CN115485028A - 免疫缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明总体涉及突变白细胞介素‑7多肽、免疫缀合物，特别地涉及包含突变白细胞介素‑7多肽和与PD‑1结合的抗体的免疫缀合物。此外，本发明涉及编码所述突变白细胞介素‑7多肽或所述免疫缀合物的多核苷酸分子，以及包含此类多核苷酸分子的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生产所述突变白细胞介素‑7多肽、免疫缀合物的方法；包含所述突变白细胞介素‑7多肽的药物组合物、包含所述免疫缀合物的药物组合物；以及其用途。

Description

免疫缀合物
技术领域
本发明总体涉及突变白细胞介素-7多肽、免疫缀合物，特别地涉及包含突变白细胞介素-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物。此外，本发明涉及编码突变白细胞介素-7多肽或免疫缀合物的多核苷酸分子，以及包含此类多核苷酸分子的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生产突变白细胞介素-7多肽或免疫缀合物的方法；包含突变白细胞介素-7多肽的药物组合物、包含免疫缀合物的药物组合物；以及其用途。
背景技术
白细胞介素-7(IL-7)是一种主要由淋巴组织中的基质细胞分泌的细胞因子。其例如通过刺激多能造血干细胞分化为淋巴母细胞来参与淋巴细胞的成熟。IL-7对于T细胞的发育和存活以及成熟T细胞的稳态至关重要。缺乏IL-7会导致未成熟的免疫细胞停滞(LinJ.等人(2017),Anticancer Res.37(3):963-967)。
IL-7与IL-7受体结合，所述受体由IL-7Rα链(IL-7Rα，CD127)以及共同的γ链(γc，CD132，IL-2Rγ)构成，所述共同的γ链为白细胞介素IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21所共有(Rochman Y.等人,(2009)Nat Rev Immunol.9:480–490)。γc由大多数造血细胞表达，而IL-7Rα几乎只由淋巴系细胞表达(Mazzucchelli R.和Durum S.K.(2007)Nat RevImmunol.7(2):144-54)。IL-7Rα在T细胞从初始细胞分化为效应细胞的整个过程中都存在于T细胞表面上，而其在终末分化的T细胞上的表达减少，并且几乎不存在于调节性T细胞表面上。IL-7RαmRNA和蛋白质表达水平受IL-2负调节，因此IL-7Rα在表达IL-2Rα(CD25)的最近活化T细胞中下调(Xue H.H等人2002,PNAS.99(21):13759-64)，这种机制确保IL-2介导的最近始发T细胞的快速克隆扩增，而IL-7的作用是平等地维持所有T细胞克隆。IL-7Rα最近也被描述于新表征的CD8 T细胞前体群即TCF-1+PD-1+干细胞样CD8 T细胞中，这种细胞发现于对PD-1阻断有反应的癌症患者的肿瘤中(Hudson等人,2019,Immunity 51,1043-1058；Im等人,PNAS,第117卷,第8期,4292-4299；Siddiqui等人,2019,Immunity 50,195–211；Held等人,Sci.,Transl.Med.11；eaay6863(2019)；Vodnala和Restifo,Nature,第576卷,19/2019年12月26日)。尽管至今还没有关于IL-7对干细胞样CD8 T细胞的效应的科学描述，但IL-7可用于扩增这一肿瘤反应性T细胞群，以增加对检查点抑制剂有反应的患者的数量。
IL-7、IL-7Rα和γc形成三元复合物，其通过JAK/STAT(Janus激酶(JAK)-信号转导子和转录激活子(STAT))通路以及PI3K/Akt(磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、蛋白激酶B(AKT))信号级联发信号，导致B细胞和T细胞的发育和稳态(Niu N.和QinX.(2013)Cell Mol Immunol.10(3):187-189,Jacobs等人,(2010),J Immunol.184(7):3461–3469)。
IL-7是一种25kDa 4螺旋束的单体蛋白。螺旋长度从13个氨基酸到22个氨基酸不等，这与其他结合白细胞介素的共同γ链(γc，CD132，IL-2Rγ)的螺旋长度相似。然而，IL-7在A螺旋中显示出独特的转角基序，此显示可稳定IL-7/IL-7Rα相互作用(McElroy,C.A.等人,(2009)Structure 17:54-65)。虽然A螺旋与受体链IL-7Rα和γc二者相互作用，但C螺旋主要与IL-7Rα相互作用，而D螺旋与γc链相互作用(基于PDB:3DI2和PDB:2ERJ进行序列和结构比对)。
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1或CD279)是CD28受体家族的抑制成员，其还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1是细胞表面受体并且在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞上表达(Okazaki等人(2002)Curr.Opin.Immunol.14:391779-82；Bennett等人(2003)JImmunol 170:711-8)。PD-1的结构是单体1型跨膜蛋白，其由一个免疫球蛋白可变样细胞外结构域和细胞质结构域组成，该细胞质结构域含有免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸基转换基序(ITSM)。已经鉴定出了PD-1的两种配体PD-L1和PD-L2，所述两种配体已显示在与PD-1结合后使T细胞活化下调(Freeman等人(2000)J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人(2001)Nat Immunol 2:261-8；Carter等人(2002)Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1和PD-L2都是与PD-1结合，而不与其他CD28家族成员结合的B7同源物。PD-1的一种配体PD-L1在多种人类癌症中是丰富的(Dong等人(2002)Nat.Med 8:787-9)。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少，从而允许癌细胞的免疫逃避(Dong等人(2003)J.MoI.Med.81:281-7；Blank等人(2005)CancerImmunol.Immunother.54:307-314；Konishi等人(2004)Clin.Cancer Res.10:5094-100)。通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制，并且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时，该效应是累加的(Iwai等人(2002)Proc.Nat 7.Acad.ScL USA 99:12293-7；Brown等人(2003)J.Immunol.170:1257-66)。
与PD-1结合的抗体描述于例如WO 2017/055443 A1中。
发明内容
本发明提供了一种新方法，所述方法经由突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的缀合，将针对免疫疗法具有有利特性的突变形式的IL-7直接靶向至诸如细胞毒性T淋巴细胞之类的免疫效应细胞而非肿瘤细胞。这导致IL-7突变体顺式递送至表达PD-1的免疫亚群，尤其是肿瘤反应性T细胞，例如CD8+PD1+TCF+T细胞亚群和其后代。
本发明中使用的IL-7突变体已经被设计用于克服与细胞因子免疫疗法相关的问题，特别是由VLS诱导引起的毒性、由AICD诱导引起的肿瘤耐受，以及由Treg细胞活化引起的免疫抑制。除了如上所述避免肿瘤从肿瘤靶向逃逸之外，将IL-7突变体靶向至免疫效应细胞还可以进一步增加肿瘤特异性CTL相对于免疫抑制Treg细胞的优先活化，这是由于Treg上的PD-1和IL-7Rα表达水平比CTL低。通过使用与PD-1结合的抗体，由PD-1与其配体PD-L1相互作用诱导的T细胞活性抑制可以另外经逆转，从而进一步增强免疫反应。
在一般方面，本发明提供突变白细胞介素-7(IL-7)多肽，其在选自下组的位置包含至少一种氨基酸取代：根据SEQ ID NO:52的人IL-7的E13、V15、V18、D21、Q22、D25、T72、L77、K81、E84、G85、I88、Q136、K139、N143和M147；即所述编号是相对于人IL-7序列SEQ IDNO:52的。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含选自以下项的组的至少一种氨基酸：E13A、E13K、V15A、V15K、V18A、V18K、D21A、D21K、Q22A、Q22K、D25A、D25K、T72A、D74K、L77A、L77K、K81A、K81E、E84A、G85K、G85E、I88K、Q136A、Q136K、K139A、K139E、N143K和M147A。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含选自以下项的组的至少一种氨基酸取代：V15A、V15K、V18A、V18K、L77A、L77K、K81E、G85K、G85E、I88K和N143K。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:53、SEQID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:136。
在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:55、SEQ IN NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:135和SEQ ID NO:136。
在另一方面，本发明提供了包含氨基酸取代的突变白细胞介素-7多肽，所述氨基酸取代消除IL-7在选自位置72、93和118的组的位置处的N-糖基化位点。取代可以选自T72A、T93A和S118A的组。在另一方面，本发明提供了一种突变白细胞介素-7多肽，其包含氨基酸取代T72A、T93A和S118A。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素7多肽包含选自SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84的组的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种突变白细胞介素-7多肽，其至少包含氨基酸取代K81E和G85K或K81E和G85E。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ IDNO:135或SEQ ID NO:136的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供如本文所公开的突变白细胞介素-7多肽，其中所述突变IL-7多肽与非IL-7部分连接。突变白细胞介素-7多肽可以与第一非IL-7部分和第二非IL-7部分连接。突变IL-7多肽可以与所述第一非IL-7部分共享羧基端肽键并且与所述第二非IL-7部分共享氨基端肽键。非IL-7部分可以是抗原结合部分或免疫效应细胞结合部分，优选PD-1结合部分。
在一个方面，本发明提供了一种免疫缀合物，其包含：(i)如本文所公开的突变IL-7多肽和(ii)与PD-1结合的抗体。在根据本发明的免疫缀合物的一些实施例中，所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的HVR-H2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3、和在根据Kabat编号的位置71-73处含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的FR-H3；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含：含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2、和含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。
在根据本发明的免疫缀合物的一些实施例中，所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含：含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H2、和含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含：含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HVR-L2、和含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L3。
在根据本发明的免疫缀合物的一些实施例中，所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和(b)轻链可变区(VL)，其包含与选自由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本发明的免疫缀合物的优选实施例中，突变IL-7多肽包含选自下组的序列：SEQID NO:55、SEQ IN NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:136。
在一些实施例中，所述免疫缀合物包含不超过一种突变IL-7多肽。在一些实施例中，抗体包含包括第一亚基和第二亚基的Fc结构域。在一些此类实施例中，所述Fc结构域是IgG类，特别是IgG1亚类的Fc结构域且/或所述Fc结构域是人Fc结构域。在一些实施例中，所述抗体是IgG类，特别是IgG1亚类免疫球蛋白。
在一些实施例中，其中所述免疫缀合物包含Fc结构域，所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基的缔合的修饰。
在一些实施例中，在Fc结构域的所述第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替代，从而在所述第一亚基的CH3结构域内产生突起，所述突起可定位在所述第二亚基的CH3结构域内的空腔中；而在所述Fc结构域的所述第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替代，从而在所述第二亚基的CH3结构域内产生空腔，所述第一亚基的CH3结构域内的所述突起可定位在所述空腔内。在一些实施例中，在所述Fc结构域的所述第一亚基中，366位的苏氨酸残基被色氨酸残基替换(T366W)；而在所述Fc结构域的所述第二亚基中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)，并且任选地，366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基替换(T366S)，并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L368A)(根据Kabat EU索引编号)。在一些此类实施例中，在所述Fc结构域的所述第一亚基中，另外，354位的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)替代或356位的谷氨酸残基被半胱氨酸残基(E356C)替代，并且在所述Fc结构域的所述第二亚基中，另外，349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替代(根据Kabat的EU索引编号)。在一些实施例中，所述突变IL-7多肽在其氨基末端氨基酸处与所述Fc结构域的所述亚基中的一个亚基的羧基末端氨基酸融合，特别是与所述Fc结构域的第一亚基的所述羧基末端氨基酸融合，任选地，通过接头肽进行融合。在一些此类实施例中，所述接头肽具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在一些实施例中，其中所述免疫缀合物包含Fc结构域，所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体，特别是Fcγ受体的结合，和/或降低效应子功能，特别是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)。在一些此类实施例中，所述一个或多个氨基酸取代位于选自L234、L235和P329(Kabat EU索引编号)的组的一个或多个位置处。在一些实施例中，Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)。
在一些实施例中，根据本发明的免疫缀合物包含：含有与SEQ ID NO:85的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:86的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，和含有与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:137和SEQ ID NO:138。在一些实施例中，所述免疫缀合物基本上由通过接头序列接合的突变IL-7多肽和IgG1免疫球蛋白分子组成。
还提供了一种生产突变IL-7多肽或包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物的方法，所述方法包括(a)在适合于表达所述突变IL-7多肽或所述免疫缀合物的条件下培养本发明的宿主细胞，以及任选地(b)回收所述突变IL-7多肽或所述免疫缀合物。本发明还提供了一种突变IL-7多肽或包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其是通过所述方法生产的。
本发明还提供了一种包含本发明的突变IL-7多肽或本发明的免疫缀合物和药用载体的药物组合物，以及使用本发明的突变IL-7多肽或免疫缀合物的方法。
具体地，本发明包括根据本发明的突变IL-7多肽或根据本发明的免疫缀合物，其用作药物和用于治疗疾病。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。
本发明还包括根据本发明的突变IL-7多肽或根据本发明的免疫缀合物在制造用于治疗疾病的药物中的用途。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。
进一步提供了一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含呈药用形式的根据本发明的突变IL-7多肽或根据本发明的免疫缀合物。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。
进一步提供了一种刺激个体的免疫系统的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的组合物，所述组合物包含呈药用形式的根据本发明的突变IL-7多肽或根据本发明的免疫缀合物。
附图说明
图1A：IgG-IL-7免疫缀合物形式的示意图，包含两个Fab结构域(可变结构域、恒定结构域)、一个异二聚体Fc结构域和与Fc结构域的C端融合的突变IL-7多肽。
图1B：另一IgG-IL-7免疫缀合物形式的示意图，包括两个Fab结构域(可变结构域、恒定结构域)、一个同二聚体Fc结构域和两个与Fc结构域的C端融合的突变IL-7多肽。
图1C：另一IgG-IL-7免疫缀合物形式的示意图，包括一个Fab结构域(可变结构域、恒定结构域)、一个异二聚体Fc结构域和一个与Fc结构域的C端融合的突变IL-7多肽。
图1D：另一IgG-IL-7免疫缀合物形式的示意图，包括两个Fab结构域(可变结构域、恒定结构域)、一个异二聚体Fc结构域和一个与Fab结构域中的一者的N端融合的突变IL-7多肽。
图1E：另一IgG-IL-7免疫缀合物形式的示意图，包括两个Fab结构域(可变结构域、恒定结构域)、一个同二聚体Fc结构域和两个与Fab结构域的N端融合的突变IL-7多肽。
图2A-H：在用增加剂量的PD1-IL7变体处理PD-1+CD4 T细胞后，通过STAT5磷酸化进行IL-7R信号传导。PD1-IL7变体的IL-7部分含有突变以降低对于IL7Rα的亲和力。STAT5-P以归一化的STAT5-P描述，其中100％等于用66nM的PD1-IL7 wt处理后STAT5-P+细胞的频率。
图2A显示了变体1-4的归一化STAT-5磷酸化。
图2B显示了变体5-8的归一化STAT-5磷酸化。
图2C显示了变体9-12的归一化STAT-5磷酸化。
图2D显示了变体13-16的归一化STAT-5磷酸化。
图2E显示了变体17-20的归一化STAT-5磷酸化。
图2F显示了变体21-24的归一化STAT-5磷酸化。
图2G显示了变体25-28的归一化STAT-5磷酸化。
图2H显示了变体29-32的归一化STAT-5磷酸化。
图3A-C：在通过PD1-IL7v锚定PD-1后，评估突变IL-7多肽向PD-1+CD4 T细胞至IL-7Rα/IL-2Rγ的顺式递送。
图3A显示了在用0.66nM的PD1-IL7突变体和PD1-IL7wt刺激后，作为人活化的PD1+CD4 T细胞中的STAT-5P频率描述的IL-7R信号传导(STAT5-P)。每个符号代表单独的供体，水平线表示N＝4的中位数。
图3B显示了PD1预阻断、活化的CD4 T细胞中的归一化STAT5-P，显示出独立于PD1的对IL7v的递送。100％的归一化STAT5-P定义为CTV标记的PD1+T细胞中STAT5-P+的频率，这些细胞与PD1预阻断、CFSE标记的CD4 T细胞一起共培养。
图3C显示了PD1阻断细胞上的归一化STAT5-P(x轴)相对于PD1+T细胞上STAT5+频率(y轴)的相关性。每个点代表一个PD1-IL7v的平均值±SEM，其中感兴趣的突变体以黑色描绘并标记。
图4A-F：在通过PD1-IL7v锚定PD-1后，通过STAT5-磷酸化评估IL-7v顺式递送至PD-1+CD4 T细胞的IL-7Rα/IL-2Rγ的效力。
图4A显示了PD1-IL7-VAR3和PD1-IL7-VAR4的IL-7R信号传导(STAT5-P)，其描述为在暴露于PD1-IL7突变体12分钟后在共培养的人PD1+非阻断(实线)和PD-1预阻断(虚线)CD4 T细胞中STAT5-P的频率。4个供体的平均值±SEM。
图4B显示了PD1-IL7-VAR6和PD1-IL7-VAR16的IL-7R信号传导(STAT5-P)，其描述为在暴露于PD1-IL7突变体12分钟后在共培养的人PD1+非阻断(实线)和PD-1预阻断(虚线)CD4 T细胞中STAT5-P的频率。4个供体的平均值±SEM。
图4C显示了PD1-IL7-VAR18和PD1-IL7-VAR20的IL-7R信号传导(STAT5-P)，其描述为在暴露于PD1-IL7突变体12分钟后在共培养的人PD1+非阻断(实线)和PD-1预阻断(虚线)CD4 T细胞中STAT5-P的频率。4个供体的平均值±SEM。
图4D显示了PD1-IL7-VAR21和PD1-IL7-VAR27的IL-7R信号传导(STAT5-P)，其描述为在暴露于PD1-IL7变体12分钟后在共培养的人PD1+非阻断(实线)和PD-1预阻断(虚线)CD4 T细胞中STAT5-P的频率。4个供体的平均值±SEM。
图4E显示了在用0.66nM的PD1-IL7突变体和PD1-IL7wt刺激后，作为人活化的PD1+CD4 T细胞中STAT-5的频率描述的IL-7R信号传导(STAT5-P)。
图4F显示了PD1+预阻断、活化的CD4 T细胞中的归一化STAT5-P，显示出独立于PD1的递送IL7v的影响。100％的归一化STAT5-P定义为PD1+T细胞中STAT5-P+的频率，这些细胞与PD1预阻断、活化CD4T细胞一起共培养。对于图4E和4F，每个符号代表单独的供体，水平线表示N＝8的中位数。
图5A-F：分别培养的PD1阻断的CD4+T细胞和表达PD-1的CD4+T细胞中的IL-7R信号传导(STAT5-P)。
图5A：PD1-IL7-VAR3和PD1-IL7-VAR4的IL-7R信号传导(STAT5-P)，其描述为在暴露于PD1-IL7突变体12分钟后在人PD1+(实线)和PD-1预阻断(虚线)CD4 T细胞中STAT5-P的频率。4个供体的平均值±SEM。
图5B：PD1-IL7-VAR5和PD1-IL7-VAR6的IL-7R信号传导(STAT5-P)，其描述为在暴露于PD1-IL7突变体12分钟后在人PD1+(实线)和PD-1预阻断(虚线)CD4 T细胞中STAT5-P的频率。4个供体的平均值±SEM。
图5C：PD1-IL7-VAR15和PD1-IL7-VAR16的IL-7R信号传导(STAT5-P)，其描述为在暴露于PD1-IL7突变体12分钟后在人PD1+(实线)和PD-1预阻断(虚线)CD4 T细胞中STAT5-P的频率。4个供体的平均值±SEM。
图5D：PD1-IL7-VAR18和PD1-IL7-VAR20的IL-7R信号传导(STAT5-P)，其描述为在暴露于PD1-IL7突变体12分钟后在人PD1+(实线)和PD-1预阻断(虚线)CD4 T细胞中STAT5-P的频率。4个供体的平均值±SEM。
图5E：PD1-IL7-VAR21和PD1-IL7-VAR22的IL-7R信号传导(STAT5-P)，其描述为在暴露于PD1-IL7突变体12分钟后在人PD1+(实线)和PD-1预阻断(虚线)CD4 T细胞中STAT5-P的频率。4个供体的平均值±SEM。
图5F：PD1-IL7-VAR27的IL-7R信号传导(STAT5-P)，其描述为在暴露于PD1-IL7突变体12分钟后在人PD1+(实线)和PD-1预阻断(虚线)CD4 T细胞中STAT5-P的频率。4个供体的平均值±SEM。
图6显示了在PDl-IL7v处理后从Treg抑制中拯救Tconv效应子功能。在存在PD1-IL7单突变体的情况下共培养5天后，Treg对Tconv分泌的颗粒酶B的抑制百分比。每个符号代表单独的供体，水平线表示N＝5的中位数。使用单因素方差分析计算P(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。
图7显示了在活化的PD-1+和PD-1-CD4细胞上用增加剂量的参考PD1-IL7突变体处理后的IL-7R信号传导(STAT5-P)。用参考PD1-IL7突变体处理后，在共培养的PD-1-(用抗PD-1预处理)和PD-1+CD4 T细胞中进行IL-7R信号传导(STAT5-P)。IL-7R信号传导(STAT5-P)描述为在暴露后12分钟时在共培养的PD-1+(实线)和PD-1(用抗PD-1预处理)(虚线)CD4T细胞中STAT5-P的频率。6个供体的平均值±SEM。
图8A显示了在活化的PD-1+和PD-1-CD4 T细胞上用增加剂量的PD1-IL7单突变体和双突变体处理后的IL-7R信号传导(STAT5-P)。用PD1-IL7突变体(VAR18、VAR21)处理后，在共培养的PD-1-(用抗PD-1预处理)和PD-1+CD4 T细胞中进行IL-7R信号传导(STAT5-P)。IL-7R信号传导(STAT5-P)描述为在暴露后12分钟时在共培养的PD-1+(实线)和PD-1(用抗PD-1预处理)(虚线)CD4 T细胞中STAT5-P的频率。4个供体的平均值±SEM。
图8B显示了在活化的PD-1+和PD-1-CD4 T细胞上用增加剂量的PD1-IL7单突变体和双突变体处理后的IL-7R信号传导(STAT5-P)。用PD1-IL7突变体(参考分子2、VAR18/20、VAR18/21)处理后，在共培养的PD-1-(用抗PD-1预处理)和PD-1+CD4 T细胞中进行IL-7R信号传导(STAT5-P)。IL-7R信号传导(STAT5-P)描述为在暴露后12分钟时在共培养的PD-1+(实线)和PD-1(用抗PD-1预处理)(虚线)CD4 T细胞中STAT5-P的频率。4个供体的平均值±SEM。
图9A显示了在用增加剂量的PD1-IL7突变体(VAR18，VAR21)处理后，活化的PD-1+CD4 T细胞相对于新鲜分离的IL-7Ra+CD4 T细胞上的IL-7R信号传导(STAT5-P)。在暴露于PD1-IL7突变体后，在共培养的活化PD1+IL-7Ra-CD4 T细胞和新鲜分离的PD1-IL-7Ra+CD4T细胞中进行IL-7R信号传导(STAT5-P)。IL-7R信号传导(STAT5-P)描述为在暴露后12分钟时在活化的PD1+T细胞(实线)和新鲜分离的IL-7Ra+T细胞(虚线)中的STAT5-P频率。3个供体的平均值±SEM。
图9B显示在用增加剂量的PD1-IL7突变体(参考分子2、VAR18/20、VAR18/21)处理后，活化的PD-1+CD4 T细胞相对于新鲜分离的IL-7Ra+CD4 T细胞上的IL-7R信号传导(STAT5-P)。在暴露于PD1-IL7突变体后，在共培养的活化PD1+IL-7Ra-CD4 T细胞和新鲜分离的PD1-IL-7Ra+CD4 T细胞中进行IL-7R信号传导(STAT5-P)。IL-7R信号传导(STAT5-P)描述为在暴露后12分钟时在活化的PD1+T细胞(实线)和新鲜分离的IL-7Ra+T细胞(虚线)中的STAT5-P频率。3个供体的平均值±SEM。
图10A-F：PD1-IL7单突变体和双突变体对同种异体特异性PD-1+CD4 T细胞的细胞毒性效应子功能和增殖的功能活性。在PD1-IL7单突变体和双突变体存在5天后，CD4 T细胞针对B细胞淋巴母细胞系(ARH-77)具有细胞毒性效应子功能(作为颗粒酶B(GrzB)分泌)和增殖。图10A-C显示了归一化的GrzB+CTV-CD4 T细胞频率相对于未经处理的倍数变化(图10A：PD1-IL7wt、PD1-IL7VAR18、PD1-IL7VAR21、PD1、PD1+FAP-IL7wt、PD1+FAP-IL7VAR18、PD1+FAP-IL7VAR21、FAP-IL7wt、FAP-IL7VAR18、FAP-IL7VAR21；图10B：PD1-IL7wt、PD1-IL7VAR18/20、PD1-IL7VAR18/21、PD1、PD1+FAP-IL7wt、PD1+FAP-IL7VAR18/20、PD1+FAP-IL7VAR18/21、FAP-IL7wt、FAP-IL7VAR18/20、FAP-IL7VAR18/21；图10C：PD1-IL7wt、参考分子2、PD1、PD1+FAP-IL7wt、PD1+FAP-IL7 SS2(1x)、PD1+FAP-IL7SS2(2x)、FAP-IL7wt、FAP-IL7 SS2(1x))。图10D-4显示通过提取CTV的MFI(相对于未经处理归一化)所测量的增殖(图10D：PD1-IL7wt、PD1-IL7VAR18、PD1-IL7VAR21、PD1、PD1+FAP-IL7wt、PD1+FAP-IL7VAR18、PD1+FAP-IL7VAR21、FAP-IL7wt、FAP-IL7VAR18、FAP-IL7VAR21；图10E：PD1-IL7wt、PD1-IL7VAR18/20、PD1-IL7VAR18/21、PD1、PD1+FAP-IL7wt、PD1+FAP-IL7VAR18/20、PD1+FAP-IL7VAR18/21、FAP-IL7wt、FAP-IL7VAR18/20、FAP-IL7VAR18/21；图10F：PD1-IL7wt、参考分子2、PD1、PD1+FAP-IL7wt、PD1+FAP-IL7 SS2(1x)、PD1+FAP-IL7 SS2(2x)、FAP-IL7wt、FAP-IL7 SS2(1x))。9个供体的平均值±SEM。
图11：通过基于PD-1相对于非靶向IL-7突变体和IL7wt对干细胞样T细胞、Treg和天然T细胞的靶向。PD1-IL7突变体和野生型相对于非靶向IL-7突变体和野生型在不饱和浓度下与干细胞样T细胞、Treg和天然T细胞结合。不饱和浓度的靶向PD-1与靶向FAP的VAR18、VAR21和野生型在37℃下与健康供体PBMC结合30分钟。
图12：PD1-IL7单突变体、双突变体和野生型对人PD-1转基因小鼠的小鼠IL-7Ra和IL-2Rg的交叉反应性。在用PD1-IL7单突变体和双突变体处理后，在来自huPD1-转基因小鼠脾脏的活化huPD1+CD4 T细胞中进行IL-7R信号传导(STAT5-P)。IL-7R信号传导(STAT5-P)描述为STAT5-P的MFI，在暴露后30分钟相对于PD1-IL7wt归一化。2只小鼠的平均值±SEM。
图13A-B：在用增加剂量的与PD-1阻断抗体的C端和N端融合的IL-7VAR18(K81E)、VAR21和野生型处理后，活化PD-1+和PD-1-CD4 T细胞上的IL-7R信号传导(STAT5-P)。在用IL-7与抗体的N端或C端融合的PD1-IL7刺激后，在共培养的PD1-(用抗PD-1预处理)和PD1+CD4 T细胞中进行IL-7R信号传导(STAT5-P)。IL-7R信号传导(STAT5-P)描述为在暴露后12分钟在共培养的PD1+(实线)和PD-1-(用抗PD-1预处理)(虚线)CD4 T细胞中的STAT5-P频率(图13A：PD1-IL7wt、PD1-IL7VAR18、IL7wt G4SG5 PD1、IL7VAR18 G4SG5 PD1、PD1+PD1-IL7wt、PD1+PD1-IL7VAR18、PD1+IL7wt G4SG5 PD1、PD1+IL7VAR18 G4SG5 PD1；图13B：PD1-IL7wt、PD1-IL7VAR21、IL7wt G4SG5 PD1、IL7VAR21 G4SG5 PD1、PD1+PD1-IL7wt、PD1+PD1-IL7VAR21、PD1+IL7wt G4SG5 PD1、PD1+IL7VAR21 G4SG5 PD1)。3个供体的平均值±SEM。
图14：用PD1-IL7v参考分子处理后，共培养的PD1预阻断和PD1+CD4+T细胞中的IL-7R信号传导(STAT5-P)。IL-7R信号传导(STAT5-P)描述为暴露后12分钟在共培养的PD1+(实线)和PD-1预阻断(虚线)CD4 T细胞中的STAT5-P频率。6个供体的平均值±SEM。
图15A-C显示了用PD1-IL7v变体18(图15A)、PD1-IL7v变体21(图15B)和PD-IL7wt(图15C)作为单一药剂的功效实验的结果。将Panc02-Fluc胰腺癌细胞系皮下注射到黑色6-huPD1转基因小鼠中，以研究皮下模型中的肿瘤生长抑制(TGI)。使用卡尺测量肿瘤大小。当肿瘤达到150mm3时，开始治疗。对于muPD1-IL7v变体18及变体21以及PD1-IL7wt，每只小鼠所注射的抗体量为1mg/kg，每周一次。治疗持续2周。与媒介物组相比，PD1-IL7v变体21及18在肿瘤生长抑制方面有显著优越的功效。PD1-IL7wt分子耐受性不佳，且在第二次施用后需要处死小鼠，因此无法计算TGI。
具体实施方式
定义
除非在下文中另外定义，否则本文使用的术语通常如本领域中所使用的。
如本文所用的术语“氨基酸突变”表示涵盖氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任何组合以获得最终构建体，前提条件是所述最终构建体具有所需特征，例如减少的与IL-7Rα和/或IL-2Rγ的结合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失和插入。末端缺失的实例是全长人IL-7的位置1中的残基的缺失。优选的氨基酸突变是氨基酸取代。出于改变例如IL-7多肽的结合特征的目的，非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸，是特别优选的。优选的氨基酸取代包括用亲水性氨基酸取代疏水性氨基酸。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或用二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)进行替代。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法来产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。设想通过除基因工程之外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也是有用的。
“亲和力”是指分子(例如，受体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，配体)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，该固有结合亲和力反映了结合对的成员(例如，抗原结合部分与抗原，或者受体与其配体)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示，所述解离常数是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域中已知的完善确立的方法(包括本文所述的那些方法)来测量。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。
IL-7与IL-7受体结合，所述受体由IL-7Rα链(在本文中也称为IL-7Ralpha、IL-7Rα、IL7Rα、IL-7a、IL7Ra或CD127)以及共同的γ链(在本文中也称为γc、CD132、IL-2Rgamma、IL-2Rg、IL2Rg、IL-2Rγ或IL2Rγ)构成，所述共同的γ链为白细胞介素IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21所共有(Rochman Y.等人,(2009)Nat Rev Immunol.9:480–490)。
突变或野生型IL-7多肽对IL-7受体的亲和力可以根据WO 2012/107417中叙述的方法，通过表面等离子体共振(SPR)，使用诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)之类的标准仪器和诸如可通过重组表达获得的受体亚基来测定(参见例如Shanafelt等人，NatureBiotechnol 18,1197-1202(2000))。可替代地，可以使用已知表达一种或另一种此类形式的受体的细胞系来评估IL-7突变体对IL-7受体的结合亲和力。下文将描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“白细胞介素-7”或“IL-7”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然IL7，所述脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如人)之类的哺乳动物，以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括未加工的IL-7以及通过细胞中加工产生的任何形式的IL-7。该术语还涵盖天然存在的IL-7变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人IL-7的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:52中。
如本文所用的术语“IL-7突变体”或“突变IL-7多肽”旨在涵盖各种形式的IL-7分子的任何突变形式，包括全长IL-7、截短形式的IL-7，以及IL-7与另一分子诸如通过融合或化学缀合连接的形式。当关于IL-7使用时，“全长”旨在表示成熟的天然长度IL-7分子。例如，全长人IL-7是指具有根据SEQ ID NO:52的多肽序列的分子。各种形式的IL-7突变体表征为具有至少一种影响IL-7与IL7Rα和/或IL2Rγ相互作用的氨基酸突变。该突变可涉及对通常位于该位置的野生型氨基酸残基的取代、缺失、截短或修饰。通过氨基酸取代获得的突变体是优选的。除非另外指明，否则IL-7突变体在本文中可称为突变IL-7肽序列、突变IL-7多肽、突变IL-7蛋白质、突变IL-7类似物或IL-7变体。
本文中关于SEQ ID NO:52所示的序列进行了对各种形式的IL-7的命名。本文可使用各种名称来指示相同的突变。例如，位置15处从缬氨酸到丙氨酸的突变可以表示为15A、A15、A15、V15A或Val15Ala。
如本文所用的“人IL-7分子”是指包含以下项的IL-7分子：与SEQ ID NO:52的人IL-7序列至少约90％、至少约91％，至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％或至少约96％相同的氨基酸序列。具体地，序列同一性为至少约95％，更特别地至少约96％。在特定实施例中，人IL-7分子是全长IL-7分子。
如本文所用，“野生型”形式的IL-7是IL-7的一种形式，所述野生型形式与突变IL-7多肽在其他方面相同，不同之处在于野生型形式在突变IL-7多肽的每个氨基酸位置处具有野生型氨基酸。例如，如果IL-7突变体是全长IL-7(即IL-7未与任何其他分子融合或缀合)，则该突变体的野生型形式是全长天然IL-7。如果IL-7突变体是IL-7与IL-7下游编码的另一种多肽(例如抗体链)之间的融合体，则该IL-7突变体的野生型形式是与相同的下游多肽融合的、具有野生型氨基酸序列的IL-7。此外，如果IL-7突变体是IL-7的截短形式(IL-7的非截短部分内的突变或修饰的序列)，则该IL-7突变体的野生型形式是具有野生型序列的类似截短的IL-7。出于比较各种形式的IL-7突变体与相应的野生型形式的IL-7的IL-7受体结合亲和力、IL-7受体结合或生物活性的目的，术语野生型涵盖如下形式的IL-7，所述形式包含与天然存在的天然IL-7相比不影响IL-7受体结合的一个或多个氨基酸突变。在根据本发明的某些实施例中，与突变IL-7多肽相比较的野生型IL-7多肽包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
“调节性T细胞”或“Treg细胞”是指能够抑制其他T细胞的应答(称为外周耐受)的特殊类型的CD4+T细胞。Treg细胞表征为升高表达的IL-2受体(CD25)的α亚基、低表达或不存在IL-7Rα(CD127)和转录因子叉头框P3(FOXP3)(Sakaguchi,Annu Rev Immunol 22,531-62(2004))，并且在诱导和维持对抗原(包括由肿瘤表达的抗原)的外周自身耐受性中起关键作用。如本文所用，术语“效应细胞”是指存活和/或稳态受IL-7影响的淋巴细胞群。效应细胞包括记忆CD4+和CD8+细胞以及最近始发的T细胞，包括肿瘤反应性干细胞样T细胞。
如本文所用，术语“PD1”、“人PD1”、“PD-1”或“人PD-1”(也称为程序性细胞死亡蛋白1，或程序性死亡1)是指人蛋白质PD1(SEQ ID NO:27，没有信号序列的蛋白质)/(SEQ IDNO:28，具有信号序列的蛋白质)。还参见UniProt登录号Q15116(第156版)。如本文所用，“与PD-1结合”、“特异性结合PD-1”、“结合PD-1”的抗体或“抗PD-1抗体”是指如下抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合PD-1，尤其是在细胞表面上表达的PD-1多肽，使得该抗体可用作靶向PD-1的诊断和/或治疗剂。在一个实施例中，抗PD-1抗体与不相关的非PD-1蛋白质的结合程度小于所测量的所述抗体与PD-1的结合的约10％，例如通过放射性免疫测定(radioimmunoassay，RIA)或流式细胞术(flow cytometry，FACS)或通过使用生物传感器系统(诸如
Figure BDA0003884610430000181
系统)进行表面等离子体共振测定法测定。在某些实施例中，结合PD-1的抗体与人PD-1结合的结合亲和力的KD值为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)。在一个实施例中，使用人PD-1的细胞外结构域(Extracellular domain，ECD)(PD-1-ECD，参见SEQ ID NO:43)作为抗原，以表面等离振子共振测定法测定结合亲和力的KD值。
“特异性结合”是指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗体结合特定抗原(例如PD-1)的能力可以通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术来测量，所述其他技术为例如表面等离子体共振(SPR)技术(例如在BIAcore仪器上分析的)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))。在一个实施例中，抗体与无关蛋白质的结合程度为所述抗体与抗原结合的小于约10％，如例如通过SPR所测量的。包含在本文所述的免疫缀合物中的抗体与PD-1特异性结合。
如本文所用，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何链，而不是指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代具有两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一者使用，或与这些术语中的任何一者可互换地使用。术语“多肽”还旨在指代多肽的表达后修饰产物，所述表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、用已知保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割，或用非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术生产，而不一定从指定的核酸序列翻译而来。它可以以任何方式生成，包括通过化学合成。多肽可以具有确定的三维结构，但它们不一定具有此类结构。具有确定的三维结构的多肽被称为折叠的；并且不具有确定的三维结构，而是可以采用大量不同构象的多肽则被称为未折叠的。
“分离的”多肽或变体或其衍生物意指不是处于其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，可以从多肽的天然或自然环境中移出分离的多肽。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被认为是出于本发明的目的而分离的，已经通过任何合适的技术分离、分级或部分或基本上纯化的天然或重组多肽也被认为是出于本发明的目的而分离的。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列相同的百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并且引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列相同的百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列相同的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列相同的百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，用BLOSUM50比较矩阵，使用FASTA包第36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序产生氨基酸序列一致性％的值。FASTA程序包由W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“Improved Tools for Biological Sequence Analysis”,PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequence comparison”Meth.Enzymol.266:227-258；以及Pearson等人，(1997)Genomics 46:24-36，并且可公开地从http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml获得。或者，可以使用可在http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器来比较序列，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；开放：-10；ext：-2；Ktup＝2)来确保执行全局而非局部比对。在输出的比对标头(alignment header)中给出氨基酸相同的百分比。
术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病毒来源的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中存在的)。术语“核酸分子”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。
“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已从其天然环境中取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被视为分离的。分离的多核苷酸的另外的实施例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或处于溶液中的纯化的(部分地或基本上纯化的)多核苷酸。分离的多核苷酸包括多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含在通常包含多核苷酸分子的细胞中，但该多核苷酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置上。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式及双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括通过合成生产的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调控元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
“编码[例如本发明的免疫缀合物]的分离的多核苷酸(或核酸)”是指编码抗体重链和轻链和/或IL-7多肽(或其片段)的一种或多种多核苷酸分子，包括在单个载体或单独载体中的此类多核苷酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此类核酸分子。
术语“表达盒”是指通过重组或合成生成的多核苷酸，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，表达盒包含编码本发明的免疫缀合物或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”是指用于将与其可操作地缔合的特定基因引入细胞中并且指导所述特定基因在细胞中表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mRNA的转录。表达载体在细胞内之后，就通过细胞转录和/或翻译机制生产由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码本发明的免疫缀合物或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全相同，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可用于产生本发明的免疫缀合物的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物的培养细胞，诸如仅举几个示例HEK细胞、CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了可能的变异抗体外，该群体中包括的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，所述可能的变异抗体例如含有天然存在的突变或是在单克隆抗体制备物的生产过程中产生的，此类变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中分离出的抗体，即不在其天然环境中的抗体。不需要特定的纯化水平。例如，可以从抗体的天然或自然环境中取出分离的抗体。在宿主细胞中表达的重组产生的抗体被认为是出于本发明的目的而分离的，已经通过任何合适的技术分离、分级或部分或基本上纯化的天然或重组抗体也被认为是出于本发明的目的而分离的。如此，分离出本发明的免疫缀合物。在一些实施例中，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)方法测定的，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述，请参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换使用以指代具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2，双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)，以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，请参见Holliger和Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136(2005)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun在The harmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)中所述；还可参见WO 93/16185；以及美国专利5,571,894和5,587,458。对于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如EP404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。在Hudson等人，Nat Med9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利6,248,516B1)。抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)生产，如本文所述。
术语“免疫球蛋白分子”是指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链组成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变结构域(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变区)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N-末端到C-末端，每条轻链具有可变结构域(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变区)，接着是一个恒定轻链(CL)结构域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可配属为以下五种类型中的一种：称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而被配属为以下两种类型中的一种：称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。免疫球蛋白实质上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。
术语“抗原结合结构域”是指抗体的一部分，该部分包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。具体地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。如本文所用，与可变区序列有关的“Kabat编号”是指由Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)提出的编号系统。
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和恒定结构域的氨基酸位置根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统进行编号，并且在本文中被称为“根据Kabat编号”或“Kabat编号”。具体地讲，将Kabat编号系统(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的第647页至第660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且将Kabat EU索引编号系统(参见第661页至第723页)用于重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2和CH3)，这在本文中通过在此种情况下称为“根据Kabat EU索引编号”来进一步阐明。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指以下项中的每一种：抗体可变结构域的在序列中高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包括：
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处发生的高可变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处发生的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处发生的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；以及
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，出处同上编号。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常在VH(或VL)中以如下次序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。此类可变结构域在本文中称为“人源化可变区”。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。本发明涵盖的“人源化抗体”的其他形式是这些抗体，所述抗体相对于原始抗体，恒定区已经经额外的修饰或改变以产生根据本发明所述的特性，尤其是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的特性。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞生产的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。在某些实施例中，人抗体来源于非人转基因哺乳动物，例如小鼠、大鼠或兔子。在某些实施例中，人抗体来源于杂交瘤细胞系。在本文中从人抗体文库分离出的抗体或抗体片段也被认为是人抗体或人抗体片段。
抗体或免疫球蛋白的“类”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，以及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管IgG重链Fc区的边界可能略有不同，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或从Pro230延伸至该重链的羧基末端。然而，由宿主细胞生产的抗体可以经历对来自重链的C末端的一个或多个，特别是一个或两个氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子生产的抗体可以包括全长重链，或者该抗体可以包括全长重链的切割变体(在本文中也称为“经切割的变体重链”)。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，根据Kabat EU索引)的情况。因此，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)可以存在或可以不存在。如果没有另外指明，则包含Fc结构域(或如本文所定义的Fc结构域的亚基)的重链的氨基酸序列在本文中被表示为没有C末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在本发明的一个实施例中，包括如本文所指定的Fc结构域的亚基的重链包含在根据本发明的免疫缀合物中，该重链包含另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，包含如本文所指定的Fc结构域的亚基的重链包含在根据本发明的免疫缀合物中，该重链包含另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)。本发明的组合物，诸如本文所述的药物组合物，包含本发明的免疫缀合物群体。该免疫缀合物群体可包含具有全长重链的分子和具有经切割的变体重链的分子。该免疫缀合物群体可以由具有全长重链的分子和具有经切割的变体重链的分子的混合物组成，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的所述免疫缀合物具有经切割的变体重链。在本发明的一个实施例中，包含本发明的免疫缀合物群体的组合物包含这样的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含这样的重链，所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，包含本发明的免疫缀合物群体的组合物包含这样的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含这样的重链，所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，这种组合物包含免疫缀合物群体，所述免疫缀合物群体由以下分子构成：包含这样的重链的分子，所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基；包含这样的重链的分子，所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)；以及包含这样的重链的分子，所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。除非本文另外指明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统(也称为EU索引)来编号的，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991(还可参见上文)中所述。如本文所用的Fc结构域的“亚基”是指形成二聚Fc结构域的两种多肽中的一种，即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽，该多肽能够稳定自缔合。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。
“促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰”是对肽骨架的操纵或Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或防止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合以形成同源二聚体。如本文所用，“促进缔合的修饰”特别包括对期望缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一亚基和第二亚基)中的每一者进行的单独修饰，其中所述修饰彼此互补以促进这两个Fc结构域亚基的缔合。例如，促进缔合的修饰可以改变Fc结构域亚基中的一者或两者的结构或电荷，以便分别使它们的缔合在空间上或静电上有利。因此，(异源)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽与包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，这在融合至每个亚基的另外组分(例如抗原结合部分)不相同的意义上可能是不同的。在一些实施例中，促进缔合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在一个特定实施例中，促进缔合的修饰包括对Fc结构域的两个亚基中的每一个的单独氨基酸突变，特别是氨基酸取代。
当关于抗体使用时，术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性，该等生物活性随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞活化。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是与包含Fc区的抗体或其衍生物特异性结合的细胞，该特异性结合通常是通过Fc区的N末端的蛋白质部分。如本文所用，术语“降低的ADCC”被定义为在靶细胞周围的培养基中给定抗体浓度下在给定时间内通过上面定义的ADCC机制裂解的靶细胞数量减少，和/或在靶细胞周围的培养基中通过ADCC机制在给定时间内实现对给定数量的靶细胞的裂解所必需的抗体浓度增加。ADCC降低是相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(该等方法为本领域技术人员已知的)，由相同类型的宿主细胞产生但尚未被工程化的相同抗体介导的ADCC。例如，由在Fc结构域中包含降低ADCC的氨基酸取代的抗体介导的ADCC的降低是相对于由在Fc结构域中没有该氨基酸取代的相同抗体介导的ADCC。用于测量ADCC的合适测定法是本领域中熟知的(参见例如PCT公开号WO 2006/082515或PCT公开号WO 2012/130831)。
“活化性Fc受体”是这样的Fc受体：其在被抗体的Fc结构域接合后引发刺激携带该受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。人活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
如本文所用，术语“工程化、工程化的、工程改造”被认为包括对肽骨架的任何操纵，或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程改造包括对氨基酸序列、糖基化模式或单独氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。
“降低的结合”，例如降低的与Fc受体或CD25的结合，是指对相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR所测量的。为清楚起见，该术语还包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测极限)，即完全消除相互作用。相反地，“增加的结合”是指对相应相互作用的结合亲和力增加。
如本文所用，术语“免疫缀合物”是指包含至少一种IL-7分子和至少一种抗体的多肽分子。IL-7分子可以通过各种相互作用和以如本文所述的各种构型与抗体连接。在特定实施例中，IL-7分子通过肽接头与抗体融合。根据本发明的特定免疫缀合物基本上由通过一个或多个(一种或多种)接头序列接合的一个(一种)IL-7分子和一个(一种)抗体组成。
“融合”是指组分(例如抗体和IL-7分子)直接地或经由一个或多个肽接头而通过肽键连接。
如本文所用，关于Fc结构域亚基等的术语“第一”和“第二”用于方便当存在多于一个类型的部分时进行区分。除非明确说明，否则这些术语的使用并非旨在赋予免疫缀合物特定次序或取向。
药剂的“有效量”是指在其所施用的细胞或组织中产生生理学变化所需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所需治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。具体地，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”是指一种制备物，该制备物的形式使得包含在其中的活性成分的生物活性有效，并且该制备物不含对将施用该组合物的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。
“药用载体”是指药物组合物中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或在临床病理学过程中执行的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的免疫缀合物用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
实施例的具体描述
突变IL-7多肽
根据本发明的IL-7变体具有用于免疫疗法的有利特性。
根据本发明的突变白细胞介素-7(IL-7)多肽包含至少一种氨基酸突变，其降低突变IL-7多肽对IL-7受体的α-亚基和/或IL-2Rγ亚基的亲和力。
对于IL-7Rα和/或IL-2Rγ具有降低的亲和力的人IL-7(hIL-7)的突变体可以例如通过氨基酸位置13、15、18、21、22、25、72、77、81、84、85、88、136、139、143或147或其组合(相对于人IL-7序列SEQ ID NO:52编号)处的氨基酸取代产生。示例性氨基酸取代包括E13A、E13K、V15A、V15K、V18A、V18K、D21A、D21K、Q22A、Q22K、D25A、D25K、T72A、L77A、L77K、K81A、K81E、E84A、G85K、G85E、I88K、Q136A、Q136K、K139A、K139E、N143K和M147A。
根据本发明的突变白细胞介素-7(IL-7)多肽可以包含至少一种提高多肽同质性的氨基酸突变，所述突变优选在氨基酸位置74、93和118或其组合中之一处。示例性氨基酸取代包括D74A、D74K、T93A和S118A。
在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQID NO:67的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ IDNO:68的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，突变白细胞介素-7多肽包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列。
本发明的特定IL-7突变体包含选自根据SEQ ID NO:52的人IL-7的下组的氨基酸突变：V15A、V15K、V18A、V18K、L77A、L77K、K81E、G85K、G85E、I88K和N143K。本发明的特定IL-7突变体包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。本发明的特定IL-7突变体包含SEQ IN NO:56的氨基酸序列。本发明的特定IL-7突变体包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。本发明的特定IL-7突变体包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。本发明的特定IL-7突变体包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。本发明的特定IL-7突变体包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。本发明的特定IL-7突变体包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。本发明的特定IL-7突变体包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。本发明的特定IL-7突变体包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。本发明的特定IL-7突变体包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。本发明的特定IL-7突变体包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。这些突变体展现与野生型形式的IL-7突变体相比，对白细胞介素7受体的亲和力显著降低。
本发明的特定IL-7突变体包含至少两个氨基酸取代，其中所述两个氨基酸取代是根据SEQ ID NO:52的人IL-7的K81E和G85K或G85E。本发明的特定IL-7突变体包含SEQ IDNO:135的氨基酸序列。本发明的特定IL-7突变体包含SEQ IN NO:136的氨基酸序列。
与在PD1-IL-7免疫缀合物中时主要以反式(在细胞邻近处)递送的野生型IL-7相比，如本文公开的IL-7突变体的其他特征包括对IL-7Rα的亲和力降低，以允许PD-1介导的在表达PD-1的CD4 T细胞上顺式(在同一细胞上)递送IL-7。
在某些实施例中，所述氨基酸突变使突变IL-7多肽对IL-Rα和/或IL-2Rγ的亲和力降低至少5倍，具体地至少10倍，更具体地至少25倍。
降低IL-7对IL-7Rα和/或IL-2Rγ的亲和力与消除IL-7的N-糖基化的组合产生了具有改善性质的IL-7蛋白质。例如，当突变IL-7多肽在诸如CHO或HEK细胞之类的哺乳动物细胞中表达时，消除N-糖基化位点导致更均质的产物。
因此，在某些实施例中，突变IL-7多肽包含另外的氨基酸突变，该另外的氨基酸突变消除了在与人IL-7的残基72、93或118对应的位置处的IL-7的N-糖基化位点。在一个实施例中，消除与人IL-7的残基72、93或118对应的位置处的IL-7的N-糖基化位点的所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代。在一个具体实施例中，所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代T72A。在另一具体实施例中，所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代T93A。在另一具体实施例中，所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代S118A。在另一具体实施例中，突变IL-7多肽包含氨基酸取代T72A、T93A和S118A。在某些实施例中，突变IL-7多肽基本上是全长IL-7分子。在某些实施例中，突变IL-7多肽是人IL-7分子。在一个实施例中，与包含不具有所述突变的SEQ ID NO:52的IL-7多肽相比，突变IL-7多肽包含具有至少一个氨基酸突变的SEQ ID NO:52序列，所述至少一个氨基酸突变降低突变IL-7多肽对IL-7Rα或IL-2Rγ的亲和力。在一个实施例中，与包含不具有所述突变的SEQ ID NO:52的IL-7多肽相比，突变IL-7多肽包含具有至少一个氨基酸突变的SEQ ID NO:52序列，所述至少一个氨基酸突变降低突变IL-7多肽对IL-7Rα和IL-2Rγ的亲和力。在一个实施例中，与包含不具有所述突变的SEQ ID NO:52的IL-7多肽相比，突变IL-7多肽包含具有至少一个氨基酸突变的SEQ ID NO:52序列，所述至少一个氨基酸突变降低突变IL-7多肽对IL-7Rα和/或IL-2Rγ的亲和力。
在一个具体实施例中，突变IL-7多肽仍可以引发选自由以下项组成的组的细胞反应中的一种或多种：T淋巴细胞的增殖、始发T淋巴细胞的效应子功能、细胞毒性T细胞(CTL)活性、活化B细胞的增殖、活化B细胞的分化、自然杀伤(NK)细胞的增殖、NK细胞的分化、通过活化T细胞或NK细胞进行的细胞因子分泌，以及NK/淋巴细胞活化杀伤(LAK)抗肿瘤细胞毒性。
在一个实施例中，与相应的野生型IL-2序列(例如SEQ ID NO:52的人IL-7序列)相比，突变IL-7多肽包含不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个，或不超过5个氨基酸突变。在一个特定实施例中，与相应的野生型IL-7序列(例如如SEQ ID NO:52所示的人IL-7氨基酸序列)相比，突变IL-7多肽包含不超过5个氨基酸突变。
免疫缀合物
如本文所述的免疫缀合物包含IL分子和抗体。此类免疫缀合物通过直接靶向IL-7(例如进入肿瘤微环境)而显著增加IL-7疗法的功效。根据本发明，包含在免疫缀合物中的抗体可以是完整抗体或免疫球蛋白，或其具有生物学功能(诸如抗原特异性结合亲和力)的部分或变体。
免疫缀合物治疗的一般益处是显而易见的。例如，包含在免疫缀合物中的抗体识别肿瘤特异性表位并导致免疫缀合物分子靶向肿瘤部位。因此，可以将高浓度的IL-7递送到肿瘤微环境中，从而使用比未缀合的IL-7所需的低得多的剂量的免疫缀合物导致本文提及的多种免疫效应细胞的活化和增殖。然而，IL-7免疫缀合物的该特征可能再次加重IL-7分子的潜在副作用：由于IL-7免疫缀合物在血流中的循环半衰期相对于未缀合的IL-7显著延长，因此IL-7或融合蛋白分子的其他部分活化通常存在于脉管系统中的组分的可能性增加。同样的问题适用于含有与另一部分(诸如Fc或白蛋白)融合的IL-7的其他融合蛋白，会导致循环中IL-7的半衰期延长。因此，包含如本文所述的突变IL-7多肽的免疫缀合物与IL-7的野生型形式相比具有降低的毒性是特别有利的。
如上所述，将IL-7直接靶向免疫效应细胞而不是肿瘤细胞可为对IL-7免疫疗法有利。
因此，本发明提供了如先前所述的突变IL-7多肽以及与PD-1结合的抗体。在一个实施例中，突变IL-7多肽和抗体形成融合蛋白，即突变IL-7多肽与抗体共享肽键。在一些实施例中，抗体包含包括第一亚基和第二亚基的Fc结构域。在一个具体实施例中，突变IL-7多肽在其氨基末端氨基酸处与Fc结构域的亚基中的一个亚基的羧基末端氨基酸融合，任选地，通过接头肽进行融合。在一些实施例中，抗体为全长抗体。在一些实施例中，抗体是免疫球蛋白分子，特别是IgG类免疫球蛋白分子，更特别是IgG1亚类免疫球蛋白分子。在一个此类实施例中，突变IL-7多肽与免疫球蛋白重链中的一个重链共享氨基末端肽键。在某些实施例中，抗体是抗体片段。在一些实施例中，抗体是Fab分子或scFv分子。在一个实施例中，抗体是Fab分子。在另一个实施例中，抗体是scFv分子。免疫缀合物还可包含多于一个(一种)抗体。当免疫缀合物中包含多于一个抗体，例如第一抗体和第二抗体时，各抗体可以独立地选自各种形式的抗体和抗体片段。例如，第一抗体可以是Fab分子，并且第二抗体可以是scFv分子。在一个具体实施例中，所述第一抗体和所述第二抗体中的每一者是scFv分子，或者所述第一抗体和所述第二抗体中的每一者是Fab分子。在一个特定实施例中，所述第一抗体和所述第二抗体中的每一者是Fab分子。在一个实施例中，所述第一抗体和所述第二抗体中的每一者与PD-1结合。
免疫缀合物形式
示例性的免疫缀合物形式描述于PCT公开号WO 2011/020783中，该专利全文以引用方式并入本文。这些免疫缀合物包含至少两个抗体。因此，在一个实施例中，根据本发明的免疫缀合物包含如本文所述的突变IL-7多肽，以及至少第一抗体和第二抗体。在一个特定实施例中，所述第一抗体和所述第二抗体独立地选自由以下项组成的组：Fv分子，特别是scFv分子；以及Fab分子。在一个具体实施例中，所述突变IL-7多肽与所述第一抗体共享氨基末端肽键或羧基末端肽键，并且所述第二抗体与i)突变IL-7多肽或ii)第一抗体共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。在一个特定实施例中，免疫缀合物基本上由通过一个或多个接头序列接合的突变IL-7多肽以及第一抗体和第二抗体(特别是Fab分子)组成。这种形式具有以下优点：它们以高亲和力与靶抗原(PD-1)结合，但仅提供与IL-7受体的单体结合，从而避免将免疫缀合物靶向至在除了靶位点以外的其他位置处的携带IL-7受体的免疫细胞。在一个特定实施例中，突变IL-7多肽与第一抗体，特别是第一Fab分子共享羧基末端肽键，并且进一步与第二抗体，特别是第二Fab分子共享氨基末端肽键。在另一个实施例中，第一抗体，特别是第一Fab分子，与突变IL-7多肽共享羧基末端肽键，并且进一步与第二抗体，特别是第二Fab分子共享氨基末端肽键。在另一个实施例中，第一抗体，特别是第一Fab分子，与第一突变IL-7多肽共享氨基末端肽键，并且进一步与第二抗体，特别是第二Fab分子共享羧基末端肽。在一个特定实施例中，突变IL-7多肽与第一重链可变区共享羧基末端肽键，并且还与第二重链可变区共享氨基末端肽键。在另一个实施例中，突变IL-7多肽与第一轻链可变区共享羧基末端肽键，并且还与第二轻链可变区共享氨基末端肽键。在另一个实施例中，第一重链或轻链可变区通过羧基末端肽键与突变IL-7多肽接合，并且还通过氨基末端肽键与第二重链或轻链可变区接合。在另一个实施例中，第一重链或轻链可变区通过氨基末端肽键与突变IL-7多肽接合，并且还通过羧基末端肽键与第二重链或轻链可变区接合。在一个实施例中，突变IL-7多肽与第一Fab重链或轻链共享羧基末端肽键，并且还与第二Fab重链或轻链共享氨基末端肽键。在另一个实施例中，第一Fab重链或轻链与突变IL-7多肽共享羧基末端肽键，并且进一步与第二Fab重链或轻链共享氨基末端肽键。在其他实施例中，第一Fab重链或轻链与突变IL-7多肽共享氨基末端肽键，并且还与第二Fab重链或轻链共享羧基末端肽键。在一个实施例中，免疫缀合物包含与一个或多个scFv分子共享氨基末端肽键，并且还与一个或多个scFv分子共享羧基末端肽键的突变IL-7多肽。
然而，根据本发明的免疫缀合物的特别合适的形式包括免疫球蛋白分子作为抗体。此类免疫缀合物形式描述于WO 2012/146628中，该专利全文以引用方式并入本文。
因此，在一个特定实施例中，免疫缀合物包含如本文所述的突变IL-7多肽和与PD-1结合的免疫球蛋白分子，特别是IgG分子，更特别是IgG1分子。在一个实施例中，免疫缀合物包含不超过一种突变IL-7多肽。在一个实施例中，免疫球蛋白分子是人。在一个实施例中，免疫球蛋白分子包含人恒定区，例如人CH1、CH2、CH3和/或CL结构域。在一个实施例中，免疫球蛋白包含人Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。在一个实施例中，突变IL-7多肽与免疫球蛋白分子共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。在一个实施例中，免疫缀合物基本上由以下组成：通过一个或多个接头序列接合的突变IL-7多肽和免疫球蛋白分子，特别是IgG分子，更特别地是IgG1分子。在一个具体实施例中，突变IL-7多肽在其氨基末端氨基酸处与免疫球蛋白重链中的一条免疫球蛋白重链的羧基末端氨基酸融合，任选地，通过接头肽进行融合。
突变IL-7多肽可以直接或通过接头肽与抗体融合，所述接头肽包含一个或多个氨基酸(通常约2-20个氨基酸)。接头肽是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性接头肽包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n连接肽。“n”通常为1至10的整数，通常为2至4。在一个实施例中，接头肽的长度为至少5个氨基酸，在一个实施例中长度为5至100个氨基酸，在另一实施例中为10至50个氨基酸。在一个特定实施例中，接头肽的长度为15个氨基酸。在一个实施例中，接头肽是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，并且(x＝3、n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3)或(x＝4、n＝2、3、4或5并且m＝0、1、2或3)，在一个实施例中，x＝4并且n＝2或3，在另一实施例中，x＝4并且n＝3。在一个特定实施例中，接头肽是(G4S)3(SEQ ID NO:21)。在一个实施例中，接头肽具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列(或由其组成)。
在一个特定实施例中，免疫缀合物包含突变IL-7分子和与PD-1结合的免疫球蛋白分子，特别是IgG1亚类免疫球蛋白分子，其中突变IL-7分子在其氨基末端氨基酸处通过如SEQ ID NO:21所示的接头肽与免疫球蛋白重链中的一者的羧基末端氨基酸融合。
在一个特定实施例中，免疫缀合物包含突变IL-7分子和与PD-1结合的抗体，其中所述抗体包含包括第一亚基和第二亚基的Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域，并且突变IL-7分子在其氨基末端氨基酸处通过如SEQ ID NO:21所示的接头肽与Fc结构域的亚基中的一个亚基的羧基末端氨基酸融合。
PD-1抗体
包含在本发明的免疫缀合物中的抗体与PD-1，特别是人PD-1结合，并且能够将突变IL-7多肽引导至表达PD-1的靶位点，特别是表达PD-1的T细胞，例如与肿瘤相关的T细胞。
可用于本发明的免疫缀合物中的合适的PD-1抗体描述于WO 2017/055443 A1中，该专利的全部内容以引用方式并入本文。
本发明的免疫缀合物可以包含可以与相同或不同抗原结合的两个或更多个(两种或更多种)抗体。然而，在特定实施例中，这些抗体中的每一者都与PD-1结合。在一个实施例中，包含在本发明的免疫缀合物中的抗体是单特异性的。在一个特定实施例中，免疫缀合物包含单一的单特异性抗体，特别是单特异性免疫球蛋白分子。
抗体可以是保持与PD-1，特别是人PD-1特异性结合的任何类型的抗体或其片段。抗体片段包括但不限于Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab')2分子。然而，在特定实施例中，抗体是全长抗体。在一些实施例中，抗体包含包括第一亚基和第二亚基的Fc结构域。在一些实施例中，抗体是免疫球蛋白，特别是IgG类，更特别是IgG1亚类免疫球蛋白。
在一些实施例中，抗体为单克隆抗体。
在一些实施例中，抗体包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3、在根据Kabat编号的位置71-73处含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的FR-H3、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2、以及含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施例中，所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3、和在根据Kabat编号的位置71-73处含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的FR-H3；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含：含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2、和含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施例中，重链和/或轻链可变区是人源化可变区。在一些实施例中，重链和/或轻链可变区包含人构架区(FR)。
在一些实施例中，抗体包括：含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQID NO:9的氨基酸序列的HVR-H2、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQ IDNO:11的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HVR-L2、以及含有SEQ IDNO:13的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施例中，所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含：含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H2、和含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含：含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HVR-L2、和含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施例中，重链和/或轻链可变区是人源化可变区。在一些实施例中，重链和/或轻链可变区包含人构架区(FR)。
在一些实施例中，抗体包含重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗体包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17和SEQ ID NO:18组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和(b)轻链可变区(VL)，其包含与选自由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个特定实施例中，抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体为人源化抗体。在一个实施例中，抗体是包含人恒定区的免疫球蛋白分子，特别是包含人CH1、CH2、CH3和/或CL结构域的IgG类免疫球蛋白分子。人恒定结构域的示例性序列在SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32(分别为人κ和λCL结构域)和SEQ IDNO:33(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施例中，抗体包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一些实施例中，第一抗体包含重链可变恒定区，其包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，重链恒定区可包含如本文所述的Fc结构域中的氨基酸突变。
Fc结构域
在特定实施例中，包含在根据本发明的免疫缀合物中的抗体包含包括第一亚基和第二亚基的Fc结构域。抗体的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，该二聚体的每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。在一个实施例中，本发明的免疫缀合物包含不超过一个Fc结构域。
在一个实施例中，包含在免疫缀合物中的抗体的Fc结构域是IgG Fc结构域。在一个特定实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在另一个实施例中，Fc结构域是IgG4 Fc结构域。在一个更具体的实施例中，Fc结构域是IgG4 Fc结构域，所述结构域包含S228位的氨基酸取代(Kabat EU索引编号)，特别是氨基酸取代S228P。该氨基酸取代减少了IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在另一特定实施例中，Fc结构域是人Fc结构域。在一个甚至更特定的实施例中，Fc结构域是人IgG1 Fc结构域。人IgG1 Fc区的示例性序列以SEQ ID NO:30给出。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
根据本发明的免疫缀合物包含突变IL-7多肽，特别是单个(不超过一个)突变IL-7多肽，所述突变IL-7多肽与Fc结构域的所述两个亚基中的一个或另一个亚基融合，由此所述Fc结构域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高免疫缀合物的产率和纯度，因此将有利的是在抗体的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰。
因此，在特定实施例中，包含在根据本发明的免疫缀合物中的抗体的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个实施例中，所述修饰位于Fc结构域的CH3结构域中。
存在几种对Fc结构域的CH3结构域进行修饰以实施异二聚化的方法，这些方法例如在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO2013157954、WO2013096291中详细描述。通常，在所有此类方法中，Fc结构域的第一亚基的CH3结构域和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域都以互补的方式工程化，使得每个CH3结构域(或包含其的重链)可以不再与其自身同源二聚化，而是被迫与互补工程化的其他CH3结构域异源二聚化(使得第一和第二CH3结构域异源二聚化并且在两个第一或两个第二CH3结构域之间不形成同源二聚体)。
在一个具体实施例中，所述促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰是所谓的“突出物入孔”修饰，所述修饰包含在Fc结构域的两个亚基中的一个亚基中进行“突出物”修饰并且在Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中进行“孔”修饰。
杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得所述突起可以定位在所述空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在一个特定实施例中，在包含在所述免疫缀合物中的抗体的Fc结构域的所述第一亚基的所述CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第一亚基的所述CH3结构域内产生突起，所述突起可定位在所述第二亚基的所述CH3结构域内的空腔中，并且在所述Fc结构域的所述第二亚基的所述CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第二亚基的所述CH3结构域内产生空腔，所述第一亚基的所述CH3结构域内的所述突起可定位在所述空腔内。
优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)组成的组。
优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)组成的组。
突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。
在一个具体实施例中，在Fc结构域的第一亚基(“杵”亚基)的CH3结构域中，366位的苏氨酸残基被色氨酸残基替换(T366W)，并且在Fc结构域的第二亚基(“臼”亚基)的CH3结构域中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个实施例中，在Fc结构域的第二亚基中，另外地366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替代，并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替代(根据Kabat的EU索引编号)。
在又一个实施例中，在Fc结构域的第一亚基中，另外地354位的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)替代或356位的谷氨酸残基被半胱氨酸残基(E356C)替代(特别地354位的丝氨酸残基被半胱氨酸残基取代)，并且在Fc结构域的第二亚基中，另外地349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替代(根据Kabat的EU索引编号)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定所述二聚体(Carter,JImmunol Methods 248,7-15(2001))。
在一个特定实施例中，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat的EU索引编号)。
在一些实施例中，Fc结构域的第二亚基另外包含氨基酸取代H435R和Y436F(根据Kabat EU索引编号)。
在一个特定实施例中，突变IL-7多肽与Fc结构域的第一亚基(包含“突出物”修饰)融合(任选地，通过接头肽进行融合)。不希望受理论束缚，突变IL-7多肽与Fc结构域的含有突出物的亚基的融合将(进一步)最小化包含两个突变IL-7多肽的免疫缀合物的产生(两个含有突出物的多肽的空间位阻)。
用于实施异源二聚化的其他CH3修饰技术被设想为根据本发明的替代方案，并且描述于例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO2007/110205、WO 2007/147901、WO2009/089004、WO 2010/129304、WO2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO2013/157954、WO2013/096291中。
在一个实施例中，替代地使用EP 1870459中描述的异源二聚化方法。该方法基于在Fc结构域的两个亚基之间的CH3/CH3结构域界面中的特定氨基酸位置处引入带有相反电荷的荷电氨基酸。包含在本发明的免疫缀合物中的抗体的一个优选实施例是氨基酸突变R409D；在(Fc结构域的)两个CH3结构域中的一个中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的CH3结构域中的另一个中的E357K(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个实施例中，包含在本发明的免疫缀合物中的抗体包含在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366W和在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366S、L368A、Y407V，以及另外地氨基酸突变R409D；在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个实施例中，包含在本发明的免疫缀合物中的抗体包含在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366W和在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366S、L368A、Y407V，或者所述抗体在包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366W和在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366S、L368A、Y407V，以及另外地氨基酸突变R409D；在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(所有根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2013/157953中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366K，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变L351D(编号根据Kabat EU索引)。在另一实施例中，第一CH3结构域包含另外的氨基酸突变L351K。在另一实施例中，第二CH3结构域还包含选自由Y349E、Y349D和L368E(优选L368E)组成的组的氨基酸突变(编号根据Kabat EU索引)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2012/058768中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一实施例中，第二CH3结构域包含在T411、D399、S400、F405、N390或K392位的进一步氨基酸突变，例如选自：a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W，b)D399R、D399W、D399Y或D399K，c)S400E、S400D、S400R或S400K，d)F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W，e)N390R、N390K或N390D，f)K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E(根据Kabat EU索引编号)。在另一实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366V、K409F。在另一实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一实施例中，第二CH3结构域还包含氨基酸突变K392E、T411E、D399R和S400R(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2011/143545中描述的异源二聚化方法，例如在选自由368和409组成的组的位置处进行氨基酸修饰(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2011/090762中描述的异源二聚化方法，该异源二聚化方法也使用上述突出物入孔技术。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366W，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407A。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366Y，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407T(编号根据Kabat EU索引)。
在一个实施例中，包含在免疫缀合物中的抗体或其Fc结构域为IgG2亚类，并且替代地使用在WO 2010/129304中描述的异源二聚化方法。
在一个替代实施例中，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如如在PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。在一个此类实施例中，第一CH3结构域包含用带负电荷的氨基酸对K392或N392进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选K392D或N392D)，并且第二CH3结构域包含用带正电荷的氨基酸对D399、E356、D356或E357进行的氨基酸取代(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R)，优选D399K、E356K、D356K或E357K，更优选D399K和E356K)。在另一实施例中，第一CH3结构域还包含用带负电荷的氨基酸对K409或R409进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选K409D或R409D)。在另一实施例中，第一CH3结构域进一步或替代地包含用带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))对K439和/或K370进行的氨基酸取代(所有根据Kabat EU索引编号)。
在又一实施例中，替代地使用WO 2007/147901中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变K253E、D282K和K322D，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变D239K、E240K和K292D(根据Kabat的EU索引编号)。
在又一实施例中，可替代地使用WO 2007/110205中描述的异源二聚化方法。
在一个实施例中，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代K392D和K409D，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代D356K和D399K(根据Kabat编号EU指数)。
减少Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
Fc结构域赋予免疫缀合物有利的药代动力学性质，包括有助于在靶组织中良好积累的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，同时，其可能导致免疫缀合物不期望地靶向至表达Fc受体的细胞，而不是优选的抗原携带细胞。此外，Fc受体信号传导通路的共活化可导致细胞因子释放，所述细胞因子释放与IL-7多肽和免疫缀合物的长半衰期组合，在全身施用后导致对细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。因此，在特定实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比，包含在根据本发明的免疫缀合物中的抗体的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个此类实施例中，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的抗体)表现出与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的抗体)相比小于50％，优选小于20％，更优选小于10％并且最优选小于5％的对Fc受体的结合亲和力，和/或与天然IgG1 Fc结构域结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的抗体)相比小于50％，优选小于20％，更优选小于10％并且最优选小于5％的效应子功能。在一个实施例中，Fc结构域结构域(或包含所述Fc结构域的抗体)基本上不与Fc受体结合和/或诱导效应子功能。在一个特定实施例中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施例中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施例中，Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施例中，Fc受体是活化人Fcγ受体，更特别地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特别地是人FcγRIIIa。在一个实施例中，效应子功能是选自CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌的组中的一种或多种效应子功能。在一个特定实施例中，效应子功能是ADCC。在一个实施例中，与天然IgG1 Fc结构域结构域相比，Fc结构域结构域对新生Fc受体(FcRn)表现出基本相似的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的抗体)表现出天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的抗体)对FcRn的结合亲和力的大于约70％，特别地大于约80％，更特别地大于约90％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合。
在某些实施例中，Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在特定实施例中，包含在免疫缀合物中的抗体的Fc结构域包含降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。在一个实施例中，氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施例中，氨基酸突变将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在存在多于一个降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施例中，这些氨基酸突变的组合可以将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍，或甚至至少50倍。在一个实施例中，与包含非工程化的Fc结构域的抗体相比，包含工程化的Fc结构域的抗体表现出对Fc受体的结合亲和力的小于20％，特别地小于10％，更特别地小于5％。在一个特定实施例中，Fc受体是Fcγ受体。在一些实施例中，Fc受体是人Fc受体。在一些实施例中，Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施例中，Fc受体是活化人Fcγ受体，更特别地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特别地是人FcγRIIIa。优选地，与这些受体中的每一个的结合降低。在一些实施例中，对补体组分的结合亲和力，特别是对C1q的结合亲和力也降低。在一个实施例中，对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当所述Fc结构域(或包含所述Fc结构域的抗体)表现出非工程化形式的所述Fc结构域(或包含所述非工程化形式的所述Fc结构域的抗体)对FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合，即保持了Fc结构域对所述受体的结合亲和力。Fc结构域或包含所述Fc结构域的包含在本发明的免疫缀合物中的抗体可表现出这种亲和力的大于约80％并且甚至大于约90％。在某些实施例中，包含在免疫缀合物中的抗体的Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可包括但不限于以下项中的一种或多种：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导的细胞凋亡、减少的靶结合抗体的交联、减少的树突细胞成熟，或减少的T细胞致敏。在一个实施例中，降低的效应子功能是选自降低的CDC、降低的ADCC、降低的ADCP和减少的细胞因子分泌的组中的一种或多种的降低的效应子功能。在一个特定实施例中，降低的效应子功能是降低的ADCC。在一个实施例中，降低的ADCC为由非工程化的Fc结构域(或包含非工程化的Fc结构域的抗体)诱导的ADCC的小于20％。
在一个实施例中，降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施例中，Fc结构域包含在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329的组的位置处的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个更具体的实施例中，Fc结构域包含在选自L234、L235和P329的组的位置处的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在一些实施例中，Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)。在一个此类实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别地是人IgG1 Fc结构域。在一个实施例中，Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代。在一个更具体的实施例中，氨基酸取代是P329A或P329G，特别地是P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施例中，所述Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代，和在选自E233、L234、L235、N297和P331的位置处的进一步氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个更具体的实施例中，所述进一步氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定实施例中，Fc结构域包含在位置P329、L234和L235处的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在更特定的实施例中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”、“PGLALA”或“LALAPG”)。具体地，在特定实施例中，Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)，即在Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中，234位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替代(L234A)，235位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替代(L235A)，并且329位的脯氨酸残基被用甘氨酸残基替代(P329G)(根据Kabat的EU索引编号)。在一个此类实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别地是人IgG1 Fc结构域。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除了人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体(以及补体)结合，如在PCT公开号WO 2012/130831中所述，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。WO 2012/130831还描述了制备此类突变Fc结构域的方法和确定其性质(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。
与IgG1抗体相比，IgG4抗体表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。因此，在一些实施例中，包含在本发明的免疫缀合物中的抗体的Fc结构域是IgG4 Fc结构域，特别是人IgG4 Fc结构域。在一个实施例中，IgG4 Fc结构域包含在位置S228处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代S228P(根据Kabat EU索引编号)。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应子功能，在一个实施例中，IgG4 Fc结构域包含在位置L235处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代L235E(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施例中，IgG4Fc结构域包含P329位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代P329G(根据Kabat的EU索引编号)。在一个特定实施例中，IgG4 Fc结构域包含S228、L235和P329位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代S228P、L235E和P329G(根据Kabat的EU索引编号)。这种IgG4 Fc结构域突变体以及它们的Fcγ受体结合性质描述于PCT公开号WO 2012/130831中，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。
在一个特定实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的Fc结构域是包含氨基酸取代L234A、L235A和任选地P329G的人IgG1 Fc结构域，或包含氨基酸取代S228P、L235E和任选地P329G的人IgG4 Fc结构域(根据Kabat的EU索引编号)。
在某些实施例中，已消除了Fc结构域的N糖基化。在一个此类实施例中，Fc结构域包含N297位的氨基酸突变，特别地是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替代天冬酰胺的氨基酸取代(根据Kabat的EU索引编号)。
除了上文和PCT公开号WO 2012/130831中所述的Fc结构域外，具有减少的Fc受体结合和/或降低的效应子功能的Fc结构域还包括具有对Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的取代的那些Fc结构域(美国专利号6,737,056)(根据Kabat的EU索引编号)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸中两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
可以使用本领域熟知的遗传或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变Fc结构域。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。
与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。可替代地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来评估Fc结构域或包含所述Fc结构域的抗体对Fc受体的结合亲和力。
Fc结构域，或包含Fc结构域的抗体的效应子功能，可以通过本领域已知的方法来测量。用于评定感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定的示例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，ProcNatl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J ExpMed 166,1351-1361(1987)中。可替代地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
Figure BDA0003884610430000491
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应物细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定感兴趣的分子的ADCC活性。
在一些实施例中，Fc结构域与补体组分，特别是C1q的结合减少。因此，在一些实施例中，其中Fc结构域经工程化以具有降低的效应子功能，所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定Fc结构域或包含所述Fc结构域的抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J ImmunolMethods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie，Blood 103,2738-2743(2004))。
FcRn结合和体内清除/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法执行(参见例如Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO 2013/120929)。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽是包含氨基酸取代V15A(相对于人IL-7序列SEQ ID NO:52编号)的人IL-7分子；并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽是包含氨基酸取代V15K(相对于人IL-7序列SEQ ID NO:52编号)的人IL-7分子；并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽是包含氨基酸取代V18A(相对于人IL-7序列SEQ ID NO:52编号)的人IL-7分子；并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽是包含氨基酸取代V18K(相对于人IL-7序列SEQ ID NO:52编号)的人IL-7分子；并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽是包含氨基酸取代L77A(相对于人IL-7序列SEQ ID NO:52编号)的人IL-7分子；并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽是包含氨基酸取代L77K(相对于人IL-7序列SEQ ID NO:52编号)的人IL-7分子；并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽是包含氨基酸取代K81E(相对于人IL-7序列SEQ ID NO:52编号)的人IL-7分子；并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽是包含氨基酸取代G85K(相对于人IL-7序列SEQ ID NO:52编号)的人IL-7分子；并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽是包含氨基酸取代G85E(相对于人IL-7序列SEQ ID NO:52编号)的人IL-7分子；并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽是包含氨基酸取代I88K(相对于人IL-7序列SEQ ID NO:52编号)的人IL-7分子；并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽是包含氨基酸取代N143K(相对于人IL-7序列SEQ ID NO:52编号)的人IL-7分子；并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽是包含氨基酸取代K81E和G85K(相对于人IL-7序列SEQ ID NO:52编号)的人IL-7分子；并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽是包含氨基酸取代K81E和G85E(相对于人IL-7序列SEQ ID NO:52编号)的人IL-7分子；并且其中所述抗体包括：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽包含SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:79的氨基酸序列；并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列，并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列，并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列，并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列，并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列，并且其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
在根据本发明上述方面中任一方面的一个实施例中，抗体是IgG类免疫球蛋白，所述IgG类免疫球蛋白包含包括第一亚基和第二亚基的人IgG1Fc结构域，其中在所述Fc结构域的所述第一亚基中，366位的苏氨酸残基被色氨酸残基替换(T366W)；而在所述Fc结构域的所述第二亚基中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)，并且任选地，366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基替换(T366S)，并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L368A)(根据Kabat EU索引编号)，并且其中进一步地，Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)。在此实施例中，突变IL-7多肽可以在其氨基末端氨基酸处通过如SEQ ID NO:21所示的接头肽与Fc结构域的第一亚基的羧基末端氨基酸融合。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含：含有与SEQ IDNO:85的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:86的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:90的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含：含有与SEQ IDNO:85的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:86的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:91的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括：含有与SEQ IDNO:85的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:86的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:92的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含：含有与SEQ IDNO:85的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:86的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:93的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含：含有与SEQ IDNO:85的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:86的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:102的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含：含有与SEQ IDNO:85的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:86的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:103的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含：含有与SEQ IDNO:85的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:86的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:105的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含：含有与SEQ IDNO:85的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:86的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:107的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含：含有与SEQ IDNO:85的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:86的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:108的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含：含有与SEQ IDNO:85的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:86的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:109的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含：含有与SEQ IDNO:85的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:86的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:114的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含：含有与SEQ IDNO:85的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:86的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:137的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含：含有与SEQ IDNO:85的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:86的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:138的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
多核苷酸
本发明还提供了编码如本文所述的免疫缀合物或其片段的分离的多核苷酸。在一些实施例中，所述片段是抗原结合片段。
编码本发明免疫缀合物的多核苷酸可以表达为编码完整免疫缀合物的单个多核苷酸，或表达为共表达的多个(例如，两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他方式缔合以形成功能性免疫缀合物。例如，抗体的轻链部分可以由来自包含抗体的重链部分和突变IL-7多肽的免疫缀合物部分的单独多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成免疫缀合物。在另一个实例中，包含两个Fc结构域亚基中的一个亚基和突变IL-7多肽的免疫缀合物部分可以由来自包含所述两个Fc结构域亚基中的另一个亚基的免疫缀合物部分的单独多核苷酸编码。当共表达时，Fc结构域亚基将缔合以形成Fc结构域。
在一些实施例中，分离的多核苷酸编码如本文所述的根据本发明的完整免疫缀合物。在其他实施例中，分离的多核苷酸编码包含在如本文所述的根据本发明的免疫缀合物中的多肽。
在一个实施例中，本发明的分离的多核苷酸编码包含在免疫缀合物中的抗体的重链(例如免疫球蛋白重链)和突变IL-7多肽。在另一个实施例中，本发明的分离的多核苷酸编码包含在免疫缀合物中的抗体的轻链。
在某些实施例中，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施例中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
可用本领域中熟知的遗传或化学方法通过缺失、取代、插入或修饰来制备可用于本发明中的突变IL-7多肽。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。天然人IL-7的序列示出于SEQ ID NO:52中。取代或插入可涉及天然和非天然的氨基酸残基。氨基酸修饰包括众所周知的化学修饰方法，诸如添加糖基化位点或碳水化合物附接等。
本发明的免疫缀合物可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。对于重组生产，将例如如上所述的编码免疫缀合物(片段)的一种或多种多核苷酸分离并插入至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。在一个实施例中，提供了一种载体，优选为表达载体，该载体包含本发明的多核苷酸中的一种或多种多核苷酸。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有免疫缀合物(片段)的编码序列以及适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见，例如在Maniatis等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)中描述的技术。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码免疫缀合物(片段)的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至所述表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，该异源编码区与编码本发明的免疫缀合物的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的键结性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的基因模板的能力，则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合，所述附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与所述多肽的N末端融合的信号肽，所述信号肽被从翻译的多肽上切割下来以生产所述多肽的分泌或“成熟”形式。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。
编码可用于促进后续纯化的短蛋白质序列(例如组氨酸标签)或帮助标记免疫缀合物的DNA可包含在免疫缀合物(片段)编码多核苷酸的内部或末端。
在另一实施例中，提供了包含一种或多种本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施例中，提供了包含一种或多种本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个此类实施例中，宿主细胞包含一种或多种载体(例如已经用一种或多种载体转化或转染)，该一种或多种载体包含编码本发明免疫缀合物的一种或多种多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的免疫缀合物或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持免疫缀合物表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的免疫缀合物用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中生产，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致生产具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,NatBiotech 22,1409-1414(2004)和Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如在Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中所述)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所述)、MRC 5细胞，以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编辑，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。
用于在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。表达与抗体的重链或轻链融合的突变IL-7多肽的细胞可以经工程化以便也表达所述抗体链中的另一条抗体链，使得表达的突变IL-7融合产物是具有重链或轻链两者的抗体。
在一个实施例中，提供了生产根据本发明的免疫缀合物的方法，其中所述方法包括在适于表达免疫缀合物的条件下培养包含一种或多种编码如本文所提供的免疫缀合物的多核苷酸的宿主细胞，以及任选地从该宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收免疫缀合物。
在本发明的免疫缀合物中，突变IL-7多肽可以与抗体基因融合，或者可以与抗体化学缀合。IL-7多肽与抗体的基因融合可经设计以使得IL-7序列直接与多肽融合或通过接头序列间接与多肽融合。接头的组成和长度可以根据本领域熟知的方法测定，并且可以测试接头的功效。本文描述了特定的接头肽。如果需要的话，还可包括另外的序列(例如内肽酶识别序列)以掺入切割位点来分离融合的各个组分。另外，IL-7融合蛋白也可以使用本领域熟知的多肽合成方法(例如Merrifield固相合成)来化学合成。突变IL-7多肽可以使用熟知的化学缀合方法与其他分子(例如抗体)化学缀合。双官能交联剂(诸如本领域熟知的同官能和异官能交联剂)可用于此目的。使用的交联剂的类型取决于与IL-7偶联的分子的性质，并且可以由本领域技术人员容易地鉴定。可替代地或另外，突变IL-7和/或其预期缀合的分子可以化学衍生化，使得突变IL-7和/或其预期缀合的分子两者可以在单独的反应中缀合，这也是本领域中熟知的。
本发明的免疫缀合物包含抗体。生产抗体的方法是本领域熟知的(参见例如Harlow和Lane，"Antibodies,a laboratory manual",Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生(例如，如在美国专利号4,186,567中所述)，或者可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如McCafferty的美国专利号5,969,108)。免疫缀合物、抗体及其制备方法也详细描述于例如PCT公开号WO 2011/020783、WO 2012/107417和WO2012/146628中，该等PCT公开各自以引用方式整体并入本文。
任何动物物种的抗体均可以用于本发明的免疫缀合物中。可用于本发明的非限制性抗体可以是鼠、灵长类或人源的。如果免疫缀合物旨在用于人类使用，则可以使用嵌合形式的抗体，其中该抗体的恒定区来自人。也可以根据本领域熟知的方法来制备人源化或完全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可通过各种方法实现，所述各种方法包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR移植到人(例如受体抗体)架构和恒定区上，所述架构和恒定区有或没有保留关键架构残基(例如对于保持良好的抗原结合亲和力或抗体功能来说重要的关键架构残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人架构和恒定区上，或者(c)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基而用人样区段“隐藏”它们。人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25--34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall'Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳匹配”方法选择的框架区(参见例如Sims等人，J.Immunol.151:2296(1993))；来源于具有轻链或重链可变区的特定子组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人，J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人类种系框架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
可以使用本领域已知的各种技术来生产人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol20,450-459(2008)中。可以通过以下方式来制备人抗体：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原激发而生产具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，所述全部或部分人免疫球蛋白基因座替代内源性免疫球蛋白基因座，或者在动物的染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述
Figure BDA0003884610430000641
技术的美国专利号5,770,429；描述K-M
Figure BDA0003884610430000651
技术的美国专利号7,041,870，以及描述
Figure BDA0003884610430000652
技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。可以进一步修饰来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区，例如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人，J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。
如本文所述，还可以通过从人抗体文库中分离来产生人抗体。
可以通过筛选组合文库中具有一种或多种所需活性的抗体来分离可用于本发明的抗体。用于筛选组合文库的方法综述于例如Lerner等人，Nature Reviews 16:498-508(2016)中。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库以获得具有所需结合特征的抗体。此类方法综述于例如Frenzel等人，mAbs 8:1177-1194(2016)；Bazan等人，Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828(2012)和Zhao等人，Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289(2016)中，以及Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编辑，Human Press,Totowa,NJ,2001)中和Marks和Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编辑，Human Press,Totowa,NJ,2003)中。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全部集合通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以从所述噬菌体文库中筛选抗原结合噬菌体，如在Winter等人，Annual Review of Immunology 12:433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。可替代地，可以克隆所有天然组成成分(例如，来自人的所有天然组成成分)以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的抗体的单一来源，而无需任何免疫，如由Griffiths等人在EMBO Journal 12:725-734(1993)中所描述的。最后，还通过以下方式来合成天然文库：克隆来自干细胞的未重排的V基因区段；以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并完成体外重排，如由Hoogenboom和Winter在Journal of Molecular Biology 227:381-388(1992)中所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373；7,985,840；7,785,903和8,679,490以及美国专利公开号2005/0079574、2007/0117126、2007/0237764和2007/0292936。本领域已知用于筛选具有一种或多种所需活性的抗体的组合文库的方法的其他实例包括核糖体和mRNA展示，以及对细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞进行抗体展示和选择的方法。用于酵母表面展示的方法综述于例如Scholler等人，Methods in MolecularBiology 503:135-56(2012)和Cherf等人，Methods in Molecular biology 1319:155-175(2015)以及Zhao等人，Methods in Molecular Biology 889:73-84(2012)中。用于核糖体展示的方法描述于例如He等人，Nucleic Acids Research 25:5132-5134(1997)和Hanes等人，PNAS 94:4937-4942(1997)中。
可能需要对本发明的免疫缀合物进行进一步的化学修饰。例如，通过与基本上直链的聚合物(例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG))缀合，可以改善免疫原性和短半衰期的问题(参见例如WO 87/00056)。
如本文所述制备的免疫缀合物可通过本领域已知的技术纯化，所述技术为诸如高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、亲和色谱、尺寸排阻色谱等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱纯化，可以使用与免疫缀合物结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，可以使用特异性结合突变IL-7多肽的抗体。对于本发明免疫缀合物的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。例如，基本上如实例中所述，可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离免疫缀合物。免疫缀合物的纯度可以通过各种熟知的分析方法中的任何一种来确定，所述各种熟知的分析方法包括凝胶电泳、高压液相色谱等。
组合物、配方和施用途径
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的免疫缀合物的药物组合物，所述药物组合物例如用于任何以下治疗方法。在一个实施例中，药物组合物包含本文提供的任何免疫缀合物，以及药用载体。在另一个实施例中，药物组合物包含本文提供的任何免疫缀合物，以及至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。
还提供了一种以适于体内施用的形式产生本发明的免疫缀合物的方法，该方法包括(a)获得根据本发明的免疫缀合物，以及(b)用至少一种药用载体配制该免疫缀合物，由此配制免疫缀合物制剂以用于体内施用。
本发明的药物组合物包含溶解或分散在药用载体中的治疗有效量的免疫缀合物。短语“药用”或“药理学可接受”(pharmaceutical or pharmacologically acceptable)是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(诸如例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。根据本公开内容，含有免疫缀合物和任选地另外的活性成分的药物组合物的制备将对本领域技术人员而言是已知的，如由Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990例示的，该文献以引用方式并入本文。此外，对于动物(例如，人)施用，应理解制备物应满足FDA生物标准办公室或其他国家/地区相应当局所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或水溶液。如本文所使用的，“药用载体”包括任何和所有的溶剂、缓冲液、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料，类似物质以及它们的组合，如本领域普通技术人员应已知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，MackPrinting Company,1990，第1289-1329页，该文献通过引用并入本文)。除了任何常规载体与活性成分不相容的情况之外，所述载体在治疗或药物组合物中的用途是可预期的。
本发明的免疫缀合物(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要的话用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。投配可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。
肠胃外组合物包括设计用于注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)的那些组合物。对于注射，本发明的免疫缀合物可以在水溶液中配制，优选在生理上相容的缓冲液(诸如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液)中配制。溶液可含有配制剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，免疫缀合物可以是粉末形式，以用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)重构。通过根据需要将本发明的免疫缀合物以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，所述真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白质的安全水平保持最低。合适的药用载体包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或在粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂(诸如例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。
除了先前描述的组合物之外，免疫缀合物还可以配制成贮库制剂。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，免疫缀合物可以用合适的聚合或疏水材料配制(例如作为可接受油中的乳液)或用离子交换树脂配制，或配制为微溶的衍生物，例如配制为微溶盐。
包含本发明免疫缀合物的药物组合物可通过常规混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干的手段制备。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，所述载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制备物。适当的配方取决于所选择的施用途径。
免疫缀合物可以配制成游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药用盐是基本上保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或与无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。
治疗方法和组合物
本文提供的任何突变IL-7多肽和免疫缀合物可用于治疗方法。本发明的突变IL-7多肽和免疫缀合物可用作免疫治疗剂，例如用于治疗癌症。
为了用于治疗方法中，本发明的突变IL-7多肽和免疫缀合物将以符合良好医学实践的方式配制、投配和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。
本发明的突变IL-7多肽和免疫缀合物可特别用于治疗对宿主免疫系统的刺激是有益的疾病状态，特别是需要增强的细胞免疫应答的病状。这些疾病状态可包括宿主免疫应答不足或缺乏的疾病状态。可以施用本发明的突变IL-7多肽和免疫缀合物的疾病状态包含例如细胞免疫应答应是特异性免疫的关键机制的肿瘤或感染。本发明的突变IL-7多肽和免疫缀合物可以本身或以任何合适的药物组合物形式施用。
在一个方面，提供了用作药物的本发明的突变IL-7多肽和免疫缀合物。在其他方面，提供了用于治疗疾病的本发明的突变IL-7多肽和免疫缀合物。在某些实施例中，提供了用于治疗方法的本发明的突变IL-7多肽和免疫缀合物。在一个实施例中，本发明提供如本文所述的免疫缀合物，以用于治疗有需要的个体的疾病。在一个实施例中，本发明提供如本文所述的突变IL-7多肽，以用于治疗有需要的个体的疾病。在某些实施例中，本发明提供突变IL-7和免疫缀合物以用于治疗患有疾病的个体的方法中，所述方法包括向个体施用治疗有效量的免疫缀合物。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中，疾病是癌症。在某些实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在其他实施例中，本发明提供免疫缀合物以用于刺激免疫系统。在某些实施例中，本发明提供突变IL-7和/或免疫缀合物以用于刺激个体的免疫系统的方法中，所述方法包括向个体施用有效量的免疫缀合物以刺激免疫系统。根据任何上述实施例的“个体”是哺乳动物，优选人。根据任何上述实施例的“对免疫系统的刺激”可以包括以下项中的任何一种或多种：免疫功能的普遍增强、T细胞功能的增强，B细胞功能的增强、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达的增多、T细胞反应性的增强，自然杀伤细胞活性或淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞活性的增强，等等。
在另一方面，本发明提供了本发明的突变IL-7和/或免疫缀合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施例中，所述药物用于治疗有此需要的个体的疾病。在一个实施例中，所述药物用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向具有所述疾病的个体施用治疗有效量的所述药物。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中，疾病是癌症。在一个实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在另一实施例中，所述药物用于刺激免疫系统。在另一实施例中，所述药物用于刺激个体的免疫系统的方法中，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述药物以刺激免疫系统。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。根据任何上述实施例的“对免疫系统的刺激”可以包括以下项中的任何一种或多种：免疫功能的普遍增强、T细胞功能的增强，B细胞功能的增强、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达的增多、T细胞反应性的增强，自然杀伤细胞活性或淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞活性的增强，等等。
在另一方面，本发明提供了治疗个体疾病的方法。在一个实施例中，所述方法包括向患有此类疾病的个体施用治疗有效量的本发明的突变IL-7和/或免疫缀合物。在一个实施例中，向所述个体施用组合物，所述组合物包含药用形式的本发明的突变IL-7和/或免疫缀合物。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中，疾病是癌症。在某些实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在另一方面，本发明提供了刺激个体的免疫系统的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的突变IL-7和/或免疫缀合物以刺激免疫系统。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。根据任何上述实施例的“对免疫系统的刺激”可以包括以下项中的任何一种或多种：免疫功能的普遍增强、T细胞功能的增强，B细胞功能的增强、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达的增多、T细胞反应性的增强，自然杀伤细胞活性或淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞活性的增强，等等。
在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病，特定是癌症。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌，以及肾癌。可以使用本发明的免疫缀合物治疗的其他细胞增殖病症包括但不限于位于以下部位中的肿瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈部、神经系统(中枢和外周神经系统)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部，以及泌尿生殖系统。还包括癌前病症或病变和癌转移。在某些实施例中，癌症选自由以下项组成的组：肾癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、前列腺癌和膀胱癌。技术人员容易认识到，在许多情况下，免疫缀合物可能不提供治愈，而可能仅提供部分益处。在一些实施例中，具有一些益处的生理变化也被认为是治疗上有益的。因此，在一些实施例中，提供生理变化的免疫缀合物的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常是哺乳动物，更特别地是人。
在一些实施例中，将有效量的本发明的免疫缀合物施用于细胞。在其他实施例中，将治疗有效量的本发明的免疫缀合物施用于个体以治疗疾病。
为预防或治疗疾病，本发明的免疫缀合物的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、施用途径、患者的体重、分子的类型(例如包含或不包含Fc结构域)、疾病的严重程度和病程、免疫缀合物是施用用于预防目的还是治疗目的、既往或同时进行的治疗干预、患者的临床病史和对免疫缀合物的反应，以及主治医师的判断。在任何情况下，负责施用的执业者将针对个体受试者来确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
免疫缀合物适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的免疫缀合物可以是用于施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次单独的施用，还是通过连续输注。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。免疫缀合物的一个示例性剂量应在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其他非限制性实例中，剂量还可包括每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重，至约1000mg/kg/体重或更多，以及从其中推导出的任何范围。在从本文所列数字可推导出的范围的非限制性实例中，约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围可以基于上述数值施用。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约两次至约二十次，或例如约六次剂量的免疫缀合物)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一种或多种较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
本发明的免疫缀合物将通常以有效实现预期目的的量使用。为用于治疗或预防病症，将本发明的免疫缀合物或其药物组合物以治疗有效量施用或施加。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
对于全身施用，治疗有效剂量可以最初根据体外测定(诸如细胞培养物测定)来进行估计。可以随后在动物模型中配制剂量，以实现包括如在细胞培养中测定的IC50循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人类的有用剂量。
初始剂量也可以使用本领域公知的技术，根据体内数据(例如动物模型)来估计。本领域的普通技术人员可以基于动物数据来容易地优化对人的施用。
可以单独地调节剂量的量和间隔，以提供足以维持治疗效果的免疫缀合物的血浆水平。通过注射施用的常用患者剂量的范围是约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。通过每天施用多个剂量可以实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC来测量血浆中的水平。
在局部施用或选择性摄取的情况下，免疫缀合物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够在无需过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文所述的治疗有效剂量的免疫缀合物将通常在不会引起实质毒性的情况下提供治疗益处。免疫缀合物的毒性和治疗功效可通过标准药学方法在细胞培养或实验动物中测定。细胞培养测定和动物研究可以用于测定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，所述治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的免疫缀合物是优选的。在一个实施例中，根据本发明的免疫缀合物表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选在包括几乎没有毒性或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以取决于多种因素而在该范围内变化，所述多种因素为例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的病症等。确切的配方、施用途径和剂量可以由个体医师根据患者的状况进行选择。(参见例如Fingl等人，1975，在：The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第1章，第1页中，该文献的全部内容以引用方式并入本文中)。
用本发明的免疫缀合物治疗的患者的主治医师应知道由于毒性、器官功能障碍等而如何以及何时终止、中断或调节施用。相反地，如果临床应答不充分(排除毒性)，则主治医师也会知道将治疗调节到更高水平。在目标疾患的管理中施用的剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、施用途径等而变化。例如，可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重性。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和应答而变化。
包含如本文所述的突变IL-7多肽的免疫缀合物的最大治疗剂量可以相对于用于包含野生型IL-7的免疫缀合物的最大治疗剂量增长。
其他药剂和治疗
根据本发明的免疫缀合物可以与治疗中的一种或多种其他药剂组合施用。例如，本发明的免疫缀合物可与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括被施用以治疗需要这种治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体适应症的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些实施例中，另外的治疗剂是免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒性剂、细胞凋亡激活剂，或增加细胞对凋亡诱导剂的敏感性的试剂。在一个特定实施例中，另外的治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡活化剂，或抗血管生成剂。
此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用免疫缀合物的量、病症或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。免疫缀合物通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以经验地/临床上确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
上述此类组合疗法包括联合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或不同的组合物中)和单独施用，在单独施用的情况下，本发明的免疫缀合物的施用可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行。本发明的免疫缀合物也可以与放射疗法组合使用。
制品
在本发明的另一方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质。该制品包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页(package insert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋等。所述容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。所述容器容纳组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合能够有效地用于治疗、预防和/或诊断病症，并且所述容器可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是具有能够被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的免疫缀合物。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包括(a)第一容器，所述第一容器中含有组合物，其中所述组合物包含本发明的免疫缀合物；以及(b)第二容器，所述第二容器中含有组合物，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明该实施例中的制品还可包含包装插页，所述包装插页指示所述组合物可用于治疗特定病症。可替代地或另外地，所述制品还可包含第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品还可以包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
氨基酸序列
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关于IL-7的氨基酸序列
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实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
示例性形式以示意图示出于图1A、1B、1C、1D和1E中。在图1A中，IgG-IL7免疫缀合物包含两个Fab结构域(可变结构域、恒定结构域)、异二聚体Fc结构域和与Fc结构域的C端融合的突变IL-7多肽。IgG-IL7免疫缀合物由根据SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123和SEQ IDNO:124的氨基酸序列的多肽构成。
在图1B中，IgG-IL7免疫缀合物包含两个Fab结构域(可变结构域、恒定结构域)、同二聚体Fc结构域和与Fc结构域的C端融合的两个突变IL-7多肽。IgG-IL7免疫缀合物由根据SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126的氨基酸序列的多肽构成。在图1C中，IgG-IL7免疫缀合物包含一个Fab结构域(可变结构域、恒定结构域)、异二聚体Fc结构域和与Fc结构域的C端融合的一个突变IL-7多肽。IgG-IL7免疫缀合物由根据SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128和SEQID NO:129的氨基酸序列的多肽构成。在图1D中，IgG-IL7免疫缀合物形式，包含两个Fab结构域(可变结构域、恒定结构域)、异二聚体Fc结构域和与Fab结构域中的一者的N端融合的一个突变IL-7多肽。IgG-IL7免疫缀合物由根据SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131和SEQ IDNO:132的氨基酸序列的多肽构成。在图1E中，IgG-IL-7免疫缀合物包含两个Fab结构域(可变结构域、恒定结构域)、同二聚体Fc结构域和与Fab结构域的N端融合的两个突变IL-7多肽。IgG-IL7免疫缀合物由根据SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:134的氨基酸序列的多肽构成。针对示例性形式所提供的序列涉及具有IL-7野生型序列的免疫缀合物。然而，如本文公开的任何突变IL-7多肽可以以所述形式而非野生型IL-7并入。
实例1
实例1.1PD1-IL7v融合蛋白的生产和分析
如表1中的抗体IL7融合构建体，诸如PD1-IL7变体(PD1-IL7v)，产生于CHO细胞中。收集后，通过ProteinA-HPLC测定上清液中存在的PD1-IL7构建体的滴度。上清液直接用于测定(细胞测定和表面等离子共振)而无需事先纯化。进行微纯化(一步式ProteinA纯化)并对洗脱液进行分析(分析尺寸排阻色谱和毛细管SDS电泳：CE-SDS)以评估存在于上清液中的分子的质量。
表1：所测PD1-IL7融合蛋白的多肽氨基酸序列
Figure BDA0003884610430001251
实施例1.1.在CHO K1细胞中产生IgG样蛋白质
PD-IL7v构建体由Evitria使用其专有的载体系统通过常规的(基于非PCR)克隆技术和使用悬浮液适应的CHO K1细胞(最初接收自ATCC，并且适于在Evitria的悬浮液培养物中进行无血清生长)制备。在生产过程中，Evitria使用了其专有的无动物成分和无血清的培养基(eviGrow和eviMake2)及其专有的转染试剂(eviFect)。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收集上清液。
实施例1.2.通过ProteinA-HPLC测定滴度
在具有UV检测器的Agilent HPLC系统上，通过Protein A–HPLC对上清液中存在的含Fc构建体进行定量。将上清液注射到POROS 20A柱(Applied Biosystems)上，用10mMTris、50mM甘氨酸、100mM NaCl(pH8.0)洗涤并在pH 2.0的相同缓冲液中洗脱。对280nm处的洗脱峰面积进行积分，并使用在同一运行中分析的标准物生成的校准曲线转换为浓度(参见表2)。
表2：通过ProteinA-HPLC测定所收集的CHO上清液的滴度测定。
Figure BDA0003884610430001261
Figure BDA0003884610430001271
实施例1.3.IgG样蛋白质的纯化
在96孔形式的液体处置平台上，使用一步式Protein A亲和色谱法从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简而言之，将上清液加载到ProPlus PhyTip柱(MabSelectSuReTM，Phynexus)上并用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠(pH 7.5)洗涤。将目标蛋白在20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸(pH 3.0)中洗脱，并用0.5M磷酸钠(pH 8.0)中和。
实施例1.4.IgG样蛋白质的分析
使用在运行缓冲液(200mM KH2PO4，250mM KCl pH 6.2，0.02％NaNd)中平衡的分析尺寸排阻柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)在25℃下通过HPLC色谱进行单体产物峰与高分子量和低分子量副产物含量的测定。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII或LabChip GX Touch(Perkin Elmer)，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。
表3：通过分析尺寸排阻色谱法测定ProteinA微纯化后的单体产物峰、高分子量(HMW)和低分子量(LMW)副产物。
Figure BDA0003884610430001272
Figure BDA0003884610430001281
表4：通过非还原CE-SDS测定ProteinA微纯化后的主产物峰和大小。
Figure BDA0003884610430001282
Figure BDA0003884610430001291
结果
在无需事先纯化的情况下但在通过ProteinA滴度测定(表2)进行定量之后，将CHO细胞中产生的IgG-IL7构建体在细胞测定和表面等离子共振中加以测试。在小规模一步式ProteinA纯化后测定质量，并通过分析尺寸排阻色谱分析显示产物峰在61％与84％之间(表3)，并通过非还原毛细管电泳显示产物峰在59％与92％之间(表4)。
结论
所产生的PD1-IL7变体和PD1-IL7wt具有相似滴度和良好质量概况，且因此可以在没有事先纯化的情况下在测定中进行比较。除变体31(S118A)外，敲除N-糖基化位点的变体由于去除了碳水化合物，根据CE-SDS显示还原的大小。这个N-糖基化(N116)位点可能未被占用。
实例1.5对其他PD1-IL7v融合蛋白产生的分析
如表5中的抗体IL7变体融合构建体，诸如PD1-IL7变体(PD1-IL7v)，产生于CHO细胞中。通过ProteinA亲和色谱法和尺寸排阻色谱法来纯化蛋白质。最终产物分析由以下组成：通过分析尺寸排阻色谱法测定单体含量和通过以下非还原毛细管SDS电泳测定主峰百分比：CE-SDS。
表5：所测PD1-IL7融合蛋白的多肽氨基酸序列
与受体链相互作用 SEQ ID NO
PD1-IL7wt - 85,86,87
PD1-IL7-VAR4(V15K) IL-7Ra 85,86,91
PD1-IL7-VAR18(K81E) IL-7Ra 85,86,105
PD1-IL7-VAR20(G85K) IL-7Ra 85,86,107
PD1-IL7-VAR21(G85E) IL-7Ra 85,86,108
PD1-IL7-VAR18(K81E)VAR20(G85K) IL-7Ra 85,86,137
PD1-IL7-VAR18(K81E)VAR21(G85E) IL-7Ra 85,86,138
在CHO细胞中产生IgG样蛋白质。本文所述的抗体IL7融合构建体由WuxiBiologics通过在其专有的CHO表达系统中表达并通过proteinA亲和及尺寸排阻色谱法纯化来制备，或者由Evitria使用其专有的载体系统通过常规的(基于非PCR)克隆技术和使用悬浮液适应的CHO K1细胞(最初接收自ATCC，并且适于在Evitria的悬浮液培养物中进行无血清生长)来产生。在生产过程中，Evitria使用了其专有的无动物成分和无血清的培养基(eviGrow和eviMake2)及其专有的转染试剂(eviFect)。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收集上清液。
IgG样蛋白质的纯化。参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，利用蛋白A亲和色谱法(平衡缓冲液：20mM柠檬酸钠，20mM磷酸钠，pH 7.5；洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠，pH 3.0)从细胞培养上清液中纯化含Fc的蛋白质。在pH 3.0下实现洗脱，随后立即中和样品的pH。通过离心(Millipore
Figure BDA0003884610430001302
ULTRA-15(Art.Nr.:UFC903096)浓缩蛋白质，然后利用尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。
IgG样蛋白质的分析。通过测量280nm处的吸光度来测定纯化的蛋白质的浓度，其中根据Pace等人(Protein Science,1995,4,2411-1423)所述的方法，使用基于氨基酸序列计算得出的质量消光系数。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII或LabChipGX Touch(Perkin Elmer)(Perkin Elmer)，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。使用在运行缓冲液(200mM KH2PO4，250mM KCl pH 6.2，0.02％NaN3)中平衡的分析型尺寸排阻柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)在25℃下通过HPLC色谱进行聚集含量的测定。
表6：通过分析尺寸排阻色谱法测定单体产物峰、高分子量(HMW)和低分子量(LMW)副产物。
Figure BDA0003884610430001301
Figure BDA0003884610430001311
表7：通过非还原CE-SDS测定的主产物峰。
PD1-IL7变体 主峰(％)
PD1-IL7-VAR4(V15K) P1AF5541-006 99
PD1-IL7-VAR18(K81E) P1AF5555-006 100
PD1-IL7-VAR20(G85K) P1AF5557-006 100
PD1-IL7-VAR21(G85E) P1AF5558-006 100
PD1-IL7-VAR18(K81E)VAR20(G85K) P1AF9696-035 96
PD1-IL7-VAR18(K81E)VAR21(G85E) P1AG0950-001 99
PD1-IL7wt P1AF5572-018 100
结果。纯化的PD1-IL7变体构建体通过ProteinA和尺寸排阻色谱法纯化。纯化材料的质量分析表明，通过分析型尺寸排阻色谱分析，单体含量超过99％(表6)，并通过非还原毛细管电泳，主产物峰在96％与100％之间(表7)。总之，所有PD1-IL7变体都可以高质量形式生产。
实例1.6对其他PD1-IL7v融合蛋白(参考分子)生产的分析
如表8中的抗体IL7变体融合构建体生产于CHO细胞中。通过ProteinA亲和色谱法和尺寸排阻色谱法来纯化蛋白质。最终产物分析由以下组成：单体含量测定(通过分析尺寸排阻色谱法)和主峰百分比(通过以下非还原毛细管SDS电泳测定：CE-SDS)。参考分子1至4根据WO 2020/127377 A1的公开内容生产并且每个缀合物包含两个IL7部分。对于参考分子5至8，WO 2020/127377 A1中所公开的IL7部分以与本文所公开的其他变体相同的形式放置，每个缀合物包含一个IL7部分。
表8：所测PD1-IL7融合蛋白的多肽氨基酸序列
SEQ ID NO IL7变体
PD1-IL7wt 85,86,87 -
参考分子1 139、140 D74E
参考分子2 139、141 SS2(C2S/C141S，C47S/C92S)
参考分子3 139、142 SS3(C47S/C92S，C34S/C129S)
参考分子4 139、143 W142H
参考分子5 85,86,144 D74E
参考分子6 85,86,145 SS2(C2S/C141S，C47S/C92S)
参考分子7 85,86,146 SS3(C47S/C92S，C34S/C129S)
参考分子8 85,86,147 W142H
在CHO细胞中产生IgG样蛋白质。本文所述的抗体IL7融合构建体由WuxiBiologics通过在其专有的CHO表达系统中表达并通过proteinA亲和及尺寸排阻色谱法纯化来制备，或者由Evitria使用其专有的载体系统通过常规的(基于非PCR)克隆技术和使用悬浮液适应的CHO K1细胞(最初接收自ATCC，并且适于在Evitria的悬浮液培养物中进行无血清生长)来产生。在生产过程中，Evitria使用了其专有的无动物成分和无血清的培养基(eviGrow和eviMake2)及其专有的转染试剂(eviFect)。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收集上清液。
IgG样蛋白质的纯化。参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，利用蛋白A亲和色谱法(平衡缓冲液：20mM柠檬酸钠，20mM磷酸钠，pH 7.5；洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠，pH 3.0)从细胞培养上清液中纯化含Fc的蛋白质。在pH 3.0下实现洗脱，随后立即中和样品的pH。通过离心(Millipore
Figure BDA0003884610430001321
ULTRA-15(Art.Nr.:UFC903096)浓缩蛋白质，然后利用尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。
IgG样蛋白质的分析。通过测量280nm处的吸光度来测定纯化的蛋白质的浓度，其中根据Pace等人(Protein Science,1995,4,2411-1423)所述的方法，使用基于氨基酸序列计算得出的质量消光系数。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII或LabChipGX Touch(Perkin Elmer)(Perkin Elmer)，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。使用在运行缓冲液(200mM KH2PO4，250mM KCl pH 6.2，0.02％NaN3)中平衡的分析型尺寸排阻柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)在25℃下通过HPLC色谱进行聚集含量的测定。
表9：通过分析尺寸排阻色谱法测定单体产物峰、高分子量(HMW)和低分子量(LMW)副产物。
PD1-IL7变体 TAPIR ID 单体峰(％) HMW峰(％) LMW峰(％)
参考分子1 P1AF9655-001 98.8 1.2 0
参考分子2 P1AF9656-001 98.8 1.2 0
参考分子3 P1AF9657-001 93 4.1 2.8
参考分子4 P1AF9658-001 99 1 0
参考分子5 P1AF9647-027 97 1.9 1
参考分子6 P1AF9648-033 99 0.9 0
参考分子7 P1AF9649-012 94 1.9 4
参考分子8 P1AF9650-004 99 1 0
PD1-IL7wt P1AF5572-018 99.6 0.4 0
表10：通过非还原CE-SDS测定的主产物峰。
PD1-IL7变体 主峰(％)
参考分子1 P1AF9655-001 94
参考分子2 P1AF9656-001 93
参考分子3 P1AF9657-001 94
参考分子4 P1AF9658-001 93
参考分子5 P1AF9647-027 99
参考分子6 P1AF9648-033 100
参考分子7 P1AF9649-012 68
参考分子8 P1AF9650-004 95
PD1-IL7wt P1AF5572-018 100
结果
纯化的PD1-IL7变体构建体通过ProteinA和尺寸排阻色谱法纯化。纯化材料的质量分析表明，通过分析型尺寸排阻色谱分析，单体含量超过93％(表9)，且通过非还原毛细管电泳，除参考分子7在非还原电泳图中显示出明显的肩峰从而导致主峰面积仅为68％外，主产物峰在93％与100％之间(表10)。总之，所有PD1-IL7变体都以高质量形式生产。
实例1.7：FAP-IL7/IL2
其他IL7缀合物作为抗FAP(成纤维细胞活化蛋白)融合物生产，所述融合物包含如本文公开的IL7变体，即FAP-IL7wt(SEQ ID NO 148、149和150)、FAP-IL7-VAR3(SEQ ID NO148、149和151)、FAP-IL7-VAR4(SEQ ID NO 148、149和152)、FAP-IL7-VAR18(SEQ IDNO148、149和153)、FAP-IL7-VAR20(SEQ ID NO 148、149和154)、FAP-IL7-VAR21(SEQ ID NO148、149和155)和FAP-IL7-SS2(SEQ ID NO 148、149和156)。还生产了具有序列SEQ ID NO148、149和157的FAP-IL2。
实例1.8：帕博利珠单抗-IL7融合构建体的生产和分析
本文所述的帕博利珠单抗-IL7融合构建体生产于CHO细胞中。通过ProteinA亲和色谱法和尺寸排阻色谱法来纯化蛋白质。最终产物分析由以下组成：单体含量测定(通过分析尺寸排阻色谱法)和主峰百分比(通过以下非还原毛细管SDS电泳测定：CE-SDS)。本文所述的帕博利珠单抗-IL7融合构建体由Wuxi Biologics通过在其专有的CHO表达系统中表达并通过proteinA亲和及尺寸排阻色谱法纯化来制备。参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简而言之，通过使用MabSelect柱(EQ/Wash1：50mM Tris-HCl、150mMNaCl，pH 7.4；Wash2：50mM Tris-HCl、150mM中和剂：1M Arg，pH 9.1)从细胞培养物上清液纯化含FC蛋白。在pH 3.4下实现洗脱，随后立即中和样品的pH。通过离心(Millipore
Figure BDA0003884610430001342
ULTRA-15(Art.Nr.:UFC903096)浓缩蛋白质，然后利用尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。通过测量280nm处的吸光度来测定纯化的蛋白质的浓度，其中根据Pace等人(Protein Science,1995,4,2411-1423)所述的方法，使用基于氨基酸序列计算得出的质量消光系数。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII或LabChip GX Touch(Perkin Elmer)(Perkin Elmer)，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。通过LC-MS检测到去糖基化和完全还原的质量。
表A：根据单体峰SEC-HPLC和主峰非还原CE-SDS的纯度(％)
Figure BDA0003884610430001341
纯化的帕博利珠单抗-IL7融合构建体通过ProteinA和尺寸排阻色谱法纯化。纯化材料的质量分析表明，通过分析型尺寸排阻色谱分析，单体含量超过98％，通过非还原SDS毛细管电泳，主产物峰超过99％(表A)。所有帕博利珠单抗-IL7融合构建体都以高质量的形式生产。
实例2
实施例2.1.IL7变体与人IL7Rα-IL2Rγ-Fc异二聚体的结合评估
表面等离子共振(SPR)实验在Biacore T200上以HBS-EP+作为运行缓冲液(0.01MHEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20(BR-1006-69，GE Healthcare))进行。Fc特异性抗体(Roche internal)通过胺偶联直接固定在CM5芯片(GE Healthcare)上。PD1-IL7构建体在100nM下从上清液中捕获120秒。人IL7Rα-IL2Rγ-Fc异二聚体由SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121构成。仅胞外结构域与Fc结构域融合，在HEK Expi细胞中生产并通过两步式柱色谱纯化，所述两步式柱色谱包括经由Protein A进行亲和纯化，之后为尺寸排阻色谱。单次注射800nM hu IL7Rα-IL2Rγ-Fc异二聚体以30μl/min通过配体240秒，以记录缔合相。监测解离阶段持续360s，并通过从样品溶液切换到HBS-EP+来触发。在每个循环后使用一次10mM甘氨酸pH 2注射60秒，使芯片表面再生。通过减去在参考流动池1上获得的响应来校正本体折射率差异。记录捕获步骤之后和缔合相结束时的响应单位，并计算结合与捕获的比率。在解离相中拟合单一结合曲线以获得易于比较的koff(Biacore评估软件，GEHealthcare)。
表11.SPR运行参数。
设备 Biacore T200
芯片 CM5(#768)
Fc1至4 Fc特异性IgG(Roche internal)
捕获 100nM PD1-IL7变体(上清液)，持续120s，10μl/min
分析物 800nM hu IL7Rα-IL2Rγ-Fc avi生物素，单次注射
运行缓冲液 HBS-EP
温度° 25℃
流速 30μl/min
缔合 240秒
解离 360秒
再生 10mM甘氨酸pH 2，持续60秒
针对IL7部分与人IL7Rα-IL2Rγ-Fc的结合分析PD1-IL7变体(PD1-IL7v)。上清液的浓度通过ProteinA结合测定(参见实例1.2)。
实例2.2：IL-7变体(IL7v)与人IL7Rα-IL2Rγ-Fc异二聚体的结合评估
计算结合与捕获的比率，并将解离相拟合到单一曲线以支持表征解离速率。选择结合与捕获比大于0.18和kd大于9.4x10-4(1/s)的九种变体，其对IL7受体的亲和力可能降低(参见表12)。
表12：对IL7受体的亲和力可能降低(解离更快)的所选候选变体。
Figure BDA0003884610430001361
基于实验2.1和2.2，通过表面等离子共振选择对重组白细胞介素7受体具有降低亲和力的九种白细胞介素7变体(IL7-VAR3；IL7-VAR4；IL7-VAR5；IL7-VAR6；IL7-VAR15；IL7-VAR16；IL7-VAR21；IL7-VAR22；IL7-VAR27)。基于结合与捕获信号的比率以及PD1-IL7变体与IL7受体明显更快的解离进行选择。
实例2.3：IL7的敲除N-糖基化的变体与人IL7Rα-IL2Rγ-Fc异二聚体的结合评估
计算结合与捕获的比率，并将解离相拟合到单一曲线以支持表征解离速率。所有敲除N-糖基化的变体(单突变体和三突变体)都具有与野生型IL7相似的解离率(表13)。
表13：野生型IL7和IL7的敲除N-糖基化的变体与IL7受体结合的比较。
Figure BDA0003884610430001371
如表7所示，去除了一个或三个N-糖基化位点的四种所测变体显示出与野生型IL7相似的结合与捕获比和解离常数。N-连接的碳水化合物在白细胞介素7与其受体的相互作用中不发挥作用。
实例2.3：其他IL7变体与人IL7Rα-IL2Rγ-Fc异二聚体的结合评估
表面等离子共振(SPR)实验在Biacore 8K上以HBS-EP+1mg/ml BSA作为运行缓冲液进行。抗P329G Fc特异性抗体(Roche internal)通过胺偶联直接固定在C1芯片(Cytiva)上。PD1-IL7构建体在5nM下被捕获140s。来自2.34至300nM的人、食蟹猴或鼠类IL7Ra-IL2Rg-Fc异二聚体的2倍连续稀释系列的复制物以30μl/min通过配体240秒，以记录缔合相。监测解离相持续800s，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液来触发。在每个循环后使用两次10mM甘氨酸pH 2注射60秒，使芯片表面再生。通过减去在参考流动池(仅含有固定的抗P329G Fc特异性IgG)上获得的响应来校正本体折射率差异。亲和常数是通过使用Biacore评估软件(Cytiva)拟合至1:1Langmuir结合由动力学速率常数得出的。
表14.SPR运行参数。
Figure BDA0003884610430001372
Figure BDA0003884610430001381
分析以下PD1-IL7变体与IL7Ra-IL2Rg-Fc的结合(表15和16)。
表15：分析与IL7Ra-IL2Rg-Fc结合的样品的描述。
样品名称所捕获的分子 TAPIR ID 浓度[g/l]
PD1-IL7-VAR4(V15K) P1AF5541-006 2.7
PD1-IL7-VAR18(K81E) P1AF5555-006 2.9
PD1-IL7-VAR20(G85K) P1AF5557-006 2.6
PD1-IL7-VAR21(G85E) P1AF5558-006 2.6
PD1-IL7-VAR18(K81E)VAR20(G85K) P1AF9696-035 1.8
PD1-IL7-VAR18(K81E)VAR21(G85E) P1AG0950-001 1.9
PD1-IL7wt P1AF5572-018 4.4
表16：IL7Ra-IL2Rg-Fc的描述。
样品名称分析物 TAPIR ID 浓度[g/l]
人IL7Ra-IL2Rg-Fc生物素 P1AF4984-007 1.43
食蟹猴IL7Ra-IL2Rg-Fc生物素 P1AF7912-003 0.92
鼠类IL7Ra-IL2Rg-Fc生物素 P1AF7911-003 1.41
IL7变体对人IL7Rα-IL2Rγ-Fc异二聚体的亲和力测定
针对与人IL7受体的结合，将四种IL7单变体和两种IL7双变体与IL7野生型进行比较(表17)。IL7变体对IL7受体的亲和力是使用具有IL7受体α链和共同IL2受体γ链的胞外结构域的重组异二聚体确定的。
表17：IL7变体与人IL7受体的结合：在25℃下通过表面等离子共振测定的亲和常数，作为复制物的平均值。
Figure BDA0003884610430001382
IL7中所引入的突变降低了与人IL7受体的结合亲和力，其中两个双突变体(K81E/G85K和K81E/G85E)显示出最低亲和力。
IL7变体对食蟹猴IL7Rα-IL2Rγ-Fc异二聚体的亲和力测定
针对与食蟹猴IL7受体的结合，将四种IL7单变体和两种IL7双变体与IL7野生型进行比较(表18)。IL7变体对IL7受体的亲和力是使用具有IL7受体α链和共同IL2受体γ链的胞外结构域的重组异二聚体确定的。
表18：IL7变体与食蟹猴IL7受体的结合：在25℃下通过表面等离子共振测定的亲和常数，作为复制物的平均值。
Figure BDA0003884610430001391
IL7中所引入的突变降低了与食蟹猴IL7受体的结合亲和力，其中G85K和两个双突变体(K81E/G85K和K81E/G85E)显示出最低亲和力。
IL7变体对鼠类IL7Rα-IL2Rγ-Fc异二聚体的亲和力测定
针对与鼠类IL7受体的结合，将四种IL7单变体和两种IL7双变体与IL7野生型进行比较(表19)。IL7变体对IL7受体的亲和力是使用具有IL7受体α链和共同IL2受体γ链的胞外结构域的重组异二聚体确定的。
表19：IL7变体与鼠类IL7受体的结合：在25℃下通过表面等离子共振测定的亲和常数，作为复制物的平均值。
Figure BDA0003884610430001392
IL7中所引入的突变极大降低了与鼠类IL7受体的结合亲和力并取消变体V15K、G85K和两个双突变体(K81E/G85K和K81E/G85E)的结合。
针对与重组白细胞介素-7受体的结合，通过表面等离子共振比较白细胞介素-7的六种变体(四个单氨基酸突变和两个双突变体)与野生型白细胞介素-7。在人IL7受体上获得以下亲和力大小排序：IL7wt>K81E>G85E>V15K>G85K>K81E+G85K>K81E+G85E。对于与食蟹猴IL7受体的结合，观察到相同的排序。与鼠类IL7受体的结合也遵循类似的排序(IL7wt>K81E>G85E)，除了针对携带V15K、G85K、K81E+G85K或K81E+G85E的IL7变体没有检测到结合。与IL7野生型相比，六种所测试的白细胞介素-7变体对IL7受体的亲和力降低，并涵盖了一系列允许调节白细胞介素-7反应的亲和力。
实例2.4：IL7变体对人IL7Rα-IL2Rγ-Fc异二聚体的亲和力测定
SPR实验在Biacore 8K上以HBS-EP+1mg/ml BSA作为运行缓冲液进行。抗P329G Fc特异性抗体(Roche internal)通过胺偶联直接固定在C1芯片(Cytiva)上。PD1-IL7构建体在5nM下被捕获140s。来自2.34至300nM人IL7Ra-IL2Rg-Fc异二聚体的2倍连续稀释系列的复制物以30μl/min通过配体240秒，以记录缔合相。监测解离相持续800s，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液来触发。在每个循环后使用两次10mM甘氨酸pH 2注射60秒，使芯片表面再生。通过减去在参考流动池(仅含有固定的抗P329G Fc特异性IgG)上获得的响应来校正本体折射率差异。亲和常数是通过使用Biacore评估软件(Cytiva)拟合至1:1Langmuir结合由动力学速率常数得出的。
表20.SPR运行参数。
Figure BDA0003884610430001401
分析以下PD1-IL7变体与IL7Ra-IL2Rg-Fc的结合(表21)。
表21：分析与IL7Ra-IL2Rg-Fc结合的样品的描述。
样品名称所捕获的分子 TAPIR ID 浓度[g/l]
PD1-IL7-VAR4(V15K) P1AF5541-006 2.7
PD1-IL7-VAR18(K81E) P1AF5555-006 2.9
PD1-IL7-VAR20(G85K) P1AF5557-006 2.6
PD1-IL7-VAR21(G85E) P1AF5558-006 2.6
PD1-IL7-VAR18(K81E)VAR20(G85K) P1AF9696-035 1.8
PD1-IL7-VAR18(K81E)VAR21(G85E) P1AG0950-001 1.9
参考分子5 P1AF9647-027 0.76
参考分子6 P1AF9648-033 2.5
参考分子7 P1AF9649-012 1.35
参考分子8 P1AF9650-004 3.81
PD1-IL7wt P1AF5572-018 4.4
表22：IL7Ra-IL2Rg-Fc的描述。
样品名称分析物 TAPIR ID 浓度[g/l]
人IL7Ra-IL2Rg-Fc生物素 P1AF4984-007 1.43
IL7变体对人IL7Rα-IL2Rγ-Fc异二聚体的亲和力测定
针对与人IL7受体的结合，将四种IL7单变体、两种IL7双变体和IL7野生型与具有经修饰IL7的四种参考分子进行比较(表23)。IL7变体对IL7受体的亲和力是使用具有IL7受体α链和共同IL2受体γ链的胞外结构域的重组异二聚体确定的。
表23：IL7变体与人IL7受体的结合：在25℃下通过表面等离子共振测定的亲和常数。除了PD1-IL7-VAR20(G85K)、PD1-IL7-VAR18(K81E)VAR21(G85E)和参考分子5为单值测定外，其余为复制物的平均值。
Figure BDA0003884610430001411
Figure BDA0003884610430001421
四种IL7单变体、两种IL7双变体和参考分子在对人IL7受体的结合亲和力方面显示出不同程度的降低。参考分子7未显示出结合。总之，针对与重组白细胞介素-7受体的结合，通过表面等离子共振比较白细胞介素-7的六种变体(四个单氨基酸突变和两个双突变体)和野生型白细胞介素-7与四种在白细胞介素-7中具有突变的参考分子。在人IL7受体上获得以下亲和力大小排序：IL7wt、参考分子5>K81E、参考分子8>G85E>参考分子6>V15K>G85K、K81E+G85K>K81E+G85E。未观察到参考分子7的结合。
实例2.5：PDL1-IL7变体的热稳定性表征
随着散射光强度的变化，使用Optim2系统(Avacta Group公共有限公司)测量PD1-IL7变体的热稳定性。在微量比色皿阵列中，将9μL的于20mM组氨酸、140mM NaCl(pH 6.0)中呈0.75mg/mL浓度的样品以0.1℃/min的速率从25℃加热到85℃。每0.6℃记录一次散射光强度(266nm激光)，并使用软件Optim client V2(Avacta Group公共有限公司)进行处理。聚集开始温度定义为散射强度开始增大时的温度。当蛋白质的3D结构展开时，这一转向会导致以前埋藏的色氨酸暴露。这导致色氨酸发射光谱(330nm和350nm)发生变化。通过确定重心平均值(Spectral Centre of Mass)来监测和分析这种变化。
表24.评估IL7-wt、非糖基化IL7(Var 32)和十一种不同IL7变体的热稳定性(聚集和熔点)
Figure BDA0003884610430001422
Figure BDA0003884610430001431
与IL7-wt和非糖基化IL-7(Var32)相比，所有变体的聚集和熔点显示出相同的稳定性。因此，IL7的设计不会影响热稳定性。
实例3
实例3.1：用增加剂量的PD1-IL7变体处理PD-1+CD4 T细胞后的IL-7R信号传导(STAT5-P)
基于PD-1+CD4 T细胞中的IL-7Rα/IL-2Rγ信号传导量，本文使用STAT5磷酸化(STAT5-P)来评估不同IL-7变体的效力。
为此目的，用CD4珠粒(130-045-101，Miltenyi)从健康供体PBMC中分选CD4 T细胞，并在1μg/ml结合板的抗CD3(过夜经预涂，克隆OKT3，#317315，BioLegend)和1μg/ml可溶性抗CD28(克隆CD28.2，#302923，BioLegend)抗体存在下活化3天以诱导PD-1表达。三天后，收集细胞并洗涤数次以去除内源性IL-2。接着，将细胞接种到V底板中，随后在37℃下用增加浓度的处理抗体(50μl，1:10稀释级，最高浓度为66nM)处理12min。为了保持磷酸化状态，在与各种构建体培育12分钟后立即添加等量的Phosphoflow Fix Buffer I(100ul，557870，BD)。接着将细胞在37℃下再培育30min，随后在-80℃下用PhosphoflowPermBuffer III(558050，BD)渗透过夜。第二天，使用抗STAT-5P抗体(47/Stat5(pY694)克隆，562076，BD)在4℃下将磷酸化形式的STAT-5染色30min。
这些细胞是在FACS BD-LSR Fortessa(BD Bioscience)上获得的。使用FlowJo(V10)确定STAT-5P的频率并使用GraphPad Prism标绘。
PD1-IL7变体携带突变以降低对IL7R的亲和力。STAT5-P以归一化的STAT5-P描述，其中，在图2中，100％等于用66nM的PD1-IL7 wt处理后STAT5-P+细胞的频率。图2显示所测试的PD1-IL7变体在PD-1+CD4T细胞中发出信号，其效力与在本文中用作阳性对照的PD1-IL7wt相似或比其降低。
表25显示获自2个供体的PD-1+CD4 T细胞上每个突变体的剂量反应STAT-5磷酸化的EC50和曲线下面积(AUC)。
Figure BDA0003884610430001441
实例3.2：通过PD-1介导的顺式递送IL-7R信号传导(STAT-5P)至PD-1+CD4 T细胞来选择IL-7变体
在此实验中，STAT5磷酸化用作读数，以评估PD1-IL7v是否会通过IL-7Rα/IL-2Rγ在与PD-1结合后，在表达PD-1的相同CD4 T细胞(顺式)而非表面不含PD-1的相邻CD4 T细胞(反式)上发出信号。
为此目的，用CD4珠粒(130-045-101，Miltenyi)从健康供体PBMC中分选CD4 T细胞，并接着分成两组，用不同的膜染料，如CFSE(5μM，在室温下持续5min；65-0850-84，eBioscience)和Cell Trace Violet(5μM，在室温下持续5min；C34557，ThermoScientific)进行标记，随后在1μg/ml结合板的抗CD3(过夜经预涂，克隆OKT3，#317315，BioLegend)和1μg/ml可溶性抗CD28(克隆CD28.2，#302923，BioLegend)抗体存在下活化3天以诱导PD-1表达。三天后，收集细胞并洗涤数次以去除内源性IL-2。将CFSE标记的细胞进一步与饱和浓度的抗PD1抗体(SEQ ID NO 165，166；10μg/ml)在室温下培育30min。
在进行几个洗涤步骤以去除过量未结合的抗PD-1抗体之后，将经抗PD1预处理(CFSE)和未处理(CTV)的细胞(25μl，6*106个细胞/ml)共培养至V底板，随后在37℃下用0.1μg/ml处理抗体(0.66nM)处理12min。为了保持磷酸化状态，在与各种构建体培育12分钟后立即添加等量的Phosphoflow Fix Buffer I(100μl，557870，BD)。接着将细胞在37℃下再培育30min，随后在80℃下用Phosphoflow PermBuffer III(558050，BD)渗透过夜。第二天，使用抗STAT-5P抗体(47/Stat5(pY694)克隆，562076，BD)在4℃下将磷酸化形式的STAT-5染色30min。
这些细胞是在FACS BD-LSR Fortessa(BD Bioscience)上获得的。使用FlowJo(V10)确定STAT-5P的频率并使用GraphPad Prism标绘。
图3A和图3B中的数据显示了在暴露于0.1μg/ml的32种PD1-IL7变体后，用CellTrace Violet标记的PD1+T细胞和用PD-1抗体预阻断的CFSE标记的PD1+T细胞中STAT-5P+细胞的频率。
图3A表明IL-7R信号传导的效力，因为某些突变与IL-7分子的较低活性有关。图3B表示其中PD-1经预阻断的T细胞上PD1-IL7v的活性，且因此所测量的是邻近的PD-1+T细胞对IL7v的非靶向或反式递送。PD1-IL7wt和PD1-IL2v(SEQ ID NO 22、24、25)用作对照，其中PD1-IL7wt在PD-1阴性T细胞(PD-1经预阻断)中也显示80％的活性。相反，PD1-IL2v在PD-1+T细胞上具有活性，而在PD-1阴性T细胞上大幅度丧失效力，表明IL-2v的递送主要由PD-1靶向以顺式方式介导。
因此，与PD1-IL2v类似，合适的PD1-IL7v分子还应将IL-7v以顺式方式递送至PD-1+T细胞，同时保留明显的激动特性。将这些特征标绘于图3C中，以支持识别具有所需特性的那些IL-7变体(PD1-IL7-VAR3；PD1-IL7-VAR4；PD1-IL7-VAR6；PD1-IL7-VAR16；PD1-IL7-VAR18；PD1-IL7-VAR20；PD1-IL7-VAR21；PD1-IL7-VAR27)。
实例3.3：在用增加剂量的PD1-IL7变体处理PD-1+CD4 T细胞后，通过PD-1介导的顺式递送IL-2R信号传导(STAT5-P)选择IL-7变体
在此实验中，STAT5磷酸化用作读数，以评估PD1-IL7v是否会通过IL-7Rα/IL-2Rγ在与PD-1结合后，在表达PD-1的相同CD4 T细胞(顺式)而非表面不含PD-1的相邻CD4 T细胞(反式)上，以剂量依赖性方式发出信号。
为此目的，用CD4珠粒(130-045-101，Miltenyi)从健康供体PBMC中分选CD4 T细胞，并接着分成两组，用不同的膜染料，如CFSE(5μM，在室温下持续5min；65-0850-84，eBioscience)和Cell Trace Violet(5μM，在室温下持续5min；C34557，ThermoScientific)进行标记，随后在1μg/ml结合板的抗CD3(过夜经预涂，克隆OKT3，#317315，BioLegend)和1μg/ml可溶性抗CD28(克隆CD28.2，#302923，BioLegend)抗体存在下活化3天以诱导PD-1表达。三天后，收集细胞并洗涤数次以去除内源性IL-2。将CFSE标记组进一步与饱和浓度的抗PD1抗体(SEQ ID NO 165、166；10μg/ml)在室温下培育30分钟。
在进行几个洗涤步骤以去除过量未结合的抗PD-1抗体之后，将经抗PD1预处理(CFSE)和未处理(CTV)的细胞(25μl，6*106个细胞/ml)共培养至V底板，随后在37℃下用增加浓度的处理抗体(50μl，1:10稀释级，最高浓度为66nM)处理12min。为了保持磷酸化状态，在与各种构建体培育12分钟后立即添加等量的Phosphoflow Fix Buffer I(100ul，557870，BD)。接着将细胞在37℃下再培育30min，随后在80℃下用Phosphoflow PermBufferIII(558050，BD)渗透过夜。第二天，使用抗STAT-5P抗体(47/Stat5(pY694)克隆，562076，BD)在4℃下将磷酸化形式的STAT-5染色30min。
这些细胞是在FACS BD-LSR Fortessa(BD Bioscience)上获得的。使用FlowJo(V10)确定STAT-5P的频率并使用GraphPad Prism标绘。
表26显示获自4个供体的PD-1+和PD-1预阻断CD4 T细胞上所选突变体的剂量反应STAT-5磷酸化的EC50和曲线下面积。
Figure BDA0003884610430001471
图4A-4D显示作为PD-1+和PD-1预阻断CD4 T细胞中所选PD1-IL7变体的IL-2R信号传导的效力差异。
图4E和图4F显示在暴露于0.1μg/ml的8种所选PD1-IL7变体后，用Cell TraceViolet标记的PD1+T细胞和用PD-1抗体(SEQ ID NO 165、166)预阻断的CFSE标记的PD1+T细胞中STAT-5P+细胞的频率。
图4E表明IL-2R信号传导的效力，因为某些突变与IL-7分子的较低活性有关。图4F表示其中PD-1经预阻断的T细胞上PD1-IL7v的活性，且因此测量邻近的PD-1+T细胞对IL7v的非靶向或反式递送。PD1-IL7wt和PD1-IL2v(SEQ ID NO 22、24、25)用作对照，其中PD1-IL7wt在PD-1阴性T细胞(PD-1经预阻断)中也显示80％的活性。相反，PD1-IL2v在PD-1+T细胞上具有活性，而在PD-1阴性T细胞上大幅度丧失效力，表明IL-2v的递送由PD-1靶向以顺式方式介导。总之，所测试的PD1-IL7变体(PD1-IL7-VAR3；PD1-IL7-VAR4；PD1-IL7-VAR6；PD1-IL7-VAR16；PD1-IL7-VAR18；PD1-IL7-VAR20；PD1-IL7-VAR21；PD1-IL7-VAR27)显示PD-1在以下方面的促成作用：介导/促进IL-7变体以剂量反应方式递送到表达PD-1与不含PD-1的CD4 T细胞上的IL-7Rα/IL-2Rγ。
实例3.4：在用增加剂量的PD1-IL7变体处理PD-1+CD4 T细胞和PD-1预阻断CD4 T细胞后的IL-2R信号传导(STAT5-P)
在此实验中，STAT5磷酸化用作读数，以评估PD1-IL7v通过IL-7Rα/IL-2Rγ在与PD-1结合后，在表达PD-1的CD4 T细胞相对于表面不含PD-1的T细胞上，以剂量依赖性方式进行信号传导的效力差异，其中PD1-IL7v结合仅依赖于与IL-7Rα/IL-2Rγ的结合。
为此目的，用CD4珠粒(130-045-101，Miltenyi)从健康供体PBMC中分选CD4 T细胞，并在1μg/ml结合板的抗CD3(过夜经预涂，克隆OKT3，#317315，BioLegend)和1μg/ml可溶性抗CD28(克隆CD28.2，#302923，BioLegend)抗体存在下活化3天以诱导PD-1表达。三天后，收集细胞并洗涤数次以去除内源性IL-2。接着，将细胞分成两组，其中一组与饱和浓度的抗PD1抗体(SEQ ID NO 165、166；10μg/ml)在室温下培育30min。
在进行几个洗涤步骤以去除过量未结合的抗PD-1抗体之后，将经抗PD1预处理和未处理的细胞(50μl，4*106个细胞/ml)接种至V底板，随后在37℃下用增加浓度的处理抗体(50μl，1:10稀释级，最高浓度为66nM)处理12min。为了保持磷酸化状态，在与各种构建体培育12分钟后立即添加等量的Phosphoflow Fix Buffer I(100μl，557870，BD)。接着将细胞在37℃下再培育30min，随后在80℃下用Phosphoflow PermBuffer III(558050，BD)渗透过夜。第二天，使用抗STAT-5P抗体(47/Stat5(pY694)克隆，562076，BD)在4℃下将磷酸化形式的STAT-5染色30min。
这些细胞是在FACS BD-LSR Fortessa(BD Bioscience)上获得的。使用FlowJo(V10)确定STAT-5P的频率并使用GraphPad Prism标绘。
图5A-F中的数据显示所选PD1-IL7变体在PD-1+和PD-1预阻断CD4 T细胞中的效力差异。PD1+CD4 T细胞中的效力测量值反映了PD1介导的IL-7递送与PD1预阻断的CD4 T细胞中的独立于PD1的IL-7递送。
每个PD1-IL7v分子的PD1介导和独立于PD-1的IL-7递送之间的STAT-5P EC50倍数增加通过将PD-1预阻断细胞的EC50除以PD1+T细胞的EC50来计算。这为每种IL7突变体的PD1依赖性IL7v递送的强度提供证据。
此外，PD1-IL7v和PD1-IL7wt之间的EC50倍数增加通过将PD1-IL7v的EC50除以PD1-IL7wt的EC50来计算。这表明由于对IL-7Rα的亲和力降低，PD1-IL7v的效力丧失。
表27显示获自4个供体的PD-1+和PD-1预阻断CD4 T细胞上所选突变体的剂量反应STAT-5磷酸化的EC50、EC50倍数增加和曲线下面积。
Figure BDA0003884610430001491
Figure BDA0003884610430001501
实例4
实例4.1：在PD1-IL7v处理后从Treg抑制中拯救Tconv效应子功能
此处评估PDl-IL7突变体是否可以逆转Treg对Tconv效应子功能的抑制。因此，建立抑制功能分析，并且为此目的，分离Tconv和Treg并如下标记。用两步调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi，#130-094-775)分离CD4+CD25+CD127dim调节性T细胞(Treg)。并行地，通过以下步骤来分离CD4+CD25-常规T细胞(Tconv)：收集CD25阳性选择(Miltenyi，#130-092-983)的阴性级分，之后进行CD4+富集(Miltenyi，#130-045-101)。将Tconv用CFSE(eBioscience，#65-0850-84)标记，并将Treg用Cell Trace Violet(ThermoFisherscientific，C34557)标记，以追踪两个群体的增殖。
接着在来自无关供体的CD4-CD25-PBMC存在下，无论是否处理，将Tconv和Treg一起培养5天以提供同种异体特异性刺激。
在第5天，通过在FACS染色之前施加蛋白质转运抑制剂(GolgiPlug#555029，BD和GolgiStop#554724，BD)5小时来增强高尔基(Golgi)复合体中细胞因子的积聚。
测量增殖的Tconv在Treg存在和不存在的情况下分泌颗粒酶B(GrzB；图6)的能力。使用下式计算Treg抑制：
Figure BDA0003884610430001502
其中细胞因子(Tconv+Treg±免疫缀合物)％是在Treg±处理存在的情况下由Tconv分泌的细胞因子的水平，细胞因子(Tconv)％是在不存在Treg的情况下由Tconv分泌的细胞因子的水平。在图6中，每个符号代表一个单独供体，水平线表示N＝5个供体的中位数，来自3个独立实验。使用单因素方差分析计算P(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。
在未经处理的样品中，Tconv的95％颗粒酶B分泌受Treg抑制。用非靶向IL-2v或IL-7v处理并不能从Treg抑制中拯救Tconv分泌颗粒酶B。然而，鉴于Treg使IL7R的表达减少，由于IL-7对Tconv的优先活性，非靶向IL-7wt能够将Treg抑制减少至63％，这转化为Tconv在其消耗方面相对于Treg的竞争优势。有趣的是，PD-1介导的IL-7wt和突变IL-7的靶向导致Treg抑制明显降低，对于突变体，取决于单突变，抑制范围在61％到8％之间，而对于PD1-IL7wt，则达到18％。PD1-IL2v由于能够克服Treg抑制而用作阳性对照，在此案例中减少到57％。
这些结果突出了PD-1介导的IL-7递送对于Tconv提供的相对于Treg的竞争优势。其还揭示那些对IL-7Rα具有降低亲和力的突变体，所述突变体仍保持IL-7wt对Tconv相对于Treg的竞争优势(图6)。
实例4.2：用增加剂量的PD1-IL7突变体处理后活化的PD-1+和PD-1-CD4 T细胞上的IL-7R信号传导(STAT5-P)
在此实验中，WO 2020/127377 A1中公开的对IL-7Ra/g具有降低亲和力的四种不同PD1-IL7突变体(参考分子1至4)的效力和顺式/反式信号传导经测量为，通过增加浓度的免疫缀合物处理活化PD1+和PD-1-(经抗PD-1预处理)CD4 T细胞进行的IL-7R信号传导。目的是确定PD1-IL7突变体对T细胞的PD-1表达的依赖性，以便递送IL-7R信号传导。
这些分子中的每一个在IL-7中都具有至少一个点突变，目的是降低对IL7Rα或对公共γ链(γc)的亲和力。
为此目的，用CD4珠粒(130-045-101，Miltenyi)从健康供体PBMC中分选CD4 T细胞，并在1μg/ml结合板的抗CD3(过夜经预涂，克隆OKT3，#317315，BioLegend)和1μg/ml可溶性抗CD28(克隆CD28.2，#302923，BioLegend)抗体存在下活化3天以诱导PD-1表达。三天后，收集细胞并洗涤数次以去除内源性细胞因子，且一半细胞用CTV(5uM，在室温下5min；C34557，Thermo Scientific)标记，而另一半未标记。
接着，将CFSE标记的细胞与饱和浓度的竞争性抗PD-1抗体(内部分子，10μg/ml)在室温下培育30min，之后进行几个洗涤步骤以去除过量的未结合抗PD1抗体。此后，将PD1预阻断的CFSE标记细胞(25μl，6*106个细胞/ml)与PD1+CTV标记的细胞(25μl，6*106个细胞/ml)在V底板中以1:1共培养，随后在37℃下用增加浓度的处理抗体(50μl，1:10稀释级)处理12min。为了保持磷酸化状态，在与各种构建体培育12分钟后立即添加等量的PhosphoflowFix Buffer I(100ul，557870，BD)。接着将细胞在37℃下再培育30min，随后在-80℃下用Phosphoflow PermBuffer III(558050，BD)渗透过夜。第二天，使用抗STAT-5P抗体(47/Stat5(pY694)克隆，562076，BD)在4℃下将磷酸化形式的STAT-5染色30min。
这些细胞是在FACS BD-LSR Fortessa(BD Bioscience)上获得的。用FlowJo(V10)确定STAT-5P的频率并用GraphPad Prism标绘。
PD-1+T细胞的剂量反应曲线提供关于参考分子1至4通过IL-7R进行信号传导的效力的信息。此外，为防止PD-1介导的递送，用竞争性抗PD-1抗体预处理的T细胞的剂量反应曲线显示，参考分子1至4在独立于PD-1表达提供IL-7R信号传导方面的效力。在此特定分析中，仅参考分子2在不存在PD-1结合的情况下对T细胞的活性比对PD-1+T细胞的活性降低超过12倍(图7，表28)。
表28.
Figure BDA0003884610430001521
实例4.3：在用增加剂量的PD1-IL7单突变体和双突变体处理后，活化的PD-1+和PD-1-CD4 T细胞上的IL-7R信号传导(STAT5-P)
在以下实验中，2种不同PD1-IL7突变体和2种双突变体和参考分子2的IL-7R信号传导通过将活化的PD1+和PD-1-(经抗PD-1预处理)CD4 T细胞暴露于增加浓度的免疫缀合物来测量。鉴于PD1-IL7wt以独立于PD1的方式或反式发挥作用，反式意味着IL-7wt部分可以在与PD1+细胞极接近处培养的PD1阴性T细胞中发信号，此实验将允许选择对IL7Ra具有降低亲和力的PD1-IL7突变体以确保顺式的优先信号传导，顺式意味着IL-7v部分在PD-1对接后，主要在相同PD-1+T细胞上结合IL-7R并通过其发信号。
为此目的，从健康供体PBMC中分选CD4 T细胞，并如实例4.2和图7所描述进行实验。
PD-1+T细胞的剂量反应曲线提供关于单突变体和双突变体通过IL-7R进行信号传导的效力的信息。此外，为防止PD-1介导的递送，用竞争性抗PD-1抗体预处理的T细胞的剂量反应曲线显示，单突变体和双突变体在独立于与PD-1结合提供IL-7R信号传导方面的效力。在此特定分析中，PD1-IL7VAR18和PD1-IL7VAR21对PD-1-T细胞的效力分别比对PD-1+T细胞的效力降低了超过20倍和30倍，表明其具有优先的顺式活性(图8A)。值得注意的是，PD1-IL7VAR18/20双突变体在PD-1-T细胞上的活性相较于PD-1+T细胞，大幅度下降约100倍(图8B)。
表29
Figure BDA0003884610430001531
实例4.4：在用增加剂量的PD1-IL7单突变体和双突变体处理后，活化的PD-1+相对于新分离的IL-7Ra+CD4 T细胞上的IL-7R信号传导(STAT5-P)
为了测量PD1-IL7单突变体和双突变体的靶上和脱靶活性，在暴露于增加浓度的免疫缀合物后，测量活化的PD-1+(代表所需目标)相对于新分离的IL-7Ra+CD4 T细胞(代表IL-7疗法的外周池(peripheral sink))中的IL-7R信号传导。
为此目的，从健康供体PBMC中分选CD4 T细胞，并如图7所描述活化。三天后，收集细胞并洗涤数次以去除内源性细胞因子，并将细胞用CTV(5μM，在室温下5min；C34557，Thermo Scientific)标记并以1:1(25μl，每一群体6*106个细胞/ml)与来自无关供体的新分离的CD4 T细胞在V底板中共培养，随后在37℃下用增加浓度的处理抗体(50μl，1:10稀释级)处理12min。为了保持磷酸化状态，在与各种构建体培育12分钟后立即添加等量的Phosphoflow Fix Buffer I(100ul，557870，BD)。接着将细胞在37℃下再培育30min，随后在-80℃下用Phosphoflow PermBuffer III(558050，BD)渗透过夜。第二天，使用抗STAT-5P抗体(47/Stat5(pY694)克隆，562076，BD)在4℃下将磷酸化形式的STAT-5染色30min。
这些细胞是在FACS BD-LSR Fortessa(BD Bioscience)上获得的。用FlowJo(V10)确定STAT-5P的频率并用GraphPad Prism标绘。
PD-1+T细胞的剂量反应曲线提供关于单突变体和双突变体与PD1-IL7wt相比在目标T细胞上通过IL-7R进行信号传导的效力的信息。相反，表达高水平IL-7Ra的新分离T细胞的剂量反应曲线显示，单突变体和双突变体与PD1-IL7wt相比在脱靶外周T细胞上提供IL-7R信号传导方面的效力。在此特定分析中，PD1-IL7VAR18和PD1-IL7VAR21对IL-7Ra+T细胞的效力分别比对PD1-IL7wt的效力降低超过60倍和130倍，而对PD-1+T细胞的效力仅降低12倍和17倍(图9A)。参考分子2在IL-7Ra+T细胞上的IL-7R信号传导减少超过130倍，这与PD-1+T细胞上的效力降低40倍相关(图9B)。有趣的是，相比于PD1-IL7wt，双突变体对IL-7Ra+T细胞的脱靶活性降低300倍和1700倍，而对PD1+T细胞的靶上活性分别降低27倍和106倍(图9B)。这表明单一突变体和甚至更多的双突变体由于对IL-7Ra的亲和力降低而在PD-1+T细胞上具有优先活性，且因此具有降低的脱靶效应。
表30
Figure BDA0003884610430001551
实例4.5：PD1-IL7单突变体和双突变体对细胞毒性效应子功能和同种异体特异性PD-1+CD4 T细胞增殖的功能活性
为了评估PD1-IL7v对T细胞效应子功能的功能活性并将其与PD1-IL7wt进行比较，将CD4 T细胞与B细胞淋巴母细胞肿瘤细胞系(ARH77)共培养5天以产生同种异体-反应性T细胞。ARH77表达中等水平的PD-L1和高水平的MHCII，并在同种异体特异性CD4 T细胞表面上诱导PD-1表达。因此，此分析允许对PD-1阻断和PD-1介导的突变和wt IL-7的递送进行功能评估。
如上文所描述进行CD4分离和CTV标记。将分选的CD4+T细胞与照射过的ARH-77(人B淋巴母细胞系)以5:1的E:T比(100’000个T细胞:20’000个ARH-77)在存在或不存在增加剂量的基于PD1或基于FAP的IL-7突变体和wt的情况下共培养。将细胞在96圆底板中在37℃、5％CO2下共培养5天。5天后，通过在FACS染色之前施加蛋白质转运抑制剂(GolgiPlug555029，BD和GolgiStop 554724，BD)5小时来增强高尔基复合体中细胞因子的积聚。首先针对CD4和活/死细胞对细胞进行染色。在固定/渗透过夜(554714，BD)后，针对颗粒酶B(GrzB)在细胞内染色所述细胞。在FACS BD-LSR Fortessa(BD Bioscience)上获得细胞并用FlowJo和GraphPad Prism进行分析。通过对活的和增殖的CD4+T细胞进行门控(CTVlow)，比较不同条件下颗粒酶B分泌的频率和平均荧光强度。
剂量反应曲线表明，单突变体PD1-IL7VAR18、PD1-IL7VAR21和双突变体PD1-IL7VAR18/20具有功能活性，并在引发细胞毒性T细胞效应子功能同时诱导相当的T细胞增殖方面甚至比PD1-IL7wt更有效(图10A-B、10D-E)。参考分子2对T细胞效应子功能(3倍)和增殖(2倍)显示出较低活性(图10C、10F)。
有趣的是，亲本抗PD1抗体与基于FAP的非靶向IL-7分子的组合并未再现类似的结果，这突出了PD-1介导的靶向对于将IL-7突变体有效递送至PD-1+同种异体T细胞的重要贡献。
表31和32以及相应的图10A-F证明了所测试分子的效力，并且组合处理没有概括融合蛋白的效应。
表31.数据图10A-C
Figure BDA0003884610430001561
表32数据图10D-F
Figure BDA0003884610430001571
实例4.6：通过基于PD1相对于非靶向IL-7突变体和wt对干细胞样T细胞、Treg和天然T细胞的靶向
作为概念验证实验，其评估IL-7中所引入的用以降低其对IL-7Ra的亲和力的突变是否改善PD-1介导的递送并因此改善PD-1+T细胞的靶向，在健康供体PBMC的结合分析中测试PD1-IL7突变体和PD1-IL7wt，所述PBMC含有大量脱靶T细胞(如天然细胞
Figure BDA0003884610430001572
和Treg)以及少量天然表达PD-1的目标群。
健康供体PBMC在37℃下与PD1-IL7VAR18、PD1-IL7VAR21、PD1-IL7wt或FAP-IL7VAR18、FAP-IL7VAR21、FAP-IL7wt培育30分钟。在去除未结合的构建体后，将PBMC用能够特异性检测到免疫缀合物的突变Fc部分的经直接标记的抗PGLALA抗体染色。将细胞在固定前进一步针对CD4和CD8染色，并用FOXP-3、PD-1和TCF-1进行渗透并染色。
基于表面和细胞内标记，T细胞分为以下亚群：Treg(CD4+FOXP3+)、CD8天然细胞(CD8+PD-1-TCF-1+)和CD8干细胞样T细胞(CD8+PD-1+TCF-1+)。接着在各处理条件下测量并计算每个T细胞亚群的PGLALA+细胞频率。
图11表明FAP-IL7wt与天然T细胞结合，之后与Treg结合，且最后与干细胞样T细胞结合，这与三个亚群上IL-7Ra的表达水平降低一致。相反，PD-1介导的PD1-IL7wt靶向，同时保持与天然细胞和Treg的结合不变，大幅度增加了对干细胞样T细胞的靶向(图11)。值得注意的是，PD1-IL7VAR18和VAR21均保持对干细胞样T细胞的靶向，但显示出与Treg和天然T细胞的脱靶结合的大幅度降低(图11)。
实例4.7：PD1-IL7单突变体、双突变体和wt对人PD-1转基因小鼠的小鼠IL-7Ra和IL-2Rg的交叉反应性
为了在小鼠中进行体内功效研究，针对与来自人PD-1转基因小鼠的活化脾细胞的鼠类IL-7Ra和IL-2Rg的交叉反应性，测试与阻断抗PD1抗体融合的IL7单突变体、双突变体和野生型。
为此目的，通过使用CD4珠粒(130-104-454，Miltenyi)从两只人类PD-1转基因小鼠脾脏的单细胞悬浮液中分离出CD4 T细胞，并在5μg/ml结合板的抗CD3(过夜经预涂，克隆145-2C11，BioLegend)和5μg/ml结合板的抗CD28(过夜经预涂，克隆37.51，BioLegend)抗体存在下活化3天以诱导PD-1表达。三天后，收集细胞并洗涤数次以去除内源性细胞因子。将PD1+CD4 T细胞(50μl，4*106个细胞/ml)接种在V底板中，随后在37℃下用增加浓度的处理抗体(50μl，1:10稀释级)处理30分钟。为了保持磷酸化状态，在与各种构建体培育30分钟后立即添加等量的Phosphoflow Fix Buffer I(100ul，557870，BD)。接着将细胞在37℃下再培育30min，随后在-80℃下用Phosphoflow PermBuffer III(558050，BD)渗透过夜。第二天，使用抗STAT-5P抗体(47/Stat5(pY694)克隆，562076，BD)在4℃下将磷酸化形式的STAT-5染色30min。
这些细胞是在FACS BD-LSR Fortessa(BD Bioscience)上获得的。用FlowJo(V10)确定STAT-5P的频率并用GraphPad Prism标绘。
显示PD1-IL7wt具有小鼠交叉反应性，并以剂量依赖性方式通过活化的CD4 T细胞的IL-7R发出信号，在比人CD4 T细胞上低10倍的浓度下达到稳定状态。此外，单突变体PD1-IL7VAR18和PD1-IL7VAR21以与PD1-IL7wt相当的效力诱导IL-7R的剂量反应信号传导，但具有降低的Cmax。相反，双突变体以及参考分子2均未在活化的PD-1+CD4 T细胞中引发任何信号传导(图12)。
实例4.8：在用增加剂量的与PD-1阻断抗体的C端和N端融合的IL-7VAR18(K81E)、VAR21和野生型处理后，活化PD-1+和PD-1-CD4 T细胞上的IL-7R信号传导(STAT5-P)
在以下实验中，对PD-1阻断抗体的C端上融合相对于N端上融合的PD1-IL7 Var18、Var21和野生型进行评估，以研究C端和N端对免疫缀合物活性的影响。接着以剂量依赖性方式在活化的PD-1+和PD-1-(用竞争性抗PD-1抗体预处理)CD4 T细胞上测试这些分子。为此目的，进行与实例4.2和图7中所描述相同的实验。
PD-1+T细胞的剂量反应曲线提供关于不同PD1-IL7 Var18、Var21和wt分子在C端和N端形式中的效力的信息，看起来较相似(图13A+B)。
实例4.9：用增加剂量的由与PD1结合剂融合的IL7突变体(参考分子5-8)构成的PD1-IL7处理后，PD-1+和PD-1-CD4 T细胞上的IL-7R信号传导(STAT5-P)
在此实验中，通过将一个突变的IL7v与PD1结合剂融合产生的四种不同PD1-IL7突变体(如上文所描述的参考分子5至8)的效力和顺式/反式信号传导经测量为，通过用增加浓度的免疫缀合物处理活化的PD1+和PD-1-(经抗PD-1预处理)CD4 T细胞进行的IL-7R信号传导。目的是确定PD1-IL7突变体对T细胞的PD-1表达的依赖性，以便递送IL-7R信号传导。为此目的，从健康供体PBMC中分选CD4 T细胞，并如上文所描述进行实验。
PD-1+T细胞的剂量反应曲线提供关于参考分子通过IL-7R进行信号传导的效力的信息。此外，为防止PD-1介导的递送，用竞争性抗PD-1抗体预处理的T细胞的剂量反应曲线显示，参考分子在独立于PD-1表达提供IL-7R信号传导方面的效力。在此特定分析中，仅参考分子6在不存在PD-1结合的情况下对T细胞的活性比对PD-1+T细胞的活性降低超过60倍(图33，表14)。
值得注意的是，与参考分子2相比，参考分子6对PD1+和PD1预阻断细胞具有更强的效力差异(图2)，这表明使用的PD-1结合剂的亲合力更高和/或一种与抗PD-1抗体融合的IL-7v分子允许PD-1介导的靶向。
表33：
Figure BDA0003884610430001601
实例5
与PD1-IL7wt Mab相比，PD1-IL7v变体18和21免疫缀合物在小鼠肿瘤细胞系的同系模型中的体内功效。
在一种同系模型中测试PD1-IL7v变体18和21免疫缀合物作为单一药剂与PD1-IL7wt抗体相比的抗肿瘤功效。在经皮下注射到Black 6小鼠中的小鼠结肠直肠MC38细胞系中测试鼠类替代物PD1-IL2v免疫缀合物。
Panc02-H7细胞(小鼠胰腺癌)最初获自MD Anderson癌症中心(Texas，USA)，并在扩增后存放在Roche-Glycart内部细胞库中。Panc02-H7-Fluc细胞系是通过钙转染和亚克隆技术在内部生产的。Panc02-H7-Fluc是在含有10％FCS(Sigma)、500μg/ml潮霉素和1％Glutamax的RPMI培养基中培养的。在5％CO2下，在水饱和的气氛中于37℃下培养细胞。第18代用于移植。细胞活力为92.6％。使用1ml结核菌素注射器(BD Biosciences)将每只动物2x105个细胞在100μl RPMI细胞培养基(Gibco)中皮下注射到小鼠的胁腹。
根据规定指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)，将实验开始时为8-10周龄的雌性Black 6-huPD1转基因小鼠(Charles Rivers，Lyon，France)维持在不含特定病原体的条件下，日循环为12h光照/12h黑暗。到达之后，将动物维持一周以适应新环境并进行观察。定期进行连续健康状态监测。
在研究第0天给小鼠皮下注射2x105个Panc02-Fluc细胞，随机分组并称重。在肿瘤细胞注射后十二天(肿瘤体积>150mm3)，小鼠经静脉内注射PD1-IL7v变体18、变体21、PD-IL7wt或媒介物，每周一次，持续两周。向所有小鼠静脉注射200μl适当的溶液。媒介物组中的小鼠经注射组氨酸缓冲液，且处理组经注射PD1-IL7v变体21构建体(1iv qw)或PD1-IL7v变体18(1mg/kg iv qw)或PD1-IL7wt(1mg/kg iv qw)，持续2周。为了获得每200μl适量的免疫缀合物，在需要时用组氨酸缓冲液稀释贮备溶液。
图15A-C显示，与媒介物组相比，PD1-IL7v变体18及21在肿瘤生长抑制方面有优越的功效。注射PD1-IL7v变体的小鼠对处理耐受性良好。PD1-IL7wt分子耐受性不佳，且在第二次施用后需要处死小鼠，因此无法计算TGI。
表34.
Figure BDA0003884610430001611
***
尽管为了清楚理解的目的既往已经通过说明和实例相当详细地描述了发明，但是所述说明和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容的全部内容以引用方式明确地并入。
序列表
<110> 豪夫迈•罗氏有限公司 (F. Hoffmann-La Roche AG)
<120> 免疫缀合物
<130> P36057
<160> 166
<170> PatentIn 3.5版
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<213> 智人
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
465 470 475 480
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
485 490 495
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
515 520 525
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
530 535 540
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565 570 575
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<223> 合成构建体
<400> 23
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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435 440 445
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<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 25
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
20 25 30
Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr
85 90 95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 27
<211> 268
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115 120 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130 135 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser
145 150 155 160
Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala
165 170 175
Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp
180 185 190
Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe
195 200 205
Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys Val Pro Glu
210 215 220
Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly Met Gly Thr Ser
225 230 235 240
Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg Ser Ala Gln Pro
245 250 255
Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
260 265
<210> 28
<211> 288
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 29
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 30
<211> 225
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 32
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 33
<211> 328
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 34
<211> 607
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Arg Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Asn Ser Ala Gly Ile Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Arg Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Val Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Asn Met Gly Thr Thr Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
210 215 220
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
290 295 300
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
305 310 315 320
Asn Ser Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325 330 335
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
340 345 350
Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn
355 360 365
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Ala Glu Asn Tyr Asp Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser
385 390 395 400
Tyr Phe Val Tyr Ser Asp Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
405 410 415
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
420 425 430
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser
450 455 460
Thr Ser Ser Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
465 470 475 480
Gln Gln Gln Gln His Leu Glu Gln Leu Leu Met Asp Leu Gln Glu Leu
485 490 495
Leu Ser Arg Met Glu Asn Tyr Arg Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu
500 505 510
Thr Ala Lys Phe Ala Leu Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys Asp Leu
515 520 525
Gln Cys Leu Glu Asp Glu Leu Gly Pro Leu Arg His Val Leu Asp Gly
530 535 540
Thr Gln Ser Lys Ser Phe Gln Leu Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser
545 550 555 560
Asn Ile Arg Val Thr Val Val Lys Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe
565 570 575
Glu Cys Gln Phe Asp Asp Glu Ser Ala Thr Val Val Asp Phe Leu Arg
580 585 590
Arg Trp Ile Ala Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln
595 600 605
<210> 35
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Arg Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Asn Ser Ala Gly Ile Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Arg Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Val Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Asn Met Gly Thr Thr Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
210 215 220
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
290 295 300
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
305 310 315 320
Asn Ser Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325 330 335
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
340 345 350
Lys Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn
355 360 365
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Lys Thr Asp Gly Ser
385 390 395 400
Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
405 410 415
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
420 425 430
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro
435 440
<210> 36
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Asp Ile Val Met Thr Gln Gly Thr Leu Pro Asn Pro Val Pro Ser Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly
85 90 95
Leu Glu Phe Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105 110
Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
115 120 125
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
145 150 155 160
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
180 185 190
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
195 200 205
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 37
<211> 595
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro
450 455 460
Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu
465 470 475 480
Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro
485 490 495
Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala
500 505 510
Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu
515 520 525
Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro
530 535 540
Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly
545 550 555 560
Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile
565 570 575
Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser
580 585 590
Thr Leu Thr
595
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
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Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
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Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
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Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
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Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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195 200 205
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210
<210> 40
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
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210
<210> 43
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<213> 智人
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<210> 44
<211> 608
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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65 70 75 80
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Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115 120 125
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130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
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195 200 205
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser
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Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
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Pro Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
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Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
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Val Asn Ser Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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<210> 46
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 47
<211> 604
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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165 170 175
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Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
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Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
325 330 335
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340 345 350
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro
355 360 365
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
370 375 380
Tyr Asp Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
385 390 395 400
Tyr Ser Asp Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
405 410 415
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
420 425 430
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Ser Ser
450 455 460
Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
465 470 475 480
Gln His Leu Glu Gln Leu Leu Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg
485 490 495
Met Glu Asn Tyr Arg Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Ala Lys
500 505 510
Phe Ala Leu Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu
515 520 525
Glu Asp Glu Leu Gly Pro Leu Arg His Val Leu Asp Gly Thr Gln Ser
530 535 540
Lys Ser Phe Gln Leu Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg
545 550 555 560
Val Thr Val Val Lys Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln
565 570 575
Phe Asp Asp Glu Ser Ala Thr Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile
580 585 590
Ala Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln
595 600
<210> 48
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp
180 185 190
Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
210 215 220
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
260 265 270
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
305 310 315 320
Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
325 330 335
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Lys Gln Met
340 345 350
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro
355 360 365
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
370 375 380
Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Lys Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
405 410 415
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
420 425 430
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 49
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp
130 135 140
Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val
145 150 155 160
Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser
180 185 190
Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 50
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Arg Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Asn Ser Ala Gly Ile Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Arg Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Val Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Asn Met Gly Thr Thr Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile
210 215 220
Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile
245 250 255
Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp
260 265 270
Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His
275 280 285
Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg
290 295 300
Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys
305 310 315 320
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu
355 360 365
Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp
370 375 380
Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu
405 410 415
Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His
420 425 430
Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 51
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Asp Ile Val Met Thr Gln Gly Thr Leu Pro Asn Pro Val Pro Ser Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly
85 90 95
Leu Glu Phe Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105 110
Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
115 120 125
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
145 150 155 160
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
180 185 190
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
195 200 205
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 52
<211> 152
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 53
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Ala Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
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50 55 60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
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Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 54
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Lys Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 55
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Ala Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
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Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
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Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
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<210> 56
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Lys Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
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Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 57
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Ala Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 58
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Lys Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 59
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Ala Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
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50 55 60
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100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
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Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 60
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Lys Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
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Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
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Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
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Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 61
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Ala Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
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Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
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Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
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<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Lys Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
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Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
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Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 63
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Ala Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 64
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Lys Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 65
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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35 40 45
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
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<223> 合成构建体
<400> 77
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<223> 合成构建体
<400> 78
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<223> 合成构建体
<400> 79
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<210> 80
<211> 152
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
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<223> 合成构建体
<400> 81
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 83
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<211> 152
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<220>
<223> 合成构建体
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 85
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 86
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<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
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<220>
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<220>
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<400> 105
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
465 470 475 480
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
485 490 495
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
500 505 510
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
515 520 525
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
530 535 540
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Ala Gly Gln Val
545 550 555 560
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
565 570 575
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
580 585 590
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
595 600 605
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
610 615
<210> 118
<211> 616
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 118
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
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Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
465 470 475 480
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
485 490 495
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
500 505 510
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
515 520 525
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530 535 540
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565 570 575
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580 585 590
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
595 600 605
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
610 615
<210> 119
<211> 616
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 119
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
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420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
465 470 475 480
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
485 490 495
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
500 505 510
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
515 520 525
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Ala Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
530 535 540
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565 570 575
Leu Glu Glu Asn Lys Ala Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
580 585 590
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
595 600 605
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
610 615
<210> 120
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 120
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1 5 10 15
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Trp His Glu
465
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 121
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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
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Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 122
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 122
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1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
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195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 123
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 123
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
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245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 124
<211> 616
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 124
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
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Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
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355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
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435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
465 470 475 480
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
485 490 495
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
500 505 510
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
515 520 525
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
530 535 540
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
545 550 555 560
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
565 570 575
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
580 585 590
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
595 600 605
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
610 615
<210> 125
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 125
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
20 25 30
Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
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100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<211> 616
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 126
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
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Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
485 490 495
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<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 127
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
<400> 128
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Gly
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<220>
<223> 合成构建体
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210 215
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 131
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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435 440 445
Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 132
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
<400> 133
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 134
<211> 617
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 134
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
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Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
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195 200 205
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg
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Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
225 230 235 240
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
245 250 255
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr
260 265 270
Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280 285
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
290 295 300
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
305 310 315 320
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325 330 335
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355 360 365
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385 390 395 400
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405 410 415
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
420 425 430
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
435 440 445
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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465 470 475 480
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
515 520 525
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
530 535 540
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
545 550 555 560
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
565 570 575
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
580 585 590
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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100 105 110
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Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 139
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Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Ser Thr Gly Gln Val Lys Gly
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Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Ser Phe
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Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu
595 600 605
Met Gly Thr Lys Glu His
610
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
<400> 143
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
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Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
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610
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 144
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<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 146
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 147
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 148
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 149
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Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ser Asp
450 455 460
Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser
465 470 475 480
Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu
485 490 495
Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Ser Asp Ala Asn Lys
500 505 510
Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu
515 520 525
Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser
530 535 540
Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Ser Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg
545 550 555 560
Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu
565 570 575
Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu
580 585 590
Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Ser Trp Asn Lys Ile Leu Met
595 600 605
Gly Thr Lys Glu His
610
<210> 157
<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 157
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala
450 455 460
Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu
465 470 475 480
Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys
485 490 495
Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr
500 505 510
Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
515 520 525
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530 535 540
Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser
545 550 555 560
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565 570 575
Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr
580 585 590
Leu Thr
<210> 158
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 158
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Ala Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 159
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 159
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 160
<211> 615
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 160
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp
450 455 460
Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met
465 470 475 480
Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn
485 490 495
Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala
500 505 510
Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln
515 520 525
Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys
530 535 540
Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys
545 550 555 560
Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu
565 570 575
Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys
580 585 590
Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile
595 600 605
Leu Met Gly Thr Lys Glu His
610 615
<210> 161
<211> 615
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 161
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1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser Ser Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp
450 455 460
Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met
465 470 475 480
Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn
485 490 495
Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala
500 505 510
Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln
515 520 525
Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Glu
530 535 540
Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys
545 550 555 560
Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu
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Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys
580 585 590
Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile
595 600 605
Leu Met Gly Thr Lys Glu His
610 615
<210> 162
<211> 615
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 162
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
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Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
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Thr Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp
450 455 460
Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met
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Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn
485 490 495
Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala
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Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys
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545 550 555 560
Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu
565 570 575
Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys
580 585 590
Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile
595 600 605
Leu Met Gly Thr Lys Glu His
610 615
<210> 163
<211> 615
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 163
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp
450 455 460
Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met
465 470 475 480
Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn
485 490 495
Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala
500 505 510
Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln
515 520 525
Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Glu
530 535 540
Val Ser Glu Lys Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys
545 550 555 560
Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu
565 570 575
Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys
580 585 590
Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile
595 600 605
Leu Met Gly Thr Lys Glu His
610 615
<210> 164
<211> 615
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 164
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser Ser Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp
450 455 460
Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met
465 470 475 480
Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn
485 490 495
Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala
500 505 510
Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln
515 520 525
Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Glu
530 535 540
Val Ser Glu Glu Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys
545 550 555 560
Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu
565 570 575
Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys
580 585 590
Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile
595 600 605
Leu Met Gly Thr Lys Glu His
610 615
<210> 165
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 165
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
20 25 30
Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr
85 90 95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
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165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 166
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 166
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
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290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450

Claims (39)

1.一种突变白细胞介素-7(IL-7)多肽，其在选自下组的位置包含至少一种氨基酸取代：根据SEQ ID NO:52的人IL-7的E13、V15、V18、D21、Q22、D25、T72、L77、K81、E84、G85、I88、Q136、K139、N143和M147。
2.根据权利要求1所述的突变白细胞介素-7多肽，其中所述氨基酸取代选自下组：E13A、E13K、V15A、V15K、V18A、V18K、D21A、D21K、Q22A、Q22K、D25A、D25K、T72A、L77A、L77K、K81A、K81E、E84A、G85K、G85E、I88K、Q136A、Q136K、K139A、K139E、N143K和M147A。
3.根据权利要求1或2所述的突变白细胞介素-7多肽，其中所述氨基酸取代选自下组：V15A、V15K、V18A、V18K、L77A、L77K、K81E、G85K、G85E、I88K和N143K。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的突变白细胞介素-7多肽，其至少包含所述氨基酸取代K81E和G85K或K81E和G85E。
5.一种免疫缀合物，其包含(i)根据权利要求1至4中任一项所述的突变IL-7多肽和(ii)与PD-1结合的抗体。
6.根据权利要求5所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3、和在根据Kabat编号的位置71至73处含有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的FR-H3；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含：含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2、和含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。
7.根据权利要求5所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含：含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H2、和含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；以及(b)轻链可变区(VL)，其包含：含有SEQ IDNO:11的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HVR-L2、和含有SEQ IDNO:13的氨基酸序列的HVR-L3。
8.根据权利要求5所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和(b)轻链可变区(VL)，其包含与选自由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含不超过一个突变IL-7多肽。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含包括第一亚基和第二亚基的Fc结构域。
11.根据权利要求10所述的免疫缀合物，其中所述Fc结构域是IgG类Fc结构域，特别是IgG1亚类Fc结构域。
12.根据权利要求10或11所述的免疫缀合物，其中所述Fc结构域是人Fc结构域。
13.根据权利要求5至12中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体是IgG类免疫球蛋白，特别是IgG1亚类免疫球蛋白。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的免疫缀合物，其中所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基的缔合的修饰。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的免疫缀合物，其中在所述Fc结构域的所述第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第一亚基的CH3结构域内产生突起，所述突起可定位在所述第二亚基的CH3结构域内的空腔中；并且在所述Fc结构域的所述第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第二亚基的CH3结构域内产生空腔，所述第一亚基的CH3结构域内的所述突起可定位在所述空腔内。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的免疫缀合物，其中在所述Fc结构域的所述第一亚基中，位置366处的苏氨酸残基被色氨酸残基替换(T366W)；并且在所述Fc结构域的所述第二亚基中，位置407处的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)，并且任选地，位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基替换(T366S)，且位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L368A)(根据Kabat EU索引编号)。
17.根据权利要求16所述的免疫缀合物，其中在所述Fc结构域的所述第一亚基中，另外地，位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)；并且在所述Fc结构域的所述第二亚基中，另外地，位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。
18.根据权利要求10至17中任一项所述的免疫缀合物，其中所述突变IL-7多肽在其氨基末端氨基酸处与所述Fc结构域的所述亚基中的一个亚基的羧基末端氨基酸融合，特别是与所述Fc结构域的所述第一亚基的羧基末端氨基酸融合，任选地通过接头肽进行融合。
19.根据权利要求18所述的免疫缀合物，其中所述接头肽具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
20.根据权利要求10至18中任一项所述的免疫缀合物，其中所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体，特别是Fcγ受体的结合，和/或降低效应子功能，特别是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
21.根据权利要求20所述的免疫缀合物，其中所述一个或多个氨基酸取代位于选自L234、L235和P329(Kabat EU索引编号)的组的一个或多个位置处。
22.根据权利要求10至21中任一项所述的免疫缀合物，其中所述Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)。
23.根据权利要求5至22中任一项所述的免疫缀合物，其包含：含有与SEQ ID NO:85的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:86的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，和含有与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ IDNO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:137和SEQ ID NO:138。
24.根据权利要求5至23中任一项所述的免疫缀合物，其基本上由通过接头序列接合的突变IL-7多肽和IgG1免疫球蛋白分子组成。
25.一种或多种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至4中任一项所述的突变IL-7多肽或根据权利要求5至24中任一项所述的免疫缀合物。
26.一种或多种载体，特别是表达载体，所述载体包含根据权利要求23所述的多核苷酸。
27.一种宿主细胞，其包含根据权利要求23所述的多核苷酸或根据权利要求24所述的载体。
28.一种生产突变IL-7多肽或包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物的方法，其包括(a)在适合于表达所述突变IL-7多肽或所述免疫缀合物的条件下培养根据权利要求26所述的宿主细胞，以及任选地(b)回收所述突变IL-7多肽或所述免疫缀合物。
29.一种突变IL-7多肽或包含突变IL-7多肽和与PD-1结合的抗体的免疫缀合物，其通过根据权利要求28所述的方法生产。
30.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至4或权利要求29中任一项所述的突变IL-7多肽或根据权利要求5至24或权利要求29中任一项所述的免疫缀合物以及药用载体。
31.根据权利要求1至4或权利要求29中任一项所述的突变IL-7多肽或根据权利要求5至24或权利要求29中任一项所述的免疫缀合物，其用作药物。
32.根据权利要求1至4或权利要求29中任一项所述的突变IL-7多肽或根据权利要求5至24或权利要求29中任一项所述的免疫缀合物，其用于治疗疾病。
33.根据权利要求32所述的用于治疗疾病的突变IL-7多肽或免疫缀合物，其中所述疾病是癌症。
34.根据权利要求1至4或权利要求29中任一项所述的突变IL-7多肽或根据权利要求5至24或权利要求29中任一项所述的免疫缀合物在制造用于治疗疾病的药物中的用途。
35.根据权利要求34所述的用途，其中所述疾病是癌症。
36.一种治疗个体的疾病的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含呈药用形式的根据权利要求1至5或权利要求29中任一项所述的突变IL-7多肽或根据权利要求4至24或权利要求29中任一项所述的免疫缀合物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述疾病是癌症。
38.一种刺激个体的免疫系统的方法，其包括向所述个体施用有效量的组合物，所述组合物包含呈药用形式的根据权利要求1至4和权利要求29中任一项所述的突变IL-7多肽或根据权利要求5至24或权利要求29中任一项所述的免疫缀合物。
39.如前所述的本发明。
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