KR20030067755A - 글루코세레브로시다제 활성을 갖는 이관능성 융합 단백질 - Google Patents

글루코세레브로시다제 활성을 갖는 이관능성 융합 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고셰병, 파브리병 및 테이삭스병과 같은 당지질 저장 장애의 치료에 기초한 치료를 이용한 이관능성 융합 단백질의 투여에 의한 당지질 대사의 효소 치환 치료 및/또는 증가를 위한, 임뮤노글로불린 (lg) 분자 및 글루코세레브로시다제의 생물학적 활성을 갖는 단백질로 주로 구성된 신규의 글루코세레브로시다제 이관능성 융합 단백질에 관한 것이다.

Description

글루코세레브로시다제 활성을 갖는 이관능성 융합 단백질{BIFUNCTIONAL FUSION PROTEINS WITH GLUCOCEREBROSIDASE ACTIVITY}
비장절제술 또는 골수이식보다 하기의 질병을 겪는 유기체에서 효소를 증가시키고자 하는 시도로서 고셰병, 파브리병 또는 테이삭스병과 같은 당지질 저장 장애로 유발되는 질병의 치료를 위해 외인성 β-글루코시다아제를 투여하는 것은 이미 라이소좀 저장 결함을 치료코자하는 문헌에 기재되어 있다. 참조, 예컨대, De Duve, C. in Fed. Proc.23, 1045 (1964) 및 Barton, N. W. 등. in Proc. Natl. Acad. Sci87, 1913(1990), 이에는 고셰병을 치료하기 위한 β-글루코시다아제 및 특히 GCR 의 사용 및 치료적 반응을 얻기 위한 이와 결합된 어려움이 기재되어 있다. 그러나, 이러한 질병의 치료를 위한 효소의 투여량은 매 2 주마다 약 60 단위/kg(체중)이며, 이는 체중이 70 kg 인 환자의 치료를 위해서는 매년 평균 경비가 효소만 약 US$ 380.000 가 소요됨을 의미한다. 이는 외인성 산 β-글루코시다아제의 짧은 세포내 반감기 때문이다.
종양 세포와 같은 특이적 세포 유형에 대한 타켓팅을 촉진하고 상당히 향상된 생체내 반감기를 갖는 항체-효소 융합 단백질이 개시되어 있다. 예컨대, 사이토킨 인터루킨 2 (IL-2)을, 두개의 별개 융합 단백질에서, 각각, 항체 KS1/4 및 chl4.18 을 이용하여 종양 항원 상피 세포 접착 분자 (Ep-CAM) 또는 디시알로간글리오시드 GD2 와 면역반응하는 모노클로날 항체 중사슬에 융합시켜, 각각, 융합 단백질 chl4.18-IL-2 및 KS1/4-IL-2를 형성시켰다. 참조, 예컨대, U.S.P No. 5,650,150.
따라서, 본 발명의 목적은 투여의 효과적인 수단 및 양식을 가능케하고, 공지된 고가의 방법보다 저렴하며 대부분의 환자, 특히 개발도상국의 환자의 가격 범위내인 고셰병, 파브리병 및 테이삭스병과 같은 당지질 저장 장애의 효과적인 치료에 적합한 화합물을 찾는 것이다. 본 발명의 목표는 낮은 투여량으로 투여가능하고, 현저하게 감소된 활성없이 유기체에서 더 긴 반감기를 가지며, 당지질 대사가 발생하는 특정 세포에 보다 낫게 타게팅하여 고셰병, 파브리병 및 테이삭스병의 보다 저렴하고 좀더 효과적 치료를 가능케하는 상기 질병의 치료를 위한 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 개요
만일 GCR 의 생물학적 활성을 갖는 단백질이 전 항체, lg 중사슬 또는 경사슬, lg 중사슬의 단편, 예컨대, 중사슬 (CH)의 불변영역, 또는 Fc 또는 Fab 단편과 같은 lg 분자에 연결되면, 효과 및 연장된 반감기에서 기대밖의 시너지효과가 존재함을 발견하게 되었다.
융합 단백질 및 특정된 융합 단백질의 변형은 당해기술에 공지되어 있다. 예컨대, 융합 단백질은 단백질 백본 자체와의 물리적 접촉으로부터 단백질분해 효소를 효과적으로 차단할 수 있어, 분해를 방지한다. 추가의 이점에는, 특정 환경하에서, 특정 발현 시스템에서의 향상된 수율, 표적 단백질의 정확한 폴딩 및 치료적 단백질의 안정성, 순환시간 및 생물학적 활성의 증가가 포함된다. 이러한 변형의 하나는 임뮤노글로불린의 Fc 영역의 사용이다. 항체는 2 개의 기능적으로 독립적인 부분, 항원과 결합하는 “Fab”로 알려진 가변 도메인, 및 보체또는 포식세포와 같은 이펙터 기능에 대한 연결을 제공하는 “Fc”로 알려진 불변 도메인을 포함한다.
임뮤노글로불린의 Fc 부분은 특히 짧은 반감기를 가진 특정 단백질에 융합되는 경우 긴 혈장 반감기를 중재한다 (Capon, 등, Nature 337: 525-531(1989)).
치료적 융합 단백질은 또한 임뮤노글로불린의 Fc 단백질에 모두 존재하는, Fc 수용체 결합, 단백질 A 결합, 보체 고정 및 태반 이동과 같은 기능을 통합하는 Fc 도메인을 사용하여 구축하였다. 예컨대, lgGl 항체의 Fc 영역은, 호지킨병 종양 세포, 역형성림프종세포, T-세포 백혈병 세포 및 기타 악성 세포형태에서 발현되는 CD30 수용체에 결합하는 분자인 CD3O-L의 N-말단 끝에 융합된다 (U.S.P No. 5,480,981). 더욱이, 특정의 비돌연변이 표적 단백질의 효과적인 발현 및 분비는 임뮤노글로불린의 Fc 부분 및 상기 표적 단백질을 함유하는 융합 단백질을 발현시킨 후, 상기 표적 단백질을 단백질분해 절단시켜 달성할 수 있음이 1996 년에 보고되었다 (WO 96/08570, US 5,541,087).
lg 폴리펩티드 사슬과 융합시킬 적합한 GCR 형 단백질은 U.S.P No. 5,879,680 에 주어진 바와 같은 아미노산 서열 및 관련 DNA 서열을 갖거나, 이로부터 유래된 절단형 (truncated form) 또는 돌연변이형일 수 있다. 절단형 및 돌연변이형을 제외한, 예시적인 상기 단백질 및 합성 방법 및 이의 조건은 U.S.P No. 5,879,680 의 교시에 기재되어 있으며, 제조 및 용도와 관련된 이의 개시는 본 명세서에 참조로 특별히 포함되어 있다.
바람직한 절단형은, 예컨대, 효소의 카르복시 말단 부위로부터 절단된 천연 GCR 효소의 아미노산의 약 1/3 내지 1/2 로 구성된 형태이다. 상기 절단된 단백질은 제한 효소 등의 적합한 시약으로 목적하는 사슬을 절단하여 전장의 단백질로부터 유도될 수 있다.
본 발명에 따른 융합 화합물에 대한 활성의 증거뿐만 아니라, lg 폴리펩티드 사슬과의 융합에 대한 적합한 후보인 효과적인 GCR 형 단백질의 확인에 대한 분석은 참조된 U.S. 특허에 기재되어 있어, 고셰병, 파브리병 및 테이삭스병과 같은 당지질 저장 장애의 치료를 위한 대안적 융합 단백질은 본 발명을 실시하기 위하여 용이하게 확인될 수 있을 것으로 여겨진다.
본 발명은 능력에 동물에서 글루코세레브로시드를 가수분해하는 GCR 형 활성을 갖는 것외에, 보다 높은 발현수준, 보다 높은 가용성, 보다 나은 조직 분포 및 보다 나은 매크로파아지에 대한 타겟팅과 같은 추가의 유리한 특성을 갖는 신규의 단백질을 제공한다. 이러한 신규의 단백질에는 GCR 형 단백질 및 전 항체 또는 이의 단편과 같은 lg 분자 (lg 중사슬 또는 경사슬 또는 CH, Fc 또는 Fab 단편과 같은 중사슬의 단편)의 융합 단백질, GCR 형 단백질에서 또는 lg 부분에서 변형된 글리코실화를 갖는 상기 융합 단백질의 형태, 예컨대, 신생아기의 Fc 수용체 (FcRn)에 대해 감소된 친화성을 갖는 절단 또는 돌연변이된 아미노산 서열을 갖는 GCR 융합 단백질의 형태 및 특정 링커를 갖는 GCR 융합 단백질이 포함된다.
본 발명은 고셰병, 파브리병 및 테이삭스병과 같은 당지질 저장 장애의 치료에 기초한 치료를 이용한 이관능성 융합 단백질의 투여에 의한 당지질 대사의 효소치환 치료 및/또는 증대를 위한, 임뮤노글로불린 (lg) 분자 (전 항체, lg 중사슬 또는 경사슬 또는 이의 단편) 및 GCR 의 생물학적 활성을 갖는 단백질 (이 용어에는 또한 올리고펩티드가 포함된다)(GCR 형 단백질)로 주로 구성된 글루코세레브로시다제 (GCR) 이관능성 융합 단백질 (GCR 융합 단백질)에 관한 것이다.
lg 부분의 아미노산 서열을 선택적으로 변경시켜, 향상된 특성, 예컨대, 향상된 안정성을 갖는 GCR 융합 단백질을 수득할 수 있다.
더욱이, GCR 의 단축 버전 및 lg 사슬이 사용된 융합 단백질을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 약학적 조성물 및 치료 방법 및 상기의 GCR 융합 단백질을 함유하는 시스템 및 약학적으로 허용가능한 담체내에 재조합적으로 생산된 GCR 융합 단백질을 치료학적 양으로 함유하는 약학적 조성물을 후술되는 질병의 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 고셰병 또는 파브리병 및 테이삭스병과 같은 당지질 저장 장애로 유발되는 또다른 질병의 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 향상된 특성을 갖는 GCR 형 활성을 갖는 단백질을 제공하는 것이며, 상기 단백질은 전 항체, lg 중사슬 또는 경사슬 또는 중사슬의 단편 (예컨대, CH, Fc 또는 Fab 단편)과 같은 lg 분자 및 GCR 형 단백질을 포함하는 융합 단백질이며, 상기 lg 부분은 상기 GCR 형 단백질에 공유결합적으로 직접 또는 간접적으로 (링커분자를 통해) 융합된다. 바람직한 구현예로서, lg 부분은 이의 C-말단을 통해 공유결합적으로 상기 GCR 형 단백질에 이의 N-말단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 (링커 분자를 통해)융합되며, lg 부분 및 GCR 부분은 변형 또는 돌연변이될 수 있고, 하기의 군으로부터 선택된다 :
여기에서, lg 는 lg 중사슬 또는 경사슬 또는 lg 중사슬의 단편 (예컨대, CH, Fc 또는 FAB 단편)을 의미한다. GCR 은 포유류, 바람직하게는 인간 기원, 특히 바람직하게는 인간 라이소좀 기원 유래의 천연 발생 GCR 을 의미하며, 또한 천연기원으로부터 조작된 재조합 GCR 을 포함한다.
GCRtrunc은 절단되었으나 이의 아미노산 서열에서는 돌연변이되지 않은 본 발명에 따른 GCR 이다. 절단형은 주로 글루코세레브로시다제의 완전한 또는 단지 약간 감소된 생물학적 활성을 갖는 단백질 단편이다. 본 발명에 따른 바람직한 GCR 의 절단형은 C-말단에서 단축된 천연 글루코세레브로시다제 효소의 아미노산 서열의 약 1/3 내지 1/2 로 구성된 것이다.
GCRm은 이의 아미노산 서열에서 돌연변이되었으나 절단은 되지 않은 본 발명에 따른 GCR 이다. 돌연변이의 수는 제한되지 않으나 분자의 생물학적 활성의 손실로 제한된다. 바람직한 구현예로서, 돌연변이의 정도는 아미노산 잔기의 5 내지 30%, 특히 바람직한 구현예에서는 5 내지 20% 이다. 증가된 GCR 생물학적 활성을 갖는 변이체는 당해기술에 공지된 방법에 의해 발생될 수 있다.
본 발명에 따른 GCR, GCRm, GCRtrunc는 글리코실화, 비글리코실화, 부분글리코실화 또는 그렇지 않으면 이의 글리코실화 패턴에서 변형된다.
GCR 융합 단백질은, 예컨대, 단백질 A 컬럼상에서 표준 기술에 의해서 정제될 수 있다.
L 은 예컨대, 글리신 및/또는 세린과 같은 일련의 펩티드를 의미한다.바람직하게는, 펩티드 링커는 약 5 - 25, 바람직하게는 10 - 20 잔기 길이의 글리신 및 세린 펩티드의 혼합열이다. 단백질분해 절단 링커, 특히 카텝신과 같은 라이소좀 프로테아제로 절단될 수 있는 링커가 특히 바람직하다.
바람직한 구현예로서, lg 부분은 Fc 수용체를 보유한 세포에 특이적이다. 따라서, GCR 에 연결시킬 lg 분자의 바람직한 단편은 Fc 영역이다. 임뮤노글로불린의 Fc 영역은 임뮤노글로불린 중사슬 불변 영역의 카르복시 말단 부분에 대한 아미노산 서열이다. Fc 영역은 임뮤노글로불린의 생물학적 기능을 측정하는데 특히 중요하며, 이러한 생물학적 기능은 이펙터 기능으로 불리운다. 공지된 바와 같이, 임뮤노글로불린 서브클래스의 중사슬에는 4 또는 5 개의 도메인이 포함된다: lgM 및 lgE 은 5 개의 중사슬 도메인을 가지며, lgA, lgD 및 lgG 는 4 개의 중사슬 도메인을 갖는다. lgA, lgD 및 lgG 의 Fc 영역은 힌지-CH2-CH3도메인의 다이머이며, lgM 및 lgE 에서 이것은 힌지-CH2-CH3-CH4도메인의 다이머이다 (참조, W.E. Paul, ed.,1993, Fundamental Immunology, Raven Press, New York, New York).
본 명세서에서 사용하는, 용어 “Fc 부분”는 임뮤노글로불린 중사슬 불변 영역의 카르복실-말단 부분, 또는 이의 상동체 또는 부분을 의미한다.
이것은, 예컨대, lg 의 임뮤노글로불린 Fc 영역, 바람직하게는 lgG 이며, 이는 적어도 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인의 일부를 포함할 수 있다.
Fc 영역은 이의 아미노 말단에서 펩티드 결합에 의해 GCR 의 카르복시 말단아미노산에 연결될 수 있거나, 바람직한 구현예로서는, Fc 영역은 이의 카르복실 말단에서 펩티드 결합에 의해 GCR 의 아미노 말단 아미노산에 연결된다.
일부의 경우에서, lg 분자내, 특히 융합 단백질의 Fc 영역에서 특정의 아미노산을 돌연변이시키는 것이 유용하다. 예컨대, 신생아기의 Fc 수용체 (FcRn) 는 lgG 에 결합하여, 융합 단백질의 임상적 효능을 감소시킬 수 있다.
따라서, FCm은 이의 아미노산 서열에서 돌연변이 및/또는 이의 글리코실화 패턴에서 변형된 전술한 바와 같은 Fc 부분이다. 이러한 변형된 Fc 부분은 향상된 특성을 가진 융합 단백질을 가져온다. 이런 상황에서, FCm은 FcRn 수용체에 대해 감소된 친화성을 갖는 추가로 변형 또는 돌연변이된 Fc 부분을 포함한다. 예컨대, lgG 중사슬의 CH2 및 CH3 도메인 (잔기 310 및 433)사이의 접점에 위치한 lgG 히스티딘은 FcRn 수용체에 대해 pH 의존적 결합에 기여하는 것이 공지되어 있다 (Raghavan, 등, Biochemistry 34(45): 14649-57 (1995)). 또한 lle 253 및 His 435 및 436 (Kim 등, Eur. J. immunol. 34: 2429-34 (1994)) 및 잔기 309 (래트, 설치류 및 인간 lgG 내 Leu, Val, Gln 또는 Met) 및 311 (래트, 설치류 및 인간 lgG 내 Gln 또는 Arg) (Kabat 등, in: Sequences of proteins of immunological interest. US Department of Health and Human Services, Bethesda, MD, USA (1991)) 는 FcRn 수용체와의 상호작용을 형성하는 것으로 보인다. 따라서, 본 발명의 목적은 FcRn 수용체 결합에 관여하는 도메인에서 하나 이상의 아미노산에서 돌연변이, 결실 또는 삽입을 갖는 생체내 순환 반감기가 향상된 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, GCR 융합 단백질은 lgG1 의 Fc 부분을 포함하며, 여기에서 상기 돌연변이는 하기와 같다: 위치 253 는 lle 가 아니고, 위치 309 는 Leu, Val, Gln 또는 Met 가 아니며, 위치 310 은 His 가 아니고, 위치 311 은 Gln 또는 Arg 가 아니며, 위치 433 은 His 가 아니고, 위치 435 는 His 가 아니며, 위치 436 은 His 가 아니다.
본 발명에 따른 상기 및 기타 변이 단백질은 Fc 수용체에 대한 향상된 결합, 향상된 안정성, 향상된 정확한 활성 형태의 채택, 향상된 약동학 특성, 향상된 합성 또는 기타 이로운 특징을 구축할 수 있다. GCR 융합 단백질을 향상시키기 위한 특정의 방법은 부위 특이적 돌연변이 기술을 이용하는 것이다. 다양한 부위 특이적 돌연변이 기술이 이용가능하며, 유사한 결과를 달성하기 위한 대안으로서 사용할 수 있음에 주목하는 것이 중요하다. 이러한 기술들에서 선택하기 위한 전략은 분자 생물학 분야의 당업자에게는 주지되어 있다. 마찬가지로, 표적 DNA 의 랜덤 및 반랜덤 돌연변이를 달성하는 다양한 기술이 존재한다. 이러한 기술 또한 분자 생물학 분야의 당업자에게는 주지되어 있다.
본 발명에 따른 lg 분자 및 GCR 형 단백질은 또한 링커 분자에 의해서 연결될 수 있으며, 아미노산 링커는 다양한 길이이다. 본 발명의 링커(L) 는 또한 프로테아제 절단 부위를 가질 수 있는 후술된 바와 같은 링커 분자이다.
펩티드 링커는 종종, 예컨대, 글리신 및/또는 세린과 같은 일련의 펩티드이다. 바람직하게는, 펩티드 링커는 약 5 - 25, 바람직하게는 10 - 20 잔기 길이의 글리신 및 세린 펩티드의 혼합열이다. 단백질분해 절단성 링커, 특히 카텝신과 같은 라이소좀 프로테아제로 절단가능한 링커가 특히 바람직하다.
바람직한 아미노산 링커 L 을 사용하며 하기의 서열을 포함한다:
1. Ala Ala Ala
2. Ala Ala Ala Ala,
3. Ala Ala Ala Ala Ala,
4. Ser,
5. Ser Ser,
6. Gly Gly Gly,
7. Gly Gly Gly Gly,
8. Gly Gly Gly Gly Gly,
9. Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly,
10. Gly Pro Gly,
11. Gly Gly Pro Gly Gly,
12. Gly Gly Gly Gly Ser, 및, 만일 링커가 프로테아제 절단 부위를 가져야 하면
13. Gly Gly Tyr Leu
14. Gly Gly Tyr
15. Gly Phe Ala Leu
16. Gly Pro Arg Leu 및
17. 서브부분 1-16 의 임의의 조합
추가의 적합한 링커는 문헌 [Robinson 등, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 95, 5929]에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용하는, “단백질분해 절단성 부위”는 단백질 분해 효소 또는 기타 단백질 분해 절단제에 의해서 우선적으로 절단되는 아미노산 서열을 의미한다. 단백질분해 절단성 부위엔 단백질 분해 효소, 특히 카텝신 또는 기타 라이소좀 프로테아제에 의해서 인식되는 아미노산 서열이 포함된다.
본 발명의 또 하나의 목적은 GCR 융합 단백질을 구축하는 것이며, 전 항체가 사용된다. 이러한 융합 분자는 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 및 특이적 항원에 결합하는 에피토프를 포함한다. 예컨대, GCR 은 항체 중사슬의 C-말단에 융합된다. 전 항체 융합 단백질을 코딩하는 DNA 구축물은 전술한 바와 같이 구축될 수 있다 (Gillies 등. [1991] Hybridoma 10:347-356).
본 발명은 또한 상기에 개시 및 청구항에 기술된 임의의 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자에 관한 것이다.
바람직한 구현예로서, 하기를 포함하는 청구항 및 상기에서 정의된 바와 같은 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자가 개시되어 있다 :
(a) 시그널/리더 서열
(b) lg분자의 서열
(c) GCR 의 생물학적 활성을 갖는 표적 단백질 서열.
전술한 바와 같은 본 발명의 시그널 서열은 소포체의 막을 가로지르는 단백질의 이송을 개시시키는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명에서 유용할 시그널 서열에는 항체 경사슬 시그널 서열, 예컨대, 항체 14.18 (Gillies et. al., Jour. of Immunol. Meth., 125:191, (1989)), 항체 중사슬 시그널 서열, 예컨대, MOPC141 항체 중사슬 시그널 서열 (Sakano 등, Nature 286:5774(1980)), 및 당해기술 분야에 공지된 임의의 기타 시그널 서열 (참조, 예컨대, Watson, Nucleic Acids Research 12:5145, (1984))이 포함된다. 이러한 참조문헌의 각각은 여기에 참조로 포함되어 있다. 시그널 서열은 당해 기술 분야에 잘 특징화되어 있고, 통상적으로 16 내지 30 개의 아미노산 잔기를 포함하는것으로 공지되어 있으며, 이보다 많거나 적은 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 통상적인 시그널 펩티드는 세개의 영역으로 구성된다: 기초 N-말단 영역, 중앙 소수성 영역 및 좀더 극성인 C-말단 영역. 중앙 소수성 영역은 초기 폴리펩티드의 이송동안 막 지질 이중층을 가로지르는 시그널 펩티드를 앵커하는 4 내지 12 개의 소수성 잔기를 포함한다. 개시후, 시그널 펩티드는 통상적으로 시그널 펩티다제로 공지된 세포성 효소에 의해서 소포체의 내강내에서 절단된다.
시그널 펩티드의 잠재적 절단 부위는 통상적으로 “(-3, -1) 룰”을 따른다. 따라서 통상적인 시그널 펩티드는 위치 -1 및 -3 에서 작은, 중성 아미노산 잔기를 가지며, 상기 영역에서 프롤린 잔기가 결핍되어 있다. 시그널 펩티다제는 -1 및 +1 아미노산 사이에서 상기의 시그널 펩티드를 절단할 것이다. 따라서, 분비동안 융합 단백질의 아미노 말단으로부터 시그널 서열을 코딩하는 DNA 의 부분이 절단될 수 있다. 이는 lg 영역 및 표적 단백질로 구성된 융합 단백질의 분비를가져온다. 시그널 펩티드 서열의 상세한 토의는 von Heijne 에 의해 제공되었다 (Nucleic Acids Res., 14:4683,(1986)). 당업자에게는 명백한 바와 같이, 분비 카세트용 특정 시그널 서열의 적합성에는 일부 루틴 실험이 요구될 수 있다. 시그널 서열은 또한 “시그널 펩티드”, “리더 서열” 또는 “리더 펩티드”로 불리우며, 시그널 서열에 대한 동일한 의미를 갖는 상기 용어의 각각을 본 명세서에서 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 표적 단백질, 즉 GCR 융합 단백질의 발현을 촉진하는 상기 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용하는, “벡터”는 숙주 세포에 도입되고, 숙주 세포 게놈과 재조합 및 통합되거나 에피좀으로 자가적으로 복제하는데 적합한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터에는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 포함된다. 바이러스 벡터의 비제한적 예에는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노관련 바이러스가 포함된다. 본 명세서에서 사용하는, “표적 단백질의 발현”은 DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 정확한 활성 형태로 폴딩된 단백질 생성물의 분비를 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명에 따라, 본 출원에서 정의된 바와 같은 융합 단백질을 발현시키는데 적합한 진핵생물, 바람직하게는 포유류의 숙주 세포를 사용한다. 상기 벡터로 상기 숙주 세포를 트랜스펙션시키는 방법, 본 발명의 융합 단백질을 발현, 정제 및 단리시키는 방법은 당해기술에 공지되어 있다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 하기를 포함한다 :
(i) 분비용 리더 서열, lg 부분, GCR, GCRm또는 GCRtrunc부분 및 임의적으로 lg 및 GCR 부분사이의 링커 서열을 포함하는 전구체 단백질을 코딩하는 DNA 의 구축.
(ii) 적당한 발현 벡터에 상기 융합 DNA 의 배치
(iii) 진핵생물 세포에서의 상기 융합 단백질의 발현 및
(iv) 상기 분비된 융합 단백질의 정제.
본 발명은 또한 하나 이상의 상기 및 하기에 정의된 바와 같은 GCR 융합 단백질, 바람직하게는 lgG 의 Fc 부분이 이의 C-말단 아미노산에서 펩티드 결합에 의해서 GCR 형 단백질의 N-말단 아미노산에 연결된 융합 단백질을 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 부형제와 함께 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 약학적 조성물은 임의적으로 GCR 결핍 질병을 공동으로 치료하는데 유용한 기타 약물 또는 의약을 포함할 수 있다.
이러한 약학적 조성물은 정맥내, 피하, 근육내, 동소 주사액, 동소 주입액, 또는 경구, 폐, 비강, 경피 또는 기타 투여 형태일 수 있다. 투여는 연속적 주입, 연동 전달, 식괴 주입 등에 의해 주기적 단위 용량으로 수행할 수 있다.
통상적으로, 본 발명의 유효량의 단백질 또는 유도체 생성물과 함께 약학적으로 허용가능한 희석제, 방부제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체를 함유하는 약학적 조성물이 본 발명에 포함된다. 이러한 조성물에는 다양한 버퍼 내용물 (예컨대, Tris-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도의 희석제; 세척제 및 가용화제와 같은 첨가제 (예컨대, Tween 80, Polysorbate 80), 산화방지제 (예컨대, 아스코르브산, 소듐 메타비술파이트), 방부제 (예컨대, Thimersol, 벤질 알코올) 및 벌킹 물질 (예컨대, 락토오스, 만니톨)이 포함된다. 상기 및 하기에기재된 용어 “비경구”에는 피하, 정맥내, 관절내 및 기관내 주사 및 주입기술이 포함된다. 비경구 투여가 바람직하다.
본 명세서에서 사용하는 용어 “약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제”는 활성화합물 또는 환자와 역반응을 일으키지 않sms 불활성, 비독성 액체 충전제, 희석제, 용매 또는 용액을 의미한다. 살균수, 염수, 수성 덱스트로스, 당용액, 에탄올, 글리콜 및 석유, 동물유, 식물유 또는 합성유를 포함한 오일과 같은 적합한 액체 담체가 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 제형물은 또한 비경구 투여에 통상적인 보조제 또는 비히클을 포함할 수 있다.
상기 적합한 제형물과 관련하여서는, 본 발명의 융합 단백질은 종국적으로 변화된 가용성을 보이는 임의의 비독성, 유기 또는 무기산과의 약학적으로 허용가능한 염을 형성시킬 수 있음에 주목하여야 한다. 무기산은, 예컨대, 염산, 황산 또는 인산 및 소듐 모노히드로겐 오르토포스페이트 및 포타슘 히드로겐 술페이트와 같은 산금속염이다. 유기산의 예는 모노, 디 및 트리 카르복실산, 예컨대 아세트산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산 및 술폰산이다. 카르복시 말단 아미노산 부분의 염에는 임의의 적합한 무기 또는 유기염기와 형성된 비독성 카르복실산염이 포함된다. 이러한염에는, 예컨대, 나트륨 및 칼륨과 같은 알칼리 금속, 칼슘 및 마그네슘과 같은 알칼리 토금속, 및 트리알킬아민과 같은 유기 일차, 이차 및 삼차 아민이 포함된다.
통상적으로, 고셰병, 테이삭스병 또는 파브리병과 같은 당지질 저장 장애의 치료를 위한 GCR 융합 단백질의 투여량은 0.01 mg 내지 25 mg, 바람직하게는 약 0.1 내지 2 mg, 좀더 바람직하게는약 0.1 내지 1 mg/kg(체중)/일이다. 유효 투여량은 종래기술에 공지된 진단 툴을 이용하여 측정할 수 있다. 통상적으로, 상기 범위내에서 주어진 환자에 대한 최적의 치료학적으로 허용가능한 투여량 및 투여 속도는 다양한 요소, 예컨대, 사용하는 특정 활성 물질의 활성, 연령, 체중, 일반적 건강, 성, 식이, 투여 시간 및 경로, 제거 속도 또는 치료의 목적에 좌우된다. 당업자는 투여 및 목적하는 치료적 효과를 관찰하여 유효한 투여량을 확인할 수 있을 것이다. 투여량은 또한 치료적 이점이 나타날때까지, 상대적으로 높은 투여량을 초기에 사용하고, 치료적 이점을 유지시키기 위해서는 낮은 투여량을 사용함으로써 치료의 과정동안 변화시킬 수 있다.
본 발명은 GCR 융합 단백질 치료에 의한 고셰병, 파브리병 및 테이삭스병과 같은 다양한 당지질 저장 장애의 치료를 위한 치료 방법 및 치료 시스템 및 상기 질병에 관련된 효소에 관한 것이다.
치료 방법에는 단계의 면에서 본 발명을 실시하기 위한 다양한 양식이 포함된다. 예컨대, GCR 융합 단백질은 혼합후, 즉, 동시에 투여하거나, 기타 약물 및/또는 첨가제, 예컨대, 비타민과 순차적으로 투여하거나, 단일 의약으로 투여할 수 있다. 더욱이, 첨가제 및/또는 추가 약물 및 융합 단백질은 0 내지 3 주의투여사이의 시간 간격, 즉, 실제적으로 첫번째 활성 약물의 투여 직후에서부터 첫번째 약물의 투여후 3 주 이하 까지 별도로 투여할 수 있다. 추가적으로, 순서는 변화시킬 수 있다, 즉, 첨가제 및/또는 추가 약물은 융합 단백질의 투여전에 투여하거나, 투여는 역순으로 실시할 수 있음을 생각할 수 있다.
또 하나의 구현예로서, 본 발명은, 예컨대, 비장의 일부 또는 전부가 제거되는 외과수술 방법과 함께 수행할 수 있을 것으로 생각된다. 이와 관련하여, 상기 방법은 외과수술후에 수행될 수 있다. 이와 달리, 외과 수술은 활성 약물의 투여사이 동안 수행할 수 있다. 이러한 방법의 예는 본 발명의 방법과 외과 비장 제거수술의 조합이다.
본 발명에 따른 치료는 통상적으로 투여의 1 사이클 이상에서 활성 약물의 투여를 포함한다. 예컨대, GCR 융합 단백질 단독으로 또는 동시에 투여하는 경우, 지질 저장 질병 약물만 또는 전술한 약물 및 첨가제 및/또는 기타 약물을 함유하는 치료학적 조성물은 단일 사이클동안 약 2 일 내지 약 3 주 동안 투여한다. 이후, 치료 사이클을 의사의 판단에 따라 필요한 경우 반복할 수 있다. 마찬가지로, 두개의 상이한 약물의 순차적 적용을 생각하는 경우, 투여시간은 통상적으로 동일한 시간 기간을 포함할 것이다. 사이클 사이의 간격은 약 0 내지 2 달일 수 있다.
또 하나의 구현예로서, 본 발명은 보조적 치료법으로서 골수 이식, 또는 당지질의 중요한 저장 부위 역활을 하는 기관, 예컨대, 비장을 제거하거나 또는 당지질 저장 장애를 겪는 사람의 예비 효소 증대 치료에 의한 성공적인 유전자 치료를위한 외과 수술과 조합하여 전술한 바와 같은 일정량의 GCR 융합 단백질을 함유하는 치료 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 고셰병의 치료방법을 기술한다.
효소 치환 또는 증대 치료에 의한 본 발명에 따른 질병중의 하나의 보조 치료의 경우에서, 융합 단백질의 투여는 다른 수술, 즉, 0 내지 3 주의 수술 및 융합 단백질의 투여사이의 시간 간격으로 투여되는 외과수술, 즉, 골수 이식과 같은 수술의 실제적인 투여 직후부터 또는 활성 약물이 투여된 후 3 주까지 활성 약물의 수술이 별도로 행해질 수 있다. 추가적으로, 순서는 변할 수 있다, 즉, 융합 단백질은 골수 이식 또는 외과수술전에 투여되거나, 또는 투여는 역순으로 행해질 수 있음을 생각할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법을 수행하는데 필요한 시약을 제공하는 팩키징 및/또는 키트를 포함하는 시스템을 계획한다. 따라서, 키트는 하기를 포함하는 팩키지를 포함하는 당지질 저장 장애의 치료를 위해 기재된다 :
a) 전술한 바와 같은 일정량의 GCR 융합 단백질을 포함하는 치료학적 조성물
b) 임의적으로 전술한 질병의 치료를 위한 첨가제 또는 보조 약물; 및
c) 고셰병, 테이삭스병 또는 파브리병을 치료하기 위한 방법에서 시약의 이용에 대한 지시사항.
본 발명이 키트내 시약은 통상적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료학적 조성물로 제형화되므로, 키트내 분배에 적합한 다양한 임의의 형태일 수 있다. 이러한 형태에는 액체, 분말, 정제, 현탁액 등 본 발명의 융합 단백질 및 임의적으로 보조 약물 및/또는 첨가제를 제공하는 제형물이 포함될 수 있다. 시약은 본 발명의 방법에 따라 별도로 투여하기에 적합한 별개의 용기에 제공하거나, 이와 달리 패키지내 단일 용기내 조성물에 조합하여 제공될 수 있다.
패키지는 본 명세서에 기재된 치료 방법에 따라 시약의 1 회 이상 투여하는데 충분한 양을 포함할 수 있다. 통상적으로, 패키지는 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료의 1 사이클에 충분한 양을 포함할 것이다.
본 발명의 키트는 또한 패키지내 포함된 물질의 "사용 지시사항"을 포함한다. 이 지시사항은 본 방법에 따른 당지질 저장 장애를 치료하기 위한 융합 단백질 및/또는 임의적으로 보조 약물 및/또는 첨가제의 사용에 관한 것이다. 이 방법이 질병의 양태 및 유형, 환자 및 질병의 상태에 따라 광범위하게 변할 수 있는 한, 지시사항은 투여 절차를 특정하기 위하여 변할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 방법에 따른 융합 단백질의 사용과 관련된 특정성 이외의 지시사항의 종류에 관해서는 제한적이지 않다.
서열 정보
하기 아미노산 서열을 본 발명에서 사용하였다.
SEQ ID NO:1인간 라이소좀 GCR 아미노산 서열 (1 문자 코드)
SEQ ID NO:2인간 lgG1 Fc 영역 - 성숙한 단백질 코딩 서열 (1 문자 코드)
SEQ ID NO:3인간 lgG2 Fc 영역 - 성숙한 단백질 코딩 서열 (1 문자 코드)
하기 실시예는 본 발명을 제한함이 없이 상술한다.
실시예 1
인간 Fc-GCR 의 발현
GCR 의 성숙한 형태를 코딩하는 서열은 표준 기술에 의해서 올리고뉴클레오티드로부터 완전하게 합성할 수 있다.
합성된 DNA 는 5' 말단에 Xmal-호환성 오버행 및 3' 말단에 Xhol-호환성 오버행을 갖도록 조작하였다.
DNA 를 클로닝시키고, 서열분석으로 돌연변이없이 성숙한 GCR 단백질을 코딩하는지 확인하였다.
발현 벡터 pdCs-FC-GCR 는 하기와 같이 구축하였다. GCR cDNA 를 포함하는 Xmal-Xhol 제한 단편을 Lo 등 [Protein Engineering (1998) 11:495]에 따라 pdCs-Fc 벡터의 Xmal-Xhol 의 단편에 연결하였다. 생성된 벡터, pdCs-Fc-GCR, 을 사용하여 Fc-GCR 발현을 위한 포유류 세포를 트랜스펙션시켰다. 이 벡터는 인간 임뮤노글로불린 감마 1 사슬 Fc-영역을 발현시킨다.
Fc 단백질 부분은 또한 통상적으로 글리코실화 부위를 포함한다. 이 부위는 표준 방법으로 비글리코실화 서열로 임의적으로 변화시킬 수 있다.
실시예 2
Fc-GCR 융합 단백질의 트랜스펙션 및 발현
일시적 트랜스펙션을 위해, 플라스미드를 BHK 세포에 도입시켰다. 이 세포를 칼슘 포스페이트와 플라스미드 DNA 의 공침강 [Sambrook 등. (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor, NY] 또는 공급자의 프로토콜에 따라 Lipofectamine Plus (Life technologies, Gaithersburg, MD)를 이용한 리포펙션으로 트랜스펙션시켰다.
안정한 세포주를 생성시키기 위하여, NS/0 세포를 일시적 트랜스펙션 및 안정한 세포주의 발생 모두에 사용하였다.
안정하게 트랜스펙션된 클론을 수득하기 위하여, 플라스미드 DNA 를 전기천공으로 세포에 도입시켰다. 약 5 x 106세포를 PBS 로 1 회 세정하고, 0.5 ml PBS에 재현탁시켰다. 이어서, 10㎍ 의 선형화 플라스미드 DNA 를 빙상의 Gene Pulser Cuvette (0.4 cm 전극갭, Bio Rad)에서 세포와 함께 10 분간 인큐베이션시켰다. 전기천공을 0.25 V 및 500 microF 에 세팅하여 Gene Pulser (Bio Rad, Hercules, CA)을 이용하여 수행하였다. 세포를 빙상에서 10 분간 회복시킨후 , 이것을 성장 배지에 재현탁시키고, 이어서 96 웰 플레이트에 도포하였다. 안정하게 트랜스펙션된 클론을 트랜스펙션 2 일후 도입시킨 100 nM 메토트렉사이트 (MTX) 의 존재하 성장으로 선별시켰다. 이 세포를 2 내지 3 회 더 매 3 일마다 영양 공급하였고, MTX 내성 클론이 2 내지 3 주후 출현하였다. 클론유래의 상층물을 항 Fc ELISA 로 분석하여 높은 생산 클론을 확인하였다. 고 생산 클론을 단리하여 100 nM MTX 함유 성장 배지에서 증식시켰다.
BHK 및 NS/0 세포를 10% 소태아 혈청, 2 nM 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 개질 이글 배지에서 성장시켰다.
겔 전기영동에 의한 루틴 특징화를 위해, 조건화 배지내 Fc 융합 단백질을 Protein A Sepharose (Repligen, Cambridge, MA)에 포획시킨후, 2- 머캅토에탄올과 함께 또는 부재하 단백질 시료 버퍼에서 끓여 용출시켰다. SDS-Gel 상에서 전기영동시킨후, 단백질 밴드를 쿠마시 염색으로 가시화시켰다. 정제를 위하여, Protein A Sepharose 상에 결합된 융합 단백질을 소듐 포스페이트 버퍼 (100 mM NaH2PO4, pH 3 및 150 mM NaCl)에서 용출시켰다. 이어서 용출물을 즉시 0.1 부피의 2 M Tris-HCl (pH 8) 로 중화시켰다.
실시예 3
카르보히드레이트 특징화
엔도글리코시다제-H 를 100 mM 소듐 아세테이트, pH 6.0 에, 10 단위/ml 의 최종농도로 용해시켰다. N-글리카나제를 250 단위/ml 현탁액으로 50% 글리세롤에 공급하였다. 인간 태반 효소 또는 GCR 활성을 포함하는 50 ㎕ 분취량의 데실-아가로오스 분획을 0.5% SDS/1M β-머캅토에탄올로 조정시켜 2 분간 끓였다. 이어서 시료를 적당한 버퍼, 200 mM 소듐아세테이트, pH 6.0 (엔도글리코시다제-H 에 대하여) 또는 200 mM 소듐 포스페이트, pH 8.5 (N-글리카나제에 대하여)로 0.1% SDS, 0.7% NP-40 및 0.02M β-머캅토에탄올의 최종 조성으로 희석시켰다. 시료를 다시 1 분간 끓인후 엔도글리코시다제-H 또는 N-글리카나제를 50 mu/ml 또는 20U/ml 의 최종농도로 각각 첨가하였다. 분해를 37℃ 에서 약 16 시간동안 수행하였다. 카르복시펩티다제 Y 를 양 탈글리코실화 반응에 대한 대조군으로 사용하였다.
실시예 4
아미노산 서열 분석:
아미노산 서열 분석용 시료를 전술한 바와 같이 SDS-Gel 상에서 전기영동적으로 분획화시킨 후, Matsudaira (J.B.C. 262:10035,1987)에 의해 기재된 바와 같이 PVDF 막으로 옮겼다. 통상적으로, 전기영동후 겔은 트랜스블로팅 (50 ma, 4 시간) 전 10 분간 트랜스퍼 버퍼 (0.1M CAPS, 10% 메탄올, pH 11.0)에서 인큐베이션시켰다. 이어서 겔을 HPLC 등급수로 5 분간 세정시키고, 0.1% 쿠마시 블루 R250 (50% 메탄올중)으로 5 분간 염색시키고, 최종적으로 50% 메탄올-10% 아세트산으로 10 분간 탈염시켰다. PVDF 막을 다시 HPLC 등급수로 세정시키고, 질소기류하 건조시키고, 아미노산 서열분석 사용전까지 -20℃ 에서 밀봉백에 저장시켰다.
아미노산 서열 분석은 Model 120A 온라인 PTH-아미노산 분석기가 장착된 Applied Biosystems Model 470A 기상 서열분석기를 이용하여 수행하였다. 프로그램 03R PTH 를 폴리브렌으로 막 스트립을 예비처리하지 않고 서열분석에 직접 사용하였다. 목적하는 단백질 밴드를 포함하는 약 2 x 8mm 조각의 PVDF 막을 절단하여, 테플론 씰의 중앙에 위치시키고, 서열분석기의 카트리지 블록에 위치시켰다. PVDF 막의 다중 스트립은 상기 방식으로 쌓을 수 있으며, 이에 따라, 서열분석에 이용할 수 있는 단백질의 양을 증가시킬 수 있다. 재조합 GCR 의 서열분석에 대한 초기 및 반복 수율은 100 피코몰의 인간 태반 GCR 을 전기영동시키고, PVDF 에 트랜스블로팅시키며 아미노산 서열의 10 회 사이클링후 수득된 수율과 비교하여 계산하였다.
성숙한 인간 태반 GCR 의 N-말단 아미노산 서열은 텍스트에 기술된 방법을 이용하여 재조합 인간 GCR 의 N-말단 아미노산 서열과 비교하였다. 성숙한 인간 및 재조합 GCR 의 직접적인 화학적 서열분석에 의해 결정된 N-말단 아미노산은 동일하였으며, 이는 재조합적으로 생산된 효소의 시그널 서열이 정확하게 프로세싱되었음을 나타낸다.
실시예 5
GCR 분석:
pH 프로필 및 억제 연구를 위해, GCR 활성을 0.15% Triton X-100, 2.5 ㎕ 의 β-D-1-14C-글루코세레브로시드 (50 mg/ml 의 소듐 타우로콜레이트중의 7.5 mg/ml), 및 총 부피 200 ㎕ 의 시료를 함유하는 100mM 포타슘 포스페이트 버퍼를 이용하여 측정하였다. 콘두리톨-B-에폭시드와 함께 예비인큐베이션을 37℃ 에서 30 분간 수행하였다. Km 측정을 위해, β-글루코시다제 활성을 0.15% Triton X-100 및 0.125% 소듐 타우로콜레이트를 함유하는 100mM 포타슘 포스페이트 버퍼중의 인공 기질 4-메틸움벨리페리-β-D-글루코피라노시드 (4MUGP) 를 이용하여 pH 5.9 에서 분석하였다. 또한 재조합 GCR 의 정제는 4MUGP 를 이용하여 모니터링하였다.
본 명세서에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며,이의 견지에서 다양한 수정 또는 변화가 당업자에게는 시사되며, 본 출원의 취지 및 범위 및 첨부된 청구항의 범위내에 포함됨을 알 수 있다.
기타 용도는 본 개시의 견지에서 당업자에게는 명백할 것이다.

Claims (25)

  1. 주로 임뮤노글로불린 분자 (Ig) 또는 이의 단편 및 비임뮤노글로불린 분자로 구성된 융합 단백질로서, 비임뮤노글로불린 분자는 글루코세레브로시다제 (GCR 형 단백질)의 생물학적 활성을 갖는 단백질인 융합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서, lg 분자가 Fc 수용체에 대한 특이성을 갖는 융합 단백질.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, lg 분자는 이의 C-말단에 의해 GCR 형 단백질의 N-말단에 공유결합되는 융합 단백질.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 링커 분자는 lg 분자와 GCR 형 단백질 사이에 융합되는 융합 단백질.
  5. 제 4 항에 있어서, 링커 분자는 프로테아제 절단 부위를 포함하는 융합 단백질.
  6. 제 5 항에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 라이소좀 프로테아제에 특이적인 융합 단백질.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서, GCR 형 단백질은 GCR 인 융합 단백질.
  8. 제 7 항에 있어서, GCR 은 절단된 (GCRtrunc) 또는 돌연변이된 (GCRm) 융합 단백질.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, GCR 또는 GCR 형 단백질은 변형된 글리코실화 패턴을 갖거나 비글리코실화된 융합 단백질.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 있어서, lg 분자는 Fc 부분인 융합 단백질.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 있어서, lg 분자는 전 항체인 융합 단백질.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 있어서, lg 분자 또는 이의 단편은 디자인된 융합 단백질.
  13. 제 12 항에 있어서, lg 분자는 FcRn 수용체에 대한 감소된 친화성을 갖는 융합 단백질.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질내의 lg 분자는 다이머화된 융합 단백질.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항중 어느 한 항의 융합단백질을 코딩하는 DNA 서열.
  16. 하기를 포함하는, 제 1 항 내지 제 14 항중 하나 이상의 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자:
    (a) 시그널/리더 서열
    (b) lg 분자
    (c) GCR 의 생물학적 활성을 갖는 표적 단백질 서열.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항의 DNA 를 포함하는 발현 벡터.
  18. 제 17 항의 벡터를 포함하는 제 1 항 내지 제 14 항중 하나 이상의 항에 정의된 융합 단백질을 발현시키는데 적합한 숙주 세포.
  19. 하기의 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 14 항중 하나 이상의 항에 따른 융합 단백질을 생산하는 방법 :
    (i) 분비용 리더 서열, lg 분자, GCR, GCRm또는 GCRtrunc부분 및 임의적으로 링커-서열을 포함하는 전구체 단백질을 코딩하는 DNA 를 구축하는 단계,
    (ii) 상기 융합된 DNA 를 적당한 발현 벡터에 넣는 단계,
    (iii) 진핵생물 세포에서 상기 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및
    (iv) 상기 분비된 융합 단백질을 정제하는 단계.
  20. 제 1 항 내지 제 14 항중 하나 이상의 항에 따른 융합단백질 및 하나이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 약학적으로 유효한 약물 및/또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물.
  22. 당지질 저장 장애의 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 제 1 항 내지제 14 항중 어느 한 항의 융합 단백질의 용도.
  23. 제 22 항에 있어서, 당지질 저장 장애는 고셰병, 파브리병 및 테이삭스병으로 구성된 군에서 선택되는 용도.
  24. 제 16 항 또는 제 17 항에 따른 약학적 조성물을 상기 질병의 환자에게 투여하는 것을 포함하는 당지질 저장 장애의 치료 방법.
  25. 제 18 항에 있어서, 당지질 저장 장애는 고셰병, 파브리병 및 테이삭스병으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
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