JP6801006B2 - Tnfファミリーリガンドトリマーとpd1結合部分とを含む抗原結合分子 - Google Patents
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Description
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子であり、
(c)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメイン
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
(i)第1のポリペプチドがCH1若しくはCLドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCL若しくはCH1ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1若しくはCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの2つの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCL若しくはCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
(ii)第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの2つの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによってポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
(iii)第1のポリペプチドがVH−CL若しくはVL−CH1ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがVL−CH1ドメイン若しくはVH−CLドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びVH若しくはVLに接続されているTNFリガンドファミリーメンバー2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのVL若しくはVHに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、抗原結合分子を提供する。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
(i)第1のポリペプチドがCH1若しくはCLドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCL若しくはCH1ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1又はCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの2つの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCL若しくはCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
(ii)第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの2つの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン若しくはその断片を含む、
抗原結合分子を提供する。
(a)標的細胞抗原と特的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片だけを含むことを特徴とし、この場合、前記TNFリガンドファミリーメンバーは、ヒトT細胞活性化を共刺激する。より特に、TNFリガンドファミリーメンバーは、4−1BBL及びOX40Lから選択される。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号9、配列番号11、配列番号12及び配列番号10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号1、配列番号3、配列番号4及び配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号10のアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号5のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)CH1又はCLドメインを含有する第1のポリペプチド、及びCL又はCH1ドメインを含有する第2のポリペプチドと
をそれぞれ含み、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1又はCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCL又はCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)CH1ドメインを含有する第1のポリペプチド、及びCLドメインを含有する第2のポリペプチドと
を含み、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1ドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCLドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)CLドメインを含有する第1のポリペプチド、及びCH1ドメインを含有する第2のポリペプチドと
を含み、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
(a)(i)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、
(b)(i)配列番号26のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号27のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号29のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号30のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号31のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、
(c)(i)配列番号34のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号35のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号36のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号37のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号38のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号39のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、
(d)(i)配列番号42のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号43のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号44のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号45のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号46のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号47のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、
(e)(i)配列番号50のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号51のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号52のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号53のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号54のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号55のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、
(f)(i)配列番号58のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号59のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号60のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号63のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、又は
(g)(i)配列番号66のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号67のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号68のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号69のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号70のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号71のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(a)配列番号19のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(b)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号22のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(c)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号23のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(d)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号24のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(e)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(f)配列番号32のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号33のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(g)配列番号40のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号41のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(h)配列番号48のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号49のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(i)配列番号56のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(k)配列番号64のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVLドメイン、又は
(l)配列番号72のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号73のアミノ酸配列を含むVLドメイン
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(a)配列番号19のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(b)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号22のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(c)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号23のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(d)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号24のアミノ酸配列を含むVLドメイン、又は
(e)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVLドメイン
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(c)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメイン
を含み、Fcドメインが、Fc受容体との、特に、Fcγ受容体への結合を低減させる1つ又は複数のアミノ酸置換を含む、上文で定義された通りのTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。
第2のペプチドリンカーによりそのC末端で第2の重鎖又は軽鎖に融合されている、第1のペプチドリンカーによって互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、第1のペプチドと、
第3のペプチドリンカーによりそのC末端で第2の軽鎖又は重鎖に融合されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメインを含む、第2のペプチドとをそれぞれ含む、抗原結合分子を提供する。
前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のペプチドが、そのC末端で第3のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるCLドメインに融合されている、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のペプチドが、そのC末端で第3のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるCH1ドメインに融合されている、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(a)PD1と特異的に結合することができるFab分子を両方が含む、第1の重鎖及び第1の軽鎖と、
(b)配列番号9、配列番号11、配列番号12及び配列番号10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
配列番号1、配列番号3、配列番号4及び配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む、上文に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(a)PD1と特異的に結合することができるFab分子と、
(b)配列番号9、配列番号11、配列番号12及び配列番号10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
配列番号1、配列番号3、配列番号4及び配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(i)配列番号19のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖、又は
配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、並びに配列番号22、配列番号23、配列番号24及び配列番号25からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(ii)配列番号74、配列番号76、配列番号78及び配列番号80からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
(iii)配列番号75、配列番号77、配列番号79及び配列番号81からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号83若しくは配列番号171のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号74のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号75のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、
(b)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号83若しくは配列番号171のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号76のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、
(c)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号83若しくは配列番号171のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号78のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号79のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、又は
(d)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号83若しくは配列番号171のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号80のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号81のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む、抗原結合分子を提供する。
(a)配列番号84のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号85のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号83若しくは配列番号171のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖、又は
(b)配列番号86のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号87のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号83若しくは配列番号171のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖
を含む、上文に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(i)Fcドメインの第1のサブユニットと、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片とを含む融合ポリペプチド、(ii)PD1と特異的に結合することができるFabドメインのVHドメインと、Fcドメインの第2のサブユニットと、ペプチドリンカーによってCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片とを含む重鎖、並びに(iii)PD1と特異的に結合することができるFabドメインのVLドメインを含む軽鎖、又は
(i)Fcドメインの第1のサブユニットと、ペプチドリンカーによりCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片とを含む融合ポリペプチド、(ii)PD1と特異的に結合することができるFabドメインのVHドメインと、Fcドメインの第2のサブユニットと、ペプチドリンカーによって互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片とを含む重鎖、並びに(iii)PD1と特異的に結合することができるFabドメインのVLドメインを含む軽鎖
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号88のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号87のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号83又は配列番号171のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(b)配列番号89のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号90のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号83又は配列番号171のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(c)配列番号91のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号86のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号83又は配列番号171のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(b)配列番号93のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号83又は配列番号171のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
別途定義がない限り、本明細書で使用される専門及び科学用語は、本発明が属する技術分野において一般に使用されているのと同じ意味を有する。本明細書を解釈するため、以下の定義を適用することとし、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は複数形も含むことになり、また逆に複数形で使用される用語は単数形も含むことになる。
1 表A中の全てのCDR定義の番号付けは、カバット等により記載された番号付け規定によるものである(下記参照)。
2 表A中で使用されている小文字「b」を伴う「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されるようなCDRを指す。
100×分数X/Y
(ここで、Xは、配列アライメントプログラムALIGN−2により該プログラムのAとBのアライメントで同一マッチとしてスコアされるアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である)。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと同一でない場合、AのBに対しての%アミノ酸配列同一性が、BのAに対しての%アミノ酸配列同一性と同一にならないことは理解されるであろう。別途特に指定のない限り、本明細書で使用される全ての%アミノ酸同一異性は、ALIGN−2コンピュータプログラムを使用して直ぐ前の段落で説明したように得たものである。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile、
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、
(3)酸性:Asp、Glu、
(4)塩基性:His、Lys、Arg、
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro、
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
本発明は、生産性、安定性、結合親和性、生物活性、標的指向化効率、及び毒性低下等の、特に有利な特性を有する、新規TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子であり、
(c)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメイン
を含む、抗原結合分子を提供する。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とし、この場合、TNFリガンドファミリーメンバーは、ヒトT細胞活性化を共刺激する。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とし、この場合、TNFリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、全ての場合、同一である。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
(i)第1のポリペプチドがCH1若しくはCLドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCL若しくはCH1ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1若しくはCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの2つの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCL若しくはCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
(ii)第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの2つの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
(iii)第1のポリペプチドがVH−CL若しくはVL−CH1ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがVL−CH1ドメイン若しくはVH−CLドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びVH若しくはVLに接続されているTNFリガンドファミリーメンバー2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのVL若しくはVHに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、上文で定義された通りの抗原結合分子が提供される。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
(i)第1のポリペプチドがCH1若しくはCLドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCL若しくはCH1ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1若しくはCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの2つの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCL若しくはCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
(ii)第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの2つの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン若しくはその断片を含む、上文で定義された通りの抗原結合分子が提供される。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、第1のポリペプチドが、配列番号9、配列番号11、配列番号12及び配列番号10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号1、配列番号3、配列番号4及び配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、第1のポリペプチドが、配列番号10のアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号5のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、第1のポリペプチドが、配列番号9のアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)CH1又はCLドメインを含有する第1のポリペプチド、及びCL又はCH1ドメインを含有する第2のポリペプチドと
をそれぞれ含み、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、
抗原結合分子は、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1又はCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCL又はCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)CH1ドメインを含有する第1のポリペプチド、及びCLドメインを含有する第2のポリペプチドと
を含み、
第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1ドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCLドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子が提供される。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)CLドメインを含有する第1のポリペプチド、及びCH1ドメインを含有する第2のポリペプチドと
を含み、
第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子が提供される。
(a)PD1と特異的に結合することができる1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
(a)PD1と特異的に結合することができる1つより多くの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドに接続されている、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、抗原結合分子を提供する。
(a)PD1と特異的に結合することができる2つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む抗原結合分子が提供される。特に、そのようTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、標的細胞抗原と特異的に結合することができる2つの部分を含む。
(a)PD1と特異的に結合することができる2つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とし、標的細胞抗原と特異的に結合することができる2つの部分が、2つの異なる標的細胞抗原と結合する、抗原結合分子を提供する。
本発明のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子のFcドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖を含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンG(IgG)分子のFcドメインは、各々のサブユニットがCH2及びCH3 IgG重鎖定常ドメインを含む、ダイマーである。Fcドメインの2つのサブユニットは、互いに安定的に結合することができる。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子であり、
(c)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメイン
を含み、Fcドメインが、Fc受容体との、特に、Fcγ受容体への結合を低減させる1つ又は複数のアミノ酸置換を含む、抗原結合分子を提供する。
一態様では、本発明のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
抗原結合分子は、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片だけを含むことを特徴とし、
(c)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインを含み、Fcドメインは、Fc受容体との、特に、Fcγ受容体への結合を低減させる1つ又は複数のアミノ酸置換を含む。したがって、これらは、典型的には2つの非同一のポリペプチド鎖(「重鎖」)中に含まれるFcドメインの2つのサブユニットの一方又は他方に融合されている異なる部分を含む。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化は、2つのポリペプチドの幾つかの可能な組合せをもたらす。したがって、組換え産生でのTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の収量及び純度を向上させるために、本発明のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子のFcドメインに所望のポリペプチドの結合を促進する修飾を導入することは、有利であるであろう。
正しいペアリングをさらに増進するために、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、異なる荷電アミノ酸置換(いわゆる「荷電残基」)を含有することができる。これらの修飾は、クロスした又はクロスしていないCH1及びCLドメインに導入される。特定の態様では、本発明は、CLドメインのうちの1つにおいて123位(EU番号付け)のアミノ酸がアルギニン(R)に置換されており、124位(EU番号付け)のアミノ酸がリジン(K)に置換されている、及びCH1ドメインのうちの1つにおいて147位(EU番号付け)及び213位(EU番号付け)のアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)アミノ酸突然変異E123R及びQ124Kを含むCLドメインを含む第1のポリペプチド、並びにアミノ酸突然変異K147E及びK213Eを含むCH1ドメインを含む第2のポリペプチドと
を含み、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、抗原結合分子が提供される。
別の態様では、本発明は、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
PD1と特異的に結合することができるFab分子を両方が含む、第1の重鎖及び第1の軽鎖と、
第2のペプチドリンカーによりそのC末端で第2の重鎖又は軽鎖に融合されている、第1のペプチドリンカーによって互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、第1のペプチドと、
第3のペプチドリンカーによりそのC末端で第2の軽鎖又は重鎖に融合されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメインを含む、第2のペプチドとをそれぞれ含む、抗原結合分子を提供する。
前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のペプチドが、そのC末端で第3のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるCH1ドメインに融合されている、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(a)(i)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、
(b)(i)配列番号26のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号27のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号29のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号30のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号31のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、
(c)(i)配列番号34のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号35のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号36のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号37のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号38のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号39のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、
(d)(i)配列番号42のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号43のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号44のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号45のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号46のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号47のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、
(e)(i)配列番号50のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号51のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号52のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号53のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号54のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号55のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、
(f)(i)配列番号58のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号59のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号60のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号63のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、又は
(g)(i)配列番号66のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号67のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号68のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号69のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号70のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号71のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(a)配列番号19のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(b)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号22のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(c)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号23のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(d)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号24のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(e)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(f)配列番号32のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号33のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(g)配列番号40のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号41のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(h)配列番号48のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号49のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(i)配列番号56のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(k)配列番号64のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVLドメイン、又は
(l)配列番号72のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号73のアミノ酸配列を含むVLドメイン
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(a)配列番号19のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(b)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号22のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(c)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号23のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(d)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号24のアミノ酸配列を含むVLドメイン、又は
(e)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVLドメイン
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(a)配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、又は配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)配列番号9、配列番号11、配列番号12及び配列番号10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
配列番号1、配列番号3、配列番号4及び配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む。
(a)配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、又は配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが配列番号10のアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが配列番号5のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)PD1と特異的に結合することができるFab分子を両方が含む、第1の重鎖及び第1の軽鎖と、
(b)配列番号9、配列番号11、配列番号12及び配列番号10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
配列番号1、配列番号3、配列番号4及び配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む、上文に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、又は配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、PD1と特異的に結合することができるFab分子と、
(b)配列番号9、配列番号11、配列番号12及び配列番号10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
配列番号1、配列番号3、配列番号4及び配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(a)(i)配列番号19のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖、又は
配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、並びに配列番号22、配列番号23、配列番号24及び配列番号25からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(b)配列番号9、配列番号11、配列番号12及び配列番号10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
配列番号1、配列番号3、配列番号4及び配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(i)配列番号19のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖、又は
配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、並びに配列番号22、配列番号23、配列番号24及び配列番号25からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(ii)配列番号74、配列番号76、配列番号78及び配列番号80からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
(iii)配列番号75、配列番号77、配列番号79及び配列番号81からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号83のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号74のアミノ酸配列を含む第2の重鎖及び配列番号75のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、
(b)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号83のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号76のアミノ酸配列を含む第2の重鎖及び配列番号77のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、
(c)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号83のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号78のアミノ酸配列を含む第2の重鎖及び配列番号79のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、又は
(d)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号83のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号80のアミノ酸配列を含む第2の重鎖及び配列番号81のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(a)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号171のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号74のアミノ酸配列を含む第2の重鎖及び配列番号75のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、
(b)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号171のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号76のアミノ酸配列を含む第2の重鎖及び配列番号77のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、
(c)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号171のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号78のアミノ酸配列を含む第2の重鎖及び配列番号79のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、又は
(d)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号171のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号80のアミノ酸配列を含む第2の重鎖及び配列番号81のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む、抗原結合分子を提供する。
(a)配列番号84のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号85のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号83のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖、又は
(b)配列番号86のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号87のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号83のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖
を含む、上文で記載された通りのTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号84のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号85のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号171のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖、又は
(b)配列番号86のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号87のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号171のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖
を含む、上文で記載された通りのTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(i)Fcドメインの第1のサブユニットと、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片とを含む融合ポリペプチド、(ii)PD1と特異的に結合することができるFabドメインのVHドメインと、Fcドメインの第2のサブユニットと、ペプチドリンカーによってCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片とを含む重鎖、並びに(iii)PD1と特異的に結合することができるFabドメインのVLドメインを含む軽鎖、又は
(i)Fcドメインの第1のサブユニットと、ペプチドリンカーによりCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片とを含む融合ポリペプチド、(ii)PD1と特異的に結合することができるFabドメインのVHドメインと、Fcドメインの第2のサブユニットと、ペプチドリンカーによって互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片とを含む重鎖、並びに(iii)PD1と特異的に結合することができるFabドメインのVLドメインを含む軽鎖
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号88のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号87のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号83のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(b)配列番号89のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号90のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号83のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(c)配列番号91のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号86のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号83のアミノ酸配列を含む軽鎖、又は
(d)配列番号93のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号83のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号88のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号87のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号171のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(b)配列番号89のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号90のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号171のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(c)配列番号91のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号86のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号171のアミノ酸配列を含む軽鎖、又は
(d)配列番号93のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号171のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
本発明は、本明細書に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片をさらに提供する。
本発明のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成(例えば、メリフィールド固相合成)又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生の場合、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチド、例えば上で説明したようなポリヌクレオチドは、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び/又は発現のために、単離され、1つ又は複数のベクターに挿入される。そのようなポリヌクレオチドは、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定することができる。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドのうちの1つ又は複数を含むベクター、好ましくは、発現ベクターが提供される。当業者に周知である方法を使用して、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子(断片)のコード配列を適切な転写/翻訳制御シグナルと共に含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えDNA手法、合成手法及びインビボ組換え/遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis等、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Laboratory、N.Y.(1989);及びAusubel等、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、N.Y.(1989)に記載の手法を参照されたい。発現ベクターは、プラスミドの一部、ウイルスであることができ、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、発現カセットを含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片(すなわち、コード化領域)をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び/又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合した状態で発現カセットにクローニングされる。本明細書で使用される「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「終止コドン」(TAG、TGA又はTAA)は、アミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード化領域の一部とみなされることがあり、しかし、何れの隣接配列も、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5’及び3’非翻訳領域等は、コード化領域の一部ではない。2つ以上のコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト内に、例えば単一のベクター上に、存在することができ、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト内に、例えば、別々の(異なる)ベクター上に存在することができる。さらに、何れのベクターも、単一のコード化領域を含有することができ、又は2つ以上のコード化領域を含むことができ、例えば、本発明のベクターは、タンパク質切断による後翻訳又は共翻訳によって最終タンパク質に分離される1つ又は複数のポリペプチドをコードすることができる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子若しくはそのポリペプチド断片又はそれらの変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合されている又は融合されていない、異種コード化領域をコードすることができる。異種コード配列には、限定ではないが、特殊化したエレメント又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインが含まれる。作動可能な結合は、遺伝子産物の発現が調節配列の影響下又は制御下で起こるように遺伝子産物、例えばポリペプチド、のコード化領域が1つ又は複数の調節配列と結合している場合である。2つのDNA断片(例えば、ポリペプチドコード化領域及びそれと結合しているプロモーター)は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合、及び2つのDNA断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力に干渉しない、又は転写されるDNAテンプレートの能力に干渉しない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域とポリペプチドをコードする核酸とは、プロモーターがその核酸の転写を果たすことができた場合、作動可能に結合していることになる。プロモーターは、所定の細胞内でのみDNAの実質的転写を指示する細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターに加えて他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルを、ポリヌクレオチドと作動可能に結合させて、細胞特異的転写を指示することもできる。
本明細書で提供される抗原結合分子を、当該技術分野で公知の様々なアッセイにより、同定することができ、それらの物理的/化学的特性及び/又は生物活性についてスクリーニングすること又は特徴を明らかにすることができる。生物活性は、例えば、様々な免疫細胞、特にT細胞の活性化及び/又は増殖を増強する能力を含み得る。例えば、これらは、免疫調節性サイトカイン(例えばインターフェロン−γ(IFN−γ)及び/又は腫瘍壊死因子α(TNFα))の分泌を増強する。増強される又は増強され得る他の免疫調節性サイトカインは、例えばIL12、グランザイムBなどである。生物活性はまた、カニクイザル結合交差反応性、並びに異なる細胞タイプへの結合も含み得る。インビボ及び/又はインビトロでそのような生物活性を有する抗原結合分子もまた提供される。
本明細書で提供されるTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の対応するTNF受容体に対する親和性を、BIAcore装置(GE Healthcare)等の標準的計測手段と、受容体又は標的タンパク質、例えば組換え発現により得ることができるものとを使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)により、実施例に記載の方法に従って判定することができる。TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子のPD1に対する親和性も、BIAcore装置(GE Healthcare)等の標準的計測手段と、受容体又は標的タンパク質、例えば組換え発現により得ることができるものとを使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)により判定することができる。結合親和性の測定についての説明に役立つ例示的な具体的実施態様を実施例4に記載する。一態様によれば、KDは、BIACORE(登録商標)T100マシン(GE Healthcare)を使用して25℃で表面プラズモン共鳴により測定される。
本明細書で提供されるTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の対応する受容体発現細胞への結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリー(FACS)により、評価することができる。一態様では、TNF受容体を発現する新鮮な抹消血単核細胞(PBMC)が結合アッセイに使用される。これらの細胞は、単離後に直接使用される(ナイーブPMBC)か、又は刺激後に使用される(活性化PMBC)。別の態様では、活性化マウス脾細胞(TNF受容体分子を発現する)を使用して、本発明のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の対応するTNF受容体発現細胞への結合を実証した。
一態様では、特定の標的細胞抗原と結合し、生物活性を有する特定のTNF受容体と結合する、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物活性としては、例えば、標的細胞抗原を発現する細胞上のTNF受容体によるアゴニストシグナル伝達を挙げることができる。アッセイによりインビトロでそのような生物活性を有すると同定されたTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子も提供される。
さらなる態様では、本発明は、本明細書で提供されるTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の何れかを含む薬学的組成物であって、例えば、下記治療方法の何れかにおいて使用するための薬学的組成物が提供される。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供されるTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の何れかと、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤とを含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供されるTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の何れかと、少なくとも1つのさらなる治療剤、例えば下記のものとを含む。
本明細書で提供されるTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の何れを治療方法に使用してもよい。
本発明のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を治療の際に1つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。例えば、本発明の融合タンパク質を少なくとも1つのさらなる治療剤と共投与してもよい。用語「治療剤」は、そのような治療を必要とする個体において症候又は疾患を治療するために投与することができる任意の薬剤を包含する。そのようなさらなる薬剤は、治療することになる特定の適応症に好適な任意の活性成分、好ましくは、互いに有害に作用しない相補的活性を有するものを含み得る。ある特定の実施態様では、さらなる治療剤は、別の抗がん剤である。
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防及び/又は診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、その容器上の又はその容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、IV溶液バッグ等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されたものであり得る。容器は、単独である組成物を保持するか、又は状態の治療、予防及び/若しくは診断に有効な別の組成物と組み合わされた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有することができる(例えば、容器は、静脈内溶液バッグであってもよく、又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであってもよい)。組成物中の少なくとも1種の活性薬剤は、本発明のTNFリガンドトリマー含有抗原結合分子である。
1.TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子。
をさらに含む、段落1に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
a.第1のポリペプチドがCH1若しくはCLドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCL若しくはCH1ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1若しくはCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCL若しくはCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
b.第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
c.第1のポリペプチドがVH−CL若しくはVL−CH1ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがVL−CH1ドメイン若しくはVH−CLドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びVH若しくはVLに接続されているTNFリガンドファミリーメンバー2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのVL若しくはVHに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、
段落1又は2に記載の抗原結合分子。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号9、配列番号11、配列番号12及び配列番号10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号1、配列番号3、配列番号4及び配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、段落1から8の何れか1つに記載の抗原結合分子。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)CH1又はCLドメインを含有する第1のポリペプチド、及びCL又はCH1ドメインを含有する第2のポリペプチドと
をそれぞれ含み、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1又はCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCL又はCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、段落1から9の何れか1つに記載の抗原結合分子。
(a)(i)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、
(b)(i)配列番号26のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号27のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号29のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号30のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号31のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、
(c)(i)配列番号34のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号35のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号36のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号37のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号38のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号39のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、
(d)(i)配列番号42のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号43のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号44のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号45のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号46のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号47のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、
(e)(i)配列番号50のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号51のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号52のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号53のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号54のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号55のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、
(f)(i)配列番号58のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号59のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号60のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号63のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン、又は
(g)(i)配列番号66のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号67のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号68のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号69のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号70のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号71のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン
を含む、段落1から13の何れか1つに記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
(a)配列番号19のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(b)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号22のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(c)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号23のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(d)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号24のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(e)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(f)配列番号32のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号33のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(g)配列番号40のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号41のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(h)配列番号48のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号49のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(i)配列番号56のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(k)配列番号64のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVLドメイン、又は
(l)配列番号72のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号73のアミノ酸配列を含むVLドメイン
を含む、段落1から14の何れか1つに記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
(a)(i)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメイン
を含む、段落1から14の何れか1つに記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
(a)配列番号19のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(b)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号22のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(c)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号23のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(d)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号24のアミノ酸配列を含むVLドメイン、又は
(e)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVLドメイン
を含む、段落1から16の何れか1つに記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
PD1と特異的に結合することができるFab分子を両方が含む、第1の重鎖及び第1の軽鎖と、
第2のペプチドリンカーによりそのC末端で第2の重鎖又は軽鎖に融合されている、第1のペプチドリンカーによって互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、第1のペプチドと、
第3のペプチドリンカーによりそのC末端で第2の軽鎖又は重鎖に融合されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメインを含む、第2のペプチドとをそれぞれ含む、段落1から20の何れか1つに記載の抗原結合分子。
(b)配列番号9、配列番号11、配列番号12及び配列番号10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、並びに配列番号1、配列番号3、配列番号4及び配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖
を含む、段落1から20の何れか1つに記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
(i)配列番号19のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖、又は
配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、並びに配列番号22、配列番号23、配列番号24及び配列番号25からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(ii)配列番号74、配列番号76、配列番号78及び配列番号80からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
(iii)配列番号75、配列番号77、配列番号79及び配列番号81からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む、段落1から20又は26の何れか1つに記載の抗原結合分子。
(b)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号83のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号76のアミノ酸配列を含む第2の重鎖及び配列番号77のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、
(c)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号83のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号78のアミノ酸配列を含む第2の重鎖及び配列番号79のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、又は
(d)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号83のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号80のアミノ酸配列を含む第2の重鎖及び配列番号81のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖
を含む、段落1から21の何れか1つに記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
(a)PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つのFabドメインと、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む、
段落1から20の何れか1つに記載の抗原結合分子。
(b)配列番号86のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号87のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号83のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖
を含む、段落29に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
(i)Fcドメインの第1のサブユニットと、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片とを含む融合ポリペプチド、(ii)PD1と特異的に結合することができるFabドメインのVHドメインと、Fcドメインの第2のサブユニットと、ペプチドリンカーによってCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片とを含む重鎖、並びに(iii)PD1と特異的に結合することができるFabドメインのVLドメインを含む軽鎖、又は
(i)Fcドメインの第1のサブユニットと、ペプチドリンカーによりCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片とを含む融合ポリペプチド、(ii)PD1と特異的に結合することができるFabドメインのVHドメインと、Fcドメインの第2のサブユニットと、ペプチドリンカーによって互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片とを含む重鎖、並びに(iii)PD1と特異的に結合することができるFabドメインのVLドメインを含む軽鎖
を含む、段落29又は32に記載の抗原結合分子。
(a)配列番号88のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号87のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号83のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(b)配列番号89のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号90のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号83のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(c)配列番号91のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号86のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号83のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(b)配列番号93のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号92のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号83のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、段落31に記載の抗原結合分子。
(i)段落37に記載の宿主細胞を、抗原結合分子の発現に好適な条件下で培養するステップ、及び
(ii)抗原結合分子を回収するステップ
を含む方法。
Sambrook等、Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989に記載されているような標準的方法を使用してDNAを操作した。分子生物学試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する遺伝子情報は、Kabat,E.A.等、(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、NIH公開番号91−3242に与えられている。
DNA配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
所望の遺伝子セグメントは、適切な鋳型を使用したPCRによって生成されたか、又は自動遺伝子合成によって合成オリゴヌクレオチド及びPCR産物から、Geneart AG(Regensburg,Germany)によって合成された。正確な遺伝子配列が入手できなかった場合は、最も近いホモログの配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織に由来するRNAからRT−PCRによって遺伝子を単離した。単独の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接している遺伝子セグメントを、標準的なクローニング/配列決定ベクター中にクローニングした。形質転換された細菌からプラスミドDNAを精製し、UV分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定により確認した。それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能とするように、好適な制限部位を用いて遺伝子セグメントを設計した。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的指向化するリーダーペプチドをコードする5’末端DNA配列と共に設計した。
Current Protocols in Cell Biology(2000)、Bonifacino,J.S.、Dasso,M.、Harford,J.B.、Lippincott−Schwartz,J及びYamada,K.M.(編)、John Wiley & Sons,Incに記載されているような、標準的な細胞培養手法を使用した。
標準的プロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡単に言うと、抗体をプロテインAセファロースカラム(GE healthcare)に適用し、PBSで洗浄した。抗体の溶出をpH2.8で果たし、その直後に試料の中和を果たした。凝集したタンパク質を、モノマー抗体から、PBS中又は20mM ヒスチジン、150mM NaCl pH6.0中でのサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200、GE Healthcare)により分離した。モノマー抗体画分をプールし、例えばMILLIPORE Amicon Ultra(30 MWCO)遠心濃縮機を(必要に応じて)使用して濃縮し、凍結し、−20℃又は−80℃で保管した。試料の一部は、例えばSDS−PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)又は質量分析による、後のタンパク質分析及び分析的特徴づけに供した。
NuPAGE(登録商標)Pre−Castゲルシステム(Invitrogen)を製造業者の説明書に従って使用した。詳細には、10%又は4−12%NuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis−TRIS Pre−Castゲル(pH6.4)及びNuPAGE(登録商標)MES(還元ゲル、NuPAGE(登録商標)抗酸化剤ランニングバッファー添加剤を伴う)又はMOPS(非還元ゲル)ランニングバッファーを使用した。
抗体の凝集及びオリゴマー状態を判定するためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を、HPLCクロマトグラフィーにより行った。簡単に言うと、300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4、pH7.5中のプロテインA精製抗体をAgilent HPLC 1100システムのTosoh TSKgel G3000SWカラムに、又は2xPBS中のプロテインA精製抗体をDionex HPLCシステムのSuperdex 200カラム(GE Healthcare)に適用した。UV吸光度、及びピーク面積の積分により、溶出タンパク質を定量した。BioRadゲル濾過スタンダード151−1901は、標準として役立った。
このセクションは、VH/VL交換された多重特異性抗体(VH/VL CrossMabs)の特徴づけを、それらの正しい構築に重点を置いて説明する。予想された一次構造を、脱グリコシル化されたインタクトなCrossMabについての及び脱グリコシル化/プラスミド消化された又は代替的に脱グリコシル化/限定LysC消化されたCrossMabについてのエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI−MS)により分析した。
生成された抗体のそれぞれの抗原への結合は、BIACORE装置(GE Healthcare Biosciences AB、Uppsala、Sweden)を使用して、表面プラズモン共鳴により調査する。簡単に言うと、親和性測定のために、ヤギ抗ヒトIgG、JIR 109−005−098抗体を、それぞれの抗原に対する抗体の提示のためにCM5チップ上にアミンカップリングによって固定化する。結合を、HBSバッファー(HBS−P(10mM HEPES、150mM NaCl、0.005%Tween 20、ph7.4)中、25℃で(又は代替的に37℃で)測定する。抗原(R&D Systems又は社内で精製したもの)を溶液中の様々な濃度で添加する。80秒から3分の抗原注入により結合を測定し、チップ表面をHBSバッファーで3−10分間洗浄することにより解離を測定し、1:1ラングミュア結合モデルを使用してKD値を推定した。系固有のベースラインドリフトの補正のために、及びノイズシグナル低減のために、試料曲線からネガティブコントロールデータ(例えば、緩衝曲線)を減算する。センソグラムの分析に、及び親和性データの計算に、それぞれのBiacore Evaluation Softwareを使用する。
1.1 抗PD1抗体の生成
マウスの免疫化
100μgのベクターDNA(プラスミド15300_hPD1−fl)を皮内適用することによって、完全長ヒトPD1をコードするプラスミド発現ベクターを使用して、NMRIマウスを遺伝子的に免疫化し、続いてエレクトロポレーションを行った(1000V/cmの2矩形波、継続時間0.1ms、間隔0.125s;続いて287.5V/cmの4矩形波、継続期間10ms、間隔0.125s。0、14、28、42、56、70、及び84日目において、いずれか6回の逐次的な免疫化をマウスに行った。36、78及び92日目で血液を採取し、血清を調製し、これを、ELISAによる力価決定に使用した(下記を参照されたい)。最も高い力価を有する動物を選択し、96日目に、50μgの組換えヒトPD1ヒトFcキメラの静脈内注入により追加免疫を行い、追加免疫の3日後に、脾細胞を骨髄腫細胞株に融合することによって、ハイブリドーマ技術によりモノクローナル抗体を単離した。
ヒト組換えPD1ヒトFcキメラを、96ウェルNUNC MaxisorpプレートにおいてPBS中0.3μg/ml、100μl/ウェルで固定化し、続いて、PBS中2%のCrotein C、200μl/ウェルでプレートをブロッキングし、100μl/ウェルのPBS中0.5%のCrotein C中で抗血清の段階希釈を2連で適用し、HRPコンジュゲートヤギ抗マウス抗体(Jackson Immunoresearch/Dianova 115−036−071;1/16 000)を用いて検出した。全てのステップで、プレートを37℃で1時間インキュベートした。全てのステップの間で、PBS中の0.05%Tween20で3回、プレートを洗浄した。BM Blue POD Substrate soluble(Roche)を100μl/ウェルで添加することによりシグナルを発生させ、100μl/ウェルの1MのHClを添加することにより停止させた。参照としての690nmに対して、450nmで吸光度を読み取った。力価は、最大シグナルの半分を生じる抗血清の希釈度と定義した。
hu PD1に関するELISA
Nunc maxisorpストレプトアビジンコートプレート(MicroCoat #11974998001)を、25μl/ウェルのビオチン化PD1−ECD−AviHisでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、25μlの抗PD1試料又は参照抗体(ヒト抗PD1;Roche/マウス抗PD1;Biolegend;カタログ番号329912)を添加し、RTで1hインキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、25μl/ウェルのヤギ抗ヒトH+L−POD(JIR、JIR109−036−088/ヒツジ抗マウスPOD(GE Healthcare; NA9310)を1:2000/1:1000希釈で添加し、RTで1時間、振盪機でインキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、25μl/ウェルのTMB基質(Rocheカタログ番号11835033001)を添加し、OD2〜3までインキュベートした。測定は370/492nmで行った。
完全長ヒトPD1をコードするプラスミド15311_hPD1−fl_pUC_Neo及びG418(プラスミド上のネオマイシン耐性マーカー)による選択で安定的にトランスフェクトされた接着性CHO−K1細胞株を、0.01×10E6細胞/ウェルの濃度で384ウェル平底プレート中に播種し、一晩増殖させた。
Nunc maxisorpストレプトアビジンコートプレート(MicroCoat #11974998001)を、25μl/ウェルのビオチン化カニクイザルPD1−ECD−ビオチンでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、25μlの抗PD1試料又は参照抗体(ヒト抗PD1;Roche)を添加し、RTで1h、振盪機でインキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、25μl/ウェルのヤギ抗ヒトH+L−POD(JIR、JIR109−036−088)を1:1000希釈で添加し、RTで1時間、振盪機でインキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、25μl/ウェルのTMB基質(Roche、11835033001)を添加し、OD2〜3までインキュベートした。測定は370/492nmで行った。
Nunc maxisorpストレプトアビジンコートプレート(MicroCoat #11974998001)を、25μl/ウェルのビオチン化PD1−ECD−AviHisでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、25μlの抗PD1試料又は参照抗体(マウス抗PD1;Biolegend;カタログ番号329912)を添加し、RTで1h、振盪機でインキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、25μl/ウェルのPD−L1(組換えヒトB7−H1/PD−L1 Fcキメラ;156−B7、R&D)を添加し、RTで1h、振盪機でインキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、25μl/ウェルのヤギ抗ヒトH+L−POD(JIR、109−036−088)を1:1000希釈で添加し、RTで1時間、振盪機でインキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、25μl/ウェルのTMB基質(Roche、11835033001)を添加し、OD2〜3までインキュベートした。測定は370/492nmで行った。
Nunc maxisorpストレプトアビジンコートプレート(MicroCoat #11974998001)を、25μl/ウェルのビオチン化PD1−ECD−AviHisでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、25μlの抗PD1試料又は参照抗体(マウス抗huPD1;Roche)を添加し、RTで1h、振盪機でインキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、25μl/ウェルのPD−L2(組換えヒトB7−DC/PD−L2 Fcキメラ;1224−PL−100、R&D)を添加し、RTで1h、振盪機でインキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、25μl/ウェルのヤギ抗ヒトH+L−POD(JIR、109−036−088)を1:2000希釈で添加し、RTで1時間、振盪機でインキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、25μl/ウェルのTMB基質(Roche、11835033001)を添加し、OD2〜3までインキュベートした。測定は370/492nmで行った。
Nunc maxisorpプレート(Nunc #464718)を、25μl/ウェルの捕捉抗体(ヤギ抗マウスIgG;JIR;115−006−071)でコーティングし、RTで1h、振盪機でインキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、プレートを、振盪機においてRTで、2%BSA含有PBSバッファーを用いて1h、ブロッキングした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、25μlのマウス抗PD1試料を添加し、RTで1h、振盪機でインキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、30μl/ウェルのマウスIgG(JIR;015−000−003)を用いて、振盪機においてRTで1h、捕捉抗体をブロッキングした。同時に、ビオチン化PD1−ECD−AviHisを、第2の試料抗体と共に、振盪機においてRTで1h、プレインキュベートした。アッセイプレートを洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、PD1抗体ミックスをアッセイプレートに移し、RTで1h、振盪機でインキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、25μl/ウェルのストレプトアビジンPOD(Roche、#11089153001)を1:4000希釈で添加し、RTで1時間、振盪機でインキュベートした。洗浄(PBSTバッファーで90μl/ウェル×3)後、25μl/ウェルのTMB基質(Roche、#11089153001)を添加し、OD1.5〜2.5までインキュベートした。測定は370/492nmで行った。エピトープ群は、参照抗体に対する階層的クラスタリングによって定義された。
表1: 例示的なPD1抗体の結合、PD-L1阻害及びエピトープ領域群(ELISA)
表2: 親マウス抗体PD1-0103に由来するヒト化PD1抗体の生化学的及び細胞結合(ELISA)
表面プラズモン共鳴(SPR)ベースのアッセイを使用して、いくつかのマウスPD1結合物質間の、並びに市販のヒトPD1結合参照間の結合の動態パラメータを決定した。そのため、抗ヒトIgGを、アミンカップリングによって(Biacore)CM5センサーチップの表面に固定化した。次いで試料を捕捉し、hu PD1−ECDをそれらに結合させた。各分析サイクルの後に、センサーチップ表面を再生した。データを1:1ラングミュア相互作用モデルに適合させることによって、最終的に平衡定数及び動態速度定数を得た。
表3: Biacoreにより決定された、キメラPD1-0103及びヒト化PD1-Abに関する動態速度定数及び平衡定数
CM5センサーシリーズSをBiacore 4000システムに取り付け、製造業者の使用説明書に従って、検出スポットの流れを調整した。
Biacore 4000装置にBiacore CAPセンサーを取り付け、製造業者に推奨されているように準備した。装置バッファーは、HBS−ET(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005%w/v Tween20)であった。装置は25℃で動作させた。
3A)混合リンパ球反応(MLR)は、1つの個体(ドナーX)のリンパ球の、別の個体のリンパ球(ドナーY)への活性化を測定する、免疫細胞アッセイである。リンパ球エフェクター細胞へのPD1経路をブロックすることの効果を実証するために、混合リンパ球反応を使用した。アッセイにおいてT細胞を、抗PD1 mAbの存在又は非存在下での活性化及びそのIFN−γ分泌に関して試験した。
表4: ポジティブコントロールとしての組換えヒトIL-2処理(20EU/ml)(=100%増加)の効果と比較した、同種異系刺激及び抗PD1抗体による処理後のIFNγ分泌のパーセンテージ
同種異系環境における抗PD1処理の効果をさらに調べるために、本発明者らは、新たに精製されたCD4 T細胞を、単球由来の同種異系成熟樹状細胞(mDC)の存在下で5日間共培養するアッセイを開発した。プラスチック接着により1週間前に新鮮なPBMCから単球を単離し、続いて非接着性細胞を除去した。次いで本発明者らは、それらをGM−CSF(50ng/ml)及びIL−4(100ng/ml)を含有する培地中で5日間培養することによって、単球から未成熟DCを生成した。iDC成熟を誘導するために、本発明者らは、さらに2日間、TNF−α、IL−1β及びIL−6(各50ng/ml)を培養培地に添加した。次いで本発明者らは、フローサイトメトリー(LSRFortessa、BD Biosciences)により、主要組織適合性複合体クラスII(MHCII)、CD80、CD83及びCD86のそれらの表面発現を測定することによって、DC成熟を評価した。
PCRによって抗PD1マウス抗体PD1−0098、PD1−0103の可変重鎖及び軽鎖領域を増幅し、エフェクター機能を妨げる突然変異L234A、L235A及びP329G(KabatのEUインデックス))(ロイシン234からアラニン、ロイシン235からアラニン、プロリン329からグリシン)を有するヒトIgG1骨格/ヒトCH1−ヒンジ−CH2−CH3との融合タンパク質として重鎖発現ベクター中に、及びヒトC−κとの融合タンパク質として軽鎖発現ベクター中に、これらをクローニングすることによって、キメラPD1抗体を生成した。次いでLC及びHCプラスミドを、HEK293中に同時トランスフェクトし、抗体精製のための標準的な方法によって7日後に上清から精製した。キメラPD1抗体を、キメラchiPD1−0098(chiPD1−0098)及びキメラPD1−0103(chiPD1−0103)と新たに命名した。比較のために、合成し、ヒトIgG1の骨格(突然変異L234A、L235A及びP329G(KabatのEUインデックス)を有する)と共にクローニングした、ニボルマブ(MDX−5C4又はMDX−1106としても知られている)及びペムブロリズマブ(MK−3475又はOrg1.09Aとしても知られている)のどちらかのVH及びVLドメインを含む参照抗PD1抗体を使用した。
マウス抗PD1抗体0103のVH及びVLドメインのヒト化
マウス抗PD1抗体PD1−0103のマウスVH及びVLドメイン(配列番号43及び44)のアミノ酸配列に基づいて、ヒト化抗抗PD1抗体変異体を生成した。
表5: PD1-0103のヒト化変異抗体のVH及びVL配列
表6: PD1-0103のヒト化変異抗体のHVR配列
表7: ヒト化PD1-0103抗体変異体及び親キメラPD1-0103に関する結果の概要
インビトロでの抑制されたT細胞応答の回復の模倣において社内で生成したPD1抗体の中和力を試験するために、市販のPD1/PD−L1レポーターアッセイ(Promega)を使用した。この系は、PD1+NFAT Jurkat細胞及び対応するPD−L1+CHO細胞からなり、これはまた活性化シグナルも生じる。原理的に、このレポーター系は、次の3つのステップに基づいている:(1)TCRに媒介されるNFAT活性化、(2)PD−1/PD−L1系による活性化時のNFATシグナルの阻害、及び(3)PD1ブロッキング抗体によるNFATシグナルの回復。
・PD−L1培地:PAN Biotech(#P04−03609);FBS(10%)及びL−Gln(4mM)
・アッセイ培地:RPMI 1640(#31870;Invitrogen)、25mM HEPES、2mM L−Gln、FBS(2%)
・このアッセイで使用した細胞(両方の細胞タイプをPromegaから購入):
PD−L1+CHO細胞(バッチ番号#139147):2〜3×104細胞/96ウェル
PD1+NFAT Jurkat細胞(バッチ番号#133024:3.5×104細胞/ウェル
PD1標的指向性4−1BBリガンドトリマー含有Fc融合抗原結合分子の調製
ヒト4−1BBリガンドのエクトドメインの一部(アミノ酸71〜254及び71〜248)をコードするDNA配列の様々な断片を、UniProtデータベースのP41273配列(配列番号103)に従って合成した。
(G4S)2リンカーにより隔てられた4−1BBリガンド(71−254)の2つのエクトドメインを含有し、ヒトIgG1−CLドメインに融合されているポリペプチドを、図6A[ヒト4−1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒト4−1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒトCL]に示されているようにクローニングした。
表8: 一価のPD1(0314)標的指向性ヒト4-1BBリガンド(71-254)含有Fc(kih)融合分子コンストラクト7.1の配列
(G4S)2リンカーによって隔てられた4−1BBリガンド(71−254)の2つのエクトドメインを含有し、ヒトIgG1−CLドメインに融合されているポリペプチドを、図6C[ヒト4−1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒト4−1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒトCL]に示すようにクローニングした。
表9: 一価のPD1(0314)標的指向性ヒト4-1BBリガンド(71-254)含有Fc(kih)融合分子コンストラクト7.2の配列
図6E[ヒトIgG1 Fcホール、(G4S)2コネクター、ヒト4−1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒト4−1BBリガンド]に示すように、(G4S)2リンカーにより隔てられた4−1BBリガンド(71−254)の2つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、ヒトIgG1 Fcホール鎖のC末端に融合した。図6F[ヒトIgG1 Fcノブ、(G4S)2コネクター、ヒト4−1BBリガンド]に示すように、4−1BBリガンド(71−254)の1つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、ヒトIgG1 Fcノブ鎖のC末端に融合した。
表10: 二価のPD1(0314)標的指向性ヒト4-1BBリガンド(71-254)含有Fc(kih)融合分子コンストラクト7.3の配列
(G4S)2リンカーにより隔てられた4−1BBリガンド(71−248)の2つのエクトドメインを含有し、ヒトIgG1−CLドメインに融合されているポリペプチドを、図8A[ヒト4−1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒト4−1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒトCL]に示すようにクローニングした。4−1BBリガンド(71−248)の1つのエクトドメインを含有し、ヒトIgG1−CHドメインに融合されているポリペプチドを、図8B[ヒト4−1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒトCH1]に示すようにクローニングした。
表11: 一価のPD1(0314)標的指向性ヒト4-1BBリガンド(71-248)含有Fc(kih)融合分子コンストラクト7.4の配列
(G4S)2リンカーにより隔てられた4−1BBリガンド(71−248)の2つのエクトドメインを含有し、ヒトIgG1−CLドメインに融合されているポリペプチドを、図8C[ヒト4−1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒト4−1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒトCL]に示されているようにクローニングした。4−1BBリガンド(71−248)の1つのエクトドメインを含有し、ヒトIgG1−CHドメインに融合されているポリペプチドを、図8D[ヒト4−1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒトCH]に示されているようにクローニングした。
表12: 一価のPD1(0314)標的指向性ヒト4-1BBリガンド(71-248)含有Fc(kih)融合分子コンストラクト7.5の配列
(G4S)2リンカーにより隔てられた4−1BBリガンド(71−248)の2つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、ヒトIgG1 Fcホール鎖のC末端に、図8E[ヒトIgG1 Fcホール、(G4S)2コネクター、ヒト4−1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒト4−1BBリガンド]に示されているように、融合させた。図8F[ヒトヒトIgG1Fcノブ、(G4S)2コネクター、ヒト4−1BBリガンド]に記載の、4−1BBリガンド(71−248)の1つのエクトドメインを含有し、ヒトIgG1Fcノブ鎖のC末端に融合されている、ポリペプチド。
表13: 二価のPD1(0314)標的指向性ヒト4-1BBリガンド(71-248)含有Fc(kih)融合分子(コンストラクト7.6)の配列
(G4S)2リンカーにより隔てられた4−1BBリガンドの2つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、図9A[ヒトIgG1 Fc、(G4S)2コネクター、ヒト4−1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒト4−1BBリガンド]に示すように、ヒトIgG1 Fcホール又はノブ鎖のC末端にインフレームでサブクローニングした。4−1BBリガンドの1つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、図9B[ヒトIgG1 Fc、(G4S)2コネクター、ヒト4−1BBリガンド]に示すように、ヒトIgG1 Fcノブ又はホール鎖のC末端にインフレームでサブクローニングした。
表14: 一価のPD1(0314)標的指向性ヒト4-1BBリガンド(71-248)含有Fc(kih)融合分子(コンストラクト7.11)の配列
表15: 一価のPD1(0314)標的指向性ヒト4-1BBリガンド(71-248)含有Fc(kih)融合分子(コンストラクト7.12)の配列
(G4S)2リンカーにより隔てられた4−1BBリガンドの2つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、図9A[ヒトIgG1 Fc、(G4S)2コネクター、ヒト4−1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒト4−1BBリガンド]に示すように、ヒトIgG1 Fcホール又はノブ鎖のC末端にインフレームでサブクローニングした。4−1BBリガンドの1つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、図9B[ヒトIgG1 Fc、(G4S)2コネクター、ヒト4−1BBリガンド]に示すように、ヒトIgG1 Fcノブ又はホール鎖のC末端にインフレームでサブクローニングした。
表16: 一価のPD1(0314)標的指向性ヒト4-1BBリガンド(71-248)含有Fc(kih)融合分子(コンストラクト7.13)の配列
表17: 一価のPD1(0314)標的指向性ヒト4-1BBリガンド(71-248)含有Fc(kih)融合分子(コンストラクト7.14)の配列
コントロール分子は、PD1標的指向性抗原結合分子に関して上述したように調製し、抗PD1結合物質(VH及びVL)を、DP47と称される抗原と結合しない生殖系列コントロールに置き換えたことだけが異なっていた。
表18: DP47非標的指向性4-1BBリガンド(71-254)トリマー含有Fc(kih)融合抗原結合分子(DP47スプリット4-1BBLトリマー)コントロールBの配列
表19: 二価のDP47非標的指向性ヒト4-1BBリガンド(71-254)含有Fc(kih)融合分子コントロールCの配列
表20: CH-CLクロスを有し、荷電残基を有する、一価のDP47非標的指向性スプリットトリマーヒト4-1BBリガンド(71-248)Fc(kih)融合体(コントロールD)のcDNA及びアミノ酸配列。*荷電残基
アッセイで使用されるさらなるコントロール分子(コントロールF)は、国際特許出願公開国際公開第2012/130831号に記載の方法に従って、Fcγ受容体への結合を妨げるためのPro329Gly、Leu234Ala及びLeu235Ala突然変異を含む、非標的指向性DP47生殖系列コントロールヒトIgG1であった。
表21: 非標的指向性DP47 huIgG1(コントロールF)の配列
表22: 抗PD1(0314)huIgG1 PGLALA(コントロールM)のcDNA及びアミノ酸配列
一価及び二価の抗PD1標的指向性スプリットトリマー4−1BBリガンドFc融合抗原結合分子及びコントロール分子の製造及び精製
標的指向性及び非標的指向性スプリットトリマー4−1BBリガンドFc(kih)融合分子をコードする配列を、MPSVプロモーターからのインサートの発現を駆動し、CDSの3’末端に位置する合成ポリA配列を含む、プラスミドベクター中にクローニングした。加えて、ベクターは、プラスミドのエピソームを維持するためのEBV OriP配列を含む。
表23 PD1標的指向性及び非標的指向性4-1BBリガンドトリマー含有Fc(kih)融合抗原結合分子及びコントロール分子の生化学的分析
表面プラズモン共鳴によるPD1標的指向性4−1BBスプリットトリマーリガンドFc融合抗原結合分子の同時結合
4.1 表面プラズモン共鳴のための抗原の調製、精製及び特徴づけ
4−1BB Fc(kih)融合分子の調製
ヒト4−1BBのエクトドメイン(Q07011である配列番号163によるヒト4−1BBのアミノ酸24〜186)をコードするDNA配列を、ヒトIgG1重鎖CH2及びCH3ドメインと共にノブ上にインフレームでサブクローニングした。AcTEVプロテアーゼ切断部位を、抗原エクトドメインとヒトIgG1のFcとの間に導入した。部位特異的ビオチン化のためのAviタグを、抗原−FcノブのC末端に導入した。S354C/T366W突然変異を含有する抗原−Fcノブ鎖と、Y349C/T366S/L368A/Y407V突然変異を含有するFcホール鎖との組合せにより、4−1BBエクトドメイン含有鎖の単一コピーを含み、したがって、Fc連結抗原のモノマー形態を生じる、ヘテロダイマーの生成が可能になる。表24は、抗原Fc融合体コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を示す。
表24: モノマー抗原Fc(kih)融合分子のcDNA及びアミノ酸配列
表25:モノマーヒト4-1BB His分子の配列
ヒト4−1BB Fc(kih)及びヒトPD1と同時に結合する能力を、表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価した。全てのSPR実験は、ランニングバッファーとしてHBS−EP(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005% Surfactant P20、Biacore、Freiburg/Germany)を用いて、25℃で、Biacore T200において実施した。
PD1標的指向性4−1BBリガンドトリマー含有Fc融合抗原結合分子の機能的特徴づけ
5.1.PD1標的指向性4−1BBリガンドトリマー含有Fc(kih)融合抗原結合分子の、新鮮な活性化されたヒトPMBCに対する結合
バフィーコートをチューリッヒ献血センター(Zurich blood donation center)から入手した。新鮮抹消血単核細胞(PBMC)を単離するために、バフィーコートを同体積のDPBS(Gibco by Life Technologies、カタログ番号14190 326)で希釈した。50mLポリプロピレン製遠心分離管(TPP、カタログ番号91050)に、15mL Histopaque 1077(SIGMA Life Science、カタログ番号10771、密度1.077g/mLに調整された、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム)を供給し、希釈バフィーコート含有量をHistopaque 1077の上に積層した。管を30分間、450xgで遠心分離した。次いで、PBMCを接触面から収集し、DPBSで3回洗浄し、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS、原産地米国、PAN biotech、P30−2009、ロットP150307GI、ガンマ線照射によりマイコプラズマ不含、35分間56℃で熱不活化済み)と、1%(v/v)GlutaMAX I(GIBCO by Life Technologies、カタログ番号35050 038)と、1mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA、カタログ番号S8636)と、1%(v/v)MEM非必須アミノ酸(SIGMA、カタログ番号M7145)と、50μM β−メルカプトエタノール(SIGMA、M3148)とを補充した、RPMI 1640培地(Gibco by Life Technology、カタログ番号42401−042)からなるT細胞培地に再懸濁させた。
表26: 新たに単離された休止期のヒトPBMCに対する結合曲線のEC50値
表27: 活性化ヒトPBMCに対する結合曲線のEC50値
PD1及び4−1BB発現腫瘍細胞に関する結合アッセイでは、2つの遺伝子改変された腫瘍細胞を使用した。ヒト発現HeLa−hu4−1BB−NFkB−lucクローン26細胞の生成は、実施例5.3.1で記載する。ヒトPD1発現腫瘍細胞株に関しては、CHO−k1細胞を、ヒトPD1で以下の通りトランスフェクトした:親接着性CHO−K1細胞株(ATCC CCL−61)を、完全長ヒトPD1をコードするプラスミド15311_hPD1−fl_pUC_Neo及びG418(ネオマイシン耐性マーカープラスミド)による選択を用いて安定にトランスフェクトした。
表28: ヒトPD1又はヒト4-1BBを発現する腫瘍細胞に対する結合曲線のEC50値
PD1標的指向性4−1BBリガンドトリマー含有Fc融合抗原結合分子の生物活性
ヒト4−1BB発現HeLa細胞株のNF−κB活性化
6.1 ヒト4−1B及びNF−κB−ルシフェラーゼを発現するHeLa細胞の生成
CMV−プロモーターの制御下にあるヒト4−1BBの配列(Uniprot寄託Q07011)とピューロマイシン耐性遺伝子とを含有する発現ベクターpETR10829に基づくプラスミドを用いて、ヒトパピローマウイルス18誘発子宮頚がん腫細胞株HeLa(ATCC CCL−2)に形質導入した。10%ウシ胎児血清(FBS、GIBCO by Life Technologies、カタログ番号16000−044、ロット番号941273、ガンマ線照射によりマイコプラズマ不含、35分間56℃で熱不活化済み)と、1%GlutaMAX−I(GIBCO by Life Technologies、カタログ番号35050−038)と、3μg/mLのピューロマイシン(InvivoGen、カタログ番号ant−pr−1)とを補充した、DMEM培地(Gibco by Life Technology、カタログ番号42430−025)で、細胞を培養した。
NFκB−luc−4−1BB−HeLaクローン26細胞を、DPBS(GIBCO by life technologies、カタログ番号14190 326)で洗浄し、0.05%トリプシンEDTA(GIBCO by life technologiesカタログ番号25300 054)で、37℃で5分間処理した。細胞を回収し、10%ウシ胎児血清(FBS、原産地米国、PAN Biotech、P30−2009、ロットP150307GI、ガンマ線照射によりマイコプラズマ不含、35分間56℃で熱不活化済み)と、1%GlutaMAX−I(GIBCO by life technologies、カタログ番号35050 038)とを補充したDMEM培地(GIBCO by life technologiesカタログ番号42430 025)中に再懸濁した。Cell Counter Vi−cell xr 2.03(Beckman Coulter、カタログ番号731050)を使用して細胞を計数し、0.2×106細胞/mLの細胞密度にした。100μL(2×104細胞)のこの細胞懸濁液を、蓋付きの滅菌白色96ウェル平底組織培養プレート(greiner bio one、カタログ番号655083)の各ウェルに移し、プレートを37℃及び5%CO2で一晩インキュベートした。翌日、異なる力価のスプリットトリマー4−1BBリガンド含有融合分子コンストラクト7.1.、コンストラクト7.3、コンストラクト7.5及びコンストラクト7.6又は適合するコントロールであるコントロールB、コントロールC、コントロールD、コントロールF及びコントロールMを含有する50μLの培地。PD1結合に媒介される架橋に関しては、PD1を発現するCHO−k1−huPD1クローン5細胞を使用した。
表29: NFκB活性化誘導ルシフェラーゼ活性曲線のEC50値
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Claims (21)
- 4−1BBLトリマー含有抗原結合分子であって、
(a)(i)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメインを含む、PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つのFab分子、
(b)第1の重鎖定常ドメイン(CH1)を含む第1のポリペプチド及び定常軽鎖ドメイン(CL)を含む第2のポリペプチド、又はCLを含む第1のポリペプチド及びCH1を含む第2のポリペプチド、
(c)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインであって、Fc受容体への結合を低減させる1つ又は複数のアミノ酸置換を含むIgG FcドメインであるFcドメイン、
を含み、
第2のポリペプチドが、第1のポリペプチドに、CH1とCLの間のジスルフィド結合によって結合し、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いにかつCH1又はCLドメインに接続されている、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む4−1BBLの2つのエクトドメインを含むこと、並びに第2のポリペプチドが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む4−1BBLの1つのエクトドメインを含むことを特徴とする、
4−1BBLトリマー含有抗原結合分子。 - 4−1BBLのエクトドメインが、配列番号1又は配列番号5のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子。
- (a)(i)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−H1と、(ii)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−H2と、(iii)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−L1と、(v)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−L2と、(vi)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−L3とを含むVLドメインを含み、PD1と特異的に結合することができる少なくとも1つのFab分子と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号9、配列番号11、配列番号12及び配列番号10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第2のポリペプチドが、配列番号1、配列番号3、配列番号4及び配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子。 - PD1と特異的に結合することができるFab分子が、
(a)配列番号19のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(b)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号22のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(c)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号23のアミノ酸配列を含むVLドメイン、
(d)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号24のアミノ酸配列を含むVLドメイン、又は
(e)配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVLドメイン
を含む、請求項1から3の何れか一項に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子。 - 4−1BBLトリマー含有抗原結合分子であって、
PD1と特異的に結合することができるFab分子を両方が含む、第1の重鎖及び第1の軽鎖と、
第2のペプチドリンカーによりそのC末端で第2の重鎖又は軽鎖に融合されている、第1のペプチドリンカーによって互いに接続されている、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む4−1BBLの2つのエクトドメインを含む、第1のペプチドと、
第3のペプチドリンカーによりそのC末端で第2の軽鎖又は重鎖に融合されている、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む4−1BBLの1つのエクトドメインを含む第2のペプチドと
をそれぞれ含む、請求項1から4の何れか一項に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子。 - 第1のペプチドリンカーにより互いに接続されている、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む4−1BBLの2つのエクトドメインを含む第1のペプチドが、そのC末端で第2のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるCLドメインに融合されており、
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む4−1BBLの1つのエクトドメインを含む第2のペプチドが、そのC末端で第3のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるCH1ドメインに融合されている、請求項1から4の何れか一項に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子。 - Fcドメインが、アミノ酸置換L234A、L235A及びP329G(カバットEUインデックスによる番号付け)を含むIgG1 Fcドメインである、請求項1から6の何れか一項に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子。
- Fcドメインが、Fcドメインの第1のサブユニットと第2のサブユニットの結合を促進するノブイントゥーホール修飾を含む、請求項1から7の何れか一項に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子。
- (i)配列番号19のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖、又は
配列番号21のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、並びに配列番号22、配列番号23、配列番号24及び配列番号25からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(ii)配列番号74、配列番号76、配列番号78及び配列番号80からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
(iii)配列番号75、配列番号77、配列番号79及び配列番号81からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む、請求項1から8の何れか一項に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子。 - (a)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号83若しくは配列番号171のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号74のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号75のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、
(b)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号83若しくは配列番号171のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号76のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、
(c)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号83若しくは配列番号171のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号78のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号79のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、又は
(d)配列番号82のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号83若しくは配列番号171のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号80のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号81のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖
を含む、請求項1から9の何れか一項に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子。 - 請求項1から10の何れか一項に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項11に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項11に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項12に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1から10の何れか一項に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子を産生する方法であって、請求項13に記載の宿主細胞を4−1BBLトリマー含有抗原結合分子の発現に好適な条件下で培養すること、及び4−1BBLトリマー含有抗原結合分子を単離することを含む方法。
- 請求項1から10の何れか一項に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子と少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
- 医薬として使用するための、請求項1から10の何れか一項に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子、又は請求項15に記載の薬学的組成物。
- 細胞傷害性T細胞活性を上方制御又は延長するのに使用するための、請求項1から10の何れか一項に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子、又は請求項15に記載の薬学的組成物。
- がんの治療に使用するための、請求項1から10の何れか一項に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子。
- がんの治療用の医薬を製造するための、請求項1から10の何れか一項に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子の使用。
- がんを有する個体を治療するための医薬であって、請求項1から10の何れか一項に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子又は請求項15に記載の薬学的組成物の有効量を含む医薬。
- がんを有する個体において細胞傷害性T細胞活性を上方制御又は延長するための医薬であって、請求項1から10の何れか一項に記載の4−1BBLトリマー含有抗原結合分子又は請求項15に記載の薬学的組成物の有効量を含む医薬。
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