CN115362174A - 包含修饰的C-末端crossfab片段的双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含修饰的C‑末端crossfab片段的双特异性抗体，所述双特异性抗体针对先前存在的抗药物抗体具有降低的反应性或没有反应性。

Description

包含修饰的C-末端crossfab片段的双特异性抗体
技术领域
本发明涉及包含经修饰的C-末端crossfab片段的双特异性抗体，该双特异性抗体对先前存在的抗药物抗体具有降低的反应性或没有反应性。
背景技术
B细胞以两种方式产生抗体：(i)随机，和(ii)响应于体内的外源性抗原。最初，一个B细胞产生一种特定种类的抗体。在任何一种情况下，B细胞都被允许增殖或通过称为克隆清除的过程被杀死。通常，免疫系统能够识别并忽略身体自身的健康蛋白质、细胞和组织，并且不会对环境中的非威胁性物质(诸如食物)反应过度。然而，大多数健康个体具有识别“自身”抗原的自身反应性B细胞。已经表征了几种类型的自身抗体，包括那些针对免疫球蛋白的抗体。最具特征的抗免疫球蛋白自身抗体是那些针对IgG的Fc区的抗体(称为类风湿因子)，或那些针对可变区的抗体(称为抗独特型自身抗体)。另一类自身抗体是那些特异性地结合蛋白水解地暴露的新表位的抗体，这些新表位在上或下铰链区中含有C-末端氨基酸残基。这些抗药物抗体(ADA)或抗铰链自身抗体(AHA)已在多项研究中检测到。有趣的是，先前存在的ADA滴度因供体而异，并且可代表过去和当前对新表位的暴露。
经典抗体(IgG)包含两个抗原结合片段(Fab)，这两个片段通过柔性铰链区融合至Fc区。虽然Fab负责识别和结合抗原，但Fc区通过与Fcγ受体接合来介导效应子功能，并通过与FcRn结合来赋予长血清半衰期。已知许多蛋白酶会在铰链区(例如在下铰链区)中切割完整的抗体，以产生F(ab')2分子。针对抗体铰链区的蛋白酶的产生已被确定为一种机制，病原体和肿瘤细胞试图通过该机制逃避宿主免疫反应。然而，由此产生的C-末端新表位最终通过免疫系统被识别出并且产生AHA。基于患有感染和炎症的个体病史，健康供体因此具有不同的先前存在的ADA。ADA可以充当替代的Fc并恢复原本蛋白水解地灭活的抗体的效应子功能，但在不需要效应子功能的情况下或在治疗性抗原结合分子具有除经典抗体结构之外的其他形式的情况下，可能会引入潜在的安全性问题。这些分子可以具有其中C-末端新表位可以规则地存在的结构。Kim等人(MABS 2016,8,1536–1547)描述了针对抗原结合片段(Fab)和(Fab')2的先前存在的AHA的问题，当需要短全身半衰期和效应子-沉默分子时，先前存在的AHA是有吸引力的治疗形式。他们可以证明，通过改造上铰链区中的C-末端残基，可以观察到对先前存在的ADA最小反应性。
某些肿瘤中的免疫抑制微环境具有高水平的共抑制信号，例如PD-L1，但缺乏肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族配体诸如OX40配体或GITR配体的充分表达。OX40(CD134；TNFRSF4)和GITR是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员，一与T细胞受体(TCR)接合，即由T细胞瞬时表达。OX40接合双向地调节T细胞与OX40L+抗原呈递细胞(例如B细胞、树突细胞(DC)、单核细胞)的相互作用。在TCR接合的情况下，OX40主要向CD4+提供共刺激信号，但也向CD8+效应T细胞提供共刺激信号，从而增强增殖、存活和效应子功能(例如细胞因子分泌)。相反地，OX40信号传导导致调节性T细胞的功能性抑制和丧失。OX40激动作用平衡TGF-β效应(例如阻碍FoxP3诱导)并降低IL-10分泌。在鼠肿瘤模型中，激动剂抗OX40抗体与OX40的接合可以促进抗肿瘤T-细胞应答、肿瘤缩小和可重复的异位效应。OX40激动剂的单药疗效普遍弱，但与免疫原性治疗(化学疗法、放射疗法和疫苗接种)、检查点抑制剂(PD-1、CTLA-4)和其他共刺激激动剂(诸如4-1BB、ICOS或GITR)组合可实现强抗肿瘤疗效。
成纤维细胞活化蛋白-α(FAP)是一种丝氨酸蛋白酶，在>90％的人上皮恶性肿瘤的癌症相关基质细胞的细胞表面上、在位于淋巴结的T细胞启动区中的网状成纤维细胞上高度表达，并且可以在正常组织中的活化成纤维细胞上发现。在各种癌症指标中的高出现率使其可以用作应该在肿瘤环境中积累的药物的靶向部分。
一种在肿瘤微环境中特异性恢复TNF受体共刺激的方法是双特异性抗体，此类双特异性抗体包括肿瘤基质中成纤维细胞活化蛋白(FAP)的至少一个抗原结合结构域和能够与TNF受体特异性结合的抗原结合结构域。例如，此类双特异性抗体已在WO 2017/055398A2和WO 2017/060144 A1中进行了描述。通过细胞表面FAP对此类双特异性分子进行的交联和表面固定为OX40阳性T细胞创造了高度激动性基质，在这种情况下，支持NFκB介导的效应子功能并可以通过OX40配体取代连接反应。针对大量的人肿瘤指标报道了在肿瘤细胞本身或免疫抑制性癌症相关成纤维细胞(CAF)上的FAP高表达。因此，需要改进的靶向双特异性抗体，其具有优异的药理学特性(诸如更好的保质期、低免疫原性)并具有弱非特异性相互作用(诸如超敏反应或不受控制的细胞因子释放)。
发明内容
本发明涉及包含具有改进特性的经修饰的C-末端crossfab片段的双特异性抗体。特别地，这些分子缺乏与抗药物抗体(ADA)反应的新表位，它们对先前存在的抗药物抗体(ADA)具有降低的反应性或没有反应性。
在一个方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段和第二Fab片段，和能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段，以及由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域；其中
(a)能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段在其C-末端处融合至第一Fc结构域亚基的N-末端，
(b)能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段在其C-末端处融合至第二Fc结构域亚基的N-末端，
(c)能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段为交叉fab片段，其中恒定结构域CH1和CL被彼此替换，并且VH结构域的N-末端融合至Fc结构域亚基之一的C-末端，并且其中交叉fab片段的CH1结构域以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCS(SEQ IDNO:1)、EPKSCG(SEQ ID NO:2)、EPKSCD(SEQ ID NO:3)、EPKSCDK(SEQ ID NO:4)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:5)。
在一个方面，双特异性抗原结合分子对先前存在的抗药物抗体(ADA)具有降低的反应性或没有反应性。
在一个方面，双特异性抗原结合分子包含能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段，其中Fab片段为crossfab片段并且其中crossfab片段的CH1结构域以EPKSCS(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列终止。
在另一个方面，双特异性抗原结合分子包含能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段，其中Fab片段为crossfab片段并且其中crossfab片段的CH1结构域以EPKSCG(SEQID NO:2)的氨基酸序列终止。
在另一方面，双特异性抗原结合分子包含能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段，其中Fab片段是crossfab片段并且其中crossfab片段的CH1结构域以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCD(SEQ ID NO:3)、EPKSCDK(SEQ ID NO:4)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:5)。在一个特定方面，双特异性抗原结合分子包含能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段，其中Fab片段是crossfab片段并且其中crossfab片段的CH1结构域以EPKSCD(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列终止。
在另一个方面，提供了如上文定义的双特异性抗原结合分子，其中双特异性抗原结合分子与第一抗原二价结合并与第二抗原单价结合。
在一个方面，双特异性抗原结合分子包含
(a)两个重链，每个重链包含能够与第一抗原特异性结合的Fab片段的VH和CH1结构域，以及Fc结构域亚基，
(b)两个轻链，每个轻链包含能够与第一抗原特异性结合的Fab片段的VL和CL结构域，以及
(c)能够与第二抗原特异性结合的交叉fab片段，交叉fab片段包含VL-CH1链和VH-CL链，其中VH-CL链与(a)的两个重链之一的C-末端连接。
在一个进一步方面，提供了如前文所定义的双特异性抗原结合分子，其中抗原结合分子包含能够与第一抗原特异性结合的第四Fab片段，其中第四Fab片段在VH-CH1链的C-末端融合至能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段的VH-CH1链的N-末端。
在另一个方面，提供了如前文所定义的双特异性抗原结合分子，其中双特异性抗原结合分子三价结合第一抗原并单价结合第二抗原。
在一个方面，双特异性抗原结合分子包含
(a)重链，其包含能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段的VH-CH1链、Fc结构域亚基、以及能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段的VH-CL链，VH-CH1链在其N-末端处融合至能够与第一抗原特异性结合的第四Fab片段的VH-CH1链，任选地经由肽接头，VH-CL链融合至Fc区亚基的C-末端，任选地经由肽接头，
(b)重链，其包含能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段的VH-CH1结构域，以及Fc结构域亚基，
(c)三个轻链，每个轻链包含能够与第一抗原特异性结合的Fab片段的VL和CL结构域，以及
(d)轻链，其包含能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段的VL和CH1结构域。
在另一方面，双特异性抗原结合分子包含
(a)重链，其包含能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段的VH-CH1链、Fc结构域亚基，VH-CH1链在其N-末端处融合至能够与第一抗原特异性结合的第四Fab片段的VH-CH1链，任选地经由肽接头，
(b)重链，其包含能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段的VH-CH1结构域和Fc区亚基、以及能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段的VH-CL链，VH-CL链融合至Fc结构域亚基的C-末端，任选地经由肽接头，
(c)三个轻链，每个轻链包含能够与第一抗原特异性结合的Fab片段的VL和CL结构域，以及
(d)轻链，其包含能够与第二抗原特异性结合的Fab片段的VL和CH1结构域。
在一个进一步方面，提供了如前文所定义的双特异性抗原结合分子，其中抗原结合分子包含能够与第一抗原特异性结合的第五Fab片段，其中第五Fab片段在VH-CH1链的C-末端融合至能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段的VH-CH1链的N-末端。
在另一个方面，提供了如前文所定义的双特异性抗原结合分子，其中双特异性抗原结合分子四价结合第一抗原并单价结合第二抗原。
在一个方面，双特异性抗原结合包含
(a)重链，其包含能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段的VH-CH1链、Fc结构域亚基、以及能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段的VH-CL链，VH-CH1链在其N-末端处融合至能够与第一抗原特异性结合的第四Fab片段的VH-CH1链，任选地经由肽接头，VH-CL链融合至Fc区亚基的C-末端，任选地经由肽接头，
(b)重链，其包含能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段的VH-CH1结构域、Fc结构域亚基，VH-CH1结构域在其N-末端处融合至能够与第一抗原特异性结合的第五Fab片段的VH-CH1链，任选地经由肽接头，
(c)三个轻链，每个轻链包含能够与第一抗原特异性结合的Fab片段的VL和CL结构域，以及
(d)轻链，其包含能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段的VL和CH1结构域。
在一个方面，提供了如前文所定义的双特异性抗原结合分子，其中Fc结构域为IgG，特别是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域，并且其中Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，其降低抗体与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。在一个特定方面，Fc结构域属于人IgG1亚类，其具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU编号)。
在另一方面，提供了如上文所定义的双特异性抗原结合分子，其中根据杵臼结构方法，Fc结构域的第一亚基包含杵并且Fc结构域的第二亚基包含臼。在一个特定方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(根据Kabat EU编号)，并且Fc区的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU编号)。
根据本发明的另一方面，提供了一种如上文所述的编码双特异性抗原结合分子的分离的核酸。本发明进一步提供了一种载体，特别是表达载体，其包含本发明的分离的核酸；并且提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸或表达载体。在一些方面，宿主细胞是真核细胞，特别是哺乳动物细胞。在另一方面，提供了一种生产如上文所述的双特异性抗原结合分子的方法，其包括在适合于表达双特异性抗原结合分子的条件下培养如上所述的宿主细胞，并且分离所述双特异性抗原结合分子。本发明还涵盖包含经修饰的C-末端crossfab片段的通过本发明的方法生产的双特异性抗原结合分子。
本发明进一步提供了一种药物组合物，其包含如上文所述的双特异性抗原结合分子以及药用载体。在一个方面，该药物组合物包含附加的治疗剂。另外，本发明涵盖如上文所述的双特异性抗原结合分子或包含如上文所定义的双特异性抗原结合分子的药物组合物，用作药物。
在具体方面，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子或如上文所定义的药物组合物，其用于治疗癌症。在另一具体方面，本发明提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子，其用于治疗癌症，其中双特异性抗原结合分子用于与化学治疗剂、放射和/或用于癌症免疫疗法的其他药剂组合施用。在另一方面，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子或本发明的药物组合物，用于上调或延长细胞毒性T细胞活性。
附图说明
图1A至图1E示出了与第一抗原和第二抗原特异性地结合的双特异性抗原结合分子的示意图。图1A示出4+1形式的双特异性抗原结合分子的示意图，该双特异性抗原结合分子由能够与第一抗原特异性结合的四个Fab片段与能够与第二抗原特异性结合的一个Fab片段(作为crossFab片段)组合而成，其中VH-Ckappa链融合在Fc杵链的C-末端(第一抗原为四价，且第二抗原为单价)。图1B示出3+1形式的双特异性抗原结合分子的示意图，该双特异性抗原结合分子由能够与第一抗原特异性结合的三个Fab片段与能够与第二抗原特异性结合的一个Fab片段(作为crossFab片段)组合而成，其中VH-Ckappa链融合在Fc杵链的C-末端(第一抗原为三价，且第二抗原为单价)。包含能够与第一抗原特异性结合的彼此融合两个Fab片段的臂位于Fc杵链上。图1C示出3+1形式的双特异性抗原结合分子的示意图，该分子由能够与第一抗原特异性结合的三个Fab片段与能够与第二抗原特异性结合的一个Fab片段(作为crossFab片段)组合而成，其中VH-Ckappa链融合在Fc杵链的C-末端(第一抗原为三价，且第二抗原为单价)。包含能够与第一抗原特异性结合的彼此融合两个Fab片段的臂位于Fc臼链上。图1D示出2+1形式的双特异性抗原结合分子的示意图，该分子由能够与第一抗原特异性结合的两个Fab片段与能够与第二抗原特异性结合的一个Fab片段(作为crossFab片段)组合而成，其中VH-Ckappa链融合在Fc杵链的C-末端(第一抗原为二价，且第二抗原为单价)。图1E示出4+1形式的双特异性FAP-OX40抗体P1AD4524的示意图，该分子由四个OX40结合Fab片段与一个FAP(4B9)结合部分(作为VH和VL结构域)组合而成，其中VL结构域融合在Fc杵链的C-末端并且VH结构域融合在Fc臼链的C-末端(OX40为四价，且FAP为单价)。黑点象征杵臼结构突变。
图2A至图2F示出了不同形式的包含OX40克隆49B4的双特异性抗原结合分子的细胞结合。FAP抗原结合结构域H212是FAP克隆212的人源化形式，本文称为FAP(1G1a)。人FAP阴性肿瘤细胞(A549-NLR)(图2F)、FAP阳性成纤维细胞(NIH/3T3-huFAP-克隆19)(图2E)、OX40阳性激活的PBMC(激活的CD4和CD8 T细胞，分别为图2A和图2C)以及OX40阴性静息PBMC(静息CD4和CD8 T细胞，分别为图2B和图2D)与测试抗体的系列稀释液一起孵育，然后通过荧光标记的针对人Fcγ的第二抗体检测。活细胞被门控，并且二抗的平均荧光强度(基线由仅培养基样品校正)从重复中绘制。误差条指示SEM。
图3A至图3F示出了不同形式的包含OX40克隆8H9的双特异性抗原结合分子与4+1形式的包含OX40克隆49B4的双特异性抗原结合分子(P1AE6838)的细胞结合。人FAP阴性肿瘤细胞(A549-NLR)(图3F)、FAP阳性成纤维细胞(NIH/3T3-huFAP-克隆19)(图3E)、OX40阳性激活的PBMC(激活的CD4和CD8 T细胞，分别为图3A和图3C)以及OX40阴性静息PBMC(静息CD4和CD8 T细胞，分别为图3B和图3D)与测试抗体的系列稀释液一起孵育，然后通过荧光标记的针对人Fcγ的第二抗体检测。活细胞被门控，并且二抗的平均荧光强度(基线由仅培养基样品校正)从重复中绘制。误差条指示SEM。克隆8H9以亚纳摩尔亲和力与OX40阳性细胞结合，并具有与三价和二价抗体相当的强度。
图4A至图4F示出了不同形式的包含OX40克隆MOXR0916的双特异性抗原结合分子与4+1形式的包含OX40克隆49B4的双特异性抗原结合分子(P1AE6838)的细胞结合。人FAP阴性肿瘤细胞(A549-NLR)(图4F)、FAP阳性成纤维细胞(NIH/3T3-huFAP-克隆19)(图4E)、OX40阳性激活的PBMC(激活的CD4和CD8 T细胞，分别为图4A和图4C)以及OX40阴性静息PBMC(静息CD4和CD8 T细胞，分别为图4B和图4D)与测试抗体的系列稀释液一起孵育，然后通过荧光标记的针对人Fcγ的第二抗体检测。活细胞被门控，并且二抗的平均荧光强度(基线由仅培养基样品校正)从重复中绘制。误差条指示SEM。克隆MOXR0916以纳摩尔亲和力与OX40阳性细胞结合，具有与三价和二价抗体相当的强度。
图5A至图5F示出了不同形式的包含OX40克隆CLC563的双特异性抗原结合分子与4+1形式的包含OX40克隆49B4的双特异性抗原结合分子(P1AE6838)的细胞结合。人FAP阴性肿瘤细胞(A549-NLR)(图5F)、FAP阳性成纤维细胞(NIH/3T3-huFAP-克隆19)(图5E)、OX40阳性激活的PBMC(激活的CD4和CD8 T细胞，分别为图5A和图5C)以及OX40阴性静息PBMC(静息CD4和CD8 T细胞，分别为图5B和图5D)与测试抗体的系列稀释液一起孵育，然后通过荧光标记的针对人Fcγ的第二抗体检测。活细胞被门控，并且二抗的平均荧光强度(基线由仅培养基样品校正)从重复中绘制。误差条指示SEM。克隆CLC-563以纳摩尔亲和力与OX40阳性细胞结合，具有与三价和二价抗体相当的强度。
图6A至图6F示出了不同形式的包含在VH结构域中具有氨基酸突变的OX40克隆49B4的不同变体的双特异性抗原结合分子与4+1形式的包含OX40克隆49B4的双特异性抗原结合分子(P1AE6838)的细胞结合。人FAP阴性肿瘤细胞(A549-NLR)(图6F)、FAP阳性成纤维细胞(NIH/3T3-huFAP-克隆19)(图6E)、OX40阳性激活的PBMC(激活的CD4和CD8 T细胞，分别为图6A和图6C)以及OX40阴性静息PBMC(静息CD4和CD8 T细胞，分别为图6B和图6D)与测试抗体的系列稀释液一起孵育，然后通过荧光标记的针对人Fcγ的第二抗体检测。活细胞被门控，并且二抗的平均荧光强度(基线由仅培养基样品校正)从重复中绘制。误差条指示SEM。与包括克隆49B4的抗原结合分子相比，包含具有氨基酸突变的OX40(49B4)变体的所有抗原结合分子与OX40阳性细胞的结合显示出略有改善。
图7A至图7F示出了3+1和4+1形式(如所示的D-和S-变体)的包含OX40克隆OX40(49B4_K23E_K73E)或OX40(CLC563)的双特异性抗原结合分子的细胞结合。OX40阳性激活的PBMC分别与激活的CD4细胞(图7A、7C、7E)和激活的CD8 T细胞(图7C、7D、7F)进行门控，与测试抗体的系列稀释液一起孵育，然后通过荧光标记的针对人Fcγ的第二抗体检测。活细胞被门控，并且二抗的平均荧光强度(基线由仅培养基样品校正)从重复中绘制。图7A示出了OX40(CLC563)3+1构建体(如D-和S-变体)与活化的CD4细胞的结合，以及与活化的CD8 T细胞的结合如图7B所示。在图7C和图7D中分别示出了OX40(CLC563)4+1构建体(如D-和S-变体)在活化的CD4细胞和活化的CD8细胞上的结合。在图7E和图7F中分别示出了OX40(49B4_K23E_K73E)4+1构建体(如D-和S-变体)与活化的CD4细胞和活化的CD8 T细胞的结合。作为对照分子，使用非靶向四价OX40(49B4)4+0构建体(P1AD3690)、四价OX40(49B4)-FAP(4B9)4+1构建体(P1AD4524)和同型对照。
图8A至图8F示出了在表达OX40的报告细胞系HeLa_hOx40_NFκB_Luc1中的NFκB介导的荧光素酶表达活性。将3+1和4+1形式(如D和S变体)的包含OX40克隆OX40(49B4_K23E_K73E)或OX40(CLC563)的双特异性抗原结合分子的浓度相对于孵育并添加萤光素酶检测溶液后测量的释放光的单位(URL)用印迹法作图。所示出的是NFκB诱导，或者与表达人FAP的NIH/3T3成纤维细胞交联(图8A针对OX40(CLC563)3+1构建体如D-和S-变体，图8C针对OX40(CLC563)4+1构建体如D-和S-变体，图8E针对OX40(49B4_K23E_K73E)4+1构建体如D-和S-变体)，或没有进一步交联(图8B针对OX40(CLC563)3+1构建体如D-和S-变体，图8D针对OX40(CLC563)4+1构建体如D-和S-变体和图8F针对OX40(49B4_K23E_K73E)4+1构建体如D-和S-变体)。同型对照抗体不诱导任何NFκB活化。所有含有OX40的构建体均诱导剂量依赖性NFκB活化。由于三聚体核心OX40受体信号单元在没有交联的情况下已经组装，包含四个OX40Fab片段的四价形式诱导了一定的NFκB活化。S和D变体的表现相似。所示出的是重复的平均值。误差条代表SEM。
图9A至图9F显示了3+1和4+1形式(如所示的D-和S-变体)的包含OX40克隆OX40(49B4_K23E_K73E)或OX40(CLC563)的双特异性抗原结合分子的初级T细胞生物活性。此处评估的生物活性标志物为CD4+ T细胞(图9A为OX40(CLC563)3+1构建体，图9C为OX40(CLC563)4+1构建体和图9E为OX40(49B4_K23E_K73E)4+1构建体)和CD8+ T细胞(图9B为OX40(CLC563)3+1构建体，图9D为OX40(CLC563)4+1构建体和图9F为OX40(49B4_K23E_K73E)4+1构建体)上的CD25活化标志物表达，细胞在端点。用FAP靶向OX40抗原结合分子以剂量依赖性方式观察到增殖和CD25激活标志物表达增加。非靶向OX40分子仅在最高测试浓度下显示活性，而同型对照在基线校正后未示出激活。在S-和D-变体之间没有检测到统计学上的显著差异。所示出的是重复的平均值。误差条代表SEM。
图10A至图10F显示与FAP靶向OX40激动剂的共刺激增强了由CEACAM5 TCB介导的肿瘤细胞裂解诱导的PBMC的细胞因子分泌。PBMC与MKN45 NLR靶细胞、FAP+NIH/3T3-huFAP克隆19、CECAM5TCB[2nM]以及3+1和4+1形式(如D和S变体)的包含OX40克隆OX40(49B4_K23E_K73E)或OX40(CLC563)的双特异性抗原结合分子共培养，如所示的历经48小时。此处评估的生物活性标志物是在测定上清液中GM-CSF(图10A针对OX40(CLC563)3+1构建体，图10C针对OX40(CLC563)4+1构建体且图10E针对OX40(49B4_K23E_K73E)4+1的构建体)和TNF-α(图10B针对OX40(CLC563)3+1构建体，图10D针对OX40(CLC563)4+1构建体且图10F针对OX40(49B4_K23E_K73E)4+1构建体)相比于仅经过TCB处理的样品的增加倍数。仅对FAP交联的OX40激动剂以剂量依赖性方式观察到细胞因子诱导。非靶向OX40对照分子(P1AD3690)和同型对照在这里没有显示活性。与D-变体相比，S-变体显示出生物活性降低的趋势。所示出的是三次重复的平均值。
图11A至图11F还示出了与FAP靶向的OX40激动剂的共刺激增强了由CEACAM5 TCB介导的肿瘤细胞裂解诱导的PBMC的细胞因子分泌。PBMC与MKN45 NLR靶细胞、FAP+NIH/3T3-huFAP克隆19、CEACAM5TCB[2nM]和3+1和4+1形式(如D和S变体)的包含OX40克隆OX40(49B4_K23E_K73E)或OX40(CLC563)的双特异性抗原结合分子共培养，如所示的历经48小时。此处评估的生物活性标志物是在测定上清液中IFNγ(图11A针对OX40(CLC563)3+1构建体，图11C针对OX40(CLC563)4+1构建体和图11E针对OX40(49B4_K23E_K73E)4+1构建体)和IL-2(图11B针对OX40(CLC563)3+1构建体，图11D针对OX40(CLC563)4+1构建体和图11F针对OX40(49B4_K23E_K73E)4+1构建体)相比于仅经过TCB处理的样品的增加倍数。仅对FAP交联的OX40激动剂以剂量依赖性方式观察到细胞因子诱导。非靶向OX40对照分子(P1AD3690)和同型对照在这里没有显示活性。与D-变体相比，S-变体显示出生物活性降低的趋势。所示出的是三次重复的平均值。
图12总结了数据并示出与所有靶向FAP的OX40激动剂的共刺激增强了由CEACAM5TCB介导的肿瘤细胞裂解诱导的PBMC的细胞因子分泌。计算图37A至图37F和图38A至图38F中的剂量应答曲线的AUC，并针对OX40(CLC563)x FAP(1G1a_EPKSCD)3+1抗原结合分子(P1AF6454，也称为3+1CLC563/H212-D)的AUC进行归一化。盒须图中的每个符号代表一种细胞因子。
图13A至图13C示出了与靶向FAP的OX40激动剂的共刺激抑制了TGFβ对Treg细胞上的FoxP3的诱导。在T细胞活化期间，用抗CD28和CD3抗体在TGFβ存在下培养含有初始CD4 T细胞的人PBMC制剂。通过3+1和4+1形式(如D和S变体)的双特异性抗原结合分子的连续稀释行提供OX40激动作用，该双特异性抗原结合分子包含OX40克隆OX40(CLC563)或OX40(49B4_K23E_K73E)。交联是由包被在珠粒上的FAP抗原提供的。OX40激动作用通过降低FoxP3表达明显干扰Treg诱导。对活的CD4+CD25+Treg单线态细胞进行门控，并报告αFoxP3抗体的MFI。每个浓度的FoxP3 MFI通过没有OX40抗体的样品的MFI校正，因此只有TGBβ存在。图13A示出了OX40(CLC563)3+1构建体的效果，图13B示出了OX40(CLC563)4+1构建体的效果，图13C示出了OX40(49B4_K23E_K73E)4+1构建体的效果。每个靶向FAP的OX40双特异性抗原结合分子的D和S变体将FoxP3抑制至相似的范围。所示出的是三次重复的平均值，误差条代表SEM。
图14示出了使用表达GITR的工程化改造的Jurkat细胞的NFκB活化测定的结果。将具有C-末端EPKSC以及S和G变体的2+1形式的包含GITR x FAP(4B9)双特异性抗体的双特异性抗原结合分子的浓度相对于孵育并添加荧光素酶检测溶液后测量的释放光单位(RLU)用印迹法作图。所示出的是NFκB诱导，与表达人FAP的NIH/3T3成纤维细胞交联。所有三个c端变体的表现相似。
图15A至图15C示出了用实例7.1中描述的测定法测量的一组人个体血浆样品中先前存在的抗药物抗体(ADA)反应性。如WO 2017/060144 A1中所述，对于双特异性抗原结合分子OX40(49B4)x FAP(4B9)(4+1)，观察到具有高信号的高发生率，其中VH和VL结构域在C-末端连接至每个重链(图15A)。对于其中融合至Fc结构域C-末端的VH和VL结构域被Fab片段取代的双特异性抗原结合分子，检测到的发生率较低。然而，似乎仍然先前存在针对Fab片段的抗药物抗体，如在图15B中针对OX40(49B4)x FAP(4B9)(4+1)所示和在图15C中针对OX40(49B4)x FAP(1G1a)(4+1)所示。1G1a为FAP克隆212(H212)的人源化变体。
图16比较了一组人个体血浆样品中2+1形式的包含不同抗OX40克隆(49B4、8H9、MOX0916和CLC-563)的双特异性抗原结合分子的先前存在的抗药物抗体(ADA)反应性。
图17A示出对照分子，即非靶向四价OX40(49B4)抗原结合分子(P1AD3690)、FAP(1G1a)抗体(P1AE1689)或种系对照抗体(DP47)不会导致先前存在的抗药物抗体(ADA)反应性，而包含融合在Fc结构域C-末端的Fab片段的双特异性抗原分子均引起先前存在的IgG干扰，如图17B所示。令人惊讶的是，较小的2+1分子比3+1和4+1形式的分子诱导的发生率略高。
图18A至图18C涉及双特异性抗原结合分子OX40(49B4)x FAP(1G1a)(3+1)的先前存在的抗药物抗体(ADA)反应性的测试。如图18A所示，具有“游离”C-末端EPKSC的包含CH1结构域的分子诱导先前存在的ADA反应性。图18B示出了通过在没有药物分子的情况下进行测定所测量的缓冲液的个体背景信号，图18C示出了减去背景信号的分子的先前存在的ADA反应性。
图19A至图19C：如在图18C中确定的双特异性抗原结合分子OX40(49B4)x FAP(1G1a)(3+1)的一组人个体血浆样品中先前存在的抗药物抗体(ADA)反应性也在图19A中示出，并且与由包含EPKSCD端的双特异性分子OX40(MOXR0916)x FAP(1G1a)(3+1)(图19B)或由包括EPKSCS端的双特异性分子OX40(MOXR0916)xFAP(1G1a)(3+1)(图19C)诱导的先前存在的IgG反应性比较。对于EPKSD变体观察到大幅降低，而EPKSCS变体导致完全消除先前存在的ADA反应性。
图20A至图20C示出了2+1形式的相应分子组，并证实了先前的结果，即与具有游离C-末端EPKSC的分子OX40(49B4)x FAP(1G1a)(2+1)(P1AE6840，图20A)相比，具有EPKSCD端的双特异性抗原结合分子OX40(MOXR0916)x FAP(1G1a)(2+1)，P1AF4852(图20B)降低了与血浆中先前存在的抗体反应性，而具有EPKSCS端的双特异性抗原结合分子OX40(MOXR0916)x FAP(1G1a)(2+1)，P1AF4858(图20C)消除了与血浆中先前存在的抗体的反应性。
图21A至图21H示出了一组C-末端延伸增加的OX40(MOXR0916)xFAP(1G1a)分子。与具有游离C-末端EPKSC的分子OX40(MOXR619)xFAP(1G1a)(2+1)(P1AE8872，图21A)相比，天冬氨酸的C-末端延伸(具有EPKSCD端的分子OX40(MOXR0916)x FAP(1G1a)(2+1)，P1AF4852，图21B)降低了与血浆中先前存在的抗体的反应性，而对于C-末端EPKSCDK(分子(MOXR619)xFAP(1G1a)(3+1)，P1AF4846，图21C)则观察到反应性略有增加。对于具有C-末端EPKSCDKT的分子(分子(MOXR619)x FAP(1G1a)(3+1)，P1AF4847，图21D)，已观察到高反应性。对于具有C-末端EPKSCDKTH的分子(分子(MOXR619)x FAP(1G1a)(2+1)，P1AF4855，图21E)和具有C-末端EPKSCDKTHT的分子(分子(MOXR619)x FAP(1G1a)(2+1)，P1AF4856，图21F)，反应性再次降低。用氨基酸L取代C-末端T，这在上铰链区中的这个位置处不是天然存在的，完全地消除了与血浆中先前存在的抗体的反应性(分子(MOXR619)x FAP(1G1a)(2+1)，P1AF4857，图21G)，与C-末端丝氨酸(具有EPKSCS端的分子OX40(MOXR0916)x FAP(1G1a)(2+1)，P1AF4858，图21H)相当。图22总结了结果。
图23A至图23F证实了在其他三个实例中观察到了相同的效果。对于具有EPKSCD端的OX40(CLC563)x FAP(1G1a)(3+1)(P1AF6454)在图23A中示出了一组人个体血浆样品中先前存在的ADA的反应性，对于具有EPKSCS端的OX40(CLC563)x FAP(1G1a)(3+1)(P1AF6455)在图23B中示出，对于具有EPKSCD端的OX40(CLC563)x FAP(1G1a)(4+1)(P1AF7205)在图23C中示出，对于具有EPKSCS端的OX40(CLC563)xFAP(1G1a)(4+1)(P1AF7217)在图23D中示出，对于具有EPKSCD端的OX40(49B4_K23E_K73E)x FAP(1G1a)(3+1)(P1AF6456)在图23E中示出并且对于具有EPKSCS端的OX40(49B4_K23E_K73E)x FAP(1G1a)(3+1)(P1AF6457)在图23F中示出。
图24A至图24C示出了一组GITR双特异性抗原结合分子GITR xFAP(4B9)(2+1)及其具有EPKSCS端(P1AG1036)和EPKSCG端(P1AG1039)的C-末端变体。它证实了先前的结果，即与具有游离C-末端的相应分子(P1AE1116，图24A)相比，丝氨酸的C-末端延伸(P1AG1036，图24B)消除了与血浆中先前存在的抗体的反应性。这还表明，与丝氨酸延伸变体类似，具有甘氨酸的进一步延伸变体消除了不需要的反应性(P1AG1039，图24C)。
具体实施方式
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的示例是抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。
如本文所用，术语“能够与抗原特异性结合的抗原结合结构域”或“能够与抗原特异性结合的部分”是指与抗原决定簇特异性地结合的多肽分子。在一个方面，抗原结合结构域能够通过其靶细胞抗原活化信号传导。在特定方面，抗原结合结构域能够将与其连接的实体(例如TNF受体激动性抗体)引导至靶位点，例如引导至携带抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。能够与抗原特异性结合的抗原结合结构域包括如本文进一步定义的抗体及其片段。具体地，能够与靶细胞抗原特异性结合的抗原结合结构域为能够与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的抗原结合结构域。
关于抗体或其片段，术语“能够与抗原特异性结合的抗原结合结构域”是指分子的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性地结合并且与之互补的区域。可通过例如一种或多种抗体可变结构域(也称为抗体可变区)来提供能够特异性抗原结合的抗原结合结构域。具体地，能够特异性抗原结合的抗原结合结构域包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。在一个特定方面，“能够与抗原特异性结合的抗原结合结构域”为Fab片段或交叉Fab片段。
本文的术语“抗体”以最广义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
如本文所用，术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结合位点与相同抗原的相同表位结合。术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性结合到至少两种独特的抗原决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种独特细胞上表达的两种抗原决定簇。如本文所述的双特异性抗原结合分子还可形成多特异性抗体的一部分。
本申请中所用的术语“价态”表示在对一种独特抗原决定簇具有特异性的抗原结合分子中存在特定数量的对一种独特抗原决定簇具有特异性的结合位点。因此，术语“二价”、“三价”、“四价”和“六价”分别表示在抗原结合分子中存在对特定抗原决定簇具有特异性的两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。在本发明的特定方面，根据本发明的双特异性抗原结合分子对特定抗原决定簇可以是单价的，意味着它们对所述抗原决定簇仅具有一个结合位点，或者对特定抗原决定簇可以是二价或四价的，意味着它们对所述抗原决定簇分别具有两个结合位点或四个结合位点。
术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用地指代具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。“天然抗体”是指具有不同结构的天然免疫球蛋白分子。例如，天然IgG类抗体为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键键合的两条轻链和两条重链组成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，后接三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N-末端到C-末端，每条轻链具有可变区(VL)(也称为可变轻结构域或轻链可变结构域)，后接轻链恒定结构域(CL)(也称为轻链恒定区)。抗体的重链可以分配为五种类型中的一种，该五种类型被称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可以进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，这两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体、三体抗体、四体抗体、交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，载于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag,New York，第269至第315页(1994)；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，该双体抗体可以是二价的或双特异性的，参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体在Hudson等人，Nat Med9,129-134(2003)中也有所描述。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。抗体片段可以通过各种技术制备，这些技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化，以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生，如本文所述。
木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个称为“Fab”片段的相同的抗原结合片段，每个“Fab”片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，如本文所用，术语“Fab片段”是指包含轻链片段以及重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段，该轻链片段包含VL结构域和轻链恒定结构域(CL)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于Fab'片段在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是Fab’片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分。根据本发明，术语“Fab片段”还包括如下文所定义的“交叉Fab片段”或“交换型Fab片段”。
术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换型Fab片段”是指这样的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。交换型Fab分子的两种不同链组成是可能的，并且包含在本发明的双特异性抗体中：在一个方面，Fab重链和轻链的可变区被交换，即交换型Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链。该交换型Fab分子也称为CrossFab(VLVH)。在另一方面，当Fab重链和轻链的恒定区被交换时，交换型Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链，以及由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链。该交换型Fab分子也称为CrossFab(CLCH1)。
“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N-末端至C-末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1，或d)VL-CH1-接头-VH-CL；并且其中所述接头是至少30个氨基酸，优选是32个至50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链Fab分子可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键，而进一步稳定化。
“交换型单链Fab片段”或“x-scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N末端至C-末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH和VL一起形成与抗原特异性结合的抗原结合位点，并且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽。此外，这些x-scFab分子可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键，而进一步稳定化。
“单链可变片段(scFv)”是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白，通过10至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解度，并且可以将VH的N-末端与VL的C-末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白保留了原始抗体的特异性。scFv抗体例如描述于Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96)中。另外，抗体片段包含单链多肽，该单链多肽的特征在于具有VH结构域，即能够与VL结构域一起装配到功能性抗原结合位点；或具有VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起装配到功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。
作为参考分子的“结合相同表位的抗原结合分子”是指这样的抗原结合分子，在竞争测定中该抗原结合分子使参考分子与其抗原的结合被阻断50％或更多，并且相反地，在竞争测定中参考分子使抗原结合分子与其抗原的结合被阻断50％或更多。作为参考分子的“不结合相同表位的抗原结合分子”是指这样的抗原结合分子，在竞争测定中该抗原结合分子使参考分子与其抗原的结合不被阻断50％或更多，并且相反地，在竞争测定中参考分子使抗原结合分子与其抗原的结合不被阻断50％或更多。
术语“抗原结合结构域”或“抗原结合位点”是指抗原结合分子的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性地结合并互补的区域。在抗原很大的情况下，抗原结合分子可以仅结合抗原的特定部分，该部分称为表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个可变结构域(也称为可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合部分与该位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。除非另有说明，否则本文中用作抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在具体实施例中，抗原是人蛋白质。当提及本文中的特定蛋白质时，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质，以及由细胞内加工而产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白质变体，例如剪接变体或等位基因变体。
“特异性结合”是指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个实施例中，例如如通过SPR所测得的，抗原结合分子与不相关蛋白的结合程度小于该抗原结合分子与抗原的结合程度的约10％。在某些实施例中，与抗原结合的分子的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)表示，解离常数(Kd)是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数之比保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。用于测量亲和力的特定方法为表面等离子体共振(SPR)。
“亲和力成熟的”的抗体是指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致了抗体对抗原的亲和力的改善。
如本文所用，“靶细胞抗原”是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，特别地肿瘤中的靶细胞(诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞)。因此，靶细胞抗原是肿瘤相关抗原。特别地，肿瘤靶细胞抗原为成纤维细胞活化蛋白(FAP)。
术语“成纤维细胞活化蛋白(FAP)”也称为脯氨酰内肽酶FAP或Seprase(EC3.4.21)，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然FAP，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工FAP，以及通过细胞中加工产生的任何形式的FAP。该术语还涵盖FAP的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个实施例中，本发明的抗原结合分子能够特异性结合到人、小鼠和/或食蟹猴FAP。人FAP的氨基酸序列示出于UniProt(www.uniprot.org)登录号Q12884(149版，SEQ ID NO:11)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2中。人FAP的胞外结构域(ECD)从氨基酸位置26延伸至氨基酸位置760。His标记的人FAP ECD的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:12中。小鼠FAP的氨基酸序列示出于UniProt登录号P97321(126版，SEQ ID NO:13)或NCBI RefSeqNP_032012.1中。小鼠FAP的胞外结构域(ECD)从氨基酸位置26延伸至氨基酸位置761。SEQID NO:14示出His标记的小鼠FAP ECD的氨基酸。SEQ ID NO:15示出His标记的食蟹猴FAPECD的氨基酸。优选地，本发明的抗FAP结合分子结合到FAP的胞外结构域。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗原结合分子与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。通常，抗体包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)出现在以下氨基酸残基处的高可变环：26至32(L1)、50至52(L2)、91至96(L3)、26至32(H1)、53至55(H2)和96至101(H3)(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；以及
(c)出现在以下氨基酸残基处的抗原接触点：27c至36(L1)、46至55(L2)、89至96(L3)、30至35b(H1)、47至58(H2)，以及93至101(H3)(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另外指明，否则CDR根据出处同上的Kabat等人所述的方法确定。本领域的技术人员将理解，CDR名称也可以根据出处同上的Chothia所述的方法、出处同上的McCallum所述的方法或者任何其他在科学上接受的命名系统来确定。
“框架”或“FR”是指除互补决定区(CDR)之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，CDR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在该抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR对应于非人抗体的CDR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经经历进行过人源化的抗体。本发明涵盖的其他形式的“人源化抗体”是这样的抗体，相对于原始抗体，该抗体中的恒定区已经经过了另外修饰或改变，以产生根据本发明的性质，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的性质。
术语“CH1结构域”表示大致从EU 118位延伸至EU 215位(根据Kabat的EU编号系统)的抗体重链多肽部分。在一个方面，CH1结构域具有ASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKV(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。通常，具有EPKSC的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的片段跟随以连接CH1结构域与铰链区。发明人发现未融合至完整铰链区的CH1结构域可导致与先前存在的抗体(ADA)的反应性。例如，可以在crossfab片段中找到具有游离C-末端的CH1结构域。
术语“铰链区”表示抗体重链多肽的在野生型抗体重链中连接CH1结构域和CH2结构域的部分，例如根据Kabat的IgG1 EU编号系统从约216位至约238位，或根据Kabat的EU编号系统从约226位至约230位。其他IgG亚类的铰链区可以通过与IgG1亚类序列的铰链区半胱氨酸残基比对来确定。铰链区通常是由两种氨基酸序列相同的多肽组成的二聚体分子。铰链区通常包含多达25个氨基酸残基，并且是柔性的，允许相关联靶结合位点独立移动。铰链区可细分为三个结构域：上铰链结构域、核心铰链结构域和下铰链结构域(例如，参见Roux,et al.,J.Immunol.161(1998)4083)。在人IgG1的情况下，上铰链区具有EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列并且对应于根据Kabat的IgG1 EU编号系统的216位至225位。根据Kabat的IgG1 EU编号系统，核心铰链区对应于226位至230位，并具有CPXCP(SEQ IDNO:8)的氨基酸序列，其中X可以是P或S。下铰链区对应于根据Kabat的IgG1 EU编号系统的231位至238位并且在人IgG1抗体中具有APELLGGP(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列，或在人IgG4抗体中具有APEFLGGP(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。上铰链形成一圈螺旋，具有低固有稳定性，并暴露于溶剂中。低铰链在不同的亚类中相似，但在IgA中似乎不存在，具有延伸的构象。该区段提供免疫球蛋白分子的节段灵活性。刚性核心形成两个通过二硫键连接的平行多脯氨酸双螺旋，其数量在不同的免疫球蛋白类别和亚类之间有所不同。中心核(或中铰链)的长度，在各种类别和亚类的免疫球蛋白分子中是不同的，并且在物种之间也是可变的。
本文中的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链C-末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgG Fc区包含IgG CH2结构域和IgGCH3结构域。人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从大致231位的氨基酸残基延伸至大致340位的氨基酸残基。(根据Kabat的EU编号系统)。在一个方面，CH2结构域具有APELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列。CH2结构域的独特之处在于它与另一个结构域的配对不紧密。相反，两个N连接的支链碳水化合物链介于完整天然Fc区的两个CH2结构域之间。据推测，碳水化合物可能为结构域-结构域配对提供替代物，并有助于稳定CH2结构域。Burton,Mol.Immunol.22(1985)161-206。在一个实施例中，碳水化合物链附接至CH2结构域。本文的CH2结构域可以是天然序列CH2结构域或变体CH2结构域。“CH3结构域”包含Fc区中C-末端至CH2结构域的一段残基(即，来自根据EU编号系统(根据IgG的Kabat)的约341位处的氨基酸残基到约447位处的氨基酸残基)。在一个方面，CH3结构域具有GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列。本文的CH3区可以是天然序列CH3结构域或变体CH3结构域(例如在其一个链中具有引入的“凸起”(“杵”)并在其另一个链中具有相应的引入的“空腔”(“臼”)的CH3结构域；参见美国专利号5,821,333，其以引用方式明确并入本文)。此类变体CH3结构域可用于促进如本文所述的两条不相同的抗体重链的异源二聚化。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
术语“野生型Fc结构域”表示与自然界中发现的Fc结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。野生型人Fc结构域包括天然人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)、天然人IgG2 Fc区、天然人IgG3 Fc区和天然人IgG4 Fc区以及其天然存在的变体。野生型Fc区表示在SEQ IDNO:19(IgG1，白种人同种异型)、SEQ ID NO:20(IgG1，非裔美国人同种异型)、SEQ ID NO:21(IgG2)、SEQ ID NO:22(IgG3)和SEQ ID NO:23(IgG4)中。术语“变体(人)Fc结构域”表示与“野生型”(人)Fc结构域氨基酸序列的氨基酸序列区别在于至少一个“氨基酸突变”的氨基酸序列。在一个方面，与天然Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸突变，诸如在天然Fc区中从约1个到约10个氨基酸突变，并且在一个方面，从约1个到约5个氨基酸突变。在一个方面，(变体)Fc区与野生型Fc区具有至少约95％的同源性。
“杵臼(knob-into-hole)”技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。一般来讲，该方法涉及在第一多肽的界面处引入凸起(“杵”)并且在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得该凸起可以定位在该空腔中，以便促进异源二聚体的形成并且阻碍同源二聚体的形成。凸起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与凸起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。凸起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸(例如通过位点特异性诱变或通过肽合成)来制备。在具体实施例中，杵修饰包含Fc结构域的两个亚基中的一个中的氨基酸取代T366W，而臼修饰包含Fc结构域的两个亚基中的另一个中的氨基酸取代T366S、L368A和Y407V。在进一步具体实施例中，包含杵修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代S354C，而包含臼修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定化二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”旨在包括免疫球蛋白的Fc区的天然存在的等位基因变体，以及具有产生取代、添加或缺失但基本上不降低免疫球蛋白介导效应子功能(诸如抗体依赖性细胞毒性)的能力的修改的变体。例如，可以使一个或多个氨基酸从免疫球蛋白的Fc区的N-末端或C-末端缺失，而基本上不丧失生物学功能。可以根据本领域中已知的一般规则来选择此类变体，以便对活性具有最小的影响(参见例如Bowie,J.U.et al.,Science 247:1306-10(1990))。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型而变化的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞活化。
Fc受体结合依赖性效应子功能可通过抗体的Fc区与Fc受体(FcR)的相互作用来介导，Fc受体是造血细胞上的特异性细胞表面受体。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已被证明可通过吞噬免疫复合物来介导去除抗体包被的病原体，并且通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来裂解涂有相应抗体的红细胞及其他各种细胞靶点(例如，肿瘤细胞)(参见例如Van de Winkel,J.G.和Anderson,C.L.，J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。FcRs由其对免疫球蛋白同种型的特异性来限定：IgG抗体的Fc受体称为FcγR。Fc受体结合描述于例如：Ravetch,J.V.and Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.,et al.,Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.,et al.,J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341和Gessner,J.E.,et al.,Ann.Hematol。76(1998)231-248。
IgG抗体(FcγR)Fc区受体的交联触发多种效应子功能，包括吞噬作用、抗体依赖性细胞细胞毒性、炎症介质的释放以及免疫复合物清除和抗体产生的调节。已在人体中鉴定出三类FcγR，其中包括：
-FcγRI(CD64)以高亲和力结合单体IgG，并且在巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。Fc区IgG中在至少一个氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329(根据Kabat的EU索引编号)的修饰，降低与FcγRI的结合。在233–236位的IgG2残基被IgG1和IgG4取代，使得与FcγRI的结合力降低103倍，并且消除了人单核细胞对抗体敏化红细胞的应答(Armour,K.L.等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2613–2624)。
-FcγRII(CD32)以中等至低亲和力结合复合IgG，并得到广泛表达。该受体可分为两种亚型，即FcγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA存在于许多参与杀伤的细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞)中，并且似乎能够活化杀伤过程。FcγRIIB似乎在抑制过程中起作用，并且存在于B细胞、巨噬细胞以及肥大细胞和嗜酸性粒细胞中。在B细胞上，它似乎起到抑制免疫球蛋白进一步产生以及同种型转换为例如IgE类的作用。在巨噬细胞上，FcγRIIB用于抑制由FcγRIIA介导的吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，B型可能通过IgE与其单独受体的结合而有助于抑制这些细胞的活化。发现例如抗体(包含在至少一个氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292和K414(根据Kabat的EU索引编号)的突变的IgG Fc区)对FcγRIIA的结合力降低。
-FcγRIII(CD16)以中等至低亲和力结合IgG，并且包括两种类型。FcγRIIIA存在于NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及一些单核细胞和T细胞上，并且介导ADCC。FcγRIIIB在中性粒细胞上的表达水平高。发现例如抗体(包含在至少一个氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338和D376(根据Kabat的EU索引编号)的突变的IgG Fc区)对FcγRIIIA的结合力降低。
Shields,R.L.等人(J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)描述了人IgG1上与Fc受体的结合位点的定位、上述突变位点以及测量与FcγRI和FcγRIIA结合的方法。
术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞毒性”是由Fc受体结合介导的功能，并且是指在效应子细胞存在下本文所报道的抗体对靶细胞的裂解。通过测量抗体与表达Fcγ受体的细胞(诸如重组表达FcγRI和/或FcγRIIA或NK细胞(在本质上表达FcγRIIIA)的细胞)的结合来研究抗体诱导介导ADCC的初始步骤的能力。具体地，测量与NK细胞上与FcγR的结合。
“活化Fc受体”是这样的Fc受体，其在抗体的Fc区接合后，引起刺激携带受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。活化Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。特定的活化Fc受体是人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637，版本141)。
“肿瘤坏死因子受体超家族”或“TNF受体超家族”目前由27种受体组成。它是一组细胞因子受体，其特征在于能够通过细胞外富含半胱氨酸的结构域(CRD)结合肿瘤坏死因子(TNF)。这些伪重复由受体链内高度保守的半胱氨酸残基形成的链内二硫键限定。除神经生长因子(NGF)外，所有TNF与原型TNF-α同源。大多数TNF受体以其活性形式在血浆膜中形成三聚体复合物。因此，大多数TNF受体含有跨膜结构域(TMD)。这些受体中的多种受体还包含细胞内死亡结构域(DD)，这些结构域在配体结合后召集与胱天蛋白酶相互作用的蛋白质，从而起始胱天蛋白酶活化的外源途径。其他缺乏死亡结构域的TNF超家族受体与TNF受体相关因子结合并且活化细胞内信号传导通路，从而导致增殖或分化。这些受体也可起始细胞凋亡，但它们经由间接机制发挥作用。除调节细胞凋亡以外，多种TNF超家族受体还参与调节免疫细胞功能，诸如B细胞稳态和活化、自然杀伤细胞活化和T细胞协同刺激。多种其他调节特定细胞类型的应答，诸如毛囊发育和破骨细胞发育。TNF受体超家族的成员包括：肿瘤坏死因子受体1(1A)(TNFRSF1A,CD120a)、肿瘤坏死因子受体2(1B)(TNFRSF1B,CD120b)、淋巴毒素β受体(LTBR,CD18)、OX40(TNFRSF4,CD134)、CD40(Bp50)、Fas受体(Apo-1,CD95,FAS)、诱骗受体3(TR6,M68,TNFRSF6B)、CD27(S152,Tp55)、CD30(Ki-1,TNFRSF8)、4-1BB(CD137,TNFRSF9)、DR4(TRAILR1,Apo-2,CD261,TNFRSF10A)、DR5(TRAILR2,CD262,TNFRSF10B)、诱骗受体1(TRAILR3,CD263,TNFRSF10C)、诱骗受体2(TRAILR4,CD264,TNFRSF10D)、RANK(CD265,TNFRSF11A)、骨保护素(OCIF,TR1,TNFRSF11B)、TWEAK受体(Fn14,CD266,TNFRSF12A)、TACI(CD267,TNFRSF13B)、BAFF受体(CD268,TNFRSF13C)、疱疹病毒侵入介体(HVEM,TR2,CD270,TNFRSF14)、神经生长因子受体(p75NTR,CD271,NGFR)、B细胞成熟抗原(CD269,TNFRSF17)、糖皮质激素诱导的TNFR相关(GITR,AITR,CD357,TNFRSF18)、TROY(TNFRSF19)、DR6(CD358,TNFRSF21)、DR3(Apo-3,TRAMP,WS-1,TNFRSF25)以及外胚叶发育不全A2受体(XEDAR,EDA2R)。
经过初始T细胞活化后，肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的多个成员将维持T细胞应答。术语“共刺激TNF受体”或“共刺激TNF受体超家族成员”或“共刺激TNF超家族受体”是指TNF受体超家族成员的一个亚组，其能够共刺激T细胞的增殖和细胞因子产生。除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然TNF家族受体，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在本发明的具体实施例中，共刺激TNF受体选自由以下项组成的组：OX40(CD134)、4-1BB(CD137)、CD27、HVEM(CD270)、CD30和GITR，它们对T细胞均具有共刺激作用。更具体地，共刺激TNF受体超家族成员选自由OX40和4-1BB组成的组。
TNF受体的进一步信息，特别是序列，可从可公开访问的数据库诸如Uniprot(www.uniprot.org)获得。例如，特定的人共刺激TNF受体具有以下氨基酸序列：人OX40(UniProt登录号P43489，SEQ ID NO:24)、人GITR(UniProt登录号Q9Y5U5，SEQ ID NO:26)和人4-1BB(UniProt登录号Q07011，SEQ ID NO:28)。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“OX40”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然OX40，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工OX40，以及由细胞中的加工所产生的任何形式的OX40。该术语还涵盖OX40的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人OX40的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:24(Uniprot P43489，112版)中，并且示例性鼠OX40的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:25(Uniprot P47741，101版)中。
如本文所用，术语“OX40激动剂”包括使OX40/OX40L相互作用激动的任何部分。如上下文所用，OX40优选是指人OX40，因此OX40激动剂优选为人OX40的激动剂。通常，该部分将为激动性OX40抗体或抗体片段，特别是Fab片段。
术语“抗OX40抗体”、“抗OX40”、“OX40抗体”和“与OX40特异性地结合的抗体”是指能够以足够亲和力结合OX40的抗体，以便该抗体用作在靶向OX40中的诊断剂和/或治疗剂。在一个方面，例如通过流式细胞术(FACS)所测得的，抗OX40抗体与不相关的非OX40蛋白的结合程度小于该抗体与OX40结合程度的约10％。在某些实施例中，与OX40结合的抗体的解离常数(KD)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-6M或更小，例如10-68M至10-13M，例如10-8M至10-10M)。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“GITR”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然GITR，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工GITR，以及由细胞中的加工所产生的任何形式的GITR。该术语还涵盖GITR的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人GITR的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:26(Uniprot P43489，112版)中，并且示例性食蟹猴GITR的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:27中。
如本文所用，术语“GITR激动剂”包括使GITR/GITRL相互作用激动的任何部分。如上下文所用，OX40优选是指人GITR，因此GITR激动剂优选为人GITR的激动剂。通常，该部分将为激动性GITR抗体或抗体片段，特别是Fab片段。
术语“抗GITR抗体”、“抗GITR”、“GITR抗体”和“与GITR特异性地结合的抗体”是指能够以足够亲和力结合GITR的抗体，以便该抗体用作在靶向GITR中的诊断剂和/或治疗剂。在一个方面，例如通过放射免疫测定法(RIA)或流式细胞术(FACS)所测得的，抗GITR抗体与不相关的非GITR蛋白的结合程度小于该抗体与GITR结合程度的约10％。在某些实施例中，与GITR结合的抗体的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-6M或更小，例如10-68M至10-13M，例如10-8M至10-10M)。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“4-1BB”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然4-1BB，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工4-1BB，以及由细胞中的加工所产生的任何形式的4-1BB。该术语还涵盖4-1BB的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人4-1BB的氨基酸序列示于SEQ ID NO:28(Uniprot登录号Q07011)中。
术语“抗4-1BB抗体”、“抗4-1BB”、“4-1BB抗体和“与4-1BB特异性结合的抗体”是指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合4-1BB，使得该抗体可用作靶向4-1BB的诊断和/或治疗剂。在一个实施例中，例如通过放射免疫测定(RIA)或流式细胞术(FACS)所测得的，抗4-1BB抗体与不相关的非4-1BB蛋白的结合程度小于该抗体与4-1BB结合程度的约10％。在某些实施例中，与4-1BB结合的抗体的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-6M或更小，例如10-68M至10-13M，例如10-8M至10-10M)。
如本文所用，术语“4-1BB激动剂”包括使4-1BB/4-1BBL相互作用激动的任何部分。如上下文所用，4-1BB优选是指人4-1BB，因此4-1BB激动剂优选为人4-1BB的激动剂。通常，该部分将为激动性4-1BB抗体或抗体片段，特别是Fab片段。
术语“肽接头”是指包含一个或多个氨基酸，通常约2至20个氨基酸的肽。肽接头是本领域中已知的或在本文中描述的。合适的非免疫原性接头肽是例如(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”通常为介于1与10之间、通常介于2与4之间的数字，特别地是2，即选自由以下项组成的组的肽：GGGGS(SEQ ID NO:29)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:30)、SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:31)和GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:32)，但也包括以下序列：GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:33)、(G4S)3(SEQ ID NO:34)、(G4S)4(SEQ ID NO:35)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:36)、GSGSGNGS(SEQ ID NO:37)、GGSGSGSG(SEQ ID NO:38)、GGSGSG(SEQ IDNO:39)、GGSG(SEQ ID NO:40)、GGSGNGSG(SEQ ID NO:41)、GGNGSGSG(SEQ ID NO:42)和GGNGSG(SEQ ID NO:43)。特定目标肽接头为(G4S)(SEQ ID NO:29)、(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:30)、(G4S)3(SEQ ID NO:34)和(G4S)4(SEQ ID NO:35)。
如本申请中所用的术语“氨基酸”表示包括以下项的天然存在的羧基α-氨基酸的组：丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、蛋氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)，以及缬氨酸(val，V)。
“融合”或“连接”意指组分(例如，抗体和Fab片段的重链)直接地或经由肽接头而通过肽键连接。
相对于参考多肽(蛋白质)序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基并引入缺口(如果需要的话)以实现最大的序列同一性百分比后，并且在不将任何保守取代考虑为所述序列同一性的一部分的情况下，与所述参考多肽序列中的氨基酸残基相同的所述候选序列中的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN.SAWI或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列同一性％的值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech,Inc.)编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从基因泰克公司(Genentech,Inc.,South San Francisco,California)公开获得，或者可以从所述源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作系统上使用，所述UNIX操作系统包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可以替代地表达为给定氨基酸序列A具有或包含与给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列同一性％的值是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
在某些实施例中，考虑了本文提供的双特异性抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善含TNF配体三聚体的抗原结合分子的结合亲和力和/或其他生物学特性。含TNF配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体可以通过向编码分子的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。用于取代诱变的目标位点包括HVR和框架(FR)。保守性取代在表B中表头“优选的取代”下提供，并在下文中参考氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可以将氨基酸取代引入目标分子中，并对产物进行所需活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC)筛选。
表A
Figure BDA0003872289030000341
Figure BDA0003872289030000351
可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
术语“氨基酸序列变体”包括实质性变体，其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中存在氨基酸取代。通常，相对于亲本抗原结合分子，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗原结合分子展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。在某些实施例中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要此类改变基本上不降低抗原结合分子的抗原结合能力即可。例如，可在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴别残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。替代地或另外地，利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的示例包括具有N末端甲硫氨酰残基的本发明的双特异性抗原结合分子。分子的其他插入变体包括与增加双特异性抗原结合分子的血清半衰期的多肽的N-末端或C-末端的融合。
在某些实施例中，改变本文提供的双特异性抗原结合分子以增加或降低抗体糖基化的程度。可通过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点，从而便利地获得分子的糖基化变体。当抗原结合分子包含Fc区时，附接于其上的碳水化合物可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的、双触角寡糖，所述双触角寡糖通常通过N-键连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可以对含TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的变体。在一个方面，提供了本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的变体，其具有缺乏附接(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能，参见例如美国专利公开号US2003/0157108(Presta,L.)或美国2004/0093621(Kyowa HakkoKogyo Co.,Ltd)。在另一方面，本发明的双特异性抗原结合分子或抗体提供有两分型寡糖的变体，例如其中附接于Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能，参见例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；以及美国2005/0123546(Umana等人)。还提供了在附接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能并描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
在某些方面，可期望产生本发明的双特异性抗原结合分子的半胱氨酸工程化改造的变体，例如“thioMAb”，其中分子的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定方面，取代的残基存在于分子的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分，诸如药物部分或接头-药物部分缀合，以产生免疫缀合物。在某些方面，可用半胱氨酸取代下列残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利号7,521,541中所述形成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。
术语“核酸”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸包含碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸酯基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以产生体内抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，在线发表于2017年6月12日，doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823B1)。
“分离的”核酸是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有核酸分子的细胞中，但该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“编码双特异性抗原结合分子或抗体的分离的核酸”是指编码双特异性抗原结合分子或抗体的重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或单独的载体中的此类核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此类核酸分子。
关于与本发明的参考核苷酸序列具有至少例如95％“一致”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，是指除了多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多五个点突变之外，多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是一致的。换句话讲，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％一致的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可缺失或被另外的核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸的至多5％的数量的核苷酸可插入到参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任意位置，或单个地散布在参考序列的残基之中，或以一个或多个连续的组散布在参考序列内。作为一种实际情况，可以使用已知的计算机程序，诸如上文针对多肽所讨论的程序(例如ALIGN-2)，常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
术语“表达盒”是指通过重组或合成生成的多核苷酸，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”是同义的并且是指用于将特定基因引入与其可操作地关联的靶细胞中并指导所述基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体处于靶细胞内部，即通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可以用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，举几个例子，例如培养的哺乳动物细胞，诸如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，以及包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。
药剂的“有效量”是指在其所施用的细胞或组织中产生生理学变化所需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。具体地，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”或“药物配制物”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用该药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的附加组分的制剂。
“药用载体”是指药物组合物或配制物中除有效成分之外的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的分子用于延迟疾病的发展或用于减缓疾病的进展。
如本文所用的术语“癌症”是指增生性疾病，诸如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastriccancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊椎轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成髓细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，包括以上癌症中的任一种的难治性型式，或一种或多种以上癌症的组合。
如本文所用，术语“化学治疗剂”是指可用于治疗癌症的化合物。在一个方面，化学治疗剂为抗代谢物。在一个方面，抗代谢物选自由以下项组成的组：氨基蝶呤、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨、巯基嘌呤、喷司他丁、硫鸟嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟尿苷和吉西他滨。在一个特定方面，抗代谢物为卡培他滨或吉西他滨。在另一方面，抗代谢物为氟尿嘧啶。在一个方面，化学治疗剂是影响微管形成的药剂。在一个方面，影响微管形成的药剂选自由以下项组成的组：紫杉醇、多西他赛、长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、泰素帝、依托泊苷和替尼泊苷。在另一方面，化学治疗剂为烷化剂诸如环磷酰胺。在一个方面，化学治疗剂为细胞毒性抗生素，诸如拓扑异构酶II抑制剂。在一个方面，拓扑异构酶II抑制剂为多柔比星。
本发明的双特异性抗原结合分子
本发明涉及包含经修饰的C-末端crossfab片段的双特异性抗原结合分子。这些双特异性抗原结合分子具有改进的特性。特别地，这些分子缺乏与抗药物抗体(ADA)反应的新表位，它们对先前存在的抗药物抗体(ADA)(特别是抗铰链自身抗体(AHA))具有降低的反应性或没有反应性。包含这种新抗FAP抗体的双特异性抗原结合分子具有特别有利的特性，诸如改进的安全窗。通过使用这些分子，可以向患者提供扩展的剂量范围，从而可以获得可能增强的功效。
如本文所述的双特异性抗原结合分子包含交叉fab片段，其中恒定结构域CH1和CL被彼此替换并且VH结构域的N-末端融合至Fc结构域亚基之一的C-末端。因此，如本文所述的双特异性抗原结合分子包含以部分铰链区终止的轻链VL-CH1。
在某些方面，如本文所述的双特异性抗原结合分子包含具有轻链VL-CH1的交叉fab片段，该轻链VL-CH1包含天然铰链区或经修饰的铰链区。天然铰链区是通常与抗体分子的CH1结构域缔合的铰链区。在某些方面，目前公开的双特异性抗原结合分子的天然铰链区可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。特别地，双特异性抗原结合分子是IgG1同型。在某些方面，交叉Fab片段是包含天然铰链区的IgG1同型。在某些方面，交叉Fab片段是包含天然铰链区的IgG4同型。经修饰的铰链区是长度和/或组成不同于天然铰链区的任何铰链。此类铰链可以包括来自其他物种的铰链区，诸如人、小鼠、大鼠、兔、猪、仓鼠、骆驼、美洲驼或山羊铰链区。其他经修饰的铰链区可包含源自与CH1结构域不同类别或亚类的抗体的完整铰链区。因此，例如，γ1类的CH1结构域可以连接至γ4类的铰链区。可替代地，经修饰的铰链区可包含天然铰链或重复单元的一部分，其中重复单元中的每个单元衍生自天然铰链区。
在某些方面，通过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基来改变天然铰链区以产生经修饰的铰链区。在某些方面，交叉Fab片段是包含经修饰的铰链区的IgG1同型。在某些方面，交叉Fab片段是包含经修饰的铰链区的IgG2同型。在某些方面，交叉Fab片段是包含经修饰的铰链区的IgG4同型。在某些方面，经修饰的铰链区包括上铰链区内一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在一个方面，所公开主题的经修饰的铰链区可以在根据Kabat Eu编号的216位至225位氨基酸处具有一个或多个取代、缺失和/或添加。
在一个方面，根据EU编号，221位处的氨基酸，即天冬氨酸，可以被改为丝氨酸(S)，例如D221S。在某些方面，本公开的双特异性抗原结合分子包含交叉Fab片段(包含取代D221S)。
在另一个方面，根据EU编号，221位处的氨基酸，即天冬氨酸，可以被改为甘氨酸(G)，例如D221G。在某些方面，本公开的双特异性抗原结合分子包含交叉Fab片段(包含取代D221G)。
在一个方面，根据EU编号，225位处的氨基酸，例如苏氨酸(T)，可以被改为亮氨酸(L)，例如T225L。.在某些方面，本公开的双特异性抗原结合分子包含交叉Fab片段(包含取代T225L)。
在一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段和第二Fab片段，和能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段，以及由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域，其中
(a)能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段在其C-末端处融合至第一Fc结构域亚基的N-末端，
(b)能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段在其C-末端处融合至第二Fc结构域亚基的N-末端，以及
(c)能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段为交叉fab片段，其中恒定结构域CH1和CL被彼此替换，并且VH结构域的N-末端融合至Fc结构域亚基之一的C-末端，并且其中交叉fab片段的轻链VL-CH1以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCS(SEQ IDNO:1)、EPKSCG(SEQ ID NO:2)、EPKSCD(SEQ ID NO:3)、EPKSCDK(SEQ ID NO:4)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:5)。
在一个特定方面，双特异性抗原结合分子包含交叉fab片段，其中恒定结构域CH1和CL被彼此替换并且VH结构域的N-末端融合至Fc结构域亚基之一的C-末端，并且其中交叉fab片段的轻链VL-CH1以EPKSCS(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列终止。在一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够与第二抗原特异性结合的交叉fab片段包含SEQ IDNO:158的氨基酸序列。
在另一个方面，双特异性抗原结合分子包含交叉fab片段，其中恒定结构域CH1和CL被彼此替换并且VH结构域的N-末端融合至Fc结构域亚基之一的C-末端，并且其中交叉fab片段的轻链VL-CH1以EPKSCG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列终止。在一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够与第二抗原特异性结合的交叉fab片段包含SEQ IDNO:159的氨基酸序列。
在进一步方面，双特异性抗原结合分子包含交叉fab片段，其中恒定结构域CH1和CL被彼此替换，并且VH结构域的N-末端融合至Fc结构域亚基之一的C-末端，并且其中交叉fab片段的轻链VL-CH1以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCD(SEQ ID NO:3)、EPKSCDK(SEQ ID NO:4)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:5)。在一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够与第二抗原特异性结合的交叉fab片段包含SEQ ID NO:160、SEQID NO:161或SEQ ID NO:162的氨基酸序列。
在一个特定方面，交叉fab片段以EPKSCD(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列终止。在一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够与第二抗原特异性结合的交叉fab片段包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列。在另一个方面，交叉fab片段以EPKSCDKTHL(SEQ IDNO:5)的氨基酸终止。在一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够与第二抗原特异性结合的交叉fab片段包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列。
在一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段和第二Fab片段，和能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段，以及由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域，其中该双特异性抗原结合分子包含
(a)两个重链，每个重链包含能够与第一抗原特异性结合和Fc区亚基的Fab片段的VH和CH1结构域，
(b)两个轻链，每个轻链包含能够与第一抗原特异性结合的Fab片段的VL和CL结构域，以及
(c)能够与第二抗原特异性结合的交叉fab片段，其包含VL-CH1链和VH-CL链，其中VH-CL链与(a)的两个重链之一的C-末端连接，并且其中交叉fab片段的轻链VL-CH1以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCS(SEQ ID NO:1)、EPKSCG(SEQ ID NO:2)、EPKSCD(SEQ ID NO:3)、EPKSCDK(SEQ ID NO:4)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:5)。
在一个方面，双特异性抗原结合分子与第一抗原二价结合并与第二抗原单价结合(2+1形式)。因此，在一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含能够与第一抗原特异性结合的两个Fab片段和一个能够与第二抗原特异性结合的交叉fab片段，该交叉fab片段包含VL-CH1链和VH-CL链，其中VH-CL链与(a)的两个重链之一的C-末端连接，并且其中交叉fab片段的轻链VL-CH1以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCS(SEQ IDNO:1)、EPKSCG(SEQ ID NO:2)、EPKSCD(SEQ ID NO:3)、EPKSCDK(SEQ ID NO:4)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:5)。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含能够特异性结合第一抗原的第一Fab片段和第二Fab片段，和能够特异性结合第二抗原的第三Fab片段，以及由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域，其中
(a)能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段在其C-末端处融合至第一Fc结构域亚基的N-末端，
(b)能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段在其C-末端处融合至第二Fc结构域亚基的N-末端，以及
(c)能够特异性结合第二抗原的第三Fab片段为交叉fab片段，其中恒定结构域CH1和CL被彼此替换，并且VH结构域的N-末端融合至Fc结构域亚基之一的C-末端，并且其中交叉fab片段的轻链VL-CH1以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCS(SEQ ID NO:1)、EPKSCG(SEQ ID NO:2)、EPKSCD(SEQ ID NO:3)、EPKSCDK(SEQ ID NO:4)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:5)，以及其中所述抗原结合分子包含能够与所述第一抗原特异性结合的第四Fab片段，其中所述第四Fab片段在VH-CH1链的C-末端处与能够与所述第一抗原特异性结合的所述第一Fab片段的VH-CH1链的N-末端融合。
因此，在一个方面，双特异性抗原结合分子与第一抗原三价结合并与第二抗原单价结合(3+1形式)。在一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中所述分子包含
(a)重链，其包含能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段的VH-CH1链、Fc区亚基、以及能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段的VH-CL链，VH-CH1链在其N-末端处融合至能够与第一抗原特异性结合的第四Fab片段的VH-CH1链，任选地经由肽接头，VH-CL链融合至Fc区亚基的C-末端，任选地经由肽接头，
(b)重链，其包含能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段的VH-CH1结构域和Fc区亚基，
(c)三个轻链，每个轻链包含能够与第一抗原特异性结合的Fab片段的VL和CL结构域，以及
(d)轻链，其包含能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段的VL和CH1结构域，该轻链以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止EPKSCS(SEQ ID NO:1)、EPKSCG(SEQ IDNO:2)、EPKSCD(SEQ ID NO:3)、EPKSCDK(SEQ ID NO:4)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:5)。
在一个进一步方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中所述分子包含
(a)重链，其包含能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段的VH-CH1链、Fc结构域亚基，VH-CH1链在其N-末端处融合至能够与第一抗原特异性结合的第四Fab片段的VH-CH1链，任选地经由肽接头，
(b)重链，其包含能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段的VH-CH1结构域和Fc区亚基、以及能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段的VH-CL链，VH-CL链融合至Fc区亚基的C-末端，任选地经由肽接头，
(c)三个轻链，每个轻链包含能够与第一抗原特异性结合的Fab片段的VL和CL结构域，以及
(d)轻链，其包含能够与第二抗原特异性结合的Fab片段的VL和CH1结构域，该轻链以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止EPKSCS(SEQ ID NO:1)、EPKSCG(SEQ ID NO:2)、EPKSCD(SEQ ID NO:3)、EPKSCDK(SEQ ID NO:4)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:5)。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含能够特异性结合第一抗原的第一Fab片段和第二Fab片段，和能够特异性结合第二抗原的第三Fab片段，以及由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域，其中
(a)能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段在其C-末端处融合至第一Fc结构域亚基的N-末端，
(b)能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段在其C-末端处融合至第二Fc结构域亚基的N-末端，以及
(c)能够特异性结合第二抗原的第三Fab片段为交叉fab片段，其中恒定结构域CH1和CL被彼此替换，并且VH结构域的N-末端融合至Fc结构域亚基之一的C-末端，并且其中交叉fab片段的轻链VL-CH1以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCS(SEQ ID NO:1)、EPKSCG(SEQ ID NO:2)、EPKSCD(SEQ ID NO:3)、EPKSCDK(SEQ ID NO:4)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:5)，以及其中抗原结合分子包含能够与第一抗原特异性结合的第四Fab片段和能够与第一抗原特异性结合的第五Fab片段，其中第四Fab片段在VH-CH1链的C-末端融合至能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段的VH-CH1链的N-末端，并且其中第五Fab片段在VH-CH1链的C-末端融合至能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段的VH-CH1链的N-末端。
因此，在一个方面，双特异性抗原结合分子与第一抗原四价结合并与第二抗原单价结合(4+1形式)。在一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中所述分子包含
(a)重链，其包含能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段的VH-CH1链、Fc区亚基、以及能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段的VH-CL链，VH-CH1链在其N-末端处融合至能够与第一抗原特异性结合的第四Fab片段的VH-CH1链，任选地经由肽接头，VH-CL链融合至Fc区亚基的C-末端，任选地经由肽接头，
(b)重链，其包含能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段的VH-CH1结构域、Fc区亚基，VH-CH1结构域在其N-末端处融合至能够与第一抗原特异性结合的第五Fab片段的VH-CH1链，任选地经由肽接头，
(c)三个轻链，每个轻链包含能够与第一抗原特异性结合的Fab片段的VL和CL结构域，以及
(d)轻链，其包含能够与第二抗原特异性结合的Fab片段的VL和CH1结构域，该轻链以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止EPKSCS(SEQ ID NO:1)、EPKSCG(SEQ ID NO:2)、EPKSCD(SEQ ID NO:3)、EPKSCDK(SEQ ID NO:4)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:5)。
在所有这些方面，Fc结构域优选地为IgG Fc结构域。特别地，Fc结构域为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。在一个特定方面，Fc区为IgG1Fc结构域。在一个特定方面，Fc结构域包含降低抗体与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。更具体地，Fc结构域属于人IgG1亚类，其具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU编号)。
在所有这些方面，Fc结构域由能够稳定缔合的第一和第二亚基组成，特别地，Fc结构域由能够稳定缔合的第一和第二亚基组成，其中根据杵臼结构方法Fc区的第一亚基包含杵并且Fc区的第二亚基包含臼。在一个特定方面，其中Fc区的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(根据Kabat EU编号)，并且Fc区的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU编号)。
示例性双特异性抗原结合分子
在一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段和第二Fab片段，和能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段，以及由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域；其中
(a)能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段在其C-末端处融合至第一Fc结构域亚基的N-末端；
(b)能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段在其C-末端处融合至第二Fc结构域亚基的N-末端；
(c)能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段为交叉fab片段，其中恒定结构域CH1和CL被彼此替换，并且VH结构域的N-末端融合至Fc结构域亚基之一的C-末端，并且其中crossfab片段的CH1结构域以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCS(SEQ IDNO:1)、EPKSCD(SEQ ID NO:2)、EPKSCDK(SEQ ID NO:3)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:4)，其中能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段是能够与靶细胞抗原特异性结合的交叉Fab片段。
在一个方面，靶细胞抗原是肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原或TAA是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，该靶细胞为例如肿瘤中的细胞(诸如癌细胞、肿瘤基质的细胞、恶性B淋巴细胞或黑色素瘤细胞)。在某些方面，靶细胞抗原为肿瘤细胞表面的抗原。在一个方面，TAA例如选自由以下项组成的组：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)、叶酸受体α(FolR1)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER2)、前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、HER2/neu、p95HER2、EpCAM、HER3、c-Met、CD30、肌腱蛋白C、TPBG(5T4)、CD19、CD79b、CD20、CD22、CD33、CD37、CD38、BCMA和GPRC5D。
在一个特定方面，靶细胞抗原为成纤维细胞活化蛋白(FAP)。
因此，在一个方面，提供了如前文所定义的双特异性抗原结合分子，其中第三Fab片段是能够与FAP特异性结合的交叉Fab片段，其中恒定结构域CH1和CL被彼此替换，并且VH结构域的N-末端融合至Fc结构域亚基之一的C-末端，并且其中crossfab片段的CH1结构域以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCS(SEQ ID NO:1)、EPKSCD(SEQ ID NO:2)、EPKSCDK(SEQ ID NO:3)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:4)。
在一个方面，提供了如上文所定义的双特异性抗原结合分子，其中能够与FAP特异性结合交叉Fab片段包含
(a)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；或者
(c)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在一个特定方面，提供了如上文所定义的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到FAP的交叉Fab片段包含：重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在另一方面，能够特异性结合到FAP的交叉Fab片段包含：重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQID NO:58的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
在一个进一步方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够与FAP特异性结合的交叉Fab片段包含
(i)重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
在一个方面，能够特异性结合到FAP的交叉Fab片段包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列。在另一方面，能够特异性结合到FAP的Fab片段包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQID NO:60的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段和第二Fab片段，和能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段，以及由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域；其中
(a)能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段在其C-末端处融合至第一Fc结构域亚基的N-末端；
(b)能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段在其C-末端处融合至第二Fc结构域亚基的N-末端；
(c)能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段为交叉fab片段，其中恒定结构域CH1和CL被彼此替换，并且VH结构域的N-末端融合至Fc结构域亚基之一的C-末端，并且其中crossfab片段的CH1结构域以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCS(SEQ IDNO:1)、EPKSCD(SEQ ID NO:2)、EPKSCDK(SEQ ID NO:3)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:4)，其中第一抗原是TNF受体。特别地，第一Fab片段和第二Fab片段能够与TNF受体激动性结合。在一方面，提供了双特异性抗原结合分子，其特征在于与TNF受体(TNFR)的靶向激动性结合。特别地，双特异性抗原结合分子是靶向针对FAP的TNFR激动剂。在另一特定方面，本发明的双特异性抗原结合分子包含由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成的Fc区，其包含降低效应子功能的突变。使用包含减少或消除效应子功能的突变的Fc区将通过经由Fc受体进行交联来防止非特异性激动作用，并防止TNFR表达细胞的ADCC。如本文所述的双特异性抗原结合分子拥有相比于能够与TNFR特异性结合的常规抗体的优势在于，它们选择性地诱导靶细胞(通常是接近肿瘤，即肿瘤基质中)上的免疫应答。
在一个方面，TNFR是OX40，意味着能够与第一抗原特异性结合的的Fab片段能够与TNF受体激动性结合、能够与OX40特异性结合，特别是人OX40。因此，它们与包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或由其组成的多肽结合。
在进一步方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够与OX40特异性结合的Fab片段包含
(a)重链可变区(VHOX40)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLOX40)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ IDNO:75的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHOX40)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLOX40)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ IDNO:83的氨基酸序列，或者
(c)重链可变区(VHOX40)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLOX40)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ IDNO:91的氨基酸序列；或者
(d)重链可变区(VHOX40)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLOX40)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ IDNO:99的氨基酸序列。
在一个方面，能够与OX40特异性结合的Fab片段包含：重链可变区(VHOX40)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLOX40)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列。在进一步方面，能够与OX40特异性结合的Fab片段包含：重链可变区(VHOX40)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ IDNO:78的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLOX40)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列。在另一方面，能够与OX40特异性结合的Fab片段包含：重链可变区(VHOX40)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLOX40)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列。在又一方面，能够与OX40特异性结合的Fab片段包含：重链可变区(VHOX40)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLOX40)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQID NO:98的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列。在一个特定方面，能够与OX40特异性结合的Fab片段包含：重链可变区(VHOX40)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLOX40)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
在一个方面，提供了如上文所定义的双特异性抗原结合分子，其中能够与OX40特异性结合的Fab片段包含
(i)重链可变区(VHOX40)，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLOX40)，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，或者
(ii)重链可变区(VHOX40)，其包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLOX40)，其包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列，或者
(iii)重链可变区(VHOX40)，其包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLOX40)，其包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列，或者
(iv)重链可变区(VHOX40)，其包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLOX40)，其包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列，或者
(v)重链可变区(VHOX40)，其包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLOX40)，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，或者
(vi)重链可变区(VHOX40)，其包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLOX40)，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，或者
(vii)重链可变区(VHOX40)，其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLOX40)，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
在一个方面，提供了如上文所定义的双特异性抗原结合分子，其中能够与OX40特异性结合的Fab片段包含：重链可变区(VHOX40)，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLOX40)，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。在另一方面，提供了如上文所定义的双特异性抗原结合分子，其中能够与OX40特异性结合的Fab片段包含：重链可变区(VHOX40)，其包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLOX40)，其包含SEQ IDNO:85的氨基酸序列。在进一步方面，提供了如上文所定义的双特异性抗原结合分子，其中能够与OX40特异性结合的Fab片段包含：重链可变区(VHOX40)，其包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLOX40)，其包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列。在又进一步方面，提供了如上文所定义的双特异性抗原结合分子，其中能够与OX40特异性结合的Fab片段包含：重链可变区(VHOX40)，其包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLOX40)，其包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列。在一个特定方面，能够与OX40特异性结合的Fab片段包含：重链可变区(VHOX40)，其包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLOX40)，其包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
在另一方面，提供了如上文所定义的双特异性抗原结合分子，其中能够与OX40特异性结合的Fab片段包含：重链可变区(VHOX40)，其包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLOX40)，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。在一个方面，能够与OX40特异性结合的Fab片段包含：重链可变区(VHOX40)，其包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLOX40)，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。在进一步方面，能够与OX40特异性结合的Fab片段包含：重链可变区(VHOX40)，其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLOX40)，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
在一个方面，TNFR是GITR，意味着能够与第一抗原特异性结合的Fab片段能够与TNF受体激动性结合、能够与GITR特异性结合，特别是人GITR。因此，它们与包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或由其组成的多肽结合。
在一个方面，提供了双特异性抗原结合分子，其中能够与GITR特异性结合的Fab片段包含：重链可变区(VHGITR)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLGITR)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ IDNO:112的氨基酸序列。
在一个方面，提供了如上文所定义的双特异性抗原结合分子，其中能够与GITR特异性结合的Fab片段包含：重链可变区(VHGITR)，其包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLGITR)，其包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。
与OX40和FAP结合的双特异性抗原结合分子
在一个方面，提供了双特异性抗原结合分子，其包含能够与OX40特异性结合的第一Fab片段和第二Fab片段，和能够与FAP特异性结合的第三Fab片段，以及由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域；其中
(a)能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段在其C-末端处融合至第一Fc结构域亚基的N-末端；
(b)能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段在其C-末端处融合至第二Fc结构域亚基的N-末端；
(c)能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段为交叉fab片段，其中恒定结构域CH1和CL被彼此替换，并且VH结构域的N-末端融合至Fc结构域亚基之一的C-末端，并且其中crossfab片段的CH1结构域以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCS(SEQ IDNO:1)、EPKSCD(SEQ ID NO:2)、EPKSCDK(SEQ ID NO:3)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:4)。
在一个方面，这些双特异性分子与OX40二价结合并与FAP单价结合。
在一个方面，提供了双特异性抗原结合分子，其包含(a)两个轻链，每个轻链包含与SEQ ID NO:135的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；一个轻链，其包含与SEQ ID NO:129的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第一重链，其包含与SEQ ID NO:134的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和第二重链，其包含与SEQ ID NO:140的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，或(b)两个轻链，每个轻链包含与SEQ ID NO:135的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；一个轻链，其包含与SEQ ID NO:142的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第一重链，其包含与SEQ ID NO:134的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和第二重链，其包含与SEQID NO:140的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，或(c)两个轻链，每个轻链包含与SEQ ID NO:135的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；一个轻链，其包含与SEQ ID NO:131的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第一重链，其包含与SEQ ID NO:134的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和第二重链，其包含与SEQ ID NO:140的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了双特异性抗原结合分子，其包含：(a)两个轻链，每个轻链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列，一个轻链，其包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列，第一重链，其包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列，和第二重链，其包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列；或(b)两个轻链，每个轻链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列，一个轻链，其包含SEQ IDNO:142的氨基酸序列，第一重链，其包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列，和第二重链，其包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列；或(c)两个轻链，每个轻链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列，一个轻链，其包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列，第一重链，其包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列，和第二重链，其包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列。
在另一方面，如上文所述的双特异性抗原结合分子与OX40三价结合并与FAP单价结合。
在一个方面，提供了双特异性抗原结合分子，其包含(a)第一重链，其包含与SEQID NO:132的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第二重链，其包含与SEQ ID NO:130的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；三个轻链，每个轻链包含与SEQ ID NO:128的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和轻链，其包含与SEQ ID NO:129的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，或(b)第一重链，其包含与SEQ ID NO:132的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第二重链，其包含与SEQ ID NO:130的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；三个轻链，每个轻链包含与SEQ ID NO:128的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和重链，其包含与SEQ ID NO:131的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，或(c)第一重链，其包含与SEQ ID NO:134的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第二重链，其包含与SEQ ID NO:136的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；三个轻链，每个轻链包含与SEQ ID NO:135的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和轻链，其包含与SEQID NO:129的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，或(d)第一重链，其包含与SEQ ID NO:134的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第二重链，其包含与SEQ ID NO:136的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；三个轻链，每个轻链包含与SEQ ID NO:135的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和轻链，其包含与SEQ ID NO:137的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，或(e)第一重链，其包含与SEQ ID NO:134的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第二重链，其包含与SEQ ID NO:136的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；三个轻链，每个轻链包含与SEQ ID NO:135的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和重链，其包含与SEQ ID NO:131的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，或
在一个方面，提供了双特异性抗原结合分子，其包含：(a)第一重链，其包含SEQ IDNO:132的氨基酸序列，第二重链，其包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列，三个轻链，每个轻链包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列，和轻链，其包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列；或(b)第一重链，其包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列，第二重链,其包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列，三个轻链，每个轻链包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列，和轻链，其包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列；或(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列，第二重链，其包含SEQID NO:136的氨基酸序列，三个轻链，每个轻链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列，和轻链，其包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列；或(d)第一重链，其包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列，第二重链，其包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列，三个轻链，每个轻链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列，和轻链，其包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列；或(e)第一重链，其包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列，第二重链，其包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列，三个轻链，每个轻链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列，和轻链，其包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。
在又一方面，如上文所述的双特异性抗原结合分子与OX40四价结合并与FAP单价结合。
在一个方面，提供了双特异性抗原结合分子，其包含(a)四个轻链，每个轻链包含与SEQ ID NO:128的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；一个轻链，其包含与SEQ ID NO:129的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第一重链，其包含与SEQ ID NO:127的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和第二重链，其包含与SEQ ID NO:130的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，或(b)四个轻链，每个轻链包含与SEQ ID NO:128的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；一个轻链，其包含与SEQ ID NO:131的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第一重链，其包含与SEQ ID NO:127的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和第二重链，其包含与SEQID NO:130的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，或(c)四个轻链，每个轻链包含与SEQ ID NO:119的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；一个轻链，其包含与SEQ ID NO:129的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第一重链，其包含与SEQ ID NO:151的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和第二重链，其包含与SEQ ID NO:152的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，或(d)四个轻链，每个轻链包含与SEQ ID NO:119的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；一个轻链，其包含与SEQ ID NO:131的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第一重链，其包含与SEQ ID NO:151的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和第二重链，其包含与SEQ ID NO:152的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个方面，提供了双特异性抗原结合分子，其包含：(a)四个轻链，每个轻链包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列，一个轻链，其包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列，第一重链，其包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列，和第二重链，其包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列；或(b)四个轻链，每个轻链包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列，一个轻链，其包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列，第一重链，其包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列，和第二重链，其包含SEQID NO:130的氨基酸序列；或(c)四个轻链，每个轻链包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列，一个轻链，其包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列，第一重链，其包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列，和第二重链，其包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列；或(d)四个轻链，每个轻链包含SEQID NO:119的氨基酸序列，一个轻链，其包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列，第一重链，其包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列，和第二重链，其包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列。
与GITR和FAP结合的双特异性抗原结合分子
在一个方面，提供了双特异性抗原结合分子，其包含能够与GITR特异性结合的第一Fab片段和第二Fab片段，和能够与FAP特异性结合的第三Fab片段，以及由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域；其中
(a)能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段在其C-末端处融合至第一Fc结构域亚基的N-末端；
(b)能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段在其C-末端处融合至第二Fc结构域亚基的N-末端；
(c)能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段为交叉fab片段，其中恒定结构域CH1和CL被彼此替换，并且VH结构域的N-末端融合至Fc结构域亚基之一的C-末端，并且其中crossfab片段的CH1结构域以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCS(SEQ IDNO:1)、EPKSCD(SEQ ID NO:2)、EPKSCDK(SEQ ID NO:3)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:4)。
在一个方面，这些双特异性分子与GITR二价结合并与FAP单价结合。
在一个方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
(a)两个轻链，每个轻链包含与SEQ ID NO:154的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；一个轻链，其包含与SEQ ID NO:156的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第一重链，其包含与SEQID NO:153的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和第二重链，其包含与SEQ ID NO:155的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，或
(b)两个轻链，每个轻链包含与SEQ ID NO:154的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；一个轻链，其包含与SEQ ID NO:157的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第一重链，其包含与SEQID NO:153的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和第二重链，其包含与SEQ ID NO:155的序列至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了双特异性抗原结合分子，其包含：(a)两个轻链，每个轻链包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列，一个轻链，其包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列，第一重链，其包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列，和第二重链，其包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列；或(b)两个轻链，每个轻链包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列，一个轻链，其包含SEQ IDNO:157的氨基酸序列，第一重链，其包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列，和第二重链，其包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列。
减少Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
本文所述的双特异性抗原结合分子进一步包含由能够稳定缔和的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域。
在某些方面，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的Fc结构域中，从而生成Fc结构域变体。Fc结构域变体可包含人Fc结构域序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc结构域)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如取代)。
Fc结构域为本发明的双特异性抗体赋予有利的药代动力学特性，包括有助于靶组织中的良好积聚的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，与此同时，可能导致本发明的双特异性抗体不期望地靶向表达Fc受体的细胞，而不是优选的抗原携带细胞。因此，在特定实施例中，与天然IgG Fc结构域，特别是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域相比，本发明的双特异性抗体的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。更具体地，Fc结构域是IgG1 Fc结构域。
在一个此类方面，与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)相比，该Fc结构域(或包含该Fc结构域的双特异性抗原结合分子)表现出对Fc受体的结合亲和力的小于50％、优选地少小20％、更优选地小于10％且最优选地小于5％；和/或与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)相比，该Fc结构域(或包含该Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出效应子功能的小于50％、优选地小于20％、更优选地小于10％且最优选地小于5％。在一个方面，Fc结构域(或包含该Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)不显著结合Fc受体和/或诱导效应子功能。在特定方面，Fc受体为Fcγ受体。在一个方面，Fc受体是人Fc受体。在一个方面，Fc受体是活化的Fc受体。在具体方面，Fc受体为活化的人Fcγ受体，更具体地为人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地为人FcγRIIIa。在一个方面，Fc受体是抑制性Fc受体。在具体方面，Fc受体是抑制性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIB。在一个方面，效应子功能是CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌中的一个或多个。在特定方面，效应子功能是ADCC。在一个方面，与天然IgG1 Fc结构域相比，Fc结构域表现出对新生儿Fc受体(FcRn)基本上类似的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70％、具体地大于约80％、更具体地大于约90％时，实现了与FcRn基本上类似的结合。
在特定方面，Fc结构域经过工程化改造，以与非工程化改造的Fc结构域相比具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在特定方面，本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。在一个方面，氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在另一方面，氨基酸突变将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在一个方面，与包含非工程化改造的Fc结构域的本发明的双特异性抗体相比，包含工程化改造的Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子表现出对Fc受体的结合亲和力的小于20％、具体地小于10％、更具体地小于5％。在特定方面，Fc受体是Fcγ受体。在其他方面，Fc受体是人Fc受体。在一个方面，Fc受体是抑制性Fc受体。在具体方面，Fc受体是抑制性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIB。在一些方面，Fc受体是活化的Fc受体。在具体方面，Fc受体为活化的人Fcγ受体，更具体地为人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地为人FcγRIIIa。优选地，与这些受体中的每一个的结合降低。在一些方面，对互补组分的结合亲和力，对C1q的特异性结合亲和力也降低。在一个方面，对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力不降低。当Fc结构域(或包含Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出Fc结构域的非工程化改造形式(或包含Fc结构域的非工程化改造形式的本发明的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现了基本上类似的与FcRn的结合，即实现了Fc结构域对该受体的结合亲和力的保留。Fc结构域或包含该Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子可表现出这种亲和力的大于约80％或甚至大于约90％。在某些实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域被工程化改造，以相比于非工程化改造的Fc结构域具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可以包括但不限于以下中的一个或多个：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导性细胞凋亡、降低的树突细胞成熟或减少的T细胞引发。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸中两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，以及Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在一个方面，Fc结构域在E233、L234、L235、N297、P331和P329位处包含氨基酸取代。在一些方面，Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(“LALA”)。在一个此类实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。在一个方面，Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代。在更具体方面，氨基酸取代是P329A或P329G，特别地是P329G。在一个实施例中，Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代并且包含选自由E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S组成的组的另外的氨基酸取代。在更特定的实施例中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”)。氨基酸取代的“P329GLALA”组合几乎完全消除人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体结合，如PCT专利申请号WO 2012/130831 A1中所述。所述文档还描述了制备此类突变Fc结构域的方法和用于确定其性质(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。此类抗体是具有突变L234A和L235A或具有突变L234A、L235A和P329G的IgG1(根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991的EU索引编号)。
在一个方面，Fc结构域为IgG4 Fc结构域。在更具体实施例中，Fc结构域是在S228位处(Kabat编号)包含氨基酸取代，具体地是氨基酸取代S228P的IgG4 Fc结构域。在更具体实施例中，Fc结构域是包含氨基酸取代L235E和S228P以及P329G的IgG4 Fc结构域。这种氨基酸取代减少IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人，Drug Metabolism andDisposition 38，84-91(2010))。
具有延长的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)结合、负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer，R.L.等人，J.Immunol.117(1976)587-593，以及Kim，J.K.等人，J.Immunol.24(1994)2429-2434)的抗体描述于US2005/0014934中。那些抗体包含这样的Fc区，所述Fc区中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一处或多处具有取代的Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。关于Fc区变体的其他示例，还参见Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；以及WO 94/29351。
与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。本文描述了合适的此类结合测定。替代地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来评估Fc结构域或包含Fc结构域的细胞活化双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。Fc结构域的效应子功能，或本发明的包含Fc结构域的双特异性抗原结合分子，可以通过本领域已知的方法来测量。本文描述了用于测量ADCC的合适的测定法。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的其他示例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)。另选地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
Figure BDA0003872289030000651
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定感兴趣的分子的ADCC活性。
以下部分描述了包含降低Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰的本发明的双特异性抗原结合分子的优选方面。在一个方面，本发明涉及双特异性抗原结合分子，其包含能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段和第二Fab片段，和能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段，以及由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域；其中
(a)能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段在其C-末端处融合至第一Fc结构域亚基的N-末端；
(b)能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段在其C-末端处融合至第二Fc结构域亚基的N-末端；
(c)能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段为交叉fab片段，其中恒定结构域CH1和CL被彼此替换，并且VH结构域的N-末端融合至Fc结构域亚基之一的C-末端，并且其中crossfab片段的CH1结构域以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCS(SEQ IDNO:1)、EPKSCD(SEQ ID NO:2)、EPKSCDK(SEQ ID NO:3)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:4)，其中第一抗原是TNF受体，并且其中Fc结构域包含一个或多个降低效应子功能的氨基酸取代。在特定方面，Fc结构域属于人IgG1亚类，其具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据KabatEU索引编号)。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
本文所述的双特异性抗原结合分子包含与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同抗原结合位点，因此该Fc结构域的两个亚基可包含在两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高本发明的双特异性抗原结合分子的产率和纯度，因此在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰将是有利的。
因此，在特定方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含能够特异性结合第一抗原的第一Fab片段和第二Fab片段，和能够特异性结合第二抗原的第三Fab片段，以及由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域；其中
(a)能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段在其C-末端处融合至第一Fc结构域亚基的N-末端；
(b)能够与第一抗原特异性结合的第二Fab片段在其C-末端处融合至第二Fc结构域亚基的N-末端；
(c)能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段为交叉fab片段，其中恒定结构域CH1和CL被彼此替换，并且VH结构域的N-末端融合至Fc结构域亚基之一的C-末端，并且其中crossfab片段的CH1结构域以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCS(SEQ IDNO:1)、EPKSCD(SEQ ID NO:2)、EPKSCDK(SEQ ID NO:3)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:4)，其中第一抗原是TNF受体，并且其中Fc结构域包含一个或多个降低效应子功能的氨基酸取代，其中Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基缔和的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个方面，所述修饰在Fc结构域的CH3结构域中。
在具体方面，所述修饰是所谓的“杵臼”修饰，所述修饰包括Fc结构域的两个亚基中的一个中的“杵”修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个中的“臼”修饰。因此，本发明涉及双特异性抗原结合分子，其包含：(a)至少两个能够与OX40特异性结合的抗原结合结构域，(b)能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，以及(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域，其中根据杵臼结构方法，Fc结构域的第一亚基包含杵并且Fc结构域的第二亚基包含臼。在特定方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(EU编号)而Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。一般来讲，该方法涉及在第一多肽的界面处引入凸起(“杵”)并且在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得所述凸起可以定位在所述空腔中，以便促进异源二聚体的形成并且阻碍同源二聚体的形成。凸起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与凸起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在一个方面，在本文所述的双特异性抗原结合分子的Fc结构域的所述第一亚基的所述CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第一亚基的所述CH3结构域内产生杵，所述杵可定位在所述第二亚基的所述CH3结构域内的空腔中，并且在所述Fc结构域的所述第二亚基的所述CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第二亚基的所述CH3结构域内产生空腔，所述第一亚基的所述CH3结构域内的所述杵可定位在所述空腔内。凸起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸(例如通过位点特异性诱变或通过肽合成)来制备。在具体方面，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，366位处的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)取代，而在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，407位处的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)取代。在一个方面中，另外在Fc结构域的第二亚基中，366位处的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)取代，并且368位处的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)取代。
在另一个方面，另外在Fc结构域的第一亚基中，354位处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)取代，并且另外在Fc结构域的第二亚基中，349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)取代。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定该二聚体(Carter(2001),J Immunol Methods 248,7-15)。在特定方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(EU编号)而Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在替代方面，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如在PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。
如本文报道的双特异性抗原结合分子的重链的C-末端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C-末端。重链的C-末端可以是缩短的C-末端，在所述缩短的C-末端中已经去除了一个或两个C-末端氨基酸残基。在一个优选的方面，重链的C-末端是以PG结束的缩短的C-末端。在本文报道的所有方面中的一个方面，如本文所指定的包含含有C-末端CH3结构域的重链的双特异性抗体，包含C-末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。在本文报道的所有方面的一个方面中，如本文所指定的包含含有C-末端CH3结构域的重链的双特异性抗体，包含C-末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)。
Fab结构域中的修饰
在一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含能够特异性结合第一抗原的第一Fab片段和第二Fab片段，和能够特异性结合第二抗原的第三Fab片段，以及由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域，其中
(a)能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段在其C-末端处融合至第一Fc结构域亚基的N-末端；
(b)能够与第一抗原特异性结合的所述第二Fab片段在其C-末端处融合至第二Fc结构域亚基的N-末端；
(c)能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段为交叉fab片段，其中恒定结构域CH1和CL被彼此替换，并且VH结构域的N-末端融合至Fc结构域亚基之一的C-末端，并且其中crossfab片段的CH1结构域以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCS(SEQ IDNO:1)、EPKSCD(SEQ ID NO:2)、EPKSCDK(SEQ ID NO:3)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:4)。因此，在一个方面，本发明包含双特异性抗原结合分子，其包含(a)包含能够与第一抗原特异性结合和Fc区的两个Fab片段的抗体的两个轻链和两个重链，和(b)能够与第二抗原特异性结合的交叉Fab片段，该第二抗原融合至Fc区的一个亚基的C-末端。根据Crossmab技术制备双特异性抗原结合分子。
WO2009/080252和Schaefer,W.等人(PNAS,108(2011)11187-1191)详细描述了在一个结合臂中具有结构域置换/交换的多特异性抗体(CrossMab VH-VL或CrossMab CH-CL)。它们明显减少了由抗第一抗原的轻链与抗第二抗原的错误重链的错配导致的副产物(与没有此类结构域交换的方法相比)。
在另一方面，并进一步改善正确的配对，双特异性抗原结合分子可能含有不同的带电荷的氨基酸取代(所谓的“带电荷的残基”)，其包含(a)能够与第一抗原特异性结合的至少两个Fab片段，(b)能够与靶细胞抗原特异性结合的crossFab片段，以及(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域，可包含带有不同电荷的氨基酸取代(所谓“带电残基”)。将这些修饰引入交叉或非交叉的CH1和CL结构域中。在特定方面，本发明涉及双特异性抗原结合分子，其中在CL结构域之一中，123位(EU编号)处的氨基酸已被精氨酸(R)取代和/或其中124位(EU编号)处的氨基酸已被赖氨酸(K)取代；并且其中在CH1结构域之一中，147位(EU编号)和/或213位(EU编号)处的氨基酸已被谷氨酸(E)取代。
多核苷酸
本发明进一步提供了编码如本文所述的双特异性抗原结合分子或其片段的分离的核酸。
编码本文公开的双特异性抗原结合分子的分离的多核苷酸可以表达为编码完整抗原结合分子的单个多核苷酸，或表达为共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他手段缔合以形成功能性抗原结合分子。例如，免疫球蛋白的轻链部分可以由来自免疫球蛋白的重链部分的单独多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成免疫球蛋白。
在一些方面中，分离的多核苷酸编码如本文所述的包含在根据本发明的双特异性分子中的多肽。
在某些实施例中，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施例中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
本发明的双特异性抗原结合分子可通过例如重组生产获得。对于重组生产，提供了一种或多种编码双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸。将一种或多种编码双特异性抗原结合分子的多核苷酸分离并插入至一种或多种载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。在本发明的一个方面，提供了一种载体，优选为表达载体，该载体包含本发明的多核苷酸中的一种或多种多核苷酸。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有双特异性抗原结合分子(片段)的编码序列以及适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如以下文献所述的技术：Maniatis等人，MOLECULARCLONING:ALABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1989)；和Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene Publishing Associates andWiley Interscience，N.Y.(1989)。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至所述表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，所述异源编码区与编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的基因模板的能力，则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。
本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔a珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合，所述附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果需要分泌双特异性抗原结合分子或其多肽片段，可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明的本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的核酸的上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与所述多肽的N-末端融合的信号肽，所述信号肽被从翻译的多肽上切割下来以产生所述多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施例中，使用天然信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或保留指导与其可操作地缔合的多肽分泌的能力的该序列的功能性衍生物。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。
DNA编码可用于促进后续纯化的短蛋白序列(例如组氨酸标签)或帮助标记融合蛋白的DNA可包含在编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。
在本发明的进一步方面，提供了包含一种或多种本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些方面，提供了包含一种或多种本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个方面，宿主细胞包含(例如，已转化或转染)载体，该载体包含编码本发明的双特异性抗原结合分子(的一部分)的多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化改造以产生本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)和Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。
用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如在Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中所述)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所述)、MRC 5细胞，以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编辑，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。用于在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。可以对表达包含免疫球蛋白的重链或轻链的多肽的细胞进行工程化改造，以便也表达另一条免疫球蛋白链，使得表达的产物为具有重链和轻链的免疫球蛋白。
在一个方面，提供了一种生产本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的方法，其中所述方法包括在适于表达本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的条件下培养包含编码如本文提供的本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段多核苷酸的宿主细胞，以及从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段。
如本文所述制备的本发明的双特异性分子可通过本领域已知的技术纯化，这些技术为诸如高效液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶电泳法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱法纯化，可以使用双特异性抗原结合分子结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明融合蛋白的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实例中所述，可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离抗原结合分子。双特异性抗原结合分子或其片段的纯度可以通过各种熟知的分析方法中任一者来确定，所述熟知的分析方法包括凝胶电泳法、高压液相色谱法等。例如，实例中所述的表达的双特异性抗原结合分子被显示为得到完整并且适当组装，如还原和非还原SDS-PAGE所示。
测定
本文提供的抗原结合分子可以通过本领域已知的各种测定来表征其结合特性和/或生物学活性。特别地，它们的特征在于实例中更详细描述的测定。
1.结合测定
可以例如通过使用表达人成纤维细胞活化蛋白(FAP)的鼠成纤维细胞系和流式细胞术(FACS)分析来评估本文提供的双特异性抗原结合分子与相应靶标表达细胞的结合。如实例2.1或4.2.2中所述，可以通过使用活化的人PBMC细胞来确定本文提供的双特异性抗原结合分子与OX40或GITR的结合。
2.活性测定
测试本发明的双特异性抗原结合分子的生物学活性。生物学活性可以包括双特异性抗原结合分子的功效和特异性。通过与靶抗原结合后OX40受体的激动性信号传导的测定证明了其功效和特异性。此外，如实例3.1中所述，OX40信号传导的刺激通过在人OX40阳性NFκB报告细胞中诱导的NFκB活化来测量。如实例4.3中所述，GITR信号传导的刺激也通过NFκB-Jurkat报告细胞测定来测量。用于评估先前存在的抗药物抗体(ADA)反应性的测定在实例5中进行了描述。
药物组合物、制剂和施用途径
在进一步方面，本发明提供了包含本文提供的双特异性抗原结合分子中任一者的药物组合物，其例如用于以下治疗方法中的任一者中。在一个方面，药物组合物包含本文所提供的双特异性抗原结合分子中的任何一者以及至少一种药用赋形剂。在另一方面，药物组合物包含本文提供的双特异性抗原结合分子中任一者以及如下文所述的至少一种附加治疗剂。
本发明的药物组合物包含溶于或分散于药用载体中的一种或多种双特异性抗原结合分子治疗有效量。术语“药学上或药理学上可接受的”是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。含有根据本发明所述的至少一种双特异性抗原结合分子和任选地附加活性成分的药物组合物的制备将是鉴于本公开而为本领域的技术人员已知的，如Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company，1990)所例示，所述文献以引用方式并入本文。具体地，组合物为冻干制剂或水溶液。如本文所用，“药用赋形剂”包括任何和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、盐、稳定剂及它们的组合，如对本领域的普通技术人员所知。
肠胃外组合物包括设计用于注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)的那些组合物。为了注射，可在水溶液中配制本发明的双特异性抗原结合分子，优选在生理相容性缓冲剂诸如Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水中配制。溶液可含有配制剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。另选地，双特异性抗原结合分子可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)构建。根据需要，通过将本发明的抗原结合分子以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中，来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，所述真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白的安全水平保持最低。合适的药用赋形剂包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或包埋在粗乳液中。此类技术在Remington'sPharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。
除了先前描述的组合物之外，抗原结合分子也可以冻干或配制成长效制备物。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，融合蛋白可以用合适的聚合或疏水材料(例如配制成可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物(例如配制成微溶盐)。
包含本发明的双特异性抗原结合分子的药物组合物可通过常规的混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干工艺进行生产。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，所述载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制备物。合适的制剂取决于所选择的施用途径。
本文所述的双特异性抗原结合分子可以配制成以游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本上保留游离酸或游离碱的生物活性的盐。这些药用盐包括酸加成盐，例如用蛋白质性质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或用无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。
组合物还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
治疗方法和组合物
本文提供的双特异性抗原结合分子中任一者可用于治疗方法中。为了用于治疗方法中，本发明的双特异性抗原结合分子可按照符合良好医学实践的方式配制、投配和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。
在一个方面，将本发明的双特异性抗原结合分子提供为用作药物。
在进一步方面，提供了本文所述的双特异性抗原结合分子，其用于(i)诱导免疫刺激，(ii)刺激肿瘤特异性T细胞应答，(iii)引起肿瘤细胞凋亡，(iv)治疗癌症，(v)延迟癌症进展，(vi)延长癌症患者的生存期，(vii)治疗感染。在特定方面，提供了用于治疗疾病特别是用于治疗癌症的双特异性抗原结合分子。
在某些方面，提供了用于治疗方法中的如本文所定义的双特异性抗原结合分子。在一个方面，提供了如本文所述的双特异性抗原结合分子，其用于治疗有此需要的个体的疾病。在某些方面，本发明提供了一种用于治疗患有疾病的个体的方法中的双特异性抗原结合分子，该方法包括向个体施用治疗有效量的双特异性抗原结合分子。在某些方面，待治疗的疾病是癌症。需要治疗的受试者、患者或“个体”通常是哺乳动物，更特别地是人。
在一个方面，提供了一种方法，其用于i)诱导免疫刺激，(ii)刺激肿瘤特异性T细胞应答，(iii)引起肿瘤细胞凋亡，(iv)治疗癌症，(v)延迟癌症进展，(vi)延长癌症患者的生存期或(vii)治疗感染，其中该方法包括向有此需要的个体施用治疗有效量的如本文所述的双特异性抗原结合分子。
在进一步方面，提供了如本文公开的双特异性抗原结合分子用于在制造或制备用于治疗有此需要的个体的疾病的药物中的用途。在一个方面，药物用于治疗疾病的方法中，该方法包括向具有所述疾病的个体施用治疗有效量的所述药物。在某些方面中，待治疗的疾病是增殖性疾患，特别是癌症。癌症的示例包括但不限于膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌以及肾癌。癌症的其他示例包括恶性肿瘤、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。可以使用本发明的双特异性抗原结合分子或抗体治疗的其他细胞增殖疾患包括但不限于位于以下部位中的肿瘤：腹部、骨骼、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头颈部、神经系统(中枢神经系统和外周神经系统)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部以及泌尿生殖系统。还包括癌前病症或病变和癌症转移。在某些实施例中，癌症选自由以下项组成的组：肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌。本领域的技术人员易于认识到，在许多情况下，本发明的双特异性抗原结合分子或抗体可能无法治愈，但可能提供益处。在一些方面，具有某些益处的生理变化也被视为具有治疗益处。因此，在一些方面，提供生理变化的本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的量被视为“有效量”或“治疗有效量”。
为了预防或治疗疾病，本发明的双特异性抗原结合分子的适当剂量(当单独使用或与一种或多种附加治疗剂联合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用途径、患者体重、具体分子、疾病的严重程度和进程、本发明的双特异性抗原结合分子是出于预防还是治疗目的施用、先前或同时进行的治疗性干预、患者的临床病史和对双特异性抗原结合分子的应答以及主治医师的酌处权。在任何情况下，负责施用的执业者将针对个体受试者来确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量。本文考虑了各种给药时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
如本文公开的双特异性抗原结合分子将通常以有效实现预期目的量使用。为用于治疗或预防病症，将本发明的双特异性抗原结合分子或其药物组合物以治疗有效量施用或施加。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。对于全身施用，最初可以根据体外测定(诸如细胞培养测定)来估计治疗有效剂量。可以随后在动物模型中配制剂量，以实现包括如在细胞培养中测定的IC50循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人类的有用剂量。还可以使用本领域熟知的技术来根据体内数据(例如动物模型)估计初始剂量。本领域的普通技术人员可以基于动物数据来容易地优化对人的施用。
剂量和间隔可以单独地调节，以提供足以维持疗效的本发明的双特异性抗原结合分子的血浆水平。通过施用多个剂量可以实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC来测量血浆中的水平。在局部施用或选择性摄入的情况下，本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域的技术人员将能够在无需过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文所述的治疗有效剂量的双特异性抗原结合分子通常将提供治疗益处而不会引起显著的毒性。融合蛋白的毒性和治疗功效可通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序来测定。细胞培养测定和动物研究可以用于测定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，所述治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的双特异性抗原结合分子是优选的。在一个方面，双特异性抗原结合分子表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选在包括毒性很小或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可以取决于多种因素而在该范围内变化，所述多种因素为例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的病症等。确切的配方、施用途径和剂量可以由个别医生根据患者的病症来选择(参见例如Fingl等人，1975，在：The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第1章，第1页中，该文献的全部内容以引用方式并入本文中)。
用本发明的融合蛋白治疗的患者的主治医师将知道如何以及何时由于毒性、器官功能障碍等终止、中断或调节施用。相反地，如果临床应答不充分(排除毒性)，则主治医师也会知道将治疗调整到更高水平。在目标病症的管理中施用的剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、施用途径等而变化。例如，可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重性。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和应答而变化。
制品
在本发明的另一个方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的物质。该制品包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页(package insert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋，等等。所述容器可以由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。容器容纳组合物，该组合物单独或与另一种有效用于治疗、预防和/或诊断所述病症的组合物组合，并且容器可具有无菌入口(例如容器可以是静脉注射溶液袋或具有可用皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是如本文所述的双特异性抗原结合分子。
标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包括(a)第一容器，所述第一容器中含有包含如本文所述的双特异性抗原结合分子的组合物；以及(b)第二容器，所述第二容器中含有包含进一步的细胞毒性剂或其他治疗剂组合物。本发明该实施例中的制品还可包含包装插页，该包装插页指示组合物可用于治疗特定病症。
可替代地或另外地，所述制品还可包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包括药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。所述药盒可以还包括从商业和用户的角度所需的其他物质，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
表B(序列)：
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实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施方案。
重组DNA技术
使用标准方法来操纵DNA，如在Sambrook等人，Molecular cloning:Alaboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下参考文献中给出：Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第五版，NIH公开号91-3242。
DNA测序
通过双链测序确定DNA序列。
基因合成
通过使用适当模板进行PCR生成所需的基因区段，或由Geneart AG(Regensburg，Germany)通过自动化基因合成从合成寡核苷酸和PCR产物合成所需的基因区段。在确切的基因序列不可用的情况下，基于最接近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并且通过RT-PCR从来源于合适的组织的RNA中分离出基因。将侧接有单个限制性内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化出质粒DNA，并通过紫外光谱法确定浓度。通过DNA测序来确认亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有合适限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计有5’端DNA序列，该序列编码前导肽，该前导肽靶向真核细胞分泌的蛋白。
蛋白质纯化
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，将抗体施加至蛋白质A琼脂糖柱(GE healthcare)并用PBS洗涤。在pH 3.0下实现抗体的洗脱，之后立即中和样品。通过离子交换色谱法(Poros XS)使用平衡缓冲液(20mM His、pH 5.5、1.47mS/cm)和洗脱缓冲液(20mM His、500mM NaCl、pH 5.5、49.1mS/cm)(梯度：至60CV中的100％洗脱缓冲液)将聚集蛋白与单体抗体分离。在某些情况下，随后在PBS或20mM组氨酸、140mM NaClpH 6.0中进行尺寸排阻色谱(Superdex 200，GE Healthcare)。将单体抗体级分合并，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩器浓缩(若需要)，冷冻并储存在-20℃或-80℃下。提供样品的部分以例如通过SDS-PAGE、尺寸排阻色谱(SEC)或质谱法来进行后续的蛋白质分析和分析表征。
SDS-PAGE
根据制造商的说明使用
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预制凝胶系统(Invitrogen)。具体地，使用10％或4-12％
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Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和
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MES(还原凝胶，具有
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抗氧化剂电泳缓冲添加剂)或MOPS(非还原凝胶)电泳缓冲液。
CE-SDS
通过CE-SDS使用微流控Labchip技术分析双特异性和对照抗体的纯度、抗体完整性和分子量(Caliper Life Science，USA)。使用HT Protein Express试剂盒根据制造商的说明制备5μl蛋白溶液用于CE-SDS分析，并使用HT Protein Express芯片在LabChip GXII系统上进行分析。使用LabChip GX软件3.0.618.0版分析数据。
分析型尺寸排阻色谱
使用BioSuite 250 5μm.7.8x300分析尺寸排阻柱(Tosoh)在200mM K-Phosophat250mM KCl pH 6.2运行缓冲液中在25℃分析分子的聚集体含量。
质谱
本节描述了对具有VH/VL或CH/CL交换(CrossMab)的多特异性抗体的表征，重点在于所述多特异性抗体的正确组装。通过对脱糖基化的完整CrossMab和脱糖基化/FabALACTICA或者另选地脱糖基化/GingisKHAN消化的CrossMab进行电喷雾电离质谱法(ESI-MS)，来分析预期的一级结构。
在37℃下以1mg/ml的蛋白质浓度将CrossMab用磷酸盐或Tris缓冲液中的N-糖苷酶F脱糖基化至多17小时。FabALACTICA或GingisKHAN(Genovis AB；瑞典)消化是在供应商供应的缓冲液中进行，该缓冲液中含有100μg去糖基化的CrossMab。在质谱分析之前，将样品经由HPLC在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上脱盐。在配备有TriVersa NanoMate源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS系统(Bruker Daltonik)上经由ESI-MS来测定总质量。
实例1
双特异性抗原结合分子靶向OX40和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的产生和生产
1.1靶向OX40和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗原结合分子的产生
在合适的表达质粒中，在具有相应恒定的人IgG1重链或轻链的框架中克隆编码抗OX40抗体(WO 2017/055398 A2中描述的克隆49B4、8H9和CLC563，或WO 2015/153513 A1中描述的MOXR0916)以及抗FAP抗体1G1a(如WO 2020/070041 A1中描述的克隆212)或4B9(如WO 2012/020006 A1中描述的)的可变重链和轻链结构域的cDNA。重链和轻链的表达由嵌合MPSV启动子驱动，该启动子由MPSV核心启动子和CMV增强子元件组成。表达盒在cDNA的3′末端还含有合成的polyA信号。此外，质粒载体具备复制起点(EBV OriP)，用于质粒的附加体维持。
以2+1、3+1和4+1形式制备双特异性OX40-FAP抗体，该形式由两个、三个或四个OX40结合部分与Fc的C-末端处的一个FAP结合臂组合而成(图1A至图1c)。为了产生2+1、3+1和4+1抗原结合分子，使用杵臼结构技术已实现异源二聚化。将S354C/T366W突变引入第一重链HC1(Fc杵重链)，并且将Y349C/T366S/L368A/Y407V突变引入第二重链HC2(Fc臼重链)。在2+1、3+1和4+1抗原结合分子中，如WO 2010/145792 A1中所描述的CrossMab技术确保了正确的轻链配对。独立于双特异性形式，在所有情况下，根据WO 2012/130831 A1中所述的方法使用效应子沉默Fc结构域(P329G；L234A，L235A)消除与Fcγ受体的结合。双特异性分子的序列示出于下表1中。
所有基因在嵌合MPSV启动子的控制下瞬时表达，所述启动子由MPSV核心启动子与CMV启动子增强子片段组合而成。表达载体还含有用于在含有EBNA(爱泼斯坦巴尔病毒核抗原)的宿主细胞中游离复制的oriP区域。
表1：双特异性抗原结合分子的氨基酸序列
Figure BDA0003872289030001011
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1.2靶向FAP和OX40的双特异性抗原结合分子的产生
这些分子是通过使用聚乙烯亚胺(PEI)将悬浮生长的HEK293-EBNA细胞与哺乳动物表达载体共转染或使用eviFECT(Evitria AG,Switzerland)将悬浮生长的CHO K1细胞与哺乳动物表达共转染来产生的。用相应的表达载体转染细胞。
通过与编码4种不同肽链的表达载体悬浮生长的HEK细胞的瞬时转染来表达抗体构建体。根据细胞供应商的说明，使用抗体载体的Maxiprep(Macherey-Nagel)制剂、Expi293FTM表达培养基(GibcoTM)、ExpiFectamineTM293试剂(GibcoTM)和初始细胞密度为2-3百万个活细胞/ml，在
Figure BDA0003872289030001382
1x还原血清培养基
Figure BDA0003872289030001383
中进行Expi293FTM细胞(GibcoTM)的转染。转染后一天(第1天，转染后18-22小时)，将ExpiFectamineTM293Transfection Enhancer 1和ExpiFectamineTM293TransfectionEnhancer 2添加到转染的培养物中。将转染的培养物在37℃下在8％CO2的湿润气氛中震荡孵育。在摇瓶或搅拌的发酵罐中培养7天后，通过以3000-5000g离心20-30分钟收集细胞培养上清液，并且通过0.22μm过滤器过滤。
为了在CHO K1细胞中生产，CHO K1细胞在eviGrow培养基(Evitria AG，Switzerland)(一种化学成分明确、不含动物成分、无血清的培养基)中生长，并用eviFect(Evitria AG,Switzerland)转染。转染后，将细胞在eviMake(Evitria AG，Switzerland)(一种化学成分确定、无动物成分、无血清的培养基)中，在37℃和5％CO2下保存7天。7天后，通过在Rotanta 460RC中以最大速度离心45分钟收集培养上清液用于纯化。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)并保存在4℃。培养基中分子的浓度通过蛋白A-HPLC或蛋白A-生物膜层干涉仪(BLI)确定。
使用MabSelectSure-SepharoseTM(GE Healthcare，Sweden)色谱通过亲和色谱从细胞培养上清液中纯化抗体。简而言之，将无菌过滤的细胞培养上清液捕获在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelect SuRe树脂上，用平衡缓冲液洗涤并用100mM乙酸钠(pH 3.0)洗脱。用1M Tris(pH 9.0)中和后，通过离子交换色谱法(Poros XS)使用平衡缓冲液(20mM His、pH 5.5、1.47mS/cm)和洗脱缓冲液(20mM His、500mM NaCl、pH 5.5、49.1mS/cm)(梯度：至60CV中的100％洗脱缓冲液)将聚集蛋白与单体抗体种类分离。在某些情况下，随后在20mM组氨酸、140mM NaCl、pH 6.0中进行尺寸排阻色谱(Superdex 200，GE Healthcare)。将单体蛋白级分合并，若需要，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30KD MWCO)离心浓缩器浓缩。纯化的蛋白质储存在-80℃。使用Nanodrop分光光度计进行蛋白质定量，并在变性和还原条件下通过CE-SDS和分析SEC进行分析。使用样品等分试样例如通过CE-SDS、尺寸排阻色谱法、质谱法和内毒素测定法用于后续的分析表征。
在存在和不存在还原剂的情况下，通过CE-SDS分析来分析最终纯化步骤之后的双特异性抗原结合分子的纯度和分子量。根据制造商的说明使用Caliper LabChip GXII系统(Caliper Lifescience)。
使用TSKgel G3000 SW XL分析尺寸排阻柱(Tosoh)，在25mM磷酸钾、125mM氯化钠、200mM左旋精氨酸单氢氯化物、0.02％(w/v)NaN3、pH 6.7运行缓冲液中在25℃下分析双特异性抗原结合分子的总含量。
表2：双特异性OX40抗原结合分子的生产产量和质量
Figure BDA0003872289030001401
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1.3靶向OX40和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗原结合分子的进一步产生-电荷块变体
与实例1.1类似，已经制备了4+1双特异性形式的不同变体，其由四个OX40结合部分与在Fc结构域的C-末端处的一个FAP结合crossfab组合而成。在所有这些构建体中，抗OX40抗体的可变重链和轻链结构域对应于WO 2017/055398 A2中描述的OX40克隆49B4。实例1中描述FAP抗体1G1a的产生和制备。为了产生4+1抗原结合分子，使用杵臼结构技术已实现异源二聚化。将S354C/T366W突变引入第一重链HC1(Fc杵重链)，并且将Y349C/T366S/L368A/Y407V突变引入第二重链HC2(Fc臼重链)。此外，如WO 2010/145792 A1中所描述的CrossMab技术确保了正确的轻链配对。独立于双特异性形式，在所有情况下，根据WO 2012/130831 A1中所述的方法使用效应子沉默Fc(P329G；L234A，L235A)消除与Fcγ受体的结合。双特异性抗原结合分子的氨基酸序列如表3所示
所有基因在嵌合MPSV启动子的控制下瞬时表达，所述启动子由与CMV启动子增强子片段组合的MPSV核心启动子组成。表达载体还含有用于在含有EBNA(爱泼斯坦巴尔病毒核抗原)的宿主细胞中游离复制的oriP区域。
表3：双特异性抗原结合分子的氨基酸序列
Figure BDA0003872289030001421
Figure BDA0003872289030001431
Figure BDA0003872289030001441
Figure BDA0003872289030001451
Figure BDA0003872289030001461
Figure BDA0003872289030001471
Figure BDA0003872289030001481
Figure BDA0003872289030001491
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1.4靶向FAP和OX40的双特异性抗原结合分子的产生(电荷块变体)
通过与编码4种不同肽链的表达载体悬浮生长的HEK细胞的瞬时转染来表达抗体。根据细胞供应商的说明，使用抗体载体的MaxiPREP(Qiagen)制剂，FreestyleTM F17培养基(Invitrogen，USA)，
Figure BDA0003872289030001512
转染试剂(Polyscience Europe GmbH)和初始细胞密度为1-2百万活细胞/ml，在不含血清的FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen)中，进行到HEK293-F细胞(Invitrogen)中的转染。在摇瓶或搅拌的发酵罐中培养7天后，通过以14000xg离心30分钟收集细胞培养上清液，并且通过0.22μm过滤器过滤。
使用MabSelectSure-SepharoseTM(GE Healthcare，Sweden)色谱通过亲和色谱从细胞培养上清液中纯化抗体。简而言之，将无菌过滤的细胞培养上清液捕获在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelectSure树脂上，用平衡缓冲液洗涤并用pH 3.0的25mM柠檬酸盐洗脱。用1M Tris缓冲液(pH 9.0)中和后，通过尺寸排阻色谱法(Superdex 200，GE Healthcare)在20mM组氨酸、140mM NaCl(pH6.0)中将聚集蛋白与单体抗体种类分离。将单体蛋白级分合并，若需要，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30KD MWCO)离心浓缩器浓缩并储存在-80℃下。使用样品等分试样例如通过CE-SDS、尺寸排阻色谱法、质谱法和内毒素测定法用于后续的分析表征。
表4：双特异性OX40抗原结合分子的生产产量和质量
Figure BDA0003872289030001513
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实例2
靶向OX40和FAP的双特异性抗原结合分子的表征
2.1靶向FAP的抗OX40双特异性抗原结合分子结合初始与活化的人PBMC的对比
通过ficoll密度梯度离心分离人PBMC。血沉棕黄层从苏黎世献血中心获得。为了分离新鲜的外周血单核细胞(PBMC)，用相同体积的DPBS(Gibco by Life Technologies，目录号14190 326)稀释血沉棕黄层。在50mL聚丙烯离心管(TPP，目录号91050)中提供15mLHistopaque 1077(SIGMA Life Science，目录号10771，聚蔗糖和泛影酸钠，密度调整为1.077g/mL)并将血沉棕黄层溶液覆盖在Histopaque 1077上方。将管在室温下以400x g离心30分钟，加速度低且无断裂。之后，将PBMC从界面收集，用DPBS洗涤3次并冷冻以备后用。将PBMC解冻、洗涤并重悬于AIM-V培养基(ThermoFischer，目录号12055091)中。使用未受刺激的PBMC(在静息人PBMC上结合)或受到刺激以在T细胞的细胞表面接受强烈的人Ox40表达(在活化的人PBMC上结合)。因此，解冻后的PBMCs在6孔组织培养板(用[2μg/mL]抗人CD3(克隆OKT3)和[2μg/mL]抗人CD28(克隆CD28.2)预先包被2小时)中的Aim-V培养基中，37℃/5％CO2下培养3天。
为了检测，将OX40初始人PBMC和活化的人PBMC混合。为了能够区分初始和活化的人PBMC，在结合测定之前使用eFluor670细胞增殖染料(eBioscience，目录号65-0840-85)标记初始细胞。然后将1x 105初始、eFluor670标记的人PBMC和未标记的活化人PBMC的1比1混合物添加到圆底96孔板(TPP，目录号92097)的每个孔中，并进行结合测定。
细胞首先在DPBS中用Zombie Aqua Fixable可固定活性染料(Biolegend，目录号423102)染色10分钟，然后在50μL/孔FACS缓冲液中在黑暗中于4℃孵育90分钟，该缓冲液含有滴定的抗OX40双特异性抗体构建体。用过量的FACS缓冲液洗涤3次后，将细胞在25μL/孔FACS缓冲液中于4℃在黑暗中染色30分钟，该缓冲液含有荧光标记的抗人CD4(克隆OKT-4、小鼠IgG2b、BioLegend、目录号317434)、抗人CD8(克隆RPA-T8、小鼠IgG1k、BioLegend、目录号301042)和异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ-片段特异性山羊IgGF(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109-096-098)的混合物。最后将样品重悬浮于20μL/孔FACS缓冲液中，并在同一天使用iQue Cell Screener和ForeCyt软件(Sartorius)获得该样品。
从图2A和图2C中可以看出，四价形式(4+1)的双特异性OX40(49B4)x FAP抗原结合分子与OX40的结合比三价(3+1)或二价(2+1)形式的更好(49B4克隆的亲和力)。随着OX40在T细胞上的自然出现，双特异性形式与活化的CD4的结合比与CD8 T细胞的结合更强，并且与靶阴性细胞(静息CD4和CD8 T细胞，图2B和图2D)没有结合。如图3A和图3C所示，包含克隆8H9的双特异性抗原结合分子以亚纳摩尔亲和力与OX40阳性细胞结合并且具有与三价和二价抗体相当的强度。随着OX40在T细胞上的自然出现，构建体与活化的CD4的结合比与CD8 T细胞的结合更强，并且与靶阴性细胞(静息CD4和CD8 T细胞，图3B和图3D)没有结合。在图4A和图4C中，示出了包含克隆MOX0916的双特异性抗体以亚纳摩尔亲和力与OX40阳性细胞结合，具有与三价或二价抗体相当的强度。随着OX40在T细胞上的自然出现，构建体与活化的CD4的结合比与CD8 T细胞的结合更强，并且与靶阴性细胞(静息CD4和CD8 T细胞，参见图4B和图4D)没有结合。包含克隆CLC-563的双特异性抗体以纳摩尔亲和力与OX40阳性细胞结合，具有与三价和二价抗体相当的强度，如图5A和图5C所示。随着OX40在T细胞上的自然出现，构建体与活化的CD4的结合比与CD8 T细胞的结合更强，并且与靶阴性细胞(静息CD4和CD8 T细胞，图5B和图5D)没有结合。
在图6A和图6C中，示出了与亲本抗体49B4相比，包含基于49B4氨基酸变体的克隆的所有双特异性抗原结合分子显示出与OX40阳性细胞的结合略有改善。随着OX40在T细胞上的自然出现，构建体与活化的CD4的结合比与CD8 T细胞的结合更强，并且与靶阴性细胞(静息CD4和CD8 T细胞，图6B和图6D)没有结合。
在另一个实验中，测试了靶向OX40和FAP的双特异性抗原结合分子与不同C-末端变体的结合。使用的PBMC解冻、洗涤并重悬于含有10％(v/v)胎牛血清(FCS,SIGMA，目录号F4135)的RPMI培养基(Gibco，目录号72400-021)中。PBMC受到刺激以在T细胞的细胞表面接受强烈的人Ox40表达(在活化的人PBMC上结合)。因此，解冻后的PBMCs在6孔组织培养板(用[2μg/mL]抗人CD3(克隆OKT3)和[2μg/mL]抗人CD28(克隆CD28.2)预先包被2小时)中的具有10％FCS的RPMI培养基中，37℃/5％CO2下培养3天。为了检测，将2x105的活化人PBMC添加到圆底96孔板(TPP，目录号92097)的每个孔中，并进行结合测定。细胞首先在DPBS中用LIVE/DEADTM可固定Aqua死细胞染色剂(Molecular probes，目录号L34957)染色20分钟，然后在一个洗涤步骤(200μL 4℃FACS缓冲液)后，在50μL/孔FACS缓冲液中在黑暗中于4℃孵育90分钟，该缓冲液含有滴定的抗OX40双特异性抗原结合分子。用过量的FACS缓冲液洗涤1次后，将细胞在50μL/孔FACS缓冲液中于4℃在黑暗中染色30分钟，该缓冲液含有荧光标记的抗人CD4(克隆A161A1，BioLegend，目录号357406)、抗人CD8(克隆SK1，BioLegend，目录号344742)和藻红蛋白(PE)缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ-片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-098)的混合物。最后将样品重悬浮于100μL/孔FACS缓冲液中，并在同一天使用运行FACS Diva软件的BD Fortessa获得该样品。
从图7A至图7F中可以看出，所有测试的双特异性FAP-OX40双特异性抗体均与活化的CD4 T细胞结合。随着OX40在T细胞上的自然出现，双特异性形式对活化的CD4的结合比对CD8 T细胞的结合更强(图7A、7C、7E与图7B、7D和图7F相比)。对于所有测试的化合物，D和S变体显示出相当的结合特性(比较每个图的开放与封闭符号)。
2.2与表达人FAP的肿瘤细胞的结合
使用表达人成纤维细胞活化蛋白(huFAP)的NIH/3T3-huFAP克隆19细胞来测试与细胞表面FAP的结合。该细胞系是通过用表达载体pETR4921转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞系(ATCC CRL-1658)以在1.5μg/mL嘌呤霉素选择下表达huFAP而产生。使用A549NucLightTMRed Cells(Essen Bioscience，目录号4491)(该细胞表达限制在细胞核内的NucLight Red荧光蛋白)测试了与OX40阴性FAP阴性肿瘤细胞结合的缺乏，以允许从未标记的人FAP阳性NIH/3T3-huFAP克隆19细胞中分离。按照标准的埃森方案，将亲本A549(ATCCCCL-185)用Essen CellPlayer NucLight Red Lentivirus(Essen Bioscience，目录号4476；EF1α，puromycin)在8μg/ml聚凝胺存在下以3(TU/细胞)的MOI转导。这导致≥70％的转导效率。或者，使用人宫颈腺癌细胞系HeLa细胞系(ATCC，CCL2)测试与OX40阴性FAP阴性肿瘤细胞结合的缺乏。无酶细胞解离缓冲液用于分离以保存胰蛋白酶敏感的表面蛋白。
将5x104未标记的NIH/3T3-huFAP克隆19细胞和A549 NucLightTM红细胞在FACS缓冲液中的混合物添加到圆底96孔板(TPP，目录号92097)的每个孔中，然后进行结合测定。细胞首先在DPBS中用Zombie Aqua Fixable可固定活性染料(Biolegend，目录号423102)染色10分钟，然后在50μL/孔FACS缓冲液中在黑暗中于4℃孵育75分钟，该缓冲液含有滴定的抗OX40双特异性抗体构建体。然后将细胞用200μL 4℃FACS缓冲液洗涤3次，并通过短暂涡旋重悬浮。用25μL/孔的4℃冷第二抗体溶液对细胞进一步染色，该溶液含有异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ-片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(JacksonImmunoResearch，目录号109-096-098)并在黑暗中于4℃孵育30分钟。最后将样品重悬浮于20μL/孔FACS缓冲液中，并在同一天使用iQue Cell Screener和ForeCyt软件(Sartorius)获得该样品。
如图2E、3E、4E、5E和图6E所示，共享FAP(1G1a)抗原结合结构域的所有双特异性抗原结合分子与人FAP阳性成纤维细胞(NIH/3T3-huFAP-clone 19)具有相当的结合。仅在图3E中示出，尽管共享相同的FAP(1G1a)抗原结合结构域，当克隆8H9被引入双特异性抗原结合分子中时表现出与人FAP阳性成纤维细胞(NIH/3T3-huFAP-clone 19)的结合略微增加。未观察到与靶阴性细胞(A549-NLR细胞，图2F、3F、4F、5F和6F)的结合。
在另一个实验中，将2x105NIH/3T3-huFAP克隆19细胞和HeLa细胞在FACS缓冲液中的混合物添加到圆底96孔板(TPP，目录号92097)的每个孔中，然后进行结合测定。细胞首先在DPBS中用LIVE/DEADTM可固定Aqua死细胞染色剂(Molecular probes，目录号L34957)染色20分钟，然后在一个洗涤步骤(200μL 4℃FACS缓冲液)后，在50μL/孔FACS缓冲液中在黑暗中于4℃孵育75分钟，该缓冲液含有滴定的抗OX40双特异性抗体构建体。然后在4℃下用200μL FACS缓冲液洗涤细胞一次，并通过短暂涡旋重悬浮。用50μL/孔的4℃冷第二抗体溶液对细胞进一步染色，该溶液含有藻红蛋白(PE)缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ-片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-098)并在黑暗中于4℃孵育30分钟。最后将样品重悬浮于100μL/孔FACS缓冲液中，并在同一天使用运行FACS Diva软件的BD Fortessa获得该样品。
所有共享FAP(1G1a)抗原结合结构域但包含C-末端S或D变体的双特异性抗原结合分子与人FAP阳性成纤维细胞(NIH/3T3-huFAP-clone 19)具有相当的结合，这意味着变体对与FAP的结合不具有影响(见下表5中的数据)。靶向阴性细胞(HeLa细胞)时未观察到结合。
2.3双特异性抗原结合分子的细胞结合特性总结
为了评估靶向FAP的OX40抗体人FAP阴性肿瘤细胞(A549-NLR或HeLa)的结合特性，将FAP阳性成纤维细胞(NIH/3T3-huFAP-clone19)、OX40阳性活化的PBMC(活化的CD4和CD8T细胞)以及OX40阴性静息PBMC(静息CD4和CD8 T细胞)与指定的连续稀释的测试抗体一起孵育，然后通过荧光标记的针对人Fcγ的第二抗体进行检测。
所有靶向FAP的OX40抗原结合分子都有效地与表达人FAP的靶细胞结合，并且不与靶阴性细胞结合。预计这将在患者中转化为指导肿瘤靶向和分子的富集。随着OX40在T细胞上的自然出现，所有构建体与活化的CD4的结合比与CD8 T细胞的结合更强。四价形式(4+1)的包含克隆49B4的双特异性抗原结合分子与OX40的结合比三价(3+1)或二价(2+1)形式的更好(克隆的亲和力；参见图2A和图2C)。与四价形式的亲本抗体相比，所有基于49B4氨基酸变体的双特异性抗原结合分子显示出与OX40阳性细胞的结合略有改善(参见图6A和图6C)。克隆8H9(图3A和图3C)和MOX0916(图4A和图4C)以亚纳摩尔亲和力与OX40阳性细胞结合，而克隆CLC-563(图5A和图5C)以纳摩尔亲和力与OX40阳性细胞结合，具有与三价和二价形式相当的强度。对于所有测试的C-末端变体，D和S变体显示出相当的结合特性。FAP结合适用于在相当的纳摩尔范围内所有双特异性抗原结合分子。
与活化的人CD4 T细胞和FAP阳性肿瘤细胞结合的EC50值总结在表5中。
表5：靶向FAP的OX40抗原结合分子与细胞表面人FAP和人Ox40(在CD4+ T细胞上)结合的EC50值
Figure BDA0003872289030001571
Figure BDA0003872289030001581
2.4靶向OX40和FAP的双特异性抗原结合分子的生物物理和生化表征
2.4.1热稳定性的测定
通过动态光散射(DLS)监测实例1中制备的靶向FAP的OX40抗原结合分子的热稳定性，并通过使用Optim 2仪器(Avacta Analytical,UK)应用温度斜坡监测温度依赖性内在蛋白荧光。将10μg蛋白浓度为1mg/ml的过滤蛋白样品一式两份加到Optim 2仪器上。温度以0.1℃/min的速度从25℃升至85℃，采集350nm/330nm处的荧光强度和266nm处的散射强度之比。结果如表6所示。实例2中产生的所有测试的FAP-Ox40分子的聚集温度(Tagg)优于先前描述的OX40(49B4)x FAP(4B9)(4+1)双特异性分子(分子P1AD4524)，如WO 2017/060144 A1中描述的。
2.4.2疏水作用层析(HIC)
通过将20μg样品注入到用25mM磷酸钠、1.5M硫酸铵，pH 7.0平衡的HIC-醚-5PW(Tosoh)柱上来确定表观疏水性。在60分钟内，使用0至100％的缓冲液B(25mM磷酸钠，pH7.0mM)的线性梯度进行洗脱。将保留时间与具有已知疏水性的蛋白质标准品进行比较。含有克隆8H9和克隆49B4的带电荷块变体的FAP x OX40双特异性抗原结合分子获得了高HIC保留时间。已显示增加的非特异性相互作用与高HIC保留时间相关。
2.4.3FcRn亲和层析
如所述(Schlottauer et al.,MAbs 2013,5(4),576-86)表达、纯化和生物素化FcRn。为了进行偶联，将制备的受体加入到链霉亲和素-琼脂糖(GE Healthcare)中。将所得的FcRn-琼脂糖基质填充在柱壳体中。用20mM的2-(N-吗啉)-乙磺酸(MES)和140mM NaCl，pH5.5(洗脱液A)以0.5ml/min的流速平衡该柱。将30μg抗体样品用洗脱液A以1:1的体积比稀释，然后施加到FcRn柱上。将该柱用5倍柱体积的洗脱液A洗涤，然后用35倍柱体积的从20％至100％的20mM Tris/HCl和140mM NaCl，pH8.8的线性梯度(洗脱液B)进行洗脱。用25℃的柱温箱执行分析。通过连续测量280nm下的吸光度来监测洗脱图谱。将保留时间与具有已知亲和力的蛋白质标准品进行比较。
2.4.4肝素亲和层析
通过将30-50μg样品注射到用50mM Tris，pH 7.4平衡的TSKgel Heparin-5PW(Tosoh)柱上来测定肝素亲和力。在37分钟内，使用0至100％的缓冲液B(50mM Tris，1MNaCl，pH 7.4mM)的线性梯度进行洗脱。将保留时间与具有已知亲和力的蛋白质标准品进行比较。
表6：测试的FAP x OX40双特异性抗体的生物物理和生化特性
Figure BDA0003872289030001591
Figure BDA0003872289030001601
2.5应激后通过表面等离子共振(SPR)表征结合效力
使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)通过表面等离子共振对分子在37℃、pH7.4和40℃、pH 6下孵育14天引起的结合效力降低进行定量。储存在-80℃和pH 6的样品用作参考。参考样品和在40℃下应激的样品在20mM组氨酸缓冲液、140mM NaCl、pH 6.0中，在37℃下应激的样品在PBS缓冲液、pH 7.4中，所有浓度均为1.0mg/ml。在应激期(14天)后，将PBS缓冲液中的样品透析回20mM组氨酸缓冲液、140mM NaCl、pH 6.0用于进一步分析。
所有SPR实验均在25℃下使用HBS-P+缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、pH 7.4、0.05％表面活性剂P20)作为运行和稀释缓冲液进行。将生物素化的人OX40和FAP以及生物素化的抗人Ig(Capture Select,Thermo Scientific,#7103262100)固定在S系列传感器芯片SA(GE Healthcare,#29104992)上，产生至少1000个共振单位(RU)的表面密度。以5μl/min的流速注射浓度为2μg/ml的FAP-OX40双特异性抗体30s，并监测解离120s。通过注入10mM甘氨酸缓冲液(pH 1.5)持续60秒，使表面再生。通过扣除空白注射和扣除从空白对照流通池获得的应答来校正本体折射率差异。为了评估，在注射结束后5秒采取结合应答。
为了标准化结合信号，OX40和FAP结合除以抗人IgG反应(在固定化的抗人IgG抗体上捕获FAP x OX40双特异性抗体时获得的信号(RU))。通过将每个温度加压样品与相应的加压力样品进行比较来计算相对结合活性。如表7所示，与先前描述的FAP-OX40双特异性抗体(如WO 2017/060144 A1中描述)相比，在应激下，实例1中制备的所有FAP xOX40双特异性抗体显示出与OX40和FAP的结合的改善。
表7：在pH 6/40℃或pH 7.4/37℃孵育2周后，FAP-OX40双特异性抗体对人Ox40和FAP的结合活性
Figure BDA0003872289030001611
Figure BDA0003872289030001621
实例3
靶向FAP的抗人OX40抗原结合分子的功能特性
3.1表达人OX40和报告基因NFκB-荧光素酶的HeLa细胞
OX40与其配体的激动性结合通过活化核因子kappa B(NFκB)来诱导下游信号传导(A.D.Weinberg et al.,J.Leukoc.Biol.2004,75(6),962-972)。生成重组报告细胞系HeLa_hOx40_NFkB_Luc1以在其表面上表达人OX40。另外，它携带报告质粒，该质粒含有在NFκB敏感增强子区段控制下的荧光素酶基因。移位至细胞核的OX40触发诱导NFκB的剂量依赖性活化，在那里它结合至报告质粒的NFκB敏感增强子上以增强荧光素酶蛋白的表达。荧光素酶催化萤光素氧化，从而产生发光的氧化萤光素。这可以通过发光计来定量。
因此，分析各种靶向FAP的OX40抗原结合分子在HeLa_hOx40_NFkB_Luc1报告细胞中诱导NFκB活化的能力作为生物活性的量度。
我们单独测试了二价、三价和四价靶向FAP的交叉Fab形式的选定的靶向FAP的OX40抗原结合分子的NFκB活化能力，并且通过第二抗体或FAP+成纤维细胞系对构建体进行超交联。使用表达人成纤维细胞活化蛋白(huFAP)的NIH/3T3-huFAP克隆19来测试由细胞表面FAP交联的FAP结合抗体。该细胞系是通过用表达载体pETR4921转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞系(ATCC CRL-1658)以在1.5μg/mL嘌呤霉素选择下表达huFAP而产生。
将粘附的HeLa_hOX40_NFkB_Luc1细胞以每孔0.2x105个细胞的细胞密度过夜培养，并用含有滴定抗OX40抗原结合分子的测定培养基刺激6小时。为了测试通过第二抗体的超交联的效果，以1:2的比例(第一抗体比第二抗体)添加25μL/孔的含有第二抗体抗人IgGFcγ-片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch,109-006-098)的培养基。为了通过细胞表面FAP结合测试超交联的效果，以3比1的比例共培养25μL/孔的含有FAP+肿瘤细胞(NIH/3T3-huFAP克隆19)的培养基(每孔的FAP+肿瘤细胞比报告细胞多三倍)。
孵育后，吸出测定上清液并将板用DPBS洗涤两次。根据制造商的说明，使用荧光素酶1000测定系统和报告裂解缓冲液(均为Promega，目录号E4550和目录号E3971)对光发射进行定量。简而言之，通过每孔加入30μL 1x裂解缓冲液，在干冰上裂解细胞30分钟。在每孔加入100μL提供的荧光素酶测定试剂之前，细胞在37℃下解冻20分钟。用Spark10MTecan酶标仪，使用500ms积分时间立即对光发射定量，无需任何滤光片来收集所有波长。通过HeLa_hOx40_NFkB_Luc1细胞的基础发光来校正发射的相对光单位(URL)，并且使用Prism7(GraphPad Software，USA)对对数第一抗体浓度作图。使用内置的S型剂量应答来拟合曲线。
因此，我们单独测试了以二价、三价和四价靶向FAP的交叉Fab形式的选定的双特异性OX40抗原结合分子的NFκB活化能力，并且通过第二抗体或FAP+成纤维细胞系对分子进行超交联。使用表达人成纤维细胞活化蛋白(huFAP)的NIH/3T3-huFAP克隆19来测试由细胞表面FAP交联的FAP结合抗体。所有OX40抗原结合分子均诱导剂量依赖性NKκB活化。四价和三价OX40抗体的使用诱导了特定的NFκB活化，这是由于在没有构建体的进一步外部交联的情况下已经组装了三聚体核心OX40受体信号单元。具有二价形式(2+1)的OX40抗原结合分子因此显示出较低的生物活性。表达FAP的人成纤维细胞经由FAP结合部分，或通过二级交联抗体经由OX40抗原结合分子的Fc区的额外交联进一步增强了所有抗原结合分子的NFκB活化。对于低纳摩尔二价OX40抗体(49B4,CLC-563)，OX40的更高化合价也导致了关于生物活性的亲和力增强(4+1>3+1>2+1)，而对于亚纳摩尔二价OX40结合物(8H9,MOXR0916)，未观察到3+1优于2+1形式的益处。4+1形式的49B4的所有氨基酸变体诱导的剂量依赖性NKκB活化程度与4+1形式的亲本抗体相似。
表8总结了无进一步交联和通过细胞表面人FAP(NIH/3T3 huFAP克隆19)交联的NFκB诱导剂量应答曲线的EC50值。
表8：在存在或不存在细胞表面人FAP+成纤维细胞的情况下，由OX40抗原结合分子以靶向FAP的形式活化NFκB的剂量应答的EC50值
Figure BDA0003872289030001641
在另一个实验中，将粘附的HeLa_hOX40_NFkB_Luc1细胞以每孔0.3x105个细胞的细胞密度培养过夜，并用含有滴定抗OX40抗原结合分子的测定培养基刺激6小时。为了通过细胞表面FAP结合测试超交联的效果，以3比1的比例共培养25μL/孔的含有FAP+肿瘤细胞(NIH/3T3-huFAP克隆19)的培养基(每孔的FAP+肿瘤细胞比报告细胞多三倍)。
孵育后，吸出测定上清液并将板用DPBS洗涤两次。根据制造商的说明，使用荧光素酶1000测定系统和报告裂解缓冲液(均为Promega，目录号E4550和目录号E3971)对光发射进行定量。简而言之，通过每孔加入30μL 1x裂解缓冲液，在干冰上裂解细胞30分钟。在每孔加入100μL提供的荧光素酶测定试剂之前，细胞在37℃下解冻20分钟。用Spark10MTecan酶标仪，使用500ms积分时间立即对光发射定量，无需任何滤光片来收集所有波长。通过HeLa_hOx40_NFkB_Luc1细胞的基础发光来校正发射的相对光单位(URL)，并且使用Prism7(GraphPad Software，USA)对对数第一抗体浓度作图。使用内置的S型剂量应答来拟合曲线。
因此，我们单独测试了3+1和4+1形式的选定的双特异性OX40抗原结合分子的NFκB活化能力，该分子包含克隆OX40(49B4_K23E_K73E)或OX40(CLC563)如D和S变体，并且通过FAP+成纤维细胞系使分子超交联。结果在图8A至图8F中示出。所有OX40抗原结合分子均诱导剂量依赖性NKκB活化。的四价和三价OX40抗体的使用诱导了某些NFκB活化，这是由于在不存在构建体进一步外部交联的情况下已经组装了三聚体核心OX40受体信号单元(图8B、8D和图8F)。表达FAP的人成纤维细胞经由FAP结合部分的额外交联进一步增加了所有抗原结合分子的NFκB活化(图8A、8C和图8E)。D和S变体的生物活性具有相当的强度。
表9总结了无进一步交联和通过细胞表面人FAP(NIH/3T3 huFAP克隆19)交联的NFκB诱导剂量应答曲线的EC50值。
表9：在存在或不存在细胞表面人FAP+成纤维细胞的情况下，由OX40抗原结合分子(D和S变体)以靶向FAP的形式活化NFκB的剂量应答的EC50值
Figure BDA0003872289030001651
3.2OX40介导的次优TCR的共刺激触发静息人PBMC和通过细胞表面FAP的超交联
在实例4.1中显示，通过提供OX40受体的强寡聚化，在人OX40阳性报告细胞系中添加FAP+肿瘤细胞可以强烈增加通过靶向FAP的OX40抗原结合分子诱导的NFκB活性。同样，我们在原代T细胞测定中测试了所有构建体在NIH/3T3-huFAP克隆19细胞存在下挽救静息人PBMC细胞的次优TCR刺激的能力。
人PBMC制剂包含(1)静息OX40阴性CD4+和CD8+T细胞以及(2)在其细胞表面具有各种Fc-γ受体分子的抗原呈递细胞(例如B细胞和单核细胞)。人IgG1同型的抗人CD3抗体可以与其Fc部分结合至目前的Fc-γ受体分子上，并在静息的OX40阴性CD4和CD8 T细胞上介导延长的TCR活化。然后这些细胞在几个小时内开始表达OX40。针对OX40的功能性激动性化合物可以通过活化的CD8+和CD4+ T细胞上存在的OX40受体发出信号，并支持TCR介导的刺激。
在辐照的FAP+NIH/3T3-huFAP克隆19细胞和滴定的双特异性OX40抗原结合分子存在下，用次优浓度的抗CD3抗体刺激静息人PBMC四天。通过监测总细胞计数(CD4+或CD8+ T细胞)并通过流式细胞术与对T细胞活化标记物(CD4+ T细胞上的CD25表达)的荧光标记抗体共染色来分析对T细胞存活和增殖的影响。使用细胞解离缓冲液(Invitrogen，目录号13151-014)在37℃下收集小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3-huFAP克隆19细胞10分钟。用DPBS将细胞洗涤一次。在x射线辐照器中使用4500RAD的剂量对NIH/3T3-huFAP克隆19细胞进行辐照以防止肿瘤细胞系的人PBMC随后过度生长。在37℃/5％CO2下，在无菌96孔圆底粘附组织培养板(TPP，目录号92097)中以每孔0.2x105个细胞的密度在T细胞培养基中将辐照的细胞培养过夜。
通过ficoll密度离心从新鲜血液分离人PBMC。将细胞以每孔0.6x105个细胞的密度添加到每个孔。抗人CD3抗体(克隆V9、人IgG1)的终浓度为[10nM]并以指定的浓度添加靶向FAP的OX40抗原结合分子。在分析之前，将细胞在37℃/5％CO2下孵育四天。
细胞首先在DPBS中用Zombie Aqua Fixable可固定活性染料(Biolegend，目录号423102)染色10分钟，然后在4℃下使用荧光染料偶联的抗体抗人CD4(克隆RPA-T4，BioLegend，目录号300532)、CD8(克隆RPa-T8，BioLegend，目录号3010441)和CD25(克隆M-A251，BioLegend，目录号356112)进行表面染色20min。用FACS缓冲液将细胞沉淀洗涤两次。最后将样品重悬浮于20μL/孔FACS缓冲液中，并在同一天使用iQue Cell Screener和ForeCyt软件(Sartorius)获得该样品。表10总结了在原代人PBMC的次优TCR刺激后，对靶向FAP的形式中的双特异性OX40抗原结合分子的CD4+ T细胞上调CD25的剂量应答的EC50值。
表10：在原代人PBMC的次优TCR刺激后，对CD4+ T细胞上调CD25的剂量应答的EC50值
Figure BDA0003872289030001671
与非靶向抗OX40(49B4)4+0形式的共刺激几乎无法挽救次优TCR刺激的CD4和CD8T细胞。对于所有测试的OX40克隆，在NIH/3T3-huFAP克隆19细胞存在下，靶向FAP的四价、三价和二价OX40抗原结合分子的超交联强烈促进了存活并在人CD4 T细胞中诱导增强的活化表型。4+1形式的49B4的所有氨基酸变体都支持T细胞活化，其程度至少与4+1形式的亲本抗体相似，即使没有轻微的改善。
在进一步测试C-末端S和D变体的实验中，根据制造商的说明，使用CFSE增殖试剂盒(Thermo Fisher，目录号C34554)在室温下以0.2[μM]CFSE的终浓度将人PBMC标记10分钟。在T细胞培养基中，以每孔0.6x105个细胞的密度将细胞添加到每个孔。以指定的浓度添加均在T细胞培养基中制备的终浓度为[10nM]的抗人CD3抗体(克隆V9、人IgG1)和靶向FAP的OX40抗原结合分子。在分析之前，将细胞在37℃/5％CO2下孵育四天。
细胞首先在DPBS中用LIVE/DEADTM可固定Aqua死细胞染色剂(Molecular probes，目录号L34957)染色20分钟，然后是一个洗涤步骤(200μL 4℃FACS缓冲液)。此后，在4℃下使用荧光染料偶联的抗体抗人CD4(克隆OKT4，BioLegend，目录号317440)、CD8(克隆SK-1，BioLegend，目录号344714)和CD25(克隆BC96，BioLegend，目录号302626)进行表面染色30min。用dPBS缓冲液将细胞沉淀洗涤两次。最后将样品重悬浮于100μL/孔FACS缓冲液中，并在同一天使用运行FACS Diva软件的BD Fortessa获得该样品。表11总结了在原代人PBMC的次优TCR刺激后，对靶向FAP的形式的双特异性OX40抗原结合分子的CD4+T细胞上调CD25的剂量应答的EC50值。
表11：在原代人PBMC的次优TCR刺激后，对CD4+ T细胞上调CD25的剂量应答的EC50值
Figure BDA0003872289030001681
如图9A至图9F所示，与非靶向四价抗OX40(49B4)(4+0形式)的共刺激仅在高于[1nM]的浓度下拯救次优TCR刺激的CD4和CD8 T细胞。在NIH/3T3-huFAP克隆19细胞存在下，靶向FAP的四价和三价OX40抗原结合分子的超交联在人CD4(图9A、9C和图9E)和CD8(图9B、9D和图9F)中强烈促进增殖并诱导增强的活化表型。对于CLC563构建体，相比于D变体，S变体表现略微较差，但统计学上并不显著(图9A至图9D)。4+1形式的49B4的所有氨基酸变体都支持T细胞活化，其程度至少与4+1形式的亲本抗体相似，即使没有轻微的改善。在这里，在S变体和D变体之间没有发现差异(图9E和图9F)。
3.3OX40介导的共刺激增加了裂解CEA+肿瘤细胞的CECAM5 TCB重定向的PBMC的细胞因子的分泌
T细胞双特异性抗体(TCB)是一种临床上探索的招募患者自身免疫系统来对抗癌症的方法。这些分子包含对T细胞上的T细胞受体(TCR)具有特异性的激动性抗CD3单元和对独特癌症抗原具有特异性的靶向部分。TCB将多克隆T细胞重定向以裂解在其细胞表面表达相应靶抗原的癌细胞。在不存在此类靶抗原的情况下不会发生T细胞活化。本实例中使用的TCB是靶向癌胚抗原(CEA)的CEACAM5 TCB并且在WO 2016/079076 A1中有详细描述。TCR的触发增加共刺激分子(例如OX40，肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员)的表达，这取决于这种初级刺激的强度和持续时间。该受体与其相应的配体的伴随激动性连接反过来促进标志T细胞效应功能，如某些促炎细胞因子(GM-CSF,IFN-γ,IL-2,TNF-α)的增殖、存活和分泌(M.Croft et al.,Immunol.Rev.2009,229(1),173-191,I.Gramaglia et al.,J.Immunol.1998,161(12),6510-6517；S.M.Jensen et al.,Seminars in Oncology 2010,37(5),524-532)。需要这种共刺激来提高T细胞对抗肿瘤细胞的全部潜力，特别是在肿瘤抗原启动弱的情况下，并在第一次攻击之后维持抗肿瘤应答，允许形成保护性记忆。在某些具有强烈免疫抑制或耗尽的表型的患者中，只有联合多克隆但肿瘤特异性T细胞募集(信号1)和恢复肿瘤限制性阳性共刺激(信号2)可促进足够的抗肿瘤功效和延长的适应性免疫保护。这可以持续地驱动肿瘤微环境朝向免疫活化更多、免疫抑制更少的状态发展。OX40的FAP依赖性共刺激也可促进TCB介导的在较低肿瘤内浓度下对肿瘤细胞的杀伤，这将允许减少全身性暴露和相关副作用。另外，因为较低的TCB浓度仍可能有效，所以治疗间隔可能会延长。
天然表达CEA抗原的MKN45 NucLight Red(NLR)细胞被用作靶细胞。按照制造商的说明，在8μg/mL聚凝胺存在下，使用Essen CellPlayer NucLight Red Lentivirus试剂(Essenbioscience，目录号4476；EF1α，嘌呤霉素)以5(TU/细胞)的MOI转导MKN-45(DSMZ，ACC409)以稳定表达核限制性NucLight Red荧光蛋白。这使得能够轻易地从非荧光效应T细胞或成纤维细胞中分离出来，并通过高通量荧光寿命显微镜检查来监测肿瘤细胞的生长。
通过表达NIH/3T3-huFAP克隆19的人成纤维细胞活化蛋白(huFAP)，提供通过细胞表面FAP进行的FAP结合抗体的交联(参见实例3.2)。通过ficoll密度离心从新鲜血液中分离人PBMC(参见实例3.1)。
在T细胞培养基中，以每孔0.1x105个细胞的密度在每个孔中添加MKN45 NucLightRed(NLR)细胞。以4600RAD对NIH/3T3-huFAP克隆19进行预辐射，并且然后在T细胞培养基中，以每孔0.1x105个细胞的密度在每个孔中添加该克隆19。在T细胞培养基中以每孔0.5x105个细胞的密度将人PBMC添加到每个孔。以指定的浓度添加均在T细胞培养基中制备的CEACAM5 TCB(终浓度为2nM)和靶向FAP的OX40抗原结合分子的滴定稀释液。在分析之前，将细胞在37℃/5％CO2下孵育三天。样品重复进行三次。
根据制造商的说明，72小时后，收集上清液，使用Bio-Plex Pro人细胞因子8-Plex测定(目录号BIO-RAD M50000007A)对选定的细胞因子进行后续分析。对于每种测试化合物，将重复进行三次的样品按相应的测试浓度合并成等份，并分析混合物中的细胞因子含量。计算与仅TCB对照样品中的浓度相比的相应细胞因子(GM-CSF、IL-2、TNF-α、IFN-γ)的倍数增加，并相对于FAP-OX40抗体浓度绘图。使用GraphPAD Prism、AUC和计算的EC50值计算剂量应答曲线，并报告在表24中。图10A至图10F描绘了GM-CSF和TNF-α的剂量应答曲线，并且图11A至11F描绘了IFN-γ和IL-2的剂量应答曲线。针对每种细胞因子将AUC归一化为FAP-OX40抗原结合分子OX40(CLC563)x FAP(1G1a_EPKSCD)3+1(在图中称为3+1CLC563/H212–D)的AUC，并针对每种化合物绘制为图12中的盒须图。
表12：人原代PBMC的FAP-OX40共刺激后TCB介导的细胞因子分泌增加的剂量应答的EC50值
Figure BDA0003872289030001701
Figure BDA0003872289030001711
如图10A至图10F和图11A至图11F所示，与非靶向抗OX40(49B4)4+0形式的共刺激不会增强由CEACAM5 TCB介导的肿瘤细胞的裂解诱导的PBMC的细胞因子分泌。在NIH/3T3-huFAP克隆19细胞存在下，靶向FAP的四价和三价OX40抗原结合分子的超交联强烈促进了GM-CSF(图10A、10C和10E)和TNF-α(图10B、10D和10F)，以及IFN-γ(图11A、11C和11E)和IL-2(图11B、11D和11F)的分泌。对于所有经测试的构建体，相比于D变体，S变体表现略微较差，但统计学上并不显著(图12)。4+1形式的49B4氨基酸变体比4+1形式的亲本克隆更强地支持T细胞活化。在这里，作为四价的CLC563比作为三价靶向FAP的OX40激动剂显示出更强的激动性潜力(图12)。
3.4OX40介导的共刺激降低TGFβ诱导的FoxP3表达
CD4+Foxp3+ T调节细胞(Tregs)在免疫稳态和外周耐受中起关键作用(SakaguchiS,Yamaguchi T,Nomura T,Ono M,Cell 2008,133(5),775-87)。它们的发育、谱系稳定性和抑制功能取决于转录因子FoxP3的表达，该因子是Treg同一性的“主”调节器(Hori S,Nomura T,Sakaguchi S,Science 2003,299(5609),1057-61)。除了它们的胸腺来源外，活化后，原初CD4+ T细胞也可以在外周诱导CD4+FoxP3+ Treg细胞，这些细胞通常称为诱导型Treg(iTregs)或外周Tregs(pTregs)(Curotto de Lafaille MA,Lafaille J,Immunity2009,30(5),626-35)。体外诱导iTregs的最具特征的条件是转化生长因子β(TGF-β)和CD28共刺激的组合。这种细胞因子有效地诱导FoxP3从头表达，从而将活化的常规T细胞转化为iTregs(Chen W,Jin W,Hardegen N,Lei KJ,Li L,Marinos N,McGrady G,WahlSM,J Exp.Med.2003,198(12),1875-86)。OX40信号传导已被描述为抑制FoxP3表达和Treg诱导(Zhang X,Xiao X,Lan P,et al.,Cell Rep.2018,24(3),607-618)。实例4.1至4.3显示，所有FAP-OX40双特异性抗原结合分子都能够诱导NFκB，并促进TCR刺激，从而导致活化表型增强和细胞因子分泌增加。同样，我们在原代T细胞试验中测试了所有构建体抑制TGF-β介导的FoxP3诱导的能力。
在T细胞活化期间，用抗CD28和CD3抗体在TGFβ存在下培养含有初始CD4 T细胞的人PBMC制剂。FoxP3诱导以及OX40表达发生在几个小时内。针对OX40的功能激动性化合物，例如包含3+1和4+1形式(D和S变体)的OX40克隆OX40(49B4_K23E_K73E)或OX40(CLC563)n的双特异性抗原结合分子，当提供FAP交联时(这里FAP抗原包被至珠粒)，该分子可以经由激活的CD4+ T细胞上存在的OX40受体发出信号。这干扰了通过降低FoxP3表达可见的Treg诱导。
在37℃/5％CO2下,将预包被抗人CD3抗体(eBioscience，目录号16-0037-85)的无菌96孔圆底粘附组织培养板(TPP，目录号92097)放置在浓度为3μg/mL的dPBS中两小时。根据制造商的说明，在4℃下长期储存在含有0.1％(w/v)BSA的dPBS中之前，将
Figure BDA0003872289030001721
M-280链霉亲和素(ThermoFisher，目录号11205D)用dPBS中的生物素化人FAP抗原(Roche，P1AD8986；0.01μg蛋白对应1μg珠粒)在室温下包被30分钟。通过ficoll密度离心从新鲜血液分离人PBMC。根据制造商的说明，使用CFSE增殖试剂盒(Thermo Fisher，目录号C34554)在室温下以0.4μMCFSE的终浓度将细胞标记10分钟。然后在无血清X-Vivo15培养基(Lonza，目录号BE02-054Q)中以每孔1x105个细胞的密度将细胞添加到预包被板的每个孔。添加重组人TGF-β(2ng/mL，R&D Systems，目录号240-B-010)，单克隆抗人CD28(1μg/mL，eBioscience，目录号16-0289-85)和包覆FAP的珠粒(每孔2x105个细胞)。以指定的浓度添加靶向FAP的OX40抗原结合分子的滴定稀释液。在分析之前，将细胞在37℃/5％CO2下孵育三天。
细胞首先在DPBS中用LIVE/DEADTM可固定Aqua死细胞染色剂(Molecular probes，目录号L34957)染色10分钟，然后是一个洗涤步骤(200μL 4℃FACS缓冲液)。此后，在4℃下使用荧光染料偶联抗体抗人CD4(克隆RPA-T4，BioLegend，目录号300532)、CD8(克隆RPA-T8，BioLegend，目录号301042)和CD25(克隆BC96，BioLegend，目录号302610)进行表面染色30min。根据制造商的说明，在室温下于黑暗中，在FoxP3固定/透化工作溶液(FoxP3染色试剂盒，eBioscience，目录号00-5521)中将细胞固定和透化60分钟之前，使用FACS缓冲液洗涤细胞沉淀两次。用1x Perm缓冲溶液(FoxP3染色试剂盒，eBioscience，目录号00-5521)洗涤两次之后，在室温下于黑暗中，在1x Perm缓冲液中，用荧光染料偶联的抗FoxP3抗体(克隆29D6，BioLegend，目录号20108)将细胞染色40分钟。用1x Perm缓冲液将细胞沉淀洗涤两次，并且最后重悬浮于100μL/孔FACS缓冲液中，并在同一天使用运行FACS Diva软件的BDFortessa获得该细胞。对活的CD4+CD25+Treg单线态细胞进行门控，并报告αFoxP3抗体的MFI。通过没有OX40双特异性抗体的样品的MFI来校正每个浓度的FoxP3 MFI，因此只有TGBβ存在。
图13A至图13C示出FAP-OX40双特异性抗原双特异性抗原结合分子以剂量依赖性方式抑制TGFβ存在下活化的静息CD4 T细胞上的FoxP3诱导。每个FAP-OX40双特异性抗体的D变体和S变体都显示出相似的生物活性特性。在表13中，总结了FAP-OX40激动剂对CD4+CD25+Treg细胞的FoxP3抑制(FoxP3 MFI)的剂量应答的EC50值。
表13：FAP-OX40抑制TGFβ-暴露的静息CD4 T细胞上的FoxP3诱导的EC50值
分子ID 抗Ox40克隆 变体 形式 EC<sub>50</sub>[nM]
P1AF6455 CLC-563 S 3+1 0.25
P1AF6454 CLC-563 D 3+1 0.11
P1AF7217 CLC-563 S 4+1 0.01
P1AF7205 CLC-563 D 4+1 0.02
P1AF6457 49B4 AA变体K23E_K73E S 4+1 0.01
P1AF6456 49B4 AA变体K23E_K73E D 4+1 0.02
实例4
双特异性抗原结合分子靶向GITR和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的产生和生产
4.1双特异性抗原结合分子靶向GITR和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的产生和生产
在合适的表达质粒中，在具有相应恒定的人IgG1重链或轻链的框架中克隆抗编码GITR抗体852.2(通过用人GITR,SEQ ID NO:26和食蟹猴GITR,SEQ ID NO:27的兔免疫来生成)以及抗FAP抗体4B9(如在WO 2012/020006 A1中所描述)的可变重链和轻链结构域的cDNA。通过CMV启动子来驱动重链和轻链的表达。表达盒在cDNA的3′末端还含有合成的polyA信号。
以2+1形式制备双特异性GITR-FAP抗体，该形式由两个GITR结合部分与Fc的C-末端处的一个FAP结合臂组合而成(根据图1A)。为了产生2+1抗原结合分子，使用杵臼结构技术已实现异源二聚化。将S354C/T366W突变引入第一重链HC1(Fc杵重链)，并且将Y349C/T366S/L368A/Y407V突变引入第二重链HC2(Fc臼重链)。在2+1抗原结合分子中，如WO 2010/145792 A1中所描述的CrossMab技术确保了正确的轻链配对。独立于双特异性形式，在所有情况下，根据WO 2012/130831 A1中所述的方法使用效应子沉默Fc结构域(P329G；L234A，L235A)消除与Fcγ受体的结合。双特异性分子的序列示出于下表14中。
表14：双特异性抗原结合分子的氨基酸序列
Figure BDA0003872289030001741
Figure BDA0003872289030001751
Figure BDA0003872289030001761
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通过与编码4种不同肽链的表达载体悬浮生长的HEK细胞的瞬时转染来表达抗体构建体。根据细胞供应商的说明，使用抗体载体的Maxiprep(Macherey-Nagel)制剂、Expi293FTM表达培养基(GibcoTM)、ExpiFectamineTM293试剂(GibcoTM)和初始细胞密度为2-3百万个活细胞/ml，在
Figure BDA0003872289030001782
1x还原血清培养基
Figure BDA0003872289030001783
中进行Expi293FTM细胞(GibcoTM)的转染。转染后一天(第1天，转染后18-22小时)，将ExpiFectamineTM293Transfection Enhancer 1和ExpiFectamineTM293TransfectionEnhancer 2添加到转染的培养物中。将转染的培养物在37℃下在8％CO2的湿润气氛中震荡孵育。在摇瓶或搅拌的发酵罐中培养7天后，通过以3000-5000g离心20-30分钟收集细胞培养上清液，并且通过0.22μm过滤器过滤。
使用MabSelectSure-SepharoseTM(GE Healthcare，Sweden)色谱通过亲和色谱从细胞培养上清液中纯化抗体。简而言之，将无菌过滤的细胞培养上清液捕获在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelect SuRe树脂上，用平衡缓冲液洗涤并用100mM乙酸钠(pH 3.0)洗脱。用1M Tris(pH 9.0)中和后，通过离子交换色谱法(Poros XS)使用平衡缓冲液(20mM His、pH 5.5、1.47mS/cm)和洗脱缓冲液(20mM His、500mM NaCl、pH 5.5、49.1mS/cm)(梯度：至60CV中的100％洗脱缓冲液)将聚集蛋白与单体抗体种类分离。在某些情况下，随后在20mM组氨酸、140mM NaCl、pH 6.0中进行尺寸排阻色谱(Superdex 200，GE Healthcare)。将单体蛋白级分合并，若需要，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30KD MWCO)离心浓缩器浓缩。纯化的蛋白质储存在-80℃。使用Nanodrop分光光度计进行蛋白质定量，并在变性和还原条件下通过CE-SDS和分析SEC进行分析。使用样品等分试样例如通过CE-SDS、尺寸排阻色谱法、质谱法和内毒素测定法用于后续的分析表征。
在存在和不存在还原剂的情况下，通过CE-SDS分析来分析最终纯化步骤之后的双特异性抗原结合分子的纯度和分子量。根据制造商的说明使用Caliper LabChip GXII系统(Caliper Lifescience)。
使用TSKgel G3000 SW XL分析尺寸排阻柱(Tosoh)，在25mM磷酸钾、125mM氯化钠、200mM左旋精氨酸单氢氯化物、0.02％(w/v)NaN3、pH 6.7运行缓冲液中在25℃下分析双特异性抗原结合分子的总含量。
表15：双特异性GITR抗原结合分子的生产产量和质量
Figure BDA0003872289030001801
4.2靶向GITR和FAP的双特异性抗原结合分子的表征
4.2.1双特异性GITR抗原结合分子与GITR和FAP的同时结合
通过表面等离子体共振(SPR)可评估同时结合人GITR Fc(kih)和人FAP的能力。所有SPR实验均采用Biacore T200，在25℃下使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)。将生物素化的人GITR Fc(kih)直接偶联至链霉亲和素(SA)传感器芯片的流通池。所用的固定化水平高达1000共振单位(RU)。使靶向GITR和FAP的双特异性抗体以200nM的浓度范围在30μL/min的流速下在90秒内通过流通池，并且将解离设置为0秒。将人FAP作为第二分析物以500nM的浓度在30μL/min的流速在90秒内注射通过流通池。监测解离120秒。通过扣除在蛋白质未固定化的参比流通池中获得的应答，校正本体折射率差异。所有双特异性构建体都可以同时结合人GITR和人FAP。
4.2.2与表达GITR的RPMI-8226细胞、HEK细胞、活化的人T细胞或表达FAP的3T3细胞结合
通过使用各种细胞来测试与细胞表面GITR的结合。从人骨髓瘤患者中分离出RPMI-8226(
Figure BDA0003872289030001802
CCL-155TM)，并且这些细胞在细胞表面处内源性表达高水平的GITR(Liu et al.,Novel Tumor Suppressor Function of Glucocorticoid-Induced TNFReceptor GITR in Multiple Myeloma,2013,PLoS ONE 8(6):e66982)。根据制造商的说明，使用GenScript提供的CRISPR/CAS9试剂盒(CAS9和gRNA表达载体)通过基因敲除来对细胞系进行工程化改造，以获得不表达GITR的对照细胞系RPMI-8226GITR-/-。简而言之，含有CAS9和GITR特异性gRNA的基于慢病毒的载体被用于使用聚凝胺转导RPMI-8226细胞。在选择后，针对GFP和GITR表达，对细胞池进行分选，并选择GFP+/GITR-细胞。从这些池中生成单个克隆，并通过FACS分析GITR表达。从经测试对GITR表达呈阴性的克隆中分离出基因组DNA，对GITR基因座进行扩增和测序。RPMI-8226GITR+/+和GITR-/-细胞系生长在含有GlutaMAX补充剂和HEPES的RPMI1640培养基(Thermo Fischer，目录号72400-054)中，该培养基补充有10％FBS(Thermo Fischer，目录号16140-071)、1mM丙酮酸钠(Thermo Fischer，目录号11360-088)和50U/mL青霉素-链霉素(Thermo Fischer，目录号15070-063)。
通过用病毒样颗粒(VLP)转导生成过表达人或食蟹猴GITR/TNFRSF18的HEK293T(ATCC CRL11268)细胞系。通过将HEK293T细胞与ViraSafeTM慢病毒包装质粒(CellBiolabs)和编码人或食蟹猴GITR/TNFRSF18的慢病毒表达载体共转染而产生基于慢病毒的病毒样颗粒。根据制造商的说明，使用Lipofectamine LTX(Invitrogen,#15338100)将质粒转染到HEK293T细胞中。在6孔板中进行转染，在转染前一天接种6×105个细胞/孔和2.5μg质粒DNA。每次转染含有0.4μg pRSV-Rev包装载体、0.4μg pCgpV包装载体、0.4μg pCMV-VSV-G包膜载体和1.3μg人或食蟹猴GITR/TNFRSF18表达载体。48小时后收集含有VLP的上清液，并通过0.45μm孔径的聚醚砜膜过滤。为了生成稳定的GITR/TNFRSF18表达细胞系，以1.0×106个细胞/孔将HEK293T细胞接种在6孔板中，并用1mL含有VLP的上清液覆盖。在800x g和32℃下，在Eppendorf离心机5810台式离心机(Eppendorf)中，通过旋转接种30分钟来进行转导。旋转接种后12小时将病毒上清液换成新鲜培养基。转导后三天，加入嘌呤霉素，使其浓度达到1μg/mL，并且将细胞培养数代。初始筛选后，通过BD FACSAria III细胞分选仪(BD Biosciences)对GITR/TNFRSF18细胞表面表达最高的细胞进行分选，并培养以建立稳定的细胞克隆。使用人/食蟹猴交叉反应性APC偶联的抗GITR/TNFRSF18抗体(eBioscience,#17-5875-42)通过FACS分析确认表达水平和稳定性，为期4周。作为对照的表达GITR的HEK细胞或亲本GITR阴性HEK细胞(HEK WT)生长在DMEM培养基(ThermoFischer，目录号42430-082)中，该培养基补充有10％FBS(Thermo Fischer，目录号16140-071)、50U/mL青霉素-链霉素(Thermo Fischer，目录号15070-063)和GlutaMAX(ThermoFischer，目录号35050-061)与仅用于表达GITR的细胞的1μg/mL嘌呤霉素(ThermoFischer，目录号A11138-03)一起生长。
通过从血沉棕黄层分离的外周血单核细胞，使用标准密度梯度程序(Stemcell，目录号07851)与活化的人T细胞上的GITR结合。将PBMC重悬浮于由含有GlutaMAX补充剂和HEPES的RPMI1640培养基(Thermo Fischer，目录号72400-054)组成的T细胞培养基中，该RPMI1640培养基补充有10％FBS(Thermo Fischer，目录号16140-071)、1mM丙酮酸钠(Thermo Fischer，目录号11360-088)、1X MEM非必需氨基酸溶液(Thermo Fischer，目录号11140035)、50μM 2-巯基乙醇(Thermo Fischer，目录号31350-010)和50U/mL青霉素-链霉素(Thermo Fischer，目录号15070-063)。在T细胞培养基中，在37℃、5％CO2和300U/mlProleukin(Novartis，Aldesleukin)和2.5ug/ml白细胞凝集素(Sigma，目录号L4144)下将PBMC活化48小时。
使用转染以表达人成纤维细胞活化蛋白(huFAP)的3T3细胞(ATCC CRL-1658)测试与细胞表面FAP的结合。3T3细胞生长在DMEM培养基(Thermo Fischer，目录号31966047)中，该培养基补充有10％CS(Sigma目录号C8056)，而3T3-huFAP细胞生长在补充有1.5μg/mL嘌呤霉素(Thermo Fischer，目录号A11138-03)。
对于结合实验，用胰蛋白酶(Thermo Fischer，目录号25300096)收集贴壁细胞并用PBS(Thermo Fischer，目录号20012-019)。用0.25μM的CellTraceTMCFSE细胞增殖试剂盒(Thermo Fischer，目录号C34554)在PBS中在37℃下将对照细胞(HEK WT,亲本3T3或RPMI-8226GITR-/-)标记7分钟。最后重悬浮在PBS+2％FBS中之前，用相应的培养基将细胞洗涤两次，并用PBS+2％FBS洗涤一次。将105个对照细胞与105个表达GITR或FAP的未标记靶细胞在圆底96孔板(TPP，目录号92097)。将板在4℃下以600x g离心3分钟并将上清液甩出。将细胞重悬浮于50μL/孔的4℃冷PBS+2％FBS中，其含有各种滴定抗体构建体，并在4℃下孵育60分钟。用冷PBS+2％FBS将板洗涤两次以去除未结合的构建体。用Zombie Aqua Fixable可固定活性试剂盒(Biolegend目录号423102)和菌种特异性第二抗体(Jackson ImmunoResearch目录号109-116-098，115-116-071或111-116-144)，在PBS中于4℃下将细胞染色30分钟。用PBS+2％FBS将板洗涤两次。将细胞重悬浮于100μL/孔FACS缓冲液(eBioscience目录号00-4222-26)中以使用4个激光器LSR II(具有DIVA软件的BD Bioscience)进行采集。
4.2.3双特异性GITR抗原结合分子对GITR和FAP的功能特性
一种测量GITR激动剂效力的方法是使用细胞表面上表达GITR的工程化改造Jurkat细胞来评估NFκB的活化，该细胞表面具有在NFκB控制下的荧光素酶基因(PromegaGITR bioassay，目录号CS184003)。为此，按照制造商的说明，在存在分子滴定的情况下将NIH/3T3-huFAP克隆19细胞和工程化改造的Jurkat细胞接种在96孔平底板(TPP目录号92096)中，以实现FAP介导的双特异性分子在NIH/3T3-huFAP克隆19细胞表面上的结合，从而增强人GITR在Jurkat细胞的细胞表面上的寡聚化。GITR的这种寡聚化导致由Jurkat细胞表达荧光素酶，并在37℃、5％CO2下孵育六小时后可测量发光。根据制造商的说明，通过添加等体积的Bio-Glo或One-Glo试剂(Promega目录号G7941 or E6120)至孔中来测量发光，并在多模式读板器上获取(Tecan Spark或Perkin Elmer Envision)。
因此，我们测试了具有不同C-末端变体的2+1形式的双特异性GITR抗原结合分子的NFκB活化能力。结果在图14中示出。所有GITR抗原结合分子均诱导剂量依赖性NKκB活化。EPKSCS和EPKSCG变体的生物活性与具有C-末端EPKSC的分子P1AE1116具有相当的强度。
实例5
预先存在的抗药物抗体反应性的评估和改善
5.1预先存在的抗药物抗体(ADA)反应性的评估
为了评估预先存在的IgG干扰的根本原因，在人个体血浆样品中进行了探索性ELISA，以检测抗药物抗体(ADA)。它使用针对药物Fc结构域中氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“PGLALA修饰”)的生物素化抗PGLALA抗体作为捕获试剂，并且使用地高辛标记的Fcγ受体I(CD64)作为检测试剂，其与作为ADA药物复合物一部分的没有PGLALA修饰的人IgG结合。为了比较预先存在的IgG对不同药物分子的干扰，在同一组初始人个体血浆样品上进行该测定。
在第一步中，将2μg/mL生物素化的抗PGLALA抗体包被在链霉亲和素包被的微量滴定板上。同时，在室温下，用含有6.7x10-9 mol/L相应药物分子的缓冲液将初始人个体血浆样品(BioIVT)预孵育30分钟，以允许形成药物-抗-药物抗体复合物。在样品的孵育和洗涤步骤后，可以用0.5μg/mL的高辛标记的Fcγ受体I(CD64)检测作为免疫复合物的一部分并结合到表面的没有PGLALA修饰的人IgG。洗涤后，添加多克隆抗地高辛-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(50mU/mL)并孵育。在另一个洗涤步骤和向微量滴定板中添加ABTS(2,2'-叠氮二(Azinobis)[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐)底物溶液后，抗体酶缀合物的HRP催化显色反应。ELISA读数器测量405nm波长处的吸收。[(Wessels et al,Bioanalysis 2017,9(11),849-859)。
5.2改善预先存在的抗药物抗体(ADA)反应性
如WO 2017/060144 A1中描述的双特异性抗原结合分子OX40(49B4)x FAP(4B9)(4+1)VH/VL在初始人血浆样品中探索预先存在的IgG干扰。如图15A所示，观察到具有高信号的高发生率。Holland等人(J.Clin.Immunol.2013,33,1192–1203)发表了包含在另一类分子中OX40(49B4)xFAP(4B9)(4+1)VH/VL中的类似VH/VL片段，其已显示出对人抗VH自身抗体的反应性。因此，有人质疑用携带FAP结合剂的Fab片段取代VH/VL片段是否会导致本发明的抗原结合分子中的ADA反应性降低。
如图15A至15C所示，产生类似于OX40(49B4)x FAP(4B9)(4+1)VH/VL，但具有携带FAP结合剂的交叉Fab片段的抗原结合分子P1AE6836，并在同一组初始人血浆样品中研究预先存在的IgG反应性。与OX40(49B4)x FAP(4B9)(4+1)VH/VL相比，具有减弱的信号的P1AE6836仍然显示出预先存在的IgG干扰，并且在不同的个体人样品中，表明对于携带FAP结合剂的交叉Fab片段的不同类型的预先存在的抗药物抗体(图15B)。一个类似的分子，但包含人源化FAP克隆1G1a(P1AE6838，图15C)，确认了用包含FAP 4B9克隆(P1AE6836)的分子获得的结果，表明FAP克隆不是预先存在的IgG反应性的根本原因。
如图16所示，所有双特异性抗原结合分子共享FAP(1G1a)抗原结合结构域，但不同的抗OX40克隆(49B4、8H9、MOX0916和CLC-563)显示出相同的预先存在的IgG干扰，表明OX40克隆不是预先存在的IgG反应性的根本原因。
在图17A中，用包含OX40(49B4)克隆(P1AD3690)(4+0)的对照分子、包含四个OX40(49B4)Fab片段的非靶向分子、包含人源化FAP(1G1a)Fab片段的FAP(1G1a)分子(P1AE1689)和种系对照抗体(P1AD5108,DP47)来测试人个体血浆样品的子集。这些分子不会引起预先存在的IgG反应性，并因此显示出低背景信号。图17B示出OX40的所有化合价(2+1、3+1和4+1)导致预先存在的IgG干扰，信号高度呈2+1>3+1>4+1的略有增加趋势，可能是由于空间位阻。
文献(Kim et al,MABS 2016,8,1536–1547)表明，几种与侵袭性疾病相关的蛋白酶能够切割铰链区中的抗体，因此生成抗铰链抗体的新表位。因此，我们在Fab片段的CH1结构域中产生了具有不同C-末端氨基酸的分子，该Fab片段与Fc结构域的C-末端融合，并因此具有“自由”铰链样区。鉴于具有EPKSC(SEQ ID NO:6)的C-末端氨基酸序列的原始双特异性抗体，产生了具有EPKSCS(SEQ ID NO:1)、EPKSCG(SEQ ID NO:2)、EPKSCD(SEQ ID NO:3)、EPKSCDK(SEQ ID NO:4)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:5)的C-末端氨基酸序列的变体。
为了评估抗原结合分子OX40(49B4)x FAP(1G1a)(3+1)的C-末端延伸变体，测试了同一组人个体血清样品(图18A)，并减去其个体背景信号(图18C)。通过在没有药物分子的情况下进行测定来测量个体背景信号(图18B)。
在分子OX40(MOXR0916)x FAP(1G1a)(3+1)(P1AF4845)中通过在上铰链区的这个位置处的天然存在的天冬氨酸生成了C-末端的延伸(图19B)。与具有游离C-末端的分子P1AE8786相比，这种修饰导致预先存在的IgG反应性降低(图19A)。为了完全消除预先存在的IgG反应性，生成了具有C-末端丝氨酸的变体。这个丝氨酸不是天然位于上铰链区的这个位置处。如图19C所示，分子P1AF4851的丝氨酸对C-末端的延伸导致预先存在的IgG反应性的完全消除。
图20A至图20C示出了了2+1形式的相应分子组，并证实了先前的结果，即与具有游离C-末端EPKSC(P1AE6840，图20A)的分子OX40(49B4)x FAP(1G1a)(2+1)相比，天冬氨酸的C-末端延伸(具有EPKSCD端的分子OX40(MOXR0916)x FAP(1G1a)(2+1)与，P1AF4852，图20B)减少，而C-末端丝氨酸(具有EPKSCS端的分子OX40(MOXR0916)xFAP(1G1a)(2+1)，P1AF4858，图20C)消除了与血浆中预先存在的抗体的反应性。
图21A至图21H示出了一组C-末端延伸增加的OX40(MOXR0916)xFAP(1G1a)分子。与具有游离C-末端EPKSC的分子OX40(MOXR619)xFAP(1G1a)(2+1)(P1AE8872，图21A)相比，天冬氨酸的C-末端延伸(具有EPKSCD端的分子OX40(MOXR0916)x FAP(1G1a)(2+1)，P1AF4852，图21B)降低了与血浆中先前存在的抗体的反应性，而对于C-末端EPKSCDK(分子(MOXR619)xFAP(1G1a)(3+1)，P1AF4846，图21C)则观察到反应性略有增加。对于具有C-末端EPKSCDKT的分子(分子(MOXR619)x FAP(1G1a)(3+1)，P1AF4847，图21D)，已观察到高反应性。对于具有C-末端EPKSCDKTH的分子(分子(MOXR619)x FAP(1G1a)(2+1)，P1AF4855，图21E)和具有C-末端EPKSCDKTHT的分子(分子(MOXR619)x FAP(1G1a)(2+1)，P1AF4856，图21F)，反应性再次降低。用氨基酸L取代C-末端T，这在上铰链区中的这个位置处不是天然存在的，完全地消除了与血浆中先前存在的抗体的反应性(分子(MOXR619)x FAP(1G1a)(2+1)，P1AF4857，图21G)，与C-末端丝氨酸(具有EPKSCS端的分子OX40(MOXR0916)x FAP(1G1a)(2+1)，P1AF4858，图21H)相当。图22总结了结果。
从图23A至图23F中可以看出，另外三个分子实例强化了以下发现：额外的C-末端丝氨酸完全消除了预先存在的ADA反应性(图23B、23D和图23F)，而C-末端天冬氨酸减少了不需要的干扰(图23A、23C和图23E)。
此外，还测试了一组GITR双特异性抗原结合分子，即双特异性抗原结合分子GITRx FAP(4B9)(2+1)及其具有EPKSCS端(P1AG1036)和EPKSCG端(P1AG1039)的C-末端变体。结果在图24A至图24C中示出。它证实了先前的结果，即与具有游离C-末端的相应分子(P1AE1116，图24A)相比，丝氨酸的C-末端延伸(P1AG1036，图24B)消除了与血浆中先前存在的抗体的反应性。与丝氨酸扩展变体类似，生成了另一个具有甘氨酸的扩展变体，其也不是天然位于上铰链区的这个位置处。甘氨酸扩展变体还消除了不需要的反应性(P1AG1039，图24C)。
***
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司
<120> 包含修饰的 C-末端 crossfab 片段的双特异性抗体
<130> P36817-WO
<150> EP20167624.4
<151> 2020-04-01
<160> 162
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1 连接子 C-末端 S-变体
<400> 1
Glu Pro Lys Ser Cys Ser
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1 连接子 C-末端 G-变体
<400> 2
Glu Pro Lys Ser Cys Gly
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1 连接子 C-末端 D-变体
<400> 3
Glu Pro Lys Ser Cys Gly
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1 连接子 C-末端 DK-变体
<400> 4
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1 连接子 C-末端 DKTHL-变体
<400> 5
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Leu
1 5 10
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1 连接子 C-末端
<400> 6
Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
1 5 10
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X 为 S 或 P
<400> 8
Cys Pro Xaa Cys Pro
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
1 5
<210> 11
<211> 760
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Met Lys Thr Trp Val Lys Ile Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Val Met Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val His
20 25 30
Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly
50 55 60
Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn Asn Ile Val Leu Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys
85 90 95
Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val
100 105 110
Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn
130 135 140
Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser
145 150 155 160
Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile
180 185 190
Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr
195 200 205
Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala
210 215 220
Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly
245 250 255
Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro
260 265 270
Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val Pro Ala Met Ile Ala Ser
275 280 285
Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val
290 295 300
Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile
305 310 315 320
Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln
325 330 335
Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val
340 345 350
Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe
355 360 365
Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val
370 375 380
Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Asn Ile
385 390 395 400
Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu
405 410 415
Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr
420 425 430
Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys
435 440 445
Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu
450 455 460
Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg
465 470 475 480
Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
485 490 495
Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu
500 505 510
Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe
515 520 525
Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro
530 535 540
Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr
545 550 555 560
Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly
565 570 575
Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu
580 585 590
Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile
595 600 605
Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser
610 615 620
Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu
625 630 635 640
Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr
645 650 655
Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp
660 665 670
Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr
675 680 685
Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn
690 695 700
Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala
705 710 715 720
Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Leu
725 730 735
Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu
740 745 750
Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp
755 760
<210> 12
<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 FAP 胞外域+poly-lys-标签+his6-标签
<400> 12
Arg Pro Ser Arg Val His Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe
20 25 30
Pro Asn Trp Ile Ser Gly Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn
35 40 45
Asn Ile Val Leu Tyr Asn Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu
50 55 60
Ser Asn Arg Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser
65 70 75 80
Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp
85 90 95
Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly
100 105 110
Glu Phe Val Arg Gly Asn Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys
115 120 125
Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile
130 135 140
Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn
145 150 155 160
Gly Arg Glu Asn Lys Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu
165 170 175
Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly
180 185 190
Lys Phe Leu Ala Tyr Ala Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile
195 200 205
Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile
210 215 220
Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile
225 230 235 240
Ile Asp Thr Thr Tyr Pro Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val
245 250 255
Pro Ala Met Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp
260 265 270
Val Thr Asp Glu Arg Val Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn
275 280 285
Val Ser Val Leu Ser Ile Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp
290 295 300
Asp Cys Pro Lys Thr Gln Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp
305 310 315 320
Ala Gly Gly Phe Phe Val Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile
325 330 335
Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His
340 345 350
Tyr Ile Lys Asp Thr Val Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys
355 360 365
Trp Glu Ala Ile Asn Ile Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr
370 375 380
Ser Ser Asn Glu Phe Glu Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg
385 390 395 400
Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His
405 410 415
Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr
420 425 430
Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser
435 440 445
Thr Leu His Asp Gly Arg Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu
450 455 460
Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu
465 470 475 480
Glu Ile Lys Lys Leu Glu Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met
485 490 495
Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile
500 505 510
Gln Val Tyr Gly Gly Pro Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala
515 520 525
Val Asn Trp Ile Ser Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala
530 535 540
Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr
545 550 555 560
Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr
565 570 575
Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile
580 585 590
Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu
595 600 605
Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val
610 615 620
Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly
625 630 635 640
Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val
645 650 655
Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His
660 665 670
Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala
675 680 685
Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser
690 695 700
Asp Gln Asn His Gly Leu Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr
705 710 715 720
His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp Gly Lys
725 730 735
Lys Lys Lys Lys Lys Gly His His His His His His
740 745
<210> 13
<211> 761
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 13
Met Lys Thr Trp Leu Lys Thr Val Phe Gly Val Thr Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Val Val Ile Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val Tyr
20 25 30
Lys Pro Glu Gly Asn Thr Lys Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Tyr Phe Pro Asn Trp Ile Ser Glu
50 55 60
Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Glu Asp Asp Asn Ile Val Phe Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ser Thr Met Lys
85 90 95
Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val
100 105 110
Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Gln Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Tyr
130 135 140
Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser
145 150 155 160
Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Glu Asn Arg Ile
180 185 190
Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr
195 200 205
Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asp Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Val
210 215 220
Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ile Pro Ile Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Gly Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly
245 250 255
Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Val Phe Ile Val Asp Thr Thr Tyr Pro
260 265 270
His His Val Gly Pro Met Glu Val Pro Val Pro Glu Met Ile Ala Ser
275 280 285
Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Ser Ser Glu Arg Val
290 295 300
Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile
305 310 315 320
Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp His Ala Trp Glu Cys Pro Lys Asn Gln
325 330 335
Glu His Val Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val
340 345 350
Ser Thr Pro Ala Phe Ser Gln Asp Ala Thr Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe
355 360 365
Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val
370 375 380
Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Tyr Ile
385 390 395 400
Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu
405 410 415
Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Asn Ser
420 425 430
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435 440 445
Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Tyr Lys Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu
450 455 460
Val Cys Tyr Gly Pro Gly Leu Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg
465 470 475 480
Thr Asp Gln Glu Ile Gln Val Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
485 490 495
Ser Leu Arg Asn Ile Gln Leu Pro Lys Val Glu Ile Lys Lys Leu Lys
500 505 510
Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe
515 520 525
Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro
530 535 540
Cys Ser Gln Ser Val Lys Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Thr Tyr
545 550 555 560
Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly
565 570 575
Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Phe Leu His Ala Val Tyr Arg Lys Leu
580 585 590
Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Leu Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile
595 600 605
Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Glu Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser
610 615 620
Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu
625 630 635 640
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Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr
145 150 155 160
Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr
165 170 175
Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly
180 185 190
Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala
195 200 205
Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys
210 215 220
Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala
225 230 235 240
Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
245
<210> 25
<211> 272
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 25
Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr
20 25 30
Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met
35 40 45
Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu
50 55 60
Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys
65 70 75 80
Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr
85 90 95
Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg
100 105 110
Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro
115 120 125
Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn
130 135 140
Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu
145 150 155 160
Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu
165 170 175
Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val
180 185 190
Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro
195 200 205
Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu
210 215 220
Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp
225 230 235 240
Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr
245 250 255
Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile
260 265 270
<210> 26
<211> 241
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg
35 40 45
Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu
50 55 60
Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His
65 70 75 80
Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro
85 90 95
Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys
100 105 110
Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys
115 120 125
Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro
130 135 140
Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala
145 150 155 160
Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys
165 170 175
Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu
180 185 190
Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val
195 200 205
Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu
210 215 220
Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp
225 230 235 240
Val
<210> 27
<211> 241
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 27
Val Ala Arg His Gly Ala Met Cys Ala Cys Gly Thr Leu Cys Cys Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Cys Ala Ala Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Lys Asp Ala Arg
35 40 45
Cys Cys Arg Val His Pro Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Gln Ser Glu
50 55 60
Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Val Cys Val Gln Pro Glu Phe His
65 70 75 80
Cys Gly Asn Pro Cys Cys Thr Thr Cys Gln His His Pro Cys Pro Ser
85 90 95
Gly Gln Gly Val Gln Pro Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Arg Cys
100 105 110
Val Asp Cys Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Gly His Asp Gly His Cys
115 120 125
Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro
130 135 140
Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala
145 150 155 160
Glu Pro Pro Gly Trp Leu Thr Ile Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys
165 170 175
Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu
180 185 190
Gly Ser Gln Pro Thr Gly Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val
195 200 205
Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Ser Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu
210 215 220
Arg Gly Glu Arg Leu Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp
225 230 235 240
Val
<210> 28
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4S 肽接头
<400> 29
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)2
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SG4)2
<400> 31
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 32
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 33
Gly Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 2
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 35
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 3
<400> 35
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 4
<400> 36
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 5
<400> 37
Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser
1 5
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 6
<400> 38
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 7
<400> 39
Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 40
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 8
<400> 40
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 9
<400> 41
Gly Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 10
<400> 42
Gly Gly Asn Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 11
<400> 43
Gly Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP (212) CDR-H1
<400> 44
Asp Tyr Asn Met Asp
1 5
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP (212) CDR-H2
<400> 45
Asp Ile Tyr Pro Asn Thr Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP (212) CDR-H3
<400> 46
Phe Arg Gly Ile His Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP (212) CDR-L1
<400> 47
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Leu Ser Phe Ile Asn
1 5 10 15
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP (212) CDR-L2
<400> 48
Gly Thr Ser Asn Arg Gly Ser
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP (212) CDR-L3
<400> 49
Gln Gln Ser Asn Glu Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 50
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP (212) VH
<400> 50
Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ala Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Asn Thr Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Arg Gly Ile His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP (212) VL
<400> 51
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Arg Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 52
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP (1G1a) VH
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Asn Thr Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Arg Gly Ile His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 53
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP (1G1a) VL
<400> 53
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Arg Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H1
<400> 54
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H2
<400> 55
Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H3
<400> 56
Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr
1 5
<210> 57
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L1
<400> 57
Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L2
<400> 58
Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L3
<400> 59
Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 60
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) VH
<400> 60
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 61
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) VL
<400> 61
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 62
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H1
<400> 62
Ser His Ala Met Ser
1 5
<210> 63
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H2
<400> 63
Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H3
<400> 64
Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr
1 5
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L1
<400> 65
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L2
<400> 66
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L3
<400> 67
Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro Thr
1 5
<210> 68
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) VH
<400> 68
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 69
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) VL
<400> 69
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 OX40 (49B4) CDR-H1
<400> 70
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 OX40 (49B4) CDR-H2
<400> 71
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 OX40 (49B4) CDR-H3
<400> 72
Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr
1 5
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 OX40 (49B4) CDR-L1
<400> 73
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 OX40 (49B4) CDR-L2
<400> 74
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 OX40 (49B4) CDR-L3
<400> 75
Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr Thr
1 5
<210> 76
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (49B4) VH
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 77
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (49B4) VL
<400> 77
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 OX40 (CLC563) CDR-H1
<400> 78
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 79
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 OX40 (CLC563) CDR-H2
<400> 79
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 OX40 (CLC563) CDR-H3
<400> 80
Asp Val Gly Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 81
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 OX40 (CLC563) CDR-L1
<400> 81
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 OX40 (CLC563) CDR-L2
<400> 82
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 OX40 (CLC563) CDR-L3
<400> 83
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 84
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (CLC-563) VH
<400> 84
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Val Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 85
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (CLC-563) VL
<400> 85
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 86
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (MOXR0916) CDR-H1
<400> 86
Asp Ser Tyr Met Ser
1 5
<210> 87
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (MOXR0916) CDR-H2
<400> 87
Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1 5 10 15
Glu
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (MOXR0916) CDR-H3
<400> 88
Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val
1 5
<210> 89
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (MOXR0916) CDR-L1
<400> 89
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (MOXR0916) CDR-L2
<400> 90
Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser
1 5
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (MOXR0916) CDR-L3
<400> 91
Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 92
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (MOXR0916) VH
<400> 92
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 93
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (MOXR0916) VL
<400> 93
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 94
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (8H9) CDR-H1
<400> 94
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 95
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (8H9) CDR-H2
<400> 95
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 OX40 CDR-H3
<400> 96
Glu Tyr Gly Trp Met Asp Tyr
1 5
<210> 97
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (8H9) CDR-L1
<400> 97
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (8H9) CDR-L2
<400> 98
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 OX40 CDR-L3
<400> 99
Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Ser Arg Phe Thr
1 5 10
<210> 100
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 8H9 VH
<400> 100
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Gly Trp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 101
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 8H9 VL
<400> 101
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Ser Arg
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 102
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (49B4_K73E) VH
<400> 102
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 103
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (49B4_K23T_K73E) VH
<400> 103
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 104
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 (49B4_K23E_K73E) VH
<400> 104
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 105
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc 杵链
<400> 105
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 106
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc 臼链
<400> 106
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 107
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GITR (852.2) CDR-H1
<400> 107
Ser Tyr Thr Met Lys
1 5
<210> 108
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GITR (852.2) CDR-H2
<400> 108
Val Ile Ser Ala Asp Gly Gly Thr Thr Asp His Ala Ala Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 109
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GITR (852.2) CDR-H3
<400> 109
Asp Arg Ala Asn Asp Trp Ile Thr Gly Ala Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GITR (852.2) CDR-L1
<400> 110
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 111
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GITR (852.2) CDR-L2
<400> 111
Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GITR (852.2) CDR-L3
<400> 112
Gln Gln Ala Arg Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 113
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GITR (852.2) VH
<400> 113
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Lys Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Ala Asp Gly Gly Thr Thr Asp His Ala Ala Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Ala Asn Asp Trp Ile Thr Gly Ala Ser Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 114
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GITR (852.2) VL
<400> 114
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Arg Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 115
<211> 807
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(49B4) VHCH1- OX40(49B4) VHCH1- Fc 臼_PGLALA - FAP(4B9) VL
<400> 115
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
225 230 235 240
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
245 250 255
Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala
260 265 270
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly
275 280 285
Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala
290 295 300
Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
305 310 315 320
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro
325 330 335
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
340 345 350
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
355 360 365
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
370 375 380
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
385 390 395 400
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
405 410 415
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
420 425 430
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
435 440 445
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
450 455 460
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
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Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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755 760 765
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275 280 285
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450 455 460
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465 470 475 480
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530 535 540
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu
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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
705 710 715 720
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg
725 730 735
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ile Gly Ser
740 745 750
Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
755 760 765
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
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Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
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Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
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Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
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Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
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Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
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Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr
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Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
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Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
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355 360 365
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130 135 140
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
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245 250 255
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
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Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr
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290 295 300
Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
305 310 315 320
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr
325 330 335
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
340 345 350
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
355 360 365
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu
370 375 380
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
385 390 395 400
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
405 410 415
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
420 425 430
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu
435 440 445
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
450 455 460
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
465 470 475 480
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
485 490 495
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
500 505 510
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
515 520 525
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
530 535 540
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
545 550 555 560
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
565 570 575
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
580 585 590
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
595 600 605
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
610 615 620
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
625 630 635 640
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
645 650 655
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
660 665 670
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
675 680 685
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln
690 695 700
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys
705 710 715 720
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Arg
725 730 735
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Asn
740 745 750
Thr Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met
755 760 765
Thr Ile Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
770 775 780
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Arg Gly Ile
785 790 795 800
His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
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Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
820 825 830
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835 840 845
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865 870 875 880
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
885 890 895
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900 905 910
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915 920
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<211> 216
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<220>
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<400> 123
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50 55 60
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100 105 110
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
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<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(49B4) VHCH1- Fc 杵_PGLALA- FAP(1G1a) VHCL
<400> 126
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100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
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130 135 140
Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
465 470 475 480
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu
485 490 495
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500 505 510
Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Asn Thr Gly Gly Thr Ile Tyr Asn
515 520 525
Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Thr Ser Thr Ser
530 535 540
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
545 550 555 560
Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Arg Gly Ile His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
565 570 575
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro
580 585 590
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
595 600 605
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
610 615 620
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
625 630 635 640
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
645 650 655
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
660 665 670
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
675 680 685
Asn Arg Gly Glu Cys
690
<210> 127
<211> 920
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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VHCL
<400> 127
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1 5 10 15
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Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
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100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
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145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
225 230 235 240
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
245 250 255
Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
260 265 270
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
275 280 285
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
290 295 300
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
385 390 395 400
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
405 410 415
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435 440 445
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450 455 460
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
465 470 475 480
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530 535 540
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
545 550 555 560
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
565 570 575
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
580 585 590
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
595 600 605
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610 615 620
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
625 630 635 640
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
645 650 655
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
660 665 670
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
675 680 685
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
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820 825 830
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(CLC563) 轻链
<400> 128
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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130 135 140
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145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
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195 200 205
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Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
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Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr
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Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
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515 520 525
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
530 535 540
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala
545 550 555 560
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
565 570 575
Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
580 585 590
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
595 600 605
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
610 615 620
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu
625 630 635 640
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
645 650 655
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
660 665 670
Leu Ser Pro
675
<210> 137
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(1G1a) VLCH1-轻链 (EPKSCDK)
<400> 137
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Arg Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
180 185 190
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215
<210> 138
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(1G1a) VLCH1-轻链 (EPKSCDKT)
<400> 138
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Arg Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
180 185 190
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215
<210> 139
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(1G1a) VLCH1-轻链 (EPKSCDKTH)
<400> 139
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Arg Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
180 185 190
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
<210> 140
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 140
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
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305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 141
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(1G1a) VLCH1-轻链 (EPKSCDKTHT)
<400> 141
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Arg Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
180 185 190
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
<210> 142
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(1G1a) VLCH1-轻链 (EPKSCDKTHL)
<400> 142
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Arg Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
180 185 190
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Leu
210 215 220
<210> 143
<211> 691
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(8H9) VHCH1- Fc 杵_PGLALA-FAP(1G1a) VHCL
<400> 143
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Gly Trp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
465 470 475 480
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp
485 490 495
Tyr Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
500 505 510
Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Asn Thr Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys
515 520 525
Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val
530 535 540
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
545 550 555 560
Cys Thr Arg Phe Arg Gly Ile His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
565 570 575
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
580 585 590
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
595 600 605
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
610 615 620
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
625 630 635 640
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
645 650 655
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
660 665 670
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
675 680 685
Gly Glu Cys
690
<210> 144
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(8H9) 轻链
<400> 144
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Ser Arg
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 145
<211> 673
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(8H9) VHCH1- OX40(8H9) VHCH1- Fc 臼_PGLALA
<400> 145
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Gly Trp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
225 230 235 240
Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly
245 250 255
Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
260 265 270
Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn
275 280 285
Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser
290 295 300
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
305 310 315 320
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Gly Trp Met Asp Tyr Trp Gly
325 330 335
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
340 345 350
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
355 360 365
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
370 375 380
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
385 390 395 400
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
405 410 415
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
420 425 430
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
435 440 445
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
450 455 460
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
465 470 475 480
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
485 490 495
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
500 505 510
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
515 520 525
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
530 535 540
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
545 550 555 560
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
565 570 575
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
580 585 590
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
595 600 605
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
610 615 620
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
625 630 635 640
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
645 650 655
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
660 665 670
Pro
<210> 146
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(8H9) VHCH1- Fc 臼_PGLALA
<400> 146
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Gly Trp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
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450 455 460
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
465 470 475 480
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
485 490 495
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
500 505 510
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
515 520 525
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
530 535 540
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
545 550 555 560
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
565 570 575
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
580 585 590
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
595 600 605
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
610 615 620
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
625 630 635 640
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
645 650 655
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
660 665 670
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
675 680 685
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln
690 695 700
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys
705 710 715 720
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Arg
725 730 735
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Asn
740 745 750
Thr Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met
755 760 765
Thr Ile Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
770 775 780
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Arg Gly Ile
785 790 795 800
His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
805 810 815
Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
820 825 830
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
835 840 845
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
850 855 860
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
865 870 875 880
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
885 890 895
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
900 905 910
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
915 920
<210> 152
<211> 677
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40(49B4_K23E_K73E) VHCH1-OX40(49B4_K23E_K73E) VHCH1-Fc
臼_PGLALA
<400> 152
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
225 230 235 240
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser
245 250 255
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
260 265 270
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr
275 280 285
Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp
290 295 300
Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
305 310 315 320
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Arg Gly Pro Tyr
325 330 335
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
340 345 350
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
355 360 365
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu
370 375 380
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
385 390 395 400
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
405 410 415
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
420 425 430
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu
435 440 445
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
450 455 460
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
465 470 475 480
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
485 490 495
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
500 505 510
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
515 520 525
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
530 535 540
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
545 550 555 560
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
565 570 575
Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
580 585 590
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
595 600 605
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
610 615 620
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
625 630 635 640
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
645 650 655
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
660 665 670
Leu Ser Leu Ser Pro
675
<210> 153
<211> 697
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GITR(852.2) VHCH1- Fc 杵_PGLALA- FAP(4B9) VHCL
<400> 153
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Lys Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Ala Asp Gly Gly Thr Thr Asp His Ala Ala Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Ala Asn Asp Trp Ile Thr Gly Ala Ser Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser
465 470 475 480
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
485 490 495
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln
500 505 510
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly
515 520 525
Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
530 535 540
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
545 550 555 560
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly
565 570 575
Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
580 585 590
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
595 600 605
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
610 615 620
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
625 630 635 640
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
645 650 655
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
660 665 670
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
675 680 685
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
690 695
<210> 154
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GITR(852.2) 轻链
<400> 154
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Arg Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 155
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GITR(852.2) VHCH1- Fc 臼_PGLALA
<400> 155
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Lys Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Ala Asp Gly Gly Thr Thr Asp His Ala Ala Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Ala Asn Asp Trp Ile Thr Gly Ala Ser Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro
450
<210> 156
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) VLCH1-轻链 (EPKSCS)
<400> 156
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
130 135 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
145 150 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
180 185 190
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
195 200 205
Glu Pro Lys Ser Cys Ser
210
<210> 157
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) VLCH1-轻链 (EPKSCG)
<400> 157
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
130 135 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
145 150 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
180 185 190
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
195 200 205
Glu Pro Lys Ser Cys Gly
210
<210> 158
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1-EPKSCS
<400> 158
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
1 5 10 15
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
20 25 30
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
35 40 45
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
65 70 75 80
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
85 90 95
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Ser
100 105
<210> 159
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1-EPKSCG
<400> 159
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
1 5 10 15
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
20 25 30
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
35 40 45
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
65 70 75 80
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
85 90 95
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly
100 105
<210> 160
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1-EPKSCD
<400> 160
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
1 5 10 15
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
20 25 30
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
35 40 45
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
65 70 75 80
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
85 90 95
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
100 105
<210> 161
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1-EPKSCDK
<400> 161
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
1 5 10 15
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
20 25 30
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
35 40 45
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
65 70 75 80
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
85 90 95
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
100 105
<210> 162
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1-EPKSCDKTHL
<400> 162
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
1 5 10 15
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
20 25 30
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
35 40 45
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
65 70 75 80
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
85 90 95
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Leu
100 105 110

Claims (25)

1.一种双特异性抗原结合分子，其包含能够与第一抗原特异性结合的第一Fab片段和第二Fab片段，和能够与第二抗原特异性结合的第三Fab片段，以及由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域，其中
(a)能够与第一抗原特异性结合的所述第一Fab片段在其C-末端处融合至第一Fc结构域亚基的N-末端；
(b)能够与第一抗原特异性结合的所述第二Fab片段在其C-末端处融合至第二Fc结构域亚基的N-末端；
(c)能够与第二抗原特异性结合的所述第三Fab片段为交叉fab片段，其中恒定结构域CH1和CL被彼此替换，并且VH结构域的N-末端融合至Fc结构域亚基之一的C-末端，并且其中所述交叉fab片段的所述CH1结构域以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCS(SEQ ID NO:1)、EPKSCG(SEQ ID NO:2)、EPKSCD(SEQ ID NO:3)、EPKSCDK(SEQ ID NO:4)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:5)。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子对于先前存在的抗药物抗体具有降低的反应性或没有反应性。
3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗原结合分子，其中crossfab片段的所述CH1结构域以EPKSCS(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列终止。
4.根据权利要求1或2所述的双特异性抗原结合分子，其中crossfab片段的所述CH1结构域以EPKSCG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列终止。
5.根据权利要求1或2所述的双特异性抗原结合分子，其中crossfab片段的所述CH1结构域以选自由以下项组成的组的氨基酸序列终止：EPKSCD(SEQ ID NO:3)、EPKSCDK(SEQ IDNO:4)和EPKSCDKTHL(SEQ ID NO:5)。
6.根据权利要求1或2或5所述的双特异性抗原结合分子，其中crossfab片段的所述CH1结构域以EPKSCD(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列终止。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子与所述第一抗原二价结合并与所述第二抗原单价结合。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其包含：
(a)两个重链，每个重链包含能够与所述第一抗原特异性结合的Fab片段的VH和CH1结构域，以及Fc结构域亚基，
(b)两个轻链，每个轻链包含能够与所述第一抗原特异性结合的Fab片段的VL和CL结构域，以及
(c)能够与所述第二抗原特异性结合的交叉fab片段，所述交叉fab片段包含VL-CH1链和VH-CL链，其中所述VH-CL链与(a)的所述两个重链之一的C-末端连接。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含能够与所述第一抗原特异性结合的第四Fab片段，其中所述第四Fab片段在VH-CH1链的C-末端处与能够与所述第一抗原特异性结合的所述第一Fab片段的VH-CH1链的N-末端融合。
10.根据权利要求1至6或9中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子与所述第一抗原三价结合并与所述第二抗原单价结合。
11.根据权利要求1至6或9或10中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其包含：
(a)重链，所述重链包含能够与所述第一抗原特异性结合的所述第一Fab片段的VH-CH1链、Fc结构域亚基、以及能够与所述第二抗原特异性结合的所述第三Fab片段的VH-CL链，所述第一Fab片段的所述VH-CH1链在其N-末端处融合至能够与所述第一抗原特异性结合的所述第四Fab片段的VH-CH1链，任选地经由肽接头，所述第三Fab片段的所述VH-CL链融合至Fc区亚基的C-末端，任选地经由肽接头，
(b)重链，所述重链包含能够与第一抗原特异性结合的所述第二Fab片段的VH-CH1结构域，以及Fc结构域亚基，
(c)三个轻链，每个轻链包含能够与所述第一抗原特异性结合的Fab片段的VL和CL结构域，以及
(d)轻链，所述轻链包含能够与所述第二抗原特异性结合的所述第三Fab片段的VL和CH1结构域。
12.根据权利要求1至6或9或10中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其包含：
(a)重链，所述重链包含能够与所述第一抗原特异性结合的所述第一Fab片段的VH-CH1链、Fc结构域亚基，所述第一Fab片段的所述VH-CH1链在其N-末端处融合至能够与所述第一抗原特异性结合的所述第四Fab片段的VH-CH1链，任选地经由肽接头，
(b)重链，所述重链包含能够与第一抗原特异性结合的所述第二Fab片段的VH-CH1结构域和Fc区亚基、以及能够与所述第二抗原特异性结合的所述第三Fab片段的VH-CL链，所述第三Fab片段的所述VH-CL链融合至所述Fc结构域亚基的C-末端，任选地经由肽接头，
(c)三个轻链，每个轻链包含能够与所述第一抗原特异性结合的Fab片段的VL和CL结构域，以及
(d)轻链，所述轻链包含能够与所述第二抗原特异性结合的Fab片段的VL和CH1结构域。
13.根据权利要求1至6或9中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含能够与所述第一抗原特异性结合的第五Fab片段，其中所述第五Fab片段在所述VH-CH1链的所述C-末端处融合至能够与所述第一抗原特异性结合的所述第二Fab片段的VH-CH1链的N-末端。
14.根据权利要求1至6或13中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子与所述第一抗原四价结合并与所述第二抗原单价结合。
15.根据权利要求1至6或13或14中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其包含：
(a)重链，所述重链包含能够与所述第一抗原特异性结合的第一Fab片段的VH-CH1链、Fc结构域亚基、以及能够与所述第二抗原特异性结合的所述第三Fab片段的VH-CL链，所述第一Fab片段的所述VH-CH1链在其N-末端处融合至能够与所述第一抗原特异性结合的所述第四Fab片段的VH-CH1链，任选地经由肽接头，所述第三Fab片段的所述VH-CL链融合至Fc区亚基的C-末端，任选地经由肽接头，
(b)重链，所述重链包含能够与第一抗原特异性结合的所述第二Fab片段的VH-CH1结构域、Fc结构域亚基，所述第二Fab片段的所述VH-CH1结构域在其N-末端处融合至能够与所述第一抗原特异性结合的所述第五Fab片段的VH-CH1链，任选地经由肽接头，
(c)三个轻链，每个轻链包含能够与所述第一抗原特异性结合的Fab片段的VL和CL结构域，以及
(d)轻链，所述轻链包含能够与所述第二抗原特异性结合的所述第三Fab片段的VL和CH1结构域。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域为IgG，特别地为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域，并且/或者其中所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代降低所述抗体与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域属于人IgG1亚类，具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat进行EU编号)。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中根据杵臼结构方法，所述Fc结构域的所述第一亚基包含杵并且所述Fc结构域的所述第二亚基包含臼。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域的所述第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(根据Kabat进行EU编号)，并且所述Fc结构域的所述第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat进行EU编号)。
20.分离的核酸，其编码根据权利要求1至19中任一项所述的双特异性抗原结合分子。
21.一种表达载体，其包含根据权利要求20所述的分离的核酸。
22.一种宿主细胞，其包含根据权利要求20所述的分离的核酸或根据权利要求21所述的表达载体。
23.一种生产双特异性抗原结合分子的方法，其包括在适合于表达所述双特异性抗原结合分子的条件下培养根据权利要求22所述的宿主细胞，以及分离所述双特异性抗原结合分子。
24.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至19中任一项所述的双特异性抗原结合分子和药用载体。
25.根据权利要求1至19中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其用作药物。
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