、細胞膜表面、特に造血細胞または血管上皮などの循環系に近い 細胞で機能するのが望ましいあらゆるポリペプチドに適用することができる。例 えば、代謝の先天的な欠陥の場合のように、必須酵素活性が存在しないことを特 徴とする疾患に苦しんでいる患者は、リン脂質アンカードメインに融合させた問 題の酵素の注入によって治療される。必要とされる代謝産物の細胞への放出およ び合成の動力学は、単に代謝産物を注入することよりも改善される。また、この 方法は、代謝産物を供給するための別の方法である体細胞形質転換よりも多（の 利点を与える。この融合体を、例えば脳細胞の代謝欠損に向けるために脳を髄液 に、または他の組織もしくは器官系に特異的な疾患を標的とするのが最も望まし いときにはリンパ系もしくは血流に注入する。

本新規融合体は、免疫系の欠陥または欠損（特に、抗原提供の過程におけるもの ）を克服するのに特に有用である。免疫応答を調節することが望まれる抗原をリ ン脂質アンカードメインとの融合体として合成し、この融合体を所望の効果を得 るために決定した条件および用量で投与する。抗原の選択には制限はないが、融 合体は抗原の関連エピトープ（群）を保存していなければならない。これは、当 業者には周知の方法に従い、天然抗原およびラベルした天然抗原に対して生成さ せた抗体を用いる通常の競合型の免疫検定によって容易に決定される。また、抗 原融合体は、上記のようなインビトロでの診断法に、あるいはアフィニティーク ロマトグラフィーにおいても有用である。

本発明の新規融合体は、所望により、リポソームまたは他の脂質膜担体中で製剤 化される。これは、融合体の溶液と予め形成させたリポソーム懸濁液を混合し、 リポソーム２重層中に融合体が挿入されるまでインキユベートすることによって 容易に行われる。別法によれば、融合体をリポソームの調製に用いた水性溶液と 混合する。

また、融合体はｍＤＡＦについて後記するように通常の薬理学的に許容しうる担 体中で製剤化される。融合体は疎水性の置換部分を保持しているので、Ｔｗｅｅ ｎ２０やＰＥＧなどの薬理学的に許容しうるデタージェントと、または血清アル ブミンとともに製剤化することができる。

ＤＡＦに関する以下の記載は、融合体は高等真核生物中で生産されるべきである と記したときを除き、すぐ後に記載するグリフホスホ脂質融合体に対しても同様 に適用されるものとみなされるべきである。

はとんどの削除および挿入、並びに特に置換は、ＤＡＦ分子の性質に激変はもた らさないであろう。しかし、置換、削除または挿入の正確な効果をそれを行う前 に予測することが困難であるとき、例えばＤＡＦ受容体結合ドメインまたは免疫 エピトープを修飾するときには、通常のスクリーニング検定によってその効果を 評価するのは当業者の認識するところであろう。例えば、変異体は通常、天然の ＤＡＦをコードしている核酸の部位特異的な突然変異誘発、組換え細胞培養での 変異核酸の発現、および所望により、細胞培養物からの精製（例えば、少なくと も１つの残存免疫エピトープによって変異体を吸着させるためのウサギポリクロ ーナル抗−ＤＡＦカラムへの免疫アフィニティー吸着による）によって調製され る。次いで、細胞溶解液または精製されたＤＡＦ変異体の活性を、目的の性質に 対して適切なスクリーニング検定で調べる。例えば、ある抗体に対する親和性な どのＤＡＦの免疫学的性質の変化は競合型の免疫検定で測定する。免疫モジニレ −ター活性の変化はＣ４ｂ２ａ検定で測定するが、イッピボでの５ＤＡＦおよび ｍＤＡＦの機能がさらにわかったときには、他の検定がそのようなスクリーニン グに有用となるであろう。酸化還元もしくは熱安定性、疎水性、タンパク質加水 分解に対する感受性、または担体と、もしくはマルチマーに集合する傾向などの タンパク質の性質の修飾は当業者には周知の方法によって検定される。

ヒト以外の種、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなど由来のＤＡＦも本発明の範 囲内に含まれる。

ＤＡＦは組換え細胞培養物中での合成によって調製するのが好ましい。そうする ためには、第１にＤＡＦをフードしている核酸を入手することが必要である。Ｄ ＡＦをコードしているすべての核酸を同定する際に相当な困難が存在した。最終 的に決定されたＤＡＦをコードしているヒトｍＤＮＡの配列を第１図に示す。上 記のようにＨｅ１ａ細胞由来のｃＤＮＡを調べることによって第２図に示す５Ｄ ＡＦをコードしているｃＤＮＡを同定するに至った。このＤＮＡが同定されたと きには、ヒトＤＮＡのゲノムライブラリーへの核酸ハイブリダイゼーションによ って、または、別の動物種のＤＡＦをコードしているＤＮＡを得るのが所望であ るときには、課程の細胞由来のＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションに よって、上記核酸を得るのは当業者には自明のことである。標的ＤＮＡに対して 完全に、またはほとんど完全に対合する極めて長い合成プローブの調製を第１図 および第２図が可能にしているので、ここでのハイブリダイゼーション分析は簡 単なことである。

ＤＡＦ核酸の供給源として選んだゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡが、完全長 さのＤＡＦをフードしている単一のクローンを含んでおらず、部分的なりローン だけを含んでいることもありうる。これらの部分的なりローンおよびフラグメン トは、部分的なりローンを重なり部分中の選択した制限部位で切断し、所望のフ ラグメントをそれぞれ回収し、そして適切な順序および配向でそれらを連結する ことによって、完全長さのＤ　Ｎ　Ａに容易に組み立てられる。必要なら、あら ゆる失われた配列を供給するためにオリゴヌクレオチドを調製する。

次いで、ＤＡＦをコードしている核酸を、さらにクローニングするための、また は発現させるための複製可能なベクターに連結する。

ベクターは適合宿主細胞と共同して２つの機能を発揮するのに有用である（宿主 −ベクター系）。機能の１つは、ＤＡＦをコードしている核酸のクローニングを 容易にすること、即ち使用可能な皿の核酸を生産させることである。他の機能は ＤＡＦを発現させることである。これら機能の１つまたは両方はベクター−宿主 系によって行われる。ベクターはそれらに行わせる機能、並びに、クローニング または発現用に選択した宿主細胞に依存して異なった成分を含有しているであろ う。

それぞれのベクターは上に記したようにＤＡＦをニードしている核酸を含有して いるであろう。通常、これはアミノ末端が分泌シグナルに結合している成熟形の ＤＡＦをコードしているＤＮＡであろう。この分泌シグナルは、通常インビボで ヒト細胞からＤＡＦを分泌させるＤＡＦプレ配列であるのが好ましい。しかし、 適当な分泌シグナルには、他の動物ＤＡＦ由来のシグナル、ウィルス性シグナル 、または同一もしくは関連の種の分泌ポリペプチド由来のシグナルも含まれる。

発現およびクローニングベクターは、１またはそれ以上の選択した宿主細胞中で のベクターの複製を可能にする核酸配列を含んでいる。ｍ常、クローニングベク ターにおいては、この配列は宿主染色体とは独立してベクターが複製することを 可能にする配列であり、複製起源または自律的に複製する配列を含んでいる。こ のような配列は種々の細菌、酵母およびウィルスについて周知である。よく知ら れているプラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起源がほとんどのダラム陰性細菌に 適しており、酵母に対しては２μプラスミド起源が、そして種々のウィルス性起 源（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウィルス、ｖＳｖまたはＢＰＶ）は哺乳動物 細胞中のクローニングベクターに有用である。起源は哺乳動物発現ベクターには 必要ではない（ＳＶ４０起源が実施例で用いられているが、これは初期プロモー ターを含んでいるからである）。はとんどの発現ベクターは「シャトル（往復） 」ベクターである：即ち、少なくとも一群の生物中で複製が可能であり、発現の ために別の生物中にトランスフェクションすることができる。例えば、ベクター を大腸菌中でクローンし、次に同じベクターを、それが宿主細胞染色体とは独立 して複製することができないものであっても、発現用に酵母または哺乳動物細胞 中にトランスフェクションスル。

また、Ｄ　Ｎ　Ａは宿主ゲノム中への挿入によってクローンされる。

これは、バシラス種を用い、例えばバシラスのゲノムＤＮＡ中に見い出される配 列に相補性であるＤＮＡ配列をベクター中に含ませることによって容易に行われ る。このベクターを用いてパシラスをトランスフェクションすると、ゲノムとＤ ＡＦＤＮＡの挿入体による相同組換えが起こる。しかし、ＤＡＦ　　ＤＮＡの切 り出しには制限酵素消化が必要であるので、ＤＡＦをコードしているゲノムＤＮ Ａの回収は外部で複製されたベクターのそれよりも複雑である。

通常、ＤＡＦ発現のための安定なセルラインまたは微生物を調製する目的でＤＮ Ａを宿主ゲノム中に挿入する。

発現およびクローニングベクターは選択遺伝子（選択マーカーとも呼ばれる）を 含んでいるべきである。これは、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存また は増殖に必要なタンパク質をコードしている遺伝子である。この遺伝子の存在は 、ベクターを欠いているすべての宿主細胞が形質転換宿主を越える増殖または複 製の利益を受けないことを確実なものにする。通常の選択遺伝子は、（ａ）抗生 物質またはその他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メ゛トドレキセ ードまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要 求欠損を補足するタンパク質、または（ｃ）コンプレックス培地から入手できな い必須栄養物質を供給するタンパク質、例えばバシラスのためのＤ−アラニンラ セマーゼをコードしている遺伝子、をフードしている。

酵母で用いるのに適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７ａｔｕｒｅ　２ ８２　：　３９　；　Ｋｉｎｇｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７９．　Ｇｅｎ ｅ　７　：　１４１　：またはＴｓｃｈｅｉｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９１１ １０．　Ｇｅｎｅ　１０　：　１５７）。このｔｒｐｌ遺伝子は、トリプトファ ン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣＮｏ、４４０７６ またはＰＥＰ４　１（Ｊｏｎｅｓ、　１９７７、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ８５　：　 １２）の選択マーカーを与える。次いで、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐｌ欠損 の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖により形質転換の検出に有効な環 境を与える。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８． ６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補足される。

哺乳動物細胞に適した選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ） またはチミジンキナーゼである。これらのマーカーは、ＤＡＦの核酸の取込みに 対してコンピテントである細胞の同定を可能にする。哺乳動物細胞形質転換体を 、マーカーを取込んだために形質転換体だけが唯一生存に適応する選択圧下に置 く。選択圧は、培地中の選択物質の濃度を連続的に変化させ、それによって選択 遺伝子とＤＡＦをコードしているＤＮＡの両方の増幅が導かれる条件下で形質転 換体を培養することによって課される。増幅とは、増殖に必須であるタンパク質 を産生ずることが強く要求されている遺伝子が組換え細胞の代々の世代の染色体 内に直列して反復される過程である。増加量のＤＡＦが増幅されたＤ　Ｎ　Ａか ら合成される。

例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、始めにヒポキサンチン、 グリシン、およびチミジンを欠く培養培地ですべての形質転換体を培養すること によって同定する。この場合の適切な宿主細胞は、υｒｌａｕｂおよびＣｈａｓ ｉｎ、　１９８０．　Ｐｒｏｃ、　Ｉｆａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌｉ ５Ａ　７７　：　４２１６の記載のように調製し、増殖させた、ＤＨＦＲ活性を 欠くチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）セルラインである。特に有用なり ＨＦＲは、ＭＴＸに対して耐性が高い突然変異Ｄ）（ＦＲである（ＥＰ　１１７ ．０６０す。この選択物質は、内生のＤＨＦＲの存在にかかわらず、その他の点 では適切なあらゆる宿主、例えばＡＴＣＣＮｏ。

ＣＣＬ６１　　ＣＨＯ−に１で用いることができる。次に、ＤＨＦＲを不活性化 する物質（メトトレキセートまたはＭＴＸ）に暴露することによって、ＤＨＦＲ とＤＡＦコード化ＤＮＡを増幅する。連続回の逐次増大するＭＴＸ濃度で増殖す ることができる細胞だけを選択することによって、細胞がさらにＤＨＦＲを必要 とする（従って・すべての外来ＤＮＡを増幅する）のを確実なものにする。

組換えを椎動物細胞培養におけるハイブリッド受容体の合成ニ適合させるのに適 したその他の方法、ベクターおよび宿主細胞は、ｌ。

Ｊ、Ｇｅｔｈｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｎａｔｕｒｅ　２９３　：　６２０−６ ２５（１９８１）　：　Ｎ、Ｍａｎｔｅｉ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ　２８１　：　４０−４６　；およびＡ、Ｌｅｖｉｎｓｏｎ　ｅｔ 　ａｌ、、　ＥＰ　１１７．０６ＯＡおよび１１７．０５８Ａが記載している。

ＤＡＦの哺乳動物細胞培養発現に特ニ有用す出発フラスミトハ、ｐＥ３４２．Ｈ ＢＶ　　Ｅ４００．Ｄ２２（ｐＥ３４８ＨＢＶＥ４００Ｄ２２とも呼ばれる；　 ＥＰ　１１７．０５８Ａ）である。

クローニングベクターとは異なり、発現ベクターは、宿主生物によって認識され 、モしてＤＡＦの核酸に機能的に結合したプロモーターを含有しているべきであ る。プロモーターは、その支配下にある核酸の転写および翻訳をコントロールす る、構造遺伝子の開始コドンの上流（通常、約１００〜１０００ｂｐ以内）に位 置している翻訳されない配列である。これらは普通２つの群、即ち誘導性および 構成性に分けられる。誘導性のプロモーターは、培養条件のある変化、例えば栄 養素の存在もしくは非存在または温度の変化に応答してそれらの支配下のＤＮＡ から増大レベルの転写を開始させるプロモーターである。現時点では、多種の可 能性ある宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。これら のプロモーターは、制限酵素消化によってこれらをこれらの元の遺伝子から取り 、次いでＤＡＦの開始コドンの５゛に挿入することによって、ＤＡＦをコードし ているＤＮＡに機能的に結合させる。これは、ゲノムＤＡＦプロモーターが使用 できないと言うものではない。しかし、一般に異種のプロモーターは、−５高い 転写および一層高い発現ＤＡＦ収量を与えることになる。

核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに機能的に結合され る。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分 泌に関係するプレタンパク質として発現されるならばポリペプチドのＤＮＡに機 能的に結合しており；プロモーターまたはエンハンサ−は、それが配列の転写に 影響を及ぼすならば暗号配列に機能的に結合しており；また、リポソーム結合部 位は、それが翻訳を促進するように設置されているならば暗号配列に機能的に結 合している。通常、機能的に結合するとは、結合されるＤＮＡ配列群が近接して おり、分泌リーダーの場合には近接してリーディング相内にあることを意味する 。結合は都合のよい制限部位でのライゲート（連結）によって行う。そのような 部位が存在しないときには、常法に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターま たはリンカ−を用いる。

原核性宿主で用いるのに適したプロモーターには、β−ラクタマーゼおよびラク トースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、＋１９７８．Ｎａｔｕｒｅ２ ７５　：　６１５　；およびＧｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１’１７９．　 Ｎａｔｕｒｅ　２８耕５４４）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔ ｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ、　１９８０．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、　８！：　４０５７およびＥＰＯ出願公開Ｎ　ｏ、　３６＋７７ ６）、およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーター（Ｌｄｅ　Ｂ ｏａｒ　ｅｔ　ａｌ、＋　１９８３．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、ＵＳＡ　８０　：　Ｈ−２５）が含まれる。しかし、その他の既知の細菌性プ ロモーターも適している。

これらのヌクレオチド配列は公表されており、従って当業者はこれらを、あらゆ る必要な制限部位を供給するためのリンカ−またはアダプターを用いて、ＤＡＦ をコードしているＤ　Ｎ　Ａに機能的に連結することができる（Ｓｉｅｂｅｎｌ ｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８０．　Ｃｅ旦２０　：　２６９）。また、細 菌性の系で用いるためのプロモーターは、ＤＡＦをフードしているＤＮＡに機能 的に結合させたシャインーダルガルノ（Ｓ、Ｄ、）配列を含有している。

酵母宿主で用いるのに適した促進配列には、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ Ｔｌｉｔｚｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｎ 、　２￥！：　２０７３）、またはその他のグルコース分解酵素（Ｂｅｓｓ　ｅ ｔ　ａｌ、、　１９６８．　Ｊ、Ａｄｖ、Ｅｎｚ）ａ＋ｅ　Ｒｅｇ、　７　：　 １４９　；およびＨｏ１ｌａｎｄ、　１９７ｇ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 １７　：　４９００）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェ ートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホス ホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホ グリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオセホスフェートイソメラー ゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどのプロモーター が含すれる。

増殖条件によってフントロールされる転写の別の利点を有している誘導性プロモ ーターであるその他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イ ソチトクロムＣ１酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関与する分解酵素、メタロチ オネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、並びにマ ルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素群のプロモーター領域である。

酵母発現において用いるのに適したベクターおよびプロモーターはＨｉｔｚｅｍ ａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（ＥＰ　７：Ｌ　６５７Ａ）がさらに開示している。また 、酵母エンハンサ−を酵母プロモーターとともに用いるのが有利である。

哺乳動物宿主細胞中のベクターからのＤＡＦの転写は、ポリオーマ、サイトメガ ロウィルス、アデノウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスおよび最も好 ましくはサルウィルス４０（ＳＶ４０）などのウィルスのゲノムから、または、 例えばアクチンプロモーターなどのへテロローガスな哺乳動物プロモーターから 得られるプロモーターによってコントロールされる。５Ｖ４Ｑウイルスの初期お よび後期プロモーターは、５Ｖ４Ｑのウィルス性複製起源をも含有する５Ｖ４Ｑ 制限フラグメントとして好都合に得られる（Ｐｉｅｒｓ　ｅｔａｌ、　＋　１９ ７８．　狂ｔｕｒｅυ３：１１３）。また、宿主細胞またはその関連種由来のプ ロモーターが本発明において有用であるのは勿論である。

高等真核生物によるＤＡＦをコードしているＤ　Ｎ　Ａの転写は、ベクター中に エンハンサ−配列を挿入することによって増大する。エンハンサ−は、通常的１ ０〜３００ｂｐのヌクレオチド配列であり、プロモーターに作用してその転写を 増強するが、その配向および位置には比較的無関係に作用する。現在では多数の エンノ＼ンサー配列カ哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、 α−フェトプロティンおよびインスリン）から既知となっている。しかし、真核 細胞ウィルスからのエンハンサ−を用いるのが普通である。その例には、５ｖ４ ０の複製起源の後期側のエンノ１ンサー（ｂｐｌｏ。

〜２７０）、サイトメガロウィルスの初期プロモーターエンノ１ンサー、ポリオ ーマの複製起源の後期側のエンノ１ンサー、およびアデノウィルスのエンハンサ −が含まれる。エンハンサ−はベクターのＤＡＦをコードしている配列の５°ま たは３′の位置に継ぎ合わせてよいが、プロモーターの５゛の位置に設置するの が好ましい。

また、真核宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、またはその他の多 細胞生物由来の有核細胞）で用いる発現ベクターは、転写の終止およびｔａ　Ｒ Ｎ　Ａの安定化に必要な配列をも含んでいるであろう。通常、このような配列は 真核性またはウィルス性のＤＮＡまたはｃＤＮＡの５°および時には３′非翻訳 化領域から得ることができる。これらの領域は、ＤＡＦをコードしているｍＲＮ Ａの非翻訳化部分にポリアデニル化されたセグメントとして転写される領域を含 んでいる。また、３°非翻訳化領域は転写終止部位をも含んでいる。

本発明のベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞は、原核生物、酵 母または高等真核細胞である。原核生物にはダラム陰性またはグラム陽性生物、 例えば大腸菌またはバシラスが含まれる。

好ましいクローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、 その他のダラム陰性またはグラム陽性原核生物、例えば大腸菌Ｂ１大腸菌Ｘ１７ ７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、大腸菌Ｗ３１　ＩＱ（ＡＴＣＣ２７，３２５） 、シェードモナス種、またはセラッチア・マルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　Ｍ ａｒｃｅｓａｎｓ）も適している。

原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核性微生物もＤＡＦをコードして いるベクターに適した宿主である。サツカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈ ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または普通のパン酵母が、低級真核 宿主微生物の中で最も普通に用いられる。しかし、その他多数の属、種、および 株が普通に用いられ、本発明にとって有用である。

ＤＡＦの発現用に好ましい宿主細胞は多細胞生物由来の細胞である。もし天然Ｄ ＡＦに対して最も忠実な立体配座を示すことを組換えタンパク質に期待するとき には、ＤＡＦが大きいことおよびその分子内ジスルフィド結合（群）により、宿 主細胞は最適には微生物よりさらに高等な系統発生オーダーのものであることが 示唆される。

さらに、それはＤＡＦをグリコジル化するのにも望ましい。これら機能のすべて は高等真核細胞によって最もうまく行うことができる。

原則的には、あらゆる高等真核細胞培養物がを推動物あるいは非を推動物培養物 由来を問わず使用可能であるが、ヒトなどの哺乳動物由来の細胞が好ましい。こ れら細胞の培養物中での増殖は自体周知である［Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ 、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ編 （１ｔ＋７３）を参照］。有用な哺乳動物宿主セルラインの例は、ＶＥＲＯおよ びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣セルライン、Ｗ１３８、ＢＨＫ、 ＣＯ３−７、ＭＤＣＫセルライン、およびヒト肝腎セルライン２９３である。

宿主細胞を上記の発現またはクローニングベクターで形質転換し、プロモーター の誘導または増幅遺伝子を含む形質転換体の選択に適するように修飾された通常 の栄養培地で培養する。温度、ｐＨなどの培養条件は、クローニングまたは発現 のために選択した宿主細胞でこれまで用いられている条件が適当であり（それぞ れの場合に応じて）、当業者には明らかであろう。

５ＤＡＦは分泌タンパク質として培養培地から回収するのが好ましいが、分泌シ グナルなしで直接発現させるときには宿主細胞溶菌液から回収することもできる 。第１段階として、培養培地または溶菌液を遠心して個々の細胞残骸を除去する 。また、ＤＡＦは不純な可溶性タンパク質から、例えば選別カラム（例えば、Ｃ ｏｎＡ）による吸着、溶離、抗−５ＤＡＦもしくは抗−ｍＤＡＦ免疫アフィニテ ィーカラムによる吸着およびそれからの溶離によって精製される。これとは別に 、他の方法、例えばアルキル・セファロース、シリカまたはアニオンもしくはカ チオン交換樹脂によるクロマトグラフィーまたはゲル電気泳動を用いて５ＤＡＦ を不純物から分離する。ｍＤＡＦは、Ｍｅｄｏｆ　ｅｔ　ａｌ、　、　（１９８ ４；同上）の方法を用いて形質転換体細胞膜から回収する。疎水性トランスメン ブラン領域および／またはｍＤＡＦホスファチジルイノシトール結合残基が削除 されているか、または置換されているＷＤＡＦ変異体は５ＤＡＦと同じ方法で回 収されるが、トランスメンブラン領域が無傷のままである変異体は形質転換体細 胞膜から回収される。

天然のＤＡＦはある条件のもとで集合する傾向を有しているので、少量のノニオ ン系界面活性剤［例えば、ツイーン（Ｔｖｅｅｎ）またはポリエチレングリコー ル］を分離中に加えることによってマルチマーの集合状態を安定化させるのが有 用であろう。また、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害物質は精製中のタンパク質 加水分解を阻害するのに有用であり、抗生物質を含有させて外来不純物の増殖を 防止してもよい。

天然のＤＡＦに適した精製方法が、組換え細胞培養物中で発現させたＤＡＦまた はその変異体の性質の変化に鑑みて、修飾を必要とすることもあることは当業者 の認めるところであろう。例えば、原核細胞の培養中に産生されたＤＡＦポリペ プチドはグリコジル化されていないので、Ｃｏｎ−Ａセファロースに吸着しない であろう。この場合には、他の方法、例えばゲル電気泳動、イオン交換または免 疫アフィニティー精製などを用いるべきである。同様に、５ＤＡＦ脂質不含のＣ −末端ｍＤＡＦ変異体は、ｍＤＡＦのようには容易に疎水性吸着剤に吸着しない であろう。適切な精製法は特定の組換えＤＡＦの性質に依存しており、当業者に は明らかであろう。

ＤＡＦはナトリウム、カリウム、リン酸、塩酸などのイオンとの非毒性塩として 調製される。通常、ＤＡＦはリン酸緩衝食塩水中で保存されるか、または糖アル コール類（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、モノサツカリド類（例 えば、グルコース、マンノース、ガラクトースまたはフルクトース）、オリゴサ ツカリド類（例えば、マルトース、ラクトースまたはスクロース）、およびタン パク質（例えば、ヒト血清アルブミン）を含む賦形剤の存在下に凍結乾燥しても よい。

また、上記の賦形剤は水溶液保存したときの不活性化または沈澱に対するＤＡＦ の安定性に寄与することもあり、通常の他の安定化剤とともに用いられることも ある。そのような安定化剤には、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤 （例えば、アスコルベートまたはジチオトレイトール）、アミノ酸、およびノニ オン系界面活性剤（例えば、ポリエチレングリフールまたはポリエチレングリコ ールとポリプロピレングリコールのブロックコポリマー）が含まれる。

ＤＡＦは、免疫機能障害または誤指向性、特に体液免疫応答における欠損から派 生する種々の障害を改善するためにヒトまたは動物に投与される。その例には、 ＰＮＨ１炎症、例えば炎症性腸障害（大腸炎）、リウマチ性関節炎、異型移植拒 絶などが含まれる。ＤＡＦによる治療は、そのような障害の発生の初期に始めら れるべきである。

治療用ＤＡＦ組成物は、薬理学的に許容しうる担体中に治療学的有効量をＤＡＦ を含んでいる。選択される用量、担体および投与経路は、各種因子の中で、特に 治療されるべき障害または異常、患者の状態、望ましい投与経路、および選択し たＤＡＦ変異体の活性に依存するであろう。これは、治療過程の中で医師によっ て容易に決定およびモニターされる。

ＤＡＦの注入または注射のための担体は、滅菌等張水溶液、例えば注射用食塩水 または５％デキストロースである。これらの調製物は、鼻内、皮下、静脈内、腹 腔内、またはその他の通常の投与経路で注射または注入される。また、調製物は 関節の滑液にも注射されまた、ＤＡＦは持続放出担体中に加えられる。適当な例 には、一定の形状を有する半透過性の高分子マトリックス（例えば、圧側または マイクロカプセル）が含まれる。移植可能な、またはマイクロカプセル持続放出 マトリックスには、ポリラクチド（米国特許３．７７３゜９１９　；　ＥＰ　５ ８．４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγエチルーＬ−グルタメートのコポリマー（ Ｕ、Ｓｉｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　１９８：Ｌ　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ＋＋　 ２２（１）　：　５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレー ト）　（Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ　ｅｔｔ　ａｔ、　；同上）、またはポリ−Ｄ−（− ）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ　１３’Ａ、　９ｕム）が含まれる。また、持続 放出ＤＡＦ組成物にはリポソームによって捕捉されたＤＡＦが含まれる。ＤＡＦ を含有するリポソームは自体既知の方法によって調製される（ＤＥ　３．２１８ ．１２１Ａ　；　Ｅｐｓｔｅｉｎ：　ＥＰ　３６６７６Ａ　：　ＥＰ　８８０４ ６Ａ　；　ＥＰ　１４３９４９Ａ　；　ＥＰ　１４２６４１Ａ　；日本特許出願 ８３−１１８００８　；米国特許４．４８５．０４５および４．５４４．５４５ 　；およびＥＰ　１０２．３２４Ａ）。通常、リポソームは小さい（約２００〜 ８００人）単一膜型のものであり、脂質含量は約３０モル％コレステロール以上 であり、この選択した割合はＤＡＦ漏出の最適速度に調節されている。

持続放出のＤＡＦ調製物は、炎症または治療部位の近接部、例えば関節の近く、 炎症腸組織に移植または注射される。

ＤＡＦに対して生成させたポリクローナルのウサギまたはネズミ抗血清がＭｅｄ ｏｆｅｔ　ａｌ、　（１９８４；同上）によって記載されている。抗血清は、Ｄ ＡＦの免疫アフィニティー精製またはＤＡＦのＥＬＩＳＡ検定において用いられ る。５ＤＡＦの特有のＣ−末端に特異的な抗体は次のように調製される：即ち、 動物を免疫原の５ＤＡＦフンジコゲート（例えば、本明細書の他の箇所に記載し たような組換え細胞培養物中で調製された免疫原融合体）に対して免疫し、次い で、ｍＤＡＦエピトープに指向性の抗体を吸着させるために抗血清を固定化ｍＤ ＡＦＯカラムに通し、吸着されなかった抗血清を”’　Ｉ　−ｓＤ　Ａ　Ｆ［” ’　Ｉ　−＋ａＤ　Ａ　Ｆと実質的に同じ方法で調製；　Ｍｅｄｏｆ　ｅｔ　ａ ｌ、　＋　１９８４（同上）コの存在下でインキュベートして特有の５ＤＡＦエ ピトープを未吸着抗血清中の抗−ｓＤＡＦ抗体に結合させ、そして未結合の１ｔ Ｊ−ｓＤＡＦの量を測定することにより（例えば、プロティンＡセファロースへ の吸着によって）、抗−ｓＤＡＦ力価の存在についてスクリーニングすることに よって調製される。

そのような抗血清中の５ＤＡＦ特異的な抗体は、固定化ｍＤＡＦによる吸着、未 吸着分画の回収、固定化５ＤＡＦによる吸着およびｐＨ４〜６緩衝液による溶離 によって、ｍＤＡＦ抗体を実質的に含まない５ＤＡＦ特異的な抗体を回収するこ とによって調製する。別法では、抗−５ＤＡＦ中和力価を示す免疫された動物か らの肺細胞を回収し、ミエローマ細胞と融合させるか、または既知の方法により ＥＢウィルスで形質転換し、モノクローナルな５ＤＡＦ特異的な抗体を調製する 。

ＤＡＦの中和抗体は、ＤＡＦ活性を有する抗イデイオタイプ抗体を生成させるた めの抗原として免疫原性ポリペプチドにコンジユゲートさせるときに有用である 。そのような抗イデイオタイプ抗体はＤＡＦと同じ診断および治療目的に有用で ある。

実施例を簡単にするため、頻繁に出て（る方法の一部は簡略して表現されている 。

「プラスミド」は、小文字ｐ１それに先立つおよび／またはそれに続く大文字、 および／または数字で表す。本発明の出発プラスミドは、市販品から入手可能で あるか、制限のない状態でだれでも入手可能であるか、またはそのような入手可 能なプラスミドから公知の方法に従って構築することができる。さらに、その他 の等価なプラスミドが当分野で知られているが、これらは当業者には明らかであ ろう。

ＤＮＡの［消化］とは、Ｄ　Ｎ　Ａ中のある位置にだけ作用する酵素によるＤＮ Ａの触媒的切断を意味する。そのような酵素は制限酵素と呼ばれ、そのそれぞれ が特異的である部位は制限部位と呼ばれている。本発明で用いられる多種の制限 酵素は市販品から入手可能であり、酵素供給元によって確立された反応条件、補 助因子、およびその他の必要条件を用いた。通常、制限酵素は、それぞれの制限 酵素が最初に得られた微生物を示す大文字とそれに続く他の文字、およびそれに 続く特定の酵素を示す数字からなる短縮形で表される。

通常、約１μ９のプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２０μＱの緩衝液中 、約２単位の酵素とともに用いる。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および 基質量は製造元によって指定されている。通常は３７°Ｃで約１時間のインキュ ベート時間を用いたが、供給元の指示に従って変えることもある。インキュベー トの後、タンパク質をフェノールおよびクロロホルムによる抽出によって除去し 、消化した核酸をエタノールによる沈澱によって水性分画から回収する。

時には、制限酵素による消化に続いて末ｔ４５′ホスフェートの細菌性アルカリ ホスファターゼ加水分解を行って、ＤＮＡフラグメントの２つの制限切断末端が 「環状化」または閉じた環を形成すること（別のＤＮＡフラグメントのこの制限 部位への挿入を妨げる）を防止する。特に記載がなければ、プラスミドの消化に 続いて５′末端の脱ホスホリル化を行うことはない。脱ホスホリル化の方法およ び試薬は通常のものである（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９ｇ２＋ 　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉ耶、　ｐｐ、１３ａ−１３４）。

「充填」または「平滑化」は、制限酵素切断した核酸の付着末端の１本鎖末端が ２本鎖に変換される過程を意味する。これにより付着末端が削除され、平滑末端 が形成される。この方法は、１つだけまたはいくつかの別の制限酵素によって創 製される末端に付着するかもしれない制限切断末端を、いずれかの平滑切断する 制限エンドヌクレアーゼの末端または他の充填された付着末端と適合する末端に 変換するための多用途の方法である。通常、平滑化は、１０ｍＭＭ　ｇ　ＣＱ　 ｔ、１＋ｏＭジチオトレイトール、５０ａ＋ＭＮａｃＩ２．１０ｍＭ）リス（ｐ Ｈ７，５）緩衝液中、ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ・フラグメント（８単位 ）および４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（それぞれ２５０μＭ）の存在下 、約３７℃で標的ＤＮＡ（２〜１５μ９）をインキュベートすることによって行 う。通常、このインキュベートはフェノールおよびクロロホルム抽出ならびにエ タノール沈澱によって３０分後に停止させる。

制限消化物からのあるＤＮＡフラグメントの「回収」または「単離」とは、電気 泳動によるポリアクリルアミドまたはアガロースゲルでの消化物の分離、その移 動度と既知分子量のマーカーＤ　Ｎ　Ａフラグメントの移動度の比較による目的 フラグメントの同定、目的のフラグメントを含有しているゲル切片の取り出し、 およびゲルからのＤＮＡの分離を意味する。この方法は広く知られている。例え ば、照。

「ノーザン」プロットは、既知のラベルされたオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ フラグメントへのハイブリダイゼーションによって細胞ｏ＋ＲＮＡの存在を確認 する方法である。本発明のためには、他に記載がなければ、ノーザン分析はＴ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、＋ｐ、２０２（同上）が記載しているような、 変性原（ホルムアルデヒド−７％）の存在下の１％アガロースでのｍＲＮＡの電 気泳動分離、ニトロセルロースへの移動、ラベルしたフラグメントとのハイブリ ダイゼーションを意味するものとする。

「形質転換」とは、ＤＮＡが染色体外要素または染色体組込み体として複製可能 なように生物中にＤＮＡを導入することを意味する。

特に記さなければ、本発明で大腸菌の形質転換に用いた方法はＭａｎｄｅｌ　ｅ ｔ　ａｌ、、　１９７０．　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　５３：　１５４］のＣａ Ｃ（１，法である。

「ライゲート（連結）」とは、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でホスホジエ ステル結合を形成させる過程を指す（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　、 　ｐ、　１４６　；同上）。特に記さなければライゲートは、ライゲートしよう とするほぼ等しい量のＤＮＡフラグメント（ｏ、５μ９）に対してＴ４　　ＤＮ Ａリガーゼ（「リガーゼＪ）（１０単位）を用い、既知の緩衝液および条件を用 いて行う。

形質転換体からのＤＮＡの「調製」とは、微生物培養物からのプラスミドＤＮＡ の単離を意味する。他に記載がなければ、￥ａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａｌ、　、　 ｐ、　９０（同上）のアルカリ／ＳＤＳ法を用いてよい。

「オリゴヌクレオチド」とは、既知の方法によって化学的に合成され、次いでポ リアクリルアミドゲルで精製された短い１本鎖または２本鎖のポリデオキシヌク レオチドである。

以下に挙げる実施例は、今わかっている本発明実施の最良の態様を単に説明する ためのものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。

（以下、余白） ｇ　ヒトＤＡＦのクローニング、ＤＡＦをコードしているｃＤＮＡクローンの同 定 ヒトＤＡＦを均質になるまで精製し、Ｎ−末端配列の２３アミノ酸を決定した。

これらの５つはアンビギニアスであった。

このアミノ酸配列に基づ＜　６９　ｍａｒのオリゴヌクレオチドプローブをイン ビトロで合成した。ｓｘｐラベルした（キナーゼ処理した）プローブは次のヌク レオチド配列を有していた：Ｇ　ＣＴＧＡＧ　ＣＡ　ＣＣＴＧ　ＣＣＣＣＣＴＧ 　ＡＴＧＴＧ　ＣＣＣＡＡ　ＴＧ　ＣＣＣＡ　Ｇ　ＣＣＴＧ　ＣＣＣＴＧＧＡＧ ＧＧＣＡＡＧＡＡＡＣＣＣＴＴＣＣＣＴＧ　。

Ｈｅ１ａ細胞γｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリー（約１ｘｌＯ”組換え体）を、この ６９ｍｅｒを用いて厳格性の低い条件下でスクリーニングした。唯１つのＤＡＦ クローン（γ２１）が、６つの偽ポジティブ（配列決定により、これらはプロー ブとの限定された核酸の相同性を有しているが、全く異なるアミノ酸配列を有し ていることがわかった）とともに同定された。γ２１は次の配列をコードしてい る挿入体を含有していた： Ａｓｐ、　Ｃｙｓ、　Ｇｌｙ、　Ｌｅｕ、　Ｐ　ｒｏ、　Ｐｒｏ、　Ａｓｐ、　 Ｖａｌ、　Ｐ　ｒｏ、　Ａｓｎ、　Ａｌａ、　Ｇ　Ｉｎ。

Ｐ　ｒｏ、　Ａ　ｌａ、　Ｌ　ｅｕ、　Ｇ　ｌｕ、　Ｇ　ｌｙ、　Ａ　ｒｇ、　 Ｔ　ｈｒ、　Ｓ　ｅｒ、　Ｐ　ｌｅ、　Ｐ　ｒｏ、　Ｇ　Ｉ凵B ［配列中、下線を引いた残基はアミノ末端配列決定によって同定された残基とは 異なっていた〕。

最初のＤＡＦクローン（クローンλ２１）は１３９５ｂｐの長さであり、ポリＡ 尾部を含有していたが、イニシエーターのメチオニンを欠いていた。

ＤＡＦ　＋ｎＲＮＡの大きさを測定するため、Ｈｅ１ａ細胞ポリＡ＋ＲＮＡを含 むノーインプロットを３！ＰラベルしたＤＡＦγ２１でスクリーニングした。こ のプローブは、大きさがおよそ１５００ｂｐおよび２０００ｂｐの２つのメツセ ージとハイブリダイズした。これらはほぼ等しい強度であった。

５′または３°末端のいずれかに延長を有する長い方のＤＡＦクローンを同定す るため、以下のように、γ２１の５゛および３”末端から２つの小さい制限フラ グメントを単離した：これらのプローブをｓａｐでラベルし、そしてこれを用い て別のＤＡＦ−コード化クローンについてＨｅ１ａｃＤＮＡライブラリーを再ス クリーニングした。さらに２つのクローンＤＡＦγ４１およびＤＡＦγ４７が同 定された。これらは両プローブとハイブリダイズし、ＤＡＦγ２１挿入体よりも 長（、それぞれ約２．ＱＯＯｂｐおよび２゜２００ｂｐであった。これら両クロ ーンは、ポリＡ尾部の前に約７８０ｂｐの付加的な３′非翻訳化配列を含んでい た。このＤＡＦ遺伝子の３°非翻訳化配列は多数のポリアデニル化シグナル（Ａ ＡＴＡＡＡ）を含んでおり、上流または下流のシグナルのいずれかを約１，５０ ０ｂｐまたは約２，０ＯＯｂｐのｍＲＮＡのどちらかを生成させるために用いる ことができるようである。

５′末端については、クローンＤＡＦγ４１はＤＡＦγ２１よりも５５ｂｐ長く 、翻訳開始のためのＡＴＧを含んでいた。クローンＤＡＦγ４７はその５°末端 がＤＡＦγ２１よりも９３ｂｐ短かった。

クローンＤＡＦ３３も同定したが、これは５°プローブとだけハイブリダイズし た。このクローンはその５°末端がＤＡＦγ２１よりも７１ｂｐ長く、従って５ ゛方向の最も長い延長を示した。

ＤＡＦγ２１およびＤＡＦγ４１はタンパク質の暗号領域が完全に重なっており 、４４０アミノ酸のタンパク質をコードしていた。

ＤＡＦγ４７およびＤＡＦγ３３は、ＤＡＦγ２１およびＤＡＦγ４１と比較す ると暗号領域の明らかな１１８ｂｐの「欠失」を含んでいた。さらに詳しく調べ ると、ＤＡＦγ２１およびＤＡＦγ４１はスプライスされていない（除去されて いない）１１８ｂｐのイントロンを含んでいるようであった。続いてさらに２つ のクローンＤＡＦγ３５およびＤＡＦγ３７を同定したが、その１つは同じイン トロンを含んでおり、他方は含んでいなかった。

スプライスされていない形態がライブラリー中に存在する頻度（６クローンのう ち３クローン）は、スプライスされていないクローンが不適切にスプライスされ たメツセージであるとは考えにくいことを示唆する。むしろ、２つの形態のＤＡ Ｆタンパク質が存在するようである。これら２つの形態はアミノ酸位置１〜３２ ７は同一であるが、異なるＣ−末端配列を有している。スプライスされていない 形態は付加的な７９アミノ酸を含有しており、スプライスされた形態は付加的な ２０アミノ酸を含有している。スプライスによってリーディング・フレームが変 化するので、２つのタンパク質のＣ−末端の間には相同性は存在しない。

２つのＤＡＦタンパク質のバイトロバシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）プロットか ら、およびその特徴がよく調べられているＴ　ｈｙ−１膜結合糖タンパク質との 比較から、スプライスされたＤＡＦ　ｃＤＮＡは膜結合ＤＡＦの合成を指令し、 一方、スプライスされていない形態は可溶型をフードしているものと結論される 。

実施例２組換え細胞培養におけるＤＡＦの発現実施例１のクローンＤＡＦγ３３ 、γ４１およびγ４７をそれぞれｐＵｃ１９（大腸菌用の容易に入手できるクロ ーニングベクター）中にサブクローンした。これは、γクローンのそれぞれをＥ ｃｏＲＩで消化し、それぞれからＤＡＦ挿入体を回収し、ｐＵｃ１９をＥｃ。

Ｒ１で消化し、開いたｐＵｃ１９に挿入体を連結（ライゲート）シ、そしてそれ ぞれの連結混合物で大腸菌２９４を形質転換することによッテ行ツタ。ｐＵｃ１ ９３３、ｐＵｃ１９４１およびｐＵｃ１９４７をアンピシリン耐性のコロニーか ら回収した。

ｐＵｃ１９３３、ｐＵｃ１９４１およびｐＵｃ１９４７をそれぞれＥｃｏＲＩお よびＨｉｎｄｌｌｌで消化し、ＤＡＦ遺伝子の５°末端、並びに５ＤＡＦおよび ｍＤＡＦ遺伝子の３′末端をそれぞれ含有するフラグメント（それぞれ、Ｉ、Ｉ ｔおよび■）を回収した。ＥｃｏＲＩで消化したｐＵｃ１９を３者（ｔｈｒｅｅ 　ｗａｙ）連結でフラグメントＩおよびＩ［ニ連結し、アンピシリン耐性の大腸 菌コロニーからｐｌＪｃ１９ｓＤＡＦを回収した。これは、第２ａ〜２ｇ図に示 した完全な５ＤＡＦ遺伝子のサブクローンであった。

フラグメント■の代わりにフラグメント■を用いたこと以外は、ｐＵｃ１９ｓＤ ＡＦと同じ方法でｐＵＣ１９＋ｎＤＡＦを構築した。このサブクローンは第１Ｒ 〜ｌｆ図の完全なｍＤＡＦ遺伝子を含有していた。

ｐＨ３４８ＨＢＶＥ４００Ｄ２２（また、ｐＨ３４２ＨＢＶＥ４００　Ｄ　２２ 　；　ＥＰ　１１７．０５８Ａ）をＨｉｎｄｌｌｌで消化し、ＤＨＦＲを含有す るフラグメントを回収した。Ｈ１ｎｄｌｌｌ付着末端を充填し、このフラグメン トをＣ１ａｌで消化し、そし、て以下のフラグメントを単離した：ＤＨＦＲＨＢ ｓＡｇ　ｆ’ＪＡ　　　ｐＭＬ　　　ＳＶ４０起源Ｃ１ａｌ　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　Ｈｉｎｄｌｌｌ（平滑） （フラグメントａ；４０８４ｂｐ） また、ｐＨ３４８ＭＢＶ　　Ｅ４００Ｄ２２もＣ１ａＩおよび５ｏｃｌｌで消化 し、ＳＶ４０起源およびＨＶｓＡｇポリＡ配列を含有する９９０ｂｐのフラグメ ントを回収した（フラグメントｂ）。

ｐＵｃｓＤＡＦおよびｐＵｃｍＤＡＦをＥｃｏＲＩで消化し１、それぞれのＤＡ Ｆをコードしているフラグメントを単離した（それぞれ、フラグメントＣ■およ びＣＩＩＩ）。

フラグメントＣ■、ａおよびｂを３者連結でライゲートし、大腸菌２９４にトラ ンスフェクションした。ｐＨ３４８ｓＤＡＦをアンピシリン耐性のコロニーから 回収した。これは、ＳＶ４０５ＤＡＦ初期プロモーターの３′に適切な配向で５ ＤＡＦ遺伝子を含有する。この５ＤＡＦ遺伝子は、哺乳動物宿主細胞への導入な らびに該細胞中でのメトトレキセード選択および増幅に適した発現ベクター中の ＳＶ４０初期プロモーターの支配下にある。

フラグメントＣ■を用いること以外は同じ方法でｐＥ　３４８ｍＤＡＦを構築し た。

ｐ３４２　Ｅ　（Ｃｒｏｗｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｍｏ１．Ｃｅ １１．Ｂｉｏｌ、　３−　：　４４−５５）をＥｃｏＲＩおよびＨｐａｌで消化 することによって別の発現ベクターを構築し、ベクターフラグメントを回収した 。ｐＩＪｃ１９ｍＤＡＦまたはｐＵＣｌ　９ｓＤＡＦｆｃＡｃｃＩ（＋ｎＤＡＦ 用）または平滑Ｘｈｏｌｌ（ｓＤＡＦ用）で消化し、充填し、ＥｃｏＲＴで消化 し、そしてＤＡＦをコードしているフラグメントを回収した。このＤＡＦフラグ メントをベクターフラグメン）・に連結し、発現ベクターを回収した。このベク ターはＤＨＦＲ遺伝子を含有していないが、ｐＦ　Ｄ　１１　（Ｓｉｗ＋ｏｎｓ ｅｎ　ｅて満足な結果が得られるであろう。

ｐＨ３４８ｓＤＡＦまたはｐＨ３４８ｓＤＡＦを常法によってＤＨＦＲ−ＣＨ○ 細胞中に同時トランスフェクションし、ＨＡＴ培地に蒔き、そして形質転換体を 連続増加のメトトレキセート濃度を有する培地での培養によって選択してＤＨＦ ＲおよびＤＡＦ遺伝子を増幅した。安定にＤＡＦを発現し、それを培養培地中に 分泌する形質転換体クローンを回収した。プロティンＡセファロース固定化の５ ＤＡＦに対するウサギポリクローナル抗体を入れた免疫アフィニティーカラムへ の吸着およびｐＨ５のグリシン緩衝液による溶離によって、培地から５ＤＡＦを 回収した。

同じ方法によってｐＨ３４８ｓＤＡＦをＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞に導入し、そして 増幅した。これまで赤血球ストロマ（海綿状細胞膜）からｍＤＡＦを回収してい た方法と実質的に同じ方法による、宿主細胞膜のデタージェントリゼイトからの 単離によってｍＤＡＦを回収した。

実施例３　リン脂質アンカードメイン融合体の構築本実施例では、スプライスさ れたｃＤＮＡによって予想される膜ＤＡＦの最後の３７アミノ酸を、切り取りを 行った形態の単純庖疹ウィルス１型（ＨＳＶＩ）の糖タンパク質Ｄ（ｇＤ−１） ［Ｃ−末端の膜スパニングドメインを欠いているので、通常、構成的に培養培地 に分泌される；　Ｌａ５ｋｙ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 　；　：　５２７　（Ｉｎ２）］のＣ−末端にフレーム（枠）内で融合させた融 合タンパク質を構築した。Ｈ３Ｖ　ｇＤ−１の最初の３００アミノ酸をコードし ているＨ　１ｎｄｌｌｌ　−Ｈ１ｎｆＩフラグメントを、合成リンカ−を介して 、ＤＡＦのＣ−末端（残基３１６〜３４７）をコードしているＸｍｎ１−Ｅｃｏ ＲＶフラグメントに連結した。合成Ｈｉｒ＋４Ｉ−ＸｍｎＩリンカ−（５’　− ＡＴＴＣＧＣＣＡＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＧＴＧＧ−ＡＡＣＣ）はｇＤ−１のアミ ノ酸３０１およびＤＡＦのアミノ酸３１１〜３１７をコードしており、フレーム 内の融合を生じた。

このｇＤ−１／ＤＡＦ融合タンパク質をフードしているＤＮＡを、ＣＡ工遺伝子 の切除と融合ＤＮＡの挿入によって哺乳動物発現ベクターのＲ３Ｖプロモーター と５Ｖ４Ｑポリアデニル化配列の間に挿入し［Ｇｏｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　７９　：　６７７７　（１９ ８２）’ｌ、リン酸カルシウム同時沈澱法によってＣＨｏ細胞中にトランスフェ クションした［％１ｇ１ｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、１ｉａｔ１．Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６：　１３７３（１９７９）、およびＳｉ＋ｎｏｎｓｅ ｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＯＳＡ　８０： 　２４９５　（１９８３）］。マウスのジヒドロ葉酸還元酵素ｃＤＮＡは遺伝子 発現の選択マーカーを与えた［Ｓｉｍｏｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　１１１０　：　２４９５　（１９８３） ］。それぞれのコロニーから得られた安定なセルラインを分析に用いた。天然の ｇＤ−１または切り取りが為されたｇＤ−１を発現しているセルラインを記載の ようにして得た［Ｌａ５ｋｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 　２　：　５２７（１９８４）およびＢｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｅｉｅ ｎｅｅ　２２２　：　５２４（１９８３）コ。得られた融合タンパク質（第３図 ）は、シグナル配列を含むｇＤ−１のＮ−末端の７５％（残基１〜３００）、並 びに２つの予想ＤＡＦタンパク質の間で相違する２０アミノ酸のセグメントおよ び１７アミノ酸の隣接共通配列を含む膜ＤＡＦのＣ−末端の１０％（３７アミノ 酸）を含んでいる。ｇＤ−１／ＤＡＦ融合タンパク質、天然ｇＤ−１［Ｂｅｒｍ ａｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　５ｃｉｅｎｃｅ　２２２　：　５２４（１９８３）］、 および切り取りが為されたｇＤ−１［Ｌａ５ｋｙ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｂｉｏ／Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｇ：　５２７（１９８４）］をＣＨＯ細胞中で発現させ、 間接免疫蛍光法によって局在化させた。天然ｇＤ−１またはｇＤ−１／ＤＡＦ融 合体のどちらかを発現している透過性にした細胞の内部ラベル化は、核周辺領域 、おそらくは小胞体における免疫蛍光の類似の局在を示した。切り取りが為され たｇＤ−１を発現している細胞は細胞質全体に拡散した強い免疫蛍光を示した。

完全長さの天然ｇＤ−１を発現している無傷の（透過性にされていない）細胞の 免疫蛍光は、このタンパク質がそのトランスメンブランドメインから予想される ように細胞表面に現れることを示す。対照的に、切り取りが為された（分泌型） 形態のｇＤ−１を発現している細胞においては表面のラベルは検出されなかった 。

また、ｇＤ−１／ＤＡＦ融合タンパク質を発現している細胞も表面染色を示し、 ＤＡＦｔｖＣ−末端ドメインの付加が分泌型（切り取り型）ｇＤ−１を再び原形 質膜に指向させることを示す。

ｇＤ−１／ＤＡＦ融合体によってコードされているＤＡＦのＣ−末端セグメント はＣ−末端に１７アミノ酸の疎水性領域を含有しており、これは、翻訳後に除去 され、ＰＩ−アンカーで置換されると考えられている一時的な膜アンカーとして 作用するのかもしれない［Ｌｏｖ、　Ｍ、　Ｇ、　、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　２４４　：　１−１（（１９８７）　；　Ｃｒｏｓｓ、　Ｇ、　Ａ、　Ｍ−Ｃ ｅ旦郵：Pｌ ７９−１８１（１９？）　：およびＣａｒａｓ、　１．Ｌ　ｅｔ　ａｌ、Ｊａｔ ｕｒｅ　３２５　：　５４５（１９ｇ？）］。

上記の実験は、融合タンパク質がリン脂質アンカーによってアンカーされている のか、または１７アミノ酸の疎水性領域によってアンカーされているのかを区別 しない。従って、結合の性質を調べるために、天然ｇＤ−１またはｇＤ−１／Ｄ ＡＦ融合体のどちらかを発現するＣＨＯ細胞を、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ 　ａｕｒｅｕｓ由来の精製したホスファチジルイノシトール特異的なホスホリパ ーゼＣ（Ｐ　１−Ｐ　Ｌ　Ｏ）［Ｌｏｖ。

Ｍ、　Ｇ、　、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　７１　：　７４１（１９８ １）コとともにインキュベートし、間接免疫蛍光および流れ血球計算法（ＦＡＣ Ｓ）によって分析した。

タンパク質加水分解不純物を含まないＰ　Ｉ　−Ｐ　Ｌ　Ｃ［Ｌｏｗ　ｅｔ　ａ ｌ、　、　Ｎａｔｕｒｅ　３１８　：　６２（１９８５）１で処理すると、対数 で表した相対的な細胞蛍光の顕著な減少によって示されるように、細胞表面のｇ Ｄ−１／ＤＡＦの量がかなり減少した。通常、定量ＦＡＣ３分析によって示され るように、７０〜８０％の細胞表面ｇＤ−１／ＤＡＦがＰＩ−ＰＬＣｉ：よって 放出させられた。対照的に、細胞表面に現れる完全長の天然ｇＤ−１はＰＩ−Ｐ Ｌ、Ｃによる処理によっては影響されなかった。この放出の特異性は、ホスファ チジルイノシトールを加水分解しないＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎ ｇｅｎｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓのどちらか由来のらｇＤ−１／ ＤＡＦを放出させなかったという観察によってさらに確認された。

ＤＡＦのグリフホスホ脂質アンカーは、ホスファチジルイノシトールに加えてエ タノールアミンおよびグルコサミンを含有している［Ｍｅｄｏｆ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５：　６７４０（１９８６）：ｌ。グリコジ ル化されたリン脂質は、ポリペプチドの末端カルボキシル基とエタノールアミン のアミン基の間のアミン結合によってタンパク質に結合されるものと考えられる ［ＬＯＷ、　Ｍ、　Ｇ、　、　Ｊ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　２４４　：　１−１３ （１９８７）およびバク質がそのような構造によってアンカーされることを確認 するため、細胞を［３Ｈ］エタノールアミンまたは［”Ｓ］システィンのどちら かで代謝的にラベルし、タンパク質を免疫沈澱法で分析した。多数の形態のｇＤ −１／ＤＡＦ、３７ｋＤの種、並びにそれぞれ約４６ｋＤおよび５２ｋＤの少な くとも２つの比較的大きい拡散度の高い種が、ｇ、Ｄ−１／ＤＡＦを発現してい る細胞においてのみ、Ｈ３Ｖ−１に対するポリクローナルおよびモノクローナル の両抗体によって検出された。予備的なパルス−チェース実験およびノイラミニ ダーゼによる実験は、３７ｋＤの種が前駆体であり、一方、大きい方の種が成熟 した高度にグリフシル化された形態のタンパク質であることを示唆シタ。４６ｋ Ｄの種に対応する［”Ｈ］エタノールアミン−ラベルされたバンドは前駆体であ り、一方、大きい方の種は成熟した高度にグリコジル化された形態のタンパク質 である。４６ｋＤおよび５２ｋＤの種に対応するＥ’ｌエタノールアミン−ラベ ルされたバンドは、３７ｋＤの種とは異なり、ｇＤ−１／ＤＡＦを発現している 細胞において特異的に検出された。グリコホスホ脂質アンカーの結合は、脂質ア ンカーされたタンパク質の生合成における初期の現象であると考えられている［ Ｍｅｄｏｆ　ｅｔ　ａｌ、、ＢｉｏｃｈｅＩ＋１ｉｓｔｒｙ　２５　：　６７４ ０（１９８６）およびＢｅｒｍａｎｅｔ　ａｌ、＋　５ｃｉｅｎｃｅ　２２２　 ：　５２４（１９８３）コ。３７ｋＤのｇＤ−１／ＤＡＦ前駆体に対応する［３ Ｈ］エタノールアミン−ラベルされたバンドが存在しないのは、本実験において 細胞をラベルするのに用いた長いパルス（１６ｈ）によるものであろう。天然の ｇＤ−１は［３Ｈ］エタノールアミンでラベルされなかった。

ｇＤ−１／ＤＡＦＭ合タンパク質はホスファチジルイノシトールを介して原形質 膜に結合されるものと結論された。この結論は以下の証拠によって支持される。

第１に、細胞表面のｇＤ−１／ＤＡＦは精製度の高いホスファチジルイノシトー ル特異的なホスホリパーゼＣによる消化に対して感受性であったが、一方、天然 のｇＤ−１は影響を受けなかった。第２に、特異性の広いホスホリパーゼがｇＤ −１／ＤＡＦの放出に有効ではなかった。第３に、ｇＤ−１／ＤＡＦはグリコホ スホ脂質アンカーの成分である［’Ｈ］エタノールアミンによって特異的にラベ ルされた。このように、リン脂質膜アンカーの結合を指向させるために必要な情 報または「シグナル」は、ＤＡＦのＣ−末端の３７アミノ酸内に含まれている。

Ｃ−末端配列が脂質を結合させる際にある役割を演じているというこの考えは、 最近の、おそらくは別のｍＲＮＡスプライシングに由来するものと考えられる、 多くの種類の神経細胞付着分子（Ｎ　−ＣＡ　Ｍ）＋ｎＲＮ　Ａの同定によって 支持される。これらのｍＲＮＡによってコードされている別形態のＮ−ＣＡＭは 別のＣ−末端ドメインを有しており、疎水性の膜−スパニングドメインによって 、またはリン脂質によって膜結合することになることは明らかである［Ｈｅｍｐ ｅｒｌｙ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

屡坊８３　：　９８２２（１９８６）］。］ＰＩ−アンカされるタンパク質にと って利用可能なＣ−末端アミノ酸配列を調べると、明確な相同性はないことがわ かり、唯一の共通の特徴はｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列によって予想されるＣ−末端の短 い疎水性ペプチド（１５〜２０残基）の存在であった。

一時的な膜アンカーとして働くこともあるこの疎水性ペプチドはプロセッシング の間に除去されるものと推定されている［Ｌｏｗ、　Ｍ、　Ｇ−＋　ムＢｉｏｃ ｈｅｍ、　２４４　：　１−１３（１９８７）およびＣｒｏｓｓ、　Ｇ、　Ａ、 　Ｍ、　、　Ｃｅ１ｌ　４８　：　１７９−１８１i１ ９８７）］。］ＰＩ−アンカされるタンパク質のＣ−末端領域における配列保存 の欠如は、プロセッシングシグナルがその性質において立体配座的なものである ことを示唆する。上記の方法によるリン脂質膜アンカーの付加は、可溶性または 分泌型タンパク質を細胞表面膜に向けるための新規機序を提供するものである。

８ま 国際調査報告 −崗−Ａ−−−−と＝／υｓ　８Ｆ＋１０２６４ｇ国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．リン脂質アンカードメインに対して異種のポリペプチドに融合させたリン脂 質アンカードメインを含有するポリペプチド。
2. ２．リン脂質アンカードメインがｍＤＡＦのアンカードメインである請求項１記 載のポリペプチド。
3. ３．異種のポリペプチドが酵素、ホルモン、免疫グロブリン、アレルゲン、受容 体または抗原である請求項２記載のポリペプチド。
4. ４．酵素がプラスミノーゲン活性化因子である請求項３記載のポリペプチド。
5. ５．抗原がウイルスのエンベロープタンパク質の免疫エピトープを保持している 請求項３記載のポリペプチド。
6. ６．酵素が代謝の先天的欠陥における欠損酵素である請求項３記載のポリペプチ ド。
7. ７．リン脂質アンカードメインが、リン脂質アンカードメインによって通常は細 胞膜にアンカーされるポリペプチドのＣ−末端にＮ−末端約１０〜５０残基が設 置されている残基を含有する請求項１記載のポリペプチド。
8. ８．リン脂質アンカードメインが異種タンパク質のＣ−末端に融合している請求 項１記載のポリペプチド。
9. ９．リン脂質アンカードメインに対して異種のポリペプチドに融合したリン脂質 アンカー認識部位を含有するポリペプチドをコードしている核酸。
10. １０．５′から３′にかけて、異種ポリペプチドおよびリン脂質アンカー認識部 位をコードしている請求項８記載の核酸。
11. １１．認識部位が約１０〜２０残基を含有するものである請求項９記載の核酸。
12. １２．リン脂質アンカードメインに対して異種のポリペプチドに融合させたリン 脂質アンカー認識部位を含有するポリペプチドをコードしている核酸で形質転換 した組換え宿主細胞。