JP7196094B2 - 共刺激tnf受容体のための二重特異性抗原結合分子 - Google Patents
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Description
(a)抗体軽鎖可変領域(VL)および抗体重鎖可変領域(VH)を含むOX40に特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)抗体軽鎖可変領域(VL)および抗体重鎖可変領域(VH)を含む上皮細胞接着分子(EpCAM)に特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
(c)安定に会合することができる第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFc領域
をさらに含む。
(i)配列番号4および配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H1、
(ii)配列番号6および配列番号7からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、ならびに
(iii)配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13および配列番号14からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含む重鎖可変ドメイン(VH)と、
(iv)配列番号15、配列番号16および配列番号17からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L1、
(v)配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、ならびに
(vi)配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25および配列番号26からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含む軽鎖可変ドメイン(VL)と
を含む。
(i)配列番号33のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号34のアミノ酸配列を含むVL、
(ii)配列番号35のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号36のアミノ酸配列を含むVL、
(iii)配列番号37のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号38のアミノ酸配列を含むVL、
(iv)配列番号39のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号40のアミノ酸配列を含むVL、
(v)配列番号41のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号42のアミノ酸配列を含むVL、
(vi)配列番号43のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号44のアミノ酸配列を含むVL、または
(vii)配列番号45のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号46のアミノ酸配列を含むVL
を含む。
(i)アミノ酸配列、配列番号51を含むCDR-H1、
(ii)アミノ酸配列、配列番号52を含むCDR-H2、および
(iii)アミノ酸配列、配列番号53を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)アミノ酸配列、配列番号54を含むCDR-L1、
(v)アミノ酸配列、配列番号55を含むCDR-L2、および
(vi)アミノ酸配列、配列番号56を含むCDR-L3
を含むVLと
を含む。
(i)配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43および配列番号45からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、ならびに配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44および配列番号46からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む、OX40に特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(ii)配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、ならびに配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む、EpCAMに特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と
を含む。
(i)配列番号35のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号36のアミノ酸配列を含むVLを含む、OX40に特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(ii)配列番号63のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号64のアミノ酸配列を含むVLを含む、EpCAMに特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と
を含む。
(i)アミノ酸配列、配列番号27を含むCDR-H1、
(ii)アミノ酸配列、配列番号28を含むCDR-H2、および
(iii)アミノ酸配列、配列番号29を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)アミノ酸配列、配列番号30を含むCDR-L1、
(v)アミノ酸配列、配列番号31を含むCDR-L2、および
(vi)アミノ酸配列、配列番号32を含むCDR-L3
を含むVLと
を含む。
(i)アミノ酸配列、配列番号57を含むCDR-H1、
(ii)アミノ酸配列、配列番号58を含むCDR-H2、および
(iii)アミノ酸配列、配列番号59を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)アミノ酸配列、配列番号60を含むCDR-L1、
(v)アミノ酸配列、配列番号61を含むCDR-L2、および
(vi)アミノ酸配列、配列番号62を含むCDR-L3
を含むVLと
を含む。
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号48のアミノ酸配列を含むVLを含む、OX40に特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(ii)配列番号65のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号66のアミノ酸配列を含むVLを含む、EpCAMに特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と
を含む。
(a)Fc領域に接続されたOX40に特異的に結合することができる少なくとも2つのFab断片と、
(b)Fc領域のC末端に接続されたEpCAMに特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と
を含む。
(a)OX40に特異的に結合することができる2つのFab断片およびFc領域を含む抗体の2つの軽鎖および2つの重鎖と、
(b)EpCAMに特異的に結合することができる部分のVHおよびVLであって、VHが(a)の2つの重鎖の一方のC末端に接続されており、VLが(a)の2つの重鎖の他方のC末端に接続されているVHおよびVLと
を含む。
(a)OX40に特異的に結合することができる2つのFab断片およびFc領域を含む抗体の2つの軽鎖および2つの重鎖と、
(b)EpCAMに特異的に結合することができる2つのFab断片であって、Fab断片の一方が(a)の2つの重鎖の一方のC末端に接続されており、Fab断片の他方が(a)の2つの重鎖の他方のC末端に接続されている2つのFab断片と
を含む。
(a)各重鎖がOX40に特異的に結合することができるFab断片のVHおよびCH1ドメインならびにFc領域サブユニットを含む、2つの重鎖と、
(b)各軽鎖がOX40に特異的に結合することができるFab断片のVLおよびCLドメインを含む、2つの軽鎖と、
(c)EpCAMに特異的に結合することができる部分のVHおよびVLであって、VHが(a)の2つの重鎖の一方のC末端に接続されており、VLが(a)の2つの重鎖の他方のC末端に接続されている、VHおよびVLと
を含む。
(a)各重鎖がOX40に特異的に結合することができるFab断片のVHおよびCH1ドメインならびにFc領域サブユニットを含む、2つの重鎖と、
(b)各軽鎖がOX40に特異的に結合することができるFab断片のVLおよびCLドメインを含む、2つの軽鎖と、
(c)EpCAMに特異的に結合することができる2つのFab断片であって、Fab断片の一方が(a)の2つの重鎖の一方のC末端に接続されており、Fab断片の他方が(a)の2つの重鎖の他方のC末端に接続されている2つのFab断片と
を含む。
123位(EU番号付け)のアミノ酸のアルギニン(R)および124位(EU番号付け)のアミノ酸のリジン(K)を含むCLドメインと、
147位(EU番号付け)のアミノ酸のグルタミン酸(E)および213位(EU番号付け)のアミノ酸のグルタミン酸(E)を含むCH1ドメインと
を含む。
配列番号183のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、
配列番号184のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
各々が配列番号182のアミノ酸配列を含む、4つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
各々が配列番号186のアミノ酸配列を含む、2つの重鎖と、
各々が配列番号187のアミノ酸配列を含む、2つの軽鎖と、
各々が配列番号185のアミノ酸配列を含む、4つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
配列番号192のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、
配列番号193のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
各々が配列番号191のアミノ酸配列を含む、4つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
(i)T細胞応答の刺激、
(ii)活性化T細胞の生存の支持、
(iii)感染症の治療、
(iv)がんの治療、
(v)がんの進行の遅延、または
(vi)がんを患っている患者の生存の延長
に使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子または本発明の薬学的組成物を提供する。
別途定義のない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を説明する目的で、以下の定義を適用し、適当な場合は、単数形で使用される用語は複数も含み、逆もまた同様である。
- FcγRI(CD64)は、高い親和性でモノマーIgGに結合し、マクロファージ、単球、好中球および好酸球上で発現される。アミノ酸残基E233~G236、P238、D265、N297、A327およびP329(Kabat EUインデックスによる番号付け)の少なくとも1つのFc領域IgGの修飾は、FcγRIへの結合を減少させる。IgG1およびIgG4に代入された233~236位のIgG2残基は、FcγRIへの結合を103倍減少させ、抗体感作赤血球に対するヒト単球応答を排除した(Armour,K.L.ら、Eur.J.Immunol.29(1999)2613~2624)。
- FcγRII(CD32)は、複合体化IgGと中程度~低い親和性で結合し、広く発現される。この受容体は2つのサブタイプ、FcγRIIAおよびFcγRIIBに分けることができる。FcγRIIAは、殺傷に関与する多くの細胞(例えば、マクロファージ、単球、好中球)上で見られ、殺傷過程を活性化することができるように思われる。FcγRIIBは、阻害過程で役割を果たすように思われ、B細胞、マクロファージおよび肥満細胞および好酸球上で見られる。B細胞上では、これはさらなる免疫グロブリン産生および例えば、IgEクラスへのアイソタイプスイッチを抑制するよう機能するように思われる。マクロファージ上では、FcγRIIBは、FcγRIIAを通して媒介される食作用を阻害するように作用する。好酸球および肥満細胞上では、B型はIgEと別の受容体の結合を通してこれらの細胞の活性化を抑制するのを助け得る。FcγRIIAに対する結合減少は、例えば、アミノ酸残基E233~G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292およびK414(Kabat EUインデックスによる番号付け)の少なくとも1つでの突然変異を有するIgG Fc領域を含む抗体について見られる。
- FcγRIII(CD16)は、IgGと中程度~低い親和性で結合し、2つの型として存在する。FcγRIIIAは、NK細胞、マクロファージ、好酸球およびいくつかの単球およびT細胞上で見られ、ADCCを媒介する。FcγRIIIBは、好中球上で高度に発現される。FcγRIIIAへの結合の減少は、例えば、アミノ酸残基E233~G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338およびD376(Kabat EUインデックスによる番号付け)の少なくとも1つでの突然変異を有するIgG Fc領域を含む抗体について見られる。
100×分数X/Y
(式中、Xは、AおよびBのプログラムのアラインメントにおける配列アラインメントプログラムALIGN-2による同一の一致としてスコアリングされるアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である)。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、Bに対するAの%アミノ酸配列同一性は、Aに対するBの%アミノ酸配列同一性と等しくないことが認識されるだろう。別途指定のない限り、本明細書で使用される全ての%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して直前の段落に記載されるように得られる。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
本発明は、製造可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率および減少した毒性などの特に有利な特性を有する新規な二重特異性抗原結合分子を提供する。
(a)抗体軽鎖可変領域(VL)および抗体重鎖可変領域(VH)を含むOX40に特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)抗体軽鎖可変領域(VL)および抗体重鎖可変領域(VH)を含む、上皮細胞接着分子(EpCAM)に特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
一態様では、本発明は、OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号1のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、二重特異性抗原結合分子を提供する。
(i)配列番号4および配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H1、
(ii)配列番号6および配列番号7からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、ならびに
(iii)配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13および配列番号14からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)配列番号15、配列番号16および配列番号17からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L1、
(v)配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、ならびに
(vi)配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25および配列番号26からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L3と
を含むVL
を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHと配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-L2および配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVL、
(b)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHと配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-L2および配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVL、
(c)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHと配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-L2および配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVL、
(d)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHと配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-L2および配列番号24のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVL、
(e)配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHと配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-L2および配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVL、
(f)配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHと配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-L2および配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVL、または
(g)配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHと配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-L2および配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVL
を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号33のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号34のアミノ酸配列を含むVL、
(ii)配列番号35のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号36のアミノ酸配列を含むVL、
(iii)配列番号37のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号38のアミノ酸配列を含むVL、
(iv)配列番号39のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号40のアミノ酸配列を含むVL、
(v)配列番号41のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号42のアミノ酸配列を含むVL、
(vi)配列番号43のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号44のアミノ酸配列を含むVL、または
(vii)配列番号45のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号46のアミノ酸配列を含むVL
を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
(i)アミノ酸配列、配列番号27を含むCDR-H1、
(ii)アミノ酸配列、配列番号28を含むCDR-H2、および
(iii)アミノ酸配列、配列番号29を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)アミノ酸配列、配列番号30を含むCDR-L1、
(v)アミノ酸配列、配列番号31を含むCDR-L2、および
(vi)アミノ酸配列、配列番号32を含むCDR-L3
を含むVLと
を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
一態様では、本発明は、上皮細胞接着分子(EpCAM)に特異的に結合することができる部分が、配列番号49のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、二重特異性抗原結合分子を提供する。
(i)アミノ酸配列、配列番号51を含むCDR-H1、
(ii)アミノ酸配列、配列番号52を含むCDR-H2、および
(iii)アミノ酸配列、配列番号53を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)アミノ酸配列、配列番号54を含むCDR-L1、
(v)アミノ酸配列、配列番号55を含むCDR-L2、および
(vi)アミノ酸配列、配列番号56を含むCDR-L3
を含むVLと
を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
(i)アミノ酸配列、配列番号57を含むCDR-H1、
(ii)アミノ酸配列、配列番号58を含むCDR-H2、および
(iii)アミノ酸配列、配列番号59を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)アミノ酸配列、配列番号60を含むCDR-L1、
(v)アミノ酸配列、配列番号61を含むCDR-L2、および
(vi)アミノ酸配列、配列番号62を含むCDR-L3
を含むVLと
を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、
(i)OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43および配列番号45のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVHと、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44および配列番号46からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVLとを含み、
(ii)EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVHと、配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVLとを含む、
二重特異性抗原結合分子が提供される。
(a)OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号33のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号34のアミノ酸配列を含むVLとを含み、EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号63のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号64のアミノ酸配列を含むVLとを含み、
(b)OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号35のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号36のアミノ酸配列を含むVLとを含み、EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号63のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号64のアミノ酸配列を含むVLとを含み、
(c)OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号37のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号38のアミノ酸配列を含むVLとを含み、EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号63のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号64のアミノ酸配列を含むVLとを含み、
(d)OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号39のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号40のアミノ酸配列を含むVLとを含み、EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号63のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号64のアミノ酸配列を含むVLとを含み、
(e)OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号41のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号42のアミノ酸配列を含むVLとを含み、EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号63のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号64のアミノ酸配列を含むVLとを含み、
(f)OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号43のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号44のアミノ酸配列を含むVLとを含み、EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号63のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号64のアミノ酸配列を含むVLとを含み、
(g)OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号45のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号46のアミノ酸配列を含むVLとを含み、EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号63のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号64のアミノ酸配列を含むVLとを含む、
二重特異性抗原結合分子が提供される。
OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号35のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号36のアミノ酸配列を含むVLとを含み、
EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号63のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号64のアミノ酸配列を含むVLとを含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
(i)OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVHと、配列番号48のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVLとを含み、
(ii)EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号65のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVHと、配列番号66のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVLとを含む、
二重特異性抗原結合分子が提供される。
OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号47のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号48のアミノ酸配列を含むVLとを含み、
EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号65のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号66のアミノ酸配列を含むVLとを含む、
二重特異性抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性抗原結合分子が、OX40について四価であり、EpCAMについて一価である。
(a)Fc領域に接続されたOX40に特異的に結合することができる4つのFab断片と、
(b)Fc領域のC末端に接続された抗体軽鎖可変領域(VL)および抗体重鎖可変領域(VH)を含むEpCAMに特異的に結合することができる部分と
を含む。
(a)OX40に特異的に結合することができる4つのFab断片およびFc領域を含む抗体の2つの軽鎖および2つの重鎖と、
(b)VHが(a)の2つの重鎖の一方のC末端に接続されており、VLが(a)の2つの重鎖の他方のC末端に接続されている、EpCAMに特異的に結合することができる部分のVHおよびVLと
を含む。
(a)各重鎖がOX40に特異的に結合することができるFab断片の2つのVHドメインおよび2つのCH1ドメインならびにFc領域サブユニットとを含む、2つの重鎖と、
(b)各軽鎖がOX40に特異的に結合することができるFab断片のVLおよびCLドメインを含む、4つの軽鎖と、
(c)VHが(a)の2つの重鎖の一方のC末端に接続されており、VLが(a)の2つの重鎖の他方のC末端に接続されている、EpCAMに特異的に結合することができる部分のVHおよびVLと
を含む。
配列番号183のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、
配列番号184のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
各々が配列番号182のアミノ酸配列を含む、4つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
配列番号192のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、
配列番号193のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
各々が配列番号191のアミノ酸配列を含む、4つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
(i)第1のポリペプチド鎖が、アミノ(N)末端からカルボキシル(C)末端方向に、VH(OX40)、CH1、VH(OX40)、CH1、CH2、CH3(Fcノブ)およびVH(EpCAM)を含み、
(ii)第2のポリペプチド鎖が、N末端からC末端方向に、VH(OX40)、CH1、VH(OX40)、CH1、CH2、CH3(Fcホール)およびVL(EpCAM)を含み、
(iii)4つの軽鎖が、N末端からC末端方向に、VL(OX40)およびCLを含む。
(i)第1のポリペプチド鎖が、アミノ(N)末端からカルボキシル(C)末端方向に、VH(OX40)、CH1、VH(OX40)、CH1、CH2、CH3(Fcノブ)およびVL(EpCAM)を含み、
(ii)第2のポリペプチド鎖が、N末端からC末端方向に、VH(OX40)、CH1、VH(OX40)、CH1、CH2、CH3(Fcホール)およびVL(EpCAM)を含み、
(iii)4つの軽鎖が、N末端からC末端方向に、VL(Ox40)およびCLを含む。
一態様では、二重特異性抗原結合分子が、OX40について四価であり、EpCAMについて二価である。
(a)Fc領域に接続されたOX40に特異的に結合することができる4つのFab断片と、
(b)Fc領域のC末端に接続された抗体軽鎖可変領域(VL)および抗体重鎖可変領域(VH)を含むEpCAMに特異的に結合することができる部分と
を含む。
(a)OX40に特異的に結合することができる4つのFab断片およびFc領域を含む、抗体の4つの軽鎖および2つの重鎖と、
(b)Fab断片の一方が(a)の2つの重鎖の一方のC末端に接続されており、Fab断片の他方が(a)の2つの重鎖の他方のC末端に接続されている、EpCAMに特異的に結合することができる2つのFab断片と
を含む。
(a)各重鎖がOX40に特異的に結合することができるFab断片の2つのVHドメインおよび2つのCH1ドメインならびにFc領域サブユニットを含む、2つの重鎖と、
(b)各軽鎖がOX40に特異的に結合することができるFab断片のVLおよびCLドメインを含む、4つの軽鎖と、
(c)Fab断片の一方が(a)の2つの重鎖の一方のC末端に接続されており、Fab断片の他方が(a)の2つの重鎖の他方のC末端に接続されている、EpCAMに特異的に結合することができる2つのFab断片と
を含む。
各々が配列番号186のアミノ酸配列を含む、2つの重鎖と、
各々が配列番号187のアミノ酸配列を含む、2つの軽鎖と、
各々が配列番号185のアミノ酸配列を含む、4つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
(i)第1および第2のポリペプチド鎖が、アミノ(N)末端からカルボキシル(C)末端方向に、VH(OX40)、CH1*、VH(OX40)、CH1*、CH2、CH3、VL(EpCAM)およびCH1を含み、
(ii)4つの軽鎖が、N末端からC末端方向に、VL(OX40)およびCL*を含み、
(iii)2つの軽鎖が、N末端からC末端方向に、VH(EpCAM)およびCLを含み、
CH1*およびCL*が、より良いペアリングを可能にするアミノ酸突然変異を含む。
本発明の種々の態様による実施形態では、二重特異性抗原結合分子が、安定に会合することができる第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFc領域をさらに含む。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Fc領域の2つのサブユニットの一方または他方に融合した、異なる抗原結合部位を含み、よって、Fc領域の2つのサブユニットが2つの非同一ポリペプチド鎖に含まれ得る。これらのポリペプチドの組換え共発現およびその後の二量体化が、2つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせをもたらす。よって、組換え産生における本発明の二重特異性抗体の収率および純度を改善するために、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を、本発明の二重特異性抗原結合分子のFc領域に導入することが有利であるだろう。
一態様では、本発明は、(a)OX40に特異的に結合することができる第1のFab断片と、(b)EpCAMに特異的に結合することができる第2のFab断片と、(c)安定に会合することができる第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFc領域とを含む二重特異性抗原結合分子であって、Fab断片の一方で、可変ドメインVHおよびVL、または定常ドメインCH1およびCLが交換されている、二重特異性抗原結合分子に関する。二重特異性抗体は、Crossmab技術に従って調製される。
本発明はさらに、本明細書に記載される本発明の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、例えば固相ペプチド合成(例えば、Merrifield固相合成)または組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、例えば上記の抗原結合分子またはそのポリペプチド断片をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを単離し、さらなるクローニングおよび/または宿主細胞中での発現のために1つまたは複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドを容易に単離し、慣用的な手順を使用して配列決定することができる。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの1つまたは複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写/翻訳制御シグナルと共に二重特異性抗原結合分子(断片)のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えDNA技術、合成技術およびインビボ組換え/遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatisら、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Laboratory、N.Y.(1989);およびAusubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、N.Y.(1989)に記載される技術を参照されたい。発現ベクターはプラスミド、ウイルスの一部であり得る、または核酸断片であり得る。発現ベクターは、プロモーターおよび/または他の転写もしくは翻訳制御エレメントと動作可能に会合した、二重特異性抗原結合分子またはそのポリペプチド断片(すなわち、コード領域)をコードするポリヌクレオチドをクローニングする発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」(TAG、TGAまたはTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部とみなすことができるが、存在する場合、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5’および3’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。2つ以上のコード領域が単一ポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一ベクター、または別個のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば別個の(異なる)ベクターに存在してもよい。さらに、任意のベクターは単一コード領域を含み得る、または2つ以上のコード領域を含み得る、例えば本発明のベクターは1つまたは複数のポリペプチドをコードすることができ、これがタンパク質分解切断を介して最終タンパク質に翻訳後にまたは翻訳と同時に分離される。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明の二重特異性抗原結合分子もしくはそのポリペプチド断片、またはその変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合したまたは融合していない、異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、限定されないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインなどの特殊エレメントまたはモチーフを含む。動作可能な会合は、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列(複数可)の影響または制御下に置くように1つまたは複数の調節配列と会合している場合である。プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合、および2つのDNA断片間の結合の性質が、発現調節配列が遺伝子産物の発現を指示する能力を妨害もせず、DNA鋳型が転写される能力も妨害しない場合に、2つのDNA断片(ポリペプチドコード領域およびこれと会合したプロモーターなど)が「動作可能に会合されている」。よって、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸の転写を行うことができる場合に、プロモーター領域はその核酸と動作可能に会合されているだろう。プロモーターは、所定の細胞内でのみDNAの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーターに加えて、他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナルをポリヌクレオチドと動作可能に会合させて、細胞特異的転写を指示することができる。
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子を、当技術分野で公知の種々のアッセイによって、その物理的/化学的特性および/または生物活性について、同定、スクリーニングまたは特徴を明らかにすることができる。
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のOX40またはEpCAMに対する親和性を、BIAcore機器(GE Healthcare)などの標準的な計装、および組換え発現によって得ることができるような受容体または標的タンパク質を使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)によって実施例に示される方法に従って決定することができる。一態様によると、KDを、25℃でBIACORE(登録商標)T200機器(GE Healthcare)を使用して表面プラズモン共鳴によって測定する。
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子と対応するOX40および/またはEpCAM発現細胞の結合は、例えばフローサイトメトリー(FACS)によって、特定の受容体または標的抗原を発現する細胞株を使用して評価することができる。一態様では、OX40を発現する新鮮な末梢血単核細胞(PBMC)を結合アッセイに使用する。これらの細胞を、単離直後(ナイーブPMBC)または刺激後(活性化PMBC)に使用する。別の態様では、活性化マウス脾細胞(OX40を発現する)を使用して、本発明の二重特異性抗原結合分子と対応するOX40発現細胞の結合を実証することができる。
一態様では、生物活性を有するEpCAMおよびOX40に結合する二重特異性抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えばOX40を発現する細胞でのOX40を通したアゴニストシグナル伝達が含まれ得る。インビトロでこのような生物活性を有するとしてアッセイによって同定される二重特異性抗原結合分子も提供される。特に、ヒトOX40を発現し、ヒトEpCAM発現腫瘍細胞と共培養されるHela細胞でNF-κB活性化を検出するレポーター細胞アッセイが提供される(例えば、実施例6.1参照)。
さらなる態様では、本発明は、例えば以下の治療方法のいずれかに使用するための、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態では、薬学的組成物が、二重特異性抗原結合分子と、少なくとも1種の薬学的に許容される賦形剤とを含む。別の実施形態では、薬学的組成物が、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のいずれかと、例えば以下に記載される、少なくとも1種の追加の治療剤とを含む。
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のいずれも治療方法に使用され得る。治療方法に使用するために、本発明の抗原結合分子を、優れた医療行為に一致した様式で製剤化、服用および投与することができる。本文脈において検討する因子には、治療している特定の障害、治療している特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュールおよび医師に知られている他の因子が含まれる。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、療法で1種または複数の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも1種の追加の治療剤と共投与され得る。「治療剤」という用語は、このような治療を必要とする個体の症状または疾患を治療するために投与することができる任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療している特定の適応症に適した任意の有効成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含み得る。一定の実施形態では、追加の治療剤が別の抗がん剤である。
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防および/または診断に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器上のまたは容器に結合したラベルまたは添付文書とを含む。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、注射器、IV溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。容器は、単独のあるいは状態を治療、予防および/または診断するのに有効な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針によって穴開け可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る)。組成物中の少なくとも1つの活性剤は本発明の二重特異性抗原結合分子である。
表C. 配列
1.(a)OX40に特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)上皮細胞接着分子(EpCAM)に特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と
を含む二重特異性抗原結合分子。
2.(c)安定に会合することができる第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFc領域
をさらに含む、パラ1に記載の二重特異性抗原結合分子。
3.OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号1のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、パラ1またはパラ2に記載の二重特異性抗原結合分子。
4.EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号49のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、パラ1から3のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
5.OX40に特異的に結合することができる部分が、
(i)配列番号4および配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H1、
(ii)配列番号6および配列番号7からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、ならびに
(iii)配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13および配列番号14からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)配列番号15、配列番号16および配列番号17からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L1、
(v)配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、ならびに
(vi)配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25および配列番号26からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むVLと
を含む、パラ1から4のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
6.OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43および配列番号45からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVHと、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44および配列番号46からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVLとを含む、パラ1から5のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
7.OX40に特異的に結合することができる部分が、
(i)配列番号33のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号34のアミノ酸配列を含むVL、
(ii)配列番号35のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号36のアミノ酸配列を含むVL、
(iii)配列番号37のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号38のアミノ酸配列を含むVL、
(iv)配列番号39のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号40のアミノ酸配列を含むVL、
(v)配列番号41のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号42のアミノ酸配列を含むVL、
(vi)配列番号43のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号44のアミノ酸配列を含むVL、または
(vii)配列番号45のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号46のアミノ酸配列を含むVL
を含む、パラ1から6のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
8.EpCAMに特異的に結合することができる部分が、
(i)アミノ酸配列、配列番号51を含むCDR-H1、
(ii)アミノ酸配列、配列番号52を含むCDR-H2、および
(iii)アミノ酸配列、配列番号53を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)アミノ酸配列、配列番号54を含むCDR-L1、
(v)アミノ酸配列、配列番号55を含むCDR-L2、および
(vi)アミノ酸配列、配列番号56を含むCDR-L3
を含むVLと
を含む、パラ1から7のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
9.EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVHと、配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVLとを含む、パラ1から8のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
10.EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号63のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号64のアミノ酸配列を含むVLとを含む、パラ1から9のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
11.(i)配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43および配列番号45からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、ならびに配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44および配列番号46からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む、OX40に特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(ii)配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む、EpCAMに特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と
を含む、パラ1から10のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
12.(i)配列番号35のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号36のアミノ酸配列を含むVLを含む、OX40に特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(ii)配列番号63のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号64のアミノ酸配列を含むVLを含む、EpCAMに特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と
を含む、パラ1から11のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
13.OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号2のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、パラ1またはパラ2に記載の二重特異性抗原結合分子。
14.EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号50のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、パラ1、2または13のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
15.OX40に特異的に結合することができる部分が、
(i)アミノ酸配列、配列番号27を含むCDR-H1、
(ii)アミノ酸配列、配列番号28を含むCDR-H2、および
(iii)アミノ酸配列、配列番号29を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)アミノ酸配列、配列番号30を含むCDR-L1、
(v)アミノ酸配列、配列番号31を含むCDR-L2、および
(vi)アミノ酸配列、配列番号32を含むCDR-L3
を含むVLと
を含む、パラ1、2、13または14のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
16.OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVHと、配列番号48のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVLとを含む、パラ1、2または13から15のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
17.OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号47のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号48のアミノ酸配列を含むVLとを含む、パラ1、2または13から16のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
18.EpCAMに特異的に結合することができる部分が、
(i)アミノ酸配列、配列番号57を含むCDR-H1、
(ii)アミノ酸配列、配列番号58を含むCDR-H2、および
(iii)アミノ酸配列、配列番号59を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)アミノ酸配列、配列番号60を含むCDR-L1、
(v)アミノ酸配列、配列番号61を含むCDR-L2、および
(vi)アミノ酸配列、配列番号62を含むCDR-L3
を含むVLと
を含む、パラ1、2または13から17のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
19.EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号65のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVHと、配列番号66のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むVLとを含む、パラ1、2または13から18のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
20.EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号65のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号66のアミノ酸配列を含むVLとを含む、パラ1、2または13から19のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
21.(i)配列番号47のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号48のアミノ酸配列を含むVLを含む、OX40に特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(ii)配列番号65のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号66のアミノ酸配列を含むVLを含む、EpCAMに特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と
を含む、パラ1、2または13から20のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
22.Fc領域がIgG、特にIgG1 Fc領域またはIgG4 Fc領域である、パラ2から21のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
23.Fc領域が、Fc受容体に対する抗体の結合親和性および/またはエフェクター機能を減少させる1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、パラ2から22のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
24.Fc領域が、(i)アミノ酸突然変異L234A、L235AおよびP329G(Kabat EUインデックスによる番号付け)を含むヒトIgG1サブクラス、または(ii)アミノ酸突然変異D265AおよびP329G(Kabat EUインデックスによる番号付け)を含むマウスIgG1サブクラスのものである、パラ2から23のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
25.Fc領域が、Fc領域の第1のサブユニットと第2のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、パラ2から24のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
26.ノブ・イントゥ・ホール法に従って、Fc領域の第1のサブユニットがノブを含み、Fc領域の第2のサブユニットがホールを含む、パラ2から25のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
27.(i)Fc領域の第1のサブユニットが、アミノ酸置換S354CおよびT366W(Kabat EUインデックスによる番号付け)を含み、Fc領域の第2のサブユニットが、アミノ酸置換Y349C、T366SおよびY407V(Kabat EUインデックスによる番号付け)を含む、または
(ii)Fc領域の第1のサブユニットが、アミノ酸置換K392DおよびK409D(Kabat EUインデックスによる番号付け)を含み、Fc領域の第2のサブユニットが、アミノ酸置換E356KおよびD399K(Kabat EUインデックスによる番号付け)を含む、
パラ2から26のいずれか1つに記載の二重特異性抗体。
28.(a)Fc領域に接続されたOX40に特異的に結合することができる少なくとも2つのFab断片と、
(b)Fc領域のC末端に接続されたEpCAMに特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と
を含む、パラ1から27のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
29.(a)OX40に特異的に結合することができる2つのFab断片およびFc領域を含む抗体の2つの軽鎖および2つの重鎖と、
(b)EpCAMに特異的に結合することができる部分のVHおよびVLであって、VHが(a)の2つの重鎖の一方のC末端に接続されており、VLが(a)の2つの重鎖の他方のC末端に接続されているVHおよびVLと
を含む、パラ1から28のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
30.(a)OX40に特異的に結合することができる2つのFab断片およびFc領域を含む抗体の2つの軽鎖および2つの重鎖と、
(b)EpCAMに特異的に結合することができる2つのFab断片であって、Fab断片の一方が(a)の2つの重鎖の一方のC末端に接続されており、Fab断片の他方が(a)の2つの重鎖の他方のC末端に接続されている、2つのFab断片と
を含む、パラ1から29のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
31.(a)各重鎖がOX40に特異的に結合することができるFab断片のVHおよびCH1ドメインならびにFc領域サブユニットを含む、2つの重鎖と、
(b)各軽鎖がOX40に特異的に結合することができるFab断片のVLおよびCLドメインを含む、2つの軽鎖と、
(c)EpCAMに特異的に結合することができる部分のVHおよびVLであって、VHが(a)の2つの重鎖の一方のC末端に接続されており、VLが(a)の2つの重鎖の他方のC末端に接続されている、VHおよびVLと
を含む、パラ1から30のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
32.(a)各重鎖がOX40に特異的に結合することができるFab断片のVHおよびCH1ドメインならびにFc領域サブユニットを含む、2つの重鎖と、
(b)各軽鎖がOX40に特異的に結合することができるFab断片のVLおよびCLドメインを含む、2つの軽鎖と、
(c)EpCAMに特異的に結合することができる2つのFab断片であって、Fab断片の一方が(a)の2つの重鎖の一方のC末端に接続されており、Fab断片の他方が(a)の2つの重鎖の他方のC接続に結合している、2つのFab断片と
を含む、パラ1から28またはパラ30のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
33.EpCAMに特異的に結合することができる2つのFab断片が、各々がVL-CH1鎖およびVH-CL鎖を含み、VL-CH1鎖の一方が(a)の2つの重鎖の一方のC末端に接続されており、VL-CH1鎖の他方が(a)の2つの重鎖の他方のC末端に接続されている、クロスオーバーFab断片である、パラ30またはパラ32に記載の二重特異性抗原結合分子。
34.OX40に特異的に結合することができる4つのFab断片を含む、パラ1から33のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
35.(a)の2つの重鎖の各々が、OX40に特異的に結合することができるFab断片の2つのVHドメインおよび2つのCH1ドメインを含む、パラ29から34のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
36.OX40に特異的に結合することができるFab断片の1つまたは複数が、
123位(EU番号付け)のアミノ酸のアルギニン(R)および124位(EU番号付け)のアミノ酸のリジン(K)を含むCLドメインと、
147位(EU番号付け)のアミノ酸のグルタミン酸(E)および213位(EU番号付け)のアミノ酸のグルタミン酸(E)を含むCH1ドメインと
を含む、パラ28から35のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子。
37.配列番号183のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、
配列番号184のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
各々が配列番号182のアミノ酸配列を含む、4つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子。
38.各々が配列番号186のアミノ酸配列を含む、2つの重鎖と、
各々が配列番号187のアミノ酸配列を含む、2つの軽鎖と、
各々が配列番号185のアミノ酸配列を含む、4つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子。
39.配列番号192のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、
配列番号193のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
各々が配列番号191のアミノ酸配列を含む、4つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子。
40.パラ1から39のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
41.パラ40に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
42.パラ40に記載のポリヌクレオチドまたはパラ41に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
43.二重特異性抗原結合分子を作製する方法であって、パラ42に記載の宿主細胞を、二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養することと、二重特異性抗原結合分子を単離することとを含む方法。
44.パラ1から39のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子と、少なくとも1種の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
45.医薬として使用するための、パラ1から39のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ44に記載の薬学的組成物。
46.(i)T細胞応答の刺激、
(ii)活性化T細胞の生存の支持、
(iii)感染症の治療、
(iv)がんの治療、
(v)がんの進行の遅延、または
(vi)がんを患っている患者の生存の延長
に使用するための、パラ1から39のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ44に記載の薬学的組成物。
47.がんの治療に使用するための、パラ1から39のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ44に記載の薬学的組成物。
48.がんを治療するための医薬の製造における、パラ1から39のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ44に記載の薬学的組成物の使用。
49.がんを有する個体を治療する方法であって、有効量のパラ1から39のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ44に記載の薬学的組成物を個体に投与することを含む方法。
50.細胞傷害性T細胞活性を上方制御または延長するのに使用するための、パラ1から39のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ44に記載の薬学的組成物。
51.細胞傷害性T細胞活性を上方制御または延長するための医薬の製造における、パラ1から39のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ44に記載の薬学的組成物の使用。
52.がんを有する個体の細胞傷害性T細胞活性を上方制御または延長する方法であって、有効量のパラ1から39のいずれか1つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ44に記載の薬学的組成物を個体に投与することを含む方法。
Sambrookら、Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、1989に記載されるように、標準的な方法を使用してDNAを操作した。製造業者の指示に従って分子生物学試薬を使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat,E.A.ら、(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、NIH Publication 番号91-3242に示される。
DNA配列を二本鎖配列決定によって決定した。
所望の遺伝子セグメントを、適切な鋳型を使用してPCRによって作製した、または自動化遺伝子合成によって合成オリゴヌクレオチドおよびPCR産物からGeneart AG(Regensburg、ドイツ)によって合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、オリゴヌクレオチドプライマーを最も近いホモログからの配列に基づいて設計し、遺伝子を、適切な組織に由来するRNAからRT-PCRによって単離した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接した遺伝子セグメントを標準的クローニング/配列決定ベクターにクローニングした。プラスミドDNAを形質転換細菌から精製し、濃度をUV分光法によって決定した。サブクローニング遺伝子断片のDNA配列をDNA配列決定によって確認した。遺伝子セグメントを適切な制限部位を用いて設計して、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にした。全てのコンストラクトを、真核細胞中で分泌するためのタンパク質を標的化するリーダーペプチドをコードする5’末端DNA配列を用いて設計した。
タンパク質を、標準的なプロトコルを参照して濾過細胞培養物上清から精製した。手短に述べれば、抗体をプロテインAセファロースカラム(GE healthcare)にアプライし、PBSで洗浄した。抗体の溶出をpH2.8で達成し、引き続いて直ちに試料を中和した。凝集タンパク質を、PBSまたは20mM ヒスチジン、150mM NaCl pH6.0中、サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200、GE Healthcare)によってモノマー抗体から分離した。モノマー抗体画分をプールし、例えばMILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)遠心濃縮機を使用して濃縮し(必要であれば)、冷凍し、-20℃または-80℃で保存した。試料の一部を、例えばSDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)または質量分析によるその後のタンパク質分析および分析特徴づけに供した。
製造業者の指示に従って、NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen)を使用した。特に、10%または4~12%NuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis-TRIS Pre-Castゲル(pH6.4)およびNuPAGE(登録商標)MES(還元ゲル、NuPAGE(登録商標)Antioxidant泳動バッファー添加剤を含む)またはMOPS(非還元ゲル)泳動バッファーを使用した。
抗体の凝集およびオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)をHPLCクロマトグラフィーによって行った。手短に述べれば、プロテインA精製抗体を、Agilent HPLC 1100システムで、300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4、pH7.5中Tosoh TSKゲル G3000SWカラムに、またはDionex HPLC-Systemで2×PBS中Superdex 200カラム(GE Healthcare)にアプライした。溶出タンパク質を、UV吸光度またはピーク面積の積分によって定量化した。BioRad Gel Filtration Standard 151-1901が標準として役立った。
OX40抗体の作製
1.1 抗原の調製、精製および特徴づけ、ならびにファージディスプレイによる新規なOX40バインダーの作製のためのスクリーニングツール
ヒト、マウスまたはカニクイザルOX40の外部ドメイン(表1)をコードするDNA配列を、ノブ上のヒトIgG1重鎖CH2およびCH3ドメインとインフレームでサブクローニングした(Merchantら、Nat Biotechnol(1998)16、677~681)。AcTEVプロテアーゼ切断部位を抗原外部ドメインとヒトIgG1のFcとの間に導入した。指示されたビオチン化用のAviタグを抗原FcノブのC末端に導入した。S354C/T366W突然変異を含む抗原-Fcノブ鎖と、Y349C/T366S/L368A/Y407V突然変異を含むFcホール鎖を組み合わせることによって、OX40外部ドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロ二量体を作製し、よってFc-結合抗原のモノマー型を作り出すことが可能になる(図1)。表1は、種々のOX40外部ドメインのアミノ酸配列を示す。表2は、図1に描かれるモノマー抗原Fc(kih)融合分子のcDNAおよびアミノ酸配列である。
表1.抗原外部ドメイン(ECD)のアミノ酸番号付けおよびその起源
表2. モノマー抗原Fc(kih)融合分子(1つのFcホール鎖と1つの抗原Fcノブ鎖の組み合わせによって作製)のcDNAおよびアミノ酸配列
抗OX40抗体を、3つの異なる一般的ファージディスプライライブラリー:DP88-4(クローン20B7、8H9 1G4および49B4)、一般的軽鎖ライブラリーVk3_20/VH3_23(クローンCLC-563およびCLC-564)およびλ-DP47(クローン17A9)から選択した。
1.10μg/mlの非関連ヒトIgGでコーティングしたmaxisorpプレート上で約1012個のファージミド粒子を事前洗浄して、抗原のFc部分を認識する抗体のライブラリーを枯渇させる、
2.総体積1mlでFcバインダーをさらに枯渇させるために100mM非関連非ビオチン化Fcノブ・イントゥ・ホールコンストラクトの存在下で、非結合ファージミド粒子を100nMビオチン化ヒトOX40と0.5時間インキュベートする、
3.ビオチン化huOX40を捕捉し、4ウェルのニュートラアビジンプレコーティングマイクロタイタープレートに10分間移すことによって結合ファージに特異的に結合させる(ラウンド1および3)、
4.5×PBS/Tween20および5×PBSを使用してそれぞれのウェルを洗浄する、
5.1ウェル当たり250μlの100mM TEA(トリエチルアミン)を添加し10分間置くことによって、ファージ粒子を溶出し、500μl 1M Tris/HCl pH7.4を4つのウェルのプールした溶出液に添加することによって中和する、
6.Fcバインダーを最終的に除去するために、100nMビオチン捕捉Fcノブ・イントゥ・ホールコンストラクトとニュートラアビジンプレコーティングマイクロタイタープレートをインキュベートすることによって、中和溶出液を後洗浄する、
7.対数期の大腸菌(E.coli)TG1細胞を溶出ファージ粒子の上清で再感染させ、ヘルパーファージVCSM13で感染させ、30℃で一晩、振盪機上でインキュベートし、その後ファージミド粒子をPEG/NaCl沈殿させて次の選択ラウンドに使用する。
表3. 一般的ファージディスプレイ抗体ライブラリー(DP88-4)の配列
表4. ライブラリーDP88-4生殖系列鋳型のcDNAおよびアミノ酸配列
表5. DP88-4ライブラリーを作製するために使用したプライマー配列
表6. PCRに使用した一般的ファージディスプレイ抗体一般的軽鎖ライブラリー(Vk3_20/VH3_23)鋳型の配列
表7. 一般的軽鎖ライブラリー(Vk3_20/VH3_23)生殖系列鋳型のcDNAおよびアミノ酸配列
表8. 一般的軽鎖ライブラリー(Vk3_20/VH3_23)を作製するために使用したプライマー配列
表9: PCRに使用した一般的ファージディスプレイλ-DP47ライブラリー(Vl3_19/VH3_23)鋳型の配列
表10. λ-DP47ライブラリー(Vl3_19/VH3_23)生殖系列鋳型のcDNAおよびアミノ酸配列
表11. λ-DP47ライブラリー(Vl3_19/VH3_23)を作製するために使用したプライマー配列
表12. ファージ誘導抗OX40抗体についての可変領域塩基対配列。下線は相補性決定領域(CDR)である。
選択された抗OX40バインダーの重鎖および軽鎖DNA配列の可変領域を、ヒトIgG1の定常重鎖または定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。Pro329Gly、Leu234AlaおよびLeu235Ala突然変異を、国際特許出願公開第2012/130831号に記載される方法に従って、ノブおよびホール重鎖の定常領域に導入してFcγ受容体への結合を抑止した。
表13. P329GLALAヒトIgG1フォーマットにおける抗OX40クローンの配列
OX40および上皮細胞接着分子(EpCAM)を標的化する二重特異性抗体の作製
2.1 ヒトOX40およびヒト上皮細胞接着分子(EpCAM)を標的化する二重特異性抗体の作製
OX40についての四価結合およびEpCAMについての一価結合を有する二重特異性アゴニストOX40コンストラクト(すなわち、「4+1」コンストラクト)を調製した。
表15. 成熟二重特異性、四価抗OX40、一価および二価抗EpCAM huIgG1 P329GLALA分子の塩基対配列
表16. 成熟二重特異性、四価抗OX40、一価および二価抗EpCAM huIgG1 P329GLALA分子のアミノ酸配列
マウスOX40についての四価結合およびマウスEpCAMについての一価結合を有する二重特異性コンストラクト(すなわち、「4+1」コンストラクト)も調製した。
表17. 成熟二重特異性、四価抗muOX40、一価抗muEpCAM huIgG1 DAPG kih 4+1分子の塩基対配列
表18. 成熟二重特異性、四価抗muOX40、一価抗muEpCAM muIgG1 DAPG kih 4+1分子のアミノ酸配列
表19. 二重特異性、四価抗OX40、抗EpCAM IgG1 4+1および4+2コンストラクトの生化学分析
全てのフォーマットを直接比較するために、静的光散乱(SLS)および印加した温度応力に応じた固有タンパク質蛍光を測定することによって、熱安定性を監視した。1mg/mlのタンパク質濃度の30μgの濾過タンパク質試料を2連でOptim 2機器(Avacta Analytical Ltd)に適用した。温度を0.1℃/分で25℃から85℃に傾斜して、半径および総散乱強度を回収した。固有タンパク質蛍光を決定するために、試料を266nmで励起させ、発光を275nm~460nmで回収した。
表20. 二重特異性、抗OX40、抗EpCAM 4+1および4+2コンストラクトについての凝集温度
マウスOX40およびマウス上皮細胞接着分子(EpCAM)を標的化する二重特異性抗体の結合
3.1 マウスOX40発現細胞:ナイーブ脾細胞および活性化脾細胞への結合の分析
マウス脾臓をC57Bl/6雌マウスから得て、3mL DPBSに回収した。注射器の背面を使用して70μm細胞ストレーナー上で脾臓をすりつぶすことによって、単一細胞懸濁物を作製した。10%熱不活性化ウシ胎児血清(Gibcoカタログ番号16140-071、ロット番号1797306A)、1%(v/v)GlutaMAXI(GIBCO by Life Tehnologies、カタログ番号35050038)、1mMピルビン酸ナトリウム(SIGMA、カタログ番号S8636)、1%(v/v)非必須アミノ酸(SIGMA、カタログ番号M7145)および50μM β-メルカプトエタノール(SIGMA、M3148)を補足したRPMI 1640培地(Gibco by Life Technology、カタログ番号42401-042)からなる10mlのT細胞培地でフィルターを洗浄し、細胞を350×gで4℃で7分間遠心分離した。遠心分離後、細胞ペレットを6mlの1×溶解バッファー(BD Pharm Lyse(商標):濃縮(10×)塩化アンモニア系溶解試薬、BD Biosciences、カタログ番号555899)に再懸濁し、室温で3分間インキュベートした。10mlのT細胞培地を添加することによって、赤血球溶解を停止した。細胞をX-Vivo 15培地(Lonza、カタログ番号04-744Q)で1回洗浄し、10mlのX-Vivo 15培地に再懸濁し、70μm細胞ストレーナーを通して濾過してデブリを除去した。
マウスEpCAMを安定的に発現するマウスEpCAM陽性CT26muEpCAM cl25細胞を使用して、細胞表面マウスEpCAMへの結合を分析した。マウスFAPを安定的に発現するmuEpCAM陰性細胞株CT26muFAPへの結合を決定することによって、結合の特異性を分析した。
表21. 抗マウスOX40、抗マウスEpCAM抗原結合分子とマウスOX40またはマウスEpCAMを発現する細胞の結合についてのEC50値
マウスOX40およびマウスEpCAMを標的化する二重特異性抗原結合分子の生物活性
4.1 最適以下TCR誘因マウス脾細胞のOX40媒介共刺激および細胞表面マウスEpCAMによる超架橋
マウスEpCAM標的化四価抗OX40抗原結合分子が静止マウス脾細胞の最適以下TCR刺激をレスキューする能力を分析した。CT26muEpCAM cl25細胞を、抗体を架橋するアッセイに使用した。
ヒトOX40およびヒト上皮細胞接着分子(EpCAM)を標的化する二重特異性抗体の結合
5.1 ヒトOX40発現細胞:ナイーブPBMCおよび活性化PBMCへの結合の分析
バフィーコートをチューリッヒ献血センターから得た。新鮮な末梢血単核細胞(PBMC)を単離するために、バフィーコートを等体積のDPBS(Gibco by Life Technologies、カタログ番号14190326)で希釈した。50mLポリプロピレン遠心管(TPP、カタログ番号91050)に、15mLのHistopaque 1077(SIGMA Life Science、カタログ番号10771、ポリスクロースおよびジアトリゾ酸ナトリウム、密度1.077g/mLに調整)を供給し、バフィーコート溶液をHistopaque 1077の上に積層した。管を、低加速で中断なしに、室温で、400×gで30分間遠心分離した。その後、PBMCを中間相から回収し、DPBSで3回洗浄し、10%ウシ胎児血清(FBS、Gibco by Life Technology、カタログ番号16000-044、ロット941273、ガンマ線照射、マイコプラズマフリー、56℃で35分間熱不活性化)、1%(v/v)GlutaMAX I(GIBCO by Life Technologies、カタログ番号35050038)、1mMピルビン酸ナトリウム(SIGMA、カタログ番号S8636)、1%(v/v)MEM非必須アミノ酸(SIGMA、カタログ番号M7145)および50μM β-メルカプトエタノール(SIGMA、M3148)を補足したRPMI 1640培地(Gibco by Life Technology、カタログ番号42401-042)からなるT細胞培地に再懸濁した。
huEpCAM陽性KATO-III細胞(ATCC HTB-103)を使用して、二重特異性抗ヒトOX40、抗ヒトEpCAM抗原結合分子が細胞表面で発現されたヒトEpCAMに結合する能力を分析した。ヒトEpCAM陰性細胞株A549 NucLight Red(Essen Bioscienceカタログ番号4491)への結合を分析することによって、結合の特異性を決定した。A549細胞は赤色タンパク質を発現し、KATO-IIIとA549 NLR細胞を識別するのを可能にした。
表22. 抗ヒトOX40、抗ヒトEpCAM抗原結合分子とヒトOX40またはヒトEpCAMを発現する細胞の結合についてのEC50値
ヒトOX40およびヒトEpCAMを標的化する二重特異性抗原結合分子の生物活性
6.1 ヒトOX40およびレポーター遺伝子NF-κB-ルシフェラーゼを発現するHeLa細胞
Ox40とそのリガンドのアゴニスト結合は、核因子κB(NFκB)の活性化を介して下流シグナル伝達を誘導する(A.D.Weinbergら、J.Leukoc.Biol.2004、75(6)、962~972)。その表面上でヒトOX40を発現する組換えレポーター細胞株HeLa_huOX40_NFκB_Luc1を作製した。この細胞株は、NFκB感受性エンハンサーセグメントの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドを抱える。OX40の結合および活性化はNFκBの用量依存性活性化を誘導し、次いでNFκBが核に移行し、ここでレポータープラスミドのNFκB感受性エンハンサーに結合して、ルシフェラーゼタンパク質の発現を増加させる。ルシフェラーゼは、ルシフェリン酸化を触媒して、オキシルシフェリンをもたらし、これが発光する。ルミノメーターを使用して光を検出および定量化することができる。よって、HeLa_huOX40_NFkB_Luc1レポーター細胞を使用して、抗OX40分子がNFκB活性化を誘導する能力を生理活性の尺度として分析することができる。
図6.1および図10に示されるように、huEpCAM+腫瘍細胞の添加は、OX40受容体の強力なオリゴマー化を提供することによって、huEpCAM標的化四価抗OX40抗原結合分子により、ヒトOX40陽性レポーター細胞株でNFκB活性化を強力に増加させることができる。EpCAM標的化四価抗OX40抗原結合分子を、ヒトEpCAM発現KATO-IIIまたはNIH/3T3huEpCAMクローン44細胞の存在下で、静止ヒトPBMCの最適以下TCR刺激をレスキューするその能力について分析した。
Claims (22)
- (a)抗体軽鎖可変領域(VL)および抗体重鎖可変領域(VH)を含むOX40に特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)抗体軽鎖可変領域(VL)および抗体重鎖可変領域(VH)を含む上皮細胞接着分子(EpCAM)に特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(c)第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFc領域と
を含み、
(I)
OX40に特異的に結合することができる部分が、
(i)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-H1、
(ii)配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-H2、および
(iii)配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-L1、
(v)配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および
(vi)配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むVLとを含み、且つ
EpCAMに特異的に結合することができる少なくとも1つの部分が、
(i)配列番号51のアミノ酸配列を含むCDR-H1、
(ii)配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR-H2、および
(iii)配列番号53のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)配列番号54のアミノ酸配列を含むCDR-L1、
(v)配列番号55のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および
(vi)配列番号56のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むVLと
を含む、又は、
(II)
OX40に特異的に結合することができる部分が、
(i)配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR-H1、
(ii)配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-H2、および
(iii)配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR-L1、
(v)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および
(vi)配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むVLと
を含み、且つ、
EpCAMに特異的に結合することができる少なくとも1つの部分が、
(i)配列番号57のアミノ酸配列を含むCDR-H1、
(ii)配列番号58のアミノ酸配列を含むCDR-H2、および
(iii)配列番号59のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)配列番号60のアミノ酸配列を含むCDR-L1、
(v)配列番号61のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および
(vi)配列番号62のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むVLと
を含み、
OX40に特異的に結合することができる部分のVHが、配列番号35のアミノ酸配列を含み、且つOX40に特異的に結合することができる部分のVLが、配列番号36のアミノ酸配列を含むか、または、
OX40に特異的に結合することができる部分のVHが、配列番号47のアミノ酸配列を含み、且つOX40に特異的に結合することができる部分のVLが、配列番号48のアミノ酸配列を含み、且つ、
EpCAMに特異的に結合することができる部分のVHが、配列番号63のアミノ酸配列を含み、且つEpCAMに特異的に結合することができる部分のVLが、配列番号64のアミノ酸配列を含むか、または、
EpCAMに特異的に結合することができる部分のVHが、配列番号65のアミノ酸配列を含み、且つEpCAMに特異的に結合することができる部分のVLが、配列番号66のアミノ酸配列を含み、
Fc領域の第1のサブユニットが、アミノ酸置換S354CおよびT366W(Kabat EUインデックスによる番号付け)を含み、且つFc領域の第2のサブユニットが、アミノ酸置換Y349C、T366SおよびY407V(Kabat EUインデックスによる番号付け)を含むか、または、
Fc領域の第1のサブユニットが、アミノ酸置換K392DおよびK409D(Kabat EUインデックスによる番号付け)を含み、且つFc領域の第2のサブユニットが、アミノ酸置換E356KおよびD399K(Kabat EUインデックスによる番号付け)を含む、
二重特異性抗原結合分子。 - OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号1のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、請求項1に記載の二重特異性抗原結合分子。
- EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号49のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、請求項1または2に記載の二重特異性抗原結合分子。
- OX40に特異的に結合することができる部分が、
(i)配列番号35のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号36のアミノ酸配列を含むVL、
を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。 - EpCAMに特異的に結合することができる部分が、
(i)配列番号51のアミノ酸配列を含むCDR-H1、
(ii)配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR-H2、および
(iii)配列番号53のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)配列番号54のアミノ酸配列を含むCDR-L1、
(v)配列番号55のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および
(vi)配列番号56のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むVLと
を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。 - (i)配列番号35のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号36のアミノ酸配列を含むVLを含む、OX40に特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(ii)配列番号63のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号64のアミノ酸配列を含むVLを含む、EpCAMに特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と
を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。 - OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号2のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、請求項1に記載の二重特異性抗原結合分子。
- EpCAMに特異的に結合することができる部分が、配列番号50のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、請求項7に記載の二重特異性抗原結合分子。
- OX40に特異的に結合することができる部分が、
(i)配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR-H1、
(ii)配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR-H2、および
(iii)配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR-L1、
(v)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および
(vi)配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むVLと
を含む、請求項1、7および8のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。 - EpCAMに特異的に結合することができる部分が、
(i)配列番号57のアミノ酸配列を含むCDR-H1、
(ii)配列番号58のアミノ酸配列を含むCDR-H2、および
(iii)配列番号59のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)配列番号60のアミノ酸配列を含むCDR-L1、
(v)配列番号61のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および
(vi)配列番号62のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むVLと
を含む、請求項1、および7から9のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。 - Fc領域が、(i)アミノ酸突然変異L234A、L235AおよびP329G(Kabat EUインデックスによる番号付け)を有するヒトIgG1サブクラス、または(ii)アミノ酸突然変異D265AおよびP329G(Kabat EUインデックスによる番号付け)を有するマウスIgG1サブクラスのものである、請求項1から10のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項12に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項12に記載のポリヌクレオチドまたは請求項13に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 二重特異性抗原結合分子を作製する方法であって、請求項14に記載の宿主細胞を、二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養することと、二重特異性抗原結合分子を単離することとを含む方法。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子と、少なくとも1種の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
- 医薬として使用するための、請求項1から11のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項16に記載の薬学的組成物。
- (i)T細胞応答の刺激、
(ii)活性化T細胞の生存の支持、
(iii)感染症の治療、
(iv)がんの治療、
(v)がんの進行の遅延、または
(vi)がんを患っている患者の生存の延長
における使用のための、請求項1から11のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項16に記載の薬学的組成物。 - がんの治療における使用のための、請求項1から11のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項16に記載の薬学的組成物。
- がんを治療するための医薬の製造における、請求項1から11のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項16に記載の薬学的組成物の使用。
- 有効量の請求項1から11のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項16に記載の薬学的組成物を含む、がんを有する個体を治療するための医薬。
- 有効量の請求項1から11のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項16に記載の薬学的組成物を含む、がんを有する個体における細胞傷害性T細胞活性を上方制御または延長するための剤。
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