JP7098725B2 - 二重特異性2+1コントースボディ - Google Patents
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Description
本発明は、第1の標的に特異的に結合することができる2つの抗原結合ドメインと第2の標的に特異的に結合することができる1つの抗原結合ドメインとを含む2つの融合ポリペプチドからなる新規の二重特異性抗体(コントースボディ(contorsbody))、及びこれらの分子を製造する方法、及びその使用方法に関する。
本発明は、3つの抗原結合ドメインを含むが、特に2つの鎖からなる二重特異性抗体に関する。本発明の抗体は、抗原結合ドメインの空間的配向がIgGフォーマットの古典的抗体とは異なる。
(a)第1の融合ポリペプチドは、第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第1の部分、スペーサードメイン、第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第2の部分、及び第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第1の部分を含み、ここで、
- スペーサードメインはポリペプチドであり、少なくとも25個のアミノ酸残基を含み、
- 第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第1の部分は、スペーサードメインのN末端に、直接又は第1のペプチドリンカーを介して融合され、
- 第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第2の部分は、スペーサードメインのC末端に、直接又は第2のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
- 第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第1の部分は、第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第2の部分のC末端に、直接又は第3のペプチドリンカーを介して融合され、又は、第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第1の部分のN末端に、直接又は第3のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
(b)第2の融合ポリペプチドは、第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第1の部分、スペーサードメイン、第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第2の部分、及び第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第2の部分を含み、ここで、
- スペーサードメインはポリペプチドであり、少なくとも25個のアミノ酸残基を含み、
- 第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第1の部分は、スペーサードメインのN末端に、直接又は第1のペプチドリンカーを介して融合され、
- 第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第2の部分は、スペーサードメインのC末端に、直接又は第2のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
- 第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第2の部分は、第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第2の部分のC末端に、直接又は第3のペプチドリンカーを介して融合され、又は、第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第1の部分のN末端に、直接又は第3のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
ここで、第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第1の部分と第2の部分は、互いに結合して第2の標的に特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し、ここで、第1の標的に特異的に結合することができる第1及び第2の抗原結合ドメインの第1の部分及び第2の部分は、互いに結合して環状融合ポリペプチドを形成し、かつ
ここで、第1の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第2の融合ポリペプチドのスペーサードメインは、ジスルフィド結合により互いに共有結合し、第1及び第2の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。
(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)、並びに(iv)配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)
を含む。
(a)配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHFAP)、及び配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLFAP)、又は
(b)配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHFAP)、及び配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLFAP)
を含む。
(a)(i)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(b)(i)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(c)(i)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(d)(i)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号24のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(e)(i)配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(f)(i)配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(g)(i)配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)
を含む。
(a)配列番号40のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号41のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(b)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号43のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(c)配列番号44のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号45のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(d)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(a)配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号49のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(a)配列番号50のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号51のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(a)配列番号52のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)
を含む。
(a)配列番号54のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
(b)配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号57のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
(c)配列番号58のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号59のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
(d)配列番号60のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号61のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
(e)配列番号62のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
(f)配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号65のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
(g)配列番号66のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号67のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド
を含む。
(a)配列番号116のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号117のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
(b)配列番号118のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号119のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
(c)配列番号120のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号121のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
(d)配列番号122のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号123のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
(e)配列番号124のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号125のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
(f)配列番号126のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号127のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号128のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である軽鎖、
(g)配列番号129のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号130のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
(h)配列番号131のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号132のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、又は
(i)配列番号133のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号134のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド
を含む。
(a)配列番号143のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号144のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、又は
(b)配列番号145のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号146のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド
を含む。
(i)配列番号167、配列番号168、配列番号169、及び配列番号170からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD40)、並びに配列番号171、配列番号172、配列番号173、及び配列番号174からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD40)、又は
(ii)配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号178、配列番号179、及び配列番号180からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD40)、並びに配列番号181、配列番号182、配列番号183、及び配列番号184からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD40)
を含む。
(a)配列番号155のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号156のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
(b)配列番号157のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号158のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
(c)配列番号159のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号160のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
(d)配列番号161のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号162のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
(e)配列番号163のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号164のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、又は
(f)配列番号165のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号166のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド
を含む。
(i)T細胞応答を刺激することにおける、
(ii)活性化T細胞の生存を支持することにおける、
(iii)感染症の治療における、
(iv)がんの治療における、
(v)がんの進行を遅延させることにおける、
(vi)がんに罹患する患者の生存期間を延長することにおける
使用のための医薬の製造における、本発明の二重特異性抗体又は本発明の薬学的組成物の使用が提供される。
定義
特に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野において一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形を含み、その逆もまた同様である。
(a)アミノ酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、及び96-101(H3)に生じる超可変ループ(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b)アミノ酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)、及び95-102(H3)に生じるCDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c)アミノ酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)、及び93-101(H3)に生じる抗原接触(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));及び
(d)HVRアミノ酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)、及び94-102(H3)を含む(a)、(b)、及び/又は(c)の組み合わせ
を含む。
-FcγRI(CD64)は単量体IgGと高親和性で結合し、マクロファージ、単球、好中球、及び好酸球上に発現する。アミノ酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327及びP329(KabatのEUインデックスによる番号付け)の少なくとも1つにおける、IgGのFc領域における改変は、FcγRIへの結合を減少させる。IgG1及びIgG4に置換された位置233-236のIgG2残基は、FcγRIへの結合を千分の一に減少させ、抗体感作赤血球に対するヒト単球応答を排除した(Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624)。
-FcγRII(CD32)は、中程度から低い親和性で、複合体化したIgGに結合し、広く発現される。この受容体は、2つのサブタイプ、FcγRIIA及びFcγRIIBに分けることができる。FcγRIIAは、死滅に関与する多くの細胞(例えば、マクロファージ、単球、好中球)に見られ、死滅プロセスを活性化するようである。FcγRIIBは、阻害プロセスにおいて役割を果たすようであり、B細胞、マクロファージ、並びに肥満細胞及び好酸球に見られる。B細胞では、さらなる免疫グロブリン産生、及び例えばIgEクラスへのアイソタイプスイッチングを抑制するように機能するようである。マクロファージでは、FcγRIIBは、FcγRIIAを介して媒介される食作用を阻害するように作用する。好酸球及び肥満細胞では、B型は、IgEがその別の受容体に結合することによってこれらの細胞の活性化を抑制するのに役立ち得る。FcγRIIAに対する結合の減少は、例えば、アミノ酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292、及びK414の少なくとも1つに変異を有するIgG Fc領域を含む抗体について見いだされる(KabatのEUインデックスによる番号付け)。
-FcγRIII(CD16)は、中程度から低い親和性でIgGに結合し、2つのタイプとして存在する。FcγRIIIAは、NK細胞、マクロファージ、好酸球、並びにいくつかの単球及びT細胞上に見いだされ、ADCCを媒介する。FcγRIIIBは好中球上で高度に発現される。FcγRIIAへの結合の減少は、例えば、アミノ酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338、及びD376の少なくとも1つに変異を有するIgG Fc領域を含む抗体について見いだされる(KabatのEUインデックスによる番号付け)。
100×分率X/Y
ここで、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN-2により、そのプログラムのAとBとの配列比較において、完全一致を記録したアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性の親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe.
本発明は、生産可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、及び低い毒性などの特に有利な特性を有する新規の二重特異性抗原結合分子を提供する。新規二重特異性抗体は、第1の標的に特異的に結合することができる2つの抗原結合ドメインと、第2の標的に特異的に結合することができる1つの抗原結合ドメインとを含む2つの融合ポリペプチドからなる。驚くべきことに、これらの2つの融合ポリペプチドは、3つの抗原結合ドメインが正しく組み立てられ、二重特異性結合が完全に機能するように設計されている。
(a)第1の融合ポリペプチドは、第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第1の部分、スペーサードメイン、第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第2の部分、及び第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第1の部分を含み、ここで、
- スペーサードメインはポリペプチドであり、少なくとも25個のアミノ酸残基を含み、
- 第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第1の部分は、スペーサードメインのN末端に、直接又は第1のペプチドリンカーを介して融合され、
- 第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第2の部分は、スペーサードメインのC末端に、直接又は第2のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
- 第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第1の部分は、第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第2の部分のC末端に、直接又は第3のペプチドリンカーを介して融合され、又は、第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第1の部分のN末端に、直接又は第3のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
(b)第2の融合ポリペプチドは、第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第1の部分、スペーサードメイン、第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第2の部分、及び第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第2の部分を含み、ここで、
- スペーサードメインはポリペプチドであり、少なくとも25個のアミノ酸残基を含み、
- 第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第1の部分は、スペーサードメインのN末端に、直接又は第1のペプチドリンカーを介して融合され、
- 第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第2の部分は、スペーサードメインのC末端に、直接又は第2のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
- 第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第2の部分は、第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第2の部分のC末端に、直接又は第3のペプチドリンカーを介して融合され、又は、第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第1の部分のN末端に、直接又は第3のペプチドリンカーを介して融合され、
ここで、第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第1の部分と第2の部分は、互いに結合して第2の標的に特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し、ここで、第1の標的に特異的に結合することができる第1及び第2の抗原結合ドメインの第1の部分及び第2の部分は、互いに結合して環状融合ポリペプチドを形成し、かつ
ここで、第1の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第2の融合ポリペプチドのスペーサードメインは、ジスルフィド結合により互いに共有結合し、第1及び第2の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。
(a)第1の融合ポリペプチドは、第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第1の部分、スペーサードメイン、第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第2の部分、及び第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第1の部分を含み、ここで、
- スペーサードメインはポリペプチドであり、少なくとも25個のアミノ酸残基を含み、
- 第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第1の部分は、スペーサードメインのN末端に、直接又は第1のペプチドリンカーを介して融合され、
- 第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第2の部分は、スペーサードメインのC末端に、直接又は第2のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
- 第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第1の部分は、第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第2の部分のC末端に、直接又は第3のペプチドリンカーを介して融合され、又は、第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第1の部分のN末端に、直接又は第3のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
(b)第2の融合ポリペプチドは、第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第1の部分、スペーサードメイン、第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第2の部分、及び第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第2の部分を含み、ここで、
- スペーサードメインはポリペプチドであり、少なくとも25個のアミノ酸残基を含み、
- 第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第1の部分は、スペーサードメインのN末端に、直接又は第1のペプチドリンカーを介して融合され、
- 第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第2の部分は、スペーサードメインのC末端に、直接又は第2のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
(c)軽鎖は、第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第2の部分を含み、
ここで、第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第1の部分と第2の部分は、互いに結合して第2の標的に特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し、ここで、第1の標的に特異的に結合することができる第1及び第2の抗原結合ドメインの第1の部分及び第2の部分は、互いに結合して環状融合ポリペプチドを形成し、かつ
ここで、第1の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第2の融合ポリペプチドのスペーサードメインは、ジスルフィド結合により互いに共有結合し、第1及び第2の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。
一態様では、本発明の二重特異性抗体は、(a)本明細書で前に定義された第1の融合ポリペプチド及び本明細書で前に定義された第2の融合ポリペプチドを含むことができ、ここで、第1及び第2の融合ポリペプチドは、第1及び第2の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。通常、これらの修飾はFcドメインに導入される。2つの構造的に異なる融合ポリペプチドの組換え共発現、及びその後の二量体化は、2つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせをもたらすであろう。したがって、組換え産生における二重特異性抗体の収率及び純度を改善するために、本発明の二重特異性抗原結合分子のFcドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利であろう。
本発明の二重特異性抗体は、スペーサードメインとして免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含み得る。例えば、免疫グロブリン G(IgG)分子のFcドメインは二量体であり、その各サブユニットはCH2及びCH3 IgG重鎖定常ドメインを含む。Fcドメインの2つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。Fc領域は、本発明の二重特異性抗体に、好ましい薬物動態特性、例えば標的組織内への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び好ましい組織-血液分布比などを付与する。しかしながら、同時に、好ましい抗原保有細胞よりはむしろFc受容体を発現する細胞に対しての、本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を導く可能性がある。したがって、特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗体のFcドメインは、天然IgG Fc領域、特にIgG1 Fc領域又はIgG4 Fc領域と比較して、Fc受容体に対する低減した結合親和性及び/又は低減したエフェクター機能を示す。より具体的には、Fc領域はIgG1 Fc領域である。
i)任意で変異P329G、L234A及びL235Aを有するヒトIgG1サブクラスのホモ二量体Fc領域、又は
ii)任意で変異P329G、S228P及びL235Eを有するヒトIgG4サブクラスのホモ二量体Fc領域、又は
iii)任意で変異P329G、L234A、L235A、I253A、H310A、及びH435Aを有する、又は任意で変異P329G、L234A、L235A、H310A、H433A、及びY436Aを有するヒトIgG1サブクラスのホモ二量体Fc領域、又は
iv)
a)1つのFc領域ポリペプチドが変異T366Wを含み、他のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A及びY407Vを含み、又は
b)1つのFc領域ポリペプチドが変異T366W及びY349Cを含み、他のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、及びS354Cを含み、又は
c)1つのFc領域ポリペプチドが変異T366W及びS354Cを含み、他のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、及びY349Cを含む
ヘテロ二量体Fc領域、
又は
v)Fc領域ポリペプチドの両方が変異P329G、L234A及びL235Aを含み、かつ
a)1つのFc領域ポリペプチドが変異T366Wを含み、他のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A及びY407Vを含み、又は
b)1つのFc領域ポリペプチドが変異T366W及びY349Cを含み、他のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、及びS354Cを含み、又は
c)1つのFc領域ポリペプチドが変異T366W及びS354Cを含み、他のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、及びY349Cを含む
ヒトIgG1サブクラスのヘテロ二量体Fc領域、
又は
vi)Fc領域ポリペプチドの両方が変異P329G、S228P及びL235Eを含み、かつ
a)1つのFc領域ポリペプチドが変異T366Wを含み、他のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A及びY407Vを含み、又は
b)1つのFc領域ポリペプチドが変異T366W及びY349Cを含み、他のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、及びS354Cを含み、又は
c)1つのFc領域ポリペプチドが変異T366W及びS354Cを含み、他のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、及びY349Cを含む
ヒトIgG4サブクラスのヘテロ二量体Fc領域、
又は
vii)i)、ii)、及びiii)のいずれかとvi)、v)、及びvi)のいずれかとの組み合わせ
を含む。
いくつかの態様では、FAPに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
(a)(i)配列番号1のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)、並びに(iv)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)、又は
(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)、並びに(iv)配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)
を含む。
を含む。
いくつかの態様では、第1の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、TNF受容体、特に共刺激TNF受容体に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。具体的には、共刺激TNF受容体はOX40である。一態様では、第1の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、OX40に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。特に、本発明の二重特異性抗体は、OX40に特異的に結合することができる2つの抗原結合ドメインを含む。
(a)(i)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(b)(i)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(c)(i)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR-H3含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(d)(i)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号24のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(e)(i)配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(f)(i)配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(g)(i)配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)を含む。
(a)配列番号40のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号41のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(b)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号43のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(c)配列番号44のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号45のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(d)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(a)配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号49のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(a)配列番号50のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号51のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(a)配列番号52のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)
を含む。
(a)配列番号54のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(b)配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号57のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(c)配列番号58のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号59のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(d)配列番号60のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号61のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(e)配列番号62のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(f)配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号65のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、又は
(g)配列番号66のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号67のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド
を含む。
(a)配列番号54のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号55のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(b)配列番号56のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号57のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(c)配列番号58のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号59のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(d)配列番号60のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号61のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(e)配列番号62のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号63のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(f)配列番号64のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号65のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、又は
(g)配列番号66のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号67のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド
を含む。
(a)配列番号116のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号117のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(b)配列番号118のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号119のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(c)配列番号120のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号121のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(d)配列番号122のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号123のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(e)配列番号124のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号125のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(f)配列番号126のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、配列番号127のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、及び配列番号128のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である軽鎖、
(g)配列番号129のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号130のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド
(h)配列番号131のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号132のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、又は
(i)配列番号133のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号134のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド
を含む。
(a)配列番号116のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号117のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(b)配列番号118のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号119のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(c)配列番号120のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号121のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(d)配列番号122のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号123のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(e)配列番号124のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号125のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(f)配列番号126のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、配列番号127のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、及び配列番号128のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(g)配列番号129のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号130のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(h)配列番号131のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号132のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、又は
(i)配列番号133のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号134のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド
を含む。
いくつかの態様では、第1の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、TNF受容体に特異的に結合することができる抗原結合ドメインであり、共刺激TNF受容体が4-1BBである二重特異性抗体が提供される。一態様では、第1の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、4-1BBに特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。特に、本発明の二重特異性抗体は、4-1BBに特異的に結合することができる2つの抗原結合ドメインを含む。
(a)配列番号143のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号144のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、又は
(b)配列番号145のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号146のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド
を含む。
(a)配列番号143のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号144のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、又は
(b)配列番号145のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号146のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド
を含む。
いくつかの態様では、第1の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、TNF受容体に特異的に結合することができる抗原結合ドメインであり、共刺激TNF受容体がCD40である二重特異性抗体が提供される。一態様では、第1の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、CD40に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。特に、本発明の二重特異性抗体は、CD40に特異的に結合することができる2つの抗原結合ドメインを含む。
(i)配列番号167、配列番号168、配列番号169、及び配列番号170からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD40)、並びに配列番号171、配列番号172、配列番号173、及び配列番号174からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD40)、又は
(ii)配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号178、配列番号179、及び配列番号180からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD40)、並びに配列番号181、配列番号182、配列番号183、及び配列番号184からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD40)
を含む。
(a)配列番号153のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD40)、及び配列番号154のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD40)、又は
(b)配列番号167のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD40)、及び配列番号171のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD40)
を含む。
(a)配列番号155のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号156のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(b)配列番号157のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号158のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(c)配列番号159のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号160のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(d)配列番号161のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号162のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(e)配列番号163のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号164のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、又は
(f)配列番号165のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号166のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド
を含む。
(a)配列番号155のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号156のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(b)配列番号157のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号158のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(c)配列番号159のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号160のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(d)配列番号161のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号162のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、
(e)配列番号163のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号164のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド、又は
(f)配列番号165のアミノ酸配列を含む第1の融合ポリペプチド、及び配列番号166のアミノ酸配列を含む第2の融合ポリペプチド
を含む。
一態様では、本発明は、(a)OX40に特異的に結合することができる2つのFab断片、及び(b)FAPに特異的に結合することができる1つのFab断片を含む二重特異性抗体であって、ここで、Fab断片の(a)及び(b)の1つにおいて、可変ドメインVH及びVL又は定常ドメインCH1及びCLのいずれかが交換されている二重特異性抗体に関する。二重特異性抗体は、Crossmab技術に従って調製される。
本発明はさらに、本明細書に記載の本発明の二重特異性抗体又はその断片をコードする単離された核酸を提供する。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成(例えばメリフィールド固体相合成)又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、例えば上述したように、抗体又はそのポリペプチド断片をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び/又は発現のために1つ又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定され得る。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの1つ又は複数を含むベクタ-、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写/翻訳制御シグナルとともに二重特異性抗原結合分子(断片)のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、in vitroでの組換えDNA技術、合成技術及びin vivoでの組換え/遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989);及びAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に記載される技術を参照のこと。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターには、二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片(すなわちコード領域)が、プロモーター及び/又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットが含まれる。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「終止コドン」(TAG、TGA、又はTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5’及び3’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。2つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば別の(異なる)ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、2つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離される1つ又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド若しくはそのポリペプチド断片又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合しているか、又は融合していない異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、1つ又は複数の制御配列と結合するときである。(ポリペプチドコード領域及びそれに結合するプロモーターのような)2つのDNA断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合、及び2つのDNA断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきDNAテンプレートの能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるであろう。プロモーターは、所定の細胞においてのみDNAの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に、他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子は、当該技術分野で公知のさまざまなアッセイによって、その物理的/化学的性質及び/又は生物活性について同定、スクリーニング又は特徴づけすることができる。
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のOX40又はFAPに対する親和性は、実施例に記載の方法に従って、BIAcore装置(GEヘルスケア)などの標準的装置と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いる表面プラズモン共鳴(SPR)により決定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって例示的な実施態様は、実施例3に記載される。一態様によれば、KDは、25℃でBIACORE(登録商標)T200装置(GEヘルスケア)を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子の、その対応するOX40及び/又はFAP発現細胞への結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリー(FACS)により評価することができる。一態様では、OX40を発現する新鮮な末梢血単核細胞(PBMC)が結合アッセイで使用される。これらの細胞は、単離直後(ナイーブPMBC)又は刺激後(活性化PMBC)に使用される。OX40への結合を測定するための具体的な例示であって例示的な実施態様は、実施例4.1に記載される。
一態様では、FAP及びOX40に結合する、生物活性を有する二重特異性抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えば、OX40を発現する細胞におけるOX40を介したアゴニストシグナル伝達が含まれ得る。これらのアッセイによってin vitroでそのような生物活性を有すると認められた二重特異性抗原結合分子も提供される。特に、ヒトOX40を発現し、FAP発現腫瘍細胞と共培養されたHela細胞におけるNFκB活性化を検出するレポーター細胞アッセイが提供される(例えば、実施例5.1を参照)。
さらなる態様では、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供される二重特異性抗体のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、本明細書で提供される二重特異性抗体のいずれかと、少なくとも1つの薬学的に許容される添加剤とを含む薬学的組成物を提供する。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される二重特異性抗体のいずれかと、例えば後述するような少なくとも1つの追加の治療剤とを含む。
本明細書に提供される二重特異性抗体のいずれも、治療方法において使用され得る。治療方法において使用される場合、本発明の二重特異性抗原結合分子は、医療実施基準に一致した様式で製剤化、調薬及び投与され得る。この観点において考慮すべき要素には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程、及び医療従事者が知るその他の要素が含まれる。
本発明の二重特異性抗体は、治療において1つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の抗体は、少なくとも1つの追加の治療剤と共投与され得る。用語「治療剤」は、このような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与され得る任意の薬剤を包含する。そのような追加の治療剤は、治療される特定の適応症に適した任意の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含み得る。特定の実施態様では、追加の治療剤は別の抗がん剤である。
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防及び/又は診断に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は、容器、及び容器上又は容器に付属するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、IV輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどのさまざまな材料から形成され得る。容器は、状態の治療、予防、及び/又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる(例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用の溶液のバッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも1つの活性剤は、本明細書に記載される二重特異性抗体である。
***
標準的な方法を使用して、Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにDNAを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に与えられている。
DNA配列は、二本鎖配列決定により決定された。
所望の遺伝子セグメントは、自動化遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチドからGeneart AG(Regensburg,Germany)での化学合成によって調製された。合成された遺伝子断片を、増殖/増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。あるいは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、又はPCRを介して、短い合成DNA断片を組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドはmetabion GmbH(Planegg-Martinsried,Germany)によって調製された。
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Incに記載されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。
特に明記しない限り、すべての市販の化学薬品、抗体、及びキットは、製造者のプロトコルに従って提供されたとおりに使用された。
二重特異性コントースボディの生成
1.1二重特異性コントースボディのための発現プラスミドの構築
本明細書で報告される二重特異性コントースボディの発現のために、以下の機能的要素を含む転写ユニットが使用された:
-イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス(P-CMV)からの最初期エンハンサー及びプロモーター、
-ヒト重鎖免疫グロブリン5’-非翻訳領域(5’UTR)、
-マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
-それぞれの環状融合ポリペプチドをコードする核酸、及び
-ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット/カセットの他に、基本的な/標準の哺乳動物発現プラスミドは、
-大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18由来の複製開始点、及び
-大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子
を含む。
二重特異性抗原結合分子の一過性発現は、トランスフェクション試薬293フリー(Novagen)を用いて、懸濁液に適合したHEK293F(FreeStyle 293-F細胞;Invitrogen)細胞で行われた。
抗原結合分子を含む培養上清をろ過し、2つのクロマトグラフィー工程により精製した。抗体は、PBS(1mMのKH2PO4、10mMのNa2HPO4、137mMのNaCl、2.7mMのKCl)、pH7.4により平衡化したHiTrap MabSelectSuRe(GE Healthcare)を使用したアフィニティークロマトグラフィーによって捕捉した。未結合のタンパク質を平衡化バッファーにより洗浄することにより除去し、抗原結合分子を50mMクエン酸バッファー、pH2.8により回収し、溶出直後に1MのTris-base、pH9.0によりpH6.0に中和した。Superdex 200TM(GE Healthcare)でのサイズ排除クロマトグラフィーを第2の精製工程として使用した。サイズ排除クロマトグラフィーは、20mMヒスチジンバッファー、0.14MのNaCl、pH6.0において行った。二重特異性抗原結合分子を含む溶液を、Biomax-SKメンブレン(Millipore、Billerica、MA)を備えたUltrafree-CL遠心フィルターユニットを用いて濃縮し、-80℃で保存した。
PNGase Fは、Roche Diagnostics GmbHから入手した(14.3U/μl;リン酸ナトリウム、EDTA及びグリセロール溶液)。IgG抗体のヒンジ領域を特異的に切断するプロテアーゼは、消化前に凍結乾燥物から新たに再構成された。
50μgの抗原結合分子を10mMリン酸ナトリウムバッファー、pH7.1により最終濃度0.6mg/mlに希釈し、1μlのPNGase Fにより37℃で16時間脱グリコシル化した。
脱グリコシル化した試料を200mMのTrisバッファー、pH8.0により最終濃度0.5mg/mlに希釈し、続いてIgG特異的プロテアーゼを用いて37℃で1時間消化した。
試料は、2%ギ酸(v/v)を含む40%アセトニトリルを使用して、Sephadex G25カラム(Kronlab、5x250mm、TAC05/250G0-SR)上でのHPLCにより脱塩した。TriVersa NanoMate源(Advion)を備えたmaXis 4G UHR-QTOF MSシステム(Bruker Daltonik)上でESI-MSによって総質量を決定した。キャリブレーションはヨウ化ナトリウムを用いて実行された(Waters ToF G2-Sample Kit 2 Part:700008892-1)。消化された抗原結合分子の場合、データ収集は1000ー4000m/zで行われた(ISCID:30eV)。生の質量スペクトルが評価され、個々の相対モル質量に変換された。結果を視覚化するために、プロプライエタリ・ソフトウェアを使用して、デコンボリューションされた質量スペクトルを生成した。
OX40に結合する2つの抗原結合ドメインとFAPに結合する1つの抗原結合ドメインとを有する二重特異性抗体の調製(FAP-OX40コントースボディ)
図1Aに示すように、2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、VH(FAP)-Ckappa
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、VL(FAP)-CH1。
図1Bに示すように、2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-CH1、(G4S)2コネクタ、VL(FAP)-Ckappa
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-CH1、(G4S)2コネクタ、VH(FAP)-CH1。
図1Aに示すように、2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-Ckappa、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-Ckappa
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-Ckappa、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-CH1。
図1Aに示すように、2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-Ckappa、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-Ckappa
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-Ckappa、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-CH1。
図1Bに示すように、2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-CH1、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-Ckappa。
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-CH1、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-CH1。
図1Bに示すように、2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-CH1、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-Ckappa。
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-CH1、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-CH1。
図1Cに示すように、2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VL(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VH(OX40)-CH1、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-Ckappa。
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VL(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VH(OX40)-CH1、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-CH1。
図1Dに示すように、2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-Ckappa、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-CH1。
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-Ckappa、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-Ckappa。
2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VL(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VH(OX40)-CH1、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-CH1。
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VL(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VH(OX40)-CH1、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-Ckappa。
2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VL(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VH(OX40)-CH1、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-Ckappa。
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-Ckappa、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-CH1。
2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-Ckappa、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-Ckappa。
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VL(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VH(OX40)-CH1、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-CH1。
2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-CH1_EE(K147E、K213E)、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-Ckappa_RK(E123R、Q124K)、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-Ckappa。
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-CH1_EE(K147E、K213E)、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-Ckappa_RK(E123R、Q124K)、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-CH1。
2つの融合ポリペプチドと軽鎖を含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-CH1_EE(K147E、K213E)、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-Ckappa_RK(E123R、Q124K)、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-Ckappa。
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(OX40)-CH1_EE(K147E、K213E)、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-Ckappa_RK(E123R、Q124K)。
-軽鎖:VL(FAP)-CH1。
2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(FAP)-Ckappa、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(OX40)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-Ckappa。
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VL(FAP)-CH1、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(OX40)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-Ckappa。
2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(FAP)-Ckappa、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VH(OX40)-CH1。
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VL(FAP)-CH1、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VH(OX40)-CH1。
2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(FAP)-Ckappa、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-CH1。
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(FAP)-Ckappa、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(OX40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VL(OX40)-CH1。
対照として、以下の二重特異性抗OX40抗体を調製した:
a)OX40に対する二価結合及びFAPに対する一価結合を有する二重特異性抗体は、国際公開第2017/055398(A2)号の実施例4.4(2+1フォーマット)と同様に調製された。この分子において、第1の重鎖(HC1)は、抗OX40バインダー49B4の1つのFabユニット(VHCH1)、それに続いて、(G4S)リンカーによって抗FAPバインダー28H1又は4B9のVHドメインに融合されたFcノブ鎖で構成された。構築物の第2の重鎖(HC2)は、抗OX40バインダー49B4の1つのFabユニット(VHCH1)と、それに続く(G4S)リンカーによって抗FAPバインダー28H1又は4B9のVLドメインに融合されたFcホール鎖で構成された。分子の概略図を図10に示す。
b)抗FAPバインダーのVH及びVLドメインが、抗原に結合していないDP47と呼ばれる生殖系列コントロールによって置換された、上記のようなOX40に対する2価結合を有する抗体。この分子は、負の「非標的」対照として使用される。
c)OX40に対する二価結合及びFAPに対する一価結合を有する二重特異性抗体は、国際公開第2017/060144(A1)号の実施例4.4(4+1フォーマット)と同様に調製された。この分子において、第1の重鎖(HC1)は、抗OX40バインダー49B4の2つのFabユニット(VHCH1_VHCH1)、それに続いて、(G4S)リンカーによって抗FAPバインダー4B9のVHドメインに融合されたFcノブ鎖で構成された。構築物の第2の重鎖(HC2)は、抗OX40バインダー49B4の2つのFabユニット(VHCH1_VHCH1)、それに続いて、(G4S)リンカーによって抗FAPバインダー4B9のVLドメインに融合されたFcホール鎖で構成された。分子の概略図を図1Pに示す。
FAP OX抗体の特徴づけ
3.1 ヒトOX40への結合(速度論的親和性)
二重特異性FAP-OX40抗体のヒトOX40への結合を、BIACORE T100機器(GE Healthcare)を使用した表面プラズモン共鳴によって調査した。捕捉システムの約8000共鳴ユニット(RU)(20μg/mlの抗ヒトIgG(Fc);注文コード:BR100839;GE Healthcare Bio-Sciences AB、スウェーデン)を、GE Healthcareによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって、pH5.0でCM5チップ(GE Healthcare BR-1005-30)上に結合させた。ランニングバッファーは、PBS-P pH7.4(20mMリン酸バッファー、2.7mMのKCl、137mMのNaCl、0.05%のSurfactant P20)であった。フローセルを25℃に、試料ブロックを12℃に設定し、ランニングバッファーで2回刺激した。二重特異性抗体は、2μg/mlの溶液を5μl/分の流速で60秒間注入することによって捕捉された。結合は、1:3希釈において600nMから開始し、30μl/分の流速で120秒間ヒトOX40を注入することによって測定された。解離フェーズは最大720秒間監視され、試料溶液からランニングバッファーに切り替えることによってトリガーされた。表面を、3MのMgCl2により10μl/分の流速で60秒間洗浄することにより、再生した。バルク屈折率の差は、抗ヒトIgG(Fc)表面から得られた応答を差し引くことにより補正された。ブランク注入も差し引かれた(=ダブルリファレンス)。KD及び速度論的パラメーターの計算のために、Langmuir 1:1モデルを使用した。
二重特異性FAP-OX40抗体のヒトFAPへの結合を、BIACORE T100機器(GE Healthcare)を使用した表面プラズモン共鳴によって調査した。捕捉システムの約12000共鳴ユニット(RU)(15μg/mlの抗ヒスチジン抗体;注文コード:28995056;GE Healthcare Bio-Sciences AB、スウェーデン)を、GE Healthcareによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって、pH4.5でCM5チップ(GE Healthcare BR-1005-30)上に結合させた。固定用のランニングバッファーはHBS-N pH7.4であった(10mMのHEPES、150mMのNaCl、pH7.4、GE Healthcare)。以下の速度論的特徴づけのためのランニングバッファーは、PBS-P pH7.4(20mMリン酸バッファー、2.7mMのKCl、137mMのNaCl、0.05%界面活性剤P20)であった。フローセルを25℃に、試料ブロックを12℃に設定し、ランニングバッファーで2回刺激した。組換えヒトFAPは、25μg/mlの溶液を5μl/分の流速で60秒間注入することにより捕捉された。結合は、1:2希釈において300nMから開始し、30μl/分の流速で120秒間ヒトOX40を注入することによって測定された。解離フェーズは最大720秒間監視され、試料溶液からランニングバッファーに切り替えることによってトリガーされた。表面を、10mMのグリシン、pH1.5により30μl/分の流速で60秒間洗浄することにより、再生した。バルク屈折率の差は、抗ヒスチジン表面から得られた応答を差し引くことにより補正された。ブランク注入も差し引かれた(=ダブルリファレンス)。 KD及び速度論的パラメーターの計算のために、Langmuir 1:1モデルを使用した。
ヒトOX40とヒトFAPを同時に結合する能力も、BIACORE T100機器(GE Healthcare)を使用した表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価された。捕捉システムの約8000共鳴ユニット(RU)(20μg/mlの抗ヒトIgG(Fc);注文コード:BR100839;GE Healthcare Bio-Sciences AB、スウェーデン)を、GE Healthcareによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって、pH5.0でCM5チップ(GE Healthcare BR-1005-30)上に結合させた。ランニングバッファーは、PBS-P pH7.4(20mMリン酸バッファー、2.7mMのKCl、137mMのNaCl、0.05%のSurfactant P20)であった。フローセルを25℃に、試料ブロックを12℃に設定し、ランニングバッファーで2回刺激した。二重特異性抗体は、2μg/mlの溶液を5μl/分の流速で60秒間注入することによって捕捉された。結合は、第1の被分析物(それぞれヒトOX40又はヒトFAP)を30μl/分の流速で120秒間、注入することによって測定された。次に、第2の被分析物(それぞれヒトFAP又はヒトOX40)を、30μl/分の流速で120秒間注入された。解離フェーズは最大720秒間監視され、試料溶液からランニングバッファーに切り替えることによってトリガーされた。表面を、3MのMgCl2により10μl/分の流速で60秒間洗浄することにより、再生した。バルク屈折率の差は、抗ヒトIgG(Fc)表面から得られた応答を差し引くことにより補正された。ブランク注入も差し引かれた(=ダブルリファレンス)。KD及び速度論的パラメーターの計算のために、Langmuir 1:1モデルを使用した。すべてのFAP-OX40コントースボディは、両方の抗原に同時にかつ独立して結合することができた。
細胞への結合
4.1 ナイーブ対活性化ヒトPBMCへの結合
バフィーコートはチューリッヒ献血センターから入手した。ヒトPBMCは、フィコール密度勾配遠心分離により単離された。新鮮な末梢血単核細胞(PBMC)を分離するために、バフィーコートは同体積のDPBS(Gibco by Life Technologies、カタログ番号14190326)により希釈された。50mLのポリプロピレン製遠心分離管(TPP、カタログ番号91050)に、15mLのヒストパック1077(SIGMA Life Science、カタログ番号10771、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、1.077g/mLの密度に調整)が供給され、バフィーコート溶液がヒストパック1077の上に層にされた。管を400xg、室温で30分間、低加速で中断なしで遠心分離した。その後、PBMCを界面から収集し、DPBSで3回洗浄し、10%ウシ胎仔血清(FBS、Life TechnologyによるGibco、カタログ番号16000-044、ロット941273、ガンマ線照射、マイコプラズマフリー、及び56℃で35分間の熱不活性化)を供給されたRPMI1640培地(Life TechnologyによるGibco、カタログ番号42401-042)、1%(v/v)GlutaMAX I(Life TechnologiesによるGibco、カタログ番号3505038)、1mMのピルビン酸ナトリウム(SIGMA、カタログ番号S8636)、1%(v/v)のMEM非必須アミノ酸(SIGMA、カタログ番号M7145)及び50μMのβメルカプトエタノール(SIGMA、M3148)からなるT細胞培地に再懸濁した。PBMCは、10%(v/v)ジメチルスルホキシドを含むFBS中で凍結された。
細胞表面FAPへの結合は、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質(huFAP)発現WM266-4細胞(ATCC CRL-1676)を使用して試験された。OX40陰性FAP陰性腫瘍細胞への結合の欠如は、非標識ヒトFAP陽性WM266-4細胞からの分離を可能にするために、核に限定されたNucLight Red蛍光タンパク質を発現するA549 NucLightTMRed Cells(Essen Bioscience、カタログ番号4491)を使用して試験された。 親A549(ATCC CCL-185)は、標準のエッセンプロトコルに従って、8μg/mlポリブレンの存在下でMOIが3(TU/細胞)で、Essen CellPlayer NucLight Redレンチウイルス(Essen Bioscience、カタログ番号4476;EF1α、ピューロマイシン)により形質導入された。これにより、≧70%の形質導入効率が得られた。
表23:異なるフォーマットのFAP標的化OX40(49B4)二重特異性抗体の細胞表面ヒトFAP及びヒトOX40(CD4+ T細胞上)への結合のEC50値
表24:異なるフォーマットのFAP標的化OX40(49B4)二重特異性抗体の細胞表面ヒトFAP及びヒトOx40(CD4+ T細胞上)への結合のEC50値
n.c.カーブフィットなし。EC50の計算はできない
n.a.適用されない
表25:異なるフォーマットのFAP標的化OX40(49B4)二重特異性抗体の細胞表面ヒトFAP及びヒトOx40(CD4+ T細胞上)への結合のEC50値
n.c.カーブフィットなし。EC50の計算はできない
n.a.適用されない
二重特異性抗ヒトOX40結合分子の機能特性
5.1 ヒトOX40及びレポーター遺伝子NFκBルシフェラーゼを発現するHeLa細胞
OX40のそのリガンドに対するアゴニスト結合は、核因子カッパB(NFκB)の活性化を介して下流のシグナル伝達を誘導する(A. D. Weinberg et al., J. Leukoc. Biol. 2004, 75(6), 962-972)。組換えレポーター細胞株HeLa_hOx40_NFκB_Luc1は、その表面にヒトOx40を発現させるために生成された。さらに、それはNFκB感受性エンハンサーセグメントの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポータープラスミドを保有している。Ox40トリガーはNFκBの用量依存的活性化を誘導し、その後NFκBは核に移行し、そこでレポータープラスミドのNFκB感受性エンハンサーに結合してルシフェラーゼタンパク質の発現を増加させる。ルシフェラーゼは、ルシフェリン酸化を触媒し、オキシルシフェリンを生成し、それが発光する。これは、ルミノメーターによって定量化可能である。
5.1節において、FAP+腫瘍細胞の追加は、OX40受容体の強力なオリゴマー化を提供することにより、ヒトOX40陽性レポーター細胞株におけるFAP標的化二価抗OX40抗体によって誘導されるNFκB活性を強く増加させることができることが示された。同様に、我々は、休止ヒトPBMC細胞の準最適なTCR刺激を救済する能力について、NIH/3T3-huFAPクローン19細胞の存在下で、FAP標的化二価抗OX40抗体を試験した。
まとめると、2+1 コントースボディCD134-0093は、2+1コントースボディCD134-0094よりも良好に機能した。活性化CD4 T細胞へのCD134-0093の結合は、FAP標的化OX40(49B4)FAP(28H1)2+1二重特異性抗体及びCD134-0094のいずれよりも強く、どちらも同様の結合特性を示した(図2A)。両方のコントースボディは、WM266-4細胞上のヒト表面FAPへの良好な結合を示し(図3A)、結合強度は、OX40(49B4)FAP(4B9)4+1二重特異性抗体(高親和性バインダー4B9を含む)とOX40(49B4)FAP(28H1)2+1二重特異性抗体(低親和性バインダー28H1を含む)の間のものであった。実施例2.9において説明されるように、コントースボディのフォーマットがOX40(49B4)FAP(28H1)2+1二重特異性抗体と異なる場合でも、結合特性は同じかそれ以上に良好であるようである。それにもかかわらず、それらはOX40(49B4)FAP(4B9)4+1二重特異性抗体(実施例2.9)のMFIに達しない。NIH 3T3 huFAP細胞を架橋することによるNFκB活性化を見ると、コントースボディは、(49B4)FAP(28H1)2+1二重特異性抗体と比較して、NFκBの中間の活性化を示したが、非標的化OX40(49B4)DP47 2+1二重特異性抗体よりも依然として強かった(図4A)。両方のコントースボディ上のFAPドメインは、架橋剤として機能し、OX40シグナル伝達を活性化できるようである。二次Fcγ特異的抗体を架橋剤として使用すると、両方のコントースボディは同様のNFκB活性化を示したが、標的化対照分子よりもあまり良好に機能しなかった(図4B)。コントースボディの生物活性試験により、CD134-0093は、CD134-0094よりもCD4及びCD8 T細胞上でより顕著な活性化表現型を誘導するようであることを明らかにした(図5A-D)。コントースボディCD134-0093は、2価の2+1形式よりもT細胞のより強い活性化を示した(図6)。
4-1BBに結合する2つの抗原結合ドメインとFAPに結合する1つの抗原結合ドメインとを有する二重特異性抗体の調製(FAP-4-1BBコントースボディ)
FAPバインダーの生成及び調製は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2012/020006(A2)号に記載されている。4-1BBバインダーについては、クローン20H4.9のVH及びVL配列は、米国特許第7288638(B2)号又は米国特許第7659384(B2)号に従って得られた。
図1Aに示すように、2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(4-1BB)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(4-1BB)-Ckappa、(GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-Ckappa
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(4-1BB)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VL(4-1BB)-Ckappa、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-CH1。
2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(4-1BB)-CH1_EE(K147E、K213E)、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(4-1BB)-Ckappa_RK(E123R、Q124K)、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-Ckappa。
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(4-1BB)-CH1_EE(K147E、K213E)、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VL(4-1BB)-Ckappa_RK(E123R、Q124K)、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-CH1。
FAP-4-BBコントースボディの特徴づけ
7.1 ヒトFAPへの結合(速度論的親和性)
二重特異性FAP-4-1BB抗体のヒトFAPへの結合を、BIACORE T100機器(GE Healthcare)を使用した表面プラズモン共鳴によって実施例3.2に記載されるように調査した。KD及び速度論的パラメーターの計算のために、Langmuir 1:1モデルを使用した。
4-1BB(CD137)受容体とそのリガンド(4-1BBL)のアゴニスト結合は、核因子カッパB(NFkB)の活性化を介して4-1BB-下流シグナル伝達を誘導し、CD8 T細胞の生存及び活性を促進する(Lee HW, Park SJ, Choi BK, Kim HH, Nam KO, Kwon BS. 4-1BB promotes the survival of CD8 (+) T lymphocytes by increasing expression of Bcl-x(L) and Bfl-1. J Immunol 2002; 169:4882-4888)。2+1 H2H抗4-1BB、抗FAP huIgG1 PGLALA二重特異性抗体によって媒介されるこのNFκB活性化を監視するために、Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2レポーター細胞株をPromega(ドイツ)から購入した。細胞は、10%(v/v)ウシ胎仔血清(FBS、Life TechnologiesのGIBCO、カタログ番号16000-044、ロット941273、ガンマ線照射マイコプラズマフリー、熱不活性化)、2mMのL-アラニル-L-グルタミンジペプチド(Glutqa-MAX-I、GIBCO by Life Technologies、カタログ番号35050-038)、1mMピルビン酸ナトリウム(SIGMA-Aldrichカタログ番号S8636)、1%(v/v)MEM-非必須アミノ酸溶液100x(SIGMA-Aldrich、カタログ番号M7145)、600μg/mlのG-418(Roche、カタログ番号04727894001)、400μg/mlハイグロマイシンB(Roche、カタログ番号:10843555001)及び25mMのHEPES(Sigma Life Sience、カタログ番号:H0887-100mLを供給されたRPMI 1640培地(Life TechnologiesのGIBCO、カタログ番号42401-042)中で浮遊細胞として培養された。アッセイのために、細胞を回収し、10%(v/v)FBS及び1%(v/v)GlutaMAX-Iが供給されたアッセイ培地RPMI 1640培地に再懸濁した。2x103のJurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2レポーター細胞を含む10μlを、蓋付きの無菌白色384ウェル平底組織培養プレート(Corning、カタログ番号3826)の各ウェルに移した。滴定濃度のコントースボディ、2+1二重特異性アゴニスト抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)huIgG1 P329GLALA抗体、抗4-1BB(20H4.9)huIgG1 P329GLALA抗体、抗4-1BB(20H4.9)huIgG4及びアイソタイプ対照(DP47 hu IgG1 P329GLALA抗体)を含むアッセイ培地10μLが加えられた。最後に、アッセイ培地のみ又は1x104細胞のFAP発現細胞、NIH/3T3-huFAPクローン19(上記のとおり)を含むアッセイ培地10μLが供給され、プレートを細胞インキュベーター内で37℃、5%CO2で6時間インキュベートした。6μlの新たに解凍したOne-Glo Luciferaseアッセイ検出溶液(Promega、カタログ番号:E6110)を各ウェルに加え、Tecanマイクロプレートリーダーを使用して、ルミネセンス発光を即座に測定した(500msの積分時間、フィルターなしですべての波長を収集する)。
CD40に結合する2つの抗原結合ドメインとFAPに結合する1つの抗原結合ドメインとを有する二重特異性抗体の調製(FAP-CD40コントースボディ)
FAPバインダーの生成及び調製は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2012/020006(A2)号に記載されている。CD40バインダーについては、クローン20H4.9のVH及びVL配列は、国際公開第2006/128103号の配列番号10及び配列番号16に従って得られた。
図1Aに示すように、2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(CD40)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(CD40)-Ckappa、(GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-Ckappa
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(CD40)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VL(CD40)-Ckappa、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-CH1。
2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(CD40)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(CD40)-Ckappa、(GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-CH1
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(CD40)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VL(CD40)-Ckappa、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-Ckappa。
2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(CD40)-CH1、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(CD40)-Ckappa、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-Ckappa。
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VL(CD40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VH(CD40)-CH1、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-CH1。
2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VL(CD40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VH(CD40)-CH1、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-Ckappa。
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VL(CD40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VH(CD40)-CH1、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-CH1。
2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VL(CD40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VH(CD40)-CH1、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-CH1。
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VL(CD40)-Ckappa、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VH(CD40)-CH1、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-Ckappa。
2つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした:
- 第1の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(CD40)-CH1_EE(K147E、K213E)、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcノブ、(G4S)2コネクタ、VL(CD40)-Ckappa_RK(E123R、Q124K)、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VH(FAP)-Ckappa。
- 第2の融合ポリペプチド(N末端からC末端まで):VH(CD40)-CH1_EE(K147E、K213E)、(G4S)2コネクタ、IgG1ヒンジ、Fcホール、(G4S)2コネクタ、VL(CD40)-Ckappa_RK(E123R、Q124K)、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号84)コネクタ、VL(FAP)-CH1。
FAP CD40抗体の特徴づけ
9.1 ヒトCD40への結合
二重特異性構築物がヒトCD40に結合する能力が、表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価された。すべてのSPR実験は、ランニングバッファーとしてHBS-EP(0.01MのHEPES pH7.4、0.15MのNaCl、3mMのEDTA、0.005%Surfactant P20、(Biacore)を使用して、25℃でBiacore T200(Biacore)上で行われた。結合は、1:3希釈中で300nMから始めて、30μl/分の流速で300秒間、溶液中にさまざまな濃度のヒトCD40細胞外ドメインを注入することによって測定された。解離フェーズは最大1200秒間監視され、試料溶液からランニングバッファーに切り替えることによってトリガーされた。表面は、30μl/分の流速でGlycine pH2.1溶液により60秒間洗浄することにより再生された。バルク屈折率の差は、ヤギ抗ヒトF(ab’)2表面から得られた応答を差し引くことにより補正された。ブランク注入も差し引かれた(=ダブルリファレンス)。みかけのKD及び速度論的パラメーターの計算のために、Langmuir 1:1モデルを使用した。見かけのKdは、BiacoreTM B4000評価ソフトウェア(バージョン1.1)を使用して計算された。
二重特異性FAP-OX40抗体のヒトFAPへの結合を、BIACORE T100機器(GE Healthcare)を使用した表面プラズモン共鳴によって調査した。捕捉システムの約12000共鳴ユニット(RU)(15μg/mlの抗ヒスチジン抗体;注文コード:28995056;GE Healthcare Bio-Sciences AB、スウェーデン)を、GE Healthcareによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって、pH4.5でCM5チップ(GE Healthcare BR-1005-30)上に結合させた。固定用のランニングバッファーはHBS-N pH7.4であった(10mMのHEPES、150mMのNaCl、pH7.4、GE Healthcare)。以下の速度論的特徴づけのためのランニングバッファーは、PBS-P pH7.4(20mMリン酸バッファー、2.7mMのKCl、137mMのNaCl、0.05%界面活性剤P20)であった。フローセルを25℃に、試料ブロックを12℃に設定し、ランニングバッファーで2回刺激した。組換えヒトFAPは、25μg/mlの溶液を5μl/分の流速で60秒間注入することにより捕捉された。結合は、1:2希釈において300nMから開始し、30μl/分の流速で120秒間ヒトOX40を注入することによって測定された。解離フェーズは最大720秒間監視され、試料溶液からランニングバッファーに切り替えることによってトリガーされた。表面を、10mMのグリシン、pH1.5により30μl/分の流速で60秒間洗浄することにより、再生した。バルク屈折率の差は、抗ヒスチジン表面から得られた応答を差し引くことにより補正された。ブランク注入も差し引かれた(=ダブルリファレンス)。KD及び速度論的パラメーターの計算のために、Langmuir 1:1モデルを使用した。
ヒトCD40とヒトFAPを同時に結合する能力も、BIACORE T100機器(GE Healthcare)を使用した表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価された。捕捉システムの約8000共鳴ユニット(RU)(20μg/mlの抗ヒトIgG(Fc);注文コード:BR100839;GE Healthcare Bio-Sciences AB、スウェーデン)を、GE Healthcareによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって、pH5.0でCM5チップ(GE Healthcare BR-1005-30)上に結合させた。ランニングバッファーは、PBS-P pH7.4(20mMリン酸バッファー、2.7mMのKCl、137mMのNaCl、0.05%のSurfactant P20)であった。フローセルを25℃に、試料ブロックを12℃に設定し、ランニングバッファーで2回刺激した。二重特異性抗体は、2μg/mlの溶液を5μl/分の流速で60秒間注入することによって捕捉された。結合は、第1の被分析物(それぞれヒトCD40又はヒトFAP)を30μl/分の流速で120秒間、注入することによって測定された。次に、第2の被分析物(それぞれヒトFAP又はヒトCD40)を、30μl/分の流速で120秒間注入された。解離フェーズは最大720秒間監視され、試料溶液からランニングバッファーに切り替えることによってトリガーされた。表面を、3MのMgCl2により10μl/分の流速で60秒間洗浄することにより、再生した。バルク屈折率の差は、抗ヒトIgG(Fc)表面から得られた応答を差し引くことにより補正された。ブランク注入も差し引かれた(=ダブルリファレンス)。KD及び速度論的パラメーターの計算のために、Langmuir 1:1モデルを使用した。すべてのFAP-CD40コントースボディは、両方の抗原に同時にかつ独立して結合することができた。
FAP標的化抗ヒトCD40結合分子の機能特性
10.1 抗原の供給源としてFAPコーティングされたDynabeads(登録商標)を使用した、FAP標的化抗ヒトCD40結合分子によるヒトB細胞の活性化
B細胞は、StiftungZurcherBlutspendedienst SRKから入手したバフィーコートから単離された。末梢血単核球(PBMC)を分離するために、50mLのバフィーコートを同量のPBS(gibco、カタログ番号10010023)で希釈した。50mLポリプロピレン製遠心分離管(TPP、カタログ番号91050)に15mLのLymphoprepTM(STEMCELL Technologies、カタログ番号07851)が供給され、管あたり25mLのバフィーコート溶液がLymphorepTMの上に注意深く層にされた。管を室温で24分間、2000rpmで、低加速で中断なしで遠心分離した。その後、PBMCを界面から収集し、PBSで3回洗浄し、10mLのPBS中に再懸濁し、Beckman CoulterセルカウンターAc・TTM5diff OV(Beckman Coulter、カタログ番号6605580)により細胞の種類と数を分析した。PBMCからのB細胞分離の前に、CD14陽性画分を、CD14マイクロビーズによるCD14陽性細胞の磁気標識(Miltenyi、カタログ番号130-050-201)、それに続くautoMACS(登録商標)Pro Separator(Miltenyi、カタログ番号130-092-545)による分離によって除去した。CD14陰性画分は、Miltenyi B細胞分離キットII(カタログ番号130-091-151)を用いたその後のB細胞分離とautoMACS(登録商標)分離のために使用された。10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)(life technologies、カタログ番号16140、ロット番号1797306A)を供給された、ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地1640(gibco、カタログ番号31870-025)、1%(v/v)ペニシリン/ストレプトマイシン(gibco、カタログ番号15070-063)、1%(v/v)L-グルタミン(gibco、カタログ番号25030-024)、1%(v/v)ピルビン酸ナトリウム(gibco、カタログ番号11360-039)、1%(v/v)MEM非必須アミノ酸(gibco、カタログ番号11140-035)及び50μMのβ-メルカプトエタノール(gibco、カタログ番号31350-010)からなるR10培地100μl中の1x105のB細胞を、96ウェル平底プレートのウェルごとに加えた。製造者のプロトコルに従って、StreptavidinDynabeads(登録商標)(ThermoFisher Scientific、カタログ番号:11205D)をビオチン化ヒトFAP(自社製、6.5x104ビーズの結合能:0.01μgのタンパク質)によりコーティングし、50μlのR10培地中で、ビーズ対細胞の比率が2:1でB細胞に加えた。対照として、コーティングされていないビーズをB細胞に加えた。
Claims (29)
- 2つの融合ポリペプチドからなり、第1の標的に特異的に結合することができる2つの抗原結合ドメインと、第2の標的に特異的に結合することができる1つの抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、
(a)第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第1の部分、スペーサードメイン、第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第2の部分、及び第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第1の部分を含む第1の融合ポリペプチドであって、ここで、
- スペーサードメインが、
少なくとも25個のアミノ酸残基を含み、
抗体ヒンジ領域又はそのC末端断片、及びアミノ酸置換L234A、L235A、及びP329G(Kabat EUインデックスによる番号付け)を含むIgG1 Fcドメインを含み、
ノブ・イントゥー・ホール法に従って、ホールを含み、
- 第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第1の部分が、スペーサードメインのN末端に、直接又は第1のペプチドリンカーを介して融合され、
- 第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第2の部分が、スペーサードメインのC末端に、直接又は第2のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
- 第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第1の部分が、第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第2の部分のC末端に、直接又は第3のペプチドリンカーを介して融合され、又は、第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第1の部分のN末端に、直接又は第3のペプチドリンカーを介して融合される、
第1の融合ポリペプチド、及び
(b)第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第1の部分、スペーサードメイン、第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第2の部分、及び第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第2の部分を含む第2の融合ポリペプチドであって、ここで、
- スペーサードメインが、
少なくとも25個のアミノ酸残基を含み、
抗体ヒンジ領域又はそのC末端断片、及びアミノ酸置換L234A、L235A、及びP329G(Kabat EUインデックスによる番号付け)を含むIgG1 Fcドメインを含み、
ノブ・イントゥー・ホール法に従って、ノブを含み、
- 第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第1の部分が、スペーサードメインのN末端に、直接又は第1のペプチドリンカーを介して融合され、
- 第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第2の部分が、スペーサードメインのC末端に、直接又は第2のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
- 第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第2の部分が、第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第2の部分のC末端に、直接又は第3のペプチドリンカーを介して融合され、又は、第1の標的に特異的に結合することができる第2の抗原結合ドメインの第1の部分のN末端に、直接又は第3のペプチドリンカーを介して融合される、
第2の融合ポリペプチド
を含み、
ここで、第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第1の部分と第2の部分が、互いに結合して第2の標的に特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し、ここで、第1の標的に特異的に結合することができる第1及び第2の抗原結合ドメインの第1の部分及び第2の部分が、互いに結合して環状融合ポリペプチドを形成し、かつ
ここで、第1の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第2の融合ポリペプチドのスペーサードメインは、ジスルフィド結合により互いに共有結合し、第1及び第2の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む、
二重特異性抗体。 - 第1の融合ポリペプチドにおいて、第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第1の部分が、第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第2の部分のC末端に、直接又は第3のペプチドリンカーを介して融合され、ここで、第2の融合ポリペプチドにおいて、第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第2の部分が、第1の標的に特異的に結合することができる第1の抗原結合ドメインの第2の部分のC末端に、直接又は第3のペプチドリンカーを介して融合される、請求項1に記載の二重特異性抗体。
- 第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第1の部分又は第2の部分を連結する第3のペプチドリンカーが、少なくとも15個のアミノ酸を含む、請求項1又は2に記載の二重特異性抗体。
- 第1の融合ポリペプチドが、第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの重鎖可変ドメインを含み、第2の融合ポリペプチドが、第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの抗体軽鎖可変ドメインを含み、又はその逆である、請求項1から3のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 第1の融合ポリペプチド及び第2の融合ポリペプチドの両方において、第1の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第1の部分が抗体重鎖Fab断片であり、第1の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第2の部分が抗体軽鎖Fab断片である、請求項1から4のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項1から5のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 第2の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項1から6のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- FAPに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
(a)(i)配列番号1のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)、並びに(iv)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)、又は
(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)、並びに(iv)配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)
を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - FAPに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
(a)(i)配列番号1のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、かつ配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHFAP)、及び(iv)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含み、かつ配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLFAP)、又は
(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、かつ配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHFAP)、及び(iv)配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含み、かつ配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLFAP)
を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 第1の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、OX40に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項1から9のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- OX40に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
(a)(i)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(b)(i)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(c)(i)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(d)(i)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号24のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(e)(i)配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(f)(i)配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(g)(i)配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び(iv)配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLOX40)
を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - OX40に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
(a)配列番号40のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号41のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(b)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号43のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(c)配列番号44のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号45のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(d)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(e)配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号49のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(f)配列番号50のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号51のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)、又は
(g)配列番号52のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)
を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - OX40に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、(a)配列番号40のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHOX40)、及び配列番号41のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLOX40)を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 第1の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、4-1BBに特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項1から9のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 4-1BBに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、(i)配列番号135のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号136のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号137のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VH4-1BB)、並びに(iv)配列番号138のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号139のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号140のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VL4-1BB)を含む、請求項1から9、又は14のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 4-1BBに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号141のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH4-1BB)、及び配列番号142のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL4-1BB)を含む、請求項1から9、14、及び15のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 第1の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、CD40に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項1から9のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- CD40に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、(i)配列番号147のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号148のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号149のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD40)、並びに(iv)配列番号150のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号151のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号152のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD40)を含む、請求項1から9、及び17のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- CD40に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号153のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD40)、及び配列番号154のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD40)を含む、請求項1から9、17、及び18のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 第1の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、CD40に特異的に結合することができる抗原結合ドメインであり、
(i)配列番号167、配列番号168、配列番号169、及び配列番号170からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD40)、並びに配列番号171、配列番号172、配列番号173、及び配列番号174からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD40)、又は
(ii)配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号178、配列番号179、及び配列番号180からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD40)、並びに配列番号181、配列番号182、配列番号183、及び配列番号184からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD40)
を含む、請求項1から9、17、及び18のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 請求項1から20のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードする単離された核酸。
- 請求項21に記載の核酸を含むベクター又は宿主細胞。
- 二重特異性抗体の発現に適した条件下で、請求項22に記載の宿主細胞を培養することを含む、二重特異性抗体を産生する方法。
- 請求項1から20のいずれか一項に記載の二重特異性抗体及び薬学的に許容される添加剤を含む薬学的組成物。
- 医薬としての使用のための、請求項1から20のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項24に記載の薬学的組成物。
- がん又は感染症の治療における使用のための、請求項1から20のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項24に記載の薬学的組成物。
- (i)T細胞応答を刺激することにおける使用のための医薬、
(ii)活性化T細胞の生存を支持することにおける使用のための医薬、
(iii)感染症の治療における使用のための医薬、
(iv)がんの治療における使用のための医薬、
(v)がんの進行を遅延させることにおける使用のための医薬、又は
(vi)がんに罹患する患者の生存期間を延長することにおける使用のための医薬
の製造における、請求項1から20のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項24に記載の薬学的組成物の使用。 - 請求項1から20のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項24に記載の薬学的組成物を含む、がん又は感染症を有する個体を治療するための医薬。
- 追加の治療剤をさらに含む、請求項28に記載の医薬。
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