ES2342964T3 - Variantes de la interleucina-7 con inmunogenicidad reducida. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido, que comprende una molécula modificada de la IL-7 humana o una porción activa de la misma, que tiene un epitopo de las células T modificado para reducir una respuesta de las células T anti-IL-7, comprendiendo dicho polipéptido, así mismo, una porción Fc de una molécula de inmunoglobulina fusionada, a través de su extremo C, con el extremo N de dicha molécula modificada de la IL-7, siendo seleccionada dicha molécula Fc-IL7 fusionada entre el grupo que comprende: (i)la huFcy2(h)(FN>AQ) - L - IL-7(F39P, F57N, L128S), siendo Fcy2(h) una porción de Fc humano con una bisagra de IgG1 y dominios CH2 y CH3 de IgG2, que comprende las mutaciones F296A y N297Q, siendo L un segmento enlazador, que tiene la secuencia GGGGSGGGG, y siendo IL-7(F39P, F57N, L128S) la IL-7, que contienen las mutaciones F39P, F57N, y L128S; teniendo dicha molécula la secuencia que está representada en la figura 31; (ii)la huFcy2(h)(FN>AQ) - L - IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S), siendo Fcy2(h) una porción de Fc humano con una bisagra de IgG1 y dominios CH2 y CH3 de IgG2, que comprende las mutaciones F296A y N297Q, siendo L un segmento enlazador, que tiene la secuencia GGGGSGGGG, y siendo IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S) la IL-7, que contiene las mutaciones F39P, F57N, L77D y L128S; teniendo dicha molécula la secuencia que esta representada en la figura 32; (iii)huFcy2(h) - L - IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S), siendo Fcy2(h) una porción de Fc humano con una bisagra de IgG1 y dominios CH2 y CH3 de IgG2, siendo L un segmento enlazador, que tiene la secuencia GGGGSGGGG, y siendo IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S) la IL-7, que contiene las mutaciones F39P, F57N, L77D y L128S; teniendo dicha molécula la secuencia que está representada en la figura 33; y (iv)huFcy2(h) - L - IL-7(F39P, F57N, L128S), siendo Fcy2(h) una porción de Fc humano con una bisagra de IgG1 y dominios CH2 y CH3 de IgG2, siendo L un segmento enlazador, que tiene la secuencia GGGGSGGGG, y siendo IL-7(F39P, F57N, L128S) la IL-7, que contiene las mutaciones F39P, F57N, y L128S; teniendo dicha molécula la secuencia que ha sido representada en la figura 34.
Description
Variantes de la interleucina-7
con inmunogenicidad reducida.
El campo de la invención se refiere, de manera
general, a moléculas de la interleucina-7
(IL-7) modificadas con objeto de reducir su
inmunogenicidad. De la misma manera, estas moléculas incluyen
proteínas de fusión, que comprenden dichas moléculas de la
IL-7 modificadas y moléculas de inmunoglobulina o
porciones de las mismas, que corresponden, de manera especial, a
proteínas de fusión Fc.
\vskip1.000000\baselineskip
Las citocinas son estimuladores del sistema
inmune y, por lo tanto, son adecuadas como fármacos. Por ejemplo,
el interferón-alfa (IFN-\alpha),
el interferón-beta (IFN-\beta), la
interleucina-2 (IL-2) y el factor
estimulante de las colonias de granulocitos/macrófagos
(GM-CSF) son, todos ellos, fármacos aprobados, que
son empleados para el tratamiento de las infecciones víricas, del
cáncer, de la desregulación del sistema inmune tal como las
enfermedades autoinmunes y para promover el restablecimiento del
sistema inmune después de una quimioterapia contra el cáncer.
Infelizmente, estas proteínas pueden estimular una respuesta inmune
contra sí mismas, provocando que los pacientes desarrollen
anticuerpos contra la proteína terapéutica. De la misma manera,
estos anticuerpos pueden inhibir la función de la misma proteína
producida por vía endógena en el paciente, dando como resultado
consecuencias potenciales a largo plazo para la salud del
paciente.
La interleucina-7 es una
citocina que promueve la supervivencia y la proliferación de las
células T, de las células B y de otras células inmunitarias. Por lo
tanto, es una proteína potencialmente terapéutica para tratar
pacientes, cuyo sistema inmune haya sido dañado por la quimioterapia
contra el cáncer, por la infección HIV o por otras enfermedades,
desórdenes o exposiciones a productos químicos. Recientemente, han
sido publicados ensayos con animales, que muestran el uso de la
administración de la IL-7. Se supone que la
IL-7 puede corregir la linfopenia de las células T
en cáncer y que reduce las tasas de metástasis en ratones. De la
misma manera, los primates expuestos al virus de la
inmunodeficiencia de los simios SIV muestran una renovación de las
células T sin aumento de la replicación vírica. En el último caso,
se ha administrado la IL-7 humana recombinante a
babuinos, sin que hayan sido observadas reacciones adversas de
anticuerpos (Alpdogan and van den Brink, (2005) Trends in Immunol.,
26(1):56-64; Storek et al., (2003)
Blood, 101(10):4209-4217). Sin embargo, en
base a sus propiedades inmunoestimulantes, se espera que la
administración terapéutica de la IL-7 induzca una
respuesta de anticuerpos contra sí misma. Por consiguiente, existe
la necesidad en el estado de la técnica de mejorar versiones de la
IL-7, que sean menos inmunogénicas, pero que
retengan la propiedad de estimular al sistema inmune.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención está dirigida a un
polipéptido, que comprende una molécula modificada de la
IL-7 humana o una porción activa de la misma, que
tiene un epitopo de las células T modificado para reducir una
respuesta de las células T
anti-IL-7, comprendiendo dicho
polipéptido, así mismo, una porción Fc de una molécula de
inmunoglobulina fusionada, a través de su extremo C, con el extremo
N de dicha molécula modificada de la IL-7, siendo
seleccionada dicha molécula Fc-IL7 fusionada entre
el grupo que comprende:
- (i)
- la huFcy2(h)(FN>AQ) - L - IL-7(F39P, F57N, L128S),
- \quad
- siendo Fcy2(h) una porción de Fc humano con una bisagra de IgG1 y dominios CH2 y CH3 de IgG2, que comprende las mutaciones F296A y N297Q, siendo L un segmento enlazador, que tiene la secuencia GGGGSGGGG, y siendo IL-7(F39P, F57N, L128S) la IL-7, que contienen las mutaciones F39P, F57N, y L128S; teniendo dicha molécula la secuencia que está representada en la figura 31;
- (ii)
- la huFcy2(h)(FN>AQ) - L - IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S),
- \quad
- siendo Fcy2(h) una porción de Fc humano con una bisagra de IgG1 y dominios CH2 y CH3 de IgG2, que comprende las mutaciones F296A y N297Q, siendo L un segmento enlazador, que tiene la secuencia GGGGSGGGG, y siendo IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S) la IL-7, que contiene las mutaciones F39P, F57N, L77D y L128S; teniendo dicha molécula la secuencia que esta representada en la figura 32;
- (iii)
- huFcy2(h) - L - IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S),
- \quad
- siendo Fcy2(h) una porción de Fc humano con una bisagra de IgG1 y dominios CH2 y CH3 de IgG2, siendo L un segmento enlazador, que tiene la secuencia GGGGSGGGG, y siendo IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S) la IL-7, que contiene las mutaciones F39P, F57N, L77D y L128S; teniendo dicha molécula la secuencia que está representada en la figura 33; y
- (iv)
- huFcy2(h) - L - IL-7(F39P, F57N, L128S),
- \quad
- siendo Fcy2(h) una porción de Fc humano con una bisagra de IgG1 y dominios CH2 y CH3 de IgG2, siendo L un segmento enlazador, que tiene la secuencia GGGGSGGGG, y siendo IL-7(F39P, F57N, L128S) la IL-7, que contiene las mutaciones F39P, F57N, y L128S; teniendo dicha molécula la secuencia que ha sido representada en la figura 34.
En una realización, la mitad Ig es la IgG2. En
algunas realizaciones, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina
humana. De la misma manera, la invención se refiere a una célula,
que comprende una secuencia de ácidos nucleicos, que codifica un
polipéptido modificado de conformidad con la invención. En una
realización, la célula es una célula procariota.
De la misma manera, la invención se refiere a un
uso del polipéptido de la invención o a la manufactura de un
medicamento destinado al tratamiento del cáncer o del HIV.
La figura 1 representa la secuencia de
aminoácidos de la IL-7 humana. La secuencia señal
está mostrada en negrita. De igual modo, se ha representado en
negrita y en cursiva un tramo de dieciocho aminoácidos que puede
ser suprimido a partir de la secuencia de la
IL-7.
La figura 2 representa la secuencia de
aminoácidos de la IL-7 bovina. La secuencia señal
está mostrada en negrita.
La figura 3 representa la secuencia de
aminoácidos de la IL-7 de carnero. La secuencia
señal está mostrada en negrita.
La figura 4 representa la secuencia de
aminoácidos de una IL-7 humana desinmunizada,
ejemplificativa, en la que han sido modificadas secuencias del
epitopo de las células T.
La figura 5 representa la secuencia de
aminoácidos de una IL-7 humana desinmunizada,
producida por vía bacteriana.
La figura 6 representa la secuencia de ácidos
nucleicos, que codifica la IL-7 madura, que
incorpora codones para las mutaciones F39P, F57N y L128S.
La figura 7 representa la secuencia de
aminoácidos de la IL-7 madura con las mutaciones
F39P, F57N y L128S.
La figura 8 representa la secuencia de ácidos
nucleicos, que codifica la IL-7 madura, que
incorpora codones para las mutaciones F39P, F57N, L77D y L128S.
La figura 9 representa la secuencia de
aminoácidos de la IL-7 madura con las mutaciones
F39P, F57N, L77D y L128S.
La figura 10 representa la secuencia de ácidos
nucleicos, que codifica la IL-7 desinmunizada,
producida por vía bacteriana
(bDel-IL-7),
codón-optimizada para E. coli con codones
para las mutaciones de los aminoácidos K68D, M69D, 188T, V96G.
La figura 11 representa la secuencia de ácidos
nucleicos, que codifica una variante de la IL-7
madura, la IL-7 desinmunizada
(Del-IL-7), con codones para las
mutaciones de los aminoácidos K68D, M69D, 188T, V96G.
La figura 12 representa la secuencia de
aminoácidos para la Fcy1-IL-7, en la
que la porción Fc está constituida por una bisagra \gamma1,
región \gamma1 CH2 y \gamma1 CH3.
La figura 13 representa la secuencia de
aminoácidos para la
Fc\gamma2(h)(FN>AQ)-IL-7
humana, que es una porción Fc con una bisagra \gamma1, un dominio
\gamma2 CH2 y un dominio \gamma2 CH3. La porción Fc incorpora
las mutaciones de los aminoácidos F296A y N297Q.
La figura 14 representa la secuencia de
aminoácidos para la Fc\gamma1-(segmento
enlazador1)-IL-7 humana, que es una
porción Fc, que está constituida por una bisagra \gamma1, región
CH1 y región CH2, que está conectada con la mitad
IL-7 a través de un segmento enlazador
polipeptídico, que tiene la secuencia de aminoácidos
GGGGSGGGGSGGGGS.
La figura 15 representa la secuencia de
aminoácidos de la Fc\gamma1 (YN>AQ)-(segmento enlazador
2)-IL-7 humana, que es una porción
\gamma1 Fc con una bisagra \gamma1, región CH1 y región CH2, que
incorpora las mutaciones Y296A y N297Q, que está conectada con una
mitad IL-7 a través de un segmento enlazador
polipeptídico, que tiene la secuencia de aminoácidos GGGGSGGGG.
La figura 16 representa la secuencia de
aminoácidos de la Fc\gamma1 (YN>AQ,d)-(segmento enlazador
2)-IL-7 humana, que es una porción
\gamma1 Fc con una bisagra \gamma1, dominios CH1 y CH2, que
incorpora las mutaciones Y296A y N297Q, así como la supresión de la
lisina C-terminal y que precede a la glicina de la
mitad Fc. La porción Fc está conectada con una mitad
IL-7 a través de un segmento enlazador
polipeptídico, que tiene la secuencia de aminoácidos GGGGSGGGG.
La figura 17 representa la secuencia de ácidos
nucleicos de Fc\gamma1, una porción Fc con una bisagra, dominio
CH1 y dominio CH2, todos ellos de la IgG1.
La figura 18 representa la secuencia de ácidos
nucleicos de la Fc\gamma1(YN>AQ), que es una porción Fc
con una bisagra, dominio CH1 y domino CH2, todos ellos de la IgG1.
La porción Fc incorpora las mutaciones Tyr296Ala y Asn297Gln.
La figura 19 representa la secuencia de ácidos
nucleicos de Fc\gamma2(h), que es una porción Fc con una
bisagra IgG1 y dominios IgG2 CH2 y CH3.
La figura 20 representa la secuencia de ácidos
nucleicos de Fc\gamma2(h)(FN>AQ), que es una porción Fc
con una bisagra IgG1 y dominios IgG2 CH2 y CH3. La porción Fc
incorpora las mutaciones F296A y N297Q.
La figura 21 representa la secuencia de
aminoácidos de la IL-7.1 humana madura
desinmunizada, en la que la IL-7 incorpora las
substituciones L24D, M54A, F57K, A60S, R61 E, M147K, T149S y las
supresiones de los residuos K150, E151 y H 152.
La figura 22 representa la secuencia de ácidos
nucleicos, que codifica la secuencia de aminoácidos de la figura
21.
La figura 23 representa la secuencia de
aminoácidos de la IL-7.2 humana madura
desinmunizada, que incorpora las substituciones D76N, L77D, T87Q,
188T, V96G, L119S, L128V, M147K, T149S y las supresiones K150, E151
y H152.
La figura 24 representa la secuencia de ácidos
nucleicos, que codifica la secuencia de aminoácidos de la figura
23.
La figura 25 representa la secuencia de
aminoácidos de la IL-7.3 humana madura
desinmunizada, que incorpora las substituciones L24D, 130T, F39P,
M54A, F57K, A60S, R61 E, M68D, N69D, L77D, T87Q, 188T, V96G, L119S,
L128A, M147K, T149S y las supresiones K150, E151 y H152.
La figura 26 representa la secuencia de ácidos
nucleicos, que codifica la secuencia de aminoácidos de la figura
25.
La figura 27 representa la secuencia de ácidos
nucleicos, que codifica la secuencia del segmento enlazador
GGGGSGGGG, seguido por la IL-7 humana madura, que contiene la substitución de los aminoácidos F39P, F57N y L128S (PNS), y que contiene loci de restricción flanqueantes Xma I y Xho I en los extremos 5' y 3' respectivamente.
GGGGSGGGG, seguido por la IL-7 humana madura, que contiene la substitución de los aminoácidos F39P, F57N y L128S (PNS), y que contiene loci de restricción flanqueantes Xma I y Xho I en los extremos 5' y 3' respectivamente.
La figura 28 representa la secuencia de ácidos
nucleicos de la huFcy2(h)(FN>AQ)(segmento
enlazador2)-IL-7(F39P, F57N,
L77D, L128S) madura, que es una porción Fc humana con una bisagra
IgG1 bisagra y dominios IgG2 CH2 y CH3, que incorpora las
mutaciones F296A y N297Q, que está conectada con el extremo N de la
mitad IL-7 humana, que incorpora las mutaciones
F39P, F57N, L77D y L128S. La porción Fc y la mitad
IL-7 están conectadas a través de una secuencia de
segmento enlazador GGGGSGGGG.
La figura 29 representa la secuencia de ácidos
nucleicos de la huFc\gamma2(h)-(segmento
enlazador2)-IL-7(F39P, F57N,
L77D, L128S) madura, que es una porción Fc humana con una bisagra
IgG1, y dominios IgG2 CH2 y CH3, que está conectada con el extremo
N de la mitad IL-7 humana, que incorpora las
mutaciones F39P, F57N, L77D y L128S. La porción Fc y la mitad
IL-7 están conectadas a través de una secuencia de
segmento enlazador GGGGSGGGG.
La figura 30 representa la secuencia de ácidos
nucleicos de la huFc\gamma2(h) (segmento
enlazador2)-IL-7(F39P, F57N,
L128S) madura, que es una porción Fc humana con una bisagra IgG1, y
dominios IgG2 CH2 y CH3, que está conectada con el extremo N de la
mitad IL-7 humana, que incorpora las mutaciones
F39P, F57N y L128S. La porción Fc y la mitad IL-7
están conectadas a través de una secuencia de segmento enlazador
GGGGSGGGG.
La figura 31 representa la secuencia de
aminoácidos de la huFc\gamma2(h)(FN>AQ)-(segmento
enlazador2)-IL-7(F39P, F57N,
L128S) madura, que es una porción Fc humana con una bisagra de IgG1
y dominios CH2 y CH3 de IgG2. La porción Fc contiene las mutaciones
F296A y N297Q. La porción Fc está enlazada con la mitad
IL-7 a través de un segmento enlazador, que tiene
la secuencia GGGGSGGGG. La mitad IL-7 contiene las
mutaciones F39P, F57N y L128S.
La figura 32 representa la secuencia de
aminoácidos de la huFc\gamma2(h)(FN>AQ)-(segmento
enlazador2)-IL-7(F39P, F57N,
L77D, L128S) madura, que es una porción Fc humana con una bisagra de
IgG1 y dominios CH2 y CH3 de IgG2. La porción Fc contiene las
mutaciones F296A y N297Q. La porción Fc está enlazada con la mitad
IL-7 a través de un segmento enlazador, que tiene
la secuencia GGGGSGGGG. La mitad IL-7 contiene las
mutaciones F39P, F57N, L77D y L128S.
La figura 33 representa la secuencia de
aminoácidos de la huFc\gamma2(h)-(segmento
enlazador2)-IL-7(F39P, F57N,
L77D, L128S) madura, que es una porción Fc humana con una bisagra de
IgG1 y dominios CH2 y CH3 de IgG2. La porción Fc está enlazada con
la mitad IL-7 a través de un segmento enlazador, que
tiene la secuencia GGGGSGGGG. La mitad IL-7
contiene las mutaciones F39P, F57N, L77D y L128S.
La figura 34 representa la secuencia de
aminoácidos de la huFc\gamma2(h) (segmento
enlazador2)-IL-7(F39P, F57N,
L128S) madura, que es una porción Fc humana con una bisagra de IgG1
y dominios CH2 y CH3 de IgG2. La porción Fc está enlazada con la
mitad IL-7 a través de un segmento enlazador, que
tiene la secuencia GGGGSGGGG. La mitad IL-7
contiene las mutaciones F39P, F57N, L77D y L128S.
La figura 35 es un alineamiento de la secuencia
de aminoácidos de las proteínas de la IL-7 de
procedencia humana, de chimpancé, de babuino, de macaco, de bovino,
de porcino, de carnero, de rata y de múrido.
La figura 36 representa las concentraciones en
plasma de la Fc-IL-7 en \mug/ml
tanto para los ratones de ensayo como para los ratones de control,
a los que se ha administrado la
Fc-IL-7 por vía subcutánea.
La figura 37 muestra los valores de la tasa
media de cambio de las concentraciones de
Fc-IL-7 en plasma entre el día 0 y
el día 2, y entre el día 2 y 4 en los ratones de ensayo, a los que
se ha administrado la Fc-IL-7 por
vía subcutánea (SC).
La figura 38 representa el peso medio del
órgano, correspondiente a los órganos que han sido extraídos de los
ratones de ensayo, sacrificados al séptimo día, en comparación con
el peso medio del órgano de ratones en el grupo de control.
La figura 39 representa una comparación de la
frecuencia de células de granulocitos Gr-1+, dada en
células/\mul, en la sangre periférica de ratones procedentes del
grupo de control, del grupo con una dosificación de 0,5 mg/kg, del
grupo con una dosificación de 5,0 mg/kg, y del grupo con una
dosificación de 25 mg/kg al séptimo día.
La figura 40 representa una comparación de la
frecuencia de las células CD19+, dada en células/\mul, en la
sangre periférica de ratones procedentes del grupo de control, del
grupo con una dosificación de 0,5 mg/kg, del grupo con una
dosificación de 5,0 mg/kg, y del grupo con una dosificación de 25
mg/kg al séptimo día.
La figura 41 representa una comparación de la
frecuencia de las células CD4+, dada en células/\mul, en la
sangre periférica de ensayo procedente del grupo de control, del
grupo con una dosificación de 0,5 mg/kg, del grupo con una
dosificación de 5,0 mg/kg, y del grupo con una dosificación de 25
mg/kg al séptimo día.
La figura 42 representa una comparación de la
frecuencia de las células CD8+, dada en células/\mul, en la
sangre periférica de ensayo procedente del grupo de control, del
grupo con una dosificación de 0,5 mg/kg, del grupo con una
dosificación de 5,0 mg/kg, y del grupo con una dosificación de 25
mg/kg al séptimo día.
La figura 43 representa la actividad de la
Fc-IL-7 en comparación con el tipo
natural de la IL-7, basada en la incorporación de
timidina tritiada en puntos por minuto frente a la concentración en
IL-7/Fc-IL-7 en un
ensayo estándar de proliferación celular.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención está dirigida a los polipéptidos,
que han sido mencionados precedentemente, caracterizados por
proteínas de la IL-7 que tienen una inmunogenicidad
disminuida en comparación con la del tipo natural de la
IL-7, así como a métodos para la obtención y el uso
de tales proteínas. De una manera más específica, la invención
proporciona mutaciones en mitades IL-7, que tienen
el efecto de reducir la inmunogenicidad de la propia
IL-7, en primer lugar por eliminación de epitopos
de las células T dentro de la IL-7, que pueden
estimular una respuesta inmune. De la misma manera, la invención
comprende proteínas de fusión, que incorporan mitades de
IL-7 modificadas de conformidad con las enseñanzas
de la invención.
Los epitopos de las células T pueden ser
identificados por medio de una variedad de métodos informáticos y
no informáticos, con inclusión de predicciones basadas en el
modelado por ordenador basado en estructuras o mediante la síntesis
de péptidos y el ensayo para enlazarse con moléculas específicas de
MHC Clase II o en un ensayo de inmunogenicidad. De conformidad con
la exposición, un epitopo potencial de las células T es una
secuencia que, cuando se considera como un péptido aislado, se
pronostica que se enlaza con una molécula de MHC Clase II o con un
equivalente en una especie no humana. Un epitopo potencial de las
células T se define, sin tenerse en cuenta los otros aspectos de
procesamiento antígeno, tal como la eficiencia de proteína
incorporada en las células que presentan antígeno, la eficiencia de
escisión en loci en una proteína intacta para proporcionar un
péptido, que puede enlazarse con el MHC Clase II, y así
sucesivamente. Por consiguiente, el grupo de epitopos de las
células T, que se presenta actualmente en el MHC Clase II tras
administración de una proteína a un animal, es un subgrupo de los
epitopos potenciales de las células T. De conformidad con esta
exposición, un epitopo de las células T es un epitopo en una
proteína, que interactúa con una molécula de MHC Clase II. Sin
pretender un compromiso teórico, se entiende que un epitopo de las
células T es una secuencia de aminoácidos en una proteína que ha
fracasado para superar el proceso de selección negativa de las
células T durante el desarrollo de las células T y que, por lo
tanto, se supone que es presentada por una molécula de MHC Clase II
y que es reconocida por un receptor de las células T.
De la misma manera, los epitopos de las células
B son identificados por medio de una variedad de métodos
informáticos y no informáticos, que incluyen predicciones basadas
en el modelado por ordenador basado en estructuras o mediante
síntesis de péptidos y el ensayo para enlazarse con moléculas
específicas receptoras del antígeno de las células B o en un ensayo
de inmunogenicidad. De conformidad con la exposición, un epitopo
potencial de las células B es una secuencia que, cuando se
considera como un péptido aislado, se pronostica que se enlaza con
un receptor del antígeno de las células B o con un equivalente en
una especie no humana. Un epitopo de las células B es un epitopo
que se enlaza o que es reconocido por un receptor del antígeno de
las células B y es un subgrupo de los epitopos potenciales de las
células B.
La exposición proporciona métodos relacionados
con la reducción de la inmunogenicidad de la IL-7.
De conformidad con la exposición, los epitopos potenciales no
propios de las células T son identificados en secuencias de la
IL-7. Por ejemplo, los epitopos potenciales no
propios de las células T son identificados con ayuda de métodos
informáticos, que están basados en el modelado de péptidos que se
enlazan con las moléculas de MHC Clase II. A continuación se llevan
a cabo substituciones de tal modo que sea reducida o eliminada la
habilidad de los péptidos que contienen a los epitopos potenciales
de las células T para enlazarse con el MHC Clase II. Este proceso
de identificación y de modificación de péptidos, que se enlazan con
el MHC Clase II se denomina "desinmunización" y las moléculas
resultantes de proteínas modificadas son denominadas
"desinmunizadas".
De conformidad con la exposición, el MHC Clase
II enlazante puede ser eliminado en situaciones en las que una
proteína debe ser producida en bacterias o en un organismo, que no
genera una pauta de glicosilación de mamíferos, tales como las
células de levadura o de insectos.
La exposición proporciona métodos no
informáticos para reducir o para eliminar el número de epitopos de
las células T en la IL-7 sin necesidad de llevar a
cabo la elaboración de simulaciones por ordenador o de estructura
proteicas tridimensionales. En una realización, un método se
beneficia del hecho de que un segmento principal de nueve
aminoácidos interacciona tanto con las moléculas de MHC Clase II así
como, también, con el receptor de las células T durante la
presentación del antígeno. El aminoácido, que está situado en el
extremo N más alejado, la posición de "anclaje" se enlaza con
una bolsillo profundo dentro de la molécula de MHC Clase II. En la
posición de anclaje está presente, de manera típica, uno de los
siguientes aminoácidos, que es importante para llevar a cabo el
enlace con una molécula de MHC Clase II: leucina, valina,
isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina y triptofano. De
manera adicional, entre 2 y 3 aminoácidos, que son adyacentes a los
9 aminoácidos principales, afectan, así mismo, a la interacción con
las moléculas de MHC.
Un método general incluye la mutación de
cualquiera de las leucinas, valinas, isoleucinas, metioninas,
fenilalaninas, tirosinas o triptofanos que estén presentes en la
IL-7. En una realización, se mutan uno o varios de
estos aminoácidos en un candidato a epitopo de las células T en una
treonina, en una alanina o en una prolina, con lo cual se retiene
algo de la naturaleza hidrófuga del aminoácido que es reemplazado.
En otras realizaciones, se suprimen uno o varios de los aminoácidos
que han sido mencionados precedentemente a partir de un candidato a
epitopo de las células T o a partir de un epitopo potencial de las
células T, o se reemplaza por un análogo de aminoácido apropiado.
Si se suprime un aminoácido, con objeto de destruir a un epitopo
potencial de las células T, deben tomarse precauciones para no
generar un nuevo epitopo de las células T, que incluya aminoácidos
cerca de la supresión.
De este modo, la invención proporciona
secuencias de ácidos nucleicos de las proteínas de la invención. De
manera específica, la exposición proporciona proteínas con
mutaciones de leucinas, de valinas, de isoleucinas, de metioninas,
de fenilalaninas, de tirosinas o de triptofanos. Cualquier residuo
alifático o aromático (leucina, valina, isoleucina, metionina,
fenilalanina, triptofano o tirosina) presenta un elevado riesgo de
generar un péptido enlazante del MHC con el aminoácido en la
primera aposición (posición de anclaje), que enlaza el bolsillo de
la molécula del MHC. Por consiguiente, la substitución de cualquiera
de los aminoácidos, que han sido mencionados precedentemente, por
un aminoácido que no sea uno de los aminoácidos que han sido citados
precedentemente, o por alanina, por prolina o por treonina,
eliminará un candidato a epitopo de las células T.
Las proteínas pueden ser proteínas humanas con
secuencias que corresponden, de manera general, a las secuencias
que se encuentran en el cuerpo humano. De la misma manera, la
invención proporciona secuencias de ácidos nucleicos, que codifican
dichas proteínas. Las secuencias de ácidos nucleicos para este
aspecto de la invención pueden existir en forma de plásmidos, en
forma de fragmentos regenerados por reacción en cadena de polimerasa
(RCP), o en forma de ácidos nucleicos, producidos por síntesis
química.
Tal como se utiliza aquí, el término
"interleucina-7" o "IL-7"
significa aquellos polipéptidos de la IL-7 y
derivados y análogos de los mismos, que tienen substancialmente
identidad en la secuencia de aminoácidos con tipo natural de la
IL-7 humana madura. Por ejemplo, la
IL-7 indica a una secuencia de aminoácidos de un
polipéptido recombinante o no recombinante, que tenga una secuencia
de aminoácidos de: i) una variante natural o alélicas, de origen
natural, de un polipéptido de la IL-7, ii) un
fragmento biológicamente activo de un polipéptido de la
IL-7, iii) un polipéptido biológicamente activo
análogo de un polipéptido de la IL-7, o iv) una
variante biológicamente activa de un polipéptido de la
IL-7.
Los polipéptidos de la IL-7,
modificados de conformidad con la invención, son humanos. Las
secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de la
IL-7 son perfectamente conocidas en el estado de la
técnica. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la
IL-7 humana tiene un número de acceso GenBank de NM
000880 (SEQ ID NO:1) y está mostrada en la figura 1; la secuencia
de aminoácidos de la IL-7 murina tiene un número de
acceso GenBank de NM 008371; la secuencia de aminoácidos de la
IL-7 de rata tiene un número de acceso GenBank de AF
367210; la secuencia de aminoácidos de la IL-7
bovina tiene un número de acceso GenBank de NM 173924 (SEQ ID NO:2)
y está mostrada en la figura 2; y la secuencia de aminoácidos de la
IL-7 de carnero tiene un número de acceso GenBank
de U10089 (SEQ ID NO:3) y está mostrada en la figura 3. La secuencia
señal para cada una de las especies polipeptídicas está mostrada en
negrita en cada una de las figuras y, de forma típica, no está
incluida cuando la porción IL-7 está fusionada en
el extremo C con la proteína portadora.
Así mismo, en la figura 35, se muestra un
alineamiento de varias secuencias de la IL-7 de
mamíferos. La IL-7 procedente de primates no
humanos tiene, por regla general, una identidad mayor que un 90% con
la IL-7 humana. Aún cuando la secuencia de la
IL-7 murina es la más divergente con respecto a la
secuencia de la IL-7 humana, con menos de un 70% de
identidad, ésta es capaz, sin embargo, de activar al receptor de la
IL-7 humana.
En el transcurso de esta solicitud, las
posiciones de los residuos de aminoácidos en la secuencia de la
IL-7 están dadas con referencia a la proteína de la
IL-7 humana madura. Por ejemplo, la cisteína en la
secuencia N-terminal MDCDIEGK...(SEQ ID NO:22) de
la proteína de la IL-7 humana, producida por vía
bacteriana, que incluye una metionina de iniciación, se denomina
también como Cys2.
Un aspecto de la invención se desprende de la
observación de que la IL-7, producida por expresión
bacteriana, no contiene modificaciones
post-traducción que sean características de los
eucariotas, tales como los mamíferos. Por ejemplo, la
IL-7 contiene tres loci previstos de glicosilación
en enlazados con N en las posiciones 70, 91 y 116. En una proteína
de fusión Fc-IL-7 expresada en
células de mamíferos, están glicosiladas las asparaginas en las
posiciones 70 y 91, mientras que no lo está la asparagina en la
posición 116. Es probable que la IL-7 producida de
forma endógena en el cuerpo humano esté también
N-glicosilada, al menos en las posiciones 70 y 91 y
posiblemente en la posición 116. Estas glicosilaciones enlazadas en
N no están presentes en la IL-7 producida por vía
bacteriana, y representa secuencias que pueden ser reconocidas por
el sistema inmune humano como "no propias", es decir que,
normalmente, no están presentes en el cuerpo humano. Por
consiguiente, la invención engloba la desinmunización de estas
regiones de epitopos potenciales en la IL-7 para
reducir la inmunogenicidad de la IL-7 y de las
proteínas emparentadas.
De conformidad con la exposición, los epitopos
de las células T están presentes en la IL-7 que
incluye porciones 70 y 91, como se ha descrito en la tabla 1. Los
epitopos mostrados en la tabla 1 están definidos en términos de un
péptido nonámero mínimo, con el potente residuo de anclaje MHC Clase
II en la primera posición.
\vskip1.000000\baselineskip
De conformidad con la exposición, un método para
llevar a cabo la reducción la inmunogenicidad de la
IL-7 producida por vía bacteriana consiste en
introducir una o varias de las siguientes mutaciones: Leu63Ala,
Leu63Val, Leu63Pro, Leu63Thr, Lys68Asp, Met69Asp, Lys68Glu,
Met69Glu, Ile88Thr, Ile88Ala, Ile88Val y Val96Gly. Otras mutaciones
pueden ser introducidas en las posiciones 63, 68, 69, 88 y/o 94.
Algunas mutaciones son particularmente adecuadas en combinación,
tales como los pares Lys68Asp acoplado con Met69Asp y/o Ile88Thr
acoplado con Val96Gly.
Cuando estas mutaciones son introducidas en la
IL-7 o en una proteína de fusión, que comprenda a la
IL-7, la proteína mutante, resultante, tiene por
regla general una actividad biológica suficiente de la
IL-7 como para ser adecuada a modo de una proteína
terapéutica. En realidad, la actividad biológica de la mitad
IL-7 es, como mínimo, de un 10%, de un 20%, de un
50%, de un 70%, de un 80%, de un 90%, de un 95%, de un 99% o del
100%, en comparación con la actividad biológica de la
IL-7 de tipo natural. La actividad de la
IL-7 de la invención puede ser evaluada en un ensayo
in vitro o in vivo. El ejemplo 9 muestra un ensayo
para evaluar la actividad biológica de las variantes de la
IL-7 de la invención.
Por otra parte, las mutaciones permiten, por
regla general, un plegamiento adecuado de la mitad
IL-7 de tal manera, que puede ser aislada una
proteína pura, ampliamente exenta de agregados de elevado peso
molecular y de formas incorrectamente enlazadas a través de
disulfuro. Sin embargo, deben ser evaluados el plegamiento y la
actividad biológica que resultan de cualquier combinación
particular, por ejemplo como se ha ilustrado en los ejemplos, para
verificar que se ha obtenido la actividad deseada.
De conformidad con la exposición, una estrategia
alternativa para llevar a cabo la reducción la inmunogenicidad de
la IL-7, producida por vía bacteriana, consiste en
alterar Asn70 y Asn91 en ácido aspártico. Sin pretender un
compromiso teórico, la mutación de Asn70 y de Asn91 en ácido
aspártico puede ser adecuada por las siguientes razones.
La inmunogenicidad de una proteína terapéutica,
administrada por vía exógena, está favorecida, en parte, por medio
de la presentación de epitopos de las células T derivados de la
proteína terapéutica. Se supone que dicha presentación se produce
por medio del mecanismo siguiente. Una proteína terapéutica es
incorporada por una célula que presenta antígenos (APC); tal como
una célula dendrítica, un macrófago o una célula B por endocitosis.
La proteína es transportada hasta una serie de vesículas denominadas
endosomas, que incluyen los endosomas tempranos, medios y tardíos.
En estas vesículas, el medio se vuelve progresivamente más duro y
menos favorable para las proteínas extracelulares, enlazada a
través de disulfuro, que pueden ser plegadas de forma estable a pH
neutro. Las proteasas, denominadas catepsinas, degradan a las
proteínas interiorizadas en péptidos pequeños. Una proporción de
estos fragmentos proteicos se enlaza entonces a través de proteínas
de MHC Clase II, que transportan a los fragmentos hasta la
superficie de la célula en forma de complejos de MHC Clase
II/péptido. Tales complejos son reconocidos por los receptores de
las células T en las células CD4+ T.
En el caso de los péptidos, que se derivan de
proteínas foráneas, la presentación de un complejo de MHC Clase
II/péptido puede estimular una respuesta inmune. Sin embargo, en el
caso de los péptidos, que se derivan de las proteínas propias,
existe una multiplicidad de mecanismos, por medio de los cuales las
células T, que reconocen a los complejos de MHC Clase II/péptido,
son suprimidas o están imposibilitadas para activar una
respuesta
inmune.
inmune.
Tomando como base los dos párrafos precedentes,
es importante considerar el modo en que una proteína
N-glicosilada sería procesada en el endosoma. Una
proteína de este tipo podría ser degradada en péptidos que contengan
oligosacáridos enlazados con N, que pudiesen enlazarse con
moléculas de MHC Clase II. De conformidad con una observación de la
invención, el endosoma contiene, así mismo, una endoglicosidasa que,
a veces, elimina de la asparagina al oligosacárido, y cuando lleva
esto a cabo, convierte a la asparagina en ácido aspártico. De este
modo, las secuencias proteicas propias, que contienen
oligosacáridos enlazados a través de asparagina, pueden ser
presentados por el MHC Clase II en forma de péptidos, que contienen
a la asparagina enlazada con un oligosacárido, o en forma de
péptidos correspondientes, que contienen ácido aspártico en lugar de
asparagina.
Como parte de la exposición, también se ha
observado que esta estrategia para llevar a cabo la reducción de la
inmunogenicidad de las proteínas de los mamíferos, que son
expresadas en bacterias, puede ser aplicada de una manera general.
De manera específica, la substitución del ácido aspártico por
asparagina en el locus de la glicosilación enlazada con N tiene,
por regla general, el efecto de reducir la inmunogenicidad de una
proteína de mamífero, que es expresada en un procariota.
La exposición contiene mutaciones adicionales,
que reducen la inmunogenicidad de la IL-7 y de las
proteínas de fusión, que contienen IL-7, cuando son
expresadas bien en células bacterianas o bien en células de
mamíferos. Estas mutaciones incluyen las que han sido enumeradas en
la tabla 2 siguiente. Una IL-7 o una proteína de
fusión, que contiene IL-7, puede comprender una o
varias de estas mutaciones. Por ejemplo, en una realización, la
IL-7 es modificada con objeto de incorporar uno o
varios de los L24D, M54A, F57K, A60S, R61E, M147K y T149S, estando
suprimidos los K150, E151 y H152. En otra realización, la
IL-7 es modificada con objeto de incorporar uno o
varios de los D76N, L77D, T87Q, 188T, V96G, L119S, M147K y T149S,
estando suprimidos los K150, E151 y H152. En otra realización, la
IL-7 puede ser modificada con objeto de llevar a
cabo la incorporación de uno o varios de los L24D, 130T, F39P,
M54A, F57K, A60S, R61 E, M68D, N69D, L77D, T87Q, 188T, V96G, L119S,
L128A, M147K y T149S, estando suprimidos los K150, E151 y H152.
En otra realización, una molécula de
IL-7 o una proteína de fusión, que contenga
IL-7, pueden incluir mutaciones de uno o varios de
los residuos 39, 57, 77 y/o 128 de la IL-7. Por
ejemplo, en una realización la IL-7 incluye una
mutación en el residuo 39. En otra realización, la
IL-7 incluye una mutación en el residuo 57. En otra
realización, la IL-7 incluye mutaciones tanto en el
residuo 39 como en el residuo 57. Así mismo, en otra realización,
la IL-7 incluye mutaciones en los residuos 39, 57 y
128, mientras que en otra realización, la IL-7
incluye mutaciones en los residuos 39, 57 y 77. Así mismo, en otra
realización, la IL-7 incluye mutaciones en los
residuos 39, 57, 77 y 128. En otra realización, el residuo de
fenilalanina en la posición 39 está reemplazado por un residuo de
prolina (F39P). En otra realización, el residuo de fenilalanina en
57 está reemplazado por un residuo de asparagina (F57N). En otra
realización, el residuo de leucina en la posición 77 está
reemplazado por el ácido aspártico (L77D). Así mismo, en otra
realización, el residuo de leucina en la posición 128 está
reemplazado por serina (L128S).
Para comprobar que una mutación ha dado
realmente como resultado la reducción de la inmunogenicidad, pueden
ser empleados ensayos experimentales estándar, que son perfectamente
conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, puede ser
empleado un ensayo de estimulación de las células T (por ejemplo
Jones et al., (2004), J. Interferon Cytokine Res.,
24:560). En un ensayo de este tipo, se obtienen células
mononucleares de sangre humana periférica (PBMCs) y se cultivan de
conformidad con las condiciones estándar. Después de una
estimulación previa, opcional, se añade al cultivo de PBMCs un
péptido, que corresponda a un epitopo potencial del MHC Clase II;
las PBMCs son incubadas a continuación y se añade, más tarde,
timidina tritiada. El péptido puede ser un nonámero mínimo o puede
tener desde aproximadamente 10 hasta 15 o más aminoácidos. Después
de otra incubación de las células, se mide por medio de técnicas
estándar la incorporación de la timidina tritiada en el ADN.
Se supone que el ensayo para la estimulación de
las células T trabaja por medio de los siguientes mecanismos. En
primer lugar, si se utiliza un péptido como estimulador, el péptido
debe ser enlazado, en primer lugar, con una molécula de MHC Clase
II presente en una célula entre las PBMCs. En segundo lugar, el
complejo de MHC Clase II/péptido debe interactuar, de manera
productiva, con un receptor de las células T en una célula CD4+ T.
Si el péptido de ensayo es incapaz de enlazarse de una manera
suficientemente firme con una molécula de MHC Clase II, no
resultará una señal. Si el péptido es capaz de enlazarse con una
molécula de MHC Clase II y existen células T que expresen un
receptor de las células T, reagrupado de manera apropiada, capaz de
reconocer a un complejo particular de MHC Clase II/péptido,
resultará una señal. Sin embargo, si dichas células T han sido
suprimidas como resultado de un proceso de selección negativa, no
resultará señal. Estos mecanismos son considerados relevantes para
la inmunogenicidad de una secuencia proteica, como se infiere de la
estimulación o de la falta de estimulación por parte de un péptido
dado.
Si están presentes células T reconocedoras en un
número muy bajo en la población de PBMC por razones estocásticas,
relacionadas con el fallo de que tenga lugar un receptor apropiado
de las células T o relacionadas con la proliferación de otras
células T no emparentadas, seguido de homeostasis de la población de
las células T, tampoco habrá señal, aún cuando sea de esperar una
señal. De este modo, pueden darse resultados con falso negativo. En
base a estas consideraciones, es importante emplear un gran número
de diferentes fuentes de PBMCs y evalúan estas muestras
independientemente. De igual modo, es adecuado por regla genera
llevar a cabo la evaluación de las PBMCs procedentes de un grupo de
seres humanos étnicamente diferentes, y llevar a cabo la
determinación de los alelos de MHC Clase II presentes en cada
población de PBMC.
El ensayo estándar de las células T tiene el
inconveniente de que la señal de la incorporación del tritio es con
frecuencia sólo dos veces mayor que la incorporación del fondo. Así
mismo, las proteínas y los péptidos de la invención pueden ser
ensayados en un ensayo modificado de las células T, en el que, por
ejemplo, se cultivan de manera concomitante células CD4+ T
purificadas y células dendríticas purificadas, en presencia del
péptido de ensayo, seguido por la exposición a la timidina tritiada
y, a continuación, son ensayadas con respecto a la incorporación de
la timidina tritiada. Este segundo ensayo tiene la ventaja de que
queda esencialmente eliminada la incorporación de la timidina
tritiada en las células irrelevantes, tales como las células CD8+ T
y, de este modo, se reduce el fondo.
Un tercer ensayo comprende la evaluación de una
proteína candidata que reduzca la inmunogenicidad en un animal tal
como un primate. Un ensayo de este tipo comprendería, por regla
general, la evaluación de una proteína de la IL-7
entera o de una proteína de fusión, que contenga
IL-7, en la que la mitad IL-7 haya
sido designada mediante la evaluación individual de péptidos
componentes con respecto a la inmunogenicidad potencial en un
ensayo de base celular tal como el que se ha descrito
precedentemente. Una vez que ha sido designada y expresada dicha
proteína candidata, que contiene IL-7, la proteína
es evaluada en cuanto a la inmunogenicidad por medio de inyección
en un animal.
La inyección de la proteína modificada, que
contiene IL-7, se lleva a cabo, de manera general,
de la misma manera que de la ruta de suministro prevista durante el
uso terapéutico en los seres humanos. Por ejemplo, puede emplearse
una infusión intradérmica, subcutánea, intramuscular, inyección
intraperitoneal o infusión intravenosa. Cuando se utilice más de
una administración, las vías de administración pueden ser
diferentes.
Para los fines del ensayo de la inmunogenicidad,
puede ser útil administrar de manera concomitante un adyuvante con
objeto de acrecentar la señal y con objeto de minimizar el número
necesario de animales, que debe ser usado. Cuando se utilice un
adyuvante, es posible usar un adyuvante carente de componente
proteico, tal como un ADN no codificante con dinucleótidos CpG no
metilados, lípido A bacteriano, N-formil metionina,
u otros componentes no proteicos, bacterianos. Sin pretender un
compromiso teórico, lo racional para evitar adyuvantes que
contengan proteína consiste en que otras proteínas pueden
suministrar epitopos de las células T, que contribuyan, en último
lugar, a una respuesta de anticuerpos contra la proteína
candidata.
Después de una o de varias administraciones de
la proteína candidata, que contiene IL-7, se evalúa
la presencia de anticuerpos
anti-IL-7 de conformidad con las
técnicas estándar, tal como el método ELISA. Se ha encontrado que
las moléculas alteradas, que contienen IL-7, de la
invención inducen menos frecuentemente la formación de anticuerpos
y, en una menor extensión, que las correspondientes moléculas, que
contienen a la IL-7 humana normal.
Un aspecto clave de la invención consiste en que
la IL-7 modificada, de conformidad con la
exposición, puede ser fusionada con una proteína portadora para
formar una proteína de fusión. En una realización, la proteína
portadora está dispuesta hacia el extremo N de la proteína de fusión
y la IL-7 está dispuesta hacia el extremo C. En
otra realización, la IL-7 está dispuesta hacia el
extremo N de la proteína de fusión y la proteína portadora está
dispuesta hacia el extremo C.
La proteína portadora puede ser una región Fc.
Tal como se utiliza aquí, "porción Fc" abarca dominios
derivados de la región constante de una inmunoglobulina, tal como
una inmunoglobulina humana, con inclusión de un fragmento, de un
análogo, de una variante, de un mutante o de un derivado de la
región constante. Las inmunoglobulinas adecuadas incluyen la IgG1,
la IgG2, la IgG3, la IgG4 y otras clases. La región constante de una
inmunoglobulina se define como un homólogo de polipéptido, de
origen natural o producido por vía sintética, con respecto a la
región C-terminal de la inmunoglobulina, y puede
incluir una bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3, o un dominio
CH4, por separado o en cualquier combinación. En la presente
invención, la porción Fc incluye, de manera típica, al menos, un
dominio CH2. Por ejemplo, la porción Fc puede incluir
bisagra-CH2-CH3. De manera
alternativa, la porción Fc puede incluir toda la región bisagra o
una porción de la misma, el dominio CH2 y/o el dominio CH3.
La región constante de una inmunoglobulina es
responsable de un gran número de funciones de anticuerpos
importantes, que incluyen el enlace del receptor Fc (FcR) y la
fijación del complemento. Existen cinco clases principales de
regiones constantes de la cadena pesada, clasificadas como IgA, IgG,
IgD, IgE e IgM. Por ejemplo, la IgG está dividida en cuatro
subclases \gamma: \gamma1, \gamma2, \gamma3 y \gamma4, que
se conocen también como IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4,
respectivamente.
Las moléculas de IgG interactúan con múltiples
clases de receptores celulares, con inclusión de tres clases de
receptores Fc\gamma (Fc\gamma R) específicos para la clase IgG
de anticuerpo, concretamente Fc\gammaR1, Fc\gammaRII y
Fc\gammaRIII. Se ha descrito que las secuencias importantes para
llevar a cabo el enlace de IgG sobre los receptores Fc\gammaR
están localizadas en los dominios CH2 y CH3. La semivida en suero
de un anticuerpo está influenciada por la habilidad de este
anticuerpo para enlazarse sobre un receptor Fc (FcR). De manera
similar, la semivida en suero de las proteínas de fusión de
inmunoglobulina está influenciada, de igual modo, por la habilidad
para enlazarse sobre dichos receptores (Gillies et al.,
(1999) Cancer Res. 59:2159-66). En comparación con
los dominios de IgG1, los dominios CH2 y CH3 de IgG2 y de IgG4
tienen una afinidad de enlace con los receptores Fc bioquímicamente
indetectable o reducida. Se ha descrito que las proteínas de fusión
de inmunoglobulina, que contienen dominios CH2 y CH3 de IgG2 o de
IgG4, ya no tienen semividas en suero comparables con las de las
proteínas de fusión correspondientes, que contienen dominios CH2 y
CH3 de IgG1 (U.S. Patent No. 5,541,087; Lo et al., (1998)
Protein Engineering, 11:495-500). Por consiguiente,
en ciertas realizaciones, los dominios CH2 y CH3 se derivan de un
isotipo anticuerpo con reducida afinidad de enlace con el receptor
y con fusiones efectoras, tal como, por ejemplo, la IgG2 o la
IgG4.
IgG4.
La región bisagra está localizada por regla
general, en posición C-terminal con respecto al
dominio CH1 de la región constante de la cadena pesada. En los
isotipos de IgG, los enlaces de disulfuro se producen de manera
típica dentro de la región bisagra, permitiendo que se forme la
molécula tetrámera final. Esta región está dominada por prolinas,
serinas y treoninas. La región bisagra es, de manera típica, al
menos, homóloga con respecto a la región de la inmunoglobulina de
origen natural, que incluye los residuos de cisteína, para formar
enlaces de disulfuro que enlazan a las dos mitades Fc. Se conocen en
el estado de la técnica secuencias representativas de las regiones
bisagra de las inmunoglobulinas humanas y de ratón y pueden ser
encontradas en la publicación de Borrebaeck, C. A. K., ed., (1992)
Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Co. Las
regiones bisagra adecuadas para la presente invención pueden
derivarse de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, y de otras clases de
inmunoglobulina.
La región bisagra IgG1 tiene tres cisteínas, dos
de las cuales intervienen en los enlaces de disulfuro entre las dos
cadenas pesadas de la inmunoglobulina. Estas mismas cisteínas
permiten, de manera eficiente y consistente, la formación del
enlace de disulfuro de una porción Fc. Por consiguiente, en una
realización, una región bisagra se deriva de IgG1, tal como la IgG1
humana. Cuando se utiliza la bisagra IgG1, la primera cisteína puede
estar mutada por otro aminoácido, tal como serina.
La región bisagra isotipo IgG2 tiene cuatro
enlaces de disulfuro que tienden a favorecer la oligomerización y
posiblemente el enlace de disulfuro incorrecto durante la secreción
en sistemas recombinantes. Una región bisagra adecuada puede
derivarse de una bisagra IgG2. En una realización, las dos primeras
cisteínas de la bisagra IgG2 están mutadas en otro aminoácido.
Se sabe que la región bisagra de IgG4 forma, de
manera inefectiva, enlaces de disulfuro intercatenarios. Sin
embargo, una región bisagra adecuada para la presente invención
puede derivarse de la región bisagra IgG4 y puede contener una
mutación que refuerce la formación correcta de enlaces de disulfuro
entre mitades derivadas de la cadena pesada (Angal et al.,
(1993) Mol. Immunol., 30:105-8).
La porción Fc puede contener dominios CH2 y/o
CH3 y/o CH4 y una región bisagra, que se deriva de diferentes
isótopos de anticuerpos, por ejemplo una porción Fc híbrida. Por
ejemplo, en una realización, la porción Fc contiene dominios CH2
y/o CH3, derivados de IgG2 o de IgG4 y una región bisagra mutante,
derivada de IgG1. De manera alternativa, una región bisagra mutante
procedente de otra subclase IgG es empleada en una porción Fc
híbrida.
Por ejemplo, puede ser usada una forma mutante
de la bisagra IgG4 que permita el enlace de disulfuro eficiente
entre las dos cadenas pesadas. De la misma manera, una bisagra
mutante puede derivarse de una bisagra IgG2 en la que las dos
primeras cisteínas estén mutadas respectivamente en "otro
aminoácido". Dichas porciones Fc híbridas facilitan la expresión
a alto nivel y mejoran el ensamblaje correcto de las proteínas de
fusión Fc-IL-7. El ensamblaje de
tales porciones Fc híbridas es conocido en el estado de la técnica y
ha sido descrito en la solicitud de patente norteamericana
publicada con el No. 2003-0044423.
En algunas realizaciones, la porción Fc contiene
modificaciones de aminoácidos, que extienden, por regla general, la
semivida en suero de una proteína de fusión Fc. Tales modificaciones
de aminoácidos incluyen mutaciones que disminuyen substancialmente
o que eliminan el enlace con el receptor Fc o la actividad de
fijación del complemento. Por ejemplo, puede ser eliminado el locus
de glicosilación dentro de la porción Fc de una cadena pesada de
inmunoglobulina. En IgG1, el locus de glicosilación es Asn297 dentro
de la secuencia de aminoácidos
Gln-Tyr-Asn-Ser (SEQ
ID NO:26). En otros isotipos de la inmunoglobulina, el locus de
glicosilación corresponde a Asn297 de IgG1. Por ejemplo, en IgG2 y
en IgG4, el locus de glicosilación es la asparagina dentro de la
secuencia de aminoácidos
Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ
ID NO:28). Por consiguiente, una mutación de Asn297 de IgG1 elimina
el locus de glicosilación en una porción Fc derivada de IgG1. En una
realización, está reemplazado Asn297 por Gln. En otras
realizaciones, está mutada además la tirosina dentro de la secuencia
de aminoácidos
Gln-Tyr-Asn-Ser (SEQ
ID NO:26) para llevar a cabo la eliminación de un epitopo potencial
no propio de las células T, que resulta de la mutación de la
asparagina. Por ejemplo, puede reemplazarse la secuencia de
aminoácidos
Gln-Tyr-Asn-Ser (SEQ
ID NO:26) dentro de una cadena pesada de IgG1 por una secuencia de
aminoácidos
Gln-Ala-Gin-Ser
(SEQ ID NO:27).
De manera similar, en IgG2, o en IgG4, una
mutación de asparagina dentro de la secuencia de aminoácidos
Gln-Phe-Asn-Ser
(SEQ ID NO:28) elimina el locus de glicosilación en una porción Fc,
derivada de la cadena pesada de IgG2 o de IgG4. En una realización,
la asparagina está reemplazada por una glutamina. En otras
realizaciones, está mutada además la fenilalanina dentro de la
secuencia de aminoácidos
Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ
ID NO:28) para eliminar un epitopo potencial no propio de las
células T, que resulta de la mutación de la asparagina. Por ejemplo,
puede reemplazarse la secuencia de aminoácidos
Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ
ID NO:28) dentro de una cadena pesada de IgG2 o de IgG4 por una
secuencia de aminoácidos
Gln-Ala-Gln-Ser (SEQ
ID NO:27).
De la misma manera, se ha observado que la
alteración de aminoácidos cerca de la unión de la porción Fc y de
la porción no-Fc puede aumentar de manera dramática
la semivida en suero de la proteína de fusión Fc. (U.S. Published
Patent Application No. 2002-0147311). Por
consiguiente, la región de unión de una
Fc-IL-7 o de la proteína de fusión
IL-7-Fc de la presente invención
puede contener alteraciones que se encuentra aproximadamente a 10
aminoácidos desde el punto de unión, con relación a las secuencias
de origen natural de una cadena pesada de inmunoglobulina y de
IL-7. Estos cambios de aminoácidos pueden provocar
un aumento de la hidrofobicidad, por ejemplo, por el cambio de la
lisina C-terminal de la porción Fc por un aminoácido
hidrófugo tal como la alanina o la leucina. (Véase, por ejemplo, la
SEQ ID NO:34). En otra realización de la invención, está suprimida
la lisina C-terminal y la glicina precedente de la
porción Fc. (Véase por ejemplo la SEQ ID NO:35).
En otras realizaciones, la porción Fc contiene
alteraciones de aminoácidos del segmento
Leu-Ser-Leu-Ser
próximo al extremo C de la porción Fc de una cadena pesada de
inmunoglobulina. Las substituciones de aminoácidos del segmento
Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ
ID NO:29) eliminan epitopos potenciales de unión de las células T.
En una realización, la secuencia de aminoácidos
Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ
ID NO:29), próxima al extremo C de la porción Fc, está reemplazada
por una secuencia de aminoácidos
Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ
ID NO:30). En otras realizaciones, están reemplazados los
aminoácidos dentro del segmento
Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ
ID NO:29) por otros aminoácidos tales como la glicina o la prolina.
Se han descrito en la solicitud de patente norteamericana publicada
con el No. 2003-0166877 métodos detallados para la
generación de substituciones de aminoácidos del segmento
Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ
ID NO:29) cerca del extremo C en una IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, o en
otras moléculas de la clase de la inmunoglobulina, así como otras
modificaciones ejemplificativas para llevar a cabo la alteración de
los epitopos de unión de las células T de la unión.
En una realización, está insertado un espaciador
o péptido de segmento enlazador entre la proteína portadora y la
proteína de la IL-7. El espaciador, o el péptido de
segmento enlazador, puede no estar cargado o puede ser no polar o
puede ser hidrófugo. La longitud del espaciador o del péptido de
segmento enlazador está comprendida entre 1 y aproximadamente 100
aminoácidos, o entre 1 y aproximadamente 50 aminoácidos, o entre 1 y
aproximadamente 25 aminoácidos, o entre 1 y aproximadamente 15
aminoácidos. En una realización, el espaciador contiene una
secuencia (G_{4}S)_{n}, en la que n es menor que 10. En
otra realización, la secuencia de segmento enlazador es GGGGSGGGG
(SEQ ID NO:67). Así mismo, en otra realización, el espaciador
contiene un motivo, que es reconocido como un locus de
glicosilación enlazado con N. En otra realización de la exposición,
la proteína portadora y la proteína de fusión IL-7
están unidas a través de un espaciador o de un péptido de segmento
enlazador. En una realización alternativa, la proteína portadora y
la proteína de fusión IL-7 están separadas por medio
de un espaciador sintético, por ejemplo un espaciador de aglutinina
de cacahuete PNA. El espaciador puede no estar cargado, o puede ser
no polar o puede ser hidrófugo.
Las proteínas de fusión, que contienen a la
IL-7 modificada de conformidad con las enseñanzas de
la invención, pueden ser sintetizadas por medio de los métodos no
limitativos, aquí descritos. De igual modo, se han descrito aquí
ensayos útiles para la evaluación de las actividades
farmacocinéticas de las proteínas de fusión, que contienen a la
IL-7, modificada de conformidad con la invención, en
modelos animales in vivo.
Las proteínas de fusión IL-7 de
la invención pueden ser producidas por medio de la utilización de
vectores de expresión recombinante conocidos en el estado de la
técnica. El término "vector de expresión" se refiere a un
constructo de ADN replicable utilizado para expresar el ADN, que
codifica la deseada proteína de fusión IL-7 y que
incluye una unidad transcripcional, que comprende un conjunto de (1)
uno o varios elementos genéticos, que tienen un papel regulador en
la expresión génica, por ejemplo promotores, operadores, o
reforzadores, enlazados de manera operativa con (2) una secuencia
de ADN, que codifica la deseada proteína de fusión
IL-7, que es transcrita en el ARNm y traducida en
proteína, y (3) secuencias apropiadas para la iniciación y para la
terminación de la transcripción y de la traducción. La elección del
promotor y de otros elementos reguladores varía, por regla general,
de acuerdo con la célula huésped prevista.
El ácido nucleico, que codifica la proteína de
fusión IL-7, es transfectado en una célula huésped
empleándose técnicas de ADN recombinante. En el contexto de la
presente invención, el ADN foráneo incluye una secuencia, que
codifica las proteínas inventivas. Las células huésped adecuadas
incluyen las células procariotas, las levaduras o las células
eucariotas superiores. En una realización, el huésped es un
organismo procariota.
Las proteínas de fusión IL-7
recombinantes pueden ser expresadas en huéspedes de levadura, tales
como las que proceden de las especies Saccharomyces, tal
como la S. cerevisiae. Así mismo, pueden ser empleadas las
levaduras de otros géneros tales como Pichia o
Kluyveromyces. Los vectores de levadura contienen, por regla
general, un origen de replicación procedente de un plásmido de
levadura o una secuencia de replicación autónoma (ARS), un
promotor, ADN que codifica la proteína de fusión
IL-7, secuencias para la poliadenilación y
terminación de la transcripción y un gen de selección. Las
secuencias promotoras adecuadas en vectores de levadura incluyen
los promotores para metalotioneína, la
3-fósforoglicerato cinasa u otros enzimas
glicolíticos, tal como la enolasa, la
gliceroaldehído-3-fosfato
dehidrogenasa, la hexocinasa, la piruvato decarboxilasa, la
fosfofructocinasa, la
glucosa-4-fosfato isomerasa, la
3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato cinasa, la
triosefosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la
glucocinasa.
glucocinasa.
Pueden emplearse varios sistemas de cultivos de
células de mamíferos o de insectos para llevar a cabo la expresión
de la proteína recombinante. Se conocen perfectamente en el estado
de la técnica sistemas de baculovirus para llevar a cabo la
producción de proteínas en células de insectos. Ejemplos de líneas
adecuadas de células huésped de mamíferos incluyen las células
NS/0, las células L, las líneas celulares C127, 3T3, de ovario de
hámster chino (CHO), HeLa, y BHK. Células huésped adicionales de
mamíferos, que son adecuadas, incluyen las células
CV-1 (ATCC CCL70) y las células
COS-7, derivándose ambas del riñón de mono. Otra
línea celular de riñón de mono adecuada, la
CV-1/EBNA, ha sido derivada por transfección de la
línea celular CV-1 con un gen que codifica el
antígeno-1 nuclear del virus
Epstein-Barr (EBNA-1) y con un
vector que contiene secuencias reguladoras de CMV (McMahan et
al., (1991), EMBO J., 10:2821). El gen EBNA-1
permite la replicación episomal de vectores de expresión, tal como
el HAV-EO o el pDC406, que contienen el origen de
replicación EBV.
Los vectores de expresión de mamíferos pueden
comprender elementos no transcritos tales como un origen de
replicación, un promotor adecuado y un reforzador enlazado con el
gen que debe ser expresado, y otras secuencias flanqueantes no
transcritas 5' o 3', y secuencias no traducidas 5' o 3', tales como
loci necesarios de enlace de ribosomas, un locus de
poliadenilación, loci donadores y aceptores de corte y empalme, y
secuencias de terminación transcripcional. Los promotores y los
reforzadores, que son utilizados comúnmente, se derivan de polioma,
de adenovirus 2, de virus de simio 40 (SV40), y del citomegalovirus
humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma vírico de SV40,
por ejemplo, el origen SV40, el promotor temprano y tardío, el
reforzador, el corte y empalme, y los loci de poliadenilación
pueden ser usados para proporcionar los otros elementos genéticos,
que se requieren para llevar a cabo la expresión de una secuencia de
ADN heteróloga.
Cuando se desea la secreción de la proteína de
fusión IL-7 a partir de la célula huésped, el vector
de expresión puede comprender ADN que codifica un péptido señal o
péptido director. En la presente invención, puede ser usada la
secuencia de señal nativa de la IL-7 o, de manera
alternativa, puede ser añadida una secuencia señal heteróloga, tal
como la secuencia señal procedente de la
interleucina-4.
De la misma manera, la presente invención
proporciona un proceso para la preparación de las proteínas
recombinantes de la presente invención, que incluye el cultivo de
una célula huésped transformada con un vector de expresión, que
comprende una secuencia de ADN, que codifica la proteína de fusión
IL-7 bajo condiciones que favorecen la expresión.
La proteína deseada se purifica a continuación a partir de los
medios de cultivo o de los extractos celulares. Por ejemplo, en
primer lugar pueden ser concentrados los sobrenadantes procedentes
de los sistemas de expresión, que secretan la proteína recombinante
en el medio de cultivo, empleándose un filtro para la concentración
de proteínas, que se encuentra disponible en el comercio, por
ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon.
Después de la etapa de concentración, el concentrado puede ser
aplicado a una matriz de purificación adecuada, tal como es
conocido en el estado de la técnica.
Una proteína de fusión IL-7 o la
porción biológicamente activa de la misma "aislada" o
"purificada" está substancialmente exenta de material celular
o de otras proteínas contaminantes, procedentes de la célula o de la
fuente tisular, del cual se deriva la proteína de fusión
IL-7, o está substancialmente exenta de precursores
químicos o de otros productos químicos cuando se haya sintetizado
por vía química. La expresión "substancialmente exenta de
material celular" incluye aquellas preparaciones de proteína de
fusión IL-7, en las que la proteína se ha separado
de los componentes celulares de las células, de las cuales se ha
aislado o se ha producido por vía recombinante. En una realización,
la expresión "substancialmente exenta de material celular"
incluye aquellas preparaciones de proteína de fusión
IL-7, que tiene menos de aproximadamente un 30% (en
peso seco) de proteína de fusión
no-IL-7 (que se denomina aquí
también como "proteína contaminante"), menos de aproximadamente
un 20% de proteína de fusión
no-IL-7, menos de aproximadamente un
10% de proteína de fusión no-IL-7, o
menos de aproximadamente un 5% de proteína de fusión
no-IL-7. Cuando la proteína de
fusión IL-7 o la porción biológicamente activa de
la misma sea purificada a partir de una fuente recombinante, ésta
está substancialmente exenta, de conformidad con una realización,
de medio de cultivo, es decir que el medio de cultivo
representa menos de aproximadamente un 20%, menos de
aproximadamente un 10%, o menos de aproximadamente un 5% del volumen
de la preparación proteica.
El término "proteína de fusión
Ig-IL-7 substancialmente pura" o
"proteína de fusión IL-7 substancialmente
pura" se refiere a una preparación en la que la
IL-7 comprende proteína de fusión constituida por,
al menos, un 60%, un 70%, un 80%, un 90%, un 95% o un 99% de las
proteínas en la preparación.
Las proteínas de la IL-7, con
inclusión de las proteínas de fusión de la invención, son adecuadas
para la manufactura de un medicamento destinado al tratamiento del
cáncer o de la infección HIV. Por otra parte, las proteínas de la
IL-7 pueden ser adecuadas para el tratamiento de
enfermedades cancerosas tales como el cáncer de vejiga, cáncer de
pulmón, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer de piel y cáncer de
próstata. En un ejemplo, es adecuado tratar con proteínas de la
IL-7 a los pacientes, que han sufrido uno o varios
ciclos de quimioterapia, tal como se ha descrito precedentemente,
para ayudar a que se regeneren sus células inmunitarias. De manera
alternativa, también es adecuado administrar las proteínas de la
IL-7, que han sido descritas precedentemente, a
pacientes con infección de HIV, a personas de edad avanzada, a
pacientes que reciban un transplante u otros pacientes con función
deficiente del sistema inmune.
Tanto la IL-7 así como las
proteínas de fusión IL-7 de la invención pueden ser
incorporadas en una composición farmacéutica adecuada para su
administración. Tales composiciones comprenden de manera típica a la
IL-7 o a una proteína de fusión
IL-7 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Tal como se utiliza aquí la expresión "excipiente
farmacéuticamente aceptable" debe entenderse que incluye
cualquier disolvente y todos los disolventes, los medios de
dispersión, los revestimientos, los agentes antibacterianos y
antifúngicos, los agentes isotónicos e retardantes de la absorción,
y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso
de tales medios y agentes para las substancias farmacéuticamente
activas es perfectamente conocido en el estado de la técnica.
Una composición farmacéutica de la exposición se
formula con objeto de que sea compatible con su vía de
administración prevista. Ejemplos de vías de administración
incluyen la administración parenteral, por ejemplo intravenosa,
intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación),
transdérmica (tópica), transmucosal y rectal. Las soluciones o las
suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica o
subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente
estéril tal como el agua para inyección, una solución salina, los
aceites fijos, los polietilenglicoles, la glicerina, el
propilenglicol u otros disolventes sintéticos; los agentes
antibacterianos tales como el alcohol bencílico o los
metilparabenos; los antioxidantes tales como el ácido ascórbico o
el bisulfito de sodio; los agentes formadores de quelatos tal como
el ácido etilendiaminotetraacético; los tampones tales como los
acetatos, los citratos o los fosfatos y los agentes para ajustar la
tonicidad tales como el cloruro de sodio o la dextrosa. El pH puede
ser ajustado con ácidos o con bases, tales como el ácido
clorhídrico o el hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede
estar recogida en ampollas, en jeringas de un solo uso o viales
para múltiples dosis, realizados con vidrio o con
plástico.
plástico.
Los medicamentos, que contienen a las proteínas
de fusión IL-7, pueden tener una concentración
comprendida entre un 0,01 y un 100% (p/p), pero la cantidad varía
de conformidad con la forma de dosificación de los medica-
mentos.
mentos.
La dosis de administración depende del peso
corporal de los pacientes, de la gravedad de la enfermedad y de la
opinión del médico. Sin embargo, en general es aconsejable
administrar entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 mg/kg
de peso corporal por día, desde aproximadamente 0,02 hasta
aproximadamente 2 mg/kg/día en caso de inyección, o aproximadamente
0,5 mg/kg/día. La dosis puede ser administrada una o varias veces al
día de conformidad con la gravedad de la enfermedad y según la
opinión del médico.
A continuación se han ilustrado aspectos de la
invención por medio de los ejemplos siguientes.
Ejemplo
1
Los epitopos de la IL-7 pueden
ser modificados mediante el uso de métodos para llevar a cabo la
introducción de mutaciones en las proteínas, con objeto de modular
su interacción con el sistema inmune. Estos métodos son similares a
los que han sido descritos en la solicitud de patente norteamericana
publicada con el No. 2003-0166877. Los métodos
conocidos en el estado de la técnica, que pueden ser adaptados,
incluyen aquellos que están descritos en el estado de la técnica
previo (WO 92/10755 y WO 96/40792 (Novo Nordisk), EP 0519 596
(Merck & Co.), EP 0699 755 (Centro de Inmunología Molecular), WO
98/52976 y WO 98/59244 (Biovation Ltd.) o métodos emparentados.
Sin embargo, pueden ser obtenidas proteínas
mutantes ventajosas si se lleva a cabo la identificación de dichos
epitopos siguiéndose el método que está descrito aquí en detalle y
aplicado a la IL-7. Existe un número de factores
que juegan papeles importantes en la determinación de la estructura
total de una proteína, de un polipéptido o de una inmunoglobulina.
En primer lugar, el enlace peptídico, es decir el enlace que une
entre sí a los aminoácidos en la cadena, es un enlace covalente.
Este enlace es de estructura planar, esencialmente es una amida
substituida. Una "amida" es cualquier grupo de compuestos
orgánicos, que contenga el agrupamiento -CONH-.
El enlace peptídico planar, que enlaza C\alpha
de aminoácidos adyacentes, puede ser representado como se muestra a
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a que O=C y los átomos
C-N yacen en un plano relativamente rígido, no se
produce una rotación libre alrededor de estos ejes. Por
consiguiente, un plano esquemáticamente representado por la línea de
trazos discontinuos se denomina, a veces, como un plano
"amida" o "plano peptídico", en el que se encuentran los
átomos de oxígeno (O), de carbono (C), de nitrógeno (N) y de
hidrógeno (H) de la cadena principal peptídica. En los vértices
opuestos de este plano amida están localizados los átomos C\alpha.
Puesto que, substancialmente, no existe rotación alrededor de los
átomos O=C ni alrededor de los átomos C-N en el
plano peptídico o en el plano amida, una cadena polipeptídica
comprende, por consiguiente, una serie de enlaces peptídicos
planares, que unen a los átomos
C\alpha.
C\alpha.
Un segundo factor, que juega un papel importante
a la hora de definir la estructura total o la conformación de un
polipéptido o de una proteína, es el ángulo de rotación de cada
plano amida alrededor del enlace común C\alpha. El término
"ángulo de rotación" y "ángulo de torsión" se consideran a
continuación como términos equivalentes. Suponiendo que los átomos
de O, de C, de N y de H permanecen en el plano amida (que es
usualmente una suposición válida, aún cuando pueden existir algunas
ligeras desviaciones respecto a la planaridad de estos átomos para
algunas conformaciones), estos ángulos de rotación definen la
conformación de la cadena principal del polipéptido N y R, es decir
que la estructura tal como la que existe como tal entre residuos
adyacentes. Estos dos ángulos son conocidos como \varphi y \psi.
Por consiguiente un grupo de los ángulos \varphi_{i},
\psi_{i}, representando el subíndice i un residuo particular de
una cadena polipeptídica, define de manera eficiente la estructura
polipeptídica secundaria. Los acuerdos empleados en la definición
de los ángulos \varphi, \psi, es decir los puntos de
referencia en los que los planos amida forma un ángulo de grado
cero, y la definición de qué ángulo es \varphi, y de qué ángulo es
\psi, para un polipéptido dado, están definidos en la literatura.
(Véase, por ejemplo, la publicación de Ramachandran et al.,
(1968), Adv. Prot. Chem. 23:283-437, en las páginas
285-94).
El método puede ser aplicado a cualquier
proteína, y está basado en parte en el descubrimiento de que en los
seres humanos la posición de anclaje primaria de la Bolsillo 1 de
las cisuras que enlazan la molécula de MHC Clase II, tiene una
especificidad perfectamente diseñada para cadenas laterales
particulares de aminoácidos. La especificidad de este bolsillo está
determinada por medio de la identidad de los aminoácidos en la
posición 86 de la cadena beta de la molécula de MHC Clase II. Este
locus está localizado en la parte inferior del Bolsillo 1 y
determina el tamaño de la cadena lateral que puede ser acomodado por
este bolsillo. Marshall, J. Immunol., (1994),
152:4946-4956. Si este residuo es una glicina,
entonces pueden ser acomodados en el bolsillo todos los aminoácidos
hidrófugos alifáticos y aromáticos (siendo hidrófugos alifáticos: la
valina, la leucina, la isoleucina, la metionina y siendo
aromáticos: la fenilalanina, la tirosina y el triptofano), siendo
preferentes las cadenas laterales aromáticas. Si este residuo de
bolsillo es una valina, entonces la cadena lateral de este
aminoácido penetra en el bolsillo y restringe el tamaño de las
cadenas laterales peptídicas que pueden ser acomodadas de tal
manera, que únicamente pueden ser acomodadas cadenas laterales
alifáticas hidrófugas. Por consiguiente, en una secuencia de
residuo de aminoácido, siempre que se encuentre un aminoácido con
una cadena lateral hidrófuga alifática o aromática, existe el
potencial para un epitopo de las células T de MHC Clase II
restringido. Sin embargo, si la cadena lateral es hidrófuga
alifática, existe una posibilidad aproximadamente dos veces mayor
de que esté asociada con un epitopo de las células T que la de una
cadena lateral aromática (suponiendo una distribución
aproximadamente uniforme de los tipos de Bolsillo 1 a través de la
población
global).
global).
Un método informático ejemplificativo perfila la
probabilidad de que las regiones peptídicas de la
IL-7 contengan epitopos de las células T de la
manera siguiente: (1) se explora la secuencia primaria de un
segmento peptídico de longitud predeterminada, y son identificadas
todas las cadenas laterales hidrófugas alifáticas y aromáticas
presentes. (2) Se asigna a las cadenas laterales hidrófugas
alifáticas un valor mayor que para las cadenas laterales
aromáticas; preferentemente dos veces aproximadamente el valor
asignado a las cadenas laterales aromáticas, por ejemplo un valor
de 2 para una cadena lateral hidrófuga alifática y un valor de 1
para una cadena lateral aromática. (3) Se suman los valores que han
sido establecidos como presentes para cada segmento de residuo de
aminoácidos de solapamiento (ventana) de longitud uniforme
predeterminada dentro del péptido, y se asigna el valor total para
un segmento particular (ventana) a un residuo individual de
aminoácidos en una posición intermedia del segmento (ventana), de
manera preferente a un residuo que se encuentra aproximadamente en
el punto central del segmento muestreado (ventana). Este
procedimiento se repite para cada segmento de residuo de
aminoácidos de solapamiento muestreado (ventana). De este modo, se
asigna a cada residuo de aminoácidos del péptido un valor que
describe la probabilidad de que un epitopo de las células T esté
presente en dicho segmento particular (ventana). (4) Los valores
calculados y asignados, tal como se ha descrito en la etapa 3,
precedente, pueden ser trazados frente a las coordenadas de los
aminoácidos de la secuencia entera del residuo de aminoácidos, que
está siendo evaluada. (5) Se considera que contienen, probablemente,
un epitopo de las células T todas las porciones de la secuencia,
que tienen una puntuación de valor predeterminado, por ejemplo un
valor de 1, y pueden ser modificadas, si se
desea.
desea.
La predicción informática de los epitopos de las
células T presentes dentro de un péptido, de conformidad con este
aspecto particular, contempla la construcción de modelos para al
menos 42 alelos de MHC Clase II, basados en las estructuras de
todas las moléculas conocidas de MHC Clase II y en un método para el
uso de estos modelos en la identificación informática de los
epitopos de las células T, en la construcción de librerías de
cadenas principales peptídicas para cada modelo, con el fin de
permitir la conocida variabilidad en posiciones relativas de la
cadena principal peptídica del carbono alfa (C\alpha), en la
construcción de librerías de conformaciones de cadena lateral de
aminoácidos para cada acoplamiento de cadena principal con cada
modelo para cada una de las 20 alternativas de aminoácidos en
posiciones críticas para la interacción entre el péptido y la
molécula de MHC Clase II, y en el uso de estas librerías de
conformaciones de cadenas principales y de cadenas laterales en
conjunción con una función de puntuación, para llevar a cabo la
selección de la conformación óptima de la cadena principal y de la
cadena lateral para un péptido particular acoplado con una molécula
particular de MHC Clase II y la deducción de una puntuación de
enlace a partir de esta interacción.
Los modelos de moléculas de MHC Clase II pueden
ser deducidos a través de un modelado de homología a partir de un
número de estructuras similares, que se encuentran en el Banco de
Datos de Proteínas (Protein Data Bank) de Brookhaven ("PDB").
Estos modelos pueden ser realizados por medio del uso de programas
de ordenador para el modelado por homología semiautomático
(Modeller et al., (1993), J. Mol. Biol.,
234:779-815), que incorpora una función de
hibridación simulada, en conjunción con el campo de fuerzas CHARMm
para minimizar la energía (disponible en la firma Molecular
Simulations Inc., San Diego, Ca.). De la misma manera pueden ser
utilizados métodos de modelado alternativos.
Se conocen otros métodos informáticos, que
utilizan librerías de datos de enlace, calculados de manera
experimental, de cada alternativa de aminoácido en cada posición en
la cisura de enlace para un grupo pequeño de moléculas de MHC Clase
II (Marshall et al., (1995), Biomed. Pept. Proteins Nucleic
Acids, 1(3):157-162), así como otros métodos
informáticos, que usan datos de enlace experimentales similares, con
objeto de definir las características de enlace de tipos
particulares de bolsillos de enlace dentro de la cisura, que usan, a
su vez, un subgrupo relativamente pequeño de moléculas de MHC Clase
II, y a continuación el "mezclado y el emparejamiento" de
tipos de bolsillo a partir de esta librería de bolsillos para formar
artificialmente otras moléculas de MHC Clase II "virtuales"
(Stumiolo et al., (1999), Nat. Biotech, 17(6):
555-561). Ambos métodos presentan el inconveniente
principal de que, como consecuencia de la complejidad de los ensayos
y de la necesidad de sintetizar un elevado número de variantes
peptídicas, únicamente puede ser explorado experimentalmente un
pequeño número de moléculas de MHC Clase II. Por consiguiente, el
primer método puede hacer predicciones únicamente para un número
pequeño de moléculas de MHC Clase II. De la misma manera, el
segundo método supone que un bolsillo alineado con aminoácidos
similares en una molécula tendrá las mismas características de
enlace en el contexto de un alelo diferente de Clase II y, además,
presenta otros inconvenientes debido a que únicamente pueden ser
formadas "virtualmente" aquellas moléculas de MHC Clase II que
contengan bolsillos, contenidos dentro de la librería de bolsillos.
Utilizando el enfoque de modelado aquí descrito, puede ser deducida
la estructura de cualquier número y tipo de moléculas de MHC Clase
II, por consiguiente pueden ser seleccionados específicamente alelos
representativos de la población global. Adicionalmente, el número
explorado de moléculas de MHC Clase II puede ser aumentado
llevándose a cabo otros modelos además de tener que generar datos
adicionales a través de una experimentación
compleja.
compleja.
El uso de una librería de cadenas principales
permite la variación en las posiciones de lops átomos C\alpha de
los diversos péptidos que son explorados cuando están acoplados con
moléculas particulares de MHC Clase II. De nuevo esto está en
contraste con los métodos informáticos alternativos descritos
precedentemente, que dependen del uso de cadenas principales
peptídicas simplificadas para explorar el enlace de aminoácidos en
bolsillos particulares. Estas cadenas principales simplificadas
probablemente no son adecuadas para ser representativas de las
conformaciones de cadenas principales, que se encuentran en los
péptidos "reales", lo que conducen a inexactitudes en cuanto a
la predicción del enlace peptídico. La presente librería de cadenas
principales se forma por medio de la superposición de las cadenas
principales de todos los péptidos enlazados con las moléculas de
MHC Clase II, que se encuentran dentro del Banco de Datos de
Proteínas (Protein Data Bank) y la anotación de la raíz significa
desviación al cuadrado (RMS) entre los átomos C\alpha y cada uno
de los once aminoácidos, que están localizados dentro de la cisura
de enlace. Aún cuando esta librería puede ser obtenida a partir de
un pequeño número de estructuras adecuadas de ratones y de seres
humanos disponibles (corrientemente 13), con objeto de permitir la
posibilidad de una variabilidad incluso mayor, la cifra RMS de cada
posición C''- \alpha es aumenta en un 50%. A continuación se
determina la posición C\alpha media de cada aminoácido y se
dibuja una esfera alrededor de este punto, cuyo radio es igual a la
desviación RMS en esta posición más un 50%. Esta esfera representa
todas las posiciones C\alpha permitidas.
Cuando se trabaja a partir de C\alpha con la
última desviación RMS (la del aminoácido en el Bolsillo 1, como se
ha mencionado precedentemente, equivalente a la posición 2 de los 11
residuos en la cisura de enlace), la esfera está cuadriculada de
forma tridimensional y cada vértice dentro de la cuadrícula se
utiliza entonces como posible localización para un C\alpha de
dicho aminoácido. El plano amida subsecuente, que corresponde al
péptido enlazado con el aminoácido subsecuente, es injertado en cada
uno de estos C\alphas y los ángulos \varphi y \psi se hacen
rotar paso a paso a intervalos establecidos, con objeto de
posicionar al C\alpha subsecuente. Si el C\alpha subsecuente
cae dentro de la "esfera de posiciones permitidas" para este
C\alpha, entonces es aceptada la orientación del dipéptido
mientras que, si cae fuera de la esfera, entonces el dipéptido es
rechazado. Este proceso se repite entonces para cada una de las
posiciones C\alpha subsecuentes, de tal manera que el péptido
crece desde el Bolsillo 1 C\alpha "de siembra", hasta que
todos los nueve C\alphas subsecuentes hayan sido posicionados
desde todas las permutaciones posibles de los C\alphas
precedentes. El proceso se repite a continuación una vez para el
C\alpha sencillo, que precede al bolsillo 1, con el fin de formar
una librería de posiciones C\alpha de la cadena principal,
localizada dentro de la cisura de enlace.
El número generado de cadenas principales
depende de diversos factores: el tamaño de las "esferas de las
posiciones permitidas"; la finura de la cuadriculación de la
"esfera primaria" en la posición del Bolsillo 1; la finura de
la rotación paso a paso de los ángulos \varphi y \psi usada para
posicionar a los C\alphas subsecuentes. Cuando se usa este
proceso, puede ser formada una amplia librería de cadenas
principales. Cuanto más amplia sea la librearía de las cadenas
principales, tanto mayor será la probabilidad de que sea encontrado
el ajuste óptimo para un péptido particular dentro de la cisura de
enlace de una molécula de MHC Clase II. Teniendo en consideración
que todas las cadenas principales no serán adecuadas para llevar a
cabo el acoplamiento con todos los modelos de las moléculas de MHC
Clase II, como consecuencia de la coincidencia con aminoácidos de
los dominios de enlace, se ha formado para cada alelo un subgrupo de
la librería, que comprende cadenas principales, que pueden ser
acomodadas con dicho alelo. El uso de la librería de cadenas
principales, en conjunción con los modelos de las moléculas de MHC
Clase II, forma una exhaustiva base de datos, que consiste en
permitir conformaciones de cadena lateral para cada aminoácido en
cada posición de la cisura de enlace para cada molécula de MHC
Clase II acoplada con cada cadena principal permitida. Este grupo de
datos es formado mediante el uso de una simple función de
superposición estérica en la que una molécula de MHC Clase II está
acoplada con una cadena principal y una cadena lateral de
aminoácidos está injertada en la cadena principal en la posición
deseada. Cada uno de los enlaces de rotación de la cadena lateral es
rotado paso a paso a intervalos establecidos y las posiciones
resultantes de los átomos dependen del enlace anotado. Se anota la
interacción del átomo con átomos de las cadenas laterales de la
cisura de enlace y las posiciones son o bien aceptadas o bien
rechazadas, de conformidad con los criterios siguientes: la suma
total de solapamiento de todos los átomos, en tanto en cuanto estén
posicionados, no debe exceder de un valor predeterminado. De este
modo la rigurosidad de la investigación en cuanto a la conformación
es una función del intervalo usado en la rotación paso a paso del
enlace y del límite predeterminado para el solapamiento total. Este
último valor puede ser pequeño si se sabe que un bolsillo
particular es rígido; sin embargo, la rigurosidad puede ser menos
exigente si se sabe que son relativamente flexibles las posiciones
de bolsillo de las cadenas laterales. De este modo, pueden hacerse
concesiones para imitar variaciones de flexibilidad dentro de los
bolsillos de la cisura de enlace. Esta investigación en cuanto a la
conformación se repite a continuación para cada aminoácido en para
cada posición de cada cadena principal cuando está acoplada con
cada una de las moléculas de MHC Clase II para formar la base de
datos exhaustiva de las conformaciones de las cadenas
laterales.
Se usa una expresión matemática adecuada para
estimar la energía de enlace entre modelos de moléculas de MHC
Clase II en conjunción con las conformaciones de ligando peptídico,
que deben ser deducidas empíricamente por exploración de la amplia
base de datos de las conformaciones de cadena principal/cadena
lateral, que han sido descritas precedentemente. De este modo, una
proteína es explorada con respecto a epitopos potenciales de las
células T por medio de la aplicación a cada posible péptido, con una
longitud que varía entre 9 y 20 aminoácidos (aún cuando la longitud
se mantiene constante para cada exploración) a los siguientes
procesos informáticos: se selecciona una molécula de MHC Clase II
junto con una cadena principal peptídica permitida para dicha
molécula y se injertan las cadenas laterales que corresponden a la
secuencia peptídica deseada. Para cada conformación permitida de
dicho aminoácido (obtenida a partir de la base de datos, que ha sido
descrita precedentemente) se recogen los datos de identidad atómica
y de distancia interatómica, relativos a una cadena lateral
particular en una posición particular en la cadena principal. Esto
se repite para cada cadena lateral a lo largo de la cadena
principal y se deducen puntuaciones peptídicas usándose una función
de puntuación. Se retiene la mejor puntuación para dicha cadena
principal y el proceso se repite para cada cadena principal
permitida para el modelo seleccionado. Se comparan las puntuaciones
precedentes de todas las cadenas principales permitidas y se
promedia la puntuación máxima como la puntuación peptídica para el
péptido deseado en el modelo de MHC Clase II. Este proceso se
repite entonces para cada modelo con cada posible péptido deducido a
partir de la proteína que está siendo explorada, y se representan
las puntuaciones para los péptidos frente a los modelos.
Cada ligando, presentado para el cálculo de la
afinidad de enlace, es un segmento de aminoácido, seleccionado a
partir de un péptido o de una proteína tal como se ha tratado
precedentemente. De este modo, el ligando es un tramo seleccionado
de aminoácidos con una longitud aproximada comprendida entre 9 y 20
aminoácidos, deducido a partir de un péptido, de un polipéptido o
de una proteína de secuencia conocida. A continuación se consideran
como términos equivalentes los términos "aminoácidos" y
"residuos". El ligando, en la forma de aminoácidos
consecutivos del péptido que debe ser examinado, injertado en la
cadena principal procedente de la librería de cadenas principales,
es colocado en la hendidura de enlace de una molécula de MHC Clase
II, procedente de la librería de modelos de moléculas de MHC Clase
II, por medio de las coordenadas de los átomos
C''-\alpha de la cadena principal peptídica y se
selecciona una conformación permitida para cada cadena lateral a
partir de la base de datos de las conformaciones permitidas. Las
identidades atómicas relevantes y las distancias interatómicas son
recuperadas también a partir de esta base de datos y son usadas para
llevar a cabo el cálculo de la puntuación de enlace peptídico. Los
ligandos, que tienen una elevada afinidad de enlace para el
bolsillo de enlace de MHC Clase II son etiquetados como candidatos
para mutagénesis dirigida al locus. Las substituciones de
aminoácidos se realizan en el ligando etiquetado (y, por
consiguiente, en la proteína de interés) que se vuelve a ensayar a
continuación usándose la función de puntuación con objeto de llevar
a cabo la determinación de los cambios que reduzcan la afinidad de
enlace por debajo de un valor de umbral predeterminado. Estos
cambios pueden ser incorporados a continuación en la proteína de
interés para eliminar los epitopos de las células T.
El enlace entre el ligando peptídico y la cisura
de enlace de las moléculas de MHC Clase II, implica interacciones
no covalentes, que incluyen, pero no que están limitadas a: enlaces
de hidrógeno, interacciones electrostáticas interacciones
hidrófugas (lipófilas) e interacciones de van der Waal. Estas
interacciones están incluidas en la función de puntuación peptídica
tal como se ha descrito en detalle más adelante. Debe entenderse que
un enlace de hidrógeno es un enlace no covalente, que puede estar
formado entre grupos polares o grupos cargados y que consiste en un
átomo de hidrógeno compartido por otros dos átomos. El hidrógeno del
donante de hidrógeno tiene una carga positiva mientras que el
aceptor de hidrógeno tiene una carga parcialmente negativa. Para
los fines de las interacciones de péptido/proteína, los donantes de
enlace de hidrógeno pueden ser o bien nitrógenos con hidrógeno
enlazado o bien hidrógenos enlazados con oxígeno o con nitrógeno.
Los átomos aceptores del enlace de hidrógeno pueden ser oxígenos no
enlazados con hidrógeno, nitrógenos con hidrógenos no enlazados y
con una o con dos conexiones, o azufres con, únicamente, una
conexión. Algunos átomos, tales como los oxígenos enlazados con
hidrógenos o los nitrógenos de tipo imina (por ejemplo C=NH) pueden
ser tanto aceptores como donantes de hidrógeno. Las energías de
enlace de hidrógeno están comprendidas entre 3 y 7 Kcal/mol y son
mucho más fuertes que los enlaces de van der Waal, pero son más
débiles que los enlaces covalentes. Los enlaces de hidrógeno
también son altamente direccionales y tienen su fuerza máxima cuando
el átomo donante, el átomo de hidrógeno y el átomo aceptor son
colineales. Los enlaces electrostáticos se forman entre pares de
iones cargados con signos opuestos y la fuerza de la interacción es
inversamente proporcional al cuadrado de la distancia entre los
átomos de conformidad con la ley de Coulomb. La distancia óptima
entre los pares de iones es aproximadamente de 2,8 \ring{A}. En
interacciones de proteína/péptido, los enlaces electrostáticos
pueden estar formados entre la arginina, la histidina o la lisina y
el aspartato o el glutamato. La fuerza del enlace depende del pKa
del grupo ionizante y de la constante dieléctrica del medio, aún
cuando éstos tienen aproximadamente una fuerza similar a la de los
enlaces de hidrógeno.
Las interacciones lipófilas son contactos
favorables hidrófugo-hidrófugo, que se producen
entre la proteína y el ligando peptídico. De manera usual, estas
interacciones se producen entre las cadenas laterales de aminoácidos
hidrófugas del péptido, que está oculto dentro de los bolsillos de
la cisura de enlace de tal manera, que no están expuestos al
disolvente. La exposición de los residuos hidrófugos al disolvente
es altamente desfavorable puesto que las moléculas de disolvente
circundantes están forzadas a formar enlaces de hidrógeno entre sí,
formando estructuras de tipo clatrato similares a una jaula. La
disminución resultante en entropía es altamente desfavorable. Los
átomos lipófilos pueden ser azufres, que no son polares ni son
aceptores de hidrógeno, y átomos de carbono, que no son
polares.
Los enlaces de van der Waal son fuerzas no
específicas, que se encuentran entre átomos que presentan una
distancia comprendida entre 3 y 4 \ring{A}. Estos enlaces son más
débiles y menos específicos que los enlaces de hidrógeno y que los
enlaces electrostáticos. La distribución de la carga electrónica
alrededor de un átomo cambia con el tiempo y, en cualquier
instante, la distribución de la carga no es simétrica. Esta
asimetría transiente en la carga electrónica induce una asimetría
similar en los átomos contiguos. Las fuerzas de atracción
resultantes entre los átomos alcanza un máximo a la distancia de
contacto de van der Waal pero disminuye muy rápidamente
aproximadamente a partir de 1 \ring{A} hasta aproximadamente 2
\ring{A}. De manera alternativa, a medida que los átomos son
separados por una distancia menor que la distancia de contacto, se
hacen cada vez más dominantes potentes fuerzas de repulsión como
las nubes electrónicas externas de la superposición de los átomos.
Aún cuando las fuerzas de atracción son relativamente débiles en
comparación con los enlaces electrostáticos y con los enlaces de
hidrógeno (aproximadamente 0,6 Kcal/mol), las fuerzas de repulsión
pueden ser, en particular, muy importantes a la hora de determinar
si un ligando peptídico puede enlazarse con éxito con una
proteína.
En una realización, la función de puntuación de
Böhm (enfoque SCORE1) es usada para llevar a cabo la estimación de
la constante de enlace. (Böhm, H.J., (1994), J. Comput. Aided Mol.
Des., 8(3):243-256). En otra realización, la
función de puntuación (enfoque SCORE2) es usada para llevar a cabo
la estimación de las afinidades de enlace como un indicador de un
ligando que contiene un epitopo de células T (Böhm, H.J., (1998), J.
Comput. Aided Mol. Des., 12(4):309-323). Sin
embargo, las funciones de puntuación de Böhm, tal como han sido
descritas en las referencias precedentes, son usadas para llevar a
cabo la estimación de la afinidad de enlace de un ligando con una
proteína, de la que se sabe ya que el ligando se enlaza con éxito
con la proteína y que el complejo de proteína/ligando, ha tenido
resulta su estructura, estando presente la estructura resuelta en el
Banco de Datos de Proteínas -Protein Data Bank- ("PDB"). Por
consiguiente, la función de puntuación ha sido desarrollada con el
beneficio de los datos de enlace positivos conocidos. Con objeto de
permitir la discriminación entre los enlazadores positivos y
negativos, tiene que ser añadido un término de repulsión. Por otra
parte, por medio del tratamiento informático de las interacciones
lipófilas de una forma pareada, se consigue una estimación de la
energía de enlace más satisfactoria, que cuando se emplea el área
basada en el término energía de las funciones de Böhm, precedentes.
Por consiguiente, en una realización, es estimada la energía de
enlace empleándose una función de puntuación modificada de Böhm. En
la función de puntuación modificada de Böhm, la energía de enlace
entre la proteína y el ligando (\DeltaG_{bind}) es estimada
tomando en consideración los parámetros siguientes: la reducción de
la energía de enlace debida a la pérdida global de entropía de
traslación y de rotación del ligando (\DeltaG_{0}); las
contribuciones de los enlaces de hidrógeno ideales
(\DeltaG_{hb}) en los que, al menos, un componente es neutro;
las contribuciones de las interacciones iónicas no perturbadas
(\DeltaG_{ionic}); las interacciones lipófilas entre los átomos
ligandos lipófilos y los átomos aceptores lipófilos
(\DeltaG_{lipo}); la pérdida de energía de enlace debida a la
congelación de grados de libertad internos en el ligando, es
decir que se reduce la libertad de rotación alrededor de cada
enlace C-C (\DeltaG_{rot}); la energía de la
interacción entre la proteína y el ligando (E_{vdw}). Tomando en
consideración estos términos se obtiene la ecuación 1:
en la que N es el número de
interacciones de idoneidad para un término específico y, en una
realización, \DeltaG_{0}, \DeltaG_{hb},
\DeltaG_{ionic}, \DeltaG_{lipo} y \DeltaG_{rot} son
constantes que están dadas con los valores: 5,4, -4,7, -4,7, -0,17
y 1,4,
respectivamente.
El término N_{hb} se calcula de acuerdo con la
ecuación 2:
Siendo f(\DeltaR, \Delta\alpha) una
función de penalización, que tiene en consideración amplias
desviaciones de los enlaces de hidrógeno con respecto al estado
ideal y que se calcula de acuerdo con la ecuación 3:
El término TOL es la desviación tolerada en la
longitud del enlace de hidrógeno = 0,25 \ring{A}; \DeltaR es la
desviación de la longitud del enlace de hidrógeno
H-O/N con respecto al valor ideal = 1,9 \ring{A};
\Delta\alpha es la desviación del ángulo del enlace de hidrógeno
\angle_{N/O-H..O/N} con respecto al valor
idealizado de 180º.
El término f(N_{neighb}) distingue
entre partes cóncavas y convexas de una superficie proteica y, por
consiguiente, asigna a las interacciones polares, que se encuentran
en bolsillos, un peso mayor que a las que se encuentran en la
superficie proteica. Esta función se calcula de conformidad con la
ecuación 4 siguiente:
El término N_{neighb} es el número de átomos
proteicos que no son hidrógeno, que tienen una proximidad mayor que
5 \ring{A} con cualquier átomo dado de la proteína.
El término N_{neighb,0} es una constante =
25.
El término _{fpcs} es una función, que permite
el contacto polar del área de la superficie por enlace de hidrógeno
y, por consiguiente, distingue entre enlaces de hidrógeno fuertes y
débiles, y su valor es determinado de acuerdo con los criterios
siguientes:
El término A_{polar} es el tamaño de la
superficie de contacto proteína polar-ligando.
El término N_{HB} es el número de enlaces de
hidrógeno.
El término \beta es una constante cuyo valor
es = 1,2.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la implementación de la función de
puntuación modificada de Böhm, son tratadas por vía informática las
contribuciones procedentes de las interacciones iónicas,
\DeltaG_{ionic}, de una manera similar a la de los átomos de
hidrógeno, que ha sido descrita precedentemente puesto que se supone
la misma dependencia geométrica.
El término N_{lipo} se calcula de conformidad
con la ecuación 5 siguiente:
El término f(r_{IL}) se calcula para de
todos los átomos del ligando lipófilo, I, y de todos los átomos de
la proteína lipófila, L, de conformidad con los criterios
siguientes:
en la
que:
R1 = r_{I}^{vdw} + r_{L}^{vdw} + 0,5
y R2 = R1 + 3,0
y r_{I}^{vdw} es el radio de van der Waal
del átomo I
y r_{L}^{vdw} es el radio de van der Waal
del átomo L.
\vskip1.000000\baselineskip
El término N_{rot} es el número de enlaces de
rotación de la cadena lateral de aminoácidos y se toma como el
número de enlaces acíclicos sp^{3} - sp^{3} y sp^{3} -
sp^{2}. No se toman en consideración las rotaciones del -CH_{3}
terminal o de -NH_{3} terminal.
El término final, E_{vdw}, se calcula de
conformidad con la ecuación 6 siguiente:
en la
que:
- \vocalinvisible
- \textoinvisible
\varepsilon_{1} y
\varepsilon_{2} son constantes, que dependen de la identidad
atómica;
r_{1}^{vdw} +r_{2}^{vdw}
son los radios atómicos de van der Waal;
y
- r
- es la distancia comprendida entre un par de átomos.
\vskip1.000000\baselineskip
Con relación a la ecuación 6, en una
realización, las constantes \varepsilon_{1} y
\varepsilon_{2} dan los valores atómicos: C: 0,245, N: 0,283,
O: 0,316, S: 0,316, respectivamente (es decir para los átomos
de carbono, de nitrógeno, de oxígeno y de azufre, respectivamente).
Con relación a las ecuaciones 5 y 6, los radios de van der Waal dan
los valores atómicos C: 1,85, N: 1,75, O: 1,60, S: 2,00
\ring{A}.
Debe entenderse que todos los valores
predeterminados y las constantes dadas en las ecuaciones precedentes
son determinados dentro de las limitaciones del conocimiento actual
de las interacciones de los ligandos proteicos, en particular con
relación al tipo de tratamiento informático al que son sometidos en
este caso.
Tal como se ha descrito precedentemente, la
función de puntuación es aplicada a los datos extraídos a partir de
la base de datos de las conformaciones de las cadenas laterales, de
las identidades atómicas y de las distancias interatómicas. Para
los fines de la presente descripción, el número de moléculas de MHC
Clase II que está incluido en esta base de datos es de 42 modelos
más cuatro estructuras resueltas. Es evidente por las descripciones
precedentes, que la naturaleza modular de la construcción del método
informático de la presente invención significa que pueden ser
simplemente adicionados nuevos modelos y que pueden ser explorados
con la librería de cadenas principales peptídicas y con la función
de investigación en cuanto a la conformación de las cadenas
laterales, con objeto de formar grupos adicionales de datos, que
pueden ser procesados por la función de puntuación peptídica, tal
como se ha descrito precedentemente. Esto permite que sea aumentado
fácilmente el repertorio de moléculas de MHC Clase II exploradas, o
que sean reemplazadas estructuras y datos asociados, si se dispone
de los datos para la formación de modelos más exactos de los alelos
existentes.
El presente método de predicción puede ser
calibrado frente a un grupo de datos, que comprenda un amplio número
de péptidos, cuya afinidad para varias moléculas de MHC Clase II
haya sido previamente determinada de forma experimental. Mediante
la comparación de los datos calculados frente a los datos
experimentales, puede determinarse una fracción de valores sobre
los cuales se sepa que todos los epitopos de las células T,
determinados por vía experimental, han sido predichos
correctamente.
Debe entenderse que, aún cuando la función de
puntuación precedente es relativamente simple, en comparación con
algunas metodologías sofisticadas, que se encuentran a disposición,
los cálculos se llevan a cabo de una manera extremadamente rápida.
De igual modo, debe entenderse que el objetivo no consiste en
calcular la verdadera energía de enlace per se para cada
péptido acoplado en la cisura de enlace de una proteína seleccionada
de MHC Clase II. El objetivo fundamental consiste en obtener datos
comparativos de energía de enlace a modo de ayuda para llevar a
cabo la predicción de la localización de los epitopos de las células
T, basada en la estructura primaria (es decir en la
secuencia de aminoácido) de una proteína seleccionada. Una energía
de enlace relativamente elevada o una energía de enlace por encima
del valor de umbral seleccionado sugeriría la presencia de un
epitopo de las células T en el ligando. El ligando puede ser
sometido entonces a, al menos, un redondeado de la substitución de
aminoácidos y puede ser recalculada la energía de enlace. Como
consecuencia de la rápida naturaleza de los cálculos, estas
manipulaciones de las secuencias peptídicas pueden llevarse a cabo
de manera interactiva dentro de la interfaz de usuario del programa
en equipos físicos informáticos disponibles a un coste rentable.
Por consiguiente, no se requiere una inversión elevada en equipo
físico informático.
Será evidente para el técnico en la materia que
podría usarse otro programa de ordenador disponible para la misma
finalidad. De manera particular, puede ser empleado un programa de
ordenador más sofisticado, que sea capaz de acoplar ligandos en los
loci de enlace de proteínas en conjunción con una minimización de la
energía. Ejemplos de programas de ordenador de acoplamiento son:
DOCK (Kuntz et al., (1982), J. Mol. Biol.,
161:269-288), LUDI (Böhm, H.J., (1994), J. Comput
Aided Mol. Des., 8:623-632) y FLEXX (Rarey et
al., (1995), ISMB, 3:300-308). Ejemplos de
programas de ordenador para el modelado y la manipulación molecular
incluyen: AMBER (Tripos) and CHARMm (Molecular Simulations Inc.).
El uso de estos métodos informáticos limitaría severamente el
rendimiento del método de esta invención debido la magnitud del
período de tiempo del procesamiento, que se requiere para llevar a
cabo los cálculos necesarios. Sin embargo, es factible que tales
métodos puedan ser usados a modo de un "cribado secundario"
para obtener cálculos más exactos de la energía de enlace para los
péptidos, que hayan sido encontrados como "enlazadores
positivos" a través del método de la presente exposición. La
limitación del tiempo necesario para el procesamiento con objeto de
llevar a cabo los cálculos sofisticados de mecánica molecular o de
dinámica molecular es la que está definida tanto por el diseño del
programa de ordenador, que realiza estos cálculos, como por las
limitaciones tecnológicas actuales de los equipos físicos
informáticos. Puede anticiparse que, en el futuro, puede ser
factible llevar a cabo tales cálculos dentro de un marco de tiempo
más gestionable por medio de la escritura de códigos más eficientes
y por medio del aumento continuo de velocidad en los procesadores
informáticos. Puede encontrarse información adicional sobre las
funciones de energía aplicadas a macromoléculas y la consideración
de diversas interacciones, que tienen lugar dentro de una
estructura proteica plegada en la publicación: Brooks et al.,
(1983), J. Comput. Chem., 4:187-217 y puede
encontrarse una información adicional relativa a las interacciones
generales entre proteína-ligando en la publicación:
Dauber-Osguthorpe et al., (1988), Proteins,
4(1):31-47. Del mismo modo, puede encontrarse
una información básica adecuada, por ejemplo, en la publicación de
Fasman, G.D., ed., Prediction of Protein Structure and the
Principles of Protein Conformation, Plenum Press, New York, ISBN:
0-306
4313-9.
4313-9.
\newpage
Ejemplo
2
Tomando como base las predicciones realizadas
por simulación con ordenador -in silico- de que son
inmunogénicas las secuencias que rodean los loci de glicosilación
enlazados con N de la proteína de la IL-7, se
analizan los péptidos que abarcan estas regiones, que separan, por
ejemplo, a Leu63 de Ser71 (LRQFLKMNS SEQ ID NO:4) o que separan a
Ile88 de Val96 (ILLNCTGQV SEQ ID NO:7) en la proteína de la
IL-7 humana madura, con respecto a su
inmunogenicidad, que es medida por medio de su habilidad para
inducir la proliferación de las células T in vitro. En
esencia, las PBMC aisladas a partir de sangre humana son incubadas
con péptidos 15-meros solapantes individuales, y se
miden las respuestas de proliferación mediante la incorporación de
la ^{3}H-timidina. En principio, las células T
que se encuentran dentro de la mezcla de las PBMC proliferan
únicamente si éstas reconocen complejos individuales
péptido-MHC o APCs autólogas (células portadoras de
antígenos) y, de este modo, la proliferación es una indicación de
la inmunogenicidad peptídica.
Por ejemplo, los péptidos
15-meros que están escalonados por tres aminoácidos
y separan, por ejemplo, a la región de Met54 de Leu80 en la
IL-7 humana, son sintetizados (Pepscan Systems,
Países Bajos), resuspendidos en DMSO (Sigma Chemical, St. Louis,
MO, U.S.A.) y son usados en los medios de cultivo a una
concentración final de 5 \muM en 0,5% de DMSO.
Las PBMC se aíslan a partir de sangre periférica
procedente de donantes sanos por medio de la centrifugación de
gradiente de Ficoll-Hypaque y se almacenan en estado
congelado en nitrógeno líquido. Así mismo, cada muestra de PBMC es
tipificada con HLA, empleándose un estuche de tipificación SSP PCR
(BioSynthesis, Lewisville, TX) sobre ADN aislado con un estuche
QiaAmp Tissue (Qiagen, Valencia, CA).
En un ensayo típico de proliferación, cada uno
de los péptidos 15-meros solapantes es ensayado por
sextuplicado en cultivos de PBMC derivados de 40 donantes, que no
ha recibido tratamiento previo. En resumen, se mezclaron 2 x
10^{5} PBMCs, rápidamente descongelados antes de su uso, con 5
\muM de cada péptido y se incuban a 37ºC en 5% de CO_{2}
durante 7 días. Como control positivo, se incuban muestras con el
péptido derivado de la toxina del tétanos MQYIKANSKFIGI (SEQ ID
NO:15), mientras que las muestras de control negativas son
incubadas con 0,5% de DMSO. Durante las últimas 12 horas de la
incubación los cultivos son pulsados con
[metil-^{3}H]timidina (0,5
\muCi/pocillo) (NEN Life Science Products, Boston, MA), los
cultivos son cosechados sobre fieltros de filtración y se mide la
incorporación de la timidina en forma de puntos por minuto (CPM)
empleándose un contador de escintilación de plataforma microplaca
beta Wallac (Perkin Elmer, Boston, MA). Se calcula el índice de
estimulación de cada péptido dividiéndose el valor CPM de un péptido
dado entre el valor CPM obtenido a partir de los controles
negativos.
Se ha encontrado que el índice de estimulación
de los péptidos de control positivos es significativamente mayor
que 1 (que es el índice de estimulación del control negativo), y que
los péptidos que contienen la secuencia principal LRQFLKMNS (SEQ ID
NO:4), FLKMNSTGD (SEQ ID NO:5) o LKMNSTGDF (SEQ ID NO:6), tales
como, por ejemplo, los péptidos ARKLRQFLKMNSTGD (SEQ ID NO:10),
LRQFLKMNSTGDFDL (SEQ ID NO:11) o FLKMNSTGDFDLHLL (SEQ ID NO:12),
tienen un aumento en el índice de estimulación. Por consiguiente,
las secuencias peptídicas tales como LRQFLKMNS (SEQ ID NO:4) o
LKMNSTGDF (SEQ ID NO:6) representan realmente epitopos potenciales
de las células T.
Se lleva a cabo un análisis similar con una
serie de péptidos 15-meros, que comprenden una
región definida por los péptidos principales ILLNCTGQV (SEQ ID
NO:7) y LLNCTGQVK (SEQ ID NO:8), y se ha encontrado que estas
secuencias peptídicas representan, igualmente, epitopos potenciales
de las células T.
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Ejemplo
3
Las células dendríticas maduras (DCs) son
células portadoras de antígenos potentes (APCs), que portan péptidos
antigénicos o proteínas completas de manera eficiente a las células
T. Se emplean Las DCs aisladas, pulsadas con péptidos antigénicos
in vitro para inducir respuestas primarias de las células T,
que pueden ser medidas en ensayos de proliferación in vitro.
Las DCs diferenciadas son generadas, por ejemplo, por medio del
siguiente procedimiento: en primer lugar, se generan monocitos
humanos permitiendo que las PBMCs se adhieran a frascos de plástico
de cultivo tisular o por medio de una purificación de las CD14^{+}
PBMCs con anticuerpos etiquetados por vía magnética (Miltenyi
Biotec, Auburn, CA). A continuación son cultivados los monocitos
purificados (desde 0,5 hasta 1,5 x 10^{6} células/ml) en medio
AIM V (GIBCO BRL, Grand Island, NY, U.S.A.), que contiene 1.000
unidades/ml de GM-CSF (Endogen; Woburn, MA) y 500
unidades/ml de IL-4 (Endogen; Woburn, MA) durante 3
días. A continuación estas DCs inmaduras son pulsadas con 5
\mug/ml de péptidos experimentales o de péptidos de control y, a
continuación, se incuban con una combinación de 1.000 unidades/ml de
TNF-\alpha (Endogen; Woburn, MA), 1.000
unidades/ml de GM-CSF y 500 unidades/ml de
IL-4 durante otras 48 horas. Las DCs maduras son
monitorizadas por medio de los niveles de expresión de gran
superficie de CD80^{+}, CD86^{+} y HLA-DR.
Estas DCs maduras, pulsadas con antígenos, son
irradiadas con 4.200 radianes y son usadas en un ensayo de
proliferación con células CD4^{+} T autólogas purificadas. (Las
células CD4^{+} T son purificadas con anticuerpos etiquetados por
vía magnética (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), empleándose alícuotas
de PBMC congeladas, procedentes del mismo donante que proporciona
los monocitos para la diferenciación DC in vitro). En un
ensayo típico, son incubadas DCs pulsadas con antígeno (2 x
10^{5}/ml) junto con células CD4^{+} T autólogas (2 x 10^{6}
células/ml) en placas de 96 pocillos de fondo redondo a 37ºC en 5%
de CO_{2} durante 7 días. Se añade
[metil-^{3}H]timidina (NEN Life Science
Products, Boston, MA) durante las últimas 12 horas de la incubación
en una cantidad de 0,5 \muCi/pocillo, las muestras son cosechadas,
lisadas sobre filtros de vidrio y se mide la incorporación de la
^{3}H-timidina en un contador de
escintilación.
En este ensayo se han evaluado péptidos
15-meros, tal como se ha descrito en el ejemplo 1, y
se han comparado con los péptidos de referencia y con otros
controles. Se ha encontrado que este ensayo es más sensible que el
ensayo descrito en el ejemplo 1, permitiendo una mejor
diferenciación entre la habilidad de los péptidos individuales para
inducir la proliferación de las células T. Se ha encontrado que los
péptidos de IL-7 que contienen las secuencias
principales LRQFLKMNS (SEQ ID NO:4), FLKMNSTGD (SEQ ID NO:5),
LKMNSTGDF (SEQ ID NO:6), ILLNCTGQV(SEQ ID NO:7) o LLNCTGQVK
(SEQ ID NO:8) inducen realmente una proliferación significativa de
las células T y que, por consiguiente, estas secuencias representan
epitopos potenciales de las células T.
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Ejemplo
4
Se han evaluado en ensayos in vitro las
substituciones de aminoácidos en las regiones peptídicas descritas
anteriormente, que se supone que hacen menos inmunogénica a la
proteína de la IL-7, tal como se ha descrito en el
ejemplo 1 y en el ejemplo 2. Por ejemplo, se espera que el péptido
de la variante de la IL-7, que abarca la secuencia
LRQFLDDNS (SEQ ID NO:13), genere una disminución significativa de la
respuesta proliferante de las células T en comparación con el tipo
natural del péptido parental que abarca la secuencia LRQFLKMNS (SEQ
ID NO:4). De manera similar, se espera que el péptido de la variante
de la IL-7 que abarca la secuencia TLLNCTGQG (SEQ
ID NO:14) genere una disminución significativa de la respuesta
proliferante de las células T en comparación con el tipo natural
del péptido parental que abarca la secuencia ILLNCTGQV (SEQ ID
NO:7).
Se ha sintetizado una serie de péptidos
15-meros derivados de la IL-7, que
abarca las secuencias de la variante de la IL-7
LRQFLDDNS (SEQ ID NO:13) o TLLNCTGQG (SEQ ID NO:14), tal como se ha
descrito en el ejemplo 1. Por otra parte, las proteínas de la
variante de la IL-7 o las proteínas de fusión, que
contienen la variante de la IL-7, que incluyen las
substituciones de la invención, son producidas bien en un sistema de
expresión procariota o bien en un sistema de expresión eucariota
(Del-IL-7's). Por ejemplo, se ha
producido una variante de la IL-7, que incluye las
substituciones de los aminoácidos K68D, M69D, 188T y V94G. (Por otra
parte, las proteínas de IL-7 producidas por vía
procariotas incluyen una metionina de iniciación). Estos péptidos y
proteínas purificadas, y sus parejas parentales, se ensayan en
cuanto a su habilidad para inducir la proliferación de las células
T, en ensayos con cultivos de PBMC completas, como se ha descrito en
el ejemplo 1, o por medio de una pulsación de DCs humanas, como se
ha descrito en el ejemplo 2. Se utilizan 25 \mug/ml de proteína
para estimular a las PBMCs o para pulsar a las DCs.
Se ha encontrado, en general, que los péptidos
derivados de las secuencias de la variante de la
IL-7 tienen una habilidad considerablemente
reducida para inducir la proliferación de las células T, en
comparación con los correspondientes péptidos, derivados del tipo
natural de la proteína de la IL-7 humana. Por
consiguiente, estas secuencias peptídicas variantes son epitopos
potenciales de las células T mucho más pobres. De la misma manera,
la proteína de la variante de la IL-7, producida por
vía bacteriana, tiene también una habilidad para inducir la
proliferación de las células T reducida, con relación al tipo
natural de la IL-7, lo que indica que estas
regiones mutadas pueden ser contribuyentes significativos para la
inmunogenicidad de la IL-7 producida por vía
procariota.
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Ejemplo
5
Para la proteína de la IL-7
humana no glicosilada, producida por vía bacteriana, pueden ser
reconocidas como "no propios" por el sistema inmune humano las
secuencias que rodean a los loci de glicosilación enlazados con N
de la IL-7 y pueden provocar una respuesta de
anticuerpos. De manera esencial, para establecer si estas
secuencias representan epitopos lineales de las células B, se
utilizan epitopos que separan a estas secuencias para inmunizar
conejos, y se evalúa la reactividad de los anticuerpos resultantes a
través de la IL-7 humana natural, producida por vía
bacteriana y a través de la IL-7 humana,
desnaturalizada. A modo de otro control adicional, se utiliza una
proteína de fusión huFc-IL-7
glicosilada, producida por vía eucariota.
Los métodos y los materiales para conseguir
anticuerpos policlonales contra un antígeno peptídico específico,
por ejemplo, en conejos, y su subsecuente purificación son
generalmente conocidos por los técnicos en la materia y pueden
encontrarse referencias a los mismos, por ejemplo, en la
publicación: Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow and D.
Lane, Cold Spring Harbor Press.
Brevemente, en un ejemplo, se acopla un péptido,
que contiene la secuencia principal FLKMNSTGD (SEQ ID NO:5), tal
como la LRQFLKMNSTGDFDL[C] (SEQ ID NO: 18) o la
[C]LRQFLKMNSTGDFDL (SEQ ID NO:19) a través de una cisteína
terminal añadida, con tres proteínas portadoras diferentes,
hemocianina de molusco (KLH, EMD Biosciences, San Diego, CA), BSA
(EMD Biosciences, San Diego, CA) y ovalbúmina (Pierce, Rockford,
IL), empleándose un agente de acoplamiento tal como el
1-carboxilato de
succinimidil-4-(N-maleinimidometil)ciclohexano
SMCC (Pierce, Rockford, IL) y se inmuniza una pluralidad de conejos
por medio de inyecciones sucesivas con cada uno de los conjugados
peptídicos en presencia de adyuvante. La respuesta inmune es
reforzada con otras inyecciones de uno de los conjugados portadores
del péptido a intervalos mensuales, y el antisuero que resulta de
cada conejo es purificado por afinidad a través de una columna
Sulfo-Link (Pierce, Rockford, IL) con la que está
acoplado el péptido, y el anticuerpo es concentrado todavía mas a
través de una columna de hidroxiapatita (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA).
Los anticuerpos purificados son evaluados frente
a la IL-7 humana natural producida por vía
bacteriana, frente a la IL-7 humana desnaturalizada
y frente a una proteína de fusión
huFc-IL-7 glicosilada, producida por
vía eucariota, en un ensayo ELISA, siguiéndose los procedimientos
estándar. Brevemente, placas ELISA, revestidas con las
preparaciones proteicas purificadas, son incubadas con las muestras
del anticuerpo evaluado, las placas se lavaron, se incubaron con un
anticuerpo secundario tal como IgG anticonejo acoplada con
peroxidasa de rábano picante, se lavaron de nuevo y se incubaron
con una solución de substrato cromogénico para indicar la
concentración de anticuerpo enlazado.
De manera similar, se obtienen anticuerpos de
otros péptidos que abarcan el locus de glicosilación
...MNSTG...
(SEQ ID NO:20) (en Asn70) en la IL-7 humana, o de péptidos que abarcan el locus de glicosilación ...LNCTG...(SEQ ID NO:21) (en Asn91). Empleándose estos enfoques, se ha encontrado que, por regla general, la IL-7 humana desnaturalizada, producida por vía bacteriana, es perfectamente reconocida por los anticuerpos y que no lo es la proteína de fusión huFc-IL-7 glicosilada. Los péptidos, que dan lugar a anticuerpos, que reaccionan con la proteína de la IL-7 humana natural producida por vía bacteriana, indican que es reconocido un epitopo lineal de las células B en el locus de glicosilación. De igual modo, se ha encontrado que los anticuerpos obtenidos contra los péptidos de este ejemplo tienen el efecto de inhibir la proliferación celular estimulada con la IL-7, en un ensayo de proliferación de base celular, tal como se ha descrito en el ejemplo 9. Este resultado indica que estos anticuerpos tienen actividad neutralizante.
(SEQ ID NO:20) (en Asn70) en la IL-7 humana, o de péptidos que abarcan el locus de glicosilación ...LNCTG...(SEQ ID NO:21) (en Asn91). Empleándose estos enfoques, se ha encontrado que, por regla general, la IL-7 humana desnaturalizada, producida por vía bacteriana, es perfectamente reconocida por los anticuerpos y que no lo es la proteína de fusión huFc-IL-7 glicosilada. Los péptidos, que dan lugar a anticuerpos, que reaccionan con la proteína de la IL-7 humana natural producida por vía bacteriana, indican que es reconocido un epitopo lineal de las células B en el locus de glicosilación. De igual modo, se ha encontrado que los anticuerpos obtenidos contra los péptidos de este ejemplo tienen el efecto de inhibir la proliferación celular estimulada con la IL-7, en un ensayo de proliferación de base celular, tal como se ha descrito en el ejemplo 9. Este resultado indica que estos anticuerpos tienen actividad neutralizante.
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Ejemplo
6
Se han construido ácidos nucleicos, que
codifican versiones de variantes de la IL-7 humana
que son o bien adecuadas para la expresión bacteriana o bien para
la expresión eucariota, por ejemplo en forma de una proteína de
fusión. Por ejemplo, se han construido ácidos nucleicos, que
codifican una variante de la IL-7 humana madura,
que contiene las substituciones K68D, M69D, 188T y V96G
(Del-IL-7 SEQ ID NO:16), empleándose
métodos estándar familiares a los técnicos en la materia. La figura
11 muestra un ejemplo de una secuencia de ADN de este tipo, que
codifica una variante de la IL-7 madura, la
Del-IL-7, con substituciones de
codón de residuos de aminoácidos K68D, M69D, 188T y V96G (SEQ ID
NO:24).
Para la expresión bacteriana, la secuencia
proteica de la Del-IL-7, que incluye
una metionina de iniciación
(bDel-IL-7 SEQ ID NO:17) es
traducida inversamente empleándose un sesgo de codón apropiado para
la expresión opcional en E. coli. La secuencia de ácidos
nucleicos resultante se adapta además para incluir características
deseadas (o para excluir características no deseadas) tales como un
codón de terminación o loci de restricción, y son añadidas
secuencias para facilitar la clonación en un vector de expresión
bacteriana, por ejemplo un vector apropiado tomado de la serie pET
(EMD Biosciences, San Diego, CA). La secuencia de ácidos nucleicos
es sintetizada por medio de síntesis génica total (Blue Heron
Biotechnology, Bothell, WA) y se inserta en el vector de expresión.
En la figura 10 (SEQ ID NO:23) se ha mostrado un ejemplo de una
secuencia de ADN, que codifica la
bDel-IL-7, codón optimizada para
E. coli con substituciones de codón de residuos de
aminoácidos K68D, M69D, 188T, V96G.
Para la expresión eucariota como una proteína de
fusión
huFc-Del-IL-7, la
secuencia de ácidos nucleicos de la IL-7 humana
madura es modificada para incorporar codones para las mutaciones
deseadas de los aminoácidos de la invención, tal como se ha
descrito precedentemente. (Véase, por ejemplo, la SEQ ID NO:24). A
continuación, la secuencia se adapta para incorporar secuencias
flanqueantes con loci de restricción únicos para la inserción en
forma de un fragmento Xma I/Xho I en la pauta de lectura dentro de
un vector de expresión pdCs-huFc, que codifica la
bisagra, región CH2 y CH3 de IgG1 (véase la publicación de Lo et
al., (1998), Protein Engineering 11:495), y es sintetizado por
medio de una síntesis génica total (Blue Heron Biotechnology,
Bothell, WA). El fragmento sintético Xma I/Xho I
Del-IL-7 se clona a continuación en
el vector pdCs-huFc, dando como resultado un
plásmido de expresión, que codifica
huFc-Del-IL-7. Otras
variantes de la IL-7 y de la
Fc-IL-7 de la invención pueden ser
producidas por métodos similares.
De manera específica, los ácidos nucleicos, que
codifican las proteínas de fusión
Fc-IL-7 humanas desinmunizadas
constituidas por la huFc\gamma2(h)(FN>AQ)-(segmento
enlazador2)-IL-7(PNS) y por
la huFc\gamma2(h)(FN>AQ)-(segmento
enlazador2)-IL-7(PNDS), se
formaron de la manera siguiente. La
huFc\gamma2(h)(FN>AQ)-(segmento
enlazador2)-IL-7(PNS) es una
proteína de fusión Fc-IL-7 humana,
que comprende el extremo N de la IL-7 humana
genéticamente fusionada con el extremo C de un domino Fc humano de
IgG2 Fc con una bisagra de IgG1 a través de una secuencia de
segmento enlazador GGGGSGGGG. La porción Fc contiene las mutaciones
Phe296Ala y Asn297Gln. La porción IL-7, que contiene
las mutaciones F39P, F57N y L128S. La
huFcy2(h)(FN>AQ)-(segmento
enlazador2)-IL-7(PNDS), es
igual que la huFcy2(h)(FN>AQF(segmento
enlazador2)-IL-7(PNS), pero
contiene una mutación adicional en la mitad IL-7,
la L77D. De la misma manera, la secuencia contiene codones para la
mutación de la secuencia LSLS próxima al extremo C de la porción
Fc, que debe ser reemplazada por ATAT. Por otra parte, la secuencia
de ácidos nucleicos incluye un codón para reemplazar la lisina
C-terminal de la porción Fc por un residuo de
alanina.
Se efectuó una síntesis fresca de un ácido
nucleico, que tiene la secuencia representada en la figura 27 (Blue
Heron Biotechnology, Bothell, WA), que codifica la secuencia del
segmento enlazador GGGGSGGGG seguida por la IL-7
humana madura, que contiene las substituciones de los aminoácidos
F39P, F57N y L128S (IL-7(PNS)) y que
contiene loci de restricción flanqueantes Xma I y Xho I en los
extremos 5' y 3', respectivamente. Este fragmento Xma I/Xho I
purificado se enlazó con un fragmento vector sometido a digestión y
purificado, de la misma manera, de la serie
pdCs-huFc,
pdC10-huFc\gamma2(h)(FN>AQ), que genera
un plásmido que codifica
huFc\gamma2(h)(FN>AQ)-(segmento
enlazador2)-IL-7(PNS). Lo
et al., (1998), Protein Engineering 11:495. La secuencia
codificante se verificó por secuenciación.
La introducción ulterior de la substitución L77D
en IL-7(PNS) se llevó a cabo por medio de los
métodos estándar de mutagénesis por reacción en cadena de
polimerasa RCP, empleándose cebadores mutagénicos
M(s)
(5'-TGACTTTGATGACCACCTGTTAAAAGTTTC-3'
(SEQ ID NO: 50); el codón mutado está subrayado) y
M(a) (5'-
AACAGGTGGTCATCAAAGTCACCAGTGC-3') (SEQ ID
NO:51).
Brevemente, se llevaron a cabo reacciones RCP
por separado sobre una matriz plásmida que contiene (segmento
enlazador2)-IL-7(PNS), una de
ellas con M(s) y el cebador descendente
5' - CTCGAGTCAGTGTTCTTAGTGCCCATC - 3' (SEQ ID
NO:52), la otra con M(a) y el cebador ascendente
5' - CCCGGGTGCTGGAGGTGGAGGATCAGGTG- 3' (SEQ ID
NO:53), los fragmentos de la RCP se purificaron y se combinaron
como la matriz para una segunda pasada por la RCP, empleándose de
nuevo el cebador ascendente
5' - CCCGGGTGCTGGAGGTGGAGGATCAGGTG- 3'(SEQ ID
NO:54) y el cebador descendente 5' - CTC
GAGTCAGTGTTCTTTAGTGCCCATC - 3'(SEQ ID NO:55). El fragmento purificado resultante se insertó en una vector de clonación TA pCR2.1 ((Invitrogen, Carlsbad, CA) y su secuencia fue confirmada. Se escindió un fragmento codificante Xma I/Xho I (segmento enlazador2)-IL-7(PNDS), y se enlazó con un fragmento de vector sometido a digestión y purificado, de la misma manera, de la serie pdCs-huFc, pdC10-huFc\gamma2(h)(FN>AQ), que genera un plásmido que codifica huFc\gamma2(h)(FN>AQ)-(segmento enlazador2)-IL-7(PNDS).
GAGTCAGTGTTCTTTAGTGCCCATC - 3'(SEQ ID NO:55). El fragmento purificado resultante se insertó en una vector de clonación TA pCR2.1 ((Invitrogen, Carlsbad, CA) y su secuencia fue confirmada. Se escindió un fragmento codificante Xma I/Xho I (segmento enlazador2)-IL-7(PNDS), y se enlazó con un fragmento de vector sometido a digestión y purificado, de la misma manera, de la serie pdCs-huFc, pdC10-huFc\gamma2(h)(FN>AQ), que genera un plásmido que codifica huFc\gamma2(h)(FN>AQ)-(segmento enlazador2)-IL-7(PNDS).
De manera similar, se obtuvieron plásmidos que
codifican variantes de estas proteínas de fusión, que se diferencian
en la mitad Fc; por ejemplo se ha obtenido un plásmido que codifica
huFc\gamma2(h)(segmento
enlazador2)-IL-7(PNDS) por
medio del enlace de un fragmento Xma I/Xho I, que codifica (segmento
enlazador2)-IL-7(PNDS), con
un fragmento vector sometido a digestión y purificado, de la misma
manera, de la serie pdCs-huFc,
pdC10-huFc\gamma2(h).
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Ejemplo
7
Para la expresión eucariota de la proteína de
fusión huFc-Del-IL-7
se utiliza una electroporación para introducir el ADN, que codifica
la proteína de fusión en una línea celular de mieloma de ratón NS/0.
Para llevar a cabo la electroporación se cultivan células NS/0 en
medio de Eagle modificado según Dulbecco, suplementado con un 10%
de suero bovino fetal inactivado por calor, 2 mM de glutamina y de
penicilina/estreptomicina. Se lavaron aproximadamente 5 x 10^{6}
células, una vez, con PBS y se volvieron a suspender en 0,5 ml de
PBS. A continuación se incubaron 10 \mug de ADN plásmido
linealizado para la
huFc-Del-IL-7 con
las células en una cubeta Gene Pulser (distancia entre los
electrodos 0,4 cm, BioRad) sobre hielo, durante 10 minutos. La
electroporación se lleva a cabo empleándose un dispositivo Gene
Pulser (BioRad, Hercules, CA) con regulación a 0,25 V y 500 \muF.
Se permite que las células se recuperen durante 10 minutos sobre
hielo, después de lo cual se vuelven a suspender en medio de
cultivo y se distribuyen en dos placas de 96 pocillos.
Se seleccionan los clones, que se han
transfectado de manera estable, por medio de su crecimiento en
presencia de 100 nM de metotrexato (MTX), que se aporta al medio de
crecimiento dos días post-transfección. Las células
son alimentadas cada 3 días, dos o tres veces más, y los clones
resistentes al MTX aparecen al cabo de 2 a 3 semanas. Los
sobrenadantes procedentes de los clones son ensayados por medio del
ensayo ELISA anti-Fc para llevar a cabo la
identificación de los clones que producen elevadas cantidades de la
proteína de fusión IL-7. Se aíslan los clones con
alta capacidad de producción son y son propagados en medio de
cultivo, que contiene 100 nM de MTX. De manera típica, es usado un
medio de crecimiento exento de suero, tal como el medio
H-SFM o el medio CD (Life Technologies).
Se lleva a cabo una purificación estándar de las
proteínas de fusión, que contienen Fc, basada en la afinidad de la
mitad proteica Fc para la proteína A. Brevemente, se cultivan
células NS/0, que expresan la proteína de fusión, tal como la
huFc-Del-IL-7, en
medio de cultivo tisular y se recolecta el sobrenadante, que
contiene la proteína expresada, y se carga sobre una columna
previamente equilibrada Fast Flow Protein A Sepharose. A
continuación, la columna se lava extensamente con tampón (tal como
100 mM de fosfato de sodio, 150 mM de NaCl a pH neutro). La
proteína enlazada es eluída a pH bajo (pH comprendido entre 2,5 y 3)
en el mismo tampón que el anterior y las fracciones son
neutralizadas inmediatamente.
La expresión bacteriana y la purificación de la
bDel-IL-7 se llevan a cabo
esencialmente como se ha descrito por los autores Cosenza et
al. para la IL-7 producida por vía bacteriana
(véase Cosenza et al., (1997) JBC, 272:32995). En esencia,
la bDel-IL-7 es aislada a partir de
cuerpos de inclusión, desnaturalizada y replegada. Brevemente, los
cultivos de expresión bacteriana transformados con el vector de
expresión que codifica, por ejemplo, la
bDel-IL-7, se cultivan en fase
logarítmica media y es inducida la expresión de la proteína
recombinante.
Después de la inducción, las bacterias son
recolectadas y lisadas por medio de aplicación de ultrasonidos y
los cuerpos de inclusión son aislados en tampón A (50 mM de Tris HCl
(7,5), 5 mM de EDTA, 20% de sucrosa). Tras lavados intensos, los
cuerpos de inclusión se vuelven a suspender en un tampón de
desnaturalización de guanidina (50 mM de Tris-HCl
(pH 8,0), 5 M de guanidina HCl, 5 mM de EDTA), se someten brevemente
a ultrasonidos y se reducen en 6 mM de DTT. La proteína
bDel-IL-7 desnaturalizada se
purifica a continuación por medio de una HPLC por exclusión de
tamaño, desnaturalizante. La proteína se vuelve a plegar a
continuación en tampón replegante (50 mM de glicina, 30 mM de NaOH,
0,4 M de L-arginina, 1 mM de DTT, pH 10), se dializa
en un tampón de fosfato y, a continuación, se purifica mediante
HPLC por exclusión de tamaño.
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Ejemplo
8
Se determina el efecto de las mutaciones
introducidas en la integridad de las proteínas de la
IL-7 por medio de análisis rutinarios de reducción
y de no reducción por electrofóresis en gel de poliacrilamida en
dodecilsulfato de sodio SDS-PAGE y por medio de una
cromatografía por exclusión de tamaño.
Por ejemplo, la proteína de fusión
huFc-Del-IL-7,
expresada a partir de células NS/0, es capturada en perlas de
Protein A Sepharose (Repligen, Needham, MA) a partir del medio de
cultivo tisular en el que es secretada, y es eluída por ebullición
en tampón para muestras de proteínas, con o sin un agente reductor
tal como el \beta-mercaptoetanol. La muestra es
fraccionada por medio de la SDS-PAGE y se visualizan
las bandas proteicas mediante tinción de Coomassie. Se supone que
una proteína de fusión, que contiene mutaciones de la
IL-7, que interfiera suficientemente con el
plegamiento correcto, tiene mayor probabilidad de mostrar productos
de degradación por medio de la SDS-PAGE.
De la misma manera, la
huFc-Del-IL-7
purificada es analizada por medio de una cromatografía por exclusión
de tamaño (SEC) para determinar la extensión en la que se ha
agregado la proteína de fusión. Brevemente, el sobrenadante del
cultivo celular es cargado sobre una columna previamente equilibrada
de Fast-Flow Protein A Sepharose, la columna es
lavada extensamente con un tampón fisiológico (tal como 100 mM de
fosfato de sodio, 150 mM de NaCl a pH neutro), y la proteína
enlazada es eluída a un pH comprendido entre aproximadamente 2,5 y
3 en el mismo tampón salino, que ha sido citado precedentemente. Las
fracciones son inmediatamente neutralizadas, se reúnen las
fracciones de las crestas y una alícuota es fraccionada sobre una
columna SEC analítica.
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Ejemplo
9
Con objeto de determinar si las variantes de la
IL-7 que contienen mutaciones de la invención
retienen su actividad citocina in vitro, se llevan a cabo
bioensayos de proliferación. Se activan PBMC (células mononucleares
de sangre periférica) humanas por medio de fitohemaglutinina
PHA-P para producir células que son sensibles a la
IL-7. La proliferación es medida en un ensayo
estándar de incorporación de timidina.
Por ejemplo, se determina la actividad citocina
de la huFc-Del-IL-7
y de la bDel-IL-7. Brevemente, en
primer lugar se incuban las PBMC durante cinco días con 10
microgramos/ml de PHA-P, las células se lavan y, a
continuación, se incuban en medio con
huFc-Del-IL-7 o con
bDel-IL-7, preparado como dilución
en serie, durante un total de 48 horas. Durante las 12 horas
finales, las muestras son pulsadas con 0,3 \muCi de
[metil-^{3}H]timidina
(Dupont-NEN-027). A continuación las
células son extensamente lavadas, recolectadas y lisadas sobre
filtros de vidrio. Se mide la ^{3}H-timidina
incorporada en el ADN en un contador de escintilación. Como
estándar, se ensaya el tipo natural de la proteína
hulL-7, obtenida en la firma R&D Systems
(Minneapolis, MN), u obtenida en el Instituto Nacional de
Estándares Biológicos y de Control - National Institute for
Biological Standards and Control - (NIBSC).
\newpage
Se obtiene un valor ED50 de la proliferación
celular para la
huFc-Del-IL-7 o para
la bDel-IL-7 por medio del trazado
de una curva de respuesta a la dosis, de conformidad con las
técnicas estándar, y se determina la concentración proteica que
resulta de la respuesta semimáxima.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se sabe que la IL-7 humana de
tipo natural, obtenida por vía bacteriana, administrada a monos
frecuentemente da como resultado la neutralización de los títulos
de anticuerpos de la IL-7 antihumana (Storek et
al., (2003), Blood, 101:4209; Fry et al., (2003), Blood,
101:2294). De este modo, se ha determinado la propensión que tienen
la variante de la IL-7, producida por manera
procariota, y las proteínas de la IL-7 de tipo
natural, así como las proteínas de fusión, producidas por vía
eucariota, que contienen polipéptidos del tipo natural o de la
variante de la IL-7, para inducir la neutralización
de anticuerpos en primates no humanos. En un experimento típico, se
inyectan macacos rhesus con 40 \mug/kg de muestras de proteína por
vía subcutánea una vez al día, durante cuatro semanas. Por ejemplo,
las muestras de proteína están constituidas por la
IL-7 producida por vía procariota, disponible en el
comercio (PeproTech, Rocky Hill, NJ), por la variante de la
IL-7(K68D, M69D, I88T, V94G) producida por
vía procariota, y por las proteínas de fusión
Fc-IL-7 equivalentes producidas en
un sistema de expresión de mamífero. Se obtiene suero de los
animales a intervalos regulares y se miden las concentraciones en
suero de los anticuerpos frente a la IL-7 humana por
medio de un ensayo ELISA, empleándose placas de 96 pocillos
revestidas con la IL-7 humana (Nunc, Naperville,
IL). De manera típica, se añaden, por triplicado, diluciones en
serie de cada muestra de suero a cada pocillo durante dos horas, se
lavan con un 0,05% de Tween (Tween 20) en PBS y se bloquea con un
1% de BSA/1% de suero de cabra en PBS. Se añade a cada muestra un
conjugado de IgG antimacaco de peroxidasa de rábano picante
(1:60,000 en tampón para muestras), se incuba a 37ºC durante 2
horas y la placa se lava 8 veces con un 0,05% de Tween en PBS. A
continuación las muestras son ensayadas usándose la solución de
substrato colorimétrico OPD (dihidrocloruro de
o-fenilendiamina) por medio de la medición de la
densidad óptica OD a 490 nm, restándose la densidad óptica OD de
fondo leída a
650 nm.
650 nm.
Se ha encontrado que la proteína del tipo
natural de la IL-7, producida por vía procariota, da
lugar, realmente, a elevados títulos de anticuerpos
anti-IL-7. Por el contrario, los
títulos de anticuerpos de la variante de la IL-7,
producida por vía procariota, da lugar a títulos de anticuerpos
anti-IL-7 significativamente más
bajos. De la misma manera, se ha encontrado que no son tan
pronunciadas las diferencias en los niveles de los títulos de
anticuerpos anti-IL-7 producidos por
animales a los que se les han administrado proteínas de tipo
natural, producidas en mamíferos, y proteínas de fusión de la
variante Fc-IL-7 (con mutaciones
alrededor de los loci de glicosilación enlazados con N). Este
resultado puede indicar que la falta de glicosilación en estos loci
en las proteínas producidas por vía procariota contribuye a la
inmunogenicidad de estas proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Se preparó la proteína de fusión
Fc-IL-7 constituida por la
huFcy2(h)(N>Q)(segmento
enlazador2)-hulL-7 de conformidad
con el método descrito en el ejemplo No. 6, se purificó, a
continuación se formuló en 50 mM de fosfato, 150 mM de cloruro de
sodio, a pH 7,00, 0,05% (v/v) de Tween 80. Se determinaron las
concentraciones en proteína de las soluciones diluidas usándose la
absorbancia a 280 nm y el coeficiente de extinción teórica de 0,98
mg/OD_{280}, basado en la secuencia proteica conocida. Para la
dosificación de ratones, se retiró una alícuota de cada muestra de
viales de almacenamiento y se diluyó con un 0,9% de suero salino,
una hora antes de la dosificación.
Se distribuyeron ratones C57B1/6 (Charles River
Laboratories, Wilmington, MA), con una edad de 17 semanas, en
grupos de 2 ratones cada uno y se les administraron las proteínas de
fusión Fc-IL-7 por vía subcutánea
durante 5 días consecutivos. Los grupos recibieron diariamente dosis
de 0,5, de 5,0, de 25 mg/kg o el vehículo de control. Todos los
ratones sobrevivieron al tratamiento al cabo del séptimo día, en
cuyo punto se sacrificaron los ratones.
Se determinaron los niveles en plasma de
Fc-IL-7 por obtención de muestras de
sangre procedentes del seno retro-orbital 6 horas
después de la dosificación, los días 0, 2, 4 y 7. Las muestras de
sangre se recogieron en tubos que contenían heparina con objeto de
evitar la coagulación. Las células se retiraron por medio de una
centrifugación y se midió la concentración de proteína de fusión
Fc-IL-7 intacta en el plasma,
empleándose procedimientos ELISA estándar. En la figura 36 se han
mostrado los niveles en plasma de la
Fc-IL-7 en \mug/\mul para los
ratones de ensayo. El plasma de los ratones mostró un aumento de la
concentración de Fc-IL-7, en
función de la dosis, en todos los puntos de tiempo ensayados y
siguió creciendo después de cada dosis. Sin embargo, como se ha
mostrado en la figura 37, la magnitud del aumento se aminoró después
de cada dosis.
Se confirmó la actividad funcional de la
Fc-IL-7 por medio de la medición de
los aumentos en células B y en células T el séptimo día después de
que se inició la dosificación. Puesto que la IL-7
refuerza la producción de las células efectoras inmunes, tales como
las células B y las células T, es de esperar que se aumente la
celularidad y el peso del bazo. Se sacrificaron los ratones al
séptimo día y se retiraron y se pesaron los órganos. La figura 38
muestra el peso medio del órgano al séptimo día. Como era de
esperar, se aumento el peso del bazo entre 3 y 5 veces 1 semana
después de la dosis inicial. El peso de los pulmones se aumentó 2
veces después de 2 dosis mayores de la
Fc-IL-7 como consecuencia de la
infiltración linfocítica. No se observaron cambios de peso en el
riñón ni en el hígado.
Se observó, al séptimo día, la respuesta de las
células B (CD19+, CD4+, CD8+ y de los granulocitos
(Gr-1 +)) en todos los grupos. La figura 39 muestra
la frecuencia de las células Gr-1 + en la sangre
periférica de dos ratones en cada grupo. Tal como muestran los
datos, los granulocitos no eran sensibles en general a la
Fc-IL-7. La figura 40 muestra la
frecuencia de las células CD19+ en la sangre periférica de dos
ratones en cada grupo. La figura 41 muestra la frecuencia de las
células CD4+ en la sangre periférica de dos ratones en cada grupo,
mientras que la figura 42 muestra la frecuencia de las células CD8+
en la sangre periférica de dos ratones en cada grupo. Los aumentos
numéricos en células B (figura 40) y en células T (figuras 41 y 42)
fueron máximos para el grupo con una dosis de 5 mg/kg, mostrando
cada ratón ensayado un número significativamente acrecentado de las
células T y de células B con respecto al grupo de control y con
respecto al grupo con una dosificación de 0,5 mg/kg. Sin embargo,
el número de las células T o bien disminuyó o bien aumentó para
ratones en el grupo con una dosificación de 25 mg/kg. Todas las
mediciones de las células están indicadas en células por \mul de
sangre.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Se midió la actividad biológica de la proteína
de fusión Fc-IL-7, evaluada en el
ejemplo 11, por medio de la timidina tritiada incorporada en un
ensayo estándar de proliferación celular, empleándose blastos de
células mononucleares de sangre periférica (PBMC) PHA, de
conformidad con el método descrito en las publicaciones de Yokota
et al., (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5894; y de
Stern et al., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87:6808-6812, con IL-7 humana, usada
como estándar. Como se muestra en la figura 43, la proliferación
celular, tal como se mide mediante la incorporación de la timidina
tritiada para la molécula de
Fc-IL-7, es similar a la de la
IL-7 humana en NIBSC estándar (World Health
Organization), lo que indica que la actividad de la molécula de
Fc-IL-7 es similar a la de la
IL-7 humana de tipo natural.
Las realizaciones precedentes deben ser
consideradas, desde todos los puntos de vista, como ilustrativas
antes que limitativas de la invención aquí descrita. Por
consiguiente, el alcance de la invención está indicado por las
reivindicaciones adjuntas.
<110> Gillies, Stephen D.
\hskip1cmWay, Jeffrey
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Variantes de la IL-7
con inmunogenicidad reducida
\vskip0.400000\baselineskip
<130> LEX-035
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/634,470
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-12-09
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ovis aries
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
IL-7 humana desinmunizada.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia producida por vía
bacteriana de aminoácidos de la IL-7 humana
desinmunizada.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 456
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácidos nucleicos, que
codifica la IL-7 madura con substituciones de codón
para F39P, F57N, y L128S.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip0,6cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
IL-7 madura con codones para substituciones de los
aminoácidos F39P, F57N, y L128S.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 456
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácidos nucleicos, que
codifica la IL-7 madura con codones para
substituciones de los aminoácidos F39P, F57N, L77D, y L128S.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
IL-7 madura con codones para substituciones de los
aminoácidos F39P, F57N, L77D, y L128S.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 462
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácidos nucleicos, que
codifica la IL-7 desinmunizada producida por vía
bacteriana, codón-optimizado para E. coli
con codones para substituciones de los aminoácidos K68D, M69D, I88T,
V96G.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 459
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácidos nucleicos, que
codifica una variante de la IL-7 madura
desinmunizada con codones para substituciones de los aminoácidos
K68D, M69D, I88T, V96G.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 384
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos para la
Fcgammal-IL-7 humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 383
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos para la
Fcgamma2 (h) (FN>AQ)-IL-7
humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 398
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos para la
Fcgamma1-(segmento enlazador1)-IL-7
humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un segmento enlazador
polipeptídico.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 393
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos para la
Fcgamma1 (YN>AQ)-(segmento
enlazador2)-IL-7 humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un segmento enlazador
polipeptídico.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 391
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos para la
Fcgamma1 (YN>AQ,d)-(segmento
enlazador2)-IL-7 humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 911
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácidos nucleicos para
la Fcgamma1 humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 911
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácidos nucleicos para
la Fcgamma1 (YN>AQ) humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 908
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácidos nucleicos para
la Fcgamma2(h) humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 908
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácidos nucleicos para
la Fcgamma2(h)(FN>AQ) humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos para la
IL-7.1 desinmunizada madura humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 450
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácidos nucleicos, que
codifica la IL-7.1 desinmunizada madura humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos para la
IL-7.2 desinmunizada madura humana.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 450
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácidos nucleicos, que
codifica la IL-7.2 desinmunizada madura humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos para la
IL-7.3 desinmunizada madura humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 450
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácidos nucleicos, que
codifica la DeI-IL-7.3 humana
madura.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 502
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácidos nucleicos, que
codifica la secuencia del segmento enlazador GGGGSGGGG seguida por
la IL-7 madura humana, que contiene las
substituciones de los aminoácidos F39P, F57N, y L128S.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácidos nucleicos de la
Fcgamma2(h)(FN>AQ)-(segmento
enlazador2)-IL-7(F39P, F57N,
L77D, L128S) madura humana.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácidos nucleicos de la
Fcgamma2 (h)-(segmento
enlazador2)-IL-7(F39P, F57N,
L128S) madura humana.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ácidos nucleicos de la
huFcgamma2(h)-(segmento
enlazador2)-IL-7(F39P, F57N,
L77D, y L128S) madura.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 392
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
Fcgamma2(h)(FN>AQ)-(segmento
enlazador2)-IL-7(F39P, F57N,
L77D, L128S) madura humana.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 392
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
Fcgamma2(h)(FN>AQ)-(segmento
enlazador2)-IL-7(F39P, F57N,
L128S) madura humana.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 392
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
Fcgamma2(h)-(segmento
enlazador2)-IL-7(F39P, F57N,
L77D, L128S) madura humana.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 392
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
Fcgamma2(h) (segmento
enlazador2)-IL-7(F39P, F57N,
L128S) madura humana.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pan troglodytes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Papio sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Macaca mulatta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.2cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ovis aries
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia N-terminal
de proteína la IL-7 humana producida por vía
bacteriana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un epitopo de las células T,
presente en la IL-7, que incluye la posición 70.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un epitopo de las células T presente
en la IL-7, que incluye la posición 70.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un epitopo de las células T presente
en la IL-7, que incluye la posición 70.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un epitopo de las células T presente
en la IL-7, que incluye la posición 70.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un epitopo de las células T presente
en la IL-7, que incluye la posición 91.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un epitopo de las células T presente
en la IL-7, que incluye la posición 91.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un locus de glicosilación en la
porción Fc de la IgG1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un locus de glicosilación en la
porción Fc de la IgG1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un locus de glicosilación en la
porción Fc de la IgG1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Una secuencia próxima al extremo C
de la porción Fc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Una secuencia modificada próxima al
extremo C de la porción Fc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un péptido derivado de la toxina del
tétanos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un péptido, que contiene un epitopo
de las células T.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un péptido, que contiene un epitopo
de las células T.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un péptido, que contiene un epitopo
de las células T.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica de una variante
de la IL-7.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica de una variante
de la IL-7.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un péptido, que contiene un epitopo
de las células T.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un péptido, que contiene un epitopo
de las células T.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Una secuencia, que contiene un locus
de glicosilación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Una secuencia, que contiene un locus
de glicosilación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador M(s).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgactttgat gaccacctgt taaaagtttc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador M(a).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacaggtggt catcaaagtc accagtgc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador descendente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgagtcag tgttctttag tgcccatc
\hfill28
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ascendente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccgggtgct ggaggtggag gatcaggtg
\hfill29
Claims (8)
1. Un polipéptido, que comprende una molécula
modificada de la IL-7 humana o una porción activa de
la misma, que tiene un epitopo de las células T modificado para
reducir una respuesta de las células T
anti-IL-7, comprendiendo dicho
polipéptido, así mismo, una porción Fc de una molécula de
inmunoglobulina fusionada, a través de su extremo C, con el extremo
N de dicha molécula modificada de la IL-7, siendo
seleccionada dicha molécula Fc-IL7 fusionada entre
el grupo que comprende:
- (i)
- la huFcy2(h)(FN>AQ) - L - IL-7(F39P, F57N, L128S),
- \quad
- siendo Fcy2(h) una porción de Fc humano con una bisagra de IgG1 y dominios CH2 y CH3 de IgG2, que comprende las mutaciones F296A y N297Q, siendo L un segmento enlazador, que tiene la secuencia GGGGSGGGG, y siendo IL-7(F39P, F57N, L128S) la IL-7, que contienen las mutaciones F39P, F57N, y L128S; teniendo dicha molécula la secuencia que está representada en la figura 31;
- (ii)
- la huFcy2(h)(FN>AQ) - L - IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S),
- \quad
- siendo Fcy2(h) una porción de Fc humano con una bisagra de IgG1 y dominios CH2 y CH3 de IgG2, que comprende las mutaciones F296A y N297Q, siendo L un segmento enlazador, que tiene la secuencia GGGGSGGGG, y siendo IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S) la IL-7, que contiene las mutaciones F39P, F57N, L77D y L128S; teniendo dicha molécula la secuencia que esta representada en la figura 32;
- (iii)
- huFcy2(h) - L - IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S),
- \quad
- siendo Fcy2(h) una porción de Fc humano con una bisagra de IgG1 y dominios CH2 y CH3 de IgG2, siendo L un segmento enlazador, que tiene la secuencia GGGGSGGGG, y siendo IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S) la IL-7, que contiene las mutaciones F39P, F57N, L77D y L128S; teniendo dicha molécula la secuencia que está representada en la figura 33; y
- (iv)
- huFcy2(h) - L - IL-7(F39P, F57N, L128S),
- \quad
- siendo Fcy2(h) una porción de Fc humano con una bisagra de IgG1 y dominios CH2 y CH3 de IgG2, siendo L un segmento enlazador, que tiene la secuencia GGGGSGGGG, y siendo IL-7(F39P, F57N, L128S) la IL-7, que contiene las mutaciones F39P, F57N, y L128S; teniendo dicha molécula la secuencia que ha sido representada en la figura 34.
2. Un polipéptido según la reivindicación 1, en
el que dicha molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina
humana.
3. Un polipéptido según la reivindicación 1 o 2,
en el que dicha molécula de inmunoglobulina es la IgG2.
4. Una molécula de ácido nucleico, que codifica
un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3.
5. Un vector de expresión, que comprende una
molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4.
6. Una célula procariota, que comprende un
vector de expresión según la reivindicación 5.
7. Uso de un polipéptido de conformidad con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la manufactura de un
medicamento destinado al tratamiento de enfermedades cancerosas o la
infección HIV.
8. Uso según la reivindicación 6, en el que la
cantidad efectiva de polipéptido administrada al paciente está
comprendida entre 0,01 y 10 mg/kg/día.
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