KR20230004494A - 면역접합체 - Google Patents

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KR20230004494A
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데크 로라 코다리
안네 프라이모저-그룬드쇼베르
크리스티안 클라인
로라 로이너
에케하르트 뫼스너
파블로 우마나
신디 슐렌부르크
엘레니 마리아 바리파타키
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본원 발명은 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드, 면역접합체, 특히 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체에 전반적으로 관계한다. 이에 더하여, 본원 발명은 이들 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드 또는 면역접합체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자, 그리고 이런 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관계한다. 본원 발명은 이들 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법, 면역접합체, 이들을 포함하는 제약학적 조성물, 그리고 이들의 용도에 더욱 관계한다.

Description

면역접합체
발명의 분야
본원 발명은 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드, 면역접합체, 특히 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체에 전반적으로 관계한다. 이에 더하여, 본원 발명은 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드 또는 면역접합체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자, 그리고 이런 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관계한다. 본원 발명은 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드 또는 면역접합체를 생산하기 위한 방법, 이들을 포함하는 제약학적 조성물, 그리고 이들의 용도에 더욱 관계한다.
배경
인터류킨-7 (IL-7)은 림프양 조직에서 기질 세포에 의해 주로 분비되는 사이토킨이다. 이것은 예를 들면 다분화성 조혈 줄기 세포의 림프모구로의 분화를 자극함으로써, 림프구의 성숙에 관련된다. IL-7은 T-세포 발달과 생존뿐만 아니라 성숙 T-세포 항상성에 필수적이다. IL-7의 결여는 미성숙 면역 세포 정지를 야기한다 (Lin J. et al. (2017), Anticancer Res. 37(3):963-967).
IL-7은 IL-7 수용체에 결합하는데, 이것은 IL-7R 알파 사슬 (IL-7Rα, CD127)뿐만 아니라 통상적인 감마 사슬 (γc, CD132, IL-2Rγ)로 구성되고, 인터류킨 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21과 상호적이다 (Rochman Y. et al., (2009) Nat Rev Immunol. 9:480-490). γc는 대부분의 조혈 세포에 의해 발현되는 반면, IL-7Rα는 거의 배타적으로 림프 계통의 세포에 의해 발현된다 (Mazzucchelli R. and Durum S.K. (2007) Nat Rev Immunol. 7(2):144-54). IL-7Rα는 미경험부터 효과기까지 T 세포의 분화 내내 이들의 표면 상에서 발견되는 반면, 이의 발현은 종말 분화된 T 세포에서 감소되고 조절 T 세포의 표면에 거의 부재한다. IL-7Rα mRNA 및 단백질 발현 수준은 IL-2에 의해 음성적으로 조절되고, 이런 이유로 IL-7Rα는 IL-2Rα (CD25)를 발현하는 최근에 활성화된 T 세포에서 하향조절되는데 (Xue H.H, et al. 2002, PNAS.99(21):13759-64), 이러한 기전은 최근에 초회감작된 T 세포의 IL-2 매개된 신속한 클론 확장을 담보하는 반면, IL-7 역할은 모든 T 세포 클론을 동등하게 유지하는 것이다. IL-7Rα는 또한, PD-1 차단에 반응하는 암 환자의 종양에서 발견되는 CD8 T 세포의 새로 특징화된 전구체 모집단, TCF-1+ PD-1+ 줄기 유사 CD8 T 세포에서 최근에 설명되었다 (Hudson et al., 2019, Immunity 51, 1043-1058; Im et al., PNAS, vol. 117, no. 8, 4292-4299; Siddiqui et al., 2019, Immunity 50, 195-211; Held et al., Sci. , Transl. Med. 11; eaay6863 (2019); Vodnala and Restifo, Nature, Vol 576, 19/26 December 2019). 비록 현재까지, 줄기 유사 CD8 T 세포에 대한 IL-7의 효과에 관한 과학적인 설명이 없긴 하지만, IL-7은 관문 저해제에 반응하는 환자 수를 증가시키기 위해 종양 반응성 T 세포의 이러한 모집단을 확대하는 데 이용될 수 있었다.
IL-7, IL-7Rα 및 γc는 삼원 복합체를 형성하는데, 이것은 JAK/STAT (야누스 키나아제 (JAK)-신호전달기 및 전사 활성인자 (STAT)) 경로뿐만 아니라 PI3K/Akt (포스파티딜이노시톨 3-키나아제 (PI3K), 세린/트레오닌 단백질 키나아제, 단백질 키나아제 B (AKT)) 신호전달 캐스케이드를 통해 신호하여, B 세포와 T 세포의 발달과 항상성을 야기한다 (Niu N. and Qin X. (2013) Cell Mol Immunol. 10(3):187-189, Jacobs et al., (2010), J Immunol.184(7): 3461-3469).
IL-7은 25 kDa 4-나선 다발, 단량체성 단백질이다. 나선 길이는 13개부터 22개 아미노산까지 다양한데, 이것은 인터류킨에 결합하는 다른 통상적인 감마 사슬 (γc, CD132, IL-2Rγ)의 나선 길이와 유사하다. 하지만, IL-7은 A 나선에서 고유한 회전 모티프를 보여주는데, 이것은 IL-7/IL-7Rα 상호작용을 안정시키는 것으로 밝혀졌다 (McElroy, C.A. et al., (2009) Structure 17: 54-65). A 나선은 수용체 사슬 IL-7Rα 및 γc 둘 모두와 상호작용하는 반면, C 나선은 IL-7Rα와 주로 상호작용하고 D 나선은 γc 사슬과 주로 상호작용한다 (PDB:3DI2 및 PDB:2ERJ에 기초된 서열 및 구조적 정렬).
예정된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1 또는 CD279)은 CD28, CTLA-4, ICOS 및 BTLA를 또한 포함하는, 수용체의 CD28 패밀리의 저해성 구성원이다. PD-1은 세포 표면 수용체이고, 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포 상에서 발현된다 (Okazaki et al (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8). PD-1의 구조는 하나의 면역글로불린 가변 유사 세포외 도메인, 그리고 면역수용체 티로신 기반 저해 모티프 (ITIM) 및 면역수용체 티로신 기반 스위치 모티프 (ITSM)를 내포하는 세포질 도메인으로 구성되는 단량체성 유형 1 막경유 단백질이다. PD-1에 대한 두 개의 리간드, PD-Ll 및 PD-L2가 확인되었는데, 이들은 PD-1에 결합 시에 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 밝혀졌다 (Freeman et al (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter etal (2002) Eur J Immunol 32:634-43). PD-Ll 및 PD-L2 둘 모두 PD-1에는 결합하지만 다른 CD28 패밀리 구성원에는 결합하지 않는 B7 동족체이다. PD-1에 대한 하나의 리간드, PD-Ll은 다양한 인간 암에서 풍부하다 (Dong et al (2002) Nat. Med 8:787-9). PD-1 및 PD-Ll 사이의 상호작용은 종양 침윤 림프구에서 감소, 암성 세포에 의한 면역 회피를 가능하게 하는 T 세포 수용체 매개된 증식에서 감소를 야기한다 (Dong et al. (2003) J. MoI. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). 면역 억제는 PD-1의 PD-Ll와의 국부 상호작용을 저해함으로써 반전될 수 있고, 이러한 효과는 PD-1의 PD-L2와의 상호작용이 차단될 때에도 부가적이다 (Iwai et al. (2002) Proc. Nat 7. Acad. ScL USA 99: 12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66).
PD-1에 결합하는 항체는 예를 들면 WO 2017/055443 A1에서 설명된다.
발명의 요약
본원 발명은 PD-1에 결합하는 항체에 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드의 접합을 통해, 종양 세포보다는 면역 효과기 세포, 예컨대 세포독성 T 림프구에 직접적으로 면역요법을 위한 유리한 특성을 갖는 IL-7의 돌연변이체 형태를 표적으로 하는 신규한 접근법을 제공한다. 이것은 IL-7 돌연변이체의 PD-1 발현 면역 부분집합, 특히 종양 반응성 T 세포 예를 들면 CD8+ PD1+ TCF+ T 세포 부분집합 및 이들의 자손으로의 시스-전달을 야기한다.
본원 발명에서 이용된 IL-7 돌연변이체는 사이토킨 면역요법과 연관된 문제점, 특히 VLS의 유도에 의해 유발된 독성, AICD의 유도에 의해 유발된 종양 내성, 그리고 Treg 세포의 활성화에 의해 유발된 면역억제를 극복하도록 설계되었다. 앞서 언급된 바와 같은 종양-표적화로부터 종양의 탈출을 회피하는 것에 더하여, IL-7 돌연변이체의 면역 효과기 세포로의 표적화는 CTL보다 Treg 상에서 더 낮은 PD-1 및 IL-7Rα 발현 수준으로 인해 면역억제성 Treg 세포에 비하여 종양 특이적 CTL의 우선적 활성화를 더욱 증가시킬 수 있다. PD-1에 결합하는 항체를 이용함으로써, PD-1 및 이의 리간드 PD-L1의 상호작용에 의해 유도된 T-세포 활성의 억제가 추가적으로 반전되어, 면역 반응을 더욱 증강할 수 있다.
일반적인 양상에서, 본원 발명은 서열 번호: 52에 따른 인간 IL-7의 E13, V15, V18, D21, Q22, D25, T72, L77, K81, E84, G85, I88, Q136, K139, N143 및 M147의 군에서 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이체 인터류킨-7 (IL-7) 폴리펩티드를 제공한다; 다시 말하면 넘버링은 서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열에 상대적이다. 본원 발명의 일부 구체예에서, 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 E13A, E13K, V15A, V15K, V18A, V18K, D21A, D21K, Q22A, Q22K, D25A, D25K, T72A, D74K, L77A, L77K, K81A, K81E, E84A, G85K, G85E, I88K, Q136A, Q136K, K139A, K139E, N143K 및 M147A의 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 V15A, V15K, V18A, V18K, L77A, L77K, K81E, G85K, G85E, I88K 및 N143K의 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 70, 서열 번호: 71, 서열 번호: 72, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74, 서열 번호: 75, 서열 번호: 76, 서열 번호: 77, 서열 번호: 78, 서열 번호: 79, 서열 번호: 80, 서열 번호: 135 및 서열 번호: 136의 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 70, 서열 번호: 72, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74, 서열 번호: 79, 서열 번호: 135 및 서열 번호: 136의 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 본원 발명은 위치 72, 93 및 118의 군에서 선택되는 위치에서 IL-7의 N-글리코실화 부위를 제거하는 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드를 제공한다. 치환은 T72A, T93A 및 S118A의 군에서 선택될 수 있다. 다른 양상에서, 본원 발명은 아미노산 치환 T72A, T93A 및 S118A를 포함하는 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드를 제공한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨 7 폴리펩티드는 서열 번호: 81, 서열 번호: 82, 서열 번호: 83 및 서열 번호: 84의 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 본원 발명은 적어도 아미노산 치환 K81E 및 G85K 또는 K81E 및 G85E를 포함하는 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드를 제공한다. 본원 발명의 일부 구체예에서, 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 135 또는 서열 번호: 136의 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 본원에서 개시된 바와 같은 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 비-IL-7 모이어티에 연결된다. 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 첫 번째와 두 번째 비-IL-7 모이어티에 연결될 수 있다. 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 상기 첫 번째 비-IL-7 모이어티와의 카르복시 말단 펩티드 결합 및 상기 두 번째 비-IL-7 모이어티와의 아미노 말단 펩티드 결합을 공유할 수 있다. 비-IL-7 모이어티는 항원 결합 모이어티 또는 면역 효과기 세포 결합 모이어티, 바람직하게는 PD-1 결합 모이어티일 수 있다.
다른 양상에서, 본원 발명은 (i) 본원에서 개시된 바와 같은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 (ii) PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 본원 발명에 따른 면역접합체의 일부 구체예에서, 항체는 (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 Kabat 넘버링에 따른 위치 71-73에서 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
본원 발명에 따른 면역접합체의 일부 구체예에서, 항체는 (a) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
본원 발명에 따른 면역접합체의 일부 구체예에서, 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
본원 발명의 면역접합체의 바람직한 구체예에서, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 70, 서열 번호: 72, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74 , 서열 번호: 79, 서열 번호: 135 및 서열 번호: 136의 군에서 선택되는 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 면역접합체는 1개 이하의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 첫 번째와 두 번째 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함한다. 일부 이런 구체예에서, Fc 도메인은 IgG 부류, 특히 IgG1 하위부류, Fc 도메인이고, 및/또는 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 일부 구체예에서, 항체는 IgG 부류, 특히 IgG1 하위부류 면역글로불린이다.
면역접합체가 Fc 도메인을 포함하는 일부 구체예에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 첫 번째와 두 번째 아단위의 연결을 증진하는 변형을 포함한다.
일부 구체예에서, Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 두 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 공동에서 위치 가능한 첫 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 생성되고, Fc 도메인의 두 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 첫 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 위치 가능한 두 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 공동이 생성된다. 일부 구체예에서, Fc 도메인의 첫 번째 아단위 내에 위치 366에서 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기 (T366W)로 대체되고, Fc 도메인의 두 번째 아단위 내에 위치 407에서 티로신 잔기가 발린 잔기 (Y407V)로 대체되고, 임의적으로 위치 366에서 트레오닌 잔기가 세린 잔기 (T366S)로 대체되고 위치 368에서 류신 잔기가 알라닌 잔기 (L368A)로 대체된다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링). 일부 이런 구체예에서, Fc 도메인의 첫 번째 아단위 내에 추가적으로 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기 (S354C)로 대체되거나 또는 위치 356에서 글루타민산 잔기가 시스테인 잔기 (E356C)로 대체되고, Fc 도메인의 두 번째 아단위 내에 추가적으로 위치 349에서 티로신 잔기가 시스테인 잔기 (Y349C)에 의해 대체된다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링). 일부 구체예에서, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 임의적으로 링커 펩티드를 거쳐, 자체의 아미노 말단 아미노산에서 Fc 도메인의 아단위 중 하나, 특히 Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 카르복시 말단 아미노산에 융합된다. 일부 이런 구체예에서, 링커 펩티드는 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 갖는다
면역접합체가 Fc 도메인을 포함하는 일부 구체예에서, Fc 도메인은 Fc 수용체, 특히 Fcγ 수용체에 결합, 및/또는 효과기 기능, 특히 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC)을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 이런 구체예에서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 L234, L235 및 P329 (Kabat EU 색인 넘버링)의 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에 있다. 일부 구체예에서, Fc 도메인의 각 아단위는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G (Kabat EU 색인 넘버링)를 포함한다.
일부 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역접합체는 서열 번호: 85의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 86의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호: 90, 서열 번호: 91, 서열 번호: 92, 서열 번호: 93, 서열 번호: 102, 서열 번호: 103, 서열 번호: 105, 서열 번호: 107, 서열 번호: 108, 서열 번호: 109, 서열 번호: 114, 서열 번호: 137 및 서열 번호: 138의 군에서 선택되는 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역접합체는 링커 서열에 의해 연결된, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 IgG1 면역글로불린 분자로 본질적으로 구성된다.
돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 생산하는 방법 역시 제공되는데, 상기 방법은 (a) 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 면역접합체의 발현에 적합한 조건하에 본원 발명의 숙주를 배양하는 단계, 및 임의적으로 (b) 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 면역접합체를 회수하는 단계를 포함한다. 상기 방법에 의해 생산된, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체 역시 본원 발명에 의해 제공된다.
본원 발명은 본원 발명의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 본원 발명의 면역접합체 및 제약학적으로 허용되는 운반체를 포함하는 제약학적 조성물, 그리고 본원 발명의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 면역접합체를 이용하는 방법을 더욱 제공한다.
특히, 본원 발명은 약제로서 이용을 위한, 그리고 질환의 치료에서 이용을 위한 본원 발명에 따른 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 본원 발명에 따른 면역접합체를 포괄한다. 특정한 구체예에서, 상기 질환은 암이다.
질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 본원 발명에 따른 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 본원 발명에 따른 면역접합체의 용도 역시 본원 발명에 의해 포괄된다. 특정한 구체예에서, 상기 질환은 암이다.
개체에서 질환을 치료하는 방법이 더욱 제공되는데, 상기 방법은 제약학적으로 허용되는 형태에서 본원 발명에 따른 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 본원 발명에 따른 면역접합체를 포함하는 조성물의 치료 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 질환은 암이다.
개체의 면역계를 자극하는 방법 역시 제공되는데, 상기 방법은 제약학적으로 허용되는 형태에서 본원 발명에 따른 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 본원 발명에 따른 면역접합체를 포함하는 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1a: 2개의 Fab 도메인 (가변 도메인, 불변 도메인), 이종이합체성 Fc 도메인 및 상기 Fc 도메인의 C 말단에 융합된 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함하는 IgG-IL-7 면역접합체 형식의 개략적 표시.
도 1b: 2개의 Fab 도메인 (가변 도메인, 불변 도메인), 동종이합체성 Fc 도메인 및 상기 Fc 도메인의 C 말단에 융합된 2개의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함하는 다른 IgG-IL-7 면역접합체 형식의 개략적 표시.
도 1c: 1개의 Fab 도메인 (가변 도메인, 불변 도메인), 이종이합체성 Fc 도메인 및 상기 Fc 도메인의 C 말단에 융합된 1개의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함하는 다른 IgG-IL-7 면역접합체 형식의 개략적 표시.
도 1d: 2개의 Fab 도메인 (가변 도메인, 불변 도메인), 이종이합체성 Fc 도메인 및 이들 Fab 도메인 중 하나의 N 말단에 융합된 1개의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함하는 다른 IgG-IL-7 면역접합체 형식의 개략적 표시.
도 1e: 2개의 Fab 도메인 (가변 도메인, 불변 도메인), 동종이합체성 Fc 도메인 및 이들 Fab 도메인의 N 말단에 융합된 2개의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함하는 다른 IgG-IL-7 면역접합체 형식의 개략적 표시.
도 2a-h: 증가하는 용량의 PD1-IL7 변이체로 PD-1+ CD4 T세포의 처리 시에 STAT5-인산화에 의한 IL-7R 신호전달. PD1-IL7 변이체의 IL-7 모이어티는 IL7Rα에 대한 친화성을 감소시키기 위한 돌연변이를 내포한다. STAT5-P는 정규화된 STAT5-P로서 묘사되는데, 여기서 100%는 66 nM의 PD1-IL7 wt로 처리 시에 STAT5-P+ 세포의 빈도와 동등하다.
도 2a는 변이체 1-4에 대한 정규화된 STAT-5 인산화를 도시한다.
도 2b는 변이체 5-8에 대한 정규화된 STAT-5 인산화를 도시한다.
도 2c는 변이체 9-12에 대한 정규화된 STAT-5 인산화를 도시한다.
도 2d는 변이체 13-16에 대한 정규화된 STAT-5 인산화를 도시한다.
도 2e는 변이체 17-20에 대한 정규화된 STAT-5 인산화를 도시한다.
도 2f는 변이체 21-24에 대한 정규화된 STAT-5 인산화를 도시한다.
도 2g는 변이체 25-28에 대한 정규화된 STAT-5 인산화를 도시한다.
도 2h는 변이체 29-32에 대한 정규화된 STAT-5 인산화를 도시한다.
도 3a-c: PD1-IL7v에 의한 PD-1 정착 시에 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드의 PD-1+ CD4 T세포의 IL-7Rα/IL-2Rγ로의 시스 전달의 사정.
도 3a는 0.66 nM의 PD1-IL7 돌연변이체 및 PD1-IL7wt로 자극 시에 인간 활성화된 PD1+ CD4 T 세포에서 STAT-5P의 빈도로서 묘사된 IL-7R 신호전달 (STAT5-P)을 도시한다. 각 부호는 별개의 공여자를 나타내고, 수평선은 N=4에서 중앙값을 표시한다.
도 3b는 PD1 미리 차단된 활성화된 CD4 T세포에서 정규화된 STAT5-P를 도시하고, IL7v의 PD1 독립된 전달을 보여준다. 100%의 정규화된 STAT5-P는 PD1 미리 차단된 CFSE 표지화된 CD4 T세포와 공동배양된 CTV 표지화된 PD1+ T세포에서 STAT5-P+의 빈도로서 규정된다.
도 3c는 PD1 차단된 세포에서 정규화된 STAT5-P (x 축) 대 PD1+ T세포에서 STAT5+의 빈도 (y 축)의 상관을 보여준다. 각 반점은 하나의 PD1-IL7v의 평균 ± SEM을 나타내는데, 여기서 관심되는 돌연변이체는 검은색으로 묘사되고 표지화된다.
도 4a-f: PD1-IL7v에 의한 PD-1 정착 시에 IL-7v의 PD-1+ CD4 T 세포의 IL-7Rα/IL-2Rγ로의 시스 전달에 대하여 STAT5-인산화에 의한 효능 사정.
도 4a는 PD1-IL7 돌연변이체에 12 분 노출 시에, 공동배양된 인간 PD1+ 비-차단된 (실선) 및 PD-1 미리 차단된 (점선) CD4 T 세포에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 PD1-IL7-VAR3 및 PD1-IL7-VAR4의 IL-7R 신호전달 (STAT5-P)을 도시한다. 4명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 4b는 PD1-IL7 돌연변이체에 12 분 노출 시에, 공동배양된 인간 PD1+ 비-차단된 (실선) 및 PD-1 미리 차단된 (점선) CD4 T 세포에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 PD1-IL7-VAR6 및 PD1-IL7-VAR16의 IL-7R 신호전달 (STAT5-P)을 도시한다. 4명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 4c는 PD1-IL7 돌연변이체에 12 분 노출 시에, 공동배양된 인간 PD1+ 비-차단된 (실선) 및 PD-1 미리 차단된 (점선) CD4 T 세포에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 PD1-IL7-VAR18 및 PD1-IL7-VAR20의 IL-7R 신호전달 (STAT5-P)을 도시한다. 4명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 4d는 PD1-IL7 변이체에 12 분 노출 시에, 공동배양된 인간 PD1+ 비-차단된 (실선) 및 PD-1 미리 차단된 (점선) CD4 T 세포에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 PD1-IL7-VAR21 및 PD1-IL7-VAR27의 IL-7R 신호전달 (STAT5-P)을 도시한다. 4명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 4e는 0.66 nM의 PD1-IL7 돌연변이체 및 PD1-IL7wt로 자극 시에 인간 활성화된 PD1+ CD4 T세포에서 STAT-5의 빈도로서 묘사된 IL-7R 신호전달 (STAT5-P)을 도시한다.
도 4f는 PD1+ 미리 차단된 활성화된 CD4 T세포에서 정규화된 STAT5-P를 도시하고, IL7v의 PD1 독립된 전달의 영향을 보여준다. 100%의 정규화된 STAT5-P는 PD1 미리 차단된 활성화된 CD4 T세포와 공동배양된 PD1+ T세포에서 STAT5-P+의 빈도로서 규정된다. 도 4e 및 4f의 경우에 각 부호는 별개의 공여자를 나타내고, 수평선은 N=8에서 중앙값을 표시한다.
도 5a-f: 별개로 배양된 PD1 차단 및 PD-1 발현 CD4+ T세포에서 IL-7R 신호전달 (STAT5-P).
도 5a: PD1-IL7 돌연변이체에 12 분 노출 시에, 인간 PD1+ (실선) 및 PD-1 미리 차단된 (점선) CD4 T 세포에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 PD1-IL7-VAR3 및 PD1-IL7-VAR4의 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 4명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 5b: PD1-IL7 돌연변이체에 12 분 노출 시에, 인간 PD1+ (실선) 및 PD-1 미리 차단된 (점선) CD4 T 세포에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 PD1-IL7-VAR5 및 PD1-IL7-VAR6의 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 4명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 5c: PD1-IL7 돌연변이체에 12 분 노출 시에, 인간 PD1+ (실선) 및 PD-1 미리 차단된 (점선) CD4 T 세포에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 PD1-IL7-VAR15 및 PD1-IL7-VAR16의 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 4명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 5d: PD1-IL7 돌연변이체에 12 분 노출 시에, 인간 PD1+ (실선) 및 PD-1 미리 차단된 (점선) CD4 T 세포에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 PD1-IL7-VAR18 및 PD1-IL7-VAR20의 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 4명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 5e: PD1-IL7 돌연변이체에 12 분 노출 시에, 인간 PD1+ (실선) 및 PD-1 미리 차단된 (점선) CD4 T 세포에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 PD1-IL7-VAR21 및 PD1-IL7-VAR22의 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 4명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 5f: PD1-IL7 돌연변이체에 12 분 노출 시에, 인간 PD1+ (실선) 및 PD-1 미리 차단된 (점선) CD4 T 세포에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 PD1-IL7-VAR27의 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 4명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 6은 PDl-IL7v 처리 시에 Treg 억제로부터 Tconv 효과기 기능의 구제를 보여준다. PD1-IL7 단일 돌연변이체의 존재에서 5 일의 공동배양 후 Tconv에 의해 분비된 그랜자임 B의 Treg에 의한 억제의 백분율. 각 부호는 별개의 공여자를 나타내고, 수평선은 N=5에서 중앙값을 표시한다. P는 일원 변량분석을 이용하여 계산되었다. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001).
도 7은 활성화된 PD-1+ 및 PD-1- CD4 T 세포에 대한 증가하는 용량의 참조 PD1-IL7 돌연변이체로 처리 시에 IL-7R 신호전달 (STAT5-P)을 도시한다. 참조 PD1-IL7 돌연변이체로 처리 시에, 공동배양된 PD-1- (항-PD-1로 전처리됨) 및 PD-1+ CD4 T 세포에서 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 12 분 노출 시에, 공동배양된 PD-1+ (실선) 및 PD-1 (항-PD-1로 전처리됨) (점선) CD4 T 세포에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 6명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 8a는 활성화된 PD-1+ 및 PD-1- CD4 T 세포에 대한 증가하는 용량의 PD1-IL7 단일 및 이중 돌연변이체로 처리 시에 IL-7R 신호전달 (STAT5-P)을 도시한다. PD1-IL7 돌연변이체 (VAR18, VAR21)로 처리 시에, 공동배양된 PD-1- (항-PD-1로 전처리됨) 및 PD-1+ CD4 T 세포에서 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 12 분 노출 시에, 공동배양된 PD-1+ (실선) 및 PD-1 (항-PD-1로 전처리됨) (점선) CD4 T 세포에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 4명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 8b는 활성화된 PD-1+ 및 PD-1- CD4 T 세포에 대한 증가하는 용량의 PD1-IL7 단일 및 이중 돌연변이체로 처리 시에 IL-7R 신호전달 (STAT5-P)을 도시한다. PD1-IL7 돌연변이체 (참조 분자 2, VAR18/20, VAR18/21)로 처리 시에, 공동배양된 PD-1- (항-PD-1로 전처리됨) 및 PD-1+ CD4 T 세포에서 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 12 분 노출 시에, 공동배양된 PD-1+ (실선) 및 PD-1 (항-PD-1로 전처리됨) (점선) CD4 T 세포에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 4명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 9a는 증가하는 용량의 PD1-IL7 돌연변이체 (VAR18, VAR21)로 처리 시에, 활성화된 PD-1+ 대 새로 단리된 IL-7Ra+ CD4 T 세포에서 IL-7R 신호전달 (STAT5-P)을 도시한다. PD1-IL7 돌연변이체에 노출 시에, 공동배양된 활성화된 PD1+ IL-7Ralow 및 새로 단리된 PD1low IL-7Rahigh CD4 T 세포에서 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 12 분 노출 시에, 활성화된 PD1+ T 세포 (실선) 및 새로 단리된 IL-7Ra+ T 세포 (점선)에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 3명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 9b는 증가하는 용량의 PD1-IL7 돌연변이체 (참조 분자 2, VAR18/20, VAR18/21)로 처리 시에, 활성화된 PD-1+ 대 새로 단리된 IL-7Ra+ CD4 T 세포에서 IL-7R 신호전달 (STAT5-P)을 도시한다. PD1-IL7 돌연변이체에 노출 시에, 공동배양된 활성화된 PD1+ IL-7Ralow 및 새로 단리된 PD1low IL-7Rahigh CD4 T 세포에서 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 12 분 노출 시에, 활성화된 PD1+ T 세포 (실선) 및 새로 단리된 IL-7Ra+ T 세포 (점선)에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 3명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 10a-f: 동종특이적 PD-1+ CD4 T 세포의 세포독성 효과기 기능 및 증식에서 PD1-IL7 단일 및 이중 돌연변이체 기능적 활성. PD1-IL7 단일 및 이중 돌연변이체의 존재에서 5 일 후 CD4 T 세포의 그랜자임 B (GrzB) 분비 및 B 세포 림프아구성 세포주 (ARH-77)로의 증식으로서 세포독성 효과기 기능. 도 10a-c는 처리되지 않음에 대해 정규화된 GrzB+ CTV- CD4 T 세포 빈도의 배수 변화를 도시한다 (도 10a: PD1-IL7wt, PD1-IL7VAR18, PD1-IL7VAR21, PD1, PD1 + FAP-IL7wt, PD1 + FAP-IL7VAR18, PD1+FAP-IL7VAR21, FAP-IL7wt, FAP-IL7VAR18, FAP-IL7VAR21; 도 10b: PD1-IL7wt, PD1-IL7VAR18/20, PD1-IL7VAR18/21, PD1, PD1 + FAP-IL7wt, PD1 + FAP-IL7VAR18/20, PD1 + FAP-IL7VAR18/21, FAP-IL7wt, FAP-IL7VAR18/20, FAP-IL7VAR18/21; 도 10c: PD1-IL7wt, 참조 분자 2, PD1, PD1 + FAP-IL7wt, PD1 + FAP-IL7 SS2(1x), PD1 + FAP-IL7 SS2(2x), FAP-IL7wt, FAP-IL7 SS2(1x)). 도 10d-4는 처리되지 않음에 대해 정규화된 CTV의 MFI를 추출함으로써 계측된 증식을 도시한다 (도 10d: PD1-IL7wt, PD1-IL7VAR18, PD1-IL7VAR21, PD1, PD1 + FAP-IL7wt, PD1 + FAP-IL7VAR18, PD1+FAP-IL7VAR21, FAP-IL7wt, FAP-IL7VAR18, FAP-IL7VAR21; 도 10e: PD1-IL7wt, PD1-IL7VAR18/20, PD1-IL7VAR18/21, PD1, PD1 + FAP-IL7wt, PD1 + FAP-IL7VAR18/20, PD1 + FAP-IL7VAR18/21, FAP-IL7wt, FAP-IL7VAR18/20, FAP-IL7VAR18/21; 도 10f: PD1-IL7wt, 참조 분자 2, PD1, PD1 + FAP-IL7wt, PD1 + FAP-IL7 SS2(1x), PD1 + FAP-IL7 SS2(2x), FAP-IL7wt, FAP-IL7 SS2(1x)). 9명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 11: PD-1 기초된 대 표적화되지 않은 IL-7 돌연변이체 및 IL7wt에 의한 줄기 유사 T 세포, Treg 및 미경험 T 세포의 표적화. 불포화 농도에서 줄기 유사 T 세포, Treg 및 미경험 T 세포에 대한 PD1-IL7 돌연변이체 및 야생형 대 표적화되지 않은 IL-7 돌연변이체 및 야생형의 결합. 37 ℃에서 30 분 동안 건강한 공여자 PBMC에 대한 불포화 농도의 PD-1 표적화 대 FAP 표적화 VAR18, VAR21 및 야생형의 결합.
도 12: 인간 PD-1 유전자도입 생쥐의 생쥐 IL-7Ra 및 IL-2Rg에 대한 PD1-IL7 단일, 이중 돌연변이체 및 wt의 교차반응성. PD1-IL7 단일 및 이중 돌연변이체로 처리 시에 huPD1-유전자도입 생쥐의 비장으로부터 획득된 활성화된 huPD1+ CD4 T 세포에서 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 30 분 노출 시에 PD1-IL7wt에 대해 정규화된 STAT5-P의 MFI로서 묘사된 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 2마리의 생쥐의 평균 ± SEM.
도 13a-b: PD-1 차단 항체의 C 말단과 N 말단에 융합된 증가하는 용량의 IL-7 VAR18 (K81E), VAR21 및 야생형으로 처리 시에, 활성화된 PD-1+ 및 PD-1- CD4 T 세포에서 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). IL-7이 항체의 N 또는 C 말단에 융합된 PD1-IL7로 자극 시에, 공동배양된 PD1- (항-PD-1로 전처리됨) 및 PD1+ CD4 T 세포에서 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 12 분 노출 시에, 공동배양된 PD1+ (실선) 및 PD-1- (항-PD-1로 전처리됨) (점선) CD4 T 세포에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 IL-7R 신호전달 (STAT5-P) (도 13a: PD1-IL7wt, PD1-IL7VAR18, IL7wt G4SG5 PD1, IL7VAR18 G4SG5 PD1, PD1 + PD1-IL7wt, PD1 + PD1-IL7VAR18, PD1 + IL7wt G4SG5 PD1, PD1 + IL7VAR18 G4SG5 PD1; 도 13b: PD1-IL7wt, PD1-IL7VAR21, IL7wt G4SG5 PD1, IL7VAR21 G4SG5 PD1, PD1 + PD1-IL7wt, PD1 + PD1-IL7VAR21, PD1 + IL7wt G4SG5 PD1, PD1 + IL7VAR21 G4SG5 PD1). 3명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 14: PD1-IL7v 참조 분자로 처리 시에, 공동배양된 PD1 미리 차단된 및 PD1+ CD4+ T세포에서 IL-7R 신호전달 (STAT5-P). 12 분 노출 시에, 공동배양된 PD1+ (실선) 및 PD-1 미리 차단된 (점선) CD4 T 세포에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 IL-7R 신호전달 (STAT5-P) 6명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 15a-c는 단일 작용제로서 PD1-IL7v 변이체 18 (도 15a), PD1-IL7v 변이체 21 (도 15b) 및 PD-IL7wt (도 15c)를 이용한 효능 실험의 결과를 제공한다. 피하 모형에서 종양 성장 저해 (TGI)를 연구하기 위해, Panc02-Fluc 췌장 암종 세포주가 Black 6-huPD1 유전자도입 생쥐에 피하 주사되었다. 종양 크기가 캘리퍼스를 이용하여 계측되었다. 종양이 150 mm3에 도달할 때 요법이 시작되었다. 생쥐마다 주사된 항체의 양은 muPD1-IL7v 변이체 18과 변이체 21 및 PD1-IL7wt qw에 대해 1 mg/kg이었다. 치료는 2 주간 지속되었다. PD1-IL7v 변이체 21과 18은 운반제 군과 비교하여, 종양 성장 저해의 관점에서 유의미한 우수한 효능을 매개하였다. PD1-IL7wt 분자는 내약성이 좋지 않았고, 생쥐가 이차 투여 후 희생되어야 했기 때문에, TGI가 계산될 수 없었다.
발명의 상세한 설명
정의
용어는 하기에서 별도로 규정되지 않으면, 당해 분야에서 일반적으로 이용된 바와 같이 본원에서 이용된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "아미노산 돌연변이"는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변형을 포괄하는 것으로 의미된다. 최종 작제물이 원하는 특징, 예를 들면, IL-7Rα 및/또는 IL-2Rγ에 감소된 결합을 소유한다면, 최종 작제물에 도달하기 위해 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의의 조합이 만들어질 수 있다. 아미노산 서열 결실과 삽입은 아미노산의 아미노 및/또는 카르복시 말단 결실과 삽입을 포함한다. 말단 결실의 실례는 전장 인간 IL-7의 위치 1에서 잔기의 결실이다. 바람직한 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들면 IL-7 폴리펩티드의 결합 특징을 변경하는 목적으로, 비보존성 아미노산 치환, 다시 말하면, 한 가지 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것이 특히 바람직하다. 바람직한 아미노산 치환은 소수성 아미노산을 친수성 아미노산에 의해 대체하는 것을 포함한다. 아미노산 치환은 비-자연 발생 아미노산에 의한, 또는 20개의 표준 아미노산의 자연 발생 아미노산 유도체 (예를 들면 4-히드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-히드록실리신)에 의한 대체를 포함한다. 아미노산 돌연변이는 당해 분야에서 널리 공지된 유전학적 또는 화학적 방법을 이용하여 산출될 수 있다. 유전학적 방법은 특정 부위 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 유전공학 이외의 방법, 예컨대 화학적 변형에 의해 아미노산의 측쇄 기를 변경하는 방법 또한 유용할 수 있는 것으로 예기된다.
"친화성"은 분자 (예를 들면, 수용체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 파트너 (예를 들면, 리간드) 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 별도로 표시되지 않으면, 본원에서 이용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 (예를 들면, 항원 결합 모이어티 및 항원, 또는 수용체 및 이의 리간드) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리 상수 (KD)에 의해 표현될 수 있는데, 이것은 해리와 연관 속도 상수 (각각, k오프 및 k온)의 비율이다. 따라서, 동등한 친화성은 속도 상수의 비율이 동일하게 남아있기만 하면, 상이한 속도 상수를 포함할 수 있다. 친화성은 본원에서 설명된 것들을 비롯한, 당해 분야에서 공지된 충분히 확립된 방법에 의해 계측될 수 있다. 친화성을 계측하기 위한 특정 방법은 표면 플라스몬 공명 (SPR)이다.
IL-7은 IL-7 수용체에 결합하는데, 이것은 IL-7R 알파 사슬 (본원에서 IL-7R알파, IL-7Rα, IL7Rα, IL-7a, IL7Ra 또는 CD127로서 또한 지칭됨)뿐만 아니라 통상적인 감마 사슬 (본원에서 γc, CD132, IL-2R감마, IL-2Rg, IL2Rg, IL-2Rγ 또는 IL2Rγ로서 또한 지칭됨)로 구성되고, 인터류킨 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21과 상호적이다 (Rochman Y. et al., (2009) Nat Rev Immunol. 9:480-490).
IL-7 수용체에 대한 돌연변이체 또는 야생형 IL-7 폴리펩티드의 친화성은 표준 기계장치 예컨대 BIAcore 기기 (GE Healthcare)를 이용하여, 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 WO 2012/107417에서 진술된 방법에 따라서 결정될 수 있고, 수용체 아단위는 예컨대 재조합 발현에 의해 획득될 수 있다 (참조: 예를 들면 Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)). 대안으로, IL-7 수용체에 대한 IL-7 돌연변이체의 결합 친화성은 이러한 수용체의 한 가지 또는 다른 이런 형태를 발현하는 것으로 알려진 세포주를 이용하여 평가될 수 있다. 결합 친화성을 계측하기 위한 특정한 예시적이고 모범적인 구체예는 아래에 설명된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "인터류킨-7" 또는 "IL-7"은 별도로 표시되지 않으면, 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들면, 인간) 및 설치류 (예를 들면, 생쥐와 쥐)를 비롯한, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 선천적 IL7을 지칭한다. 상기 용어는 처리되지 않은 IL-7뿐만 아니라 세포에서 처리로부터 발생하는 IL-7의 임의의 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한, IL-7의 자연 발생 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다. 예시적인 인간 IL-7 의 아미노산 서열은 서열 번호: 52에서 도시된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "IL-7 돌연변이체" 또는 "돌연변이체 IL-7 폴리펩티드"는 전장 IL-7, IL-7의 절두된 형태 및 IL-7이 예컨대 융합 또는 화학적 접합에 의해 다른 분자에 연결되는 형태를 비롯한 다양한 형태의 IL-7 분자의 임의의 돌연변이체 형태를 포괄하는 것으로 의도된다. IL-7과 관련하여 이용될 때 "전장"은 성숙, 자연 길이 IL-7 분자를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 전장 인간 IL-7은 서열 번호: 52에 따른 폴리펩티드 서열을 갖는 분자를 지칭한다. 다양한 형태의 IL-7 돌연변이체는 IL-7의 IL7R알파 및/또는 IL2R감마와의 상호작용에 영향을 주는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 갖는 것으로 특징화된다. 이러한 돌연변이는 상기 위치에서 정상적으로 위치되는 야생형 아미노산 잔기의 치환, 결실, 절두 또는 변형을 수반할 수 있다. 아미노산 치환에 의해 획득된 돌연변이체가 선호된다. 별도로 표시되지 않으면, IL-7 돌연변이체는 본원에서 돌연변이체 IL-7 펩티드 서열, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드, 돌연변이체 IL-7 단백질, 돌연변이체 IL-7 유사체 또는 IL-7 변이체로서 지칭될 수 있다.
다양한 형태의 IL-7의 지정은 본원에서 서열 번호: 52에서 도시된 서열에 대해 이루어진다. 다양한 지정은 동일한 돌연변이를 표시하기 위해 본원에서 이용될 수 있다. 예를 들면 위치 15에서 발린에서 알라닌으로의 돌연변이는 15A, A15, A15, V15A, 또는 Val15Ala로서 표시될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "인간 IL-7 분자"는 서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 96% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 IL-7 분자인 것으로 의미된다. 특히, 서열 동일성은 적어도 약 95%, 더욱 특히 적어도 약 96%이다. 특정한 구체예에서, 인간 IL-7 분자는 전장 IL-7 분자이다.
본원에서 이용된 바와 같이, IL-7의 "야생형" 형태는 이러한 야생형 형태가 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드의 각 아미노산 위치에서 야생형 아미노산을 갖는다는 점을 제외하고, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드와 다른 모든 면에서 동일한 IL-7의 형태이다. 예를 들면, 만약 IL-7 돌연변이체가 전장 IL-7 (다시 말하면 임의의 다른 분자에 융합되거나 또는 접합되지 않은 IL-7)이면, 이러한 돌연변이체의 야생형 형태는 전장 선천적 IL-7이다. 만약 IL-7 돌연변이체가 IL-7 및 IL-7의 하류에 인코딩된 다른 폴리펩티드 (예를 들면 항체 사슬) 사이의 융합이면, 이러한 IL-7 돌연변이체의 야생형 형태는 동일한 하류 폴리펩티드에 융합된 야생형 아미노산 서열을 갖는 IL-7이다. 게다가, 만약 IL-7 돌연변이체가 IL-7의 절두된 형태 (IL-7의 비절두된 부분 내에 돌연변이되거나 또는 변형된 서열)이면, 이러한 IL-7 돌연변이체의 야생형 형태는 야생형 서열을 갖는, 유사하게 절두된 IL-7이다. 다양한 형태의 IL-7 돌연변이체의 IL-7 수용체 결합 친화성, IL-7 수용체 결합 또는 생물학적 활성을 IL-7의 상응하는 야생형 형태와 비교하는 목적으로, 용어 야생형은 자연 발생, 선천적 IL-7과 비교하여 IL-7 수용체 결합에 영향을 주지 않는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IL-7의 형태를 포괄한다. 본원 발명에 따른 일정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드가 비교되는 야생형 IL-7 폴리펩티드는 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함한다.
"조절 T 세포" 또는 "Treg 세포"는 말초 내성으로 불리는, 다른 T 세포의 반응을 억제할 수 있는 특수한 유형의 CD4+ T 세포인 것으로 의미된다. Treg 세포는 IL-2 수용체 (CD25)의 α-아단위의 상승된 발현, 낮거나 또는 부재하는 IL-7Rα (CD127) 및 전사 인자 포크헤드 상자 P3 (FOXP3)에 의해 특징화되고 (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)), 그리고 종양에 의해 발현된 것들을 비롯한, 항원에 대한 말초 자기 관용의 유도와 유지에서 결정적인 역할을 수행한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "효과기 세포"는 생존 및/또는 항상성이 IL-7에 의해 영향을 받는 림프구의 모집단을 지칭한다. 효과기 세포는 기억 CD4+와 CD8+ 세포 및 종양 반응성 줄기 유사 T 세포를 비롯한 최근에 초회감작된 T 세포를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "PD1", "인간 PD1", "PD-1" 또는 "인간 PD-1" (예정된 세포 사멸 단백질 1, 또는 예정된 사멸 1로서 또한 알려져 있음)은 인간 단백질 PD1 (서열 번호: 27, 신호 서열이 없는 단백질) / (서열 번호: 28, 신호 서열이 있는 단백질)을 지칭한다. 또한 UniProt 엔트리 번호 Q15116 (버전 156)을 참조한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "PD-1에 결합하는 항체", "PD-1에 특이적으로 결합하는 항체", "PD-1에 결합하는 항체" 또는 "항-PD-1 항체"는 PD-1, 특히 세포 표면 상에서 발현되는 PD-1 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체로서, PD-1의 표적화에서 진단 시약 및/또는 치료제로서 유용할 만큼 충분한 친화성을 갖는 항체를 지칭한다. 한 구체예에서, 관련 없는, 비-PD-1 단백질에 항-PD-1 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사면역검정 (RIA) 또는 유세포분석 (FACS)에 의해, 또는 바이오센서 시스템 예컨대 Biacore® 시스템을 이용한 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 계측될 때, PD-1에 대한 상기 항체의 결합의 약 10%보다 적다. 일정한 구체예에서, PD-1에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들면 10-8 M 이하, 예를 들면 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 인간 PD-1에 결합에 대한 결합 친화성의 KD 값을 갖는다. 한 구체예에서, 결합 친화성의 KD 값은 인간 PD-1의 세포외 도메인 (ECD) (PD-1-ECD, 서열 번호: 43을 참조한다)을 항원으로서 이용한 표면 플라스몬 공명 검정에서 결정된다.
"특이적 결합"은 결합이 항원에 선택적이고, 원치 않는 또는 비특이적 상호작용으로부터 차별될 수 있다는 것으로 의미된다. 특이적 항원 (예를 들면 PD-1)에 결합하는 항체의 능력은 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 또는 당업자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술 (예를 들면 BIAcore 기기에서 분석됨) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) 및 전통적인 결합 검정 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 계측될 수 있다. 한 구체예에서, 관련 없는 단백질에 항체의 결합의 정도는 예를 들면, SPR에 의해 계측될 때 항원에 대한 상기 항체의 결합의 약 10%보다 적다. 본원에서 설명된 면역접합체 내에 포함된 항체는 PD-1에 특이적으로 결합한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합 (펩티드 결합으로서 또한 알려져 있음)에 의해 선형으로 연결된 단량체 (아미노산)로 구성되는 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 두 개 이상의 아미노산의 임의의 사슬을 지칭하고, 특정한 길이의 산물을 지칭하지 않는다. 따라서, 두 개 이상의 아미노산의 사슬을 지칭하는 데 이용되는 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬", 또는 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이들 용어 대신에, 또는 이들과 교체가능하게 이용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 또한, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질분해성 개열, 또는 비-자연 발생 아미노산에 의한 변형을 제한 없이 포함하는, 폴리펩티드의 발현후 변형의 산물을 지칭하는 것으로 의도된다. 폴리펩티드는 자연의 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 지정된 핵산 서열로부터 반드시 번역되는 것은 아니다. 이것은 화학적 합성을 비롯한, 임의의 방식으로 산출될 수 있다. 폴리펩티드는 규정된 3차원 구조를 가질 수 있지만, 반드시 이런 구조를 갖는 것은 아니다. 규정된 3차원 구조를 갖는 폴리펩티드는 접힘된 것으로 지칭되고, 규정된 3차원 구조를 소유하지 않는 폴리펩티드는 오히려 다수의 상이한 입체형태를 채택할 수 있고 접힘되지 않은 것으로 지칭된다.
"단리된" 폴리펩티드, 또는 이의 변이체 또는 유도체는 자연 환경에 있지 않는 폴리펩티드인 것으로 의도된다. 특정 수준의 정제가 필요한 것은 아니다. 예를 들면, 단리된 폴리펩티드는 선천적 또는 자연 환경으로부터 이전될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생산된 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적절한 기술에 의해 분리되거나, 분획되거나, 또는 부분적으로 또는 실제적으로 정제된 선천적 또는 재조합 폴리펩티드가 그러한 것처럼, 본원 발명의 목적으로 단리된 것으로 고려된다.
참조 폴리펩티드 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하면, 갭을 도입한 후에, 그리고 임의의 보존성 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 참조 폴리펩티드 서열 내에 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내에 아미노산 잔기의 백분율로서 규정된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당해 분야의 기술 범위 안에 있는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) 소프트웨어 또는 FASTA 프로그램 패키지를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 하지만, 본원에서 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 BLOSUM50 비교 매트릭스와 함께 FASTA 패키지 버전 36.3.8c 또는 그 후속 버전의 ggsearch 프로그램을 이용하여 산출된다. FASTA 프로그램 패키지는 W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) "Effective protein sequence comparison" Meth. Enzymol. 266:227- 258; 및 Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36에 의해 저술되었고, http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml로부터 공개적으로 가용하다. 대안으로, 국부보다는 전역 정렬이 수행되도록 담보하기 위해 ggsearch (global protein:protein) 프로그램 및 디폴트 옵션 (BLOSUM50; 개방: -10; ext: -2; Ktup = 2)을 이용하여, http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi에서 접근 가능한 공개 서버가 서열을 비교하는 데 이용될 수 있다. 퍼센트 아미노산 동일성은 출력 정렬 헤더에서 제공된다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단리된 핵산 분자 또는 작제물, 예를 들면 전령 RNA (mRNA), 바이러스-유래된 RNA, 또는 플라스미드 DNA (pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포다이에스터 결합 또는 비-통상적인 결합 (예를 들면, 펩티드 핵산 (PNA)에서 발견되는 바와 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드 내에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 절편, 예를 들면, DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다.
"단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 선천적 환경으로부터 이전된 핵산 분자, DNA 또는 RNA인 것으로 의도된다. 예를 들면, 벡터에 내포된 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본원 발명의 목적을 위하여 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 또 다른 예는 이종 숙주 세포 내에 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 정제된 (부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 정상적으로 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 세포에 함유된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체외에 존재하거나 이의 천연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본원 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체뿐 아니라 양성 및 음성 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 본원 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성에 의해 생성된 이러한 분자들을 더 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결인자와 같은 조절 요소일 수 있거나 조절 요소를 포함할 수 있다.
"[예를 들면 본원 발명의 면역접합체]를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 (또는 핵산)"은 항체 중쇄와 경쇄 및/또는 IL-7 폴리펩티드 (또는 이들의 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자, 단일 벡터 또는 별개의 벡터에서 이런 폴리뉴클레오티드 분자(들), 그리고 숙주 세포 내에 하나 이상의 위치에서 존재하는 이런 핵산 분자(들)를 지칭한다.
용어 "발현 카세트"는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 가능하게 하는 일련의 특정된 핵산 요소로, 재조합적으로 또는 합성적으로 산출된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 원형자 DNA, 바이러스, 또는 핵산 단편 내로 통합될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열 중에서, 전사되는 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 일정한 구체예에서, 발현 카세트는 본원 발명의 면역접합체 또는 이들의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 자신이 세포 내에서 작동가능하게 연결되는 특이적 유전자를 도입하고 이의 발현을 주동하는 데 이용되는 DNA 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기 복제 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라 자신이 도입된 숙주 세포의 유전체 내로 통합된 벡터를 포함한다. 본원 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 대량의 안정된 mRNA의 전사를 가능하게 한다. 일단 발현 벡터가 세포 내부에 있게 되면, 유전자에 의해 인코딩되는 리보핵산 분자 또는 단백질이 세포 전사 및/또는 번역 기구에 의해 생산된다. 한 구체예에서, 본원 발명의 발현 벡터는 본원 발명의 면역접합체 또는 이들의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양액"은 교체가능하게 이용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 및 이런 세포의 자손을 지칭한다. 숙주 세포에는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"가 포함되는데, 이들은 일차 형질전환된 세포 및 계대 (passage)의 횟수에 상관없이, 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 부모 세포와 완전하게 동일하지 않을 수도 있으며 돌연변이를 내포할 수도 있다. 최초 형질전환된 세포에 대해 선별검사되거나 또는 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손은 본원에 포함된다. 숙주 세포는 본원 발명의 면역접합체를 산출하는 데 이용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들면 포유류 배양된 세포, 예컨대 몇몇 예를 들면 HEK 세포, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 생쥐 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 그리고 식물 세포, 그러나 또한 유전자도입 동물, 유전자도입 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미에서 이용되고, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면 이중특이적 항체), 그리고 항체 단편 (이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
본원에서 이용된 바와 같이 용어 "단일클론 항체"는 실제적으로 균질한 항체의 모집단으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 모집단 내에 포함되는 개별 항체는 예를 들면, 자연 발생 돌연변이를 내포하거나 또는 단일클론 항체 제조물의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체 (이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 대해 지향된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 균질한 모집단으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 표시하고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본원 발명에 따라서 이용되는 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 전시 방법, 그리고 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 내포하는 유전자도입 동물을 활용하는 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있는데, 이런 방법 및 단일클론 항체를 만들기 위한 다른 예시적인 방법은 본원에서 설명된다.
"단리된" 항체는 자연 환경의 구성요소로부터 분리된, 다시 말하면 자연 환경에 있지 않는 것이다. 특정 수준의 정제가 필요한 것은 아니다. 예를 들면, 단리된 항체는 선천적 또는 자연 환경으로부터 이전될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생산된 항체는 임의의 적절한 기술에 의해 분리되거나, 분획되거나, 또는 부분적으로 또는 실제적으로 정제된 선천적 또는 재조합 항체가 그러한 것처럼, 본원 발명의 목적으로 단리된 것으로 고려된다. 따라서, 본원 발명의 면역접합체가 단리된다. 일부 구체예에서, 항체는 예를 들면, 전기이동 (예를 들면, SDS-PAGE, 등전위 초점 (IEF), 모세관 전기이동) 또는 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법에 의해 결정될 때, 95% 또는 99% 이상의 순도까지 정제된다. 항체 순도의 사정을 위한 방법에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조한다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 선천적 항체 구조와 실제적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 실례는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자 (예를 들면 scFv), 그리고 단일 도메인 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 항체 단편에 관한 검토를 위해, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)을 참조한다. ScFv 단편에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Pl
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ckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참조한다; 또한, WO 93/16185; 및 U.S. 특허 번호 5,571,894와 5,587,458을 참조한다. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 관한 논의를 위해, U.S. 특허 번호 5,869,046을 참조한다. 디아바디는 이가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 참조: 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). 트리아바디 및 테트라바디 역시 Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)에서 설명된다. 단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인 중에서 전부 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인 중에서 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 일정한 구체예에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 참조: 예를 들면 U.S. 특허 번호 6,248,516 B1). 항체 단편은 본원에서 설명된 바와 같이, 무손상 항체의 단백질분해성 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들면 대장균 (E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.
용어 "면역글로불린 분자"는 자연 발생 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들면, IgG 부류의 면역글로불린은 이황화 결합되는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성되는, 약 150,000 달톤의 이종삼합체성 당단백질이다. N 말단으로부터 C 말단으로, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 영역으로 또한 불리는 가변 도메인 (VH), 그 이후에 중쇄 불변 영역으로 또한 불리는 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N 말단으로부터 C 말단으로, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 영역으로 또한 불리는 가변 도메인 (VL), 그 이후에 경쇄 불변 영역으로 또한 불리는 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는 α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG), 또는 μ (IgM)으로 불리는 5가지 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있으며, 이들 중에서 일부는 아형, 예를 들면 γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) 및 α2 (IgA2)로 더욱 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 두 가지 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있다. 면역글로불린은 본질적으로, 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결된, 2개의 Fab 분자 및 Fc 도메인으로 구성된다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 상보적인 구역을 포함하는, 항체의 부분을 지칭한다. 항원 결합 도메인은 예를 들면, 하나 이상의 항체 가변 도메인 (항체 가변 영역으로 또한 불림)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 항체 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는 데 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 선천적 항체의 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 (각각, VH와 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. 참조: 예를 들면, Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 페이지 91 (2007). 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원 결합 특이성을 부여하는 데 충분할 수 있다. 가변 영역 서열과 관련하여 본원에서 이용된 바와 같이, "Kabat 넘버링"은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에 의해 진술된 넘버링 시스템을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 중쇄와 경쇄의 모든 불변 영역과 도메인의 아미노산 위치는 본원에서 "Kabat에 따른 넘버링" 또는 "Kabat 넘버링"으로서 지칭되는, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에서 설명된 Kabat 넘버링 시스템에 따라서 넘버링된다. 구체적으로 Kabat 넘버링 시스템 (Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)의 페이지 647-660을 참조한다)은 카파와 람다 아이소타입의 경쇄 불변 도메인 CL에 이용되고, Kabat EU 색인 넘버링 시스템 (페이지 661-723을 참조한다)은 중쇄 불변 도메인 (CH1, 힌지, CH2 및 CH3)에 이용되는데, 이것은 본원에서 이 경우에 있어서 "Kabat EU 색인에 따른 넘버링"을 참조함으로써 더욱 명료해진다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변성 ("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")이고 및/또는 구조적으로 규정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하고 및/또는 항원 접촉 잔기 ("항원 접촉")를 내포하는, 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH에서 3개 (H1, H2, H3), 그리고 VL에서 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 본원에서 예시적인 HVR은 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 그리고 96-101 (H3)에서 발생하는 초가변 루프 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 그리고 95-102 (H3)에서 발생하는 CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 그리고 93-101 (H3)에서 발생하는 항원 접촉 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 그리고
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 그리고 94-102 (H3)를 비롯한, (a), (b) 및/또는 (c)의 조합.
별도로 표시되지 않으면, HVR 잔기 및 가변 도메인에서 다른 잔기 (예를 들면, FR 잔기)는 본원에서 Kabat et al., 위와 같음에 따라서 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"인간화" 항체는 비인간 HVR로부터 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실제적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 HVR (예를 들면, CDR)의 전부 또는 실제적으로 전부가 비인간 항체의 것들에 상응하고, FR의 전부 또는 실제적으로 전부가 인간 항체의 것들에 상응한다. 이런 가변 도메인은 본원에서 "인간화 가변 영역"으로서 지칭된다. 인간화 항체는 임의적으로, 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 인간화 항체에서 일부 FR 잔기는 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 복원하거나 또는 향상시키기 위해, 비인간 항체 (예를 들면, HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환된다. 항체, 예를 들면, 비인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다. 본원 발명에 포괄된 "인간화 항체"의 다른 형태는 불변 영역이 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련하여 본원 발명에 따른 특성을 생성하기 위해 원래 항체의 불변 영역으로부터 추가로 변형 또는 변경된 것이다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 활용하는 비인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특정적으로 배제한다. 일정한 구체예에서, 인간 항체는 비인간 유전자도입 포유동물, 예를 들면 생쥐, 쥐, 또는 토끼로부터 유래된다. 일정한 구체예에서, 인간 항체는 하이브리도마 세포주로부터 유래된다. 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편 역시 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편인 것으로 고려된다.
항체 또는 면역글로불린의 "부류"는 이의 중쇄에 의해 소유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 이들 중에서 몇몇은 하위부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
본원에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 내포하는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 규정하는 데 이용된다. 상기 용어는 선천적 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 비록 IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 변할 수도 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로, Cys226부터, 또는 Pro230부터 중쇄의 카르복실 말단까지 걸쳐있는 것으로 규정된다. 하지만, 숙주 세포에 의해 생산되는 항체는 중쇄의 C 말단으로부터 하나 이상, 특히 1개 또는 2개의 아미노산의 번역후 개열을 겪을 수 있다. 이런 이유로, 전장 중쇄를 인코딩하는 특이적 핵산 분자의 발현에 의해 숙주 세포에 의해 생산되는 항체는 전장 중쇄를 포함할 수 있거나, 또는 이것은 전장 중쇄의 개열된 변이체 (본원에서 "개열된 변이체 중쇄"로서 또한 지칭됨)를 포함할 수 있다. 이것은 중쇄의 최종 2개의 C 말단 아미노산이 글리신 (G446) 및 리신 (K447, Kabat EU 색인에 따른 넘버링)인 경우에 그러할 수 있다. 이런 이유로, Fc 영역의 C 말단 리신 (Lys447), 또는 C 말단 글리신 (Gly446) 및 리신 (K447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. Fc 도메인 (또는 본원에서 규정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위)을 포함하는 중쇄의 아미노산 서열은 별도로 표시되지 않으면, C 말단 글리신-리신 디펩티드가 없이 표시된다. 본원 발명의 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역접합체 내에 포함된, 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 본원 발명의 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역접합체 내에 포함된, 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신 잔기 (G446, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 본원 발명의 조성물, 예컨대 본원에서 설명된 제약학적 조성물은 본원 발명의 면역접합체의 모집단을 포함한다. 면역접합체의 모집단은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 개열된 변이체 중쇄를 갖는 분자를 포함할 수 있다. 면역접합체의 모집단은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 개열된 변이체 중쇄를 갖는 분자의 혼합물로 구성될 수 있고, 여기서 이들 면역접합체 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%가 개열된 변이체 중쇄를 갖는다. 본원 발명의 구체예에서, 본원 발명의 면역접합체의 모집단을 포함하는 조성물은 추가의 C 말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 갖는 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 면역접합체를 포함한다. 본원 발명의 구체예에서, 본원 발명의 면역접합체의 모집단을 포함하는 조성물은 추가의 C 말단 글리신 잔기 (G446, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 갖는 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 면역접합체를 포함한다. 본원 발명의 구체예에서, 이런 조성물은 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 분자; 추가의 C 말단 글리신 잔기 (G446, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 갖는 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 분자; 및 추가의 C 말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 갖는 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 분자로 구성되는 면역접합체의 모집단을 포함한다. 본원에서 별도로 특정되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 바와 같이, EU 색인으로 또한 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다 (또한 상기 참조). 본원에서 이용된 바와 같이, Fc 도메인의 "아단위"는 이합체성 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중에서 하나, 다시 말하면, 안정되게 자가 결합할 수 있는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들면, IgG Fc 도메인의 아단위는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
"Fc 도메인의 첫 번째와 두 번째 아단위의 연결을 증진하는 변형"은 동종이합체를 형성하는, Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드의 동일한 폴리펩티드와의 연관을 감소시키거나 또는 예방하는 펩티드 중추의 조작 또는 Fc 도메인 아단위의 번역후 변형이다. 본원에서 이용된 바와 같이, 연결을 증진하는 변형은 특히, 연결하기 원하는 2개의 Fc 도메인 아단위 각각 (다시 말하면, Fc 도메인의 첫 번째와 두 번째 아단위)에 만들어진 별개의 변형을 포함하고, 여기서 이들 변형은 2개의 Fc 도메인 아단위의 연결을 증진하기 위해 서로에 상보적이다. 예를 들면, 연결을 증진하는 변형은 Fc 도메인 아단위의 연결을 각각, 입체적으로 또는 정전으로 우호적으로 만들기 위해, 이들 중에서 하나 또는 둘 모두의 구조 또는 전하를 변경할 수 있다. 따라서, 각각의 아단위 (예를 들면 항원 결합 모이어티)에 융합된 추가 구성요소가 동일하지 않다는 의미에서 비동일할 수도 있는, 첫 번째 Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드 및 두 번째 Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드 사이에서 (이종)이합체화가 일어난다. 일부 구체예에서 연결을 증진하는 변형은 Fc 도메인에서 아미노산 돌연변이, 특이적으로 아미노산 치환을 포함한다. 특정한 구체예에서, 연결을 증진하는 변형은 Fc 도메인의 2개의 아단위 각각에서 별개의 아미노산 돌연변이, 특이적으로 아미노산 치환을 포함한다.
항체와 관련하여 이용될 때, 용어 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인한 생물학적 활성을 지칭하는데, 이들은 항체 아이소타입에 따라서 변한다. 항체 효과기 기능의 실례는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC), 항체-의존성 세포 식균작용 (ADCP), 사이토킨 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체-매개된 항원 흡수, 세포 표면 수용체 (예를 들면 B 세포 수용체)의 하향조절, 그리고 B 세포 활성화.
항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC)은 면역 효과기 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해를 야기하는 면역 기전이다. 표적 세포는 항체 또는 Fc 영역을 포함하는 이들의 유도체가 일반적으로, Fc 영역의 N 말단인 단백질 부분을 통해 특이적으로 결합하는 세포이다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "감소된 ADCC"는 앞서 규정된 ADCC의 기전에 의해, 표적 세포를 둘러싸는 배지에서 소정의 항체 농도에서 소정의 시점에 용해되는 표적 세포의 숫자에서 감소 및/또는 ADCC의 기전에 의해, 소정의 시점에 소정의 숫자의 표적 세포의 용해를 달성하는 데 필요한, 표적 세포를 둘러싸는 배지에서 항체의 농도에서 증가 중 어느 한 가지로서 규정된다. ADCC에서 감소는 동일한 표준 생산, 정제, 조제 및 저장 방법 (이들은 당업자에게 공지된다)을 이용하여 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생산되지만 조작되지 않은 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 상대적이다. 예를 들면, ADCC를 감소시키는 아미노산 치환을 Fc 도메인 내에 포함하는 항체에 의해 매개된 ADCC에서 감소는 Fc 도메인 내에 이러한 아미노산 치환이 없는 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 상대적이다. ADCC를 계측하기 위한 적합한 검정은 당해 분야에서 널리 공지된다 (참조: 예를 들면 PCT 공개 번호 WO 2006/082515 또는 PCT 공개 번호 WO 2012/130831).
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 도메인에 의한 인게이지먼트 이후에, 수용체-보유 세포가 효과기 기능을 수행하도록 자극하는 신호전달 사건을 이끌어 내는 Fc 수용체이다. 인간 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) 및 FcαRI (CD89)를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "조작한다, 조작된, 조작"은 펩티드 중추의 임의의 조작, 또는 자연 발생 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 번역후 변형을 포함하는 것으로 고려된다. 가공은 아미노산 서열의 변형, 글리코실화 패턴의 변형, 또는 개별 아미노산의 측쇄 기의 변형뿐만 아니라 이들 접근법의 조합을 포함한다.
"감소된 결합", 예를 들면 Fc 수용체 또는 CD25에 감소된 결합은 예를 들면 SPR에 의해 계측될 때, 개별 상호작용에 대한 친화성에서 감소를 지칭한다. 명료함을 위해, 상기 용어는 또한, 제로 (또는 분석 방법의 검출 한계 미만)까지 친화성의 감소, 다시 말하면, 상호작용의 완전한 소멸을 포함한다. 반대로, "증가된 결합"은 개별 상호작용에 대한 결합 친화성에서 증가를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "면역접합체"는 적어도 하나의 IL-7 분자 및 적어도 하나의 항체를 포함하는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. IL-7 분자는 본원에서 설명된 바와 같은 다양한 상호작용에 의해, 그리고 다양한 입체형상에서 항체에 결합될 수 있다. 특정한 구체예에서, IL-7 분자는 펩티드 링커를 통해 항체에 융합된다. 본원 발명에 따른 특정 면역접합체는 하나 이상의 링커 서열에 의해 연결된 하나의 IL-7 분자 및 하나의 항체로 본질적으로 구성된다.
"융합된"은 구성요소 (예를 들면 항체 및 IL-7 분자)가 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해, 펩티드 결합에 의해 연결되는 것으로 의미된다.
본원에서 이용된 바와 같이, Fc 도메인 아단위 등에 대하여 용어 "첫 번째" 및 "두 번째"는 하나 초과의 각 유형의 모이어티가 있을 때 편의상 식별을 위해 이용된다. 이들 용어의 이용은 만약 명시적으로 진술되지 않으면, 면역접합체의 특정한 순서 또는 배향정위를 부여하는 것으로 의도되지 않는다.
작용제의 "효과량"은 이것이 투여되는 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 야기하는 데 필요한 양을 지칭한다.
작용제, 예를 들면, 제약학적 조성물의 "치료 효과량"은 원하는 치료적 또는 방지적 결과를 달성하는 데 필요한 용량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 작용제의 치료 효과량은 예를 들면 질환의 부정적인 효과를 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화하거나 또는 예방한다.
"개체" 또는 "피험자"는 포유동물이다. 포유동물은 순치된 동물 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 그리고 설치류 (예를 들면, 생쥐와 쥐)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 특히, 대상체 또는 피험자는 인간이다.
용어 "제약학적 조성물"은 그 안에 내포된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 그런 형태이고, 이러한 조성물이 투여될 개체에게 받아들이기 어려울 정도로 독성인 추가 성분을 내포하지 않는 제조물을 지칭한다.
"제약학적으로 허용되는 운반체"는 개체에게 비독성인, 제약학적 조성물에서 활성 성분 이외의 성분을 지칭한다. 제약학적으로 허용되는 운반체는 완충액, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, "치료" (및 이의 문법적 변이, 예컨대 "치료한다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체에서 질환의 자연 경과를 변경하려는 시도에서 임상적 개입을 지칭하고, 임상 병리의 예방을 위해 또는 임상 병리의 경과 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이 예방, 질환 진행의 속도 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 그리고 관해 또는 향상된 예후를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 본원 발명의 면역접합체는 질환의 발달을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 늦추는 데 이용된다.
구체예에 관한 상세한 설명
돌연변이체 IL-7 폴리펩티드
본원 발명에 따른 IL-7 변이체는 면역요법에 대한 유리한 특성을 갖는다.
본원 발명에 따른 돌연변이체 인터류킨-7 (IL-7) 폴리펩티드는 IL-7 수용체의 α-아단위 및/또는 IL-2Rγ 아단위에 대한 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드의 친화성을 감소시키는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
IL-7Rα 및/또는 IL-2Rγ에 대한 감소된 친화성을 갖는 인간 IL-7 (hIL-7)의 돌연변이체는 예를 들면 아미노산 위치 13, 15, 18, 21, 22, 25, 72, 77, 81, 84, 85, 88, 136, 139, 143 또는 147 또는 이들의 조합 (서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열에 상대적으로 넘버링)에서 아미노산 치환에 의해 산출될 수 있다. 예시적인 아미노산 치환은 E13A, E13K, V15A, V15K, V18A, V18K, D21A, D21K, Q22A, Q22K, D25A, D25K, T72A, L77A, L77K, K81A, K81E, E84A, G85K, G85E, I88K, Q136A, Q136K, K139A, K139E, N143K 및 M147A를 포함한다.
본원 발명에 따른 돌연변이체 인터류킨-7 (IL-7) 폴리펩티드는 바람직하게는 아미노산 위치 74, 93 및 118 중 하나 또는 이들의 조합에서 폴리펩티드의 균질성을 향상시키는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예시적인 아미노산 치환은 D74A, D74K, T93A 및 S118A를 포함한다.
본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 71의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 135의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 일부 구체예에서 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드는 서열 번호: 136의 아미노산 서열을 포함한다.
본원 발명의 특정 IL-7 돌연변이체는 서열 번호: 52에 따른 인간 IL-7의 V15A, V15K, V18A, V18K, L77A, L77K, K81E, G85K, G85E, I88K 및 N143K의 군에서 선택되는 아미노산 돌연변이를 포함한다. 본원 발명의 특정 IL-7 돌연변이체는 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 특정 IL-7 돌연변이체는 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 특정 IL-7 돌연변이체는 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 특정 IL-7 돌연변이체는 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 특정 IL-7 돌연변이체는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 특정 IL-7 돌연변이체는 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 특정 IL-7 돌연변이체는 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 특정 IL-7 돌연변이체는 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 특정 IL-7 돌연변이체는 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 특정 IL-7 돌연변이체는 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 특정 IL-7 돌연변이체는 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함한다. 이들 돌연변이체는 IL-7 돌연변이체의 야생형 형태와 비교하여, 인터류킨 7 수용체에 대한 실제적으로 감소된 친화성을 나타낸다.
본원 발명의 특정 IL-7 돌연변이체는 적어도 두 개의 아미노산 치환을 포함하는데, 여기서 두 개의 아미노산 치환은 서열 번호: 52에 따른 인간 IL-7의 K81E 및 G85K 또는 G85E이다. 본원 발명의 특정 IL-7 돌연변이체는 서열 번호: 135의 아미노산 서열을 포함한다. 본원 발명의 특정 IL-7 돌연변이체는 서열 번호: 136의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 개시된 바와 같은 IL-7 돌연변이체의 다른 특징은 PD1-IL-7 면역접합체로 있을 때 주로 트랜스로 (세포 상에서 매우 근접하여) 전달되는 야생형 IL-7과 비교하여, PD-1 발현 CD4 T 세포 상에서 시스로 (동일한 세포 상에서) IL-7의 PD-1 매개된 전달을 가능하게 하는, IL-7Rα에 대한 감소된 친화성을 포함한다.
일정한 구체예에서 상기 아미노산 돌연변이는 IL-Rα 및/또는 IL-2Rγ에 대한 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드의 친화성을 적어도 5배, 특정하게는 적어도 10배, 더 특정하게는 적어도 25배 감소시킨다.
IL-7의 N-글리코실화의 제거와 조합으로 IL-7Rα 및/또는 IL-2Rγ에 대한 IL-7의 친화성의 감소는 향상된 특성을 갖는 IL-7 단백질을 야기한다. 예를 들면, N-글리코실화 부위의 제거는 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드가 포유류 세포 예컨대 CHO 또는 HEK 세포에서 발현될 때 더 균질한 산물을 야기한다.
따라서, 일정한 구체예에서 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 인간 IL-7의 잔기 72, 93 또는 118에 상응하는 위치에서 IL-7의 N-글리코실화 부위를 제거하는 추가의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서 인간 IL-7의 잔기 72, 93 또는 118에 상응하는 위치에서 IL-7의 N-글리코실화 부위를 제거하는 상기 추가의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 특정한 구체예에서, 상기 추가의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 T72A이다. 다른 특정한 구체예에서, 상기 추가의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 T93A이다. 다른 특정한 구체예에서, 상기 추가의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 S118A이다. 다른 특정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 아미노산 치환 T72A, T93A 및 S118A를 포함한다. 일정한 구체예에서 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 본질적으로 전장 IL-7 분자이다. 일정한 구체예에서 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 인간 IL-7 분자이다. 한 구체예에서 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 돌연변이가 없는 서열 번호: 52를 포함하는 IL-7 폴리펩티드와 비교하여, IL-7Rα 또는 IL-2Rγ에 대한 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드의 친화성을 감소시키는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 갖는 서열 번호: 52의 서열을 포함한다. 한 구체예에서 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 돌연변이가 없는 서열 번호: 52를 포함하는 IL-7 폴리펩티드와 비교하여, IL-7Rα 및 IL-2Rγ에 대한 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드의 친화성을 감소시키는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 갖는 서열 번호: 52의 서열을 포함한다. 한 구체예에서 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 돌연변이가 없는 서열 번호: 52를 포함하는 IL-7 폴리펩티드와 비교하여, IL-7Rα 및/또는 IL-2Rγ에 대한 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드의 친화성을 감소시키는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 갖는 서열 번호: 52의 서열을 포함한다.
특정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 T 림프구 세포에서 증식, 초회감작된 T 림프구 세포에서 효과기 기능, 세포독성 T 세포 (CTL) 활성, 활성화된 B 세포에서 증식, 활성화된 B 세포에서 분화, 자연 킬러 (NK) 세포에서 증식, NK 세포에서 분화, 활성화된 T 세포 또는 NK 세포에 의한 사이토킨 분비, 그리고 NK/림프구 활성화된 킬러 (LAK) 항종양 세포독성으로 구성된 군에서 선택되는 세포 반응 중에서 한 가지 이상을 여전히 이끌어 낼 수 있다.
한 구체예에서, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 상응하는 야생형 IL-2 서열, 예를 들면 서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열과 비교하여, 12개 이내, 11개 이내, 10개 이내, 9개 이내, 8개 이내, 7개 이내, 6개 이내, 또는 5개 이내의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 상응하는 야생형 IL-7 서열, 예를 들면 서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열과 비교하여, 5개 이내의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
면역접합체
본원에서 설명된 바와 같은 면역접합체는 IL-분자 및 항체를 포함한다. 이런 면역접합체는 IL-7을 예를 들면 종양 미세환경 내로 직접적으로 표적화함으로써 IL-7 요법의 효능을 유의미하게 증가시킨다. 본원 발명에 따라서, 면역접합체 내에 포함된 항체는 전체 항체 또는 면역글로불린, 또는 생물학적 기능 예컨대 항원 특이적 결합 친화성을 갖는 이의 부분 또는 변이체일 수 있다.
면역접합체 요법의 전반적인 유익성은 쉽게 알 수 있다. 예를 들면, 면역접합체 내에 포함된 항체는 종양 특이적 에피토프를 인식하고 면역접합체 분자의 종양 부위로의 표적화를 야기한다. 이런 이유로, 높은 농도의 IL-7이 종양 미세환경 내로 전달될 수 있고, 그것에 의하여 접합되지 않은 IL-7의 경우에 요구될 것보다 훨씬 낮은 용량의 면역접합체를 이용하여 본원에서 언급된 다양한 면역 효과기 세포의 활성화와 증식을 야기한다. 하지만, IL-7 면역접합체의 이러한 특징은 IL-7 분자의 잠재적인 부작용을 다시 한 번 악화시킬 수 있다: 접합되지 않은 IL-7에 비하여 혈류 내에서 IL-7 면역접합체의 훨씬 긴 순환 반감기로 인해, 융합 단백질 분자의 IL-7 또는 다른 부분이 혈관구조 내에 일반적으로 존재하는 성분을 활성화할 확률이 증가한다. 순환에서 IL-7의 연장된 반감기를 야기하는 다른 모이어티 예컨대 Fc 또는 알부민에 융합된 IL-7을 내포하는 다른 융합 단백질에 동일한 우려가 적용된다. 이런 이유로 IL-7의 야생형 형태와 비교하여 감소된 독성을 갖는, 본원에서 설명된 바와 같은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체가 특히 유리하다.
전술된 바와 같이, IL-7을 종양 세포보다는 면역 효과기 세포로 직접적으로 표적화하는 것이 IL-7 면역요법을 위해 유리할 수 있다.
따라서, 본원 발명은 전술된 바와 같은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 제공한다. 한 구체예에서 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 항체는 융합 단백질을 형성한다, 다시 말하면 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 항체와 펩티드 결합을 공유한다. 일부 구체예에서, 항체는 첫 번째와 두 번째 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함한다. 특정한 구체예에서 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 임의적으로 링커 펩티드를 거쳐, 자체의 아미노 말단 아미노산에서 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 카르복시 말단 아미노산에 융합된다. 일부 구체예에서, 항체는 전장 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 면역글로불린 분자, 특히 IgG 부류 면역글로불린 분자, 더욱 특히 IgG1 하위부류 면역글로불린 분자이다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄 중에서 하나와 아미노 말단 펩티드 결합을 공유한다. 일정한 구체예에서 항체는 항체 단편이다. 일부 구체예에서 항체는 Fab 분자 또는 scFv 분자이다. 한 구체예에서 항체는 Fab 분자이다. 다른 구체예에서 항체는 scFv 분자이다. 면역접합체는 또한, 하나 초과의 항체를 포함할 수 있다. 하나 초과의 항체, 예를 들면 첫 번째와 두 번째 항체가 면역접합체 내에 포함되는 경우에, 각 항체는 다양한 형태의 항체 및 항체 단편에서 독립적으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 첫 번째 항체는 Fab 분자일 수 있고, 두 번째 항체는 scFv 분자일 수 있다. 특정한 구체예에서 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 항체 각각은 scFv 분자이거나, 또는 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 항체 각각은 Fab 분자이다. 특정한 구체예에서 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 항체 각각은 Fab 분자이다. 한 구체예에서 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 항체 각각은 PD-1에 결합한다.
면역접합체 형식
예시적인 면역접합체 형식은 PCT 공개 번호 WO 2011/020783에서 설명되는데, 이것은 본원에서 온전히 참조로서 편입된다. 이들 면역접합체는 적어도 두 개의 항체를 포함한다. 따라서, 한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역접합체는 본원에서 설명된 바와 같은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 적어도 첫 번째와 두 번째 항체를 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 첫 번째와 두 번째 항체는 Fv 분자, 특히 scFv 분자 및 Fab 분자로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. 특정한 구체예에서, 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 상기 첫 번째 항체와 아미노 또는 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 두 번째 항체는 i) 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 ii) 첫 번째 항체 중 어느 하나와 아미노 또는 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유한다. 특정한 구체예에서, 면역접합체는 하나 이상의 링커 서열에 의해 연결된, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 첫 번째와 두 번째 항체, 특히 Fab 분자로 본질적으로 구성된다. 이런 형식은 이들이 표적 항원 (PD-1)에 높은 친화성으로 결합하지만 IL-7 수용체에 단량체성 결합만을 제공하여, 면역접합체를 표적 부위와 상이한 위치에서 IL-7 수용체 보유 면역 세포로 표적화하는 것을 방지한다는 이점을 갖는다. 특정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 첫 번째 항체, 특히 첫 번째 Fab 분자와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 두 번째 항체, 특히 두 번째 Fab 분자와 아미노 말단 펩티드 결합을 더욱 공유한다. 다른 구체예에서, 첫 번째 항체, 특히 첫 번째 Fab 분자는 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 두 번째 항체, 특히 두 번째 Fab 분자와 아미노 말단 펩티드 결합을 더욱 공유한다. 다른 구체예에서, 첫 번째 항체, 특히 첫 번째 Fab 분자는 첫 번째 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드와 아미노 말단 펩티드 결합을 공유하고, 두 번째 항체, 특히 두 번째 Fab 분자와 카르복시 말단 펩티드를 더욱 공유한다. 특정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 첫 번째 중쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 두 번째 중쇄 가변 영역과 아미노 말단 펩티드 결합을 더욱 공유한다. 다른 구체예에서 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 첫 번째 경쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 두 번째 경쇄 가변 영역과 아미노 말단 펩티드 결합을 더욱 공유한다. 다른 구체예에서, 첫 번째 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은 카르복시 말단 펩티드 결합에 의해 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드에 연결되고, 아미노 말단 펩티드 결합에 의해 두 번째 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 더욱 연결된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은 아미노 말단 펩티드 결합에 의해 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드에 연결되고 카르복시 말단 펩티드 결합에 의해 두 번째 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 더욱 연결된다. 한 구체예에서, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 첫 번째 Fab 중쇄 또는 경쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 두 번째 Fab 중쇄 또는 경쇄와 아미노 말단 펩티드 결합을 더욱 공유한다. 다른 구체예에서, 첫 번째 Fab 중쇄 또는 경쇄는 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 두 번째 Fab 중쇄 또는 경쇄와 아미노 말단 펩티드 결합을 더욱 공유한다. 다른 구체예에서, 첫 번째 Fab 중쇄 또는 경쇄는 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드와 아미노 말단 펩티드 결합을 공유하고, 두 번째 Fab 중쇄 또는 경쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 더욱 공유한다. 한 구체예에서, 면역접합체는 하나 이상의 scFv 분자와 아미노 말단 펩티드 결합을 공유하고 하나 이상의 scFv 분자와 카르복시 말단 펩티드 결합을 더욱 공유하는 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함한다.
본원 발명에 따른 면역접합체에 대한 특히 적합한 형식은 하지만, 면역글로불린 분자를 항체로서 포함한다. 이런 면역접합체 형식은 WO 2012/146628에서 설명되는데, 이것은 본원에서 온전히 참조로서 편입된다.
따라서, 특정한 구체예에서, 면역접합체는 본원에서 설명된 바와 같은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 면역글로불린 분자, 특히 IgG 분자, 더욱 특히 IgG1 분자를 포함한다. 한 구체예에서, 면역접합체는 1개 이하의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 면역글로불린 분자는 인간이다. 한 구체예에서, 면역글로불린 분자는 인간 불변 영역, 예를 들면 인간 CH1, CH2, CH3 및/또는 CL 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 면역글로불린은 인간 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 한 구체예에서 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 면역글로불린 분자와 아미노 또는 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유한다. 한 구체예에서, 면역접합체는 하나 이상의 링커 서열에 의해 연결된, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 면역글로불린 분자, 특히 IgG 분자, 더욱 특히 IgG1 분자로 본질적으로 구성된다. 특정한 구체예에서 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 임의적으로 링커 펩티드를 거쳐, 자체의 아미노 말단 아미노산에서 면역글로불린 중쇄 중 하나의 카르복시 말단 아미노산에 융합된다.
돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 직접적으로, 또는 1개 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2-20개의 아미노산을 포함하는 링커 펩티드를 거쳐 항체에 융합될 수 있다. 링커 펩티드는 당해 분야에서 공지되고 본원에서 설명된다. 적합한, 비면역원성 링커 펩티드는 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 링커 펩티드를 포함한다. "n"은 일반적으로, 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 정수이다. 한 구체예에서 링커 펩티드는 적어도 5개 아미노산, 한 구체예에서 5 내지 100개 아미노산, 추가 구체예에서 10 내지 50개 아미노산의 길이를 갖는다. 특정한 구체예에서, 링커 펩티드는 15개 아미노산의 길이를 갖는다. 한 구체예에서 링커 펩티드는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm인데, 여기서 G=글리신, S=세린, 그리고 (x=3, n= 3, 4, 5 또는 6 및 m=0, 1, 2 또는 3) 또는 (x=4, n=2, 3, 4 또는 5 및 m= 0, 1, 2 또는 3)이고, 한 구체예에서 x=4 및 n=2 또는 3이고, 추가 구체예에서 x=4 및 n=3이다. 특정한 구체예에서 링커 펩티드는 (G4S)3 (서열 번호: 21)이다. 한 구체예에서, 링커 펩티드는 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 갖는다 (또는 이것으로 구성된다).
특정한 구체예에서, 면역접합체는 돌연변이체 IL-7 분자 및 PD-1에 결합하는 면역글로불린 분자, 특히 IgG1 하위부류 면역글로불린 분자를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 분자는 서열 번호: 21의 링커 펩티드를 거쳐, 자체의 아미노 말단 아미노산에서 면역글로불린 중쇄 중 하나의 카르복시 말단 아미노산에 융합된다.
특정한 구체예에서, 면역접합체는 돌연변이체 IL-7 분자 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하고, 여기서 상기 항체는 첫 번째와 두 번째 아단위로 구성되는 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함하고, 상기 돌연변이체 IL-7 분자는 서열 번호: 21의 링커 펩티드를 거쳐, 자체의 아미노 말단 아미노산에서 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 카르복시 말단 아미노산에 융합된다.
PD-1 항체
본원 발명의 면역접합체 내에 포함된 항체는 PD-1, 특히 인간 PD-1에 결합하고, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 PD-1이 발현되는 표적 부위, 특히 예를 들면 종양과 연관된, PD-1을 발현하는 T 세포로 지향시킬 수 있다.
본원 발명의 면역접합체에서 이용될 수 있는 적합한 PD-1 항체는 WO 2017/055443 A1에서 설명되는데, 이것은 본원에서 온전히 참조로서 편입된다.
본원 발명의 면역접합체는 동일하거나 또는 상이한 항원에 결합할 수 있는 두 개 이상의 항체를 포함할 수 있다. 하지만, 특정한 구체예에서, 이들 항체 각각이 PD-1에 결합한다. 한 구체예에서, 본원 발명의 면역접합체 내에 포함된 항체는 단일특이적이다. 특정한 구체예에서, 면역접합체는 단일, 단일특이적 항체, 특히 단일특이적 면역글로불린 분자를 포함한다.
항체는 PD-1, 특히 인간 PD-1에 특이적 결합을 유지하는 임의의 유형의 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 항체 단편은 Fv 분자, scFv 분자, Fab 분자, 그리고 F(ab')2 분자를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 하지만, 특정한 구체예에서, 항체는 전장 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 첫 번째와 두 번째 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 면역글로불린, 특히 IgG 부류, 더욱 특히 IgG1 하위부류 면역글로불린이다.
일부 구체예에서, 항체는 단일클론 항체이다.
일부 구체예에서, 항체는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, Kabat 넘버링에 따른 위치 71-73에서 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3, 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 Kabat 넘버링에 따른 위치 71-73에서 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 인간화 가변 영역이다. 일부 구체예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 인간 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 (a) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 인간화 가변 영역이다. 일부 구체예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 인간 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 서열 번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
특정한 구체예에서, 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 항체는 인간화 항체이다. 한 구체예에서, 항체는 인간 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 분자, 특히 인간 CH1, CH2, CH3 및/또는 CL 도메인을 포함하는 IgG 부류 면역글로불린 분자이다. 인간 불변 도메인의 예시적인 서열은 서열 번호 31 및 32 (각각, 인간 카파 및 람다 CL 도메인), 그리고 서열 번호: 33 (인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 CH1-CH2-CH3)에서 제공된다. 일부 구체예에서, 항체는 서열 번호: 31 또는 서열 번호: 32의 아미노산 서열, 특히 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 서열 번호: 33의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 중쇄 불변 영역은 본원에서 설명된 바와 같이 Fc 도메인에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
Fc 도메인
특정한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역접합체 내에 포함된 항체는 첫 번째와 두 번째 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함한다. 항체의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 예를 들면, 면역글로불린 G (IgG) 분자의 Fc 도메인은 이합체이며, 이것의 각 아단위는 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개의 아단위는 서로 안정되게 연결될 수 있다. 한 구체예에서 본원 발명의 면역접합체는 1개 이하의 Fc 도메인을 포함한다.
한 구체예에서, 면역접합체 내에 포함된 항체의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정한 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 다른 구체예에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 더 특정한 구체예에서, Fc 도메인은 위치 S228 (Kabat EU 색인 넘버링)에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 이러한 아미노산 치환은 IgG4 항체의 생체내 Fab 팔 교환을 감소시킨다 (참조: Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). 더 특정한 구체예에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 훨씬 특정한 구체예에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 인간 IgG1 Fc 영역의 예시적인 서열은 서열 번호: 30에서 제공된다.
이종이합체화를 증진하는 Fc 도메인 변형
본원 발명에 따른 면역접합체는 Fc 도메인의 2개의 아단위 중 하나 또는 다른 하나에 융합된 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드, 특히 단일 (1개 이하의) 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함하고, 따라서 Fc 도메인의 2개의 아단위가 전형적으로, 2개의 비동일한 폴리펩티드 사슬 내에 포함된다. 이들 폴리펩티드의 재조합 공동발현 및 차후 이합체화는 이들 2개의 폴리펩티드의 여러 가능한 조합을 야기한다. 재조합 생산에서 면역접합체의 수율과 순도를 향상시키기 위해, 원하는 폴리펩티드의 연결을 증진하는 변형을 항체의 Fc 도메인에 도입하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역접합체 내에 포함된 항체의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 첫 번째와 두 번째 아단위의 연결을 증진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개의 아단위 사이에서 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용의 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인 내에 있다. 따라서, 한 구체예에서 상기 변형은 Fc 도메인의 CH3 도메인 내에 있다.
이종이합체화를 시행하기 위한 Fc 도메인의 CH3 도메인에서 변형을 위한 여러 접근법이 존재하는데, 이들은 예를 들면 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291에서 충분히 설명된다. 전형적으로, 이와 같은 모든 접근법에서 Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 CH3 도메인 및 Fc 도메인의 두 번째 아단위의 CH3 도메인은 각 CH3 도메인 (또는 이것을 포함하는 중쇄)이 그 자체로는 더 이상 동종이합체를 형성할 수 없지만, 상보적으로 조작된 다른 CH3 도메인과 이종이합체를 형성하도록 강제되도록 (첫 번째와 두 번째 CH3 도메인이 이종이합체를 형성하고, 2개의 첫 번째 또는 2개의 두 번째 CH3 도메인 사이에 어떤 동종이합체도 형성되지 않도록), 둘 모두 상보성 방식으로 조작된다.
특정한 구체예에서, Fc 도메인의 첫 번째와 두 번째 아단위의 연결을 증진하는 상기 변형은 Fc 도메인의 2개의 아단위 중 하나에서 "노브" 변형 및 Fc 도메인의 2개의 아단위 중 다른 하나에서 "홀" 변형을 포함하는, 이른바 "노브 인투 홀" 변형이다.
노브 인투 홀 기술은 예를 들면 US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) 및 Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)에서 설명된다. 일반적으로, 상기 방법은 이종이합체 형성을 증진하고 동종이합체 형성을 방해하기 위해 융기가 공동 내에 배치될 수 있도록, 융기 ("노브")를 첫 번째 폴리펩티드의 인터페이스에서, 그리고 상응하는 공동 ("홀")을 두 번째 폴리펩티드의 인터페이스 내에 도입하는 것을 수반한다. 융기는 첫 번째 폴리펩티드의 인터페이스로부터 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄 (예를 들면 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 구축된다. 융기와 동일한 또는 유사한 크기의 보상성 공동은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 두 번째 폴리펩티드의 인터페이스 내에 창출된다.
따라서, 특정한 구체예에서, 면역접합체 내에 포함된 항체의 Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 두 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 공동에서 위치 가능한 첫 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 생성되고, Fc 도메인의 두 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 첫 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 위치 가능한 두 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 공동이 생성된다.
바람직하게는 더 큰 측쇄 용적을 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y) 및 트립토판 (W)으로 구성된 군에서 선택된다.
바람직하게는 더 작은 측쇄 용적을 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T) 및 발린 (V)으로 구성된 군에서 선택된다.
융기 및 공동은 이들 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을, 예를 들면 부위 특이적 돌연변이유발에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 변경함으로써 만들어질 수 있다.
특정한 구체예에서, Fc 도메인의 첫 번째 아단위 ("노브" 아단위)의 CH3 도메인에서 위치 366에서 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기 (T366W)로 대체되고, Fc 도메인의 두 번째 아단위 ("홀" 아단위)의 CH3 도메인에서 위치 407에서 티로신 잔기가 발린 잔기 (Y407V)로 대체된다. 한 구체예에서, Fc 도메인의 두 번째 아단위 내에 추가적으로 위치 366에서 트레오닌 잔기가 세린 잔기 (T366S)로 대체되고 위치 368에서 류신 잔기가 알라닌 잔기 (L368A)로 대체된다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링).
다른 추가 구체예에서, Fc 도메인의 첫 번째 아단위 내에 추가적으로 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기 (S354C)로 대체되거나 또는 위치 356에서 글루타민산 잔기가 시스테인 잔기 (E356C)로 대체되고 (특히 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기로 대체되고), 그리고 Fc 도메인의 두 번째 아단위 내에 추가적으로 위치 349에서 티로신 잔기가 시스테인 잔기 (Y349C)에 의해 대체된다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링). 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 도메인의 2개의 아단위 사이에 이황화 다리의 형성을 야기하여, 이합체를 더욱 안정시킨다 (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
특정한 구체예에서, Fc 도메인의 첫 번째 아단위는 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고, Fc 도메인의 두 번째 아단위는 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다.
일부 구체예에서, Fc 도메인의 두 번째 아단위는 아미노산 치환 H435R 및 Y436F (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 추가적으로 포함한다.
특정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 Fc 도메인의 첫 번째 아단위 ("노브" 변형 포함)에 융합된다 (임의적으로 링커 펩티드를 거쳐). 이론에 한정됨 없이, Fc 도메인의 노브 내포 아단위에 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드의 융합은 2개의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체의 산출 (2개의 노브 내포 폴리펩티드의 입체 충돌)을 (더욱) 최소화할 것이다.
이종이합체화를 시행하기 위한 CH3-변형의 다른 기술이 본원 발명에 따른 대안으로서 예기되고, 예를 들면 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291에서 설명된다.
한 구체예에서, EP 1870459에서 설명된 이종이합체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 이러한 접근법은 Fc 도메인의 2개의 아단위 사이에서 CH3/CH3 도메인 인터페이스 내에 특정한 아미노산 위치에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 도입에 기초된다. 본원 발명의 면역접합체 내에 포함된 항체에 대한 한 가지 바람직한 구체예는 아미노산 돌연변이 R409D; 2개의 CH3 도메인 (Fc 도메인의) 중 하나에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; Fc 도메인의 CH3 도메인 중 다른 하나에서 E357K이다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링).
다른 구체예에서, 본원 발명의 면역접합체 내에 포함된 항체는 Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 T366W 및 Fc 도메인의 두 번째 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, 그리고 부가적으로 아미노산 돌연변이 R409D; Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 CH3 도메인에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; Fc 도메인의 두 번째 아단위의 CH3 도메인에서 E357K를 포함한다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링).
다른 구체예에서, 본원 발명의 면역접합체 내에 포함된 항체는 Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366W 및 Fc 도메인의 두 번째 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함하거나, 또는 상기 항체는 Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366W 및 Fc 도메인의 두 번째 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366S, L368A, Y407V, 그리고 부가적으로 아미노산 돌연변이 R409D; Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 CH3 도메인에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; Fc 도메인의 두 번째 아단위의 CH3 도메인에서 E357K를 포함한다 (이들 모두 Kabat EU 색인에 따른 넘버링).
한 구체예에서, WO 2013/157953에서 설명된 이종이합체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 한 구체예에서, 첫 번째 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366K를 포함하고, 두 번째 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351D를 포함한다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링). 추가 구체예에서, 첫 번째 CH3 도메인은 추가 아미노산 돌연변이 L351K를 포함한다. 추가 구체예에서, 두 번째 CH3 도메인은 Y349E, Y349D 및 L368E에서 선택되는 아미노산 돌연변이 (바람직하게는 L368E)를 더욱 포함한다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링).
한 구체예에서, WO 2012/058768에서 설명된 이종이합체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 한 구체예에서, 첫 번째 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고, 두 번째 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가 구체예에서, 두 번째 CH3 도메인은 위치 T411, D399, S400, F405, N390 또는 K392에서, 예를 들면, a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E 또는 T411W, b) D399R, D399W, D399Y 또는 D399K, c) S400E, S400D, S400R 또는 S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V 또는 F405W, e) N390R, N390K 또는 N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F 또는 K392E에서 선택되는 추가 아미노산 돌연변이를 포함한다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링). 추가 구체예에서, 첫 번째 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고, 두 번째 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366V, K409F를 포함한다. 추가 구체예에서, 첫 번째 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함하고, 두 번째 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가 구체예에서, 두 번째 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K392E, T411E, D399R 및 S400R을 더욱 포함한다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링).
한 구체예에서, WO 2011/143545에서 설명된 이종이합체화 접근법이 예를 들면, 368 및 409 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)로 구성된 군에서 선택되는 위치에서 아미노산 변형으로, 대안적으로 이용된다.
한 구체예에서, 전술된 노브 인투 홀 기술을 또한 이용하는, WO 2011/090762에서 설명된 이종이합체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 한 구체예에서, 첫 번째 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366W를 포함하고, 두 번째 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함한다. 한 구체예에서, 첫 번째 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366Y를 포함하고, 두 번째 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407T를 포함한다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링).
한 구체예에서, 면역접합체 내에 포함된 항체 또는 이의 Fc 도메인은 IgG2 하위부류의 것이고, WO 2010/129304에서 설명된 이종이합체화 접근법이 대안적으로 이용된다.
대안적 구체예에서, Fc 도메인의 첫 번째와 두 번째 아단위의 연결을 증진하는 변형은 예를 들면 PCT 공개 WO 2009/089004에서 설명된 바와 같이, 정전 스티어링 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 이러한 방법은 동종이합체 형성이 정전적으로 불리하지만 이종이합체화가 정전적으로 유리하게 되도록, 하전된 아미노산 잔기에 의한 2개의 Fc 도메인 아단위의 인터페이스에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 대체를 수반한다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 첫 번째 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산 (예를 들면 글루타민산 (E) 또는 아스파르트산 (D), 바람직하게는 K392D 또는 N392D)으로 K392 또는 N392의 아미노산 치환을 포함하고, 두 번째 CH3 도메인은 양으로 하전된 아미노산 (예를 들면 리신 (K) 또는 아르기닌 (R), 바람직하게는 D399K, E356K, D356K 또는 E357K, 더 바람직하게는 D399K 및 E356K)으로 D399, E356, D356 또는 E357의 아미노산 치환을 포함한다. 추가 구체예에서, 첫 번째 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산 (예를 들면, 글루타민산 (E) 또는 아스파르트산 (D), 바람직하게는 K409D 또는 R409D)으로 K409 또는 R409의 아미노산 치환을 더욱 포함한다. 추가 구체예에서, 첫 번째 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산 (예를 들면, 글루타민산 (E) 또는 아스파르트산 (D))으로 K439 및/또는 K370의 아미노산 치환 (이들 모두 Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 추가로 또는 대안적으로 포함한다.
다른 추가 구체예에서, WO 2007/147901에서 설명된 이종이합체화 접근법이 대안적으로 이용된다. 한 구체예에서, 첫 번째 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K253E, D282K 및 K322D를 포함하고, 두 번째 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 D239K, E240K 및 K292D를 포함한다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링).
또 다른 구체예에서, WO 2007/110205에서 설명된 이종이합체화 접근법이 대안적으로 이용될 수 있다.
한 구체예에서, Fc 도메인의 첫 번째 아단위는 아미노산 치환 K392D 및 K409D를 포함하고, Fc 도메인의 두 번째 아단위는 아미노산 치환 D356K 및 D399K를 포함한다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링).
Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
Fc 도메인은 표적 조직에서 우수한 축적에 기여하는 긴 혈청 반감기 및 우호적인 조직-혈액 분포 비율을 비롯한, 우호적인 약동학적 특성을 면역접합체에 부여한다. 이와 동시에 이것은 하지만, 바람직한 항원-보유 세포보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포로, 면역접합체의 바람직하지 않은 표적화를 야기할 수 있다. 게다가, Fc 수용체 신호전달 경로의 공동활성화는 사이토킨 방출을 야기할 수 있는데, 이것은 IL-7 폴리펩티드 및 면역접합체의 긴 반감기와 함께, 전신 투여 시에 사이토킨 수용체의 과도한 활성화 및 중증 부작용을 유발한다. 따라서, 특정한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역접합체 내에 포함된 항체의 Fc 도메인은 선천적 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 이러한 Fc 도메인 (또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 항체)은 선천적 IgG1 Fc 도메인 (또는 선천적 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항체)과 비교하여, Fc 수용체에 대한 결합 친화성의 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더 바람직하게는 10% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 5% 미만 및/또는 선천적 IgG1 Fc 도메인 (또는 선천적 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항체)과 비교하여, 효과기 기능의 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더 바람직하게는 10% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 5% 미만을 나타낸다. 한 구체예에서, 이러한 Fc 도메인 (또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 항체)는 Fc 수용체에 실질적으로 결합하지 않고 및/또는 효과기 기능을 유도하지 않는다. 특정한 구체예에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 한 구체예에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 한 구체예에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정한 구체예에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더 특정하게는 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 특정하게는 인간 FcγRIIIa이다. 한 구체예에서, 효과기 기능은 CDC, ADCC, ADCP 및 사이토킨 분비의 군에서 선택되는 한 가지 이상이다. 특정한 구체예에서, 효과기 기능은 ADCC이다. 한 구체예에서, 이러한 Fc 도메인은 선천적 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 실제적으로 유사한 결합 친화성을 나타낸다. FcRn에 대한 실제적으로 유사한 결합은 이러한 Fc 도메인 (또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 항체)이 FcRn에 대한 선천적 IgG1 Fc 도메인 (또는 선천적 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항체)의 결합 친화성의 약 70% 초과, 특히 약 80% 초과, 더욱 특히 약 90% 초과를 나타낼 때 달성된다.
일정한 구체예에서, Fc 도메인은 비조작된 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 특정한 구체예에서, 면역접합체 내에 포함된 항체의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc 도메인의 2개의 아단위 각각에서 존재한다. 한 구체예에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시킨다. 한 구체예에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시키는 하나 초과의 아미노산 돌연변이가 있는 구체예에서, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 적어도 10배, 적어도 20-배, 또는 심지어 적어도 50-배 감소시킬 수 있다. 한 구체예에서, 조작된 Fc 도메인을 포함하는 항체는 비조작된 Fc 도메인을 포함하는 항체와 비교하여, Fc 수용체에 대한 결합 친화성의 20% 미만, 특히 10% 미만, 더욱 특히 5% 미만을 나타낸다. 특정한 구체예에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일부 구체예에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일부 구체예에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정한 구체예에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더 특정하게는 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 특정하게는 인간 FcγRIIIa이다. 바람직하게는, 이들 수용체 각각에 대한 결합이 감소된다. 일부 구체예에서, 보체 성분에 대한 결합 친화성, 특정하게는 C1q에 대한 결합 친화성 역시 감소된다. 한 구체예에서, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합 친화성은 감소되지 않는다. FcRn에 대한 실제적으로 유사한 결합, 다시 말하면, 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성의 보존은 이러한 Fc 도메인 (또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 항체)이 FcRn에 대한 비조작된 형태의 Fc 도메인 (또는 상기 비조작된 형태의 Fc 도메인을 포함하는 항체)의 결합 친화성의 약 70% 초과를 나타낼 때 달성된다. 이러한 Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본원 발명의 면역접합체 내에 포함된 항체는 이런 친화성의 약 80% 초과 및 심지어 약 90% 초과를 나타낼 수 있다. 일정한 구체예에서, 면역접합체 내에 포함된 항체의 Fc 도메인은 비조작된 Fc 도메인과 비교하여, 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 감소된 효과기 기능은 하기 중에서 한 가지 이상을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다: 감소된 보체 의존성 세포독성 (CDC), 감소된 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC), 감소된 항체-의존성 세포 식균작용 (ADCP), 감소된 사이토킨 분비, 항원-제시 세포에 의한 감소된 면역 복합체-매개된 항원 흡수, NK 세포에 감소된 결합, 대식세포에 감소된 결합, 단핵구에 감소된 결합, 다형핵 세포에 감소된 결합, 감소된 직접적인 신호전달 유도 아폽토시스, 표적-결합된 항체의 감소된 교차연결, 감소된 수지상 세포 성숙, 또는 감소된 T 세포 초회감작. 한 구체예에서, 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC, 감소된 ADCC, 감소된 ADCP, 그리고 감소된 사이토킨 분비의 군에서 선택되는 한 가지 이상이다. 특정한 구체예에서, 감소된 효과기 기능은 감소된 ADCC이다. 한 구체예에서, 감소된 ADCC는 비조작된 Fc 도메인 (또는 비조작된 Fc 도메인을 포함하는 항체)에 의해 유도된 ADCC의 20% 미만이다.
한 구체예에서, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 한 구체예에서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)의 군에서 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 구체예에서, Fc 도메인은 L234, L235 및 P329 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)의 군에서 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 한 구체예에서, Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 구체예에서, 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)이다. 한 구체예에서, Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환, 그리고 E233, L234, L235, N297 및 P331 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 선택되는 위치에서 추가 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 구체예에서, 추가 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정한 구체예에서, Fc 도메인은 위치 P329, L234 및 L235 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 구체예에서, Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G ("P329G LALA", "PGLALA" 또는 "LALAPG")를 포함한다. 구체적으로, 특정한 구체예에서, Fc 도메인의 각 아단위는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G (Kabat EU 색인 넘버링)를 포함한다, 다시 말하면, Fc 도메인의 첫 번째와 두 번째 아단위 각각에서 위치 234에서 류신 잔기가 알라닌 잔기 (L234A)로 대체되고, 위치 235에서 류신 잔기가 알라닌 잔기 (L235A)로 대체되고, 위치 329에서 프롤린 잔기가 글리신 잔기 (P329G)에 의해 대체된다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링). 이와 같은 한 가지 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은 본원에서 온전히 참조로서 편입되는 PCT 공개 번호 WO 2012/130831에서 설명된 바와 같이, 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 (뿐만 아니라 보체) 결합을 거의 완전히 전폐한다. WO 2012/130831은 또한, 이런 돌연변이체 Fc 도메인을 제조하는 방법, 그리고 이의 특성 예컨대 Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능을 결정하기 위한 방법을 설명한다.
IgG4 항체는 IgG1 항체와 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 따라서, 일부 구체예에서 본원 발명의 면역접합체 내에 포함된 항체의 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 한 구체예에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228에서 아미노산 치환, 특이적으로 아미노산 치환 S228P (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함한다. Fc 수용체에 대한 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 더욱 감소시키기 위해, 한 구체예에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 L235에서 아미노산 치환, 특이적으로 아미노산 치환 L235E (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함한다. 다른 구체예에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환, 특이적으로 아미노산 치환 P329G (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함한다. 특정한 구체예에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228, L235 및 P329에서 아미노산 치환, 특이적으로 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 이런 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 이들의 Fcγ 수용체 결합 특성은 본원에서 온전히 참조로서 편입되는 PCT 공개 번호 WO 2012/130831에서 설명된다.
특정한 구체예에서, 선천적 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인, 또는 아미노산 치환 S228P, L235E 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG4 Fc 도메인이다 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링).
일정한 구체예에서, Fc 도메인의 N-글리코실화가 제거되었다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, Fc 도메인은 위치 N297에서 아미노산 돌연변이, 특히 아스파라긴을 알라닌 (N297A) 또는 아스파르트산 (N297D)에 의해 대체하는 아미노산 치환 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함한다.
상기에서 및 PCT 공개 번호 WO 2012/130831에서 설명된 Fc 도메인에 더하여, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 갖는 Fc 도메인은 또한, Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중에서 하나 이상의 치환을 갖는 것들 (U.S. 특허 번호 6,737,056) (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함한다. 이런 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 "DANA" Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 두 개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (US 특허 번호 7,332,581).
돌연변이체 Fc 도메인은 당해 분야에서 널리 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 이용한 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조될 수 있다. 유전학적 방법은 인코딩 DNA 서열의 부위 특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성, 기타 등등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는 예를 들면 염기서열분석에 의해 실증될 수 있다.
Fc 수용체에 결합은 예를 들면 ELISA에 의해, 또는 표준 기계장치 예컨대 BIAcore 기기 (GE Healthcare)를 이용한 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 쉽게 결정될 수 있고, Fc 수용체는 예컨대 재조합 발현에 의해 획득될 수 있다. 대안으로, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 항체의 결합 친화성은 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 알려진 세포주, 예컨대 FcγIIIa 수용체를 발현하는 인간 NK 세포를 이용하여 평가될 수 있다.
Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 항체의 효과기 기능은 당해 분야에서 알려진 방법에 의해 계측될 수 있다. 관심되는 분자의 ADCC 활성을 사정하기 위한 시험관내 검정의 실례는 U.S. 특허 번호 5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) 및 Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); U.S. 특허 번호 5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)에서 설명된다. 대안으로, 비방사성 검정 방법이 이용될 수 있다 (참조: 예를 들면, 유세포분석의 경우에 ACTI™ 비방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI)). 이런 검정을 위한 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안으로, 또는 부가적으로, 관심되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 동물 모형, 예컨대 Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)에서 개시된 것에서 사정될 수 있다.
일부 구체예에서, 보체 성분, 특이적으로 C1q에 대한 Fc 도메인의 결합이 감소된다. 따라서, Fc 도메인이 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작되는 일부 구체예에서, 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC를 포함한다. C1q 결합 검정은 Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 항체가 C1q에 결합할 수 있고, 따라서 CDC 활성을 갖는지를 결정하기 위해 실행될 수 있다. 참조: 예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q와 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 사정하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다 (참조: 예를 들면, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); 및 Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).
FcRn 결합 및 생체내 소실/반감기 결정이 또한, 당해 분야에서 알려진 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (참조: 예를 들면, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929).
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 아미노산 치환 V15A (서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-7 분자이고; 그리고 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 아미노산 치환 V15K (서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-7 분자이고; 그리고 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 아미노산 치환 V18A (서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-7 분자이고; 그리고 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 아미노산 치환 V18K (서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-7 분자이고; 그리고 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 아미노산 치환 L77A (서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-7 분자이고; 그리고 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 아미노산 치환 L77K (서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-7 분자이고; 그리고 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 아미노산 치환 K81E (서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-7 분자이고; 그리고 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 아미노산 치환 G85K (서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-7 분자이고; 그리고 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 아미노산 치환 G85E (서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-7 분자이고; 그리고 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 아미노산 치환 I88K (서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-7 분자이고; 그리고 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 아미노산 치환 N143K (서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-7 분자이고; 그리고 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 아미노산 치환 K81E 및 G85K (서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-7 분자이고; 그리고 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 아미노산 치환 K81E 및 G85E (서열 번호: 52의 인간 IL-7 서열에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-7 분자이고; 그리고 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 서열 번호: 67 및 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 서열 번호: 135의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 서열 번호: 136의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 구체예에서 본원 발명의 임의의 상기 양상에 따라서, 항체는 첫 번째와 두 번째 아단위로 구성되는 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 IgG 부류 면역글로불린이고,
여기서 Fc 도메인의 첫 번째 아단위 내에 위치 366에서 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기 (T366W)로 대체되고, Fc 도메인의 두 번째 아단위 내에 위치 407에서 티로신 잔기가 발린 잔기 (Y407V)로 대체되고, 임의적으로 위치 366에서 트레오닌 잔기가 세린 잔기 (T366S)로 대체되고 위치 368에서 류신 잔기가 알라닌 잔기 (L368A)로 대체되고 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링), 그리고 여기서 더 나아가 Fc 도메인의 각 아단위가 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G (Kabat EU 색인 넘버링)를 포함한다. 이러한 구체예에서, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 서열 번호: 21의 링커 펩티드를 거쳐, 자체의 아미노 말단 아미노산에서 Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 카르복시 말단 아미노산에 융합될 수 있다.
한 양상에서, 본원 발명은 서열 번호: 85의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 86의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호: 90의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 양상에서, 본원 발명은 서열 번호: 85의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 86의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호: 91의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 양상에서, 본원 발명은 서열 번호: 85의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 86의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호: 92의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 양상에서, 본원 발명은 서열 번호: 85의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 86의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호: 93의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 양상에서, 본원 발명은 서열 번호: 85의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 86의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호: 102의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 양상에서, 본원 발명은 서열 번호: 85의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 86의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호: 103의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 양상에서, 본원 발명은 서열 번호: 85의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 86의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호: 105의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 양상에서, 본원 발명은 서열 번호: 85의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 86의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호: 107의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 양상에서, 본원 발명은 서열 번호: 85의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 86의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호: 108의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 양상에서, 본원 발명은 서열 번호: 85의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 86의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호: 109의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 양상에서, 본원 발명은 서열 번호: 85의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 86의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호: 114의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 양상에서, 본원 발명은 서열 번호: 85의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 86의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호: 137의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 양상에서, 본원 발명은 서열 번호: 85의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 86의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호: 138의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
폴리뉴클레오티드
본원 발명은 본원에서 설명된 바와 같은 면역접합체 또는 이의 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 더욱 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 단편은 항원 결합 단편이다.
본원 발명의 면역접합체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전체 면역접합체를 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드로서, 또는 공동발현되는 복수 (예를 들면, 2개 이상)의 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 공동발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 예를 들면, 이황화 결합 또는 다른 수단을 통해 연결되어, 기능적 면역접합체를 형성할 수 있다. 예를 들면, 항체의 경쇄 부분은 항체의 중쇄 부분 및 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체의 부분으로부터 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 공동발현될 때, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 연결되어 면역접합체를 형성할 것이다. 다른 실례에서, 2개의 Fc 도메인 아단위 중에서 하나 및 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체의 부분은 2개의 Fc 도메인 아단위 중에서 다른 것을 포함하는 면역접합체의 부분으로부터 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있었다. 공동발현될 때, Fc 도메인 아단위는 연결되어 Fc 도메인을 형성할 것이다.
일부 구체예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에서 설명된 바와 같은 발명에 따른 전체 면역접합체를 인코딩한다. 다른 구체예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에서 설명된 바와 같은 발명에 따른 면역접합체 내에 포함된 폴리펩티드를 인코딩한다.
한 구체예에서, 본원 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 면역접합체 내에 포함된 항체의 중쇄 (예를 들면 면역글로불린 중쇄), 그리고 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 인코딩한다. 다른 구체예에서, 본원 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 면역접합체 내에 포함된 항체의 경쇄를 인코딩한다.
일정한 구체예에서 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 구체예에서, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 전령 RNA (mRNA)의 형태에서 RNA이다. 본원 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본원 발명에서 유용한 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 당해 분야에서 널리 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 이용한 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조될 수 있다. 유전학적 방법은 인코딩 DNA 서열의 부위 특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성, 기타 등등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는 예를 들면 염기서열분석에 의해 실증될 수 있다. 선천적 인간 IL-7의 서열은 서열 번호: 52에서 도시된다. 치환 또는 삽입은 자연뿐만 아니라 비-자연 아미노산 잔기를 수반할 수 있다. 아미노산 변형은 화학적 변형의 널리 알려진 방법 예컨대 글리코실화 부위의 부가 또는 탄수화물 부착 등을 포함한다.
본원 발명의 면역접합체는 예를 들면, 고체-상태 펩티드 합성 (예를 들면 Merrifield 고체상 합성) 또는 재조합 생산에 의해 획득될 수 있다. 재조합 생산의 경우에, 예를 들면, 전술된 바와 같은 면역접합체 (단편)를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 단리되고, 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 이런 폴리뉴클레오티드는 전통적인 절차를 이용하여 쉽게 단리되고 염기서열분석될 수 있다. 한 구체예에서, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드 중에서 하나 이상을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당업자에게 널리 공지된 방법이 적합한 전사/번역 제어 신호와 함께 면역접합체 (단편)의 코딩 서열을 내포하는 발현 벡터를 작제하는 데 이용될 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 참조: 예를 들면, the techniques described in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 부분일 수 있거나, 또는 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는 면역접합체 (단편)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 (다시 말하면, 코딩 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소와 작동가능하게 연결되어 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 구성되는 핵산의 부분이다. "종결 코돈" (TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지는 않지만, 만약 존재하면 코딩 영역의 일부인 것으로 고려될 수 있으며, 임의의 측접 서열, 예를 들면 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 5'와 3' 비번역 영역 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 두 개 이상의 코딩 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 작제물 내에, 예를 들면 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 작제물 내에, 예를 들면 별개의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 게다가, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 내포할 수 있거나, 또는 두 개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있다, 예를 들면 본원 발명의 벡터는 단백질분해 개열을 통해 최종 단백질로 번역후 또는 공동번역에서 분리되는 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 이에 더하여, 본원 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본원 발명의 면역접합체, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 또는 융합되지 않은 이종성 코딩 영역을 인코딩할 수 있다. 이종성 코딩 영역은 특수한 요소 또는 모티프, 예컨대 분비 신호 펩티드 또는 이종성 기능적 도메인을 제한 없이 포함한다. 작동 가능한 연결은 유전자 산물의 발현이 조절 서열(들)의 영향 또는 제어하에 놓이도록 하는 그와 같은 방식으로, 유전자 산물, 예를 들면 폴리펩티드에 대한 코딩 영역이 하나 이상의 조절 서열과 연결될 때이다. 2개의 DNA 단편 (예컨대 폴리펩티드 코딩 영역 및 그것과 연결된 프로모터)은 만약 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 야기하고, 만약 이들 2개의 DNA 단편 사이의 연쇄의 성격이 유전자 산물의 발현을 주동하는 발현 조절 서열의 능력을 간섭하지 않거나 또는 전사되는 DNA 주형의 능력을 간섭하지 않으면 "작동가능하게 연결"된다. 따라서, 프로모터 영역은 만약 이러한 프로모터가 핵산의 전사를 달성할 수 있다면, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 작동가능하게 연결될 것이다. 프로모터는 미리 결정된 세포에서만 DNA의 실제적인 전사를 주동하는 세포 특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에 다른 전사 제어 요소, 예를 들면 인핸서, 오퍼레이터, 억제인자, 그리고 전사 종결 신호가 세포 특이적 전사를 주동하기 위해 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 제어 영역이 본원에서 개시된다. 다양한 전사 제어 영역이 당업자에게 알려져 있다. 이들은 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역, 예컨대 하지만 제한 없이, 시토메갈로바이러스로부터 프로모터와 인핸서 분절 (예를 들면 인트론-A와 함께 극초기 프로모터), 유인원 바이러스 40 (예를 들면 초기 프로모터), 그리고 레트로바이러스 (예컨대 예를 들면 라우스 육종 바이러스)를 제한 없이 포함한다. 다른 전사 제어 영역은 척추동물 유전자로부터 유래된 것들 예컨대 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 제어 영역은 조직 특이적 프로모터와 인핸서뿐만 아니라 유도성 프로모터 (예를 들면 프로모터 유도성 테트라사이클린)를 포함한다. 유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 당업자에게 알려져 있다. 이들은 리보솜 결합 부위, 번역 개시와 종결 코돈, 그리고 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소 (특히 내부 리보솜 유입 부위 또는 IRES, CITE 서열로서 또한 지칭됨)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 발현 카세트는 또한, 다른 특질 예컨대 복제 기점 및/또는 염색체 통합 요소 예컨대 레트로바이러스 긴 말단 반복 (LTR) 또는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 반전 말단 반복 (ITR)을 포함할 수 있다.
본원 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 본원 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 분비를 주동하는 분비 또는 신호 펩티드를 인코딩하는 추가 코딩 영역과 연결될 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유류 세포에 의해 분비된 단백질은 일단 조면소포체의 전역에서 성장 단백질 사슬의 이출이 시작되면, 성숙 단백질로부터 개열되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비되는 폴리펩티드가 일반적으로, 이러한 폴리펩티드의 N 말단에 융합된 신호 펩티드를 갖는다는 것을 인식하는데, 신호 펩티드는 번역되는 폴리펩티드로부터 개열되어 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙" 형태가 생산된다. 대안으로, 이종성 포유류 신호 펩티드, 또는 이의 기능적 유도체가 이용될 수 있다. 예를 들면, 야생형 리더 서열이 인간 조직 플라스미노겐 활성인자 (TPA) 또는 생쥐 β-글루쿠론산분해효소의 리더 서열로 치환될 수 있다.
추후 정제를 가능하게 하거나 (예를 들면 히스티딘 태그) 또는 면역접합체의 표지화를 보조하는 데 이용될 수 있었던 짧은 단백질 서열을 인코딩하는 DNA가 상기 면역접합체 (단편) 인코딩 폴리뉴클레오티드 내에 또는 이의 단부에서 포함될 수 있다.
추가 구체예에서, 본원 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이들 폴리뉴클레오티드와 벡터는 각각, 폴리뉴클레오티드 및 벡터와 관련하여 본원에서 설명된 임의의 특질을 단독적으로 또는 조합으로 통합할 수 있다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 숙주 세포는 본원 발명의 면역접합체를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함한다 (예를 들면, 이것으로 형질전환되거나 또는 형질감염되었다). 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본원 발명의 면역접합체 또는 이의 단편을 산출하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 지칭한다. 면역접합체를 복제하고 이들의 발현을 뒷받침하는 데 적합한 숙주 세포는 당해 분야에서 널리 알려져 있다. 이런 세포는 타당하면, 특정 발현 벡터로 형질감염되거나 또는 형질도입될 수 있고, 대량의 벡터 내포 세포는 대규모 발효기에 파종되어 임상적 적용을 위한 충분한 양의 면역접합체를 획득하기 위해 성장될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예컨대 대장균 (E. coli), 또는 다양한 진핵 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 세포 (CHO), 곤충 세포, 또는 기타 유사한 것을 포함한다. 예를 들면, 폴리펩티드는 특히 글리코실화가 필요하지 않을 때 세균에서 생산될 수 있다. 발현 후, 폴리펩티드는 가용성 분획물에서 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 더욱 정제될 수 있다. 원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어, 부분적으로 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드의 생산을 유발하는 균류 및 효모 균주를 비롯한, 실모양 균류 또는 효모가 폴리펩티드-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참조: Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004) 및 Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). (글리코실화된) 폴리펩티드의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 생물체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 실례는 식물과 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 이용될 수 있는 다양한 바쿨로바이러스 계통이 확인되었다. 식물 세포 배양액 또한, 숙주로서 활용될 수 있다. 참조: 예를 들면, US 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (유전자도입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 설명). 척추동물 세포 또한, 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 현탁 상태에서 성장하도록 적응되는 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 실례는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면, Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)에서 설명된 바와 같은 293 또는 293T 세포), 아기 햄스터 신장 세포 (BHK), 생쥐 세르톨리 세포 (예를 들면, Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)에서 설명된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포 (CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76), 인간 경부 암종 세포 (HELA), 개 신장 세포 (MDCK), 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A), 인간 폐 세포 (W138), 인간 간 세포 (Hep G2), 생쥐 유방 종양 세포 (MMT 060562), TRI 세포 (예를 들면, Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)에서 설명된 바와 같이), MRC 5 세포, 그리고 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 dhfr- CHO 세포를 비롯한, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); 그리고 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0, P3X63 및 Sp2/0을 포함한다. 단백질 생산에 적합한 일정한 포유류 숙주 세포주에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참조한다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예컨대 몇몇 예를 들면, 포유류 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포를 포함하지만, 그러나 또한 유전자도입 동물, 유전자도입 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유류 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 배아 신장 (HEK) 세포 또는 림프구양 세포 (예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
이들 시스템에서 외래 유전자를 발현하는 표준 기술은 당해 분야에서 공지된다. 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 어느 한 가지에 융합된 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 발현하는 세포는 발현된 돌연변이체 IL-7 융합 산물이 중쇄와 경쇄 둘 모두를 갖는 항체이도록, 이들 항체 사슬 중에서 다른 것을 또한 발현하도록 조작될 수 있다.
한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역접합체를 생산하는 방법이 제공되는데, 여기서 상기 방법은 본원에서 제시된 바와 같은 면역접합체의 발현에 적합한 조건하에, 상기 면역접합체를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 임의적으로, 상기 면역접합체를 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 단계를 포함한다.
본원 발명의 면역접합체에서, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 항체에 유전적으로 융합될 수 있거나, 또는 항체에 화학적으로 접합될 수 있다. 항체에 IL-7 폴리펩티드의 유전자 융합은 IL-7 서열이 상기 폴리펩티드에 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 융합되도록 설계될 수 있다. 링커의 조성과 길이는 당해 분야에서 널리 공지된 방법에 따라서 결정될 수 있고 효능에 대해 검사될 수 있다. 특정 링커 펩티드는 본원에서 설명된다. 원하는 경우에, 융합의 개별 구성요소를 분리하기 위한 개열 부위를 통합하기 위해 추가 서열, 예를 들면 엔도펩티다아제 인식 서열이 또한 포함될 수 있다. 이에 더하여, IL-7 융합 단백질은 또한, 당해 분야에서 널리 알려진 바와 같은 폴리펩티드 합성의 방법 (예를 들면 Merrifield 고체상 합성)을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 널리 알려진 화학적 접합 방법을 이용하여, 다른 분자, 예를 들면 항체에 화학적으로 접합될 수 있다. 당해 분야에서 널리 공지된 이중기능성 교차연결 시약 예컨대 동종기능성 및 이종기능성 교차연결 시약이 이러한 목적으로 이용될 수 있다. 이용되는 교차연결 시약의 유형은 IL-7에 연계되는 분자의 성격에 의존하고 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 대안으로, 또는 이에 더하여, 돌연변이체 IL-7 및/또는 이것이 접합되도록 의도되는 분자는 이들 2개가 당해 분야에서 또한 널리 공지된 바와 같이 별개의 반응에서 접합될 수 있도록 화학적으로 유도체화될 수 있다.
본원 발명의 면역접합체는 항체를 포함한다. 항체를 생산하기 위한 방법은 당해 분야에서 널리 알려져 있다 (참조: 예를 들면 Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 비-자연 발생 항체는 고체상-펩티드 합성을 이용하여 작제될 수 있거나, 재조합적으로 생산될 수 있거나 (예를 들면 U.S. 특허 번호 4,186,567에서 설명된 바와 같이), 또는 예를 들면, 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리를 선별검사함으로써 획득될 수 있다 (참조: 예를 들면 U.S. 특허 번호 5,969,108, McCafferty). 면역접합체, 항체, 그리고 이들을 생산하기 위한 방법은 또한, 예를 들면 PCT 공개 번호 WO 2011/020783, WO 2012/107417 및 WO 2012/146628에서 상세하게 설명되고, 이들은 각각 본원에서 온전히 참조로서 편입된다.
항체의 임의의 동물 종류가 본원 발명의 면역접합체에 이용될 수 있다. 본원 발명에서 유용한 무제한적 항체는 뮤린, 영장류, 또는 인간 기원일 수 있다. 만약 면역접합체가 인간 이용 용도로 의도되면, 항체의 불변 영역이 인간으로부터 유래되는, 항체의 키메라 형태가 이용될 수 있다. 항체의 인간화 또는 완전 인간 형태 역시 당해 분야에서 널리 알려진 방법에 따라서 제조될 수 있다 (참조: 예를 들면 U.S. 특허 번호 5,565,332, Winter). 인간화는 (a) 비인간 (예를 들면, 공여자 항체) CDR을, 결정적인 프레임워크 잔기 (예를 들면, 우수한 항원 결합 친화성 또는 항체 기능을 유지하는 데 중요한 것들)의 보유와 함께 또는 보유 없이 인간 (예를 들면 수용자 항체) 프레임워크 및 불변 영역 위에 합체하거나, (b) 비인간 특이성 결정 영역 (SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 결정적인 잔기)만을 인간 프레임워크 및 불변 영역 위에 합체하거나, 또는 (c) 전체 비인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기의 대체에 의해 이들을 인간 유사 섹션으로 "은폐하는" 것을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 인간화 항체 및 이들을 만드는 방법은 예를 들면, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 검토되고, 예를 들면, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (특이성 결정 영역 (SDR) 합체를 설명); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) ("표면치환"을 설명); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링"을 설명); 그리고 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "보도된 선택" 접근법을 설명)에서 더욱 설명된다. 인간화에 이용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: "최고 적합" 방법을 이용하여 선택된 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); 인간 성숙 (체성으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); 그리고 선별검사 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
인간 항체는 당해 분야에서 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)에서 전반적으로 설명된다. 인간 항체는 항원 공격에 대한 응답으로 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 포함하는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 유전자도입 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이런 동물은 전형적으로, 내인성 면역글로불린 좌위를 대체하거나, 또는 염색체외로 존재하거나 또는 동물의 염색체 내로 무작위로 통합되는 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 내포한다. 이런 유전자도입 생쥐에서, 내인성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 비활성화된다. 유전자도입 동물로부터 인간 항체를 획득하기 위한 방법에 관한 검토를 위해, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)를 참조한다. 또한, 예를 들면, XENOMOUSETM 기술을 설명하는 U.S. 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584; HuMab® 기술을 설명하는 U.S. 특허 번호 5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 설명하는 U.S. 특허 번호 7,041,870, 그리고 VelociMouse® 기술을 설명하는 U.S. 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900을 참조한다. 이런 동물에 의해 산출된 무손상 항체로부터 인간 가변 영역은 예를 들면, 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 더욱 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한, 하이브리도마-기초된 방법에 의해 만들어질 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 생쥐-인간 헤테로골수종 세포주가 설명되었다. (참조: 예를 들면, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) 인간 B-세포 하이브리도마 기법을 통해 산출된 인간 항체 역시 Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에서 설명된다. 추가 방법은 예를 들면, U.S. 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단일클론 인간 IgM 항체의 생산을 설명) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 설명)에서 설명된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기법 (트리오마 기술) 역시 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에서 설명된다.
인간 항체는 또한, 본원에서 설명된 바와 같이, 인간 항체 라이브러리로부터 단리에 의해 산출될 수 있다.
본원 발명에 유용한 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 선별검사함으로써 단리될 수 있다. 조합 라이브러리를 선별검사하기 위한 방법은 예를 들면, Lerner et al. in Nature Reviews 16:498-508 (2016)에서 검토된다. 예를 들면, 파지 전시 라이브러리를 산출하고, 원하는 결합 특징을 소유하는 항체에 대해 이런 라이브러리를 선별검사하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에서 공지된다. 이런 방법은 예를 들면, Frenzel et al. in mAbs 8:1177-1194 (2016); Bazan et al. in Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012) 및 Zhao et al. in Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016)에서뿐만 아니라 Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) 및 Marks and Bradbury in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)에서 검토된다.
일정한 파지 전시 방법에서, VH와 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되는데, 이들 라이브러리는 이후, Winter et al. in Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994)에서 설명된 바와 같이 항원 결합 파지에 대해 선별검사될 수 있다. 파지는 전형적으로, 단일 사슬 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 전시한다. 면역화된 공급원으로부터 라이브러리는 하이브리도마를 구축하는 요건 없이 면역원에 대한 높은 친화성 항체를 제공한다. 대안으로, 미경험 레퍼토리는 Griffiths et al. in EMBO Journal 12: 725-734 (1993)에 의해 설명된 바와 같이, 면역화 없이 넓은 범위의 비자가 및 또한 자가 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공하도록 클로닝될 수 있다 (예를 들면, 인간으로부터). 최종적으로, 미경험 라이브러리는 또한, Hoogenboom and Winter in Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992)에 의해 설명된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 고도로 가변적 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성하기 위한 무작위 서열을 내포하는 PCR 프라이머를 이용함으로써 합성적으로 만들어질 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 설명하는 특허 공보는 예를 들면 US 특허 번호 5,750,373; 7,985,840; 7,785,903 및 8,679,490뿐만 아니라 US 특허 공개 번호 2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 및 2007/0292936을 포함한다. 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리를 선별검사하기 위한 당해 분야에서 알려진 방법의 추가 실례는 리보솜 및 mRNA 전시뿐만 아니라 세균, 포유류 세포, 곤충 세포 또는 효모 세포에서 항체 전시와 선택을 위한 방법을 포함한다. 효모 표면 전시를 위한 방법은 예를 들면 Scholler et al. in Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012) 및 Cherf et al. in Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015)에서뿐만 아니라 Zhao et al. in Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012)에서 검토된다. 리보솜 전시를 위한 방법은 예를 들면 He et al. in Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997) 및 Hanes et al. in PNAS 94:4937-4942 (1997)에서 설명된다.
본원 발명의 면역접합체의 추가 화학적 변형이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 면역원성 및 짧은 반감기의 문제가 실제적으로 직쇄 중합체 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜 (PPG)에 접합에 의해 향상될 수 있다 (참조: 예를 들면 WO 87/00056).
본원에서 설명된 바와 같이 제조된 면역접합체는 공지된 기술 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기이동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 기타 등등에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질을 정제하는 데 이용되는 실제 조건은 순전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 부분적으로 의존할 것이고, 당업자에게 명백할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, 항체, 리간드, 수용체, 또는 면역접합체가 결합하는 항원이 이용될 수 있다. 예를 들면, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체가 이용될 수 있다. 본원 발명의 면역접합체의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스가 이용될 수 있다. 예를 들면, 순차적 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피가 본질적으로 실시예에서 설명된 바와 같이 면역접합체를 단리하는 데 이용될 수 있다. 면역접합체의 순도는 겔 전기이동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 비롯한 임의의 다양한 널리 알려진 분석법에 의해 결정될 수 있다.
조성물, 제제 및 투여 루트
추가의 양상에서, 본원 발명은 예를 들면, 임의의 하기 치료 방법에서 이용을 위한 본원에서 설명된 바와 같은 면역접합체를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 한 구체예에서, 제약학적 조성물은 본원에서 제공된 임의의 면역접합체 및 제약학적으로 허용되는 운반체를 포함한다. 다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 예를 들면, 아래에 설명된 바와 같이, 본원에서 제공된 면역접합체 및 적어도 한 가지의 추가 치료제를 포함한다.
생체내 투여에 적합한 형태에서 본원 발명의 면역접합체를 생산하는 방법이 더욱 제공되고, 상기 방법은 (a) 본원 발명에 따른 면역접합체를 획득하는 단계, 그리고 (b) 상기 면역접합체를 적어도 하나의 제약학적으로 허용되는 운반체로 조제하는 단계를 포함하고, 여기서 면역접합체의 제조물은 생체내 투여용으로 조제된다.
본원 발명의 제약학적 조성물은 제약학적으로 허용되는 운반체에서 용해되거나 또는 분산된 면역접합체의 치료 효과량을 포함한다. 관용구 "제약학적 또는 약리학적으로 허용되는"은 일반적으로 이용된 용량과 농도에서 수용자에게 비독성인, 다시 말하면, 적절하면 동물, 예컨대 예를 들면, 인간에게 투여될 때 불리한 반응, 알레르기 반응 또는 다른 부반응을 발생시키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 면역접합체 및 임의적으로 추가 활성 성분을 내포하는 제약학적 조성물의 제조는 본원에서 참조로서 편입되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990에 의해 예시된 바와 같이, 본원 발명에 비추어 당업자에게 알려져 있을 것이다. 게다가, 동물 (예를 들면, 인간) 투여의 경우에, 제조물은 FDA 생물 표준 사무국 또는 다른 국가에서 해당 정부 당국에 의해 요구되는 바와 같은 무균, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 기준에 부합해야 하는 것으로 이해될 것이다. 바람직한 조성물은 동결 건조된 제제 또는 수성 용액이다. 본원에서 이용된 바와 같이, "제약학적으로 허용되는 운반체"는 당업자에게 공지된 바와 같은, 임의의 모든 용매, 완충액, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제 (예를 들면, 항세균제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연 작용제, 염, 보존제, 항산화제, 단백질, 약물, 약물 안정제, 중합체, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 염료, 이들과 유사한 물질 그리고 이들의 조합을 포함한다 (예를 들면, 본원에서 참조로서 편입되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329를 참조한다). 임의의 전통적인 운반체가 활성 성분과 양립하지 않는 경우가 아닌 한에 있어서, 치료적 또는 제약학적 조성물에서 이의 이용이 예기된다.
본원 발명의 면역접합체 (및 임의의 추가 치료제)는 비경구, 폐내 및 비내를 비롯한 임의의 적절한 수단에 의해, 그리고 국소 치료를 위해 원하는 경우에, 병소내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 임의의 적합한 루트에 의할 수 있다, 예를 들면, 부분적으로 투여가 단기 또는 장기인지에 따라서, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다.
비경구 조성물은 주사, 예를 들면 피하, 피내, 병소내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 척수강내 또는 복막내 주사에 의한 투여용으로 설계된 것들을 포함한다. 주사를 위해, 본원 발명의 면역접합체는 수성 용액에서, 바람직하게는 생리학적으로 양립성 완충액 예컨대 행크 용액, 링거액, 또는 생리식염수 완충액에서 조제될 수 있다. 용액은 조제 작용제 예컨대 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 내포할 수 있다. 대안으로, 면역접합체는 이용 전, 적합한 운반제, 예를 들면, 무균 발열원 없는 물로 구성을 위한 분말 형태일 수 있다. 무균 주사가능 용액은 적합한 용매에서 필요한 양의 본원 발명의 면역접합체를, 필요에 따라, 아래에 열거된 다양한 다른 성분과 통합함으로써 제조된다. 살균은 예를 들면, 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 살균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및/또는 다른 성분을 내포하는 무균 운반제 내로 통합함으로써 제조된다. 무균 주사가능 용액, 현탁액 또는 유제의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 또는 동결 건조 기술인데, 이들 기술은 이전에 무균 여과된 액체 배지로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 산출한다. 액체 매질은 필요하면 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 주사에 앞서, 충분한 식염수 또는 글루코오스로 먼저 등장성이 되도록 만들어져야 한다. 조성물은 제조와 보관의 조건하에 안정되어야 하고, 미생물, 예컨대 세균 및 균류의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준에서, 예를 들면, 0.5 ng/mg 단백질 미만으로 최소한으로 유지되어야 함을 인지할 것이다. 적합한 제약학적으로 허용되는 운반체는 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 완충액, 예컨대 인산염, 구연산염, 그리고 다른 유기 산; 아스코르빈산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들면, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 덱스트란, 또는 기타 유사한 것을 내포할 수 있다. 임의적으로, 현탁액은 또한, 화합물의 용해도를 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 데 적합한 안정제 또는 작용제를 내포할 수 있다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적합한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 운반제는 지방유 예컨대 호마유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 클리트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜을 포함한다.
활성 성분은 예를 들면, 액적형성 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로유제, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로유제에서 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이런 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990)에서 개시된다. 지속된 방출 제조물이 제조될 수 있다. 지속된 방출 제조물의 적합한 실례는 폴리펩티드를 내포하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하는데, 이들 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 특정한 구체예에서, 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 이들 조성물에서 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이들의 조합의 이용에 의해 달성될 수 있다.
전술된 조성물에 더하여, 면역접합체는 또한 저장소 제조물로서 조제될 수 있다. 이런 지속성 제제는 이식 (예를 들면, 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 면역접합체는 적합한 중합성 또는 소수성 물질 (예를 들면, 허용되는 오일에서 유제로서) 또는 이온 교환 수지로, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들면, 난용성 염으로서 조제될 수 있다.
본원 발명의 면역접합체를 포함하는 제약학적 조성물은 전통적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결 건조 과정에 의하여 제조될 수 있다. 제약학적 조성물은 이들 단백질의 제약학적으로 이용될 수 있는 제조물로의 처리를 가능하게 하는 한 가지 이상의 생리학적으로 허용가능 운반체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 이용하여 전통적인 방식으로 조제될 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여 루트에 의존한다.
면역접합체는 유리 산 또는 염기, 중성 또는 염 형태에서 조성물로 조제될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 염은 유리 산 또는 염기의 생물학적 활성을 실제적으로 유지하는 염이다. 이들은 산 부가염, 예를 들면, 단백질성 조성물의 자유 아미노 기로 형성된 것들, 또는 무기 산 예컨대 예를 들면, 염화수소산 또는 인산, 또는 유기 산 예컨대 아세트산, 옥살산, 주석산 또는 만델산으로 형성된 것들을 포함한다. 자유 카르복실 기로 형성된 염은 또한, 무기 염기 예컨대 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철; 또는 유기 염기 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인으로부터 유래될 수 있다. 제약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매에서 더 가용성인 경향이 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에서 제공된 임의의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 면역접합체는 치료 방법에서 이용될 수 있다. 본원 발명의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 면역접합체는 예를 들면 암의 치료에서 면역치료제로서 이용될 수 있다.
치료 방법에서 이용을 위해, 본원 발명의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 면역접합체는 모범 의료행위 지침과 일치하는 방식으로 조제되고, 투약되고, 투여될 것이다. 이러한 문맥에서 고려되는 인자는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여의 일정, 그리고 개업의에게 공지된 다른 인자를 포함한다.
본원 발명의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 면역접합체는 숙주의 면역계의 자극이 유익한 질환 상태, 특히 증강된 세포성 면역 반응이 바람직한 질환을 치료하는 데 특히 유용할 수 있다. 이들은 숙주 면역 반응이 불충분하거나 또는 결함성인 질환 상태를 포함할 수 있다. 본원 발명의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 면역접합체가 투여될 수 있는 질환 상태는 예를 들면, 세포성 면역 반응이 특이적 면역에 대한 결정적인 기전일 종양 또는 감염을 포함한다. 본원 발명의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 면역접합체는 그 자체로 또는 임의의 적합한 제약학적 조성물에 담겨 투여될 수 있다.
한 양상에서, 약제로서 이용을 위한 본원 발명의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 면역접합체가 제공된다. 추가의 양상에서, 질환을 치료하는 데 이용을 위한 본원 발명의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 면역접합체가 제공된다. 일정한 구체예에서, 치료 방법에서 이용을 위한 본원 발명의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 면역접합체가 제공된다. 한 구체예에서, 본원 발명은 치료가 필요한 개체에서 질환의 치료에서 이용을 위한 본원에서 설명된 바와 같은 면역접합체를 제공한다. 한 구체예에서, 본원 발명은 치료가 필요한 개체에서 질환의 치료에서 이용을 위한 본원에서 설명된 바와 같은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 질환을 앓는 개체를 치료하는 방법에서 이용을 위한 돌연변이체 IL-7 및 면역접합체를 제공하는데, 상기 방법은 면역접합체의 치료 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서 치료되는 질환은 증식성 장애이다. 특정한 구체예에서 질환은 암이다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제, 예를 들면, 만약 치료되는 질환이 암이면 항암제의 치료 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 추가 구체예에서, 본원 발명은 면역계를 자극하는 데 이용을 위한 면역접합체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 개체에서 면역계를 자극하는 방법에서 이용을 위한 돌연변이체 IL-7 및/또는 면역접합체를 제공하는데, 상기 방법은 면역계를 자극하기 위한 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 임의의 상기 구체예에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 임의의 상기 구체예에 따른 "면역계의 자극"은 면역 기능에서 전반적인 증가, T 세포 기능에서 증가, B 세포 기능에서 증가, 림프구 기능의 수복, IL-2 수용체의 발현에서 증가, T 세포 반응성에서 증가, 자연 살해 세포 활성 또는 림포카인 활성화 킬러 (LAK) 세포 활성에서 증가, 기타 등등 중에서 한 가지 이상을 포함할 수 있다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 약제의 제조 또는 준비에서 본원 발명의 돌연변이체 IL-7 및/또는 면역접합체의 용도를 제공한다. 한 구체예에서, 약제는 치료가 필요한 개체에서 질환의 치료를 위한 것이다. 한 구체예에서, 약제는 질환을 치료하는 방법에서 이용을 위한 것이고, 상기 방법은 상기 약제의 치료 효과량을 질환을 앓는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서 치료되는 질환은 증식성 장애이다. 특정한 구체예에서 질환은 암이다. 한 구체예에서, 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제, 예를 들면, 만약 치료되는 질환이 암이면 항암제의 치료 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 추가 구체예에서, 약제는 면역계를 자극하기 위한 것이다. 추가 구체예에서, 약제는 개체에서 면역계를 자극하는 방법에서 이용을 위한 것이고, 상기 방법은 면역계를 자극하기 위한 약제의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 임의의 상기 구체예에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다. 임의의 상기 구체예에 따른 "면역계의 자극"은 면역 기능에서 전반적인 증가, T 세포 기능에서 증가, B 세포 기능에서 증가, 림프구 기능의 수복, IL-2 수용체의 발현에서 증가, T 세포 반응성에서 증가, 자연 살해 세포 활성 또는 림포카인 활성화 킬러 (LAK) 세포 활성에서 증가, 기타 등등 중에서 한 가지 이상을 포함할 수 있다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 개체에서 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 이런 질환을 앓는 개체에게 본원 발명의 돌연변이체 IL-7 및/또는 면역접합체의 치료 효과량을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서 제약학적으로 허용되는 형태에서 본원 발명의 돌연변이체 IL-7 및/또는 면역접합체를 포함하는 조성물이 상기 개체에게 투여된다. 일정한 구체예에서 치료되는 질환은 증식성 장애이다. 특정한 구체예에서 질환은 암이다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제, 예를 들면, 만약 치료되는 질환이 암이면 항암제의 치료 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 추가의 양상에서, 본원 발명은 개체에서 면역계를 자극하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 면역계를 자극하기 위한 돌연변이체 IL-7 및/또는 면역접합체의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 임의의 상기 구체예에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다. 임의의 상기 구체예에 따른 "면역계의 자극"은 면역 기능에서 전반적인 증가, T 세포 기능에서 증가, B 세포 기능에서 증가, 림프구 기능의 수복, IL-2 수용체의 발현에서 증가, T 세포 반응성에서 증가, 자연 살해 세포 활성 또는 림포카인 활성화 킬러 (LAK) 세포 활성에서 증가, 기타 등등 중에서 한 가지 이상을 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서 치료되는 질환은 증식성 장애, 특히 암이다. 암의 무제한적 실례는 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평상피 세포 암종, 골암, 그리고 신장암을 포함한다. 본원 발명의 면역접합체를 이용하여 치료될 수 있는 다른 세포 증식 장애는 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비 샘 (부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계 (중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 영역, 그리고 비뇨생식기계에서 위치된 신생물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 전암성 상태 또는 병변 및 암 전이 또한 포함된다. 일정한 구체예에서 암은 신장암, 피부암, 폐암, 결장직장암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 전립선암 및 방광암으로 구성된 군에서 선택된다. 당업자는 많은 경우에 면역접합체가 치유를 제공할 수 없을 수도 있으며 단지 부분적인 유익성만을 제공할 수도 있다는 것을 쉽게 인식한다. 일부 구체예에서, 일부 유익성을 갖는 생리학적 변화 또한 치료적으로 유익한 것으로 고려된다. 따라서, 일부 구체예에서, 생리학적 변화를 제공하는 면역접합체의 양은 "효과량" 또는 "치료 효과량"인 것으로 고려된다. 치료가 필요한 개체, 환자, 또는 피험자는 전형적으로 포유동물, 더 특정하게는 인간이다.
일부 구체예에서, 본원 발명의 면역접합체의 효과량은 세포에 투여된다. 다른 구체예에서, 본원 발명의 면역접합체의 치료 효과량은 질환의 치료를 위해 개체에게 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위한, 본원 발명의 면역접합체의 적절한 용량 (단독으로 이용되거나 또는 한 가지 이상의 다른 추가 치료제와 병용될 때)은 치료되는 질환의 유형, 투여 루트, 환자의 체중, 분자의 유형 (Fc 도메인을 포함하거나 또는 그렇지 않음), 질환의 중증도와 경과, 면역접합체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 또는 동시 치료적 개입, 환자의 임상 병력 및 면역접합체에 대한 반응, 그리고 주치의의 재량에 의존할 것이다. 어떤 상황에서든, 투여에 대한 책임이 있는 의사가 조성물에서 활성 성분(들)의 농도 및 개별 개체에 대한 적합한 용량(들)을 결정할 것이다. 단회 투여 또는 다양한 시점에 걸쳐 복수 투여, 일시 투여, 그리고 펄스 주입을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 투약 일정이 본원에서 예기된다.
면역접합체는 적합하게는, 한꺼번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다. 질환의 유형과 중증도에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들면, 0.1 mg/kg - 10mg/kg)의 면역접합체가 예를 들면, 1회 이상의 별개 투여에 의한, 또는 연속 주입에 의한 것인지에 상관없이, 환자에게 투여를 위한 초기 후보 용량일 수 있다. 한 가지 전형적인 일일량은 전술된 인자에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수도 있다. 수일 이상에 걸쳐 반복된 투여의 경우에, 상태에 따라서, 치료는 일반적으로, 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 면역접합체의 한 가지 예시적인 용량은 약 0.005 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위 안에 있을 것이다. 다른 무제한적 실례에서, 용량은 또한, 투여마다 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중 내지 약 1000 mg/kg/체중 이상, 그리고 그 안에서 도출 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에서 열거된 숫자로부터 도출 가능한 범위의 무제한적 실례에서, 약 5 mg/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중, 기타 등등의 범위가 전술된 숫자에 근거하여 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합) 중에서 한 가지 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이런 용량은 간헐적으로, 예를 들면 매주 또는 3 주마다 (예를 들면 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들면, 약 6회 용량의 면역접합체를 제공받도록) 투여될 수 있다. 초기 더 높은 부하 용량, 그 이후에 1회 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 하지만, 다른 투약 섭생이 유용할 수도 있다. 이러한 요법의 진행은 전통적인 기술과 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
본원 발명의 면역접합체는 일반적으로, 의도된 목적을 달성하는 데 효과적인 양으로 이용될 것이다. 질환 상태를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위해, 본원 발명의 면역접합체, 또는 이의 제약학적 조성물은 치료 효과량으로 투여되거나 또는 적용된다. 치료 효과량의 결정은 특히 본원에서 제공된 상술된 개시에 비추어, 당업자의 능력 범위 안에 있다.
전신 투여의 경우, 치료적으로 유효 용량은 시험관내 검정, 예컨대 세포 배양 검정으로부터 초기에 추정될 수 있다. 용량은 이후, 세포 배양액에서 결정된 대로의 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모형에서 공식화될 수 있다. 이런 정보는 인간에서 유용한 용량을 더 정확하게 결정하는 데 이용될 수 있다.
초기 용량은 또한, 당해 분야에서 널리 공지된 기술을 이용하여 생체내 데이터, 예를 들면, 동물 모형으로부터 추정될 수 있다. 당업자는 동물 데이터에 근거하여 인간에 대한 투여를 쉽게 최적화할 수 있었다.
복용량 및 간격은 치료 효과를 유지하는 데 충분한, 면역접합체의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. 주사에 의한 투여를 위한 통상의 환자 용량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 mg/kg/일의 범위 안에 있다. 치료적으로 효과적인 혈장 수준은 매일 복수 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 혈장에서 수준은 예를 들면, HPLC에 의해 계측될 수 있다.
국부 투여 또는 선택적 흡수의 사례에서, 면역접합체의 효과적인 국부 농도는 혈장 농도에 관련되지 않을 수도 있다. 당업자는 과도한 실험 없이 치료적으로 효과적인 국부 용량을 최적화할 수 있을 것이다.
본원에서 설명된 면역접합체의 치료적으로 유효 용량은 일반적으로, 실제적인 독성을 유발하지 않으면서 치료적 유익성을 제공할 것이다. 면역접합체의 독성 및 치료 효능은 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준 제약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 세포 배양액 검정 및 동물 연구가 LD50 (모집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50 (모집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하는 데 이용될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이에 용량 비율은 치료 지수인데, 이것은 비율 LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 면역접합체가 선호된다. 한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역접합체는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양액 검정 및 동물 연구로부터 획득된 데이터는 인간에서 이용에 적합한 용량의 범위를 공식화하는 데 이용될 수 있다. 용량은 바람직하게는, 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 안에 있다. 용량은 다양한 인자, 예를 들면, 이용된 약형, 활용된 투여 루트, 개체의 상태 등에 따라서 이러한 범위 내에서 변할 수 있다. 정확한 제제, 투여 루트 및 용량은 환자의 상태에 비추어 개별 의사에 의해 선택될 수 있다. (예를 들면, 본원에서 온전히 참조로서 편입되는 Fingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1을 참조한다).
본원 발명의 면역접합체로 치료되는 환자에 대한 주치의는 독성, 장기 기능장애 등으로 인해 투여를 언제 및 어떻게 종결하거나, 중단하거나, 또는 조정할지를 알고 있을 것이다. 반대로, 주치의는 또한, 만약 임상적 반응이 적절하지 않으면 (독성 배제) 치료를 더 높은 수준으로 조정하는 것을 알고 있을 것이다. 관심되는 장애의 관리에서 투여된 용량의 크기는 치료되는 질환의 중증도, 투여 루트 등에 따라서 변할 것이다. 질환의 중증도는 예를 들면 부분적으로, 표준 예후적 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 게다가, 용량 및 아마도 투약 빈도 또한 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라서 변할 것이다.
본원에서 설명된 바와 같은 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체의 최대 치료 용량은 야생형 IL-7을 포함하는 면역접합체에 대해 이용되는 것들로부터 증가될 수 있다.
다른 작용제 및 치료
본원 발명에 따른 면역접합체는 치료 동안 한 가지 이상의 다른 작용제와 병용으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 본원 발명의 면역접합체는 적어도 한 가지 추가 치료제와 병용투여될 수 있다. 용어 "치료제"는 이런 치료가 필요한 개체에서 증상 또는 질환을 치료하기 위해 투여되는 임의의 작용제를 포괄한다. 이런 추가 치료제는 치료되는 특정 징후에 적합한 임의의 활성 성분, 바람직하게는 서로에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 추가 치료제는 면역조정제, 정균제, 세포 부착의 저해제, 세포독성제, 세포 아폽토시스의 활성인자, 또는 아폽토시스성 유도인자에 대한 세포의 민감도를 증가시키는 작용제이다. 특정한 구체예에서, 추가 치료제는 항암제, 예를 들면 미소관 교란물질, 대사길항물질, 국소이성화효소 저해제, DNA 삽입제, 알킬화제, 호르몬 요법, 키나아제 저해제, 수용체 길항제, 종양 세포 아폽토시스의 활성인자, 또는 항신생혈관제이다.
이런 다른 작용제는 적절하게는 의도된 목적에 효과적인 양에서 조합으로 존재한다. 이런 다른 작용제의 효과량은 이용된 면역접합체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 그리고 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 면역접합체는 일반적으로, 본원에서 설명된 바와 동일한 용량에서 및 투여 루트로, 또는 본원에서 설명된 용량의 약 1 내지 99%에서, 또는 경험적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정되는 임의의 용량에서 및 임의의 루트에 의해 이용된다.
전술된 이런 병용 요법은 병용 투여 (여기서 두 가지 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 조성물 내에 포함된다) 및 별개 투여를 포괄하고, 이러한 사례에서, 본원 발명의 면역접합체의 투여는 추가 치료제 및/또는 어쥬번트의 투여에 앞서, 투여와 동시에 및/또는 투여 이후에 발생할 수 있다. 본원 발명의 면역접합체는 또한, 방사선요법과 병용될 수 있다.
제조 물품
본원 발명의 다른 양상에서, 전술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 내포하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 결합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 단독으로, 또는 질환을 치료하고, 예방하고 및/또는 진단하는 데 효과적인 다른 조성물과 조합으로 조성물을 보유하고, 무균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백, 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물에서 적어도 한 가지 활성제는 본원 발명의 면역접합체이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택 질환을 치료하는 데 이용된다는 것을 지시한다. 게다가, 제조 물품은 (a) 조성물이 그 안에 내포된 첫 번째 용기 (여기서 상기 조성물은 본원 발명의 면역접합체를 포함한다); 및 (b) 조성물이 그 안에 내포된 두 번째 용기 (여기서 상기 조성물은 추가 세포독성제 또는 만약 그렇지 않으면 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본원 발명의 이러한 구체예에서 제조 물품은 조성물이 특정 질환을 치료하는 데 이용될 수 있다는 것을 표시하는 포장 삽입물을 더욱 포함할 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 제조 물품은 제약학적으로 허용되는 완충액, 예컨대 정균성 주사용수 (BWFI), 인산염-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 두 번째 (또는 세 번째) 용기를 더욱 포함할 수도 있다. 이것은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 비롯하여, 상업적 관점 및 이용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 더욱 포함할 수도 있다.
아미노산 서열
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아미노산 서열 re IL-7
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실시예
다음은 본원 발명의 방법과 조성물의 실시예이다. 앞서 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 구체예가 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
예시적인 형식은 도 1a, 1b, 1c, 1d 및 1e에서 개략적 표시로서 도시된다. 도 1a에서, IgG-IL7 면역접합체는 2개의 Fab 도메인 (가변 도메인, 불변 도메인), 이종이합체성 Fc 도메인 및 상기 Fc 도메인의 C 말단에 융합된 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 IgG-IL7 면역접합체는 서열 번호: 122, 서열 번호: 123 및 서열 번호: 124에 따른 아미노산 서열의 폴리펩티드로 구성된다. 도 1b에서, IgG-IL7 면역접합체는 2개의 Fab 도메인 (가변 도메인, 불변 도메인), 동종이합체성 Fc 도메인 및 상기 Fc 도메인의 C 말단에 융합된 2개의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 IgG-IL7 면역접합체는 서열 번호: 125 및 서열 번호: 126에 따른 아미노산 서열의 폴리펩티드로 구성된다. 도 1c에서, IgG-IL7 면역접합체는 하나의 Fab 도메인 (가변 도메인, 불변 도메인), 이종이합체성 Fc 도메인 및 상기 Fc 도메인의 C 말단에 융합된 하나의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 IgG-IL7 면역접합체는 서열 번호: 127, 서열 번호: 128 및 서열 번호: 129에 따른 아미노산 서열의 폴리펩티드로 구성된다. 도 1d에서, 2개의 Fab 도메인 (가변 도메인, 불변 도메인), 이종이합체성 Fc 도메인 및 이들 Fab 도메인 중 하나의 N 말단에 융합된 하나의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함하는 IgG-IL7 면역접합체 형식. 이러한 IgG-IL7 면역접합체는 서열 번호: 130, 서열 번호: 131 및 서열 번호: 132에 따른 아미노산 서열의 폴리펩티드로 구성된다. 도 1e에서, IgG-IL-7 면역접합체는 2개의 Fab 도메인 (가변 도메인, 불변 도메인), 동종이합체성 Fc 도메인 및 이들 Fab 도메인의 N 말단에 융합된 2개의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 IgG-IL7 면역접합체는 서열 번호: 133 및 서열 번호: 134에 따른 아미노산 서열의 폴리펩티드로 구성된다. 이들 예시적인 형식에 대하여 제공된 서열은 IL-7 야생형 서열을 갖는 면역접합체에 관계한다. 하지만, 본원에서 개시된 바와 같은 임의의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드가 야생형 IL-7 대신에 상기 형식에 통합될 수 있다.
실시예 1
실시예 1.1 PD1-IL7v 융합 단백질의 생산 및 분석기술
표 1의 경우에서와 같은 항체 IL7 융합 작제물, 예컨대 PD1-IL7 변이체 (PD1-IL7v)가 CHO 세포에서 생산되었다. 수확 후, 상층액 내에 존재하는 PD1-IL7 작제물의 역가가 단백질A-HPLC에 의해 결정되었다. 상층액이 선행 정제 없이, 검정 (세포 검정 및 표면 플라스몬 공명)에 직접적으로 이용되었다. 마이크로-정제 (1 단계 단백질A 정제)가 수행되었고, 상층액 내에 존재하는 분자의 품질을 사정하기 위해 용출물에 분석기술 (분석적 크기 배제 크로마토그래피 및 모세관 SDS 전기이동: CE-SDS)이 실행되었다.
표 1: 검사된 PD1-IL7 융합 단백질의 폴리펩티드 아미노산 서열
수용체 사슬과의 상호작용 서열 번호
PD1-IL7wt - 85, 86, 87
PD1-IL7-VAR1 (E13A) IL-7Ra 및 IL-2Rg 85, 86, 88
PD1-IL7-VAR2 (E13K) IL-7Ra 및 IL-2Rg 85, 86, 89
PD1-IL7-VAR3 (V15A) IL-7Ra 85, 86, 90
PD1-IL7-VAR4 (V15K) IL-7Ra 85, 86, 91
PD1-IL7-VAR5 (V18A) IL-7Ra 85, 86, 92
PD1-IL7-VAR6 (V18K) IL-7Ra 85, 86, 93
PD1-IL7-VAR7 (D21A) IL-2Rg 85, 86, 94
PD1-IL7-VAR8 (D21K) IL-2Rg 85, 86, 95
PD1-IL7-VAR9 (Q22A) IL-7Ra 및 IL-2Rg 85, 86, 96
PD1-IL7-VAR10 (Q22K) IL-7Ra 및 IL-2Rg 85, 86, 97
PD1-IL7-VAR11 (D25A) IL-2Rg 85, 86, 98
PD1-IL7-VAR12 (D25K) IL-2Rg 85, 86, 99
PD1-IL7-VAR13 (D74A) IL-7Ra 85, 86, 100
PD1-IL7-VAR14 (D74K) IL-7Ra 85, 86, 101
PD1-IL7-VAR15 (L77A) IL-7Ra 85, 86, 102
PD1-IL7-VAR16 (L77K) IL-7Ra 85, 86, 103
PD1-IL7-VAR17 (K81A) IL-7Ra 85, 86, 104
PD1-IL7-VAR18 (K81E) IL-7Ra 85, 86, 105
PD1-IL7-VAR19 (E84A) IL-7Ra 85, 86, 106
PD1-IL7-VAR20 (G85K) IL-7Ra 85, 86, 107
PD1-IL7-VAR21 (G85E) IL-7Ra 85, 86, 108
PD1-IL7-VAR22 (I88K) IL-7Ra 85, 86, 109
PD1-IL7-VAR23 (Q136A) IL-2Rg 85, 86, 110
PD1-IL7-VAR24 (Q136K) IL-2Rg 85, 86, 111
PD1-IL7-VAR25 (K139A) IL-2Rg 85, 86, 112
PD1-IL7-VAR26 (K139E) IL-2Rg 85, 86, 113
PD1-IL7-VAR27 (N143K) IL-2Rg 85, 86, 114
PD1-IL7-VAR28 (M147A) IL-2Rg 85, 86, 115
PD1-IL7-VAR29 (N-Glc KO, T72A) - 85, 86, 116
PD1-IL7-VAR30 (N-Glc KO, T93A) - 85, 86, 117
PD1-IL7-VAR31 (N-Glc KO, S118A) - 85, 86, 118
PD1-IL7-VAR32 (N-Glc KO, T72A, T93A, S118A) - 85, 86, 119
실시예 1.1. CHO K1 세포에서 IgG 유사 단백질의 생산
PD-IL7v 작제물이 Evitria에 의해, 전통적인 (비-PCR 기반) 클로닝 기술과 함께 자사의 독점적인 벡터 시스템을 이용하여, 그리고 현탁 적응 CHO K1 세포 (본래 ATCC로부터 수령되고 Evitria에서 현탁 배양 동안 혈청 없는 성장에 적응됨)를 이용하여 제조되었다. 생산을 위해, Evitria는 자사의 독점적인, 동물-성분 없고 혈청 없는 배지 (eviGrow 및 eviMake2) 및 자사의 독점적인 형질감염 시약 (eviFect)을 이용하였다. 상층액이 원심분리 및 후속 여과 (0.2 μm 필터)에 의해 수확되었다.
실시예 1.2. 단백질A-HPLC에 의한 역가 결정
상층액 내에 존재하는 Fc 내포 작제물의 정량이 UV 검출기가 구비된 Agilent HPLC 시스템 상에서 단백질 A - HPLC에 의해 수행되었다. 상층액이 POROS 20 A 칼럼 (Applied Biosystems)에 주입되고, 10mM 트리스, 50mM 글리신, 100mM NaCl, pH 8.0으로 세척되고, pH 2.0에서 동일한 완충액에서 용리되었다. 280 nm에서 용리된 피크 면적이 적분되고, 동일한 작업에서 분석된 표준으로 산출된 교정 곡선의 이용에 의해 농도로 전환되었다 (표 2 참조).
표 2: 단백질A-HPLC에 의해 결정된, 수확된 CHO 상층액의 역가 결정.
농도 (μg/μl)
PD1-IL7-VAR1 (E13A) 0.19
PD1-IL7-VAR2 (E13K) 0.22
PD1-IL7-VAR3 (V15A) 0.24
PD1-IL7-VAR4 (V15K) 0.25
PD1-IL7-VAR5 (V18A) 0.25
PD1-IL7-VAR6 (V18K) 0.25
PD1-IL7-VAR7 (D21A) 0.24
PD1-IL7-VAR8 (D21K) 0.27
PD1-IL7-VAR9 (Q22A) 0.24
PD1-IL7-VAR10 (Q22K) 0.23
PD1-IL7-VAR11 (D25A) 0.25
PD1-IL7-VAR12 (D25K) 0.23
PD1-IL7-VAR13 (D74A) 0.25
PD1-IL7-VAR14 (D74K) 0.23
PD1-IL7-VAR15 (L77A) 0.23
PD1-IL7-VAR16 (L77K) 0.26
PD1-IL7-VAR17 (K81A) 0.24
PD1-IL7-VAR18 (K81E) 0.25
PD1-IL7-VAR19 (E84A) 0.23
PD1-IL7-VAR20 (G85K) 0.22
PD1-IL7-VAR21 (G85E) 0.24
PD1-IL7-VAR22 (I88K) 0.25
PD1-IL7-VAR23 (Q136A) 0.26
PD1-IL7-VAR24 (Q136K) 0.25
PD1-IL7-VAR25 (K139A) 0.25
PD1-IL7-VAR26 (K139E) 0.22
PD1-IL7-VAR27 (N143K) 0.22
PD1-IL7-VAR28 (M147A) 0.22
PD1-IL7-VAR29 (N-Glc KO, T72A) 0.23
PD1-IL7-VAR30 (N-Glc KO, T93A) 0.22
PD1-IL7-VAR31 (N-Glc KO, S118A) 0.20
PD1-IL7-VAR32 (N-Glc KO, T72A, T93A, S118A) 0.23
PD1-IL7wt 0.24
실시예 1.3. IgG 유사 단백질의 정제
1 단계 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 96 웰 형식에서 액체 처리 플랫폼 상에서, 여과된 세포 배양 상층액으로부터 단백질이 정제되었다. 간단히 말하면, 상층액이 ProPlus PhyTip 칼럼 (MabSelect SuRe™, Phynexus)에 부하되고 20 mM 인산나트륨, 20 mM 구연산나트륨, pH 7.5로 세척되었다. 표적 단백질이 20 mM 구연산나트륨, 100 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신, pH 3.0에서 용리되고 0.5 M 인산나트륨, pH 8.0으로 중화된다.
실시예 1.4. IgG 유사 단백질의 분석기술
작업 완충액 (200 mM KH2PO4, 250 mM KCl pH 6.2, 0.02% NaNd)에서 평형화된 분석적 크기 배제 칼럼 (TSKgel G3000 SW XL 또는 UP-SW3000)을 이용하여 25 ℃에서 HPLC 크로마토그래피에 의해, 단량체 산물 피크 대 고분자량 및 저분자량 부산물 함량의 결정이 수행되었다. 이들 단백질의 순도와 분자량이 LabChipGXII 또는 LabChip GX Touch (Perkin Elmer)를 이용하여 환원제의 존재와 부재에서 CE-SDS에 의해 분석되었다.
표 3: 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된, 단백질A 마이크로-정제 후 단량체 산물 피크, 고분자량 (HMW) 및 저분자량 (LMW) 부산물.
IL7 변이체 단량체 피크 (%) HMW 피크 (%) LMW 피크 (%)
PD1-IL7-VAR1 (E13A) 81 5 14
PD1-IL7-VAR2 (E13K) 67 7 24
PD1-IL7-VAR3 (V15A) 77 6 17
PD1-IL7-VAR4 (V15K) 79 7 14
PD1-IL7-VAR5 (V18A) 79 5 16
PD1-IL7-VAR6 (V18K) 80 5 15
PD1-IL7-VAR7 (D21A) 78 8 14
PD1-IL7-VAR8 (D21K) 77 13 10
PD1-IL7-VAR9 (Q22A) 77 6 17
PD1-IL7-VAR10 (Q22K) 82 5 13
PD1-IL7-VAR11 (D25A) 77 8 15
PD1-IL7-VAR12 (D25K) 79 7 14
PD1-IL7-VAR13 (D74A) 74 10 16
PD1-IL7-VAR14 (D74K) 76 11 13
PD1-IL7-VAR15 (L77A) 78 6 16
PD1-IL7-VAR16 (L77K) 79 6 15
PD1-IL7-VAR17 (K81A) 72 7 21
PD1-IL7-VAR18 (K81E) 75 12 13
PD1-IL7-VAR19 (E84A) 78 10 12
PD1-IL7-VAR20 (G85K) 73 10 17
PD1-IL7-VAR21 (G85E) 77 8 15
PD1-IL7-VAR22 (I88K) 81 5 14
PD1-IL7-VAR23 (Q136A) 80 7 13
PD1-IL7-VAR24 (Q136K) 84 5 11
PD1-IL7-VAR25 (K139A) 63 20 17
PD1-IL7-VAR26 (K139E) 61 25 14
PD1-IL7-VAR27 (N143K) 76 6 18
PD1-IL7-VAR28 (M147A) 70 8 22
PD1-IL7-VAR29 (N-Glc KO, T72A) 66 16 18
PD1-IL7-VAR30 (N-Glc KO, T93A) 76 7 17
PD1-IL7-VAR31 (N-Glc KO, S118A) 73 8 19
PD1-IL7-VAR32 (N-Glc KO, T72A, T93A, S118A) 66 19 15
PD1-IL7wt 66 4 30
표 4: 비환원 CE-SDS에 의해 결정된, 단백질A 마이크로-정제 후 주된 산물 피크와 크기.
IL7 변이체 주된 피크 (%) 크기 (kDa)
PD1-IL7-VAR1 (E13A) 90 176
PD1-IL7-VAR2 (E13K) 83 177
PD1-IL7-VAR3 (V15A) 90 176
PD1-IL7-VAR4 (V15K) 92 176
PD1-IL7-VAR5 (V18A) 89 176
PD1-IL7-VAR6 (V18K) 90 174
PD1-IL7-VAR7 (D21A) 90 174
PD1-IL7-VAR8 (D21K) 89 176
PD1-IL7-VAR9 (Q22A) 88 177
PD1-IL7-VAR10 (Q22K) 92 175
PD1-IL7-VAR11 (D25A) 90 176
PD1-IL7-VAR12 (D25K) 90 177
PD1-IL7-VAR13 (D74A) 85 175
PD1-IL7-VAR14 (D74K) 59 175
PD1-IL7-VAR15 (L77A) 90 174
PD1-IL7-VAR16 (L77K) 88 175
PD1-IL7-VAR17 (K81A) 82 176
PD1-IL7-VAR18 (K81E) 83 178
PD1-IL7-VAR19 (E84A) 86 177
PD1-IL7-VAR20 (G85K) 83 176
PD1-IL7-VAR21 (G85E) 83 177
PD1-IL7-VAR22 (I88K) 91 176
PD1-IL7-VAR23 (Q136A) 87 175
PD1-IL7-VAR24 (Q136K) 92 177
PD1-IL7-VAR25 (K139A) 74 177
PD1-IL7-VAR26 (K139E) 64 179
PD1-IL7-VAR27 (N143K) 90 179
PD1-IL7-VAR28 (M147A) 89 177
PD1-IL7-VAR29 (N-Glc KO, T72A) 86 170
PD1-IL7-VAR30 (N-Glc KO, T93A) 85 173
PD1-IL7-VAR31 (N-Glc KO, S118A) 88 178
PD1-IL7-VAR32 (N-Glc KO, T72A, T93A, S118A) 81 165
huIL7wt 77 177
결과
CHO 세포에서 생산된 IgG-IL7 작제물이 선행 정제 없이, 그러나 단백질A 역가 결정에 의한 정량 후 세포 검정 및 표면 플라스몬 공명에서 검사되었다 (표 2). 품질이 소규모 1 단계 단백질A 정제 후 결정되었고, 산물 피크가 분석적 크기 배제 크로마토그래피 분석에 의해 61 및 84% 사이 (표 3)이고 비환원 모세관 전기이동에 의해 59 및 92% 사이 (표 4)라는 것을 드러냈다.
결론
PD1-IL7 변이체 및 PD1-IL7wt가 유사한 역가 및 좋은 품질 프로필로 생산되었고, 이런 이유로 선행 정제 없이 검정에서 비교될 수 있었다. N-글리코실화 부위 녹아웃 변이체는 변이체 31 (S118A)을 제외하고, 탄수화물의 제거로 인해 CE-SDS마다 감소된 크기를 보여주었다. 이러한 N-글리코실화 (N116) 부위는 점유되지 않을 수 있다.
실시예 1.5 추가의 PD1-IL7v 융합 단백질의 생산 및 분석기술
표 5의 경우에서와 같은 항체 IL7 변이체 융합 작제물, 예컨대 PD1-IL7 변이체 (PD1-IL7v)가 CHO 세포에서 생산되었다. 이들 단백질은 단백질A 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 최종 산물 분석기술은 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의한 단량체 함량 결정 및 비환원 모세관 SDS 전기이동: CE-SDS에 의해 결정된 주된 피크의 백분율로 구성된다.
표 5: 검사된 PD1-IL7 융합 단백질의 폴리펩티드 아미노산 서열
수용체 사슬과의 상호작용 서열 번호
PD1-IL7wt - 85, 86, 87
PD1-IL7-VAR4 (V15K) IL-7Ra 85, 86, 91
PD1-IL7-VAR18 (K81E) IL-7Ra 85, 86, 105
PD1-IL7-VAR20 (G85K) IL-7Ra 85, 86, 107
PD1-IL7-VAR21 (G85E) IL-7Ra 85, 86, 108
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR20 (G85K) IL-7Ra 85, 86, 137
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR21 (G85E) IL-7Ra 85, 86, 138
CHO 세포에서 IgG 유사 단백질의 생산. 본원에서 설명된 항체 IL7 융합 작제물이 Wuxi Biologics에 의해, 자사의 독점적인 CHO 발현 시스템에서 발현 및 단백질A 친화성과 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제로 제조되거나, 또는 Evitria에 의해, 전통적인 (비-PCR 기반) 클로닝 기술과 함께 자사의 독점적인 벡터 시스템을 이용하여, 그리고 현탁 적응 CHO K1 세포 (본래 ATCC로부터 수령되고 Evitria에서 현탁 배양 동안 혈청 없는 성장에 적응됨)를 이용하여 생산되었다. 생산을 위해, Evitria는 자사의 독점적인, 동물-성분 없고 혈청 없는 배지 (eviGrow 및 eviMake2) 및 자사의 독점적인 형질감염 시약 (eviFect)을 이용하였다. 상층액이 원심분리 및 후속 여과 (0.2 μm 필터)에 의해 수확되었다.
IgG 유사 단백질의 정제. 단백질이 표준 프로토콜을 참조하여, 여과된 세포 배양 상층액으로부터 정제되었다. 간단히 말하면, Fc 내포 단백질이 단백질 A-친화성 크로마토그래피 (평형화 완충액: 20 mM 구연산나트륨, 20 mM 인산나트륨, pH 7.5; 용리 완충액: 20 mM 구연산나트륨, pH 3.0)에 의해 세포 배양 상층액으로부터 정제되었다. pH 3.0에서 용리가 달성되었고, 그 이후에 샘플의 즉각적인 pH 중화가 뒤따랐다. 단백질이 원심분리 (Millipore Amicon® ULTRA-15 (Art.Nr.: UFC903096)에 의해 농축되었고, 응집된 단백질이 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화나트륨, pH 6.0에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단량체성 단백질로부터 분리되었다.
IgG 유사 단백질의 분석기술. 정제된 단백질의 농도가 Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423에 따라서 아미노산 서열에 기초하여 계산된 질량 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서 흡수를 계측함으로써 결정되었다. 이들 단백질의 순도와 분자량이 LabChipGXII 또는 LabChip GX Touch (Perkin Elmer) (Perkin Elmer)를 이용하여 환원제의 존재와 부재에서 CE-SDS에 의해 분석되었다. 응집체 함량의 결정이 작업 완충액 (200 mM KH2PO4, 250 mM KCl pH 6.2, 0.02% NaN3)에서 평형화된 분석적 크기 배제 칼럼 (TSKgel G3000 SW XL 또는 UP-SW3000)을 이용하여 25 ℃에서 HPLC 크로마토그래피에 의해 수행되었다.
표 6: 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 단량체 산물 피크, 고분자량 (HMW) 및 저분자량 (LMW) 부산물.
PD1-IL7 변이체 TAPIR ID 단량체 피크 (%) HMW 피크 (%) LMW 피크 (%)
PD1-IL7-VAR4 (V15K) P1AF5541-006 99.7 0.3 0
PD1-IL7-VAR18 (K81E) P1AF5555-006 99.6 0.4 0
PD1-IL7-VAR20 (G85K) P1AF5557-006 100 0 0
PD1-IL7-VAR21 (G85E) P1AF5558-006 99.8 0 0.2
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR20 (G85K) P1AF9696-035 99.7 0.3 0
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR21 (G85E) P1AG0950-001 99 1 0
PD1-IL7wt P1AF5572-018 99.6 0.4 0
표 7: 비환원 CE-SDS에 의해 결정된 주된 산물 피크.
PD1-IL7 변이체 주된 피크 (%)
PD1-IL7-VAR4 (V15K) P1AF5541-006 99
PD1-IL7-VAR18 (K81E) P1AF5555-006 100
PD1-IL7-VAR20 (G85K) P1AF5557-006 100
PD1-IL7-VAR21 (G85E) P1AF5558-006 100
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR20 (G85K) P1AF9696-035 96
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR21 (G85E) P1AG0950-001 99
PD1-IL7wt P1AF5572-018 100
결과. 정제된 PD1-IL7 변이체 작제물이 단백질A와 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 정제된 물질의 품질 분석은 단량체 함량이 분석적 크기 배제 크로마토그래피 분석에 의해 99% 초과 (표 6)이고, 주된 산물 피크가 비환원 모세관 전기이동에 의해 96 및 100% 사이 (표 7)라는 것을 드러냈다. 결론적으로, 모든 PD1-IL7 변이체가 좋은 품질로 생산될 수 있었다.
실시예 1.6 추가의 PD1-IL7v 융합 단백질 (참조 분자)의 생산 및 분석기술
표 8의 경우에서와 같은 항체 IL7 변이체 융합 작제물이 CHO 세포에서 생산되었다. 이들 단백질은 단백질A 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 최종 산물 분석기술은 단량체 함량 결정 (분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의한) 및 주된 피크의 백분율 (비환원 모세관 SDS 전기이동: CE-SDS에 의해 결정됨)로 구성된다. 참조 분자 1 내지 4가 WO 2020/127377 A1의 개시에 따라서 생산되었고, 접합체마다 2개의 IL7 모이어티를 포함한다. 참조 분자 5 내지 8의 경우에, WO 2020/127377 A1에서 개시된 바와 같은 IL7 모이어티가 본원에서 개시된 다른 변이체와 동일한, 접합체마다 하나의 IL7 모이어티를 포함하는 형식에 집어넣어졌다.
표 8: 검사된 PD1-IL7 융합 단백질의 폴리펩티드 아미노산 서열
서열 번호 IL7 변이체
PD1-IL7wt 85, 86, 87 -
참조 분자 1 139, 140 D74E
참조 분자 2 139, 141 SS2 (C2S/C141S, C47S/C92S)
참조 분자 3 139, 142 SS3 (C47S/C92S, C34S/C129S)
참조 분자 4 139, 143 W142H
참조 분자 5 85, 86, 144 D74E
참조 분자 6 85, 86, 145 SS2 (C2S/C141S, C47S/C92S)
참조 분자 7 85, 86, 146 SS3 (C47S/C92S, C34S/C129S)
참조 분자 8 85, 86, 147 W142H
CHO 세포에서 IgG 유사 단백질의 생산. 본원에서 설명된 항체 IL7 융합 작제물이 Wuxi Biologics에 의해, 자사의 독점적인 CHO 발현 시스템에서 발현 및 단백질A 친화성과 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제로 제조되거나, 또는 Evitria에 의해, 전통적인 (비-PCR 기반) 클로닝 기술과 함께 자사의 독점적인 벡터 시스템을 이용하여, 그리고 현탁 적응 CHO K1 세포 (본래 ATCC로부터 수령되고 Evitria에서 현탁 배양 동안 혈청 없는 성장에 적응됨)를 이용하여 생산되었다. 생산을 위해, Evitria는 자사의 독점적인, 동물-성분 없고 혈청 없는 배지 (eviGrow 및 eviMake2) 및 자사의 독점적인 형질감염 시약 (eviFect)을 이용하였다. 상층액이 원심분리 및 후속 여과 (0.2 μm 필터)에 의해 수확되었다.
IgG 유사 단백질의 정제. 단백질이 표준 프로토콜을 참조하여, 여과된 세포 배양 상층액으로부터 정제되었다. 간단히 말하면, Fc 내포 단백질이 단백질 A-친화성 크로마토그래피 (평형화 완충액: 20 mM 구연산나트륨, 20 mM 인산나트륨, pH 7.5; 용리 완충액: 20 mM 구연산나트륨, pH 3.0)에 의해 세포 배양 상층액으로부터 정제되었다. pH 3.0에서 용리가 달성되었고, 그 이후에 샘플의 즉각적인 pH 중화가 뒤따랐다. 단백질이 원심분리 (Millipore Amicon® ULTRA-15 (Art.Nr.: UFC903096)에 의해 농축되었고, 응집된 단백질이 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화나트륨, pH 6.0에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단량체성 단백질로부터 분리되었다.
IgG 유사 단백질의 분석기술. 정제된 단백질의 농도가 Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423에 따라서 아미노산 서열에 기초하여 계산된 질량 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서 흡수를 계측함으로써 결정되었다. 이들 단백질의 순도와 분자량이 LabChipGXII 또는 LabChip GX Touch (Perkin Elmer) (Perkin Elmer)를 이용하여 환원제의 존재와 부재에서 CE-SDS에 의해 분석되었다. 응집체 함량의 결정이 작업 완충액 (200 mM KH2PO4, 250 mM KCl pH 6.2, 0.02% NaN3)에서 평형화된 분석적 크기 배제 칼럼 (TSKgel G3000 SW XL 또는 UP-SW3000)을 이용하여 25 ℃에서 HPLC 크로마토그래피에 의해 수행되었다.
표 9: 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 단량체 산물 피크, 고분자량 (HMW) 및 저분자량 (LMW) 부산물.
PD1-IL7 변이체 TAPIR ID 단량체 피크 (%) HMW 피크 (%) LMW 피크 (%)
참조 분자 1 P1AF9655-001 98.8 1.2 0
참조 분자 2 P1AF9656-001 98.8 1.2 0
참조 분자 3 P1AF9657-001 93 4.1 2.8
참조 분자 4 P1AF9658-001 99 1 0
참조 분자 5 P1AF9647-027 97 1.9 1
참조 분자 6 P1AF9648-033 99 0.9 0
참조 분자 7 P1AF9649-012 94 1.9 4
참조 분자 8 P1AF9650-004 99 1 0
PD1-IL7wt P1AF5572-018 99.6 0.4 0
표 10: 비환원 CE-SDS에 의해 결정된 주된 산물 피크.
PD1-IL7 변이체 주된 피크 (%)
참조 분자 1 P1AF9655-001 94
참조 분자 2 P1AF9656-001 93
참조 분자 3 P1AF9657-001 94
참조 분자 4 P1AF9658-001 93
참조 분자 5 P1AF9647-027 99
참조 분자 6 P1AF9648-033 100
참조 분자 7 P1AF9649-012 68
참조 분자 8 P1AF9650-004 95
PD1-IL7wt P1AF5572-018 100
결과
정제된 PD1-IL7 변이체 작제물이 단백질A와 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 정제된 물질의 품질 분석은 단량체 함량이 분석적 크기 배제 크로마토그래피 분석에 의해 93% 초과 (표 9)이고, 단지 68%의 주된 피크 표면을 야기하는, 비환원 전기이동도에서 확연한 어깨를 보여주는 참조 분자 7을 제외하고, 주된 산물 피크가 비환원 모세관 전기이동에 의해 93 및 100% 사이 (표 10)라는 것을 드러냈다. 결론적으로, 모든 PD1-IL7 변이체가 좋은 품질로 생산되었다.
실시예 1.7: FAP-IL7/IL2
추가의 IL7 접합체가 본원에서 개시된 바와 같은 IL7 변이체를 포함하는 항-FAP (섬유모세포 활성화 단백질) 융합, 다시 말하면 FAP-IL7wt (서열 번호 148, 149 및 150), FAP-IL7-VAR3 (서열 번호 148, 149 및 151), FAP-IL7-VAR4 (서열 번호 148, 149 및 152), FAP-IL7-VAR18 (서열 번호 148, 149 및 153), FAP-IL7-VAR20 (서열 번호 148, 149 및 154), FAP-IL7-VAR21 (서열 번호 148, 149 및 155) 및 FAP-IL7-SS2 (서열 번호 148, 149 및 156)로서 생산되었다. 서열 번호 148, 149 및 157의 서열을 갖는 FAP-IL2 또한 생산되었다.
실시예 1.8: 펨브로리주맙-IL7 융합 작제물의 생산 및 분석기술
본원에서 설명된 펨브로리주맙-IL7 융합 작제물이 CHO 세포에서 생산되었다. 이들 단백질은 단백질A 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 최종 산물 분석기술은 단량체 함량 결정 (분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의한) 및 주된 피크의 백분율 (비환원 모세관 SDS 전기이동: CE-SDS에 의해 결정됨)로 구성된다. 본원에서 설명된 펨브로리주맙-IL7 융합 작제물이 Wuxi Biologics에 의해, 자사의 독점적인 CHO 발현 시스템에서 발현 및 단백질A 친화성과 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제로 제조되었다. 단백질이 표준 프로토콜을 참조하여, 여과된 세포 배양 상층액으로부터 정제되었다. 간단히 말하면, Fc 내포 단백질이 MabSelect 칼럼 (EQ/Wash1: 50 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4, Wash2: 50 mM 트리스-HCl, 150 mM 중화제: 1 M Arg, pH 9.1)을 이용함으로써 세포 배양 상층액으로부터 정제되었다. pH 3.4에서 용리가 달성되었고, 그 이후에 샘플의 즉각적인 pH 중화가 뒤따랐다. 단백질이 원심분리 (Millipore Amicon® ULTRA-15 (Art.Nr.: UFC903096)에 의해 농축되었고, 응집된 단백질이 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화나트륨, pH 6.0에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단량체성 단백질로부터 분리되었다. 정제된 단백질의 농도가 Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423에 따라서 아미노산 서열에 기초하여 계산된 질량 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서 흡수를 계측함으로써 결정되었다. 이들 단백질의 순도와 분자량이 LabChipGXII 또는 LabChip GX Touch (Perkin Elmer) (Perkin Elmer)를 이용하여 환원제의 존재와 부재에서 CE-SDS에 의해 분석되었다. 데글리코실화되고 완전히 환원된 덩어리가 LC-MS에 의해 검출되었다.
표 A: 단량체 피크 SEC-HPLC 및 주된 피크 비환원 CE-SDS에 의한 순도 (%)
Figure pct00030
정제된 펨브로리주맙-IL7 융합 작제물이 단백질A와 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 정제된 물질의 품질 분석은 단량체 함량이 분석적 크기 배제 크로마토그래피 분석에 의해 98% 초과이고, 주된 산물 피크가 비환원 SDS 모세관 전기이동에 의해 99% 초과라는 것을 드러냈다 (표 A). 모든 펨브로리주맙-IL7 융합 작제물이 좋은 품질로 생산되었다.
실시예 2
실시예 2.1. 인간 IL7Rα-IL2Rγ-Fc 이종이합체에 대한 IL7 변이체의 결합 사정
표면 플라스몬 공명 (SPR) 실험이 HBS-EP+를 작업 완충액 (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20 (BR-1006-69, GE Healthcare))으로서 이용한 Biacore T200에서 수행되었다. Fc 특이적 항체 (Roche 내부)가 CM5 칩 (GE Healthcare) 위에 아민 연계에 의해 직접적으로 고정되었다. PD1-IL7 작제물이 100 nM에서 120 s 동안 상층액으로부터 포착되었다. 인간 IL7Rα-IL2Rγ-Fc 이종이합체가 서열 번호: 120 및 서열 번호: 121로 구성되었다. 단지 세포외 도메인만 Fc 도메인에 융합되고, HEK Expi 세포에서 생산되고, 단백질 A를 통한 친화성 정제, 그 이후에 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는 2 단계 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 연결 단계를 기록하기 위해, 800 nM hu IL7Rα-IL2Rγ -Fc 이종이합체의 단일 주입이 240 초 동안 30 μl/분으로 리간드 위에 통과되었다. 해리 단계가 360 s 동안 모니터링되고 샘플 용액에서 HBS-EP+로 전환함으로써 촉발되었다. 모든 주기 후, 60 초 동안 10 mM 글리신 pH 2의 1회 주입을 이용하여 칩 표면이 재생되었다. 참조 흐름 셀 1에서 획득된 반응을 차감함으로써, 벌크 굴절률 차이가 교정되었다. 포획 단계 후 및 연결 단계의 종료 시점에서 반응 단위가 기록되었고, 결합 대 포획의 비율이 계산되었다. 비교의 편의성을 위한 koff를 획득하기 위해, 단일 결합 곡선이 해리 단계에서 적합되었다 (Biacore 평가 소프트웨어, GE Healthcare).
표 11. SPR 작업 파라미터.
기계장치 Biacore T200
칩 CM5 (# 768)
Fc1 내지 4 Fc 특이적 IgG (Roche 내부)
포획 120 s 동안, 10 μl/분으로 100 nM PD1-IL7 변이체 (상층액)
피분석물 800 nM hu IL7Rα-IL2Rγ-Fc avi 비오틴, 단일 주입
작업 완충액 HBS-EP
T° 25 ℃
흐름 30 μl/분
연결 240 초
해리 360 초
재생 60 초 동안 10 mM 글리신 pH 2
PD1-IL7 변이체 (PD1-IL7v)가 인간 IL7Rα-IL2Rγ-Fc에 대한 IL7 모이어티의 결합에 대해 분석되었다. 상층액의 농도가 단백질A 결합에 의해 결정되었다 (실시예 1.2 참조).
실시예 2.2: 인간 IL7Rα-IL2Rγ-Fc 이종이합체에 대한 IL-7 변이체 (IL7v)의 결합 사정
결합 대 포획의 비율이 계산되었고, 오프 레이트의 특징화를 뒷받침하기 위해 해리 단계가 단일 곡선에 적합되었다. 0.18 초과의 결합 대 포획의 비율 및 9.4x10-4 (1/s) 초과의 kd를 갖는 9개의 변이체가 IL7 수용체에 대한 가능한 감소된 친화성으로 선택되었다 (표 12 참조).
표 12: IL7 수용체에 대한 가능한 감소된 친화성 (더 빠른 해리)을 갖는 선택된 후보.
샘플 명칭 포획된 분자 kd [1/s] 결합/포획 비율 감소된 친화성 후보
PD1-IL7-VAR1 (E13A) 5.55E-04 0.35
PD1-IL7-VAR2 (E13K) 8.64E-04 0.27
PD1-IL7-VAR3 (V15A) 1.83E-03 0.30 선택됨
PD1-IL7-VAR4 (V15K) 9.94E-03 0.19 선택됨
PD1-IL7-VAR5 (V18A) 1.13E-03 0.33 선택됨
PD1-IL7-VAR6 (V18K) 1.15E-03 0.30 선택됨
PD1-IL7-VAR7 (D21A) 6.23E-04 0.31
PD1-IL7-VAR8 (D21K) 6.34E-04 0.29
PD1-IL7-VAR9 (Q22A) 5.98E-04 0.37
PD1-IL7-VAR10 (Q22K) 5.86E-04 0.33
PD1-IL7-VAR11 (D25A) 6.87E-04 0.31
PD1-IL7-VAR12 (D25K) 7.15E-04 0.29
PD1-IL7-VAR13 (D74A) 6.81E-04 0.29
PD1-IL7-VAR14 (D74K) 8.02E-04 0.25
PD1-IL7-VAR15 (L77A) 9.45E-04 0.30 선택됨
PD1-IL7-VAR16 (L77K) 1.19E-03 0.27 선택됨
PD1-IL7-VAR17 (K81A) 6.48E-04 0.32
PD1-IL7-VAR18 (K81E) 8.10E-04 0.28
PD1-IL7-VAR19 (E84A) 6.11E-04 0.32
PD1-IL7-VAR20 (G85K) 7.41E-03 0.06
PD1-IL7-VAR21 (G85E) 4.90E-03 0.24 선택됨
PD1-IL7-VAR22 (I88K) 1.11E-03 0.27 선택됨
PD1-IL7-VAR23 (Q136A) 7.66E-04 0.27
PD1-IL7-VAR24 (Q136K) 9.18E-04 0.27
PD1-IL7-VAR25 (K139A) 5.06E-04 0.20
PD1-IL7-VAR26 (K139E) 9.47E-04 0.07
PD1-IL7-VAR27 (N143K) 1.40E-02 0.19 선택됨
PD1-IL7-VAR28 (M147A) 8.69E-04 0.29
PD1-IL7wt 4.46E-04 0.30
실험 2.1 및 2.2에 근거하여, 재조합 인터류킨 7 수용체에 대한 감소된 친화성을 갖는 인터류킨 7의 9개 변이체가 표면 플라스몬 공명에 의해 선택되었다 (IL7-VAR3; IL7-VAR4; IL7-VAR5; IL7-VAR6; IL7-VAR15; IL7-VAR16; IL7-VAR21; IL7-VAR22; IL7-VAR27). 이러한 선택은 결합 대 포획 신호의 비율 및 IL7 수용체로부터 PD1-IL7 변이체의 외견상 더 빠른 해리에 근거되었다.
실시예 2.3: 인간 IL7Rα-IL2Rγ-Fc 이종이합체에 대한 IL7의 N-글리코실화 녹아웃 변이체의 결합 사정
결합 대 포획의 비율이 계산되었고, 오프 레이트의 특징화를 뒷받침하기 위해 해리 단계가 단일 곡선에 적합되었다. 모든 N-글리코실화 녹아웃 변이체 (단일 및 삼중 돌연변이체)는 야생형 IL7과 유사한 오프 레이트를 갖는다 (표 13).
표 13: IL7 수용체에 결합에 대한 야생형 IL7 및 IL7의 N-글리코실화 녹아웃 변이체의 비교.
샘플 명칭 포획된 분자 결합/포획 비율 kd [1/s]
PD1-IL7-VAR29 (N-Glc KO, T72A) 0.29 6.45E-04
PD1-IL7-VAR30 (N-Glc KO, T93A) 0.29 7.56E-04
PD1-IL7-VAR31 (N-Glc KO, S118A) 0.28 8.15E-04
PD1-IL7-VAR32 (N-Glc KO, T72A, T93A, S118A) 0.30 4.77E-04
PD1-IL7wt 0.30 4.46E-04
표 7에서 실증된 바와 같이, 1개 또는 3개의 N-글리코실화 부위가 제거된 4개의 검사된 변이체는 야생형 IL7과 유사한 비율의 결합 대 포획 및 해리 상수를 보여주었다. N 연결된 탄수화물은 인터류킨 7 및 이의 수용체의 상호작용에서 어떤 역할도 수행하지 않는다.
실시예 2.3: 인간 IL7Rα-IL2Rγ-Fc 이종이합체에 대한 추가 IL7 변이체의 결합 사정
표면 플라스몬 공명 (SPR) 실험이 HBS-EP + 1 mg/ml BSA를 작업 완충액으로서 이용하여 Biacore 8K에서 수행되었다. 항-P329G Fc 특이적 항체 (Roche 내부)가 C1 칩 (Cytiva) 위에 아민 연계에 의해 직접적으로 고정되었다. PD1-IL7 작제물이 5 nM에서 140 s 동안 포획되었다. 연결 단계를 기록하기 위해, 2.34로부터 300 nM 인간, 시노몰구스 또는 뮤린 IL7Ra-IL2Rg-Fc 이종이합체로의 2배 연속 희석 계열의 복제물이 240 초 동안 30 μl/분으로 리간드 위에 통과되었다. 해리 단계가 800 s 동안 모니터링되고 샘플 용액에서 작업 완충액으로 전환함으로써 촉발되었다. 모든 주기 후, 60 초 동안 10 mM 글리신 pH 2의 2회 주입을 이용하여 칩 표면이 재생되었다. 참조 흐름 셀 (고정된 항 P329G Fc 특이적 IgG만을 내포)에서 획득된 반응을 차감함으로써 벌크 굴절률 차이가 교정되었다. Biacore 평가 소프트웨어 (Cytiva)를 이용하여 1:1 랭뮤어 결합에 적합시킴으로써, 친화성 상수가 동력학 속도 상수로부터 도출되었다.
표 14. SPR 작업 파라미터.
기계장치 Biacore 8K (Cytiva)
칩 C1 (# 854)
Fc1 내지 8 항-P329G Fc 특이적 IgG (Roche 내부)
포획 140 s 동안, 10 μl/분으로 5 nM PD1-IL7 변이체
피분석물 2.34로부터 300 nM의 인간, 시노몰구스 또는 뮤린 IL7Ra-IL2Rg-Fc avi 비오틴 (Fc에 융합된 IL7Ra 및 IL2Rg 사슬의 ECD의 이종이합체)으로의 2배 연속 희석액
작업 완충액 HBS-EP (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20 (BR-1006-69, Cytiva) + 1 mg/ml BSA
T° 25 ℃
흐름 30 μl/분
연결 240 초
해리 800 초
재생 2 x 60 초 동안 10 mM 글리신 pH 2
하기 PD1-IL7 변이체가 IL7Ra-IL2Rg-Fc에 결합에 대해 분석되었다 (표 15 및 16).
표 15: IL7Ra-IL2Rg-Fc에 결합에 대해 분석된 샘플에 관한 설명.
샘플 명칭 포획된 분자 TAPIR ID 농도 [g/l]
PD1-IL7-VAR4 (V15K) P1AF5541-006 2.7
PD1-IL7-VAR18 (K81E) P1AF5555-006 2.9
PD1-IL7-VAR20 (G85K) P1AF5557-006 2.6
PD1-IL7-VAR21 (G85E) P1AF5558-006 2.6
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR20 (G85K) P1AF9696-035 1.8
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR21 (G85E) P1AG0950-001 1.9
PD1-IL7wt P1AF5572-018 4.4
표 16: IL7Ra-IL2Rg-Fc에 관한 설명.
샘플 명칭 피분석물 TAPIR ID 농도 [g/l]
인간 IL7Ra-IL2Rg-Fc 비오틴 P1AF4984-007 1.43
시노몰구스 IL7Ra-IL2Rg-Fc 비오틴 P1AF7912-003 0.92
뮤린 IL7Ra-IL2Rg-Fc 비오틴 P1AF7911-003 1.41
인간 IL7R알파-IL2R감마-Fc 이종이합체에 대한 IL7 변이체의 친화성 결정
4개의 IL7 단일 변이체 및 2개의 IL7 이중 변이체가 인간 IL7 수용체에 결합에 대해 IL7 야생형과 비교되었다 (표 17). IL7 수용체에 대한 IL7 변이체의 친화성이 IL7 수용체 알파 사슬 및 통상적인 IL2 수용체 감마 사슬의 세포외 도메인의 재조합 이종이합체를 이용하여 결정되었다.
표 17: 인간 IL7 수용체에 IL7 변이체의 결합: 표면 플라스몬 공명에 의해 25 ℃에서 복제물의 평균으로서 결정된 친화성 상수.
샘플 명칭 포획된 분자 TAPIR ID ka [1/Ms] kd [1/s] KD [M]
PD1-IL7-VAR4 (V15K) P1AF5541-006 3.05E+05 5.35E-03 2.58E-08
PD1-IL7-VAR18 (K81E) P1AF5555-006 3.20E+05 7.19E-04 2.26E-09
PD1-IL7-VAR20 (G85K) P1AF5557-006 1.89E+05 1.43E-02 7.58E-08
PD1-IL7-VAR21 (G85E) P1AF5558-006 2.73E+05 3.13E-03 1.15E-08
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR20 (G85K) P1AF9696-035 1.35E+05 1.62E-02 1.21E-07
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR21 (G85E) P1AG0950-001 7.81E+04 2.07E-02 2.66E-07
PD1-IL7wt P1AF5572-018 4.44E+05 3.13E-04 7.68E-10
IL7에 도입된 이들 돌연변이는 인간 IL7 수용체에 대한 결합 친화성을 감소시키는데, 2개의 이중 돌연변이체 (K81E/G85K 및 K81E/G85E)가 가장 낮은 친화성을 보여준다.
시노몰구스 IL7R알파-IL2R감마-Fc 이종이합체에 대한 IL7 변이체의 친화성 결정
4개의 IL7 단일 변이체 및 2개의 IL7 이중 변이체가 시노몰구스 IL7 수용체에 결합에 대해 IL7 야생형과 비교되었다 (표 18). IL7 수용체에 대한 IL7 변이체의 친화성이 IL7 수용체 알파 사슬 및 통상적인 IL2 수용체 감마 사슬의 세포외 도메인의 재조합 이종이합체를 이용하여 결정되었다.
표 18: 시노몰구스 IL7 수용체에 IL7 변이체의 결합: 표면 플라스몬 공명에 의해 25 ℃에서 복제물의 평균으로서 결정된 친화성 상수.
샘플 명칭 포획된 분자 TAPIR ID ka [1/Ms] kd [1/s] KD [M]
PD1-IL7-VAR4 (V15K) P1AF5541-006 3.29E+05 1.20E-02 3.65E-08
PD1-IL7-VAR18 (K81E) P1AF5555-006 2.42E+05 9.51E-04 3.93E-09
PD1-IL7-VAR20 (G85K) P1AF5557-006 3.60E+05 5.10E-02 1.42E-07
PD1-IL7-VAR21 (G85E) P1AF5558-006 2.77E+05 4.31E-03 1.56E-08
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR20 (G85K) P1AF9696-035 1.62E+05 2.51E-02 1.55E-07
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR21 (G85E) P1AG0950-001 6.70E+04 3.50E-02 5.29E-07
PD1-IL7wt P1AF5572-018 3.45E+05 3.55E-04 1.03E-09
IL7에 도입된 이들 돌연변이는 시노몰구스 IL7 수용체에 대한 결합 친화성을 감소시키는데, G85K 및 2개의 이중 돌연변이체 (K81E/G85K 및 K81E/G85E)가 가장 낮은 친화성을 보여준다.
뮤린 IL7R알파-IL2R감마-Fc 이종이합체에 대한 IL7 변이체의 친화성 결정
4개의 IL7 단일 변이체 및 2개의 IL7 이중 변이체가 뮤린 IL7 수용체에 결합에 대해 IL7 야생형과 비교되었다 (표 19). IL7 수용체에 대한 IL7 변이체의 친화성이 IL7 수용체 알파 사슬 및 통상적인 IL2 수용체 감마 사슬의 세포외 도메인의 재조합 이종이합체를 이용하여 결정되었다.
표 19: 뮤린 IL7 수용체에 IL7 변이체의 결합: 표면 플라스몬 공명에 의해 25 ℃에서 복제물의 평균으로서 결정된 친화성 상수.
샘플 명칭 포획된 분자 TAPIR ID ka [1/Ms] kd [1/s] KD [M]
PD1-IL7-VAR4 (V15K) P1AF5541-006 결합 없음
PD1-IL7-VAR18 (K81E) P1AF5555-006 3.47E+05 3.15E-03 8.88E-09
PD1-IL7-VAR20 (G85K) P1AF5557-006 결합 없음
PD1-IL7-VAR21 (G85E) P1AF5558-006 3.95E+05 1.69E-02 4.30E-08
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR20 (G85K) P1AF9696-035 결합 없음
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR21 (G85E) P1AG0950-001 결합 없음
PD1-IL7wt P1AF5572-018 4.26E+05 7.49E-04 1.76E-09
IL7에 도입된 이들 돌연변이는 뮤린 IL7 수용체에 대한 결합 친화성을 강하게 감소시키고 변이체 V15K, G85K 및 2개의 이중 돌연변이체 (K81E/G85K 및 K81E/G85E)에 대한 결합을 전폐한다.
인터류킨-7의 6개 변이체 (4개의 단일 아미노산 돌연변이 및 2개의 이중 돌연변이체)가 표면 플라스몬 공명에 의해, 재조합 인터류킨-7 수용체에 결합에 대해 야생형 인터류킨-7과 비교되었다. 친화성에서 하기 순위가 인간 IL7 수용체에서 획득되었다: IL7wt > K81E > G85E > V15K > G85K > K81E+G85K > K81E+G85E. 동일한 순위가 시노몰구스 IL7 수용체에 결합에 대해 관찰되었다. 뮤린 IL7 수용체에 결합 또한, V15K, G85K, K81E+G85K 또는 K81E+G85E를 보유하는 IL7 변이체의 경우에 결합이 검출될 수 없다는 점을 제외하고, 유사한 순위 (IL7wt > K81E > G85E)를 따른다. 6개의 검사된 인터류킨-7 변이체는 IL7 야생형과 비교하여 IL7 수용체에 대한 감소된 친화성을 갖고, 인터류킨-7 반응을 조정하는 것을 가능하게 하는 친화성의 범위를 커버한다.
실시예 2.4: 인간 IL7R알파-IL2R감마-Fc 이종이합체에 대한 IL7 변이체의 친화성 결정
SPR 실험이 HBS-EP + 1 mg/ml BSA를 작업 완충액으로서 이용하여 Biacore 8K에서 수행되었다. 항-P329G Fc 특이적 항체 (Roche 내부)가 C1 칩 (Cytiva) 위에 아민 연계에 의해 직접적으로 고정되었다. PD1-IL7 작제물이 5 nM에서 140 s 동안 포획되었다. 연결 단계를 기록하기 위해, 2.34로부터 300 nM 인간 IL7Ra-IL2Rg-Fc 이종이합체로의 2배 연속 희석 계열의 복제물이 240 초 동안 30 μl/분으로 리간드 위에 통과되었다. 해리 단계가 800 s 동안 모니터링되고 샘플 용액에서 작업 완충액으로 전환함으로써 촉발되었다. 모든 주기 후, 60 초 동안 10 mM 글리신 pH 2의 2회 주입을 이용하여 칩 표면이 재생되었다. 참조 흐름 셀 (고정된 항 P329G Fc 특이적 IgG만을 내포)에서 획득된 반응을 차감함으로써 벌크 굴절률 차이가 교정되었다. Biacore 평가 소프트웨어 (Cytiva)를 이용하여 1:1 랭뮤어 결합에 적합시킴으로써, 친화성 상수가 동력학 속도 상수로부터 도출되었다.
표 20. SPR 작업 파라미터.
기계장치 Biacore 8K (Cytiva)
칩 C1 (# 854)
Fc1 내지 8 항-P329G Fc 특이적 IgG (Roche 내부)
포획 140 s 동안, 10 μl/분으로 5 nM PD1-IL7 변이체
피분석물 2.34로부터 300 nM의 인간 IL7Ra-IL2Rg-Fc avi 비오틴 (Fc에 융합된 IL7Ra 및 IL2Rg 사슬의 ECD의 이종이합체)으로의 2배 연속 희석
작업 완충액 HBS-EP (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20 (BR-1006-69, Cytiva) + 1 mg/ml BSA
T° 25 ℃
흐름 30 μl/분
연결 240 초
해리 800 초
재생 2 x 60 초 동안 10 mM 글리신 pH 2
하기 PD1-IL7 변이체가 IL7Ra-IL2Rg-Fc에 결합에 대해 분석되었다 (표 21).
표 21: IL7Ra-IL2Rg-Fc에 결합에 대해 분석된 샘플에 관한 설명.
샘플 명칭 포획된 분자 TAPIR ID 농도 [g/l]
PD1-IL7-VAR4 (V15K) P1AF5541-006 2.7
PD1-IL7-VAR18 (K81E) P1AF5555-006 2.9
PD1-IL7-VAR20 (G85K) P1AF5557-006 2.6
PD1-IL7-VAR21 (G85E) P1AF5558-006 2.6
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR20 (G85K) P1AF9696-035 1.8
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR21 (G85E) P1AG0950-001 1.9
참조 분자 5 P1AF9647-027 0.76
참조 분자 6 P1AF9648-033 2.5
참조 분자 7 P1AF9649-012 1.35
참조 분자 8 P1AF9650-004 3.81
PD1-IL7wt P1AF5572-018 4.4
표 22: IL7Ra-IL2Rg-Fc에 관한 설명.
샘플 명칭 피분석물 TAPIR ID 농도 [g/l]
인간 IL7Ra-IL2Rg-Fc 비오틴 P1AF4984-007 1.43
인간 IL7R알파-IL2R감마-Fc 이종이합체에 대한 IL7 변이체의 친화성 결정
4개의 IL7 단일 변이체, 2개의 IL7 이중 변이체 및 IL7 야생형이 인간 IL7 수용체에 결합에 대해, 변형된 IL7을 갖는 4개의 참조 분자와 비교되었다 (표 23). IL7 수용체에 대한 IL7 변이체의 친화성이 IL7 수용체 알파 사슬 및 통상적인 IL2 수용체 감마 사슬의 세포외 도메인의 재조합 이종이합체를 이용하여 결정되었다.
표 23: 인간 IL7 수용체에 IL7 변이체의 결합: 25 ℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 친화성 상수. 단일 값 결정을 갖는 PD1-IL7-VAR20 (G85K), PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR21 (G85E) 및 참조 분자 5를 제외하고, 복제물의 평균.
샘플 명칭 포획된 분자 TAPIR ID ka [1/Ms] kd [1/s] KD [M]
PD1-IL7-VAR4 (V15K) P1AF5541-006 2.51E+05 1.01E-02 4.02E-08
PD1-IL7-VAR18 (K81E) P1AF5555-006 3.92E+05 5.63E-04 1.44E-09
PD1-IL7-VAR20 (G85K) P1AF5557-006 1.70E+05 1.96E-02 1.16E-07
PD1-IL7-VAR21 (G85E) P1AF5558-006 5.04E+05 2.67E-03 5.36E-09
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR20 (G85K) P1AF9696-035 9.64E+04 1.24E-02 1.29E-07
PD1-IL7-VAR18 (K81E) VAR21 (G85E) P1AG0950-001 4.33E+04 1.48E-02 3.42E-07
참조 분자 5 P1AF9647-027 3.72E+05 2.77E-04 7.46E-10
참조 분자 6 P1AF9648-033 1.01E+05 1.41E-03 1.41E-08
참조 분자 7 P1AF9649-012 결합 없음
참조 분자 8 P1AF9650-004 3.03E+05 4.41E-04 1.46E-09
PD1-IL7wt P1AF5572-018 3.89E+05 2.18E-04 5.67E-10
4개의 IL7 단일 변이체, 2개의 IL7 이중 변이체 및 참조 분자는 인간 IL7 수용체에 대한 결합 친화성에서 상이한 수준의 감소를 보여준다. 참조 분자 7은 결합 없음을 보여주었다. 결론적으로, 인터류킨-7의 6개 변이체 (4개의 단일 아미노산 돌연변이 및 2개의 이중 돌연변이체) 및 야생형 인터류킨-7이 표면 플라스몬 공명에 의해, 재조합 인터류킨-7 수용체에 결합에 대해 인터류킨-7에서 돌연변이를 갖는 4개의 참조 분자와 비교되었다. 친화성에서 하기 순위가 인간 IL7 수용체에서 획득되었다: IL7wt, 참조 분자 5 > K81E, 참조 분자 8 > G85E > 참조 분자 6 > V15K > G85K, K81E+G85K > K81E+G85E. 참조 분자 7은 결합 없음이 관찰되었다.
실시예 2.5: PDL1-IL7 변이체의 열 안정성의 특징화
PD1-IL7 변이체의 열 안정성이 Optim2 시스템 (Avacta Group plc)을 이용하여, 산란광 강도에서 변화로서 계측되었다. 마이크로 큐벳 어레이에서, 0.75 mg/mL의 농도로 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0에서 9 μL의 샘플이 0.1℃/분의 비율로 25℃에서 85℃로 가열되었다. 산란광 강도 (266 nm 레이저)가 0.6℃마다 기록되고 소프트웨어 Optim 클라이언트 V2 (Avacta Group plc)로 처리되었다. 응집 개시 온도는 산란 강도가 증가하기 시작하는 온도로서 규정된다. 단백질의 3D 구조가 풀릴 때, 이러한 회전은 이전에 매몰되었던 트립토판의 노출을 야기한다. 이것은 트립토판 방출 스펙트럼 (330 nm 및 350 nm)의 변화를 야기한다. 이러한 변화는 모니터링되고 질량중심 평균 (스펙트럼의 질량중심)을 결정함으로써 분석되었다.
표 24. IL7-wt, 비글리코실화된 IL7 (Var 32) 및 11개의 상이한 IL7 변이체에 대한 열 안정성 (응집 및 융점)의 사정
Tagg [℃]± 1 Tm [℃]± 1
PD1-IL7-wt 59.5 59.5
PD1-IL7-V15A (Var3) 59.0 59.0
PD1-IL7-V15K (Var4) 59.0 59.5
PD1-IL7-V18A (Var5) 59.0 59.0
PD1-IL7-V18K (Var6) 59.0 59.5
PD1-IL7-L77A (Var15) 59.0 59.5
PD1-IL7-L77A (Var16) 59.5 59.5
PD1-IL7-K81C (Var18) 59.5 59.5
PD1-IL7-G85K (Var18) 59.5 59.0
PD1-IL7-G85E (Var21) 59.0 58.5
PD1-IL7-I88K (Var22) 59.0 59.0
PD1-IL7-N143K (Var27) 59.5 59.0
PD1-IL7-N-Glc KO, T72A, T93A, S118A (Var32) 59.5 58.5
모든 변이체의 응집 및 융점은 IL7-wt 및 비-글리코실화 IL-7(Var32)과 비교하여 동일한 안정성을 보여준다. 이런 이유로, IL7의 설계는 열 안정성에 영향을 주지 않는다.
실시예 3
실시예 3.1: 증가하는 용량의 PD1-IL7 변이체로 PD-1+ CD4 T 세포의 처리 시에 IL-7R 신호전달 (STAT5-P)
PD-1+ CD4 T 세포에서 IL-7Rα/IL-2Rγ 신호전달의 양에 근거하여 상이한 IL-7 변이체의 효능을 사정하기 위해, STAT5 인산화 (STAT5-P)가 여기에서 이용되었다.
이러한 목적으로 CD4 T 세포가 CD4 비드 (130-045-101, Miltenyi)로 건강한 공여자 PBMC로부터 분류되고, PD-1 발현을 유도하기 위해 1 μg/ml 평판 결합된 항-CD3 (하룻밤 동안 피복됨, 클론 OKT3, #317315, BioLegend) 및 1 μg/ml의 가용성 항-CD28 (클론 CD28.2, #302923, BioLegend) 항체의 존재에서 3일 동안 활성화되었다. 3 일 후, 세포가 수확되고 내인성 IL-2를 제거하기 위해 수회 세척되었다. 이후, 이들 세포는 증가하는 농도의 치료 항체 (50 μl, 66 nM의 최고 농도에서 1:10 희석 단계)로 37 ℃에서 12 분 동안 처리되기 전 V-바닥 평판 내로 파종되었다. 인산화 상태를 보존하기 위해, 다양한 작제물과 함께 12 분 배양 직후에 동등한 양의 Phosphoflow Fix 완충액 I (100ul, 557870, BD)가 첨가되었다. 이들 세포는 이후, Phosphoflow PermBuffer III (558050, BD)로 -80 ℃에서 하룻밤 동안 투과화되기 전 37 ℃에서 추가로 30 분 동안 배양되었다. 그 다음 날, 인산화된 형태에서 STAT-5가 항-STAT-5P 항체 (47/Stat5(pY694) 클론, 562076, BD)를 이용함으로써 4 ℃에서 30 분 동안 염색되었다.
세포가 FACS BD-LSR Fortessa (BD Bioscience)에서 획득되었다. STAT-5P의 빈도가 FlowJo (V10)로 결정되고 GraphPad Prism으로 플로팅되었다.
PD1-IL7 변이체는 IL7R에 대한 친화성을 감소시키기 위한 돌연변이를 보유한다. STAT5-P는 정규화된 STAT5-P로서 묘사되는데, 여기서 100%는 도 2에서 66 nM의 PD1-IL7 wt로 처리 시에 STAT5-P+ 세포의 빈도와 동등하다. 도 2는 검사된 PD1-IL7 변이체가, 여기에서 양성 대조로서 이용된 PD1-IL7wt와 유사하거나 또는 이보다 감소된 효능으로 PD-1+ CD4 T 세포에서 신호한다는 것을 보여준다.
표 25는 2명의 공여자로부터 획득된 PD-1+ CD4 T 세포에서 각 돌연변이체에 대한 용량 반응 STAT-5 인산화의 EC50 및 곡선 아래 면적 (AUC)을 보여준다.
분자 EC50 (평균 ± SEM) AUC (평균 ± SEM)
PD1-IL7-VAR1 (E13A) 66.1 ± 16.6 257.4 ± 0.8
PD1-IL7-VAR2 (E13K) 70.8 ± 11.9 265.5 ± 2.9
PD1-IL7-VAR3 (V15A) 300.3 ± 0.1 191.1 ± 13.4
PD1-IL7-VAR4 (V15K) 539.1 ± 65.1 152.4 ± 17.7
PD1-IL7-VAR5 (V18A) 171.4 ± 15.4 218.6 ± 23.1
PD1-IL7-VAR6 (V18K) 216.6 ± 11 199.2 ± 17.6
PD1-IL7-VAR7 (D21A) 107.7 ± 18.8 256.4 ± 21.9
PD1-IL7-VAR8 (D21K) 118.8 ± 18.7 238 ± 20.1
PD1-IL7-VAR9 (Q22A) 74.1 ± 16.3 261.5 ± 24.1
PD1-IL7-VAR10 (Q22K) 98.6 ± 24.6 247.4 ± 22.6
PD1-IL7-VAR11 (D25A) 97.2 ± 34.2 257.4 ± 19.9
PD1-IL7-VAR12 (D25K) 75.7 ± 7.3 274.9 ± 14
PD1-IL7-VAR13 (D74A) 136.2 ± 11.2 230.9 ± 8.4
PD1-IL7-VAR14 (D74K) 165.1 ± 12.2 223.5 ± 7.1
PD1-IL7-VAR15 (L77A) 138.9 ± 2.1 238.2 ± 7.7
PD1-IL7-VAR16 (L77K) 208.9 ± 5.5 204.2 ± 0.2
PD1-IL7-VAR17 (K81A) 192.3 ± 12.4 218.4 ± 0.3
PD1-IL7-VAR18 (K81E) 852.9 ± 181.1 133.1 ± 2.9
PD1-IL7-VAR19 (E84A) 97.5 ± 7.6 256.9 ± 0.5
PD1-IL7-VAR20 (G85K) 1212.5 ± 32.5 120.9 ± 1.3
PD1-IL7-VAR21 (G85E) 1145.5 ± 120.5 118.2 ± 0.4
PD1-IL7-VAR22 (I88K) 76.6 ± 19.4 263.5 ± 14.4
PD1-IL7-VAR23 (Q136A) 85.5 ± 20.9 250.7 ± 21.6
PD1-IL7-VAR24 (Q136K) 83.7 ± 3.9 257.3 ± 19.8
PD1-IL7-VAR25 (K139A) 181.7 ± 45.5 221.6 ± 22.8
PD1-IL7-VAR26 (K139E) 314.3 ± 66.1 189.9 ± 17.5
PD1-IL7-VAR27 (N143K) 248.7 ± 62.2 161.8 ± 30.7
PD1-IL7-VAR28 (M147A) 73.1 ± 2.4 260.6 ± 13.3
PD1-IL7-VAR29 (N-Glc KO, T72A) 98.2 ± 3.3 267.8 ± 15.8
PD1-IL7-VAR30 (N-Glc KO, T93A) 66.6 ± 11.4 265.3 ± 12.4
PD1-IL7-VAR31 (N-Glc KO, S118A) 93.2 ± 18.4 263 ± 10.3
PD1-IL7-VAR32 (N-Glc KO, T72A, T93A, S118A) 76.8 ± 2.4 251.7 ± 7.5
PD1-IL7wt 86.6 ± 13.5 270 ± 9.6
실시예 3.2: IL-7R 신호전달 (STAT-5P)의 PD-1+ CD4 T 세포로의 PD-1 매개된 시스 전달을 통한 IL-7 변이체의 선택
본 실험에서, 표면 상에서 PD-1이 결여된 이웃 CD4 T 세포 (트랜스)에서보다는, PD-1을 발현하는 동일한 CD4 T 세포 (시스)에서 PD-1에 결합 시에, PD1-IL7v가 IL-7Rα/IL-2Rγ를 통해 신호할 것인지를 사정하기 위한 판독으로서 STAT5 인산화가 이용되었다.
이러한 목적으로 CD4 T 세포가 CD4 비드 (130-045-101, Miltenyi)로 건강한 공여자 PBMC로부터 분류되고, 이후 PD-1 발현을 유도하기 위해 1 μg/ml 평판 결합된 항-CD3 (하룻밤 동안 피복됨, 클론 OKT3, #317315, BioLegend) 및 1 μg/ml의 가용성 항-CD28 (클론 CD28.2, #302923, BioLegend) 항체의 존재에서 3일 동안 활성화되기 전 CFSE (5 μM, 실온에서 5 분; 65-0850-84, eBioscience) 및 Cell Trace Violet (5 μM, 실온에서 5 분; C34557, Thermo Scientific)과 같은 상이한 막 염료로 표지화된 2개의 군으로 분할되었다. 3 일 후, 세포가 수확되고 내인성 IL-2를 제거하기 위해 수회 세척되었다. CFSE 표지화된 세포가 실온에서 30 분 동안 포화 농도의 항-PD1 항체 (서열 번호 165, 166; 10 μg/ml)와 함께 더욱 배양되었다.
과잉의 결합되지 않은 항-PD-1 항체를 제거하기 위한 여러 세척 단계 이후에, 항-PD1 전처리된 (CFSE) 및 처리되지 않은 (CTV) 세포 (25 μl, 6*106개 세포/ml)가 0.1 μg/ml의 치료 항체 (0.66 nM)로 37 ℃에서 12 분 동안 처리되기 전 V-바닥 평판 내로 공동배양되었다. 인산화 상태를 보존하기 위해, 다양한 작제물과 함께 12 분 배양 직후에 동등한 양의 Phosphoflow Fix 완충액 I (100 μl, 557870, BD)가 첨가되었다. 이들 세포는 이후, Phosphoflow PermBuffer III (558050, BD)로 80 ℃에서 하룻밤 동안 투과화되기 전 37 ℃에서 추가로 30 분 동안 배양되었다. 그 다음 날, 인산화된 형태에서 STAT-5가 항-STAT-5P 항체 (47/Stat5(pY694) 클론, 562076, BD)를 이용함으로써 4 ℃에서 30 분 동안 염색되었다.
세포가 FACS BD-LSR Fortessa (BD Bioscience)에서 획득되었다. STAT-5P의 빈도가 FlowJo (V10)로 결정되고 GraphPad Prism으로 플로팅되었다.
도 3a 및 도 3b에서 데이터는 0.1 μg/ml의 32개의 PD1-IL7 변이체에 노출 시에, Cell Trace Violet으로 표지화된 PD1+T 세포 및 PD-1 항체로 미리 차단된 CFSE로 표지화된 것들 내에 STAT-5P+ 세포의 빈도를 도시한다.
도 3a는 IL-7R 신호전달의 효능을 표시하는데, 그 이유는 일정한 돌연변이가 IL-7 분자의 더 낮은 활성과 연관되기 때문이다. 도 3b는 PD-1이 미리 차단되는 T 세포 상에서 PD1-IL7v의 활성을 나타내고, 이런 이유로, 매우 근접하는 PD-1+ T 세포에 의한 IL7v의 표적화되지 않은 또는 트랜스-전달이 계측된다. PD1-IL7wt 및 PD1-IL2v (서열 번호 22, 24, 25)가 대조로서 이용되는데, 여기서 PD1-IL7wt는 PD-1 음성 T 세포 (PD-1 미리 차단됨)에서도 80%의 활성을 보여준다. 반대로, PD1-IL2v는 PD-1+ T 세포에서 활성이고 PD-1 음성 T 세포에 대한 효능을 극적으로 상실하는데, 이것은 IL-2v의 전달이 PD-1 표적화에 의해 주로 시스로 매개된다는 것을 암시한다.
이런 이유로, 적합한 PD1-IL7v 분자는 또한, 감지 가능한 효현 특성을 유지하면서, PD1-IL2v와 유사하게 IL-7v를 PD-1+ T 세포에 시스로 전달해야 한다. 이들 특질은 원하는 특성을 갖는 이들 IL-7 변이체 (PD1-IL7-VAR3; PD1-IL7-VAR4; PD1-IL7-VAR6; PD1-IL7-VAR16; PD1-IL7-VAR18; PD1-IL7-VAR20; PD1-IL7-VAR21; PD1-IL7-VAR27)의 확인을 뒷받침하기 위해 도 3c에서 플로팅된다.
실시예 3.3: 증가하는 용량의 PD1-IL7 변이체로 PD-1+ CD4 T 세포의 처리 시에 IL-2R 신호전달 (STAT5-P)의 PD-1 매개된 시스 전달을 통한 IL-7 변이체의 선택
본 실험에서, 표면 상에서 PD-1이 결여된 이웃 CD4 T 세포 (트랜스)에서보다는, PD-1을 발현하는 동일한 CD4 T 세포 (시스)에서 PD-1에 결합 시에, PD1-IL7v가 IL-7Rα/IL-2Rγ를 통해 용량 의존성 방식으로 신호할 것인지를 사정하기 위한 판독으로서 STAT5 인산화가 이용되었다.
이러한 목적으로 CD4 T 세포가 CD4 비드 (130-045-101, Miltenyi)로 건강한 공여자 PBMC로부터 분류되고, 이후 PD-1 발현을 유도하기 위해 1 μg/ml 평판 결합된 항-CD3 (하룻밤 동안 피복됨, 클론 OKT3, #317315, BioLegend) 및 1 μg/ml의 가용성 항-CD28 (클론 CD28.2, #302923, BioLegend) 항체의 존재에서 3일 동안 활성화되기 전 CFSE (5 μM, 실온에서 5 분; 65-0850-84, eBioscience) 및 Cell Trace Violet (5 μM, 실온에서 5 분; C34557, Thermo Scientific)과 같은 상이한 막 염료로 표지화된 2개의 군으로 분할되었다. 3 일 후, 세포가 수확되고 내인성 IL-2를 제거하기 위해 수회 세척되었다. CFSE 표지화된 군은 실온에서 30 분 동안 포화 농도의 항-PD1 항체 (서열 번호 165, 166; 10 μg/ml)와 함께 더욱 배양되었다.
과잉의 결합되지 않은 항-PD-1 항체를 제거하기 위한 여러 세척 단계 이후에, 항-PD1 전처리된 (CFSE) 및 처리되지 않은 (CTV) 세포 (25 μl, 6*106개 세포/ml)가 증가하는 농도의 치료 항체 (50 μl, 66 nM의 최고 농도에서 1:10 희석 단계)로 37 ℃에서 12 분 동안 처리되기 전 V-바닥 평판 내로 공동배양되었다. 인산화 상태를 보존하기 위해, 다양한 작제물과 함께 12 분 배양 직후에 동등한 양의 Phosphoflow Fix 완충액 I (100ul, 557870, BD)가 첨가되었다. 이들 세포는 이후, Phosphoflow PermBuffer III (558050, BD)로 80 ℃에서 하룻밤 동안 투과화되기 전 37 ℃에서 추가로 30 분 동안 배양되었다. 그 다음 날, 인산화된 형태에서 STAT-5가 항-STAT-5P 항체 (47/Stat5(pY694) 클론, 562076, BD)를 이용함으로써 4 ℃에서 30 분 동안 염색되었다.
세포가 FACS BD-LSR Fortessa (BD Bioscience)에서 획득되었다. STAT-5P의 빈도가 FlowJo (V10)로 결정되고 GraphPad Prism으로 플로팅되었다.
표 26은 4명의 공여자로부터 획득된 PD-1+ 및 PD-1 미리 차단된 CD4 T 세포에서, 선택된 돌연변이체에 대한 용량 반응 STAT-5 인산화의 EC50 및 곡선 아래 면적을 보여준다.
EC50 (평균 ± SEM) AUC (평균 ± SEM) EC50 PD1bl. (평균 ± SEM) AUC PD1bl. (평균 ± SEM)
PD1-IL7-VAR3 (V15A) 144.4 ± 12.7 173.3 ± 7.4 401.2 ± 62.4 141.4 ± 11.1
PD1-IL7-VAR4 (V15K) 261.8 ± 14.7 148.1 ± 5.1 1253 ± 196.5 105.4 ± 8.4
PD1-IL7-VAR6 (V18K) 131.9 ± 5.5 175.8 ± 6 307.1 ± 33.8 146.2 ± 9
PD1-IL7-VAR16 (L77K) 126.4 ± 3.7 174.8 ± 5.9 297.3 ± 33.2 145.2 ± 9.4
PD1-IL7-VAR18 (K81E) 375.4 ± 20.5 137.8 ± 4 1425.9 ± 239 100.4 ± 8.1
PD1-IL7-VAR20 (G85K) 884.3 ± 86.8 111.8 ± 2.5 7396.8 ± 1341 60.6 ± 6.8
PD1-IL7-VAR21 (G85E) 515.7 ± 47.9 128.8 ± 3.8 2606 ± 441 85.9 ± 8
PD1-IL7-VAR27 (N143K) 264.7 ± 23.9 124.9 ± 7 766.2 ± 134.1 94.6 ± 8.6
PD1-IL7wt 73.2 ± 4.5 192.4 ± 6.3 105 ± 13.8 175.6 ± 9
도 4a-d는 효능 차이를, PD-1+ 및 PD-1 미리 차단된 CD4 T 세포에서, 선택된 PD1-IL7 변이체의 IL-2R 신호전달로서 도시한다.
도 4e 및 도 4f는 0.1 μg/ml의 8개의 선택된 PD1-IL7 변이체에 노출 시에, Cell Trace Violet로 표지화된 PD1+T 세포 및 PD-1 항체 (서열 번호 165, 166)로 미리 차단된 CFSE로 표지화된 것들 내에 STAT-5P+ 세포의 빈도를 도시한다.
도 4e는 IL-2R 신호전달의 효능을 표시하는데, 그 이유는 일정한 돌연변이가 IL-7 분자의 더 낮은 활성과 연관되기 때문이다. 도 4f는 PD-1이 미리 차단되는 T 세포 상에서 PD1-IL7v의 활성을 나타내고, 이런 이유로 매우 근접하는 PD-1+ T 세포에 의한 IL7v의 표적화되지 않은 또는 트랜스-전달이 계측된다. PD1-IL7wt 및 PD1-IL2v (서열 번호 22, 24, 25)가 대조로서 이용되는데, 여기서 PD1-IL7wt는 PD-1 음성 T 세포 (PD-1 미리 차단됨)에서도 80%의 활성을 보여준다. 반대로, PD1-IL2v는 PD-1+ T 세포에서 활성이고 PD-1 음성 T 세포에 대한 효능을 극적으로 상실하는데, 이것은 IL-2v의 전달이 PD-1 표적화에 의해 시스로 매개된다는 것을 암시한다. 요약하면, 검사된 PD1-IL7 변이체 (PD1-IL7-VAR3; PD1-IL7-VAR4; PD1-IL7-VAR6; PD1-IL7-VAR16; PD1-IL7-VAR18; PD1-IL7-VAR20; PD1-IL7-VAR21; PD1-IL7-VAR27)는 PD-1 발현 대 PD-1 결여 CD4 T 세포에서 용량 반응 방식으로, IL-7 변이체의 IL-7Rα/IL-2Rγ로의 전달을 매개하는/촉진하는 데에 PD-1의 기여를 보여준다.
실시예 3.4: 증가하는 용량의 PD1-IL7 변이체로 PD-1+ CD4 T 세포 및 PD-1 미리 차단된 CD4 T세포의 처리 시에 IL-2R 신호전달 (STAT5-P)
본 실험에서, PD-1 발현 CD4 T 세포 대 표면 상에서 PD-1이 결여된 T 세포에서 PD-1에 결합 시에 IL-7Rα/IL-2Rγ를 통해 용량 의존성 방식으로 신호전달에서 PD1-IL7v의 효능 차이를 사정하기 위한 판독으로서 STAT5 인산화가 이용되었는데, 여기서 PD1-IL7v 결합은 IL-7Rα/IL-2Rγ에 결합에만 의존한다.
이러한 목적으로 CD4 T 세포가 CD4 비드 (130-045-101, Miltenyi)로 건강한 공여자 PBMC로부터 분류되고, PD-1 발현을 유도하기 위해 1 μg/ml 평판 결합된 항-CD3 (하룻밤 동안 피복됨, 클론 OKT3, #317315, BioLegend) 및 1 μg/ml의 가용성 항-CD28 (클론 CD28.2, #302923, BioLegend) 항체의 존재에서 3일 동안 활성화되었다. 3 일 후, 세포가 수확되고 내인성 IL-2를 제거하기 위해 수회 세척되었다. 이후, 이들 세포는 2개의 군으로 분할되었는데, 이들 중에서 하나가 실온에서 30 분 동안 포화 농도의 항-PD1 항체 (서열 번호 165, 166; 10 μg/ml)와 함께 배양되었다.
과잉의 결합되지 않은 항-PD-1 항체를 제거하기 위한 여러 세척 단계 이후에, 항-PD1 전처리된 및 처리되지 않은 세포 (50 μl, 4*106개 세포/ml)가 증가하는 농도의 치료 항체 (50 μl, 66 nM의 최고 농도에서 1:10 희석 단계)로 37 ℃에서 12 분 동안 처리되기 전 V-바닥 평판 내로 파종되었다. 인산화 상태를 보존하기 위해, 다양한 작제물과 함께 12 분 배양 직후에 동등한 양의 Phosphoflow Fix 완충액 I (100 μl, 557870, BD)가 첨가되었다. 이들 세포는 이후, Phosphoflow PermBuffer III (558050, BD)로 80 ℃에서 하룻밤 동안 투과화되기 전 37 ℃에서 추가로 30 분 동안 배양되었다. 그 다음 날, 인산화된 형태에서 STAT-5가 항-STAT-5P 항체 (47/Stat5(pY694) 클론, 562076, BD)를 이용함으로써 4 ℃에서 30 분 동안 염색되었다.
세포가 FACS BD-LSR Fortessa (BD Bioscience)에서 획득되었다. STAT-5P의 빈도가 FlowJo (V10)로 결정되고 GraphPad Prism으로 플로팅되었다.
도 5a-f에서 데이터는 PD-1+ 및 PD-1 미리 차단된 CD4 T 세포에서, 선택된 PD1-IL7 변이체의 효능 차이를 증명한다. PD1+ CD4 T 세포에서 효능 치수는 PD1 미리 차단된 CD4 T 세포에서 IL-7의 PD1-매개된 전달 대 IL-7의 PD1-독립된 전달을 반영한다.
각 PD1-IL7v 분자의 IL-7의 PD1-매개된 및 PD-1 독립된 전달 사이에 STAT-5P EC50 배수 증가가 PD-1 미리 차단된 세포의 EC50을 PD1+ T 세포의 EC50으로 나눔으로써 계산되었다. 이것은 IL7 돌연변이체 각각에 대한 IL7v의 PD1-의존성 전달의 강도에 관한 증거를 제공한다.
게다가, PD1-IL7v 및 PD1-IL7wt 사이에 EC50 배수 증가가 PD1-IL7v의 EC50을 PD1-IL7wt의 EC50으로 나눔으로써 계산되었다. 이것은 IL-7Rα에 대한 감소된 친화성에 기인한 PD1-IL7v의 효능에서 상실을 암시하였다.
표 27은 4명의 공여자로부터 획득된 PD-1+ 및 PD-1 미리 차단된 CD4 T 세포에서, 선택된 돌연변이체에 대한 용량 반응 STAT-5 인산화의 EC50, EC50 배수 증가 및 곡선 아래 면적을 보여준다.
PD1+ 세포에서 EC50 (평균 ± SEM) PD1-차단된 세포에서 EC50 (평균 ± SEM) EC50에서 배수 증가 EC50 [PD1bl과 함께] /EC50 [PD1+] EC50에서 배수 증가 EC50 [PD1+] /EC50 PD1-IL7wt [PD1+] PD1+ 세포에서 AUC (평균 ± SEM) PD1-차단된 세포에서 AUC (평균 ± SEM)
PD1-IL7 - V15A (Var3) 337.8 ± 46.3 3559.3 ± 514.9 10.5 ± 0.6 1.7 ± 0.4 93.2 ± 11.1 46.5 ± 6.9
PD1-IL7 - V15K (Var4) 554 ± 104.6 14688.5 ± 4413 28.8 ± 8.5 2.5 ± 0.3 73.6 ± 10.4 30.5 ± 5.9
PD1-IL7 - V18A (Var5) 229.4 ± 33.8 1204.2 ± 260 5.5 ± 1.2 1.1 ± 0.2 102.8 ± 12.8 64.4 ± 10.8
PD1-IL7 - V18K (Var6) 412.7 ± 82.6 2940.2 ± 927.3 8.3 ± 3.2 1.9 ± 0.3 91.2 ± 12.3 53.8 ± 10.8
PD1-IL7 - L77A (Var15) 270.8 ± 52.7 1140.3 ± 334.2 4.6 ± 1.3 1.2 ± 0.1 103.9 ± 11.7 68 ± 11.2
PD1-IL7 - L77K (Var16) 325.9 ± 52.6 1617 ± 303 5 ± 0.7 1.5 ± 0.2 92.2 ± 13.4 63 ± 11.6
PD1-IL7 - K81E (Var18) 897.4 ± 191.9 9009 ± 1702 10.8 ± 2.1 4.3 ± 1 78.7 ± 9.2 33.8 ± 5.7
PD1-IL7 - G85K (Var20) 2158.3 ± 553 77889853.8 ± 53733993.1 25039.4 ± 15045.7 9.3 ± 0.7 56.1 ± 8.2 16.3 ± 4.1
PD1-IL7 - G85E (Var21) 1428.8 ± 325.2 18197.8 ± 6098.5 12 ± 1.2 6.4 ± 0.8 63 ± 6.8 24.8 ± 2.4
PD1-IL7 - I88K (Var22) 137 ± 25.7 233.5 ± 46.4 1.7 ± 0.2 0.6 ± 0.1 123.5 ± 12.9 94.6 ± 10.9
PD1-IL7 - N143K (Var27) 2210.7 ± 1373.2 6161 ± 2049 4.7 ± 2.1 7.8 ± 2.5 44.4 ± 11.4 23.3 ± 3.6
PD1-IL7 - wt 246.3 ± 80.6 318.5 ± 90.2 1.5 ± 0.4 1 ± 0 118 ± 11.8 91.8 ± 8.8
실시예 4
실시예 4.1: PD1-IL7v 처리 시에 Treg 억제로부터 Tconv 효과기 기능의 구조
여기에서, PDl-IL7 돌연변이체가 Tconv 효과기 기능의 Treg 억제를 반전시킬 수 있는지가 사정되었다. 이런 이유로, 억제-기능 검정이 확립되었고, 이러한 목적으로, Tconv 및 Treg가 단리되고 아래와 같이 표지화되었다. CD4+ CD25+ CD127dim 조절 T 세포 (Treg)가 2 단계 조절 T 세포 단리 키트 (Miltenyi, #130-094-775)로 단리되었다. 병렬적으로 CD4+ CD25- 전통적인 T 세포 (Tconv)가 CD25 양성 선택의 음성 분획물 (Miltenyi, #130-092-983), 그 이후에 CD4+ 농축물 (Miltenyi, #130-045-101)을 수집함으로써 단리되었다. 양쪽 모집단의 증식을 추적하기 위해, Tconv가 CFSE (eBioscience, #65-0850-84)로 표지화되었고, Treg가 Cell Trace Violet (ThermoFisher scientific, C34557)로 표지화되었다.
Tconv 및 Treg는 이후, 동종특이적 자극을 제공하기 위해 관련 없는 공여자로부터 획득된 CD4- CD25- PBMC의 존재에서, 처리와 함께 또는 처리 없이 5 일 동안 함께 배양되었다.
5일 자에, 골지 복합체에서 사이토킨의 축적이 FACS 염색에 앞서 5 시간 동안 단백질 수송 저해제 (GolgiPlug #555029, BD 및 GolgiStop #554724, BD)를 적용함으로써 증강되었다.
Treg의 존재와 부재에서 그랜자임 B (GrzB; 도 6)를 분비하는 증식된 Tconv의 능력이 계측되었다. Treg 억제는 하기 공식으로 계산되었고:
Figure pct00031
여기서
Figure pct00032
는 Treg ± 처리의 존재에서 Tconv에 의해 분비된 사이토킨의 수준이고,
Figure pct00033
는 Treg의 부재에서 Tconv에 의해 분비된 사이토킨의 수준이다. 도 6에서, 각 부호는 별개의 공여자를 나타내고, 수평선은 3번의 독립된 실험으로부터 N=5 공여자에서 중앙값을 표시한다. P는 일원 변량분석을 이용하여 계산되었다. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001).
처리되지 않은 샘플에서, Tconv에 의한 그랜자임 B 분비의 95%가 Treg에 의해 억제되었다. 표적화되지 않은 IL-2v 또는 IL-7v로 처리는 Treg 억제로부터 그랜자임 B의 Tconv 분비를 구조하지 못하였다. 하지만, 표적화되지 않은 IL-7wt는 Treg에 의한 IL7R의 감소된 발현을 고려할 때 Tconv에서 IL-7 우선적 활성으로 인해, Treg 억제를 63%까지 감소시킬 수 있었는데, 이것은 이의 소비에 대한 Treg에 비하여 Tconv의 경쟁 이점으로 해석된다. 흥미롭게도, IL-7wt 및 돌연변이된 IL-7의 PD-1 매개된 표적화는 단일 돌연변이에 따라서, 돌연변이체의 경우에 61% 내지 8% 사이의 범위 안에, 그리고 PD1-IL7wt의 경우에 18%에 이르는, Treg 억제의 확연한 감소를 야기하였다. PD1-IL2v는 Treg 억제 (이 경우에 있어서 57%까지 감소되었다)를 극복하는 능력으로 인해 양성 대조로서 이용되었다.
이들 결과는 IL-7의 PD-1 매개된 전달에 의한, Treg와 대비하여 Tconv에 제공된 경쟁 이점을 부각시킨다. 이들은 또한, IL-7Rα에 대한 감소된 친화성을 갖는 돌연변이체가 Treg와 대비하여 Tconv에 대한 IL-7wt 경쟁 이점을 여전히 유지한다는 것을 드러낸다 (도 6).
실시예 4.2: 증가하는 용량의 PD1-IL7 돌연변이체로 처리 시에 활성화된 PD-1+ 및 PD-1- CD4 T 세포에서 IL-7R 신호전달 (STAT5-P)
본 실험에서, 활성화된 PD1+ 및 PD-1- (항-PD-1 전처리된) CD4 T 세포를 증가하는 농도의 면역접합체로 처리함으로써, IL-7Ra/g에 대한 감소된 친화성을 갖는, WO 2020/127377 A1에서 개시된 4개의 상이한 PD1-IL7 돌연변이체 (참조 분자 1 내지 4)의 효능 및 시스/트랜스 신호전달이 IL-7R 신호전달로서 계측되었다. 목적은 IL-7R 신호를 전달하기 위한 T 세포의 PD-1 발현에 대한 PD1-IL7 돌연변이체의 의존성을 결정하는 것이었다.
이들 분자 각각은 IL7Rα 또는 통상적인 감마 사슬 (γc) 중 어느 하나에 대한 친화성을 낮추려는 의도로 IL-7 내에 적어도 하나의 점 돌연변이를 갖는다.
이러한 목적으로 CD4 T 세포가 CD4 비드 (130-045-101, Miltenyi)로 건강한 공여자 PBMC로부터 분류되고, PD-1 발현을 유도하기 위해 1 μg/ml 평판 결합된 항-CD3 (하룻밤 동안 피복됨, 클론 OKT3, #317315, BioLegend) 및 1 μg/ml의 가용성 항-CD28 (클론 CD28.2, #302923, BioLegend) 항체의 존재에서 3일 동안 활성화되었다. 3 일 후, 세포가 수확되고 내인성 사이토킨을 제거하기 위해 수회 세척되었으며, 그리고 이들 세포 중 절반은 CTV (5uM, 실온에서 5 분; C34557, Thermo Scientific)로 표지화되었고 다른 나머지 절반은 표지화되지 않았다.
이후, CFSE 표지화된 세포가 실온에서 30 분 동안 포화 농도의 경쟁 항-PD-1 항체 (인하우스 분자, 10 μg/ml)와 함께 배양되었고, 그 이후에 과잉의 결합되지 않은 항-PD1 항체를 제거하기 위한 여러 세척 단계가 뒤따랐다. 그 후에 PD1 미리 차단된 CFSE 표지화된 세포 (25μl, 6*106개 세포/ml)가 증가하는 농도의 치료 항체 (50 μl, 1:10 희석 단계)로 37 ℃에서 12 분 동안 처리되기 전 V-바닥 평판에서 PD1+ CTV 표지화된 세포 (25 μl, 6*106개 세포/ml)와 함께 1:1로 공동배양되었다. 인산화 상태를 보존하기 위해, 다양한 작제물과 함께 12 분 배양 직후에 동등한 양의 Phosphoflow Fix 완충액 I (100ul, 557870, BD)가 첨가되었다. 이들 세포는 이후, Phosphoflow PermBuffer III (558050, BD)로 -80 ℃에서 하룻밤 동안 투과화되기 전 37 ℃에서 추가로 30 분 동안 배양되었다. 그 다음 날, 인산화된 형태에서 STAT-5가 항-STAT-5P 항체 (47/Stat5(pY694) 클론, 562076, BD)를 이용함으로써 4 ℃에서 30 분 동안 염색되었다.
세포가 FACS BD-LSR Fortessa (BD Bioscience)에서 획득되었다. STAT-5P의 빈도가 FlowJo (V10)로 결정되고 GraphPad Prism으로 플로팅되었다.
PD-1+ T 세포에서 용량 반응 곡선은 IL-7R을 통한 신호전달에서 참조 분자 1 내지 4의 효능에 관한 정보를 제공한다. 이에 더하여, PD-1 매개된 전달을 예방하기 위해, 경쟁 항-PD-1 항체로 전처리된 T 세포에서 용량 반응 곡선은 PD-1 발현과는 독립적으로 IL-7R 신호전달을 제공하는 데에 참조 분자 1 내지 4의 효능을 보여준다. 이러한 특정 검정에서 단지 참조 분자 2만 PD-1+ T 세포에서보다, PD-1 결합이 부재하는 T 세포에서 12배 초과 감소된 활성을 나타냈다 (도 7, 표 28).
표 28.
EC50 (PD1+) EC50 (PD1 차단됨) 면적 (PD1+) 면적 (PD1 차단된)
참조 분자 1 85.65 211.3 104.4 81.21
참조 분자 2 1920 33420 45.11 15.36
참조 분자 3 결정되지 않음 결정되지 않음 0.6909 0.7512
참조 분자 4 761.3 2019 60.76 44.14
실시예 4.3: 증가하는 용량의 PD1-IL7 단일 및 이중 돌연변이체로 처리 시에 활성화된 PD-1+ 및 PD-1- CD4 T 세포에서 IL-7R 신호전달 (STAT5-P)
하기 실험에서, 활성화된 PD1+ 및 PD-1- (항-PD-1 전처리된) CD4 T 세포를 증가하는 농도의 면역접합체에 노출시킴으로써, 2개의 상이한 PD1-IL7 돌연변이체 및 2개의 이중 돌연변이체 및 참조 분자 2의 IL-7R 신호전달이 계측되었다. PD1-독립된 방식으로, 또는 IL-7wt 모이어티가 PD1+ 세포에 근접하게 배양된 PD1 음성 T 세포에서 신호할 수 있다는 것을 의미하는 트랜스로 PD1-IL7wt가 작용한다는 점을 고려하면, 이러한 실험은 IL-7v 모이어티가 PD-1 도킹 후 동일한 PD-1+ T세포 상에서 IL-7R에 주로 결합하고 이를 통해 신호한다는 것을 의미하는 시스로 우선적 신호전달을 담보하기 위한, IL7Ra에 대한 감소된 친화성을 갖는 PD1-IL7 돌연변이체의 선택을 가능하게 할 것이다.
이러한 목적으로, CD4 T 세포가 건강한 공여자 PBMC로부터 분류되었고, 실험이 실시예 4.2 및 도 7에 대해 설명된 바와 같이 수행되었다.
PD-1+ T 세포에서 용량 반응 곡선은 IL-7R을 통한 신호전달에서 단일 및 이중 돌연변이체의 효능에 관한 정보를 제공한다. 이에 더하여, PD-1 매개된 전달을 예방하기 위해, 경쟁 항-PD-1 항체로 전처리된 T 세포에서 용량 반응 곡선은 PD-1에 결합과는 독립적으로 IL-7R 신호전달을 제공하는 데에 단일 및 이중 돌연변이체의 효능을 보여준다. 이러한 특정 검정에서 PD1-IL7VAR18 및 PD1-IL7VAR21은 각각, 그들의 우선적 시스-활성을 표시하는, PD-1+ T 세포에서보다 PD-1- T 세포에서 20배 및 30배 초과 감소된 효능을 나타냈다 (도 8a). 흥미롭게도, PD1-IL7VAR18/20 이중 변이체는 PD-1+ T 세포와 비교할 때 PD-1- T 세포에서 거의 100배의 극적인 활성 감소를 보여주었다 (도 8b).
표 29
EC50 PD1+ EC50 PD1 차단됨 EC50 [PD1차단됨]/ EC50 [PD1+] EC50 [PD1+]/ EC50[PD1-IL7wt] AUC PD1+ AUC PD1 차단됨
PD1-IL7wt 39.8 82.0 2.1 1.0 138.6 106.5
참조 분자 2 1334.0 15411.0 11.6 33.5 59.6 22.9
PD1-IL7 VAR18/20 (K81E/G85K) 655.6 71266.0 108.7 16.5 58.0 12.9
PD1-IL7 VAR18/21 (K81E/G85E) 1986.0 ~ 44192470 결정되지 않음 49.9 28.5 3.0
PD1-IL7 VAR18 (K81E) 331.4 7554.0 22.8 8.3 80.8 34.3
PD1-IL7 VAR21 (G85E) 382.2 13640.0 35.7 9.6 71.9 24.5
실시예 4.4: 증가하는 용량의 PD1-IL7 단일 및 이중 돌연변이체로 처리 시에 활성화된 PD-1 + 대 새로 단리된 IL-7Ra + CD4 T 세포에서 IL-7R 신호전달 (STAT5-P)
PD1-IL7 단일 및 이중 돌연변이체의 표적내 및 표적 이탈 활성을 계측하기 위해, 증가하는 농도의 면역접합체에 노출 시에, 원하는 표적을 대표하는 활성화된 PD-1+ 대 IL-7 요법에 대한 말초 싱크를 대표하는 새로 단리된 IL-7Ra+ CD4 T 세포에서 IL-7R 신호전달이 계측되었다.
이러한 목적으로, CD4 T 세포가 건강한 공여자 PBMC로부터 분류되고 도 7에 대해 설명된 바와 같이 활성화되었다. 3 일 후, 세포가 수확되고 내인성 사이토킨을 제거하기 위해 수회 세척되었으며, 그리고 이들 세포는 CTV (5 μM, 실온에서 5 분; C34557, Thermo Scientific)로 표지화되고 증가하는 농도의 치료 항체 (50 μl, 1:10 희석 단계)로 37 ℃에서 12 분 동안 처리되기 전 V-바닥 평판에서 관련 없는 공여자로부터 획득된 새로 단리된 CD4 T 세포와 함께 1:1로 공동배양되었다 (25 μl, 각 모집단에 대해 6*106개 세포/ml). 인산화 상태를 보존하기 위해, 다양한 작제물과 함께 12 분 배양 직후에 동등한 양의 Phosphoflow Fix 완충액 I (100ul, 557870, BD)가 첨가되었다. 이들 세포는 이후, Phosphoflow PermBuffer III (558050, BD)로 -80 ℃에서 하룻밤 동안 투과화되기 전 37 ℃에서 추가로 30 분 동안 배양되었다. 그 다음 날, 인산화된 형태에서 STAT-5가 항-STAT-5P 항체 (47/Stat5(pY694) 클론, 562076, BD)를 이용함으로써 4 ℃에서 30 분 동안 염색되었다.
세포가 FACS BD-LSR Fortessa (BD Bioscience)에서 획득되었다. STAT-5P의 빈도가 FlowJo (V10)로 결정되고 GraphPad Prism으로 플로팅되었다.
PD-1+ T 세포에서 용량 반응 곡선은 표적 T 세포에서 IL-7R을 통한 신호전달에서 PD1-IL7wt와 비교하여 단일 및 이중 돌연변이체의 효능에 관한 정보를 제공한다. 반대로, 높은 수준의 IL-7Ra을 발현하는 새로 단리된 T 세포에서 용량 반응 곡선은 표적 이탈 말초 T 세포에서 IL-7R 신호전달을 제공하는 데에, PD1-IL7wt와 비교하여 단일 및 이중 돌연변이체의 효능을 보여준다. 이러한 특정 검정에서 PD1-IL7VAR18 및 PD1-IL7VAR21은 각각, PD1-IL7wt보다 IL-7Ra+ T 세포에서 60배 및 130배 초과 감소된 효능을 나타냈고, 반면 PD-1+ T 세포에서는 효능에서 단지 12배 및 17배 감소만을 나타냈다 (도 9a). 참조 분자 2는 PD-1+ T 세포에서 효능의 40배 감소와 연관된, IL-7Ra+ T 세포에서 130배 초과 더 적은 IL-7R 신호전달을 나타냈다 (도 9b). 흥미롭게도, 이중 돌연변이체는 PD1-IL7wt와 비교할 때, IL-7Ra+ T 세포에서 300배 및 1700배 더 적은 표적 이탈 활성, 그리고 PD1+ T 세포에서 각각, 27배 및 106배 감소된 표적내 활성을 보여주었다 (도 9b). 이것은 IL-7Ra에 대한 감소된 친화성 및 이런 이유로 감소된 표적 이탈 효과로 인해, PD-1+ T 세포에서 단일 돌연변이체의 우선적 활성 및 이중 돌연변이체의 훨씬 높은 우선적 활성을 암시한다.
표 30
EC50 [활성] EC50[활성] / EC50 [활성 PD1-IL7wt] EC50 [신규] EC50[신규]/EC50 [신규 PD1-IL7wt] AUC [활성] AUC [신규]
PD1-IL7wt 29.99 1.0 3.705 1.0 200.2 376.9
참조 분자 2 1193 39.8 501.2 135.3 84.46 175.8
PD1-IL7 VAR18/20 (K81E/G85K) 821 27.4 1125 303.6 80.99 142.8
PD1-IL7 VAR18/21 (K81E/G85E) 3187 106.3 6377 1721.2 42.84 73.02
PD1-IL7 VAR18 (K81E) 360.9 12.0 233.1 62.9 119.1 214.2
PD1-IL7 VAR21 (G85E) 532.2 17.7 480.7 129.7 104.4 184.6
실시예 4.5: 동종특이적 PD-1 + CD4 T 세포의 세포독성 효과기 기능 및 증식에 대한 PD1-IL7 단일 및 이중 돌연변이체 기능적 활성
T 세포의 효과기 기능에 대한 PD1-IL7v의 기능적 활성을 사정하고 이것을 PD1-IL7wt와 비교하기 위해, CD4 T 세포가 동종반응성 T 세포를 산출하기 위한 B 세포 림프아구성 종양 세포주 (ARH77)와 함께 5 일 동안 공동배양되었다. ARH77은 중간 수준의 PD-L1 및 높은 수준의 MHCII를 발현하고, 동종특이적 CD4 T 세포의 표면 상에서 PD-1 발현을 유도한다. 이러한 검정은 이런 이유로, 돌연변이된 및 wt IL-7의 PD-1 차단 및 PD-1 매개된 전달의 기능적 사정을 가능하게 한다.
CD4 단리 및 CTV 표지화가 전술된 바와 같이 수행되었다. 분류된 CD4+ T 세포가 증가하는 용량의 PD1 기반 또는 FAP 기반 IL-7 돌연변이체 및 wt의 존재 또는 부재에서 5:1 (100,000개 T 세포: 20,000개 ARH-77)의 E:T 비율에서, 방사선조사된 ARH-77 (인간 B 림프모구 세포주)와 공동배양되었다. 이들 세포는 37 ℃, 5% CO2에서 5 일 동안 96-둥근 바닥 평판에서 공동배양되었다. 5 일 후 골지 복합체에서 사이토킨의 축적이 FACS 염색에 앞서 5 시간 동안 단백질 수송 저해제 (GolgiPlug, 555029, BD 및 GolgiStop, 554724, BD)를 적용함으로써 증강되었다. 이들 세포는 먼저, CD4에 대해 및 생존/죽음에 대해 염색되었다. 하룻밤 동안 고정/ 투과화 (554714, BD) 후, 이들 세포는 그랜자임 B (GrzB)에 대해 세포내 염색되었다. 이들 세포는 FACS BD-LSR Fortessa (BD Bioscience)에서 획득되고 FlowJo 및 GraphPad Prism으로 분석되었다. 살아있고 증식하는 CD4+ T 세포 (CTVlow)에서 게이팅함으로써, 그랜자임 B 분비의 빈도 및 평균 형광 강도가 조건 사이에서 비교되었다.
용량 반응 곡선은 단일 돌연변이체 PD1-IL7VAR18, PD1-IL7VAR21 및 이중 변이체 PD1-IL7VAR18/20이 기능적으로 활성이고, 비슷한 T 세포-증식을 유도하면서, 세포독성 T 세포 효과기 기능을 이끌어 내는 데에 PD1-IL7wt보다 훨씬 강력하다는 것을 암시한다 (도 10a-b, 10d-e). 참조 분자 2는 T 세포 효과기 기능 (3배) 및 증식 (2배)에서 더 낮은 활성을 보여주었다 (도 10c, 10f).
흥미롭게도, 부모 항-PD1 항체 및 표적화되지 않은 FAP 기반 IL-7 분자의 조합은 유사한 결과를 재현하지 못하였는데, 이것은 IL-7 돌연변이체의 PD-1+ 동종특이적 T 세포로의 효율적인 전달을 위한 PD-1 매개된 표적화의 중대한 기여를 부각시켰다.
표 31과 32 및 상응하는 도 10a-f는 검사된 분자의 효능을 보여주고, 통합 처리가 융합 단백질의 효과를 개괄하지 않는다는 것을 증명한다.
표 31. 데이터 도 10a-c
EC50 총면적 EC50 총면적 EC50 총면적
PD1-IL7wt 63 5.6 PD1 + FAP-IL7wt 155 4.7 FAP-IL7wt 458 2.8
PD1-IL7 VAR18/20 (K81E/G85K) 60 7.2 PD1 + FAP-IL7 VAR18 /VAR20 (K81E/G85K) 516 2.5 FAP-IL7 VAR18 /VAR20 (K81E/G85K) 20299 1.3
PD1-IL7 VAR18/21 (K81E/G85E) 31 4.2 PD1 + FAP-IL7 VAR18 / VAR21 (K81E/G85E) 579 2.2 FAP-IL7 VAR18 / VAR21 (K81E/G85E) 4446 0.3
PD1-IL7 VAR18 (K81E) 78 8.6 PD1 + FAP-IL7 VAR18 (K81E) 726 3.0 FAP-IL7 VAR18 (K81E) 959 1.2
PD1-IL7 VAR21 (G85E) 44 8.1 PD1 + FAP-IL7 VAR21 (G85E) 374 2.8 FAP-IL7 VAR21 (G85E) 9333 0.8
참조 분자 2 77 2.3 PD1 + FAP-IL7 SS2 (1x) 2249 2.4 FAP-IL7 SS2 (1x) 29811 1.6
PD1 65 1.2 PD1 + FAPIL7 SS2 (2x) 4457 3.2
표 32 데이터 도 10d-f
EC50 총면적 EC50 총면적 EC50 총면적
PD1-IL7wt 1 131 PD1 + FAP-IL7wt 2 118 FAP-IL7wt 4 115
PD1-IL7 VAR18/20 (K81E/G85K) 57 104 PD1 + FAP-IL7 VAR18 /VAR20 (K81E/G85K) 3375 35 FAP-IL7 VAR18 /VAR20 (K81E/G85K) 5443 39
PD1-IL7 VAR18/21 (K81E/G85E) 15 59 PD1 + FAP-IL7 VAR18 / VAR21 (K81E/G85E) 9489 19 FAP-IL7 VAR18 /VAR21 (K81E/G85E) 7501 23
PD1-IL7 VAR18 (K81E) 7 129 PD1 + FAP-IL7 VAR18 (K81E) 45 69 FAP-IL7 VAR18 (K81E) 91 69
PD1-IL7 VAR21 (G85E) 7 121 PD1 + FAP-IL7 VAR21 (G85E) 323 51 FAP-IL7 VAR21 (G85E) 422 54
참조 분자 2 101 65 PD1 + FAP-IL7 SS2 (1x) 5940 34 FAP-IL7 SS2 (1x) 4224 43
PD1 357 18 PD1 + FAPIL7 SS2 (2x) 4555 50
실시예 4.6: PD1 기반 대 표적화되지 않은 IL-7 돌연변이체 및 wt에 의한 줄기 유사 T 세포, Treg 및 미경험 T 세포의 표적화
IL-7에 도입된 돌연변이가 IL-7Ra에 대한 이의 친화성을 감소시키고, PD-1 매개된 전달 및 이런 이유로 PD-1+ T 세포의 표적화를 향상시키는지를 사정하기 위한 개념 증거 실험으로서, PD1-IL7 돌연변이체 및 PD1-IL7wt가 풍부한 표적 이탈 T 세포 예를 들면 미경험 및 Treg, 그리고 PD-1을 자연적으로 발현하는 작은 표적 집단을 내포하는 건강한 공여자 PBMC에서 결합 검정에서 검사되었다.
건강한 공여자 PBMC는 PD1-IL7VAR18, PD1-IL7VAR21, PD1-IL7wt 또는 FAP-IL7VAR18, FAP-IL7VAR21, FAP-IL7wt 중 어느 하나와 함께 37 ℃에서 30 분 동안 배양되었다. 결합되지 않은 작제물의 제거 후, 이들 PBMC는 면역접합체의 돌연변이된 Fc-부분을 특이적으로 검출할 수 있는, 직접적으로 표지화된 항-PGLALA 항체로 염색되었다. 이들 세포는 고정 전, CD4 및 CD8에 대해 더욱 염색되고, 투과화되고 FOXP-3, PD-1 및 TCF-1로 염색되었다.
표면과 세포내 마커에 근거하여 T 세포는 하기 하위모집단: Treg (CD4+FOXP3+), CD8 미경험 (CD8+PD-1-TCF-1+) 및 CD8 줄기 유사 T 세포 (CD8+PD-1+TCF-1+)로 분할되었다. 이후, PGLALA+ 세포의 빈도가 계측되고, 처리 조건 전체에 대하여 각 T 세포 부분집합에 대해 계산되었다.
도 11은 이들 3개의 부분집합에서 IL-7Ra의 감소하는 발현 수준과 합치하게, FAP-IL7wt가 미경험 T 세포, 그 이후에 Treg 및 마지막으로 줄기 유사 T 세포에 결합한다는 것을 증명한다. 반대로, PD1-IL7wt의 PD-1 매개된 표적화는 변화 없이 남아있는 반면, 미경험 및 Treg에 결합은 줄기 유사 T 세포를 향한 표적화를 극적으로 증가시켰다 (도 11). 특히, PD1-IL7VAR18 및 VAR21 둘 모두 줄기 유사 T 세포를 향한 표적화를 유지하지만, Treg 및 미경험 T 세포 둘 모두에 대한 표적 이탈 결합에서 극적인 감소를 보여주었다 (도 11).
실시예 4.7: 생쥐 IL-7Ra 및 인간 PD-1 유전자도입 생쥐의 IL-2Rg에 대한 PD1-IL7 단일, 이중 돌연변이체 및 wt의 교차반응성
생쥐에서 생체내 효능 연구를 수행하기 위해, 차단 항-PD1 항체에 융합된 IL7 단일, 이중 돌연변이체 및 야생형이 뮤린 IL-7Ra 및 인간 PD-1 유전자도입 생쥐로부터 획득된 활성화된 비장세포의 IL-2Rg에 대한 교차반응성에 대해 검사되었다.
이러한 목적으로 CD4 T 세포가 CD4 비드 (130-104-454, Miltenyi)를 이용함으로써 2마리의 인간 PD-1 유전자도입 생쥐의 비장의 단일 세포 현탁액으로부터 단리되었고, PD-1 발현을 유도하기 위해 5 μg/ml 평판 결합된 항-CD3 (하룻밤 동안 피복됨, 클론 145-2C11, BioLegend) 및 5 μg/ml의 평판 결합된 항-CD28 (하룻밤 동안 피복됨, 클론 37.51, BioLegend) 항체의 존재에서 3일 동안 활성화되었다. 3 일 후, 세포가 수확되고 내인성 사이토킨을 제거하기 위해 수회 세척되었다. PD1+ CD4 T 세포 (50 μl, 4*106개 세포/ml)가 증가하는 농도의 치료 항체 (50 μl, 1:10 희석 단계)로 37 ℃에서 30 분 동안 처리되기 전 V-바닥 평판에 파종되었다. 인산화 상태를 보존하기 위해, 다양한 작제물과 함께 30 분 배양 직후에 동등한 양의 Phosphoflow Fix 완충액 I (100ul, 557870, BD)가 첨가되었다. 이들 세포는 이후, Phosphoflow PermBuffer III (558050, BD)로 -80 ℃에서 하룻밤 동안 투과화되기 전 37 ℃에서 추가로 30 분 동안 배양되었다. 그 다음 날, 인산화된 형태에서 STAT-5가 항-STAT-5P 항체 (47/Stat5(pY694) 클론, 562076, BD)를 이용함으로써 4 ℃에서 30 분 동안 염색되었다.
세포가 FACS BD-LSR Fortessa (BD Bioscience)에서 획득되었다. STAT-5P의 빈도가 FlowJo (V10)로 결정되고 GraphPad Prism으로 플로팅되었다.
PD1-IL7wt는 생쥐 교차반응성이고, 인간 CD4 T 세포에서보다 10배 더 낮은 농도에서 안정기를 달성하는 활성화된 CD4 T 세포의 IL-7R을 통해 용량 의존성 방식으로 신호하는 것으로 밝혀졌다. 또한 단일 돌연변이체 PD1-IL7VAR18 및 PD1-IL7VAR21은 PD1-IL7wt와 비슷한 효능으로, 그러나 감소된 Cmax에서 IL-7R의 용량 반응 신호전달을 유도하였다. 반대로, 양쪽 이중 돌연변이체뿐만 아니라 참조 분자 2는 활성화된 PD-1+ CD4 T 세포에서 어떤 신호전달도 이끌어 내지 못하였다 (도 12).
실시예 4.8: PD-1 차단 항체의 C 말단과 N 말단에 융합된 증가하는 용량의 IL-7 VAR18 (K81E), VAR21 및 야생형으로 처리 시에 활성화된 PD-1 + 및 PD-1 - CD4 T 세포에서 IL-7R 신호전달 (STAT5-P)
하기 실험에서, 면역접합체의 활성에 대한 C 말단과 N 말단의 영향을 조사하기 위해, PD-1 차단 항체의 C 말단 대 N 말단에서 융합된 PD1-IL7 Var18, Var21 및 야생형이 사정되었다. 이들 분자는 이후, 활성화된 PD-1+ 및 PD-1- (경쟁 항-PD-1 항체로 전처리된) CD4 T 세포에서 용량 의존성 방식으로 검사되었다. 이러한 목적으로, 실시예 4.2 및 도 7에서 설명된 바와 동일한 실험이 수행되었다.
PD-1+ T 세포에서 용량 반응 곡선은, 유사한 것으로 보이는 C 말단과 N 말단 형식에서 상이한 PD1-IL7 Var18, Var21 및 wt 분자의 효능에 관한 정보를 제공한다 (도 13a+b).
실시예 4.9: PD1 결합제에 융합된 IL7 돌연변이체에 의해 구성된 증가하는 용량의 PD1-IL7 (참조 분자 5-8)로 처리 시에 활성화된 PD-1 + 및 PD-1 - CD4 T 세포에서 IL-7R 신호전달 (STAT5-P)
본 실험에서, 활성화된 PD1+ 및 PD-1- (항-PD-1 전처리된) CD4 T 세포를 증가하는 농도의 면역접합체로 처리함으로써, 하나의 돌연변이된 IL7v를 PD1 결합제에 융합함에 의해 산출된 4개의 상이한 PD1-IL7 돌연변이체 (전술된 바와 같은 참조 분자 5 내지 8)의 효능 및 시스/트랜스 신호전달이 IL-7R 신호전달로서 계측되었다. 목적은 IL-7R 신호를 전달하기 위한 T 세포의 PD-1 발현에 대한 PD1-IL7 돌연변이체의 의존성을 결정하는 것이었다. 이러한 목적으로, CD4 T 세포가 건강한 공여자 PBMC로부터 분류되었고, 실험이 전술된 바와 같이 수행되었다.
PD-1+ T 세포에서 용량 반응 곡선은 IL-7R을 통한 신호전달에서 이들 참조 분자의 효능에 관한 정보를 제공한다. 이에 더하여, PD-1 매개된 전달을 예방하기 위해, 경쟁 항-PD-1 항체로 전처리된 T 세포에서 용량 반응 곡선은 PD-1 발현과는 독립적으로 IL-7R 신호전달을 제공하는 데에 이들 참조 분자의 효능을 보여준다. 이러한 특정 검정에서, 단지 참조 분자 6만 PD-1+ T 세포에서보다 PD-1 결합이 부재하는 T 세포에서 60배 초과 감소된 활성을 나타냈다 (표 33, 도 14).
특히, 참조 분자 6은 참조 분자 2와 비교하여 PD1+ 및 PD1 미리 차단된 세포에서 더 강한 효능 차이를 나타내는데 (도 2), 이것은 이용된 PD-1 결합제의 결합능이 더 높고 및/또는 하나의 IL-7v 분자가 항-PD-1 항체에 융합되는 것이 PD-1 매개된 표적화를 가능하게 한다는 것을 암시한다.
표 33:
EC50 (PD1+) EC50 (PD1 차단됨) 면적 (PD1+) 면적 (PD1 차단됨)
참조 분자 5 65.2 194.4 113.4 81.6
참조 분자 6 649.1 38244 62.5 15.3
참조 분자 7 6199 결정되지 않음 9.0 1.5
참조 분자 8 128.8 569.7 96.1 62.1
실시예 5
PD1-IL7wt Mab와 비교하여, 생쥐 종양 세포주의 동계 모형에서 PD1-IL7v 변이체 18과 21 면역접합체의 생체내 효능.
PD1-IL7v 변이체 18과 21 면역접합체가 한 가지 동계 모형에서 항종양 효능에 대해 PD1-IL7wt 항체와 비교하여 단일 작용제로서 검사되었다. 뮤린 대용품 PD1-IL2v 면역접합체가 Black 6 생쥐 내로 피하 주입된 생쥐 결장직장 MC38 세포주에서 검사되었다.
Panc02-H7 세포 (생쥐 췌장 암종)가 본래 MD Anderson 암 센터 (Texas, USA)로부터 획득되었고, 확대 후 Roche-Glycart 내부 세포 은행에 기탁되었다. Panc02-H7-Fluc 세포주가 칼슘 형질감염 및 하위클로닝 기술에 의해 인하우스 생산되었다. Panc02-H7-Fluc는 10% FCS (Sigma), 500 μg/ml 히그로마이신 및 1%의 글루타맥스를 내포하는 RPMI 배지에서 배양되었다. 이들 세포는 5 % CO2에서 물 포화된 공기 중 37℃에서 배양되었다. 이식을 위해 계대 18이 이용되었다. 세포 생존력은 92.6 %이었다. 동물마다 2x105개 세포가 1 ml 투베르쿨린 주입기 (BD Biosciences)를 이용하여 생쥐의 옆구리 내로, 100 μl의 RPMI 세포 배양 배지 (Gibco)에 담겨 피하 주입되었다.
실험의 시작 시점에 8-10 주령의 암컷 Black 6-huPD1 유전자도입 생쥐 (Charles Rivers, Lyon, France)가 약속된 지침 (GV-Solas; Felasa; TierschG)에 따라서 12 시간 밝음 / 12 시간 어둠의 일일 주기에서 특정 병원체 부재 조건하에 유지되었다. 도착 후, 동물은 새로운 환경에 익숙해지도록 1 주 동안 유지되고 관찰되었다. 연속 건강 모니터링이 규칙적인 기초에서 실행되었다.
생쥐는 연구 0 일자에 2x105개의 Panc02-Fluc 세포가 피하 주입되고, 무작위배정되고, 칭량되었다. 종양 세포 주입 12 일 후 (종양 용적 > 150 mm3), 생쥐는 PD1-IL7v 변이체 18, 변이체 21, PD-IL7wt 또는 운반제가 2주 동안 주 1회 i.v. 주사되었다. 모든 생쥐는 200 μl의 적합한 용액이 i.v. 주사되었다. 운반제 군에서 생쥐는 히스티딘 완충액이 주사되었고, 치료군은 2 주 동안 PD1-IL7v 변이체 21 작제물이 1 iv qw로 또는 PD1-IL7v 변이체 18이 1 mg/kg iv qw로 또는 PD1-IL7wt가 1 mg/kg iv qw로 주사되었다. 200 μl당 적합한 양의 면역접합체를 획득하기 위해, 필요할 때 원액이 히스티딘 완충액으로 희석되었다.
도 15a-c는 PD1-IL7v 변이체 18과 21이 운반제 군과 비교하여, 종양 성장 저해의 관점에서 우수한 효능을 매개했다는 것을 보여준다. PD1-IL7v 변이체가 주사된 생쥐는 치료에 대한 내약성이 양호하였다. PD1-IL7wt 분자는 내약성이 좋지 않았고, 생쥐가 이차 투여 후 희생되어야 했기 때문에, TGI가 계산될 수 없었다.
표 34.
화합물 배치 ID 용량/생쥐 농도
(mg/mL)
PD1-IL7v var18
 P1AF5555_006 20 μg 2.9
(= 원액)
PD1-IL7v var 21
 P1AF5558_006 20 μg 2.6
(= 원액)
PD1-IL7wt P1AF5572_014 20 μg 2
(= 원액)
비록 전술된 발명이 이해의 명료함을 위해 예시와 실례로서 일부 상세하게 설명되긴 했지만, 이들 설명과 실례는 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에서 인용된 모든 특허와 과학 문헌의 개시는 명시적으로 온전히 참조로서 편입된다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Immunoconjugates <130> P36057 <140> PCT/EP2021/059473 <141> 2021-04-13 <150> EP 20169510.3 <151> 2020-04-15 <160> 166 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Ser Ser Tyr Thr 1 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Gly Arg Val Tyr Phe 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Thr Ser Asp Asn Ser Phe 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Asn Tyr Asp Val Pro Trp 1 5 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Arg Asp Asn 1 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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn 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Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 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Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450

Claims (39)

  1. 서열 번호: 52에 따른 인간 IL-7의 E13, V15, V18, D21, Q22, D25, T72, L77, K81, E84, G85, I88, Q136, K139, N143 및 M147의 군에서 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 돌연변이체 인터류킨-7(IL-7) 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 치환은 E13A, E13K, V15A, V15K, V18A, V18K, D21A, D21K, Q22A, Q22K, D25A, D25K, T72A, L77A, L77K, K81A, K81E, E84A, G85K, G85E, I88K, Q136A, Q136K, K139A, K139E, N143K 및 M147A의 군에서 선택되는, 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아미노산 치환은 V15A, V15K, V18A, V18K, L77A, L77K, K81E, G85K, G85E, I88K 및 N143K의 군에서 선택되는, 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 아미노산 치환 K81E 및 G85K 또는 K81E 및 G85E를 포함하는, 돌연변이체 인터류킨-7 폴리펩티드.
  5. (i) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 (ii) PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체.
  6. 제5항에 있어서, 항체는 (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 Kabat 넘버링에 따른 위치 71-73에서 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 (b) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 면역접합체.
  7. 제5항에 있어서, 항체는 (a) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 (b) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 면역접합체.
  8. 제5항에 있어서, 항체는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 (b) 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 면역접합체.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체는 1개 이하의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함하는, 면역접합체.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 첫 번째와 두 번째 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 면역접합체.
  11. 제10항에 있어서, Fc 도메인은 IgG 부류, 특히 IgG1 하위부류, Fc 도메인인, 면역접합체.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인인, 면역접합체.
  13. 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 IgG 부류, 특히 IgG1 하위부류 면역글로불린인, 면역접합체.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 첫 번째와 두 번째 아단위의 연결을 증진하는 변형을 포함하는, 면역접합체.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 두 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 공동에서 위치 가능한 첫 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 생성되고, Fc 도메인의 두 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 첫 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 위치 가능한 두 번째 아단위의 CH3 도메인 내에 공동이 생성되는, 면역접합체.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인의 첫 번째 아단위 내에 위치 366에서 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기(T366W)로 대체되고, Fc 도메인의 두 번째 아단위 내에 위치 407에서 티로신 잔기가 발린 잔기(Y407V)로 대체되고, 임의적으로 위치 366에서 트레오닌 잔기가 세린 잔기(T366S)로 대체되고 위치 368에서 류신 잔기가 알라닌 잔기(L368A)(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)로 대체되는, 면역접합체.
  17. 제16항에 있어서, Fc 도메인의 첫 번째 아단위 내에 추가적으로 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기(S354C)로 대체되거나 또는 위치 356에서 글루타민산 잔기가 시스테인 잔기(E356C)로 대체되고, Fc 도메인의 두 번째 아단위 내에 추가적으로 위치 349에서 티로신 잔기가 시스테인 잔기(Y349C)(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 대체되는, 면역접합체.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드는 임의적으로 링커 펩티드를 거쳐, 자체의 아미노 말단 아미노산에서 Fc 도메인의 아단위 중 하나, 특히 Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 카르복시 말단 아미노산에 융합되는, 면역접합체.
  19. 제18항에 있어서, 링커 펩티드는 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 갖는, 면역접합체.
  20. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인은 Fc 수용체, 특히 Fcγ 수용체에 결합, 및/또는 효과기 기능, 특히 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 면역접합체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 L234, L235 및 P329(Kabat EU 색인 넘버링)의 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에 있는, 면역접합체.
  22. 제10항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인의 각 아단위는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(Kabat EU 색인 넘버링)를 포함하는, 면역접합체.
  23. 제5항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 85의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호: 86의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호: 90, 서열 번호: 91, 서열 번호: 92, 서열 번호: 93, 서열 번호: 102, 서열 번호: 103, 서열 번호: 105, 서열 번호: 107, 서열 번호: 108, 서열 번호: 109, 서열 번호: 114, 서열 번호: 137 및 서열 번호: 138의 군에서 선택되는 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 면역접합체.
  24. 제5항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 서열에 의해 연결된, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 IgG1 면역글로불린 분자로 본질적으로 구성되는, 면역접합체.
  25. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 제5항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역접합체를 인코딩하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드.
  26. 제23항의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 하나 이상의 벡터, 특히 발현 벡터.
  27. 제23항의 폴리뉴클레오티드(들) 또는 제24항의 벡터(들)를 포함하는 숙주 세포.
  28. 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 생산하는 방법으로서, (a) 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 면역접합체의 발현에 적합한 조건하에 제26항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의적으로 (b) 상기 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 면역접합체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제28항의 방법에 의해 생산된, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 및 PD-1에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체.
  30. 제1항 내지 제4항 또는 제29항 중 어느 한 항의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 제5항 내지 제24항 또는 제29항 중 어느 한 항의 면역접합체 및 제약학적으로 허용되는 운반체를 포함하는 제약학적 조성물.
  31. 약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제4항 또는 제29항 중 어느 한 항의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 제5항 내지 제24항 또는 제29항 중 어느 한 항의 면역접합체.
  32. 질환의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제4항 또는 제29항 중 어느 한 항의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 제5항 내지 제24항 또는 제29항 중 어느 한 항의 면역접합체.
  33. 제32항의 질환의 치료에 사용하기 위한 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 면역접합체로서, 여기서 상기 질환이 암인, 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 면역접합체.
  34. 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제4항 또는 제29항 중 어느 한 항의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 제5항 내지 제24항 또는 제29항 중 어느 한 항의 면역접합체의 용도.
  35. 제34항에 있어서, 상기 질환은 암인, 용도.
  36. 개체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 제약학적으로 허용되는 형태에서 제1항 내지 제5항 또는 제29항 중 어느 한 항의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 제4항 내지 제24항 또는 제29항 중 어느 한 항의 면역접합체를 포함하는 조성물의 치료 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 질환은 암인, 방법.
  38. 개체의 면역계를 자극하는 방법으로서, 제약학적으로 허용되는 형태에서 제1항 내지 제4항 또는 제29항 중 어느 한 항의 돌연변이체 IL-7 폴리펩티드 또는 제5항 내지 제24항 또는 제29항 중 어느 한 항의 면역접합체를 포함하는 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  39. 전술된 바와 같은 발명.
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