CN111182944B - 双特异性2+1 Contorsbody - Google Patents

双特异性2+1 Contorsbody Download PDF

Info

Publication number
CN111182944B
CN111182944B CN201880063441.2A CN201880063441A CN111182944B CN 111182944 B CN111182944 B CN 111182944B CN 201880063441 A CN201880063441 A CN 201880063441A CN 111182944 B CN111182944 B CN 111182944B
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
binding
antigen
domain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201880063441.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111182944A (zh
Inventor
M·阿曼
C·费拉拉·科勒
R·弗鲁里
G·乔治
S·格雷-理查兹
A·哈斯
F·黑森
S·伊姆霍夫-荣格
C·克莱恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN111182944A publication Critical patent/CN111182944A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111182944B publication Critical patent/CN111182944B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

本发明涉及新颖的由两条融合多肽组成的双特异性抗体,其包含两个能够特异性结合第一靶物的抗原结合域和一个能够特异性结合第二靶物的抗原结合域,和生成这些分子的方法和使用它们的方法。

Description

双特异性2+1 Contorsbody
发明领域
本发明涉及新颖的由两条融合多肽组成的双特异性抗体(Contorsbody)，其包含两个能够特异性结合第一靶物的抗原结合域和一个能够特异性结合第二靶物的抗原结合域,及生成这些分子的方法和使用它们的方法。
发明背景
自Koehler和Milstein在1974年开发出第一批单克隆抗体起，已经付出了很多努力来开发适合人类治疗的抗体。第一批变成可用的单克隆抗体是在小鼠和大鼠中开发的。这些抗体在用于人类治疗时由于抗啮齿动物抗体而引起不想要的副作用。已经付出了很多努力来减轻或甚至消除此类不想要的副作用。在过去几年中越来越多的人单克隆抗体或人源化单克隆抗体已经进入市场。
双特异性抗体已经变得对于诊断和治疗应用越来越受关注。虽然天然抗体是单特异性的,但是双特异性抗体识别相同或不同抗原上的两种不同表位。在过去几年里,已经开发出很多种新的抗体型式。精致的分子设计和基因工程的应用解决了与双特异性抗体的形成有关的许多技术问题，诸如稳定性,溶解性和赋予药物特性且在术语“可开发性”下汇总的的其它参数。另外,要生成的双特异性抗体的不同期望特征(即目标产物概况)使之必须获得一组多样的抗体型式。这些型式可以在大小,它们的结合模块的几何学,效价,柔性以及它们的药动学特性方面不同(Brinkmann U.and Kontermann R.E.,MABS 2017,9(2),182-212)。
然而,似乎对于所有需求没有一种最佳型式，而且仍然有潜力优化自野生型四链Y形抗体型式衍生的抗体型式。对于作为药学产品的用途,双特异性抗体需要以可再现的方式大量生成,优选以高产率生成。越是复杂的组成(例如3-4链较之2链IgG)确实常常需要越是广泛的表达系统优化。而且,不想要的副产物的存在或缺失可能是非常重要的。
发明概述
本发明涉及一种双特异性抗体，特别是由两条链组成的，尽管它们包含三个抗原结合域。本发明的抗体在抗原结合域的空间取向方面不同于IgG型式的经典抗体。
本发明提供一种双特异性抗体，由两条融合多肽组成且包含两个能够特异性结合第一靶物的抗原结合域和一个能够特异性结合第二靶物的抗原结合域,其中
(a)第一融合多肽包含能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第一部分,间隔物域,能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第二部分和能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第一部分,其中
-间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,
-能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第一部分直接或经由第一肽接头融合至间隔物域的N端,
-能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第二部分直接或经由第二肽接头融合至间隔物域的C端,且
-能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第一部分直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第二部分的C端或直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第一部分的N端,且
(b)第二融合多肽包含能够特异性结合第一靶物的第二抗原结合域的第一部分,间隔物域,能够特异性结合第一靶物的第二抗原结合域的第二部分和能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第二部分,其中
-间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,
-能够特异性结合第一靶物的第二抗原结合域的第一部分直接或经由第一肽接头融合至间隔物域的N端,
-能够特异性结合第一靶物的第二抗原结合域的第二部分直接或经由第二肽接头融合至间隔物域的C端,且
-能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第二部分直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第二抗原结合域的第二部分的C端或直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第二抗原结合域的第一部分的N端,
其中能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第一部分和第二部分彼此联合以形成能够特异性结合第二靶物的抗原结合域且其中能够特异性结合第一靶物的第一和第二抗原结合域的第一部分和第二部分彼此联合以形成环状融合多肽,且
其中第一融合多肽的间隔物域和第二融合多肽的间隔物域通过二硫键彼此共价联合且包含促进第一和第二融合多肽联合的修饰。
在一个方面,提供的是如本文中前面定义的双特异性抗体,其中在第一融合多肽中能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第一部分直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第二部分的C端且其中在第二融合多肽中能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第二部分直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第二部分的C端。
在另一个方面,提供的是如本文中前面定义的双特异性抗体,其中在第一融合多肽中能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第一部分直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第一部分的N端且其中在第二融合多肽中能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第二部分直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第一部分的N端。
在一个方面,提供的是如本文中前面定义的双特异性抗体,其中连接能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第一部分或第二部分的第三肽接头包含至少15个氨基酸。在一个方面,连接能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第一部分的第三肽接头和连接能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第二部分的第三肽接头是同一的。在一个方面,第三肽接头包含15至25个氨基酸。在一个特定方面,第三肽接头包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。
在一个方面,本发明提供如本文中前面定义的双特异性抗体,其中第一融合多肽包含能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的重链可变域且第二融合多肽包含能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的抗体轻链可变域或反之。在一个特定方面,抗原结合域的第一部分是抗体重链Fab片段且抗原结合域的第二部分是抗体轻链Fab片段或反之。在一个方面,抗原结合域的第一部分和抗原结合域的第二部分通过二硫键彼此共价联合。
如此,在一个方面,抗原结合域的第一部分是抗体重链Fab片段(VH-CH1)且抗原结合域的第二部分是抗体轻链Fab片段(VL-Cκ)。在另一个方面,抗原结合域的第一部分是抗体轻链Fab片段且抗原结合域的第二部分是抗体重链Fab片段。在另一个方面,抗原结合域的第一部分是包含VH-Cκ的抗体交叉Fab片段且抗原结合域的第二部分是包含VL-CH1的抗体交叉Fab片段。在又一个方面,抗原结合域的第一部分是包含VL-CH1的抗体交叉Fab片段且抗原结合域的第二部分是包含VH-Cκ的抗体交叉Fab片段。
如上文描述的,双特异性抗体由第一和第二融合多肽组成,二者均包含间隔物域,第一融合多肽的间隔物域和第二融合多肽的间隔物域通过二硫键彼此共价联合且包含促进第一和第二融合多肽联合的修饰。间隔物域包含至少25个氨基酸。
在本发明的一个方面,间隔物域包含抗体铰链区或其(C端)片段和抗体CH2域或其(N端)片段。在另一个方面,间隔物域包含抗体铰链区或其片段,抗体CH2域,和抗体CH3域或其片段。而且,第一融合多肽的间隔物域和第二融合多肽的间隔物域包含促进第一和第二融合多肽联合的修饰。在一个特定方面,依照节入穴方法第一融合多肽的间隔物域包含穴且第二融合多肽的间隔物域包含节。在又一个方面,本发明包含一种双特异性抗体,其中间隔物域包含抗体铰链区或其片段和IgG1 Fc域。特别地,IgG1 Fc域包含降低对Fc受体,特别是Fcγ受体的结合的一处或多处氨基酸替代。更加特别地,IgG1 Fc域包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一些方面,提供的是一种双特异性抗体，其中一个能够特异性结合第二靶物的抗原结合域是能够特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合域。特别地,肿瘤相关抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)。在一个方面,提供的是一种双特异性抗体,其中能够特异性结合第二靶物的抗原结合域是能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)的抗原结合域。
在一些方面,能够特异性结合FAP的抗原结合域包含
(a)重链可变区(VHFAP)，包含(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLFAP)，包含(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3,或
(b)重链可变区(VHFAP)，包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLFAP)，包含(iv)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3。
更加特别地,能够特异性结合FAP的抗原结合域包含
(a)包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)，和包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)，或
(b)包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)，和包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)。
在一些方面,提供的是一种双特异性抗体，其中能够特异性结合第一靶物的抗原结合域是能够特异性结合TNF受体,特别是共刺激性TNF受体的抗原结合域。特别地,共刺激性TNF受体是OX40。在一个方面,提供的是一种双特异性抗体,其中能够特异性结合第一靶物的抗原结合域是能够特异性结合OX40的抗原结合域。特别地,本发明的双特异性抗体包含两个能够特异性结合OX40的抗原结合域。
在一些方面,能够特异性结合OX40的抗原结合域包含
(a)重链可变区(VHOX40),包含(i)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLOX40),包含(iv)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-L3,或
(b)重链可变区(VHOX40),包含(i)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLOX40),包含(iv)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-L3,或
(c)重链可变区(VHOX40),包含(i)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLOX40),包含(iv)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-L3,或
(d)重链可变区(VHOX40),包含(i)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLOX40),包含(iv)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L3,或
(e)重链可变区(VHOX40),包含(i)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLOX40),包含(iv)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L3,或
(f)重链可变区(VHOX40),包含(i)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLOX40),包含(iv)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L3,或
(g)重链可变区(VHOX40),包含(i)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLOX40),包含(iv)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-L3。
特别地,能够特异性结合OX40的抗原结合域包含重链可变区(VHOX40),包含(i)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLOX40),包含(iv)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些方面,能够特异性结合OX40的抗原结合域包含
(a)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40)和包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40),或
(b)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40)和包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40),或
(c)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40)和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40),或
(d)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40)和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40),或
(e)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40)和包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40),或
(f)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40)和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40),或
(g)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40)和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40)。
在一个特定方面,能够特异性结合OX40的抗原结合域包含(a)包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40),和包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40)。
特别地,本发明提供一种双特异性抗体,其中该双特异性抗体包含
(a)包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽，和包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,
(b)包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,
(c)包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:59的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,
(d)包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,
(e)包含与SEQ ID NO:62的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,
(f)包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,或
(g)包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:67的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽。
而且,本发明提供一种双特异性抗体,其中双特异性抗体包含
(a)包含与SEQ ID NO:116的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:117的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,
(b)包含与SEQ ID NO:118的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:119的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,
(c)包含与SEQ ID NO:120的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:121的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,
(d)包含与SEQ ID NO:122的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:123的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,
(e)包含与SEQ ID NO:124的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:125的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,
(f)包含与SEQ ID NO:126的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,包含与SEQ ID NO:127的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和与SEQ ID NO:128的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的轻链,
(g)包含与SEQ ID NO:129的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:130的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,
(h)包含与SEQ ID NO:131的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:132的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,或
(i)包含与SEQ ID NO:133的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:134的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽。
在一些方面,提供的是一种双特异性抗体，其中该共刺激性TNF受体是4-1BB。在一个方面,提供的是一种双特异性抗体,其中能够特异性结合第一靶物的抗原结合域是能够特异性结合4-1BB的抗原结合域。特别地,本发明的双特异性抗体包含两个能够特异性结合4-1BB的抗原结合域。
在一些方面,能够特异性结合4-1BB的抗原结合域包含重链可变区(VH4-1BB),包含(i)包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VL4-1BB),包含(iv)包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的CDR-L3。在一个方面,能够特异性结合4-1BB的抗原结合域包含包含与SEQ ID NO:141的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH4-1BB),和包含与SEQ ID NO:142的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL4-1BB)。
特别地,本发明提供一种双特异性抗体,其中双特异性抗体包含
(a)包含与SEQ ID NO:143的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:144的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,或
(b)包含与SEQ ID NO:145的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:146的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽。
在一些方面,提供的是一种双特异性抗体，其中共刺激性TNF受体是CD40。在一个方面,提供的是一种双特异性抗体,其中能够特异性结合第一靶物的抗原结合域是能够特异性结合CD40的抗原结合域。特别地,本发明的双特异性抗体包含两个能够特异性结合CD40的抗原结合域。
在一些方面,能够特异性结合CD40的抗原结合域包含重链可变区(VHCD40),包含(i)包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLCD40),包含(iv)包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的CDR-L3。在一个方面,能够特异性结合CD40的抗原结合域包含包含与SEQ ID NO:153的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VHCD40),和包含与SEQ ID NO:154的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VLCD40)。
在另一个方面,能够特异性结合第一靶物的抗原结合域是能够特异性结合CD40的抗原结合域，其包含
(i)包含选自由SEQ ID NO:167,SEQ ID NO:168,SEQ ID NO:169和SEQ ID NO:170组成的组的氨基酸序列的重链可变区(VHCD40),和包含选自由SEQ ID NO:171,SEQ ID NO:172,SEQ ID NO:173,和SEQ ID NO:174组成的组的氨基酸序列的轻链可变区(VLCD40),或
(ii)包含选自由SEQ ID NO:175,SEQ ID NO:176,SEQ ID NO:177,SEQ ID NO:178,SEQ ID NO:179和SEQ ID NO:180组成的组的氨基酸序列的重链可变区(VHCD40),和包含选自由SEQ ID NO:181,SEQ ID NO:182,SEQ ID NO:183,和SEQ ID NO:184组成的组的氨基酸序列的轻链可变区(VLCD40)。
特别地,本发明提供一种双特异性抗体,其中双特异性抗体包含
(a)包含与SEQ ID NO:155的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:156的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,
(b)包含与SEQ ID NO:157的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:158的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,
(c)包含与SEQ ID NO:159的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:160的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,
(d)包含与SEQ ID NO:161的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:162的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,
(e)包含与SEQ ID NO:163的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:164的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,或
(f)包含与SEQ ID NO:165的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽,和包含与SEQ ID NO:166的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的融合多肽。
本发明还提供编码本发明的双特异性抗体的分离的核酸。还提供的是包含本发明的核酸的表达载体，而且提供了包含本发明的分离的核酸或表达载体的宿主细胞。还包括的是一种生成双特异性抗体的方法,其包括在适合于双特异性抗体表达的条件下培养本发明的宿主细胞。该方法还可以包括分离双特异性抗体的步骤。
本发明还提供一种药学组合物，其包含本发明的双特异性抗体和至少一个药学可接受赋形剂。
本发明还提供本发明的双特异性抗体或本发明的药学组合物,其用作药物。更加特别地,还提供的是本发明的双特异性抗体，其用于治疗癌症或传染病。特别地,提供本发明的双特异性抗体，其用于治疗癌症。
在又一个方面,提供的是本发明的双特异性抗体或本发明的药学组合物在制造用于下述各项的药物中的用途：
(i)刺激T细胞应答,
(ii)支持激活的T细胞的存活,
(iii)治疗感染,
(iv)治疗癌症,
(v)延迟癌症进展,或
(vi)延长罹患癌症的患者的存活。
本发明还提供一种治疗具有癌症或传染病的个体的方法，其包括对个体施用有效量的本发明的双特异性抗体或本发明的药学组合物。
本发明还提供本发明的的双特异性抗体或本发明的药学组合物制造用于上调或延长细胞毒性T细胞活性的药物的用途。还提供的是一种在具有癌症的个体中上调或延长细胞毒性T细胞活性的方法,其包括对个体施用有效量的本发明的双特异性抗体或本发明的药学组合物。在依照本发明的各个方面的一些实施方案中，个体是哺乳动物,特别是人。
附图简述
图1A,1B,1C和1D显示例子,如何能组装本发明的Contorsbody。在图1A中,Contorsbody由第一融合多肽和第二融合多肽组成,第一融合多肽包含能够特异性结合第一靶物的Fab的第一半(重链Fab),经由肽接头(黑色线)连接至间隔物域,经由肽接头(黑色线)连接至能够特异性结合第一靶物的Fab的第二半(轻链Fab),进一步连接至能够特异性结合第二靶物的交叉Fab的第一半(VH-Cκ)(自N至C),第二融合多肽包含能够特异性结合第一靶物的Fab的第一半(重链Fab),经由肽接头(黑色线)连接至间隔物域,经由肽接头(黑色线)连接至能够特异性结合第一靶物的Fab的第二半(轻链Fab),进一步连接至能够特异性结合第二靶物的交叉Fab的第二半(VL-CH1)(自N至C)。两个间隔物域彼此不同且包含促进第一和第二融合多肽联合的修饰。这种类型的Contorsbody的一个例子是CD134-0093(见实施例2.1)。在图1B中,Contorsbody由第一融合多肽和第二融合多肽组成,第一融合多肽包含能够特异性结合第一靶物的交叉Fab的第一半(VH-Cκ),经由肽接头(黑色线)连接至间隔物域,经由肽接头(黑色线)连接至能够特异性结合第一靶物的交叉Fab的第二半(VL-CH1),进一步连接至能够特异性结合第二靶物的Fab的第一半(轻链Fab)(自N至C),第二融合多肽包含能够特异性结合第一靶物的交叉Fab的第一半(VH-Cκ),经由肽接头(黑色线)连接至间隔物域,经由肽接头(黑色线)连接至能够特异性结合第一靶物的交叉Fab的第二半(VL-CH1),进一步连接至能够特异性结合第二靶物的Fab的第二半(重链Fab)(自N至C)。两个间隔物域彼此不同且包含促进第一和第二融合多肽联合的修饰。这种类型的Contorsbody的一个例子是CD134-0094(见实施例2.2)。在图1C中,Contorsbody由第一融合多肽和第二融合多肽组成,第一融合多肽包含能够特异性结合第一靶物的Fab的第一半(VL-Cκ),经由肽接头(黑色线)连接至间隔物域,经由肽接头(黑色线)连接至能够特异性结合第一靶物的Fab的第二半(VH-CH1),进一步连接至能够特异性结合第二靶物的交叉Fab的第一半(VH-Cκ)(自N至C),第二融合多肽包含能够特异性结合第一靶物的Fab的第一半(VL-Cκ),经由肽接头(黑色线)连接至间隔物域,经由肽接头(黑色线)连接至能够特异性结合第一靶物的Fab的第二半(VH-CH1),进一步连接至能够特异性结合第二靶物的交叉Fab的第二半(VL-CH1)(自N至C)。两个间隔物域彼此不同且包含促进第一和第二融合多肽联合的修饰。这种类型的Contorsbody的一个例子是P1AE0821(见实施例2.7)。在图1D中,Contorsbody由第一融合多肽和第二融合多肽组成,第一融合多肽包含能够特异性结合第二靶物的交叉Fab的第一半(VH-Cκ),经由肽接头(黑色线)连接至能够特异性结合第一靶物的交叉Fab的第一半(VH-Cκ),进一步经由肽接头(黑色线)连接至间隔物域,经由肽接头(黑色线)连接至能够特异性结合第一靶物的交叉Fab的第二半(VL-CH1)(自N至C),第二融合多肽包含能够特异性结合第二靶物的交叉Fab的第一半(VL-CH1),经由肽接头(黑色线)连接至能够特异性结合第一靶物的交叉Fab的第一半(VH-Cκ),进一步经由肽接头(黑色线)连接至间隔物域,经由肽接头(黑色线)连接至能够特异性结合第一靶物的交叉Fab的第二半(VH-CH1)(自N至C)。两个间隔物域彼此不同且包含促进第一和第二融合多肽联合的修饰。这种类型的Contorsbody的一个例子是P1AE2735(见实施例2.14)。
图1E是Contorsbody CD134-0093(实施例2.1)的组装结构的示意图。
在图1F中显示Contorsbody CD134-0094(实施例2.2)的组装结构的示意图。
图1G是Contorsbody P1AE0085和P1AE0086(实施例2.3和2.4)的组装结构的示意图。能够特异性结合第二靶物的抗原结合域(交叉Fab)经由改变分子的几何学的更长肽接头连接。
图1H是Contorsbody P1AE0087(实施例2.5)和Contorsbody P1AE0839(实施例2.6)的组装结构的示意图。在这种情况中能够特异性结合第二靶物的抗原结合域是Fab且两个能够特异性结合第一靶物的抗原结合域均是交叉Fab。
在图1I中显示Contorsbody P1AE0821(Contorsbody 11,实施例2.7)的组装结构的示意图。
图1J是Contorsbody P1AE1122(Contorsbody 1,实施例2.8)的组装结构的示意图。
在图1K中显示Contorsbody P1AE1887(Contorsbody 3,实施例2.10)的组装结构的示意图。
在图1L中显示Contorsbody P1AE2254(Contorsbody 5,实施例2.12)的组装结构的示意图。在分别与OX40的VL和VH融合的CH和Cκ中,引入氨基酸突变(所谓的带电荷残基)以阻止Bence Jones蛋白的生成和进一步推动正确配对。
图1M是Contorsbody P1AE2340(Contorsbody 6,实施例2.13)的组装结构的示意图。在这种情况中分子由两个融合蛋白和轻链构成。
图1N是Contorsbody P1AE2735(Contorsbody 8,实施例2.14)的组装结构的示意图。
图1O是具有对OX40的二价结合和对FAP的单价结合的2+1 OX40 x FAP双特异性抗体的示意图(阳性对照分子)。生成具有相同结构的阴性对照分子,其中FAP结合域用DP47种系替换(2+1 OX40 x DP47抗体)。
图1P是具有对OX40的四价结合和对FAP的单价结合的4+1 OX40 x FAP双特异性抗体的示意图。这些对照分子在实施例2.18中更加详细地描述。
在图2A,2B,2C和2D中显示OX40 x FAP双特异性抗体对激活的CD4+和CD8+T细胞(分别是图2A和2C)和静息的CD4+和CD8+T细胞(分别是图2B和2D)的结合。四价4+1 OX40 xFAP(4B9)双特异性抗体显示对CD4+和CD8+T细胞的最强结合。2+1型式2+1 OX40(49B4)x FAP(28H1)和2+1 OX40(49B4)x DP47显示中等结合。Contorsbody CD134-0093指示比2+1型式更强的结合,而Contorsbody CD134-0094结合不太强。对CD4+T细胞的结合比对CD8+T细胞的强得多。阴性对照DP47 hu IgG1 P329G LALA并不结合CD4+或CD8+T细胞。无一分子结合静息的CD4+或CD8+T细胞(图2B和2D)。
图2E,2F,2G和2H显示用Contorsbody P1AE0085,P1AE0086和P1AE0087获得的结果。所有2+1型式OX40(49B4)x FAP(28H1),OX40(49B4)x FAP(4B9)和OX40(49B4)x DP47均显示相似的较好的对激活的CD4+和CD8+T细胞的结合(分别是图2E和2G),而对于Contorsbody分子,尤其是对于Contorsbody P1AE0087,对OX40的结合部分受损。正如预期的,DP47 hu IgG1 P329G LALA并不结合CD4+或CD8+T细胞。对于任何测试的分子没有观察到对静息的CD4+或CD8+T细胞的结合(分别是图2F和2H)。
对人FAP表达性肿瘤细胞的结合在图3A,3B,3C和3D中显示。在第一实验中,与对照分子比较Contorsbody CD134-0093和CD134-0094。对WM266-4(FAP+阳性)和A549NLR(FAP阴性)肿瘤细胞的结合分别在图3A和3B中显示。所有OX40 x FAP双特异性抗体均有效结合人FAP表达性靶细胞。四价4+1OX40 x FAP(4B9,对FAP的高亲和力)双特异性抗体结合FAP+细胞最强,接着是Contorsbody CD134-0093,Contorsbody CD1334-0094和2+1 OX40(49B4)xFAP(28H1)双特异性抗体。非靶向性2+1 OX40(49B4)x DP47和阴性对照(DP47 hu IgG1P329G LALA)并不结合任何FAP+细胞。图3C和3D显示Contorsbody P1AE0085,P1AE0086和P1AE0087对NIH/3T3huFAP克隆19(FAP+)(图3C)和A549NLR(FAP-)肿瘤细胞(图3D)的结合。所有FAP靶向性抗OX40抗体均有效结合人FAP表达性靶细胞。Contorsbody分子的结合与它们的相应对照相比略微受损。再次,非靶向性2+1 OX40(49B4)x DP47和阴性对照(DP47 huIgG1 P329G LALA)显示不结合FAP+细胞。
在图4A,4B,4C,4D,4E和4F中显示不同类型的交联的NFκB激活。使用FAP表达性细胞(NIH/3T3 huFAP克隆19)作为交联剂,FAP靶向性2+1 OX40(49B4)x FAP(28H1)构建物诱导最强的NFκB激活,接着是Contorsbody CD134-0093和CD134-0094,而CD134-0094显示比CD134-0093略微更强的激活。非靶向性和因此不交联的2种非靶向性2+1 OX40(49B4)xDP47诱导弱NFκB激活(图4A)。在使用抗hu IgG1 Fcγ特异性二抗作为交联剂时,两种2+1构建物OX40(49B4)x FAP(28H1)和OX40(49B4)x DP47行为相似。Contorsbody CD134-0093和CD134-0094同样运行相似,但是比2+1构建物更低(图4B)。通过不使用交联剂获得最少NFκB激活。2+1构建物OX40(49B4)x FAP(28H1)和OX40(49B4)x DP47显示适度NFκB激活,接着是甚至效力更少的Contorsbody CD134-0093和CD134-0094。DP47 hu IgG1 P329G LALA并不诱导任何NFκB激活(图4C)。在有不同类型的交联的情况下Contorsbody P1AE0085,P1AE0086和P1AE0087诱导NFκB激活的能力在图4D至4F中显示。在交联缺失下,在最高抗体浓度只能检测到弱信号(图4D)。在通过人FAP表达性细胞交联时,三种Contorsbody分子诱导与FAP靶向性2+1型式OX40(49B4)x FAP(28H1)和OX40(49B4)x FAP(4B9)非常相似的NFκB激活(图4E)。在二抗交联存在下,所有三种Contorsbody分子均展示比2+1对照分子略微更低的NFκB激活(图4F)。DP47 hu IgG1 P329G LALA并不诱导任何NFκB激活。
OX40介导的亚最佳TCR触发的静息的人PBMC的共刺激和通过细胞表面FAP的高交联,在图5A,5B,5C,5D,5E和5F中显示。图5A和5B分别显示亚最佳CD3刺激后的FSC-A(前向侧散射(FSC)脉冲的“区域”),分别是CD4和CD8 T细胞的大小,如通过FACS分析作为以小角度散射的光的强度测量的。FAP靶向性2+1构建物OX40(49B4)x FAP(28H1)显示大小的中等增大,而Contorsbody CD134-0093指示更强增大。非靶向性2+1 OX40(49B4)x DP47,Contorsbody CD134-0094和阴性对照(DP47 hu IgG1 P329G LALA)并不改变CD4或CD8 T细胞的大小。图5C和5D使用表面标志物CD25显示CD4和CD8 T细胞的激活。对于CD4 T细胞(图5C),Contorsbody CD134-0093和CD134-0094展现最高激活,接着是效力低一些的靶向性2+1 OX40(49B4)x FAP(28H1)。非靶向性OX40(49B4)x DP47和阴性对照在基线修正之后并不显示任何激活。对于CD8 T细胞(图5D),Contorsbody CD134-0094展现与2+1 OX40(49B4)xFAP(28H1)和CD134-0093相比更强的激活。图5E和5F显示激活后下调的IL-7Rα(CD127)。Contorsbody CD134-0093显示CD4和CD8 T细胞的最强CD127下调,接着是靶向性2+1 OX40(49B4)x FAP(28H1)和Contorsbody CD134-0094。
图6图示CD4和CD8 T细胞上FSC-A和CD25的标准化曲线下面积(AUC)值。实心符号代表CD4 T细胞,空心符号代表CD8 T细胞。所有值针对Contorsbody CD134-0093的最高AUC值(＝100％)标准化。非靶向性2+1构建物OX40(49B4)x DP47仅仅显示最低限度的CD4和CD8T细胞激活,而FAP靶向性2+1构建物OX40(49B4)x FAP(28H1)关于CD4和CD8 T细胞上的FSC-A和CD25展现更高效力(标准化值在60和100之间),但是效力不如CD134-0093。对于Contorsbody CD134-0094,只有CD4和CD8 T细胞的CD25 MFI AUC值显示与CD134-0093相似的激活。
Contorsbody P1AE0085,P1AE0086和P1AE0087对OX40介导的亚最佳TCR触发的PBMC的共刺激和通过细胞表面FAP的高交联的影响在图7A,7B,7C和7D中显示。图7A和7B分别显示亚最佳CD3刺激后的FSC-A,分别是CD4和CD8 T细胞的大小。图7C和7D分别使用表面标志物CD25的表达显示CD4和CD8 T细胞的激活。所有FAP靶向性分子(对照和所有三种Contorsbody分子)均诱导CD4和CD8 T细胞二者上前向侧散射区域和CD25表达的剂量依赖性升高。非靶向性2+1构建物OX40(49B4)x DP47和阴性对照(DP47 hu IgG1 P329G LALA)在基线修正之后并不显示任何激活。
在图8A,8B,8C和8D中显示不同OX40 x FAP Contorsbody对激活的CD4+T细胞的结合。使用非靶向性2+1构建物OX40(49B4)x DP47作为阳性对照,并使用DP47 hu IgG1 P329GLALA作为阴性对照。图8A显示Contorsbody 1(P1AE1122),Contorsbody 2(P1AE1942)和Contorsbody 3(P1AE1887)的结合,而图8B显示Contorsbody 4(P1AE1888),Contorsbody 5(P1AE2254)和Contorsbody 6(P1AE2340)的结合。Contorsbody 7(P1AE0086)和Contorsbody 8(P1AE2735)的结合在图8C中显示,而Contorsbody 9(P1AE2743)和Contorsbody 10(P1AE2762)的结合在图8D中显示。在图9A,9B,9C和9D中分别显示测试的Contorsbody无一结合静息的CD4 T细胞。在图10A,10B,10C和10D中显示相同OX40 x FAPContorsbody对激活的CD8+T细胞的结合。使用非靶向性2+1构建物OX40(49B4)x DP47作为阳性对照,并使用DP47 hu IgG1 P329G LALA作为阴性对照。在图11A,11B,11C和11D中分别显示测试的Contorsbody无一结合静息的CD8 T细胞。对激活的或静息的CD4+T细胞的结合的曲线下面积值的汇总在图12A中显示,而对激活的或静息的CD8+T细胞的结合在图12B中显示。
Contorsbody 1至10对人FAP表达性肿瘤细胞的结合分别在图13A,13B,13C和13D和图14A,14B,14C和14D中显示。对NIH/3T3-huFAP克隆19(FAP+)肿瘤细胞(FAP+阳性)的结合分别在图12A至12D中显示。图13A显示Contorsbody 1(P1AE1122),Contorsbody 2(P1AE1942)和Contorsbody 3(P1AE1887)的结合,而图13B显示Contorsbody 4(P1AE1888),Contorsbody 5(P1AE2254)和Contorsbody 6(P1AE2340)的结合。Contorsbody 7(P1AE0086)和Contorsbody 8(P1AE2735)的结合在图13C中显示,而Contorsbody 9(P1AE2743)和Contorsbody 10(P1AE2762)的结合在图13D中显示。所有OX40x FAP双特异性Contorsbody均有效结合人FAP表达性靶细胞。Contorbody 8(图12C)结合FAP+细胞最强,接着是Contorbody 10(图12D)和Contorbody 6(图12B),比2+1双特异性抗体OX40(49B4)xFAP(4B9)强得多。非靶向性2+1构建物OX40(49B4)x DP47和阴性对照(DP47 hu IgG1 P329GLALA)并不结合任何FAP+细胞。相应的Contorsbody 1至10对A549NLR(FAP-阴性)肿瘤细胞的结合在图14A至14D中显示。无一FAP靶向性分子(Contorsbody 1至10或2+1双特异性抗体OX40(49B4)x FAP(4B9))能够结合FAP-靶细胞。
在图15A,15B,15C和15D中显示在有交联的情况下Contorsbody 1至11的NFκB激活。使用FAP表达性细胞(NIH/3T3 huFAP克隆19)作为交联剂,所有Contorbody的NFκB激活是相当的,其中Contorbody 11(P1AE0821)效力最小。非靶向性且因此不交联的2种非靶向性2+1 OX40(49B4)x DP47抗体(7718)诱导弱NFκB激活,而双特异性OX40(49B4)x FAP(4B9)抗体(7719)引起最高的NFκB激活。DP47 hu IgG1 P329G LALA(8105)并不诱导任何NFκB激活。在没有通过FAP的交联的情况下的NFκB激活在图16A,16B,16C和16D中显示。在交联缺失下,在更高抗体浓度只能检测到弱信号。非靶向性2+1 OX40(49B4)x DP47抗体(7718)显示适度NFκB激活,接着是Contorbody 7(图16C)。其它Contorbody诱导微小或零水平。阴性对照(8105)并不诱导任何NFκB激活。在有和没有用FAP+细胞的交联的情况下HeLa细胞中NFκB激活的标准化曲线下面积值在图17中汇总。阴性对照(8105)在两种情况中均不诱导任何NFκB激活,而非靶向性2+1 OX40(49B4)x DP47抗体(7718)在两种情况中均仅仅显示最低限度的激活。双特异性OX40(49B4)x FAP(4B9)抗体(7719)展现更高水平的激活,接着是Contorbody 8,9和10。对Contorbody 11(P1AE0821)观察到更低的水平。
Contorsbody 7,8,9和10的OX40介导的亚最佳TCR触发的静息的人PBMC的共刺激和通过细胞表面FAP的高交联在图18A,18B,18C和18D中显示。使用亚最佳CD3刺激后的表面标志物CD25,图18A和18B显示CD4 T细胞的激活,而图18C和18D显示CD8 T细胞的激活。对于CD4 T细胞(图18A和18B),双特异性OX40(49B4)x FAP(4B9)抗体(7719)展现最高激活,接着是效力略低的Contorbody 8。非靶向性2+1 OX40(49B4)x DP47抗体(7718)和阴性对照(8105)在基线修正之后并不显示任何激活。对于CD8 T细胞(图18C和18D),Contorbody 7,8和9以及双特异性OX40(49B4)x FAP(4B9)抗体(7719)展现与Contorbody 10相比更强的激活。图19A,19B,19C和19D显示亚最佳CD3刺激之后的FSC-A,分别是CD4(图19A和19B)和CD8T细胞(图19C和19D)的大小。所有Contorbody指示相当的中等升高。添加非靶向性2+1抗OX40分子(7718)和阴性对照(8105)并不改变CD4或CD8 T细胞的大小。图20A,20B,20C和20D显示亚最佳CD3刺激之后的eFluor 670水平,分别是CD4(图20A和20B)和CD8 T细胞(图20C和20D)的增殖。在CD4亚群中,Contorbody 8和10显示可观的eFluor 670水平的降低,指示更强的增殖。在CD8亚群中,Contorbody 7和9显示更大的eFluor 670水平的降低。非靶向性2+1抗OX40分子(7718)和阴性对照(8105)在所有亚群中仅仅显示微小的降低。图21A,21B,21C和21D显示激活后下调的IL-7Rα(CD127)。对于CD4和CD8 T细胞,双特异性OX40(49B4)xFAP(4B9)抗体(7719)显示最强的下调,接着是Contorbody 10。在CD4细胞中观察到比CD8亚群更大的CD127下调。CD4和CD8 T细胞上CD25(图22A),FSC-A(图22B),eFluor 670(图22C)和CD127(图22D)的标准化曲线下面积值在图22A,22B,22C和22D中汇总。非靶向性2+1抗OX40分子(7718)在CD4和CD8 T细胞上仅仅显示最低限度激活,而双特异性OX40(49B4)xFAP(4B9)抗体(7719)关于CD4和CD8 T细胞上的eFluor 679和CD127展现与Contorbody相比更高的效力。CD25和FSC-A在CD4和CD8亚群二者中在7719分子和Contorbody二者中指示相似的激活水平。
图23A和23B显示4-1BB表达性报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中的NFκB介导的萤光素酶表达活性。为了测试2+1抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)Contorsbody较之2+1抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)抗原结合分子较之对照的功能性,温育分子。将抗原结合分子或它的对照的浓度针对温育6小时后测量的释放光单位(RLU)绘图。通过减去空白对照(例如不添加抗体)的基线值对所有值进行基线修正。在图23A中显示FAP靶不依赖性4-1BB激活,其中在没有任何FAP介导的交联的情况下在报告细胞系中4-1BB结合诱导NFκB控制的萤光素酶表达。在图23B中添加高FAP表达性细胞系NIH/3T3-huFAP克隆19(人FAP转基因小鼠成纤维细胞细胞系)。FAP表达性肿瘤细胞导致双特异性4-1BB(20H4.9)x FAP(4B9)抗原结合分子的交联和它在4-1BB表达性报告细胞系中诱导NFκB-诱导/萤光素酶激活的潜力的强烈升高。双特异性2+1抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)抗原结合分子(黑色实心星形和线)显示比Contorsbody略微更好的激活(更低的EC50值)。然而,由Contorsbody引起的激活比由非靶向性4-1BB抗体显示的激活高得多。
图24A,24B,24C,24D,24E,24F,24G和24H显示在FAP包被的(图24A,24C,24E和24G)或未包被的
Figure BDA0002429335460000191
(图24B,24D,24F和24H)存在下温育2天后二价人抗CD40 x FAPContorsbody对人B细胞的体外激活。与由交联的SGN40诱导的CD69,CD80,CD86和HLA-DR的FAP不依赖性上调相比,在FAP包被的珠存在下由FAP依赖性双特异性抗原结合分子诱导的这些激活标志物的上调略微更低。在FAP缺失下(未包被的珠)对FAP靶向性抗CD40Contorsbody观察不到CD69,CD80,CD86或HLA-DR表达的升高,而交联的阳性对照抗体SGN40诱导这些激活标志物的上调。显示的是与指定滴定的Contorsbody或对照抗体一起温育2天后CD69,CD80,CD86或HLA-DR阳性要害B细胞的百分比。XL代表用山羊抗人IgG Fcγ片段特异性F(ab')2片段的交联。X轴显示Contorsbody构建物或对照抗体的浓度。
发明详述
定义
除非另有定义,本文中使用的技术和科学术语具有与此发明所属领域中一般使用的相同的含义。出于解释此说明书的目的,会应用下述定义,而且在适宜时,以单数使用的术语还会包括复数,反之亦然。
如本文中使用的,术语“抗原结合分子”以其最广义指特异性结合抗原性决定簇的分子。抗原结合分子的例子是抗体,抗体片段和支架抗原结合蛋白。
术语“抗原结合域”指抗原结合分子中特异性结合抗原性决定簇的部分。在一个方面,抗原结合域能够经由它的靶细胞抗原激活信号传导。抗原结合域包括抗体中与部分或整个抗原特异性结合和互补的区域或片段。另外,抗原结合域包括如本文中进一步定义的支架抗原结合蛋白,例如基于设计的重复蛋白或设计的重复域的结合域(参见例如WO2002/020565)。特别地,抗原结合域由第一部分和第二部分构成,其中第一部分包含抗体轻链可变区(VL)且第二部分包含抗体重链可变区(VH)或反之。
术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体,单特异性和多特异性抗体(例如双特异性抗体),和抗体片段,只要它们展现期望的抗原结合活性。
如本文中使用的术语“单克隆抗体”指自实质性同质的抗体群体获得的抗体,即构成该群体的抗体个体是同一的和/或结合相同表位,除了可能的抗体变体,例如,含有天然发生的突变的或在单克隆抗体制备物的生成期间产生的,此类变体一般以微小量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物形成对比,单克隆抗体制备物中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
如本文中使用的术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体,每个该位点结合相同抗原的相同表位。术语“双特异性”意味着抗原结合分子能够特异性结合至少两种截然不同的抗原性决定簇。双特异性抗原结合分子至少包含两个抗原结合位点,其每个是对不同抗原性决定簇特异性的。在某些实施方案中,双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇,特别是在两种截然不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。例如,本发明的抗原结合分子是双特异性的,包含能够特异性结合第一靶物的抗原结合域和能够特异性结合第二靶物的抗原结合域。在一个特定方面,本发明的抗体包含能够特异性结合OX40的抗原结合域和能够特异性结合FAP的抗原结合域。在另一个特定方面,本发明的抗体包含能够特异性结合4-1BB的抗原结合域和能够特异性结合FAP的抗原结合域。在又一个方面,本发明的抗体包含能够特异性结合CD40的抗原结合域和能够特异性结合FAP的抗原结合域。
如本申请内使用的术语“价”表示抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。照此,术语“二价”,“四价”,和“六价”分别表示抗原结合分子中两个结合位点,四个结合位点,和六个结合位点的存在。还可以关于针对给定抗原性决定簇的结合位点的数目来表述抗原结合分子的价。例如,本发明的双特异性抗体就第一靶物而言是二价的且就第二靶物而言是单价的。
术语“全长抗体”,“完整抗体”,和“全抗体”在本文中可互换使用,指具有与天然抗体结构实质性相似的结构的抗体。“天然抗体”指具有不同结构的天然发生的免疫球蛋白分子。例如,天然IgG类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,由成二硫键的两条轻链和两条重链构成。自N端至C端,每条重链具有一个可变区(VH),也称作可变重域或重链可变域,接着是三个恒定域(CH1,CH2,和CH3),也称作重链恒定区。类似地,自N端至C端,每条轻链具有一个可变区(VL),也称作可变轻域或轻链可变域,接着是一个轻链恒定域(CL),也称作轻链恒定区。抗体的重链可指派至五种型之一,称作α(IgA),δ(IgD),ε(IgE),γ(IgG),或μ(IgM),其中一些可进一步分成亚型,例如γ1(IgG1),γ2(IgG2),γ3(IgG3),γ4(IgG4),α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列,抗体的轻链可指派至两种型之一,称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子,其包含完整抗体中与完整抗体所结合的抗原结合的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv,Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)2；双抗体,三抗体,四抗体,交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和单域抗体。关于某些抗体片段的综述,参见Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述,参见例如Plückthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；还参见WO93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论,参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价或双特异性的,参见例如EP 404,097；WO1993/01161；Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)；和Hollinger et al.,Proc NatlAcad Sci USA 90,6444-6448(1993)。Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)中还描述了三抗体和四抗体。单域抗体是包含抗体的重链可变域的全部或一部分或轻链可变域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中,单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利No.6,248,516 B1)。可以通过各种技术来生成抗体片段,包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成,如本文中描述的。
完整抗体的木瓜蛋白酶消化生成两个同一的抗原结合片段,称作“Fab”片段,每个含有重和轻链可变域,还有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。如此,如本文中使用的,术语“Fab片段”指包含包含轻链的VL和恒定域(CL)的轻链片段,和重链的VH和第一恒定域(CH1)的抗体片段。Fab’片段因在重链CH1域的羧基末端增加少数残基而与Fab片段不同,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab’片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分的F(ab’)2片段。依照本发明,术语“Fab片段”还包括如下文定义的“交叉Fab片段”或“交换Fab片段”。
术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”指其中重和轻链的可变区或恒定区任一交换的Fab片段。交叉Fab分子的两种不同链组成是可能的且包含在本发明的双特异性抗体中:一方面,Fab重和轻链的可变区交换,即交换Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链,和由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab(VLVH)。另一方面,当Fab重和轻链的恒定区交换时,交换Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链,和由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab(CLCH1)。
“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变域(VH),抗体恒定域1(CH1),抗体轻链可变域(VL),抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以N端至C端方向具有下述次序之一:a)VH-CH1-接头-VL-CL,b)VL-CL-接头-VH-CH1,c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；且其中所述接头是至少30个氨基酸,优选32至50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段经由CL域和CH1域之间的天然二硫键而稳定化。另外,这些单链Fab分子可通过经由半胱氨酸残基的插入(例如依照Kabat编号方式的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键而进一步稳定化。
“交换单链Fab片段”或“x-scFab”是由抗体重链可变域(VH),抗体恒定域1(CH1),抗体轻链可变域(VL),抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以N端至C端方向具有下述次序之一:a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH和VL一起形成特异性结合抗原的抗原结合位点,且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽。另外,这些x-scFab分子可通过经由半胱氨酸残基的插入(例如依照Kabat编号方式的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键而进一步稳定化。
“单链可变片段(scFv)”是以10至约25个氨基酸的短接头肽连接的抗体的重(VH)和轻(VL)链可变区的融合蛋白。接头经常富含出于柔性的甘氨酸,以及出于溶解性的丝氨酸或苏氨酸,而且可将VH的N端与VL的C端连接,或反之亦然。尽管去除恒定区并引入接头,此蛋白质保留原始抗体的特异性。scFv抗体描述于例如Houston,J.S.,Methods inEnzymol.203(1991)46-96。另外,抗体片段包含具有VH的特征(即能够与VL一起装配)或VL的特征(即能够与VH一起装配)的单链多肽,VH与VL一起装配成功能性抗原结合位点并由此提供全长抗体的抗原结合特性。
“支架抗原结合蛋白”在本领域中是已知的,例如,纤连蛋白和设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)已经用作抗原结合域的备选支架,参见例如Gebauer and Skerra,Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.CurrOpin Chem Biol 13:245-255(2009)和Stumpp et al.,Darpins:A new generation ofprotein therapeutics.Drug Discovery Today 13:695-701(2008)。在本发明的一个方面,支架抗原结合蛋白选自由CTLA-4(Evibody),脂质运载蛋白(Anticalin),蛋白A衍生的分子,诸如蛋白A的Z域(Affibody),A域(Avimer/Maxibody),血清转铁蛋白(trans-body)；设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin),抗体轻链或重链的可变域(单域抗体,sdAb),抗体重链的可变域(纳米抗体,aVH),VNAR片段,纤连蛋白(AdNectin),C型凝集素域(Tetranectin)；新的抗原受体β-内酰胺酶的可变域(VNAR片段),人γ-晶体蛋白或泛素(Affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型域,微体,诸如来自knottin家族的蛋白质,肽适体和纤连蛋白(adnectin)组成的组。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是主要在CD4+T细胞上表达的CD28家族受体。其细胞外域具有类似可变域的Ig折叠。可用异源序列取代对应于抗体的CDR的环,以赋予不同的结合特性。经过工程化而具有不同结合特异性的CTLA-4分子也被称为Evibodies(例如,US7166697B1)。Evibodies的大小与抗体(例如,域抗体)的分离可变区大约相同。进一步的详情参见Journal of Immunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。脂质运载蛋白为细胞外蛋白质家族,其转运小的疏水性分子,如类固醇,胆红素,类视黄醇和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构,在锥形结构的开口端具有可被工程化以结合不同的靶抗原的多个环。Anticalin的大小在160-180个氨基酸之间,并且衍生自脂质运载蛋白。进一步的详情参见Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000),US7250297B1和US20070224633。亲和体是衍生自金黄色葡萄球菌蛋白A的支架,其可被工程化以结合抗原。该域由具有约58个氨基酸的三螺旋束组成。通过表面残基的随机化生成了文库。进一步的详情参见Protein Eng.Des.Sel.2004,17,455-462和EP 1641818A1。Avimers是衍生自A域支架家族的多域蛋白。具有约35个氨基酸的天然域采用定义的二硫键结构。多样性是通过改变A域家族所显示的自然变异产生的。进一步的详情参见Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)和Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6),909-917(June 2007)。转铁蛋白是单体的血清转运糖蛋白。可以通过在允许的表面环中插入肽序列将转铁蛋白工程化以结合不同的靶抗原。工程化转铁蛋白支架的实例包括Trans-body。进一步的详情参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)衍生自锚蛋白,锚蛋白是介导整合膜蛋白与细胞骨架附着的蛋白质家族。单个锚蛋白重复是由两个α-螺旋和β-转角组成的33个残基的基序。通过随机化每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基,它们可以被工程化以结合不同的靶抗原。通过增加模块的数量(亲和力成熟法)可以增加它们的结合界面。进一步的详情参见J.Mol.Biol.332,489-503(2003),PNAS100(4),1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)以及US20040132028A1。单域抗体是由单个单体的可变抗体域组成的抗体片段。第一个单域来源于来自骆驼科动物(camelids)抗体重链的可变域(纳米抗体或VHH片段)。此外,术语单域抗体包括自主的人重链可变域(aVH)或来源于鲨鱼的VNAR片段。纤连蛋白是一种可以被工程化为与抗原结合的支架。Adnectin由人纤连蛋白III型(FN3)的15个重复单元的第10个域的天然氨基酸序列的主链组成。可以将β-夹心一端的三个环工程化,使Adnectin能够特异性地识别感兴趣的治疗靶标。进一步的详情参见Protein Eng.Des.Sel.18,435-444(2005),US20080139791,WO2005056764和US6818418B1。肽适体是由恒定框架蛋白组成的组合识别分子,所述框架蛋白通常是含有在活性位点插入的约束可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。进一步的详情参见Expert Opin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。微体源自长度为25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白,其含有3-4个半胱氨酸桥-微蛋白的实例包括KalataBI以及芋螺毒素和半胱氨酸结肽(knottin)。微蛋白具有可以工程化以包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的整体折叠的环。工程化的半胱氨酸结肽域的更多详情参见WO2008098796。
与参照分子“结合相同表位的抗原结合分子”指如下的抗原结合分子,抗原结合分子在竞争测定法中将参照分子对其抗原的结合阻断50％或更多,相反,参照分子在竞争测定法中将抗原结合分子对其抗原的结合阻断50％或更多。
如本文中使用的,术语“抗原性决定簇”与“抗原”和“表位”同义,而且指多肽大分子上的如下位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区域构成的构象构造),抗原结合模块与该位点结合,形成抗原结合模块-抗原复合物。有用的抗原性决定簇可以例如在肿瘤细胞的表面上,在病毒感染的细胞的表面上,在其它患病细胞的表面上,在免疫细胞的表面上,游离在血清中,和/或在细胞外基质(ECM)中找到。作为本文中的抗原有用的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的蛋白质的任何天然形式,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。在一个特定实施方案中,抗原是人蛋白质。在提及本文中的特定蛋白质的情况中,该术语涵盖“全长”未加工的蛋白质以及源自细胞中的加工的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖蛋白质的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。
术语“互补位”指给定抗体分子中靶物和结合位点之间的特异性结合所需要的能够部分。互补位可以是连续的,即由结合位点中存在的相邻氨基酸残基形成,或不连续的,即由氨基酸残基的一级序列中的(诸如氨基酸残基的CDR的氨基酸序列中的)不同位置处但在结合位点采取的三维结构中密切接近的氨基酸残基形成。
“特异性结合”意味着结合对于抗原是选择性的且可以与不想要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子结合特定抗原的能力可经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量,例如表面等离振子共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329(2000)),和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。在一个实施方案中,抗原结合分子对无关蛋白质的结合的程度小于抗原结合分子对抗原的结合的约10％,如通过例如SPR测量的。在某些实施方案中,结合抗原的分子具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更小,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
“亲和力”或“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点和其结合配偶(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力一般可以用解离常数(Kd)来代表,它是解离和结合速率常数(分别是koff和kon)的比。如此,等同的亲和力可包含不同的速率常数,只要速率常数的比保持相同。可以通过本领域已知的常用方法来测量亲和力,包括本文中描述的那些。用于测量亲和力的一种特定方法是表面等离振子共振(SPR)。
“亲和力成熟的”抗体指与不拥有此类改变的亲本抗体相比,在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体,此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
如本文中使用的，“肿瘤相关抗原”指靶细胞的表面上呈现的抗原性决定簇,其中靶细胞是肿瘤中的细胞，诸如癌细胞,肿瘤基质的细胞或B细胞。在某些方面,肿瘤相关抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)。
术语“能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)”指能够以足够的亲和力结合FAP,使得抗原结合分子可用作靶向FAP中的诊断和/或治疗剂的抗原结合分子。抗原结合分子包括但不限于抗体,Fab分子,交换Fab分子,单链Fab分子,Fv分子,scFv分子,单域抗体,和VH和支架抗原结合蛋白。在一个实施方案中,抗FAP抗原结合分子对无关的,非FAP蛋白的结合程度小于抗原结合分子对FAP的结合的约10％,如例如通过表面等离振子共振(SPR)测量的。特别地,能够特异性结合FAP的抗原结合分子具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更少,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中,抗FAP抗原结合分子结合来自不同物种的FAP。特别地,抗FAP抗原结合分子结合人,食蟹猴和小鼠FAP。
术语“成纤维细胞激活蛋白(FAP)”,还称作脯氨酰内肽酶FAP或Seprase(EC3.4.21),指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然FAP,除非另有说明。该术语涵盖“全长”,未加工的FAP以及因细胞中的加工所致的任何形式的FAP。该术语还涵盖FAP的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中,本发明的抗原结合分子能够特异性结合人,小鼠和/或食蟹猴FAP。人FAP的氨基酸序列显示于UniProt(www.uniprot.org)登录号Q12884(版本149,SEQ ID NO:97),或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2。人FAP的胞外域(ECD)自氨基酸位置26延伸至760。小鼠FAP的氨基酸序列显示于UniProt登录号P97321(版本126,SEQ ID NO:98),或NCBI RefSeq NP_032012.1。小鼠FAP的胞外域(ECD)自氨基酸位置26延伸至761。优选地,本发明的抗FAP结合分子结合FAP的胞外域。例示性抗FAP结合分子描述于国际专利申请号WO 2012/020006 A2。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗原结合分子结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。单个VH或VL可足以赋予抗原结合特异性。
如本文中使用的,术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环的(“高变环”)和/或含有抗原接触残基的(“抗原接触”)每一个区域。一般地,抗体包含六个HVR:三个在VH中(H1,H2,H3),三个在VL中(L1,L2,L3)。本文中的例示性HVR包括:
(a)高变环,其存在于氨基酸残基26-32(L1),50-52(L2),91-96(L3),26-32(H1),53-55(H2),和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)CDR,其存在于氨基酸残基24-34(L1),50-56(L2),89-97(L3),31-35b(H1),50-65(H2),和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)抗原接触,其存在于氨基酸残基27c-36(L1),46-55(L2),89-96(L3),30-35b(H1),47-58(H2),和93-101(H3)(MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a),(b),和/或(c)的组合,包括HVR氨基酸残基46-56(L2),47-56(L2),48-56(L2),49-56(L2),26-35(H1),26-35b(H1),49-65(H2),93-102(H3),和94-102(H3)。
除非另外指明,HVR(例如CDR)残基和可变域中的其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等人,见上文编号。
Kabat等人还定义了可应用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员能明确地将“Kabat编号方式”的这种系统指派给任何可变区序列,不依赖于超出序列本身的任何实验数据。如本文中使用的,“Kabat编号方式”是指由Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest"(1983)中列出的编号系统。除非另有规定,抗体可变区中具体氨基酸残基位置的编号的提及依照Kabat编号系统。
如本文中使用的,在抗原结合分子(例如抗体)的语境中术语“亲和力成熟的”指如下的抗原结合分子,其例如通过突变而自参照抗原结合分子衍生,与参照抗体结合相同抗原,优选结合相同表位；且对抗原具有比参照抗原结合分子要高的亲和力。亲和力成熟一般牵涉修饰抗原结合分子的一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸残基。典型地,亲和力成熟的抗原结合分子与初始参照抗原结合分子结合相同表位。
“框架”或“FR”指除了高变区(HVR)残基之外的可变域残基。可变域的FR一般由四个FR域组成:FR1,FR2,FR3,和FR4。因而,HVR和FR序列一般在VH(或VL)中以下述顺序出现:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
出于本文中的目的,“受体人框架”是包含自如下文定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“自”人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列,或者它可含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中,氨基酸变化的数目是10或更少,9或更少,8或更少,7或更少,6或更少,5或更少,4或更少,3或更少,或2或更少。在一些实施方案中,VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列同一。
术语“嵌合”抗体指如下的抗体,其中重和/或轻链的一部分自特定来源或物种衍生,而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。有五大类抗体:IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM,而且其中若干可进一步分为亚类(同种型),例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,和IgA2。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α,δ,ε,γ,和μ。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体会包含至少一个,通常两个实质性整个如下的可变域,其中整个或实质性整个HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些,而且整个或实质性整个FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可包含自人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体,例如非人抗体的“人源化形式”指经历人源化的抗体。本发明涵盖的其它形式的“人源化抗体”是其中恒定区已经自原始抗体的恒定区另外修饰或变化以生成依照本发明的特性,尤其是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的那些。
“人”抗体是拥有与由人或人细胞生成的或自利用人抗体全集或其它人抗体编码序列的非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义专门排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
术语“CH1域”指抗体重链多肽中大约自EU位置118延伸至EU位置215的部分(EU编号系统依照Kabat)。在一个方面,CH1域具有氨基酸序列ASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKV(SEQ ID NO:94)。通常,后面是具有氨基酸序列EPKSC(SEQ ID NO:99)的区段，用于将CH1域连接至铰链区。
术语“铰链区”指抗体重链多肽中在野生型抗体重链中连接CH1域和CH2域的部分,例如依照Kabat的EU编号系统自约位置216至约位置230，或依照Kabat的EU编号系统自约位置226至约位置230。可以通过与IgG1亚类序列的铰链区半胱氨酸残基比对来确定其它IgG亚类的铰链区。铰链区在正常情况下是由具有相同氨基酸序列的两条多肽组成的二聚体分子。铰链区一般包含多至25个氨基酸残基且是柔性的，容许相关靶物结合位点独立移动。铰链区可以细分成三个域:上,中,和下铰链域(参见例如Roux et al.,J.Immunol.161(1998)4083)。
在一个方面,铰链区具有氨基酸序列DKTHTCPXCP(SEQ ID NO:100),其中X是S或P。在一个方面,铰链区具有氨基酸序列HTCPXCP(SEQ ID NO:101),其中X是S或P。在一个方面,铰链区具有氨基酸序列CPXCP(SEQ ID NO:102),其中X是S或P。
本文中的术语“Fc域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个方面,人IgG重链Fc域自Cys226或自Pro230或自Ala231延伸至重链的羧基末端。然而,Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。IgG Fc区包含IgG CH2和IgG CH3域。
人IgG Fc区的“CH2域”通常自约EU位置231处的氨基酸残基延伸至约EU位置340处的氨基酸残基(EU编号系统依照Kabat)。在一个方面,CH2域具有氨基酸序列APELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK(SEQ ID NO:95)。CH2域的独特之处在于它没有与另一域紧密配对。而是说,两条N连接的分支的碳水化合物链介于完整天然Fc区的两个CH2域之间。推测该碳水化合物可能提供域-域配对的替代且帮助使CH2域稳定(Burton,Mol.Immunol.22(1985)161-206)。在一个实施方案中,碳水化合物链附着于CH2域。本文中的CH2域可以是天然序列CH2域或变体CH2域。
“CH3域”包含Fc区中在CH2域C端的那段残基，指抗体重链多肽中大约自EU位置341延伸至EU位置446的部分(EU编号系统依照Kabat)。在一个方面,CH3域具有氨基酸序列GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG(SEQ ID NO:96)。本文中的CH3区可以是天然序列CH3域或变体CH3域(例如具有在其一条链中引入的“隆起”(“节”)和在其另一条链中相应引入的“空腔”(“穴”)的CH3域；参见美国专利No.5,821,333,通过援引明确收入本文)。如本文中描述的,此类变体CH3域可用于促进两条不相同抗体重链的异二聚化。在一个实施方案中,人IgG重链Fc区自Cys226或自Pro230延伸至重链的羧基末端。然而,Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定,Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号依照EU编号系统,也称作EU索引,如Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中描述的。
“节-入-穴”技术在例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway et al.,Prot Eng9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中描述。一般地,该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”),使得该隆起可放置在该空腔中,从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。通过将大氨基酸侧链用较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换而在第二多肽的界面中创建与隆起相同或相似大小的补偿性空腔。可通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变,或通过肽合成来生成隆起和空腔。在一个具体实施方案中,节修饰包含Fc域的两个亚基之一中的氨基酸替代T366W,而穴修饰包含Fc域的两个亚基之另一中的氨基酸替代T366S,L368A和Y407V。在又一个具体实施方案中,Fc域中包含节修饰的亚基另外包含氨基酸替代S354C,而Fc域中包含穴修饰的亚基另外包含氨基酸替代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫桥,如此进一步稳定化二聚体(Carter,J Immunol Methods248,7-15(2001))。编号方式依照Kabat et al,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991的EU索引。
“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”意图包括免疫球蛋白的Fc区的天然发生等位变体以及具有生成替代,添加,或删除的改变但并不实质性降低免疫球蛋白介导效应器功能(诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性)的能力的变体。例如,可以自免疫球蛋白的Fc区的N端或C端删除一个或多个氨基酸,生物学功能没有实质性损失。可以依照本领域已知的一般规则来选择此类变体,从而对活性具有最小限度影响(参见例如Bowie,J.U.et al.,Science247:1306-10(1990))。
术语“野生型Fc域”指与在自然界中找到的Fc域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。野生型人Fc域包括天然人IgG1 Fc区(非A和A同种异型),天然人IgG2 Fc区,天然人IgG3 Fc区,和天然人IgG4 Fc区以及其天然发生变体。野生型Fc区显示于SEQ ID NO:102(IgG1,高加索人同种异型),SEQ ID NO:103(IgG1,非洲裔美国人同种异型),SEQ ID NO:104(IgG2),SEQ ID NO:105(IgG3)和SEQ ID NO:106(IgG4)。
术语“变体(人)Fc域”指因至少一处“氨基酸突变”而与“野生型”(人)Fc域的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在一个方面,变体Fc区具有与天然Fc区相比的至少一处氨基酸突变,例如约一处至约十处氨基酸突变,和，在一个方面，天然Fc区中的约一处至约五处氨基酸突变。在一个方面,(变体)Fc区与野生型Fc区具有至少约95％同源性。
术语“效应器功能”指那些可归于抗体的Fc区的生物学活性,其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的例子包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC),Fc受体结合,抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),抗体依赖性细胞吞噬(ADCP),细胞因子分泌,免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取,细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调,和B细胞活化。
Fc受体结合依赖性效应器功能可以通过抗体的Fc区与Fc受体(FcR,它们是造血细胞上的专门化细胞表面受体)的相互作用来介导。Fc受体属于免疫球蛋白超家族,而且已经显示介导通过免疫复合物的吞噬去除抗体包被的病原体和被相应抗体包被的红细胞和多种其它细胞靶(例如肿瘤细胞)经抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)裂解二者(参见例如Van de Winkel,J.G.and Anderson,C.L.,J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。FcR通过它们对免疫球蛋白同种型的特异性来定义:针对IgG抗体的Fc受体称作FcγR。Fc受体结合记载于例如Ravetch,J.V.and Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.,et al.,Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.,et al.,J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；和Gessner,J.E.,et al.,Ann.Hematol.76(1998)231-248。
针对IgG抗体Fc区的受体(FcγR)的交联触发极其广泛的效应器功能,包括吞噬,抗体依赖性细胞细胞毒性,和释放炎症性介导物,以及免疫复合物清除和调节抗体生成。在人中,三类FcγR已经表征,它们是:
-FcγRI(CD64)以高亲和力结合单体IgG且在巨噬细胞,单核细胞,嗜中性细胞和嗜曙红细胞上表达。IgG Fc区中至少氨基酸残基E233-G236,P238,D265,N297,A327和P329(编号方式依照Kabat的EU索引)之一处的修饰降低对FcγRI的结合。将位置233-236处的IgG2残基替代入IgG1和IgG4将对FcγRI的结合降低103倍并消除针对抗体敏化的红血球的人单核细胞应答(Armour,K.L.,et al.,Eur.J.Immunol.29(1999)2613-2624)。
-FcγRII(CD32)以中等至低亲和力结合复合的IgG且广泛表达。这种受体可分成两个亚型,FcγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA在牵涉杀伤的许多细胞上找到(例如巨噬细胞,单核细胞,嗜中性细胞)且看来能够激活杀伤过程。FcγRIIB看来在抑制性过程中发挥作用且在B细胞,巨噬细胞上并在肥大细胞和嗜曙红细胞上找到。在B细胞上它看来发挥遏制进一步免疫球蛋白生成和同种型转换成例如IgE类的功能。在巨噬细胞上,FcγRIIB起抑制经由FcγRIIA介导的吞噬的作用。在嗜曙红细胞和肥大细胞上,B形式可有助于经由结合其分开的受体的IgE遏制这些细胞的激活。例如,对包含至少在氨基酸残基E233-G236,P238,D265,N297,A327,P329,D270,Q295,A327,R292,和K414(编号方式依照Kabat的EU索引)之一处具有突变的IgG Fc区的抗体找到降低的对FcγRIIA的结合。
-FcγRIII(CD16)以中等至低亲和力结合IgG且以两种类型存在。FcγRIIIA在NK细胞,巨噬细胞,嗜曙红细胞和一些单核细胞和T细胞上找到且介导ADCC。FcγRIIIB在嗜中性细胞上高表达。例如,对包含至少在氨基酸残基E233-G236,P238,D265,N297,A327,P329,D270,Q295,A327,S239,E269,E293,Y296,V303,A327,K338和D376(编号方式依照Kabat的EU索引)之一处具有突变的IgG Fc区的抗体找到降低的对FcγRIIIA的结合。
人IgG1上针对Fc受体的结合位点的定位,上文所述突变位点和用于测量对FcγRI和FcγRIIA的结合的方法记载于Shields,R.L.,et al.J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604。
术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞细胞毒性”是通过Fc受体结合介导的功能且指在效应细胞存在下如本文中报告的抗体对靶细胞的裂解。抗体诱导介导ADCC的初始步骤的能力通过测量它们对表达Fcγ受体的细胞,诸如重组表达FcγRI和/或FcγRIIA的细胞,或NK细胞(本质上表达FcγRIIIA)的结合来调查。特别地,测量对NK细胞上的FcγR的结合。
“活化性Fc受体”是在受到抗体的Fc区啮合后引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a),FcγRI(CD64),FcγRIIa(CD32),和FcαRI(CD89)。一种特定活化性Fc受体是人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637,版本141)。
“肿瘤坏死因子受体超家族”或“TNF受体超家族”当前由27种受体组成。它是一组特征在于经细胞外富半胱氨酸域(CRD)结合肿瘤坏死因子(TNF)的能力的细胞因子受体。这些假重复通过受体链内由高度保守的半胱氨酸残基生成的链内二硫化物来定义。除神经生长因子(NGF)以外,所有TNF与原型TNF-α同源。以它们的活性形式,绝大多数TNF受体在质膜中形成三聚体复合物。因而,大多数TNF受体含有跨膜域(TMD)。数种这些受体还含有细胞内死亡域(DD),它在配体结合后募集胱天蛋白酶相互作用蛋白以启动胱天蛋白酶激活的外在途径。其它缺乏死亡域的TNF超家族受体结合TNF受体相关因子并激活能导致增殖或分化的细胞内信号传导途径。这些受体还能启动凋亡,但是它们经间接机制这样做。在调节凋亡以外,数种TNF超家族受体牵涉调节免疫细胞功能,诸如B细胞稳态和激活,天然杀伤细胞激活,和T细胞共刺激。数种其它受体调节细胞类型特异性应答,诸如毛囊发育和破骨细胞发育。TNF受体超家族的成员包括下面的:肿瘤坏死因子受体1(1A)(TNFRSF1A,CD120a),肿瘤坏死因子受体2(1B)(TNFRSF1B,CD120b),淋巴毒素β受体(LTBR,CD18),OX40(TNFRSF4,CD134),CD40(Bp50),Fas受体(Apo-1,CD95,FAS),诱饵受体3(TR6,M68,TNFRSF6B),CD27(S152,Tp55),CD30(Ki-1,TNFRSF8),4-1BB(CD137,TNFRSF9),DR4(TRAILR1,Apo-2,CD261,TNFRSF10A),DR5(TRAILR2,CD262,TNFRSF10B),诱饵受体1(TRAILR3,CD263,TNFRSF10C),诱饵受体2(TRAILR4,CD264,TNFRSF10D),RANK(CD265,TNFRSF11A),骨保护素(OCIF,TR1,TNFRSF11B),TWEAK受体(Fn14,CD266,TNFRSF12A),TACI(CD267,TNFRSF13B),BAFF受体(CD268,TNFRSF13C),疱疹病毒进入介导物(HVEM,TR2,CD270,TNFRSF14),神经生长因子受体(p75NTR,CD271,NGFR),B细胞成熟抗原(CD269,TNFRSF17),糖皮质激素诱导的TNFR相关的(GITR,AITR,CD357,TNFRSF18),TROY(TNFRSF19),DR6(CD358,TNFRSF21),DR3(Apo-3,TRAMP,WS-1,TNFRSF25)和Ectodysplasin A2受体(XEDAR,EDA2R)。
肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的数个成员在初始T细胞活化后发挥维持T细胞应答的功能。术语“共刺激性TNF受体家族成员”或“共刺激性TNF家族受体”指TNF受体家族成员的一个亚组,它们能够共刺激T细胞的增殖和细胞因子生成。该术语指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然TNF家族受体,除非另有说明。在本发明的具体实施方案中,共刺激性TNF受体家族成员选自由OX40(CD134),4-1BB(CD137),CD40,CD27,HVEM(CD270),CD30,和GITR组成的组,它们都对T细胞具有共刺激效果。更加特别地,本发明的抗原结合分子至少包含能够特异性结合共刺激性TNF受体家族成员OX40的模块。
可以自公众可及的数据库(诸如Uniprot(www.uniprot.org))获得TNF受体家族成员的别的信息(特别是序列)。例如,人共刺激性TNF受体具有下面的氨基酸序列:人OX40(UniProt登录号P43489,SEQ ID NO:108),人4-1BB(UniProt登录号Q07011,SEQ ID NO:109),人CD27(UniProt登录号P26842,SEQ ID NO:110),人HVEM(UniProt登录号Q92956,SEQID NO:111),人CD30(UniProt登录号P28908,SEQ ID NO:112),人GITR(UniProt登录号Q9Y5U5,SEQ ID NO:113)和人CD40(UniProt登录号P25942,SEQ ID NO:115)。
如本文中使用的,术语“OX40”指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然OX40,除非另有说明。该术语涵盖“全长”,未加工的OX40以及因细胞中的加工所致的任何形式的OX40。该术语还涵盖OX40的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。一种例示性的人OX40的氨基酸序列在SEQ ID NO:107(Uniprot P43489,版本112)中显示而一种例示性的鼠OX40的氨基酸序列在SEQ ID NO:113(Uniprot P47741,版本101)中显示。
在数种共刺激分子中,肿瘤坏死因子(TNF)受体家族成员OX40(CD134)在效应和记忆T细胞的存活和稳态中发挥关键作用(Croft M.et al.(2009)Immunological Reviews229,173-191)。OX40(CD134)在数种类型的细胞中表达且调节针对感染,肿瘤和自身抗原的免疫应答,而且已经证明它在T细胞,NKT细胞和NK细胞以及嗜中性粒细胞的表面上的表达(Baumann R.et al.(2004)Eur.J.Immunol.34,2268-2275)且显示出响应多种刺激信号而严格可诱导地或强烈地上调。该分子的功能活性已经在每一种OX40表达性细胞类型中证明,提示在体内OX40介导的活性的复杂调节。与T细胞受体触发组合,T细胞上由其天然配体或激动性抗体实现的OX40啮合引起PI3K和NFκB信号传导途径的协同激活(Song J.et al.(2008)J.Immunology 180(11),7240-7248)。继而,这对活化的T细胞导致增强的增殖,升高的细胞因子受体和细胞因子生成及更好的存活。在它在效应CD4+或CD8+T细胞中的共刺激性活性以外,OX40触发最近显示抑制T调节细胞的发育和免疫抑制性功能。这种效果有可能至少部分对增强OX40对抗肿瘤或抗微生物免疫应答的活性负有责任。鉴于OX40卷入能扩充T细胞群体,促进细胞因子分泌,和支持T细胞记忆,激动剂包括抗体和可溶性形式的配体OX40L已经成功用于多种临床前肿瘤模型(Weinberg et al.(2000)J.Immunol.164,2160-2169)。
术语“抗OX40抗体”,“抗OX40”,“OX40抗体”和“特异性结合OX40的抗体”指能够以足够的亲和力结合OX40,使得抗体可用作靶向OX40中的诊断和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中,抗OX40抗体对无关的,非OX40蛋白的结合程度小于抗体对OX40的结合的约10％,如例如通过流式细胞术(FACS)测量的。在某些实施方案中,结合OX40的抗体具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-6M或更少,例如10-68M至10-13M,例如10-8M至10-10M)的解离常数(KD)。
如本文中使用的,术语“4-1BB”或“CD137”指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然4-1BB,除非另有说明。该术语涵盖“全长”,未加工的4-1BB以及因细胞中的加工所致的任何形式的4-1BB。该术语还涵盖4-1BB的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。一种例示性的人4-1BB的氨基酸序列在SEQ ID NO:109(Uniprot登录号Q07011)中显示。
术语“抗4-1BB抗体”,“抗4-1BB”,“4-1BB抗体”和“特异性结合4-1BB的抗体”指能够以足够的亲和力结合4-1BB,使得抗体可用作靶向4-1BB中的诊断和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中,抗4-1BB抗体对无关的,非4-1BB蛋白的结合程度小于抗体对4-1BB的结合的约10％,如例如通过放射免疫测定法(RIA)或流式细胞术(FACS)测量的。在某些实施方案中,结合4-1BB的抗体具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-6M或更少,例如10-68M至10-13M,例如10-8M至10-10M)的解离常数(KD)。特别地,抗4-1BB抗体是如美国专利No.7,288,638中公开的克隆20H4.9。
如本文中使用的,术语“CD40”指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然CD40,除非另有说明。该术语涵盖“全长”,未加工的CD40以及因细胞中的加工所致的任何形式的CD40。该术语还涵盖CD40的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。一种例示性的人CD40的氨基酸序列在SEQ ID NO:115(Uniprot登录号P25942,版本200)中显示。CD40抗原是属于肿瘤坏死因子受体(TNF-R)家族的一种50kDa细胞表面糖蛋白(Stamenkovic et al.(1989),EMBO J.8:1403-10)。CD40在许多正常和肿瘤细胞类型中表达,包括B淋巴细胞,树突细胞,单核细胞,巨噬细胞,胸腺上皮,内皮细胞,成纤维细胞,和平滑肌细胞。CD40在所有B淋巴瘤中和在70％的所有实体瘤中表达，而且在抗原呈递细胞(APC)中通过成熟信号,诸如IFN-γ和GM-CSF而上调。CD40激活还经由APC-CD40诱导的细胞因子诱导单核细胞分化成功能性树突细胞(DC)并增强NK细胞的细胞溶解活性。如此CD40通过诱导APC成熟,辅助细胞因子分泌,共刺激性分子上调,和效应器功能增强在免疫应答的启动和增强中发挥至关紧要作用。
如本文中使用的，术语“CD40激动剂”包括激动CD40/CD40L相互作用的任何模块。如此语境中使用的，CD40优选指人CD40,因而CD40激动剂优选是人CD40的激动剂。典型地,模块会是激动性CD40抗体或抗体片段。
术语“抗CD40抗体”,“抗CD40”,“CD40抗体”和“特异性结合CD40的抗体”指能够以足够的亲和力结合CD40,使得抗体可用作靶向CD40中的诊断和/或治疗剂的抗体。在一个方面,抗CD40抗体对无关的,非CD40蛋白的结合程度小于抗体对CD40的结合的约10％,如例如通过放射免疫测定法(RIA)或流式细胞术(FACS)测量的。在某些实施方案中,结合CD40的抗体具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-6M或更少,例如10-68M至10-13M,例如10-8M至10-10M)的解离常数(KD)。
术语“肽接头”指包含一个或多个氨基酸,典型地约2-20个氨基酸的肽。肽接头在本领域中是已知的或在本文中描述。合适的非免疫原性接头肽是例如(G4S)n,(SG4)n或G4(SG4)n肽接头,其中“n”一般是介于1和10之间,典型地介于1和4之间的数目,特别是2,即肽选自由GGGGS(SEQ ID NO:77)GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:78),SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:79),GGGGGSGGGGSSGGGGS(SEQ ID NO:80),(G4S)3或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:81),GGGGSGGGGSGGGG或G4(SG4)2(SEQ ID NO:82),(G4S)4或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:83),和GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)组成的组,但是还包括序列GSPGSSSSGS(SEQID NO:85),GSGSGSGS(SEQ ID NO:86),GSGSGNGS(SEQ ID NO:87),GGSGSGSG(SEQ ID NO:88),GGSGSG(SEQ ID NO:89),GGSG(SEQ ID NO:90),GGSGNGSG(SEQ ID NO:91),GGNGSGSG(SEQ ID NO:92)和GGNGSG(SEQ ID NO:93)。特别感兴趣的肽接头是(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:78)和GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)。
依照本发明的“间隔物域”是在折叠后形成结构域的多肽。如此,间隔物域可以小于100个氨基酸残基,但是需要在结构上受限以固定结合基序。例示性的间隔物域是五聚体卷曲螺旋,抗体铰链区或抗体Fc区或其片段。间隔物域是二聚化域,即间隔物域包含能够提供二聚化功能性的氨基酸。
如此申请内使用的术语“氨基酸”表示天然发生羧基α-氨基酸的组,包含丙氨酸(三字母代码:ala,单字母代码:A),精氨酸(arg,R),天冬酰胺(asn,N),天冬氨酸(asp,D),半胱氨酸(cys,C),谷氨酰胺(gln,Q),谷氨酸(glu,E),甘氨酸(gly,G),组氨酸(his,H),异亮氨酸(ile,I),亮氨酸(leu,L),赖氨酸(lys,K),甲硫氨酸(met,M),苯丙氨酸(phe,F),脯氨酸(pro,P),丝氨酸(ser,S),苏氨酸(thr,T),色氨酸(trp,W),酪氨酸(tyr,Y),和缬氨酸(val,V)。
“融合”或“连接”意味着各构件(例如抗体和Fab片段的重链)通过肽键,或是直接地或是经由一个或多个肽接头连接。
如本文中使用的“融合多肽”或“单一融合多肽”指由直接地或是经由肽接头彼此融合的不同构件(诸如TNF配体家族成员的外域)构成的单链多肽。“融合”或“连接”意味着各构件(例如多肽和所述TNF配体家族成员的外域)通过肽键,或是直接地或是经由一个或多个肽接头连接。
关于参照多肽(蛋白质)序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列和在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性之后,而且不考虑任何保守替代作为序列同一性的一部分,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。出于确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以以本领域的技能内的多种方式实现,例如使用公众可得的计算机软件,诸如BLAST,BLAST-2,ALIGN.SAWI或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能确定用于比对序列的适宜参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大比对需要的任何算法。然而,出于本文中的目的,使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写,而且源代码已经与用户文档一起提交美国版权局(Washington D.C.,20559),以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech公司(South San Francisco,California)可得到ALIGN-2程序,或者可以自源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统,包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设置且不变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况中,给定氨基酸序列A相对于(to),与(with),或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列A具有或包含相对于,与,或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算:
100 乘 分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B的比对中打分为同一匹配的氨基酸残基的数目,且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。会领会的是,在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况中,A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明,本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值是如上一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
在某些实施方案中,涵盖本文中提供的抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如,可能想要改善抗原结合分子的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗原结合分子的氨基酸序列变体可通过将适宜修饰引入编码该分子的核苷酸序列,或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的删除,和/或插入和/或替代。可进行删除,插入,和替代的任何组合来得到最终的构建物,前提是最终的构建物拥有想要的特征,例如抗原结合。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和框架(FR)。保守替代在表A中在标题“优选替代”下提供且在下文中提及氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可将氨基酸替代引入感兴趣的分子并对产物筛选想要的活性,例如保留/改善的抗原结合,降低的免疫原性,或改善的ADCC或CDC。
表A
原始残基 例示性替代 优选替代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以依照共同的侧链特性来分组:
(1)疏水性的:正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；
(2)中性亲水性的:Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；
(3)酸性的:Asp,Glu；
(4)碱性的:His,Lys,Arg；
(5)影响链取向的残基:Gly,Pro；
(6)芳香族的:Trp,Tyr,Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一类别。
术语“氨基酸序列变体”包括其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中有氨基酸替代的实质性变体。一般地,为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗原结合分子会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力,降低的免疫原性)和/或会实质性保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体,其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之,将一个或多个HVR残基突变并将变体抗原结合分子在噬菌体上展示并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。在某些实施方案中,可以在一个或多个HVR内发生替代,插入,或删除,只要此类变化不实质性降低抗原结合分子结合抗原的能力。例如,可以在HVR中进行不实质性降低结合亲和力的保守改变(例如如本文中提供的保守替代)。一种对于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域有用的方法称作“丙氨酸扫描诱变”,如由Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085描述的。在此方法中,鉴定残基或靶残基的组(例如带电荷的残基,诸如Arg,Asp,His,Lys,和Glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外,利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。作为替代的候选,可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有想要的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合,以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的本发明的双特异性抗原结合分子。分子的其它插入变体包括与延长双特异性抗原结合分子的血清半衰期的多肽的N或C端的融合。
在某些实施方案中,改变本文中提供的双特异性抗原结合分子以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列,使得创建或去除一个或多个糖基化位点来方便地获得分子的糖基化变体。在双特异性抗原结合分子包含Fc区的情况中,可改变附着于其的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体典型地包含分支的双触角寡糖,其一般通过N连接附着至Fc区的CH2域的Asn297。参见例如Wright et al.,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物,例如甘露糖,N-乙酰葡糖胺(GlcNAc),半乳糖,和唾液酸,以及附着于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中,可进行抗原结合分子中的寡糖的修饰以创建具有某些改良特性的变体。在一个方面,提供具有缺乏(直接或间接)附着于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的变体。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能,参见例如美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)或US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。在另一个方面,提供具有两分型寡糖的本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的变体,例如,其中附着于Fc区的双触角寡糖通过GlcNAc两分。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能,参见例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利No.6,602,684(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)。还提供在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能且在例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中描述。
在某些方面,可能想要创建本发明的双特异性抗原结合分子的半胱氨酸工程化改造的变体,例如“thioMAb”,其中分子的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定方面,替代的残基出现于分子的可及位点。通过用半胱氨酸替代那些残基,由此将反应性硫醇基团放置在抗体的可及位点且可用于将抗体与其它模块诸如药物模块或接头-药物模块缀合以创建免疫缀合物。在某些方面,可以用半胱氨酸替代任一个或多个下述残基:轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541中所述生成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。
在某些方面,可进一步修饰本文中提供的双特异性抗体以含有本领域已知且容易获得的另外的非蛋白质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG),乙二醇/丙二醇共聚物,羧甲基纤维素,右旋糖苷,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,聚-1,3-二氧戊环,聚-1,3,6-三噁烷,乙烯/马来酸酐共聚物,聚氨基酸(或是均聚物或是随机共聚物),和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇,丙二醇均聚物,环氧丙烷/环氧乙烷共聚物,聚氧乙烯化多元醇(例如甘油),聚乙烯醇,及其混合物。由于其在水中的稳定性,聚乙二醇丙醛在制造中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量,而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物的数目可以变化,而且如果附着了超过一个聚合物,那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言,可基于下述考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型,包括但不限于抗体要改进的特定特性或功能,双特异性抗体衍生物是否会用于限定条件下的疗法,等。在另一个方面,提供抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中,非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam,N.W.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可以是任何波长的,而且包括但不限于对普通细胞没有损害,但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
在另一个方面,可获得本文中提供的双特异性抗体的免疫缀合物。“免疫缀合物”是与包括但不限于细胞毒剂在内的一个或多个异源分子缀合的抗体。
术语“核酸”指分离的核酸分子或构建物,例如信使RNA(mRNA),病毒衍生的RNA,或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键,诸如在肽核酸(PNA)中找到的)。术语“核酸分子”指多核苷酸中存在的任一个或多个核酸区段,例如DNA或RNA片段。
“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已经自其天然环境移出的核酸分子,DNA或RNA。例如,出于本发明的目的,认为载体中包含的编码多肽的重组多核苷酸是分离的。分离的多核苷酸的别的例子包括在异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或溶液中(部分或实质性)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括正常情况下含有该多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子,但是该多核苷酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物,以及正和负链形式,和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成生成的此类分子。另外,多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件,诸如启动子,核糖体结合位点,或转录终止子。
具有与本发明的参照核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指除了该多核苷酸序列可包括至多该参照核苷酸序列的每100个核苷酸的5个点突变之外,该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列同一。换言之,为了获得具有与参照核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸,参照序列中至多5％的核苷酸可以删除或用另一种核苷酸替代,或者,在参照序列中,总核苷酸的至多5％的数目的多个核苷酸可插入参照序列。参照序列的这些改变可发生于参照核苷酸序列的5’或3’端位置或那些末端位置之间的任何地方,或是在参照序列中的残基间个别散布或是以一个或多个连续组在参照序列内散布。实际上,使用已知的计算机程序,诸如上文关于多肽讨论的(例如ALIGN-2),可常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％同一。
术语“表达盒”指重组或合成生成的多核苷酸,具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列规定核酸元件。重组表达盒可并入质粒,染色体,线粒体DNA,质体DNA,病毒,或核酸片段。典型地,在其它序列以外,表达载体的重组表达盒部分包括要转录的核酸序列和启动子。在某些实施方案中,本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建物”同义且指用于将与其可操作联合的特定基因导入靶细胞并指导表达的DNA分子。该术语包括作为自身复制性核酸结构的载体以及并入其已经导入的宿主细胞的基因组的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体容许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体在靶细胞内,则由细胞转录和/或翻译机制生成由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中,本发明的表达载体包含包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列的表达盒。
术语“宿主细胞”,“宿主细胞系”,和“宿主细胞培养物”可互换使用且指其中已经导入外源核酸的细胞,包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体/转化子”和“转化细胞”,其包括原代转化细胞和自其衍生的后代,不管传代的次数。后代在核酸内容方面与亲本细胞可以不是完全同一,但是可含有突变。具有与在原始转化细胞中筛选或选择相同的功能或生物学活性的突变体后代包括在本文中。宿主细胞是可用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞,例如培养的哺乳动物细胞,诸如CHO细胞,BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,酵母细胞,昆虫细胞,和植物细胞,仅列举少数,但是还有转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。
药剂的“有效量”指在接受其施用的细胞或组织中导致生理变化必需的量。
药剂(例如药用组合物)的“治疗有效量”指在剂量和时间段方面有效实现想要的治疗或预防结果必需的量。例如,治疗有效量的药剂消除,减轻/减少,延迟,最小化或预防疾病的不利影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛,绵羊,猫,犬,和马),灵长类(例如人和非人灵长类,诸如猴),家兔,和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。特定地,个体或受试者是人。
术语“药用组合物”指其为此类形式的制剂,所述形式允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的,而且所述制剂不含另外的对会接受该配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的成分。
“药学可接受赋形剂”指药用组合物中除了活性组分以外,对受试者无毒的组分。药学可接受赋形剂包括但不限于缓冲剂,稳定剂,或防腐剂。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗性产品的商业包装中的说明书,其含有关于关注此类治疗性产品的使用的适应症,用法,剂量,施用,组合疗法,禁忌症和/或警告的信息。
如本文中使用的,“治疗/处理”指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预,而且可以或是为了预防或是在临床病理学的过程中实施的。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发,缓解症状,削弱疾病的任何直接或间接病理学后果,预防转移,减缓疾病进展的速率,改善或减轻疾病状态,和消退或改善的预后。在一些实施方案中,使用本发明的分子来延迟疾病的发生或减缓疾病的进展。
如本文中使用的术语“癌症”指增殖性疾病,诸如淋巴瘤,癌瘤,淋巴瘤,母细胞瘤,肉瘤,白血病,淋巴细胞性白血病,肺癌,非小细胞肺(NSCL)癌,支气管肺泡细胞肺癌,骨癌,胰腺癌,皮肤癌,头或颈癌,皮肤或眼内黑素瘤,子宫癌,卵巢癌,直肠癌,肛门区癌,胃癌,胃的癌,结肠直肠癌(CRC),胰腺癌,乳腺癌,三重阴性乳腺癌,子宫癌,输卵管癌,子宫内膜癌,宫颈癌,阴道癌,外阴癌,霍奇金(Hodgkin)氏病,食管癌,小肠癌,内分泌系统的癌症,甲状腺癌,甲状旁腺癌,肾上腺癌,软组织肉瘤,尿道癌,阴茎癌,前列腺癌,膀胱癌,肾或输尿管癌,肾细胞癌,肾盂癌,间皮瘤,肝细胞癌,胆道癌,中枢神经系统(CNS)赘生物,脊索瘤,脑干胶质瘤,多形性成胶质细胞瘤,星形细胞瘤,施旺细胞瘤,室管膜瘤,成神经管细胞瘤,脑膜瘤,鳞状细胞癌,垂体腺瘤和尤因氏肉瘤,黑素瘤,多发性骨髓瘤,B细胞癌(淋巴瘤),慢性淋巴细胞性白血病(CLL),急性成淋巴细胞性白血病(ALL),毛细胞白血病,慢性成髓细胞性白血病,包括任何上述癌症的顽固性形式,或一种或多种上述癌症的组合。
本发明的双特异性抗原结合分子
本发明提供具有特别有利的特性的新颖的双特异性抗体,所述特性诸如可生产性,稳定性,结合亲和力,生物学活性,靶向效率和降低的毒性。新颖的双特异性抗体由两条融合多肽组成，融合多肽包含两个能够特异性结合第一靶物的抗原结合域和一个能够特异性结合第二靶物的抗原结合域。令人惊讶的是,以三个抗原结合域能正确组装且双特异性结合有完全功能的方式改造这两条融合多肽。
对于意图朝向临床应用开发的分子,不得不避免功能活性分子的聚集物,意味着形成抗原结合分子的不同融合多肽的组装的纯度和稳定性是非常关键的。重要的是,在本发明的双特异性抗体中,以三个抗原结合域能够正确组装的方式融合全部三个抗原结合域。而且，以每一个抗原结合域均能结合它们各自靶物的方式放置全部三个抗原结合域。而且，本发明的新双特异性抗原结合分子仅仅由两条融合多肽构成且不包含任何轻链。如此,能避免重和轻链之间正确配对的问题。同样重要的是，构建物是以合理的好滴度可表达的且生成好比率的希望产物。包含用于二聚化的间隔物域的抗体样体系结构与其它蛋白质相比是稳定的；它们的表达使用不同细胞系也是非常稳健的。
本发明的新颖的双特异性抗原结合分子称作2+1 Contorsbody。
如此,2+1 Contorsbody是一种双特异性抗体，由两条融合多肽组成且包含两个能够特异性结合第一靶物的抗原结合域和一个能够特异性结合第二靶物的抗原结合域,其中
(a)第一融合多肽包含能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第一部分,间隔物域,能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第二部分和能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第一部分,其中
-间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,
-能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第一部分直接或经由第一肽接头融合至间隔物域的N端,
-能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第二部分直接或经由第二肽接头融合至间隔物域的C端,且
-能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第一部分直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第二部分的C端或直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第一部分的N端,且
(b)第二融合多肽包含能够特异性结合第一靶物的第二抗原结合域的第一部分,间隔物域,能够特异性结合第一靶物的第二抗原结合域的第二部分和能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第二部分,其中
-间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,
-能够特异性结合第一靶物的第二抗原结合域的第一部分直接或经由第一肽接头融合至间隔物域的N端,
-能够特异性结合第一靶物的第二抗原结合域的第二部分直接或经由第二肽接头融合至间隔物域的C端,且
-能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第二部分直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第二抗原结合域的第二部分的C端或直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第二抗原结合域的第一部分的N端,
其中能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第一部分和第二部分彼此联合以形成能够特异性结合第二靶物的抗原结合域且其中能够特异性结合第一靶物的第一和第二抗原结合域的第一部分和第二部分彼此联合以形成环状融合多肽,且
其中第一融合多肽的间隔物域和第二融合多肽的间隔物域通过二硫键彼此共价联合且包含促进第一和第二融合多肽联合的修饰。
在一个方面,提供的是如本文中前面定义的双特异性抗体,其中在第一融合多肽中能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第一部分直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第二部分的C端且其中在第二融合多肽中能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第二部分直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第二部分的C端。
在另一个方面,提供的是如本文中前面定义的双特异性抗体,其中在第一融合多肽中能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第一部分直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第一部分的N端且其中在第二融合多肽中能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第二部分直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第一部分的N端。
如此,在如本文中前面定义的双特异性抗体中,通过柔性肽接头融合原始抗体域。这些接头能够实现Contorsbody分子内的正确域联合,以及抗体的正确折叠。这种新的链拓扑学导致与经典IgG1型式不同的Fab臂和Fc部分空间取向。由于它的抗原结合位点的平行取向,Contorsbody是一种非常适合于激动机制的抗体型式。
在一个方面,提供的是如本文中前面定义的双特异性抗体,其中连接能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第一部分或第二部分的第三肽接头包含至少15个氨基酸。在一个方面,连接能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第一部分的第三肽接头和连接能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第二部分的第三肽接头是同一的。在一个方面,第三肽接头包含15至25个氨基酸。在一个特定方面,第三肽接头包含SEQ ID NO:83或SEQ IDNO:84的氨基酸序列。更加特别地,第三肽接头包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。在又一个方面,第三肽接头(在两种融合多肽中)包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84的氨基酸序列且第一和第二肽接头包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。
在一个方面,本发明提供如本文中前面定义的双特异性抗体,其中第一融合多肽包含能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的重链可变域且第二融合多肽包含能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的抗体轻链可变域或反之。
在一个方面,本发明提供如本文中前面定义的双特异性抗体,其中第一融合多肽包含能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的重链可变域且第二融合多肽包含能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的抗体轻链可变域或反之。在一个特定方面,抗原结合域的第一部分是抗体重链Fab片段且抗原结合域的第二部分是抗体轻链Fab片段或反之。在一个方面,抗原结合域的第一部分和抗原结合域的第二部分通过二硫键彼此共价联合。
在一个备选方面,一种双特异性抗体，由两条融合多肽组成且包含两个能够特异性结合第一靶物的抗原结合域和一个能够特异性结合第二靶物的抗原结合域,其中
(a)第一融合多肽包含能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第一部分,间隔物域,能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第二部分和能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第一部分,其中
-间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,
-能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第一部分直接或经由第一肽接头融合至间隔物域的N端,
-能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第二部分直接或经由第二肽接头融合至间隔物域的C端,且
-能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第一部分直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第二部分的C端或直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合第一靶物的第一抗原结合域的第一部分的N端,且
(b)第二融合多肽包含能够特异性结合第一靶物的第二抗原结合域的第一部分,间隔物域,能够特异性结合第一靶物的第二抗原结合域的第二部分和能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第二部分,其中
-间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,
-能够特异性结合第一靶物的第二抗原结合域的第一部分直接或经由第一肽接头融合至间隔物域的N端,
-能够特异性结合第一靶物的第二抗原结合域的第二部分直接或经由第二肽接头融合至间隔物域的C端,且
(c)轻链包含能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第二部分,
其中能够特异性结合第二靶物的抗原结合域的第一部分和第二部分彼此联合以形成能够特异性结合第二靶物的抗原结合域且其中能够特异性结合第一靶物的第一和第二抗原结合域的第一部分和第二部分彼此联合以形成环状融合多肽,且
其中第一融合多肽的间隔物域和第二融合多肽的间隔物域通过二硫键彼此共价联合且包含促进第一和第二融合多肽联合的修饰。
在一些方面,抗原结合域的第一部分是抗体重链Fab片段且抗原结合域的第二部分是抗体轻链Fab片段或反之。在一个方面,抗原结合域的第一部分和抗原结合域的第二部分通过二硫键彼此共价联合。
在一个方面,提供的是如本文中前面定义的双特异性抗体,其中在第一融合多肽和第二融合多肽二者中能够特异性结合第一靶物的抗原结合域的第一部分是抗体重链Fab片段且能够特异性结合第一靶物的抗原结合域的第二部分是抗体轻链Fab片段。
如果抗原结合域是Fab片段,那么Fab可以是常规Fab,交叉Fab或DutaFab。
在常规Fab的情况中,抗原结合域的第一部分包含抗体重链可变域(VH)和第一抗体重链恒定域(CH1)的至少N端片段(或整个)且相应的抗原结合域的第二部分包含抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL或Cκ)的至少N端片段(或整个)。这些域的次序可以是任何次序，只要它们的联合和(功能性)抗原结合域的形成是可能的(即不被阻止)。在一个方面,抗原结合域的一个部分以N至C端方向包含VH-CH1且抗原结合域的另一个部以N至C端方向包含VL-CL(Cκ)。
在交叉Fab的情况中，抗原结合域的两个部分每个包含抗体可变域和抗体恒定域的至少N端片段(或整个)，其中成对可变域和恒定域不是彼此天然相关的且是通过重链域和轻链域的域交换/互换获得的。这可以是VH与VL或CH1与CL的交换。这些域的次序可以是任何次序，只要它们的联合和(功能性)结合位点的形成是可能的(即不被阻止)。在一个方面,抗原结合域的第一部分以N至C端方向包含VL-CH1且结合域的第二部分以N至C端方向包含VH-CL(Cκ)。在另一个方面,抗原结合域的第一部分以N至C端方向包含VH-CL且抗原结合域的第二部分以N至C端方向包含VL-CH1。
在DutaFab的情况中,抗原结合域的第一部分包含抗体重链可变域(VH)和第一抗体重链恒定域(CH1)的至少N端片段(或整个)且相应的第二抗原结合域包含抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL)的至少N端片段(或整个),其中所述抗原结合域包含重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)的互补对中的两个非交叠互补位,其中第一互补位包含来自VL域CDR1和CDR3和VH域CDR2的残基,且第二互补位包含来自VH域CDR1和CDR3和VL域CDR2的残基。
如此,在一个方面,抗原结合域的第一部分是抗体重链Fab片段(VH-CH1)且抗原结合域的第二部分是抗体轻链Fab片段(VL-Cκ)。在另一个方面,抗原结合域的第一部分是抗体轻链Fab片段且抗原结合域的第二部分是抗体重链Fab片段。在另一个方面,抗原结合域的第一部分是包含VH-Cκ的抗体交叉Fab片段且抗原结合域的第二部分是包含VL-CH1的抗体交叉Fab片段。在又一个方面,抗原结合域的第一部分是包含VL-CH1的抗体交叉Fab片段且抗原结合域的第二部分是包含VH-Cκ的抗体交叉Fab片段。
在一个特定方面,本发明提供一种双特异性抗体,其中能够特异性结合第二靶物的抗原结合域是交叉Fab且其中两个能够特异性结合第一靶物的抗原结合域均是常规Fab。
在另一个方面,本发明提供一种双特异性抗体,其中能够特异性结合第二靶物的抗原结合域是常规Fab且其中两个能够特异性结合第一靶物的抗原结合域均是交叉Fab。
如上文描述的,双特异性抗体由均包含间隔物域的第一和第二融合多肽组成,第一融合多肽的间隔物域和第二融合多肽的间隔物域通过二硫键彼此共价联合且包含促进第一和第二融合多肽联合的修饰。间隔物域包含至少25个氨基酸。
在本发明的一个方面,间隔物域包含抗体铰链区或其(C端)片段和抗体CH2域或其(N端)片段。在另一个方面,间隔物域包含抗体铰链区或其片段,抗体CH2域,和抗体CH3域或其片段。在一个方面,如本文中描述的融合多肽的间隔物域是抗体Fc域,特别是IgG1,IgG2或IgG4亚类的,更特别是IgG1亚类的。
在一个方面,间隔物域包含具有选自由SEQ ID NO:103,Seq ID NO:104,SEQ IDNO:105,SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:107组成的组的氨基酸序列的Fc域,或其95％同源性变体。
而且,第一融合多肽的间隔物域和第二融合多肽的间隔物域包含促进第一和第二融合多肽联合的修饰。在一个特定方面,依照节入穴方法第一融合多肽的间隔物域包含穴且第二融合多肽的间隔物域包含节。在又一个方面,本发明包含一种双特异性抗体,其中间隔物域包含抗体铰链区或其片段和IgG1 Fc域。特别地,IgG1 Fc域包含降低对Fc受体,特别是Fcγ受体的结合的一处或多处氨基酸替代。在一个特定方面,IgG1 Fc域包含氨基酸替代L234A和L235A。在另一个方面,IgG1 Fc域包含突变P329G。更加特别地,IgG1 Fc域包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。
在另一个方面,如本文中报告的Fc域是IgG1或IgG2亚类的且包含突变PVA236,GLPSS331,和/或L234A/L235A/P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。在又一个方面,如本文中报告的Fc域是IgG4亚类的且包含突变L235E。在一个方面,Fc域进一步包含突变S228P。在一个方面,IgG4亚类的Fc域包含突变P329G。在一个方面,如本文中报告的Fc域是IgG4亚类的且包含突变S228P/L235E/P329G(所有编号方式依照Kabat的EU索引)。
在一些方面,提供的是一种双特异性抗体，其中一个能够特异性结合第二靶物的抗原结合域是能够特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合域。特别地,肿瘤相关抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)。在一个方面,提供的是一种双特异性抗体,其中能够特异性结合第二靶物的抗原结合域是能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)的抗原结合域。
促进异二聚化的Fc域修饰
在一个方面,本发明的双特异性抗体可包含(a)如本文中前面定义的第一融合多肽和如本文中前面定义的第二融合多肽,其中第一和第二融合多肽包含促进第一和第二融合多肽联合的修饰。典型地,在Fc域中引入这些修饰。两种结构不同的融合多肽的重组共表达和后续二聚化会导致两条多肽的数种可能组合。为了改善重组生成中双特异性抗体的产率和纯度,在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc域中引入促进想要的多肽的联合的修饰如此会是有利的。
人IgG Fc域的两个亚基之间最广泛蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc域的CH3域中。如此,所述修饰特别是在Fc域的CH3域中。
在一个具体方面,所述修饰是所谓的“节-入-穴”修饰,包含Fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和Fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。如此,在一个特定方面,本发明涉及如本文中之前描述的双特异性抗原结合分子,其包括IgG分子,其中第一重链的Fc部分包含第一二聚化模块且第二重链的Fc部分包含第二二聚化模块,容许IgG分子的两条重链异二聚化,而且依照节入穴技术,第一二聚化模块包含节且第二二聚化模块包括穴。
“节入穴”技术例如描述于US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人Prot Eng9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常,该方法包括在第一多肽的界面处引入突起(“节”)并且在第二多肽的界面中引入相应的腔(“穴”),使得该突起可以定位在该腔中,从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链,在第二多肽的界面中产生与突起具有相同或相似大小的补偿腔。
可以通过例如WO 96/027011；Ridgway,J.B.,et al.,Protein Eng.9(1996)617-621；和Merchant,A.M.,et al.,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681中以数个例子详细描述的“节-入-穴”技术改变如本文中报告的第一和第二融合多肽中的CH3域。在这种方法中，改变两个CH3域的相互作用表面以提高含有这两种CH3域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两种CH3域中的每一个可以是“节”,而另一个是“穴”。引入二硫桥进一步使异二聚体稳定(Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.,et al.,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并提高产率。
因此,在一个特定方面,在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc域的第一亚基的CH3域中,将氨基酸残基替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基,由此在第一亚基的CH3域内产生可定位于第二亚基的CH3域内的腔中的突起；并且在Fc域的第二亚基的CH3域中,将氨基酸残基替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基,由此在第二亚基的CH3域内产生可将第一亚基的CH3域内的突起定位在其中的腔。
在一个具体方面,在Fc域的第一亚基(“节链”)的CH3域中,第366位的苏氨酸残基替换为色氨酸残基(T366W),而在Fc域的第二亚基的CH3域中,第407位酪氨酸残基替换为缬氨酸残基(Y407V)。更加特别地,在Fc域的第二亚基(“穴链”)中,另外将366位的苏氨酸残基替换为丝氨酸残基(T366S),将368位的亮氨酸残基替换为丙氨酸残基(L368A)。更加特别地，在Fc域的第一亚基中,另外将第354位的丝氨酸残基替换为半胱氨酸残基(S354C),而在Fc域的第二亚基中,另外将第349位酪氨酸残基替换为半胱氨酸残基(Y349C)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc域的两个亚基之间形成二硫桥。二硫桥进一步使二聚体稳定(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
但是，或者/另外，还可以使用其它节入穴技术，如EP 1870459 A1描述的。在一个实施方案中，如本文中报告的多环状融合多肽包含“节链”的CH3域中的R409D和K370E突变和“穴链”的CH3域中的D399K和E357K突变(编号方式依照Kabat EU索引)。
在又一个方面,双特异性抗原结合分子可包含两个CH3域之一中的Y349C和T366W突变和两个CH3域之另一中的S354C,T366S,L368A和Y407V突变,或者如本文中报告的双特异性抗原结合分子包含两个CH3域之一中的Y349C和T366W突变和两个CH3域之另一中的S354C,T366S,L368A和Y407V突变和另外地“节链”的CH3域中的R409D和K370E突变和“穴链”的CH3域中的D399K和E357K突变(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个替代方面,促进Fc域的第一和第二亚基的联合的修饰包括介导静电操纵效应的修饰,例如,如PCT公开WO 2009/089004中所述。通常,这种方法包括通过将两个Fc域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基,使得在静电方面不利于同二聚体形成,但在静电方面有利于异二聚化。
除了“节入穴技术”以外，本领域还知道用于修饰重链的CH3域以强化异二聚化的其它技术。本文中涵盖这些技术作为“节入穴技术”的备选，与如本文中描述的双特异性抗原结合分子组合,尤其是WO 96/27011,WO 98/050431,EP 1870459,WO 2007/110205,WO2007/147901,WO 2010/129304,WO 2011/90754,WO 2011/143545,WO 2012/058768,WO2013/157954和WO 2013/096291中描述的。
在一个方面,引入第一和第二重链二者之间的CH3/CH3域界面中的特定氨基酸位置处具有相反电荷的带电荷氨基酸以进一步促进期望多肽的联合。因而，这个方面涉及如本文中公开的双特异性抗原结合分子,其中在抗体的三级结构中第一重链的CH3域和第二重链的CH3域形成界面，位于相应抗体CH3域之间,其中相应的第一重链的CH3域和第二重链的CH3域的氨基酸序列每个包含位于环状融合多肽的三级结构中的所述界面内的一组氨基酸,且其中来自位于一条重链的CH3域中的界面中的一组氨基酸的第一氨基酸用带正电荷的氨基酸替代且来自位于另一条重链的CH3域中的界面中的一组氨基酸的第二氨基酸用带负电荷的氨基酸替代。依照这个方面的双特异性抗原结合分子在本文中还称作“CH3(+/-)改造的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子”(其中缩写“+/-”代表在相应CH3域中引入的带相反电荷的氨基酸)。在如本文中报告的所述CH3(+/-)改造的双特异性抗原结合分子的一个方面，带正电荷的氨基酸选自K,R和H,且带负电荷的氨基酸选自E或D。在另一个方面,在如本文中报告的所述CH3(+/-)改造的双特异性抗原结合分子中，带正电荷的氨基酸选自K和R,且带负电荷的氨基酸选自E或D。在又一个方面,在如本文中报告的所述CH3(+/-)改造的双特异性抗原结合分子中，带正电荷的氨基酸是K,且带负电荷的氨基酸是E。在一个方面,在如本文中报告的所述CH3(+/-)改造的双特异性抗原结合分子中，在一条重链的CH3域中位置409处的氨基酸R用D替代且位置370处的氨基酸K用E替代,且在另一条重链的CH3域中位置399处的氨基酸D用K替代且位置357处的氨基酸E用K替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在本发明的又一个方面,IgG1 Fc域包含降低对Fc受体,特别是Fcγ受体的结合的一处或多处氨基酸替代。
降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰
本发明的双特异性抗体可包含免疫球蛋白分子的重链域作为间隔物域。例如,免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域是二聚体,其每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定域。Fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。Fc区赋予本发明的双特异性抗体以有利的药动学特性,包括长血清半衰期,其有助于在靶组织中的较好积累和有利的组织-血液分配比。然而,同时它可能导致不想要的本发明的双特异性抗体对表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。因而,在具体的实施方案中,本发明的双特异性抗体的Fc区展现出与天然IgG Fc区,特别是IgG1 Fc区或IgG4 Fc区相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。更加特别地,Fc区是IgG1 Fc区。
在一个此类方面,Fc区(或包含所述Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子)展现出与天然IgG1 Fc区(或包含天然IgG1 Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子)相比少于50％,优选少于20％,更优选少于10％且最优选少于5％的对Fc受体的结合亲和力,和/或与天然IgG1 Fc区(或包含天然IgG1 Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子)相比少于50％,优选少于20％,更优选少于10％且最优选少于5％的效应器功能。在一个方面,Fc区(或包含所述Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子)没有实质性结合Fc受体和/或诱导效应器功能。在一个特定的方面,所述Fc受体是Fcγ受体。在一个方面,所述Fc受体是人Fc受体。在一个方面,所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体的方面,所述Fc受体是活化性人Fcγ受体,更具体地是人FcγRIIIa,FcγRI或FcγRIIa,最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面,所述Fc受体是抑制性Fc受体。在一个具体的方面,所述Fc受体是抑制性人Fcγ受体,更具体地是人FcγRIIB。在一个方面,效应器功能是CDC,ADCC,ADCP,和细胞因子分泌中的一项或多项。在一个特定的方面,所述效应器功能是ADCC。在一个方面,所述Fc区结构域展现出与天然IgG1 Fc区相比基本相似的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当Fc区(或包含所述Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子)展现出超过约70％,特别是超过约80％,更特别是超过约90％的天然IgG1 Fc区(或包含天然IgG1 Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力时,实现基本相似的对FcRn的结合。
在一个特定的方面,Fc区工程化改造为具有与非工程化Fc区相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个特定的方面,本发明的双特异性抗原结合分子的Fc区包含一处或多处降低Fc区对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常,Fc区的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个方面,所述氨基酸突变降低Fc区对Fc受体的结合亲和力。在另一个方面,所述氨基酸突变将Fc区对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍,至少5倍,或至少10倍。在一个方面,包含工程化Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子展现出与包含非工程化Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子相比少于20％,特别是少于10％,更特别是少于5％的对Fc受体的结合亲和力。在一个特定的方面,所述Fc受体是Fcγ受体。在其它方面,所述Fc受体是人Fc受体。在一个方面,所述Fc受体是抑制性Fc受体。在一个具体的方面,所述Fc受体是抑制性人Fcγ受体,更具体地是人FcγRIIB。在一些方面,所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体的方面,所述Fc受体是活化性人Fcγ受体,更特别是人FcγRIIIa,FcγRI或FcγRIIa,最特别是人FcγRIIIa。优选地,对这些受体的每一种的结合是降低的。在一些方面,对补体成分的结合亲和力,特别是对C1q的结合亲和力也是降低的。在一个方面,对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当Fc区(或包含所述Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子)展现出非工程化形式的Fc区(或包含所述非工程化形式的Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的超过约70％时,实现基本相似的对FcRn的结合,即保留该Fc区对所述受体的结合亲和力。Fc区或包含所述Fc区的本发明的双特异性抗原结合分子可以展现出超过约80％和甚至超过约90％的此类亲和力。在某些实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子的Fc区工程化改造为具有与非工程化Fc区相比降低的效应器功能。所述降低的效应器功能可包括但不限于下列一项或多项:降低的补体依赖性细胞毒性(CDC),降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP),降低的细胞因子分泌,降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取,降低的对NK细胞的结合,降低的对巨噬细胞的结合,降低的对单核细胞的结合,降低的对多形核细胞的结合,降低的诱导凋亡的直接信号传导,降低的树突细胞成熟,或降低的T细胞引发。
在某些方面,提供的是拥有一些但不是所有效应器功能的双特异性抗体,使其成为如下应用的期望候选物,其中体内半衰期是重要的,而某些效应器功能(诸如CDC和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如,可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保环状融合蛋白缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性),但是保留FcRn结合能力。
因而,在特定方面,与天然IgG1 Fc域相比,本发明的双特异性抗体的Fc域展现降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个方面,Fc并不实质性结合Fc受体和/或并不诱导效应器功能。在一个特定方面,Fc受体是Fcγ受体。在一个方面,Fc受体是人Fc受体。在一个具体方面,Fc受体是活化性人Fcγ受体,更具体地是人FcγRIIIa,FcγRI或FcγRIIa,最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面,Fc域并不诱导效应器功能。降低的效应器功能可包括但不限于下述一种或多种:降低的补体依赖性细胞毒性(CDC),降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP),降低的细胞因子分泌,降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取,降低的对NK细胞的结合,降低的对巨噬细胞的结合,降低的对单核细胞的结合,降低的对多形核细胞的结合,降低的诱导凋亡的直接信号传导,降低的树突细胞成熟,或降低的T细胞引发。
在某些方面,可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的双特异性抗原结合分子的Fc区,由此生成Fc区变体。Fc区变体可包含包含一个或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1,IgG2,IgG3或IgG4 Fc区)。
在一个特定方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其中间隔物域包含Fc域，Fc域包含一处或多处降低对Fc受体,特别是对Fcγ受体的结合的氨基酸替代。
在一个方面,本发明的双特异性抗原结合分子的Fc域包含一处或多处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。典型地,在Fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。特别是,Fc域包含位置E233,L234,L235,N297,P331和P329(EU编号方式)处的氨基酸替代。特别是,Fc域包含IgG重链的位置234和235(EU编号方式)和/或329(EU编号方式)处的氨基酸替代。更特别地,提供的是依照本发明的双特异性抗原结合分子,其包含具有IgG重链中的氨基酸替代L234A,L235A和P329G(“P329G LALA”,EU编号方式依照Kabat)的Fc域。氨基酸替代L234A和L235A指所谓的LALA突变。“P329GLALA”氨基酸替代组合几乎完全消除人IgG1Fc域的Fcγ受体结合且在国际专利申请公开号WO 2012/130831 A1中描述,其还描述了制备此类突变体Fc域的方法及用于测定其特性诸如Fc受体结合或效应器功能的方法。“EU编号方式”指依照Kabat et al.,Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991的EU索引的编号方式。
具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域还包括那些具有Fc域残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265,269,270,297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体,包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
在另一个方面,Fc域是IgG4 Fc域。与IgG1抗体相比,IgG4抗体展现降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。在一个更具体方面,Fc域是包含位置S228(Kabat编号方式)处的氨基酸替代,特别是氨基酸替代S228P的IgG4 Fc域。在一个更具体方面,Fc域是包含氨基酸替代L235E和S228P和P329G(EU编号方式)的IgG4 Fc域。此类IgG4 Fc域突变体和其Fcγ受体结合特性也在WO 2012/130831中描述。
突变体Fc域可使用本领域公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除,替代,插入或修饰来制备。遗传方法可包括编码DNA序列的位点特异性诱变,PCR,基因合成,等等。正确的核苷酸变化可例如通过测序来验证。
可以例如通过ELISA或通过使用诸如BIAcore仪(GE Healthcare)的标准仪器的表面等离振子共振(SPR)容易地确定与Fc受体的结合,并且可以诸如通过重组表达获得Fc受体。适合的此类结合测定法描述于本文中。或者,可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来评估Fc域或包含Fc域的细胞活化性双特异性抗原结合分子针对Fc受体的结合亲和力。
可以通过本领域已知的方法测量Fc域或包含Fc域的本发明的双特异性抗体的效应器功能。适合的用于测量ADCC的测定法描述于本文中。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其他实例描述于美国专利No.5,500,362；Hellstrom等人,Proc.Natl Acad SciUSA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人,Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann等人,J Exp Med 166,1351-1361(1987)。或者,可以采用非放射性测定方法(参见,例如ACTITM non-radioactive cytotoxicity assayfor flow cytometry(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox
Figure BDA0002429335460000591
non-radioactive cytotoxicity assay(Promega,Madison,WI))。用于这种测定法的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代地,或另外地,可以在体内,例如,在Clynes等人,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中评估感兴趣分子的ADCC活性。
在一些实施方案中,Fc域对补体成分,具体是C1q的结合降低。因而,在其中将Fc域工程化改造成具有降低的效应器功能的一些实施方案中,所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定法来确定本发明的双特异性抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化,可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro et al.,J Immunol Methods202,163(1996)；Cragg et al.,Blood 101,1045-1052(2003)；和Cragg and Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
在特定方面,双特异性抗原结合分子包含(所有位置依照Kabat的EU索引)
i)人IgG1亚类的同二聚体Fc区，任选具有突变P329G,L234A和L235A,或
ii)人IgG4亚类的同二聚体Fc区，任选具有突变P329G,S228P和L235E,或
iii)人IgG1亚类的同二聚体Fc区，任选具有突变P329G,L234A,L235A,I253A,H310A,和H435A,或任选具有突变P329G,L234A,L235A,H310A,H433A,和Y436A,或
iv)异二聚体Fc区，其中
a)一条Fc区多肽包含突变T366W,且另一条Fc区多肽包含突变T366S,L368A和Y407V,或
b)一条Fc区多肽包含突变T366W和Y349C,且另一条Fc区多肽包含突变T366S,L368A,Y407V,和S354C,或
c)一条Fc区多肽包含突变T366W和S354C,且另一条Fc区多肽包含突变T366S,L368A,Y407V和Y349C,或
v)人IgG1亚类的异二聚体Fc区，其中两条Fc区多肽均包含突变P329G,L234A和L235A，且
a)一条Fc区多肽包含突变T366W,且另一条Fc区多肽包含突变T366S,L368A和Y407V,或
b)一条Fc区多肽包含突变T366W和Y349C,且另一条Fc区多肽包含突变T366S,L368A,Y407V,和S354C,或
c)一条Fc区多肽包含突变T366W和S354C,且另一条Fc区多肽包含突变T366S,L368A,Y407V和Y349C,或
vi)人IgG4亚类的异二聚体Fc区，其中两条Fc区多肽均包含突变P329G,S228P和L235E，且
a)一条Fc区多肽包含突变T366W,且另一条Fc区多肽包含突变T366S,L368A和Y407V,或
b)一条Fc区多肽包含突变T366W和Y349C,且另一条Fc区多肽包含突变T366S,L368A,Y407V,和S354C,或
c)一条Fc区多肽包含突变T366W和S354C,且另一条Fc区多肽包含突变T366S,L368A,Y407V和Y349C,或
vii)i),ii),和iii)之一与iv),v)和vi)之一的组合。
如本文中报告的双特异性抗体中包含的融合多肽的C端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C端。C端可以是缩短的C端,其中去除了一个或两个C端氨基酸残基。在一个优选的实施方案中,C端是以氨基酸残基PG结束的缩短的C端。
在一些方面,提供的是一种双特异性抗体，其中一个能够特异性结合第二靶物的抗原结合域是能够特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合域。特别地,肿瘤相关抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)。在一个方面,提供的是一种双特异性抗体,其中能够特异性结合第二靶物的抗原结合域是能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)的抗原结合域。
结合TNF受体和FAP的双特异性抗体
在一些方面,能够特异性结合FAP的抗原结合域包含
(a)重链可变区(VHFAP)，包含(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLFAP)，包含(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3,或
(b)重链可变区(VHFAP)，包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLFAP)，包含(iv)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3。
更加特别地,能够特异性结合FAP的抗原结合域包含
(a)包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)，和包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP),或
(b)包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP),和包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)。
在一个特定方面,能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)，和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)，。在一个方面,能够特异性结合FAP的抗原结合域由包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)组成。
在另一个方面,能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)，和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)。在一个方面,能够特异性结合FAP的抗原结合域由包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)组成。
在一个方面,本文中提供的双特异性抗体单价结合FAP。
结合OX40和FAP的双特异性抗体
在一些方面,提供的是一种双特异性抗体，其中能够特异性结合第一靶物的抗原结合域是能够特异性结合TNF受体,特别是共刺激性TNF受体的抗原结合域。特别地,共刺激性TNF受体是OX40。在一个方面,提供的是一种双特异性抗体,其中能够特异性结合第一靶物的抗原结合域是能够特异性结合OX40的抗原结合域。特别地,本发明的双特异性抗体包含两个能够特异性结合OX40的抗原结合域。
在一些方面,能够特异性结合OX40的抗原结合域包含
(a)重链可变区(VHOX40),包含(i)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLOX40),包含(iv)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-L3,或
(b)重链可变区(VHOX40),包含(i)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLOX40),包含(iv)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-L3,或
(c)重链可变区(VHOX40),包含(i)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLOX40),包含(iv)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-L3,或
(d)重链可变区(VHOX40),包含(i)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLOX40),包含(iv)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L3,或
(e)重链可变区(VHOX40),包含(i)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLOX40),包含(iv)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L3,或
(f)重链可变区(VHOX40),包含(i)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLOX40),包含(iv)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L3,或
(g)重链可变区(VHOX40),包含(i)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLOX40),包含(iv)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-L3。
特别地,能够特异性结合OX40的抗原结合域包含重链可变区(VHOX40),包含(i)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLOX40),包含(iv)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些方面,能够特异性结合OX40的抗原结合域包含
(a)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40)和包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40),或
(b)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40)和包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40),或
(c)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40)和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40),或
(d)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40)和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40),或
(e)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40)和包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40),或
(f)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40)和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40),或
(g)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40)和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40)。
在一个特定方面,能够特异性结合OX40的抗原结合域包含(a)包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40),和包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40)。
在一个特定方面,能够特异性结合OX40的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40)和包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40)。在一个方面,能够特异性结合OX40的抗原结合域由包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40)和包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40)组成。
在一个方面,提供双特异性抗体，其包含两个能够特异性结合OX40的抗原结合域，包含包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区(VHOX40)和包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的轻链可变区(VLOX40)。
更加特别地,本发明提供一种双特异性抗体,其中双特异性抗体包含
(a)包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,
(b)包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,
(c)包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:59的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,
(d)包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,
(e)包含与SEQ ID NO:62的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,
(f)包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,或
(g)包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:67的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽。
在一个方面,双特异性抗体包含
(a)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的第二融合多肽,
(b)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的第二融合多肽,
(c)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的第二融合多肽,
(d)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的第二融合多肽,
(e)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的第二融合多肽,
(f)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的第二融合多肽,或
(g)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的第二融合多肽。
而且,本发明提供一种双特异性抗体,其中双特异性抗体包含
(a)包含与SEQ ID NO:116的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:117的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,
(b)包含与SEQ ID NO:118的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:119的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,
(c)包含与SEQ ID NO:120的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:121的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,
(d)包含与SEQ ID NO:122的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:123的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,
(e)包含与SEQ ID NO:124的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:125的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,
(f)包含与SEQ ID NO:126的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,包含与SEQ ID NO:127的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,和与SEQ ID NO:128的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的轻链,
(g)包含与SEQ ID NO:129的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:130的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,
(h)包含与SEQ ID NO:131的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:132的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,或
(i)包含与SEQ ID NO:133的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:134的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽。
在一个方面,双特异性抗体包含
(a)包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的第二融合多肽,
(b)包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第二融合多肽,
(c)包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的第二融合多肽,
(d)包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的第二融合多肽,
(e)包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的第二融合多肽,
(f)包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的第一融合多肽,包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的第二融合多肽,和包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的轻链,
(g)包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的第二融合多肽,
(h)包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的第二融合多肽,或
(i)包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的第二融合多肽。
结合4-1BB和FAP的双特异性抗体
在一些方面,提供的是一种双特异性抗体，其中能够特异性结合第一靶物的抗原结合域是能够特异性结合TNF受体的抗原结合域,其中共刺激性TNF受体是4-1BB。在一个方面,提供的是一种双特异性抗体,其中能够特异性结合第一靶物的抗原结合域是能够特异性结合4-1BB的抗原结合域。特别地,本发明的双特异性抗体包含两个能够特异性结合4-1BB的抗原结合域。
在一些方面,能够特异性结合4-1BB的抗原结合域包含重链可变区(VH4-1BB),包含(i)包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VL4-1BB),包含(iv)包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的CDR-L3。在一个方面,能够特异性结合4-1BB的抗原结合域包含包含与SEQ ID NO:141的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH4-1BB),和包含与SEQ ID NO:142的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL4-1BB)。
在一个特定方面,能够特异性结合4-1BB的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的重链可变区(VH4-1BB)和包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的轻链可变区(VL4-1BB)。在一个方面,能够特异性结合4-1BB的抗原结合域由包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的重链可变区(VH4-1BB)和包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的轻链可变区(VL4-1BB)组成。
特别地,本发明提供一种双特异性抗体,其中双特异性抗体包含
(a)包含与SEQ ID NO:143的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:144的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,或
(b)包含与SEQ ID NO:145的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:146的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽。
在一个方面,双特异性抗体包含
(a)包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的第二融合多肽,或
(b)包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的第二融合多肽。
结合CD40和FAP的双特异性抗体
在一些方面,提供的是一种双特异性抗体，其中能够特异性结合第一靶物的抗原结合域是能够特异性结合TNF受体的抗原结合域,其中共刺激性TNF受体是CD40。在一个方面,提供的是一种双特异性抗体,其中能够特异性结合第一靶物的抗原结合域是能够特异性结合CD40的抗原结合域。特别地,本发明的双特异性抗体包含两个能够特异性结合CD40的抗原结合域。
在一些方面,能够特异性结合CD40的抗原结合域包含重链可变区(VHCD40),包含(i)包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(VLCD40),包含(iv)包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的CDR-L3。在一个方面,能够特异性结合CD40的抗原结合域包含包含与SEQ ID NO:153的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VHCD40),和包含与SEQ ID NO:154的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VLCD40)。
在另一个方面,能够特异性结合第一靶物的抗原结合域是能够特异性结合CD40的抗原结合域，其包含
(i)包含选自由SEQ ID NO:167,SEQ ID NO:168,SEQ ID NO:169和SEQ ID NO:170组成的组的氨基酸序列的重链可变区(VHCD40),和包含选自由SEQ ID NO:171,SEQ ID NO:172,SEQ ID NO:173,和SEQ ID NO:174组成的组的氨基酸序列的轻链可变区(VLCD40),或
(ii)包含选自由SEQ ID NO:175,SEQ ID NO:176,SEQ ID NO:177,SEQ ID NO:178,SEQ ID NO:179和SEQ ID NO:180组成的组的氨基酸序列的重链可变区(VHCD40),和包含选自由SEQ ID NO:181,SEQ ID NO:182,SEQ ID NO:183,和SEQ ID NO:184组成的组的氨基酸序列的轻链可变区(VLCD40)。
在一个方面,能够特异性结合第一靶物的抗原结合域是能够特异性结合CD40的抗原结合域，其包含
(a)包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的重链可变区(VHCD40),和包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的轻链可变区(VLCD40),或
(b)包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的重链可变区(VHCD40),和包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链可变区(VLCD40)。
特别地,本发明提供一种双特异性抗体,其中双特异性抗体包含
(a)包含与SEQ ID NO:155的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:156的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,
(b)包含与SEQ ID NO:157的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:158的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,
(c)包含与SEQ ID NO:159的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:160的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,
(d)包含与SEQ ID NO:161的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:162的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,
(e)包含与SEQ ID NO:163的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:164的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽,或
(f)包含与SEQ ID NO:165的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含与SEQ ID NO:166的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的第二融合多肽。
在一个方面,双特异性抗体包含
(a)包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的第二融合多肽,
(b)包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的第二融合多肽,
(c)包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的第二融合多肽,
(d)包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的第二融合多肽,
(e)包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第二融合多肽,或
(f)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的第一融合多肽,和包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的第二融合多肽。
Fab域中的修饰
在一个方面,本发明涉及一种双特异性抗体,其包含(a)两个能够特异性结合OX40的Fab片段和(b)一个能够特异性结合FAP的Fab片段,其中在Fab片段中的(a)和(b)之一中可变域VH和VL或恒定域CH1和CL任一是交换的。该双特异性抗体依照Crossmab技术来制备。
具有一个结合臂中的域替换/交换的多特异性抗体(CrossMabVH-VL或CrossMabCH-CL)详细记载于WO2009/080252和Schaefer,W.et al.,PNAS,108(2011)11187-1191。它们清楚地减少由针对第一抗原的轻链与错误的针对第二抗原的重链错配引起的副产物(与没有此类域交换的办法相比)。
在一个方面,本发明涉及一种双特异性抗体，其包含(a)两个能够特异性结合OX40的Fab片段和(b)一个能够特异性结合FAP的交叉Fab片段,其中恒定域CL(Cκ)和CH1彼此替换使得CH1域融合至VL域且CL域融合至VH域。
在另一个方面,本发明涉及一种双特异性抗体,其包含(a)两个能够特异性结合OX40的交叉Fab片段,其中VH域融合至CL(Cκ)域且VL域融合至CH1域和(b)一个能够特异性结合FAP的Fab片段。
在另一个方面,及为了进一步改善正确配对,双特异性抗体可含有不同的带电荷的氨基酸替代(所谓的“带电荷的残基”)。在交叉或非交叉CH1和CL域中引入这些修饰。在一个特定的方面,本发明涉及一种双特异性抗体,其中在CL域之一中位置123(EU编号方式)处的氨基酸被精氨酸(R)替换且位置124(EU编号方式)处的氨基酸被赖氨酸(K)替代(正电荷)且其中在CH1域之一中位置147(EU编号方式)处的和位置213(EU编号方式)处的氨基酸被谷氨酸(E)替代(负电荷)。
更加特别地,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含Fab,其中在CL域中位置123(EU编号方式)处的氨基酸被精氨酸(R)替换且位置124(EU编号方式)处的氨基酸被赖氨酸(K)替代,且其中在CH1域中位置147(EU编号方式)处的和位置213(EU编号方式)处的氨基酸被谷氨酸(E)替代。
因而,在一些实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子的一个或多个Fab片段(例如能够特异性结合OX40的Fab片段)包含包含精氨酸(R)作为位置123(EU编号方式)处的氨基酸和赖氨酸(K)作为位置124(EU编号方式)处的氨基酸的CL域,和包含谷氨酸(E)作为位置147(EU编号方式)处的氨基酸和谷氨酸(E)作为位置213(EU编号方式)处的氨基酸的CH1域。
多核苷酸
本发明进一步提供了编码如本文中描述的发明的双特异性抗体的分离的核酸或其片段。
编码本发明的双特异性抗体的分离的核酸可以作为编码整个抗原结合分子的单个多核苷酸或共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸来表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以通过例如二硫键或其他手段联合以形成功能性抗原结合分子。在共表达时融合多肽联合以形成能够特异性结合第二靶物(例如FAP)的抗原结合域。能够特异性结合第一靶物(例如OX40)的抗原结合域可以由一种多核苷酸编码。在共表达时融合多肽将联合以形成双特异性抗体。
在某些实施方案中,该多核苷酸或核酸是DNA。在其它实施方案中,本发明的多核苷酸是RNA,例如处于信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
依照本发明的另一个方面,提供有分离的多核苷酸,其编码如本文中之前描述的融合多肽。本发明进一步提供包含本发明的分离的多核苷酸的载体,特别是表达载体和包含分离的多核苷酸或本发明的载体的宿主细胞。在一些实施方案中,宿主细胞是真核细胞,特别是哺乳动物细胞。
在另一个方面,提供的是一种用于生成本发明的双特异性抗体的方法,其包含下述步骤:(i)在适合于所述抗体表达的条件下培养本发明的宿主细胞,并(ii)分离所述双特异性抗体。本发明还涵盖通过本发明的方法生成的双特异性抗体。
重组方法
可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得本发明的双特异性抗原结合分子。对于重组生产,分离一个或多个编码例如上文所述的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸,并将其插入到一个或多个载体中用于进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用常规程序容易地分离这样的多核苷酸并将其测序。在本发明的一个方面,提供了包含一个或多个本发明的多核苷酸的载体,优选表达载体。可使用本领域技术人员熟知的方法构建包括双特异性抗原结合分子(片段)的编码序列以及适当的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术,合成技术和体内重组/遗传重组。参见,例如描述于Maniatis等人,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold SpringHarbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等人,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)中的技术。表达载体可以是质粒,病毒的一部分,或者可以是核酸片段。表达载体包括将编码双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸(即,编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件以可操作地关联的方式克隆到其中的表达盒。如本文中使用的,“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸模块。虽然“终止密码子”(TAG,TGA或TAA)不翻译成氨基酸,但如果存在的话,它可被认为是编码区的一部分,但任何侧翼序列,例如启动子,核糖体结合位点,转录终止子,内含子,5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。在单个多核苷酸构建体中,例如,在单个载体上,或在单独的多核苷酸构建体中,例如,在单独的(不同的)载体上可以存在两个或更多个编码区。此外,任何载体可以包含单个编码区,或者可以包含两个或更多个编码区,例如本发明的载体可以编码一个或多个多肽,其通过蛋白水解切割在翻译后或以共翻译方式分离成最终的蛋白质。另外,本发明的载体,多核苷酸或核酸可以编码异源编码区,所述异源编码区与编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序,例如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作地关联是指这样一种方式:基因产物例如多肽的编码区与一个或多个调节序列相关联以使基因产物的表达在调节序列的影响或控制下进行。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录,并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力,则所述两个DNA片段(例如多肽编码区和与其关联的启动子)是“可操作地关联的”。因此,如果启动子能够影响编码多肽的核酸的转录,则启动子区与该核酸可操作地关联。启动子可以是仅在预定细胞中指导实质性DNA转录的细胞特异性启动子。除了启动子之外,其他转录控制元件例如增强子,操纵子,阻抑物和转录终止信号,可与多核苷酸可操作地关联以指导细胞特异性转录。
本文中公开了适合的启动子和其他转录控制区。许多转录控制区是本领域中的技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区,例如但不限于来自巨细胞病毒(例如立即早期启动子,与内含子A结合),猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如,例如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括衍生自脊椎动物基因如肌动蛋白,热休克蛋白,牛生长激素和兔α珠蛋白的那些转录控制区,以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。另外的适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地,许多翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点,翻译起始和终止密码子以及衍生自病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES,也称为CITE序列)。表达盒还可以包括诸如复制起点的其他特征,和/或诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)的染色体整合元件。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与另外的编码分泌肽或信号肽的编码区相关联,所述分泌肽或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如,如果希望分泌双特异性抗原结合分子或其多肽片段,则编码信号序列的DNA可以位于编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的核酸的上游。根据信号假说,由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列,所述信号肽或分泌前导序列在起始生长蛋白质链输出穿过粗面内质网后被从成熟蛋白质切割下来。本领域普通技术人员知道,脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与多肽的N末端融合的信号肽,其被从翻译的多肽切割下来以产生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施方案中,使用了天然信号肽例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽,或该序列的功能衍生物,所述衍生物保留了指导与其可操作地相关联的多肽分泌的能力。或者,可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如,野生型前导序列可以替代为人组织纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列。
编码可用于方便后续纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记融合蛋白的短蛋白质序列的DNA可以包括在编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。
在本发明的一个另外的方面,提供了包含一个或多个本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中,提供了包含一个或多个本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可分别掺入关于多核苷酸和载体的单一或组合地在本文中描述的任何特征。在一个方面,宿主细胞包含(例如已经转化或转染)包含编码本发明的双特异性抗原结合分子的(一部分)的多核苷酸的载体。如本文中使用的,术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞系统。适合于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域熟知的。可以使用特定的表达载体适当地转染或转导这样的细胞,并且可以培养大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵罐以获得足够量的用于临床应用的抗原结合分子。适合的宿主细胞包括原核微生物,如大肠杆菌,或各种真核细胞,如中国仓鼠卵巢细胞(CHO),人胚胎肾(HEK)细胞,昆虫细胞等。例如,尤其是在不需要糖基化时,可以在细菌中产生多肽。表达后,可以从菌体糊分离出可溶性级分中的多肽,并可将其进一步纯化。除了原核生物之外,诸如丝状真菌或酵母的真核微生物是编码多肽的载体的适合克隆或表达宿主,包括其糖基化途径已被“人源化”的导致产生具有部分或完全人糖基化样式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004),和Li等人,NatBiotech 24,210-215(2006)。
用于表达(糖基化)多肽的适合宿主细胞也源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞结合使用尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如美国专利Nos.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978,和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如,适应在悬液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是经SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(例如,在Graham等人,J Gen Virol 36,59(1977)中描述的293或293T细胞)；仓鼠婴肾细胞(BHK)；小鼠塞托利细胞(如在Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；牛鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)；TRI细胞(如在Mather等人,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中描述)；MRC 5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人,Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO,NS0,P3X63和Sp2/0。对于适用于蛋白质产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述,参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞,例如培养的哺乳动物细胞,酵母细胞,昆虫细胞,细菌细胞和植物细胞,在此仅列举少数,还有包括在转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织内的细胞。在一个实施方案中,宿主细胞是真核细胞,优选哺乳动物细胞,例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,人胚胎肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0,NS0,Sp20细胞)。在这些系统中表达外源基因的标准技术在本领域中是已知的。可以将表达包含抗原结合域重链或轻链的多肽的细胞工程化,以便也表达另一个免疫球蛋白链,使得所表达的产物是具有重链和轻链两者的抗原结合域。
在另一个方面,提供的是一种用于生成本发明的双特异性抗体的方法,其包含下述步骤:(i)在适合于所述双特异性抗体表达的条件下培养本发明的宿主细胞,和(ii)自宿主细胞或宿主细胞培养液分离所述双特异性抗体。
双特异性抗体的各构件在遗传上彼此融合。双特异性抗原结合分子可设计成使得其构件直接地或经由接头序列间接地彼此融合。可以依照本领域公知的方法确定接头的组成和长度,而且可以测试功效。双特异性抗原结合分子的不同构件之间的接头序列的例子见本文中提供的序列中。如果想要的话,还可以包括另外的序列以掺入切割位点以分开融合物的各个构件,例如内肽酶识别序列。
在某些方面,形成抗体的一部分的能够特异性结合FAP的抗原结合域(例如Fab片段或scFv)至少包含能够结合FAP的免疫球蛋白可变区。类似地,在某些方面,形成双特异性抗体的一部分的能够特异性结合OX40的模块(例如Fab片段或scFv)至少包含能够结合OX40的免疫球蛋白可变区。可变区可形成天然或非天然发生的抗体和其片段的一部分且自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域公知的(参见例如Harlow and Lane,"Antibodies,a laboratory manual",Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然发生抗体可以使用固相肽合成来构建,可以重组生成(例如如美国专利No.4,186,567中描述的)或可以通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如授予McCafferty的美国专利No.5,969,108)。
在某些方面,依照例如PCT公开文本WO 2012/020006(参见关于亲和力成熟的实施例)或美国专利申请公开文本No.2004/0132066中公开的方法工程化改造本发明的抗原结合分子中包含的能够特异性结合有关靶的抗原结合域(例如Fab片段或scFv)以具有增强的结合亲和力。本发明抗原结合分子结合特定抗原性决定簇的能力可经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量,例如表面等离振子共振技术(Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329(2000))),和传统的结合测定法(Heeley,EndocrRes 28,217-229(2002))。可使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争结合特定抗原的抗原结合分子。在某些实施方案中,此类竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与参照抗原结合分子结合的相同。用于抗原结合分子结合的表位的作图的详细的例示性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,in Methods in MolecularBiology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。在一种例示性竞争测定法中,在包含结合抗原的第一经标记抗原结合分子和第二未标记抗原结合分子(测试其与第一抗原结合分子竞争结合抗原的能力)的溶液中温育固定化抗原。第二抗原结合分子可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照,在包含第一经标记抗原结合分子但不包含第二未标记抗原结合分子的溶液中温育固定化抗原。在允许第一抗体与抗原结合的条件下温育后,去除过量的未结合的抗体,并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果在测试样品中与固定化抗原联合的标记物的量相对于对照样品实质性降低,那么这指示第二抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合抗原。参见Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manualch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
可以通过本领域已知的技术如高效液相层析术,离子交换层析术,凝胶电泳,亲和层析术,大小排阻层析术等来纯化如本文中描述制备的本发明的双特异性抗体。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分地取决于诸如净电荷,疏水性,亲水性等因素,并且对于本领域技术人员将是显而易见的。对于亲和层析术纯化,可以使用与双特异性抗原结合分子结合的抗体,配体,受体或抗原。例如,为了本发明的融合蛋白的亲和层析术纯化,可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以基本上如实施例中描述依次使用蛋白A或G亲和层析术和大小排阻层析术分离抗原结合分子。双特异性抗原结合分子或其片段的纯度可以通过各种熟知的分析方法中的任何一种加以测定,包括凝胶电泳,高压液相层析术等。例如,正如通过还原和非还原性SDS-PAGE证实,如实施例中描述表达的双特异性抗原结合分子显示是完整且正确组装的。
本发明还涵盖通过本发明的方法生成的双特异性抗体。
测定法
可以通过本领域已知的各种测定法来鉴定,筛选或通过其物理/化学性质和/或生物学活性来表征在本文中提供的双特异性抗原结合分子。
1.亲和力测定法
根据实施例中提出的通过表面等离振子共振(SPR)的方法,使用标准仪器如BIAcore仪器(GE Healthcare),以及可以通过诸如重组表达获得的受体或靶蛋白,可以测定在本文中提供的双特异性抗原结合分子对OX40或FAP的亲和力。用于测量结合亲和力的一种具体的说明性和例示性实施方案在实施例3中描述。根据一个方面,使用
Figure BDA0002429335460000781
T200仪(GE Healthcare)通过表面等离振子共振在25℃测量KD。
2.结合测定法和其他测定法
例如通过流式细胞术(FACS),使用表达特定受体或靶抗原的细胞系,可以评价在本文中提供的双特异性抗原结合分子与相应的OX40和/或FAP表达细胞的结合。在一个方面,在结合测定法中使用表达OX40的新鲜的外周血单个核细胞(PBMC)。在分离后(幼稚PMBC)或刺激后(活化的PMBC)直接使用这些细胞。用于测量与OX40的结合的一种具体的说明性和例示性实施方案在实施例4.1中描述。
在又一个方面,使用表达FAP的癌细胞系来证明双特异性抗体与FAP的结合(见实施例4.2)。
在另一个方面,可以使用竞争测定法来鉴定与特异性抗体或抗原结合分子分别竞争结合FAP或OX40的抗原结合分子。在某些实施方案中,这种竞争性抗体结合的表位(例如线性或构象表位)与特异性抗FAP抗体或特异性抗OX40抗体结合的相同。用于抗体所结合的表位的作图的详细示例性方法提供于Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”inMethods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中。
3.活性测定法
在一个方面,提供了用于鉴定具有生物学活性的结合FAP和OX40的双特异性抗原结合分子的测定法。生物学活性可以包括例如通过表达OX40的细胞上的OX40的激动性信号传导。还提供了通过测定法鉴定为具有这样的体外生物学活性的双特异性抗原结合分子。特别地,提供检测表达人OX40且与FAP表达性肿瘤细胞共培养的Hela细胞中的NF-κB激活的报告细胞测定法(见例如实施例5.1)。
在另一个方面,提供了用于鉴定具有生物学活性的结合FAP和4-1BB的双特异性抗原结合分子的测定法。特别地,提供检测表达人4-1BB和NFκB-萤光素酶报告基因的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中的NF-κB激活的报告细胞测定法(见例如实施例7.2)。
在另一个方面,提供了用于鉴定具有生物学活性的结合FAP和CD40的双特异性抗原结合分子的测定法。特别地,提供使用FAP包被的
Figure BDA0002429335460000791
作为抗原的来源测量FAP靶向性抗人CD40结合分子对人B细胞的激活的方法(见例如实施例10.1)。
在某些方面,测试了本发明的双特异性抗原结合分子的这种生物学活性。用于检测本发明的分子的生物学活性的测定法是实施例5中描述的那些。此外,用于检测细胞裂解的测定法(例如通过测量LDH释放),诱导的凋亡动力学(例如通过测量半胱天冬酶3/7活性)或凋亡(例如使用TUNEL测定法)是本领域熟知的。另外,可以通过评估复合物对各种淋巴细胞亚群如NK细胞,NKT细胞或γδT细胞的存活,增殖和淋巴因子分泌的影响,或评估其调节抗原呈递细胞如树突细胞,单核细胞/巨噬细胞或B细胞的表型和功能的能力来评估此类复合物的生物学活性。
药学组合物,配制剂和给药途径
在又一个方面,本发明提供了包含本文中提供的任何双特异性抗体的药学组合物,以供例如在任何下列治疗方法中使用。在一个实施方案中,药学组合物包含本文中提供的任何双特异性抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中,药学组合物包含本文中提供的任何双特异性抗体和至少一种另外的例如如下文所述的治疗剂。
本发明的药学组合物包含治疗有效量的一种或多种溶解或分散在药学上可接受的赋形剂中的双特异性抗体。短语“药学的或药学上可接受的”是指在采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒的分子实体和组合物,即在适当施用于动物,例如人时不产生不利的,过敏的或其他不良的反应。根据本公开内容,包含至少一种双特异性抗体和任选地另外的活性成分的药学组合物的制备将是本领域技术人员已知的,如Remington's PharmaceuticalSciences第18版,Mack Printing Company,1990所例示,通过提述将其并入本文。具体地说,组合物是冻干制剂或水溶液。如本文中使用的,正如本领域普通技术人员已知,“药学上可接受的赋形剂”包括溶剂,缓冲剂,分散介质,包衣,表面活性剂,抗氧化剂,防腐剂(例如抗菌剂,抗真菌剂),等渗剂,盐,稳定剂中任一种和全部及其组合。
肠胃外组合物包括为通过注射给药而设计的那些,例如皮下,皮内,病灶内,静脉内,动脉内,肌内,鞘内或腹膜内注射。为了注射,可以将本发明的双特异性抗体配制在水溶液中,优选在生理学相容的缓冲液如汉克斯溶液,林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。溶液可以含有配制剂,例如悬浮剂,稳定剂和/或分散剂。或者,融合蛋白在使用前可处于粉末形式以与适合的载体(例如无菌无热原水)组构。根据需要,通过将在适当溶剂中的本发明的融合蛋白以所要求的量并入下文列举的多种其他成分中来制备无菌注射溶液。可以例如通过无菌过滤膜进行过滤而容易地实现无菌性。通常,通过将各种灭菌的活性成分并入无菌载体中来制备分散体,所述无菌载体含有基础分散介质和/或其他成分。在用于制备无菌注射溶液,悬浮液或乳状液的无菌粉末的情况下,优选制备方法为真空干燥或冷冻干燥技术,从而产生来自其先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何其他期望的成分的粉末。必要时应该适当缓冲该液体介质并且在注射之前首先用足够盐水或葡萄糖使液体稀释剂变得等张。在制造和储存条件下该组合物必须是稳定的,并且保持对抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用。应当理解,内毒素污染应该最低限度地保持在安全水平,例如低于0.5ng/mg蛋白质。适合的药学上可接受的赋形剂包括但不限于:诸如磷酸盐,柠檬酸盐,和其他有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵,苄索氯铵；苯酚,丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯,如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质,如血清白蛋白,明胶,或免疫球蛋白；亲水性聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸,如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸,或赖氨酸；单糖类,二糖类,和其他碳水化合物类,包括葡萄糖,甘露糖,或糊精；螯合剂,如EDTA；糖类,如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子,如钠；金属复合物(例如,Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂,如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬液可含有增加该悬液粘度的化合物,例如羧甲基纤维素钠,山梨糖醇,或葡聚糖等。任选地,悬液还可以含有适合的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的药剂。另外,这些活性化合物的悬液可制备为适当的油性注射悬液。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(如芝麻油),合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯),或脂质体。
可以将活性成分包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中,例如分别在胶体药物递送系统(例如,脂质体,白蛋白微球,微乳液,纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊。这样的技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed.Mack Printing Company,1990)中。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有该多肽的固体疏水聚合物的半透性基质,所述基质呈成形物品的形式,例如薄膜,或微胶囊。在特定实施方案中,通过在组合物中使用延迟吸收的药剂,例如单硬脂酸铝,明胶或其组合,可延长注射组合物的吸收。
本文中的示例性药学上可接受的赋形剂还包括诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)的间质药物分散剂,例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白,例如rHuPH20(
Figure BDA0002429335460000811
Baxter International,Inc.)。在美国专利公开No.2005/0260186和2006/0104968中描述了包括rHuPH20的某些示例性的sHASEGP和使用方法。在一个方面,将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性的冻干抗体配制剂描述于美国专利No.6,267,958中。水性抗体配制剂包括美国专利No.6,171,586和WO2006/044908中描述的那些,后一种配制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
除前述组合物之外,融合蛋白还可配制为贮库制剂。此类长效配制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给予。因此,例如,融合蛋白可以用适合的聚合材料或疏水材料(例如作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制,或配制为微溶的衍生物,例如微溶盐。
包含本发明的融合蛋白的药学组合物可以通过常规的混合,溶解,乳化,包封,包埋或冻干过程进行制造。可以使用有利于将蛋白质加工成药学上可使用的制剂的一种或多种生理学上可接受的载体,稀释剂,赋形剂或助剂以常规方式配制药学组合物。适当的配制剂取决于所选择的给药途径。
可以将双特异性抗体配制成游离酸或碱,中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些盐包括酸加成盐,例如由蛋白质组合物的游离氨基形成的或与无机酸诸如例如盐酸或磷酸形成的那些,或与诸如乙酸,草酸,酒石酸或扁桃酸的有机酸形成的那些。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱,诸如例如氢氧化钠,氢氧化钾,氢氧化铵,氢氧化钙或氢氧化铁；或诸如异丙胺,三甲胺,组氨酸或普鲁卡因的有机碱。与相应的游离碱形式相比,药物盐在水性溶剂和其他质子溶剂中的溶解度更高。
在被治疗的特殊适应症需要时,本文中的组合物还可含有一种以上的活性成分,优选地,所述活性成分具有彼此无不良影响的互补活性。这样的活性成分以对预期目的有效的量适当地组合存在。
用于体内给药的制剂通常是无菌的。可以例如通过无菌过滤膜进行过滤而容易地实现无菌性。
治疗方法和组合物
本文中提供的任何双特异性抗体均可在治疗方法中使用。为了在治疗方法中使用,本发明的抗原结合分子可以以符合良好医学实践的方式配制,给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症,被治疗的具体哺乳动物,个体患者的临床状况,病症的原因,药剂的递送部位,给药方法,给药进度表,以及执业医师已知的其他因素。
在一个方面,提供了本发明的双特异性抗体,其用作药剂。在另外的方面,提供了本发明的双特异性抗原结合分子,其用于治疗疾病,尤其是用于治疗癌症。在某些实施方案中,提供了本发明的双特异性抗体,其用于治疗方法。在一个实施方案中,本发明提供了用于治疗有需要的个体中的疾病的如本文中描述的双特异性抗体。在某些实施方案中,本发明提供了在治疗患有疾病的个体的方法中使用的双特异性抗体,所述方法包括向个体施用治疗有效量的双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中,待治疗的疾病是癌症。在某些实施方案中,待治疗的疾病是增殖性病症,具体地是癌症。癌症的实例包括膀胱癌,脑癌,头颈癌,胰腺癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,子宫癌,子宫颈癌,子宫内膜癌,食道癌,结肠癌,结肠直肠癌,直肠癌,胃癌,前列腺癌,血癌,皮肤癌,鳞状细胞癌,骨癌,和肾癌。可以使用本发明的双特异性抗原结合分子进行治疗的其他细胞增殖病症包括但不限于位于腹部,骨骼,乳腺,消化系统,肝脏,胰腺,腹膜,内分泌腺(肾上腺,甲状旁腺,垂体,睾丸,卵巢,胸腺,甲状腺),眼,头颈部,神经系统(中枢和外周),淋巴系统,盆腔,皮肤,软组织,脾脏,胸部,和泌尿生殖系统的肿瘤。还包括癌前状态或病变和癌症转移。在某些实施方案中,癌症选自由肾细胞癌,皮肤癌,肺癌,结肠直肠癌,乳腺癌,脑癌,头颈癌组成的组。需要治疗的受试者,患者或“个体”通常是哺乳动物,更具体地说是人。
本发明还涵盖的是本发明的双特异性抗体,或本发明的药学组合物,其用于上调或延长细胞毒性T细胞活性。
在又一个方面,本发明提供本发明的双特异性抗体在制造或制备用于治疗有需要的个体中的疾病的药剂中的用途。在一个方面,所述药剂用于在治疗疾病的方法中使用,所述方法包括向患有疾病的个体施用治疗有效量的药剂。在某些方面,待治疗的疾病是增殖性病症,具体地是癌症。癌症的实例包括膀胱癌,脑癌,头颈癌,胰腺癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,子宫癌,子宫颈癌,子宫内膜癌,食道癌,结肠癌,结肠直肠癌,直肠癌,胃癌,前列腺癌,血癌,皮肤癌,鳞状细胞癌,骨癌,和肾癌。可以使用本发明的双特异性抗原结合分子进行治疗的其他细胞增殖病症包括但不限于位于腹部,骨骼,乳腺,消化系统,肝脏,胰腺,腹膜,内分泌腺(肾上腺,甲状旁腺,垂体,睾丸,卵巢,胸腺,甲状腺),眼,头颈部,神经系统(中枢和外周),淋巴系统,盆腔,皮肤,软组织,脾脏,胸部,和泌尿生殖系统的肿瘤。还包括癌前状态或病变和癌症转移。在某些实施方案中,癌症选自由肾细胞癌,皮肤癌,肺癌,结肠直肠癌,乳腺癌,脑癌,头颈癌组成的组。技术人员容易认识到,在许多情况下,双特异性抗原结合分子可能不提供治愈,而可能仅仅提供部分益处。在一些实施方案中,具有一些益处的生理变化也被认为是治疗有益的。因此,在一些实施方案中,提供生理变化的双特异性抗体的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。在任何上述实施方案中,个体优选是哺乳动物,特别是人。
在又一个方面,本发明涉及如本文中描述的双特异性抗体制造或制备用于治疗传染病,特别是用于治疗病毒感染或用于治疗自身免疫病,例如狼疮疾病的药物的用途。
在又一个方面,本发明提供一种用于治疗个体中的疾病的方法,其包含对所述个体施用治疗有效量的本发明的双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中,将组合物施用于所述个体,其包含处于药学可接受形式的本发明的融合蛋白。在某些实施方案中,待治疗的疾病是增殖性病症。在一个特定实施方案中,该疾病是癌症。在某些实施方案中,该方法进一步包含对该个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂,例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。依照任何上述实施方案的“个体”可以是哺乳动物,优选人。
为了预防或治疗疾病,本发明的双特异性抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型,给药途径,患者的体重,融合蛋白的类型,疾病的严重程度和病程,给予融合蛋白是用于预防还是治疗目的,先前或同时的治疗干预,患者的临床病史,和对融合蛋白的响应,和主治医师的决定。在任何情况下,负责给药的医师将决定组合物中活性成分的浓度和个体受试者的适当剂量。本文中考虑到各种给药进度表,包括但不限于在各个时间点上的单次或多次给药,推注给药和脉冲输注。
一次性地或以一系列治疗的方式适当地向患者施用双特异性抗体。根据疾病的类型和严重程度,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗原结合分子可以是向患者施用的初始候选剂量,例如无论是通过一次或多次分开给药,还是通过连续输注。取决于上面提到的因素,一个典型的日剂量可能在约1μg/kg至100mg/kg或更高的范围内。对于数天或更长时间的反复给药,根据病情,治疗通常将持续到出现期望的疾病症状的遏制时为止。融合蛋白的一个示例性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其他实例中,剂量还可以包含每次给药从约1μg/kg体重,约5μg/kg体重,约10μg/kg体重,约50μg/kg体重,约100μg/kg体重,约200μg/kg体重,约350μg/kg体重,约500μg/kg体重,约1mg/kg体重,约5mg/kg体重,约10mg/kg体重,约50mg/kg体重,约100mg/kg体重,约200mg/kg体重,约350mg/kg体重,约500mg/kg体重,至约1000mg/kg体重或更多,以及其中可推导的任何范围。在本文中所列数字的可推导范围的实例中,可以基于上述数字以约5mg/kg体重至约100mg/kg体重,约5μg/kg体重至约500mg/kg体重等的范围进行施用。因此,可向患者施用约0.5mg/kg,2.0mg/kg,5.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量。这样的剂量可以间歇施用,例如,每周或每三周一次(例如使得患者接受约2个至约20个,或例如约6个剂量的双特异性抗原结合分子)。可以施用初始较高的加载剂量,然后施用一个或多个较低的剂量。然而,其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定法易于监测这种疗法的进展。
通常以有效实现预期目的的量使用本发明的双特异性抗体。为了用于治疗或预防疾病状况,以治疗有效量施用或应用本发明的双特异性抗原结合分子或其药学组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内,尤其是在根据本文中提供的详细公开内容的情况下。
对于全身给药,可以根据体外测定法(例如细胞培养物测定法)初步估计治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包括在细胞培养中确定的IC50在内的循环浓度范围。这类信息可以用来更精确地确定用于人的剂量。也可以使用本领域熟知的技术根据体内数据(例如,动物模型)估计初始剂量。基于动物数据,本领域普通技术人员可以容易地优化对人的给药。可以单独调整剂量和间隔以提供足以维持治疗效果的双特异性抗原结合分子的血浆水平。通常注射给药的患者剂量为约0.1至50mg/kg/天,一般为约0.5至1mg/kg/天。可以通过每天施用多个剂量来实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC测量血浆中的水平。
在局部给药或选择性吸收的情况下,双特异性抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够优化治疗有效的局部剂量而无需过度实验。
本文中描述的双特异性抗体的治疗有效剂量通常将提供治疗益处而不引起实质性毒性。可以通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序来确定融合蛋白的毒性和治疗效果。可使用细胞培养物测定法和动物研究来确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比为治疗指数,它可以被表示为比率LD50/ED50。表现出较大治疗指数的双特异性抗原结合分子是优选的。在一个实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子表现出高治疗指数。从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据可以在配制适合于在人类中使用的剂量范围中加以使用。剂量优选地处在循环浓度范围内,其包括具有很小或没有毒性的ED50。取决于多种因素,例如采用的剂型,所用给药途径,受试者的状况等,剂量可以在这个范围内变化。考虑到患者的状况,个体医师可以选择确切的配方,给药途径和剂量(参见,例如Fingl等人,1975,in:ThePharmacological Basis of Therapeutics,Ch.1,p.1,通过提述将其完整并入本文)。
用本发明的双特异性抗原结合分子治疗患者的主治医师知道如何并且何时由于毒性,器官功能障碍等而终止,中断或调整给药。相反,如果临床响应不足(排除毒性),主治医师也会知道将治疗调整到更高水平。在感兴趣病症的管理中,施用剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度,给药途径等而变化。可以例如部分地通过标准预后评价方法来评价病症的严重程度。此外,剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄,体重和响应而变化。
其他药剂和治疗
本发明的双特异性抗体可以在治疗中与一种或多种其他药剂联合给药。例如,本发明的双特异性抗体可以与至少一种另外的治疗剂共同给药。术语“治疗剂”涵盖可施用于治疗需要这种治疗的个体中的症状或疾病的任何药剂。这种另外的治疗剂可包含适合于被治疗的特定适应症的任何活性成分,优选地,所述活性成分具有彼此无不良影响的互补活性。在某些实施方案中,另外的治疗剂是另一种抗癌剂。
此类其他药剂以对预期目的有效的量适当地组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所使用的融合蛋白的量,病症或治疗的类型,以及以上讨论的其他因素。通常以与本文中所述相同的剂量和给药途径,或本文中所述剂量的约1％至99％,或以在经验/临床上确定为适当的任何剂量并通过任何途径使用双特异性抗原结合分子。
上述此类联合疗法涵盖联合给药(其中两种或更多种治疗剂包括在同一个或分开的组合物中)和分开给药,在分开给药的情况下,本发明的双特异性抗原结合分子的给药可以发生在给予另外的治疗剂和/或佐剂之前,同时和/或之后。
制品
在本发明的另一个方面,提供了含有用于治疗,预防和/或诊断上述病症的物质的制品。制品包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。适合的容器包括例如瓶,管形瓶,注射器,IV溶液袋等。可以由各种材料如玻璃或塑料形成容器。容器容纳组合物本身或连同另一种有效治疗,预防和/或诊断病症的组合物,并且可以具有无菌进入口(例如,该容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中至少一种活性剂是如本文中描述的双特异性抗体。
标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的病症。而且,制品可以包括(a)其中含有组合物的第一容器,其中该组合物包含本发明的双特异性抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器,其中该组合物包含另外的细胞毒性治疗剂或其它治疗剂。在本发明的这个实施方案中的制品可以进一步包括指示组合物可用于治疗特定病症的包装插页。
替代地或另外,制品可以进一步包括第二(或第三)容器,其包含药学上可接受的缓冲剂,例如抑菌性注射用水(BWFI),磷酸盐缓冲盐水,林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可以包括立足于商业和用户立场所需的其它物品,包括其它缓冲剂,稀释剂,过滤器,针头和注射器。
表B:序列
Figure BDA0002429335460000871
Figure BDA0002429335460000881
Figure BDA0002429335460000891
Figure BDA0002429335460000901
Figure BDA0002429335460000911
Figure BDA0002429335460000921
Figure BDA0002429335460000931
Figure BDA0002429335460000941
Figure BDA0002429335460000951
关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中给出。抗体链的氨基酸依照如上文定义的依照Kabat的EU编号系统(Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutesof Health,Bethesda,MD(1991))进行编号和提及。
实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。理解的是,鉴于上文提供的一般性描述,可以实践各种其它实施方案。
重组DNA技术
使用标准方法来操作DNA,如Sambrook et al.,Molecular cloning:Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989中描述的。依照制造商的说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.et al.,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No91-3242中给出。
DNA测序
通过双链测序测定DNA序列。
基因合成
在Geneart GmbH(Regensburg，Germany)通过自动化基因合成自合成的寡核苷酸通过化学合成制备期望的基因区段。将合成的基因片段克隆入大肠杆菌质粒进行繁殖/扩增。通过DNA测序来检验亚克隆的基因片段的DNA序列。或者，通过化学合成的寡核苷酸的退火或经由PCR来组装短合成DNA片段。由metabion GmbH(Planegg-Martinsried，Germany)制备各自寡核苷酸。
细胞培养技术
使用标准细胞培养技术,如Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.and Yamada,K.M.(eds.),John Wiley&Sons,Inc.中描述的。
试剂
如果没有另外说明的话，依照制造商的方案以提供的那样使用所有商品化化学药品，抗体和试剂盒。
实施例1
双特异性Contorsbody的生成
1.1用于双特异性Contorsbody的表达质粒的构建
为了表达如本文中报告的双特异性Contorsbody,使用包含下面的功能元件的转录单元:
-包括内含子A的来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子,
-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR),
-鼠免疫球蛋白重链信号序列,
-编码相应环状融合多肽的核酸,和
-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
在包括要表达的期望基因的表达单元/盒以外,基本/标准哺乳动物表达质粒含有
-容许这种质粒在大肠杆菌中复制的来自载体pUC18的复制起点,和-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
1.2双特异性Contorsbody的表达
用293-free转染试剂(Novagen)在适应悬浮的HEK293F(FreeStyle 293-F细胞；Invitrogen)细胞中实施双特异性抗原结合分子的瞬时表达。
在融化之后在125ml摇瓶中通过稀释将细胞传代至少四次(体积30ml)(于37℃,7％CO2,85％湿度,135rpm温育/摇动)。在250ml体积中将细胞扩充至3x105个细胞/ml。三天后,分拆细胞并在1升摇瓶中在250ml体积中以7x105个细胞/ml的密度重新接种。转染会在24小时后,以1.4-2.0x106个细胞/ml左右的细胞密度。
在转染之前在10ml的终体积中稀释250μg质粒DNA,与预热(水浴；37℃)的Opti-MEM(Gibco)一起。温和混合溶液并于室温温育不超过5分钟。然后将333.3μl 293-free转染试剂添加至DNA-OptiMEM溶液。之后温和混合溶液并于室温温育15-20分钟。将整个体积的混合物添加至1L摇瓶,具有250ml HEK细胞培养体积。
于37℃,7％CO2,85％湿度,135rpm温育/摇动6或7天。
通过第一离心步骤(2,000rpm,4℃,10分钟)收获上清液。然后将上清液转移入新的离心烧瓶进行第二离心(4,000rpm,4℃,20分钟)。之后将无细胞上清液过滤穿过0.22μm瓶顶滤器并保存在冰箱中(-20℃)。
1.3双特异性Contorsbody的纯化
将含有抗原结合分子的培养物上清液过滤并通过两个层析步骤来纯化。使用用PBS(1mM KH2PO4,10mM Na2HPO4,137mM NaCl,2.7mM KCl),pH7.4平衡的HiTrapMabSelectSuRe(GE Healthcare)通过亲和层析捕捉抗体。通过用平衡缓冲液清洗来去除未结合的蛋白质,并用50mM柠檬酸盐缓冲液,pH 2.8回收抗原结合分子,并在洗脱之后立即用1M Tris碱,pH 9.0中和至pH6.0。使用Superdex 200TM(GE Healthcare)上的大小排阻层析作为第二纯化步骤。在20mM组氨酸缓冲液,0.14M NaCl,pH 6.0中实施大小排阻层析。用配备有Biomax-SK膜(Millipore,Billerica,MA)的Ultrafree-CL离心滤器单元将含有双特异性抗原结合分子的溶液浓缩并保存于-80℃。
1.4双特异性Contorsbody的质谱分析
自Roche Diagnostics GmbH获得PNGase F(14.3U/μl；磷酸钠,EDTA和甘油中的溶液)。在消化之前自冻干物新鲜重建在IgG抗体的铰链区中特异性切割的蛋白酶。
用PNGase F进行的酶促去糖基化
用10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.1将50μg抗原结合分子稀释至0.6mg/ml的终浓度,并用1μl PNGase F于37℃去糖基化16小时。
酶促切割
用200mM Tris缓冲液,pH 8.0将经过去糖基化的样品稀释至0.5mg/ml的终浓度,并随后用IgG特异性蛋白酶于37℃消化1小时。
ESI-QTOF质谱术
使用含2％甲酸(v/v)的40％乙腈通过Sephadex G25柱(Kronlab,5x250mm,TAC05/250G0-SR)上的HPLC将样品脱盐。经由配备有TriVersa NanoMate源(Advion)的maXis 4GUHR-QTOF MS系统(Bruker Daltonik)上的ESI-QTOF MS测定总质量。用碘化钠(Waters ToFG2样品试剂盒2部分:700008892-1)实施校准。对于经过消化的抗原结合分子,于1000-4000m/z(ISCID:30eV)进行数据采集。评估原始质谱并转换成各个相对摩尔质量。为了显现结果,使用专有软件生成解卷积质谱。
实施例2
具有两个结合OX40的抗原结合域和一个结合FAP的抗原结合域的双特异性抗体(FAP-OX40 Contorsbody)的制备
FAP结合物的生成和制备描述于WO 2012/020006 A2,通过援引将其收入本文。OX40结合物描述于WO 2017/055398 A2。
2.1 FAP(4B9)-OX40(49B4)Contorsbody CD134-0093的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如图1A中描绘的:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,VH(FAP)-Cκ
-第二融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VL(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,VL(FAP)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表1显示双特异性抗体CD134-0093的氨基酸序列。
表1:CD134-0093的序列
Figure BDA0002429335460000981
Figure BDA0002429335460000991
组装结构的示意图显示于图1E。
2.2 FAP(4B9)-OX40(49B4)Contorsbody CD134-0094的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如图1B中描绘的:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(OX40)-CH1,(G4S)2连接头,VL(FAP)-Cκ
-第二融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VL(OX40)-CH1,(G4S)2连接头,VH(FAP)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表2显示双特异性抗体CD134-0094的氨基酸序列。
表2:CD134-0094的序列
Figure BDA0002429335460000992
Figure BDA0002429335460001001
组装结构的示意图显示于图1F。
2.3 FAP(28H1)-OX40(49B4)Contorsbody P1AE0085的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如图1A中描绘的:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(OX40)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-Cκ
-第二融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VL(OX40)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表3显示双特异性抗体P1AE0085的氨基酸序列。
表3:P1AE0085的序列
Figure BDA0002429335460001002
Figure BDA0002429335460001011
组装结构的示意图显示于图1G。
2.4 FAP(4B9)-OX40(49B4)Contorsbody P1AE0086的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如图1A中描绘的:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(OX40)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-Cκ
-第二融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VL(OX40)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表4显示双特异性抗体P1AE0086(Contorsbody 7)的氨基酸序列。
表4:P1AE0086的序列
Figure BDA0002429335460001021
组装结构的示意图显示于图1G。
2.5 FAP(28H1)-OX40(49B4)Contorsbody P1AE0087的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如图1B中描绘的:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(OX40)-CH1,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-Cκ。
-第二融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VL(OX40)-CH1,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表5显示双特异性抗体P1AE0087的氨基酸序列。
表5:P1AE0087的序列
Figure BDA0002429335460001031
组装结构的示意图显示于图1H。
2.6 FAP(4B9)-OX40(49B4)Contorsbody P1AE0839的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如图1B中描绘的:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(OX40)-CH1,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-Cκ。
-第二融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VL(OX40)-CH1,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表6显示双特异性抗体P1AE0839的氨基酸序列。
表6:P1AE0839的序列
Figure BDA0002429335460001041
Figure BDA0002429335460001051
组装结构的示意图显示于图1H。
2.7 FAP(4B9)-OX40(49B4)Contorsbody P1AE0821的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如图1C中描绘的:
-第一融合多肽(自N至C端):VL(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VH(OX40)-CH1,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-Cκ。
-第二融合多肽(自N至C端):VL(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VH(OX40)-CH1,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表7显示双特异性抗体P1AE0821(Contorsbody 11)的氨基酸序列。
表7:P1AE0821的序列
Figure BDA0002429335460001052
Figure BDA0002429335460001061
组装结构的示意图显示于图1I。
2.8 FAP(4B9)-OX40(49B4)Contorsbody P1AE1122(Contorsbody 1)的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如图1D中描绘的:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(OX40)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-CH1。
-第二融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VL(OX40)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-Cκ。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表8显示双特异性抗体P1AE1122的氨基酸序列。
表8:P1AE1122的序列
Figure BDA0002429335460001062
Figure BDA0002429335460001071
组装结构的示意图显示于图1J。
2.9 FAP(4B9)-OX40(49B4)Contorsbody P1AE1942(Contorsbody 2)的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如下:
-第一融合多肽(自N至C端):VL(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VH(OX40)-CH1,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-CH1。
-第二融合多肽(自N至C端):VL(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VH(OX40)-CH1,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-Cκ。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表9显示双特异性抗体P1AE1942的氨基酸序列。
表9:P1AE1942的序列
Figure BDA0002429335460001081
2.10 FAP(4B9)-OX40(49B4)Contorsbody P1AE1887(Contorsbody 3)的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如下:
-第一融合多肽(自N至C端):VL(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VH(OX40)-CH1,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-Cκ。
-第二融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VL(OX40)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表10显示双特异性抗体P1AE1887的氨基酸序列。
表10:P1AE1887的序列
Figure BDA0002429335460001091
组装结构的示意图显示于图1K。
2.11 FAP(4B9)-OX40(49B4)Contorsbody P1AE1888(Contorsbody 4)的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如下:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(OX40)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-Cκ。
-第二融合多肽(自N至C端):VL(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VH(OX40)-CH1,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表11显示双特异性抗体P1AE1888的氨基酸序列。
表11:P1AE1888的序列
Figure BDA0002429335460001101
Figure BDA0002429335460001111
2.12 FAP(4B9)-OX40(49B4)Contorsbody P1AE2254(Contorsbody 5)的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如下:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-CH1_EE(K147E,K213E),(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(OX40)-Cκ_RK(E123R,Q124K),GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-Cκ。
-第二融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-CH1_EE(K147E,K213E),(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VL(OX40)-Cκ_RK(E123R,Q124K),GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。而且,在分别与OX40的VL和VH融合的CH和Cκ中,引入氨基酸突变(所谓的带电荷残基)以阻止Bence Jones蛋白的生成和进一步推动正确配对,即抗OX40结合物49B4的CH1域中的负电荷(K147E,K213E,编号方式依照Kabat EU索引)和CL域中的正电荷(E123R和Q124K,编号方式依照Kabat EU索引)。
表12显示双特异性抗体P1AE2254的氨基酸序列。
表12:P1AE2254的序列
Figure BDA0002429335460001112
Figure BDA0002429335460001121
组装结构的示意图显示于图1L。
2.13 FAP(4B9)-OX40(49B4)Contorsbody P1AE2340(Contorsbody 6)的制备
克隆包含两条融合多肽和轻链的双特异性抗体,如下:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-CH1_EE(K147E,K213E),(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(OX40)-Cκ_RK(E123R,Q124K),GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-Cκ。
-第二融合多肽(自N至C端):VH(OX40)-CH1_EE(K147E,K213E),(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VL(OX40)-Cκ_RK(E123R,Q124K)。
-轻链:VL(FAP)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。而且,在分别与OX40的VL和VH融合的CH和Cκ中,引入氨基酸突变(所谓的带电荷残基)以阻止Bence Jones蛋白的生成和进一步推动正确配对,即抗OX40结合物49B4的CH1域中的负电荷(K147E,K213E,编号方式依照Kabat EU索引)和CL域中的正电荷(E123R和Q124K,编号方式依照Kabat EU索引)。
表13显示双特异性抗体P1AE2340的氨基酸序列。
表13:P1AE2340的序列
Figure BDA0002429335460001131
组装结构的示意图显示于图1M。
2.14 FAP(4B9)-OX40(49B4)Contorsbody P1AE2735(Contorsbody 8)的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如下:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(FAP)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(OX40)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(OX40)-Cκ。
-第二融合多肽(自N至C端):VL(FAP)-CH1,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(OX40)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VL(OX40)-Cκ。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表14显示双特异性抗体P1AE2735的氨基酸序列。
表14:P1AE2735的序列
Figure BDA0002429335460001141
Figure BDA0002429335460001151
组装结构的示意图显示于图1N。
2.15 FAP(4B9)-OX40(49B4)Contorsbody P1AE2743(Contorsbody 9)的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如下:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(FAP)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VH(OX40)-CH1。
-第二融合多肽(自N至C端):VL(FAP)-CH1,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VH(OX40)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表15显示双特异性抗体P1AE2743的氨基酸序列。
表15:P1AE2743的序列
Figure BDA0002429335460001152
Figure BDA0002429335460001161
2.16 FAP(4B9)-OX40(49B4)Contorsbody P1AE2762(Contorsbody 10)的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如下:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(FAP)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(OX40)-CH1。
-第二融合多肽(自N至C端):VH(FAP)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(OX40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VL(OX40)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表16显示双特异性抗体P1AE2762的氨基酸序列。
表16:P1AE2762的序列
Figure BDA0002429335460001162
Figure BDA0002429335460001171
2.17 纯化后分子的生化分析
表17汇总FAP OX40 Contorsbody的产率和最终单体含量。
表17:FAP OX40 Contorsbody的生化分析
Figure BDA0002429335460001172
Figure BDA0002429335460001181
2.18 作为对照分子的双特异性OX40抗体的制备
作为对照,制备下面的双特异性抗OX40抗体:
a)与WO 2017/055398 A2的实施例4.4(2+1型式)类似地制备具有对OX40的二价结合和对FAP的单价结合的双特异性抗体。在这种分子中,第一重链(HC 1)由一个Fab单元(VHCH1)的抗OX40结合物49B4,继以Fc节链,通过(G4S)接头融合至抗FAP结合物28H1或4B9的VH域构成。构建物的第二重链(HC 2)由一个Fab单元(VHCH1)的抗OX40结合物49B4,继以Fc穴链,通过(G4S)接头融合至抗FAP结合物28H1或4B9的VL域构成。分子的示意图显示于图1O。
b)如上具有对OX40的二价结合的抗体,其中抗FAP结合物的VH和VL域用不结合抗原的称作DP47的种系对照替换。这种分子用作阴性,“非靶向性”对照。
c)与WO 2017/060144 A1(4+1型式)的实施例4.4类似地制备具有对OX40的二价结合和对FAP的单价结合的双特异性抗体。在这种分子中,第一重链(HC 1)由两个Fab单元(VHCH1_VHCH1)的抗OX40结合物49B4,继以Fc节链,通过(G4S)接头融合至抗FAP结合物4B9的VH域构成。构建物的第二重链(HC 2)由两个Fab单元(VHCH1_VHCH1)的抗OX40结合物49B4,继以Fc穴链,通过(G4S)接头融合至抗FAP结合物4B9的VL域构成。分子的示意图显示于图1P。
通过应用节入穴技术以容许组装两种不同重链来制备具有对OX40的四价结合和对FAP的单价结合的双特异性激动性OX40抗体。依照国际专利申请公开号WO 2012/130831A1中描述的方法在重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。
表18:实验中使用的对照分子
Figure BDA0002429335460001182
Figure BDA0002429335460001191
实施例3
FAP OX抗体的表征
3.1对人OX40的结合(动力学亲和力)
使用BIACORE T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振调查双特异性FAP-OX40抗体对人OX40的结合。通过使用由GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒于pH 5.0在CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上偶联8000个共振单元(RU)左右的捕捉系统(20μg/ml抗人IgG(Fc)；订购代码:BR100839；GE Healthcare Bio-Sciences AB,Sweden)。运行缓冲液是PBS-P pH 7.4(20mM磷酸盐缓冲液,2.7mM KCl,137mM NaCl,0.05％表面活性剂P20)。将流动室设置为25℃,并将样品块设置为12℃,并用运行缓冲液引发两次。通过将2μg/ml溶液以5μl/min的流速注射60秒来捕捉双特异性抗体。通过以30μl/min的流速将人OX40注射120秒来测量联合,始于600nM,1:3稀释。对解离期监测多至720秒并通过自样品溶液转换至运行缓冲液来触发。通过以10μl/min的流速用3M MgCl2清洗60秒来再生表面。通过减去自抗人IgG(Fc)表面获得的响应来修正本体折射率(bulk refractive index)差异。还减去空白注射(＝双重参照)。为了计算KD和动力学参数,使用Langmuir 1:1模型。
表19:抗FAP/抗OX40抗体对重组人OX40的结合
Figure BDA0002429335460001192
Figure BDA0002429335460001201
两种Contorsbody均具有与“4+1”IgG样型式的四价抗OX40抗体相比相似的KD值；亲和力在分子间是相当的且Rmax指示测试的各种分子的效价。
测试别的FAP-OX40 Contorsbody并显示如下文表20中列出的KD值。
表20:抗FAP/抗OX40抗体对重组人OX40的结合
Figure BDA0002429335460001202
3.2对人FAP的结合(动力学亲和力)
使用BIACORE T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振调查双特异性FAP-OX40抗体对人FAP的结合。通过使用由GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒于pH 4.5在CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上偶联12000个共振单元(RU)左右的捕捉系统(15μg/ml抗组氨酸抗体；订购代码:28995056；GE Healthcare Bio-Sciences AB,Sweden)。用于固定化的运行缓冲液是HBS-N pH 7.4(10mM HEPES,150mM NaCl,pH 7.4,GE Healthcare)。对于下面的动力学表征,运行缓冲液是PBS-P pH 7.4(20mM磷酸盐缓冲液,2.7mM KCl,137mM NaCl,0.05％表面活性剂P20)。将流动室设置为25℃,并将样品块设置为12℃,并用运行缓冲液引发两次。通过以5μl/min的流速将25μg/ml溶液注射60秒来捕捉重组人FAP。通过以30μl/min的流速将双特异性抗体注射120秒来测量联合,始于300nM,1:2稀释。对解离期监测多至720秒并通过自样品溶液转换至运行缓冲液来触发。通过以30μl/min的流速用10mM甘氨酸pH1.5清洗60秒来再生表面。通过减去自抗组氨酸表面获得的响应来修正本体折射率差异。还减去空白注射(＝双重参照)。为了计算KD和动力学参数,使用Langmuir 1:1模型。
表21:抗FAP/抗OX40抗体对重组人FAP的结合
Figure BDA0002429335460001211
两种分子具有相似的KD值。Contorsbody型式对FAP ECD的联合与标准对照分子相比不太理想。然而,在对照分子中使用两个4xG4S肽接头将抗FAP模块C端连接至Fc部分,而在Contorsbody中使用两个2xG4S肽接头将抗FAP模块连接至Contorsbody。测试别的FAP-OX40 Contorsbody并显示如下文表22中列出的KD值。
表22:抗FAP/抗OX40抗体对重组人FAP的结合
Figure BDA0002429335460001212
Figure BDA0002429335460001221
3.3对人OX40和人FAP的同时结合(动力学亲和力)
还使用BIACORE T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振(SPR)评估同时结合人OX40和人FAP的能力。通过使用由GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒于pH 5.0在CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上偶联8000个共振单元(RU)左右的捕捉系统(20μg/ml抗人IgG(Fc)；订购代码:BR100839；GE Healthcare Bio-Sciences AB,Sweden)。运行缓冲液是PBS-P pH 7.4(20mM磷酸盐缓冲液,2.7mM KCl,137mM NaCl,0.05％表面活性剂P20)。将流动室设置为25℃,并将样品块设置为12℃,并用运行缓冲液引发两次。通过以5μl/min的流速将2μg/ml溶液注射60秒来捕捉双特异性抗体。通过以30μl/min的流速将第一分析物(分别是人OX40或人FAP)注射120秒来测量联合。然后以30μl/min的流速将第二分析物(分别是人FAP或人OX40)注射120秒。对解离期监测多至720秒并通过自样品溶液转换至运行缓冲液来触发。通过以10μl/min的流速用3M MgCl2清洗60秒来再生表面。通过减去自抗人IgG(Fc)表面获得的响应来修正本体折射率差异。还减去空白注射(＝双重参照)。为了计算KD和动力学参数,使用Langmuir 1:1模型。所有FAP-OX40 Contorsbody均能够同时且独立结合至两种抗原。
实施例4
对细胞的结合
4.1对幼稚的较之激活的人PBMC的结合
自苏黎世献血中心获得血沉棕黄层。通过Ficoll密度梯度离心分离人PBMC。为了分离新鲜的外周血单个核细胞(PBMC),用相同体积的DPBS(Gibco by Life Technologies,目录号14190 326)稀释血沉棕黄层。对50mL聚丙烯离心管(TPP,目录号91050)供应15mLHistopaque 1077(SIGMA Life Science,目录号10771,聚蔗糖和泛影酸钠,调节至1.077g/mL的密度)并将血沉棕黄层溶液在Histopaque 1077上面分层。将管以400x g,室温,低加速度和无中断离心30分钟。之后,自界面收集PBMC,用DPBS清洗三次并在由供应有10％胎牛血清(FBS,Gibco by Life Technology,目录号16000-044,批号941273,经伽马照射,无支原体且于56℃热灭活35分钟的),1％(v/v)GlutaMAX I(Gibco by Life Technologies,目录号35050 038),1mM丙酮酸钠(SIGMA,目录号S8636),1％(v/v)MEM非必需氨基酸(SIGMA,目录号M7145)和50μMβ-巯基乙醇(SIGMA,M3148)的RPMI 1640培养基(Gibco by LifeTechnology,目录号42401-042)组成的T细胞培养基中重悬浮。在含有10％(v/v)二甲亚砜的FBS中冷冻PBMC。
在T细胞培养基中融化冷冻的PBMC并在分离之后直接使用PBMC(对静息的人PBMC的结合),或者刺激它们以接受T细胞的细胞表面上的强人OX40表达(对激活的人PBMC的结合)。因此,将幼稚的PBMC在6孔组织培养板中在供应有200U/mL Proleukin和2μg/mL PHA-L的T细胞培养基中培养2天,然后在T细胞培养基中在预包被的6孔组织培养板[4μg/mL抗人CD3(克隆OKT3)和2μg/mL抗人CD28(克隆CD28.2)]上培养1天。
为了检测OX40,混合幼稚的人PBMC和激活的人PBMC。为了能够区分幼稚的与激活的人PBMC,在结合测定法之前使用eFluor670细胞增殖染料(eBioscience,目录号65-0840-85)标记幼稚的细胞。然后将1x105个eFluor670标记的幼稚的人PBMC和未标记的激活的人PBMC的1对1混合物添加至圆底悬浮细胞96孔板(greiner bio-one,cellstar,目录号650185)的每个孔并实施结合测定法。
将细胞于4℃在黑暗中在50μL/孔含有滴定的抗OX40抗体构建物的4℃冷FACS缓冲液中染色120分钟。在用过量的FACS缓冲液清洗三次之后,将细胞于4℃在黑暗中在25μL/孔含有荧光标记的抗人CD4(克隆RPA-T4,小鼠IgG1κ,BioLegend,目录号300532),抗人CD8(克隆RPA-T8,小鼠IgG1κ,BioLegend,目录号3010441)和异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch,目录号109-096-098)的混合物的4℃冷FACS缓冲液中染色45分钟。最后将板在85μL/孔含有0.2μg/mL DAPI(Santa Cruz Biotec,目录号Sc-3598)的FACS缓冲液中重悬浮并在同一天使用5激光LSR-Fortessa(带有DIVA软件的BD Bioscience)采集。
如图2B和2D中显示的,对OX40特异性的抗原结合分子无一结合静息的的人CD4 T细胞或CD8 T细胞。与之对比,所有抗原结合分子(OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体,OX40(49B4)DP47 2+1双特异性抗体,OX40(49B4)FAP(4B9)4+1双特异性抗体,ContorsbodyCD134-0093和CD134-0094)均结合激活的CD8+或CD4+T细胞(图2A和2C)。对CD4+T细胞的结合比对CD8+T细胞强得多。所有型式的2+1设计以相似强度结合OX40表达性(阳性)细胞,不依赖于第二特异性的结合模块。另外,4+1构建物显示最强结合。Contorsbody CD134-0093显示介于2+1和4+1型式之间的中等结合,第二Contorsbody CD134-0094对CD4+和CD8+T细胞的结合不如2+1型式强。阴性对照DP47 hu IgG1抗体(P329G LALA)并不结合激活的T细胞也不结合静息的T细胞。由于OX40并不在静息的CD4或CD8 T细胞上上调,因此测试的分子无一结合静息的细胞。而且,所有构建物(除了阴性对照以外)的结合在CD4 T细胞上更强,因为OX40表达在这些细胞上比在CD8 T细胞上更高。
第二实验的结果在图2E至2H中显示。如这些图中显示的,正如预期的,测试的分子(OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体,OX40(49B4)FAP(4B9)2+1双特异性抗体,OX40(49B4)DP47 2+1双特异性抗体,Contorsbody P1AE0085,P1AE0086和P1AE0087)无一结合静息的人CD4+T细胞或CD8+T细胞,因为OX40并不在静息的细胞上表达(图2F和2H)。与之对比,所有抗原结合分子展示对激活的CD8+和CD4+T细胞的结合(图2E和2G)。CD8+T细胞上的信号幅度比CD4 T细胞上的更低,与OX40表达水平有关(在CD4+T细胞上高)。然而,每种测试的分子的结合样式在CD4+和CD8+T细胞之间是相当的。所有三种Contorsbody分子确实结合OX40表达性细胞,然而它们显示与2+1对照分子相比降低的对OX40的结合能力,不管FAP结合克隆。特别地,Contorsbody P1AE0087的结合比Contorsbody P1AE0085受损略微更多。
别的Contorsbody(Contorsbody 1至11)对激活的CD4+T细胞的结合显示于图8A至8D,对激活的CD8+T细胞的结合显示于图10A至10D。分别在图9A至9D和图11A至11D中,正如预期的,显示了Contorsbody 1至11无一结合静息的人CD4 T细胞或CD8 T细胞。与之对比,所有抗原结合分子均结合激活的CD8+或CD4+T细胞。对CD4+T细胞的结合比对CD8+T细胞强得多。所有型式的2+1设计以相似强度结合OX40阳性细胞,不依赖于第二特异性的结合模块。阴性对照(DP47 hu IgG1 P329G LALA)并不结合激活的或静息的T细胞。由于OX40并不在静息的CD4或CD8 T细胞上上调,因此测试的分子无一结合静息的细胞。而且,所有构建物(除了阴性对照以外)的结合在CD4+T细胞上更强,因为OX40表达在这些细胞上比在CD8+T细胞上更高。
4.2对人FAP表达性肿瘤细胞的结合
使用人成纤维细胞激活蛋白(huFAP)表达性WM266-4细胞(ATCC CRL-1676)测试对细胞表面FAP的结合。使用局限于核表达NucLight Red荧光蛋白的A549 NucLightTM Red细胞(Essen Bioscience,目录号4491)测试对OX40阴性FAP阴性肿瘤细胞的结合的缺乏以容许与未标记的人FAP阳性WM266-4细胞分开。遵循标准Essen方案在8μg/ml Polybrene存在下以MOI 3(TU/细胞)用Essen CellPlayer NucLight Red慢病毒(Essen Bioscience,目录号4476；EF1α,嘌呤霉素)转导亲本A549(ATCC CCL-185)。这导致≥70％转导效率。
将5x104个未标记的WM266-4细胞和未标记的A549 NucLightTM Red细胞在FACS缓冲液中的混合物添加至圆底悬浮细胞96孔板(greiner bio-one,cellstar,目录号650185)的每个孔并实施结合测定法。将板以400x g于4℃离心4分钟,并弹掉上清液。将细胞用200μL DPBS清洗一次并通过短暂且温和的漩涡震荡重悬浮团粒。以指定范围的浓度(滴定)在50μL/孔含有双特异性抗原结合分子(一抗)的4℃冷FACS缓冲液中重悬浮所有样品并于4℃温育120分钟。之后,将细胞用200μL 4℃FACS缓冲液清洗四次并通过短暂漩涡震荡重悬浮。将细胞进一步用25μL/孔含有异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch,目录号109-096-098)的4℃冷二抗溶液染色并于4℃在黑暗中温育60分钟。最后在90μL/孔含有0.2μg/mL DAPI(Santa CruzBiotec,目录号Sc-3598)的FACS缓冲液中重悬浮板并在同一天使用5激光LSR-Fortessa(带有DIVA软件的BD Bioscience)采集。
如图3A和3B中显示的,FAP靶向性抗OX40双特异性抗体有效结合人FAP表达性靶细胞。因此,只有FAP靶向性抗OX40抗原结合分子显示直接肿瘤靶向特性。FAP 4B9具有对人FAP的高亲和力,而28H1具有对人FAP的低亲和力。FAP靶向性OX40(49B4)FAP(4B9)4+1双特异性抗体指示对FAP+细胞的最强结合,接着是2+1 Contorsbody CD134-0093,ContorsbodyCD134-0094,然后是OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体。必须指出的是,FAP 4B9具有与28H1相比更高的对人FAP的亲和力。两种Contorsbody对FAP+细胞的结合与含有VHVL的靶向性2+1抗体构建物相比均略微改善。非靶向性OX40(49B4)DP47 2+1双特异性抗体和阴性对照(DP47 hu IgG1抗体(P329G LALA))并不结合任何FAP+细胞。对激活的人CD4 T细胞和FAP阳性肿瘤细胞的结合的EC50值在表23中汇总。
表23:不同型式的FAP靶向性OX40(49B4)双特异性抗体对(CD4+T细胞上的)细胞表面人FAP和人OX40的结合的EC50值
Figure BDA0002429335460001261
在又一项实验中,与OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体,OX40(49B4)FAP(4B9)2+1双特异性抗体和OX40(49B4)DP47 2+1双特异性抗体(阴性对照)比较测试Contorsbody P1AE0085,P1AE0086和P1AE0087。结果在图3C和3D中显示。所有FAP靶向性抗OX40抗原结合分子均结合人FAP表达性细胞。FAP 4B9克隆具有与28H1相比更高的对人FAP的亲和力。因而,正如预期的,对OX40(49B4)FAP(4B9)2+1双特异性抗体观察对最佳结合特性且OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体显示降低的结合。所有三种Contorsbody显示对FAP的结合,尽管对于两种FAP克隆(4B9和28H1)而言对FAP+细胞的结合与OX40(49B4)FAP2+1双特异性抗体相比均略微受损。接头长度看来并不影响对huFAP的结合,因为Contorsbody P1AE0085和P1AE0087展示非常相似的结合特性。非靶向性2OX40(49B4)DP472+1双特异性抗体和阴性对照(DP47 hu IgG1抗体(P329G LALA))并不结合任何FAP+细胞。另外,分子无一显示对FAP-A549NLR细胞的结合,指示结合对人FAP是特异性的。对激活的人CD4和CD8 T细胞和FAP阳性细胞的结合的EC50值在表24中汇总。
表24:不同型式的FAP靶向性OX40(49B4)双特异性抗体对(CD4+T细胞上的)细胞表面人FAP和人OX40的结合的EC50值
Figure BDA0002429335460001271
n.c.无曲线拟合。不可能计算EC50
n.a.不适用
Contorsbody 1至10对FAP+细胞(NIH/3T3-huFAP肿瘤细胞)的结合结果在图13A至13D中显示。所有FAP靶向性抗OX40抗原结合分子均结合人FAP表达性细胞。如图14A至14D中显示的,FAP靶向性抗OX40抗原结合分子无一能够结合A549NLR(FAP阴性)肿瘤细胞。Contorbody 8结合FAP+细胞最强,接着是Contorbody 10和Contorbody 6。两种contorbody对FAP+细胞的结合与含有VHVL的靶向性2+1抗体构建物相比略微改善。非靶向性2+1抗OX40构建物(7718)和阴性对照(8105)并不结合任何FAP+细胞。对激活的人CD4+T细胞和FAP阳性肿瘤细胞的结合的EC50值在表25中汇总。
表25:不同型式的FAP靶向性OX40(49B4)双特异性抗体对(CD4+T细胞上的)细胞表面人FAP和人OX40的结合的EC50值
Figure BDA0002429335460001281
n.c.无曲线拟合。不可能计算EC50
n.a.不适用
实施例5
双特异性抗人OX40结合分子的功能特性
5.1表达人OX40和报告基因NFκB-萤光素酶的HeLa细胞
OX40对它的配体的激动性结合经由核因子κB(NFκB)的激活诱导下游信号传导(A.D.Weinberg et al.,J.Leukoc.Biol.2004,75(6),962-972)。生成重组报告细胞系HeLa_hOX40_NFκB_Luc1以在它的表面上表达人OX40。另外,它包含含有在NFκB敏感性增强子区段控制下的萤光素酶基因的报告质粒。OX40触发诱导NFκB的剂量依赖性激活,它在核中易位,在那里它在报告质粒的NFκB敏感性增强子上结合以提高萤光素酶蛋白质表达。萤光素酶催化萤光素氧化,产生发射光的氧化萤光素。这可以通过照度计来量化。
如此,作为生物活性的度量分析各种抗OX40分子在HeLa_hOX40_NFκB_Luc1报告细胞中诱导NFκB激活的能力。
单独地和在有构建物通过二抗或FAP+肿瘤细胞系高交联的情况下测试选定双特异性OX40(49B4)抗体(二价FAP靶向性VHVL或Contorsbody型式的NFκB激活能力。使用人成纤维细胞激活蛋白(huFAP)表达性NIH/3T3-huFAP克隆19测试FAP结合性抗体通过细胞表面FAP的交联。这种细胞系是通过在1.5μg/mL嘌呤霉素选择下用表达载体pETR4921转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞系(ATCC CRL-1658)以表达huFAP生成的。
以0.2x105个细胞/孔的细胞密度将贴壁HeLa_hOX40_NFκB_Luc1细胞培养过夜并用含有滴定的双特异性抗OX40(49B4)抗体(OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体,OX40(49B4)DP47 2+1双特异性抗体,Contorsbody CD134-0093和CD134-0094的测定培养基刺激5小时。为了测试通过二抗的高交联的影响,以1:2比率(一抗对二抗)添加25μL/孔含有二抗抗人IgG Fcγ片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch,109-006-098)的培养基。为了测试通过细胞表面FAP结合的高交联的影响,以4对1比率(FAP+肿瘤细胞是报告细胞的四倍每孔)共培养25μL/孔含有FAP+肿瘤细胞(NIH/3T3-huFAP克隆19)的培养基。
温育后,吸出测定上清液并将板用DPBS清洗两次。使用萤光素酶100测定系统和报告物裂解缓冲液(均来自Promega,目录号E4550和目录号E3971)依照制造商的说明书进行光发射的量化。简言之,通过添加30μL/孔1x裂解缓冲液将细胞于-20℃裂解10分钟。将细胞于37℃融化20分钟,之后添加90μL/孔提供的萤光素酶测定试剂。立即用SpectraMax M5/M5e微量板读数仪(Molecular Devices,USA)量化光发射,使用500ms积分时间,没有任何滤光片以收集所有波长。通过HeLa_hOX40_NFκB_Luc1细胞的基础发光来修正发射的相对光单元(URL)并使用Prism4(GraphPad Software,USA)针对对数一抗浓度绘图。使用内置的S形剂量响应拟合曲线。
如图4A至4C中显示的,所有抗OX40构建物的存在均诱导NFκB激活。经由抗huIgGFcγ特异性二抗的高交联以FAP不依赖性方式提高所有结合物的NFκB激活。两种双特异性抗体,2+1构建物OX40(49B4)FAP(28H1)和OX40(49B4)DP47,运行相似,因为FAP靶向看来不影响NFκB诱导。Contorsbody CD134-0093和CD134-0094性能相当,但是显示在交联下不太强的NFκB激活(它们的效果看来是固有的且是不依赖交联的)。当使用FAP靶向性分子(实心三角形,半实心圆形,实心圆形)时FAP表达性肿瘤细胞以浓度依赖性方式强烈提高NFκB介导的萤光素酶激活的诱导。对OX40(49B4)DP47 2+1双特异性抗体(空心圆形)没有看到此类效果,因为构建物不能通过FAP+肿瘤细胞进一步高交联。另外,FAP靶向性OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体诱导比Contorsbody CD134-0093和Contorsbody CD134-0094更强的NFκB激活,而CD134-0094显示比CD134-0093更强的激活(图4A)。总之,Contorsbody构建物能够诱导OX40介导的NFκB激活,然而它们不如通过二抗或细胞表面表达的FAP交联的FAP靶向性OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体有活性。然而,在没有次级寡聚化的情况下添加时也有更少的活性。
第二实验的结果在图4D至4F中显示。如这些图中显示的,所有测试的抗OX40分子(OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体,OX40(49B4)FAP(4B9)2+1双特异性抗体,OX40(49B4)DP47 2+1双特异性抗体,Contorsbody P1AE0085,P1AE0086和P1AE0087)的存在均在交联缺失下诱导非常微小的NFκB激活(图4D)。所有三种2+1对照分子(OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体,OX40(49B4)FAP(4B9)2+1双特异性抗体和OX40(49B4)DP472+1双特异性抗体)均在通过二抗提供高交联时显示非常相似的NFκB激活(图4F)。三种Contorsbody分子显示与对照相比略微降低的活性。在FAP表达性细胞存在下没有观察到测试的Contorsbody和对照分子之间NFκB激活中的这种差异。用GraphPad Prism软件分析与Contorsbody分子和它们的相应FAP靶向性对照分子对应的曲线,分享一个全局曲线拟合,指示效力没有显著差异。即使测试的两个克隆(4B9和28H1)之间对FAP有不同结合亲和力,它并不转化成这种测定法中的效力的明显差异。DP47靶向性2+1对照分子仅仅展示最低限度活性,因为它并不具有FAP结合模块。阴性对照(DP47 hu IgG1抗体(P329G LALA))显示没有活性,不依赖于交联。
我们进一步测试单独的和在双特异性抗体构建物通过FAP+肿瘤细胞系高交联的情况下Contorsbody 1至11的NFκB激活能力。在图15A至15D中显示在FAP表达性肿瘤细胞存在下的NFκB激活。在图16A至16D中能看到在没有通过FAP的交联的情况下的NFκB激活。在有和没有用FAP+细胞的交联的情况下HeLa细胞中的NFκB激活的曲线下面积值的汇总在图17中显示。所有抗OX40构建物的存在均诱导NFκB激活。经由FAP+肿瘤细胞的高交联提高所有测试的双特异性抗体的NFκB激活。在使用FAP靶向性分子时FAP表达性肿瘤细胞以浓度依赖性方式强烈提高NFκB介导的萤光素酶激活的诱导。在2+1型式中FAP结合模块用非结合性DP47单元替换时没有看到此类效果(空心三角形),因为构建物不能通过FAP+肿瘤细胞进一步高交联。所有Contorsbody性能与OX40(49B4)FAP(4B9)2+1双特异性抗体相当。
5.2 OX40介导的亚最佳TCR触发的静息的人PBMC的共刺激和通过细胞表面FAP的高交联
5.1节中显示添加FAP+肿瘤细胞能强烈提高人OX40阳性报告细胞系中由FAP靶向性二价抗OX40抗体通过提供OX40受体的强寡聚化诱导的NFκB活性。同样地,我们在NIH/3T3-huFAP克隆19细胞存在下对FAP靶向性二价抗OX40抗体测试它们挽救静息的人PBMC细胞的亚最佳TCR刺激的能力。
人PBMC制备物含有(1)静息的OX40阴性CD4+和CD8+T细胞和(2)在它们的细胞表面上具有各种Fcγ受体分子的抗原呈递细胞,例如B细胞和单核细胞。人IgG1同种型的抗人CD3抗体能以它的Fc部分结合静息的OX40阴性CD4+和CD8+T细胞上存在的Fcγ受体分子并介导延长的TCR激活。这些细胞然后在数小时内开始表达OX40。针对OX40的功能性激动性化合物能经由激活的CD8+和CD4+T细胞上存在的OX40受体发信号并支持TCR介导的刺激。
在经过照射的FAP+NIH/3T3-huFAP克隆19细胞和滴定的抗OX40构建物存在下将静息的人PBMC用亚最佳浓度的抗CD3抗体刺激5天。经由监测总细胞计数和用荧光标记的针对T细胞激活和成熟标志物(CD25/CD127)的抗体的共染色通过流式细胞术分析对T细胞存活和增殖的影响。
于37℃使用细胞解离缓冲液(Invitrogen,目录号13151-014)收获小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3-huFAP克隆19细胞10分钟。将细胞用DPBS清洗一次。将NIH/3T3-huFAP克隆19细胞以0.2x105个细胞/孔的密度在T细胞培养基中在无菌96孔圆底贴壁组织培养板(TPP,目录号92097)中在温箱(Hera Cell 150)中于37℃和5％CO2培养过夜。次日在X射线辐照仪中使用4500RAD的剂量照射它们以防止稍后人PBMC过度生长超过肿瘤细胞系。
通过Ficoll密度离心分离人PBMC。以0.6x105个细胞/孔的密度将细胞添加至每个孔。添加10nM终浓度的抗人CD3抗体(克隆V9,人IgG1)和指定浓度的FAP靶向性二价抗OX40抗原结合分子和Contorsbody。将细胞在温箱(Hera Cell 150)中于37℃和5％CO2激活4天。
然后,将细胞用荧光染料缀合的抗体抗人CD4(克隆RPA-T4,BioLegend,目录号300532),CD8(克隆RPa-T8,BioLegend,目录号3010441),CD25(克隆M-A251,BioLegend,目录号356112)和CD127(克隆A019D5,BioLegend,目录号351324)于4℃表面染色20分钟。将细胞团粒用FACS缓冲液清洗一次。将板最后在85μL/孔含有0.2μg/mL DAPI(Santa CruzBiotec,目录号Sc-3598)的FACS缓冲液中重悬浮并在同一天使用5激光LSR-Fortessa(带有DIVA软件的BD Bioscience)采集。
如图5A至5F中显示的,用非靶向性OX40(49B4)DP47 2+1双特异性抗体(空心三角形)的共刺激并不挽救亚最佳TCR刺激的CD4和CD8 T细胞。FAP靶向性OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体(实心三角形)和2+1Contorsbody CD134-0093和CD134-0094通过NIH/3T3-huFAP克隆19细胞的存在的高交联在人CD4和CD8 T细胞中强烈促进存活并诱导增强的激活表型。而且,尤其是Contorsbody CD134-0093(实心圆形)看来显示与靶向性OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体相比最相似的就激活而言的特性。而且,ContorsbodyCD134-0094(半实心圆形)显示对CD8 T细胞比对CD4 T细胞更强的激活(图5D),而它展现与Contorsbody CD134-0093和FAP靶向性OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体相当的对CD4 T细胞的激活。总之,将生物活性和T细胞激活的结果标准化并在图6中汇总,其中对于分析的标志物作为曲线下面积量化每种构建物的激动能力并针对彼此绘图。如图6中显示的,关于FSC-A和CD25,Contorsbody CD134-0093显示最强的对CD4和CD8 T细胞二者的激活。这种分子看来比FAP靶向性OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体更加有力,大致是CD134-0093的强度的约75％。Contorsbody CD134-0094看来效力略低,因为仅仅CD25得到上调,但是CD4和CD8 T细胞的大小(FSC-A)没有增大。而且,非靶向性2+1分子和阴性对照并不显示任何激活(很低的标准化AUC值)。
在又一项实验中,用非靶向性OX40(49B4)DP47 2+1双特异性抗体的共刺激并不挽救亚最佳TCR刺激的CD4+和CD8+T细胞。FAP靶向性二价抗OX40抗体OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体和OX40(49B4)FAP(4B9)双特异性抗体,和三种Contorsbody分子(P1AE0085,P1AE0086和P1AE0087)通过NIH/3T3-huFAP克隆19细胞的存在的高交联强烈促进增强的原代人CD4和CD8 T细胞的激活。P1AE0086触发与相应的2+1 4B9对照抗体OX40(49B4)FAP(4B9)双特异性抗体非常相似的T细胞激活。它们导致比具有已知具有较低人FAP亲和力的28H1 FAP结合物的分子更加激活的表型。与2+1对照分子OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体相比,Contorsbody P1AE0085和P1AE0087显示相似的CD4和CD8 T细胞上的CD25表达和略微更高的FSC-A MFI。用原代PBMC的这种测定法显示含有高亲和力结合物(4B9)的FAP靶向性分子的效力比具有低亲和力FAP结合物(28H1)的分子更高。生物活性和T细胞激活的结果在图7A至7D中显示。
还测试Contorsbody 7,8,9和10挽救亚最佳TCR刺激的CD4+和CD8+T细胞的能力。图18A和18B显示CD4 T细胞的激活,通过亚最佳CD3刺激后的表面标志物CD25指示。在图18C和18D中显示CD8 T细胞的激活,通过表面标志物CD25指示。图19A和19B显示CD4 T细胞的FSC-A MFI,而图19C和19D显示CD8 T细胞的FSC-A MFI。eFluor 670是用于测量细胞分裂的增殖染料。eFluor 670水平,分别地,CD4 T细胞的增殖在图20A和20B中显示,而CD8 T细胞的增殖在图20C和20D中显示。CD4 T细胞的IL-7Ra(CD127)下调在图21A和21B中显示,而CD8 T细胞的在图21C和21D中显示。所有结果证明,在人CD4中和以较小程度在CD8 T细胞中,Contorsbody和OX40(49B4)FAP(4B9)双特异性抗体(实心三角形)在NIH/3T3-huFAP克隆19细胞存在下的高交联强烈促进存活并诱导增强的激活表型。在图22A至22D中,各种生物活性测定法的结果作为曲线下面积汇总。
5.3结果的汇总
总之,2+1 Contorsbody CD134-0093性能比2+1 Contorsbody CD134-0094更好。CD134-0093在激活的CD4 T细胞上的结合比FAP靶向性OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体和CD134-0094之一更强,二者显示相似的结合特性(图2A)。两种Contorsbody展示较好的对WM266-4细胞上的人表面FAP的结合(图3A),结合强度介于OX40(49B4)FAP(4B9)4+1双特异性抗体(包含高亲和力结合物4B9)和OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体(包含低亲和力结合物28H1)之间。即使Contorsbody的型式不同于如实施例2.9中描述的OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体,结合特性看来一样好或甚至更好。无论如何,它们没有达到OX40(49B4)FAP(4B9)4+1双特异性抗体(实施例2.9)的MFI。查看在有交联性NIH 3T3huFAP细胞的情况下的NFκB激活,Contorsbody显示与OX40(49B4)FAP(28H1)2+1双特异性抗体相比中等NFκB激活,但是仍然比非靶向性OX40(49B4)DP47 2+1双特异性抗体(图4A)更强。两种Contorsbody上的FAP域看来能够起交联剂的作用和激活OX40信号传导。使用Fcγ特异性二抗作为交联剂,两种Contorsbody展现相似的NFκB激活,但是性能不如靶向性对照分子好(图4B)。Contorsbody的生物活性测试揭示CD134-0093看来诱导比CD134-0094更加明显的CD4和CD8 T细胞上的激活表型(图5A-D)。Contorsbody CD134-0093甚至展现比二价2+1型式更强的T细胞激活(图6)。
Contorsbody P1AE0085,P1AE0086和P1AE 0087显示与二价抗OX40对照分子相比略微降低的结合激活的CD4+和CD8+T细胞的表面上表达的OX40的能力(图2E-2H)。P1AE0085,P1AE0086和P1AE0087还展示与它们的相应对照(2+1 4B9和28H1 FAP结合物)相比部分受损的对NIH-3T3 huFAP克隆19细胞的表面上表达的人FAP的结合(图3C和3D)。含有高亲和力FAP结合物4B9的分子展现比具有更低亲和力28H1结合物的分子卓越的对人FAP的结合能力。NFκB激活测定法揭示在经由NIH-3T3 huFAP克隆19细胞交联时三种Contorsbody分子P1AE0085,P1AE0086和P1AE 0087诱导与对照FAP靶向性分子相似的NFκB激活(图4F)。低和高亲和力FAP靶向性抗OX40分子在HeLa NFκB报告测定法中的效力没有区别。还在5天激活测定法中使用原代人PBMC和NIH-3T3 huFAP克隆19细胞作为交联细胞测试Contorsbody分子的生物活性。具有4B9 FAP结合物的分子在CD4+和CD8+T细胞中诱导与28H1结合物相比更多的激活表型。Contorsbody分子性能与它们的相应对照分子一样好。总之,这些数据指示Contorsbody分子P1AE0085,P1AE0086和P1AE0087具有与对照分子相似的效力,尽管对OX40和huFAP的结合能力略微降低。
总而言之,尽管型式不同,Contorsbody(和尤其是CD134-0093)看来具有与实施例2.18中描述的FAP靶向性2+1抗OX40抗体相当的(如果不是更好的)关于结合和T细胞激活的特性。
实施例6
具有两个结合4-1BB的抗原结合域和一个结合FAP的抗原结合域的双特异性抗体(FAP-4-1BB Contorsbody)的制备
FAP结合物的生成和制备描述于WO 2012/020006 A2,通过援引将其收入本文。对于4-1BB结合物,依照US 7,288,638 B2或US 7,659,384 B2获得克隆20H4.9的VH和VL序列。
6.1 FAP(4B9)-4-1BB(20H4.9)Contorsbody P1AE1899的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如图1A中描绘的:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(4-1BB)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(4-1BB)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-Cκ
-第二融合多肽(自N至C端):VH(4-1BB)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VL(4-1BB)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表26显示双特异性抗体P1AE1899的氨基酸序列。
表26:P1AE1899的序列
Figure BDA0002429335460001351
Figure BDA0002429335460001361
组装结构的示意图显示于图1E(OX40用4-1BB替换)。
6.2 FAP(4B9)-4-1BB(20H4.9)Contorsbody P1AE2051的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如下:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(4-1BB)-CH1_EE(K147E,K213E),(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(4-1BB)-Cκ_RK(E123R,Q124K),GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-Cκ。
-第二融合多肽(自N至C端):VH(4-1BB)-CH1_EE(K147E,K213E),(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VL(4-1BB)-Cκ_RK(E123R,Q124K),GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。而且,在分别与OX40的VL和VH融合的CH和Cκ中,引入氨基酸突变(所谓的带电荷残基)以阻止Bence Jones蛋白的生成和进一步推动正确配对,即抗OX40结合物49B4的CH1域中的负电荷(K147E,K213E,编号方式依照Kabat EU索引)和CL域中的正电荷(E123R和Q124K,编号方式依照Kabat EU索引)。
表27显示双特异性抗体P1AE2051的氨基酸序列。
表27:P1AE2051的序列
Figure BDA0002429335460001362
Figure BDA0002429335460001371
组装结构的示意图显示于图1L(OX40用4-1BB替换)。
6.3 纯化后分子的生化分析
表28汇总FAP-4-1BB Contorsbody的产率和最终单体含量。
表28:FAP 4-1BB Contorsbody的生化分析
构建物 单体[％](SEC) 蛋白A后的产率[mg/l]
Contorsbody P1AE1899 100 0.72
Contorsbody P1AE2051 100 0.06
实施例7
FAP-4-BB Contorsbody的表征
7.1对人FAP的结合(动力学亲和力)
如实施例3.2中描述的使用BIACORE T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振调查双特异性FAP-4-1BB抗体对人FAP的结合。为了计算KD和动力学参数,使用Langmuir 1:1模型。
表29:抗FAP/抗4-1BB抗体对重组人FAP的结合
分子 ka(1/Ms) kd(1/s) K<sub>D</sub>(M) R<sub>max</sub>(RU) t<sub>1/2</sub>(s)
Contorsbody P1AE1899 5.41E+04 2.80E-04 5.17E-09 18.8 2475.7
Contorsbody P1AE2051 4.40E+04 3.67E-04 8.32E-09 6.7 1891.1
两种分子具有相似的KD值。
7.2人4-1BB和NFκB-萤光素酶报告基因表达性报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中的NF-κB激活
4-1BB(CD137)受体对它的配体(4-1BBL)的激动性结合经由核因子κB(NFκB)的激活诱导4-1BB下游信号传导并促进CD8 T细胞的存活和活性(Lee HW,Park SJ,Choi BK,KimHH,Nam KO,Kwon BS.4-1BB promotes the survival of CD8(+)T lymphocytes byincreasing expression of Bcl-x(L)and Bfl-1.J Immunol 2002；169:4882-4888)。为了监测这种由2+1H2H抗4-1BB,抗FAP huIgG1 PGLALA双特异性抗体介导的NFκB激活,自Promega(Germany)购买Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2报告细胞系。在100mL供应有10％(v/v)胎牛血清(FBS,Gibco by Life Technologies,目录号16000-044,批号941273,经伽马照射,无支原体,热灭活的),2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽(Glutqa-MAX-I,Gibco by LifeTechnologies,目录号35050-038),1mM丙酮酸钠(SIGMA-Aldrich目录号S8636),1％(v/v)MEM-非必需氨基酸溶液100x(SIGMA-Aldrich,目录号M7145),600μg/ml G-418(Roche,目录号04727894001),400μg/ml潮霉素B(Roche,目录号:10843555001)和25mM HEPES(SigmaLife Sience,目录号:H0887)的RPMI 1640培养基(Gibco by Life Technologies,目录号42401-042)中作为悬浮细胞培养细胞。为了测定法,收获细胞并在供应有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-I的测定培养基RPMI 1640培养基中重悬浮。将含有2x103个Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2报告细胞的10μl转移至无菌白色384孔带盖平底组织培养板(Corning,目录号:3826)的每个孔。添加10μL含有滴定浓度的Contorsbody,2+1双特异性激动性抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)huIgG1 P329GLALA抗体,抗4-1BB(20H4.9)huIgG1 P329GLALA抗体,抗4-1BB(20H4.9)huIgG4和同种型对照(DP47 hu IgG1 P329GLALA抗体)的测定培养基。最后,供应10μL单独的或含有1x104个细胞FAP表达性细胞,NIH/3T3-huFAP克隆19(如上文描述的)的测定培养基并将板在细胞温箱中于37℃和5％CO2温育6小时。将6μl新鲜融化的One-Glo萤光素酶测定法检测溶液(Promega,目录号:E6110)添加至每个孔并立即使用Tecan微量板读数仪(500ms积分时间,无滤光片收集所有波长)测量发光光发射。
如图23A中显示的,在FAP表达性细胞缺失下,无一分子能够在Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2报告细胞系中诱导强人4-1BB受体激活,导致NFκB激活和因此萤光素酶表达。在FAP表达性细胞,像NIH/3T3-huFAP克隆19(人FAP转基因小鼠成纤维细胞细胞系)存在下(见图23B),双特异性2+1FAP 4-1BB Contorsbody以及2+1双特异性激动性抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)huIgG1 P329GLALA抗体(黑色实心星形)的交联导致Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2报告细胞系中NFκB激活的萤光素酶活性的强烈升高,超出由非靶向性对照4-1BB抗体介导的激活。EC50值和激活曲线的曲线下面积(AUC)在表30和表31中列出。
表30:图23B中显示的激活曲线的EC50值
Figure BDA0002429335460001391
表31:图23B中显示的激活曲线的曲线下面积(AUC)的值
Figure BDA0002429335460001392
Figure BDA0002429335460001401
实施例8
具有两个结合CD40的抗原结合域和一个结合FAP的抗原结合域的双特异性抗体(FAP-CD40 Contorsbody)的制备
FAP结合物的生成和制备描述于WO 2012/020006 A2,通过援引将其收入本文。对于CD40结合物,依照WO 2006/128103的SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:16获得克隆20H4.9的VH和VL序列。
8.1 FAP(4B9)-CD40 Contorsbody P1AE1799的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如图1A中描绘的:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(CD40)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(CD40)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-Cκ
-第二融合多肽(自N至C端):VH(CD40)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VL(CD40)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表32显示双特异性抗体P1AE1799的氨基酸序列。
表32:P1AE1799的序列
Figure BDA0002429335460001402
Figure BDA0002429335460001411
组装结构的示意图显示于图1E(OX40用CD40替换)。
8.2 FAP(4B9)-CD40 Contorsbody P1AE1902的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如下:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(CD40)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(CD40)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-CH1
-第二融合多肽(自N至C端):VH(CD40)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VL(CD40)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-Cκ。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表33显示双特异性抗体P1AE1902的氨基酸序列。
表33:P1AE1902的序列
Figure BDA0002429335460001421
8.3 FAP(4B9)-CD40 Contorsbody P1AE1800的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如下:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(CD40)-CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(CD40)-Cκ,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-Cκ。
-第二融合多肽(自N至C端):VL(CD40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VH(CD40)-CH1,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表34显示双特异性抗体P1AE1800的氨基酸序列。
表34:P1AE1800的序列
Figure BDA0002429335460001431
8.4 FAP(4B9)-CD40 Contorsbody P1AE2052的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如下:
-第一融合多肽(自N至C端):VL(CD40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VH(CD40)-CH1,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-Cκ。
-第二融合多肽(自N至C端):VL(CD40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VH(CD40)-CH1,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表35显示双特异性抗体P1AE2052的氨基酸序列。
表35:P1AE2052的序列
Figure BDA0002429335460001441
Figure BDA0002429335460001451
8.5 FAP(4B9)-CD40 Contorsbody P1AE1901的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如下:
-第一融合多肽(自N至C端):VL(CD40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VH(CD40)-CH1,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-CH1。
-第二融合多肽(自N至C端):VL(CD40)-Cκ,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VH(CD40)-CH1,GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-Cκ。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
表36显示双特异性抗体P1AE1901的氨基酸序列。
表36:P1AE1901的序列
Figure BDA0002429335460001452
Figure BDA0002429335460001461
8.6 FAP(4B9)-CD40 Contorsbody P1AE2255的制备
克隆包含两条融合多肽的双特异性抗体,如下:
-第一融合多肽(自N至C端):VH(CD40)-CH1_EE(K147E,K213E),(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(CD40)-Cκ_RK(E123R,Q124K),GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VH(FAP)-Cκ。
-第二融合多肽(自N至C端):VH(CD40)-CH1_EE(K147E,K213E),(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,VL(CD40)-Cκ_RK(E123R,Q124K),GGGGSGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)连接头,VL(FAP)-CH1。
已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。而且,在分别与OX40的VL和VH融合的CH和Cκ中,引入氨基酸突变(所谓的带电荷残基)以阻止Bence Jones蛋白的生成和进一步推动正确配对,即抗OX40结合物49B4的CH1域中的负电荷(K147E,K213E,编号方式依照Kabat EU索引)和CL域中的正电荷(E123R和Q124K,编号方式依照Kabat EU索引)。
表37显示双特异性抗体P1AE2255的氨基酸序列。
表37:P1AE2255的序列
Figure BDA0002429335460001462
Figure BDA0002429335460001471
组装结构的示意图显示于图1L(OX40用CD40替换)。
8.7 纯化后分子的生化分析
表38汇总FAP-4-1BB Contorsbody的产率和最终单体含量。
表38:FAP 4-1BB Contorsbody的生化分析
构建物 单体[％](SEC) 滴度[mg/l]
Contorsbody P1AE1799 100 3.40
Contorsbody P1AE1902 100 4.42
Contorsbody P1AE1800 98.8 2.44
Contorsbody P1AE2052 100 4.06
Contorsbody P1AE1901 100 3.60
Contorsbody P1AE2255 100 1.82
实施例9
FAP CD40抗体的表征
9.1对人CD40的结合
通过表面等离振子共振(SPR)评估双特异性构建物结合人CD40的能力。于25℃在BIACORE T200(Biacore)上实施所有SPR实验,用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％表面活性剂P20(Biacore)。通过以30μl/min的流以溶液中的各种浓度注射人CD40胞外域300秒来测量联合,始于300nM,1:3稀释。对解离期监测多至1200秒并通过自样品溶液转换至运行缓冲液来触发。通过以30μl/min的流速用甘氨酸pH 2.1溶液清洗60秒来再生表面。通过减去自山羊抗人F(ab’)2表面获得的响应来修正本体折射率差异。还减去空白注射(＝双重参照)。为了计算表观KD和其它动力学参数,使用Langmuir 1:1模型。使用BiacoreTM B4000评估软件(版本1.1)计算表观Kd。
表39:双特异性CD40 x FAP Contorsbody对重组人CD40_ECD的结合(Biacore)
分子 ka(1/Ms) kd(1/s) K<sub>D</sub>(M) R<sub>max</sub>(RU) t<sub>1/2</sub>(s)
Contorsbody P1AE1800 1.35E+06 1.27E-02 9.43E-09 5.2 55
Contorsbody P1AE1799 9.57E+05 1.51E-02 1.57E-08 10.7 46
Contorsbody P1AE1901 9.91E+05 6.92E-03 6.98E-09 12.3 100
Contorsbody P1AE1902 7.76E+05 1.45E-02 1.87E-08 9.9 48
Contorsbody P1AE2052 9.45E+05 6.81E-03 7.20E-09 10.9 102
Contorsbody P1AE2255 9.18E+05 1.59E-02 1.73E-08 14.2 44
9.2对人FAP的结合(动力学亲和力)
使用BIACORE T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振调查双特异性FAP-OX40抗体对人FAP的结合。通过使用由GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒于pH 4.5在CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上偶联12000个共振单元(RU)左右的捕捉系统(15μg/ml抗组氨酸抗体；订购代码:28995056；GE Healthcare Bio-Sciences AB,Sweden)。用于固定化的运行缓冲液是HBS-N pH 7.4(10mM HEPES,150mM NaCl,pH 7.4,GE Healthcare)。对于下面的动力学表征,运行缓冲液是PBS-P pH 7.4(20mM磷酸盐缓冲液,2.7mM KCl,137mM NaCl,0.05％表面活性剂P20)。将流动室设置为25℃,并将样品块设置为12℃,并用运行缓冲液引发两次。通过以5μl/min的流速将25μg/ml溶液注射60秒来捕捉重组人FAP。通过以30μl/min的流速将双特异性抗体注射120秒来测量联合,始于300nM,1:2稀释。对解离期监测多至720秒并通过自样品溶液转换至运行缓冲液来触发。通过以30μl/min的流速用10mM甘氨酸pH1.5清洗60秒来再生表面。通过减去自抗组氨酸表面获得的响应来修正本体折射率差异。还减去空白注射(＝双重参照)。为了计算KD和动力学参数,使用Langmuir 1:1模型。
表40:抗FAP/抗CD40抗体对重组人FAP的结合
分子 ka(1/Ms) kd(1/s) K<sub>D</sub>(M) R<sub>max</sub>(RU) t<sub>1/2</sub>(sec)
Contorsbody P1AE1800 8.57E+04 7.78E-04 9.07E-09 18.4 891
Contorsbody P1AE1799 5.53E+04 2.53E-04 4.58E-09 28.9 2741
Contorsbody P1AE1901 3.82E+04 2.69E-04 7.05E-09 32.0 2578
Contorsbody P1AE1902 5.41E+04 2.88E-04 5.33E-09 26.0 2405
Contorsbody P1AE2052 3.56E+04 2.96E-04 8.31E-09 28.2 2345
Contorsbody P1AE2255 5.28E+04 2.35E-04 4.44E-09 36.7 2955
9.3对人CD40和人FAP的同时结合(动力学亲和力)
还使用BIACORE T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振(SPR)评估同时结合人CD40和人FAP的能力。通过使用由GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒于pH 5.0在CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上偶联8000个共振单元(RU)左右的捕捉系统(20μg/ml抗人IgG(Fc)；订购代码:BR100839；GE Healthcare Bio-Sciences AB,Sweden)。运行缓冲液是PBS-P pH 7.4(20mM磷酸盐缓冲液,2.7mM KCl,137mM NaCl,0.05％表面活性剂P20)。将流动室设置为25℃,并将样品块设置为12℃,并用运行缓冲液引发两次。通过以5μl/min的流速将2μg/ml溶液注射60秒来捕捉双特异性抗体。通过以30μl/min的流速将第一分析物(分别是人CD40或人FAP)注射120秒来测量联合。然后以30μl/min的流速将第二分析物(分别是人FAP或人CD40)注射120秒。对解离期监测多至720秒并通过自样品溶液转换至运行缓冲液来触发。通过以10μl/min的流速用3M MgCl2清洗60秒来再生表面。通过减去自抗人IgG(Fc)表面获得的响应来修正本体折射率差异。还减去空白注射(＝双重参照)。为了计算KD和动力学参数,使用Langmuir 1:1模型。所有FAP-CD40 Contorsbody均能够同时且独立结合两种抗原。
实施例10
FAP靶向性抗人CD40结合分子的功能特性
10.1 FAP靶向性抗人CD40结合分子对人B细胞的激活,使用FAP包被的
Figure BDA0002429335460001491
作为抗原的来源
自从Stiftung Zürcher Blutspendedienst SRK获得的血沉棕黄层分离B细胞。为了分离外周血单个核细胞(PBMC),在相同体积的PBS(gibco,目录号10010023)中稀释50mL血沉棕黄层。对50mL聚丙烯离心管(TPP,目录号91050)供应15mL LymphoprepTM(STEMCELLTechnologies,目录号07851)并小心地将25mL血沉棕黄层溶液每管在LymphorepTM上面分层。将管以2000rpm,室温,低加速度和无中断离心24分钟。之后,自界面收集PBMC,用PBS清洗三次,在10mL PBS中重悬浮并用Beckman Coulter细胞计数仪Ac·TTM5diff OV(BeckmanCoulter,目录号6605580)对细胞分析细胞类型和数目。在自PBMC分离B细胞之前,通过用CD14微珠(Miltenyi,目录号130-050-201)进行的CD14阳性细胞的磁标记和随后用
Figure BDA0002429335460001501
Pro Separator(Miltenyi,目录号130-092-545)进行的分离来去除CD14阳性级分。将CD14阴性级分用于随后用Miltenyi B细胞分离试剂盒II(目录号130-091-151)和
Figure BDA0002429335460001502
分离进行的B细胞分离。对96孔平底板的每个孔添加100μl由供应有10％(v/v)胎牛血清(FBS)(life technologies,目录号16140,批号1797306A),1％(v/v)青霉素/链霉素(gibco,目录号15070-063),1％(v/v)L-谷氨酰胺(gibco,目录号25030-024),1％(v/v)丙酮酸钠(gibco,目录号11360-039),1％(v/v)MEM非必需氨基酸(gibco,目录号11140-035)和50μMβ-巯基乙醇(gibco,目录号31350-010)的Roswell Park MemorialInstitute(RPMI)培养基1640(gibco,目录号31870-025)组成的R10培养基中的1x105个B细胞。依照制造商的方案用生物素化人FAP(内部生成,结合能力为6.5x104粒珠:0.01μg蛋白质)包被链霉亲合素
Figure BDA0002429335460001503
(ThermoFisher Scientific,目录号:11205D)并在50μlR10培养基中以2:1的珠对细胞比率添加至B细胞。作为对照,将未包被的珠添加至B细胞。
以范围为6.7至0.003nM的浓度(3倍稀释系列)在50μl R10培养基中将FAP靶向性抗人CD40 Contorsbody添加至B细胞。作为阳性FAP不依赖性对照,使用激动性抗人CD40抗体SGN40(IgG1,INN:Dacetuzumab)。由于文献中描述了SGN40抗体的生物学活性需要Fc受体交联(C.Law et al.,Cancer Res2005,65,8331-8338),因此在添加至B细胞之前将抗体与交联性山羊抗人IgG Fcγ片段特异性F(ab’)2片段(Jackson ImmunoResearch,目录号109-006-008)一起温育30分钟。48小时后,将细胞转移入96孔圆底板,用PBS清洗一次并与50μlPBS中的3μg/mL Fc受体阻断性小鼠IgG同种型对照(ThermoFisher Scientific,目录号10400C)一起温育。于4℃温育15分钟后,用PBS清洗细胞并将50μl荧光标记的抗体在PBS中的混合物添加至细胞。使用下面的荧光标记的抗体:抗人CD80 BV605(BD Biosciences,克隆L307.4,目录号563315),抗人CD69 Alexa
Figure BDA0002429335460001511
488(BioLegend,克隆FN50,目录号310916),抗人CD14 PerCP-Cy5.5(BioLegend,克隆HCD14,目录号325622),抗人CD3PerCP-Cy5.5(BioLegend,克隆UCHT1,目录号300430),抗人CD86 PE-CF594(BD Biosciences,克隆FUN-1,目录号562390),抗HLA-DR BUV395(BD Biosciences,克隆G46-6,目录号564040)和抗人CD19 APC-H7(BD Biosciences,克隆SJ25C1,目录号560177)。为了区分活的和死的细胞,将存活力染料力Zombie AquaTM(BioLegend,目录号423102)添加至抗体混合物。于4℃温育30分钟后,将细胞用PBS清洗两次并在200μl PBS中重悬浮。在同一天使用5激光LSR-Fortessa(带有DIVA软件的BD Bioscience)分析细胞。使用FlowJo版本10软件(FlowJoLLC)实施数据分析。对CD14和CD3阴性和CD19阳性的活的(aqua阴性)细胞分析CD69,CD80,CD86和HLA-DR表达。
对于所有测试的构建物,与激动性抗CD40 Contorsbody或交联性SGN40抗体一起温育2天后分析的B细胞显示CD69,CD80,CD86和HLA-DR表达升高(见图24A至24H)。这些表达标志物的上调在不同FAP靶向性Contorsbody的情况中依赖于FAP,而且由这些FAP依赖性抗体诱导的表达的升高与由交联的SGN40抗体诱导的升高相当或略微更低。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 双特异性2+1 Contorsbody
<130> P34510-WO
<150> EP17199537.6
<151> 2017-11-01
<160> 184
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H1
<400> 1
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H2
<400> 2
Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H3
<400> 3
Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr
1 5
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L1
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L2
<400> 5
Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L3
<400> 6
Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) VH
<400> 7
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) VL
<400> 8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H1
<400> 9
Ser His Ala Met Ser
1 5
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H2
<400> 10
Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H3
<400> 11
Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr
1 5
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L1
<400> 12
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L2
<400> 13
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L3
<400> 14
Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro Thr
1 5
<210> 15
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) VH
<400> 15
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) VL
<400> 16
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(8H9,49B4,1G4, 20B7) CDR-H1
<400> 17
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(CLC-563, CLC-564, 17A9) CDR-H1
<400> 18
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(8H9,49B4,1G4, 20B7) CDR-H2
<400> 19
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(CLC-563, CLC-564, 17A9) CDR-H2
<400> 20
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(8H9) CDR-H3
<400> 21
Glu Tyr Gly Trp Met Asp Tyr
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(49B4) CDR-H3
<400> 22
Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr
1 5
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(1G4) CDR-H3
<400> 23
Glu Tyr Gly Ser Met Asp Tyr
1 5
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(20B7) CDR-H3
<400> 24
Val Asn Tyr Pro Tyr Ser Tyr Trp Gly Asp Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(CLC-563) CDR-H3
<400> 25
Asp Val Gly Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(CLC-564) CDR-H3
<400> 26
Asp Val Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(17A9)-CDR-H3
<400> 27
Val Phe Tyr Arg Gly Gly Val Ser Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(8H9,49B4,1G4, 20B7) CDR-L1
<400> 28
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(CLC-563, CLC564) CDR-L1
<400> 29
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(17A9) CDR-L1
<400> 30
Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(8H9,49B4,1G4, 20B7) CDR-L2
<400> 31
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(CLC-563, CLC564) CDR-L2
<400> 32
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(17A9) CDR-L2
<400> 33
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(8H9) CDR-L3
<400> 34
Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Ser Arg Phe Thr
1 5 10
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(49B4) CDR-L3
<400> 35
Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr Thr
1 5
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(1G4) CDR-L3
<400> 36
Gln Gln Tyr Ile Ser Tyr Ser Met Leu Thr
1 5 10
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(20B7) CDR-L3
<400> 37
Gln Gln Tyr Gln Ala Phe Ser Leu Thr
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(CLC-563, CLC-164) CDR-L3
<400> 38
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(17A9) CDR-L3
<400> 39
Asn Ser Arg Val Met Pro His Asn Arg Val
1 5 10
<210> 40
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(8H9) VH
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Gly Trp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(8H9) VL
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Ser Arg
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(49B4) VH
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(49B4) VL
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 44
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(1G4) VH
<400> 44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Gly Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(1G4) VL
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Ser Tyr Ser Met
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(20B7) VH
<400> 46
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Asn Tyr Pro Tyr Ser Tyr Trp Gly Asp Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(20B7) VL
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ala Phe Ser Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(CLC-563) VH
<400> 48
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Val Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 49
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(CLC-563) VL
<400> 49
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 50
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(CLC-564) VH
<400> 50
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Phe Asp Val Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(CLC-564) VL
<400> 51
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(17A9) VH
<400> 52
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Phe Tyr Arg Gly Gly Val Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 53
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(17A9) VL
<400> 53
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Val Met Pro His Asn Arg
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105
<210> 54
<211> 916
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) CD134-0093
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
465 470 475 480
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
485 490 495
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
500 505 510
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
530 535 540
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser
545 550 555 560
Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
565 570 575
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
580 585 590
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
595 600 605
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
610 615 620
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
625 630 635 640
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
645 650 655
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
660 665 670
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
690 695 700
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
705 710 715 720
Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
725 730 735
Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr
740 745 750
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
755 760 765
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
770 775 780
Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly
785 790 795 800
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser
805 810 815
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
820 825 830
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
835 840 845
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
850 855 860
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
865 870 875 880
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
885 890 895
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
900 905 910
Arg Gly Glu Cys
915
<210> 55
<211> 905
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) CD134-0093
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
465 470 475 480
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
485 490 495
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
500 505 510
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
530 535 540
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser
545 550 555 560
Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
565 570 575
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
580 585 590
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
595 600 605
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
610 615 620
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
625 630 635 640
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
645 650 655
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
660 665 670
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser
690 695 700
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
705 710 715 720
Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
725 730 735
Pro Arg Leu Leu Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro
740 745 750
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
755 760 765
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly
770 775 780
Ile Met Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
785 790 795 800
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
805 810 815
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
820 825 830
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
835 840 845
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
850 855 860
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
865 870 875 880
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
885 890 895
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
900 905
<210> 56
<211> 910
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) CD134-0094
<400> 56
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
130 135 140
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
145 150 155 160
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
165 170 175
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
180 185 190
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
195 200 205
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
210 215 220
Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
225 230 235 240
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
275 280 285
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
305 310 315 320
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
355 360 365
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
405 410 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
420 425 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
435 440 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
465 470 475 480
Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
485 490 495
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
500 505 510
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu
515 520 525
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
530 535 540
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
545 550 555 560
Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
565 570 575
Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
580 585 590
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
610 615 620
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
625 630 635 640
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
645 650 655
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
660 665 670
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
675 680 685
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly
690 695 700
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
705 710 715 720
Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
725 730 735
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr
740 745 750
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
755 760 765
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
770 775 780
Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
785 790 795 800
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
805 810 815
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
820 825 830
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
835 840 845
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
850 855 860
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
865 870 875 880
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
885 890 895
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
900 905 910
<210> 57
<211> 915
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) CD134-0094
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
130 135 140
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
145 150 155 160
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
165 170 175
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
180 185 190
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
195 200 205
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
210 215 220
Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
225 230 235 240
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
275 280 285
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
305 310 315 320
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
355 360 365
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
405 410 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
420 425 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
435 440 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
465 470 475 480
Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
485 490 495
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
500 505 510
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu
515 520 525
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
530 535 540
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
545 550 555 560
Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
565 570 575
Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
580 585 590
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
610 615 620
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
625 630 635 640
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
645 650 655
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
660 665 670
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
675 680 685
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly
690 695 700
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
705 710 715 720
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
725 730 735
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser
740 745 750
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
755 760 765
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn
785 790 795 800
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
805 810 815
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
820 825 830
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
835 840 845
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
850 855 860
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
865 870 875 880
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
885 890 895
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
900 905 910
Lys Ser Cys
915
<210> 58
<211> 924
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE0085
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
465 470 475 480
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
485 490 495
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
500 505 510
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
530 535 540
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser
545 550 555 560
Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
565 570 575
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
580 585 590
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
595 600 605
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
610 615 620
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
625 630 635 640
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
645 650 655
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
660 665 670
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
690 695 700
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
705 710 715 720
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Ala Met Ser
725 730 735
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
740 745 750
Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
755 760 765
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
770 775 780
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Trp
785 790 795 800
Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
805 810 815
Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
820 825 830
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
835 840 845
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
850 855 860
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
865 870 875 880
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
885 890 895
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
900 905 910
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915 920
<210> 59
<211> 914
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE0085
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
465 470 475 480
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
485 490 495
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
500 505 510
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
530 535 540
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser
545 550 555 560
Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
565 570 575
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
580 585 590
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
595 600 605
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
610 615 620
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
625 630 635 640
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
645 650 655
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
660 665 670
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val
690 695 700
Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
705 710 715 720
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala
725 730 735
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ile Gly
740 745 750
Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
755 760 765
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp
770 775 780
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro Thr Phe
785 790 795 800
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
805 810 815
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
820 825 830
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
835 840 845
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
850 855 860
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
865 870 875 880
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
885 890 895
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
900 905 910
Ser Cys
<210> 60
<211> 925
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE0086
<400> 60
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
465 470 475 480
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
485 490 495
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
500 505 510
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
530 535 540
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser
545 550 555 560
Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
565 570 575
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
580 585 590
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
595 600 605
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
610 615 620
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
625 630 635 640
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
645 650 655
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
660 665 670
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
690 695 700
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
705 710 715 720
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
725 730 735
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
740 745 750
Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
755 760 765
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
770 775 780
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly
785 790 795 800
Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
805 810 815
Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
820 825 830
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
835 840 845
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
850 855 860
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
865 870 875 880
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
885 890 895
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
900 905 910
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915 920 925
<210> 61
<211> 914
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE0086
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
465 470 475 480
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
485 490 495
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
500 505 510
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
530 535 540
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser
545 550 555 560
Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
565 570 575
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
580 585 590
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
595 600 605
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
610 615 620
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
625 630 635 640
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
645 650 655
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
660 665 670
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val
690 695 700
Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
705 710 715 720
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala
725 730 735
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Asn Val
740 745 750
Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
755 760 765
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp
770 775 780
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr Phe
785 790 795 800
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
805 810 815
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
820 825 830
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
835 840 845
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
850 855 860
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
865 870 875 880
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
885 890 895
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
900 905 910
Ser Cys
<210> 62
<211> 919
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE0087
<400> 62
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
130 135 140
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
145 150 155 160
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
165 170 175
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
180 185 190
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
195 200 205
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
210 215 220
Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
225 230 235 240
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
275 280 285
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
305 310 315 320
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
355 360 365
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
405 410 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
420 425 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
435 440 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
465 470 475 480
Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
485 490 495
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
500 505 510
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu
515 520 525
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
530 535 540
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
545 550 555 560
Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
565 570 575
Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
580 585 590
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
610 615 620
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
625 630 635 640
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
645 650 655
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
660 665 670
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
675 680 685
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
690 695 700
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
705 710 715 720
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
725 730 735
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
740 745 750
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
755 760 765
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
770 775 780
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
785 790 795 800
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
805 810 815
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
820 825 830
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
835 840 845
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
850 855 860
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
865 870 875 880
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
885 890 895
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
900 905 910
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915
<210> 63
<211> 923
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE0087
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
130 135 140
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
145 150 155 160
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
165 170 175
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
180 185 190
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
195 200 205
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
210 215 220
Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
225 230 235 240
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
275 280 285
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
305 310 315 320
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
355 360 365
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
405 410 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
420 425 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
435 440 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
465 470 475 480
Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
485 490 495
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
500 505 510
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu
515 520 525
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
530 535 540
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
545 550 555 560
Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
565 570 575
Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
580 585 590
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
610 615 620
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
625 630 635 640
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
645 650 655
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
660 665 670
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
675 680 685
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
690 695 700
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
705 710 715 720
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
725 730 735
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
740 745 750
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
755 760 765
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
770 775 780
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
785 790 795 800
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
805 810 815
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
820 825 830
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
835 840 845
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
850 855 860
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
865 870 875 880
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
885 890 895
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
900 905 910
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
915 920
<210> 64
<211> 919
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE0839
<400> 64
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
130 135 140
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
145 150 155 160
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
165 170 175
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
180 185 190
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
195 200 205
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
210 215 220
Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
225 230 235 240
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
275 280 285
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
305 310 315 320
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
355 360 365
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
405 410 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
420 425 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
435 440 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
465 470 475 480
Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
485 490 495
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
500 505 510
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu
515 520 525
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
530 535 540
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
545 550 555 560
Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
565 570 575
Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
580 585 590
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
610 615 620
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
625 630 635 640
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
645 650 655
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
660 665 670
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
675 680 685
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
690 695 700
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
705 710 715 720
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
725 730 735
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
740 745 750
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
755 760 765
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
770 775 780
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
785 790 795 800
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
805 810 815
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
820 825 830
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
835 840 845
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
850 855 860
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
865 870 875 880
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
885 890 895
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
900 905 910
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915
<210> 65
<211> 924
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE0839
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
130 135 140
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
145 150 155 160
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
165 170 175
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
180 185 190
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
195 200 205
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
210 215 220
Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
225 230 235 240
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
275 280 285
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
305 310 315 320
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
355 360 365
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
405 410 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
420 425 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
435 440 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
465 470 475 480
Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
485 490 495
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
500 505 510
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu
515 520 525
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
530 535 540
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
545 550 555 560
Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
565 570 575
Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
580 585 590
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
610 615 620
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
625 630 635 640
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
645 650 655
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
660 665 670
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
675 680 685
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
690 695 700
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
705 710 715 720
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
725 730 735
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
740 745 750
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
755 760 765
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
770 775 780
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
785 790 795 800
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
805 810 815
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
820 825 830
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
835 840 845
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
850 855 860
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
865 870 875 880
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
885 890 895
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
900 905 910
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
915 920
<210> 66
<211> 925
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE0821
<400> 66
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
450 455 460
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys
465 470 475 480
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
485 490 495
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile
500 505 510
Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg
515 520 525
Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu
530 535 540
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu
545 550 555 560
Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
565 570 575
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
580 585 590
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
595 600 605
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
610 615 620
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
625 630 635 640
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
645 650 655
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
660 665 670
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
690 695 700
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
705 710 715 720
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
725 730 735
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
740 745 750
Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
755 760 765
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
770 775 780
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly
785 790 795 800
Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
805 810 815
Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
820 825 830
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
835 840 845
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
850 855 860
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
865 870 875 880
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
885 890 895
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
900 905 910
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915 920 925
<210> 67
<211> 914
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE0821
<400> 67
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
450 455 460
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys
465 470 475 480
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
485 490 495
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile
500 505 510
Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg
515 520 525
Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu
530 535 540
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu
545 550 555 560
Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
565 570 575
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
580 585 590
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
595 600 605
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
610 615 620
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
625 630 635 640
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
645 650 655
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
660 665 670
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val
690 695 700
Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
705 710 715 720
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala
725 730 735
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Asn Val
740 745 750
Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
755 760 765
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp
770 775 780
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr Phe
785 790 795 800
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
805 810 815
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
820 825 830
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
835 840 845
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
850 855 860
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
865 870 875 880
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
885 890 895
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
900 905 910
Ser Cys
<210> 68
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (49B4) VHCH1 Fc节 VH (28H1) (重链1)
<400> 68
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
465 470 475 480
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
485 490 495
Ser Ser His Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
500 505 510
Glu Trp Val Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp
515 520 525
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
530 535 540
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
545 550 555 560
Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
565 570 575
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
580
<210> 69
<211> 575
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (49B4) VHCH1 Fc穴 VL (28H1) (重链2)
<400> 69
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu
465 470 475 480
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
485 490 495
Ser Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
500 505 510
Arg Leu Leu Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
530 535 540
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln
545 550 555 560
Val Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
565 570 575
<210> 70
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (49B4) VLCL-轻链
<400> 70
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 71
<211> 584
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (49B4) VHCH1 Fc节 VH (4B9) (重链1)
<400> 71
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
465 470 475 480
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
485 490 495
Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
500 505 510
Glu Trp Val Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala
515 520 525
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
530 535 540
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
545 550 555 560
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln
565 570 575
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
580
<210> 72
<211> 575
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (49B4) VHCH1 Fc穴 VL (4B9) (重链2)
<400> 72
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu
465 470 475 480
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
485 490 495
Thr Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
500 505 510
Arg Leu Leu Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
530 535 540
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile
545 550 555 560
Met Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
565 570 575
<210> 73
<211> 582
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (49B4) VHCH1 Fc节 VH (DP47) (重链1)
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
465 470 475 480
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
485 490 495
Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
500 505 510
Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala
515 520 525
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
530 535 540
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
545 550 555 560
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
565 570 575
Leu Val Thr Val Ser Ser
580
<210> 74
<211> 575
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (49B4) VHCH1 Fc穴 VL (DP47) (重链2)
<400> 74
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu
465 470 475 480
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
485 490 495
Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
500 505 510
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
530 535 540
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly
545 550 555 560
Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
565 570 575
<210> 75
<211> 816
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC 1(49B4) VHCH1_VHCH1 Fc节 VH (4B9)
<400> 75
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
225 230 235 240
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
245 250 255
Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala
260 265 270
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly
275 280 285
Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala
290 295 300
Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
305 310 315 320
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro
325 330 335
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
340 345 350
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
355 360 365
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
370 375 380
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
385 390 395 400
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
405 410 415
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
420 425 430
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
435 440 445
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
450 455 460
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
465 470 475 480
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
485 490 495
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
500 505 510
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
515 520 525
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
530 535 540
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
545 550 555 560
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
565 570 575
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
580 585 590
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
595 600 605
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
610 615 620
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
625 630 635 640
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
645 650 655
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
660 665 670
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
675 680 685
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu
690 695 700
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
705 710 715 720
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val
725 730 735
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ile Gly
740 745 750
Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
755 760 765
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
770 775 780
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Phe
785 790 795 800
Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
805 810 815
<210> 76
<211> 807
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC 2 (49B4) VHCH1_VHCH1 Fc穴 VL (4B9)
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
225 230 235 240
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
245 250 255
Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala
260 265 270
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly
275 280 285
Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala
290 295 300
Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
305 310 315 320
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro
325 330 335
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
340 345 350
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
355 360 365
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
370 375 380
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
385 390 395 400
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
405 410 415
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
420 425 430
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
435 440 445
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
450 455 460
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
465 470 475 480
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
485 490 495
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
500 505 510
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
515 520 525
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
530 535 540
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
545 550 555 560
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
565 570 575
Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
580 585 590
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
595 600 605
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
610 615 620
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
625 630 635 640
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
645 650 655
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
660 665 670
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
675 680 685
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr
690 695 700
Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
705 710 715 720
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr
725 730 735
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Asn Val Gly Ser
740 745 750
Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
755 760 765
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
770 775 780
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln
785 790 795 800
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
805
<210> 77
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头G4S
<400> 77
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 78
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头(G4S)2
<400> 78
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头(SG4)2
<400> 79
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 80
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头细节
<400> 80
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头(G4S)3
<400> 81
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 82
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头G4(SG4)2
<400> 82
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 83
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头(G4S)4
<400> 83
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 84
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头GGGGSGGGGSGGGSGGGGS
<400> 84
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头GSPGSSSSGS
<400> 85
Gly Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头GSGSGSGS
<400> 86
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 87
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头GSGSGNGS
<400> 87
Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser
1 5
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头GGSGSGSG
<400> 88
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 89
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头GGSGSG
<400> 89
Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 90
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头GGSG
<400> 90
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 91
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GGSGNGSG
<400> 91
Gly Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 92
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头GGNGSGSG
<400> 92
Gly Gly Asn Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 93
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头GGNGSG
<400> 93
Gly Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 94
<211> 98
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 94
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val
<210> 95
<211> 107
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 95
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Trp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Glu Ser Thr Tyr Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
65 70 75 80
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
85 90 95
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105
<210> 96
<211> 106
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 96
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 97
<211> 760
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 97
Met Lys Thr Trp Val Lys Ile Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Val Met Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val His
20 25 30
Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly
50 55 60
Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn Asn Ile Val Leu Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys
85 90 95
Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val
100 105 110
Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn
130 135 140
Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser
145 150 155 160
Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile
180 185 190
Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr
195 200 205
Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala
210 215 220
Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly
245 250 255
Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro
260 265 270
Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val Pro Ala Met Ile Ala Ser
275 280 285
Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val
290 295 300
Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile
305 310 315 320
Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln
325 330 335
Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val
340 345 350
Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe
355 360 365
Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val
370 375 380
Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Asn Ile
385 390 395 400
Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu
405 410 415
Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr
420 425 430
Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys
435 440 445
Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu
450 455 460
Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg
465 470 475 480
Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
485 490 495
Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu
500 505 510
Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe
515 520 525
Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro
530 535 540
Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr
545 550 555 560
Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly
565 570 575
Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu
580 585 590
Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile
595 600 605
Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser
610 615 620
Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu
625 630 635 640
Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr
645 650 655
Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp
660 665 670
Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr
675 680 685
Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn
690 695 700
Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala
705 710 715 720
Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Leu
725 730 735
Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu
740 745 750
Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp
755 760
<210> 98
<211> 761
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 98
Met Lys Thr Trp Leu Lys Thr Val Phe Gly Val Thr Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Val Val Ile Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val Tyr
20 25 30
Lys Pro Glu Gly Asn Thr Lys Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Tyr Phe Pro Asn Trp Ile Ser Glu
50 55 60
Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Glu Asp Asp Asn Ile Val Phe Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ser Thr Met Lys
85 90 95
Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val
100 105 110
Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Gln Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Tyr
130 135 140
Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser
145 150 155 160
Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Glu Asn Arg Ile
180 185 190
Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr
195 200 205
Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asp Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Val
210 215 220
Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ile Pro Ile Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Gly Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly
245 250 255
Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Val Phe Ile Val Asp Thr Thr Tyr Pro
260 265 270
His His Val Gly Pro Met Glu Val Pro Val Pro Glu Met Ile Ala Ser
275 280 285
Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Ser Ser Glu Arg Val
290 295 300
Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile
305 310 315 320
Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp His Ala Trp Glu Cys Pro Lys Asn Gln
325 330 335
Glu His Val Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val
340 345 350
Ser Thr Pro Ala Phe Ser Gln Asp Ala Thr Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe
355 360 365
Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val
370 375 380
Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Tyr Ile
385 390 395 400
Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu
405 410 415
Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Asn Ser
420 425 430
Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys
435 440 445
Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Tyr Lys Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu
450 455 460
Val Cys Tyr Gly Pro Gly Leu Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg
465 470 475 480
Thr Asp Gln Glu Ile Gln Val Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
485 490 495
Ser Leu Arg Asn Ile Gln Leu Pro Lys Val Glu Ile Lys Lys Leu Lys
500 505 510
Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe
515 520 525
Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro
530 535 540
Cys Ser Gln Ser Val Lys Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Thr Tyr
545 550 555 560
Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly
565 570 575
Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Phe Leu His Ala Val Tyr Arg Lys Leu
580 585 590
Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Leu Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile
595 600 605
Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Glu Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser
610 615 620
Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu
625 630 635 640
Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr
645 650 655
Ala Ser Ile Tyr Ser Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp
660 665 670
Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr
675 680 685
Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn
690 695 700
Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala
705 710 715 720
Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Ile
725 730 735
Ser Ser Gly Arg Ser Gln Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe
740 745 750
Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp
755 760
<210> 99
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1连接头
<400> 99
Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链，X是S或P
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X是S或P
<400> 100
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Xaa Cys Pro
1 5 10
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链，X是S或P
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X是S或P
<400> 101
His Thr Cys Pro Xaa Cys Pro
1 5
<210> 102
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链，X是S或P
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X是S或P
<400> 102
Cys Pro Xaa Cys Pro
1 5
<210> 103
<211> 330
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 103
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 104
<211> 330
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 104
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 105
<211> 326
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 105
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 106
<211> 377
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 106
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 107
<211> 327
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 107
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 108
<211> 277
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 108
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 109
<211> 255
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 109
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 110
<211> 260
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 110
Met Ala Arg Pro His Pro Trp Trp Leu Cys Val Leu Gly Thr Leu Val
1 5 10 15
Gly Leu Ser Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr
20 25 30
Trp Ala Gln Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe
35 40 45
Leu Val Lys Asp Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro
50 55 60
Cys Ile Pro Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His
65 70 75 80
Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys
85 90 95
Thr Ile Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys
100 105 110
Arg Asp Lys Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu
115 120 125
Thr Ala Arg Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His
130 135 140
Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met
145 150 155 160
Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr
165 170 175
His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile
180 185 190
Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala
195 200 205
Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser
210 215 220
Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu
225 230 235 240
Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro
245 250 255
Ala Cys Ser Pro
260
<210> 111
<211> 283
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 111
Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro
1 5 10 15
Lys Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala
20 25 30
Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro
35 40 45
Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys
50 55 60
Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro
65 70 75 80
Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys
85 90 95
Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser
100 105 110
Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile
115 120 125
Val Gln Asp Gly Asp His Cys Ala Ala Cys Arg Ala Tyr Ala Thr Ser
130 135 140
Ser Pro Gly Gln Arg Val Gln Lys Gly Gly Thr Glu Ser Gln Asp Thr
145 150 155 160
Leu Cys Gln Asn Cys Pro Pro Gly Thr Phe Ser Pro Asn Gly Thr Leu
165 170 175
Glu Glu Cys Gln His Gln Thr Lys Cys Ser Trp Leu Val Thr Lys Ala
180 185 190
Gly Ala Gly Thr Ser Ser Ser His Trp Val Trp Trp Phe Leu Ser Gly
195 200 205
Ser Leu Val Ile Val Ile Val Cys Ser Thr Val Gly Leu Ile Ile Cys
210 215 220
Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val Ser
225 230 235 240
Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile Glu
245 250 255
Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu Thr
260 265 270
Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His
275 280
<210> 112
<211> 595
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 112
Met Arg Val Leu Leu Ala Ala Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu
1 5 10 15
Arg Ala Phe Pro Gln Asp Arg Pro Phe Glu Asp Thr Cys His Gly Asn
20 25 30
Pro Ser His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys Cys Tyr Arg Cys
35 40 45
Pro Met Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln Arg Pro Thr Asp
50 55 60
Cys Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Asp Arg
65 70 75 80
Cys Thr Ala Cys Val Thr Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr
85 90 95
Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Val Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met
100 105 110
Phe Cys Ser Thr Ser Ala Val Asn Ser Cys Ala Arg Cys Phe Phe His
115 120 125
Ser Val Cys Pro Ala Gly Met Ile Val Lys Phe Pro Gly Thr Ala Gln
130 135 140
Lys Asn Thr Val Cys Glu Pro Ala Ser Pro Gly Val Ser Pro Ala Cys
145 150 155 160
Ala Ser Pro Glu Asn Cys Lys Glu Pro Ser Ser Gly Thr Ile Pro Gln
165 170 175
Ala Lys Pro Thr Pro Val Ser Pro Ala Thr Ser Ser Ala Ser Thr Met
180 185 190
Pro Val Arg Gly Gly Thr Arg Leu Ala Gln Glu Ala Ala Ser Lys Leu
195 200 205
Thr Arg Ala Pro Asp Ser Pro Ser Ser Val Gly Arg Pro Ser Ser Asp
210 215 220
Pro Gly Leu Ser Pro Thr Gln Pro Cys Pro Glu Gly Ser Gly Asp Cys
225 230 235 240
Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg Cys
245 250 255
Thr Ala Cys Val Ser Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr Pro
260 265 270
Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met Ile
275 280 285
Cys Ala Thr Ser Ala Thr Asn Ser Cys Ala Arg Cys Val Pro Tyr Pro
290 295 300
Ile Cys Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Pro Gln Asp Met Ala Glu Lys
305 310 315 320
Asp Thr Thr Phe Glu Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn
325 330 335
Pro Thr Pro Glu Asn Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln
340 345 350
Ser Leu Leu Val Asp Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr
355 360 365
Ser Ala Pro Val Ala Leu Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala
370 375 380
Gly Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly
385 390 395 400
Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile
405 410 415
Arg Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys
420 425 430
Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg
435 440 445
Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met
450 455 460
Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu
465 470 475 480
Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser
485 490 495
Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn
500 505 510
Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly
515 520 525
Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala
530 535 540
Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr
545 550 555 560
Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met
565 570 575
Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala
580 585 590
Ser Gly Lys
595
<210> 113
<211> 241
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 113
Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg
35 40 45
Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu
50 55 60
Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His
65 70 75 80
Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro
85 90 95
Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys
100 105 110
Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys
115 120 125
Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro
130 135 140
Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala
145 150 155 160
Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys
165 170 175
Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu
180 185 190
Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val
195 200 205
Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu
210 215 220
Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp
225 230 235 240
Val
<210> 114
<211> 272
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 114
Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr
20 25 30
Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met
35 40 45
Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu
50 55 60
Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys
65 70 75 80
Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr
85 90 95
Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg
100 105 110
Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro
115 120 125
Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn
130 135 140
Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu
145 150 155 160
Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu
165 170 175
Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val
180 185 190
Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro
195 200 205
Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu
210 215 220
Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp
225 230 235 240
Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr
245 250 255
Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile
260 265 270
<210> 115
<211> 277
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 115
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
195 200 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210 215 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225 230 235 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245 250 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
260 265 270
Val Gln Glu Arg Gln
275
<210> 116
<211> 914
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE1122
<400> 116
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
465 470 475 480
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
485 490 495
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
500 505 510
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
530 535 540
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser
545 550 555 560
Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
565 570 575
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
580 585 590
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
595 600 605
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
610 615 620
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
625 630 635 640
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
645 650 655
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
660 665 670
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val
690 695 700
Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
705 710 715 720
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala
725 730 735
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Asn Val
740 745 750
Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
755 760 765
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp
770 775 780
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr Phe
785 790 795 800
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
805 810 815
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
820 825 830
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
835 840 845
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
850 855 860
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
865 870 875 880
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
885 890 895
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
900 905 910
Ser Cys
<210> 117
<211> 925
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE1122
<400> 117
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
465 470 475 480
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
485 490 495
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
500 505 510
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
530 535 540
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser
545 550 555 560
Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
565 570 575
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
580 585 590
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
595 600 605
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
610 615 620
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
625 630 635 640
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
645 650 655
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
660 665 670
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
690 695 700
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
705 710 715 720
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
725 730 735
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
740 745 750
Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
755 760 765
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
770 775 780
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly
785 790 795 800
Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
805 810 815
Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
820 825 830
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
835 840 845
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
850 855 860
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
865 870 875 880
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
885 890 895
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
900 905 910
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915 920 925
<210> 118
<211> 914
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE1942
<400> 118
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
450 455 460
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys
465 470 475 480
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
485 490 495
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile
500 505 510
Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg
515 520 525
Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu
530 535 540
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu
545 550 555 560
Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
565 570 575
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
580 585 590
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
595 600 605
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
610 615 620
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
625 630 635 640
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
645 650 655
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
660 665 670
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val
690 695 700
Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
705 710 715 720
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala
725 730 735
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Asn Val
740 745 750
Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
755 760 765
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp
770 775 780
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr Phe
785 790 795 800
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
805 810 815
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
820 825 830
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
835 840 845
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
850 855 860
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
865 870 875 880
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
885 890 895
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
900 905 910
Ser Cys
<210> 119
<211> 925
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE1942
<400> 119
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
450 455 460
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys
465 470 475 480
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
485 490 495
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile
500 505 510
Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg
515 520 525
Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu
530 535 540
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu
545 550 555 560
Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
565 570 575
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
580 585 590
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
595 600 605
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
610 615 620
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
625 630 635 640
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
645 650 655
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
660 665 670
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
690 695 700
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
705 710 715 720
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
725 730 735
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
740 745 750
Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
755 760 765
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
770 775 780
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly
785 790 795 800
Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
805 810 815
Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
820 825 830
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
835 840 845
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
850 855 860
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
865 870 875 880
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
885 890 895
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
900 905 910
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915 920 925
<210> 120
<211> 925
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE1887
<400> 120
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
450 455 460
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys
465 470 475 480
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
485 490 495
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile
500 505 510
Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg
515 520 525
Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu
530 535 540
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu
545 550 555 560
Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
565 570 575
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
580 585 590
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
595 600 605
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
610 615 620
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
625 630 635 640
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
645 650 655
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
660 665 670
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
690 695 700
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
705 710 715 720
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
725 730 735
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
740 745 750
Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
755 760 765
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
770 775 780
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly
785 790 795 800
Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
805 810 815
Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
820 825 830
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
835 840 845
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
850 855 860
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
865 870 875 880
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
885 890 895
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
900 905 910
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915 920 925
<210> 121
<211> 914
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE1887
<400> 121
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
465 470 475 480
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
485 490 495
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
500 505 510
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
530 535 540
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser
545 550 555 560
Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
565 570 575
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
580 585 590
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
595 600 605
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
610 615 620
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
625 630 635 640
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
645 650 655
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
660 665 670
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val
690 695 700
Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
705 710 715 720
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala
725 730 735
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Asn Val
740 745 750
Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
755 760 765
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp
770 775 780
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr Phe
785 790 795 800
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
805 810 815
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
820 825 830
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
835 840 845
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
850 855 860
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
865 870 875 880
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
885 890 895
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
900 905 910
Ser Cys
<210> 122
<211> 925
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE1888
<400> 122
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
465 470 475 480
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
485 490 495
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
500 505 510
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
530 535 540
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser
545 550 555 560
Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
565 570 575
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
580 585 590
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
595 600 605
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
610 615 620
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
625 630 635 640
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
645 650 655
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
660 665 670
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
690 695 700
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
705 710 715 720
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
725 730 735
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
740 745 750
Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
755 760 765
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
770 775 780
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly
785 790 795 800
Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
805 810 815
Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
820 825 830
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
835 840 845
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
850 855 860
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
865 870 875 880
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
885 890 895
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
900 905 910
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915 920 925
<210> 123
<211> 914
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE1888
<400> 123
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
450 455 460
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys
465 470 475 480
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
485 490 495
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile
500 505 510
Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg
515 520 525
Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu
530 535 540
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu
545 550 555 560
Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
565 570 575
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
580 585 590
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
595 600 605
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
610 615 620
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
625 630 635 640
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
645 650 655
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
660 665 670
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val
690 695 700
Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
705 710 715 720
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala
725 730 735
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Asn Val
740 745 750
Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
755 760 765
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp
770 775 780
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr Phe
785 790 795 800
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
805 810 815
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
820 825 830
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
835 840 845
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
850 855 860
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
865 870 875 880
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
885 890 895
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
900 905 910
Ser Cys
<210> 124
<211> 925
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE2254
<400> 124
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
465 470 475 480
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
485 490 495
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
500 505 510
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
530 535 540
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser
545 550 555 560
Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
565 570 575
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys
580 585 590
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
595 600 605
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
610 615 620
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
625 630 635 640
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
645 650 655
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
660 665 670
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
690 695 700
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
705 710 715 720
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
725 730 735
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
740 745 750
Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
755 760 765
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
770 775 780
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly
785 790 795 800
Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
805 810 815
Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
820 825 830
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
835 840 845
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
850 855 860
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
865 870 875 880
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
885 890 895
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
900 905 910
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915 920 925
<210> 125
<211> 914
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE2254
<400> 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
465 470 475 480
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
485 490 495
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
500 505 510
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
530 535 540
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser
545 550 555 560
Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
565 570 575
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys
580 585 590
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
595 600 605
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
610 615 620
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
625 630 635 640
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
645 650 655
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
660 665 670
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val
690 695 700
Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
705 710 715 720
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala
725 730 735
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Asn Val
740 745 750
Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
755 760 765
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp
770 775 780
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr Phe
785 790 795 800
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
805 810 815
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
820 825 830
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
835 840 845
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
850 855 860
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
865 870 875 880
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
885 890 895
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
900 905 910
Ser Cys
<210> 126
<211> 925
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE2340
<400> 126
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
465 470 475 480
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
485 490 495
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
500 505 510
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
530 535 540
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser
545 550 555 560
Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
565 570 575
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys
580 585 590
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
595 600 605
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
610 615 620
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
625 630 635 640
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
645 650 655
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
660 665 670
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
690 695 700
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
705 710 715 720
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
725 730 735
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
740 745 750
Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
755 760 765
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
770 775 780
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly
785 790 795 800
Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
805 810 815
Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
820 825 830
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
835 840 845
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
850 855 860
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
865 870 875 880
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
885 890 895
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
900 905 910
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915 920 925
<210> 127
<211> 688
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE2340
<400> 127
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
465 470 475 480
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
485 490 495
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
500 505 510
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
515 520 525
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
530 535 540
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser
545 550 555 560
Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
565 570 575
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys
580 585 590
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
595 600 605
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
610 615 620
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Val Thr Glu Gln
625 630 635 640
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
645 650 655
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
660 665 670
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
675 680 685
<210> 128
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链P1AE2340
<400> 128
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
130 135 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
145 150 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
180 185 190
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
195 200 205
Glu Pro Lys Ser Cys
210
<210> 129
<211> 925
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE2735
<400> 129
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
115 120 125
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
130 135 140
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
145 150 155 160
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
165 170 175
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
180 185 190
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
195 200 205
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
245 250 255
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe
260 265 270
Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
275 280 285
Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
305 310 315 320
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
325 330 335
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly
340 345 350
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
355 360 365
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
370 375 380
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
385 390 395 400
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
405 410 415
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
420 425 430
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
435 440 445
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
465 470 475 480
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
485 490 495
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
500 505 510
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
515 520 525
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
530 535 540
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
545 550 555 560
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
565 570 575
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
580 585 590
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys
595 600 605
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
610 615 620
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
625 630 635 640
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
645 650 655
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
660 665 670
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
675 680 685
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly
690 695 700
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
705 710 715 720
Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
725 730 735
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
740 745 750
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly
755 760 765
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
770 775 780
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
785 790 795 800
Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
805 810 815
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
820 825 830
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
835 840 845
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
850 855 860
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
865 870 875 880
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
885 890 895
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
900 905 910
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915 920 925
<210> 130
<211> 914
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE2735
<400> 130
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
130 135 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
145 150 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
180 185 190
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
195 200 205
Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
225 230 235 240
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
245 250 255
Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala
260 265 270
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly
275 280 285
Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala
290 295 300
Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
305 310 315 320
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro
325 330 335
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
340 345 350
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
355 360 365
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
370 375 380
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
385 390 395 400
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
405 410 415
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
420 425 430
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
435 440 445
Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
450 455 460
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
465 470 475 480
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
485 490 495
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
500 505 510
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
515 520 525
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
530 535 540
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
545 550 555 560
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
565 570 575
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
580 585 590
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
595 600 605
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
610 615 620
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
625 630 635 640
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
645 650 655
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
660 665 670
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
675 680 685
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
690 695 700
Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
705 710 715 720
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr
725 730 735
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser
740 745 750
Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
755 760 765
Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala
770 775 780
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln
785 790 795 800
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
805 810 815
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
820 825 830
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
835 840 845
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
850 855 860
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
865 870 875 880
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
885 890 895
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
900 905 910
Glu Cys
<210> 131
<211> 925
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE2743
<400> 131
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
115 120 125
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
130 135 140
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
145 150 155 160
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
165 170 175
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
180 185 190
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
195 200 205
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala
245 250 255
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile
260 265 270
Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
275 280 285
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg
290 295 300
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
305 310 315 320
Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser
325 330 335
Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
340 345 350
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
355 360 365
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
370 375 380
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
385 390 395 400
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
405 410 415
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
420 425 430
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
435 440 445
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
465 470 475 480
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
485 490 495
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
500 505 510
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
515 520 525
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
530 535 540
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
545 550 555 560
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
565 570 575
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
580 585 590
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
595 600 605
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
610 615 620
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
625 630 635 640
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
645 650 655
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
660 665 670
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
675 680 685
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
690 695 700
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
705 710 715 720
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
725 730 735
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
740 745 750
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
755 760 765
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
770 775 780
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
785 790 795 800
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
805 810 815
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
820 825 830
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
835 840 845
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
850 855 860
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
865 870 875 880
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
885 890 895
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
900 905 910
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
915 920 925
<210> 132
<211> 914
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE2743
<400> 132
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
130 135 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
145 150 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
180 185 190
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
195 200 205
Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
225 230 235 240
Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
245 250 255
Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
260 265 270
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
275 280 285
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
290 295 300
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
305 310 315 320
Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
325 330 335
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
340 345 350
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
355 360 365
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
370 375 380
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
385 390 395 400
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
405 410 415
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
420 425 430
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
450 455 460
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
465 470 475 480
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
485 490 495
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
500 505 510
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
515 520 525
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
530 535 540
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
545 550 555 560
Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
565 570 575
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
580 585 590
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
595 600 605
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
610 615 620
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
625 630 635 640
Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
645 650 655
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
660 665 670
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser
675 680 685
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
690 695 700
Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly
705 710 715 720
Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
725 730 735
Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn
740 745 750
Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser
755 760 765
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
770 775 780
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr
785 790 795 800
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
805 810 815
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
820 825 830
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
835 840 845
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
850 855 860
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
865 870 875 880
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
885 890 895
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
900 905 910
Ser Cys
<210> 133
<211> 919
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE2762
<400> 133
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln
225 230 235 240
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
245 250 255
Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile
275 280 285
Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile
290 295 300
Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
305 310 315 320
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg
325 330 335
Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
340 345 350
Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
355 360 365
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
370 375 380
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
385 390 395 400
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
405 410 415
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
420 425 430
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
435 440 445
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
465 470 475 480
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
485 490 495
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
500 505 510
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
515 520 525
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
530 535 540
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
545 550 555 560
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
565 570 575
Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
580 585 590
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu
595 600 605
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
610 615 620
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
625 630 635 640
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
645 650 655
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
660 665 670
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
675 680 685
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
690 695 700
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala
705 710 715 720
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile
725 730 735
Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
740 745 750
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg
755 760 765
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
770 775 780
Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser
785 790 795 800
Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser
805 810 815
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
820 825 830
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
835 840 845
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
850 855 860
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
865 870 875 880
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
885 890 895
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
900 905 910
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
915
<210> 134
<211> 924
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE2762
<400> 134
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
225 230 235 240
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser
245 250 255
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
260 265 270
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
275 280 285
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
290 295 300
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
305 310 315 320
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
325 330 335
Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
340 345 350
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
355 360 365
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
370 375 380
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
385 390 395 400
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
405 410 415
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
420 425 430
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
435 440 445
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
450 455 460
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr
465 470 475 480
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
485 490 495
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
500 505 510
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
515 520 525
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
530 535 540
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
545 550 555 560
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
565 570 575
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
580 585 590
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
595 600 605
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
610 615 620
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
625 630 635 640
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
645 650 655
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
660 665 670
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
675 680 685
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly
690 695 700
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
705 710 715 720
Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
725 730 735
Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
740 745 750
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
755 760 765
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
770 775 780
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
785 790 795 800
Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
805 810 815
Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
820 825 830
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
835 840 845
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
850 855 860
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
865 870 875 880
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
885 890 895
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
900 905 910
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
915 920
<210> 135
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB (20H4.9) CDR-H1
<400> 135
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 136
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB (20H4.9) CDR-H2
<400> 136
Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser
1 5 10 15
<210> 137
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB (20H4.9) CDR-H3
<400> 137
Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 138
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB (20H4.9) CDR-L1
<400> 138
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 139
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB (20H4.9) CDR-L2
<400> 139
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 140
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB (20H4.9) CDR-L3
<400> 140
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Ala Leu Thr
1 5 10
<210> 141
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB (20H4.9) VH
<400> 141
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 142
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB (20H4.9) VL
<400> 142
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 143
<211> 930
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE1899
<400> 143
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
225 230 235 240
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
245 250 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
260 265 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
275 280 285
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
290 295 300
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
305 310 315 320
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
325 330 335
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
340 345 350
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys
355 360 365
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
370 375 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385 390 395 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
405 410 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
420 425 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
435 440 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala
465 470 475 480
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
485 490 495
Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
500 505 510
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly
515 520 525
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
530 535 540
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
545 550 555 560
Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
565 570 575
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
580 585 590
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
595 600 605
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
610 615 620
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
625 630 635 640
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
645 650 655
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
660 665 670
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
690 695 700
Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
705 710 715 720
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
725 730 735
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
740 745 750
Trp Val Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
755 760 765
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
770 775 780
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
785 790 795 800
Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly
805 810 815
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
820 825 830
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
835 840 845
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
850 855 860
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
865 870 875 880
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
885 890 895
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
900 905 910
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
915 920 925
Glu Cys
930
<210> 144
<211> 919
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE1899
<400> 144
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
225 230 235 240
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
245 250 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
260 265 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
275 280 285
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
290 295 300
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
305 310 315 320
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
325 330 335
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
340 345 350
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser
355 360 365
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
370 375 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385 390 395 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
405 410 415
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
420 425 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
435 440 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala
465 470 475 480
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
485 490 495
Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
500 505 510
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly
515 520 525
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
530 535 540
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
545 550 555 560
Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
565 570 575
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
580 585 590
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
595 600 605
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
610 615 620
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
625 630 635 640
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
645 650 655
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
660 665 670
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
690 695 700
Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
705 710 715 720
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr
725 730 735
Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
740 745 750
Leu Leu Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
755 760 765
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
770 775 780
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met
785 790 795 800
Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser
805 810 815
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
820 825 830
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
835 840 845
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
850 855 860
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
865 870 875 880
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
885 890 895
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
900 905 910
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
915
<210> 145
<211> 930
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE2051
<400> 145
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
225 230 235 240
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
245 250 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
260 265 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
275 280 285
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
290 295 300
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
305 310 315 320
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
325 330 335
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
340 345 350
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys
355 360 365
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
370 375 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385 390 395 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
405 410 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
420 425 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
435 440 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala
465 470 475 480
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
485 490 495
Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
500 505 510
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly
515 520 525
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
530 535 540
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
545 550 555 560
Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
565 570 575
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
580 585 590
Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
595 600 605
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
610 615 620
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
625 630 635 640
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
645 650 655
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
660 665 670
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
690 695 700
Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
705 710 715 720
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
725 730 735
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
740 745 750
Trp Val Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
755 760 765
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
770 775 780
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
785 790 795 800
Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly
805 810 815
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
820 825 830
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
835 840 845
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
850 855 860
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
865 870 875 880
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
885 890 895
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
900 905 910
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
915 920 925
Glu Cys
930
<210> 146
<211> 919
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE2051
<400> 146
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
225 230 235 240
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
245 250 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
260 265 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
275 280 285
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
290 295 300
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
305 310 315 320
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
325 330 335
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
340 345 350
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser
355 360 365
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
370 375 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385 390 395 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
405 410 415
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
420 425 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
435 440 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala
465 470 475 480
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
485 490 495
Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
500 505 510
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly
515 520 525
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
530 535 540
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
545 550 555 560
Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
565 570 575
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
580 585 590
Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
595 600 605
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
610 615 620
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
625 630 635 640
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
645 650 655
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
660 665 670
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
690 695 700
Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
705 710 715 720
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr
725 730 735
Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
740 745 750
Leu Leu Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
755 760 765
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
770 775 780
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met
785 790 795 800
Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser
805 810 815
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
820 825 830
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
835 840 845
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
850 855 860
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
865 870 875 880
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
885 890 895
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
900 905 910
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
915
<210> 147
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H1
<400> 147
Gly Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 148
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H2
<400> 148
Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 149
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H3
<400> 149
Glu Gly Ile Tyr Trp
1 5
<210> 150
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-L1
<400> 150
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu His
1 5 10 15
<210> 151
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-L2
<400> 151
Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-L3
<400> 152
Ser Gln Thr Thr His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 153
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 VH
<400> 153
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 154
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 VL
<400> 154
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 155
<211> 926
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE1799
<400> 155
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
465 470 475 480
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
485 490 495
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
500 505 510
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
515 520 525
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
530 535 540
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
545 550 555 560
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
565 570 575
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
580 585 590
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
595 600 605
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
610 615 620
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
625 630 635 640
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
645 650 655
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
660 665 670
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
675 680 685
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
690 695 700
Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
705 710 715 720
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
725 730 735
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala
740 745 750
Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
755 760 765
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
770 775 780
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
785 790 795 800
Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
805 810 815
Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
820 825 830
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
835 840 845
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
850 855 860
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
865 870 875 880
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
885 890 895
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
900 905 910
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915 920 925
<210> 156
<211> 915
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE1799
<400> 156
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
465 470 475 480
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
485 490 495
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
500 505 510
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
515 520 525
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
530 535 540
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
545 550 555 560
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
565 570 575
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
580 585 590
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
595 600 605
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
610 615 620
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
625 630 635 640
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
645 650 655
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
660 665 670
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
675 680 685
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile
690 695 700
Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg
705 710 715 720
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu
725 730 735
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Asn
740 745 750
Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
755 760 765
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
770 775 780
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr
785 790 795 800
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys
805 810 815
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
820 825 830
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
835 840 845
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
850 855 860
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
865 870 875 880
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
885 890 895
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
900 905 910
Lys Ser Cys
915
<210> 157
<211> 915
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE1902
<400> 157
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
465 470 475 480
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
485 490 495
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
500 505 510
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
515 520 525
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
530 535 540
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
545 550 555 560
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
565 570 575
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
580 585 590
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
595 600 605
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
610 615 620
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
625 630 635 640
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
645 650 655
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
660 665 670
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
675 680 685
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile
690 695 700
Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg
705 710 715 720
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu
725 730 735
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Asn
740 745 750
Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
755 760 765
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
770 775 780
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr
785 790 795 800
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys
805 810 815
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
820 825 830
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
835 840 845
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
850 855 860
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
865 870 875 880
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
885 890 895
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
900 905 910
Lys Ser Cys
915
<210> 158
<211> 926
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE1902
<400> 158
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
465 470 475 480
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
485 490 495
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
500 505 510
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
515 520 525
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
530 535 540
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
545 550 555 560
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
565 570 575
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
580 585 590
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
595 600 605
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
610 615 620
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
625 630 635 640
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
645 650 655
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
660 665 670
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
675 680 685
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
690 695 700
Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
705 710 715 720
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
725 730 735
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala
740 745 750
Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
755 760 765
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
770 775 780
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
785 790 795 800
Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
805 810 815
Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
820 825 830
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
835 840 845
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
850 855 860
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
865 870 875 880
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
885 890 895
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
900 905 910
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915 920 925
<210> 159
<211> 926
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE1800
<400> 159
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
465 470 475 480
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
485 490 495
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
500 505 510
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
515 520 525
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
530 535 540
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
545 550 555 560
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
565 570 575
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
580 585 590
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
595 600 605
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
610 615 620
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
625 630 635 640
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
645 650 655
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
660 665 670
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
675 680 685
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
690 695 700
Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
705 710 715 720
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
725 730 735
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala
740 745 750
Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
755 760 765
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
770 775 780
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
785 790 795 800
Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
805 810 815
Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
820 825 830
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
835 840 845
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
850 855 860
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
865 870 875 880
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
885 890 895
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
900 905 910
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915 920 925
<210> 160
<211> 915
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE1800
<400> 160
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
465 470 475 480
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
485 490 495
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
500 505 510
Trp Val Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln
515 520 525
Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr
530 535 540
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
545 550 555 560
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
565 570 575
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
580 585 590
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
595 600 605
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
610 615 620
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
625 630 635 640
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
645 650 655
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
660 665 670
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser
675 680 685
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile
690 695 700
Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg
705 710 715 720
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu
725 730 735
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Asn
740 745 750
Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
755 760 765
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
770 775 780
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr
785 790 795 800
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys
805 810 815
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
820 825 830
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
835 840 845
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
850 855 860
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
865 870 875 880
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
885 890 895
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
900 905 910
Lys Ser Cys
915
<210> 161
<211> 926
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE2052
<400> 161
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
465 470 475 480
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
485 490 495
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
500 505 510
Trp Val Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln
515 520 525
Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr
530 535 540
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
545 550 555 560
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
565 570 575
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
580 585 590
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
595 600 605
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
610 615 620
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
625 630 635 640
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
645 650 655
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
660 665 670
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser
675 680 685
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
690 695 700
Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
705 710 715 720
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
725 730 735
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala
740 745 750
Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
755 760 765
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
770 775 780
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
785 790 795 800
Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
805 810 815
Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
820 825 830
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
835 840 845
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
850 855 860
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
865 870 875 880
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
885 890 895
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
900 905 910
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915 920 925
<210> 162
<211> 915
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE2052
<400> 162
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
465 470 475 480
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
485 490 495
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
500 505 510
Trp Val Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln
515 520 525
Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr
530 535 540
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
545 550 555 560
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
565 570 575
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
580 585 590
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
595 600 605
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
610 615 620
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
625 630 635 640
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
645 650 655
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
660 665 670
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser
675 680 685
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile
690 695 700
Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg
705 710 715 720
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu
725 730 735
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Asn
740 745 750
Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
755 760 765
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
770 775 780
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr
785 790 795 800
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys
805 810 815
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
820 825 830
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
835 840 845
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
850 855 860
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
865 870 875 880
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
885 890 895
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
900 905 910
Lys Ser Cys
915
<210> 163
<211> 915
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE1901
<400> 163
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
465 470 475 480
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
485 490 495
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
500 505 510
Trp Val Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln
515 520 525
Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr
530 535 540
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
545 550 555 560
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
565 570 575
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
580 585 590
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
595 600 605
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
610 615 620
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
625 630 635 640
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
645 650 655
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
660 665 670
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser
675 680 685
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile
690 695 700
Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg
705 710 715 720
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu
725 730 735
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Asn
740 745 750
Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
755 760 765
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
770 775 780
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr
785 790 795 800
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys
805 810 815
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
820 825 830
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
835 840 845
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
850 855 860
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
865 870 875 880
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
885 890 895
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
900 905 910
Lys Ser Cys
915
<210> 164
<211> 926
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE1901
<400> 164
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
465 470 475 480
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
485 490 495
Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
500 505 510
Trp Val Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln
515 520 525
Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr
530 535 540
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
545 550 555 560
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
565 570 575
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
580 585 590
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
595 600 605
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
610 615 620
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
625 630 635 640
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
645 650 655
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
660 665 670
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser
675 680 685
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
690 695 700
Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
705 710 715 720
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
725 730 735
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala
740 745 750
Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
755 760 765
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
770 775 780
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
785 790 795 800
Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
805 810 815
Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
820 825 830
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
835 840 845
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
850 855 860
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
865 870 875 880
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
885 890 895
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
900 905 910
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915 920 925
<210> 165
<211> 926
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一融合多肽(Fc节) P1AE2255
<400> 165
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
465 470 475 480
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
485 490 495
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
500 505 510
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
515 520 525
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
530 535 540
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
545 550 555 560
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
565 570 575
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg
580 585 590
Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
595 600 605
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
610 615 620
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
625 630 635 640
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
645 650 655
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
660 665 670
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
675 680 685
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
690 695 700
Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
705 710 715 720
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
725 730 735
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala
740 745 750
Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
755 760 765
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
770 775 780
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
785 790 795 800
Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
805 810 815
Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
820 825 830
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
835 840 845
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
850 855 860
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
865 870 875 880
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
885 890 895
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
900 905 910
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915 920 925
<210> 166
<211> 915
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二融合多肽(Fc穴) P1AE2255
<400> 166
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
465 470 475 480
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
485 490 495
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
500 505 510
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
515 520 525
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
530 535 540
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
545 550 555 560
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
565 570 575
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg
580 585 590
Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
595 600 605
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
610 615 620
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
625 630 635 640
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
645 650 655
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
660 665 670
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
675 680 685
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile
690 695 700
Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg
705 710 715 720
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu
725 730 735
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Asn
740 745 750
Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
755 760 765
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
770 775 780
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr
785 790 795 800
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys
805 810 815
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
820 825 830
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
835 840 845
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
850 855 860
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
865 870 875 880
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
885 890 895
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
900 905 910
Lys Ser Cys
915
<210> 167
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1a (CD40)
<400> 167
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 168
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1b (CD40)
<400> 168
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 169
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1c (CD40)
<400> 169
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly His Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 170
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1d (CD40)
<400> 170
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 171
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL1a (CD40)
<400> 171
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 172
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL1b (CD40)
<400> 172
Asp Ile Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 173
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL1c (CD40)
<400> 173
Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 174
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL1d (CD40)
<400> 174
Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 175
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2a (CD40)
<400> 175
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 176
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2b (CD40)
<400> 176
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 177
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2c (CD40)
<400> 177
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly His Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 178
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2d (CD40)
<400> 178
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 179
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2ab (CD40)
<400> 179
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 180
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2ac (CD40)
<400> 180
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 181
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2a (CD40)
<400> 181
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 182
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2b (CD40)
<400> 182
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 183
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2ab (CD40)
<400> 183
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 184
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2ac (CD40)
<400> 184
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (9)

1.一种双特异性抗体，由两条融合多肽组成且包含两个能够特异性结合OX40的抗原结合域和一个能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)的抗原结合域，其包含
(a)第一融合多肽，包含能够特异性结合OX40的第一抗原结合域的第一部分,间隔物域,能够特异性结合OX40的第一抗原结合域的第二部分和能够特异性结合FAP的抗原结合域的第一部分,其中
-间隔物域为IgG1亚类的抗体Fc域,
-能够特异性结合OX40的第一抗原结合域的第一部分直接或经由第一肽接头融合至间隔物域的N端,
-能够特异性结合OX40的第一抗原结合域的第二部分直接或经由第二肽接头融合至间隔物域的C端,且
-能够特异性结合FAP的抗原结合域的第一部分直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合OX40的第一抗原结合域的第二部分的C端或直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合OX40的第一抗原结合域的第一部分的N端,和
(b)第二融合多肽，包含能够特异性结合OX40的第二抗原结合域的第一部分,间隔物域,能够特异性结合OX40的第二抗原结合域的第二部分和能够特异性结合FAP的抗原结合域的第二部分,其中
-间隔物域为IgG1亚类的抗体Fc域,
-能够特异性结合OX40的第二抗原结合域的第一部分直接或经由第一肽接头融合至间隔物域的N端,
-能够特异性结合OX40的第二抗原结合域的第二部分直接或经由第二肽接头融合至间隔物域的C端,且
-能够特异性结合FAP的抗原结合域的第二部分直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合OX40的第二抗原结合域的第二部分的C端或直接或经由第三肽接头融合至能够特异性结合OX40的第二抗原结合域的第一部分的N端,
且其中在第一融合多肽和第二融合多肽二者中能够特异性结合OX40的抗原结合域的第一部分是抗体重链Fab片段且能够特异性结合OX40的抗原结合域的第二部分是抗体轻链Fab片段,
且其中能够特异性结合FAP的抗原结合域的第一部分是包含VH-Cκ的抗体交叉Fab片段且能够特异性结合FAP的抗原结合域的第二部分是包含VL-CH1的抗体交叉Fab片段,
且其中能够特异性结合FAP的抗原结合域的第一部分和第二部分彼此联合以形成能够特异性结合FAP的抗原结合域且其中能够特异性结合OX40的第一和第二抗原结合域的第一部分和第二部分彼此联合以形成环状融合多肽,且
其中第一融合多肽的间隔物域和第二融合多肽的间隔物域通过二硫键彼此共价联合且依照节入穴方法,第一融合多肽的间隔物域包含节链的CH3域中的S354C/T366W突变且第二融合多肽的间隔物域包含穴链的CH3域中的Y349C/T366S/L368A/Y407V突变,
且其中第三肽接头包含15-25个氨基酸,
且其中能够特异性结合FAP的抗原结合域包含如SEQ ID NO:7的氨基酸序列所示的重链可变区VHFAP和如SEQ ID NO:8的氨基酸序列所示的轻链可变区VLFAP,
且其中能够特异性结合OX40的抗原结合域包含如SEQ ID NO:40的氨基酸序列所示的重链可变区VHOX40和如SEQ ID NO:41的氨基酸序列所示的轻链可变区VLOX40。
2.权利要求1的双特异性抗体,其中在第一融合多肽中能够特异性结合FAP的抗原结合域的第一部分经由第三肽接头融合至能够特异性结合OX40的第一抗原结合域的第二部分的C端且其中在第二融合多肽中能够特异性结合FAP的抗原结合域的第二部分经由第三肽接头融合至能够特异性结合OX40的第一抗原结合域的第二部分的C端。
3.权利要求1的双特异性抗体,其中IgG1 Fc域包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G,编号方式依照Kabat EU索引。
4.一种分离的核酸，其编码权利要求1至3任一项的双特异性抗体。
5.一种载体或宿主细胞，其包含权利要求4的核酸。
6.一种生成双特异性抗体的方法,其在适合于双特异性抗体表达的条件下培养权利要求5的宿主细胞。
7.一种药学组合物,其包含权利要求1至3任一项的双特异性抗体和药学可接受赋形剂。
8.权利要求1至3任一项的双特异性抗体或权利要求7的药学组合物在制造用于治疗表达FAP的癌症的药物中的用途。
9.权利要求8的用途,其进一步包括将另外的治疗剂施用于个体。
CN201880063441.2A 2017-11-01 2018-10-31 双特异性2+1 Contorsbody Active CN111182944B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17199537.6 2017-11-01
EP17199537 2017-11-01
PCT/EP2018/079785 WO2019086500A2 (en) 2017-11-01 2018-10-31 Bispecific 2+1 contorsbodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111182944A CN111182944A (zh) 2020-05-19
CN111182944B true CN111182944B (zh) 2022-11-22

Family

ID=60201893

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880063441.2A Active CN111182944B (zh) 2017-11-01 2018-10-31 双特异性2+1 Contorsbody

Country Status (18)

Country Link
US (1) US20210324108A1 (zh)
EP (1) EP3703821A2 (zh)
JP (1) JP7098725B2 (zh)
KR (1) KR20200079492A (zh)
CN (1) CN111182944B (zh)
AU (1) AU2018357923A1 (zh)
BR (1) BR112020006443A2 (zh)
CA (1) CA3076027A1 (zh)
CL (1) CL2020000662A1 (zh)
CR (1) CR20200171A (zh)
IL (1) IL272747A (zh)
MA (1) MA50505A (zh)
MX (1) MX2020004571A (zh)
PE (1) PE20210844A1 (zh)
SG (1) SG11202002903XA (zh)
TW (1) TWI829658B (zh)
WO (1) WO2019086500A2 (zh)
ZA (1) ZA202001139B (zh)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL282922B (en) 2014-11-14 2022-08-01 Hoffmann La Roche Antigen binding molecules containing a trimer of a tnf family ligand
MX2018013342A (es) * 2016-05-02 2019-05-09 Hoffmann La Roche Polipeptido de fusion multicircular "contorsbody" - ligante de diana de cadena sencilla.
AU2017384126A1 (en) 2016-12-20 2019-05-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of anti-CD20/anti-CD3 bispecific antibodies and 4-1BB (CD137) agonists
CA3047070A1 (en) 2017-01-03 2018-07-12 F.Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-4-1bb clone 20h4.9
EP3601346A1 (en) 2017-03-29 2020-02-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
CN110573528B (zh) * 2017-03-29 2023-06-09 豪夫迈·罗氏有限公司 针对共刺激性tnf受体的双特异性抗原结合分子
US11242396B2 (en) 2018-10-01 2022-02-08 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antigen binding molecules comprising anti-FAP clone 212
WO2020127618A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
EP3959238A1 (en) * 2019-04-25 2022-03-02 F. Hoffmann-La Roche AG Activatable therapeutic multispecific polypeptides with extended half-life
CA3132275A1 (en) * 2019-04-25 2020-10-29 Ulrich Brinkmann Generation of antibody-derived polypeptides by polypeptide chain exchange
CA3132494A1 (en) * 2019-04-25 2020-10-29 Ulrich Brinkmann Therapeutic multispecific polypeptides activated by polypeptide chain exchange
TW202108626A (zh) * 2019-05-15 2021-03-01 日商協和麒麟股份有限公司 與cd40及fap結合之雙專一性抗體
WO2020260326A1 (en) * 2019-06-27 2020-12-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel icos antibodies and tumor-targeted antigen binding molecules comprising them
AR121706A1 (es) 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap
CN116249555A (zh) * 2020-05-19 2023-06-09 勃林格殷格翰国际有限公司 用于癌症治疗的结合分子
WO2023245022A2 (en) * 2022-06-14 2023-12-21 Invenra Inc. Multispecific binding agents that target b7h3 and gd2 and uses thereof
WO2024038183A1 (en) * 2022-08-18 2024-02-22 Immunocore Limited Multi-domain binding molecules

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1603345A (zh) * 2003-09-29 2005-04-06 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种三价双特异性抗体，其制备方法及用途
CN102369214A (zh) * 2009-04-07 2012-03-07 罗氏格黎卡特股份公司 三价、双特异性抗体
CN103154038A (zh) * 2010-08-13 2013-06-12 罗切格利卡特公司 抗成纤维细胞激活蛋白抗体及使用方法
WO2014116846A2 (en) * 2013-01-23 2014-07-31 Abbvie, Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
WO2017060144A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies with tetravalency for a costimulatory tnf receptor
WO2017191101A1 (en) * 2016-05-02 2017-11-09 F. Hoffmann-La Roche Ag The contorsbody - a single chain target binder
WO2017180913A9 (en) * 2016-04-13 2017-11-23 Sanofi Trispecific and/or trivalent binding proteins
WO2018127473A1 (en) * 2017-01-03 2018-07-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-4-1bb clone 20h4.9
WO2018185045A1 (en) * 2017-04-04 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel bispecific antigen binding molecules capable of specific binding to cd40 and to fap

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1156905B (it) 1977-04-18 1987-02-04 Hitachi Metals Ltd Articolo di ornamento atto ad essere fissato mediante un magnete permanente
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
JP4213224B2 (ja) 1997-05-02 2009-01-21 ジェネンテック，インコーポレーテッド ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
CA2385347C (en) 1999-10-04 2009-12-15 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
CA2421447C (en) 2000-09-08 2012-05-08 Universitat Zurich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
KR20040054669A (ko) 2001-08-03 2004-06-25 글리카트 바이오테크놀로지 아게 항체 의존적 세포 독성이 증가된 항체 글리코실화 변이체
CN100423777C (zh) 2001-10-25 2008-10-08 杰南技术公司 糖蛋白组合物
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7993650B2 (en) 2003-07-04 2011-08-09 Affibody Ab Polypeptides having binding affinity for HER2
AU2003275958A1 (en) 2003-08-25 2005-03-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
RS57466B1 (sr) 2003-11-05 2018-09-28 Roche Glycart Ag Molekuli koji se vezuju za antigen sa povećanim afinitetom vezivanja za fc receptor i efektornom funkcijom
CA2552435A1 (en) 2003-12-05 2005-06-23 Compound Therapeutics, Inc. Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
BR122019012028B1 (pt) 2004-04-13 2023-09-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticorpos anti-p-selectina, molécula de ácido nucléico, vetor, e composição
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
RU2412947C2 (ru) 2004-09-23 2011-02-27 Дженентек, Инк. Антитела, сконструированные на основе цистеинов, и их конъюгаты
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
KR100991010B1 (ko) 2005-05-26 2010-10-29 제넨테크, 인크. 인간화 항-ｃｄ４０ 항체 및 그의 사용 방법
CA2646965C (en) 2006-03-24 2016-06-21 Jonathan H. Davis Engineered heterodimeric protein domains
EP2035456A1 (en) 2006-06-22 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
EP1958957A1 (en) 2007-02-16 2008-08-20 NascaCell Technologies AG Polypeptide comprising a knottin protein moiety
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
PL2235064T3 (pl) 2008-01-07 2016-06-30 Amgen Inc Sposób otrzymywania cząsteczek przeciwciał z heterodimerycznymi fc z zastosowaniem kierujących efektów elektrostatycznych
WO2010129304A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
PT2519543T (pt) 2009-12-29 2016-10-07 Emergent Product Dev Seattle Proteínas de ligação de heterodímero e suas utilizações
EP2569337A1 (en) 2010-05-14 2013-03-20 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
JP6167040B2 (ja) 2010-11-05 2017-07-19 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計
WO2012130831A1 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Roche Glycart Ag Antibody fc variants
CN104011221B (zh) 2011-12-20 2019-01-08 米迪缪尼有限公司 用于双特异性抗体支架的经修饰的多肽
KR20230091201A (ko) 2012-04-20 2023-06-22 메뤼스 엔.페. Ig-유사 분자의 제조방법 및 제조수단
EP3356403A2 (en) 2015-10-02 2018-08-08 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for a costimulatory tnf receptor

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1603345A (zh) * 2003-09-29 2005-04-06 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种三价双特异性抗体，其制备方法及用途
CN102369214A (zh) * 2009-04-07 2012-03-07 罗氏格黎卡特股份公司 三价、双特异性抗体
CN103154038A (zh) * 2010-08-13 2013-06-12 罗切格利卡特公司 抗成纤维细胞激活蛋白抗体及使用方法
WO2014116846A2 (en) * 2013-01-23 2014-07-31 Abbvie, Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
WO2017060144A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies with tetravalency for a costimulatory tnf receptor
WO2017180913A9 (en) * 2016-04-13 2017-11-23 Sanofi Trispecific and/or trivalent binding proteins
WO2017191101A1 (en) * 2016-05-02 2017-11-09 F. Hoffmann-La Roche Ag The contorsbody - a single chain target binder
WO2018127473A1 (en) * 2017-01-03 2018-07-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-4-1bb clone 20h4.9
WO2018185045A1 (en) * 2017-04-04 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel bispecific antigen binding molecules capable of specific binding to cd40 and to fap

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The making of bispecific antibodies;Ulrich Brinkmann 等;《MABS》;20170110;第9卷(第2期);第182-213页 *
TriFabs—Trivalent IgG-Shaped Bispecific Antibody Derivatives: Design, Generation, Characterization and Application for Targeted Payload Delivery;Klaus M 等;《International Journal of Molecular Sciences》;20151117;第16卷(第11期);第27497-27507页 *
双特异性抗体的结构设计及其装配工艺研究进展;黎晓维 等;《Chinese Journal of New Drugs》;20141118;第23卷(第20期);第2430-2436页 *
基因工程双特异性抗体构建模式研究进展;解志刚 等;《军事医学科学院院刊》;20040831;第28卷(第4期);第375-378页 *

Also Published As

Publication number Publication date
TWI829658B (zh) 2024-01-21
AU2018357923A1 (en) 2020-03-05
PE20210844A1 (es) 2021-05-10
MA50505A (fr) 2020-09-09
US20210324108A1 (en) 2021-10-21
IL272747A (en) 2020-04-30
RU2020117441A3 (zh) 2022-04-01
CA3076027A1 (en) 2019-05-09
TW201922791A (zh) 2019-06-16
ZA202001139B (en) 2021-03-31
SG11202002903XA (en) 2020-04-29
JP7098725B2 (ja) 2022-07-11
WO2019086500A3 (en) 2019-08-29
JP2021500898A (ja) 2021-01-14
KR20200079492A (ko) 2020-07-03
RU2020117441A (ru) 2021-12-01
MX2020004571A (es) 2020-08-24
EP3703821A2 (en) 2020-09-09
WO2019086500A2 (en) 2019-05-09
CL2020000662A1 (es) 2020-10-02
BR112020006443A2 (pt) 2020-09-29
CR20200171A (es) 2020-06-14
CN111182944A (zh) 2020-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111182944B (zh) 双特异性2+1 Contorsbody
US20220073646A1 (en) Bispecific antibodies with tetravalency for a costimulatory tnf receptor
CN110461873B (zh) 包含抗4-1bb克隆20h4.9的双特异性抗原结合分子
US10526413B2 (en) Bispecific antibodies specific for OX40
TWI638832B (zh) 雙特異性ｔ細胞活化抗原結合分子
CN111246884A (zh) 新颖的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子
CN114773481A (zh) 对pd1和tim3特异性的双特异性抗体
JP2023065370A (ja) 抗ｆａｐクローン２１２を含む二重特異性抗原結合分子
US11453722B2 (en) Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory TNF receptor
CN112424228A (zh) 新型双特异性激动性4-1bb抗原结合分子
CN113286822A (zh) 靶向肿瘤的超激动性cd28抗原结合分子
JP7196094B2 (ja) 共刺激ｔｎｆ受容体のための二重特異性抗原結合分子
CN115362174A (zh) 包含修饰的C-末端crossfab片段的双特异性抗体
RU2797305C2 (ru) Биспецифические 2+1 конторстела

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40029815

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant