TW201321413A - 雙特異性活化ｔ細胞之抗原結合分子 - Google Patents

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Abstract

本發明大體上係關於用於T細胞活化及重引導至特定目標細胞之新穎雙特異性抗原結合分子。此外，本發明係關於編碼該等雙特異性抗原結合分子之聚核苷酸，及包含該等聚核苷酸之載體及宿主細胞。本發明此外係關於製造本發明之雙特異性抗原結合分子之方法，及使用此等雙特異性抗原結合分子治療疾病之方法。

Description

雙特異性活化T細胞之抗原結合分子
本發明大體上係關於用於活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。此外，本發明係關於編碼該等雙特異性抗原結合分子之聚核苷酸，及包含該等聚核苷酸之載體及宿主細胞。本發明此外係關於製造本發明之雙特異性抗原結合分子之方法，及使用此等雙特異性抗原結合分子治療疾病之方法。
在多種臨床配置中常常需要選擇性破壞個別細胞或特定細胞類型。舉例而言，癌症療法之主要目標在於特異性破壞腫瘤細胞，而保持健康細胞及組織完整且不受損傷。
達成此目的之一種有吸引力的方式為藉由誘導針對腫瘤之免疫反應，使諸如天然殺手(NK)細胞或細胞毒性T淋巴細胞(CTL)之免疫效應細胞攻擊並破壞腫瘤細胞。CTL構成免疫系統之最有效之效應細胞，然而其不能由習知治療性抗體之Fc域所介導之效應機制活化。
在此方面，經設計成用一個「臂」結合至目標細胞之表面抗原且用第二「臂」結合至T細胞受體(TCR)複合物之活化不變組分的雙特異性抗體近年來已變得備受關注。該種抗體同時結合至其兩個目標將促成目標細胞與T細胞之間的暫時性相互作用，引起任何細胞毒性T細胞活化，隨後目標細胞溶解。因此，免疫反應被重引導至目標細胞且與目標細胞之肽抗原呈遞或T細胞之特異性無關，而此對於 正常MHC限制之CTL活化係相關的。在此情形下，重要的為CTL僅在目標細胞向其呈遞雙特異性抗體(亦即模擬免疫突觸)時活化。尤其需要的為不需要淋巴細胞預調節或協同刺激來引發目標細胞之有效溶解的雙特異性抗體。
已開發出數種雙特異性抗體形式且研究其用於T細胞介導之免疫療法的適用性。其中，所謂的BiTE(雙特異性T細胞接合劑)分子已得以充分表徵且已顯示一些臨床前景(於Nagorsen及Bäuerle,Exp Cell Res 317,1255-1260(2011)中綜述)。BiTE為串聯的scFv分子，其中兩個scFv分子由可撓性連接子融合。正針對T細胞接合加以評估之其他雙特異性形式包括雙功能抗體(Holliger等人，Prot Eng 9,299-305(1996))及其衍生物，諸如串聯雙功能抗體(Kipriyanov等人，J Mol Biol 293,41-66(1999))。更近期開發所謂DART(雙親和力重靶向)分子，其係基於雙功能抗體形式但以具有C端二硫橋鍵達成額外穩定化為特徵(Moore等人，Blood 117,4542-51(2011))。為全雜合小鼠/大鼠IgG分子且當前亦正在臨床試驗中加以評估的所謂的三功能單抗(triomab)代表更大尺寸之形式(於Seimetz等人，Cancer Treat Rev 36,458-467(2010)中綜述)。
正在開發之多種形式在免疫療法中顯示歸因於T細胞重引導及活化之巨大潛力。然而，產生適用於此之雙特異性抗體之任務決非不重要的，而涉及很多必須面對的與抗體之功效、毒性、適用性及製造能力相關之挑戰。
諸如BiTE分子之小型構築體雖然能有效地使效應細胞與 目標細胞交聯，但具有極短的血清半衰期，由此需要其藉由連續輸注向患者投與。另一方面，類似IgG之形式雖然具有長半衰期之巨大益處，但受與IgG分子固有之天然效應功能相關之毒性影響。其免疫原性潛力構成類似IgG之雙特異性抗體(尤其非人類形式)對於成功治療性開發之另一不利特徵。最終，綜合開發雙特異性抗體之主要挑戰為以臨床上充足的量及純度製造雙特異性抗體構築體，此係由於不同特異性之抗體重鏈與輕鏈在共表現後會發生錯配，由此降低正確組裝之構築體之產率且產生許多非功能性副產物，所要雙特異性抗體難以與其分離。
鑒於與當前可用於T細胞介導之免疫療法之雙特異性抗體相關之困難及缺陷，仍需要該等分子之新穎改良形式。本發明提供經設計用於T細胞活化及重引導之雙特異性抗原結合分子，其將良好功效及製造能力與低毒性及有利藥物動力學性質組合。
在第一態樣中，本發明提供一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含第一及第二抗原結合部分，其中之一者為能夠特異性結合至活化T細胞抗原之Fab分子且其中之另一者為能夠特異性結合至目標細胞抗原之Fab分子，及由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成之Fc域；其中第一抗原結合部分為(a)單鏈Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈由肽連接子連接，或(b)交換Fab分子，其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變區或恆定區互換。
在一特定實施例中，不超過一個能夠特異性結合至活化T細胞抗原之抗原結合部分存在於活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中(亦即活化T細胞之雙特異性抗原結合分子提供與活化T細胞抗原之單價結合)。在特定實施例中，第一抗原結合部分為交換Fab分子。在更特定實施例中，第一抗原結合部分為交換Fab分子，其中Fab輕鏈與Fab重鏈之恆定區互換。
在一些實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之第一與第二抗原結合部分視情況經由肽連接子彼此融合。在一個該種實施例中，第二抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端。在另一該種實施例中，第一抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至第二抗原結合部分之Fab重鏈之N端。在另一該種實施例中，第二抗原結合部分於Fab輕鏈之C端處融合至第一抗原結合部分之Fab輕鏈之N端。在其中第一抗原結合部分為交換Fab分子且其中(i)第二抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端或(ii)第一抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至第二抗原結合部分之Fab重鏈之N端的實施例中，第一抗原結合部分之Fab輕鏈與第二抗原結合部分之Fab輕鏈可另外視情況經由肽連接子彼此融合。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之第二抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之第一或第二次單元之N端。在另一實施例中，第一抗原結合部 分於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之第一或第二次單元之N端。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之第一及第二抗原結合部分各自於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之一個次單元之N端。
在某些實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含第三抗原結合部分，該第三抗原結合部分為能夠特異性結合至目標細胞抗原之Fab分子。在一個該種實施例中，第三抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之第一或第二次單元之N端。在一特定實施例中，活化T細胞之抗原結合分子之第二及第三抗原結合部分各自於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之一個次單元之N端，且第一抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至第二抗原結合部分之Fab重鏈之N端。在另一特定實施例中，活化T細胞之抗原結合分子之第一及第三抗原結合部分各自於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之一個次單元之N端，且第二抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端。活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之組分可直接或經由適合肽連接子融合。在一個實施例中，第二及第三抗原結合部分及Fc域為免疫球蛋白分子之一部分。在一特定實施例中，免疫球蛋白分子為IgG類免疫球蛋白。在一更特定實施例中，免疫球蛋白為IgG1子類免疫球蛋白。在另一實施例中，免疫球蛋白為IgG4子類免疫球蛋白。
在一特定實施例中，Fc域為IgG Fc域。在一特定實施例 中，Fc域為IgG1 Fc域。在另一特定實施例中，Fc域為IgG4 Fc域。在一更特定實施例中，Fc域為包含胺基酸取代S228P(Kabat編號)之IgG4 Fc域。在特定實施例中，Fc域為人類Fc域。
在特定實施例中，Fc域包含促進第一與第二Fc域次單元締合之修飾。在一特定的該種實施例中，Fc域之第一次單元之CH3域中之胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在第一次單元之CH3域內產生隆凸，該隆凸可定位於第二次單元之CH3域內之凹穴中，且Fc域之第二次單元之CH3域中之胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在第二次單元之CH3域內產生凹穴，第一次單元之CH3域內之隆凸可定位於該凹穴內。
在一特定實施例中，與天然IgG1 Fc域相比，該Fc域展現減小之與Fc受體之結合親和力及/或減少之效應功能。在某些實施例中，與非工程改造之Fc域相比，該Fc域經工程改造成具有減小之與Fc受體之結合親和力及/或減少之效應功能。在一個實施例中，Fc域包含一或多個減少與Fc受體之結合及/或效應功能之胺基酸取代。在一個實施例中，Fc域中之一或多個減少與Fc受體之結合及/或效應功能之胺基酸取代係在選自L234、L235及P329(Kabat編號)之群之一或多個位置處。在特定實施例中，Fc域之各次單元包含減少與Fc受體之結合及/或效應功能之三個胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G。在一個該種實施例中，Fc域為IgG1 Fc域，尤其為人類IgG1 Fc域。在其他實施例中，Fc域之各次單元包含減少與Fc受體之結合及/或效應功能之兩個胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L235E及P329G。在一個該種實施例中，Fc域為IgG4 Fc域，尤其為人類IgG4 Fc域。
在一個實施例中，Fc受體為Fcγ受體。在一個實施例中，Fc受體為人類Fc受體。在一個實施例中，Fc受體為活化Fc受體。在一特定實施例中，Fc受體為人類FcγRIIa、FcγRI及/或FcγRIIIa。在一個實施例中，效應功能為抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在一特定實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠結合之活化T細胞抗原為CD3。在其他實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠結合之目標細胞抗原為腫瘤細胞抗原。在一個實施例中，目標細胞抗原係選自由以下組成之群：黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、纖維母細胞活化蛋白(FAP)、CD19、CD20及CD33。
根據本發明之另一態樣，提供編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段之經分離聚核苷酸。本發明亦涵蓋由本發明之聚核苷酸編碼之多肽。本發明進一步提供包含本發明之經分離聚核苷酸之表現載體，及包含本發明之經分離聚核苷酸或表現載體之宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞為真核細胞，尤其為哺乳動物細胞。
在另一態樣中，提供製造本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之方法，該方法包含以下步驟：a)在適於 活化T細胞之雙特異性抗原結合分子表現之條件下培養本發明之宿主細胞，及b)回收活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。本發明亦涵蓋藉由本發明之方法製造之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。
本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子及醫藥學上可接受之載劑。
本發明亦涵蓋使用本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子及醫藥組合物之方法。在一個態樣中，本發明提供本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或醫藥組合物以用作藥劑。在一個態樣中，提供本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或醫藥組合物以用於治療有需要之個體之疾病。在一特定實施例中，該疾病為癌症。
亦提供本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子於製造用於治療有需要之個體之疾病之藥劑的用途；以及治療個體之疾病之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的呈醫藥學上可接受之形式的包含本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之組合物。在一特定實施例中，該疾病為癌症。在任一以上實施例中，個體較佳為哺乳動物，尤其為人類。
本發明亦提供誘導目標細胞、尤其腫瘤細胞溶解之方法，該方法包含使目標細胞與本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子在T細胞、尤其細胞毒性T細胞存在下接觸。
定義
除非在下文中另外定義，否則術語如此項技術中一般所用而用於本文中。
如本文所用，術語「抗原結合分子」在其最廣泛意義上係指特異性結合抗原決定子之分子。抗原結合分子之實例為免疫球蛋白及其衍生物(例如片段)。
術語「雙特異性」意謂抗原結合分子能夠特異性結合至至少兩種不同抗原決定子。典型地，雙特異性抗原結合分子包含兩個抗原結合位點，其各自對不同抗原決定子具有特異性。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩種抗原決定子，尤其在兩種不同細胞上表現之兩種抗原決定子。
如本文所用之術語「價」表示在抗原結合分子中存在規定數目之抗原結合位點。因此，術語「單價結合至抗原」表示抗原結合分子中存在一個(且不超過一個)對抗原具有特異性之抗原結合位點。
「抗原結合位點」係指抗原結合分子中提供與抗原之相互作用的位點(亦即一或多個胺基酸殘基)。舉例而言，抗體之抗原結合位點包含互補決定區(CDR)之胺基酸殘基。天然免疫球蛋白分子典型地具有兩個抗原結合位點，Fab分子典型地具有單個抗原結合位點。
如本文所用，術語「抗原結合部分」係指特異性結合至抗原決定子之多肽分子。在一個實施例中，抗原結合部分 能夠將其所連接之實體(例如第二抗原結合部分)引導至目標位點，例如引導至帶有抗原決定子之特定類型之腫瘤細胞或腫瘤基質。在另一實施例中，抗原結合部分能夠經由其目標抗原(例如T細胞受體複合抗原)活化信號傳導。如本文中進一步定義，抗原結合部分包括抗體及其片段。特定抗原結合部分包括抗體之抗原結合域，其包含抗體重鏈可變區及抗體輕鏈可變區。在某些實施例中，如本文中進一步定義且此項技術中所已知，抗原結合部分可包含抗體恆定區。適用之重鏈恆定區包括五個同型中之任一者：α、δ、ε、γ或μ。適用之輕鏈恆定區包括兩個同型中之任一者：κ及λ。
如本文所用，術語「抗原決定子」與「抗原」及「抗原決定基」同義，且係指多肽巨分子上與抗原結合部分結合從而形成抗原結合部分-抗原複合物之位點(例如胺基酸之連續延伸段或由不同非連續胺基酸區構成之構形組態)。可發現適用之抗原決定子例如在腫瘤細胞之表面、受病毒感染細胞之表面、其他病變細胞之表面、免疫細胞之表面上、游離於血清中及/或胞外基質(ECM)中。除非另有指示，否則本文中稱為抗原之蛋白質(例如MCSP、FAP、CEA、EGFR、CD33、CD3)可為來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及齧齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何天然蛋白質形式。在一特定實施例中，抗原為人類蛋白。在本文中提及特定蛋白質時，該術語涵蓋「全長」、未加工蛋白質以及由在細胞中加工而產 生之任何蛋白質形式。該術語亦涵蓋天然存在之蛋白質變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。適用作抗原之例示性人類蛋白包括(但不限於)：黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)，亦稱為硫酸軟骨素蛋白聚糖4(UniProt第Q6UVK1號(版本70)，NCBI參考序列號NP_001888.2)；纖維母細胞活化蛋白(FAP)，亦稱為Seprase(Uni Prot第Q12884、Q86Z29、Q99998號NCBI寄存編號NP_004451)；癌胚抗原(CEA)，亦稱為癌胚抗原相關細胞黏著分子5(UniProt第P06731號(版本119)，NCBI參考序列號NP_004354.2)；CD33，亦稱為gp67或Siglec-3(UniProt第P20138號，NCBI寄存編號NP_001076087、NP_001171079)；表皮生長因子受體(EGFR)，亦稱為ErbB-1或Her1(UniProt第P0053號，NCBI寄存編號NP_958439、NP_958440)；及CD3、尤其CD3之ε次單元(參見UniProt第P07766號(版本130)，NCBI參考序列號NP_000724.1，SEQ ID NO：265(人類序列)；或UniProt第Q95LI5號(版本49)，NCBI GenBank第BAB71849.1號，SEQ ID NO：266(獼猴[食蟹獼猴(Macaca fascicularis)]序列))。在某些實施例中，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子結合至活化T細胞抗原或目標細胞抗原之抗原決定基，該抗原決定基在來自不同物種之活化T細胞抗原或目標抗原間得以保留。
「特異性結合」意謂結合針對抗原具選擇性且可與不需要或非特異性相互作用區分開來。可經由酶聯結免疫吸附 劑分析(ELISA)或熟習此項技術者所熟知之其他技術(例如表面電漿共振(SPR)技術(在BIAcore儀器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))及傳統結合分析(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002)))來量測抗原結合部分結合至特異性抗原決定子之能力。在一個實施例中，如例如藉由SPR所量測，抗原結合部分與無關蛋白結合之程度小於抗原結合部分與抗原之結合的約10%。在某些實施例中，結合至抗原之抗原結合部分或包含彼抗原結合部分之抗原結合分子的解離常數(KD)1 μM、100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或0.001 nM(例如10-8 M或小於10-8 M、例如10-8 M至10-13 M、例如10-9 M至10-13 M)。
「親和力」係指分子(例如受體)之單個結合位點與其結合搭配物(例如配體)之間的非共價相互作用總和之強度。除非另有指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指固有結合親和力，其反映結合對之成員(例如抗原結合部分與抗原，或受體與其配體)之間的1：1相互作用。分子X對其搭配物Y之親和力通常可由解離常數(KD)表示，解離常數為解離速率常數與締合速率常數(分別為koff與kon)之比率。因此，相等親和力可包含不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同即可。可藉由此項技術中已知之充分確定方法(包括本文所述之方法)來量測親和力。用於量測親和力之特定方法為表面電漿共振(SPR)。
「結合減少」(例如減少與Fc受體之結合)係指如藉由例如SPR所量測，各別相互作用之親和力減小。為了明確起 見，該術語亦包括將親和力減小為零(或低於分析方法之偵測極限)，亦即完全消除相互作用。相反地，「結合增加」係指各別相互作用之結合親和力增大。
如本文所用之「活化T細胞抗原」係指在T淋巴細胞、尤其細胞毒性T淋巴細胞之表面上表現之抗原決定子，其能夠在與抗原結合分子相互作用後誘導T細胞活化。特定言之，抗原結合分子與活化T細胞抗原之相互作用可藉由觸發T細胞受體複合物之信號傳導級聯而誘導T細胞活化。在一特定實施例中，活化T細胞抗原為CD3。
如本文所用之「T細胞活化」係指T淋巴細胞、尤其細胞毒性T淋巴細胞之一或多種選自以下之細胞反應：增殖、分化、細胞因子分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒性活性及活化標記物表現。本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子能夠誘導T細胞活化。量測T細胞活化之適合分析在本文所述之技術中已知。
如本文所用之「目標細胞抗原」係指存在於目標細胞(例如腫瘤中之細胞，諸如癌細胞或腫瘤基質細胞)之表面上之抗原決定子。
如本文所用，關於抗原結合部分等之術語「第一」及「第二」係在存在一個以上各部分類型時為了便於區別而使用。除非明確如此規定，否則此等術語之使用不意欲賦予活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之特定次序或方向。
「Fab分子」係指由免疫球蛋白之重鏈(「Fab重鏈」)之 VH及CH1域及輕鏈(「Fab輕鏈」)之VL及CL域組成之蛋白質。
「融合」意謂組分(例如Fab分子及Fc域次單元)直接或經由一或多個肽連接子，由肽鍵連接。
如本文所用，術語「單鏈」係指包含由肽鍵線性連接之胺基酸單體的分子。在某些實施例中，抗原結合部分中之一者為單鏈Fab分子，亦即其中Fab輕鏈及Fab重鏈由肽連接子連接而形成單肽鏈之Fab分子。在一特定該種實施例中，在單鏈Fab分子中Fab輕鏈之C端連接至Fab重鏈之N端。
「交換」Fab分子(亦稱為「Crossfab」)意謂其中Fab重與輕鏈之可變區或恆定區互換之Fab分子，亦即交換Fab分子包含由輕鏈可變區及重鏈恆定區構成之肽鏈及由重鏈可變區及輕鏈恆定區構成之肽鏈。為了明確起見，在其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變區互換之交換Fab分子中，包含重鏈恆定區之肽鏈在本文中稱為交換Fab分子之「重鏈」。相反地，在其中Fab輕鏈與Fab重鏈之恆定區互換之交換Fab分子中，包含重鏈可變區之肽鏈在本文中稱為交換Fab分子之「重鏈」。
術語「免疫球蛋白分子」係指具有天然存在之抗體結構之蛋白質。舉例而言，IgG類免疫球蛋白為約150,000道爾頓(dalton)、由以二硫鍵鍵結之兩個輕鏈及兩個重鏈構成之雜四聚醣蛋白。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重域或重鏈可變域；隨後為三個恆定域 (CH1、CH2及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域；隨後為恆定輕鏈(CL)域，亦稱為輕鏈恆定區。免疫球蛋白之重鏈可歸為以下五個類型中之一者：稱為α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中一些可進一步分成子類型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)及α2(IgA2)。免疫球蛋白之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列而歸為以下兩個類型中之一者：稱為kappa(κ)及lambda(λ)。免疫球蛋白基本上由經由免疫球蛋白鉸鏈區連接之兩個Fab分子及Fc域組成。
本文中之術語「抗體」以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體及抗體片段，只要其展現所要抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指不同於完整抗體之分子，其包含完整抗體中結合該完整抗體所結合之抗原的一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、雙功能抗體、線抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)及單域抗體。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269頁至第315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基且具有延長之活體內半衰期之 Fab及F(ab')2片段之論述，參見美國專利第5,869,046號。雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點之抗體片段，其可二價或雙特異性的。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)中。單域抗體為包含抗體之全部或部分重鏈可變域或全部或部分輕鏈可變域的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。如本文所述，抗體片段可藉由多種技術製得，該等技術包括(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)製造。
術語「抗原結合域」係指抗體中包含特異性結合至抗原且與一部分或所有抗原互補之區域的部分。抗原結合域可由例如一或多個抗體可變域(亦稱為抗體可變區)提供。特定言之，抗原結合域包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原結合之域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變域(分別為VH及VL)通常具有類似結構，其中各域包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(HVR)。參見例如Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.,第91頁(2007)。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異 性。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中序列高度可變及/或形成結構確定之環(「高變環」)的各區域。一般而言，天然四鏈抗體包含六個HVR；三個在VH中(H1、H2、H3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含來自高變環及/或互補決定區(CDR)之胺基酸殘基，互補決定區具有最高序列可變性及/或參與抗原識別。除VH中之CDR1以外，CDR通常包含形成高變環之胺基酸殘基。高變區(HVR)亦稱為「互補決定區」(CDR)，且在本文中，此等術語在關於形成抗原結合區之可變區部分時可互換使用。此特定區已由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest(1983)及Chothia等人，J Mol Biol 196：901-917(1987)加以描述，其中當相對於彼此進行比較時，該等定義包括胺基酸殘基之重疊或子集。然而，應用任一定義來指稱抗體或其變異體之CDR意欲處於如本文所定義且使用之術語之範疇內。涵蓋如以上所引用之參考文獻各自所定義之CDR的適當胺基酸殘基闡述於下表1中以作比較。涵蓋特定CDR之確切殘基數目將視CDR之序列及大小而變化。在指定抗體之可變區胺基酸序列之情況下，熟習此項技術者可常規地確定何等殘基構成特定CDR。
1表1中之所有CDR定義之編號均係根據Kabat等人所闡述之編號慣例(參見下文)。2如表1中所用之具有小寫字母「b」之「AbM」係指如由Oxford Molecular之「AbM」抗體模型化軟體所定義之CDR。
Kabat等人亦定義適用於任何抗體之可變區序列之編號系統。一般熟習此項技術者可在不依靠除序列本身以外之任何實驗資料的情況下明確地將此「Kabat編號」系統分派給任何可變區序列。如本文所用，「Kabat編號」係指由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services，「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)所闡述之編號系統。除非另外規定，否則提及抗體可變區中之特定胺基酸殘基位置之編號係根據Kabat編號系統。
序列表之多肽序列(亦即SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15等)並非根據Kabat編號系統編號。然而，將序列表之序列編號轉換為Kabat編號完全在一般技術者之技能範疇內。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外之可變域殘基。可變域之FR通常由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列通常按以下序列出現於 VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗體或免疫球蛋白之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區之類型。存在五個主要抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中若干類別可進一步分為子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
術語「Fc域」或「Fc區」在本文中用以定義免疫球蛋白重鏈之C端區，其含有至少一部分恆定區。該術語包括天然序列Fc區及變異型Fc區。雖然IgG重鏈之Fc區之邊界可能稍微變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自Cys226或自Pro230延伸至重鏈羧基末端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非本文中另外規定，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統(亦稱為EU索引)，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。如本文所用之Fc域之「次單元」係指形成二聚Fc域之兩個多肽中之一者，亦即包含免疫球蛋白重鏈之C端恆定區、能夠穩定自締合之多肽。舉例而言，IgG Fc域之次單元包含IgG CH2及IgG CH3恆定域。
「促進Fc域之第一及第二次單元締合之修飾」為對肽主鏈之操縱或對Fc域次單元之轉譯後修飾，其減少或防止包含Fc域次單元之多肽與相同多肽締合形成均二聚體。如本 文所用之促進締合之修飾尤其包括對需要締合之兩個Fc域次單元(亦即Fc域之第一及第二次單元)各自進行之各別修飾，其中該等修飾彼此互補以促進兩個Fc域次單元締合。舉例而言，促進締合之修飾可改變Fc域次單元中之一者或兩者之結構或電荷以分別使其締合空間或靜電有利。因此，(雜)二聚在包含第一Fc域次單元之多肽與包含第二Fc域次單元之多肽之間發生，該兩種多肽可為不相同的，意為與各次單元融合之其他組分(例如抗原結合部分)不相同。在一些實施例中，促進締合之修飾包含Fc域中之胺基酸突變、尤其胺基酸取代。在一特定實施例中，促進締合之修飾在Fc域之兩個次單元之每一者中包含各別胺基酸突變、尤其胺基酸取代。
術語「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物學活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：Clq結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、細胞因子分泌、免疫複合物介導之抗原呈遞細胞對抗原之吸收、細胞表面受體(例如B細胞受體)下調及B細胞活化。
如本文所用，術語「工程改造」被視為包括對肽主鏈之任何操縱或對天然存在或重組多肽或其片段之轉譯後修飾。工程改造包括修飾胺基酸序列、糖基化模式或個別胺基酸之側鏈基團，以及此等方法之組合。
如本文所用之術語「胺基酸突變」意欲涵蓋胺基酸取 代、缺失、插入及修飾。可進行取代、缺失、插入及修飾之任何組合以獲得最終構築體，限制條件為最終構築體具有所要特徵，例如與Fc受體之結合減少或與另一肽之締合增加。胺基酸序列缺失及插入包括胺基及/或羧基末端缺失及插入胺基酸。特定胺基酸突變為胺基酸取代。為了改變例如Fc區之結合特徵，非保守性胺基酸取代(亦即將一個胺基酸置換為具有不同結構及/或化學性質之另一胺基酸)尤其較佳。胺基酸取代包括經非天然存在之胺基酸或經二十種標準胺基酸之天然存在之胺基酸衍生物(例如4-羥基脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥基離胺酸)置換。胺基酸突變可使用此項技術中熟知之基因或化學方法來產生。基因方法可包括定點突變誘發、PCR、基因合成及其類似方法。預期藉由除基因工程改造以外之方法(諸如化學修飾)改變胺基酸側鏈基團之方法亦可適用。在本文中可使用多個名稱來表示相同胺基酸突變。舉例而言，Fc域之329位置處之脯胺酸取代為甘胺酸可表示為329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
如本文所用，術語「多肽」係指由以醯胺鍵(亦稱為肽鍵)線性連接之單體(胺基酸)構成的分子。術語「多肽」係指具有兩個或兩個以上胺基酸之任何鏈，且不指代特定長度之產物。因此，用以指代具有兩個或兩個以上胺基酸之鏈之肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或任何其他術語包括在「多肽」之定義內，且術語「多肽」可替代此等術語中之任一者或可與此等術語中之任一者互 換使用。術語「多肽」亦欲指代多肽之表現後修飾之產物，包括(但不限於)糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、由已知保護/封端基團衍生、蛋白水解裂解或由非天然存在之胺基酸修飾。多肽可衍生自天然生物來源或藉由重組技術製造，但不一定由指定核酸序列轉譯。其可以任何方式(包括藉由化學合成)產生。本發明之多肽之大小可為約3個或3個以上、5個或5個以上、10個或10個以上、20個或20個以上、25個或25個以上、50個或50個以上、75個或75個以上、100個或100個以上、200個或200個以上、500個或500個以上、1,000個或1,000個以上、或2,000個或2,000個以上胺基酸。多肽可具有所定義之三維結構，但其不一定具有該種結構。具有所定義之三維結構之多肽稱為經摺疊的，且不具有所定義之三維結構之多肽實際上可採用多種不同構形，且稱為未摺疊的。
「經分離」之多肽或其變異體或衍生物意欲為其天然環境中不存在之多肽。無需特定程度之純化。舉例而言，經分離多肽可自其自然或天然環境中移出。出於本發明之目的，在宿主細胞中表現之重組製造之多肽及蛋白質視為經分離的，已藉由任何適合技術分離、分級或部分或實質上純化之天然或重組多肽亦視為經分離的。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將任何保守性取代視為序列一致性之一部分的情況下，候選序列 中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。可以此項技術內之多種方式，例如使用公開可得之電腦軟體(諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體)來達成比對以測定胺基酸序列一致性百分比。熟習此項技術者可確定適於比對序列之參數，包括為在所比較序列之全長上達成最大比對所需要的任何演算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2來產生胺基酸序列一致性百分比值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech,Inc.創作，且源程式碼已與使用說明書一起在美國版權局(U.S.Copyright Office)(Washington D.C.,20559)存檔，其中其以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程式可自Genentech,Inc.,South San Francisco,California公開獲得，或可自源程式碼編譯。ALIGN-2程式應經編譯以供在UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)上使用。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不變。在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情況下，如下計算既定胺基酸序列A對、與、或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性百分比(或者其可稱為既定胺基酸序列A具有或包含某一對、與、或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性百分比)：100×分數X/Y其中X為在A與B之程式比對中由序列比對程式ALIGN-2評為一致匹配的胺基酸殘基數目，且其中Y為B中胺基酸殘 基總數。應瞭解，若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A對B之胺基酸序列一致性百分比將不等於B對A之胺基酸序列一致性百分比。除非另外明確規定，否則本文中使用之所有胺基酸序列一致性百分比值均使用ALIGN-2電腦程式如前一段中所述而獲得。
術語「聚核苷酸」係指經分離核酸分子或構築體，例如信使RNA(mRNA)、病毒衍生之RNA或質體DNA(pDNA)。聚核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如見於肽核酸(PNA)中)。術語「核酸分子」係指存在於聚核苷酸中之任何一或多個核酸片段，例如DNA或RNA片段。
「經分離」之核酸分子或聚核苷酸意欲為已自其天然環境中移出之核酸分子、DNA或RNA。舉例而言，出於本發明之目的，含於載體中編碼多肽之重組聚核苷酸視為經分離的。經分離聚核苷酸之其他實例包括維持在異源性宿主細胞中之重組聚核苷酸或溶液狀態下之經純化(部分或實質上)之聚核苷酸。經分離聚核苷酸包括含於通常含有聚核苷酸分子之細胞中之聚核苷酸分子，但該聚核苷酸分子存在於染色體外或不同於其天然染色體位置之染色體位置處。經分離RNA分子包括本發明之活體內或活體外RNA轉錄物以及正股及負股形式及雙股形式。本發明之經分離聚核苷酸或核酸進一步包括以合成方式製造之該等分子。另外，聚核苷酸或核酸可能為或可能包括調節元件，諸如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。
核苷酸序列與本發明之參考核苷酸序列至少(例如)95%「一致」之核酸或聚核苷酸意謂除聚核苷酸序列可包括每100個參考核苷酸序列之核苷酸至多五個點突變以外，聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致。換言之，為獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%一致之聚核苷酸，在參考序列中至多5%之核苷酸可經缺失或經另一核苷酸取代，或佔參考序列中總核苷酸至多5%之數目之核苷酸可插入參考序列中。參考序列之此等變化可發生在參考核苷酸序列之5'或3'末端位置處或彼等末端位置之間的任何位置，個別地散佈於參考序列中之殘基間或參考序列內之一或多個相連基團中。實際上，任何特定聚核苷酸序列與本發明之核苷酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%抑或99%一致可慣常地使用已知電腦程式(諸如以上關於多肽所述者(例如ALIGN-2))來確定。
術語「表現卡匣」係指以重組或合成方式產生之聚核苷酸，其具有一系列允許特定核酸在目標細胞內轉錄的指定核酸元件。重組表現卡匣可併入質體、染色體、線粒體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表現載體之重組表現卡匣部分尤其包括待轉錄之核酸序列及啟動子。在某些實施例中，本發明之表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段之聚核苷酸序列。
術語「載體」或「表現載體」與「表現構築體」同義且係指用以引入且引導與其可操作地締合之特定基因在目標細胞中表現之DNA分子。該術語包括呈自我複製型核酸結 構形式之載體以及併入至其所引入之宿主細胞之基因組中的載體。本發明之表現載體包含表現卡匣。表現載體允許大量穩定mRNA轉錄。一旦表現載體處於目標細胞內，由基因編碼之核糖核酸分子或蛋白質即藉由細胞轉錄及/或轉譯機構製造。在一個實施例中，本發明之表現載體包含表現卡匣，其包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段之聚核苷酸序列。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且指代其中已引入有外原性核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初級轉型細胞及由其衍生之子代而不考慮繼代次數。子代在核酸含量方面可能不完全與母細胞相同，而可能含有突變。本文中包括具有與在最初轉型細胞中所篩選或選擇相同之功能或生物活性的突變子代。宿主細胞為可用於產生本發明之雙特異性抗原結合分子的任何類型之細胞系統。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，諸如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞；酵母細胞；昆蟲細胞；及植物細胞(僅舉幾個例子)，以及轉殖基因動物、轉殖基因植物或栽培植物或動物組織內所包含之細胞。
「活化Fc受體」為在抗體Fc域接合後引發刺激帶有受體之細胞執行效應功能之信號傳導事件的Fc受體。人類活化Fc受體包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa (CD32)及FcαRI(CD89)。
抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)為引起經抗體塗佈之目標細胞經免疫效應細胞溶解的免疫機制。目標細胞為包含Fc區之抗體或其衍生物通常經由處於Fc區之N端之蛋白質部分所特異性結合之細胞。如本文所用，術語「ADCC減少」定義為在既定時間內在目標細胞周圍介質中之既定抗體濃度下藉由上文所定義之ADCC機制所溶解之目標細胞數目減少，及/或達成在既定時間內藉由ADCC機制溶解既定數目目標細胞所需之目標細胞周圍介質中之抗體濃度升高。ADCC減少係相對於由相同類型之宿主細胞使用相同標準製造、純化、調配及儲存方法(該等方法為熟習此項技術者已知)製造但尚未經工程改造之相同抗體所介導之ADCC。舉例而言，由在Fc域中包含減少ADCC之胺基酸取代之抗體所介導之ADCC減少係相對於由在Fc域中不具有此胺基酸取代之相同抗體所介導之ADCC。量測ADCC之適合分析為此項技術中所熟知(參見例如PCT公開案第WO 2006/082515號或PCT專利申請案第PCT/EP2012/055393號)。
藥劑之「有效量」係指在其所投與之細胞或組織中產生生理變化所必需之量。
藥劑(例如醫藥組合物)之「治療有效量」係指在必需劑量下且經必需時段後有效達成所要治療性或預防性結果的量。舉例而言，治療有效量之藥劑消除、減少、延遲、最小化或預防疾病之不良反應。
「個體(individual)」或「個體(subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如母牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物(諸如猴子))、兔及齧齒動物(例如小鼠及大鼠)。特定言之，個體為人類。
術語「醫藥組合物」係指呈允許其中所含之活性成分之生物活性有效之形式且不含有對該調配物將投與之個體產生不可接受之毒性之其他組分的製劑。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥組合物中除活性成分以外對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所使用，「治療」(及其語法變化形式)係指試圖改變所治療個體之疾病之自然過程且可出於預防目的或在臨床病理學過程中進行的臨床干預。所要治療效應包括(但不限於)預防疾病發生或復發、緩和症狀、削弱疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、降低疾病進展率、改善或減輕疾病病況，及緩解或改善預後。在一些實施例中，使用本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子來延遲疾病發生或減緩疾病進展。
術語「包裝插頁」用以指代通常包括於治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於與使用該等治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或警告的資訊。
實施例之詳細描述
在第一態樣中，本發明提供活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含第一及第二抗原結合部分，其中之一者為能夠特異性結合至活化T細胞抗原之Fab分子，且其中之另一者為能夠特異性結合至目標細胞抗原之Fab分子，及由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成之Fc域；其中第一抗原結合部分為(a)單鏈Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈由肽連接子連接，或(b)交換Fab分子，其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變區或恆定區互換。
活化T細胞之雙特異性抗原結合分子形式
活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之組分可以多種組態彼此融合。例示性組態描繪於圖1中。
在一些實施例中，第二抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之第一或第二次單元之N端。
在一特定的該種實施例中，第一抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至第二抗原結合部分之Fab重鏈之N端。在一特定的該種實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子基本上由第一及第二抗原結合部分、由第一及第二次單元構成之Fc域及視情況一或多個肽連接子組成，其中第一抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至第二抗原結合部分之Fab重鏈之N端，且第二抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之第一或第二次單元之N端。在一更特定實施例中，第一抗原結合部分為單鏈Fab分子。或者，在 一特定實施例中，第一抗原結合部分為交換Fab分子。視情況，若第一抗原結合部分為交換Fab分子，則第一抗原結合部分之Fab輕鏈與第二抗原結合部分之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在一替代性該種實施例中，第一抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之第一或第二次單元之N端。在一特定的該種實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子基本上由第一及第二抗原結合部分、由第一及第二次單元構成之Fc域及視情況一或多個肽連接子組成，其中第一及第二抗原結合部分各自於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之一個次單元之N端。在一更特定實施例中，第一抗原結合部分為單鏈Fab分子。或者，在一特定實施例中，第一抗原結合部分為交換Fab分子。
在另一該實施例中，第二抗原結合部分於Fab輕鏈之C端處融合至第一抗原結合部分之Fab輕鏈之N端。在一特定的該種實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子基本上由第一及第二抗原結合部分、由第一及第二次單元構成之Fc域及視情況一或多個肽連接子組成，其中第一抗原結合部分於Fab輕鏈之N端處融合至第二抗原結合部分之Fab輕鏈之C端，且第二抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之第一或第二次單元之N端。在一更特定實施例中，第一抗原結合部分為交換Fab分子。
在其他實施例中，第一抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之第一或第二次單元之N端。
在一特定的該種實施例中，第二抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端。在一特定的該種實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子基本上由第一及第二抗原結合部分、由第一及第二次單元構成之Fc域及視情況一或多個肽連接子組成，其中第二抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端，且第一抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之第一或第二次單元之N端。在一更特定實施例中，第一抗原結合部分為交換Fab分子。視情況，第一抗原結合部分之Fab輕鏈與第二抗原結合部分之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在特定的此等實施例中，第一抗原結合部分能夠特異性結合至活化T細胞抗原。在其他實施例中，第一抗原結合部分能夠特異性結合至目標細胞抗原。
抗原結合部分可直接或經由包含一或多個胺基酸、典型地約2-20個胺基酸之肽連接子融合至Fc域或彼此融合。肽連接子為此項技術中已知且在本文中描述。適合非免疫原性肽連接子包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽連接子。「n」通常為1與10之間、典型地2與4之間的數字。用於將第一與第二抗原結合部分之Fab輕鏈彼此融合之尤其適合之肽連接子為(G4S)2。適於連接第一與第二抗原結合部分之Fab重鏈之例示性肽連接子為EPKSC(D)-(G4S)2(SEQ ID NO 150及151)。另外，連接子可包含免疫球蛋白鉸鏈區(之一部分)。尤其在抗原結合部分融合至Fc 域次單元之N端的情況下，其可經由免疫球蛋白鉸鏈區或其一部分、在存在或不存在另一肽連接子下融合。
具有能夠特異性結合至目標細胞抗原之單一抗原結合部分之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(例如如圖1A、1B、1D、1E、1H、1I、1K或1M中所示)適用，在預期目標細胞抗原在結合高親和力抗原結合部分之後內化之情況下尤其適用。在該等情況下，存在一個以上對目標細胞抗原具有特異性之抗原結合部分可增加目標細胞抗原內化，從而降低其可用性。
然而，在多種其他情況下，宜具有包含兩個或兩個以上對目標細胞抗原具有特異性之抗原結合部分之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(參見圖1C、1F、1G、1J或1L中所示之實例)，例如使對目標位點之靶向最佳化或允許目標細胞抗原交聯。
因此，在某些實施例中，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子進一步包含第三抗原結合部分，該第三抗原結合部分為能夠特異性結合至目標細胞抗原之Fab分子。在一個實施例中，第三抗原結合部分能夠特異性結合至與第一或第二抗原結合部分相同之目標細胞抗原。在一特定實施例中，第一抗原結合部分能夠特異性結合至活化T細胞抗原，且第二及第三抗原結合部分能夠特異性結合至目標細胞抗原。
在一個實施例中，第三抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之第一或第二次單元之N端。在一特定實施例 中，第二及第三抗原結合部分各自於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之一個次單元之N端，且第一抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至第二抗原結合部分之Fab重鏈之N端。在一個該種實施例中，第一抗原結合部分為單鏈Fab分子。在一特定的該種實施例中，第一抗原結合部分為交換Fab分子。視情況，若第一抗原結合部分為交換Fab分子，則第一抗原結合部分之Fab輕鏈與第二抗原結合部分之Fab輕鏈可另外彼此融合。
第二及第三抗原結合部分可直接或經由肽連接子融合至Fc域。在一特定實施例中，第二及第三抗原結合部分可各自經由免疫球蛋白鉸鏈區融合至Fc域。在一特定實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人類IgG1鉸鏈區。在一個實施例中，第二及第三抗原結合部分及Fc域為免疫球蛋白分子之一部分。在一特定實施例中，免疫球蛋白分子為IgG類免疫球蛋白。在一更特定實施例中，免疫球蛋白為IgG1子類免疫球蛋白。在另一實施例中，免疫球蛋白為IgG4子類免疫球蛋白。在另一特定實施例中，免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。在其他實施例中，免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人類化免疫球蛋白。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子基本上由能夠特異性結合至目標細胞抗原之免疫球蛋白分子及能夠特異性結合至活化T細胞抗原之抗原結合部分組成，其中抗原結合部分為視情況經由肽連接子融合至一個免疫球蛋白重鏈之N端的單鏈Fab分子或交換Fab分子、尤其交換Fab分子。
在一替代性實施例中，第一及第三抗原結合部分各自於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之一個次單元之N端，且第二抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端。在一特定的該種實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子基本上由第一、第二及第三抗原結合部分、由第一及第二次單元構成之Fc域及視情況一或多個肽連接子組成，其中第二抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端，且第一抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之第一次單元之N端，且其中第三抗原結合部分於Fab重鏈之C端處融合至Fc域之第二次單元之N端。在一特定的該種實施例中，第一抗原結合部分為交換Fab分子。視情況，第一抗原結合部分之Fab輕鏈與第二抗原結合部分之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在一些本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中，第一抗原結合部分之Fab輕鏈與第二抗原結合部分之Fab輕鏈視情況經由連接肽彼此融合。視第一及第二抗原結合部分之組態而定，第一抗原結合部分之Fab輕鏈可於其C端處融合至第二抗原結合部分之Fab輕鏈之N端，或第二抗原結合部分之Fab輕鏈可於其C端處融合至第一抗原結合部分之Fab輕鏈之N端。第一與第二抗原結合部分之Fab輕鏈之融合進一步減少不匹配之Fab重鏈與輕鏈之錯配，且亦減少表現一些本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子所需之質體之數目。
在某些實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含其中第一Fab輕鏈與肽連接子共用羧基端肽鍵，該肽連接子轉而與第一Fab重鏈共用羧基端肽鍵，該第一Fab重鏈轉而與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VL-CL-連接子-VH-CH1-CH2-CH2(-CH4))；及其中第二Fab重鏈與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在一些實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子進一步包含第二Fab輕鏈多肽(VL-CL)。在某些實施例中，多肽例如由二硫鍵共價連接。
在一些實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含其中第一Fab輕鏈與肽連接子共用羧基端肽鍵，該肽連接子轉而與第一Fab重鏈共用羧基端肽鍵，該第一Fab重鏈轉而與第二Fab重鏈共用羧基端肽鍵，該第二Fab重鏈轉而與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VL-CL-連接子-VH-CH1-VH-CH1-CH2-CH2(-CH4))。在此等實施例中之一者中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子進一步包含第二Fab輕鏈多肽(VL-CL)。根據此等實施例之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可進一步包含(i)Fc域次單元多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)其中第三Fab重鏈與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))及第三Fab輕鏈多肽(VL-CL)。在某些實施例中，多肽例如由二硫鍵共價連接。
在某些實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含其中第一Fab輕鏈可變區與第一Fab重鏈恆定區(亦即 交換Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)共用羧基端肽鍵，該第一Fab重鏈恆定區轉而與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VL-CH1-CH2-CH2(-CH4))；及其中第二Fab重鏈與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在一些實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子進一步包含其中Fab重鏈可變區與Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VH-CL)及Fab輕鏈多肽(VL-CL)。在某些實施例中，多肽例如由二硫鍵共價連接。
在替代性實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含其中第一Fab重鏈可變區與第一Fab輕鏈恆定區(亦即交換Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)共用羧基端肽鍵，該第一Fab輕鏈恆定區轉而與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH-CL-CH2-CH2(-CH4))；及其中第二Fab重鏈與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在一些實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子進一步包含其中Fab輕鏈可變區與Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VL-CH1)及Fab輕鏈多肽(VL-CL)。在某些實施例中，多肽例如由二硫鍵共價連接。
在一些實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含其中第一Fab輕鏈可變區與第一Fab重鏈恆定區(亦即交換Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)共用羧基端肽鍵，該第一Fab重鏈恆定區轉而與第二Fab重鏈共用羧基端肽鍵，該第二Fab重鏈轉而與Fc域次單元共用羧基 端肽鍵的多肽(VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在其他實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含其中第一Fab重鏈可變區與第一Fab輕鏈恆定區(亦即交換Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)共用羧基端肽鍵，該第一Fab輕鏈恆定區轉而與第二Fab重鏈共用羧基端肽鍵，該第二Fab重鏈轉而與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH-CL-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在其他實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含其中第二Fab重鏈與第一Fab輕鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第一Fab輕鏈可變區轉而與第一Fab重鏈恆定區(亦即交換Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)共用羧基端肽鍵，該第一Fab重鏈恆定區轉而與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在其他實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含其中第二Fab重鏈與第一Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第一Fab重鏈可變區轉而與第一Fab輕鏈恆定區(亦即交換Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)共用羧基端肽鍵，該第一Fab輕鏈恆定區轉而與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH-CH1-VH-CL-CH2-CH3(-CH4))。
在一些此等實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子進一步包含其中Fab重鏈可變區與Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵的交換Fab輕鏈多肽(VH-CL)，及Fab輕鏈多肽(VL-CL)。在其他此等實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子進一步包含其中Fab輕鏈可變區與Fab重鏈恆定 區共用羧基端肽鍵的交換Fab輕鏈多肽(VL-CH1)，及Fab輕鏈多肽(VL-CL)。在其他此等實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子進一步包含其中Fab輕鏈可變區與Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵，該Fab重鏈恆定區轉而與Fab輕鏈多肽共用羧基端肽鍵的多肽(VL-CH1-VL-CL)，其中Fab重鏈可變區與Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵，該Fab輕鏈恆定區轉而與Fab輕鏈多肽共用羧基端肽鍵的多肽(VH-CL-VL-CL)；其中Fab輕鏈多肽與Fab輕鏈可變區共用羧基端肽鍵，該Fab輕鏈可變區轉而與Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VL-CL-VL-CH1)；或其中Fab輕鏈多肽與Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵，該Fab重鏈可變區轉而與Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VL-CL-VH-CL)。
根據此等實施例之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可進一步包含(i)Fc域次單元多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)其中第三Fab重鏈與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))及第三Fab輕鏈多肽(VL-CL)。在某些實施例中，多肽例如由二硫鍵共價連接。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含其中第二Fab輕鏈與第一Fab輕鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第一Fab輕鏈可變區轉而與第一Fab重鏈恆定區(亦即交換Fab輕鏈，其中輕鏈恆定區經重鏈恆定區置換)共用羧基端肽鍵的多肽(VL-CL-VL-CH1)；其中第二Fab重鏈與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))；及其中第一Fab重鏈可變區與第一Fab輕鏈恆定區 共用羧基端肽鍵的多肽(VH-CL)。在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含其中第二Fab輕鏈與第一Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第一Fab重鏈可變區轉而與第一Fab輕鏈恆定區(亦即交換Fab輕鏈，其中輕鏈可變區經重鏈可變區置換)共用羧基端肽鍵的多肽(VL-CL-VH-CL)；其中第二Fab重鏈與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))；及其中第一Fab輕鏈可變區與第一Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VL-CH1)。根據此等實施例之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可進一步包含(i)Fc域次單元多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)其中第三Fab重鏈與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))及第三Fab輕鏈多肽(VL-CL)。在某些實施例中，多肽例如由二硫鍵共價連接。
根據以上實施例中之任一者，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之組分(例如抗原結合部分、Fc域)可直接或經由各種連接子、尤其包含一或多個胺基酸、典型地約2-20個胺基酸之肽連接子融合，該等肽連接子在本文中加以描述或為此項技術中已知。適合之非免疫原性肽連接子包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽連接子，其中n通常為1與10之間、典型地2與4之間的數字。
Fc域
活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之Fc域由一對包含免疫球蛋白分子之重鏈域之多肽鏈組成。舉例而言，免疫球蛋白G(IgG)分子之Fc域為二聚體，其各次單元包含CH2 及CH3 IgG重鏈恆定域。Fc域之兩個次單元能夠彼此穩定締合。在一個實施例中，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含不超過一個Fc域。
在本發明之一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之Fc域為IgG Fc域。在一特定實施例中，Fc域為IgG1 Fc域。在另一實施例中，Fc域為IgG4 Fc域。在一更特定實施例中，Fc域為在位置S228(Kabat編號)處包含胺基酸取代、尤其胺基酸取代S228P之IgG4 Fc域。此胺基酸取代減少IgG4抗體之活體內Fab臂互換(參見Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在另一特定實施例中，Fc域為人類Fc域。人類IgG1 Fc區之例示性序列在SEQ ID NO：149中給出。
促進雜二聚之Fc域修飾
本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含融合至Fc域之兩個次單元中之一者或另一者之不同抗原結合部分，因此Fc域之兩個次單元典型地包含於兩個不一致的多肽鏈中。此等多肽之重組共表現隨後二聚產生兩個多肽之數種可能的組合。因此，為了改良重組製造中活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之產率及純度，宜在活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之Fc域中引入促進所要多肽締合之修飾。
因此，在特定實施例中，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之Fc域包含促進Fc域之第一與第二次單元締合之修飾。人類IgG Fc域之兩個次單元之間的最廣泛蛋 白質間相互作用之位點在Fc域之CH3域中。因此，在一個實施例中，該修飾在Fc域之CH3域中。
在一特定實施例中，該修飾為所謂的「杵入臼(knob-into-hole)」修飾，其包含對Fc域之兩個次單元中之一者之「杵」修飾及對Fc域之兩個次單元中之另一者之「臼」修飾。
杵入臼技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9,617-621(1996)；及Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。一般而言，該方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)且在第二多肽之界面處引入相應凹穴(「臼」)，以使得該隆凸可定位於該凹穴中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換來自第一多肽之界面之小胺基酸側鏈來構造隆凸。在第二多肽之界面處，藉由用較小側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈產生與隆凸一致或類似大小之補償性凹穴。
因此，在一特定實施例中，在活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之Fc域之第一次單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在第一次單元之CH3域內產生隆凸，該隆凸可定位於第二次單元之CH3域內之凹穴中，且在Fc域之第二次單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在第二次單元之CH3域內產生凹穴，第一次單元之CH3域內之隆凸可定位於該凹穴內。
可藉由改變編碼多肽之核酸(例如藉由定點突變誘發)或藉由肽合成來形成隆凸及凹穴。
在一特定實施例中，在Fc域之第一次單元之CH3域中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在Fc域之第二次單元之CH3域中，位置407處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)。在一個實施例中，另外在Fc域之第二次單元中，位置366處之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換(T366S)且位置368處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A)。
在另一實施例中，另外在Fc域之第一次單元中，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(S354C)，且另外在Fc域之第二次單元中，位置349處之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(Y349C)。引入此兩個半胱胺酸殘基致使在Fc域之兩個次單元之間形成二硫橋鍵，進一步穩定化二聚體(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在一特定實施例中，能夠結合至活化T細胞抗原之抗原結合部分融合(視情況經由能夠結合至目標細胞抗原之抗原結合部分)於Fc域之第一次單元(包含「杵」修飾)。在不受理論限制的情況下，能夠結合至活化T細胞抗原之抗原結合部分與Fc域之含杵次單元之融合將(進一步)使包含兩個能夠結合至活化T細胞抗原之抗原結合部分之抗原結合分子之產生(兩個含杵多肽之空間碰撞)減至最少。
在一替代性實施例中，例如如PCT公開案WO 2009/089004中所述，促進Fc域之第一與第二次單元締合 之修飾包含介導靜電牽引效應之修飾。一般而言，此方法涉及以帶電胺基酸殘基置換兩個Fc域次單元之界面處之一或多個胺基酸殘基，以使得均二聚體形成變得靜電不利而雜二聚變得靜電有利。
減少Fc受體結合及/或效應功能之Fc域修飾
Fc域賦予活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以有利藥物動力學性質，該等性質包括長血清半衰期(其促成在目標組織中之良好積聚)及有利組織-血液分佈比。然而，同時其可導致不合需要地將活化T細胞之雙特異性抗原結合分子靶向表現Fc受體之細胞而非較佳之帶有抗原之細胞。此外，Fc受體信號傳導路徑之共活化可導致細胞因子釋放，其與抗原結合分子之T細胞活化性質及長半衰期組合，導致在全身性投與後細胞因子受體之過度活化及嚴重副作用。除T細胞以外之(帶有Fc受體之)免疫細胞之活化甚至可因T細胞例如受NK細胞之潛在破壞而降低活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之功效。
因此，在特定實施例中，與天然IgG1 Fc域相比，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之Fc域展現減小之與Fc受體之結合親和力及/或減少之效應功能。在一個該種實施例中，Fc域(或包含該Fc域之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)展現與天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1 Fc域之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)相比小於50%、較佳小於20%、更佳小於10%且最佳小於5%的與Fc受體之結合親和力，及/或與天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1 Fc域之 活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)相比小於50%、較佳小於20%、更佳小於10%且最佳小於5%的效應功能。在一個實施例中，Fc域(或包含該Fc域之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)不實質上結合至Fc受體及/或誘導效應功能。在一特定實施例中，Fc受體為Fcγ受體。在一個實施例中，Fc受體為人類Fc受體。在一個實施例中，Fc受體為活化Fc受體。在一特定實施例中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更尤其為人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最尤其為人類FcγRIIIa。在一個實施例中，效應功能為選自以下之群之一或多者：CDC、ADCC、ADCP及細胞因子分泌。在一特定實施例中，效應功能為ADCC。在一個實施例中，與天然IgG1 Fc域相比，該Fc域展現實質上類似之與新生兒Fc受體(FcRn)之結合親和力。當Fc域(或包含該Fc域之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)展現大於約70%、尤其大於約80%、更尤其大於約90%之天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1 Fc域之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)與FcRn之結合親和力時，達成實質上類似之與FcRn之結合。
在某些實施例中，與非工程改造之Fc域相比，該Fc域經工程改造成具有減小之與Fc受體之結合親和力及/或減少之效應功能。在特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之Fc域包含一或多個減小Fc域與Fc受體之結合親和力及/或效應功能的胺基酸突變。典型地，Fc域之兩個次單元之每一者中存在相同的一或多個胺基酸突變。在 一個實施例中，胺基酸突變減小Fc域與Fc受體之結合親和力。在一個實施例中，胺基酸突變使Fc域與Fc受體之結合親和力減小至少2倍、至少5倍或至少10倍。在其中存在一個以上減小Fc域與Fc受體之結合親和力之胺基酸突變的實施例中，此等胺基酸突變之組合可使Fc域與Fc受體之結合親和力減小至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。在一個實施例中，包含經工程改造Fc域之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子展現與包含非工程改造Fc域之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子相比小於20%、尤其小於10%、更尤其小於5%的與Fc受體之結合親和力。在一特定實施例中，Fc受體為Fcγ受體。在一些實施例中，Fc受體為人類Fc受體。在一些實施例中，Fc受體為活化Fc受體。在一特定實施例中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更尤其為人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最尤其為人類FcγRIIIa。較佳，減少與此等受體中之每一者之結合。在一些實施例中，亦減小與互補組分之結合親和力、尤其與Clq之結合親和力。在一個實施例中，不減小與新生兒Fc受體(FcRn)之結合親和力。當Fc域(或包含該Fc域之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)展現大於約70%的非工程改造形式之Fc域(或包含該非工程改造形式之Fc域之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)與FcRn之結合親和力時，達成實質上類似之與FcRn之結合(亦即保持Fc域與該受體之結合親和力)。Fc域或包含該Fc域之本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可展現大於約80%且甚至大於約90%的該親 和力。在某些實施例中，與非工程改造之Fc域相比，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之Fc域經工程改造成具有減少之效應功能。減少之效應功能可包括(但不限於)以下一或多者：減少之補體依賴性細胞毒性(CDC)、減少之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、減少之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、減少之細胞因子分泌、減少之免疫複合物介導之抗原呈遞細胞對抗原之吸收、減少之與NK細胞之結合、減少之與巨噬細胞之結合、減少之與單核細胞之結合、減少之與多形核細胞之結合、減少之直接信號傳導誘導之細胞凋亡、減少之目標結合之抗體交聯、減少之樹突狀細胞成熟或減少之T細胞激活。在一個實施例中，減少之效應功能為選自以下之群之一或多者：減少之CDC、減少之ADCC、減少之ADCP及減少之細胞因子分泌。在一特定實施例中，減少之效應功能為減少之ADCC。在一個實施例中，減少之ADCC小於由非工程改造之Fc域(或包含非工程改造之Fc域之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)誘導之ADCC的20%。
在一個實施例中，減小Fc域與Fc受體之結合親和力及/或效應功能之胺基酸突變為胺基酸取代。在一個實施例中，Fc域在選自以下之群之位置處包含胺基酸取代：E233、L234、L235、N297、P331及P329。在一更特定實施例中，Fc域在選自以下之群之位置處包含胺基酸取代：L234、L235及P329。在一些實施例中，Fc域包含胺基酸取代L234A及L235A。在一個該種實施例中，Fc域為IgG1 Fc 域，尤其為人類IgG1 Fc域。在一個實施例中，Fc域在位置P329處包含胺基酸取代。在一更特定實施例中，胺基酸取代為P329A或P329G，尤其為P329G。在一個實施例中，Fc域在位置P329處包含胺基酸取代且在選自以下之位置處包含其他胺基酸取代：E233、L234、L235、N297及P331。在一更特定實施例中，其他胺基酸取代為E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定實施例中，Fc域在位置P329、L234及L235處包含胺基酸取代。在更特定實施例中，Fc域包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G(「P329G LALA」)。在一個該種實施例中，Fc域為IgG1 Fc域，尤其為人類IgG1 Fc域。如PCT專利申請案第PCT/EP2012/055393號中所述，胺基酸取代之「P329G LALA」組合幾乎完全消除人類IgG1 Fc域之Fcγ受體結合，該案以全文引用的方式併入本文中。PCT/EP2012/055393亦描述製備該等突變Fc域之方法及測定其性質(諸如Fc受體結合或效應功能)之方法。
與IgG1抗體相比，IgG4抗體展現減小之與Fc受體之結合親和力及減少之效應功能。因此，在一些實施例中，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之Fc域為IgG4 Fc域，尤其為人類IgG4 Fc域。在一個實施例中，IgG4 Fc域在位置S228處包含胺基酸取代，尤其為胺基酸取代S228P。為了進一步減小其與Fc受體之結合親和力及/或其效應功能，在一個實施例中，IgG4 Fc域在位置L235處包含胺基酸取代，尤其為胺基酸取代L235E。在另一實施例 中，IgG4 Fc域在位置P329處包含胺基酸取代，尤其為胺基酸取代P329G。在一特定實施例中，IgG4 Fc域在位置S228、L235及P329處包含胺基酸取代，尤其為胺基酸取代S228P、L235E及P329G。該等IgG4 Fc域突變體及其Fcγ受體結合性質描述於PCT專利申請案第PCT/EP2012/055393號中，該案以全文引用的方式併入本文中。
在一特定實施例中，與天然IgG1 Fc域相比，展現減小之與Fc受體之結合親和力及/或減少之效應功能之Fc域為包含胺基酸取代L234A、L235A及視情況存在之P329G之人類IgG1 Fc域，或為包含胺基酸取代S228P、L235E及視情況存在之P329G之人類IgG4 Fc域。
在某些實施例中，已消除Fc域之N-糖基化。在一個該種實施例中，Fc域在位置N297處包含胺基酸突變，尤其為天冬醯胺經丙胺酸(N297A)或天冬胺酸(N297D)置換之胺基酸取代。
除在上文及PCT專利申請案第PCT/EP2012/055393號中所描述之Fc域之外，具有減少之Fc受體結合及/或效應功能之Fc域亦包括Fc域殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代的Fc域(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或兩者以上處具有取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂的「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
可藉由使用此項技術中熟知之基因或化學方法進行胺基 酸缺失、取代、插入或修飾來製備突變Fc域。基因方法可包括編碼DNA序列之定點突變誘發、PCR、基因合成及其類似方法。可藉由例如定序來驗證正確的核苷酸變化。
可藉由例如ELISA或表面電漿共振(SPR)，使用諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)之標準儀器配備及諸如可藉由重組表現獲得之Fc受體容易地測定與Fc受體之結合。適合之該種結合分析在本文中加以描述。或者，可使用已知表現特定Fc受體之細胞株(諸如表現FcγIIIa受體之人類NK細胞)來評估Fc域或包含Fc域之活化細胞之雙特異性抗原結合分子對於Fc受體的結合親和力。
可藉由此項技術中已知之方法來量測Fc域或包含Fc域之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的效應功能。量測ADCC之適合分析在本文中加以描述。評定相關分子之ADCC活性之活體外分析之其他實例描述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)；及Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)中。或者，可採用非放射性分析(參見例如流動式細胞量測術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。適用於該等分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可在活體內，例如在動物模型(諸如Clynes等 人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中所揭示之動物模型)中評定相關分子之ADCC活性。
在一些實施例中，減少Fc域與互補組分、尤其與Clq之結合。因此，在其中Fc域經工程改造成具有減少之效應功能之一些實施例中，該減少之效應功能包括減少之CDC。可進行Clq結合分析以確定活化T細胞之雙特異性抗原結合分子是否能夠結合Clq且因此具有CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之Clq及C3c結合ELISA。為了評定補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；及Cragg及Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
抗原結合部分
本發明之抗原結合分子為雙特異性的，亦即其包含至少兩個能夠特異性結合至兩種不同抗原決定子之抗原結合部分。根據本發明，抗原結合部分為Fab分子(亦即由各自包含可變區及恆定區之重鏈及輕鏈構成之抗原結合域)。在一個實施例中，該等Fab分子為人類Fab分子。在另一實施例中，該等Fab分子為人類化Fab分子。在另一實施例中，該等Fab分子包含人類重鏈及輕鏈恆定區。
至少一個抗原結合部分為單鏈Fab分子或交換Fab分子。該等修飾防止來自不同Fab分子之重鏈與輕鏈錯配，從而改良重組製造中本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之產率及純度。在適用於本發明之活化T細胞之雙特 異性抗原結合分子之一特定單鏈Fab分子中，Fab輕鏈之C端由肽連接子連接至Fab重鏈之N端。肽連接子允許Fab重鏈與輕鏈排列形成功能性抗原結合部分。適用於連接Fab重鏈及輕鏈之肽連接子包括例如(G4S)6-GG(SEQ ID NO：152)或(SG3)2-(SEG3)4-(SG3)-SG(SEQ ID NO：153)。在適用於本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之一特定交換Fab分子中，Fab輕鏈與Fab重鏈之恆定區互換。在適用於本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之另一交換Fab分子中，Fab輕鏈與Fab重鏈之可變區互換。
在本發明之一特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子能夠同時結合至目標細胞抗原、尤其腫瘤細胞抗原及活化T細胞抗原。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子能夠藉由同時結合至目標細胞抗原及活化T細胞抗原而交聯T細胞與目標細胞。在一更特定實施例中，該同時結合引起目標細胞、尤其腫瘤細胞溶解。在一個實施例中，該同時結合引起T細胞活化。在其他實施例中，該同時結合引起T淋巴細胞、尤其細胞毒性T淋巴細胞的選自以下之群之細胞反應：增殖、分化、細胞因子分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒性活性及活化標記物表現。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子與活化T細胞抗原結合而不同時與目標細胞抗原結合不引起T細胞活化。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子能夠將T細胞之細胞毒性活性重引導至目標細胞。在一特 定實施例中，該重引導與目標細胞之MHC介導之肽抗原呈遞及/或T細胞之特異性無關。
特定言之，本發明之實施例中之任一者之T細胞為細胞毒性T細胞。在一些實施例中，T細胞為CD4+或CD8+ T細胞，尤其為CD8+ T細胞。
活化T細胞抗原結合部分
本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含至少一個能夠結合至活化T細胞抗原(本文亦稱為「活化T細胞抗原結合部分」)之抗原結合部分。在一特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含不超過一個能夠特異性結合至活化T細胞抗原之抗原結合部分。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子提供與活化T細胞抗原之單價結合。活化T細胞抗原結合部分可為習知Fab分子或經修飾之Fab分子(亦即單鏈或交換Fab分子)。在其中活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中包含有一個以上能夠特異性結合至目標細胞抗原之抗原結合部分的實施例中，能夠特異性結合至活化T細胞抗原之抗原結合部分較佳為經修飾之Fab分子。
在一特定實施例中，活化T細胞抗原為CD3，尤其為人類CD3(SEQ ID NO：265)或獼猴CD3(SEQ ID NO：266)，最尤其為人類CD3。在一特定實施例中，活化T細胞抗原結合部分可與人類及獼猴CD3交叉反應(亦即與其特異性結合)。在一些實施例中，活化T細胞抗原為CD3之ε次單元。
在一個實施例中，活化T細胞抗原結合部分可與單株抗 體H2C(描述於PCT公開案第WO2008/119567號中)競爭結合CD3之抗原決定基。在另一實施例中，活化T細胞抗原結合部分可與單株抗體V9(描述於Rodrigues等人，Int J Cancer增刊7,45-50(1992)及美國專利第6,054,297號中)競爭結合CD3之抗原決定基。在另一實施例中，活化T細胞抗原結合部分可與單株抗體FN18(描述於Nooij等人，Eur J Immunol 19,981-984(1986)中)競爭結合CD3之抗原決定基。在一特定實施例中，活化T細胞抗原結合部分可與單株抗體SP34(描述於Pessano等人，EMBO J 4,337-340(1985)中)競爭結合CD3之抗原決定基。在一個實施例中，活化T細胞抗原結合部分結合至與單株抗體SP34相同之CD3抗原決定基。在一個實施例中，活化T細胞抗原結合部分包含SEQ ID NO：163之重鏈CDR1、SEQ ID NO：165之重鏈CDR2、SEQ ID NO：167之重鏈CDR3、SEQ ID NO：171之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：173之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：175之輕鏈CDR3。在另一實施例中，活化T細胞抗原結合部分包含與SEQ ID NO：169至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之重鏈可變區序列及與SEQ ID NO：177至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之輕鏈可變區序列，或其保留功能性之變異體。
在一特定實施例中，活化T細胞抗原結合部分包含SEQ ID NO：249之重鏈CDR1、SEQ ID NO：251之重鏈CDR2、SEQ ID NO：253之重鏈CDR3、SEQ ID NO：257之輕鏈 CDR1、SEQ ID NO：259之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：261之輕鏈CDR3。在一個實施例中，活化T細胞抗原結合部分可與包含以下之抗原結合部分競爭結合CD3之抗原決定基：SEQ ID NO：249之重鏈CDR1、SEQ ID NO：251之重鏈CDR2、SEQ ID NO：253之重鏈CDR3、SEQ ID NO：257之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：259之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：261之輕鏈CDR3。在一個實施例中，活化T細胞抗原結合部分結合至與包含以下之抗原結合部分相同之CD3抗原決定基：SEQ ID NO：249之重鏈CDR1、SEQ ID NO：251之重鏈CDR2、SEQ ID NO：253之重鏈CDR3、SEQ ID NO：257之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：259之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：261之輕鏈CDR3。在另一實施例中，活化T細胞抗原結合部分包含與SEQ ID NO：255至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之重鏈可變區序列及與SEQ ID NO：263至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之輕鏈可變區序列，或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，活化T細胞抗原結合部分可與包含SEQ ID NO：255之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：263之輕鏈可變區序列之抗原結合部分競爭結合CD3之抗原決定基。在一個實施例中，活化T細胞抗原結合部分結合至與包含SEQ ID NO：255之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：263之輕鏈可變區序列之抗原結合部分相同的CD3抗原決定基。在另一實施例中，活化T細胞抗原結合部分包含SEQ ID NO：255之重鏈可變區序列之人類化 型式及SEQ ID NO：263之輕鏈可變區序列之人類化型式。在一個實施例中，活化T細胞抗原結合部分包含SEQ ID NO：249之重鏈CDR1、SEQ ID NO：251之重鏈CDR2、SEQ ID NO：253之重鏈CDR3、SEQ ID NO：257之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：259之輕鏈CDR2、SEQ ID NO：261之輕鏈CDR3及人類重及輕鏈可變區構架序列。
目標細胞抗原結合部分
本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含至少一個能夠結合至目標細胞抗原之抗原結合部分(本文亦稱為「目標細胞抗原結合部分」)。在某些實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含兩個能夠結合至目標細胞抗原之抗原結合部分。在一特定的該種實施例中，此等抗原結合部分各自特異性結合至相同抗原決定子。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含能夠特異性結合至目標細胞抗原之免疫球蛋白分子。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含不超過兩個能夠結合至目標細胞抗原之抗原結合部分。
目標細胞抗原結合部分通常為Fab分子，其結合至特定抗原決定子且能夠將活化T細胞之雙特異性抗原結合分子引導至目標位點，例如帶有抗原決定子之特定類型之腫瘤細胞。
在某些實施例中，目標細胞抗原結合部分係針對與病理病狀相關之抗原，諸如存在於腫瘤細胞上或受病毒感染細胞上之抗原。適合抗原為細胞表面抗原，例如(但不限於) 細胞表面受體。在特定實施例中，抗原為人類抗原。在一特定實施例中，目標細胞抗原係選自以下之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20及CD33。
在特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含至少一個對黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)具有特異性之抗原結合部分。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含至少一個、典型地兩個或兩個以上可與單株抗體LC007(參見SEQ ID NO 75及83，及歐洲專利申請案第EP 11178393.2號，以全文引用的方式併入本文中)競爭結合至MCSP之抗原決定基之抗原結合部分。在一個實施例中，對MCSP具有特異性之抗原結合部分包含SEQ ID NO：69之重鏈CDR1、SEQ ID NO：71之重鏈CDR2、SEQ ID NO：73之重鏈CDR3、SEQ ID NO：77之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：79之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：81之輕鏈CDR3。在另一實施例中，對MCSP具有特異性之抗原結合部分包含與SEQ ID NO：75至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之重鏈可變區序列及與SEQ ID NO：83至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之輕鏈可變區序列，或其保留功能性之變異體。在特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含至少一個、典型地兩個或兩個以上可與單株抗體M3-4 ML2(參見SEQ ID NO 239及247，及歐洲專利申請案第EP 11178393.2號，以全文引用的方式併入本文中)競爭結合至MCSP之抗原決定基之抗原結合部分。在一個實施例中，對MCSP具有特異性之抗原結合部分結合至與單株抗體M3-4 ML2相同之MCSP抗原決定基。在一個實施例中，對MCSP具有特異性之抗原結合部分包含SEQ ID NO：233之重鏈CDR1、SEQ ID NO：235之重鏈CDR2、SEQ ID NO：237之重鏈CDR3、SEQ ID NO：241之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：243之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：245之輕鏈CDR3。在另一實施例中，對MCSP具有特異性之抗原結合部分包含與SEQ ID NO：239至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，尤其約98%、99%或100%一致之重鏈可變區序列及與SEQ ID NO：247至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，尤其約98%、99%或100%一致之輕鏈可變區序列，或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，對MCSP具有特異性之抗原結合部分包含親和力成熟型式之單株抗體M3-4 ML2之重鏈及輕鏈可變區序列。在一個實施例中，對MCSP具有特異性之抗原結合部分包含具有一、二、三、四、五、六或七個，尤其二、三、四或五個胺基酸取代之SEQ ID NO：239之重鏈可變區序列；及具有一、二、三、四、五、六或七個，尤其二、三、四或五個胺基酸取代之SEQ ID NO：247之輕鏈可變區序列。可變區序列內之任何胺基酸殘基(包括CDR區內之胺基酸殘基)均可經不同胺基酸取代，限制條件為保持結 合至MCSP、尤其人類MCSP。較佳之變異體為對MCSP之結合親和力與包含未經取代之可變區序列之抗原結合部分之結合親和力至少相等(或更強)的變異體。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：1之多肽序列、SEQ ID NO：3之多肽序列及SEQ ID NO：5之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：7之多肽序列、SEQ ID NO：9之多肽序列及SEQ ID NO：11之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：13之多肽序列、SEQ ID NO：15之多肽序列及SEQ ID NO：5之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：17之多肽序列、SEQ ID NO：19之多肽序列及SEQ ID NO：5之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：21之多肽序列、SEQ ID NO：23之多肽序列及SEQ ID NO：5之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：25之多肽序列、SEQ ID NO：27之多肽序列及SEQ ID NO：5之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：29之多肽序列、SEQ ID NO：31之多肽序列、SEQ ID NO：33之多肽序列及SEQ ID NO：5之多肽序 列，或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：29之多肽序列、SEQ ID NO：3之多肽序列、SEQ ID NO：33之多肽序列及SEQ ID NO：5之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：35之多肽序列、SEQ ID NO：3之多肽序列、SEQ ID NO：37之多肽序列及SEQ ID NO：5之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：39之多肽序列、SEQ ID NO：3之多肽序列、SEQ ID NO：41之多肽序列及SEQ ID NO：5之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：29之多肽序列、SEQ ID NO：3之多肽序列、SEQ ID NO：5之多肽序列及SEQ ID NO：179之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：5之多肽序列、SEQ ID NO：29之多肽序列、SEQ ID NO：33之多肽序列及SEQ ID NO：181之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：5之多肽序列、SEQ ID NO：23之多肽序列、SEQ ID NO：183之多肽序列及SEQ ID NO：185之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：5之多肽序列、SEQ ID NO：23之多肽序列、SEQ ID NO：183 之多肽序列及SEQ ID NO：187之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：33之多肽序列、SEQ ID NO：189之多肽序列、SEQ ID NO：191之多肽序列及SEQ ID NO：193之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：183之多肽序列、SEQ ID NO：189之多肽序列、SEQ ID NO：193之多肽序列及SEQ ID NO：195之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：189之多肽序列、SEQ ID NO：193之多肽序列、SEQ ID NO：199之多肽序列及SEQ ID NO：201之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：5之多肽序列、SEQ ID NO：23之多肽序列、SEQ ID NO：215之多肽序列及SEQ ID NO：217之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：5之多肽序列、SEQ ID NO：23之多肽序列、SEQ ID NO：215之多肽序列及SEQ ID NO：219之多肽序列，或其保留功能性之變異體。
在一特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含由與選自以下之群之序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列：SEQ ID NO：70、SEQ ID NO： 72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：234、SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：218及SEQ ID NO：220。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含至少一個對表皮生長因子受體(EGFR)具有特異性之抗原結合部分。在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含至少一個、典型地兩個或兩個以上可與單株抗體GA201競爭結合至EGFR之抗原決定基之抗原結合部分。參見PCT公開案WO 2006/082515，該案以全文引用的方式併入本文中。在一個實施例中，對EGFR具有特異性之抗原結合部分包含SEQ ID NO：85之重鏈CDRI、SEQ ID NO：87之重鏈CDR2、SEQ ID NO：89之重鏈CDR3、SEQ ID NO：93之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：95之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：97之輕鏈CDR3。在另一實施例中，對EGFR具有特異性之抗原結合部分包含與SEQ ID NO：91至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之重鏈可變區序列及與SEQ ID NO：99至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之輕鏈可變區序列，或其保留功能性之變異體。
在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：43之多肽序列、SEQ ID NO：45之多肽序列及SEQ ID NO：47之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：49之多肽序列、SEQ ID NO：51之多肽序列及SEQ ID NO：11之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：53之多肽序列、SEQ ID NO：45之多肽序列及SEQ ID NO：47之多肽序列，或其保留功能性之變異體。
在一特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含由與選自以下之群之序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列：SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：12。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含至少一個對纖維母細胞活化蛋白(FAP)具有特異性之抗原結合部分。在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含至少一個、典型地兩個或兩個以上可與單株抗體3F2競爭結合至FAP之抗原決定基之抗原結合部分。參見PCT公開案WO 2012/020006，該案以全文引用的方式併入本文中。在一個實施例中，對FAP具有特異性之抗原結合部分包含SEQ ID NO：101之重鏈CDR1、SEQ ID NO：103之重鏈CDR2、SEQ ID NO：105之重鏈CDR3、SEQ ID NO：109之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：111之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：113之輕鏈CDR3。在另一實施例中，對FAP具有特異性之抗原結合部分包含與SEQ ID NO：107至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之重鏈可變區序列及與SEQ ID NO：115至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之輕鏈可變區序列，或其保留功能性之變異體。
在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：55之多肽序列、SEQ ID NO：51之多肽序列及SEQ ID NO：11之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：57之多肽序列、SEQ ID NO：59之多肽 序列及SEQ ID NO：61之多肽序列，或其保留功能性之變異體。
在一特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含由與選自以下之群之序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列：SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：52及SEQ ID NO：12。
在特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含至少一個對癌胚抗原(CEA)具有特異性之抗原結合部分。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含至少一個、典型地兩個或兩個以上可與單株抗體BW431/26(描述於歐洲專利第EP 160 897號及Bosslet等人，Int J Cancer 36,75-84(1985)中)競爭結合至CEA之抗原決定基之抗原結合部分。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含至少一個、典型地兩個或兩個以上可與單株抗體CH1A1A(參見SEQ ID NO 123及131)競爭結合至CEA之抗原決定基之抗原結合部分。參見PCT專利公開案第WO 2011/023787號，該案以全文引用的方式併入本文中。在一個實施例中，對CEA具有特異性之抗原結合部分結合至與單株抗體CH1A1A相同之CEA抗原決定基。在一個實施例中，對CEA具有特異性之抗原結合部分 包含SEQ ID NO：117之重鏈CDR1、SEQ ID NO：119之重鏈CDR2、SEQ ID NO：121之重鏈CDR3、SEQ ID NO：125之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：127之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：129之輕鏈CDR3。在另一實施例中，對CEA具有特異性之抗原結合部分包含與SEQ ID NO：123至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，尤其約98%、99%或100%一致之重鏈可變區序列及與SEQ ID NO：131至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，尤其約98%、99%或100%一致之輕鏈可變區序列，或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，對CEA具有特異性之抗原結合部分包含親和力成熟型式之單株抗體CH1A1A之重鏈及輕鏈可變區序列。在一個實施例中，對CEA具有特異性之抗原結合部分包含具有一、二、三、四、五、六或七個，尤其二、三、四或五個胺基酸取代之SEQ ID NO：123之重鏈可變區序列；及具有一、二、三、四、五、六或七個，尤其二、三、四或五個胺基酸取代之SEQ ID NO：131之輕鏈可變區序列。可變區序列內之任何胺基酸殘基(包括CDR區內之胺基酸殘基)均可經不同胺基酸取代，限制條件為保持結合至CEA、尤其人類CEA。較佳之變異體為對CEA之結合親和力與包含未經取代可變區序列之抗原結合部分之結合親和力至少相等(或更強)的變異體。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：63之多肽序列、SEQ ID NO：65之多肽序 列、SEQ ID NO：67之多肽序列及SEQ ID NO：33之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：65之多肽序列、SEQ ID NO：67之多肽序列、SEQ ID NO：183之多肽序列及SEQ ID NO：197之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：183之多肽序列、SEQ ID NO：203之多肽序列、SEQ ID NO：205之多肽序列及SEQ ID NO：207之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：183之多肽序列、SEQ ID NO：209之多肽序列、SEQ ID NO：211之多肽序列及SEQ ID NO：213之多肽序列，或其保留功能性之變異體。
在一特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含由與選自以下之群之序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列：SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：212及SEQ ID NO：214。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子 包含至少一個對CD33具有特異性之抗原結合部分。在一個實施例中，對CD33具有特異性之抗原結合部分包含SEQ ID NO：133之重鏈CDR1、SEQ ID NO：135之重鏈CDR2、SEQ ID NO：137之重鏈CDR3、SEQ ID NO：141之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：143之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：145之輕鏈CDR3。在另一實施例中，對CD33具有特異性之抗原結合部分包含與SEQ ID NO：139至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、147%或100%一致之重鏈可變區序列及與SEQ ID NO：147至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、147%或100%一致之輕鏈可變區序列，或其保留功能性之變異體。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：33之多肽序列、SEQ ID NO：213之多肽序列、SEQ ID NO：221之多肽序列及SEQ ID NO：223之多肽序列，或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO：33之多肽序列、SEQ ID NO：221之多肽序列、SEQ ID NO：223之多肽序列及SEQ ID NO：225之多肽序列，或其保留功能性之變異體。
在一特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含由與選自以下之群之序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列：SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO： 142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：222、SEQ ID NO：224及SEQ ID NO：226。
聚核苷酸
本發明進一步提供編碼如本文所述之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段之經分離聚核苷酸。
本發明之聚核苷酸包括與以下闡述之序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸：SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262及264，包括其功能片段或變異體。
編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之聚核苷酸可表現為編碼整個活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之單個聚核苷酸或共表現之多個(例如兩個或兩個以 上)聚核苷酸。由共表現之聚核苷酸編碼之多肽可經由例如二硫鍵或其他方法締合形成功能性活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。舉例而言，抗原結合部分之輕鏈部分可由與活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中包含該抗原結合部分之重鏈部分、Fc域次單元及視情況存在之另一抗原結合部分(之一部分)的部分不同之聚核苷酸編碼。當共表現時，重鏈多肽將與輕鏈多肽締合形成抗原結合部分。在另一實例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中包含兩個Fc域次單元中之一者及視情況存在之一或多個抗原結合部分(之一部分)的部分可由與活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中包含兩個Fc域次單元中之另一者及視情況存在之抗原結合部分(之一部分)的部分不同之聚核苷酸編碼。當共表現時，Fc域次單元將締合形成Fc域。
在某些實施例中，本發明之經分離聚核苷酸編碼活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中包含第一及第二抗原結合部分及由兩個次單元構成之Fc域之片段，其中第一抗原結合部分為單鏈Fab分子。在一個實施例中，本發明之經分離聚核苷酸編碼第一抗原結合部分及Fc域之次單元。在一更特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼其中單鏈Fab分子與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽。在另一實施例中，本發明之經分離聚核苷酸編碼第二抗原結合部分之重鏈及Fc域之次單元。在一更特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼其中Fab重鏈與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽。在另一實施例中，本發明之經分離聚核苷酸編碼第一抗原結 合部分、第二抗原結合部分之重鏈及Fc域之次單元。在一更特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼其中單鏈Fab分子與Fab重鏈共用羧基端肽鍵，該Fab重鏈轉而與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽。
在某些實施例中，本發明之經分離聚核苷酸編碼活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中包含第一及第二抗原結合部分及由兩個次單元構成之Fc域之片段，其中第一抗原結合部分為交換Fab分子。在一個實施例中，本發明之經分離聚核苷酸編碼第一抗原結合部分之重鏈及Fc域之次單元。在一更特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼其中Fab輕鏈可變區與Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵，該Fab重鏈恆定區轉而與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽。在另一特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼其中Fab重鏈可變區與Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵，該Fab輕鏈恆定區轉而與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽。在另一實施例中，本發明之經分離聚核苷酸編碼第二抗原結合部分之重鏈及Fc域之次單元。在一更特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼其中Fab重鏈與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽。在另一實施例中，本發明之經分離聚核苷酸編碼第一抗原結合部分之重鏈、第二抗原結合部分之重鏈及Fc域之次單元。在一更特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼其中Fab輕鏈可變區與Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵，該Fab重鏈恆定區轉而與Fab重鏈共用羧基端肽鍵，該Fab重鏈轉而與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽。在另一特定實施例 中，經分離聚核苷酸編碼其中Fab重鏈可變區與Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵，該Fab輕鏈恆定區轉而與Fab重鏈共用羧基端肽鍵，該Fab重鏈轉而與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽。在另一特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼其中Fab重鏈與Fab輕鏈可變區共用羧基端肽鍵，該Fab輕鏈可變區轉而與Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵，該Fab重鏈恆定區轉而與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽。在另一特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼其中Fab重鏈與Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵，該Fab重鏈可變區轉而與Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵，該Fab輕鏈恆定區轉而與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽。
在其他實施例中，本發明之經分離聚核苷酸編碼第三抗原結合部分之重鏈及Fc域之次單元。在一更特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼其中Fab重鏈與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽。
在其他實施例中，本發明之經分離聚核苷酸編碼抗原結合部分之輕鏈。在一些實施例中，經分離聚核苷酸編碼其中Fab輕鏈可變區與Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽。在其他實施例中，經分離聚核苷酸編碼其中Fab重鏈可變區與Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽。在其他實施例中，本發明之經分離聚核苷酸編碼第一抗原結合部分之輕鏈及第二抗原結合部分之輕鏈。在一更特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼其中Fab重鏈可變區與Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵，該Fab輕鏈恆定區轉而與Fab輕鏈共 用羧基端肽鍵的多肽。在另一特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼其中Fab輕鏈與Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵，該Fab重鏈可變區轉而與Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽。在另一特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼其中Fab輕鏈可變區與Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵，該Fab重鏈恆定區轉而與Fab輕鏈共用羧基端肽鍵的多肽。在另一特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼其中Fab輕鏈與Fab輕鏈可變區共用羧基端肽鍵，該Fab輕鏈可變區轉而與Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽。
在另一實施例中，本發明係關於編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段之經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含編碼如下所示之可變區序列之序列：SEQ ID NO 75、83、91、99、107、115、123、131、139、147、169、177、239、247、255及263。在另一實施例中，本發明係關於編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段之經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含編碼如下所示之多肽序列之序列：SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229及231。在另一實施例中，本發明另外係關於編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其 片段之經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含與以下所示之核苷酸序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列：SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262或264。在另一實施例中，本發明係關於編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段之經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含以下所示之核酸序列：SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、164、 166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262或264。在另一實施例中，本發明係關於編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段之經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含編碼與以下之胺基酸序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之可變區序列的序列：SEQ ID NO 75、83、91、99、107、115、123、131、139、147、169、177、239、247、255或263。在另一實施例中，本發明係關於編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段之經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含編碼與以下之胺基酸序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽序列的序列：SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229或231。本發明涵蓋編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段之經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含編碼具有保守性胺基酸取代之以下之可變區序列之序列：SEQ ID NO 75、83、91、99、107、115、123、131、139、147、169、177、239、247、255或263。本發明亦涵蓋編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段之經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含編碼具有保守性胺基酸取代之以下之多肽序列之序列：SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229或231。
在某些實施例中，聚核苷酸或核酸為DNA。在其他實施例中，本發明之聚核苷酸為RNA，例如呈信使RNA(mRNA)形式。本發明之RNA可為單股或雙股RNA。
重組方法
可例如藉由固態肽合成(例如Merrifield固相合成)或重組製造來獲得本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。對於重組製造，將一或多種例如如上文所述之編碼活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(片段)之聚核苷酸分離且插入一或多種載體中以便在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。可使用習知程序容易地分離該等聚核苷酸並定序。在一個實施例中，提供包含本發明之一或多種聚核苷酸之載體、較佳表現載體。可使用熟習此項技術者所熟知之方法構築含有活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(片 段)之編碼序列以及適當轉錄/轉譯控制信號的表現載體。此等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/基因重組。參見例如Maniatis等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；及Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)中所述之技術。表現載體可為質體、病毒之一部分，或可為核酸片段。表現載體包括其中選殖有與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件可操作締合之編碼活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(片段)之聚核苷酸(亦即編碼區)的表現卡匣。如本文所用，「編碼區」為核酸中由轉譯為胺基酸之密碼子組成的一部分。雖然「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)並不轉譯為胺基酸，但其若存在仍可視為編碼區之一部分，但例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5'及3'非轉譯區及其類似部分之任何側接序列並非編碼區之一部分。兩個或兩個以上編碼區可存在於單個聚核苷酸構築體中，例如於單個載體上；或於各別聚核苷酸構築體中，例如於各別(不同)載體上。此外，任何載體可含有單個編碼區，或可包含兩個或兩個以上編碼區，例如本發明之載體可編碼一或多種多肽，該一或多種多肽係經由蛋白水解裂解在轉譯後或共轉譯地分離為最終蛋白。此外，本發明之載體、聚核苷酸或核酸可編碼異源性編碼區，其融合或未融合至編碼本發明之活化T 細胞之雙特異性抗原結合分子(片段)之聚核苷酸或其變異體或衍生物。異源性編碼區包括(但不限於)特殊化元件或基元，諸如分泌性信號肽或異源性功能域。可操作締合為基因產物(例如多肽)之編碼區與一或多個調節序列締合，以使得基因產物之表現受調節序列影響或控制。若誘導啟動子功能可引起編碼所要基因產物之mRNA的轉錄且若兩個DNA片段之間的鍵聯之性質不干擾表現調節序列引導基因產物表現之能力或干擾DNA模板被轉錄之能力，則兩個DNA片段(諸如多肽編碼區及與其締合之啟動子)「可操作地締合」。因此，若啟動子能夠實現編碼多肽之核酸的轉錄，則啟動子區將與彼核酸可操作地締合。啟動子可為僅引導預定細胞內之DNA實質轉錄之細胞特異性啟動子。除啟動子外，其他轉錄控制元件(例如增強子、操縱子、抑制因子及轉錄終止信號)可與聚核苷酸可操作地締合以引導細胞特異性轉錄。適合啟動子及其他轉錄控制區在本文中加以揭示。多種轉錄控制區為熟習此項技術者所已知。其包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用之轉錄控制區，諸如(但不限於)來自以下病毒之啟動子及增強子區段：細胞巨大病毒(例如即刻早期啟動子，與內含子-A結合)、猿猴病毒40(例如早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))。其他轉錄控制區包括衍生自脊椎動物基因之轉錄控制區，諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔â球蛋白，以及能夠控制真核細胞中之基因表現的其他序列。其他適合之轉錄控制區包括組 織特異性啟動子及增強子以及誘導性啟動子(例如啟動子誘導性四環素)。類似地，多種轉譯控制元件為一般熟習此項技術者所已知。其包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子及衍生自病毒系統之元件(尤其內部核糖體入口位點或IRES，亦稱為CITE序列)。表現卡匣亦可包括其他特徵，諸如複製起點及/或染色體整合元件(諸如反轉錄病毒長末端重複序列(LTR)或腺相關病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR))。
本發明之聚核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌性或信號肽之其他編碼區締合，該等肽引導由本發明之聚核苷酸編碼的多肽之分泌。舉例而言，若需要活化T細胞之雙特異性抗原結合分子分泌，則可將編碼信號序列之DNA置於編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段之核酸之上游。根據信號假說，哺乳動物細胞分泌之蛋白質具有信號肽或分泌性前導序列，一旦引發生長蛋白鏈穿過粗糙內質網排出，該信號肽或分泌性前導序列即自成熟蛋白質裂解。一般熟習此項技術者應瞭解，脊椎動物細胞分泌之多肽通常具有融合至多肽之N端之信號肽，其自經轉譯多肽裂解產生多肽之分泌或「成熟」形式。在某些實施例中，使用天然信號肽(例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽)，或彼序列之保留引導與其可操作地締合之多肽分泌之能力的功能性衍生物。或者，可使用異源性哺乳動物信號肽或其功能性衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡萄 糖醛酸酶之前導序列取代。分泌性信號肽之例示性胺基酸及聚核苷酸序列以SEQ ID NO 154-162給出。
編碼可用以促進後續純化(例如組胺酸標籤)或幫助標記活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的短蛋白序列之DNA可包括於編碼活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(片段)之聚核苷酸內或末端。
在另一實施例中，提供包含一或多種本發明之聚核苷酸之宿主細胞。在某些實施例中，提供包含一或多種本發明之載體之宿主細胞。聚核苷酸及載體可併有單個的或組合形式的本文分別關於聚核苷酸及載體所述之任一特徵。在一個該種實施例中，宿主細胞包含有含編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(之一部分)之聚核苷酸的載體(例如已用其轉型或轉染)。如本文所用，術語「宿主細胞」係指可經工程改造以產生本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段的任何種類之細胞系統。適於複製及適於支持活化T細胞之雙特異性抗原結合分子表現之宿主細胞為此項技術中所熟知。該等細胞可視需要用特定表現載體轉染或轉導，且大量含載體細胞可生長用於對大規模醱酵槽進行接種以獲得充足量之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以供臨床應用。適合之宿主細胞包括原核細胞型微生物，諸如大腸桿菌；或各種真核細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞或其類似物。舉例而言，可在細菌中、尤其在不需要糖基化時產生多肽。表現之後，多肽可於可溶部分中與細菌細胞糊狀物分離且可 經進一步純化。除原核生物之外，真核細胞型微生物(諸如絲狀真菌或酵母)為多肽編碼載體之適合之選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」致使產生具有部分或完全人類糖基化模式之多肽的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)，及Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。適用於(糖基化)多肽表現之宿主細胞亦衍生自多細胞生物(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出眾多可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978及6,417,429號(描述用於在轉殖基因植物中製造抗體之PLANTIBODIESTM技術)。脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用之哺乳動物宿主細胞株之其他實例為由SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7)；人類胚腎細胞株(如例如Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中所述之293或293T細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(sertoli cell)(如例如Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴(African green monkey)腎細胞(VERO-76)；人類宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤細胞 (MMT 060562)；TRI細胞(如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所述)；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他適用之哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr-CHO細胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。關於適用於蛋白質製造之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ)，第255頁至第268頁(2003)。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞及植物細胞(僅舉幾個例子)；以及轉殖基因動物、轉殖基因植物或栽培植物或動物組織內所包含之細胞。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，較佳為哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚腎(HEK)細胞或淋巴樣細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。
在此等系統中表現外來基因之標準技術為此項技術中已知。表現包含抗原結合域(諸如抗體)之重鏈或輕鏈之多肽之細胞可經工程改造以便亦表現另一抗體鏈以使得所表現之產物為兼具重鏈及輕鏈之抗體。
在一個實施例中，提供製造本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之方法，其中該方法包含在適於活化T細胞之雙特異性抗原結合分子表現之條件下培養如本文提供之包含編碼活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之聚核 苷酸之宿主細胞，及自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。
活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之組分以基因彼此融合。活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可經設計以使其組分直接或經由連接子序列間接地彼此融合。連接子之組成及長度可根據此項技術中熟知之方法來測定且可測試功效。活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之不同組分之間的連接子序列之實例見於本文提供之序列中。必要時，亦可包括其他序列(例如肽鏈內切酶辨識序列)併入裂解位點以分離融合物之個別組分。
在某些實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之一或多個抗原結合部分包含至少一個能夠結合抗原決定子之抗體可變區。可變區可形成天然或非天然存在之抗體及其片段之一部分且自天然或非天然存在之抗體及其片段衍生。製造多株抗體及單株抗體之方法為此項技術中所熟知(參見例如Harlow及Lane,「Antibodies,a laboratory manual」,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在之抗體可使用固相肽合成來構築，可以重組方式製造(例如如美國專利第4,186,567號中所述)，或可例如藉由篩選包含可變重鏈及可變輕鏈之組合庫而獲得(參見例如McCafferty之美國專利第5,969,108號)。
任何動物物種之抗體、抗體片段、抗原結合域或可變區均可用於本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中。適用於本發明之非限制性抗體、抗體片段、抗原結合 域或可變區可源於鼠類、靈長類動物或人類。若活化T細胞之雙特異性抗原結合分子意欲供人類使用，則可使用其中抗體之恆定區來自人類之嵌合抗體形式。亦可根據此項技術中熟知之方法製備人類化或完全人類形式之抗體(參見例如Winter之美國專利第5,565,332號)。可藉由多種方法來達成人類化，包括(但不限於)(a)在保留或不保留關鍵構架殘基(例如對保留良好抗原結合親和力或抗體功能較重要之殘基)之情況下將非人類(例如供者抗體)CDR移植於人類(例如受者抗體)構架區及恆定區上；(b)僅將非人類特異性決定區(SDR或a-CDR；對抗體-抗原相互作用較關鍵之殘基)移植於人類構架區及恆定區上；或(c)移植整個非人類可變域，但藉由置換表面殘基而使其「外罩」有擬似人類之部分。人類化抗體及其製造方法於例如Almagro及Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)中綜述，且進一步描述於例如Riechmann等人，Nature 332,323-329(1988)；Queen等人，Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337、7,527,791、6,982,321及7,087,409號；Jones等人，Nature 321,522-525(1986)；Morrison等人，Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison及Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人，Methods 36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(描述「重修表 面」)；Dall'Acqua等人，Methods 36,43-60(2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36,61-68(2005)及Klimka等人，Br J Cancer 83,252-260(2000)(描述FR改組之「導引選擇」方法)中。可使用此項技術中已知之多種技術來製造人類抗體及人類可變區。人類抗體一般性描述於van Dijk及van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)及Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)中。人類可變區可形成藉由融合瘤方法製造之人類單株抗體之一部分且自藉由融合瘤方法製造之人類單株抗體衍生(參見例如Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51頁至第63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。亦可藉由向轉殖基因動物投與經修飾以回應於抗原攻擊產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體之免疫原來製備人類抗體及人類可變區(參見例如Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005)。亦可藉由分離選自人類衍生之噬菌體呈現庫之Fv純系可變區序列來產生人類抗體及人類可變區(參見例如Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology 178,1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,2001)；及McCafferty等人，Nature 348,552-554；Clackson等人，Nature 352,624-628(1991))。噬菌體典型地呈現呈單鏈Fv(scFv)片段形式或呈Fab片段形式之抗體片段。
在某些實施例中，適用於本發明之抗原結合部分根據例如揭示於美國專利申請公開案第2004/0132066號中之方法 工程改造成具有增大之結合親和力，該案之全部內容藉此以引用的方式併入。可經由酶聯結免疫吸附劑分析(ELISA)或為熟習此項技術者所熟知之其他技術(例如表面電漿共振技術(在BIACORE T100系統上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))及傳統結合分析(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002)))來量測本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子結合至特異性抗原決定子之能力。可使用競爭分析來鑑別與參考抗體競爭結合至特定抗原之抗體、抗體片段、抗原結合域或可變域，例如與V9抗體競爭結合至CD3之抗體。在某些實施例中，該種競爭性抗體結合至與由參考抗體所結合者相同之抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)。Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology，第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中提供定位抗體所結合之抗原決定基的詳細例示性方法。在一例示性競爭分析中，在包含結合至抗原之第一經標記抗體(例如V9抗體)及第二未標記抗體(測試其與第一抗體競爭結合至抗原之能力)之溶液中培育固定化抗原(例如CD3)。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一經標記抗體但不包含第二未標記抗體之溶液中培育固定化抗原。在容許第一抗體與抗原結合之條件下培育之後，移除過量未結合抗體，且量測與固定化抗原締合之標記之量。若測試樣品中與固定化抗原締合之標記之量相對於對照樣品實質上減少，則其表明第二抗體與第一抗體競爭結合至抗原。參見Harlow 及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
如本文所述製備之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可藉由此項技術中已知之技術來純化，該等技術諸如高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和力層析、尺寸排阻層析及其類似技術。用以純化特定蛋白質之實際條件將部分地視諸如淨電荷、疏水性、親水性等因素而定，且將為熟習此項技術者所顯而易見。對於親和力層析純化，可使用活化T細胞之雙特異性抗原結合分子所結合之抗體、配體、受體或抗原。舉例而言，對於本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之親和力層析純化，可使用具有蛋白質A或蛋白質G之基質。可基本上如實例中所述相繼使用蛋白質A或G親和力層析及尺寸排阻層析來分離活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。可藉由多種熟知分析方法中之任一者來測定活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之純度，該等方法包括凝膠電泳、高壓液相層析及其類似方法。舉例而言，如由還原SDS-PAGE所證明，如實例中所述表現之重鏈融合蛋白顯示為完整的且適當地組裝(參見例如圖2)。三個條帶於約Mr 25,000、Mr 50,000及Mr 75,000處解析，其對應於活化T細胞之雙特異性抗原結合分子輕鏈、重鏈及重鏈/輕鏈融合蛋白之預測分子量。
分析
本文提供之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可藉由此項技術中已知之多種分析來鑑別、篩選或表徵其物理/ 化學性質及/或生物學活性。
親和力分析
可根據實例中所闡述之方法藉由表面電漿共振(SPR)，使用諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)之標準儀器配備及諸如可藉由重組表現獲得之受體或目標蛋白來測定活化T細胞之雙特異性抗原結合分子對Fc受體或目標抗原之親和力。或者，可藉由例如流動式細胞量測術(FACS)，使用表現特定受體或目標抗原之細胞株來評估活化T細胞之雙特異性抗原結合分子對不同受體或目標抗原之結合。用於量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例描述於下文及以下實例中。
根據一個實施例，在25℃下藉由表面電漿共振，使用BIACORE® T100機(GE Healthcare)量測KD。
為了分析Fc部分與Fc受體之間的相互作用，由固定於CM5晶片上之抗五His抗體(Qiagen)捕捉帶His標籤之重組Fc受體且使用雙特異性構築體作為被分析物。簡言之，根據供應商之說明書用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5，GE Healthcare)。用10 mM乙酸鈉(pH 5.0)將抗五-His抗體稀釋至40 μg/ml，隨後以5微升/分鐘之流速注入，以達成約6500個反應單位(RU)之偶聯蛋白。在注入配體之後，注入1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。隨後以4或10 nM捕捉Fc受體60秒。對於動力學量測，在25℃下以30微升/分鐘之流速持續120秒注入於 HBS-EP(GE Healthcare，10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05%界面活性劑P20，pH 7.4)中四倍連續稀釋之雙特異性構築體(在500 nM至4000 nM的範圍內)。
為測定與目標抗原之親和力，如關於抗五-His抗體所述，由固定於活化CM5感測器晶片表面上之抗人類Fab特異性抗體(GE Healthcare)來捕捉雙特異性構築體。偶聯蛋白之最終量為約12000 RU。以300 nM捕捉雙特異性構築體90秒。使目標抗原以介於250至1000 nM範圍內之濃度以30微升/分鐘之流速通過流槽持續180秒。監測解離180秒。
藉由減去參考流槽上所得之反應來校正整體折射率差異。使用穩態反應，藉由朗繆爾(Langmuir)結合等溫線之非線性曲線擬合來得出解離常數KD。使用簡單的一對一朗繆爾結合模型(BIACORE® T100評估軟體1.1.1版)，藉由同時擬合締合及解離感測圖來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。以koff/kon比來計算平衡解離常數(KD)。參見例如Chen等人，J Mol Biol 293,865-881(1999)。
活性分析
可藉由如實例中所述之多種分析來量測本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之生物活性。生物活性可包括例如誘導T細胞增殖、誘導T細胞中之信號傳導、誘導T細胞中之活化標記物之表現、誘導T細胞之細胞因子分泌、誘導諸如腫瘤細胞之目標細胞溶解及誘導腫瘤消退及/或改善存活。
組合物、調配物及投藥途徑
在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含本文提供之任一活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其例如用於以下任一治療方法中。在一個實施例中，醫藥組合物包含本文提供之任一活化T細胞之雙特異性抗原結合分子及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥組合物包含本文提供之任一活化T細胞之雙特異性抗原結合分子及至少一種例如如下所述之其他治療劑。
另外提供製造呈適於活體內投與之形式之本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的方法，該方法包含(a)獲得本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，及(b)將活化T細胞之雙特異性抗原結合分子與至少一種醫藥學上可接受之載劑一起調配，藉以調配活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之製劑以供活體內投與。
本發明之醫藥組合物包含治療有效量之溶解或分散於醫藥學上可接受之載劑中的一或多種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。短語「醫藥或藥理學上可接受」係指在所用劑量及濃度下對接受者一般無毒(亦即當視需要向動物(諸如人類)投與時不產生不良、過敏性或其他不適當反應)的分子實體及組合物。熟習此項技術者根據本發明將知曉含有至少一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子及視情況選用之另外活性成分之醫藥組合物的製備，如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版Mack Printing Company,1990所例示，該文獻以引用的方式併入本文中。此外，對於動物(例如人類)投藥，應瞭解，製劑 應滿足如FDA生物學標準辦公室(FDA Office of Biological Standards)或其他國家之相應權利機構所要求之滅菌、發熱性、一般安全性及純度標準。較佳之組合物為凍乾調配物或水溶液。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括如一般熟習此項技術者已知之任何及所有溶劑、緩衝劑、分散介質、塗佈劑、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等張劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、抗氧化劑、蛋白、藥物、藥物穩定劑、聚合物、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料、該種類似物質及其組合(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版Mack Printing Company,1990，第1289頁至第1329頁，其以引用的方式併入本文中)。除非任何習知載劑與活性成分不相容，否則預期其在治療或醫藥組合物中使用。
組合物可包含不同類型之載劑，此視其係以固體、液體抑或氣溶膠形式投與，及對於諸如注射之投藥途徑其是否需要滅菌而定。本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(及任何另外治療劑)可藉由以下方式投與：靜脈內、皮內、動脈內、腹膜內、病變內、顱內、關節內、前列腺內、脾內、腎內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、瘤內、肌肉內、腹膜內、皮下、結膜下、囊泡內、經黏膜、心包內、臍內、眼內、經口、表面(topically)、局部(locally)、藉由吸入(例如氣溶膠吸入)、注射、輸注、連續輸注、直接局部灌注浴洗目標細胞、經 由導管、經由灌洗、於乳膏中、於脂質組合物(例如脂質體)中，或藉由如一般熟習此項技術者已知之其他方法或前述方法之任何組合(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版Mack Printing Company,1990，其以引用的方式併入本文中)。非經腸投藥、尤其靜脈內注射最常用於投與多肽分子，諸如本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。
非經腸組合物包括經設計以用於藉由注射(例如皮下、皮內、病變內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹膜內注射)投與的組合物。為進行注射，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可在水溶液中調配，較佳在生理學上相容之緩衝液(諸如亨克氏溶液(Hanks' solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理食鹽水緩衝液)中調配。溶液可含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑之調配劑。或者，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可呈粉末形式，其在使用之前用適合媒劑(例如無菌無熱原質的水)組配。藉由按需要將本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以所需量併入含有以下所列舉之多種其他成分之適當溶劑中來製備無菌可注射溶液。可容易地例如藉由經由無菌過濾膜過濾來達成無菌。一般藉由將多種經滅菌之活性成分併入含有基本分散介質及/或其他成分之無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液、懸浮液或乳液之無菌粉末的情況下，較佳之製備方法為真空乾燥或冷凍乾燥技術，該等技術自預先經滅菌過濾之液體介質產生活 性成分加任何其他所要成分之粉末。必要時，液體介質應適當地經緩衝，且首先使液體稀釋劑等張隨後與充足鹽水或葡萄糖一起注射。組合物在製造及儲存條件下必須穩定，且經防腐處理以免受諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。應瞭解，應使內毒素污染最低程度地保持在安全水準，例如小於0.5 ng/mg蛋白質。適合之醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽的相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子性界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之化合物，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、葡聚糖或其類似物。視情況，懸浮液亦可含有增加化合物溶解性以允許製備高濃度溶液之適合穩定劑或試劑。另外，活性化合物之懸浮液可經製備為適當 的油性注射懸浮液。適合之親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯；或脂質體。
活性成分可包覆於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中；膠態藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中；或巨乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版Mack Printing Company,1990)中。可製備持續釋放性製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有多肽之固體疏水性聚合物的半透性基質，該等基質呈成形物品(例如膜或微囊)形式。在特定實施例中，可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來達成。
除先前所述之組合物之外，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子亦可調配為儲槽式製劑。該種長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內)或藉由肌肉內注射投與。因此，舉例而言，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可與適合之聚合或疏水性物質(例如作為於可接受之油中之乳液)或離子交換樹脂一起調配，或調配為微溶衍生物(例如為微溶鹽)。
包含本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之醫藥組合物可藉助於習知混合、溶解、乳化、囊封、包覆或凍乾製程而製造。醫藥組合物可以習知方式使用一或多種 生理學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑調配，該等載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑有助於將蛋白質加工成醫藥學上可使用之製劑。適當調配物視所選投藥途徑而定。
活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可經調配為呈游離酸或鹼、中性或鹽形式之組合物。醫藥學上可接受之鹽為實質上保留游離酸或鹼之生物活性之鹽。其包括酸加成鹽，例如與蛋白質組合物之游離胺基形成之鹽，或與無機酸(諸如鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、草酸、酒石酸或杏仁酸)形成之鹽。與游離羧基形成之鹽亦可衍生自無機鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)。醫藥鹽傾向於比相應游離鹼形式更易溶於水性及其他質子性溶劑中。
治療方法及組合物
本文提供之任一活化T細胞之雙特異性抗原結合分子均可用於治療方法中。本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可用作免疫治療劑，例如用於治療癌症。
為了於治療方法中使用，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子將以符合良好醫療規範之方式進行調配、給藥及投與。在此情況下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之起因、藥劑之傳遞位點、投藥方法、投藥時程及醫療工作者已知之其他因素。
在一個態樣中，提供本發明之活化T細胞之雙特異性抗 原結合分子以用作藥劑。在其他態樣中，提供本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子用於治療疾病。在某些實施例中，提供本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子用於治療方法中。在一個實施例中，本發明提供如本文所述之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子用於治療有需要之個體之疾病。在某些實施例中，本發明提供活化T細胞之雙特異性抗原結合分子用於治療患有疾病之個體之方法中，該方法包含向該個體投與治療有效量之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在某些實施例中，欲治療之疾病為增生性病症。在一特定實施例中，該疾病為癌症。在某些實施例中，該方法進一步包含向個體投與治療有效量之至少一種另外治療劑，例如若欲治療之疾病為癌症則為抗癌劑。在其他實施例中，本發明提供如本文所述之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子用於誘導目標細胞、尤其腫瘤細胞溶解。在某些實施例中，本發明提供活化T細胞之雙特異性抗原結合分子用於誘導個體中之目標細胞、尤其腫瘤細胞溶解之方法中，該方法包含向個體投與有效量之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以誘導目標細胞溶解。以上任一實施例中之「個體」為哺乳動物，較佳為人類。
在另一態樣中，本發明提供本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之用途，其係用於製造或製備藥劑。在一個實施例中，該藥劑係用於治療有需要之個體之疾病。在另一實施例中，該藥劑係用於治療疾病之方法中，該方 法包含向患有疾病之個體投與治療有效量之藥劑。在某些實施例中，欲治療之疾病為增生性病症。在一特定實施例中，該疾病為癌症。在一個實施例中，該方法進一步包含向該個體投與治療有效量之至少一種另外治療劑，例如若欲治療之疾病為癌症則為抗癌劑。在另一實施例中，該藥劑係用於誘導目標細胞、尤其腫瘤細胞溶解。在另一實施例中，藥劑係用於誘導個體中之目標細胞、尤其腫瘤細胞溶解之方法中，該方法包含向該個體投與有效量之藥劑以誘導目標細胞溶解。以上任一實施例中之「個體」可為哺乳動物，較佳為人類。
在另一態樣中，本發明提供治療疾病之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有該疾病之個體投與治療有效量之本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，向該個體投與組合物，該組合物包含呈醫藥學上可接受之形式之本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在某些實施例中，欲治療之疾病為增生性病症。在一特定實施例中，該疾病為癌症。在某些實施例中，該方法進一步包含向該個體投與治療有效量之至少一種另外治療劑，例如若欲治療之疾病為癌症則為抗癌劑。以上任一實施例中之「個體」可為哺乳動物，較佳為人類。
在另一態樣中，本發明提供誘導目標細胞、尤其腫瘤細胞溶解之方法。在一個實施例中，該方法包含使目標細胞與本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子在T細胞、尤其細胞毒性T細胞存在下接觸。在另一態樣中，提供誘 導個體中之目標細胞、尤其腫瘤細胞溶解之方法。在一個該種實施例中，該方法包含向該個體投與有效量之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以誘導目標細胞溶解。在一個實施例中，「個體」為人類。
在某些實施例中，欲治療之疾病為增生性病症，尤其為癌症。癌症之非限制性實例包括膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血液癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌及腎癌。可使用本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子治療之其他細胞增殖病症包括(但不限於)位於以下部位之贅瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系統、肝臟、胰臟、腹膜、內分泌腺(腎上腺、甲狀旁腺、垂體、睾丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭及頸、神經系統(中樞及周邊)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾臟、胸部及泌尿生殖系統。亦包括癌前病狀或病變及癌轉移。在某些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、腦癌、頭頸癌。熟習技術人員易於認識到，在許多情況下活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可能不提供治癒而可能僅提供部分益處。在一些實施例中，具有一些益處之生理變化亦被視為是治療有益的。因此，在一些實施例中，提供生理變化之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之量被視為「有效量」或「治療有效量」。需要治療之個體(subject)、患者或個體(individual)典 型地為哺乳動物，更尤其為人類。
在一些實施例中，向細胞投與有效量之本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在其他實施例中，向個體投與治療有效量之本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以治療疾病。
對於疾病之預防或治療，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(當單獨或與一或多種其他另外治療劑組合使用時)之適當劑量將視欲治療疾病之類型、投藥途徑、患者體重、活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之類型、疾病之嚴重程度及進程、出於預防抑或治療目的投與活化T細胞之雙特異性抗原結合分子、先前或同時進行之治療性干涉、患者之臨床病史及對活化T細胞之雙特異性抗原結合分子反應、及主治醫師之判斷而定。負責投與之人士在任何情況下均將確定組合物中活性成分之濃度及適用於個別個體之劑量。本文涵蓋多種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或經多個時間點多次投藥、快速投藥(bolus administration)及脈衝式輸注。
活化T細胞之雙特異性抗原結合分子宜一次性或經一系列治療向患者投與。視疾病之類型及嚴重程度而定，約1 μg/kg至15 mg/kg(例如0.1 mg/kg至10 mg/kg)之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可為用於例如藉由一或多次各別投藥抑或藉由連續輸注向患者投與之初始候選劑量。一種典型日劑量可視上文所提及之因素而在約1 μg/kg至100 mg/kg或高於100 mg/kg之範圍內。對於歷經數天或更長時 間之重複投藥，治療視病狀而定通常可持續直至發生對疾病症狀之所要抑制為止。活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之一種例示性劑量將在約0.005 mg/kg至約10 mg/kg之範圍內。在其他非限制性實例中，劑量亦可包含每次投藥每公斤體重約1微克、每公斤體重約5微克、每公斤體重約10微克、每公斤體重約50微克、每公斤體重約100微克、每公斤體重約200微克、每公斤體重約350微克、每公斤體重約500微克、每公斤體重約1毫克、每公斤體重約5毫克、每公斤體重約10毫克、每公斤體重約50毫克、每公斤體重約100毫克、每公斤體重約200毫克、每公斤體重約350毫克、每公斤體重約500毫克、每公斤體重約1000毫克或高於每公斤體重約1000毫克及其中可得出之任何範圍。在可自此處所列數目得出之範圍的非限制性實例中，基於上述數目，可投與每公斤體重約5 mg至每公斤體重約100 mg、每公斤體重約5微克至每公斤體重約500毫克等之範圍。因此，可向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg或10 mg/kg(或其任何組合)之一或多個劑量。該等劑量可間歇地(例如每週或每三週)投與(例如以使得患者接受約二至約二十個或例如約六個劑量之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)。可投與初始較高負荷劑量，隨後可投與一或多個較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進行易於藉由習知技術及分析監測。
本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子一般將以有效達成預期目的之量使用。對於用於治療或預防疾病病 狀，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其醫藥組合物以治療有效量投與或應用。治療有效量之確定完全處於熟習此項技術者能力範圍之內，尤其根據本文所提供之詳細揭示內容。
對於全身性投藥，可最初自活體外分析(諸如細胞培養物分析)估算治療有效劑量。隨後可在動物模型中調配劑量以達成包括如在細胞培養物中所測定之IC50值之循環濃度範圍。該資訊可用於更準確地確定適用於人類之劑量。
亦可使用此項技術中所熟知之技術自活體內資料(例如動物模型)估算初始劑量。一般熟習此項技術者可容易地基於動物資料而最佳化向人類之投藥。
可個別地調節劑量及時間間隔以提供足以維持治療效應的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之血漿含量。藉由注射投與之常用患者劑量在每天約0.1至50 mg/kg、典型地每天約0.5至1 mg/kg之範圍內。可藉由每天投與多個劑量來達成治療有效之血漿含量。可藉由例如HPLC量測血漿含量。
在局部投藥或選擇吸收之情況下，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之有效局部濃度可能與血漿濃度無關。熟習此項技術者將能夠在不進行過度實驗之情況下最佳化治療有效局部劑量。
治療有效劑量之本文所述之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子一般將提供治療效益而不產生實質性毒性。可藉由標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中測定活化T細 胞之雙特異性抗原結合分子之毒性及治療功效。可使用細胞培養物分析及動物研究來測定LD50(50%群體之致死劑量)及ED50(在50%群體中治療有效之劑量)。毒性與治療效應之間的劑量比為治療指數，其可以LD50/ED50比表示。展現較大治療指數之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子較佳。在一個實施例中，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子展現較高治療指數。自細胞培養物分析及動物研究中所獲得之資料可用於調配適用於人類之劑量範圍。劑量較佳處於包括ED50而具有極小毒性或無毒性的循環濃度範圍內。劑量可視多種因素(例如所用劑型、所用投藥途徑、個體之病狀及其類似因素)而在此範圍內變化。確切配方、投藥途徑及劑量可由個別醫師考慮患者之病狀來選擇(參見例如Fingl等人，1975,The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1頁，其以全文引用的方式併入本文中)。
以本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子治療之患者之主治醫師將知曉如何及何時因毒性、器官功能障礙及其類似情況而終止、中斷或調整投藥。相反，主治醫師亦應知曉若臨床反應不充足則調整治療至較高水準(排除毒性)。管理相關病症中所投與劑量之量值將隨欲治療病狀之嚴重程度、投藥途徑及其類似因素而變化。病狀之嚴重程度可例如部分地藉由標準預後評估方法評估。此外，劑量及或許給藥頻率亦將視個別患者之年齡、體重及反應而變化。
其他藥劑及治療
本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可在療法中與一或多種其他藥劑組合投與。舉例而言，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可與至少一種另外治療劑共投與。術語「治療劑」涵蓋為了治療需要該治療之個體中之症狀或疾病而投與的任何藥劑。該另外治療劑可包含適於所治療之特定適應症之任何活性成分，較佳為具有不會不利地彼此影響之互補活性的活性成分。在某些實施例中，另外治療劑為免疫調節劑、細胞生長抑制劑、細胞黏著抑制劑、細胞毒性劑、細胞凋亡活化劑或增加細胞對細胞凋亡誘導劑之敏感性之藥劑。在一特定實施例中，另外治療劑為抗癌劑，例如微管破裂劑、抗代謝物、拓撲異構酶抑制劑、DNA嵌入劑、烷基化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡活化劑或抗血管生成劑。
該等其他藥劑宜以有效達成預定目標之量組合存在。該等其他藥劑之有效量視所用活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之量、病症或治療之類型及以上所論述之其他因素而定。活化T細胞之雙特異性抗原結合分子一般係以與本文所述相同之劑量及投藥途徑、或以本文所述劑量之1至99%、或以憑經驗/臨床上確定為適當之任何劑量及任何途徑使用。
以上所示之該等組合療法涵蓋組合投藥(其中兩種或兩種以上治療劑包括於同一或各別組合物中)；及各別投藥， 在該情況下，投與本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可在投與另外治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後進行。本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子亦可與放射療法組合使用。
製品
在本發明之另一態樣中，提供一種製品，其含有適用於治療、預防及/或診斷如上所述病症之物質。該製品包含容器及容器上或隨附於容器之標籤或包裝插頁。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納組合物自身或與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。標籤或包裝插頁指示組合物用於治療所選病狀。此外，該製品可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另外細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中的製品可進一步包含包裝插頁，指示組合物可用於治療特定病狀。或者或另外，該製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液(諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液)。其可進一步包括自商業及使用者觀點而言所要之其他物 質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
實例
以下為本發明之方法及組合物之實例。應瞭解，鑒於以上提供之一般性描述，可實踐各種其他實施例。
通用方法 重組DNA技術
如Sambrook等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述，使用標準方法來操縱DNA。根據製造商說明書使用分子生物學試劑。關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列的一般資訊提供於：Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH公開案第91-3242號中。
DNA定序
藉由雙股定序來測定DNA序列。
基因合成
所要基因區段在需要時係藉由PCR使用適當模板產生，或係藉由Geneart AG(Regensburg,Germany)自合成寡核苷酸及自動化基因合成之PCR產物合成。在不能獲得確切基因序列之情況下，基於最接近同系物之序列設計寡核苷酸引子且藉由RT-PCR自來源於適當組織之RNA分離基因。將側接有單數限制性核酸內切酶裂解位點之基因區段選殖至標準選殖/定序載體中。自經轉型細菌純化質體DNA且 藉由UV光譜法測定濃度。藉由DNA定序來確認次選殖基因片段之DNA序列。基因區段經設計成具有適合之限制性位點以允許次選殖至各別表現載體中。所有構築體均經設計成具有編碼靶向在真核細胞中分泌之蛋白質之前導肽的5'端DNA序列。SEQ ID NO 154-162分別提供例示性前導肽及編碼其之聚核苷酸序列。
自PBMC分離初代人類全T細胞
藉由自獲自本地血庫或獲自健康人類供者新鮮血液之富集淋巴細胞製劑(白血球層(Buffy Coat))Histopaque密度離心來製備周邊血液單核細胞(PBMC)。簡言之，用無菌PBS稀釋血液且小心地層鋪於Histopaque梯度(Sigma，H8889)上。在室溫下以450×g離心30分鐘(制動斷開)之後，棄去含PBMC界相以上之血漿部分。將PBMC轉移至新50 ml Falcon管中且管用PBS填滿至50 ml之總體積。在室溫下以400×g離心混合物10分鐘(制動接通)。棄去上清液且用無菌PBS洗滌PBMC集結粒兩次(離心步驟在4℃下以350×g持續10分鐘)。對所得PBMC群體自動地計數(ViCell)，且將其於含有10% FCS及1% L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸(Biochrom，K0302)之RPMI1640培養基中儲存在37℃、5% CO2下之培育箱中直至開始分析。
根據製造商說明書使用全T細胞分離套組II(Pan T Cell Isolation Kit II)(Miltenyi Biotec #130-091-156)進行自PBMC之T細胞富集。簡言之，以每1千萬個細胞40 μl冷緩衝液(PBS，含有0.5% BSA、2 mM EDTA，經滅菌過濾)稀 釋細胞集結粒，且在4℃下以每1千萬個細胞10 μl生物素-抗體混合液(Biotin-Antibody Cocktail)培育10分鐘。每1千萬個細胞添加30 μl冷緩衝液及20 μl抗生物素磁性珠子，且在4℃下再培育混合物15分鐘。藉由添加10-20×當前體積及以300×g持續10分鐘之後續離心步驟來洗滌細胞。將至多1億個細胞再懸浮於500 μl緩衝液中。根據製造商說明書使用LS管柱(Miltenyi Biotec #130-042-401)進行未經標記之人類全T細胞之磁性分離。對所得T細胞群體自動地計數(ViCell)且將其於AIM-V培養基中儲存在37℃、5% CO2下之培育箱中直至開始分析(不超過24小時)。
自PBMC分離初代人類原始T細胞
藉由自獲自本地血庫或獲自健康人類供者新鮮血液之富集淋巴細胞製劑(白血球層)Histopaque密度離心來製備周邊血液單核細胞(PBMC)。根據製造商說明書使用來自Miltenyi Biotec之原始CD8+ T細胞分離套組(Naive CD8+ T cell isolation Kit)(#130-093-244)進行自PBMC之T細胞富集，但跳過最後的CD8+ T細胞分離步驟(亦參見關於分離初代人類全T細胞之描述)。
自脾細胞分離鼠類全T細胞
自C57BL/6小鼠分離脾臟，將其轉移至含有MACS緩衝液(PBS+0.5% BSA+2 mM EDTA)之GentleMACS C管(Miltenyi Biotech #130-093-237)中，且根據製造商說明書以GentleMACS解離器解離以獲得單細胞懸浮液。使細胞懸浮液通過預分離過濾器以移除剩餘的未解離組織粒子。 在4℃下以400×g離心4分鐘之後，添加ACK溶解緩衝液以溶解紅血球(在室溫下培育5分鐘)。用MACS緩衝液洗滌剩餘細胞兩次，計數且用於分離鼠類全T細胞。根據製造商說明書使用來自Miltenyi Biotec之全T細胞分離套組(#130-090-861)進行負性(磁性)選擇。對所得T細胞群體自動地計數(ViCell)且立即用於進一步分析。
自肝素化血液分離初代獼猴PBMC
如下藉由自健康獼猴供者之新鮮血液密度離心來製備周邊血液單核細胞(PBMC)：用無菌PBS 1：3稀釋肝素化血液，且用無菌PBS將Lymphoprep培養基(Axon Lab #1114545)稀釋至90%。將兩體積之稀釋血液層鋪於一體積之經稀釋密度梯度上，且藉由在室溫下在無制動之情況下以520×g離心30分鐘來分離PBMC部分。將PBMC帶轉移至新鮮50 ml Falcon管中，且在4℃下用無菌PBS藉由以400×g離心10分鐘來洗滌。進行一次低速離心以移除血小板(在150×g、4℃下15分鐘)，且對所得PBMC群體自動地計數(ViCell)且立即用於進一步分析。
目標細胞
對於評定靶向MCSP之雙特異性抗原結合分子，使用以下腫瘤細胞株：人類黑色素瘤細胞株WM266-4(ATCC #CRL-1676)，其衍生自惡性黑色素瘤之轉移位點且表現高含量之人類MCSP；及人類黑色素瘤細胞株MV-3(The Radboud University Nijmegen Medical Centre友情贊助)，其表現中等含量之人類MCSP。
對於評定靶向CEA之雙特異性抗原結合分子，使用以下腫瘤細胞株：人類胃癌細胞株MKN45(DSMZ #ACC 409)，其表現極高含量之人類CEA；人類女性高加索(Caucasian)結腸腺癌細胞株LS-174T(ECACC #87060401)，其表現中等至低含量之人類CEA；人類上皮樣胰臟癌細胞株Panc-1(ATCC #CRL-1469)，其表現(極)低含量之人類CEA；及鼠類結腸癌細胞株MC38-huCEA，其經內部工程改造以穩定表現人類CEA。
此外，使用人類T細胞白血病細胞株Jurkat(ATCC #TIB-152)來評定不同雙特異性構築體與細胞上之人類CD3之結合。
實例1 雙特異性抗原結合分子之製備、純化及表徵
與預先插入各別受者哺乳動物表現載體中之恆定重鏈或恆定輕鏈同框次選殖重鏈及輕鏈可變區序列。由MPSV啟動子推動抗體表現且將合成polyA信號序列定位於CDS之3'末端處。此外，各載體含有EBV OriP序列。
藉由用哺乳動物表現載體共轉染HEK293 EBNA細胞來製造分子。使用磷酸鈣方法轉染指數式生長之HEK293 EBNA細胞。或者，使用聚伸乙基亞胺(PEI)來轉染生長於懸浮液中之HEK293 EBNA細胞。對於製備「1+1 IgG scFab，一個臂/一個臂反向」構築體，用相應表現載體以1：1：1比率(「載體重鏈」：「載體輕鏈」：「載體重鏈-scFab」)轉染細胞。對於製備「2+1 IgG scFab」構築體， 用相應表現載體以1：2：1比率(「載體重鏈」：「載體輕鏈」：「載體重鏈-scFab」)轉染細胞。對於製備「1+1 IgG Crossfab」構築體，用相應表現載體以1：1：1：1比率(「載體第二重鏈」：「載體第一輕鏈」：「載體輕鏈Crossfab」：「載體第一重鏈-重鏈Crossfab」)轉染細胞。對於製備「2+1 IgG Crossfab」構築體，用相應表現載體以1：2：1：1比率(「載體第二重鏈」：「載體輕鏈」：「載體第一重鏈-重鏈Crossfab」：「載體輕鏈Crossfab」)轉染細胞。對於製備「2+1 IgG Crossfab，連接輕鏈」構築體，用相應表現載體以1：1：1：1比率(「載體重鏈」：「載體輕鏈」：「載體重鏈(CrossFab-Fab-Fc)」：「載體連接輕鏈」)轉染細胞。對於製備「1+1 CrossMab」構築體，用相應表現載體以1：1：1：1比率(「載體第一重鏈」：「載體第二重鏈」：「載體第一輕鏈」：「載體第二輕鏈」)轉染細胞。對於製備「1+1 IgG Crossfab輕鏈融合」構築體，用相應表現載體以1：1：1：1比率(「載體第一重鏈」：「載體第二重鏈」：「載體輕鏈Crossfab」：「載體第二輕鏈」)轉染細胞。
對於使用磷酸鈣轉染，使細胞於使用補充有10%(v/v)FCS之DMEM培養基之T燒瓶中生長為黏著單層培養物，且在其達到50%至80%匯合時轉染。對於T150燒瓶轉染，在轉染24小時前將1500萬個細胞接種於25 ml補充有FCS(最終為10% v/v)之DMEM培養基中，且將細胞置於37℃下具有5% CO2氛圍之培育箱中隔夜。對於欲轉染之各T150燒瓶，藉由混合94 μg以相應比率分開之總質體載體DNA、 水(達到469 μl之最終體積)及469 μl 1 M CaCl2溶液來製備DNA、CaCl2及水之溶液。向此溶液中添加938 μl 50 mM HEPES、280 mM NaCl、1.5 mM Na2HPO4溶液(pH 7.05)，立即混合10秒，且使其在室溫下靜置20秒。用10 ml補充有2%(v/v)FCS之DMEM稀釋懸浮液，且將其添加至T150中替代現有培養基。隨後，再添加13 ml轉染培養基。在37℃、5% CO2下培育細胞約17至20小時，隨後以25 ml DMEM、10% FCS置換培養基。在培養基互換約7天後藉由以210×g離心15分鐘收集改良性培養基，經滅菌過濾(0.22 μm過濾器)，用疊氮化鈉補充至0.01%(w/v)之最終濃度，且保持於4℃下。
對於使用聚伸乙基亞胺(PEI)轉染，將HEK293 EBNA細胞懸浮式培育於無血清CD CHO培養基中。對於在500 ml搖瓶中製造，在轉染前24小時接種4億個HEK293 EBNA細胞。對於轉染，以210×g離心細胞5分鐘，且將上清液置換為20 ml預溫之CD CHO培養基。將表現載體混合於20 ml CD CHO培養基中達到200 μg DNA之最終量。在添加540 μl PEI之後，使混合物渦旋15秒，隨後在室溫下培育10分鐘。隨後將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500 ml搖瓶中且在37℃下在具有5% CO2氛圍之培育箱中培育3小時。在培育時間之後，添加160 ml F17培養基且培育細胞24小時。在轉染一天之後，添加1 mM丙戊酸及7%饋料1(Lonza)。在培育7天之後，收集上清液以藉由以210×g離心15分鐘來純化，將溶液滅菌過濾(0.22 μm過濾器)，用疊 氮化鈉補充至0.01% w/v之最終濃度，且保持於4℃下。
相繼藉由蛋白質A親和力層析及尺寸排阻層析步驟自細胞培養物上清液純化所分泌之蛋白質。
對於親和力層析，將上清液裝載於用25 ml 20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉(pH 7.5)或40 ml 20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉、0.5 M氯化鈉(pH 7.5)平衡之HiTrap ProteinA HP管柱(CV=5 ml，GE Healthcare)上。藉由用至少十管柱體積之20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉、0.5 M氯化鈉(pH 7.5)洗滌，隨後使用六管柱體積之10 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉、0.5 M氯化鈉(pH 5.45)進行另一洗滌步驟來移除未結合蛋白。隨後，用20 ml 10 mM MES、100 mM氯化鈉(pH 5.0)洗滌管柱，且將目標蛋白於六管柱體積之20 mM檸檬酸鈉、100 mM氯化鈉、100 mM甘胺酸(pH 3.0)中溶離。或者，使用經20管柱體積自20 mM檸檬酸鈉、0.5 M氯化鈉(pH 7.5)至20 mM檸檬酸鈉、0.5 M氯化鈉(pH 2.5)之梯度溶離目標蛋白。藉由添加1/10之0.5 M磷酸鈉(pH 8)中和蛋白質溶液。濃縮並過濾目標蛋白，隨後裝載於用pH 6.7之25 mM磷酸鉀、125 mM氯化鈉、100 mM甘胺酸溶液平衡之HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)上。對於純化1+1 IgG Crossfab，管柱用pH 6.0之20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉溶液平衡。
藉由量測280 nm下之光學密度(OD)，使用基於胺基酸序列計算之莫耳消光係數來測定經純化蛋白質樣品之蛋白質濃度。藉由根據製造商說明書使用NuPAGE®預製凝膠系 統(Invitrogen,USA)(4-12% Tris-乙酸鹽凝膠或4-12% Bis-Tris)在存在及不存在還原劑(5 mM 1,4-二硫蘇糖醇)下且以庫馬斯(Coomassie)(來自Invitrogen之SimpleBlueTM SafeStain)染色進行SDS-PAGE來分析雙特異性構築體之純度及分子量。或者，藉由使用Caliper LabChip GXII系統(Caliper Lifescience)在存在及不存在還原劑下進行CE-SDS分析來分析分子之純度及分子量。
在25℃下使用Superdex 200 10/300GL分析型尺寸排阻層析管柱(GE Healthcare)於2 mM MOPS、150 mM NaCl、0.02%(w/v)NaN3(pH 7.3)操作緩衝液中分析蛋白質樣品之聚集體含量。或者，在25℃下使用TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)於25 mM K2HPO4、125 mM NaCl、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02%(w/v)NaN3(pH 6.7)操作緩衝液中分析抗體樣品之聚集體含量。
圖2-14展示SDS PAGE及分析型尺寸排阻層析之結果，且表2A展示不同雙特異性構築體之製劑之產率、蛋白質A層析後之聚集體含量及最終單體含量。
圖47展示抗CD3/抗MCSP雙特異性「2+1 IgG Crossfab，連接輕鏈」構築體(參見SEQ ID NO 3、5、29及179)之CE-SDS分析之結果。使用2 μg樣品進行分析。圖48展示最終產物之分析型尺寸排阻層析之結果(注入20 μg樣品)。
圖54展示多種構築體之CE-SDS及SDS PAGE分析之結果，且表2A展示不同雙特異性構築體之製劑之產率、蛋白質A層析後之聚集體含量及最終單體含量。
以先前技術串聯scFv形式(「(scFv)2」)且藉由將串聯scFv融合至Fc域(「(scFv)2-Fc」)產生雙特異性抗原結合分子作為對照。以與上文關於本發明之雙特異性抗原結合分子所述類似之方式在HEK293-EBNA細胞中製造分子且相繼藉由蛋白質A親和力層析及尺寸排阻層析步驟純化。由於高聚集體形成，一些樣品必須藉由應用自用20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉(pH 6.7)平衡之HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)至Superdex 10/300 GL管柱(GE Healthcare)之溶離及濃縮樣品來進一步純化，以便獲得具有高單體含量之蛋白質。隨後，如上文所述測定蛋白質濃度、純度及分子量及聚集體含量。
對照分子之產率、第一純化步驟後之聚集體含量及最終單體含量展示於表2B中。第一純化步驟(蛋白質A)後之聚集體含量之比較表明IgG Crossfab及IgG scFab構築體與「(scFv)2-Fc」及二硫橋鍵穩定化「(dsscFv)2-Fc」分子相 比之優良穩定性。
藉由動態光散射(DLS)監測蛋白質之熱穩定性。將30 μg具有1 mg/ml蛋白質濃度之經過濾蛋白質樣品一式兩份施用於Dynapro平板讀取器(Wyatt Technology Corporation；USA)。使溫度以0.05攝氏度/分鐘自25℃勻變至75℃，收集半徑及總散射強度。結果展示於圖15及表2C中。對於「(scFv)2-Fc」(抗MCSP/抗huCD3)分子，在49℃及68℃下觀測到兩個聚集點。「(dsscFv)2-Fc」構築體由於引入之二硫橋鍵而具有升高之聚集溫度(57℃)(圖15A，表2C)。「2+1 IgG scFab」及「2+1 IgG Crossfab」兩種構築體均在高於60℃之溫度下聚集，證實其與「(scFv)2-Fc」及「(dsscFv)2-Fc」形式相比之優良熱穩定性(圖15B，表2C)。
實例2 Fc受體與目標抗原結合之表面電漿共振分析 方法
所有表面電漿共振(SPR)實驗均在25℃下於Biacore T100上以HBS-EP作為操作緩衝液(0.01 M HEPES(pH 7.4)、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005%界面活性劑P20，Biacore,Freiburg/Germany)進行。
不同Fc變異體之FcR結合之分析
分析設置展示於圖16A中。對於分析不同Fc變異體與人類FcγRIIIa-V158及鼠類FcγRIV之相互作用，在pH 5.0下使用標準胺偶聯套組(Biacore,Freiburg/Germany)於CM5晶片上進行約6,500個共振單位(RU)之抗五His抗體(Qiagen)之直接偶聯。分別以4及10 nM捕捉HuFcγRIIIa-V158-K6H6及muFcγRIV-aviHis-生物素60秒。
使具有不同Fc突變之構築體以1000 nM之濃度以30微升/分鐘之流速通過流槽120秒。監測解離220秒。藉由減去參考流槽中所獲得之反應來校正整體折射率差異。此處，使Fc變異體流經固定化有抗五His抗體但其上注入HBS-EP而非HuFcγRIIIa-V158-K6H6或muFcγRIV-aviHis-生物素之表面。使用介於500-4000 nM範圍內之濃度測定野生型Fc與人類FcγRIIIa-V158及鼠類FcγRIV之親和力。
使用穩態反應藉由朗繆爾結合等溫線之非線性曲線擬合來得出解離常數KD。使用Biacore T100評估軟體(vAA，Biacore AB，Uppsala/Sweden)藉由數值積分擬合1：1朗繆爾 結合之速率方程得出動力學常數。
結果
藉由表面電漿共振監測Fc變異體與人類FcγRIIIa及鼠類FcγRIV之相互作用。與具有野生型(wt)Fc域之構築體相比，所分析之所有Fc突變體與捕捉之huFcγRIIIa-V158-K6H6及muFcγRIV-aviHis-生物素之結合均顯著減少。
與人類Fcγ受體之結合最少之Fc突變體為P329G L234A L235A(LALA)及P329G LALA N297D。單獨LALA突變不足以去除與huFcγRIIIa-V158-K6H6之結合。僅攜有LALA突變之Fc變異體與人類FcγRIIIa之殘餘結合親和力為2.100 nM，而wt Fc以600 nM之親和力結合人類FcγRIIIa受體(表3)。兩個KD值均藉由1：1結合模型，使用單一濃度得出。
可僅分析wt Fc與人類FcγRIIIa-V158及鼠類FcγRIV之親和力。KD值列於表3中。對於所分析之所有Fc突變體，與鼠類FcγRIV之結合幾乎完全消除。
與腫瘤抗原及CD3之同時結合之分析
藉由使用標準偶聯程序將1650個共振單位(RU)之MCSP之生物素標記D3域直接偶聯於感測器晶片SA上來進行T細胞雙特異性構築體與腫瘤抗原及人類CD3ε之同時結合之分析。使用標準胺基偶聯程序固定化人類EGFR。在pH 5.5下將8000個RU固定於CM5感測器晶片上。分析設置展示於圖16B中。
以200 nM捕捉不同T細胞雙特異性構築體60秒。隨後使人類CD3γ(G4S)5CD3ε-AcTev-Fc(杵)-Avi/Fc(臼)以2000 nM之濃度及40微升/分鐘之流速通過60秒。藉由減去參考流槽上所獲得之反應來校正整體折射率差異，其中使重組CD3ε流經固定化有MCSP或EGFR之D3域但不捕捉有T細胞雙特異性構築體之表面。
結果
藉由表面電漿共振來分析與腫瘤抗原及人類CD3ε之同時結合(圖17、圖18)。所有構築體均能夠同時結合腫瘤抗原及CD3。對於大多數構築體，注入人類CD3ε後之結合程度(RU)高於單獨注入構築體後達成之結合程度，由此反映腫瘤抗原及人類CD3ε均結合至構築體。
實例3 雙特異性構築體與細胞上之各別目標抗原之結合
藉由FACS測定不同雙特異性構築體與Jurkat細胞(ATCC #TIB-152)上之CD3及目標細胞上之相應腫瘤抗原之結合。簡言之，收集細胞，計數且檢查生存力。每孔塗佈15-20萬個細胞(於含有0.1% BSA之PBS中；90 μl)於圓底96孔盤 中，且在4℃下以指定濃度之雙特異性構築體及相應IgG對照物(10 μl)培育30分鐘。為了更好地比較，所有構築體及IgG對照物均校正至相同莫耳濃度。在培育之後，對細胞進行離心(5分鐘，350×g)，用150 μl含有0.1% BSA之PBS洗滌，再懸浮且在4℃下以每孔12微升結合FITC或PE之二次抗體再培育30分鐘。使用FACSCantoII(軟體FACS Diva)偵測結合之構築體。使用結合FITC之抗His抗體(Lucerna，#RHIS-45F-Z)偵測「(scFv)2」分子。對於所有其他分子，使用結合FITC或PE之AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人類IgG特異性Fcγ片段(分別為Jackson Immuno Research Lab #109-096-098/工作溶液1：20或#109-116-170/工作溶液1：80)。藉由添加每孔120 μl含有0.1% BSA之PBS且以350×g離心5分鐘洗滌細胞。以每孔150 μl含有0.1% BSA之PBS進行第二洗滌步驟。除非另有指示，否則在暗處在4℃下以每孔100 μl固定緩衝液(BD #554655)固定細胞15分鐘，以400×g離心6分鐘且保持於每孔200 μl含有0.1% BSA之PBS中直至樣品用FACS CantoII進行量測。使用GraphPad Prism軟體計算EC50值。
在第一實驗中，藉由流動式細胞量測術分析靶向人類MCSP及人類CD3之不同雙特異性構築體與Jurkat(即人類T細胞白血病細胞)上表現之人類CD3或Colo-38人類黑色素瘤細胞上之人類MCSP之結合。
結果呈現於圖19-21中，其展示以雙特異性分子、對照IgG、僅二次抗體培育或左側未經處理之細胞的平均螢光 強度。
如圖19中所示，對於「(scFv)2」分子之兩種抗原結合部分(亦即CD3(圖19A)及MCSP(圖19B))，與對照樣品相比，均觀測到明顯結合信號。
「2+1 IgG scFab」分子(SEQ ID NO 5、17、19)展示與Colo-38細胞上之huMCSP之良好結合(圖20A)。該CD3部分之CD3結合稍佳於參考抗人類CD3 IgG(圖20B)。
如圖21A中所描繪，兩種「1+1」構築體展示相當的與細胞上之人類CD3之結合信號。參考抗人類CD3 IgG產生稍弱之信號。此外，所測試之兩種構築體(「1+1 IgG scFab，一個臂」(SEQ ID NO 1、3、5)及「1+1 IgG scFab，一個臂反向」(SEQ ID NO 7、9、11))展示相當的與細胞上之人類MCSP之結合(圖21B)。由參考抗人類MCSP IgG所獲得之結合信號稍弱些。
在另一實驗中，藉由流動式細胞量測術分析經純化「2+1 IgG scFab」雙特異性構築體(SEQ ID NO 5、17、19)及相應抗人類MCSP IgG與Colo-38人類黑色素瘤細胞上之人類MCSP之劑量依賴性結合，以確定雙特異性構築體係經由其「臂」中之一者抑或兩者結合至MCSP。如圖22中所描繪，「2+1 IgG scFab」構築體展示與MCSP IgG相同之結合模式。
在另一實驗中，評定Crossfab片段中具有VL/VH(參見SEQ ID NO 33、63、65、67)或CL/CH1互換(參見SEQ ID NO 66、67、183、197)之CD3/CEA「2+1 IgG Crossfab， 反向」雙特異性構築體與Jurkat細胞表現之人類CD3或LS-174T細胞表現之人類CEA的結合。作為對照，同樣評定相等最大濃度的相應IgG及因經標記之二次抗體(山羊抗人類結合FITC之AffiniPure F(ab')2片段，特異性Fcγ片段，Jackson Immuno Research Lab #109-096-098)之背景染色。如圖55中所說明，兩種構築體均展示與細胞上之人類CEA以及人類CD3之良好結合。「2+1 IgG Crossfab，反向(VL/VH)」及「2+1 IgG Crossfab，反向(CL/CH1)」構築體之EC50計算值分別為4.6及3.9 nM(CD3)及9.3及6.7 nM(CEA)。
在另一實驗中，評定CD3/MCSP「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)及「2+1 IgG Crossfab，反向」(參見SEQ ID NO 5、23、183、187)構築體與Jurkat細胞表現之人類CD3或WM266-4細胞表現之人類MCSP的結合。圖56顯示，雖然兩種構築體與細胞上之MCSP之結合良好程度相當，但「反向」構築體與CD3之結合與另一構築體相比減少。「2+1 IgG Crossfab，反向」及「2+1 IgG Crossfab」構築體之EC50計算值分別為6.1及1.66 nM(CD3)及0.57及0.95 nM(MCSP)。
在另一實驗中，測定「1+1 IgG Crossfab輕鏈(LC)融合物」構築體(SEQ ID NO 183、209、211、213)與Jurkat細胞表現之人類CD3及LS-174T細胞表現之人類CEA的結合。作為對照，同樣評定相等最大濃度的相應抗CD3及抗CEA IgG及因經標記之二次抗體(山羊抗人類結合FITC之 AffiniPure F(ab')2片段，特異性Fcγ片段，Jackson Immuno Research Lab #109-096-098)之背景染色。如圖57中所描繪，「1+1 IgG Crossfab LC融合物」與CEA之結合似乎大大減少，而與CD3之結合至少與參考IgG相當。
在最終實驗中，測定「2+1 IgG Crossfab」(SEQ ID NO 5、23、215、217)及「2+1 IgG Crossfab，反向」(SEQ ID NO 5、23、215、219)構築體與Jurkat細胞表現之人類CD3及WM266-4腫瘤細胞表現之人類MCSP的結合。如圖58中所描繪，與另一構築體相比，「2+1 IgG Crossfab，反向」與人類CD3之結合減少，但與人類MCSP之結合良好程度相當。「2+1 IgG Crossfab」及「2+1 IgG Crossfab，反向」構築體之EC50計算值分別為10.3及32.0 nM(CD3)及3.1及3.4 nM(MCSP)。
實例4 初代人類T細胞上之表面活化標記物在接合雙特異性構築體後之FACS分析
藉由流動式細胞量測術測試靶向huMCSP-huCD3之經純化雙特異性「2+1 IgG scFab」(SEQ ID NO 5、17、19)及「(scFv)2」分子在表現人類MCSP之腫瘤細胞存在下上調CD8+ T細胞上之早期表面活化標記物CD69或晚期活化標記物CD25之潛力。
簡言之，用細胞解離緩衝液收集MCSP陽性Colo-38細胞，計數且檢查生存力。於AIM-V培養基中調節細胞至每毫升0.3×106個(活)細胞，每孔吸取100 μl之此細胞懸浮液 至圓底96孔盤(如指定)中。添加50 μl(經稀釋)雙特異性構築體至含有細胞之孔中，獲得1 nM之最終濃度。自健康供者之新鮮血液中分離人類PBMC效應細胞且於AIM-V培養基中調節至每毫升6×106個(活)細胞。向分析盤(參見上文)之每孔中添加50 μl此細胞懸浮液，獲得10：1之最終E：T比。為分析雙特異性構築體是否僅在表現腫瘤抗原huMCSP之目標細胞存在下能夠活化T細胞，包括含有1 nM各別雙特異性分子以及PBMC但無目標細胞之孔。
在37℃、5% CO2下培育15小時(CD69)或24小時(CD25)之後，對細胞進行離心(5分鐘，350×g)且用每孔150 μl含有0.1% BSA之PBS洗滌兩次。根據供應商建議在4℃下針對CD8(小鼠IgG1,κ；純系HIT8a；BD #555635)、CD69(小鼠IgG1；純系L78；BD #340560)及CD25(小鼠IgG1,κ；純系M-A251；BD #555434)進行表面染色30分鐘。用每孔150 μl含有0.1% BSA之PBS洗滌細胞兩次，且在4℃下使用每孔100 μl固定緩衝液(BD #554655)固定15分鐘。離心之後，將樣品再懸浮於每孔200 μl具有0.1% BSA之PBS中，且使用FACS CantoII機(軟體FACS Diva)分析。
圖23描繪CD8+ T細胞上之早期活化標記物CD69(A)或晚期活化標記物CD25(B)在分別培育15小時或24小時後之表現量。兩種構築體均僅在目標細胞存在下誘導兩種活化標記物之上調。在此分析中，「(scFv)2」分子似乎比「2+1 IgG scFab」構築體具有稍高之活性。
藉由流動式細胞量測術進一步測試靶向huMCSP-huCD3 之經純化雙特異性「2+1 IgG scFab」及「(scFv)2」分子在表現人類MCSP之腫瘤細胞存在下上調CD8+ T細胞或CD4+ T細胞上之晚期活化標記物CD25之潛力。實驗步驟如上文所述，其中以5：1之E：T比使用人類全T效應細胞且培育時間為五天。
圖24顯示，兩種構築體均僅在目標細胞存在下誘導CD8+(A)以及CD4+ (B)T細胞上之CD25之上調。在此分析中，「2+1 IgG scFab」構築體與「(scFv)2」分子相比似乎誘導較少之CD25上調。一般而言，CD8+上之CD25上調比CD4+ T細胞上之CD25上調顯著。
在另一實驗中，分析靶向獼猴CD3及人類MCSP之經純化「2+1 IgG Crossfab」(SEQ ID NO 3、5、35、37)在腫瘤目標細胞存在下上調CD8+ T細胞上之表面活化標記物CD25之潛力。簡言之，用細胞解離緩衝液收集表現人類MCSP之MV-3腫瘤目標細胞，洗滌且將其再懸浮於含有2% FCS及1% GlutaMax之DMEM中。每孔塗佈30 000個細胞於圓底96孔盤中且以指定濃度添加相應抗體稀釋液(圖25)。雙特異性構築體及不同IgG對照物經調節至相同莫耳濃度。添加自兩個健康動物之血液分離之獼猴PBMC效應細胞，獲得3：1之最終E：T比。在37℃、5% CO2下培育43小時之後，以350×g離心細胞5分鐘且用含有0.1% BSA之PBS洗滌兩次。根據供應商建議針對CD8(Miltenyi Biotech #130-080-601)及CD25(BD #557138)進行表面染色。用每孔150 μl含有0.1% BSA之PBS洗滌細胞兩次，且在4℃下使用每 孔100 μl固定緩衝液(BD #554655)固定15分鐘。離心之後，將樣品再懸浮於每孔200 μl具有0.1% BSA之PBS中，且使用FACS CantoII機(軟體FACS Diva)分析。
如圖25中所描繪，雙特異性構築體僅在目標細胞存在下誘導CD8+ T細胞上之CD25之濃度依賴性上調。抗獼猴CD3 IgG(純系FN-18)亦能在不交聯之情況下誘導CD8+ T細胞上之CD25上調(參見由Nestor獼猴所得之資料)。在最大雙特異性構築體濃度(在不存在目標細胞下)不存在獼猴T細胞之過度活化。
在另一實驗中，將CD3-MCSP「2+1 IgG Crossfab，連接輕鏈」(參見SEQ ID NO 3、5、29、179)與CD3-MCSP「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)在腫瘤目標細胞存在下上調CD8+ T細胞上之早期活化標記物CD69或晚期活化標記物CD25之潛力相比較。在存在或不存在MCSP陽性Colo38目標細胞下以指定濃度之雙特異性構築體培育初代人類PBMC(如上文所述分離)至少22小時。簡言之，含有MCSP陽性目標細胞(或培養基)之平底96孔盤之每孔塗佈30萬個初代人類PBMC。最終效應細胞與目標細胞(E：T)比為10：1。在37℃、5% CO2下以指定濃度之雙特異性構築體及對照物培育細胞指定之培育時間。將效應細胞針對CD8及CD69或CD25進行染色且藉由FACS CantoII分析。
圖53展示此實驗之結果。兩種2+1 IgG Crossfab分子(連接或不連接輕鏈)之間的CD69(A)或CD25上調(B)未偵測到 顯著差異。
在另一實驗中，將CD3/MCSP「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)及「1+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 5、29、33、181)構築體與「1+1 CrossMab」構築體(參見SEQ ID NO 5、23、183、185)在腫瘤目標細胞存在下上調CD4+或CD8+ T細胞上之CD69或CD25之潛力相比較。如上文所述進行分析，其中在存在或不存在表現人類MCSP之MV-3腫瘤細胞下進行，培育時間為24小時。
如圖59中所示，「1+1 IgG Crossfab」及「2+1 IgG Crossfab」構築體比「1+1 CrossMab」分子誘導較顯著之活化標記物上調。
在最終實驗中，評定CD3/MCSP「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 5、23、215、217)及「2+1 IgG Crossfab，反向」(參見SEQ ID NO 5、23、215、219)構築體在腫瘤目標細胞存在下上調來自兩種不同獼猴之CD4+或CD8+ T細胞上之CD25之潛力。如上文所述進行分析，其中在存在或不存在表現人類MCSP之MV-3腫瘤細胞下進行，E：T比為3：1且培育時間為約41小時。
如圖60中所示，兩種構築體均能夠以濃度依賴性方式上調CD4+及CD8+ T細胞上之CD25，兩種形式之間無顯著差異。不具有抗體且不具有目標細胞之對照樣品產生與具有抗體但無目標之樣品相當之信號(未展示)。
實例5 用CD3雙特異性構築體活化人類全T細胞後之干擾素γ分泌
分析靶向人類MCSP及人類CD3之經純化「2+1 IgG scFab」(SEQ ID NO 5、17、19)在人類MCSP陽性U-87MG細胞存在下誘導T細胞活化之潛力，藉由至上清液中之人類干擾素(IFN)-γ之釋放進行量測。使用調節至相同莫耳濃度之抗人類MCSP及抗人類CD3 IgG作為對照物。簡言之，用細胞解離緩衝液收集表現huMCSP之U-87MG神經膠母細胞瘤星形細胞瘤目標細胞(ECACC 89081402)，洗滌且將其再懸浮於AIM-V培養基(Invitrogen #12055-091)中。每孔塗佈20 000個細胞於圓底96孔盤中，且添加相應抗體稀釋液，獲得1 nM之最終濃度。添加自白血球層分離之人類全T效應細胞，獲得5：1之最終E：T比。在37℃、5% CO2下隔夜培育18.5小時之後，以350×g離心分析盤5分鐘且將上清液轉移至新鮮96孔盤中。根據製造商說明書(BD OptEIA人類IFN-γ ELISA套組II，來自Becton Dickinson,#550612)藉由ELISA量測上清液中之人類IFN-γ含量。
如圖26中所描繪，參考IgG顯示無至弱之IFN-γ分泌誘導，而「2+1 IgG scFab」構築體能夠活化人類T細胞以分泌IFN-γ。
實例6
由靶向T細胞上之CD3及腫瘤細胞上之MCSP或EGFR之交聯雙特異性構築體所介導之重引導T細胞細胞毒性(LDH釋放分析)
在第一系列實驗中，分析靶向CD3及MCSP之雙特異性構築體在構築體經由抗原結合部分與細胞上之其各別目標 抗原之結合而交聯後誘導腫瘤目標細胞中T細胞介導之細胞凋亡的潛力(圖27-38)。
在一個實驗中，比較靶向人類CD3及人類MCSP之經純化「2+1 IgG scFab」(SEQ ID NO 5、21、23)及「2+1 IgG Crossfab」(SEQ ID NO 3、5、29、33)構築體及相應「(scFv)2」分子。簡言之，用細胞解離緩衝液收集表現huMCSP之MDA-MB-435人類黑色素瘤目標細胞，洗滌且將其再懸浮於AIM-V培養基(Invitrogen #12055-091)中。每孔塗佈30 000個細胞於圓底96孔盤中且以指定濃度添加各別構築體稀釋液。所有構築體及相應對照IgG均調節至相同莫耳濃度。添加人類全T效應細胞，獲得5：1之最終E：T比。使用1 μg/mL PHA-M(Sigma #L8902；自菜豆(Phaseolus vulgaris)分離之同工凝集素(isolectin)之混合物)作為活化人類全T細胞之陽性對照物。為了校正，目標細胞之最大溶解(=100%)係藉由以1% Triton X-100之最終濃度培育目標細胞來測定。最小溶解(=0%)係指與效應細胞共培育但無任何構築體或抗體之目標細胞。在37℃、5% CO2下隔夜培育20小時之後，根據製造商說明書用LDH偵測套組(Roche Applied Science，#11 644 793 001)量測至上清液中之細胞凋亡/壞死目標細胞之LDH釋放。
如圖27中所描繪，兩種「2+1」構築體均誘導與「(scFv)2」分子相當的目標細胞中之細胞凋亡。
此外，比較Fc域不同之經純化「2+1 IgG Crossfab」(SEQ ID NO 3、5、29、33)及「2+1 IgG scFab」構築體， 以及「(scFv)2」分子。Fc域中之不同突變(如指定之L234A+L235A(LALA)、P329G及/或N297D)減少或消除由含有野生型(wt)Fc域之構築體誘導之(NK)效應細胞功能。實驗程序如上文所述。
圖28顯示，所有構築體均誘導與「(scFv)2」分子相當的目標細胞中之細胞凋亡。
圖29展示經純化「2+1 IgG scFab」(SEQ ID NO 5、17、19)與「(scFv)2」分子誘導腫瘤目標細胞中T細胞介導之細胞凋亡之潛力的比較結果。實驗程序如上文所述，其中以5：1之E：T比使用表現huMCSP之Colo-38人類黑色素瘤目標細胞，且隔夜培育18.5小時。如圖中所描繪，「2+1 IgG scFab」構築體展示與「(scFv)2」分子相當之細胞毒性活性。
類似地，圖30展示經純化「2+1 IgG scFab」構築體(SEQ ID NO 5、17、19)與「(scFv)2」分子的比較結果，其中以5：1之E：T比使用表現huMCSP之Colo-38人類黑色素瘤目標細胞且培育時間為18小時。如圖中所描繪，「2+1 IgG scFab」構築體展示與(scFv)2分子相當之細胞毒性活性。
圖31展示經純化「2+1 IgG scFab」構築體(SEQ ID NO 5、17、19)與「(scFv)2」分子的比較結果，其中以5：1之E：T比使用表現huMCSP之MDA-MB-435人類黑色素瘤目標細胞且隔夜培育23.5小時。如圖中所描繪，該構築體與「(scFv)2」分子誘導目標細胞中之細胞凋亡的程度相當。 「2+1 IgG scFab」構築體在最高濃度下展示減少之功效。
此外，分析對於人類CD3及人類MCSP兩種目標均為單價之不同雙特異性構築體以及相應「(scFv)2」分子誘導T細胞介導之細胞凋亡之潛力。圖32展示「1+1 IgG scFab，一個臂」(SEQ ID NO 1、3、5)及「1+1 IgG scFab，一個臂反向」(SEQ ID NO 7、9、11)構築體之結果，其中以5：1之E：T比使用表現huMCSP之Colo-38人類黑色素瘤目標細胞且培育時間為19小時。如圖中所描繪，在此分析中，兩種「1+1」構築體之活性均小於「(scFv)2」分子，其中「1+1 IgG scFab，一個臂」分子優於「1+1 IgG scFab，一個臂反向」分子。
圖33展示「1+1 IgG scFab」構築體(SEQ ID NO 5、21、213)之結果，其中以5：1之E：T比使用表現huMCSP之Colo-38人類黑色素瘤目標細胞，且培育時間為20小時。如圖中所描繪，「1+1 IgG scFab」構築體之細胞毒性小於「(scFv)2」分子。
在另一實驗中，分析經純化「2+1 IgG Crossfab」(SEQ ID NO 3、5、29、33)、「1+1 IgG Crossfab」(SEQ ID NO 5、29、31、33)及「(scFv)2」分子在構築體經由細胞上之兩種目標抗原CD3及MCSP之結合而交聯後誘導腫瘤目標細胞中T細胞介導之細胞凋亡的潛力。使用表現huMCSP之MDA-MB-435人類黑色素瘤細胞作為目標細胞，E：T比為5：1，且培育時間為20小時。結果展示於圖34中。「2+1 IgG Crossfab」構築體誘導之目標細胞中之細胞凋亡與 「(scFv)2」分子相當。單價與二價「IgG Crossfab」形式之比較明確顯示二價形式更有效。
在另一實驗中，分析經純化「2+1 IgG Crossfab」(SEQ ID NO 3、5、29、33)構築體誘導不同(腫瘤)目標細胞中T細胞介導之細胞凋亡的潛力。簡言之，用細胞解離緩衝液收集如所指定之MCSP陽性Colo-38腫瘤目標細胞、間葉細胞幹細胞(衍生自骨髓，Lonza #PT-2501或脂肪組織，Invitrogen #R7788-115)或外被細胞(來自胎盤；PromoCell #C-12980)，洗滌且將其再懸浮於AIM-V培養基(Invitrogen #12055-091)中。每孔塗佈30 000個細胞於圓底96孔盤中且以指定濃度添加各別抗體稀釋液。添加自健康供者之新鮮血液分離之人類PBMC效應細胞，獲得25：1之最終E：T比。在37℃、5% CO2下培育4小時之後，根據製造商說明書用LDH偵測套組(Roche Applied Science，#11 644 793 001)量測至上清液中之細胞凋亡/壞死目標細胞之LDH釋放。
如圖35中所描繪，僅可在Colo-38細胞中觀測到顯著的T細胞介導之細胞毒性。此結果與Colo-38細胞表現顯著含量之MCSP，而間葉細胞幹細胞及外被細胞僅極弱地表現MCSP相一致。
亦將經純化「2+1 IgG scFab」(SEQ ID NO 5、17、19)構築體及「(scFv)2」分子與在Fc域中具有減小比例之岩藻糖基化N-聚糖的經糖工程改造(glycoengineered)之抗人類MCSP IgG抗體(MCSP GlycoMab)相比較。對於此實驗，以25：1之固定E：T比(圖36A)或以20：1至1：10之不同E：T比(圖 36B)使用表現huMCSP之Colo-38人類黑色素瘤目標細胞及人類PBMC效應細胞。以圖36A中所指定之濃度或以1667 pM之固定濃度(圖36B)使用不同分子。在培育21小時之後進行讀數。如圖36A及B中所描繪，兩種雙特異性構築體均展示比MSCP GlycoMab高之效能。
在另一實驗中，分析靶向獼猴CD3及人類MCSP之經純化「2+1 IgG Crossfab」(SEQ ID NO 3、5、35、37)。簡言之，用細胞解離緩衝液收集表現人類MCSP之MV-3腫瘤目標細胞，洗滌且將其再懸浮於含有2% FCS及1% GlutaMax之DMEM中。每孔塗佈30 000個細胞於圓底96孔盤中且以指定之濃度添加構築體或參考IgG之各別稀釋液。雙特異性構築體及不同IgG對照物經調節至相同莫耳濃度。添加自健康獼猴之血液分離之獼猴PBMC效應細胞，獲得3：1之最終E：T比。在37℃、5% CO2下培育24小時或43小時之後，根據製造商說明書用LDH偵測套組(Roche Applied Science，#11 644 793 001)量測至上清液中之細胞凋亡/壞死目標細胞之LDH釋放。
如圖37中所描繪，雙特異性構築體誘導自目標細胞之濃度依賴性LDH釋放。該效應在43小時之後比在24小時之後強。抗獼猴CD3 IgG(純系FN-18)亦能在不交聯之情況下誘導目標細胞之LDH釋放。
圖38展示經純化「2+1 IgG Crossfab」(SEQ ID NO 3、5、29、33)與「(scFv)2」構築體的比較結果，其中以10：1之E：T比使用表現MCSP之人類黑色素瘤細胞株(MV-3)作為 目標細胞及人類PBMC作為效應細胞，且培育時間為26小時。如圖中所描繪，根據EC50，「2+1 IgG Crossfab」構築體比「(scFv)2」分子有效。
在第二系列實驗中，分析靶向CD3及EGFR之雙特異性構築體在構築體經由抗原結合部分與細胞上之其各別目標抗原之結合而交聯後誘導腫瘤目標細胞中之T細胞介導之細胞凋亡的潛力(圖39-41)。
在一個實驗中，比較靶向CD3及EGFR之經純化「2+1 IgG scFab」(SEQ ID NO 45、47、53)及「1+1 IgG scFab」(SEQ ID NO 47、53、213)構築體及相應「(scFv)2」分子。簡言之，用胰蛋白酶收集表現人類EGFR之LS-174T腫瘤目標細胞，洗滌且將其再懸浮於AIM-V培養基(Invitrogen #12055-091)中。每孔塗佈30 000個細胞於圓底96孔盤中且以指定濃度添加各別抗體稀釋液。所有構築體及對照物均調節至相同莫耳濃度。添加人類全T效應細胞，獲得5：1之最終E：T比。使用1 μg/mL PHA-M(Sigma #L8902)作為活化人類全T細胞之陽性對照物。為了校正，目標細胞之最大溶解(=100%)係藉由以1% Triton X-100之最終濃度培育目標細胞來測定。最小溶解(=0%)係指與效應細胞共培育但無任何構築體或抗體之目標細胞。在37℃、5% CO2下隔夜培育18小時之後，根據製造商說明書用LDH偵測套組(Roche Applied Science，#11 644 793 001)量測至上清液中之細胞凋亡/壞死目標細胞之LDH釋放。
如圖39中所描繪，「2+1 IgG scFab」構築體展示與 「(scFv)2」分子相當之細胞毒性活性，而「1+1 IgG scFab」構築體之活性較小。
在另一實驗中，比較經純化「1+1 IgG scFab，一個臂」(SEQ ID NO 43、45、47)、「1+1 IgG scFab，一個臂反向」(SEQ ID NO 11、49、51)、「1+1 IgG scFab」(SEQ ID NO 47、53、213)及「(scFv)2」分子。實驗條件如上文所述，但其培育時間為21小時。
如圖40中所描繪，在此分析中，「1+1 IgG scFab」構築體展示比「(scFv)2」分子稍低之細胞毒性活性。兩種「1+1 IgG scFab，一個臂(反向)」構築體之活性均明顯小於「(scFv)2」分子。
在另一實驗中，比較經純化「1+1 IgG scFab，一個臂」(SEQ ID NO 43、45、47)及「1+1 IgG scFab，一個臂反向」(SEQ ID NO 11、49、51)構築體及「(scFv)2」分子。此實驗中之培育時間為16小時，且結果描繪於圖41中。以人類全T細胞培育後，兩種「1+1 IgG scFab，一個臂(反向)」構築體之活性均小於「(scFv)2」分子，但顯示LDH自目標細胞之濃度依賴性釋放(圖41A)。在LS-174T腫瘤細胞與自PBMC分離之原始T細胞共培育後，構築體僅具有基礎活性，其中「(scFv)2」分子最具活性(圖41B)。
在另一實驗中，分析靶向CD3及纖維母細胞活化蛋白(FAP)之經純化「1+1 IgG scFab，一個臂反向」(SEQ ID NO 11、51、55)、「1+1 IgG scFab」(57、61、213)及「2+1 IgG scFab」(57、59、61)及相應「(scFv)2」分子在 構築體經由兩種靶向部分細胞上之其各別目標抗原之結合而交聯後誘導表現人類FAP之纖維母細胞GM05389細胞中T細胞介導之細胞凋亡的潛力。簡言之，在前一天用胰蛋白酶收集人類GM05389目標細胞，洗滌且將其再懸浮於AIM-V培養基(Invitrogen #12055-091)中。每孔塗佈30 000個細胞於圓底96孔盤中且在37℃、5% CO2下培育隔夜以允許細胞回收及黏著。次日，對細胞進行離心，棄去上清液，且以指定濃度添加新鮮培養基以及構築體或參考IgG之各別稀釋液。所有構築體及對照物均調節至相同莫耳濃度。添加人類全T效應細胞，獲得5：1之最終E：T比。使用5 μg/mL PHA-M(Sigma #L8902)作為活化人類全T細胞之陽性對照物。為了校正，目標細胞之最大溶解(=100%)係藉由以1% Triton X-100之最終濃度培育目標細胞來測定。最小溶解(=0%)係指與效應細胞共培育但無任何構築體或抗體之目標細胞。在37℃、5% CO2下再隔夜培育18小時之後，根據製造商說明書用LDH偵測套組(Roche Applied Science，#11 644 793 001)量測至上清液中之細胞凋亡/壞死目標細胞之LDH釋放。
如圖42中所描繪，根據EC50值，「2+1 IgG scFab」構築體展示與「(scFv)2」分子相當之細胞毒性活性。在此分析中，「1+1 IgG scFab，一個臂反向」構築體之活性小於另一構築體。
在另一組實驗中，將CD3/MCSP「2+1 IgG Crossfab，連接輕鏈」(參見SEQ ID NO 3、5、29、179)與CD3/MCSP 「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)相比較。簡言之，在分析當天用細胞解離緩衝液(或在開始分析前一天用胰蛋白酶)收集目標細胞(人類Colo-38、人類MV-3或WM266-4黑色素瘤細胞)，洗滌且將其再懸浮於適當細胞培養基(RPMI1640，包括2% FCS及1% Glutamax)中。每孔塗佈20 000-30 000個細胞於平底96孔盤中且如指定添加各別抗體稀釋液(一式三份)。添加PBMC作為效應細胞，使得最終效應細胞與目標細胞(E：T)比為10：1。所有構築體及對照物均調節至相同莫耳濃度，培育時間為22小時。如上文所述進行LDH釋放之偵測及校正。
圖49至52展示用MV-3黑色素瘤細胞(圖49)、Colo-38細胞(圖50及51)或WM266-4細胞(圖52)進行之四個分析之結果。如圖49中所示，在以MV-3細胞作為目標細胞之分析中，連接輕鏈之構築體與不連接輕鏈之構築體相比效能較低。如圖50及51中所示，在以表現高MCSP之Colo-38細胞作為目標細胞之分析中，連接輕鏈之構築體與不連接輕鏈之構築體相比效能較高。最終，如圖52中所示，當使用表現高MCSP之WM266-4細胞作為目標細胞時，兩種構築體之間不存在顯著差異。
在另一實驗中，比較兩種靶向CEA之「2+1 IgG Crossfab，反向」構築體，其中在Crossfab片段中V區(VL/VH，參見SEQ ID NO 33、63、65、67)或C區(CL/CH1，參見SEQ ID NO 65、67、183、197)互換。如上文所述進行分析，其中使用人類PBMC作為效應細胞及表 現人類CEA之目標細胞。用胰蛋白酶-EDTA(LuBiosciences #25300-096)收集目標細胞(MKN-45或LS-174T腫瘤細胞)，洗滌且將其再懸浮於包括1% Glutamax(LuBiosciences #35050087)及2% FCS之RPMI1640(Invitrogen #42404042)中。每孔塗佈30 000個細胞於圓底96孔盤中且以指定濃度添加雙特異性構築體。所有構築體及對照物均調節至相同莫耳濃度。添加人類PBMC效應細胞，獲得10：1之最終E：T比，培育時間為28小時。使用GraphPad Prism 5軟體計算EC50值。
如圖61中所示，具有CL/CH1互換之構築體對兩種目標細胞株均展示比具有VL/VH互換之構築體稍佳的活性。CL/CH1互換之構築體及VL/VH互換之構築體之EC50計算值分別為115及243 pM(MKN-45細胞)，及673及955 pM(LS-174T細胞)。
類似地，比較兩種靶向MCSP之「2+1 IgG Crossfab」構築體，其中在Crossfab片段中V區(VL/VH，參見SEQ ID NO 33、189、191、193)或C區(CL/CH1，參見SEQ ID NO 183、189、193、195)互換。如上文所述進行分析，其中使用人類PBMC作為效應細胞及表現人類MCSP之目標細胞。用細胞解離緩衝液(LuBiosciences #13151014)收集目標細胞(WM266-4)，洗滌且將其再懸浮於包括1% Glutamax(LuBiosciences #35050087)及2% FCS之RPMI1640(Invitrogen #42404042)中。每孔塗佈30 000個細胞於圓底96孔盤中且以指定濃度添加構築體。所有構築 體及對照物均調節至相同莫耳濃度。添加人類PBMC效應細胞，獲得10：1之最終E：T比，培育時間為26小時。使用GraphPad Prism 5軟體計算EC50值。
如圖62中所描繪，兩種構築體展示相當活性，具有CL/CH1互換之構築體具有稍低的EC50值(CL/CH1互換之構築體為12.9 pM，與VL/VH互換之構築體為16.8 pM相比)。
圖63展示用表現人類MCSP之MV-3目標細胞進行之類似分析之結果。兩種構築體再次展示相當活性，具有CL/CH1互換之構築體具有稍低的EC50值(CL/CH1互換之構築體為約11.7 pM，與VL/VH互換之構築體為約82.2 pM相比)。不能計算確切EC50值，此係因為殺傷曲線未達至高濃度化合物下之平台區。
在另一實驗中，將CD3/MCSP「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)及「1+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 5、29、33、181)構築體與CD3/MCSP「1+1 CrossMab」(參見SEQ ID NO 5、23、183、185)相比較。如上文所述進行分析，其中使用人類PBMC作為效應細胞及WM266-4或MV-3目標細胞(E：T比=10：1)且培育時間為21小時。
如圖64中所示，在此分析中，「2+1 IgG Crossfab」構築體為最有效分子，隨後為「1+1 IgG Crossfab」及「1+1 CrossMab」。與表現高MCSP之WM266-4細胞相比，此分級在表現中等含量之MCSP之MV-3細胞情況下更顯著。「2+1 IgG Crossfab」、「1+1 IgG Crossfab」及「1+1 CrossMab」之EC50計算值分別為9.2、40.9及88.4 pM(MV-3細胞)，及33.1、28.4及53.9 pM(WM266-4細胞)。
在另一實驗中，測試不同濃度之「1+1 IgG Crossfab LC融合物」構築體(SEQ ID NO 183、209、211、213)，其中以10：1之E：T比使用MKN-45或LS-174T腫瘤目標細胞及人類PBMC效應細胞且培育時間為28小時。如圖65中所示，「1+1 IgG Crossfab LC融合物」構築體誘導MKN-45目標細胞中之細胞凋亡之EC50計算值為213 pM，而在LS-174T細胞情況下之EC50計算值為1.56 nM，由此顯示在某一段時間內不同腫瘤抗原表現量對雙特異性構築體之效能之影響。
在另一實驗中，將「1+1 IgG Crossfab LC融合物」構築體(SEQ ID NO 183、209、211、213)與非靶向之「2+1 IgG Crossfab」分子相比較。使用MC38-huCEA腫瘤細胞及人類PBMC(E：T比=10：1)，且培育時間為24小時。如圖66中所示，「1+1 IgG Crossfab LC融合物」構築體以濃度依賴性方式誘導目標細胞之細胞凋亡，其中EC50計算值為約3.2 nM。相比較而言，非靶向之「2+1 IgG Crossfab」僅在最高濃度下展示非抗原依賴性T細胞介導之目標細胞殺傷。
在最終實驗中，比較「2+1 IgG Crossfab(V9)」(SEQ ID NO 3、5、29、33)、「2+1 IgG Crossfab，反向(V9)」(SEQ ID NO 5、23、183、187)、「2+1 IgG Crossfab(抗CD3)」 (SEQ ID NO 5、23、215、217)、「2+1 IgG Crossfab，反向(抗CD3)」(SEQ ID NO 5、23、215、219)，其中使用人類MCSP陽性MV-3或WM266-4腫瘤細胞及人類PBMC(E：T比=10：1)，且培育時間為約24小時。如圖67中所描繪，對於兩種CD3黏合劑，「2+1 IgG Crossfab，反向」構築體之T細胞介導之殺傷作用與由「2+1 IgG Crossfab」構築體誘導之殺傷作用相比似乎稍強或至少相等。EC50計算值如下：
實例7 CD107a/b分析
藉由流動式細胞量測術測試均靶向人類MCSP及人類CD3之經純化「2+1 IgG scFab」構築體(SEQ ID NO 5、17、19)及「(scFv)2」分子在存在或不存在表現人類MCSP之腫瘤細胞下上調CD107a及胞內穿孔素(perforin)含量之潛力。
簡言之，在第一天，每孔塗佈30 000個Colo-38腫瘤目標細胞於圓底96孔盤中且在37℃、5% CO2下培育隔夜以使其黏著。如所述在第1天或第2天自白血球層分離初代人類全T細胞。
在第二天，每孔添加15萬個效應細胞，獲得5：1之最終E：T比。添加結合FITC之CD107a/b抗體以及不同雙特異性 構築體及對照物。不同雙特異性分子及抗體經調節至相同莫耳濃度，獲得9.43 nM之最終濃度。在37℃、5% CO2下之1小時培育步驟之後，添加莫能菌素(monensin)，不僅抑制分泌，而且中和內體及溶酶體內之pH值。在再5小時之培育時間之後，在4℃下染色細胞30分鐘以供表面CD8表現。用染色緩衝液(PBS/0.1% BSA)洗滌細胞，使用具有BD Golgi Stop之BD Cytofix/Cytoperm Plus套組(BD Biosciences #554715)固定且滲透20分鐘。使用1×BD Perm/Wash緩衝液洗滌細胞兩次，且在4℃下針對穿孔素進行胞內染色30分鐘。在用1×BD Perm/Wash緩衝液之最終洗滌步驟之後，將細胞再懸浮於PBS/0.1% BSA中，且在FACS CantoII上分析(所有抗體均購自BD Biosciences或BioLegend)。
如所指定(圖43)，於所有CD107a/b陽性、穿孔素陽性或雙陽性細胞上設置閘門。「2+1 IgG scFab」構築體僅在目標細胞存在下能夠活化T細胞且上調CD107a/b及胞內穿孔素含量(圖43A)，而「(scFv)2」分子在不存在目標細胞下亦展示活化T細胞之(弱)誘導(圖43B)。二價參考抗CD3 IgG與「(scFv)2」分子或另一雙特異性構築體相比導致較低程度之活化。
實例8 增殖分析
藉由流動式細胞量測術測試均靶向人類CD3及人類MCSP之經純化「2+1 IgG scFab」(SEQ ID NO 5、17、19) 及「(scFv)2」分子在存在及不存在表現人類MCSP之腫瘤細胞下誘導CD8+或CD4+ T細胞之增殖之潛力。
簡言之，經新鮮分離之人類全T細胞於溫PBS中調節至每毫升1百萬個細胞，且在室溫下用1 μM CFSE染色10分鐘。藉由添加含有10% FCS及1% GlutaMax之RPMI1640培養基使染色體積加倍。在室溫下再培育20分鐘之後，用預溫之培養基洗滌細胞三次以移除剩餘CFSE。用細胞解離緩衝液收集MCSP陽性Colo-38細胞，計數且檢查生存力。細胞於AIM-V培養基中調節至每毫升0.2×106個(活)細胞，每孔吸取100 μl之此細胞懸浮液至圓底96孔盤(如指定)中。添加50 μl(經稀釋)雙特異性構築體至含有細胞之孔中，獲得1 nM之最終濃度。CFSE染色之人類全T效應細胞於AIM-V培養基中調節至每毫升2×106個(活)細胞。分析盤(參見上文)每孔添加50 μl此細胞懸浮液，獲得5：1之最終E：T比。為了分析雙特異性構築體是否僅在表現腫瘤抗原huMCSP之目標細胞存在下能夠活化T細胞，包括含有1 nM各別雙特異性分子以及PBMC但無目標細胞之孔。在37℃、5% CO2下培育五天之後，對細胞進行離心(5分鐘，350×g)且用每孔150 μl包括0.1% BSA之PBS洗滌兩次。根據供應商建議在4℃下針對CD8(小鼠IgG1,κ；純系HIT8a；BD #555635)、CD4(小鼠IgG1,κ；純系RPA-T4；BD #560649)或CD25(小鼠IgG1,κ；純系M-A251；BD #555434)進行表面染色30分鐘。用每孔150 μl含有0.1% BSA之PBS洗滌細胞兩次，將其再懸浮於每孔200 μl具有0.1% BSA之 PBS中，且使用FACS CantoII機(軟體FACS Diva)分析。藉由在非增殖細胞周圍設置閘門且使用此閘門之細胞數目相對於量測之總細胞數目作為參考來測定相對增殖程度。
圖44顯示，所有構築體均僅在目標細胞存在下與「(scFv)2」分子相當地誘導CD8+ T細胞(A)或CD4+ T細胞(B)之增殖。一般而言，在此分析中，活化之CD8+ T細胞之增殖程度高於活化之CD4+ T細胞。
實例9 細胞因子釋放分析
分析均靶向人類MCSP及人類CD3之經純化「2+1 IgG scFab」構築體(SEQ ID NO 5、17、19)及「(scFv)2」分子在存在或不存在腫瘤目標細胞下誘導T細胞介導之細胞因子重新(de novo)分泌之能力。
簡言之，自白血球層分離人類PBMC且每孔塗佈30萬個細胞至圓底96孔盤中。添加表現人類MCSP之Colo-38腫瘤目標細胞，獲得10：1之最終E：T比。以1 nM最終濃度添加雙特異性構築體及IgG對照物且在37℃、5% CO2下培育細胞24小時。次日，以350×g離心細胞5分鐘，且將上清液轉移至新的深孔96孔盤中以供隨後分析。根據FACS CantoII之製造商說明書，使用Human Th1/Th2細胞因子套組II(BD #551809)進行CBA分析。
圖45展示上清液中所量測到之不同細胞因子之含量。在目標細胞存在下，T細胞活化後分泌之主要細胞因子為IFN-γ。「(scFv)2」分子誘導之IFN-γ含量稍高於「2+1 IgG scFab」構築體。對於人類TNF可發現相同趨勢，但此細胞因子之總含量與IFN-γ相比低得多。在存在(或不存在)目標細胞下T細胞活化後Th2細胞因子(IL-10及IL-4)無顯著分泌。在不存在Colo-38目標細胞下，僅觀測到極弱之TNF分泌誘導，其在用「(scFv)2」分子處理之樣品中為最高的。
在第二實驗中，分析以下靶向人類MCSP及人類CD3之經純化雙特異性構築體：「2+1 IgG Crossfab」構築體(SEQ ID NO 3、5、29、33)、「(scFv)2」分子以及包含野生型或突變(如指定之LALA、P329G及/或N297D)Fc域之不同「2+1 IgG scFab」分子。簡言之，深孔96孔盤每孔塗佈280 μl來自健康供者之全血。以1 nM最終濃度添加30 000個表現人類MCSP之Colo-38腫瘤目標細胞以及不同雙特異性構築體及IgG對照物。在37℃、5% CO2下培育細胞24小時，隨後以350×g離心5分鐘。將上清液轉移至新的深孔96孔盤中以供隨後分析。根據FACS CantoII之製造商說明書，使用以下CBA Flex Set之組合進行CBA分析：人類顆粒酶B(BD #560304)、人類IFN-γ Flex Set(BD #558269)、人類TNF Flex Set(BD #558273)、人類IL-10 Flex Set(BD #558274)、人類IL-6 Flex Set(BD #558276)、人類IL-4 Flex Set(BD #558272)、人類IL-2 Flex Set(BD #558270)。
圖46展示上清液中所量測到之不同細胞因子之含量。在Colo-38腫瘤細胞存在下分泌之主要細胞因子為IL-6，隨後為IFN-γ。此外，在目標細胞存在下活化T細胞後顆粒酶B 之含量亦大大升高。一般而言，「(scFv)2」分子在目標細胞存在下誘導較高含量之細胞因子分泌(圖46，A及B)。在存在(或不存在)目標細胞下T細胞活化後Th2細胞因子(IL-10及IL-4)無顯著分泌。
在此分析中，即使在不存在目標細胞下亦存在由不同「2+1 IgG scFab」構築體誘導之弱IFN-γ分泌(圖46，C及D)。在此等條件下，在具有野生型或突變Fc域之「2+1 IgG scFab」構築體之間未觀測到顯著差異。
* * *
雖然上文已出於清楚理解之目的藉助於說明及實例較詳細地描述本發明，但該等描述及實例不應視為限制本發明之範疇。本文中引用之所有專利及科學文獻之揭示內容係以全文引用的方式明確地併入。
圖1.本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之例示性組態。(A)「1+1 IgG scFab，一個臂」，及(B)「1+1 IgG scFab，一個臂反向」分子之圖解。在「1+1 IgG scFab，一個臂」分子中，靶向T細胞之Fab之輕鏈由連接子融合至重鏈，而「1+1 IgG scFab，一個臂反向」分子在靶向腫瘤之Fab中具有連接子。(C)「2+1 IgG scFab」分子之圖解。(D)「1+1 IgG scFab」分子之圖解。(E)「1+1 IgG Crossfab」分子之圖解。(F)「2+1 IgG Crossfab」分子之圖解。(G)具有Crossfab及Fab組分之替代性次序(「反向」)之「2+1 IgG Crossfab」分子之圖解。(H)「1+1 IgG Crossfab輕鏈(LC)融合物」分子之圖解。(I)「1+1 CrossMab」分子之圖解。(J)「2+1 IgG Crossfab，連接輕鏈」分子之圖解。(K)「1+1 IgG Crossfab，連接輕鏈」分子之圖解。(L)「2+1 IgG Crossfab，反向，連接輕鏈」分子之圖解。(M)「1+1 IgG Crossfab，反向，連接輕鏈」分子之圖解。黑點：Fc域中視情況存在之促進雜二聚之修飾。
圖2.「1+1 IgG scFab，一個臂」(抗MCSP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 1、3、5)(非還原(A)及還原(B))及「1+1 IgG scFab，一個臂反向」(抗MCSP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 7、9、11)(非還原(C)及還原(D))之SDS PAGE(4-12% Bis/Tris，NuPage Invitrogen，經庫馬斯染色)。
圖3.「1+1 IgG scFab，一個臂」(抗MCSP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 1、3、5)(A)及「1+1 IgG scFab，一個臂反向」(抗MCSP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 7、9、11)(B)之分析型尺寸排阻層析(Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare；2 mM MOPS pH 7.3，150 mM NaCl，0.02%(w/v)NaCl；注入50 μg樣品)。
圖4.「1+1 IgG scFab，一個臂」(抗EGFR/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 43、45、57)(非還原(A)及還原(B))及「1+1 IgG scFab，一個臂反向」(抗EGFR/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 11、49、51)(非還原(C)及還原(D))之SDS PAGE(4-12% Bis/Tris，NuPage Invitrogen，經庫馬斯染色)。
圖5.「1+1 IgG scFab，一個臂」(抗EGFR/抗huCD3)(參 見SEQ ID NO 43、45、47)(A)及「1+1 IgG scFab，一個臂反向」(抗EGFR/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 11、49、51)(B)之分析型尺寸排阻層析(Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare；2 mM MOPS pH 7.3，150 mM NaCl，0.02%(w/v)NaCl；注入50 μg樣品)。
圖6.(A、B)「1+1 IgG scFab，一個臂反向」(抗FAP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 11、51、55)之SDS PAGE(4-12% Bis/Tris，NuPage Invitrogen，經庫馬斯染色)，非還原(A)及還原(B)。(C)「1+1 IgG scFab，一個臂反向」(抗FAP/抗huCD3)之分析型尺寸排阻層析(Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare；2 mM MOPS pH 7.3，150 mM NaCl，0.02%(w/v)NaCl；注入50 μg樣品)。
圖7.(A)「2+1 IgG scFab，P329G LALA」(抗MCSP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 5、21、23)，非還原(色帶2)及還原(色帶3)；(B)「2+1 IgG scFab，LALA」(抗MCSP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 5、17、19)，非還原(色帶2)及還原(色帶3)；(C)「2+1 IgG scFab，wt」(抗MCSP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 5、13、15)，非還原(色帶2)及還原(色帶3)；及(D)「2+1 IgG scFab，P329G LALA N297D」(抗MCSP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 5、25、27)，非還原(色帶2)及還原(色帶3)的SDS PAGE(4-12% Bis/Tris，NuPage Invitrogen，經庫馬斯染色)。
圖8.(A)「2+1 IgG scFab，P329G LALA」(抗MCSP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 5、21、23)；(B)「2+1 IgG scFab，LALA」抗MCSP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 5、17、19)；(C)「2+1 IgG scFab，wt」(抗MCSP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 5、13、15)及(D)「2+1 IgG scFab，P329G LALA N297D」(抗MCSP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 5、25、27)的分析型尺寸排阻層析(Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare；2 mM MOPS pH 7.3，150 mM NaCl，0.02%(w/v)NaCl；注入50 μg樣品)。
圖9.(A、B)「2+1 IgG scFab，P329G LALA」(抗EGFR/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 45、47、53)之SDS PAGE(4-12% Bis/Tris，NuPage Invitrogen，經庫馬斯染色)，非還原(A)及還原(B)。(C)「2+1 IgG scFab，P329G LALA」(抗EGFR/抗huCD3)之分析型尺寸排阻層析(Superdex 200 10/300GL GE Healthcare；2 mM MOPS pH 7.3，150 mM NaCl，0.02%(w/v)NaCl；注入50 μg樣品)。
圖10.(A、B)「2+1 IgG scFab，P329G LALA」(抗FAP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 57、59、61)之SDS PAGE(4-12% Bis/Tris，NuPage Invitrogen，經庫馬斯染色)，非還原(A)及還原(B)。(C)「2+1 IgG scFab，P329G LALA」(抗FAP/抗huCD3)之分析型尺寸排阻層析(Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare；2 mM MOPS pH 7.3，150 mM NaCl，0.02%(w/v)NaCl；注入50 μg樣品)。
圖11.(A、B)「1+1 IgG Crossfab，Fc(臼)P329G LALA/Fc(杵)wt」(抗MCSP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 5、29、31、33)之SDS PAGE(4-12% Tris-乙酸鹽(A)或4-12% Bis/Tris(B)，NuPage Invitrogen，經庫馬斯染色)，非還原(A)及還原(B)。(C)「1+1 IgG Crossfab，Fc(臼)P329G LALA/Fc(杵)wt」(抗MCSP/抗huCD3)之分析型尺寸排阻層析(Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare；2 mM MOPS pH 7.3，150 mM NaCl，0.02%(w/v)NaCl；注入50 μg樣品)。
圖12.(A、B)「2+1 IgG Crossfab」(抗MCSP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)之SDS PAGE(4-12% Bis/Tris，NuPage Invitrogen，經庫馬斯染色)，非還原(A)及還原(B)。(C)「2+1 IgG Crossfab」(抗MCSP/抗huCD3)之分析型尺寸排阻層析(Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare；2 mM MOPS pH 7.3，150 mM NaCl，0.02%(w/v)NaCl；注入50 μg樣品)。
圖13.(A、B)「2+1 IgG Crossfab」(抗MCSP/抗cyCD3)(參見SEQ ID NO 3、5、35、37)之SDS PAGE(4-12% Bis/Tris，NuPage Invitrogen，經庫馬斯染色)，非還原(A)及還原(B)。(C)「2+1 IgG Crossfab」(抗MCSP/抗cyCD3)之分析型尺寸排阻層析(Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare；2 mM MOPS pH 7.3，150 mM NaCl，0.02%(w/v)NaCl；注入50 μg樣品)。
圖14.(A、B)「2+1 IgG Crossfab，反向」(抗CEA/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 33、63、65、67)之SDS PAGE(4-12% Bis/Tris，NuPage Invitrogen，經庫馬斯染色)，非還原(A)及還原(B)。(C)「2+1 IgG Crossfab，反向」(抗CEA/ 抗huCD3)之分析型尺寸排阻層析(Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare；2 mM MOPS pH 7.3，150 mM NaCl，0.02%(w/v)NaCl；注入50 μg樣品)。
圖15.(A)「(scFv)2-Fc」及「(dsscFv)2-Fc」(抗MCSP(LC007)/抗huCD3(V9))之熱穩定性。動態光散射，在以0.05℃/分鐘自25至75℃之溫度勻變下量測。黑色曲線：「(scFv)2-Fc」；灰色曲線：「(dsscFv)2-Fc」。(B)「2+1 IgG scFab」(參見SEQ ID NO 5、21、23)及「2+1 IgG Crossfab」(抗MCSP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)之熱穩定性。動態光散射，在以0.05℃/分鐘自25至75℃之溫度勻變下量測。黑色曲線：「2+1 IgG scFab」；灰色曲線：「2+1 IgG Crossfab」。
圖16.用於(A)測定各種Fc突變體與人類FcγRIIIa之相互作用，及用於(B)使T細胞雙特異性構築體與腫瘤目標及人類CD3γ(G4S)5CD3ε-AcTev-Fc(杵)-Avi/Fc(臼)同時結合的Biacore分析設置。
圖17. T細胞雙特異性構築體與人類MCSP之D3域及人類CD3γ(G4S)5CD3ε-AcTev-Fc(杵)-Avi/Fc(臼)之同時結合。(A)「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)，(B)「2+1 IgG scFab」(參見SEQ ID NO 5、21、23)。
圖18. T細胞雙特異性構築體與人類EGFR及人類CD3γ(G4S)5CD3ε-AcTev-Fc(杵)-Avi/Fc(臼)之同時結合。(A)「2+1 IgG scFab」(參見SEQ ID NO 45、47、53)，(B)「1+1 IgG scFab，一個臂」(參見SEQ ID NO 43、45、 47)，(C)「1+1 IgG scFab，一個臂反向」(參見SEQ ID NO 11、49、51)，及(D)「1+1 IgG scFab」(參見SEQ ID NO 47、53、213)。
圖19.藉由FACS量測的「(scFv)2」分子(50 nM)與Jurkat細胞上表現之CD3(A)或Colo-38細胞上之MCSP(B)之結合。描繪與未經處理細胞及僅以二次抗體染色之細胞相比之平均螢光強度。
圖20.藉由FACS量測的「2+1 IgG scFab，LALA」(參見SEQ ID NO 5、17、19)構築體(50 nM)與Jurkat細胞上表現之CD3(A)或Colo-38細胞上之MCSP(B)之結合。描繪與以參考抗CD3 IgG(如指定)處理之細胞、未經處理細胞及僅以二次抗體染色之細胞相比之平均螢光強度。
圖21.藉由FACS量測的「1+1 IgG scFab，一個臂」(參見SEQ ID NO 1、3、5)及「1+1 IgG scFab，一個臂反向」(參見SEQ ID NO 7、9、11)構築體(50 nM)與Jurkat細胞上表現之CD3(A)或Colo-38細胞上之MCSP(B)之結合。描繪與以參考抗CD3或抗MCSP IgG(如指定)處理之細胞、未經處理細胞及僅以二次抗體染色之細胞相比之平均螢光強度。
圖22.如藉由FACS量測的「2+1 IgG scFab，LALA」(參見SEQ ID NO 5、17、19)雙特異性構築體及相應抗MCSP IgG與Colo-38細胞上之MCSP之劑量依賴性結合。
圖23.在存在或不存在如指定之Colo-38腫瘤目標細胞下(PBMC與腫瘤細胞之E：T比=10：1)以1 nM「2+1 IgG scFab，LALA」(參見SEQ ID NO 5、17、19)或「(scFv)2」CD3-MCSP雙特異性構築體培育後人類T細胞上之不同活化標記物之表面表現量。描繪在分別培育15或24小時後CD8+ T細胞上之早期活化標記物CD69(A)或晚期活化標記物CD25(B)之表現量。
圖24.在存在或不存在如指定之Colo-38腫瘤目標細胞下(E：T比=5：1)以1 nM「2+1 IgG scFab，LALA」(參見SEQ ID NO 5、17、19)或「(scFv)2」CD3-MCSP雙特異性構築體培育後人類T細胞上之晚期活化標記物CD25之表面表現量。描繪CD8+ T細胞(A)或CD4+ T細胞(B)上之晚期活化標記物CD25在培育5天後之表現量。
圖25.在存在或不存在表現人類MCSP之MV-3腫瘤目標細胞下(E：T比=3：1)以指定濃度之「2+1 IgG Crossfab」雙特異性構築體(靶向獼猴CD3及人類MCSP；參見SEQ ID NO 3、5、35、37)培育43小時後來自兩種不同動物(Nestor獼猴、Nobu獼猴)之獼猴CD8+ T細胞上之晚期活化標記物CD25的表面表現量。使用參考IgG(抗獼猴CD3 IgG、抗人類MCSP IgG)或非生理刺激PHA-M作為對照物。
圖26.由「2+1 IgG scFab，LALA」CD3-MCSP雙特異性構築體(參見SEQ ID NO 5、17、19)在U87MG腫瘤細胞存在下(E：T比=5：1)活化18.5小時之人類全T細胞所分泌的IFN-γ含量。投與相應抗CD3及抗MCSP IgG作為對照物。
圖27.在與人類全T細胞共培養(E：T比=5：1)且由不同濃度之「2+1 IgG scFab」(參見SEQ ID NO 5、21、23)、「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)及「(scFv)2」雙特異性分子及相應IgG活化20小時後對MDA-MB-435腫瘤細胞之殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
圖28.在與人類全T細胞共培養(E：T比=5：1)且由不同濃度之雙特異性構築體及相應IgG活化20小時後對MDA-MB-435腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。比較Fc域不同之「2+1 IgG scFab」構築體(具有野生型Fc域(參見SEQ ID NO 5、13、15)或經突變以消除(NK)效應細胞功能之Fc域：P329G LALA(參見SEQ ID NO 5、21、23)、P329G LALA N297D(參見SEQ ID NO 5、25、27))與「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)構築體。
圖29.在與人類全T細胞共培養(E：T比=5：1)且用CD3-MCSP雙特異性「2+1 IgG scFab，LALA」(參見SEQ ID NO 5、17、19)構築體、「(scFv)2」分子或相應IgG處理18.5小時後對Colo-38腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
圖30.在與人類全T細胞共培養(E：T比=5：1)且用CD3-MCSP雙特異性「2+1 IgG scFab，LALA」(參見SEQ ID NO 5、17、19)構築體、「(scFv)2」分子或相應IgG處理18小時後對Colo-38腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
圖31.在與人類全T細胞共培養(E：T比=5：1)且由不同濃度之CD3-MCSP雙特異性「2+1 IgG scFab，LALA」(參見SEQ ID NO 5、17、19)構築體、「(scFv)2」分子或相應IgG 活化23.5小時後對MDA-MB-435腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
圖32.在與人類全T細胞共培養(E：T比=5：1)且由不同濃度之CD3-MCSP雙特異性「1+1 IgG scFab，一個臂」(參見SEQ ID NO 1、3、5)、「1+1 IgG scFab，一個臂反向」(參見SEQ ID NO 7、9、11)或「(scFv)2」構築體或相應IgG活化19小時後對Colo-38腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
圖33.在與人類全T細胞共培養(E：T比=5：1)且用「1+1 IgG scFab」CD3-MCSP雙特異性構築體(參見SEQ ID NO 5、21、213)或「(scFv)2」分子處理20小時後對Colo-38腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
圖34.在與人類全T細胞共培養(E：T比=5：1)且由不同濃度之雙特異性構築體及相應IgG活化21小時後對MDA-MB-435腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。比較CD3-MCSP雙特異性「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)及「1+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 5、29、31、33)構築體、「(scFv)2」分子及相應IgG。
圖35.藉由以135 ng/mL或1.35 ng/mL「2+1 IgG Crossfab」CD3-MCSP雙特異性構築體(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)活化人類T細胞(E：T比=25：1)所誘導之對不同目標細胞(如指定之MCSP陽性Colo-38腫瘤目標細胞、衍生自骨髓或脂肪組織之間葉細胞幹細胞或來自胎盤之外被細胞)的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
圖36.在與人類PBMC及不同CD3-MCSP雙特異性構築體(「2+1 IgG scFab，LALA」(參見SEQ ID NO 5、17、19)及「(scFv)2」分子)或經糖工程改造之抗MCSP IgG (GlycoMab)共培養後隔夜培育21小時之後所量測之對Colo-38腫瘤目標細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。效應細胞與目標細胞比固定為25：1(A)，或如所描繪而改變(B)。PBMC係自新鮮血液(A)或白血球層(B)中分離。
圖37.靶向獼猴CD3及人類MCSP之「2+1 IgG Crossfab」構築體(參見SEQ ID NO 3、5、35、37)之時間依賴細胞毒性效應。描繪表現人類MCSP之MV-3細胞在與初代獼猴PBMC共培養(E：T比=3：1)24小時或43小時後之LDH釋放。使用相同莫耳濃度之參考IgG(抗獼猴CD3 IgG及抗人類MCSP IgG)作為對照物。PHA-M充當(非生理)T細胞活化之對照物。
圖38.在與人類PBMC共培養(E：T比=10：1)且用不同CD3-MCSP雙特異性構築體(「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)及「(scFv)2」)處理約26小時後對huMCSP陽性MV-3黑色素瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
圖39.在與人類全T細胞共培養(E：T比=5：1)且用不同CD3-EGFR雙特異性構築體(「2+1 IgG scFab」(參見SEQ ID NO 45、47、53)、「1+1 IgG scFab」(參見SEQ ID NO 47、53、213)及「(scFv)2」)或參考IgG處理18小時後對EGFR陽 性LS-174T腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
圖40.在與人類全T細胞共培養(E：T比=5：1)且用不同CD3-EGFR雙特異性構築體(「1+1 IgG scFab，一個臂」(參見SEQ ID NO 43、45、47)、「1+1 IgG scFab，一個臂反向」(參見SEQ ID NO 11、49、51)、「1+1 IgG scFab」(參見SEQ ID NO 47、53、213)及「(scFv)2」)或參考IgG處理21小時後對EGFR陽性LS-174T腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
圖41.在與人類全T細胞(A)或人類原始T細胞(B)共培養且用不同CD3-EGFR雙特異性構築體(「1+1 IgG scFab，一個臂」(參見SEQ ID NO 43、45、47)、「1+1 IgG scFab，一個臂反向」(參見SEQ ID NO 11、49、51)及「(scFv)2」)或參考IgG處理16小時後對EGFR陽性LS-174T腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。效應細胞與目標細胞比為5：1。
圖42.在與人類全T細胞共培養(E：T比=5：1)且用不同CD3-FAP雙特異性構築體(「1+1 IgG scFab，一個臂反向」(參見SEQ ID NO 11、51、55)、「1+1 IgG scFab」(參見SEQ ID NO 57、61、213)、「2+1 IgG scFab」(參見SEQ ID NO 57、59、61)及「(scFv)2」)處理約18小時後對FAP陽性GM05389纖維母細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
圖43.已在存在(A)或不存在(B)目標細胞下用不同CD3- MCSP雙特異性構築體(「2+1 IgG scFab，LALA」(參見SEQ ID NO 5、17、19)及「(scFv)2」)或相應對照IgG處理6小時之CD8+ T細胞中之CD107a/b表現量以及穿孔素含量的流動式細胞量測術分析。人類全T細胞以5：1之效應與目標比在存在或不存在Colo-38腫瘤目標細胞下用9.43 nM之不同分子培育。在培育第一小時之後添加莫能菌素以藉由防止蛋白質轉運而增加胞內蛋白質含量。如所描繪，於所有CD107a/b陽性、穿孔素陽性或雙陽性細胞上設置閘門。
圖44. CD8+(A)或CD4+(B)人類T細胞在以5：1之效應細胞與目標細胞比在存在或不存在Colo-38腫瘤目標細胞下以1 nM不同CD3-MCSP雙特異性構築體(「2+1 IgG scFab，LALA」(參見SEQ ID NO 5、17、19)或「(scFv)2」)或相應對照IgG培育後之相對增殖。藉由FACS表徵經CFSE標記之人類全T細胞。藉由在非增殖細胞周圍設定閘門且使用此閘門之細胞數目相對於量測之總細胞數目作為參考來測定相對增殖程度。
圖45.在存在(A)或不存在(B)Colo-38腫瘤細胞下用1 nM不同CD3-MCSP雙特異性構築體(「2+1 IgG scFab，LALA」(參見SEQ ID NO 5、17、19)或「(scFv)2」)或相應對照IgG處理24小時之後在人類PBMC之上清液中所量測到之不同細胞因子之含量。效應細胞與目標細胞比為10：1。
圖46.在存在(A、B)或不存在(C、D)Colo-38腫瘤細胞下用1 nM不同CD3-MCSP雙特異性構築體(「2+1 IgG scFab」、「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、 33)或「(scFv)2」)或相應對照IgG處理24小時之後在全血之上清液中所量測到之不同細胞因子之含量。雙特異性構築體中有具有野生型Fc域(參見SEQ ID NO 5、13、15)或經突變以消除(NK)效應細胞功能之Fc域(LALA(參見SEQ ID NO 5、17、19)、P329G LALA(參見SEQ ID NO 5、2、23)及P329G LALA N297D(參見SEQ ID NO 5、25、27))的不同「2+1 IgG scFab」構築體。
圖47. CE-SDS分析。展示2+1 IgG Crossfab，連接輕鏈(參見SEQ ID NO 3、5、29、179)之SDS PAGE之電泳圖。(色帶1：還原，色帶2：非還原)。
圖48. 2+1 IgG Crossfab，連接輕鏈(參見SEQ ID NO 3、5、29、179)(最終產物)之分析型尺寸排阻層析。注入20 μg樣品。
圖49.在與人類PBMC共培養(E：T比=10：1)且用不同CD3-MCSP雙特異性構築體(「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)及「2+1 IgG Crossfab，連接LC」(參見SEQ ID NO 3、5、29、179))處理約44小時後對MCSP陽性MV-3腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。人類PBMC係自健康志願者之新鮮血液中分離。
圖50.在與人類PBMC共培養(E：T比=10：1)且用不同CD3-MCSP雙特異性構築體(「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)及「2+1 IgG Crossfab，連接LC」(參見SEQ ID NO 3、5、29、179))處理約22小時後對MCSP陽性Colo-38腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。人 類PBMC係自健康志願者之新鮮血液中分離。
圖51.在與人類PBMC共培養(E：T比=10：1)且用不同CD3-MCSP雙特異性構築體(「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)及「2+1 IgG Crossfab，連接LC」(參見SEQ ID NO 3、5、29、179))處理約22小時後對MCSP陽性Colo-38腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。人類PBMC係自健康志願者之新鮮血液中分離。
圖52.在與人類PBMC共培養(E：T比=10：1)且用不同CD3-MCSP雙特異性構築體(「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)及「2+1 IgG Crossfab，連接LC」(參見SEQ ID NO 3、5、29、179))處理約22小時後對MCSP陽性WM266-4細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。人類PBMC係自健康志願者之新鮮血液中分離。
圖53.在存在或不存在表現人類MCSP之Colo-38腫瘤目標細胞下(E：T比=10：1)以10 nM、80 pM或3 pM之不同CD3-MCSP雙特異性構築體(「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)及「2+1 IgG Crossfab，連接LC」(參見SEQ ID NO 3、5、29、179))培育22小時後人類CD8+ T細胞上之早期活化標記物CD69(A)及晚期活化標記物CD25(B)的表面表現量。
圖54. CE-SDS分析。(A)展示1+1 IgG Crossfab；VL/VH互換(LC007/V9)(參見SEQ ID NO 5、29、33、181)之SDS-PAGE之電泳圖：a)非還原，b)還原。(B)展示1+1 CrossMab；CL/CH1互換(LC007/V9)(參見SEQ ID NO 5、 23、183、185)之SDS-PAGE之電泳圖：a)還原，b)非還原。(C)展示2+1 IgG Crossfab，反向；CL/CH1互換(LC007/V9)(參見SEQ ID NO 5、23、183、187)之SDS-PAGE之電泳圖：a)還原，b)非還原。(D)展示2+1 IgG Crossfab；VL/VH互換(M4-3 ML2/V9)(參見SEQ ID NO 33、189、191、193)之SDS-PAGE之電泳圖：a)還原，b)非還原。(E)展示2+1 IgG Crossfab；CL/CH1互換(M4-3 ML2/V9)(參見SEQ ID NO 183、189、193、195)之SDS-PAGE之電泳圖：a)還原，b)非還原。(F)展示2+1 IgG Crossfab，反向；CL/CH1互換(CH1A1A/V9)(參見SEQ ID NO 65、67、183、197)之SDS-PAGE之電泳圖：a)還原，b)非還原。(G)展示2+1 IgG Crossfab；CL/CH1互換(M4-3 ML2/H2C)(參見SEQ ID NO 189、193、199、201)之SDS-PAGE之電泳圖：a)還原，b)非還原。(H)展示2+1 IgG Crossfab，反向；CL/CH1互換(431/26/V9)(參見SEQ ID NO 183、203、205、207)之SDS-PAGE之電泳圖：a)還原，b)非還原。(I)展示「2+1 IgG Crossfab輕鏈融合物」(CH1A1A/V9)(參見SEQ ID NO 183、209、211、213)之SDS-PAGE之電泳圖：a)還原，b)非還原。(J)「2+1 IgG Crossfab」(抗MCSP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 5、23、215、217)之SDS PAGE(4-12% Bis/Tris，NuPage Invitrogen，經庫馬斯染色)，非還原(左)及還原(右)。(K)展示「2+1 IgG Crossfab，反向」(抗MCSP/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 5、23、215、219)之SDS-PAGE之電泳圖：a) 還原，b)非還原。(L)「1+1 IgG Crossfab」(抗CD33/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 33、213、221、223)之SDS PAGE(4-12% Bis/Tris，NuPage Invitrogen，經庫馬斯染色)，還原(左)及非還原(右)。(M)「2+1 IgG Crossfab」(抗CD33/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 33、221、223、225)之SDS PAGE(4-12% Bis/Tris，NuPage Invitrogen，經庫馬斯染色)，還原(左)及非還原(右)。(N)「2+1 IgG Crossfab」(抗CD20/抗huCD3)(參見SEQ ID NO 33、227、229、231)之SDS PAGE(4-12% Bis/Tris，NuPage Invitrogen，經庫馬斯染色)，非還原。
圖55.如藉由FACS測定之雙特異性構築體(CEA/CD3「2+1 IgG Crossfab，反向(VL/VH)」(參見SEQ ID NO 33、63、65、67)及「2+1 IgG Crossfab，反向(CL/CH1)」(參見SEQ ID NO 65、67、183、197))與Jurkat細胞表現之人類CD3(A)或LS-174T細胞表現之人類CEA(B)的結合。作為對照，同樣評定相等最大濃度的參考IgG及因經標記之二次抗體(山羊抗人類結合FITC之AffiniPure F(ab')2片段，特異性Fcγ片段，Jackson Immuno Research Lab #109-096-098)之背景染色。
圖56.如藉由FACS測定之雙特異性構築體(MCSP/CD3「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)及「2+1 IgG Crossfab，反向」(參見SEQ ID NO 5、23、183、187))與Jurkat細胞表現之人類CD3(A)或WM266-4腫瘤細胞表現之人類MCSP(B)的結合。
圖57.如藉由FACS測定之「1+1 IgG Crossfab輕鏈融合物」(參見SEQ ID NO 183、209、211、213)與Jurkat細胞表現之人類CD3(A)或LS-174T細胞表現之人類CEA(B)的結合。
圖58.如藉由FACS測定之「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 5、23、215、217)及「2+1 IgG Crossfab，反向」(參見SEQ ID NO 5、23、215、219)構築體與Jurkat細胞表現之人類CD3(A)或WM266-4腫瘤細胞表現之人類MCSP(B)的結合。
圖59.用指定濃度之CD3/MCSP「1+1 CrossMab」(參見SEQ ID NO 5、23、183、185)、「1+1 IgG crossfab」(參見SEQ ID NO 5、29、33、181)及「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)構築體培育24小時後人類CD4+或CD8+ T細胞上之早期活化標記物CD69(A)或晚期活化標記物CD25(B)的表面表現量。在存在或不存在如指定之MV-3目標細胞下進行分析。
圖60.在存在或不存在huMCSP陽性MV-3腫瘤細胞下與獼猴PBMC共培養(E：T比=3：1，針對CD3+數目校正)且用「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 5、23、215、217)及「2+1 IgG Crossfab，反向」(參見SEQ ID NO 5、23、215、219)處理約41小時後來自兩種不同獼猴(A及B)之CD4+或CD8+ T細胞上之早期活化標記物CD25的表面表現量。
圖61.在與人類PBMC共培養(E：T比=10：1)且由不同濃度 之「2+1 IgG Crossfab，反向(VL/VH)」(參見SEQ ID NO 33、63、65、67)相較於「2+1 IgG Crossfab，反向(CL/CH1)」(參見SEQ ID NO 65、67、183、197)構築體活化28小時後對MKN-45(A)或LS-174T(B)腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
圖62.在與人類PBMC共培養(E：T比=10：1)且由不同濃度之「2+1 IgG Crossfab(VL/VH)」(參見SEQ ID NO 33、189、191、193)相較於「2+1 IgG Crossfab(CL/CH1)」(參見SEQ ID NO 183、189、193、195)構築體活化26小時後對WM266-4腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
圖63.在與人類PBMC共培養(E：T比=10：1)且由不同濃度之「2+1 IgG Crossfab(VH/VL)」(參見SEQ ID NO 33、189、191、193)相較於「2+1 IgG Crossfab(CL/CH1)」(參見SEQ ID NO 183、189、193、195)構築體活化27小時後對MV-3腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
圖64.在與人類PBMC共培養(E：T比=10：1)且藉由如指定之不同濃度之「2+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)、「1+1 CrossMab」(參見SEQ ID NO 5、23、183、185)及「1+1 IgG Crossfab」(參見SEQ ID NO 5、29、33、181)活化21小時後對人類MCSP陽性WM266-4(A)或MV-3(B)腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
圖65.在與人類PBMC共培養(E：T比=10：1)且由不同濃度 之「1+1 IgG Crossfab LC融合物」(參見SEQ ID NO 183、209、211、213)活化28小時後對MKN-45(A)或LS-174T(B)腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
圖66.在與人類PBMC共培養(E：T比=10：1)且由不同濃度之「1+1 IgG Crossfab LC融合物」(參見SEQ ID NO 183、209、211、213)相較於非靶向之「2+1 IgG Crossfab」參考物活化24小時後對MC38-huCEA腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
圖67.在與人類PBMC共培養(E：T比=10：1)且用「2+1 IgG Crossfab(V9)」(參見SEQ ID NO 3、5、29、33)及「2+1 IgG Crossfab，反向(V9)」(參見SEQ ID NO 5、23、183、187)、「2+1 IgG Crossfab(抗CD3)」(參見SEQ ID NO 5、23、215、217)及「2+1 IgG Crossfab，反向(抗CD3)」(參見SEQ ID NO 5、23、215、219)構築體處理後對人類MCSP陽性MV-3(A)或WM266-4(B)腫瘤細胞的殺傷作用(如藉由LDH釋放所量測)。
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33 VL
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 150
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 151
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 152
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 153
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前導子1
<400> 155
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<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前導子1
<400> 156
<210> 157
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前導子2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前導子2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前導子3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前導子3
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<212> DNA
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 HCDR3
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> V9 VH
<400> 170
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 LCDR1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 LCDR2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 LCDR2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 LCDR3
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 LCDR3
<400> 176
<210> 177
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 VL
<400> 177
<210> 178
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 VL
<400> 178
<210> 179
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VH-CL)-LC007(VL-CL)
<400> 179
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<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VH-CL)-LC007(VL-CL)
<400> 180
<210> 181
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc(杵)P329G LALA
<400> 181
<210> 182
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc(杵)P329G LALA
<400> 182
<210> 183
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VL-CH1)
<400> 183
<210> 184
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VL-CH1)
<400> 184
<210> 185
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VH-CL)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 185
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<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VH-CL)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 186
<210> 187
<211> 682
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007(VH-CH1)-V9(VH-CL)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 187
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<211> 2046
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007(VH-CH1)-V9(VH-CL)-Fc(杵)P329G LALA
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<210> 189
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2(VL-CL)
<400> 189
<210> 190
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2(VL-CL)
<400> 190
<210> 191
<211> 664
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VL-CH1)-M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 191
<210> 192
<211> 1992
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VL-CH1)-M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(杵)P329G LALA(DNA)
<400> 192
<210> 193
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(臼)P329G LALA
<400> 193
<210> 194
<211> 1326
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(臼)P329G LALA
<400> 194
<210> 195
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VH-CL)-M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 195
<210> 196
<211> 2043
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VH-CL)-M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(杵)P329G LALA(DNA)
<400> 196
<210> 197
<211> 690
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A(VH-CH1)-V9(VH-CL)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 197
<210> 198
<211> 2070
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A(VH-CH1)-V9(VH-CL)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 198
<210> 199
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H2C(VL-CH1)
<400> 199
<210> 200
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H2C(VL-CH1)
<400> 200
<210> 201
<211> 684
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H2C(VH-CL)-M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 201
<210> 202
<211> 2052
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H2C(VH-CL)-M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 202
<210> 203
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 431/26(VL-CL)
<400> 203
<210> 204
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 431/26(VL-CL)
<400> 204
<210> 205
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 431/26(VH-CH1)-V9(VH-CL)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 205
<210> 206
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 431/26(VH-CH1)-V9(VH-CL)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 206
<210> 207
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 431/26(VH-CH1)-Fc(臼)P329G LALA
<400> 207
<210> 208
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 431/26(VH-CH1)-Fc(臼)P329G LALA
<400> 208
<210> 209
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A(VL-CL)-V9(VH-CL)
<400> 209
<210> 210
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A(VL-CL)-V9(VH-CL)
<400> 210
<210> 211
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A(VH-CH1)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 211
<210> 212
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A(VH-CH1)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 212
<210> 213
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc(臼)P329G LALA
<400> 213
<210> 214
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc(臼)P329G LALA
<400> 214
<210> 215
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH2527(VL-CH1)
<400> 215
<210> 216
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH2527(VL-CH1)
<400> 216
<210> 217
<211> 684
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH2527(VH-CL)-LC007(VH-CH1)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 217
<210> 218
<211> 2052
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH2527(VH-CL)-LC007(VH-CH1)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 218
<210> 219
<211> 685
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007(VH-CH1)-CH2527(VH-CL)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 219
<210> 220
<211> 2055
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007(VH-CH1)-CH2527(VH-CL)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 220
<210> 221
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33(VL-CL)
<400> 221
<210> 222
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33(VL-CL)
<400> 222
<210> 223
<211> 668
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VL-CH1)-抗CD33(VH-CH1)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 223
<210> 224
<211> 2004
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VL-CH1)-抗CD33(VH-CH1)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 224
<210> 225
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33(VH-CH1)-Fc(臼)P329G LALA
<400> 225
<210> 226
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33(VH-CH1)-Fc(臼)P329G LALA
<400> 226
<210> 227
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20(VL-CL)
<400> 227
<210> 228
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20(VL-CL)
<400> 228
<210> 229
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VL-CH1)-抗CD20(VH-CH1)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 229
<210> 230
<211> 2013
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VL-CH1)-抗CD20(VH-CH1)-Fc(杵)P329G LALA
<400> 230
<210> 231
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20(VH-CH1)-Fc(臼)P329G LALA
<400> 231
<210> 232
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20(VH-CH1)-Fc(臼)P329G LALA
<400> 232
<210> 233
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 HCDR1
<400> 233
<210> 234
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 HCDR1
<400> 234
<210> 235
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 HCDR2
<400> 235
<210> 236
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 HCDR2
<400> 236
<210> 237
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 HCDR3
<400> 237
<210> 238
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 HCDR3
<400> 238
<210> 239
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 VH
<400> 239
<210> 240
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 VH
<400> 240
<210> 241
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 LCDR1
<400> 241
<210> 242
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 LCDR1
<400> 242
<210> 243
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 LCDR2
<400> 243
<210> 244
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 LCDR2
<400> 244
<210> 245
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 LCDR3
<400> 245
<210> 246
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 LCDR3
<400> 246
<210> 247
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 VL
<400> 247
<210> 248
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 VL
<400> 248
<210> 249
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 HCDR1
<400> 249
<210> 250
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 HCDR1
<400> 250
<210> 251
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 HCDR2
<400> 251
<210> 252
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 HCDR2
<400> 252
<210> 253
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 HCDR3
<400> 253
<210> 254
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 HCDR3
<400> 254
<210> 255
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH
<400> 255
<210> 256
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH
<400> 256
<210> 257
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 LCDR1
<400> 257
<210> 258
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 LCDR1
<400> 258
<210> 259
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 LCDR2
<400> 259
<210> 260
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 LCDR2
<400> 260
<210> 261
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 LCDR3
<400> 261
<210> 262
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 LCDR3
<400> 262
<210> 263
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL
<400> 263
<210> 264
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL
<400> 264
<210> 265
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人
<400> 265
<210> 266
<211> 198
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<400> 266

Claims (44)

  1. 一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含第一及第二抗原結合部分，其中之一者為能夠特異性結合至活化T細胞抗原之Fab分子，且其中之另一者為能夠特異性結合至目標細胞抗原之Fab分子，及由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成之Fc域；其中該第一抗原結合部分為(a)單鏈Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈係由肽連接子連接，或(b)交換Fab分子，其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變區或恆定區互換。
  2. 如請求項1之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含不超過一個能夠特異性結合至活化T細胞抗原之抗原結合部分。
  3. 如請求項1之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該第一抗原結合部分與該第二抗原結合部分視情況經由肽連接子彼此融合。
  4. 如請求項1之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該第二抗原結合部分係於Fab重鏈之C端處融合至該第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端。
  5. 如請求項1之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該第一抗原結合部分係於Fab重鏈之C端處融合至該第二抗原結合部分之Fab重鏈之N端。
  6. 如請求項4或5之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子， 其中該第一抗原結合部分為交換Fab分子且該第一抗原結合部分之Fab輕鏈與該第二抗原結合部分之Fab輕鏈視情況經由肽連接子彼此融合。
  7. 如請求項1之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之該第二抗原結合部分係於Fab輕鏈之C端處融合至該第一抗原結合部分之Fab輕鏈之N端。
  8. 如請求項1、5或7之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之該第二抗原結合部分係於Fab重鏈之C端處融合至該Fc域之第一或第二次單元之N端。
  9. 如請求項1至4中任一項之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該第一抗原結合部分係於Fab重鏈之C端處融合至該Fc域之第一或第二次單元之N端。
  10. 如請求項1之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分各自於Fab重鏈之C端處融合至該Fc域之一個次單元之N端。
  11. 如請求項1至4、5、7及10中任一項之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含第三抗原結合部分，該第三抗原結合部分為能夠特異性結合至目標細胞抗原之Fab分子。
  12. 如請求項11之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該第三抗原結合部分係於Fab重鏈之C端處融合至該Fc域之第一或第二次單元之N端。
  13. 如請求項11之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該第二抗原結合部分及該第三抗原結合部分各自於Fab重鏈之C端處融合至該Fc域之一個次單元之N端，且該第一抗原結合部分係於Fab重鏈之C端處融合至該第二抗原結合部分之Fab重鏈之N端。
  14. 如請求項11之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該第一抗原結合部分及該第三抗原結合部分各自於Fab重鏈之C端處融合至該Fc域之一個次單元之N端，且該第二抗原結合部分係於Fab重鏈之C端處融合至該第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端。
  15. 如請求項13之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該第二抗原結合部分及該第三抗原結合部分及該Fc域為免疫球蛋白分子、尤其IgG類免疫球蛋白之一部分。
  16. 如請求項1之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域為IgG、尤其IgG1或IgG4 Fc域。
  17. 如請求項1之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域為人類Fc域。
  18. 如請求項1之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域包含促進該Fc域之第一次單元與第二次單元締合之修飾。
  19. 如請求項18之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中在該Fc域之第一次單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在該第一次單元之CH3域內產生隆凸，該隆凸可定位於該第二次單元 之CH3域內之凹穴中，且在該Fc域之第二次單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在該第二次單元之CH3域內產生凹穴，該第一次單元之CH3域內之該隆凸可定位於該凹穴內。
  20. 如請求項1之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中與天然IgG1 Fc域相比，該Fc域展現減小之與Fc受體之結合親和力及/或減少之效應功能。
  21. 如請求項20之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域包含一或多個減少與Fc受體之結合及/或效應功能之胺基酸取代。
  22. 如請求項21之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該一或多個胺基酸取代係在選自以下之群之一或多個位置處：L234、L235及P329。
  23. 如請求項22之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域之各次單元包含三個減少與活化Fc受體之結合及/或效應功能之胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G。
  24. 如請求項20之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc受體為Fcγ受體。
  25. 如請求項20之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該效應功能為抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
  26. 如請求項1之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該活化T細胞抗原為CD3。
  27. 如請求項1之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該目標細胞抗原係選自由以下組成之群：黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、CD19、CD20、CD33、癌胚抗原(CEA)及纖維母細胞活化蛋白(FAP)。
  28. 一種經分離聚核苷酸，其編碼如請求項1至27中任一項之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段。
  29. 一種多肽，其由如請求項28之經分離聚核苷酸編碼。
  30. 一種載體、尤其一種表現載體，其包含如請求項28之經分離聚核苷酸。
  31. 一種宿主細胞，其包含如請求項28之經分離聚核苷酸或如請求項30之表現載體。
  32. 一種製造如請求項1至27中任一項之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的方法，該方法包含以下步驟：a)在適於該活化T細胞之雙特異性抗原結合分子表現之條件下培養如請求項31之宿主細胞，及b)回收該活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。
  33. 一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其由如請求項32之方法製造。
  34. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至27中任一項之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子及醫藥學上可接受之載劑。
  35. 如請求項1之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其用作藥劑。
  36. 如請求項1之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其用於治療有需要之個體之疾病。
  37. 如請求項36之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該疾病為癌症。
  38. 如請求項34之醫藥組合物，其用作藥劑。
  39. 如請求項34之醫藥組合物，其用於治療有需要之個體之疾病。
  40. 如請求項39之醫藥組合物，其中該疾病為癌症。
  41. 一種如請求項1至27中任一項之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之用途，其用於製造用於治療有需要之個體之疾病的藥劑。
  42. 如請求項41之用途，其中該疾病為癌症。
  43. 一種誘導目標細胞溶解之活體外方法，其包含使目標細胞與如請求項1至27中任一項之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子在T細胞存在下接觸。
  44. 一種如請求項1至27中任一項之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的用途，其用於製造用於誘導目標細胞溶解之藥劑，其中使該藥劑與該目標細胞在T細胞存在下接觸。
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ZA (1) ZA201309742B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI638832B (zh) 2013-02-26 2018-10-21 羅齊克雷雅公司 雙特異性ｔ細胞活化抗原結合分子
US10766967B2 (en) 2015-10-02 2020-09-08 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific T cell activating antigen binding molecules
US11013801B2 (en) 2015-12-09 2021-05-25 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment method

Families Citing this family (296)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
PE20120591A1 (es) 2009-04-02 2012-05-23 Roche Glycart Ag Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla
CA2757931C (en) 2009-04-07 2019-03-26 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) * 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
WO2011034605A2 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
CN103052649B (zh) 2010-07-29 2015-12-16 Xencor公司 具有修改的等电点的抗体
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
DK2635607T3 (da) 2010-11-05 2019-11-18 Zymeworks Inc Stabilt heterodimert antistofdesign med mutationer i fc-domænet
CN109160951A (zh) 2010-11-30 2019-01-08 中外制药株式会社 细胞毒诱导治疗剂
WO2012085111A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
CA2825081A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Birgit Bossenmaier Antigen binding proteins
WO2012116927A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
WO2012116453A1 (en) 2011-03-03 2012-09-07 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
AU2012245260B2 (en) 2011-04-22 2016-09-08 Aptevo Research And Development Llc Prostate-specific membrane antigen binding proteins and related compositions and methods
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
PT2748201T (pt) * 2011-08-23 2018-02-08 Roche Glycart Ag Moléculas de ligação ao antigénio biespecíficas que ativam as células t
BR112014004168A2 (pt) 2011-08-23 2017-12-12 Roche Glycart Ag anticorpo biespecífico, composição farmacêutica, uso do anticorpo biespecífico, célula hospedeira procariótica ou eucariótica, método de produção de anticorpo e invenção
BR112014003999A2 (pt) 2011-08-23 2017-06-13 Roche Glycart Ag anticorpo isolado que se liga a um epítopo próximo da membrana de mcsp humano, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica, uso do anticorpo, método de tratamento de indivíduos portadores de câncer, método de undução da lise celular em indivíduos e teste imuno-histoquímico de mcsp
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
HRP20211773T1 (hr) 2011-11-04 2022-03-04 Zymeworks Inc. Stabilna heterodimerni dizajn antitijela s mutacijama u fc domeni
CA2861124A1 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Genentech, Inc. Single-chain antibodies and other heteromultimers
JP6628966B2 (ja) 2012-06-14 2020-01-15 中外製薬株式会社 改変されたＦｃ領域を含む抗原結合分子
WO2014004586A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
CA2871880A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for selection and production of tailor-made highly selective and multi-specific targeting entities containing at least two different binding entities and uses thereof
MX2014014804A (es) 2012-06-27 2015-02-12 Hoffmann La Roche Metodo para la elaboracion de conjugados de la region fc de anticuerpos que comprenden por lo menos una entidad de union que se une especificamente a un objetivo y usos del mismo.
WO2014012082A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design an constructs
US9682143B2 (en) * 2012-08-14 2017-06-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
WO2014028560A2 (en) * 2012-08-14 2014-02-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
CN104704004B (zh) 2012-10-08 2019-12-31 罗切格利卡特公司 包含两个Fab片段的无Fc的抗体及使用方法
CN104271602B (zh) * 2012-11-21 2020-08-21 武汉友芝友生物制药有限公司 双特异性抗体
CN105026430A (zh) 2012-11-28 2015-11-04 酵活有限公司 工程化免疫球蛋白重链-轻链对及其用途
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
SI2943511T1 (sl) 2013-01-14 2020-01-31 Xencor, Inc. Novi heterodimerni proteini
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2014113510A1 (en) 2013-01-15 2014-07-24 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
EP2953972B1 (en) 2013-02-05 2020-07-08 EngMab Sàrl Method for the selection of antibodies against bcma
KR102685501B1 (ko) 2013-02-20 2024-07-17 노파르티스 아게 인간화 항-EGFRvIII 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
BR112015017800A2 (pt) * 2013-02-26 2017-11-21 Roche Glycart Ag moléculas de ligação ao antígeno biespecífica ativadora de célula t, polinucleotídeo, polipeptídeo, vetor, célula hospedeira, método de produção da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ativadora de célula t, composição farmacêutica e uso da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ativadora de célula t
US20140242080A1 (en) * 2013-02-26 2014-08-28 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
DK2970486T3 (en) 2013-03-15 2018-08-06 Xencor Inc MODULATION OF T-CELLS WITH BISPECIFIC ANTIBODIES AND FC-FUSIONS
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
EP2789630A1 (en) * 2013-04-09 2014-10-15 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3e and ROR1
SG10201800492PA (en) * 2013-04-29 2018-03-28 Hoffmann La Roche Human fcrn-binding modified antibodies and methods of use
CA2917886A1 (en) * 2013-07-12 2015-01-15 Zymeworks Inc. Bispecific cd3 and cd19 antigen binding constructs
CN104342453A (zh) * 2013-08-06 2015-02-11 深圳先进技术研究院 含基因工程抗体基因表达盒的微环dna重组母质粒、含该表达盒的微环dna及应用
MX2016003593A (es) 2013-10-11 2016-06-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos de cadena ligera variable comun intercambiada de dominio multiespecifico.
EA036414B1 (ru) 2013-10-25 2020-11-09 Псайоксус Терапьютикс Лимитед Онколитические аденовирусы, содержащие трансгены
JPWO2015068847A1 (ja) 2013-11-11 2017-03-09 中外製薬株式会社 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子
AU2014357292B2 (en) 2013-11-27 2020-06-25 Zymeworks Bc Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting HER2
MX2016008667A (es) * 2013-12-30 2017-02-02 Epimab Biotherapeutics Inc Inmunoglobulina con fab en tandem y usos de esta.
EP3094648A1 (en) 2014-01-15 2016-11-23 F. Hoffmann-La Roche AG Fc-region variants with improved protein a-binding
SG10202008629XA (en) 2014-03-28 2020-10-29 Xencor Inc Bispecific antibodies that bind to cd38 and cd3
SG11201607434WA (en) 2014-04-07 2016-10-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Immunoactivating antigen-binding molecule
US11505605B2 (en) * 2014-05-13 2022-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha T cell-redirected antigen-binding molecule for cells having immunosuppression function
CA2946503C (en) 2014-05-28 2022-11-22 Zymeworks Inc. Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof
SG11201609707WA (en) 2014-07-01 2017-01-27 Pfizer Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof
EP3169776A4 (en) * 2014-07-14 2018-07-04 The Regents of The University of California Crispr/cas transcriptional modulation
SG11201700418VA (en) 2014-07-21 2017-02-27 Novartis Ag Treatment of cancer using a cll-1 chimeric antigen receptor
JP7054622B2 (ja) 2014-07-21 2022-04-14 ノバルティス アーゲー ヒト化抗ｂｃｍａキメラ抗原受容体を使用した癌の処置
BR112017001579A2 (pt) 2014-07-25 2017-11-21 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-cd3, anticorpos anti-cd3 ativáveis, anticorpos anti-cd3 multiespecíficos, anticorpos anti-cd3 ativáveis multiespecíficos e métodos de uso dos mesmos
MX2017001401A (es) 2014-07-31 2017-08-07 Amgen Res (Munich) Gmbh Constructos de anticuerpos de cadena sencilla biespecifica especificos para especies cruzadas optimizadas.
MA50584A (fr) 2014-08-04 2020-09-16 Hoffmann La Roche Molécules bispécifiques de liaison à l'antigène activant des lymphocytes t
EP2982692A1 (en) * 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
US10059763B2 (en) 2014-09-03 2018-08-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Compound targeting IL-23A and TNF-alpha and uses thereof
WO2016055592A1 (en) * 2014-10-09 2016-04-14 Engmab Ag Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1
JP7125248B2 (ja) 2014-11-11 2022-08-24 中外製薬株式会社 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子のライブラリ
PL3221355T3 (pl) 2014-11-20 2021-03-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Terapia skojarzona składająca się z dwuswoistych aktywujących limfocyty T cząsteczek wiążących antygen CD3 i receptor folianowy 1 (FolR1) oraz antagonistów wiązania osi PD-1
PE20170585A1 (es) * 2014-11-20 2017-05-11 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno biespecificas activadoras de celulas t
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
AU2015353416C1 (en) 2014-11-26 2022-01-27 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CD38
NZ732144A (en) 2014-11-26 2020-04-24 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens
EP3227332B1 (en) 2014-12-03 2019-11-06 F.Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
LT3227336T (lt) 2014-12-05 2019-09-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd79b antikūnai ir jų naudojimo būdai
WO2016100788A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Alkermes, Inc. Single chain fc fusion proteins
EP3237449A2 (en) 2014-12-22 2017-11-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
AU2016205967B2 (en) 2015-01-08 2021-11-11 Genmab A/S Bispecific antibodies against CD3 and CD20
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
EA201792193A1 (ru) 2015-04-17 2018-05-31 Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх Конструкции биспецифического антитела для cdh3 и cd3
JP6996983B2 (ja) 2015-06-16 2022-02-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｌｌ－１抗体及び使用方法
BR112017024610A2 (pt) 2015-06-24 2018-07-31 F. Hoffmann-La Roche Ag anticorpos para receptor antitransferrina com afinidade especificada
EP3322735A4 (en) 2015-07-15 2019-03-13 Zymeworks Inc. BISPECIFIC ANTIGEN-BINDING CONSTRUCTS CONJUGATED TO A MEDICINAL PRODUCT
TWI717375B (zh) 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI793062B (zh) 2015-07-31 2023-02-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｄｌｌ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
JO3620B1 (ar) 2015-08-05 2020-08-27 Amgen Res Munich Gmbh مثبطات نقطة فحص مناعية للاستخدام في علاج سرطانات محمولة عبر الدم
KR20180053322A (ko) 2015-09-21 2018-05-21 압테보 리서치 앤드 디벨롭먼트 엘엘씨 Cd3 결합 폴리펩타이드
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
EP3356407B1 (en) * 2015-10-02 2021-11-03 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific anti-cd19xcd3 t cell activating antigen binding molecules
MA43023A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Anticorps de récepteur de la transferrine humaine/anti-humaine cd20 bispécifique et leurs procédés d'utilisation
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
US20170096485A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific t cell activating antigen binding molecules
JP6932693B2 (ja) 2015-10-08 2021-09-08 ザイムワークス，インコーポレイテッド カッパ及びラムダ軽鎖を含む抗原結合ポリペプチド構築物及びその使用
US11660340B2 (en) 2015-11-18 2023-05-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Combination therapy using T cell redirection antigen binding molecule against cell having immunosuppressing function
WO2017086419A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 液性免疫応答の増強方法
AU2016358296B2 (en) * 2015-11-19 2020-05-21 Revitope Limited Functional antibody fragment complementation for a two-components system for redirected killing of unwanted cells
CN108699136B (zh) 2015-12-07 2022-03-18 Xencor股份有限公司 结合cd3和psma的异二聚抗体
EP3178848A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
SG11201805137XA (en) 2015-12-17 2018-07-30 Psioxus Therapeutics Ltd Virus encoding an anti-tcr-complex antibody or fragment
US10596257B2 (en) 2016-01-08 2020-03-24 Hoffmann-La Roche Inc. Methods of treating CEA-positive cancers using PD-1 axis binding antagonists and anti-CEA/anti-CD3 bispecific antibodies
EP3405493A1 (en) 2016-01-22 2018-11-28 Janssen Biotech, Inc. Anti-ror1 antibodies, ror1 x cd3 bispecific antibodies, and methods of using the same
SI3411404T1 (sl) 2016-02-03 2023-01-31 Amgen Research (Munich) Gmbh Konstrukti bispecifičnih protiteles PSMA in CD3, ki aktivirajo T celico
JP6959011B2 (ja) 2016-02-03 2021-11-02 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハーＡＭＧＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ）ＧｍｂＨ Ｂｃｍａおよびｃｄ３に対する二重特異性を有するｔ細胞エンゲージ抗体コンストラクト
EA039859B1 (ru) 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
NZ743881A (en) 2016-02-06 2023-11-24 Epimab Biotherapeutics Inc Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
US20190241910A1 (en) * 2016-03-11 2019-08-08 Bluebird Bio, Inc. Genome edited immune effector cells
US11291721B2 (en) 2016-03-21 2022-04-05 Marengo Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
RS64266B1 (sr) 2016-03-22 2023-07-31 Hoffmann La Roche Bispecifični molekul koji aktivira t ćeliju koji se aktivira proteazom
CN109790517B (zh) 2016-04-15 2023-05-02 纪念斯隆-凯特林癌症中心 转基因t细胞和嵌合抗原受体t细胞组合物和相关方法
JOP20170091B1 (ar) 2016-04-19 2021-08-17 Amgen Res Munich Gmbh إعطاء تركيبة ثنائية النوعية ترتبط بـ cd33 وcd3 للاستخدام في طريقة لعلاج اللوكيميا النخاعية
TW201902512A (zh) * 2016-06-02 2019-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 治療方法
KR20230054508A (ko) 2016-06-14 2023-04-24 젠코어 인코포레이티드 이중특이적 체크포인트 억제제 항체
US10335459B2 (en) 2016-06-22 2019-07-02 Alkermes, Inc. Compositions for modulating IL-10 immunostimulatory and anti-inflammatory properties
CN116063545A (zh) 2016-06-28 2023-05-05 Xencor股份有限公司 结合生长抑素受体2的异源二聚抗体
BR112018077375A2 (pt) 2016-06-30 2019-10-01 F. Hoffmann-La Roche Ag kits, moléculas de anticorpo biespecífico trivalente, composição farmacêutica, vetor de expressão, célula hospedeira e método para a produção de uma molécula de anticorpo biespecífico trivalente
TWI790206B (zh) * 2016-07-18 2023-01-21 法商賽諾菲公司 特異性結合至ｃｄ３和ｃｄ１２３的雙特異性抗體樣結合蛋白
GB201713765D0 (en) * 2017-08-28 2017-10-11 Psioxus Therapeutics Ltd Modified adenovirus
CA3034517A1 (en) 2016-08-29 2018-03-08 Psioxus Therapeutics Limited Adenovirus armed with bispecific t cell activator
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CN109843926B (zh) 2016-09-30 2023-01-20 豪夫迈·罗氏有限公司 针对cd3的双特异性抗体
JP7273453B2 (ja) 2016-10-14 2023-05-15 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲアルファＦｃ融合タンパク質およびＰＤ－１抗体の断片を含む二重特異性ヘテロ二量体融合タンパク質
TW201829463A (zh) 2016-11-18 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗hla-g抗體及其用途
JOP20190189A1 (ar) 2017-02-02 2019-08-01 Amgen Res Munich Gmbh تركيبة صيدلانية ذات درجة حموضة منخفضة تتضمن بنيات جسم مضاد يستهدف الخلية t
EP3579877A4 (en) * 2017-02-09 2020-12-09 The Regents of The University of California CHEMERIC T-LYMPHOCYTE ANTIGENIC RECEPTORS AND METHODS OF USE
WO2018151820A1 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
EP3583123A1 (en) 2017-02-17 2019-12-25 Denali Therapeutics Inc. Anti-tau antibodies and methods of use thereof
BR112019016970A2 (pt) 2017-03-10 2020-04-07 Hoffmann La Roche método para produzir um anticorpo multiespecífico
BR112019017629A2 (pt) 2017-03-27 2020-04-07 Hoffmann La Roche receptor de união ao antígeno, polinucleotídeo isolado, vetor, célula t transduzida, métodos para o tratamento de uma doença e para induzir a lise, utilização do receptor e receptor
TWI676681B (zh) * 2017-03-29 2019-11-11 臺北醫學大學 具抗原專一性的t細胞及其用途
BR112019018767A2 (pt) 2017-04-03 2020-05-05 Hoffmann La Roche anticorpos, molécula de ligação ao antígeno biespecífica, um ou mais polinucleotídeos isolados, um ou mais vetores, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, composição farmacêutica, usos, método para tratar uma doença em um indivíduo e invenção
CR20190427A (es) * 2017-04-04 2019-11-01 Hoffmann La Roche Nuevas moléculas de unión a antígeno biespecíficas capaces de unirse específicamente a cd40 y a fap
EP3615074A4 (en) * 2017-04-26 2020-05-13 Mayo Foundation for Medical Education and Research METHODS AND MATERIALS FOR THE TREATMENT OF CANCER
AU2018261951A1 (en) 2017-05-05 2019-10-31 Amgen Inc. Pharmaceutical composition comprising bispecific antibody constructs for improved storage and administration
WO2018222901A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
CA3068056A1 (en) * 2017-06-22 2018-12-27 Development Center For Biotechnology Asymmetric heterodimeric fc-scfv fusion anti-globo h and anti-cd3 bispecifc antibody and uses thereof in cancer therapy
JP2020529832A (ja) 2017-06-30 2020-10-15 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαおよび抗原結合ドメインを含む標的化ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
EP3457139A1 (en) 2017-09-19 2019-03-20 Promise Advanced Proteomics Antibody-like peptides for quantifying therapeutic antibodies
TWI687227B (zh) * 2017-10-03 2020-03-11 生倍科技股份有限公司 用於t細胞免疫療法之組合及其用途
EP3694885A1 (en) 2017-10-14 2020-08-19 CytomX Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
SG11202003024WA (en) * 2017-10-20 2020-05-28 Hutchinson Fred Cancer Res Systems and methods to produce b cells genetically modified to express selected antibodies
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
KR20200085828A (ko) 2017-11-08 2020-07-15 젠코어 인코포레이티드 신규의 항-pd-1 서열을 사용한 이중특이적 및 단일특이적 항체
UA127831C2 (uk) * 2017-11-27 2024-01-17 4Д Молекьюлар Терапьютикс Інк. Капсид аденоасоційованого вірусу та його застосування для інгібування ангіогенезу
JP7357616B2 (ja) 2017-12-05 2023-10-06 中外製薬株式会社 Ｃｄ３およびｃｄ１３７に結合する改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子
JP7344206B2 (ja) 2017-12-11 2023-09-13 アムジェン インコーポレイテッド 二重特異性抗体製品のための連続製造プロセス
US11319355B2 (en) 2017-12-19 2022-05-03 Xencor, Inc. Engineered IL-2 Fc fusion proteins
AR114001A1 (es) 2017-12-21 2020-07-08 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a hla- a2 / wt1
AU2018392728A1 (en) 2017-12-22 2020-07-09 Genentech, Inc. Targeted integration of nucleic acids
US11440957B2 (en) 2017-12-29 2022-09-13 Alector Llc Anti-TMEM106B antibodies and methods of use thereof
TW201940518A (zh) 2017-12-29 2019-10-16 美商安進公司 針對ｍｕｃ１７和ｃｄ３之雙特異性抗體構建體
JP7268038B2 (ja) 2018-01-31 2023-05-02 アレクトル エルエルシー 抗ｍｓ４ａ４ａ抗体及びその使用方法
EP3746480A1 (en) 2018-01-31 2020-12-09 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies comprising an antigen-binding site binding to lag3
CN111630063A (zh) 2018-01-31 2020-09-04 豪夫迈·罗氏有限公司 稳定化的免疫球蛋白结构域
GB201801614D0 (en) 2018-01-31 2018-03-14 Psioxus Therapeutics Ltd Formulation
AR115360A1 (es) 2018-02-08 2021-01-13 Genentech Inc Moléculas de unión al antígeno y métodos de uso
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
EP3765516A2 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
US20210238280A1 (en) 2018-03-14 2021-08-05 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
CA3091231A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Genentech, Inc. Modulating lactogenic activity in mammalian cells
US10982006B2 (en) 2018-04-04 2021-04-20 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
EP3781599A1 (en) 2018-04-18 2021-02-24 Xencor, Inc. Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
JP2021520829A (ja) 2018-04-18 2021-08-26 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ Ｆｃ融合タンパク質およびＴＩＭ−３抗原結合ドメインを含む、ＴＩＭ−３標的化ヘテロ二量体融合タンパク質
AR115052A1 (es) 2018-04-18 2020-11-25 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecíficos y utilización de los mismos
WO2019210848A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Shanghai Epimab Biotherapeutics Co., Ltd. High affinity antibodies to pd-1 and lag-3 and bispecific binding proteins made therefrom
SG11202011082UA (en) 2018-05-25 2020-12-30 Alector Llc Anti-sirpa antibodies and methods of use thereof
AU2019284911A1 (en) 2018-06-13 2020-12-17 Novartis Ag BCMA chimeric antigen receptors and uses thereof
US12060422B2 (en) 2018-06-29 2024-08-13 Alector Llc Anti-SIRP-Beta1 antibodies and methods of use thereof
US11845797B2 (en) 2018-07-03 2023-12-19 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
US11396546B2 (en) 2018-07-13 2022-07-26 Alector Llc Anti-Sortilin antibodies and methods of use thereof
SG11202100710TA (en) 2018-07-30 2021-02-25 Amgen Res Munich Gmbh Prolonged administration of a bispecific antibody construct binding to cd33 and cd3
AU2019316164A1 (en) 2018-07-31 2021-01-21 Amgen Inc. Dosing regimen for BCMA-CD3 bispecific antibodies
CN112512581A (zh) 2018-08-03 2021-03-16 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 针对cldn18.2和cd3的抗体构建体
TW202028239A (zh) 2018-09-28 2020-08-01 美商安進公司 針對可溶性bcma之抗體
US11358999B2 (en) 2018-10-03 2022-06-14 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
AU2019356564A1 (en) 2018-10-11 2021-04-29 Amgen Inc. Downstream processing of bispecific antibody constructs
JP7410143B2 (ja) * 2018-11-01 2024-01-09 山▲東▼新▲時▼代▲薬▼▲業▼有限公司 二重特異性抗体及びその用途
CN113631711A (zh) 2018-12-21 2021-11-09 豪夫迈·罗氏有限公司 核酸的靶向整合
KR102524247B1 (ko) * 2018-12-21 2023-04-21 가톨릭대학교 산학협력단 p40-EBI3의 복합체 및 이의 용도
SG10202105788SA (en) 2018-12-21 2021-06-29 Hoffmann La Roche Antibodies binding to cd3
AU2020224680A1 (en) 2019-02-21 2021-09-16 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to T cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
WO2020172571A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
GB2597851B (en) 2019-02-21 2024-05-29 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof
WO2020172596A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and thereof
CA3131016A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Andreas Loew Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
CN110914296B (zh) 2019-02-22 2021-02-19 武汉友芝友生物制药有限公司 改造的Fc片段，包含其的抗体及其应用
WO2020180726A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
US11667712B2 (en) * 2019-05-08 2023-06-06 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods for modulating t cell mediated immunity
KR20220031616A (ko) 2019-06-11 2022-03-11 알렉터 엘엘씨 치료요법에 사용하기 위한 항-소르틸린 항체
JP2022537650A (ja) 2019-06-13 2022-08-29 アムジエン・インコーポレーテツド 生物製剤の製造における自動化された生物量に基づく灌流制御
CN116987197A (zh) * 2019-06-20 2023-11-03 成都恩沐生物科技有限公司 共价多特异性抗体
JP7359864B2 (ja) * 2019-07-10 2023-10-11 中外製薬株式会社 クローディン６結合分子およびその使用
CN114174342B (zh) 2019-07-31 2024-08-16 豪夫迈·罗氏有限公司 与gprc5d结合的抗体
WO2021018925A1 (en) 2019-07-31 2021-02-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to gprc5d
AU2020321969A1 (en) 2019-07-31 2022-03-17 Alector Llc Anti-MS4A4A antibodies and methods of use thereof
CN112390882A (zh) * 2019-08-19 2021-02-23 杨洋 靶向cd3和cd20的双特异性抗体及其应用
JP2022547135A (ja) 2019-09-10 2022-11-10 アムジエン・インコーポレーテツド 増強されたプロテインｌ捕捉動的結合容量を有する二重特異性抗原結合ポリペプチドの精製方法
KR20220064980A (ko) 2019-09-18 2022-05-19 제넨테크, 인크. 항 klk7 항체, 항 klk5 항체, 다중특이적 항 klk5/klk7 항체, 및 사용 방법
EP3819007B1 (en) 2019-11-11 2024-07-10 Amgen Research (Munich) GmbH Dosing regimen for anti-bcma agents
EP4058485A1 (en) 2019-11-13 2022-09-21 Amgen Inc. Method for reduced aggregate formation in downstream processing of bispecific antigen-binding molecules
BR112022009938A2 (pt) 2019-11-25 2022-09-13 Alkermes Inc Compostos macrocíclicos substituídos e métodos de tratamento relacionados
WO2021122875A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to hla-a2/mage-a4
IL293640A (en) 2019-12-20 2022-08-01 Amgen Inc CD40 antagonistic mesothelin-targeted multispecific antibody constructs for the treatment of solid tumors
IL294131A (en) 2019-12-23 2022-08-01 Genentech Inc Antibodies specific for apolipoprotein l1 and methods of use
WO2021138407A2 (en) 2020-01-03 2021-07-08 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof
WO2021150824A1 (en) 2020-01-22 2021-07-29 Amgen Research (Munich) Gmbh Combinations of antibody constructs and inhibitors of cytokine release syndrome and uses thereof
CA3174103A1 (en) 2020-03-06 2021-09-10 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cd44 antibodies and their uses
TW202200615A (zh) 2020-03-12 2022-01-01 美商安進公司 用於治療和預防患者的crs之方法
CA3175275A1 (en) 2020-03-19 2021-09-23 Amgen Inc. Antibodies against mucin 17 and uses thereof
EP4127153A2 (en) 2020-03-26 2023-02-08 Genentech, Inc. Modified mammalian cells having reduced host cell proteins
JP7085666B2 (ja) 2020-03-31 2022-06-16 中外製薬株式会社 Ｄｌｌ３標的多重特異性抗原結合分子およびその使用
BR112022021203A2 (pt) 2020-04-24 2022-12-06 Hoffmann La Roche Modulação de enzima e via com compostos sulfidrila e seus derivados
EP4139363A4 (en) 2020-04-24 2024-09-04 Marengo Therapeutics Inc MULTIFUNCTIONAL MOLECULES BINDING TO T-CELL ASSOCIATED CANCER CELLS AND USES THEREOF
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
CA3183693A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Amgen Inc. Adverse effects-mitigating administration of a bispecific construct binding to cd33 and cd3
JP2023527918A (ja) 2020-06-08 2023-06-30 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｈｂｖ抗体及び使用方法
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
AU2021291005A1 (en) 2020-06-19 2023-01-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to CD3 and FolR1
US20220010015A1 (en) 2020-06-19 2022-01-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies binding to cd3
US11780920B2 (en) 2020-06-19 2023-10-10 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies binding to CD3 and CD19
US20230416363A1 (en) * 2020-06-23 2023-12-28 Kadmon Corporation, Llc Anti-PD-1 Antibodies and Fusion Proteins
MX2022015205A (es) 2020-06-24 2023-01-05 Genentech Inc Integracion dirigida de acidos nucleicos.
MX2022016453A (es) 2020-06-24 2023-02-01 Genentech Inc Lineas celulares resistentes a la apoptosis.
KR20230038735A (ko) 2020-07-17 2023-03-21 제넨테크, 인크. 항-notch2 항체 및 이용 방법
KR20230166150A (ko) 2020-08-19 2023-12-06 젠코어 인코포레이티드 항-cd28 조성물
EP4204458A1 (en) 2020-08-26 2023-07-05 Marengo Therapeutics, Inc. Methods of detecting trbc1 or trbc2
AU2021331075A1 (en) 2020-08-26 2023-04-06 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
CA3190766A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to nkp30 and uses thereof
CN116648507A (zh) 2020-08-28 2023-08-25 基因泰克公司 宿主细胞蛋白的CRISPR/Cas9多重敲除
EP4210742A1 (en) 2020-09-10 2023-07-19 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
US20230357440A1 (en) 2020-09-10 2023-11-09 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
EP4210746A1 (en) 2020-09-10 2023-07-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating chronic lymphocytic leukemia
BR112023004296A2 (pt) 2020-09-10 2023-04-04 Genmab As Método para tratar linfoma de célula b grande difusa em um indivíduo humano
IL301085A (en) 2020-09-10 2023-05-01 Genmab As A bispecific antibody against CD3 and CD20 in combination therapy for the treatment of diffuse large B-cell lymphoma
US20220168407A1 (en) 2020-11-05 2022-06-02 Dcprime B.V. Use of tumor-independent antigens in immunotherapies
CA3198064A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Amgen Inc. Antigen binding domain with reduced clipping rate
EP4240767A1 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Amgen Inc. Polypeptide constructs binding to cd3
TW202233679A (zh) 2020-11-06 2022-09-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 選擇性地與cldn6和cd3結合的多肽構建體
CR20230229A (es) 2020-11-06 2023-09-05 Amgen Res Munich Gmbh Moléculas de unión a antígeno biespecíficas con múltiples dianas de selectividad aumentada
WO2022103781A1 (en) 2020-11-10 2022-05-19 Amgen Inc. Methods for administering a bcma x cd3 binding molecule
CA3202986A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Alector Llc Methods of use of anti-sortilin antibodies
AU2021399841A1 (en) 2020-12-17 2023-07-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-hla-g antibodies and use thereof
JP2024509695A (ja) 2021-02-03 2024-03-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性結合タンパク質分解プラットフォームおよび使用方法
CA3209479A1 (en) 2021-02-03 2022-08-11 Mozart Therapeutics, Inc. Binding agents and methods of using the same
EP4301782A1 (en) 2021-03-05 2024-01-10 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cd44 antibodies and their uses
KR20230156079A (ko) 2021-03-09 2023-11-13 젠코어 인코포레이티드 Cd3과 cldn6에 결합하는 이종이량체 항체
WO2022192586A1 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
EP4304732A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Genentech, Inc. Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use
US20240174746A1 (en) 2021-03-18 2024-05-30 Alector Llc Anti-tmem106b antibodies and methods of use thereof
JP2024511610A (ja) 2021-03-23 2024-03-14 アレクトル エルエルシー コロナウイルス感染の治療及び予防のための抗ｔｍｅｍ１０６ｂ抗体
TW202313681A (zh) 2021-04-02 2023-04-01 美商安進公司 Ｍａｇｅｂ２結合構建體
AU2022255506A1 (en) 2021-04-08 2023-11-09 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules binding to tcr and uses thereof
AU2022253902A1 (en) 2021-04-10 2023-11-02 Profoundbio Us Co. Folr1 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
EP4326855A1 (en) 2021-04-19 2024-02-28 Genentech, Inc. Modified mammalian cells
TW202308699A (zh) 2021-04-23 2023-03-01 美商普方生物製藥美國公司 Ｃｄ７０結合劑、其結合物及其使用方法
CN117279947A (zh) 2021-05-06 2023-12-22 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 用于在增殖性疾病中使用的靶向cd20和cd22的抗原结合分子
JP2024521107A (ja) 2021-05-21 2024-05-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド 目的の組換え産物を産生するための修飾細胞
EP4371125A1 (en) 2021-07-13 2024-05-22 Genentech, Inc. Multi-variate model for predicting cytokine release syndrome
AU2022315528A1 (en) 2021-07-22 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Heterodimeric fc domain antibodies
JP2024528217A (ja) 2021-08-03 2024-07-26 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗体および使用方法
AU2022324456A1 (en) 2021-08-05 2024-02-15 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses
EP4395810A1 (en) 2021-09-03 2024-07-10 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cmet antibodies and their uses
WO2023034571A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-lamp1 antibodies and their uses
WO2023076876A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Mozart Therapeutics, Inc. Modulation of immune responses to viral vectors
AU2022381918A1 (en) 2021-11-03 2024-06-13 Affimed Gmbh Bispecific cd16a binders
WO2023078968A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Affimed Gmbh Bispecific cd16a binders
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
US20230322958A1 (en) 2022-01-19 2023-10-12 Genentech, Inc. Anti-Notch2 Antibodies and Conjugates and Methods of Use
TW202346368A (zh) 2022-05-12 2023-12-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 具有增加的選擇性的多鏈多靶向性雙特異性抗原結合分子
TW202417504A (zh) 2022-07-22 2024-05-01 美商建南德克公司 抗ｓｔｅａｐ１抗原結合分子及其用途
WO2024030956A2 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Mozart Therapeutics, Inc. Cd39-specific binding agents and methods of using the same
WO2024059675A2 (en) 2022-09-14 2024-03-21 Amgen Inc. Bispecific molecule stabilizing composition
WO2024079074A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 Universite D'aix Marseille ANTI-sCD146 ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2024079015A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and imids
WO2024079009A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and proteasome inhibitors
WO2024079010A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and cd38 antibodies
WO2024081918A1 (en) 2022-10-14 2024-04-18 Talem Therapeutics Llc Anti-trkb/cd3 antibodies and uses thereof
WO2024086796A1 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Alector Llc Anti-ms4a4a antibodies with amyloid-beta therapies
US20240240156A1 (en) 2022-11-15 2024-07-18 Genentech, Inc. Combined transposon-mediated integration and targeted integration of nucleic acids into host cells
WO2024129594A1 (en) 2022-12-12 2024-06-20 Genentech, Inc. Optimizing polypeptide sialic acid content
WO2024151974A1 (en) 2023-01-12 2024-07-18 Genentech, Inc. Combinatorial vector cloning and transfection strategies for targeted integration of nucleic acids
WO2024155807A1 (en) 2023-01-18 2024-07-25 Genentech, Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
WO2024156672A1 (en) 2023-01-25 2024-08-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to csf1r and cd3

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2388385B1 (fr) 1977-04-18 1982-01-08 Hitachi Metals Ltd Piece d'ornement fixee par des aimants permanents
DE3416774A1 (de) 1984-05-07 1985-11-14 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Monoklonale antikoerper, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
CA2312208C (en) 1997-12-05 2011-01-25 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
US6197510B1 (en) 1998-10-01 2001-03-06 Bio-Id Diagnostic Inc. Multi-loci genomic analysis
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
WO2001025454A2 (en) 1999-10-04 2001-04-12 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes in the presence of nitrogen
WO2001077342A1 (en) * 2000-04-11 2001-10-18 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
WO2002028997A2 (en) * 2000-10-03 2002-04-11 University Of North Carolina Methods of isolating bipotent hepatic progenitor cells
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
US7317091B2 (en) * 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
CN1961003B (zh) 2004-03-31 2013-03-27 健泰科生物技术公司 人源化抗TGF-β抗体
DK1737891T3 (da) 2004-04-13 2013-03-25 Hoffmann La Roche Anti-p-selectin-antistoffer
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
TWI487535B (zh) * 2004-11-30 2015-06-11 Centocor Inc 類鐸受體３（ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ３）拮抗劑，方法及用途
ES2755976T3 (es) 2005-02-07 2020-04-24 Roche Glycart Ag Moléculas de unión a antígeno que se unen a EGFR, vectores que las codifican y usos de las mismas
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CA2618482C (en) * 2005-08-19 2014-10-07 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
SG153825A1 (en) * 2005-12-16 2009-07-29 Ibc Pharmaceuticals Inc Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
CA2633713A1 (en) * 2005-12-21 2007-06-28 Micromet Ag Epha2 bite molecules and uses thereof
AT503889B1 (de) * 2006-07-05 2011-12-15 Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F Multivalente immunglobuline
RS53008B2 (sr) 2007-04-03 2022-12-30 Amgen Res Munich Gmbh Interspecijski specifičan cd3-epsilon vezujući domen
JP2010535032A (ja) * 2007-07-31 2010-11-18 メディミューン，エルエルシー 多重特異性エピトープ結合性タンパク質およびその用途
US8242247B2 (en) * 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) * 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) * 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
MX350962B (es) 2008-01-07 2017-09-27 Amgen Inc Metodo para fabricar moleculas heterodimericas de fragmentos cristalizables de anticuerpo, utilizando efectos electrostaticos de direccion.
RU2010153578A (ru) * 2008-06-03 2012-07-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение
CA2757931C (en) * 2009-04-07 2019-03-26 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
CN102361884A (zh) * 2009-04-07 2012-02-22 罗氏格黎卡特股份公司 双特异性抗-ErbB-2/抗-c-Met抗体
EP2417159A1 (en) * 2009-04-07 2012-02-15 Roche Glycart AG Bispecific anti-erbb-3/anti-c-met antibodies
JP5719354B2 (ja) * 2009-05-27 2015-05-20 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 三重又は四重特異性抗体
US9676845B2 (en) * 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) * 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
BR112012003983A2 (pt) 2009-08-31 2021-09-14 Roche Glycart Ag Molecula de ligação abm moleculas de ligação de antigenos abm variante polipeptideo isolado molecula de ligação de antigeneos humanizada anticorpo polinucleotideo isolado composição vetor celula hospedeira metodo de produção de abm metodo de indução da lise celular de tumor, metodo de diagnostico de doença em pacientes que possuem um cancer metodo de aumento de tempo de sobrevivencia em pacientes que possuem um cancer metodo de indução em pacientes de regressão de um motor uso abm e invenção
WO2012020006A2 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Roche Glycart Ag Anti-fap antibodies and methods of use
PT2748201T (pt) * 2011-08-23 2018-02-08 Roche Glycart Ag Moléculas de ligação ao antigénio biespecíficas que ativam as células t

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI638832B (zh) 2013-02-26 2018-10-21 羅齊克雷雅公司 雙特異性ｔ細胞活化抗原結合分子
US10155815B2 (en) 2013-02-26 2018-12-18 Roche Glycart Ag Bispecific T cell activating antigen binding molecules
US10781258B2 (en) 2013-02-26 2020-09-22 Roche Glycart Ag Bispecific T cell activating antigen binding molecules
US10781257B2 (en) 2013-02-26 2020-09-22 Roche GlyeArt AG Bispecific T cell activating antigen binding molecules
US10766967B2 (en) 2015-10-02 2020-09-08 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific T cell activating antigen binding molecules
US11013801B2 (en) 2015-12-09 2021-05-25 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment method

Also Published As

Publication number Publication date
JP7175291B2 (ja) 2022-11-18
PE20141521A1 (es) 2014-10-25
ZA201309742B (en) 2019-08-28
EP3321286B1 (en) 2021-01-06
CA2837975A1 (en) 2013-02-28
WO2013026833A1 (en) 2013-02-28
UA116192C2 (uk) 2018-02-26
BR112014003769A2 (pt) 2017-12-26
EP2748201A1 (en) 2014-07-02
EP3892640A1 (en) 2021-10-13
ECSP14013220A (es) 2015-03-31
MA35448B1 (fr) 2014-09-01
IL268886A (en) 2019-10-31
MY169358A (en) 2019-03-26
CN103748114A (zh) 2014-04-23
EA030147B1 (ru) 2018-06-29
ES2659764T3 (es) 2018-03-19
CL2014000126A1 (es) 2014-08-01
SI2748201T1 (en) 2018-03-30
ES2857734T3 (es) 2021-09-29
AU2012298537B2 (en) 2017-08-10
PL2748201T3 (pl) 2018-04-30
US20180273643A1 (en) 2018-09-27
JP2017029156A (ja) 2017-02-09
JP2014529402A (ja) 2014-11-13
LT2748201T (lt) 2018-02-26
AU2012298537A8 (en) 2014-01-09
MX352101B (es) 2017-11-08
IL229765A0 (en) 2014-01-30
AR087608A1 (es) 2014-04-03
CA2837975C (en) 2022-04-05
TWI633121B (zh) 2018-08-21
EP3321286A1 (en) 2018-05-16
IL229765B (en) 2019-09-26
US20230340160A1 (en) 2023-10-26
PL3321286T3 (pl) 2021-05-31
BR112014003769B1 (pt) 2022-05-10
AU2012298537A1 (en) 2013-12-12
IL268886B (en) 2021-10-31
NO2748201T3 (zh) 2018-05-12
KR101963923B1 (ko) 2019-03-29
JP6339015B2 (ja) 2018-06-06
PT2748201T (pt) 2018-02-08
US20130078249A1 (en) 2013-03-28
CR20130669A (es) 2014-02-12
DK2748201T3 (en) 2018-02-12
KR20140034310A (ko) 2014-03-19
RS56879B1 (sr) 2018-04-30
EP2748201B1 (en) 2017-12-13
CN103748114B (zh) 2017-07-21
EA201400254A1 (ru) 2014-08-29
JP2018153188A (ja) 2018-10-04
JP2020114213A (ja) 2020-07-30
HRP20180243T1 (hr) 2018-04-06
BR112014003769A8 (pt) 2018-04-17
CO6811817A2 (es) 2013-12-16
HUE038225T2 (hu) 2018-10-29
MX2014002099A (es) 2014-05-28

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