ES2774337T3

ES2774337T3 - Método para fabricación de moléculas heterodímeras Fc de anticuerpos utilizando efectos de conducción electrostática

Info

Publication number: ES2774337T3
Application number: ES15187984T
Authority: ES
Inventors: Gunasekaran Kannan; Michael Wittekind
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2008-01-07
Filing date: 2009-01-06
Publication date: 2020-07-20
Anticipated expiration: 2029-01-06
Also published as: PL2235064T3; ES2563027T3; AU2009204501B2; JP2018138035A; JP2011508604A; CA2709847A1; CY1117162T1; EP3061770B1; EP3061770A1; JP2016093175A; HUE028536T2; JP6157046B2; EP2235064B1; EP2235064A1; JP6703560B2; JP6328087B2; DK2235064T3; EP3663318A1; US20140024111A1; PT2235064E

Abstract

Una célula hospedadora in vitro para la preparación de una proteína heterodímera, comprendiendo dicha célula hospedadora un ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que contiene CH3 de IgG y un ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido que contiene CH3 de IgG, en la cual dicho primer polipéptido que contiene CH3 de IgG comprende la sustitución de los aminoácidos en las posiciones 392 y 409 o en las posiciones 370, 392 y 409 con un aminoácido cargado negativamente, y dicho segundo polipéptido que contiene CH3 de IgG comprende la sustitución de los aminoácidos en las posiciones 356 y 399 o en las posiciones 356, 357 y 399 con un aminoácido de carga positiva.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para fabricación de moléculas heterodímeras Fc de anticuerpos utilizando efectos de conducción electrostática.

ANTECEDENTES

Los anticuerpos se han convertido en la modalidad de elección en la industria biofarmacéutica debido a que poseen varias características que son atractivas para quienes desarrollan moléculas terapéuticas. Junto con la posibilidad de direccionar estructuras o células específicas, los anticuerpos hacen su diana susceptible de fagocitosis y destrucción mediada por receptores celulares Fc (Raghavan y Bjorkman 1996). Adicionalmente, la capacidad del anticuerpo para interaccionar con el receptor Fc neonatal (FcRn) de manera dependiente del pH le confiere una semivida prolongada en suero (Ghetie y Ward 2000). Esta característica singular de los anticuerpos permite extender la semivida de la proteína o péptido terapéutico en el suero mediante el diseño de moléculas de fusión de Fc.

Los anticuerpos pertenecen a la clase de proteínas inmunoglobulina que incluye IgG, IgA, IgE, IgM, e IgD. La clase de inmunoglobulinas más abundante en el suero humano es IgG, cuya estructura esquemática se muestra en la Figura 1 (Deisenhofer 1981, Huber 1984; Roux 1999). La estructura de IgG tiene 4 cadenas, 2 cadenas ligeras y 2 pesadas; cada cadena ligera tiene 2 dominios y cada cadena pesada tiene 4 dominios. El sitio de fijación de antígeno está localizado en la región Fab (Fragmento de fijación de antígeno) que contiene un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio variable de cadena pesada (VH) así como dominios constantes de cadena ligera (LC) y de cadena pesada (CH1). La región de dominio CH2 y CH3 de la cadena pesada se conoce como Fc (Fragmento cristalizable). La molécula IgG puede considerarse como un heterotetrámero que tiene dos cadenas pesadas que se mantienen unidas por enlaces disulfuro (-S-S-) en la región bisagra y dos cadenas ligeras. El número de enlaces disulfuro de la bisagra varía entre las subclases de inmunoglobulina (Papadea y Check 1989). El sitio de fijación de FcRn está localizado en la región Fc del anticuerpo (Martin, West et al. 2001), y por tanto la propiedad de semivida prolongada en suero del anticuerpo está retenida en el fragmento Fc. La región Fc sola puede considerarse como un homodímero de cadenas pesadas que comprende los dominios CH2 y CH3.

En ciertos casos, es deseable crear una molécula que contiene la porción Fc de un anticuerpo pero comprende un heterodímero. Una aplicación importante de moléculas Fc heterodímeras es la generación de anticuerpos biespecíficos (BsAbs). El término anticuerpo biespecíficos se refiere a anticuerpos que tienen especificidades para al menos dos antígenos diferentes (Nolan y O'Kennedy 1990; Leij, Molema et al. 1998, Carter 2001). En lugar de tener secuencia idéntica en ambos Fabs, los anticuerpos biespecíficos llevan secuencias diferentes en los dos Fabs de tal modo que cada rama de la molécula en forma de Y puede fijarse a antígenos diferentes. El documento WO 2007/110205 describe una proteína de múltiples dominios diseñada que incluye al menos dos dominios diseñados no idénticos, cada uno de los cuales contiene una interfaz de interacción proteína-proteína que contiene segmentos de la secuencia de aminoácidos derivados de dos o más dominios progenitores homólogos existentes, con lo que se confieren a los dominios diseñados unas especificidades de ensamblaje distintas a las especificidades de ensamblaje de los dominios progenitores.

El uso de anticuerpos biespecíficos para inmunoterapia del cáncer ha sido revisado extensamente en la bibliografía (véase por ejemplo (Nolan y O'Kennedy 1990; de Leij, Molema et al. 1998, Carter 2001)). Por tener la posibilidad de fijarse a dos epítopos o moléculas diferentes, los BsAbs proporcionan medios tanto para disparar una célula efectora inmune como para fijar un antígeno de superficie en una célula tumoral diana. Esto contribuye a hacer uso del sistema inmunitario para destruir las células del cáncer. Otras aplicaciones de anticuerpos biespecíficos se abarcan extensamente en las patentes U.S. Nos. 5.731.168 y 7.183.076.

El método clásico de producción de BsAbs por co-expresión de dos IgGs diferentes en hibridomas híbridos conduce a hasta 10 combinaciones posibles de cadenas pesada y ligera. Esto pone en compromiso el rendimiento e impone un reto de purificación. Carter y colaboradores han diseñado cadenas pesadas para heterodimerización utilizando una estrategia de "botones-en-ojales" (Ridgway, Presta et al. 1996; Atwell, Ridgway et al. 1997; Merchant, Zhu et al.

1998; Carter 2001). El concepto botones-en-ojales fue propuesto originalmente por Crick como modelo para empa quetamiento de cadenas laterales de aminoácidos entre hélices a adyacentes (Crick 1952). Carter y colaboradores crearon un botón en la interfaz del dominio CH3 de la primera cadena por reemplazamiento de una cadena lateral de aminoácido más pequeña con una mayor (por ejemplo, T366Y); y se creó un ojal en la posición yuxtapuesta en la interfaz CH3 de la segunda cadena por reemplazamiento de una cadena lateral de aminoácido mayor en una región mayor con una más pequeña (por ejemplo, Y407T). La base para la creación de botón y ojal en las posiciones yux tapuestas es que la interacción botón y ojal favorecerá la formación de heterodímeros, mientras que la interacción botón-botón y la ojal-ojal dificultarán la formación de homodímeros debido a impedimento estérico y deleción de interacciones favorables, respectivamente. Las mutaciones de botones-en-ojales se combinaron también con el diseño de enlaces disulfuro inter-dominios CH3 para aumentar la formación de heterodímeros (Sowdhamini. Srinivasan et al. 1989; Atwell, Ridgway et al. 1997). Además de estas mutaciones, la ratio de DNA de entrada se modificó también para maximizar el rendimiento (Merchant, Zhu et al. 1998). La técnica de "botones-en-ojales" se describe en las Patentes U.S. Nos. 5.731.168 y 7.183.076. La remodelización de la interfaz de los dominios basada en mutacio nes estéricamente complementarias o enlaces de disulfuro entre las cadenas puede facilitar la producción de un heterodímero que sea un diacuerpo funcional (Zhu Z et al: "Remodeling domain interfaces to enhance heterodimer formation", Protein Science, Wiley, EE. UU., vol. 6, n° 4, 1 de abril de 1997, páginas 781-788).

La electrostática desempeña un papel principal a la hora de definir los mecanismos de la formación de complejos proteína-proteína, reconocimientos moleculares, estabilidades térmicas, adaptabilidades conformacionales y movimientos de las proteínas (Sinha Neeti et al: "Electrostatics in protein binding and function", Current Protein and Peptide Science, Bentham Science Publishers, Países Bajos, vol. 3, n° 6, 1 de diciembre de 2002, páginas 601 614).

SUMARIO

La presente invención proporciona una célula hospedadora in vitro para la preparación de una proteína heterodímera. La célula hospedadora comprende un ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que contiene CH3 de IgG y un ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido que contiene CH3 de IgG, en la cual dicho primer polipéptido que contiene CH3 de IgG comprende la sustitución de los aminoácidos en las posiciones 392 y 409 o en las posiciones 370, 392 y 409 con un aminoácido cargado negativamente, y dicho segundo polipéptido que contiene CH3 de IgG comprende la sustitución de los aminoácidos en las posiciones 356 y 399 o en las posiciones 356, 357 y 399 con un aminoácido cargado positivamente.

La célula hospedadora in vitro que comprende ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos que contienen los CH3 de IgG primero y segundo puede ser cultivada de tal modo que los polipéptidos son co-expresados por la célula. Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos que contienen el primer CH3 de IgG y el segundo CH3 de IgG pueden ser proporcionados a la célula hospedadora en cierta ratio, por ejemplo 1:1, 1:2, 2:1, 1:3, 3:1, 1:4, 4:1, 1:5, 5:1, 1:6, 6:1, 1:7,7:1, 1:8, 8:1, 1:9,9:1, 1:10, 10:1. Se contempla que la alteración de la ratio de ácidos nucleicos puede aumentar la producción de moléculas heterodímeras frente a moléculas homodímeras.

Las moléculas heterodímeras pueden purificarse a partir del cultivo de células hospedadoras utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, cuando la proteína heterodímera comprende un Fc, la proteína puede purificarse utilizando una columna de Proteína A. Las técnicas de purificación incluyen, pero sin carácter limitante, métodos cromatográficos tales como cromatografía de exclusión de tamaños, de intercambio iónico y basada en afinidad, y ultracentrifugación.

Las moléculas heterodímeras comprenden un primer polipéptido que contiene CH3 de IgG y un segundo polipéptido que contiene CH3 de IgG que se encuentran juntos para formar una interfaz diseñada con el fin de propiciar la formación del heterodímero. El primer polipéptido que contiene CH3 de IgG y el segundo polipéptido que contiene CH3 de IgG se diseñan, tal como se reivindica, para que comprendan aminoácidos cargados dentro de la interfaz que son electrostáticamente desfavorables para la formación de homodímeros pero electrostáticamente favorables para la formación de heterodímeros.

En ciertas realizaciones, el polipéptido que contiene CH3 de IgG comprende una región Fc de IgG, derivada preferiblemente de una región Fc de IgG humana de tipo salvaje. Por Fc de IgG humana "tipo salvaje" se entiende una secuencia de aminoácidos que existe naturalmente en la población humana. Por supuesto, del mismo modo que la secuencia Fc puede variar ligeramente entre individuos, pueden hacerse una o más alteraciones en una secuencia de tipo salvaje y permanecer todavía dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, la región Fc puede contener alteraciones adicionales que no están relacionadas con la presente invención, tales como una mutación en un sitio de glicosilación, inclusión de un aminoácido no natural, o una mutación de "botones-en-ojales".

El polipéptido que contiene la región CH3 es una molécula de IgG y puede contener adicionalmente un dominio CH1 y CH2. Secuencias ilustrativas de IgG humana comprenden las regiones constantes de IgG 1 (v.g., SEQ ID NO:3; CH1 = aminoácidos 1-98, CH2 = aminoácidos 111-223, CH3 = 224-330), IgG2 (v.g., S^eQ ID NO:4; CH1 = aminoácidos 1-94, CH2 = aminoácidos 111-219, CH3 =220-326), IgG3 (v.g., s Eq ID nO:5; CH1 = aminoácidos 1-98, CH2 = aminoácidos 161-270, CH3 = 271-377), e IgG4 (v.g., SEQ ID NO:6; CH1 = aminoácidos 1-98, CH2 = aminoácidos 111-220, CH3 = 221-327). Los expertos en la técnica pueden diferir en su comprensión de los aminoácidos exactos que corresponden a los diversos dominios de la molécula IgG. Así, el término N o el término C de los dominios arriba reseñados pueden prolongarse o acortarse en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o incluso 10 aminoácidos. Téngase también en cuenta que el esquema de numeración utilizado en este caso para designar los dominios difiere del esquema de numeración EU de Kabat que se utiliza en el resto de esta solicitud de patente. Por ejemplo, IgG1 "CH3 = 224-230" corresponde a "CH3 = 341 -447" en el esquema de numeración EU.

La región Fc puede estar comprendida también dentro de la región constante de una cadena pesada IgA (v.g., SEQ ID NO:7), IgD (v.g., SEQ ID NO:8), IgE (v.g., SEQ ID NO:9), e IgM (v.g., SEQ ID NO: 10).

El polipéptido que contiene la región CH3 puede ser una cadena pesada de anticuerpo y la célula hospedadora puede expresar adicionalmente una o más cadenas ligeras de anticuerpo. En realizaciones en las que se co expresan más de una cadena pesada y cadenas ligeras (v.g., anticuerpo bivalente), cada cadena pesada puede comprender una mutación en la región CH1 y cada cadena ligera puede comprender una mutación en la región constante para fijarse preferentemente una a otra, pero no se une a la otra cadena ligera o pesada, respectivamente.

Tales mutaciones implican alteración de la carga de uno o más aminoácidos en la interfaz entre la región CH1 y la región constante de una cadena ligera.

Realizaciones preferidas de la invención incluyen, pero sin carácter limitante, un anticuerpo, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo monoespecífico monovalente, un maxicuerpo biespecífico (maxicuerpo se refiere a scFv-Fc), un monocuerpo, un pepticuerpo, un pepticuerpo biespecífico, un pepticuerpo monovalente (un péptido fusionado a una rama de una molécula Fc heterodímera), y una proteína de fusión receptor-Fc. Véase FIG. 2.

Ejemplos de células hospedadoras de mamífero que pueden utilizarse incluyen, pero sin carácter limitante, CHO, 293, y linajes de células de mieloma. La célula hospedadora puede ser también levadura o un procariota, tal como E. coli.

Tal como se describe en la presente, las proteínas heterodímeras pueden ser particularmente útiles en composiciones terapéuticas. Puede formularse una proteína heterodímera en una composición que incluye uno o más tampones o excipientes farmacéuticamente aceptables. Tal como se describe en la presente, dichas composiciones terapéuticas pueden administrarse a un individuo para tratar una enfermedad o puede administrarse para prevenir una enfermedad o prevenir el progreso de los síntomas de una enfermedad.

La presente invención proporciona una célula hospedadora in vitro para producir una proteína heterodímera, com prendiendo dicha célula hospedadora un ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que contiene CH3 de IgG y un ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido que contiene CH3 de IgG, donde dicho primer polipéptido que contiene CH3 de IgG comprende la sustitución de los aminoácidos en las posiciones 392 y 409 o en las posicio nes 370, 392 y 409 con un aminoácido cargado negativamente, y dicho segundo polipéptido que contiene CH3 de IgG comprende la sustitución de los aminoácidos en las posiciones 356 y 399 o en las posiciones 356, 357 y 399 con un aminoácido cargado positivamente.

El aminoácido cargado negativamente puede ser ácido aspártico.

El aminoácido cargado positivamente puede ser lisina.

La proteína heterodímera puede comprender una región Fc de IgG humana.

La región Fc de IgG humana puede comprender una región Fc de IgG1, una región Fc de IgG2, una región Fc de IgG3 o una región Fc de IgG4.

El primer y/o segundo polipéptido que contiene CH3 de IgG puede ser una cadena pesada de anticuerpo.

La proteína heterodímera puede comprender adicionalmente una o más cadenas ligeras de anticuerpo.

La proteína heterodímera se puede seleccionar del grupo constituido por un anticuerpo, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo monoespecífico monovalente, un maxicuerpo biespecífico, un monocuerpo, un pepticuerpo, un pepti cuerpo biespecífico, un pepticuerpo monovalente, y una proteína de fusión de receptores.

La célula hospedadora puede ser una célula hospedadora de mamífero y opcionalmente la célula hospedadora de mamífero puede ser una línea celular de ovario de hámster chino (CHO).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Diagrama esquemático del anticuerpo IgG 1 con los dominios indicados. El anticuerpo IgG 1 es un tetrámero en forma de Y con dos cadenas pesadas (longitud mayor) y dos cadenas ligeras (longitud menor). Las dos cadenas pesadas están unidas por enlaces disulfuro (-S-S-) en la región bisagra. Fab - fragmento de fijación de antígeno, Fc - fragmento cristalizable, VL - dominio variable de cadena ligera, VH - dominio variable de cadena pesada, CL - dominio constante (sin variación de secuencia) de cadena ligera, CH1 -dominio constante 1 de cadena pesada, CH2 - dominio constante 2 de cadena pesada, CH3 - dominio constante 3 de cadena pesada.

Figura 2. La figura representa algunas de las realizaciones que incluyen moléculas Fc heterodímeras. Éstas incluyen anticuerpos biespecíficos (que tienen especificidad para dos o más antígenos) hasta moléculas de fusión receptor-Fc. Preferiblemente, el Fc retiene su capacidad para interaccionar con el receptor FcRn, incluso sin los dominios Fab, conduciendo a una semivida en suero más larga para proteínas/dominios que están fusionados a las cadenas pesadas Fc, scFv - fragmento variable monocatenario, Pep. - pepticuerpo, A y B representa proteínas o receptores o dominios.

Figura 3. Se representa la estructura de interfaz de dominio CH3 con residuos implicados en la interacción dominio-dominio. Los residuos de interfaz se identificaron utilizando un método de punto de corte por distancia. Los residuos estructuralmente conservados y ocultos (área de superficie accesible al disolvente < 10%) se representan en el modelo de puntos y rayas. Los residuos expuestos al disolvente o no conservados estructuralmente se muestran en la representación de rayas. El análisis está basado en la estructura cristalina de IgG 1 (código PDB: 1L6X) que está determinada a alta resolución (1,65 Á) (Idusogie, Presta et al., 2000).

Figura 4. Comparación de secuencias de subclases IgG de (a) humana y (b) de ratón. Únicamente se mues tra la secuencia de cadena pesada correspondiente al dominio CH3. El asterisco (*) indica las posiciones de residuos implicados en la interacción de dominios CH3-CH3 identificada basada en la estructura cristalina del Fc de IgG 1 humana (1L6X). Las posiciones marcadas con rectángulos son residuos preferidos para muta ción a fin de aumentar la formación de heterodímeros. Puede observarse aquí que los residuos cargados es tán muy conservados entre las IgGs. (c) Comparación de secuencias de dominio CH3 de otras clases de anticuerpos (IgA, IgE, IgD, e IgM). Las posiciones de los residuos de interfaz (indicadas por "*") en (b) y (c) se identificaron basándose en comparación de secuencia con la secuencia Hu IgG 1 que se muestra también. En (a), las secuencias derivadas de IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4 humanas corresponden a SEQ ID NO:11, SEQ ID ⁿO:12, SEQ ID NO:13, y SEQ ID NO: 14, respectivamente. En (b), las secuencias derivadas de IgG1 huma na, IgG1 de ratón, IgG2a de ratón, IgG2b de ratón, e IgG3 de ratón corresponden a SEQ ID NO: 15, SEQ ID nO:16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:18, y SEQ ID NO: 19, respectivamente. En (c), las secuencias derivadas de IgG1 humana, IgA humana, IgE humana, IgD humana, e IgM humana corresponden a SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, y SEQ ID NO:24, respectivamente.

Figura 5. Estructura cristalina del homodímero del dominio CH3 con un dominio que se muestra en represen tación de cinta y el otro dominio representado en modelo de hilo. Los residuos Lys409 (Lys409' en el segundo dominio) y Asp399 (Asp399' en el segundo) se representan en modelo de puntos y rayas a fin de ilustrar cada interacción por pares se representan dos veces en la estructura. Esto es debido a la simetría doble presente en la interacción de dominios CH3-CH3. La figura se creó utilizando las coordenadas 1L6X depositadas en el PDB.

Figura 6. Esquemas que muestran interacciones electrostáticas en el tipo salvaje y en los mutantes diseñados como ejemplo para aumentar la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. (a) En el caso de WT, las interacciones electrostáticas favorecen tanto la formación de heterodímeros como la de homodímeros, confiriendo a ambas igual probabilidad. (b) En el caso del mutante simple (K409E), uno de los homodímeros está desfavorecido por ambas interacciones y al mismo tiempo el heterodímero está desfavorecido también por una de las interacciones. (c) En el caso del mutante doble, ambas interacciones electrostáticas favorecen la formación de heterodímero y desincentivan la formación de homodímero. (d) Mutaciones adicionales que implican cambio de carga (por ejemplo, K360E) podrían utilizarse también para aumentar los efectos de conducción electrostática sobre la formación de heterodímero y homodímero.

Figura 7. Esta figura muestra que podrían utilizarse también interacciones electrostáticas para favorecer la formación de homodímeros y desincentivar la de heterodímeros, cuando se expresan dos cadenas diferentes. Figura 8. La figura muestra (a) el dibujo esquemático de los constructos utilizados en el Ejemplo. La primera cadena del Fc tiene un maxicuerpo (fragmento variable de cadena simple scFv enlazado covalentemente, y la segunda cadena, denominada Fc simulado, no tiene dominio o funcionalidad alguno fijado(a) a ella. (b) Ilustración de la movilidad relativa esperada en la SDS-PAGE. Dado que la cadena Fc unida al maxicuerpo tiene un peso molecular mayor que el Fc simulado, los homodímeros y heterodímeros tienen movilidad diferente en la SDS-PAGE. El grosor de la banda en la SDS-PAGE puede utilizarse como medida de la fracción de rendimiento de heterodímero y homodímero. El tipo salvaje se incluye como control y para monitorizar la mejora relativa en el rendimiento de heterodímero debida a diversas mutaciones.

Figura 9. Análisis SDS-PAGE que muestra los efectos de mutaciones en el par de interacción D399'--K409. Figura 10. Análisis SDS-PAGE de las mutaciones de residuos de carga (enumeradas en la Tabla 6) además de las mutaciones de par D399'K--K409D. Se muestran también el tipo salvaje (pista primera) y las mutaciones de botones-en-ojales (pista última) para comparación. En este caso se utilizó una ratio DNA de entrada 1:2 de Fc simulado y maxicuerpo M315.

Figura 11. Transferencia Western que demuestra que ciertas combinaciones de mutante alcanzan selectividad alta para formación de heterodímeros. Las moléculas Fc se detectaron utilizando anticuerpo de cabra anti-Fc humana, conjugado con HRP a 1:10.000.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Esta solicitud describe, en general, una estrategia para alterar la interacción de dominios de anticuerpo, v.g. alterar un dominio CH3 a fin de reducir la capacidad del dominio para interaccionar consigo mismo, es decir, formar homodímeros. En particular, uno o más residuos que constituyen la interfaz CH3-CH3 se reemplaza(n) con un aminoácido cargado de tal modo que la interacción se vuelve electrostáticamente desfavorable. Un aminoácido cargado positivamente en la interfaz, tal como una lisina, arginina, o histidina, se reemplaza con un aminoácido con carga negativa, tal como ácido aspártico o ácido glutámico. Un aminoácido cargado negativamente en la interfaz se reemplaza con un aminoácido cargado positivamente. El aminoácido puede ser reemplazado con un aminoácido no natural que tiene la característica de carga deseada.

Se describe adicionalmente en esta memoria una estrategia para alteración de un par de dominios CH3 a fin de reducir la capacidad de cada dominio para interaccionar consigo mismo pero para aumentar la capacidad de los dominios para interaccionar uno con otro, es decir, formar heterodímeros. Esto puede conseguirse por reemplazamiento de uno o más residuos que constituyen la interfaz CH3-CH3 en ambos dominios CH3 con un aminoácido cargado tal que la formación de homodímeros es electrostáticamente desfavorable, pero la heterodimerización es electrostáticamente favorable. En ciertas realizaciones, un aminoácido cargado en cada dominio CH3 se reemplaza con un aminoácido de carga opuesta. Por ejemplo, un aminoácido con carga positiva puede reemplazarse con un aminoácido con carga negativa en el primer dominio CH3, y un aminoácido con carga negativa puede reemplazarse con un aminoácido con carga positiva en el segundo dominio CH3. Por inversión de la carga del aminoácido, se reduce la formación de homodímeros. Cuando los reemplazamientos se coordinan adecuadamente, las cargas inversas son electrostáticamente favorables, es decir cargas opuestas en la interfaz, para formación de heterodimerización.

Un total de 48 estructuras cristalinas de anticuerpos que tenían coordenadas correspondientes a la región Fc se identificaron a partir del Banco de Datos de Proteínas (PDB) (Bernstein, Koetzle et al. 1977) utilizando un algoritmo de búsqueda basado en estructura (Ye y Godzik 2004). El examen de las estructuras cristalinas Fc identificadas reveló que la estructura determinada a resolución máxima corresponde al fragmento Fc de RITUXIMAB unido a una versión minimizada del dominio B de la proteína A denominado Z34C (código PDB = 1L6X). La estructura del homodímero Fc biológico para 1L6X se generó utilizando las coordenadas de monómeros Fc depositadas y simetría cristalina. Se utilizaron dos métodos para identificar los residuos implicados en la interacción de dominios CH3-CH3: (i) contacto como se determinó por el criterio del límite de distancia y (ii) análisis del área de la superficie accesible al disolvente.

Conforme al método basado en contacto, los residuos de la interfaz se definen como residuos cuyos átomos pesados de la cadena lateral están posicionados más próximos que un límite especificado de los átomos pesados de cualesquiera residuos en la segunda cadena. Aunque se prefiere un límite de distancia de 4,5 Á, podría utilizarse también un límite de distancia más largo (por ejemplo, 5,5 Á) a fin de identificar los residuos de interfaz (Bahar y Jernigan 1997).

El segundo método implica el cálculo del área de la superficie accesible al disolvente (ASA) de los residuos del dominio CH3 en presencia y ausencia de la segunda cadena (Lee y Richards 1971). Los residuos que muestran diferencia (> 1 Á2) en ASA entre los dos cálculos se identifican como residuos de interfaz. Ambos métodos identificaron un conjunto similar de residuos de interfaz. Adicionalmente, los mismos eran consistentes con el trabajo publicado (Miller 1990).

La Tabla 1 enumera 24 residuos d interfaz identificados basándose en el método del criterio de contacto, utilizando el límite de distancia de 4,5 Á. Estos residuos se examinaron ulteriormente en cuanto a conservación estructural. Para este propósito, 48 estructuras cristalinas Fc identificadas por el PDB se superpusieron y se analizaron calculando la desviación cuadrática media para los átomos pesados de la cadena lateral. Las designaciones de los residuos están basadas en el esquema de numeración EU de Kabat, que corresponde también a la numeración en el Banco de Datos de Proteínas (PDB).

La Figura 3 muestra la interfaz de /dominio CH3 junto con las posiciones estructuralmente conservadas, ocultas (% ASA < 10), y expuestas (% ASA > 10) (% ASA se refiere a la ratio de ASA observada frente a la ASA estándar de los aminoácidos; (Lee y Richards 1971)). La conservación de residuos de interfaz entre las subclases IgG Humana y Ratón así como entre otras clases de Ig se examinó también por comparaciones de secuencia (Figura 4).

Tabla 1: Lista de residuos de interfaz de dominio CH3 en la primera cadena (A) y sus residuos de contacto en la segunda cadena (B)a

A pH neutro (= 7,0), los residuos Asp y Glu están cargados negativamente, y Lys, Arg e His están cargados positivamente. Estos residuos cargados pueden utilizarse para promover la formación de heterodímeros y dificultar al mismo tiempo los homodímeros. Tiene lugar una interacción atractiva entre cargas opuestas, y ocurre interacción repulsiva entre cargas iguales. El método aquí presentado hace uso de las interacciones atractivas y repulsivas para promover los heterodímeros y dificultar los homodímeros, respectivamente, por realización de mutagénesis orientada de residuos de interfaz cargados.

El examen de los residuos de interfaz de dominios CH3 identificados (Tabla 1) revela cuatro pares de residuos de carga singulares implicados en la interacción dominio-dominio (Asp356---Lys439', Glu357-Lys370', Lys392---Asp399', Asp399---Lys409'; la numeración de residuos en la segunda cadena se indica por el signo prima '). Estos pares de carga no están implicados necesariamente en la interacción carga-carga en la estructura cristalina aquí utilizada (1L6X), dado que la estructura cristalina es un producto final en el mecanismo de reacción de plegamiento de las proteínas y representa la estructura en el estado cristalino. Se supone aquí que para contar con efectos de conducción electrostática es suficiente que los residuos estén próximos en el espacio como se define por el criterio de límite de distancia (4,5 Á). Debe indicarse también aquí que, debido a la simetría doble presente en la interacción de dominios CH3-CH3, cada interacción singular se representará dos veces en la estructura (por ejemplo, Asp399---Lys409' y Lys409---Asp399'; Figura 5).

Los cuatro pares se clasificaron conforme a la extensión de la accesibilidad al disolvente (análisis ASA) (Lee y Richards 1971). En el caso de Lys 409 -- Asp399', ambos residuos estaban conservados estructuralmente y ocultos. En el caso de otros 3 pares, al menos uno de los miembros del par está expuesto al disolvente (% ASA > 10). Por esta razón, para el Ejemplo presente, el par Lys 409 -- Asp 399' se seleccionó para mutagénesis orientada. La estrategia se muestra esquemáticamente en la Figura 6.

En el tipo salvaje, la interacción K409 -- D399' favorece la formación tanto de heterodímeros como de homodímeros. Una sola mutación que cambia la polaridad de carga (K409E; carga positiva a negativa) en la primera cadena conduce a interacciones desfavorables para la formación del homodímero de la primera cadena. Las interacciones desfavorables se presentan debido a las interacciones repulsivas que existen entre cargas iguales (negativa - negativa; D399 -- K409E & K409E -- D399). Una mutación similar de cambio de la polaridad de carga (D399'K; carga negativa a positiva) en la segunda cadena conduce a interacciones desfavorables (K409' -- D399'K & D399'K --K409') para la formación de homodímeros de la segunda cadena. Sin embargo, al mismo tiempo, estas dos mutaciones (K409E & D399'K) conducen a interacciones favorables (K409E -- D399'K & D399 -- K409') para la formación de heterodímeros.

Los efectos de conducción electrostática sobre la formación de heterodímeros y la desincentivación de homodímeros, pueden aumentarse por mutación de residuos de carga adicionales que pueden estar apareados o no con un residuo de carga opuesta en la segunda cadena, tales como Arg355 y Lys 360, como se muestra en la Figura 6d. Las mutaciones representadas en la Figura 6 tienen por objeto únicamente servir de ilustración. La Tabla 2 enumera muchas mutaciones posibles que implican residuos de carga, y las mutaciones pueden combinarse para aumentar los efectos electrostáticos.

Tabla 2a: Lista de algunas posibles mutaciones de residuos de carga por pares a fin de aumentar la formación de heterodímerosa

Tabla 2b: Mutaciones de residuos de carga simple adicionales que aumentan los efectos de conducción

electrostáticaa

Cada residuo cargado positivamente (Lys y Arg) puede mutarse en dos residuos cargados negativamente (Asp o Glu) y viceversa, y como resultado, el método aquí descrito proporciona numerosas combinaciones. Debe indicarse aquí que diferentes combinaciones tendrán diverso efecto sobre la formación de estructura cuaternaria (homodímero/heterodímero) dependiendo de los residuos circundantes en el sitio de mutación y el papel de las moléculas de agua. El aminoácido histidina (His) está cargado positivamente a pH neutro y por tanto se contempla también la mutación de His. Sin embargo, la mutación de residuos cargados negativamente (Asp o Glu) a His conducirá a aumento en el volumen de la cadena lateral, lo cual puede causar problemas estéricos. Adicionalmente, la forma donante y aceptora del promotor de histidina depende del entorno localizado. Estos problemas deberían tenerse en cuenta durante la estrategia de diseño.

Dado que los residuos de interfaz están altamente conservados en las subclases IgG Humana y de Ratón, los efectos de la conducción electrostática pueden aplicarse a IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 Humana o de Ratón. Esta estrategia puede extenderse también a la modificación de residuos sin carga a residuos cargados en la interfaz del dominio CH3. Una estrategia similar concerniente a permutaciones de residuos de carga puede utilizarse también para aumentar la formación de homodímeros e impedir la de heterodímeros cuando se co-expresan dos cadenas pesadas diferentes (Figura 7).

Con objeto de evaluar la estabilidad de los mutantes de residuos cargados, se utilizó software EGAD para estimar la energía libre de enlace de dominios CH3-CH3. Por optimización de los parámetros utilizados en el cálculo, Pokala y Handel pudieron predecir los efectos de aproximadamente 400 mutaciones en la formación de complejos proteínaproteína dentro de un error de 1,0 kcal/mol (Pokala y Handel 2005). Se utilizó EGAD para comparar groseramente la energía libre de enlace de diversas mutaciones realizadas en la interfaz del dominio CH3.

La Tabla 3 enumera la energía libre de enlace calculada (AAG) para los mutantes residuales de carga de la interfaz. La energía libre de enlace de un mutante se define como AAG^mut= p(AG^mut- AG^wt); donde p (= 0,1, en general) es el factor de escalación utilizado para normalizar los cambios predichos en la afinidad de enlace de modo que tengan una pendiente de 1 cuando se comparan con las energías experimentales (Pokala y Handel 2005). La energía libre de disociación (AG) se define como la diferencia en energía entre los estados complejo (AG^combinado) y libre (AG^libre). La comparación muestra que las mutaciones de residuos cargados afectan a la estabilidad en mucho menor grado comparadas con las mutaciones de botones-en-ojales. Para comparación, se dan las temperaturas de fusión consignadas para el tipo salvaje y los mutantes de botones-en-ojales. Las temperaturas de fusión fueron medidas por Carter y colaboradores utilizando únicamente el constructo del dominio CH3 (Atwell, Ridgway et al. 1997). Para los mutantes de botones-en-ojales, se observó también disminución de entalpía en los experimentos por calorimetría de barrido diferencial.

Tabla 3: Energía libre de enlace del dominio CH3-CH3 para diversos mutantes diseñados a fin de aumentar la formación de heterodímeros, calculada utilizando el programa EGAD (Pokala y Handel 2005^a)

La Figura 2 representa varias realizaciones que comprenden moléculas heterodímeras Fc, desde anticuerpos biespecíficos a complejos de receptores heterodímeros. Las dos cadenas pesadas de las moléculas Fc heterodímeras pueden fusionarse con proteínas y/o dominios que tienen funcionalidades diferentes. Por ejemplo, la fusión de Fabs que se fijan a antígenos diferentes conducirá a anticuerpos biespecíficos (BsAbs). La fusión de dos dominios Fv de cadena simple diferentes (scFv; cadena ligera y pesada variables unidas por un enlazador peptídico flexible) conducirá a maxicuerpos biespecíficos. Adicionalmente, los dominios o proteínas que interaccionan por razones funcionales pueden fusionarse también con Fc heterodímero para el propósito de desarrollar ensayos funcionales o para usos terapéuticos. Por ejemplo, en la familia de receptores hematopoyéticos gp130 es conocido por interaccionar con otros receptores tales como el Receptor del Factor Inhibidor de la Leucemia (LIFR). El dominio celular adicional (ECD) de gp130 puede fusionarse a la primera cadena pesada de Fc, y el ECD de LIFR puede fusionarse a la segunda cadena pesada de Fc, lo cual puede conducir a la formación de complejo gp130-LIFR que mimetiza probablemente el estado biológico. Dado que el sitio de enlace de FcRn está localizado en la región Fc, es probable que las moléculas de fusión Fc tengan semivida en suero prolongada - una característica que distingue las moléculas heterodímeras Fc de otras moléculas heterodímeras tales como las proteínas de fusión de cremallera de leucina (Liu, Caderas et al. 2001). No es esencial tener funcionalidades diferentes unidas a las dos cadenas pesadas del heterodímero Fc. Puede crearse también un monocuerpo (Figura 2).

En ciertas realizaciones, v.g., cuando se producen anticuerpos biespecíficos, cadenas ligeras diferentes múltiples pueden coexpresarse con las cadenas pesadas diferentes múltiples. Para aumentar la fidelidad de cada cadena ligera que se fija a la cadena pesada apropiada manteniendo con ello la especificidad de la "rama" del anticuerpo, los dominios CH1 de una o más de las cadenas pesadas y la región constante de una o más de las cadenas ligeras pueden diseñarse para favorecer la dimerización. Preferiblemente, esto se realiza utilizando una técnica de conducción electrostática similar a la arriba descrita para los dominios CH3.

Se analizó la interacción de la secuencia de la cadena ligera kappa correspondiente al código de deposición del Banco de Datos de Proteínas (PDB) 1N0X (SEQ ID NO: 25) y la cadena ligera lambda correspondiente al código de deposición (PDB) 7FAB (SEQ ID NO: 26) con la secuencia de cadena pesada correspondiente al dominio CH1 de IgG1 (SEQ ID NO: 27). Los contactos cadena ligera lambda-cadena pesada dentro de la interfaz se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4: Lista de residuos de interfaz cadena ligera lambda y sus residuos de contacto en la cadena pesada3

Los contactos cadena ligera kappa-cadena pesada dentro de la interfaz se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5: Lista de residuos de interfaz cadena ligera kappa y sus residuos de contacto en la cadena pesada3

Lys125 de la cadena lambda puede mutarse a un aminoácido cargado negativamente, y una mutación correspondiente puede realizarse en una cadena pesada en Asp148, cambiando el residuo a un aminoácido con carga positiva. Alternativa o adicionalmente, Glu119 de la cadena lambda puede mutarse a un aminoácido con carga positiva, una mutación correspondiente puede realizarse en una cadena pesada en Lys213, que cambia el residuo a un aminoácido cargado negativamente.

El análisis de la interacción cadena ligera-cadena pesada revelaba posiciones en las cuales podrían introducirse pares de carga en la secuencia para aumentar la fijación de un par específico de cadenas ligera y pesada. Estas posiciones incluyen Thr112 de lambda y Ala141 de la cadena pesada, Glu156 de lambda y Ser176 de la cadena pesada, y Ser171 de lambda y Ser183 de la cadena pesada y otras posiciones representadas en las Tablas 4 y 5 en negrilla.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Este ejemplo demuestra que pueden diseñarse dominios CH3 para favorecer la heterodimerización al mismo tiempo que se desincentiva la homodimerización utilizando efectos de conducción electrostática. Se fabricó un constructo Fc simulado - maxicuerpo como se muestra en la Figura 8(a) que tenía mutaciones de residuos de carga en la interfaz del dominio CH3. La formación de rendimiento de homodímero y heterodímero se evaluó por electroforesis en gel SDS-poliacrilamida. Dado que el maxicuerpo tiene un peso molecular mayor comparado con el Fc simulado, el heterodímero (Fc simulado - maxicuerpo) y los homodímeros (maxicuerpo-maxicuerpo y Fc simulado - Fc simulado) tienen movilidad diferente en la SDS-P^aG^e, lo que facilita la identificación de los diversos pares (FIG. 8(b)).

Se generó un anticuerpo NKG2D de rata anti-ratón, diseñado M315, por fusiones de hibridoma convencionales y se utilizaron las secuencias de DNA que codificaban la cadena pesada variable (VH) y la cadena ligera variable (VL) para construir M315 scFv-Fc utilizando un método descrito previamente (Gilliland, Norris et al. 1996).

La secuencia de M315 scFv-Fc (SEQ ID NO: 1) y hulgG1 Fc (SEQ ID NO: 2) se clonaron en el vector de expresión de mamífero pTT5 y los dos constructos se utilizaron para co-transfectar células 293-6E a fin de evaluar la formación de heterodímero Fc/scFv-Fc con relación a homodímero Fc y homodímero scFv-Fc.

SEQ ID NO: 1

M 315scFv-huFc

HMAEVQLQQSGAELVKPGSSVKISCKASGYTFANNFMHWIKQQPGNGLEW

IGWIYPGDGDTEYNQKFSGKATLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCI

RLTEGTTYWGQGVMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQFVLTQPNSVSTNLGS

TVKLSCKRSTGNIGSNYVNWYQQHEGRSPTTMIYRDDKRPDGVPDRFSGS

IDGSSNSALLTINNVQTEDEADYFCQSYSRGVSPVFGGGTKLTVLlAAAEPi

'KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLEPBKPKDTLMrSRTPEVTCVWDVS;

'HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS.TYRyySVLTyLHQDWLNGK

'EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC:

'LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFIiYSKLTVDKSRW;

jQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 2

huIgGl-Fcj

ÍEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFlilfPPKPKDTLMISRTPEyTGWVDVSl

«EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE.QYNSTYRWSyLTVLHQDWLNGK!

(El sombreado corresponde a la región Fc).

Los pares de residuos de carga en la región CH3 identificada por análisis computacional se cambiaron a aminoácido de polaridad de carga opuesta en los constructos humanos IgG1Fc (simulado) o M315 scFv-Fc (mxb). Las mutaciones, que se enumeran en la Tabla 6, se generaron utilizando el kit de mutagénesis QuikChange® de Stratagene y se comprobaron por secuenciación de DNA. Las mutaciones se designan por el residuo de tipo salvaje seguido por la posición utilizando el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., ed. 5. [1991]), que es consistente con el esquema de numeración de la estructura cristalina (código PDB: 1L6X), y luego con el residuo de sustitución en código de una sola letra. La secuencia Fc utilizada en estos dos constructos se derivaba de IgG1 humana alotipo “no-(a)”, que tiene un Glu en posición 356 y un Met en posición 358. Las secuencias CH3 de la estructura cristalina son de un alotipo IgG1 diferente, que tiene un Asp en posición 356 y un Leu en posición 368.

TABLA 6: Lista de mutaciones de residuos de carga

Se transfectó DNA en el linaje de células de riñón de embrión humano 293-6E utilizando reactivo Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen). El sobrenadante de cultivo de células se cosechó 3-4 días después de la transfección y se analizó en Geles SDS-PAGE en condición no reducida. El gel se transfirió luego a una membrana de nitrocelulosa y se sometió a análisis Western utilizando el anticuerpo IgG anti-humana de cabra conjugado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories) y los resultados se muestran en Fig. 10.

La co-transfección del vector de expresión para M315 scFv-Fc (mxb) junto con Fc simulado dio como resultado la formación de heterodímero scFv-Fc/Fc así como homodímero scFv-Fc y homodímero Fc. La ratio de heterodímero scFv-Fc/Fc a homodímero scFv-Fc y homodímero Fc está próxima a 1:1:1, cuando se utiliza la secuencia CH3 de tipo salvaje.

La introducción de una mutación de par de cargas K409D en Fc simulado y D399'K en el maxicuerpo M315 aumentaba significativamente la ratio de heterodímero scFv-Fc con relación al homodímero scFv-Fc así como al homodímero Fc. Se observó también un aumento similar de la formación heterodímero para otras variantes mutantes tales como K409D/D399'R, K409E/D399'K y K409E/D399'R (Fig. 9), que subrayaba adicionalmente la importancia de la complementación de la polaridad de carga para la formación de heterodímeros de Fc. (El constructo M315 scFv-Fc de tipo salvaje utilizado en este estudio tiene una etiqueta extra en el terminal carboxilo de Fc, por lo que migra más lentamente en el gel SDS-PAGE.)

Cuando se introdujeron mutaciones adicionales en los residuos de carga que están localizados cerca de K409, tales como K360 y K392, se observó un aumento adicional de la formación de heterodímeros (Fig. 10). Por ejemplo, la combinación K409D; K392D en Fc simulado con D399'K en el maxicuerpo M315 demostró que aumentaba la ratio de heterodímero a homodímeros, debido probablemente a la disrupción del homodímero Fc. Una banda de 25 KD correspondiente al tamaño del monómero Fc se detectaba en todas las transfecciones utilizando K409D; K392D Fc simulado (datos no presentados). La adición de otra mutación tal como D356'K o D357'K encima de la variante D399'K del maxicuerpo M315 exhibía una mejora adicional. La combinación de K409D; K392D en Fc simulado con D399'K; D356'K en el maxicuerpo M315 daba como resultado una formación casi exclusiva de heterodímero. Otras combinaciones tales como K409D; K392D/D399'K; D357'K y K409D; K370D/D399'K; D357'K ofrecían también una mejora significativa con respecto a la variante K409D/D399'K.

Tabla 7: Cuantificación del porcentaje de rendimientos de homodímero y heterodímero para la SDS-PAGE representada en la Figura 10a.

aND significa No Detectable en el análisis basado en densidad.

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra que los dominios CH3 que contienen ciertas mutaciones triples de par de carga eran incapaces de formar homodímeros cuando se expresaban solos, pero eran capaces de formar heterodímeros cuando se co-expresaban. Se produjeron mutantes y las células se transfectaron como se describe en el Ejemplo 1. Cuando los constructos se sometieron a co-transfección, se utilizó una ratio de plásmidos 1:1. Los resultados se muestran en la Figura 11. Los heterodímeros y homodímeros se detectaron por transferencia Western utilizando anticuerpo anti-Fc humano de cabra conjugado con HRP. Es interesante que las moléculas que contenían Fc que tenían mutaciones triples en las que los residuos cargados positivamente se cambiaron a residuos cargados negativamente (K409D, K392D, K370D o K409D, K392D, K439D) no podían ser detectadas cuando se expresaban solas. Análogamente, las moléculas que contenían Fc que tenían mutaciones triples en las que residuos con carga negativa se cambiaban a residuos con carga positiva (D399K, E356K, E357K) no podían detectarse cuando se expresaban solas. En cambio, cuando se co-expresaban con una molécula que contenía Fc que tenía mutaciones de polaridad de carga opuesta, se detectaban únicamente heterodímeros.

A todo lo largo de esta solicitud de patente de invención, debe entenderse que el uso de un término en singular puede implicar, en caso apropiado, el uso del término respectivo en plural, y viceversa.

Atwell, S., J. B. Ridgway, et al. (1997). "Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library." J Mol Biol 270(1): 26-35.

Bahar, I. y R. L. Jernigan (1997). "Inter-residue potentials in globular proteins and the dominance of highly specific hydrophilic interactions at close separation." J Mol Biol 266(1): 195-214.

Bernstein, F. C., T. F. Koetzle, et al. (1977). "The Protein Data Bank: a computer-based archival file for macromolecular structures." J Mol Biol 112(3): 535-42.

Bogan, A. A. y K. S. Thorn (1998). "Anatomy of hot spots in protein interfaces." J Mol Biol 280(1): 1-9. Carter, P. (2001). "Bispecific human IgG by design." J Immunol Methods 248(1 -2): 7-15.

Crick, F. H. (1952). "Is alpha-keratin a coiled coil?" Nature 170(4334): 882-3.

de Leij, L., G. Molema, et al. (1998). "Bispecific antibodies for treatment of cancer in experimental animal models and man." Adv Drug Deliv Rev 31(1-2): 105-129.

Deisenhofer, J. (1981). "Crystallographic refinement and atomic models of a human Fc fragment and its complex with fragment B of protein A from Staphylococcus aureus at 2.9- and 2.8-A resolution." Biochemistry 20(9): 2361-70.

Gabdoulline, R. R. y R. C. Wade (2002). "Biomolecular diffusional association." Curr Opin Struct Biol 12(2): 204-13.

Ghetie, V. y E. S. Ward (2000). "Multiple roles for the major histocompatibility complex class I-related recep tor FcRn." Annu Rev Immunol 18: 739-66.

Gilliland, L. K., N. A. Norris, et al. (1996). "Rapid and reliable cloning of antibody variable regions and generation of recombinant single chain antibody fragments." Tissue Antigens 47(1): 1-20

Halperin, I., H. Wolfson, et al. (2004). "Protein-protein interactions; coupling of structurally conserved residues and of hot spots across interfaces. Implications for docking." Structure 12(6): 1027-38.

Huber, R. (1984). "Three-dimensional structure of antibodies." Behring Inst Mitt(76): 1-14.

Idusogie, E. E., L. G. Presta, et al. (2000). "Mapping of the C1q binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human IgG1 Fc." J Immunol 164(8): 4178-84.

Joachimiak, L. A., T. Kortemme, et al. (2006). "Computational design of a new hydrogen bond network and at least a 300-fold specificity switch at a protein-protein interface." J Mol Biol 361(1): 195-208.

King, D. J., J. R. Adair, et al. (1992). "Expression, purification and characterization of a mouse-human chi meric antibody and chimeric Fab' fragment." Biochem J 281 (Pt 2): 317-23.

Kortemme, T. y D. Baker (2004). "Computational design of protein-protein interactions." Curr Opin Chem Biol 8(1): 91-7.

Kortemme, T., L. A. Joachimiak, et al. (2004). "Computational redesign of protein-protein interaction specifi city." Nat Struct Mol Biol 11 (4): 371-9.

Laemmli, U. K. (1970). "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." Nature 227(5259): 680-5.

Lee, B. y F. M. Richards (1971). "The interpretation of protein structures: estimation of static accessibility." J Mol Biol 55(3): 379-400.

Liu, N., G. Caderas, et al. (2001). "Fusion proteins from artificial and natural structural modules." Curr Pro tein Pept Sci 2(2): 107-21.

Maizel, J. V., Jr., D. F. Summers, et al. (1970). "SDS-acrylamide gel electrophoresis and its application to the proteins of poliovirus- and adenovirus-infected human cells." J Cell Physiol 76(3): 273-87.

Martin, W. L., A. P. West, Jr., et al. (2001). "Crystal structure at 2.8 A of an FcRn/heterodimeric Fc complex: mechanism of pH-dependent binding." Mol Cell 7(4): 867-77.

Marvin, J. S. y H. B. Lowman (2003). "Redesigning an antibody fragment for faster association with its anti gen." Biochemistry 42(23): 7077-83.

Matthews, B. W. (1995). "Studies on protein stability with T4 lysozyme." Adv Protein Chem 46: 249-78. Merchant, A. M., Z. Zhu, et al. (1998). "An efficient route to human bispecific IgG." Nat Biotechnol 16(7): 677-81.

Miller, S. (1990). "Protein-protein recognition and the association of immunoglobulin constant domains." J Mol Biol 216(4): 965-73.

Nolan, O. y R. O'Kennedy (1990). "Bifunctional antibodies: concept, production and applications." Biochim Biophys Acta 1040(1): 1-11.

Papadea, C. y I. J. Check (1989). "Human immunoglobulin G and immunoglobulin G subclasses: biochemical, genetic, and clinical aspects." Crit Rev Clin Lab Sci 27(1): 27-58.

Pokala, N. y T. M. Handel (2005). "Energy functions for protein design: adjustment with protein-protein complex affinities, models for the unfolded state, and negative design of solubility and specificity." J Mol Biol 347(1): 203-27.

Raghavan, M. y P. J. Bjorkman (1996). "Fc receptors and their interactions with immunoglobulins." Annu Rev Cell Dev Biol 12: 181-220.

Ridgway, J. B., L. G. Presta, et al. (1996). "'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization." Protein Eng 9(7): 617-21.

Roux, K. H. (1999). "Immunoglobulin structure and function as revealed by electron microscopy." Int Arch Allergy Immunol 120(2): 85-99.

Schreiber, G., Y. Shaul, et al. (2006). "Electrostatic design of protein-protein association rates." Methods Mol Biol 340: 235-49.

Selzer, T., S. Albeck, et al. (2000). "Rational design of faster associating and tighter binding protein complexes." Nat Struct Biol 7(7): 537-41.

Sheinerman, F. B., R. Norel, et al. (2000). "Electrostatic aspects of protein-protein interactions." Curr Opin Struct Biol 10(2): 153-9.

Sondermann, P., R. Huber, et al. (2000). "The 3.2-A crystal structure of the IgG 1 Humana Fc fragment-Fc gammaRIII complex." Nature 406(6793): 267-73.

Sowdhamini, R., N. Srinivasan, et al. (1989). "Stereochemical modeling of disulfide bridges. Criteria for introduction into proteins by site-directed mutagenesis." Protein Eng 3(2): 95-103.

Szczepek, M., V. Brondani, et al. (2007). "Structure-based redesign of the dimerization interface reduces the toxicity of zinc-finger nucleases." Nat Biotechnol 25(7): 786-93.

Ye, Y. y A. Godzik (2004). "FATCAT: a web server for flexible structure comparison and structure similarity searching." Nucleic Acids Res 32(Web Server issue): W582-5.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula hospedadora in vitro para la preparación de una proteína heterodímera, comprendiendo dicha célula hospedadora un ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que contiene CH3 de IgG y un ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido que contiene CH3 de IgG, en la cual dicho primer polipéptido que contiene CH3 de IgG comprende la sustitución de los aminoácidos en las posiciones 392 y 409 o en las posiciones 370, 392 y 409 con un aminoácido cargado negativamente, y dicho segundo polipéptido que contiene CH3 de IgG comprende la sustitución de los aminoácidos en las posiciones 356 y 399 o en las posiciones 356, 357 y 399 con un aminoácido de carga positiva.

2. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en la cual el aminoácido con carga negativa es ácido aspártico.

3. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en la cual el aminoácido cargado positivamente es lisina.

4. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en la cual la proteína heterodímera comprende una región Fc de IgG humana.

5. La célula hospedadora de la reivindicación 4, en la cual la región Fc de IgG humana comprende una región Fc de IgG 1, una región Fc de IgG2, una región Fc de IgG3 o una región Fc de IgG4.

6. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en la cual el primer y/o el segundo polipéptido que contiene CH3 de IgG es una cadena pesada de anticuerpo.

7. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en la cual la proteína heterodímera comprende adicionalmente una o más cadenas ligeras de anticuerpo.

8. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en la cual la proteína heterodímera se selecciona del grupo constituido por un anticuerpo, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo monoespecífico monovalente, un maxicuerpo biespecífico, un monocuerpo, un pepticuerpo, un pepticuerpo biespecífico, un pepticuerpo monovalente, y una proteína de fusión de receptores.

9. La célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la célula hospedadora es una célula hospedadora de mamífero y opcionalmente en la que la célula hospedadora de mamífero es una línea celular de ovario de hámster chino (CHO).