TW202010757A - 具有經受限cd3結合的多重特異性多肽構築體以及相關方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本發明大體上係關於具有經受限CD3結合的多重特異性多肽。於一些實施例中,該等多重特異性多肽含有非可裂解連接子,該等連接子不含有對藉由蛋白酶裂解具特異性之受質識別位點。本發明亦提供製備及使用此等多重特異性多肽於各種治療性、診斷性及預防性適應症中之方法。
Description
本發明大體上係關於具有經受限CD3結合的多重特異性多肽。於一些實施例中,該等多重特異性多肽含有非可裂解連接子,該等連接子不含有對藉由蛋白酶裂解具特異性之受質識別位點。本發明亦提供製備及使用此等多重特異性多肽於各種治療性、診斷性及預防性適應症中之方法。
造成靶細胞耗盡之治療抗體一般依賴於經由與Fc-γ-受體(FcγR)及補體蛋白質相互作用介導之效應功能。表現FcγR之效應細胞主要為先天免疫系統之彼等。T-細胞不針對涉及抗體介導之靶細胞耗盡之效應細胞。
CD3 (分化簇3) T-細胞共受體為由四個不同多肽鏈(稱作ε、γ、δ及ζ鏈)組成之多聚體蛋白。CD3複合體用作T細胞受體之信號傳導模組,其與T細胞受體(TCR)之抗原結合a/b鏈非共價締合。
因為CD3之直接接合導致T-細胞活化,其為各種治療性及/或診斷性適應症之所需靶。因此,存在對靶向CD3/TCR路徑之抗體及治療劑之需要。
本發明提供展示經受限CD3結合之多重特異性多肽構築體。於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體由包含免疫球蛋白Fc區之第一組分及包含CD3結合區之第二組分組成,其中該第一組分及該第二組分藉由連接子偶合,其中該Fc區經定位至該CD3結合區之N端;及該第一組分及該第二組分中之一者或二者包含結合至腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域。於一些實施例中,該CD3結合區結合CD3 (CD3ε)。於一些實施例中,該抗原結合域相對於該Fc區胺基端定位及/或相對於該多重特異性多肽構築體之CD3結合區羧基端定位。於一些實施例中,該第一組分包含第一抗原結合域及該第二組分包含第二抗原結合域,其中該等抗原結合域各者結合至腫瘤相關抗原(TAA)。於一些情況下,該第一抗原結合域在該多重特異性構築體之胺基端定位及該第二抗原結合域在該多重特異性構築體之羧基端定位。於一些實施例中,該第一抗原結合域相對於該Fc區胺基端定位及/或相對於該多重特異性多肽構築體之CD3結合區羧基端定位。
本文中提供一種多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性構築體以自N端至C端之順序包含:結合至腫瘤相關抗原(TAA)之第一抗原結合域;免疫球蛋白Fc區;連接子;結合CD3 (CD3ε)之CD3結合區;及結合至腫瘤相關抗原(TAA)之第二抗原結合域。亦提供一種多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性構築體以自N端至C端之順序包含:免疫球蛋白Fc區;連接子;結合CD3 (CD3ε)之CD3結合區;及結合至腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域。提供一種多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性構築體以自N端至C端之順序包含:結合至腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域;免疫球蛋白Fc區;連接子;及結合CD3 (CD3ε)之CD3結合區。
於一些所提供實施例中之任一者中,該連接子為非可裂解連接子。於一些實施例中,該連接子為不含有對藉由蛋白酶裂解具特異性之受質識別位點之連接子。
於一些所提供實施例中之任一者中,將Fc區定位至CD3結合區之N端降低或防止CD3結合區結合CD3之能力。於一些實施例中,連接該多重特異性多肽構築體之第一組分(組分#1)及第二組分(組分#2)及除非抗原結合域結合至其同源抗原,否則不允許結合至CD3。於一些實施例中,組分#1含有至少一個抗原結合域及Fc區。於一些實施例中,組分#2含有至少一個CD3結合區域及一個抗原結合域,其前者能結合CD3 (當多重特異性構築體結合至藉由抗原結合域或組分#1或組分#2之域識別之抗原時)。因此,如所述將CD3結合區連接至Fc區確保除非抗原結合域結合至其同源抗原,否則多重特異性多肽構築體不結合或以其他方式接合CD3。此係有利,因為其防止CD3結合區系統結合至T細胞及相反聚焦CD3結合區之能力以結合至抗原表現位點。此係有益,因為其消除外周T細胞之主要結合槽,允許在抗原表現位點(例如,腫瘤細胞或腫瘤微環境) 更有利分佈及定位。
當抗原結合域結合至其同源抗原時,經由組分#2之多重特異性多肽構築體能在抗原表現細胞與T細胞之間形成免疫突觸。此共接合介導抗原依賴性T細胞活化、細胞毒性、細胞激素釋放、脫粒及增殖。於一些實施例中,該等多重特異性多肽構築體能與FcγR相互作用及介導先天免疫效應功能,例如,抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)。於一些實施例中,該等多重特異性多肽構築體能與補體蛋白(即C1q)相互作用及介導補體依賴性細胞毒性。
於一些實施例中,藉由所提供多重特異性多肽構築體之抗原結合域識別之同源抗原為腫瘤相關抗原(TAA)。
因此,在所提供實施例中,該多重特異性多肽構築體由包含免疫球蛋白Fc區之第一組分及包含CD3結合區之第二組分組成,其中該第一組分及該第二組分藉由連接子偶合,其中該Fc區經定位至該CD3結合區之N端;及該第一組分及該第二組分中之一者或二者包含結合至腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域。於一些實施例中,該CD3結合區結合CD3 (CD3ε)。於一些實施例中,該抗原結合域相對於該Fc區胺基端定位及/或相對於該多重特異性多肽構築體之CD3結合區羧基端定位。於一些實施例中,該第一組分包含第一抗原結合域及該第二組分包含第二抗原結合域,其中該等抗原結合域各者結合至腫瘤相關抗原(TAA)。於一些情況下,該第一抗原結合域在多重特異性構築體之胺基端定位及該第二抗原結合域在多重特異性構築體之羧基端定位。於一些實施例中,該第一抗原結合域相對於該Fc區胺基端定位及/或相對於該多重特異性多肽構築體之CD3結合區羧基端定位。
本文中提供一種多重特異性多肽構築體,其包含包含免疫球蛋白Fc區及第一組分及包含CD3結合區之第二組分,其中該CD3結合區為包含可變重鏈區(VH)及可變輕鏈區(VL)之抗CD3抗體或抗原結合片段(為Fv抗體片段);該Fc為異二聚體Fc,其包含第一Fc多肽及第二Fc多肽且該抗CD3抗體或抗原結合片段之VH及VL連接至該異二聚體Fc之相反多肽;該第一組分及該第二組分藉由非可裂解連接子偶合,其中該Fc區經定位至該CD3結合區之N端;及該第一組分包含第一抗原結合域及該第二組分包含第二抗原結合域,其中該等抗原結合域各者結合至腫瘤相關抗原(TAA)。於一些實施例中,該CD3結合區結合CD3 (CD3ε)。於一些實施例中,該第一抗原結合域相對於該多重特異性構築體之Fc區胺基端定位及該第二抗原結合域相對於該多重特異性構築體之CD3結合區羧基端定位。於一些實施例中,該多重特異性構築體以自N端至C端之順序包含:結合至腫瘤相關抗原(TAA)之第一抗原結合域;免疫球蛋白Fc區;非可裂解連接子;CD3結合區,其中該CD3結合區結合CD3 (CD3ε);及結合至腫瘤相關抗原(TAA)之第二抗原結合域。
本文中提供一種多重特異性多肽構築體,其包含包含免疫球蛋白Fc區之第一組分及包含CD3結合區之第二組分,其中:該CD3結合區為包含可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)之抗CD3抗體或抗原結合片段,其為經二硫鍵穩定之Fv抗體片段(dsFv);該Fc為異二聚體Fc,其包含第一Fc多肽及第二Fc多肽且該抗CD3抗體或抗原結合片段之VH及VL連接至該異二聚體Fc之相反多肽;該第一組分及該第二組分藉由非可裂解連接子偶合,其中該Fc區經定位至該CD3結合區之N端;及該第一組分及該第二組分中之一者或二者包含結合至腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域。於一些實施例中,該CD3結合區結合CD3 (CD3ε)。
本文中提供一種多重特異性多肽構築體,其包含包含免疫球蛋白Fc區之第一組分及包含CD3結合區之第二組分,其中:該CD3結合區為包含可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)之抗CD3抗體或抗原結合片段(為Fv抗體片段);該Fc為異二聚體Fc,其包含第一Fc多肽及第二Fc多肽且該抗CD3抗體或抗原結合片段之VH及VL連接至該異二聚體Fc之相反多肽;該第一組分及該第二組分藉由非可裂解連接子偶合,其中該Fc區經定位至該CD3結合區之N端;及該第一組分及該第二組分中之一者或二者包含結合至腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域,其中該抗原結合域為單鏈抗體片段。於一些實施例中,該CD3結合區結合CD3 (CD3ε)。
於本文中所提供之實施例中,該多重特異性構築體以自N端至C端之順序包含:結合至腫瘤相關抗原(TAA)之第一抗原結合域;免疫球蛋白Fc區;非可裂解連接子;CD3結合區,其中該CD3結合區結合CD3 (CD3ε);及結合至腫瘤相關抗原(TAA)之第二抗原結合域。
於本文中所提供之實施例中,該多重特異性構築體以自N端至C端之順序包含:免疫球蛋白Fc區;非可裂解連接子;CD3結合區,其中該CD3結合區結合CD3 (CD3ε);及結合至腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域。
於本文中所提供之實施例中,該多重特異性構築體以自N端至C端之順序包含:結合至腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域;免疫球蛋白Fc區;非可裂解連接子;及CD3結合區,其中該CD3結合區結合CD3 (CD3ε)。
本文中提供一種多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性構築體以自N端至C端之順序包含:結合至腫瘤相關抗原(TAA)之第一抗原結合域;免疫球蛋白Fc區;連接子;結合CD3 (CD3ε)之CD3結合區;及結合至腫瘤相關抗原(TAA)之第二抗原結合域。亦提供一種多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性構築體以自N端至C端之順序包含:免疫球蛋白Fc區;連接子;結合CD3 (CD3ε)之CD3結合區;及結合至腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域。提供一種多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性構築體以自N端至C端之順序包含:結合至腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域;免疫球蛋白Fc區;連接子;及結合CD3 (CD3ε)之CD3結合區。
於一些態樣中,該抗原結合域或該等抗原結合域各者獨立地選自抗體或抗原結合片段、天然同源結合搭檔、抗運載蛋白(Anticalin) (經工程改造之脂鈣蛋白)、Darpin、Fynomer、Centyrin (經工程改造之纖維連接蛋白III域)、胱胺酸結域、人泛素(Affilin)、親和抗體(Affibody)或經工程改造之CH3域。於一些實施例中,該天然同源結合搭檔包含TAA或展示對該TAA之結合活性之其變異體之初始同源結合搭檔的細胞外域或其結合片段。
於一些實施例中,該(等)抗原結合域包含抗體或其抗原結合片段之一或多個複本。於一些實施例中,該(等)抗原結合域包含選自由以下組成之群之抗體或其抗原結合片段之一或多個複本:Fab片段、F(ab')2
片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體及單域輕鏈抗體。於一些實施例中,該(等)抗原結合域包含一或多個單域抗體(sdAb)片段之一或多個複本,例如,VH
H、VNAR
、經工程改造之VH
或VK
域。VH
H可自僅駱駝狀重鏈抗體產生。VNAR
可自僅軟骨魚狀重鏈抗體產生。已實施各種方法以自習知異二聚體VH
及VK
域產生單體sdAb,該等方法包括介面工程改造及選擇特異性生殖系家族。
於一些實施例中,該一或多個抗原結合域獨立地結合抗原,該抗原為腫瘤相關抗原(TAA)。於一些實例中,該抗原結合域或該等抗原結合域各者獨立地結合至選自以下之腫瘤抗原:1-92-LFA-3、5T4、α-4整聯蛋白(integrin)、α-V整聯蛋白、α4β1整聯蛋白、α4β7整聯蛋白、AGR2、抗Lewis-Y、Apelin J受體、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補體、C-242、CA9、CA19-9、(Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5 (CEA)、CEACAM6 (NCA-90)、CLAUDIN-3、CLAUDIN-4、cMet、膠原蛋白、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、內皮素(Endothelin) B受體(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV之F蛋白、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受體α (FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受體、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、透明質酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受體(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R (wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰島素受體、Jagged配位體、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、間皮素(Mesothelin)、MRP4、MUC1、黏蛋白(Mucin)-16 (MUC16、CA-125)、Na/K ATPase、NGF、呆蛋白(Nicastrin)、Notch受體、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂醯基-絲胺酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、1-磷酸鞘胺醇(Sphingosine)、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、轉鐵蛋白(Transferrin)、轉鐵蛋白受體、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2及WISP-3。
於一些實施例中,該第一組分包含抗原結合域之一或多個複本。於某些實施例中,該第一組分含有至少兩個抗原結合域,諸如兩個抗原結合域。於一些實施例中,該第一組分之至少兩個抗原結合域結合至相同TAA。於一些情況下,該第一組分之至少兩個抗原結合域結合至相同TAA之不同抗原決定基。於一些情況下,該第一組分之至少兩個抗原結合域結合至相同TAA之相同抗原決定基。於一些實施例中,該第一組分之至少兩個抗原結合域結合至不同TAA。
於一些實施例中,該Fc區為均二聚體Fc區。於一些實施例中,該第一組分之免疫球蛋白Fc區為選自由IgG1同種型、IgG2同種型、IgG3同種型及IgG4子集組成之群之IgG同種型。於一些實例中,該Fc區為人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4之Fc區或為其免疫活性片段。於一些實施例中,該Fc區包含多肽,該多肽包含SEQ ID NO: 1中所闡述之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 1至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性之胺基酸序列。於一些情況下,該Fc區包含多肽,該多肽包含SEQ ID NO: 2中所闡述之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 2至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性之胺基酸序列。於任何此等實施例中之一些中,該Fc區包含多肽,該多肽包含SEQ ID NO: 4中所闡述之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性之胺基酸序列。於一些實例中,該Fc區包含多肽,該多肽包含SEQ ID NO: 5中所闡述之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 5至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性之胺基酸序列。
於一些實施例中,該免疫球蛋白Fc區為多肽,該多肽包含衍生自選自由SEQ ID NO: 1-6組成之群之胺基酸序列之胺基酸序列。
於一些實施例中,該免疫球蛋白Fc區為多肽,該多肽包含選自由SEQ ID NO: 1-6組成之群之胺基酸序列。於一些實施例中,該免疫球蛋白Fc區為多肽,該多肽包含與選自由SEQ ID NO: 1-6組成之群之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性之胺基酸序列。
於一些實施例中,該Fc區為異二聚體Fc區。
於一些實施例中,該Fc區為含有第一Fc多肽及第二Fc多肽之異二聚體,其中該異二聚體Fc區之第一Fc多肽及第二Fc多肽中之一者或二者為變異體Fc多肽,該變異體Fc多肽相較於人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4之Fc區包含至少一個修飾以誘導異二聚化。於一些實施例中,該至少一個修飾係於人類IgG1之Fc區中或相較於人類IgG1之Fc區。於一些實施例中,該至少一個修飾係於SEQ ID NO: 1中所闡述之Fc多肽或其免疫活性片段中或相較於SEQ ID NO: 1中所闡述之Fc多肽或其免疫活性片段。於一些情況下,該異二聚體Fc區之Fc多肽中之一者或二者相較於均二聚體Fc區之多肽,視情況相較於SEQ ID NO: 1中所闡述之Fc多肽或其免疫活性片段包含至少一個修飾以誘導異二聚化。於一些實施例中,該異二聚體Fc之Fc多肽各者獨立地包含至少一個胺基酸修飾。於一些情況下,該至少一個修飾係選自立體修飾、杵臼(knob-into-hole)修飾、增加多肽之靜電互補性之電荷突變、改變等電點之修飾(pI變異體)或其組合。
於一些實例中,該胺基酸修飾為增加多肽之靜電互補性之電荷突變。於一些實施例中,該第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含互補位置之修飾,其中該修飾為利用具有與另一多肽之互補胺基酸相反電荷之胺基酸替換。於一些實施例中,該第一多肽或該第二多肽包含互補位置之修飾,其中該修飾為利用具有與另一多肽之互補胺基酸相反電荷之胺基酸替換。於一些實施例中,至少該第一Fc多肽或第二Fc多肽各者包含互補位置之修飾,其中該修飾為利用具有與另一多肽之互補胺基酸相反電荷之胺基酸替換。於一些實施例中,該第一Fc多肽及第二Fc多肽各者包含互補位置之修飾,其中該修飾為利用具有與另一多肽之互補胺基酸相反電荷之胺基酸替換。
於一些實例中,該胺基酸修飾為杵臼修飾。
於一些實施例中,該異二聚體Fc之第一Fc多肽包含選自Thr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val及其組合之修飾及該異二聚體Fc之第二Fc多肽包含修飾T366W。於一些情況下,該第一Fc多肽及第二Fc多肽還包含非半胱胺酸殘基至半胱胺酸殘基之修飾,其中該第一多肽之修飾係在位置Ser354及Y349中之一者處及該第二Fc多肽之修飾係在位置Ser354及Y349之另一處。於一些實施例中,該第一Fc多肽包含修飾T366W/S354C及該第二Fc多肽包含修飾T366S/L368A/Y407V/Y349C。於一些實施例中,該第一Fc多肽包含修飾L368D/K370S及該第二Fc多肽包含修飾S364K/E357Q。
於一些實施例中,該第一Fc多肽包含修飾L368D/K370S及該第二Fc多肽包含修飾S364K/E357Q。
於一些實施例中,該第一多肽及該第二多肽中之至少一者包含修飾Q295E/N384D/Q418E/N421D。
於一些實施例中,該異二聚體Fc之第一Fc多肽或第二Fc多肽中之一者還包含殘基Ile253處之修飾。於一些情況下,該修飾為Ile253Arg。於一些實施例中,該異二聚體Fc之第一Fc多肽或第二Fc多肽中之一者還包含殘基His435處之修飾。於一些情況下,該修飾為His435Arg。
於一些實施例中,該Fc區(諸如第一Fc多肽及/或第二Fc多肽)包含缺少Lys447之多肽。
於一些所提供實施例中之任一者中,該異二聚體Fc之第一多肽包含SEQ ID NO: 82、86或201中之任一者中所闡述之胺基酸序列,及該異二聚體Fc之第二多肽包含SEQ ID NO: 83、87、90、92、202或205中之任一者中所闡述之胺基酸序列。於一些實施例中,該第一Fc多肽及該第二Fc多肽包含選自由以下組成之群之序列:分別為SEQ ID NO: 82及83;分別為SEQ ID NO: 86及87;分別為SEQ ID NO: 201及202;分別為SEQ ID NO: 82及90;分別為SEQ ID NO: 86及92;及分別為SEQ ID NO: 201及205。
於一些實施例中,該免疫球蛋白Fc區為多肽,該多肽包含衍生自選自由SEQ ID NO: 1-6組成之群之胺基酸序列之胺基酸序列,其包含一或多個修飾。於一些實施例中,該免疫球蛋白Fc區為多肽,該多肽包含衍生自選自由SEQ ID NO: 1-6組成之群之胺基酸序列之胺基酸序列,其包含一或多個修飾以防止糖基化、以改變Fc受體相互作用、以降低Fc受體結合、以增強與CD32A之相互作用、以降低補體蛋白C1q結合、以延長半衰期、以增強FcRn結合、以改變抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)、以誘導異二聚化、以防止二聚化、以穩定CH3:CH3介面處之均二聚化及其組合。
於一些實施例中,Fc區內之修飾降低結合至Fc-受體γ,同時對結合至新生Fc受體(FcRn)具有最小影響。於一些實施例中,該突變或經修飾之Fc多肽包含下列突變:Met252Tyr及Met428Leu或Met252Tyr及Met428Val (M252Y、M428L或M252Y、M428V),該等突變使用Kabat編號系統。
於一些實施例中,該Fc區包含多肽,該多肽包含至少一個修飾以增強FcRn結合。於一些實例中,該修飾係在選自由Met252、Ser254、Thr256、Met428、Asn434及其組合組成之群之位置處。於一些情況下,該修飾係在選自由Met252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S及其組合組成之群之位置處。於一些特定實施例中,該修飾係在位置Met252處及在位置Met428處。於一些情況下,該修飾為Met252Y及Met428L。於一些情況下,該修飾為Met252Y及Met428V。
於一些實施例中,該異二聚體Fc之第一多肽包含SEQ ID NO: 94、96或207中之任一者中所闡述之胺基酸序列,及該異二聚體Fc之第二多肽包含SEQ ID NO: 98、100或209中之任一者中所闡述之胺基酸序列。於一些實施例中,該第一Fc多肽及該第二Fc多肽包含選自由以下組成之群之序列:分別為SEQ ID NO: 94及98;分別為SEQ ID NO: 96及100;及分別為SEQ ID NO: 207及209。
於一些實施例中,該Fc區包含多肽,該多肽包含至少一個修飾以增強FcγR結合。於一些情況下,該修飾為Ser239或Ile332處之修飾。於一些實施例中,該Fc區之糖基化經修飾以相較於未經修飾之Fc區增強FcγR結合。於一些實例中,該Fc區缺少或具有降低之岩藻糖含量。
於一些實施例中,該Fc區包含多肽,該多肽包含降低效應功能及/或降低結合至選自Fc γ受體或C1q之效應分子之至少一個胺基酸修飾。於一些實施例中,該一或多個胺基酸修飾為缺失Glu233、Leu234或Leu235中之一或多者。
於一些實施例中,該異二聚體Fc之第一多肽包含SEQ ID NO: 82、86、94或96中之任一者中所闡述之胺基酸序列,及該異二聚體Fc之第二多肽包含SEQ ID NO: 83、87、90、92、98或100中之任一者中所闡述之胺基酸序列。於一些實施例中,該Fc區包含多肽,該多肽包含降低效應功能及/或降低結合至選自Fc γ受體或C1q之效應分子之至少一個胺基酸修飾。於一些實例中,該一或多個胺基酸修飾為缺失Glu233、Leu234或Leu235中之一或多者。於一些態樣中,該異二聚體Fc之第一多肽包含SEQ ID NO: 84、88、95或97中之任一者中所闡述之胺基酸序列及該異二聚體Fc之第二多肽包含SEQ ID NO: 85、89、91、93、99或101中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
於一些實施例中,該異二聚體Fc之第一多肽包含SEQ ID NO: 84、88、95、97、203或208中之任一者中所闡述之胺基酸序列及該異二聚體Fc之第二多肽包含SEQ ID NO: 85、89、91、93、99、101、204、206或210中之任一者中所闡述之胺基酸序列。於一些實施例中,第一Fc多肽及第二Fc多肽包含選自由以下組成之群之序列:分別為SEQ ID NO: 84及85;分別為SEQ ID NO: 88及89;分別為SEQ ID NO: 203及204;分別為SEQ ID NO: 95及99;分別為SEQ ID NO: 97及101;分別為SEQ ID NO: 208及210;分別為SEQ ID NO: 84及91;分別為SEQ ID NO: 88及93;及分別為SEQ ID NO: 203及206。
於一些實施例中,該CD3結合區為抗CD3抗體或抗原結合片段。於一些實施例中,該抗CD3抗體或抗原結合片段包含可變重鏈區(VH)及可變輕鏈區(VL)。於任何此等實施例中之一些中,該CD3結合區係一價。
於一些實施例中,該抗CD3抗體或抗原結合片段非單鏈抗體,視情況非單鏈可變片段(scFv)。於一些實施例中,該Fc為異二聚體Fc且包含該抗CD3抗體或抗原結合片段之VH及VL連接至該異二聚體Fc之相反多肽。
於一些實施例中,除非該等抗原結合域中之至少一者結合至其TAA,否則該CD3結合區不能或實質上不能結合或接合CD3。於一些態樣中,除非該等抗原結合域中之至少兩者結合至其TAA,否則該CD3結合區不能或實質上不能結合或接合CD3。
於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體含有連接子,該連接子為多肽連接子。於一些實施例中,該連接子為長度至多25個胺基酸之多肽。於一些情況下,該連接子為以下之多肽:約2至24個胺基酸、2至20個胺基酸、2至18個胺基酸、2至14個胺基酸、2至12個胺基酸、2至10個胺基酸、2至8個胺基酸、2至6個胺基酸、6至24個胺基酸、6至20個胺基酸、6至18個胺基酸、6至14個胺基酸、6至12個胺基酸、6至10個胺基酸、6至8個胺基酸、8至24個胺基酸、8至20個胺基酸、8至18個胺基酸、8至14個胺基酸、8至12個胺基酸、8至10個胺基酸、10至24個胺基酸、10至20個胺基酸、10至18個胺基酸、10至14個胺基酸、10至12個胺基酸、12至24個胺基酸、12至20個胺基酸、12至18個胺基酸、12至14個胺基酸、14至24個胺基酸、14至20個胺基酸、14至18個胺基酸、18至24個胺基酸、18至20個胺基酸或20至24個胺基酸。於一些實施例中,該連接子為長度3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸之多肽。
於一些實施例中,該連接子長度為3至18個胺基酸。於一些實施例中,該連接子長度為12至18個胺基酸。於一些實施例中,該連接子長度為15至18個胺基酸。於一些實施例中,該連接子為長度18個胺基酸之多肽。
於一些實施例中,該非可裂解連接子不含有針對藉由蛋白酶裂解特異性識別之受質識別位點。於一些實施例中,該蛋白酶藉由免疫效應細胞、藉由腫瘤或藉由存在於腫瘤微環境中之細胞產生。於一些實施例中,該蛋白酶藉由免疫效應細胞產生且該免疫效應細胞為經活化之T細胞、自然殺手(NK)細胞或NK T細胞。於一些實施例中,該蛋白酶係選自蛋白裂解酶(matriptase)、基質金屬蛋白酶(MMP)、顆粒酶B及其組合。於一些實施例中,該蛋白酶為顆粒酶B。
於一些實施例中,該連接子包含胺基酸序列GS、GGS、GGGGS (SEQ ID NO: 149)、GGGGGS (SEQ ID NO: 135)及其組合。於一些實施例中,該連接子包含胺基酸序列(GGS)n
,其中n為1至10。於一些實施例中,該連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n
(SEQ ID NO: 173),其中n為1至10。於一些實施例中,該連接子包含(GGGGGS)n
(SEQ ID NO: 172),其中n為1至4。
於一些實施例中,該連接子為或包含GGS。於一些實施例中,該連接子為或包含GGGGS (SEQ ID NO: 149)。於一些實施例中,該連接子為或包含GGGGGS (SEQ ID NO: 135)。於一些實施例中,該連接子為或包含GGSGGS (「(GGS)2
」) (SEQ ID NO: 10)。於一些實施例中,該連接子為或包含GGSGGSGGS (「(GGS)3
」) (SEQ ID NO: 11)。於一些實施例中,該連接子為或包含GGSGGSGGSGGS (「(GGS)4
」) (SEQ ID NO: 12)。於一些實施例中,該連接子為或包含GGSGGSGGSGGSGGS (「(GGS)5
」) (SEQ ID NO: 13)。於一些實施例中,該連接子為或包含GGGGGSGGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 119)。於一些實施例中,該連接子為或包含GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 147)。於一些實施例中,該連接子為或包含GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 170)。於一些實施例中,該連接子為或包含GGGGG (SEQ ID NO: 192)。
於一些實施例中,該第一組分之抗原結合域及免疫球蛋白Fc區(於一些情況下,其為第一抗原結合域)經由一或多個其他胺基酸連接子(本文中稱作組分內連接子)以可操作方式連接。該第一組分之組分內肽連接子(亦稱作LP1)可為諸如第II.3節中所述之任一者之肽連接子。存在於第一組分中(即,連接Fc區及抗原結合域)之組分內連接子可為各種長度,例如,5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個胺基酸長度。於一些實施例中,此等組分內連接子主要由胺基酸甘胺酸及絲胺酸(本文中表示為GS-連接子)組成。於一些實施例中,該GS-連接子包含選自由以下組成之群之胺基酸序列:GGSGGS,即(GGS)2
(SEQ ID NO: 10);GGSGGSGGS,即(GGS)3
(SEQ ID NO: 11);GGSGGSGGSGGS,即(GGS)4
(SEQ ID NO: 12);及GGSGGSGGSGGSGGS,即(GGS)5
(SEQ ID NO: 13)。
於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體包含至少(i)包含該異二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子及該抗CD3抗體或其抗原結合片段之VH域之第一多肽;及(ii)包含該異二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子及該抗CD3抗體或其抗原結合片段之VL域之第二多肽;其中該第一多肽及該第二多肽中之一者或二者包含結合至腫瘤相關抗原(TAA)之至少一個抗原結合域。於一些實施例中,該抗CD3抗體或抗原結合片段之VH係在與結合至腫瘤相關抗原(TAA)之至少一個抗原結合域相同的多肽上。於一些實施例中,包含該抗CD3抗體或抗原結合片段之VL之多肽不含有結合至腫瘤相關抗原(TAA)之至少一個抗原結合域。
於一些實施例中,該第二組分包含CD3結合區之一或多個複本。
於一些實施例中,該CD3結合區為抗CD3抗體或抗原結合片段,其包含能結合或接合CD3 (諸如CD3ε)之抗體或其抗原結合片段之一或多個複本。於一些實施例中,該抗CD3結合域包含選自由以下組成之群之抗體或其抗原結合片段之一或多個複本:Fab片段、F(ab')2
片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體及單域輕鏈抗體。於一些實施例中,該抗CD3結合域包含結合CD3ε之Fv抗體片段(本文中稱作抗CD3ε Fv片段)。
於一些實施例中,該抗CD3ε Fv抗體片段包含選自SEQ ID NO: 32-81、191、196-200、211及212之群之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε Fv抗體片段包含與選自由SEQ ID NO: 32-81、191、196-200、211及212組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε Fv抗體片段包含選自SEQ ID NO: 32-62、196-198及211之群之胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 63-81、191、199、200及212組成之群之胺基酸序列之組合。於一些實施例中,該抗CD3ε Fv抗體片段包含與選自由SEQ ID NO: 32-62、196-198及211組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列及與選自由SEQ ID NO: 63-81、191、199、200及212組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列的組合。
於一些實施例中,該抗CD3ε Fv抗體片段為經二硫鍵穩定之抗CD3結合Fv片段(dsFv)。
於一些實施例中,該第二組分包含抗原結合域之一或多個複本。於某些實施例中,該第二組分含有至少兩個抗原結合域,諸如兩個抗原結合域。於一些實施例中,該第二組分之至少兩個抗原結合域結合至相同TAA。於一些情況下,該第二組分之至少兩個抗原結合域結合至相同TAA之不同抗原決定基。於一些情況下,該第二組分之至少兩個抗原結合域結合至相同TAA之相同抗原決定基。於一些實施例中,該第二組分之至少兩個抗原結合域結合至不同TAA。
於一些實施例中,該第一組分含有第一抗原結合域及該第二組分之抗原結合域為第二抗原結合域。於一些實施例中,該多重特異性抗原結合域包含至少第一抗原結合域及第二抗原結合域,其中該第一抗原結合域及第二抗原結合域結合至相同TAA。於一些情況下,該第一抗原結合域及該第二抗原結合域結合相同TAA之不同抗原決定基。於一些情況下,該第一抗原結合域及該第二抗原結合域結合相同TAA之相同抗原決定基。於一些實施例中,該多重特異性抗原結合域包含至少第一抗原結合域及第二抗原結合域,其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域結合不同TAA。
於一些實施例中,該第二組分之抗原結合域(於一些情況下,其為第二抗原結合域)及CD3結合區經由一或多個其他胺基酸連接子(本文中稱作組分內連接子)以可操作方式連接。該第二組分之組分內肽連接子(亦稱作LP2)可為諸如第II.3節中所述之任一者之肽連接子。存在於第二組分中(即,連接CD3結合區及抗原結合域)之組分內連接子可為各種長度,例如,5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個胺基酸長度。於一些實施例中,該第二組分之組分內連接子主要由胺基酸甘胺酸及絲胺酸(本文中表示為GS-連接子)組成。於一些實施例中,該GS-連接子包含選自由以下組成之群之胺基酸序列:GGSGGS,即(GGS)2
(SEQ ID NO: 10);GGSGGSGGS,即(GGS)3
(SEQ ID NO: 11);GGSGGSGGSGGS,即(GGS)4
(SEQ ID NO: 12);及GGSGGSGGSGGSGGS,即(GGS)5
(SEQ ID NO: 13)。
本文中提供一種多重特異性多肽構築體,該多重特異性多肽構築體包含包含異二聚體Fc區之第一組分及包含包含可變重鏈區(VH)及可變輕鏈區(VL)之抗CD3抗體或抗原結合片段之第二組分,其中:該包含抗CD3抗體或抗原結合片段之VH及VL連接至該異二聚體Fc區之相反多肽;該第一組分及該第二組分藉由連接子偶合,其中該異二聚體Fc區經定位至該抗CD3抗體或抗原結合片段之N端;及該第一組分及該第二組分中之一者或二者包含結合腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域。
於一些實施例中,該連接子為長度至多50個胺基酸之多肽。於一些實施例中,該連接子為長度至多25個胺基酸之多肽。於一些實施例中,該連接子為長度至多15個胺基酸之多肽。
於提供實施例中之任一者中,該結合TAA之一或多個抗原結合域導致與該TAA之一價、二價、三價或四價結合。於一些實施例中,該結合TAA之一或多個抗原結合域係獨立地選自sdAb、scFv或Fab。於一些實施例中,該結合TAA之一或多個抗原結合域為單鏈分子,諸如含有VH及VL之單鏈抗體片段,例如,sdAb或scFv。於一些實施例中,該結合TAA之一或多個抗原結合域為sdAb,諸如VH
H或VHNAR
。於一些實施例中,該等抗原結合域中之至少一者為Fab,其含有包含VH-CH1 (Fd)之第一鏈及包含VL-CL之第二鏈。
於一些實施例中,該結合TAA之抗原結合域連接至該抗CD3結合域之VH。於一些實施例中,該結合TAA之抗原結合域連接至連接該抗CD3結合域之VH之異二聚體Fc之同側(例如,隆突或穴)。於一些實施例中,該結合TAA之抗原結合域為連接至該抗CD3結合域之VH之sdAb。於一些實施例中,該結合TAA之抗原結合域為連接至連接該抗CD3結合域之VH之異二聚體Fc域之同側(例如,隆突或穴)的sdAb。於一些實施例中,該結合TAA之抗原結合域為連接至該抗CD3結合域之VH之VH
H或VHNAR
。於一些實施例中,該結合TAA之抗原結合域為連接至連接該抗CD3結合域之VH之異二聚體Fc域之同側(例如,隆突或穴)的VH
H或VHNAR
。於一些實施例中,該結合TAA之抗原結合域為連接至該抗CD3結合域之VH之VH
H。於一些實施例中,該結合TAA之抗原結合域為連接至連接該抗CD3結合域之VH之異二聚體Fc域之同側(例如,隆突或穴)的VH
H。於一些實施例中,該結合TAA之抗原結合域為連接至該抗CD3結合域之VH之VHNAR
。於一些實施例中,該結合TAA之抗原結合域為連接至同側(例如,隆突或穴)之VHNAR
或連接該抗CD3結合域之VH之Fc域。
於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體包含至少(i)包含異二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子及抗CD3抗體或抗原結合片段之VH域之第一多肽;及(ii)包含異二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子及抗CD3抗體或抗原結合片段之VL域之第二多肽,其中該第一多肽及該第二多肽中之一者或二者包含結合至腫瘤相關抗原(TAA)之至少一個抗原結合域。於一些情況下,僅該第一多肽或該第二多肽中之一者包含結合TAA之至少一個抗原結合域。
於一些實施例中,該(等)抗原結合域中之至少一者為Fab。於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體包含:(i)包含異二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子及抗CD3抗體或抗原結合片段之VH域之第一多肽;(ii)包含異二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子及抗CD3抗體或抗原結合片段之VL域之第二多肽,及(iii)包含結合至腫瘤相關抗原之Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL之第三多肽,其中該第一多肽及/或第二多肽還包含該Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL之另一者。於一些情況下,僅該第一多肽或該第二多肽中之一者包含該Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL之另一者。於一些實施例中,該第一多肽或該第二多肽均包含該Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL之另一者。於一些情況下,該Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL之另一者相對於該Fc區胺基端定位及/或相對於該多重特異性多肽構築體之第一多肽或第二多肽中之一者之CD3結合區羧基端定位。於一些實施例中,該Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL之另一者相對於該第一多肽或該第二多肽之Fc區胺基端定位及相對於該第一多肽或該第二多肽之另一者之CD3結合區羧基端定位。
於一些實施例中,該至少一個抗原結合域相對於該Fc區胺基端定位及/或相對於該多重特異性多肽構築體之第一多肽或第二多肽中之一者之CD3結合區羧基端定位。於一些情況下,該至少一個抗原結合域相對於該多重特異性構築體之Fc區胺基端定位及該第二抗原結合域相對於該多重特異性構築體之CD3結合區羧基端定位。於一些實施例中,該至少一個抗原結合域為sdAb。於一些實施例中,該為sdAb之至少一個抗原結合域經定位至該多重特異性構築體之CD3結合區之羧基端。於一些實施例中,該為sdAb之至少一個抗原結合域經定位至該多重特異性構築體之Fc區之胺基端。於一些實施例中,該至少一個抗原結合域為VH
H。於一些實施例中,該為VH
H之至少一個抗原結合域經定位至該多重特異性構築體之CD3結合區之羧基端。於一些實施例中,該為VH
H之至少一個抗原結合域經定位至該多重特異性構築體之Fc區之胺基端。
於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體包含第一抗原結合域與免疫球蛋白Fc多肽區(Fc區)之間之第一連接肽(LP1)。於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體包含抗CD3結合域(CD3結合區)與第二抗原結合域之間之第二連接肽(LP2)。於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體包含第一抗原結合域與免疫球蛋白Fc多肽區(Fc區)之間之第一連接肽(LP1)及抗CD3結合域(CD3結合區)與第二抗原結合域之間之第二連接肽(LP2)。
於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體具有如下自N端至C端之結構排列:第一抗原結合域–LP1-免疫球蛋白Fc多肽連接區(Fc區)–連接子–抗CD3結合域–LP2–第二抗原結合域。於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體具有如下自N端至C端之結構排列:第二抗原結合域–LP2–免疫球蛋白Fc多肽連接區(Fc區)–連接子–抗CD3結合域(CD3結合區)–LP1–第一抗原結合域。
於一些實施例中,該等兩種連接肽LP1及LP2係彼此不相同。於一些情況下,LP1或LP2獨立地為長度約1至20個胺基酸之肽。於一些實例中,LP1或LP2獨立地包含肽,該肽為或包含如SEQ ID NO: 10-13、119、135、147、149中所闡述之任何Gly-Ser連接子。
於一些實施例中,該多重特異性構築體為具有圖1中所示之結構排列中之任一者的構築體。於一些實施例中,該構築體為具有如下自N端至C端之結構排列之雙特異性構築體。該雙特異性構築體之N端包含結合腫瘤相關抗原(TAA)之第一抗原結合域。該第一結合域結合該TAA靶上之第一抗原決定基。偶合至該第一抗原結合域為調節FcγR相互作用及/或FcRn相互作用之中央免疫球蛋白Fc多肽區。於一些實施例中,該中央免疫球蛋白Fc多肽區係異二聚。該免疫球蛋白Fc多肽區偶合至連接子,該連接子位於該免疫球蛋白Fc多肽區之末端之位置C端處。該連接子連接至位於該Fc區之C端之抗CD3結合序列,於一些情況下,該連接子係在第二組分之遠端。
於一些實施例中,該抗CD3抗體或抗原結合片段為Fv抗體片段。於一些實施例中,該Fv抗體片段包含經二硫鍵穩定之抗CD3結合Fv片段(dsFv)。於一些實施例中,該抗CD3結合序列為Fv抗體片段,該Fv抗體片段經工程改造以包含可變重鏈(VH)與可變輕鏈(VL)區之間之二硫鍵,從而產生經二硫鍵穩定之抗CD3結合Fv片段(dsFv)。於一些實施例中,包含抗CD3 Fv之VH及VL域以可操作方式連接至異二聚體Fc區之相反成員。於此等實施例中,該抗CD3 Fv以一價方式結合CD3。雙特異性構築體之C端包含結合TAA之第二抗原結合域。於一些實施例中,該第二抗原結合域結合與位於第一組分內之第一抗原結合域相同之TAA。於一些實施例中,該第二抗原結合域結合TAA上之第二抗原決定基,其中該第二抗原決定基與TAA上之第一抗原決定基不具競爭性。於一些實施例中,該第二抗原結合域結合與第一抗原結合域結合之TAA不同之TAA。於所提供之態樣中,除非該多重特異性多肽構築體結合至同源抗原,否則該抗CD3 dsFv不接合CD3。
於一些實施例中,該雙特異性構築體之第一抗原結合域及第二抗原結合域各者包含抗體或其抗原結合片段之一或多個複本。於一些實施例中,該雙特異性構築體之第一抗原結合域及第二抗原結合域各者包含選自由以下組成之群之抗體或其抗原結合片段之一或多個複本:Fab片段、F(ab')2
片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體及單域輕鏈抗體。於一些實施例中,該抗原結合域或該等抗原結合域各者獨立地為選自由以下組成之群之抗體或其抗原結合片段:Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體及單域輕鏈抗體。於一些實施例中,該雙特異性構築體之第一抗原結合域及第二抗原結合域各者包含一或多個單域抗體(sdAb)片段(例如,VH
H、VNAR
、經工程改造之VH
或VK
域)之一或多個複本。VH
Hs可自僅天然駱駝狀重鏈抗體,一般而言僅產生重鏈抗體之經修飾之齧齒動物,或初始/合成駱駝狀或人源化駱駝狀單域抗體庫產生。VNAR
s可僅自軟骨魚狀重鏈抗體產生。已實施各種方法以自習知二聚體VH
及VK
域產生單體sdAb,該等方法包括介面工程改造及選擇特異性生殖系家族。
於一些實施例中,該抗體或抗原結合片段為sdAb。於一些情況下,該sdAb為人類或人源化sdAb。於一些態樣中,該sdAb為VH
H、VNAR
、經工程改造之VH域或經工程改造之VK域。於一些實例中,該抗體或其抗原結合片段為scFv。於一些情況下,該抗體或其抗原結合片段為Fab。
於一些所提供實施例中之任一者中,該抗CD3抗體或抗原結合片段包含以下:包含胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 16)之VH CDR1、包含胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 17)之VH CDR2、包含胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 18)之VH CDR3、包含胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 19)之VL CDR1、包含胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 20)之VL CDR2、及包含胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 21)之VL CDR3。
於一些實施例中,該抗CD3抗體或抗原結合片段包含:具有SEQ ID NO: 14、32-62、196-198及211中之任一者之胺基酸序列或展示與SEQ ID NO: 14、32-62、196-198及211中之任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之序列之VH;及具有SEQ ID NO: 15、63-81、191、199、200及212中之任一者之胺基酸序列或展示與SEQ ID NO: 15、63-81、191、199、200及212中之任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之序列之VL。
於一些實施例中,該抗CD3抗體或抗原結合片段為Fv。於一些實施例中,該抗CD3 Fv包含:具有SEQ ID NO: 14、32-43、45-47、196及211中之任一者之胺基酸序列或展示與SEQ ID NO: 14、32-43、45-47、196及211中之任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之序列之VH;及具有SEQ ID NO: 15、63、65-71、73、75、77及199中之任一者之胺基酸序列或展示與SEQ ID NO: 15、63、65-71、73、75、77及199中之任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之序列之VL。於一些情況下,該抗CD3 dsFv包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列及SEQ ID NO: 15之胺基酸序列。於其他情況下,該抗CD3 Fv包含SEQ ID NO: 196之胺基酸序列及SEQ ID NO: 199之胺基酸序列。
於一些情況下,該抗CD3 dsFv包含SEQ ID NO: 211之胺基酸序列及SEQ ID NO: 212之胺基酸序列。
於一些實施例中,該CD3結合域之VH及VL鏈區各者獨立地包含至少一個胺基酸修飾。於一些實施例中,該CD3結合域之VH及VL鏈區之至少一個胺基酸修飾增加該CD3結合域之穩定性。於一些實施例中,該CD3結合域之VH及VL鏈區之至少一個胺基酸修飾增加該CD3結合域結合CD3之能力。於一些實施例中,該CD3結合域之VH及VL鏈區之至少一個胺基酸修飾藉由創建該等VH及VL鏈區之間之二硫鍵來增加CD3結合域之穩定性。
於一些實施例中,該CD3結合區具有VH與VL區之間之經二硫鍵穩定之連接。於一些實施例中,該抗CD3抗體或抗原結合片段為經二硫鍵穩定之Fv (dsFv)。於一些實施例中,該經二硫鍵穩定之抗CD3 Fv包含具有突變G44C之抗CD3 VH及具有突變G100C之抗CD3 VL,該等突變藉由Kabat編號。於一些實施例中,該經二硫鍵穩定之抗CD3 Fv包含具有Cys之位置105處之突變之抗CD3 VH及具有Cys之位置43處之突變之抗CD3 VL,該等突變藉由Kabat編號。
於一些實施例中,該抗CD3 dsFv包含:具有SEQ ID NO: 44及49-62、197及198中之任一者之胺基酸序列或展示與SEQ ID NO: 44及49-62、197及198中之任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之序列之VH;及具有SEQ ID NO: 64、72、74、76、78-81、191、200及212中之任一者之胺基酸序列或展示與SEQ ID NO: 64、72、74、76、78-81、191、200及212中之任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之序列之VL。於一些情況下,該抗CD3 dsFv包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列及SEQ ID NO: 72之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3 dsFv包含SEQ ID NO: 198之胺基酸序列及SEQ ID NO: 200之胺基酸序列。
於一些實施例中,該多重特異性構築體亦包含結合至該多重特異性構築體之藥劑。於一些實施例中,該藥劑為治療劑。於一些實施例中,該藥劑為可檢測部分。於一些實施例中,該可檢測部分為診斷劑。於一些實施例中,該藥劑經由連接子結合至該多重特異性構築體。於一些實施例中,該連接子為非可裂解連接子。
於一些實施例中,本文中所述之多重特異性構築體結合一或多種額外藥劑或額外藥劑之組合使用。適宜額外藥劑包括用於預期應用(諸如例如,癌症)之目前醫藥及/或外科療法。例如,該多重特異性構築體可結合額外化療劑或抗腫瘤劑使用。
於一些實施例中,該多重特異性構築體及額外藥劑經調配成單一治療組合物,及同時投與該多重特異性構築體及額外藥劑。於一些實施例中,該多重特異性構築體及額外藥劑彼此分離,例如,各者經調配成分開治療組合物,及同時投與該多重特異性構築體及該額外藥劑,或在治療方案期間之不同時間投與該多重特異性構築體及該額外藥劑。例如,在投與該額外藥劑之前投與該多重特異性構築體,投與該額外藥劑隨後投與該多重特異性構築體,或以交替方式投與該多重特異性構築體及該額外藥劑。如本文中所述,以單一劑量或多個劑量投與該多重特異性構築體及額外藥劑。
於一些實施例中,該多重特異性構築體天然含有一或多個二硫鍵。於一些實施例中,該多重特異性構築體可經工程改造以包含一或多個二硫鍵。
本發明亦提供編碼本文中所述多重特異性構築體之至少一部分之單離核酸分子或多核苷酸及/或編碼本文中所述多重特異性構築體之一或多個核酸分子,諸如例如,至少編碼該多重特異性構築體之第一組分之至少一部分之第一核酸及編碼該多重特異性構築體之第二組分之至少一部分之第二核酸,以及包含此等經單離核酸序列之載體。
所提供實施例為編碼所提供多重特異性多肽構築體中之任一者之多核苷酸。亦提供編碼所提供多重特異性多肽構築體中之任一者之多肽鏈之多核苷酸。還提供一種多核苷酸,其包含編碼所提供多重特異性構築體中之任一者之第一多肽之第一核酸序列及編碼多重特異性構築體之第二多肽之第二核酸序列,其中該第一核酸序列及第二核酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或編碼自我裂解肽之核酸或引起核糖體跳躍之肽分離。於一些情況下,該第一核酸序列及第二核酸序列以可操作方式連接至相同啟動子。於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體包含第三多肽鏈,及該多核苷酸還包含編碼該多重特異性構築體之第三多肽之第三核酸。於一些實施例中,該第三核酸藉由內部核糖體進入位點(IRES)、或編碼自我裂解肽之核酸或引起核糖體跳躍之肽自該第一多肽及/或第二多肽分離及/或該第三核酸序列以可操作方式連接至與該第一核酸序列及/或第二核酸序列相同之啟動子。於一些實例中,該編碼自我裂解肽之核酸或引起核糖體跳躍之肽係選自T2A、P2A、E2A或F2A (SEQ ID NO: 159-164,或藉由SEQ ID NO: 165中所闡述之序列編碼)。
本文中提供一種載體,其包含所提供多核苷酸中之任一者。於一些實施例中,該載體為表現載體。於一些實例中,該載體為病毒載體或真核載體,視情況其中該真核載體為哺乳動物載體。
提供一種細胞,其包含所提供多核苷酸或載體中之任一者。於係情況下,該細胞經重組或單離。於一些實例中,該細胞為哺乳動物細胞。於一些實例中,該細胞為HEK293或CHO細胞。
本發明提供藉由在導致表現多重特異性構築體之條件下培養細胞來產生多重特異性構築體之方法,其中該細胞包含此(此等)核酸分子。於一些實施例中,該細胞包含此載體。
本文中提供一種產生多重特異性多肽構築體之方法,該方法包括向細胞中引入所提供多核苷酸或載體中之任一者及在導致表現多重特異性構築體之條件下培養細胞以產生該多重特異性多肽構築體。亦提供一種產生多重特異性多肽構築體之方法,該方法包括在藉由細胞表現或產生多重特異性多肽之條件下培養所提供細胞中之任一者。於一些情況下,該細胞為哺乳動物細胞。於一些實例中,該細胞為HEK293或CHO細胞。於一些實施例中,該方法還包括自細胞單離或純化該多重特異性多肽構築體。於一些情況下,該多重特異性多肽構築體為異二聚體。
本文中提供藉由所提供方法中之任一者產生之多重特異性多肽構築體。
本文中提供一種刺激或誘導免疫反應之方法,該方法包括使靶細胞及T細胞與所提供多重特異性多肽構築體或醫藥組合物中之任一者接觸,該靶細胞表現藉由多重特異性多肽構築體識別之腫瘤相關抗原。於一些實施例中,該靶細胞為表現腫瘤相關抗原(TAA)之腫瘤細胞。
於一些實施例中,離體或於活體外進行該接觸。於一些實施例中,於個體之活體內進行該接觸。
提供一種刺激或誘導個體之免疫反應之方法,該方法包括對有需要之個體投與治療上有效量之所提供多重特異性結合物或醫藥組合物中之任一者。於一些情況下,該方法增加細胞介導之免疫。於一些實施例中,該方法增加T-細胞活性。於一些實施例中,該方法增加溶細胞T-細胞(CTL)活性。於一些實例中,對腫瘤或癌症增加該免疫反應。於一些實施例中,該方法治療個體之疾病或病狀。
本發明亦提供藉由對需此治療或預防之個體投與本發明之多重特異性多肽構築體來治療、預防、延遲一或多種病理之進展或以其他方式改善一或多種病理之症狀或減輕與此等病理相關之症狀的方法。本文中提供一種治療個體之疾病或病狀之方法,該方法包括對有需要之個體投與治療上有效量之所提供多重特異性結合物或醫藥組合物中之任一者。於一些實施例中,該疾病或病狀為腫瘤或癌症。
於所提供方法中之任一者之一些實施例中,該個體(諸如待治療之個體)為(例如)人類或其他哺乳動物。於所提供方法中之任一者之一些實施例中,該個體為人類。於一些實施例中,該個體為非人類哺乳動物,諸如非人類靈長類動物、伴生動物(例如,貓、狗、馬)、農場動物、工作動物或動物園動物。於一些實施例中,該個體為齧齒動物。
此等方法及用途之實施例中之任一者中所使用之本發明的多重特異性多肽構築體可在疾病之任何階段投與。例如,此多重特異性多肽構築體可對患有任何階段(自早期至轉移)之癌症之患者投與。本文中可交換使用術語個體及患者。
可在包括新輔助療法之治療方案中使用此等方法及用途之實施例中之任一者中所使用之本發明的多重特異性多肽構築體。
此等方法及用途之實施例中之任一者中所使用之本發明的多重特異性多肽構築體可單獨或與一或多種額外藥劑組合投與,該一或多種額外藥劑包括小分子抑制劑、其他基於抗體之療法、多肽或基於肽之療法、基於核酸之療法及/或其他生物製劑。於一些實施例中,多重特異性多肽構築體與一或多種額外藥劑(諸如,舉非限制性實例而言,化療劑,諸如烷基化劑、抗代謝物、抗微管劑、拓撲異構酶抑制劑、細胞毒性抗生素及任何其他核酸損傷劑)組合投與。於一些實施例中,該額外藥劑為紫杉烷,諸如特素(paclitaxel) (例如,Abraxane®)。於一些實施例中,該額外藥劑為抗代謝物,諸如吉西他濱(gemcitabine)。於一些實施例中,該額外藥劑為烷基化劑,諸如基於鉑之化療,諸如卡鉑(carboplatin)或順鉑(cisplatin)。於一些實施例中,該額外藥劑為靶向劑,諸如激酶抑制劑,例如,索拉非尼(sorafenib)或埃羅替尼(erlotinib)。於一些實施例中,該額外藥劑為靶向劑,諸如另一種抗體,例如,單株抗體(例如,貝伐單抗(bevacizumab))、雙特異性抗體或多重特異性抗體。於一些實施例中,該額外藥劑為蛋白酶抑制劑,諸如硼替佐米(bortezomib)或卡非佐米(carfilzomib)。於一些實施例中,該額外藥劑為免疫調節劑,諸如來那度胺(lenolidominde)或IL-2。於一些實施例中,該額外藥劑為放射物。於一些實施例中,該額外藥劑為認為由熟習此項技術者關注之標準之藥劑。於一些實施例中,該額外藥劑為熟習此項技術者熟知之化療劑。於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體及該(等)額外藥劑經調配成單一組合物。於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體及該(等)額外藥劑呈兩種或更多種分開組合物投與。於一些實施例中,同時投與該多重特異性多肽構築體及該(等)額外藥劑。於一些實施例中,依序投與該多重特異性多肽構築體及該(等)額外藥劑。
於一些實施例中,該(等)額外藥劑為化療劑,諸如選自由以下組成之群之化療劑:多西他奇(docetaxel)、特素、abraxane (即,白蛋白結合之特素)、多柔比星(doxorubicin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、卡鉑、順鉑、依立替康(irinotecan)及吉西他濱。
於一些實施例中,該(等)額外藥劑為檢查點抑制劑、激酶抑制劑、於腫瘤微環境中靶向抑制劑之藥劑、及/或T細胞或NK促效劑。於一些實施例中,該(等)額外藥劑為單獨或與另一種額外藥劑(諸如化療劑或抗腫瘤劑)組合之放射療法。於一些實施例中,該(等)額外藥劑為疫苗、腫瘤病毒及/或DC活化劑,諸如,舉非限制性實例而言,類鐸受體(TLR)促效劑及/或α-CD40。於一些實施例中,該(等)額外藥劑為經設計以經由ADCC或經由直接結合至毒素(例如,抗體藥物結合物(ADC))殺死腫瘤之靶向腫瘤之抗體。
於一些實施例中,該檢查點抑制劑為選自由CTLA-4、LAG-3、PD-1、PDL1、TIGIT、TIM-3、B7H3、B7H4及Vista組成之群之靶之抑制劑。於一些實施例中,該激酶抑制劑係選自由B-RAFi、MEKi及Btk抑制劑(諸如依魯替尼(ibrutinib)組成之群。於一些實施例中,該激酶抑制劑為克唑替尼(crizotinib)。於一些實施例中,該腫瘤微環境抑制劑係選自由以下組成之群:IDO抑制劑、α-CSF1R抑制劑、α-CCR4抑制劑、TGF-β、源自骨髓之抑制細胞、或T-調節細胞。於一些實施例中,該促效劑係選自由以下組成之群:OX40、GITR、CD137、CD28、ICOS、CD27及HVEM。於一些實施例中,該檢查點抑制劑為結合選自CTLA-4、PD-1及/或PD-L1之靶之抗體。於一些實施例中,該檢查點抑制劑為抗CTLA4抗體、抗PD-1抗體、及抗PD-L1抗體及/或其組合。於一些實施例中,該檢查點抑制劑為抗CTLA4抗體,諸如例如,Yervoy™。於一些實施例中,該檢查點抑制劑為抗PD-1抗體,諸如例如,Opdivo™及/或Keytruda™。
於一些實施例中,該抑制劑為CTLA-4抑制劑。於一些實施例中,該抑制劑為LAG-3抑制劑。於一些實施例中,該抑制劑為PD-1抑制劑。於一些實施例中,該抑制劑為PDL1抑制劑。於一些實施例中,該抑制劑為TIGIT抑制劑。於一些實施例中,該抑制劑為TIM-3抑制劑。於一些實施例中,該抑制劑為B7H3抑制劑。於一些實施例中,該抑制劑為B7H4抑制劑。於一些實施例中,該抑制劑為Vista抑制劑。於一些實施例中,該抑制劑為B-RAFi抑制劑。於一些實施例中,該抑制劑為MEKi抑制劑。於一些實施例中,該抑制劑為Btk抑制劑。於一些實施例中,該抑制劑為依魯替尼。於一些實施例中,該抑制劑為克唑替尼。於一些實施例中,該抑制劑為IDO抑制劑。於一些實施例中,該抑制劑為α-CSF1R抑制劑。於一些實施例中,該抑制劑為α-CCR4抑制劑。於一些實施例中,該抑制劑為TGF-β。於一些實施例中,該抑制劑為源自骨髓之抑制細胞。於一些實施例中,該抑制劑為T-調節細胞。
於一些實施例中,該促效劑為OX40。於一些實施例中,該促效劑為GITR。於一些實施例中,該促效劑為CD137。於一些實施例中,該促效劑為CD28。於一些實施例中,該促效劑為ICOS。於一些實施例中,該促效劑為CD27。於一些實施例中,該促效劑為HVEM。
於一些實施例中,在治療期間及/或於治療後投與該多重特異性多肽構築體與一或多種額外藥劑(諸如例如,化療劑、抗發炎劑及/或免疫抑制劑)組合。於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體及該額外藥劑經調配成單一治療組合物,及同時投與該多重特異性多肽構築體及該額外藥劑。或者,該多重特異性多肽構築體及額外藥劑彼此分離,例如,各者經調配成分開治療組合物,及同時投與該多重特異性多肽構築體及該額外藥劑,或在治療方案期間之不同時間投與該多重特異性多肽構築體及該額外藥劑。例如,在投與該額外藥劑之前投與該多重特異性多肽構築體,投與該額外藥劑隨後投與該多重特異性多肽構築體,或以交替方式投與該多重特異性多肽構築體及該額外藥劑。如本文中所述,該多重特異性多肽構築體及額外藥劑以單一劑量或多個劑量投與。
於一些實施例中,同時投與該多重特異性多肽構築體及該(等)額外藥劑。例如,該多重特異性多肽構築體及該(等)額外藥劑可經調配成單一組合物或呈兩個或更多個分開組合物投與。於一些實施例中,依序投與該多重特異性多肽構築體及該(等)額外藥劑,或在治療方案期間之不同時間投與該多重特異性多肽構築體及該額外藥劑。
除了上述要素外,該多重特異性多肽構築體可含有額外要素,諸如例如,該多重特異性多肽構築體之胺基酸序列N端或C端。例如,多重特異性多肽構築體可包含靶向部分以促進所關注細胞或組織之遞送。多重特異性多肽構築體可結合至藥劑,諸如治療劑、可檢測部分或診斷劑。本文中揭示藥劑之實例。
該多重特異性多肽構築體亦可包含結合藥劑、連接子及本文中結合本發明之多肽特異性多肽構築體所述之其他組分中之任一者。
本發明亦關於免疫結合物,該等免疫結合物包括結合至細胞毒性劑,諸如毒素(例如,細菌、真菌、植物或動物起源之酵素活性毒素或其片段)或放射性同位素(即,放射結合物)之多重特異性多肽構築體。用於靶向疾病T細胞(諸如於源自T細胞之淋巴瘤中)之適宜細胞毒性劑包括(例如)朵拉司他汀(dolastatin)及其衍生物(例如,奧利司他汀(auristatin) E、AFP、MMAD、MMAF、MMAE)。於一些實施例中,該藥劑為朵拉司他汀。於一些實施例中,該藥劑為奧利司他汀或其衍生物。於一些實施例中,該藥劑為美登醇(maytansinoid)或美登醇衍生物。於一些實施例中,該藥劑為DM1或DM4。於一些實施例中,該藥劑為多卡黴素(duocarmycin)或其衍生物。於一些實施例中,該藥劑為卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物。於一些實施例中,該藥劑為吡咯苯并二氮雜環庚烷。
於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體與該細胞毒性劑之間之連接子係可裂解。於一些實施例中,該連接子係非可裂解。於一些實施例中,存在兩種或更多種連接子。該兩種或更多種連接子係全部相同,例如,可裂解或非可裂解,或該兩種或更多種連接子係不同,例如,至少一者可裂解及至少一者非可裂解。
該等多重特異性多肽構築體及其結合物可用於治療各種病症及/或疾病之方法中。疾病之非限制性實例包括:所有類型之癌症(乳癌、肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、頭頸癌、胰癌等)、類風濕性關節炎、克羅恩氏病(Crohn’s disuse)、SLE、心血管損傷、缺血等。例如,適應症將包括白血病(包括T-細胞急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL))、淋巴母細胞性疾病(包括多發性骨髓瘤)、及實體腫瘤(包括肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、胰癌及乳癌(包括三陰性乳癌))。例如,適應症包括骨病或癌症之轉移,不管原發性腫瘤來源;乳癌,舉非限制性實例而言包括ER/PR+乳癌、Her2+乳癌、三陰性乳癌;結腸直腸癌;子宮內膜癌;胃癌;膠質母細胞瘤;頭頸癌,諸如食道癌;肺癌,經由非限制實例諸如非小細胞肺癌;多發性骨髓瘤卵巢癌;胰癌;前列腺癌;肉瘤,諸如骨肉瘤;腎癌,舉非限制性實例而言諸如腎細胞癌;及/或皮膚癌,經由非限制實例諸如鱗狀細胞癌、基底細胞癌或黑色素瘤。於一些實施例中,該癌症為鱗狀細胞癌。於一些實施例中,該癌症為皮膚鱗狀細胞癌。於一些實施例中,該癌症為食道鱗狀細胞癌。於一些實施例中,該癌症為頭頸鱗狀細胞癌。於一些實施例中,該癌症為肺鱗狀細胞癌。
亦提供一種醫藥組合物,其包含本文中所提供之多重特異性多肽構築體中之任一者及醫藥上可接受之載劑。於一些情況下,該醫藥組合物係無菌。根據本發明之醫藥組合物可包含本發明之多重特異性多肽構築體及載劑。此等醫藥組合物可包含於套組(諸如例如,診斷套組)中。
熟習此項技術者將瞭解本發明之抗體具有各種用途。例如,本發明之蛋白質係用作各種病症之治療劑。本發明之抗體亦用作診斷套組之試劑或用作診斷工具,或此等抗體可用於競爭分析中以產生治療劑。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2018年4月11日申請之標題為「MULTISPECIFIC POLYPEPTIDE CONSTRUCTS HAVING CONSTRAINED CD3 BINDING AND RELATED METHODS AND USES」之美國臨時申請案62/656,331的優先權,出於所有目的,該案之全部內容以引用的方式併入。參考序列表之併入
本申請案連同呈電子格式之序列表一起提交。將該序列表提供為2019年4月07日創建之標題為744952000241SeqList.TXT之檔案,其大小為234千位元組。電子格式之序列表中之資訊之全文以引用的方式併入。
本發明提供呈多重特異性多肽構築體形式之經受限T-細胞接合融合蛋白,該等多重特異性多肽構築體結合至少CD3及第二抗原。本文中所提供之多重特異性多肽構築體包含至少包含結合以可操作方式連接至免疫球蛋白Fc區之抗原之抗原結合域之一或多個複本的第一組分,包含至少一個結合CD3之結合域(本文中稱作抗CD3結合域或CD3結合區,其為本文中可交換使用之術語)之一或多個複本的第二組分,及連接子,諸如連接第一組分及第二組分之多肽連接子。於一些實施例中,該抗原為腫瘤相關抗原(TAA)。於一些實施例中,該連接子為非可裂解連接子。於一些實施例中,該連接子不含有藉由蛋白酶(諸如為顆粒酶B、MMP或蛋白裂解酶之蛋白酶)特異性識別之受質識別位點。
所提供多重特異性多肽構築體包含組態,其中該含有Fc區之第一組分為含有CD3結合區之第二組分之N端。於此實施例中,該第一組分及該第二組分經由C端連接子連接至Fc區末端。於一些實施例中,該(等)抗原結合域位於多重特異性多肽構築體之胺基端(N端)。於一些實施例中,該(等)抗原結合域位於多重特異性多肽構築體之羧基端(C端)。於一些實施例中,該(等)抗原結合域位於多重特異性多肽構築體之N端區及C端區二者。如本文中所提供之多重特異性多肽構築體之各種組態示於圖 1
中。
所提供多重特異性多肽構築體展示經受限T-細胞接合活性,因為一旦抗原經由抗原結合域結合,此等構築體僅實質結合至CD3。此於本文中所提供之實例及圖中示例,其證明經受限CD3接合蛋白有限結合TAA陽性細胞,同時很少結合T細胞或不結合T細胞之能力。此獨特性質允許經受限CD3接合蛋白分佈至位點(其中存在TAA),而不結合至外周T細胞。此形式不同於其他CD3接合多重特異性構築體,因為不允許或消除構成CD3結合,藉由避免外周T-細胞結合及允許最佳分佈至該(等)位點提供顯著利益,在該(等)位點處呈遞抗原,如藉由抗原結合域所識別。此外,其他CD3接合構築體介導抗原依賴性T-細胞活化。然而,本文中所提供之多重特異性多肽構築體介導抗原依賴性T-細胞結合及活化二者。
於一些態樣中,所提供多重特異性多肽構築體之經受限T-細胞接合活性係由於Fc區N端至CD3結合區之定位。於一些實施例中,此定位減少、減弱、抑制及/或防止藉由CD3結合區之CD3結合。在藉由抗原結合域之抗原結合不存在下,本文中所提供之多重特異性多肽構築體證明降低或消除之CD3結合及T-細胞活化能力。於一些實施例中,在藉由多重特異性多肽構築體之該(等)抗原結合域介導之抗原結合事件之存在下,藉由CD3結合區結合CD3之能力極大增強。於一些實施例中,在藉由多重特異性多肽構築體之該(等)抗原結合域介導之抗原結合事件之存在下,活化T-細胞之能力極大增強。藉由多重特異性多肽構築體內之該(等)抗原結合域接合其同源抗原導致隨後T-細胞接合並介導抗原依賴性T-細胞活化,諸如細胞毒性、細胞介素釋放、脫粒及增殖。於一些實施例中,所提供多重特異性多肽構築體可用於增加免疫反應,諸如增強T-細胞活性,包括溶細胞(或細胞毒性) T-細胞活性。於一些態樣中,免疫反應之調節可治療個體之疾病或病狀。
於一些實施例中,一或多個抗原結合域結合腫瘤細胞或腫瘤微環境之細胞上之抗原。於一些態樣中,所提供多重特異性多肽構築體可用於增加免疫反應,諸如T-細胞活性,例如,對腫瘤或癌症之細胞毒性活性。於一些實施例中,所提供多重特異性多肽構築體可用於治療個體之腫瘤或癌症。
於一些實施例中,本發明之多重特異性多肽構築體確保不經由外周血中之CD3結合T-細胞,因為此等構築體之CD3結合區受限或原本藉由Fc區之存在阻斷及/或抑制。因此,本發明之多重特異性多肽構築體提供許多優點。於一些態樣中,此等構築體限制藉由結合所有T-細胞引起之減弱效應。於一些態樣中,此等構築體降低全身毒性。
於一些實施例中,本發明之所提供多重特異性多肽構築體允許可控生物分佈至個體之所需位點,諸如例如,腫瘤相關抗原(TAA)表現位點。TAA表現位點包括(例如)腫瘤及周圍腫瘤微環境。
於一些實施例中,本發明之多重特異性多肽構築體展示對CD3及一或多個其他抗原之特異性。於一些實施例中,該等多重特異性多肽構築體可含有一個以上能結合一或多個TAA之抗原結合域,諸如2、3或4個抗原結合域,參見例如,圖 1
。於一些實施例中,該一或多個抗原結合域結合相同抗原。於一些實施例中,該等多重特異性多肽構築體包含一個以上抗原結合域,該等抗原結合域結合相同抗原上之不同抗原決定基。於一些實施例中,該等多重特異性多肽構築體包含一個以上抗原結合域,該等抗原結合域結合一或多個不同抗原。於一些實施例中,該等多重特異性多肽構築體包含結合相同抗原上之不同抗原決定基之一個以上抗原結合域以及包含結合至一或多個不同抗原之額外抗原結合域。於一些態樣中,所提供多重特異性多肽構築體為雙特異性多肽構築體,使得其能經由結合該多重特異性多肽構築體之抗原結合域結合至CD3及至另一抗原,諸如TAA。於一些實例中,所提供多重特異性多肽構築體為雙特異性多肽構築體,該等構築體通過使用第一抗原結合域及第二抗原結合域提供一或多個TAA之四價接合。例如,於一些實施例中,該等雙特異性多肽構築體包含第一抗原結合單域抗體(sdAb)及第二抗原結合sdAb。
於一些實施例中,根據結合CD3及隨後活化T-細胞之能力,本文中所提供之多重特異性多肽構築體以兩種狀態存在:(1)當不結合該(等)抗原結合域中之任一者或所有使得CD3結合受限及避免T-細胞相互作用時,「不活躍」狀態產生,及(2)在藉由該(等)抗原結合域中之任一者或所有抗原結合使得CD3結合區能結合CD3及允許T-細胞相互作用後,「活躍」狀態產生。
於一些實施例中,Fc區經由連接子連接至CD3結合域。於一些實施例中,Fc區經由非可裂解連接子(諸如所述中之任一者)連接至CD3結合區。
於一些實施例中,Fc區為均二聚體Fc區。於一些實施例中,Fc區為異二聚體Fc區。於一些實施例中,Fc區為單體Fc區。於一些實施例中,多重特異性多肽構築體之Fc區能與FcγR相互作用並介導先天免疫效應功能,例如,抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)。於一些實施例中,多重特異性多肽構築體之Fc區能與補體蛋白(即C1q)相互作用並介導補體依賴性細胞毒性。因此,於一些態樣中,本發明之多重特異性多肽構築體允許多個免疫效應機制,包括先天免疫效應及T-細胞。
於一些實施例中,本發明之多重特異性多肽構築體允許T-細胞及NK細胞介導之細胞毒性同時產生。於一些情況下,此活性可產生於多重特異性多肽構築體中,其中包含可靶向給定TAA之不同及/或非競爭性抗原決定基之第一抗原結合域(例如,第一抗TAA抗原結合域)及第二抗原結合域(例如,第二抗TAA抗原結合域)。
期望經受限CD3接合構築體可供與任何TAA結合域使用,藉由避免與外周T-細胞相互作用及介導強效TAA依賴性T-細胞毒性允許腫瘤或腫瘤微環境內之更好治療暴露。於一些實施例中,第二部分或組分含有CD3結合區,該結合區對CD3一價,使得除非TAA存在,否則不活化T-細胞。
於一些態樣中,本發明之多重特異性多肽構築體提供超過目前雙特異性療法之許多優點。本發明之多重特異性多肽構築體小於習知治療抗體,例如,150 kDa相對於125 kDa,其將允許更好靶(例如,腫瘤)滲透。於一些態樣中,整個多重特異性多肽構築體之尺寸提供構築體之長半衰期。於一些態樣中,本發明之多重特異性多肽構築體展示降低之全身毒性或腫瘤及/或腫瘤微環境外之任何區域之毒性,因為在CD3接合發生之前,藉由CD3結合區之CD3結合依賴於TAA接合。
本文中所引用之所有公開案及專利文檔以引用的方式併入本文中,併入程度如同特別且個別指示各此公開案或文檔以引用的方式併入本文中般。公開案及專利文檔之引用不意欲承認任一者為相關先前技術,亦不構成對相同內容或日期之任何承認。現已經由書面描述來描述本發明,熟習此項技術者將知曉可於各種實施例中實踐本發明及先前描述及以下實例係出於說明目的且不限於隨後申請專利範圍。I. 定義
除非另有指定,否則關於本發明使用之科技術語應具有由一般技術者通常瞭解之含義。術語「一(a)」實體或「一個(an)」實體係指該實體中之一或多者。例如,化合物係指一或多種化合物。因而,術語「一(a/an)」、「一或多者」及「至少一者」可交換使用。此外,除非上下文所需,否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。一般而言,關於本文中所述細胞及組織培養、分子生物學、及蛋白質及寡核苷酸或多核苷酸化學及雜交所利用之命名法及其技術為此項技術中熟知且常用之彼等。標準技術係用於重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉形(例如,電穿孔、脂質轉染)。根據製造商之說明或如此項技術中通常實現或如本文中所述進行酶促反應及純化技術。一般根據此項技術中熟知及如各種一般及更特定參考文獻中所述之習知方法進行上述技術及程序,整篇本說明書引用及討論該等參考文獻。參見例如,Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))。關於本文中所述之分析化學、合成有機化學、及醫藥化學所利用之命名法及其實驗程序及技術為此項技術中熟知且常用之彼等。標準技術係用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及遞送、及治療患者。
如根據本發明所用,除非另有指明,否則應理解下列術語具有下列含義:
如本文中所用,術語「抗體」係指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白(Ig)分子(即,含有特異性結合抗原(與抗原免疫反應)之抗原結合位點之分子)之抗原結合部分。「特異性結合」或「與…免疫反應」或「免疫特異性結合」意指抗體與所需抗原之一或多個抗原決定基反應且不與其他多肽反應或在低得多的親和力(Kd
> 10-6
)下結合。抗體包括(但不限於)多株、單株、嵌合、全人類、域抗體、單鏈、Fab及F(ab')2
片段、Fvs、scFvs及Fab表現庫。通常,「抗原結合片段」含有結合至所關注抗原之至少一個抗原決定基之免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈之至少一個CDR。就此而言,抗原結合片段可包含來自結合抗原之抗體之可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)序列之1、2、3、4、5或所有6個CDR,諸如針對含有VH及VL之抗體,一般6個CDR (針對重鏈及輕鏈各者,「CDR1」、「CDR2」及「CDR3」),或針對含有單個可變域之抗體,3個CDR。抗原結合片段包含單域抗體,諸如僅含有VH或僅含有VL之彼等,包括例如,VH
H、VNAR
、經工程改造之VH
或VK
域。
已知基本抗體結構單元包含四聚體。各四聚體由兩個相同多肽鏈對組成,各對具有一個「輕」鏈(約25 kDa)及一個「重」鏈(約50至70 kDa)。各鏈之胺基端部分包含約100至110或更多個胺基酸之可變區,其主要負責抗原識別。各鏈之羧基端部分定義恆定區,其主要負責效應功能。一般而言,自人類獲得之抗體分子係與類別IgG、IgM、IgA、IgE及IgD中之任一者相關,根據存在於分子中之重鏈之性質其彼此不同。某些類別亦具有子類別,諸如IgG1
、IgG2
、IgG3
、IgG4
及其他。此外,於人類中,輕鏈可為κ鏈或λ鏈。
如本文中所用,術語「單株抗體」(mAb)或「單株抗體組合物」係指抗體分子群體,該群體僅含有由獨特輕鏈基因產品及獨特重鏈基因產品組成之抗體分子之一個分子種類。特定言之,單株抗體之互補決定區(CDR)於群體之所有分子中係相同。MAb含有能與抗原之特定抗原決定基免疫反應之抗原結合位點,該抗原藉由對其獨特結合親和力表徵。
術語「抗原結合位點」或「結合部分」係指參與抗原結合之免疫球蛋白分子之部分。抗原結合位點藉由重(「H」)及輕(「L」)鏈之N端可變(「V」)區之胺基酸殘基形成。重鏈及輕鏈之V區內之三個高度發散延伸(稱作「高度可變區」)在更多個保守側翼延伸(稱作「框架區」或「FR」)之間插入。因此,術語「FR」係指在免疫球蛋白之高度可變區之間或鄰近免疫球蛋白之高度可變區自然發現之胺基酸序列。於抗體分子中,於三維空間中相對於彼此處理輕鏈之三個高度可變區及重鏈之三個高度可變區以形成抗原結合表面。該抗原結合表面與結合抗原之三維表面互補,及將重鏈及輕鏈各者之三個高度可變區稱作「互補決定區」或「CDR」。胺基酸分配至各域係根據Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987及1991))或Chothia及Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia等人,Nature 342:878-883 (1989)之定義。
如本文中所用,術語「抗原決定基」包含藉由抗體、抗體片段或其他結合域靶向之抗原之任何特定部分。術語「抗原決定基」包含針對特異性結合之任何蛋白質區域。術語「抗原決定基」包含能特異性結合至免疫球蛋白或T-細胞受體之任何蛋白質決定基。抗原決定基通常由分子之化學活性表面基團(諸如胺基酸或糖側鏈)組成且通常具有特定三維結構特徵,以及特定電荷特徵。例如,可對多肽之N端、中心或C端肽產生抗體。此外,可對多肽之直鏈或不連續抗原決定基產生抗體。據說當解離常數≤ 1 µM時,抗體特異性結合抗原;例如,於一些實施例中,≤ 100 nM及於一些實施例中,≤ 10 nM且不顯示結合至緊密相關或不同之其他蛋白質。
如本文中所用,術語「特異性結合」、「免疫結合」及「免疫結合性質」係指在免疫球蛋白分子與抗原之間發生之類型之非共價相互作用,該免疫球蛋白對該抗原係特異性。免疫結合相互作用之強度或親和力可根據相互作用之解離常數(Kd
)表示,其中更小Kd
表示更大親和力。選定多肽之免疫結合性質可使用此項技術中熟知方法定量。一種此方法需要量測抗原結合位點/抗原複合體形成及解離速率,其中彼等速率依賴於複合體搭檔之濃度、相互作用之親和力及同等影響二個方向速率之幾何參數。因此,「開速率常數」 (Kon
)及「關速率常數」 (Koff
)二者可藉由計算濃度及締合及解離之實際速率來測定。(參見Nature 361:186-87 (1993))。Koff
/Kon
之比率使能取消與親和力不相關之所有參數及等於解離常數Kd
。(一般參見,Davies等人,(1990) Annual Rev Biochem 59:439-473)。據說當結合常數(Kd
) is ≤1 μM時,本發明之抗體特異性結合至EGFR,例如,於一些實施例中,≤100 nM,於一些實施例中,≤10 nM,及於一些實施例中,≤100 pM至約1 pM,如藉由諸如放射性配位體結合分析或熟習此項技術者已知之類似分析之分析所量測。
如本文中所用,術語「經單離之多核苷酸」應意指基因組、cDNA或合成來源之多核苷酸或其一些組合,由於其來源,該「經單離之多核苷酸」(1)與多核苷酸之所有或部分不相關,其中在自然中發現該「經單離之多核苷酸」,(2)以可操作方式連接至在自然中不被連接之多核苷酸,或(3)在自然中不作為更大序列之部分產生。根據本發明之多核苷酸包含編碼本文中所示之重鏈免疫球蛋白分子之核酸分子,及編碼本文中所示之輕鏈免疫球蛋白分子之核酸分子。
本文中提及之術語「經單離之蛋白質」意指cDNA、重組RNA或合成來源之蛋白質或其一些組合,由於其來源或衍生源,該「經單離之蛋白質」(1)與自然中發現之蛋白質不相關,(2)自相同來源釋放其他蛋白質,例如,釋放鼠科蛋白質,(3)藉由來自不同物種之細胞表現,或(4)不在自然中發生。
本文中作為統稱使用之術語「多肽」係指初始蛋白質、片段或多肽序列之類似物。因此,初始蛋白質片段及類似物為多肽屬之種類。根據本發明之多肽包括本文中所示之重鏈免疫球蛋白分子及本文中所示之輕鏈免疫球蛋白分子,以及藉由組合形成之抗體分子,該等組合包含重鏈免疫球蛋白分子與輕鏈免疫球蛋白分子(諸如κ輕鏈免疫球蛋白分子)及反之亦然,以及其片段及類似物。
如本文中所用,如應用於物體之術語「天然產生」係指可在自然中發現物體之事實。例如,存在於生物體(包括病毒)中之多肽或多核苷酸序列可自天然來源單離且尚未藉由實驗室人員故意修飾或原本係天然產生。
如本文中所用,術語「以可操作方式連接」係指如此描述之組分之位置係於許可其以其預期方式作用之關係中。「以可操作方式連接」至編碼序列之對照序列以使得在與該等對照序列相容之條件下達成編碼序列之表現的方式結合。
如本文中所用,術語「對照序列」係指必要影響結合其之編碼序列之表現及處理之多核苷酸序列。依賴於原核生物之宿主生物體,此等對照序列之性質不同,此等對照序列一般包含啟動子、核糖體結合位點及真核細胞中之轉錄終止序列,一般而言,此等對照序列包含啟動子及轉錄終止序列。術語「對照序列」意欲包含至少所有組分,該等組分之存在對表現及處理必須,及亦可包含額外組分,其存在係不利,例如,前導序列及融合搭檔序列。如本文中所提及之術語「多核苷酸」意指長度至少10個鹼基之核苷酸,核糖核苷酸或去氧核苷酸或任何類型核苷酸之修飾形式。該術語包括DNA之單股及雙股形式。
本文中所提及之術語「寡核苷酸」包括藉由天然產生及非天然產生寡核苷酸連接子連接在一起之天然產生及經修飾之核苷酸。寡核苷酸為多核苷酸子集,一般包含200個鹼基或更少之長度。於一些實施例中,寡核苷酸長度為10至60個鹼基,例如,於一些實施例中,長度12、13、14、15、16、17、18、19、或20至40個鹼基。寡核苷酸通常係單股,例如,用於探針,雖然寡核苷酸可係雙股,例如,用於構建基因突變體。本發明之寡核苷酸為正義或反義寡核苷酸。
本文中所提及之術語「天然產生之核苷酸」包括去氧核苷酸及核糖核苷酸。本文中所提及之術語「經修飾之核苷酸」包括具有經修飾或經取代糖基之核苷酸及類似者。本文中所提及之術語「寡核苷酸連接子」包括寡核苷酸連接子,諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、醯基苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)、磷醯胺酯(phosphoronmidate)及類似者。參見例如,LaPlanche等人,Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986);Stec等人,J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984),Stein等人,Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988),Zon等人,Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991);Zon等人,Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach,第87至108頁(F. Eckstein編輯,Oxford University Press,Oxford England (1991));Stec等人,美國專利案第5,151,510號;Uhlmann及Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)。若所需,則寡核苷酸可包含標籤用於檢測。
如本文中所用,二十種習知胺基酸及其縮略語按照習知使用。參見Immunology - A Synthesis (第2版,E.S. Golub及D.R. Gren編輯,Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991))。該等二十種習知胺基酸、非天然胺基酸(諸如α-胺基酸、α-二取代之胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸)及其他非習知胺基酸之立體異構體(例如,D-胺基酸)亦可為本發明之多肽之適宜組分。非習知胺基酸之實例包括:4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸酯、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲酸基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸及其他類似胺基酸及亞胺基酸(例如,4-羥基脯胺酸)。於本文中所用之多肽標記中,根據標準使用及慣例,左手方向為胺基端方向及右手方向為羧基端方向。
類似地,除非另有指明,否則單股多核苷酸序列之左手端為5'端,將雙股多核苷酸序列之左手方向稱作5'方向。將新生RNA轉錄本之5'至3'添加之方向稱作具有與該RNA相同之序列之DNA股上之轉錄方向序列區及將5'至RNA轉錄本之5'端稱作「上游序列」,具有與該RNA相同之序列之DNA股上之序列區及將3'至RNA轉錄本之3'端稱作「下游序列」。
如應用於多肽,術語「實質同一性」意指當諸如藉由程式GAP或BESTFIT使用缺省間隙權重最佳比對時,兩個肽序列共用至少80%序列同一性,例如,於一些實施例中,至少90%序列同一性,於一些實施例中,至少95%序列同一性,及於一些實施例中,至少99%序列同一性。
於一些實施例中,不相同之殘基位置不同之處為保守胺基酸置換。
如本文中所討論,涵蓋抗體或免疫球蛋白分子之胺基酸序列之最小變化,如由本發明所涵蓋,只要胺基酸序列之變化維持至少75%,例如,於一些實施例中,至少80%、90%、95%,及於一些實施例中,99%。特定言之,涵蓋保守胺基酸置換。保守置換為於其側鏈中相關之胺基酸家族內發生之彼等。經基因編碼之胺基酸一般分為以下家族:(1)酸性胺基酸為天冬胺酸、麩胺酸;(2)鹼性胺基酸為離胺酸、精胺酸、組胺酸;(3)非極性胺基酸為丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯基丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸及(4)不帶電極性胺基酸為甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。親水性胺基酸包括精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、麩胺醯胺、麩胺酸、組胺酸、離胺酸、絲胺酸及蘇胺酸。疏水性胺基酸包括丙胺酸、半胱胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。其他胺基酸家族包括(i)絲胺酸及蘇胺酸,其為脂族-羥基家族;(ii)天冬醯胺及麩胺醯胺,其為含醯胺之家族;(iii)丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸,其為脂族;及(iv)苯基丙胺酸、色胺酸及酪胺酸,其為芳族。例如,合理期望利用異白胺酸或纈胺酸單獨置換白胺酸,利用麩胺酸置換天冬胺酸,利用絲胺酸置換蘇胺酸,或利用結構上相關胺基酸類似置換胺基酸將不具有對所得分子之結合或性質之主要影響,尤其若該置換不涉及框架位點內之胺基酸。無論胺基酸改變是否導致功能肽,其可容易藉由分析多肽衍生物之特異性活性測定。本文中詳細描述分析。抗體或免疫球蛋白分子之片段或類似物可容易藉由一般技術者製備。於一些實施例中,片段或類似物之胺基及羧基端在功能域之邊界附近出現。結構及功能域可藉由比較核苷酸及/或胺基酸序列資料與公共或專有序列資料庫來識別。計算比較方法係用於識別序列基序或經預測之蛋白質構象域,該等構象域出現於已知結構及/或功能之其他蛋白質中。識別折疊成已知三維結構之蛋白質序列之方法係已知。Bowie等人,Science 253:164 (1991)。因此,上述實例證明熟習此項技術者可知曉可用於定義根據本發明之結構及功能域之序列基序及結構構象。
於一些實施例中,胺基酸置換為以下之彼等:(1)降低對蛋白質水解之易感性,(2)降低對氧化之易感性,(3)改變結合親和力以形成蛋白質複合體,(4)改變結合親和力,及(4)賦予或修改此等類似物之其他物理化學或功能性質。類似物可包含除了天然產生之肽序列外之序列之各種突變蛋白。例如,可在天然產生之序列中(例如,於形成分子間接觸之域外部之多肽部分中)作出單個或多個胺基酸置換(例如,保守胺基酸置換)。保守胺基酸置換不應實質上改變母體序列之結構特徵(例如,置換胺基酸不應趨向於破壞母體序列中出現之螺旋,或打亂表徵母體序列之其他類型之二級結構)。技術知曉之多肽二級及四級結構之實例述於Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton編輯, W. H. Freeman and Company, New York (1984));Introduction to Protein Structure (C. Branden及J. Tooze編輯, Garland Publishing, New York, N.Y. (1991));及Thornton等人,Nature 354:105 (1991)中。
如本文中所用,術語「多肽片段」係指具有胺基端及/或羧基端缺失及/或一或多個內部缺失之多肽,但是其中剩餘胺基酸序列與(例如)自全長cDNA序列推斷之天然產生之序列中之對應位置相同。片段通常係至少5、6、8或10個胺基酸長,例如,於一些實施例中,至少14個胺基酸長,於一些實施例中,至少20個胺基酸長,通常至少50個胺基酸長,及於一些實施例中,至少70個胺基酸長。如本文中所用,術語「類似物」係指包含一節至少25個胺基酸之多肽,該類似物具有與經推斷胺基酸序列之部分之實質同一性及在適宜結合條件下,特異性結合至EGFR。通常,多肽類似物包含相對於天然產生之序列之保守胺基酸置換(或添加或缺失)。類似物通常係至少20個胺基酸長,例如,於一些實施例中,至少50個胺基酸長或更長,及經常可與全長天然產生之多肽一樣長。
本文中所用之術語「藥劑」表示化學化合物、化學化合物之混合物、生物大分子或自生物材料製得之提取物。
如本文中所用,術語「標記(label/labeled)」係指併入可檢測標誌物,例如,藉由併入經放射標記之胺基酸或連接至可藉由經標記抗生物素(avidin)檢測之生物素基部分之多肽(例如,含有螢光標誌物之鏈黴抗生物素(streptavidin)或可藉由光學或量熱法檢測之酵素活性)。於某些情況下,標記或標誌物亦可係治療性。標記多肽及醣蛋白之各種方法係此項技術中已知及可使用。用於多肽之標記之實例包括(但不限於)下列:放射性同位素或放射性核素(例如,3
H、14
C、15
N、35
S、90
Y、99
Tc、111
In、125
I、131
I)、螢光標記(例如,螢光團、羅丹明(rhodamine)、鑭系螢光粉)、酵素標記(例如,山葵過氧化物酶、p-牛乳糖、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光、生物素基、藉由二級報告基因識別之預定多肽抗原決定基(例如,白胺酸拉鍊(zipper)對序列、針對二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標記)。於一些實施例中,標記藉由各種長度之間隔臂連接以降低潛在位阻。如本文中所用,術語「醫藥劑或藥物」係指當對患者適當投與時,能誘導所需治療效果之化學化合物或組合物。
如本文中所用,組合物係指兩種或更多種產品、物質或化合物(包括細胞)之任何混合物。其可為溶液、懸浮液、液體、粉末、膏劑、水溶液、非水溶液或其任何組合。
術語「醫藥組合物」係指適用於哺乳動物個體(通常人類)之醫藥用途之組合物。醫藥組合物通常包含有效量之活性劑(例如,多重特異性多肽構築體)及載劑、賦形劑或稀釋劑。該載劑、賦形劑或稀釋劑通常各自為醫藥上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
如本文中所用,術語疾病或病症之「治療(treating/treatment/therapy)」意指藉由單獨或與如本文中所述之另一種化合物組合投與本發明之醫藥組合物來減慢、停止或逆轉疾病或病症進展,如藉由減少、停止或消除臨床或診斷症狀證實。「治療(treating/treatment/therapy)」亦意指急性或慢性疾病或病症之症狀之嚴重度的降低或復發率之降低。如本文中所用,在癌症之背景下,術語癌症之「治療」或「抑制(inhibit/inhibiting/inhibition)」係指下列中之至少一者:腫瘤生長速率之統計上顯著降低、腫瘤生長停止或腫瘤大小、質量、代謝活性或體積降低,如藉由諸如但不限於以下之標準所量測:實體腫瘤之反應評價標準(Response Evaluation Criteria for Solid Tumors,RECIST),或無進展生存率(PFS)或總生存率(OS)之統計上顯著增加。疾病或病症之「預防(Preventing/prophylaxis/prevention)」係指單獨或與另一種化合物組合投與醫藥組合物以預防疾病或病症或疾病或病症之症狀中之一些或所有之發生或發作或減少疾病或病症發作之可能性。
術語「有效量」或「治療上有效量」係指當單獨(即,作為單藥療法)或與額外治療劑組合投與至患者時,產生疾病進展之統計上顯著減少(例如,改善或消除疾病之症狀及/或原因)之組合物之數量及/或濃度。有效量可為緩解、減少或減輕至少一種症狀或生物反應或與疾病或病症相關之影響,預防疾病或病症之進展,或改善患者之生理功能之量。
如本文中所用,「實質上純」意指目標物質為存在之主要物質(即,基於莫耳,其較組合物中之任何其他個別物質更豐富),及實質上經純化部分為組合物,其中該目標物質包含存在之所有大分子物質之至少約50% (基於莫耳)。
一般而言,實質上純組合物將包含存在於組合物中之所有大分子物質之超過約80%,例如,於一些實施例中,超過約85%、90%、95%及99%。於一些實施例中,將目標物質純化至基本均一性(於組合物中藉由習知檢測方法不可檢測污染物),其中該組合物基本上由單個大分子物質組成。
術語患者包括人類及獸醫個體。
根據此項技術中之習知用途使用其他化學術語,如由The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S.編輯,McGraw-Hill, San Francisco (1985))所示例。
如本文中所用,術語「約」係指此技術領域中為熟習者易知之各自值之通常誤差範圍。本文中提及「約」值或參數包括(及描述) 指向該值或參數本身之實施例。例如,提及「約X」之描述包括「X」之描述。II. 多重特異性多肽構築體
本文中提供一組多重特異性多肽構築體,其包含含有免疫球蛋白Fc區之第一組分及包含CD3結合區之第二組分,其中該第一組分及該第二組分藉由連接子偶合,其中該Fc區經定位至CD3結合區之N端;及該第一組分及該第二組分中之一者或二者包含結合腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域。於一些實施例中,該連接子為非可裂解連接子。於一些實施例中,該連接子不含有針對藉由蛋白酶裂解特異性識別之受質識別。
於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體以自N端至C端之順序含有:免疫球蛋白Fc區、連接子、結合CD3 (CD3ε)之CD3結合區、及結合腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域。於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體以自N端至C端之順序含有:結合至腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域、免疫球蛋白Fc區、連接子、及結合CD3 (CD3ε)之CD3結合區。於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體以自N端至C端之順序含有:結合至腫瘤相關抗原(TAA)之第一抗原結合域、免疫球蛋白Fc區、連接子、結合CD3 (CD3ε)之CD3結合區、及結合腫瘤相關抗原(TAA)之第二抗原結合域。
以下更詳細描述本發明之多重特異性多肽構築體之組分各者。 1. 抗 CD3 結合域:
本發明之多重特異性多肽構築體包含抗CD3結合域之一或多個複本。本發明之抗CD3結合域經由接合T細胞上之CD3ε來活化T細胞。本發明之抗CD3結合域促效、刺激、活化及/或以其他方式增強CD3介導之T細胞活化。CD3之生物活性包括(例如) T細胞活化及通過CD3與T-細胞受體(TCR)之抗原結合亞基之間之相互作用的其他信號傳導。例如,本發明之抗CD3結合域經由接合T細胞上之CD3ε藉由部分或完全調節(例如,促效、刺激、活化或以其他方式增強) CD3介導之T細胞活化完全或部分活化T細胞。
於較佳實施例中,本發明之抗CD3結合域特異性結合CD3之ε鏈,亦稱作CD3ε。本發明之抗CD3ε結合域經由結合T細胞上之CD3ε活化T細胞。本發明之抗CD3ε結合域包含單株抗體,諸如例如,哺乳動物單株抗體、靈長類動物單株抗體、全人類單株抗體,以及人源化單株抗體及嵌合抗體,以及其抗原結合片段。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含抗體或其抗原結合片段之一或多個複本。
於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含VH CDR1序列、VH CDR2序列及VH CDR3序列之組合,其中該VH CDR1序列、VH CDR2序列及VH CDR3序列中之至少一者係選自包含至少胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 16)之VH CDR1序列;包含至少胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 17)之VH CDR2序列;及包含至少胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 18)之VH CDR3序列。
於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含VL CDR1序列、VL CDR2序列及VL CDR3序列之組合,其中該VL CDR1序列、VL CDR2序列及VL CDR3序列中之至少一者係選自包含至少胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 19)之VL CDR1序列;包含至少胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 20)之VL CDR2序列;及包含至少胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 21)之VL CDR3序列。
於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含包含至少胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 16)之VH CDR1序列;包含至少胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 17)之VH CDR2序列;包含至少胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 18)之VH CDR3序列;包含至少胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 19)之VL CDR1序列;包含至少胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 20)之VL CDR2序列;及包含至少胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 21)之VL CDR3序列。
於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含VH CDR1序列、VH CDR2序列及VH CDR3序列之組合,其中該VH CDR1序列、VH CDR2序列及VH CDR3序列中之至少一者係選自包含與胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 16)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列之VH CDR1序列;包含與胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 17)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列之VH CDR2序列;及包含與胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 18)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列之VH CDR3序列。
於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含VL CDR1序列、VL CDR2序列及VL CDR3序列之組合,其中該VL CDR1序列、VL CDR2序列及VL CDR3序列中之至少一者係選自包含與胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 19)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列之VL CDR1序列;包含與胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 20)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列之VL CDR2序列;及包含與胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 21)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之序列之VL CDR3序列。
於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含與胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 16)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之VH CDR1序列;與胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 17)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之VH CDR2序列;與胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 18)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之VH CDR3序列;與胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 19)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之VL CDR1序列;與胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 20)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之VL CDR2序列;及與胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 21)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之VL CDR3序列。
於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含選自由以下組成之群之抗體或其抗原結合片段之一或多個複本:Fab片段、F(ab')2
片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體及單域輕鏈抗體。於一些實施例中,該抗CD3結合域包含結合CD3ε之Fv抗體片段(本文中稱作抗CD3ε Fv片段)。於一些實施例中,該抗CD3ε Fv抗體片段為經二硫鍵穩定之抗CD3結合Fv片段(dsFv)。於一些實施例中,該抗CD3結合域係一價用於結合CD3。
於一些實施例中,該CD3結合區非單鏈抗體。例如,於一些態樣中,該CD3結合區非單鏈可變片段(scFv)。
於一些實施例中,該CD3結合區為含有諸如所述任一者之可變重鏈(Hv,亦稱作VH)及可變輕鏈(Lv,亦稱作VL)之Fv抗體片段。於此等實施例之態樣中,免疫球蛋白Fc區為含有兩個不同Fc多肽能在Fc異二聚體之兩個多肽之間異二聚締合之異二聚體Fc區,諸如第II.2節中所述之任一者。於此等實施例中,CD3結合區之可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)連接在異二聚體Fc之相反鏈上。
於一些實施例中,該抗CD3ε Fv抗體片段包含選自SEQ ID NO: 32-81之群之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε Fv抗體片段包含與選自由SEQ ID NO: 32-81組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε Fv抗體片段包含選自SEQ ID NO: 32-62之群之胺基酸序列及選自由SEQ ID NO: 63-81組成之群之胺基酸序列之組合。於一些實施例中,該抗CD3ε Fv抗體片段包含與選自由SEQ ID NO: 32-62組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列及與選自由SEQ ID NO: 63-81胺基酸序列組成之群之胺基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列之組合。
於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列之組合,該胺基酸序列包括選自SEQ ID NO: 32-81之群之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含選自SEQ ID NO: 32-62之群之重鏈可變區胺基酸序列及包含選自SEQ ID NO: 63-81之群之胺基酸序列之輕鏈可變區胺基酸序列之組合。
於一些實施例中,該抗CD3ε結合域為包含重鏈可變胺基酸序列及輕鏈可變胺基酸序列之組合之Fv片段。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域為包含重鏈可變胺基酸序列及輕鏈可變胺基酸序列之組合之Fv片段,該胺基酸序列包括與選自由SEQ ID NO: 14、15、32-81、191、196-200、211及212組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域為包含重鏈可變胺基酸序列及輕鏈可變胺基酸序列之組合之Fv片段,該胺基酸序列包括選自由SEQ ID NO: 14、15、32-81、191、196-200、211及212組成之群之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域為Fv片段,其包含選自SEQ ID NO: 14、32-62、196-198及211之群之重鏈可變胺基酸序列及選自由SEQ ID NO: 15、63-81、191、199、200及212組成之群之輕鏈可變胺基酸序列之組合。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域為Fv片段,其包含與選自由SEQ ID NO: 14、32-62、196-198及211組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之重鏈可變胺基酸序列及與選自由SEQ ID NO: 15、63-81、191、199、200及212組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之輕鏈可變胺基酸序列之組合。
於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列之組合,該胺基酸序列包括選自SEQ ID NO: 32-81、191、196-200、211及212之群之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含選自SEQ ID NO: 32-62、196-198及211之群之重鏈可變區胺基酸序列及包含選自SEQ ID NO: 63-81、191、199、200及212之群之胺基酸序列之輕鏈可變區胺基酸序列之組合。
於一些實施例中,該抗CD3ε Fv抗體片段包含與選自由SEQ ID NO: 14、32-43、45-47、196及211組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列及與選自由SEQ ID NO: 15、63、65-71、73、75、77及199組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列之組合。於一些實施例中,該抗CD3ε Fv抗體片段包含選自SEQ ID NO: 14、32-43、45-47、196及211之群之胺基酸序列及選自由SEQ ID NO: 15、63、65-71、73、75、77及199組成之群之胺基酸序列之組合。
於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含可變重鏈(VH),該可變重鏈包含與SEQ ID NO: 14之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含可變輕鏈(VL),該可變輕鏈包含與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含包含與SEQ ID NO: 14之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列之可變重鏈(VH)及包含與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列之可變輕鏈(VL)。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含可變重鏈(VH),該可變重鏈包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含可變輕鏈(VL),該可變輕鏈包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列之可變重鏈(VH)及包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之可變輕鏈(VL)。
於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含可變重鏈(VH),該可變重鏈包含與SEQ ID NO: 196之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含可變輕鏈(VH),該可變輕鏈包含與SEQ ID NO: 198之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含包含與SEQ ID NO: 196之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列之可變重鏈(VH)及包含與SEQ ID NO: 198之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列之可變輕鏈(VL)。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含可變重鏈(VH),該可變重鏈包含SEQ ID NO: 196之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含可變輕鏈(VL),該可變輕鏈包含SEQ ID NO: 198之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含包含SEQ ID NO: 196之胺基酸序列之可變重鏈(VH)及包含SEQ ID NO: 198之胺基酸序列之可變輕鏈(VL)。
於特定實施例中,該Fv為經二硫鍵穩定之Fv片段(dsFv),其中該VH
-VL
異二聚體藉由鏈間二硫鍵穩定。於一些實施例中,該鏈間二硫鍵藉由VH及/或VL鏈之框架位置中之位置突變工程改造。於一些實施例中,該VH鏈含有突變G44C及該VL鏈含有突變G100C,各者藉由kabat編號。於一些實施例中,該經二硫鍵穩定之抗CD3 Fv包含具有Cys之位置105處之突變之抗CD3 VH及具有Cys之位置43之突變之抗CD3 VL,該突變藉由Kabat編號。
於一些實施例中,該抗CD3ε Fv抗體片段包含與選自由SEQ ID NO: 44及49-62、197及198組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列及與選自由SEQ ID NO: 64、72、74、76、78-81、191、200及212胺基酸序列組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列之組合。於任何此等實施例中之一些中,該抗CD3 Fv為dsFv,其具有含有突變G44C之VH鏈及含有突變G100C之VL鏈,各者藉由kabat編號。於一些實施例中,該抗CD3ε Fv抗體片段包含選自SEQ ID NO: 44及49-62、197及198之群之胺基酸序列及選自由SEQ ID NO: 64、72、74、76、78-81、191、200及212組成之群之胺基酸序列之組合。
於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含可變重鏈(VH),該可變重鏈包含與SEQ ID NO: 44之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含可變輕鏈(VL),該可變輕鏈包含與SEQ ID NO: 72之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含包含與SEQ ID NO: 44之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列之可變重鏈(VH)及包含與SEQ ID NO: 72之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列之可變輕鏈(VL)。於任何此等實施例中之一些中,該抗CD3 Fv為dsFv,其具有含有突變G44C之VH鏈及含有突變G100C之VL鏈,各者藉由kabat編號。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含可變重鏈(VH),該可變重鏈包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含可變輕鏈(VH),該可變輕鏈包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之可變重鏈(VH)及包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列之可變輕鏈(VL)。
於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含可變重鏈(VH),該可變重鏈包含與SEQ ID NO: 198之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含可變輕鏈(VL),該可變輕鏈包含與SEQ ID NO: 200之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含包含與SEQ ID NO: 198之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列之可變重鏈(VH)及包含與SEQ ID NO: 200之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性之胺基酸序列之可變輕鏈(VL)。於任何此等實施例中之一些中,該抗CD3 Fv為dsFv,其具有含有突變G44C之VH鏈及含有突變G100C之VL鏈,各者藉由kabat編號。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含可變重鏈(VH),該可變重鏈包含SEQ ID NO: 198之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含可變輕鏈(VL),該可變輕鏈包含SEQ ID NO: 200之胺基酸序列。於一些實施例中,該抗CD3ε結合域包含包含SEQ ID NO: 198之胺基酸序列之可變重鏈(VH)及包含SEQ ID NO: 200之胺基酸序列之可變輕鏈(VL)。 2. 免疫球蛋白 Fc 多肽:
本發明之多重特異性多肽構築體之第一組分包含免疫球蛋白Fc區。於一些實施例中,該免疫球蛋白Fc區為選自由IgG1同種型、IgG2同種型、IgG3同種型及IgG4子集組成之群之IgG同種型。於一些實施例中,該Fc區為人類Fc。於一些實施例中,該免疫球蛋白Fc區為包含選自由SEQ ID NO: 1-6組成之群之胺基酸序列之多肽。於一些實施例中,該免疫球蛋白Fc區含有Fc鏈,該Fc鏈為SEQ ID NO: 1-6中之任一者之免疫活性片段。於一些實施例中,該免疫球蛋白Fc區含有與SEQ ID NO: 1-6中之任一者之胺基酸序列或其免疫活性片段至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性之Fc多肽鏈。
於一些實施例中,該多重特異性多肽構築體為藉由多肽形成之二聚體,該等多肽各者含有Fc。於一些特定實施例中,相同或實質上相同多肽將經二聚化以創建均二聚體。於一些實施例中,該二聚體為均二聚體,其中該多重特異性多肽構築體之兩個多肽係相同。於其他情況下,該Fc區藉由Fc域形成,該等Fc域經突變或修飾以促進異二聚體化,其中不同多肽可經二聚化以形成異二聚體。因此,於一些實施例中,該二聚體為異二聚體,其中該多重特異性多肽構築體之兩個多肽鏈係不同。促進異二聚體化之示例性修飾係已知,包括如下所述之任一者。
一般而言,該Fc區負責效應功能,諸如補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞毒性(ADCC),除了抗原結合能力(其為免疫球蛋白之主要功能)外。此外,存在於Fc區中之FcRn序列起著藉由增加活體內半衰期藉由結合至活體內FcRn受體來調節血清中之IgG含量之作用。於一些實施例中,於Fc中可改變(諸如降低或增強)此等功能用於與所提供多重特異性多肽構築體使用。
於一些實施例中,所提供多重特異性多肽構築體之Fc區展示一或多種效應功能。於一些情況下,Fc區能提供Fc-介導之效應功能,諸如例如,ADCC (例如,藉由NK細胞釋放顆粒酶B)、ADCP及/或CDC。因此,於一些實施例中,其中多重特異性多肽構築體含有可裂解連接子,連接子之裂解可產生各者具有生物活性之兩種組分:能結合及接合T細胞上之CD3之CD3結合區及連接至TAA之Fc區-可展示靶特異性效應功能之抗原結合域。於本文中所提供之特定實施例中,該等多重特異性多肽構築體含有非可裂解連接子及於一些態樣中,可不展示獨立的Fc-介導之效應功能。
於一些實施例中,該Fc區包含Fc多肽,該Fc多肽經突變或修飾以改變一或多種效應功能。Fc多肽之突變以改變(諸如降低)效應功能之各種實例係已知,包括如下所述之任一者。於一些實施例中,除非參考特定SEQ ID NO描述,否則提及Fc區之胺基酸置換係藉由Kabat藉由EU編號(亦稱作Kabat編號)。EU編號係已知及根據最近更新之IMGT科學圖表(IMGT®,the international ImMunoGeneTics information system®,http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html (創建:2001年5月17日,最後一次更新:2013年1月10日)及如於Kabat, E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological interest.第5版,US Department of Health and Human Services, NIH出版物編號91-3242 (1991)中所報導之EU索引。
於一些實施例中,所提供含有展示降低之效應功能之Fc區之多重特異性多肽構築體可為應用之所需候選,其中尚需要經受限CD3結合,某些效應功能(諸如CDC及ADCC)係不必需或有害。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以證實CDC及/或ADCC活性之降低/耗盡。例如,可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保多重特異性多肽構築體及/或其裂解組分缺少FcγR結合(因此,同樣缺少ADCC活性),但是保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初級細胞、NK細胞僅表現FcγRIII,然而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。評估所關注分子之ADCC活性之活體外分析之非限制性實例述於美國專利案第5,500,362號(參見,例如,Hellstrom, I.等人,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I等人, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
82:1499-1502 (1985);美國專利案第5,821,337號(參見Bruggemann, M.等人,J. Exp. Med
. 166:1351-1361 (1987))中。或者,可採用非放射性分析方法(參見,例如,針對流動式細胞測量術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.);及CytoTox 96™非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, Wis.))。此等分析之可用效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者,或額外地,所關注分子之ADCC活性可於活體內,例如,於諸如Clynes等人,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
95:652-656 (1998)中所揭示之動物模型中評估。亦可進行C1q結合分析以證實多重特異性多肽構築體或其裂解組分不能結合C1q及因此缺少CDC活性。參見,例如,WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化,可進行CDC分析(參見,例如,Gazzano-Santoro等人,J. Immunol. Methods
202:163 (1996);Cragg, M. S.等人,Blood
101:1045-1052 (2003);及Cragg, M. S.及M. J. Glennie,Blood
103:2738-2743 (2004))。亦可使用此項技術中已知方法進行FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(參見,例如,Petkova, S. B.等人,Int'l. Immunol.
18(12):1759-1769 (2006))。
於一些實施例中,該免疫球蛋白Fc區或其免疫活性片段為IgG同種型。例如,融合蛋白之免疫球蛋白Fc區為具有以下胺基酸序列之人類IgG1同種型:
PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 1)
於一些實施例中,該免疫球蛋白Fc區或其免疫活性片段包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性之人類IgG1多肽序列。
於一些實施例中,諸如以下所述之任一者之IgG1 Fc多肽或其變異體可呈G1 m1或G1 m3同種異型製備。於一些實施例中,該Fc區可含有人類G1 m1同種異型之胺基酸,諸如含有位置356及358處之Asp (D)及Leu (L)之殘基,例如,如於SEQ ID NO: 1中所闡述。於一些情況下,Fc多肽可含有胺基酸置換E356D及M358L以再組成同種異型G1 m1之殘基。於其他實施例中,該Fc區可含有人類G1 m3同種異型之胺基酸,諸如在藉由EU編號之位置356及358處之殘基Glu (E)及Met (M),例如,如於SEQ ID NO: 194及195中所闡述。於一些情況下,Fc多肽可含有胺基酸置換D356E及L358M以再組成同種異型G1 m3之殘基。於一些實施例中,人類IgG1 Fc區經修飾以改變抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC),例如,於以下中所描述之胺基酸修飾:Natsume等人,2008 Cancer Res, 68(10): 3863-72;Idusogie等人,2001 J Immunol, 166(4): 2571-5;Moore等人,2010 mAbs, 2(2): 181-189;Lazar等人,2006 PNAS, 103(11): 4005-4010;Shields等人,2001 JBC, 276(9): 6591-6604;Stavenhagen等人,2007 Cancer Res, 67(18): 8882-8890;Stavenhagen 等人,2008 Advan. Enzyme Regul., 48: 152-164;Alegre等人,1992 J Immunol, 148: 3461-3468;Kaneko及Niwa, 2011 Biodrugs, 25(1):1-11中之評論,其各者之全部內容以引用的方式併入本文中。
於一些實施例中,Fc區(諸如人類IgG1 Fc區)經修飾以增強ADCC活性或CDC活性。增強ADCC之突變之實例包括在Ser239及Ile332處之修飾,例如,Ser239Asp及Ile332Glu (S239D,I332E)。增強CDC之突變之實例包括在Lys326及Glu333處之修飾。於一些實施例中,該Fc區在此等位置中之一者或二者處經修飾,例如,使用Kabat編號系統之Lys326Ala及/或Glu333Ala (K326A及E333A)。
於一些實施例中,本發明之人類IgG1 Fc區融合蛋白缺少或具有降低之連接至N297處之N連接之多醣鏈的海藻糖。存在許多方法防止岩藻糖基化,包括(但不限於)於FUT8缺乏細胞系中產生;添加抑制劑至哺乳動物細胞培養基中,例如,栗精胺(Castanospermine);及產生細胞系之代謝工程改造。於一些實施例中,人類IgG1 Fc區在胺基酸Asn297 (Boxed,Kabat編號)處經修飾以防止融合蛋白之糖基化,例如,Asn297Ala (N297A)或Asn297Asp (N297D)。
於一些實施例中,該Fc區經改變以提供降低之Fc-介導之效應功能,諸如經由降低之Fc受體結合,例如,結合至FcγR結合,但是一般非FcRn結合。於一些實施例中,融合蛋白之Fc區在下列位置中之一或多者處經改變以降低Fc受體結合:Leu 234 (L234)、Leu235 (L235)、Asp265 (D265)、Asp270 (D270)、Ser298 (S298)、Asn297 (N297)、Asn325 (N325)或Ala327 (A327)。例如,Leu 234Ala (L234A)、Leu235Ala (L235A)、Asp265Asn (D265N)、Asp270Asn (D270N)、Ser298Asn (S298N)、Asn297Ala (N297A)、Asn325Glu (N325E)或Ala327Ser (A327S)。於一些實施例中,融合蛋白之Fc區在胺基酸Leu235 (於以上SEQ ID NO: 1中加框,Kabat編號)處經修飾以改變Fc受體相互作用,例如,Leu235Glu (L235E)或Leu235Ala (L235A)。於一些實施例中,融合蛋白之Fc區在胺基酸Leu234 (於以上SEQ ID NO: 1中加框,Kabat編號)處經修飾以改變Fc受體相互作用,例如,Leu234Ala (L234A)。於一些實施例中,融合蛋白之Fc區在胺基酸234及235,例如,Leu234Ala及Leu235Ala (L234A/L235A)或Leu234Val及Leu235Ala (L234V/L235A)二者處改變。於較佳實施例中,Fc區內之修飾減少結合至Fc-受體-γ受體,同時對結合至新生Fc受體(FcRn)具有最小影響。
於一些實施例中,人類IgG Fc區經修飾以增強FcRn結合。增強結合至FcRn之Fc突變之實例為Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu (各自為M252Y、S254T、T256E) (Kabat編號,Dall’Acqua等人2006,J. Biol Chem
第281卷(33) 23514-23524)、Met428Leu及Asn434Ser (M428L、N434S) (Zalevsky等人,2010Nature Biotech
,第28卷(2) 157-159) (Kabat
等人1991Sequences of Proteins of Immunological Interest
之EU索引)。於一些實施例中,經突變或經修飾之Fc多肽包含下列突變:Met252Tyr及Met428Leu或Met252Tyr及Met428Val (M252Y、M428L或M252Y、M428V),該等突變使用Kabat編號系統。
於一些實施例中,融合蛋白之Fc區在下列位置中之一或多者處缺少胺基酸以減少Fc受體結合:Glu233 (E233)、Leu234 (L234)或Leu235 (L235)。於此等實施例中,此等三種胺基酸之Fc缺失減少補體蛋白C1q結合。
PAPGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 2)
於一些實施例中,該Fc區在下列位置中之一或多者處突變以減少Fc受體結合:Glu233 (E233)、Leu234 (L234)或Leu235 (L235)。該一或多個突變可包括E233P、L234V及/或L235A。
於一些實施例中,融合蛋白之Fc區在Gly236 (於以上SEQ ID NO: 1中加框)處改變以減少Fc受體結合。例如,其中Gly236自該融合蛋白缺失。於一些實施例中,人類IgG1 Fc區在胺基酸Gly236處經修飾以增強與CD32A (例如,Gly236Ala (G236A))相互作用。
於特定實施例中,例如,經由減少Fc受體結合至FcγR降低Fc效應功能之Fc區之突變包括來自以下中之任一者之突變:G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G或E233P/L234V/L235A/G236del。
於一些實施例中,人類IgG1 Fc區缺少Lys447 (Kabat
等人1991Sequences of Proteins of Immunological Interest
之EU索引)。
於一些實施例中,其融合或免疫活性片段包含與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性之人類IgG2多肽序列。
於一些實施例中,免疫球蛋白Fc區或融合蛋白之免疫活性片段為具有以下胺基酸序列之人類IgG2同種型:
PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK (SEQ ID NO: 3)
於一些實施例中,其融合或免疫活性片段包含與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性之人類IgG2多肽序列。
於一些實施例中,人類IgG2 Fc區在胺基酸Asn297 (加框,以防止抗體糖基化,例如,Asn297Ala (N297A)或Asn297Asp (N297D))處經修飾。於一些實施例中,人類IgG2 Fc區缺少Lys447 (Kabat
等人1991Sequences of Proteins of Immunological Interest
之EU索引)。
於一些實施例中,免疫球蛋白Fc區或融合蛋白之免疫活性片段為具有以下胺基酸序列之人類IgG3同種型:
PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFKWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST FRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESSGQPEN NYNTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNIFSCSVMH EALHNRFTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 4)
於一些實施例中,抗體或其免疫活性片段包含與SEQ ID NO: 4之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性之人類IgG3多肽序列。
於一些實施例中,人類IgG3 Fc區在胺基酸Asn297 (加框,Kabat編號)處經修飾以防止抗體糖基化,例如,Asn297Ala (N297A)或Asn297Asp (N297D)。於一些實施例中,人類IgG3 Fc區在胺基酸435處經修飾以延長半衰期,例如,Arg435His (R435H)。於一些實施例中,人類IgG3 Fc區缺少Lys447 (EU index ofKabat
等人1991Sequences of Proteins of Immunological Interest
之EU索引)。
於一些實施例中,免疫球蛋白Fc區或融合蛋白之免疫活性片段為具有以下胺基酸序列之人類IgG4同種型:
PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK (SEQ ID NO: 5)
於一些實施例中,抗體或其免疫活性片段包含與SEQ ID NO: 5之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性之人類IgG4多肽序列。
於一些實施例中,免疫球蛋白Fc區或融合蛋白之免疫活性片段為具有以下胺基酸序列之人類IgG4同種型:
PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK (SEQ ID NO: 6)
於一些實施例中,抗體或其免疫活性片段包含與SEQ ID NO: 6之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性之人類IgG4多肽序列。
於其他實施例中,人類IgG4 Fc區在胺基酸235處經修飾以改變Fc受體相互作用,例如,Leu235Glu (L235E)。於一些實施例中,人類IgG4 Fc區在胺基酸Asn297 (加框,Kabat編號)處經修飾以防止抗體糖基化,例如,Asn297Ala (N297A)或Asn297Asp (N297D)。於一些實施例中,人類IgG4 Fc區缺少Lys447 (Kabat
等人1991Sequences of Proteins of Immunological Interest
之EU索引)。
於一些實施例中,人類IgG Fc區藉由引入兩個二硫鍵藉由將Ser354改變成Cys (S354C)及將Tyr349改變成Cys (Y349C) (S354C/Y349C)修飾以穩定CH3:CH3介面處之均二聚化。
於本文中所提供之多重特異性多肽構築體之特定實施例中,人類IgG Fc區經修飾以誘導異二聚化。已知各種方法用於促進互補Fc多肽之異二聚化,參見例如,Ridgway等人,Protein Eng. 9:617-621 (1996);Merchant等人,Nat. Biotechnol. 16(7): 677-81 (1998);Moore等人(2011) MAbs, 3:546-57;Von Kreudenstein等人,MAbs, (2013) 5:646-54;Gunasekaran等人(2010) J. Biol. Chem., 285:19637-46;Leaver-Fay等人(2016) Structure, 24:641-51;Ha等人(2016) Frontiers in Immunology, 7:1;Davis等人(2010) Protein Eng Des Sel, 23:195-202;公開國際PCT申請案號WO 1998/050431、WO 2009/089004、WO2011143545、WO 2014/067011、WO 2012/058768、WO2018027025;公開美國專利申請案號US20140363426、US20150307628、US20180016354、US20150239991;及美國專利案號US5731168、US7183076、US9701759、US9605084及US9650446。促進Fc鏈之異二聚化之方法包括Fc區之誘變,諸如藉由包含一組「杵臼」突變或包含影響Fc之靜電轉向以利於不同多肽鏈之吸引相互作用之突變。例如,於一些實施例中,異二聚體之Fc多肽包含改變跨Fc二聚體介面之電荷極性使得靜電匹配之Fc鏈之共同表現支持有利吸引相互作用從而促進所需Fc異二聚體形成之突變,然而不利排斥電荷相互作用抑制非所需Fc均二聚體形成(Guneskaran等人(2010) JBC, 285: 19637-19646)。當於細胞中共同表現時,該等鏈之間之締合係可能,但是由於電荷排斥,該等鏈實質上不自締合。產生異二聚體Fc之其他策略包括混合人類IgG及IgA CH3域片段以創建互補CH3異二聚體,將其稱作SEED Fc。
異二聚化之方法及變異體亦包括於公開國際PCT申請案WO2014/145806中所述之彼等,包括「隆突及穴」突變(亦稱作「偏斜」變異體)、關於「靜電轉向」或「電荷對」之突變及pI變異體。異二聚化變異體亦包括如美國公開申請案號US2012/0149876或US2018/011883中所述之任一者。
於一些實施例中,修飾包括將隆凸(隆突)引入第一Fc多肽及將腔(穴)引入第二Fc多肽使得該隆凸可位於該腔中以促進第一含Fc多肽及第二含Fc多肽之複合。用於置換及/或修飾以創建多肽中之隆凸或腔而靶向之胺基酸通常為介面胺基酸,該等胺基酸與第二多肽之介面中之一或多個胺基酸相互作用或接觸。
於一些實施例中,經修飾以含有隆凸(穴)胺基酸之第一Fc多肽包含用具有自第一Fc多肽之介面伸出之至少一個側鏈之胺基酸置換初始或原始胺基酸及因此可位於第二多肽之相鄰介面之補償腔(穴)中。最常見,置換胺基酸為具有較原始胺基酸殘基更大側鏈體積者。熟習此項技術者知道如何測定及/或評估胺基酸殘基之性質以識別為創建隆凸之理想置換胺基酸之彼等。於一些實施例中,用於形成隆凸之置換殘基為天然存在之胺基酸殘基及包括(例如)精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)或色胺酸(W)。於一些實例中,用於置換識別之原始殘基為具有小側鏈之胺基酸殘基,諸如,例如,丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸。
於一些實施例中,經修飾以含有腔(穴)之第二Fc多肽為包含用具有自第二多肽之介面凹出之至少一個側鏈之胺基酸置換初始或原始胺基酸者及因此能適應來自第一多肽之介面之對應隆凸。最常見,置換胺基酸為具有較原始胺基酸殘基更小側鏈體積者。熟習此項技術者知道如何測定及/或評估胺基酸殘基之性質以識別為形成腔之理想置換殘基之彼等。一般而言,用於形成腔之置換殘基為天然存在之胺基酸及包括(例如)丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)。於一些實例中,用於置換識別之原始胺基酸為具有大側鏈之胺基酸,諸如例如,酪胺酸、精胺酸、苯丙胺酸或色胺酸。
人類IgG1之CH3介面(例如)涉及位於四個反平行β-股之各域上之十六個殘基,其自各表面掩埋1090 Å2 (參見例如,Deisenhofer等人(1981) Biochemistry, 20:2361-2370;Miller等人,(1990) J Mol. Biol., 216, 965-973;Ridgway等人,(1996) Prot. Engin., 9: 617-621;美國專利案第5,731,168號)。創建隆凸或腔之CH3域之修飾述於(例如)美國專利案第5,731,168號;國際專利申請案WO98/50431及WO 2005/063816;及Ridgway等人,(1996) Prot. Engin., 9: 617-621中。於一些實例中,通常將創建隆凸或腔之CH3域之修飾靶向至位於兩個中心反平行β-股上之殘基。目標為最小化創建之隆凸可藉由突出於周圍溶劑中來適應而非藉由搭檔CH3域中之補償腔適應之風險。
例如,於一些實施例中,異二聚體Fc包含具有CH3域內在Thr366處之胺基酸修飾之多肽,當用更大體積胺基酸(例如,Try (T366W))置換時,其能與第二CH3域優先配對,該第二CH3域具有位置Thr366、Leu368及Tyr407,例如,各自為Ser、Ala及Val (T366S/L368A/Y407V)處之更少大體積胺基酸之胺基酸修飾。經由CH3修飾之異二聚化可進一步藉由引入二硫鍵,例如,藉由在相反CH3域上將Ser354改變成Cys (S354C)及將Tyr349改變成Cys (Y349C)穩定(於Carter, 2001 Journal of Immunological Methods, 248: 7-15中評論)。
於特定實施例中,多重特異性多肽構築體含有能介導Fc異二聚化之第一及第二Fc,含有含有突變T366W及S354C之第一Fc多肽及含有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之第二Fc多肽。於一些實施例中,該第一Fc多肽係選自包含SEQ ID NO: 201或207中所闡述之序列之Fc多肽及該第二Fc多肽係選自包含SEQ ID NO: 202、205或209中所闡述之序列之Fc多肽。於一些實施例中,該第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 82、86、94或96中之任一者中所闡述之胺基酸序列及該第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 83、87、90、92、98或100中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
於一些實施例中,該Fc多肽展示提供Fc-介導之效應功能之特徵。於特定實例中,該第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 201中所闡述之序列及第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 202或205。於一些實施例中,該第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 82中所闡述之序列及該等二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 83或90中所闡述之序列。於一些實施例中,該第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 86中所闡述之序列及該第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 87或92中所闡述之序列。該第一Fc多肽及第二Fc多肽可在構築體之任一多肽鏈上形式化。
於一些實施例中,第一Fc多肽及第二Fc多肽中之一者或二者還可包含一或多個胺基酸突變以進一步降低一或多種Fc效應功能,諸如降低之Fc受體結合。降低Fc效應功能之示例性突變包括如所述中之任一者。於一些實施例中,修飾可為一或多個位置Glu233 (E233)、Leu234 (L234)或Leu235 (L235)之缺失,諸如胺基酸Glu233 (E233)、Leu234 (L234)及Leu235 (L235)之缺失。於一些實施例中,該第一Fc多肽係選自包含SEQ ID NO: 203或208中所闡述之序列之Fc多肽及該第二Fc多肽係選自包含SEQ ID NO: 204、206或210中所闡述之序列之Fc多肽。於一些實施例中,該第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 84、88、95或97中之任一者中所闡述之胺基酸序列及該第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 85、89、91、93、99或101中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
於特定實例中,該第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 203中所闡述之序列及該第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 204或206。於一些實施例中,該第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 84中所闡述之序列及該第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 85或91中所闡述之序列。於一些實施例中,該第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 88中所闡述之序列及該第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 89或93中所闡述之序列。該第一Fc多肽及第二Fc多肽可在構築體之任一多肽鏈上形式化。
於一些實施例中,該第一Fc多肽或第二Fc多肽還包含突變M252Y及/或M428V。於特定實例中,該第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 207中所闡述之序列及該第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 209中所闡述之序列。於一些實施例中,該第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 94中所闡述之序列及該第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 98中所闡述之序列。於一些實施例中,該第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 96中所闡述之序列及該第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 100中所闡述之序列。於其他實例中,該第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 208中所闡述之序列及該第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 210中所闡述之序列。於一些實施例中,該第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 95中所闡述之序列及該第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 99中所闡述之序列。於一些實施例中,該第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 97中所闡述之序列及該第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 101中所闡述之序列。該第一Fc多肽及第二Fc多肽可在構築體之任一多肽鏈上形式化。
可促進異二聚體之啟動之變異體之額外實例為來自以下之第一Fc多肽及第二Fc多肽之立體變異體(例如,偏斜變異體)之任何組合或對:S364K/E357Q及L368D/K370S;L368D/K370S及S364K;L368E/K370S及S364K;T411T/E360E/Q362E及D401K;L368D/K370S及S364K/E357L;K370S及S364K/E357Q及T366S/L368A/Y407V及T366W或366S/L368A/Y407V/Y349C及T366W/S354C,其中各對表示第一Fc多肽及第二Fc多肽中之突變。於特定實施例中,所提供構築體含有含有突變對L368D/K370S及S364K及E357Q之第一Fc多肽及第二Fc多肽。
有時將可用於產生異二聚體之額外機理稱作「靜電轉向」,如Gunasekaran等人,J. Biol. Chem. 285(25):19637 (2010)中所述。本文中有時將此稱作「電荷對」。於此實施例中,使用靜電使形成偏斜向異二聚化。此項技術者應瞭解此等亦可具有對pI之影響,及因此對純化之影響,及因此於一些情況下,亦可被認為pI變異體。然而,因為產生此等以強迫異二聚化及不用作純化工具,將其歸類為「立體變異體」。於一實施例中,第一Fc多肽可含有突變D221E/P228E/L368E及第二Fc多肽可含有突變D221R/P228R/K409R。於另一實施例中,第一Fc多肽可含有突變C220E/P228E/368E及第二Fc多肽可含有突變C220R/E224R/P228R/K409R。
於一些實施例中,異二聚化可藉由pI變異體促進。於一些態樣中,pI變異體可包含增加蛋白質之PI之彼等(鹼性改變)。於其他態樣中,pI變異體可包含減少蛋白質之PI之彼等(酸性改變)。於一些情況下,可完成此等變異體之所有組合,包括組合,其中一個Fc多肽可係野生型,或變異體不顯示與野生型顯著不同之pI,及另一Fc多肽可係更鹼性或更酸性。或者,可改變各Fc多肽,一者至更鹼性及一者至更酸性。於一些實施例中,至少一個Fc多肽為含有突變Q295E/N384D/Q418E/N421D之陰性pI變異體Fc。
於一些實施例中,可使用立體異二聚化變異體(例如,隆突及穴)及pI或電荷對變異體之組合。
於特定實施例中,所提供構築體含有(a)包含偏斜變異體S364K/E357Q之第一Fc多肽;及b)含有偏斜變異體L368D/K370S及pI變異體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D之第二Fc多肽。於一些實施例中,該第一多肽及該第二多肽中之一者或二者可進一步含有突變以降低Fc效應活性,諸如示例性突變E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。能介導Fc異二聚化之此第一Fc多肽及第二Fc多肽之實例包括SEQ ID NO: 194及195中所闡述之序列。該第一Fc多肽及第二Fc多肽可在構築體之任一多肽鏈上形式化。
所得多重特異性多肽構築體可藉由任何適宜方法(諸如例如,藉由經蛋白A或蛋白G管柱之親和層析法)純化。在將編碼不同多肽之兩種核酸分子轉化成細胞之情況下,均二聚體及異二聚體之形成將發生。可調整表現之條件使得異二聚體形成勝過均二聚體形成。
基於異二聚體對親和試劑之差別親和力自均二聚體回收異二聚體之技術係已知。於一些態樣中,此等技術包括設計異二聚體使得Fc多肽鏈中之一者不結合至親和試劑蛋白A。於一些情況下,多肽鏈中之一者可含有一或多個胺基酸置換以取消或降低對Fc異二聚體之多肽中之一者中之蛋白A試劑之親和力,參見例如,WO2017134440、WO2010151792、Jendeberg等人(Jendeberg等人(1997) J. Immunol. Methods, 201(1): 25-34)。於此等實施例中之一些中,Fc區可在異二聚體之一個成員之蛋白-A結合位點處經修飾以便防止蛋白-A結合及從而使能更有效純化異二聚體融合蛋白。此結合位點內之示例性修飾為Ile253,例如,Ile253Arg (I253R)。於一些實施例中,該修飾可為H435R或H435R/Y436F。於一些實施例中,Fc異二聚體之Fc多肽可含有修飾使得其能結合蛋白A但不結合蛋白G (pA+/pG-)。示例性pA+/pG-胺基酸修飾包括含有位置428處之絲胺酸、位置434處之絲胺酸及視情況位置436處之組胺酸(關於人類IgGl)或包含人類IgG 2、3或4之對應位置處之此等殘基之Fc。於一些態樣中,一個IgG Fc多肽在位置428、434及視情況436處之此等胺基酸修飾減少或防止蛋白G之結合,增強蛋白質之純化。
於一些實施例中,賦予對親和試劑之差別親和力之此等修飾中之任一者可與上述任何一或多種其他胺基酸修飾組合。例如,I253R修飾可與T366S/L368A/Y407V修飾或與T366W修飾組合。經T366S/L368A/Y407V修飾之Fc能形成均二聚體,因為在經T336W修飾之Fc之情況下,不存在二聚化介面之立體包藏。因此,於一些實施例中,將I253R修飾與經T366S/L368A/Y407V修飾之Fc組合以不允許純化可形成之任何均二聚體Fc。可藉由組合T366S/L368A/Y407V及H453R採用類似修飾。
於一些實施例中,異二聚體分子之Fc區可額外含有一或多個其他Fc突變,諸如上述任一者。於一些實施例中,異二聚體分子含有具有突變之Fc區,該突變降低效應功能。
於一些實施例中,異二聚體Fc之一個Fc多肽包含SEQ ID NO: 201 (例如,SEQ ID NO: 82)、86、207 (例如,SEQ ID NO: 94)或96中之任一者中所闡述之胺基酸序列,及異二聚體Fc之另一Fc多肽含有SEQ ID NO: 201 (例如,SEQ ID NO: 83)、87、205 (例如,SEQ ID NO: 90)、92、209 (例如,SEQ ID NO: 98)或100中之任一者中所闡述之胺基酸序列。於一些實施例中,異二聚體Fc之一個Fc多肽包含SEQ ID NO: 203 (例如,SEQ ID NO: 84)、88、208 (例如,SEQ ID NO: 95)或97中之任一者中所闡述之胺基酸序列及異二聚體Fc之另一Fc多肽包含SEQ ID NOS: 204 (例如,SEQ ID NO: 85)、89、206 (例如,SEQ ID NO: 91)、93、210 (例如,SEQ ID NO: 99)或101中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
於一些實施例中,人類IgG Fc區經修飾以防止二聚化。於此等實施例中,本發明之融合蛋白係單體。例如,殘基Thr366至帶電殘基(例如,Thr366Lys、Thr366Arg、Thr366Asp或Thr366Glu (各自為T366K、T366R、T366D或T366E))之修飾防止CH3-CH3二聚化。
於一些實施例中,融合蛋白之Fc區在下列位置中之一或多者處經改變以減少Fc受體結合:Leu 234 (L234)、Leu235 (L235)、Asp265 (D265)、Asp270 (D270)、Ser298 (S298)、Asn297 (N297)、Asn325 (N325)或Ala327 (A327)。例如,Leu 234Ala (L234A)、Leu235Ala (L235A)、Asp265Asn (D265N)、Asp270Asn (D270N)、Ser298Asn (S298N)、Asn297Ala (N297A)、Asn325Glu (N325E)或Ala327Ser (A327S)。於較佳實施例中,Fc區內之修飾減少結合至Fc-受體-γ受體,同時對結合至新生Fc受體(FcRn)具有最小影響。
於一些實施例中,融合蛋白含有源自免疫球蛋白鉸鏈區之多肽。該鉸鏈區可係選自人類IgG子集中之任一者。例如,融合蛋白可含有具有EPKSSDKTHTCPPC (SEQ ID NO: 7)之序列之經修飾之IgG1鉸鏈,其中與輕鏈之C端半胱胺酸形成二硫鍵之Cys220經突變成絲胺酸,例如,Cys220Ser (C220S)。於其他實施例中,融合蛋白含有具有序列DKTHTCPPC (SEQ ID NO: 8)之縮短鉸鏈。
於一些實施例中,融合蛋白具有來自IgG4之經修飾之鉸鏈,其經修飾以防止或減少股交換,例如,具有序列ESKYGPPCPPC (SEQ ID NO: 9)之Ser228Pro (S228P)。於一些實施例中,融合蛋白含有連接子多肽。於其他實施例中,融合蛋白含有連接子及鉸鏈多肽。 3. 連接子
所提供多重特異性多肽構築體含有連接子,該連接子連接或偶合含有免疫球蛋白Fc區之第一組分及含有CD3結合區之第二組分。於一些實施例中,該連接子為非可裂解連接子。於一些實施例中,該連接子不含有針對藉由蛋白酶裂解特異性識別之受質識別位點。因此,所提供多重特異性多肽構築體中之連接子不包含可用作蛋白酶(諸如細胞外蛋白酶)受質之胺基酸序列。例如,非可裂解連接子不包含含有至少一個肽鍵之裂解序列,該肽鍵位於蛋白酶之可裂解肽序列內。
於一些實施例中,連接子位於Fc區之C端區末端,使得該Fc區為CD3結合區之N端。因為所提供多重特異性多肽構築體為多聚體(諸如二聚體),所提供構築體包含連接第一Fc多肽之連接子及第一多肽之CD3結合區之第一域(例如,VH)及第二Fc多肽及第二多肽之CD3結合區之第二域(例如,VL)。通常,存在於多重特異性多肽構築體之第一多肽及第二多肽中之連接子係相同。因此,於一些實施例中,CD3結合域之各域經由連接子(諸如相同連接子)連接至Fc (諸如異二聚體Fc)之相反多肽。
用於融合蛋白之各種多肽連接子係已知(參見例如,Chen等人(2013) Adv. Drug. Deliv. 65:1357-1369;及國際PCT公開案號WO 2014/099997、WO2000/24884;美國專利案第5,258,498號;美國專利案第5,525,491號;美國專利案第5,525,491號、美國專利案第6,132,992號)。
於一些實施例中,選擇連接子使得當CD3結合區連接至多重特異性多肽結合物之Fc區時,CD3結合區受限且在該多重特異性多肽構築體與細胞接觸後,不能或實質上不能結合或接合細胞(例如,T細胞)表面上之CD3。可採用各種分析評估CD3藉由多重特異性多肽構築體之結合或接合,包括評估T細胞結合、使用報告基因系統之NFAT活化、溶細胞T細胞活性、細胞激素產生及/或T細胞活化標誌物之表現之分析。示例性分析示於所提供實例中。通常,連接子亦為確保多肽構築體之正確折疊者,其不展示與所連接多肽之活性或功能不相符之電荷或與阻止或改變所連接多肽之活性之域中之一或多者中之胺基酸殘基形成鍵或其他相互作用。於一些實施例中,該連接子為多肽連接子。該多肽連接子可為可撓性連接子或剛性連接子或二者之組合。
於一些態樣中,該連接子為短、中等或長連接子。於一些實施例中,該連接子長度為至多40個胺基酸。於一些實施例中,該連接子長度為至多25個胺基酸。於一些實施例中,該連接子長度為至少2個或至少約2個胺基酸。於一些態樣中,適宜長度為(例如)至少一個及通常少於約40個胺基酸殘基(諸如2至25個胺基酸殘基、5至20個胺基酸殘基、5至15個胺基酸殘基、8至12個胺基酸)之長度。於一些實施例中,該連接子為約2至24個胺基酸、2至20個胺基酸、2至18個胺基酸、2至14個胺基酸、2至12個胺基酸、2至10個胺基酸、2至8個胺基酸、2至6個胺基酸、6至24個胺基酸、6至20個胺基酸、6至18個胺基酸、6至14個胺基酸、6至12個胺基酸、6至10個胺基酸、6至8個胺基酸、8至24個胺基酸、8至20個胺基酸、8至18個胺基酸、8至14個胺基酸、8至12個胺基酸、8至10個胺基酸、10至24個胺基酸、10至20個胺基酸、10至18個胺基酸、10至14個胺基酸、10至12個胺基酸、12至24個胺基酸、12至20個胺基酸、12至18個胺基酸、12至14個胺基酸、14至24個胺基酸、14至20個胺基酸、14至18個胺基酸、18至24個胺基酸、18至20個胺基酸或20至24個胺基酸。於一些實施例中,該連接子長度為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸。
於某些態樣中,當多重特異性多肽結合物結合至其抗原(例如,TAA)時,連接子長度越長,CD3結合越多。因此,於一些態樣中,連接子長度為大於12個胺基酸,諸如長度大於13、14、15、16、17或18個胺基酸。於一些實施例中,連接子長度為12至40個胺基酸、12至30個胺基酸、12至24個胺基酸、12至18個胺基酸、12至15個胺基酸、15至40個胺基酸、15至30個胺基酸、15至24個胺基酸、15至18個胺基酸、18至40個胺基酸、18至30個胺基酸、18至24個胺基酸、24至40個胺基酸、24至30個胺基酸或30至40個胺基酸。
連接子可係天然產生、合成或二者之組合。特別適宜連接子多肽主要包含選自甘胺酸(Gly)、絲胺酸(Ser)、丙胺酸(Ala)及蘇胺酸(Thr)之胺基酸殘基。例如,連接子可含有選自Gly、Ser、Ala及Thr之胺基酸殘基之至少75% (基於存在於多肽連接子中之殘基之總數目計算),諸如至少80%、至少85%或至少90%。連接子亦可僅由Gly、Ser、Ala及/或Thr殘基組成。於一些實施例中,連接子含有1至25個甘胺酸殘基、5至20個甘胺酸殘基、5至15個甘胺酸殘基或8至12個甘胺酸殘基。於一些態樣中,適宜肽連接子通常含有至少50%甘胺酸殘基,諸如至少75%甘胺酸殘基。於一些實施例中,肽連接子僅包含甘胺酸殘基。於一些實施例中,肽連接子僅包含甘胺酸及絲胺酸殘基。
於一些實施例中,此等連接子主要由胺基酸甘胺酸及絲胺酸組成,本文中表示為GS連接子。於一些實施例中,連接子含有(GGS)n,其中n為1至10,諸如1至5,例如1至3,諸如GGS(GGS)n
(SEQ ID NO: 171),其中n為0至10。於特定實施例中,連接子含有序列(GGGGS)n
(SEQ ID NO: 173),其中n為1至10或n為1至5,諸如1至3。於其他實施例中,連接子含有(GGGGGS)n
(SEQ ID NO: 172),其中n為1至4,諸如1至3。連接子可包含以上任一者之組合,諸如可組合2、3、4或5個GS、GGS、GGGGS及/或GGGGGS連接子之重複。於一些實施例中,此連接子長度為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個胺基酸。
於一些實施例中,連接子為(以單字母胺基酸編碼):GGS、GGGGS (SEQ ID NO: 149)或GGGGGS (SEQ ID NO: 135)。於一些實施例中,GS-連接子包含以下之胺基酸序列:GGSGGS,即,(GGS)2
(SEQ ID NO: 10);GGSGGSGGS,即,(GGS)3
(SEQ ID NO: 11);GGSGGSGGSGGS,即,(GGS)4
(SEQ ID NO: 12);GGSGGSGGSGGSGGS,即,(GGS)5
(SEQ ID NO: 13);GGGGGSGGGGGSGGGGGS,即,(G5S)3
(SEQ ID NO: 119),GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 147)及GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 170)。於一些實施例中,連接子為GGGG (SEQ ID NO: 103)。於一些實施例中,連接子為GGGGG (SEQ ID NO: 192)。於一些以上實例中之任一者中,絲胺酸可經丙胺酸置換(例如,(Gly4Ala)或(Gly3Ala))。
於一些實施例中,連接子包含具有胺基酸序列Glyx
Xaa-Glyy
-Xaa-Glyz
(SEQ ID NO: 174)之肽連接子,其中各Xaa係獨立地選自丙胺酸(Ala)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸(Ile)、甲硫胺酸(Met)、苯丙胺酸(Phe)、色胺酸(Trp)、脯胺酸(Pro)、甘胺酸(Gly)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、半胱胺酸(Cys)、酪胺酸(Tyr)、天冬醯胺(Asn)、麩胺醯胺(Gln)、離胺酸(Lys)、精胺酸(Arg)、組胺酸(His)、天冬胺酸(Asp)及麩胺酸(Glu),且其中x、y及z各者為1至5範圍內之整數。於一些實施例中,各Xaa係獨立地選自由Ser、Ala及Thr組成之群。於特定變型中,x、y及z各者係等於3 (從而產生具有胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 175)之肽連接子),其中如上選擇各Xaa。
於一些實施例中,連接子為基於(SSSSG)n (SEQ ID NO: 185)基序之重複之絲胺酸濃化連接子,其中n為至少1,儘管n可為2、3、4、5、6、7、8及9。
於一些情況下,可期望提供一些剛性至肽連接子中。此可藉由包含脯胺酸殘基於肽連接子之胺基酸序列中來實現。因此,於一些實施例中,連接子包含至少一個脯胺酸殘基於肽連接子之胺基酸序列中。例如,肽連接子可具有胺基酸序列,其中該等胺基酸殘基之至少25% (例如,至少50%或至少75%)為脯胺酸殘基。於一特定實施例中,肽連接子僅包含脯胺酸殘基。
於一些態樣中,肽連接子包含至少一個半胱胺酸殘基,諸如一個半胱胺酸殘基。例如,於一些實施例中,連接子包含至少一個半胱胺酸殘基及選自由Gly、Ser、Ala及Thr組成之群之胺基酸殘基。於一些此等實施例中,連接子包含甘胺酸殘基及半胱胺酸殘基,諸如僅甘胺酸殘基及半胱胺酸殘基。通常,每個肽連接子將僅包含一個半胱胺酸殘基。包含半胱胺酸殘基之特定連接子之一個實例包括具有胺基酸序列Glym
-Cys-Glyn
之肽連接子,其中n及m各者為1至12 (例如,3至9、4至8或4至7)之整數。於特定變型中,此肽連接子具有胺基酸序列GGGGG-C-GGGGG (SEQ ID NO: 177)。
於一些實施例中,融合蛋白之連接子為結構或經受限連接子。於特定實施例中,結構連接子含有序列(AP)n
或(EAAAK)n
(SEQ ID NO: 178),其中n為2至20,較佳地4至10,包括(但不限於) AS-(AP)n
-GT (SEQ ID NO: 179)或AS-(EAAAK)n
-GT (SEQ ID NO: 180),其中n為2至20,諸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。於其他實施例中,連接子包含序列(GGGGA)n
(SEQ ID NO: 181)、(PGGGS)n
(SEQ ID NO: 182)、(AGGGS)n
(SEQ ID NO: 183)或GGS-(EGKSSGSGSESKST)n
-GGS (SEQ ID NO: 184),其中n為2至20。於一些實施例中,連接子為SSSASASSA (SEQ ID NO: 186)、GSPGSPG (SEQ ID NO: 187)或ATTTGSSPGPT (SEQ ID NO: 176)。於一些實施例中,根據其結構,此等連接子可更抗蛋白質降解,從而當活體內注射時提供優點。
於一些實施例中,連接子非可裂解連接子(可與非可裂解連接子交換使用)。於一些實施例中,連接子不可藉由蛋白酶裂解。於一些實施例中,非可裂解連接子或不可藉由蛋白酶裂解之連接子為一般穩定用於活體內遞送或重組產生者。於一些態樣中,不可藉由蛋白酶裂解之連接子包括不含有至少一個肽鍵之彼等,該肽鍵較佳地位於蛋白酶之可裂解肽序列或識別位點。於特定實施例中,非可裂解連接子非蛋白酶之靶受質,使得其相較於含有相同蛋白酶之受質識別位點之連接子不藉由蛋白酶優先或特異性裂解。
於一些實施例中,連接子不含有特定蛋白酶之受質識別位點或裂解位點,其為藉由蛋白酶裂解之藉由蛋白酶之活性位點識別之序列。通常,例如,針對絲胺酸蛋白酶,裂解序列由受質中之P1-P4及P1′-P4′胺基酸組成,其中裂解於P1位置後發生。通常,絲胺酸蛋白酶之裂解序列長度為6個殘基以匹配許多蛋白酶之擴展之受體特異性,但是可係更長或更短,依賴於該蛋白酶。通常,連接子不包含藉由蛋白酶識別之P1-P1′剪接鍵序列。
於一些態樣中,非可裂解連接子或不含有對藉由蛋白酶裂解特異性識別之受質識別位點之連接子為其藉由蛋白酶之裂解實質上少於該蛋白酶之靶受質之裂解者。通常,蛋白酶展示特定靶受質相較於另一非靶受質之裂解之特異性或優先。此特異性程度可基於序列(例如,連接子序列)之裂解速率常數測定,其為蛋白酶對其受質偏好及酵素效率之量度。可使用測定在各種濃度受質存在下,裂解隨時間增加之速率之任何方法來計算特異性常數。例如,將受質連接至螢光部分,其在藉由蛋白酶裂解後釋放。藉由測定不同蛋白酶濃度下之裂解速率,可針對朝向特定連接子之特定蛋白酶測定裂解之特異性常數(kcat
/Km
)。於一些實施例中,非可裂解連接子或不含有對藉由蛋白酶裂解特異性識別之受質識別位點之連接子為若完全裂解,則藉由蛋白酶在小於1×104
M−1
S−1
,或小於5×103
M−1
S,小於1×103
M−1
S,或小於1×102
M−1
S或更小之速率下裂解之連接子。
於一些實施例中,本文中所提供之多重特異性構築體中之連接子不含有蛋白酶之受質識別位點,該蛋白酶包括(例如)基質金屬蛋白酶(MMP)、半胱胺酸蛋白酶、絲胺酸蛋白酶及纖溶酶活化子。於特定實施例中,連接子不含有蛋白酶之受質識別位點,該蛋白酶為藉由腫瘤、經活化免疫效應細胞(例如,T細胞或NK細胞)或腫瘤微環境中之細胞產生之蛋白酶。
於一些實施例中,連接子不含有藉由下列酵素或蛋白酶中之一或多者特異性識別之受質識別位點:ADAMS、ADAMTS (例如,ADAM8);ADAM9;ADAM10;ADAM12;ADAM15;ADAM17/TACE;ADAMDEC1;ADAMTS1;ADAMTS4;ADAMTS5;天冬胺酸蛋白酶,例如,BACE或腎素(Renin);天冬胺酸組織蛋白酶,例如,組織蛋白酶D或組織蛋白酶E;半胱天冬酶,例如,半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10或半胱天冬酶14;半胱胺酸組織蛋白酶,例如,組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V/L2、組織蛋白酶X/Z/P;半胱胺酸蛋白酶,例如,Cruzipain;天冬醯胺內肽酶(Legumain);Otubain-2;KLK,例如,KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13或KLK14;金屬蛋白酶,例如,跨膜肽酶(Meprin);腦啡肽酶(Neprilysin);PSMA;BMP-1;MMP,例如,MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP23、MMP24、MMP26、或MMP27,絲胺酸蛋白酶,例如,經活化之蛋白C、組織蛋白酶A、組織蛋白酶G、胃促胰酶(Chymase)、凝血因子蛋白酶(例如,FVIIa、FIXa、Fxa、FXIa、FXIIa)、彈性蛋白酶(Elastase)、顆粒酶B、胍啶苯甲酸酯酶(Guanidinobenzoatase)、HtrA1、人類嗜中性白血球彈性蛋白酶、乳鐵蛋白(Lactoferrin)、Marapsin、NS3/4A、PACE4、纖溶酶、PSA、tPA、凝血酶、類胰蛋白酶、uPA;II類跨膜絲胺酸蛋白酶(TTSP),例如,DESC1、DPP-4、FAP、Hepsin、蛋白裂解酶-2、蛋白裂解酶、TMPRSS2、TMPRSS3或TMPRSS4;及其任何組合。於一些實施例中,連接子不含有藉由顆粒酶B、蛋白裂解酶或MMP (諸如MMP-2)特異性識別之受質識別位點。
於一些實施例中,連接子不包含為顆粒酶B之受質之胺基酸。於一些實施例中,連接子不含有具有通式P4 P3 P2 P1 ↓ P1’ (SEQ ID NO: 150)之胺基酸序列,其中P4為胺基酸I、L、Y、M、F、V或A;P3為胺基酸A、G、S、V、E、D、Q、N或Y;P2為胺基酸H、P、A、V、G、S或T;P1為胺基酸D或E;且P1’為胺基酸I、L、Y、M、F、V、T、S、G或A。於一些實施例中,連接子不含有具有通式P4 P3 P2 P1 ↓ P1’ (SEQ ID NO: 151)之胺基酸序列,其中P4為胺基酸I或L;P3為胺基酸E;P2為胺基酸P或A;P1為胺基酸D;及P1’為胺基酸I、V、T、S或G。
於一些實施例中,連接子不含有胺基酸序列LEAD (SEQ ID NO: 22)、LEPD(SEQ ID NO: 142)或LEAE (SEQ ID NO: 143)。於一些實施例中,連接子不含有胺基酸序列IEPDI (SEQ ID NO: 136)、LEADT (SEQ ID NO: 137)、IEPDG (SEQ ID NO: 138)、IEPDV (SEQ ID NO: 139)、IEPDS (SEQ ID NO: 140)、IEPDT (SEQ ID NO: 141)、IEPDP (SEQ ID NO: 144)、LEPDG (SEQ ID NO: 152)或LEADG (SEQ ID NO: 153)。
於一些實施例中,連接子不包含為蛋白裂解酶之受質之胺基酸。於一些實施例中,連接子不包含序列P1QAR↓(A/V) (SEQ ID NO: 154),其中P1為任何胺基酸。於一些實施例中,連接子不包含序列RQAR(A/V) (SEQ ID NO: 155)。於一些實施例中,連接子不包含胺基酸序列RQAR (SEQ ID NO: 23)。於一些實施例中,連接子不包含胺基酸序列RQARV (SEQ ID NO: 156)。
於一些實施例中,連接子不包含為一或多種基質金屬蛋白酶(MMP)之受質之胺基酸。於一些實施例中,該MMP為MMP-2。於一些實施例中,連接子不含有具有通式P3 P2 P1 ↓ P1’ (SEQ ID NO: 157)之序列,其中P3為P、V或A;P2為Q或D;P1為A或N;且P1’為L、I或M。於一些實施例中,連接子不含有通式P3 P2 P1 ↓ P1’ (SEQ ID NO: 158),其中P3為P;P2為Q或D;P1為A或N;且P1’為L或I。於一些實施例中,連接子不包含胺基酸序列PAGL (SEQ ID NO: 24)。
於一些實施例中,連接子非包含如下所述之胺基酸序列之連接子:TGLEADGSPAGLGRQARVG (SEQ ID NO: 25)、TGLEADGSRQARVGPAGLG (SEQ ID NO: 26)、TGSPAGLEADGSRQARVGS (SEQ ID NO: 27)、TGPAGLGLEADGSRQARVG (SEQ ID NO: 28)、TGRQARVGLEADGSPAGLG (SEQ ID NO: 29)、TGSRQARVGPAGLEADGS (SEQ ID NO: 30);及TGPAGLGSRQARVGLEADGS (SEQ ID NO: 31)、GPAGLGLEPDGSRQARVG (SEQ ID NO: 104)、GGSGGGGIEPDIGGSGGS (SEQ ID NO: 105)、GGSGGGGLEADTGGSGGS (SEQ ID NO: 106)、GSIEPDIGS (SEQ ID NO: 107)、GSLEADTGS (SEQ ID NO: 108)、GGSGGGGIEPDGGGSGGS (SEQ ID NO: 109)、GGSGGGGIEPDVGGSGGS (SEQ ID NO: 110)、GGSGGGGIEPDSGGSGGS (SEQ ID NO: 111)、GGSGGGGIEPDTGGSGGS (SEQ ID NO: 112)、 GGGSLEPDGSGS (SEQ ID NO: 113);及GPAGLGLEADGSRQARVG (SEQ ID NO: 114)、GGEGGGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 115)、GSSAGSEAGGSGQAGVGS (SEQ ID NO: 116)、GGSGGGGLEAEGSGGGGS (SEQ ID NO: 117)、GGSGGGGIEPDPGGSGGS(SEQ ID NO: 118)、TGGSGGGGIEPDIGGSGGS (SEQ ID NO: 148)。 4. 抗原結合域:
本發明之多重特異性多肽構築體包含至少一個抗原結合域,諸如至少第一抗原結合域及第二抗原結合域。於一些態樣中,該抗原結合域或該等抗原結合域各者係獨立地選自抗體或抗原結合片段、天然同源結合搭檔、抗運載蛋白(Anticalin) (經工程改造之脂鈣蛋白(lipocalin))、Darpin、Fynomer、Centyrin (經工程改造之纖維連接蛋白III域)、胱胺酸結域、人泛素、親和抗體或經工程改造之CH3域。於一些實施例中,天然同源結合搭檔包含展示對TAA結合活性之TAA或其變異體之天然同源結合搭檔之細胞外域或其結合片段。
於一些實施例中,TAA為主要存在於哺乳動物個體之腫瘤細胞上但是一般不在哺乳動物個體之正常細胞上發現之反結構。腫瘤特異性抗原不必為腫瘤細胞專用,但是具有腫瘤相關抗原之特定哺乳動物之細胞之百分比係足夠高或腫瘤表面上之腫瘤相關抗原之含量係足夠高使得其可藉由抗腫瘤療法(諸如所提供之多重特異性多肽構築體)靶向,及自腫瘤之作用提供哺乳動物之預防或治療。於一些實施例中,於來自患有腫瘤之哺乳動物之細胞之隨機統計樣品中,顯示TAA之細胞之至少50%係癌變。於其他實施例中,顯示TAA之細胞之至少60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%係癌變。
於一些實施例中,該抗原結合域或該等抗原結合域(諸如第一抗原結合域及第二抗原結合域)各者獨立地包含抗體或其抗原結合片段之一或多個複本。於一些實施例中,該抗原結合域或該等抗原結合域各者獨立地包含選自由以下組成之群之抗體或其抗原結合片段之一或多個複本:Fab片段、F(ab')2
片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體及單域輕鏈抗體。於一些實施例中,該抗原結合域或該等抗原結合域(諸如第一抗原結合域及第二抗原結合域)各者獨立地為單鏈抗體。於一些實例中,該單鏈為scFv、scAb、單域重鏈抗體或單域輕鏈抗體。於一些實施例中,該第一抗原結合域及該第二抗原結合域各者包含一或多個單域抗體(sdAb)片段,例如,VH
H、VNAR
、經工程改造之VH
或VK
域。VH
H可自僅天然駱駝狀重鏈抗體、產生僅重鏈抗體之經基因修飾之齧齒動物、或初始/合成駱駝狀或人源化駱駝狀單域抗體庫產生。VNAR
可自僅軟骨魚狀重鏈抗體產生。已實施各種方法以自習知異二聚體VH
及VK
域產生單體sdAb,該等方法包括介面工程改造及選擇特異性生殖系家族。
於一些實施例中,該抗原結合域或該等抗原結合域(諸如多重特異性多肽構築體之第一抗原結合域及/或第二抗原結合域)各者獨立地含有結合TAA之至少一個sdAb或scFv。於一些實施例中,結合TAA之至少一個scFv或sdAb相對於Fc區胺基端定位及/或相對於多重特異性多肽構築體之CD3結合區羧基端定位。於一些實施例中,多重特異性多肽構築體僅含有結合至TAA之一個scFv或sdAb,其可相對於Fc區胺基端定位及/或相對於CD3結合區羧基端定位。於一些實施例中,多重特異性多肽構築體含有結合至TAA之兩個scFv或sdAb,其相對於Fc區胺基端定位及/或相對於CD3結合區羧基端定位。於一些實施例中,多重特異性多肽構築體含有三個scFv或sdAb,其中兩者相對於Fc區胺基端定位或相對於CD3結合區羧基端定位,及第三者在該多重特異性多肽構築體之另一端定位。
於一些實施例中,多重特異性多肽構築體自兩個多肽形成或包含兩個多肽,該等多肽包括包含異二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如,Fv)之VH域及結合至腫瘤相關抗原之scFv或sdAb之第一多肽;及包含異二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如,Fv)之VL域及視情況結合至腫瘤相關抗原之相同或不同scFv或sdAb之第二多肽。結合至TAA之scFv或sdAb可相對於異二聚體Fc之Fc多肽胺基端定位及/或相對於CD3結合區之VH或VL鏈羧基端定位。於一些實施例中,多重特異性多肽構築體之抗原結合域或該等抗原結合域各者獨立地含有組裝為FAB或scFv之VH及VL序列。於一些實施例中,多重特異性多肽構築體之抗原結合域或該等抗原結合域各者獨立地含有如單域抗體(sdAb)之結合域。
於一些實施例中,該抗原結合域或該等抗原結合域(諸如第一抗原結合域及第二抗原結合域)各者獨立地含有一個以上鏈。於一些實施例中,多重特異性多肽構築體之抗原結合域或該等抗原結合域(諸如第一抗原結合域及/或第二抗原結合域)各者獨立地含有組裝為FAB之VH及VL序列。
於一些實施例中,多重特異性多肽構築體之抗原結合域或該等抗原結合域(諸如第一抗原結合域及/或第二抗原結合域)各者獨立地含有結合TAA之Fab抗體之VH-CH1 (Fd)及VL-CL。於一些實施例中,該含有VH-CH1 (Fd)及VL-CL之Fab抗體相對於Fc區胺基端定位及/或相對於多重特異性多肽構築體之CD3結合區羧基端定位。於一些實施例中,多重特異性多肽構築體含有僅一個含VH-CH1 (Fd)及VL-CL之Fab抗體,其結合至TAA,其可相對於Fc區胺基端定位及/或相對於CD3結合區羧基端定位。於一些實施例中,多重特異性多肽構築體含有結合至TAA之兩個Fab抗體片段(各者含有VH-CH1 (Fd)及VL-CL),其中一者相對於Fc區胺基端定位及另一者相對於CD3結合區羧基端定位。
於一些實施例中,多重特異性多肽構築體自三個或更多個多肽形成或包含三個或更多個多肽,該等多肽包括包含異二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子及結合至腫瘤相關抗原之Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL之第一多肽;包含異二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子及視情況結合至腫瘤相關抗原之Fab抗體片段之相同VH-CH1 (Fd)或VL-CL之第二多肽;及包含結合至TAA之Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL中之另一者之第三多肽。
於一些實施例中,該抗原結合域或該等抗原結合域各者獨立地為或包含展示對TAA之結合活性之TAA或其變異體之初始同源結合搭檔之細胞外域或其結合片段。
於一些實施例中,該等抗原結合域各者(諸如第一抗原結合域及第二抗原結合域各者)結合相同抗原。於一些實施例中,第一抗原結合域及第二抗原結合域各者結合不同抗原。於一些實施例中,抗原結合域各者(諸如第一抗原結合域及第二抗原結合域各者)結合相同腫瘤相關抗原(TAA)。於一些實施例中,抗原結合域各者(諸如第一抗原結合域及第二抗原結合域各者)結合不同TAA。於一些實施例中,抗原結合域各者(諸如第一抗原結合域及第二抗原結合域各者)結合相同TAA上之不同抗原決定基。於一些實施例中,抗原結合域各者(諸如第一抗原結合域及第二抗原結合域各者)結合相同TAA上之相同抗原決定基。
於一些實施例中,該等抗原結合域導致與該TAA之一價、二價、三價或四價結合。
於一些實施例中,該TAA係選自由以下組成之群:1-92-LFA-3、5T4、α-4整聯蛋白、α-V整聯蛋白、α4β1整聯蛋白、α4β7整聯蛋白、AGR2、抗Lewis-Y、Apelin J受體、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補體、C-242、CA9、CA19-9、(Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5 (CEA)、CEACAM6 (NCA-90)、CLAUDIN-3、CLAUDIN-4、cMet、膠原蛋白、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、內皮素B受體(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV之F蛋白、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受體α (FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受體、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、透明質酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受體(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R (wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰島素受體、Jagged配位體、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、間皮素、MRP4、MUC1、黏蛋白-16 (MUC16、CA-125)、Na/K ATPase、NGF、呆蛋白、Notch受體、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂醯基-絲胺酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、1-磷酸鞘胺醇、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2及WISP-3。
於一些實施例中,至少一個抗原結合域或各抗原結合域獨立地結合腫瘤相關抗原(TAA)葉酸受體α (FRα)。例如,抗原結合域含有如結合FRα之sdAb之結合域。示例性結合FRα之sdAb述於SEQ ID NO: 120、121及122中。
於一些實施例中,至少一個抗原結合域或各抗原結合域獨立地結合腫瘤相關抗原(TAA) cMET。例如,抗原結合域含有如結合cMET之sdAb之結合域。示例性結合cMET之sdAb述於SEQ ID NO: 123中(美國專利案第9,346,884號)。
於一些實施例中,至少一個抗原結合域或各抗原結合域獨立地結合腫瘤相關抗原(TAA) B7H3。例如,抗原結合域含有如結合B7H3之scFv之結合域。示例性結合B7H3之scFv述於SEQ ID NO: 124中。於一些實施例中,抗原結合域為或含有包含VH-CH1 (Fd)及LC之Fab抗體片段。示例性B7H3 Fd述於SEQ ID NO: 127中及示例性B7H3 LC述於SEQ ID NO: 128中(PCT公開案號WO2017/030926)。
於一些實施例中,至少一個抗原結合域或各抗原結合域獨立地結合腫瘤相關抗原(TAA) CD20。於一些實施例中,此抗原結合域含有SEQ ID NO: 189中所闡述之VH及SEQ ID NO: 190中所闡述之VL或展示與SEQ ID NO: 189或SEQ ID NO: 190至少或約85%、90%、95%、96%、97%、98%、98%、或99%序列同一性之序列。例如,抗原結合域含有如結合CD20之scFv之結合域。示例性結合CD20之scFv述於SEQ ID NO: 125及213中(美國公開案號US 2005/0123546)。
於一些實施例中,至少一個抗原結合域或各抗原結合域獨立地結合腫瘤相關抗原(TAA) DLL3。例如,抗原結合域含有如結合DLL3之scFv之結合域。示例性結合DLL3之scFv述於SEQ ID NO: 126及188 (美國公開案號US 2017/0037130)中。於一些實施例中,抗原結合域為或含有包含結合DLL3之Fd及LC之Fab抗體片段。示例性DLL3 Fd述於SEQ ID NO: 133中及示例性DLL3 LC述於SEQ ID NO: 134中(美國專利案號US 8,044,178)。
於一些實施例中,至少一個抗原結合域或各抗原結合域獨立地結合腫瘤相關抗原(TAA) 5T4。示例性5T4 Fd述於SEQ ID NO: 129中及示例性5T4 LC述於SEQ ID NO: 130中。於一些實施例中,抗體結合域包含如SEQ ID NO: 167及168中所闡述之VH-CH1 (Fd)或VL-CL (美國專利案號US 8,044,178)。
於一些實施例中,至少一個抗原結合域或各抗原結合域獨立地結合腫瘤相關抗原(TAA) gpNMB。於一些實施例中,抗原結合域為或含有包含Fd及LC鏈之Fab片段。示例性gpNMB Fd述於SEQ ID NO: 131中及示例性gpNMB LC述於SEQ ID NO: 132中。
於一些實施例中,抗原結合域經由連接子直接或間接連接至Fc區及/或CD3結合區。於一些實施例中,連接係經由連接子。於一些實施例中,該連接子為連接肽(LP),其可包括如第II.3節中所述之任何可撓性或剛性連接子,雖然一般連接抗原結合域之肽非可裂解連接子。
於一些實施例中,多重特異性多肽構築體包含第一抗原結合域與Fc區之間之第一連接肽(LP1)。於一些實施例中,多重特異性多肽構築體包含CD3結合區與第二抗原結合域之間之第二連接肽(LP2)。於一些實施例中,多重特異性多肽構築體包含第一抗原結合域與Fc區之間之第一連接肽(LP1)及CD3結合區與第二抗原結合域之間之第二連接肽(LP2)。於一些態樣中,多重特異性多肽構築體具有如下自N端至C端之結構排列:第一抗原結合域–LP1- Fc區–連接子–CD3結合區–LP2–第二抗原結合域。於一些實施例中,兩個連接肽彼此不相同。
於一些實施例中,LP1或LP2獨立地為長度約1至20個胺基酸之肽。於一些實施例中,LP1或LP2獨立地為肽,該肽為或包含如SEQ ID NO: 10-13、119、135、147、149或GGS中所闡述之任何Gly-Ser連接子。III. 醫藥組合物
本文中提供所提供多重特異性多肽構築體中之任一者之組合物。應瞭解,根據本發明之治療實體之投與將與適宜載劑、賦形劑及併入調配物中以提供改善之轉移、遞送、耐藥性及類似者之其他物劑投與。可於所有醫藥化學家已知之調配中發現大量適宜調配物:其中藉由Blaug、Seymour之Remington’s Pharmaceutical Sciences (第15版,Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)),特定言之第87章。此等調配物包括(例如)粉末、膏劑、軟膏、凝膠劑、蠟、油、脂類、含有囊泡之脂質(陽離子或陰離子) (諸如Lipofectin™)、DNA結合物、無水吸收膏劑、水包油及油包水乳液、乳液碳蠟(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠及含有碳蠟之半固體混合物。上述混合物中之任一者於根據本發明之治療及療法中可係適宜,只要調配物中之活性成分未藉由該調配物滅活且該調配物與投與途徑生理相容及耐受。亦參見Baldrick P. 「Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.」 Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000),Wang W. 「Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.」 Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000),Charman WN 「Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.」 J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000),Powell等人,「Compendium of excipients for parenteral formulations」 PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)及其中針對與醫藥化學家熟知之調配物、賦形劑及載劑有關之額外資訊之引用。
於一些實施例中,可將多重特異性多肽構築體、結合多重特異性多肽構築體及其組合(本文中統稱為治療)及其衍生物、片段、類似物及同源物併入適於投與之醫藥組合物中。涉及製備此等組合物之原則及考量,以及選擇組分之指導提供於(例如) Remington’s Pharmaceutical Sciences: The Science And Practice Of Pharmacy第19版(Alfonso R. Gennaro等人編輯) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995;Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994;及Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences,第4卷),1991, M. Dekker, New York中。
此等組合物通常包含多重特異性多肽構築體或其結合物及醫藥上可接受之載劑。在多重特異性多肽構築體包含抗體片段之情況下,可使用特異性結合至靶蛋白之抗體之最小片段。例如,基於抗體之可變區序列,可設計保留抗體結合靶蛋白序列之能力之肽分子。此等肽可化學合成及/或藉由重組DNA技術產生。(參見,例如,Marasco等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993))。
如本文中所用,術語「醫藥上可接受之載劑」意欲包括與醫藥投與相容之任何及所有溶劑、分散介質、塗層、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑及類似者。適宜載劑述於Remington’s Pharmaceutical Sciences之最近版本,該領域之標準參考文本,其以引用的方式併入本文中。此等載劑或稀釋劑之適宜實例包括(但不限於)水、鹽水、林格氏(ringer’s)溶液、右旋糖溶液及5%人類血清白蛋白。亦可使用脂質體及非水媒劑(諸如固定油)。使用此介質及物劑用於醫藥活性物質係此項技術中熟知。除了任何習知介質或物劑與活性化合物不相容之範圍外,涵蓋其於組合物中之用途。
用於活體內投與之調配物必須係無菌。此藉由通過無菌過濾膜過濾容易實現。
本發明之醫藥組合物經調配與其預期投與途徑相容。投與途徑之實例包括非經腸,例如,靜脈內、皮內、皮下、口(例如,吸入)、經皮(即,局部)、經黏膜及直腸投與。用於非經腸、皮內或皮下應用之溶液或懸浮液可包含下列組分:無菌稀釋劑,諸如,用於注射之水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑;抗細菌劑,諸如苄醇或對羥基苯甲酸甲酯;抗氧化劑,諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉;螯合劑,諸如乙二胺四乙酸(EDTA);緩衝劑,諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽,及張力調節劑,諸如氯化鈉或右旋糖。pH可利用酸或鹼(諸如鹽酸或氫氧化鈉)調整。非經腸製劑可封閉於安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑膠製成之多劑量小瓶中。
適用於可注射用途之醫藥組合物包括無菌水溶液(在可水溶之情況下)或分散液及用於即時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。針對靜脈內投與,適宜載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL™
(BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。於所有情況下,組合物必須係無菌且應係流動性至容易可注射性存在之程度。其在製造及儲存條件下必須穩定且必須保留抗微生物(諸如細菌及真菌)之污染行為。載劑可為含有以下之溶劑或分散介質:例如,水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及類似者)及其適宜混合物。適宜流動性可(例如)藉由使用塗層(諸如卵磷脂),藉由在分散之情況下維持所需粒度及藉由使用表面活性劑來維持。防止微生物作用可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如,對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、噻汞撒(thimerosal)及類似者)達成。於許多情況下,適於包含等滲劑,例如,糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨醇)、氯化鈉於組合物中。可注射組合物之延長吸收可藉由包含延遲吸收之物劑(例如,單硬脂酸鋁及明膠)於組合物中帶來。
無菌可注射溶液可藉由將所需量之活性化合物與一種以上列舉成分或以上列舉成分之組合併入適宜溶劑中,視需要,接著無菌過濾來製備。一般而言,分散液藉由將活性化合物併入無菌媒劑中來製備,該無菌媒劑含有基礎分散介質及來自以上列舉彼等之所需其他成分。於用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情況下,製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥,該冷凍乾燥產生活性成分之粉末加上來自其先前無菌過濾溶液之任何額外所需成分。在凍乾組合物之情況下,可在凍乾及再構成之前或於其之後進行使用此方法滅菌。用於非經腸投與之組合物可呈凍乾形式或呈溶液儲存。此外,一般將非經腸組合物放入具有無菌入口之容器中,例如,靜脈內溶液袋或具有藉由皮下注射針可刺穿之瓶塞之小瓶。
於一些實施例中,醫藥組合物通過任何途徑對個體投與,包括經口、透皮、藉由吸入、經靜脈內、經動脈內、經肌肉內、直接施覆於創傷位點、施覆於手術位點、經腹膜內、藉由栓劑、經皮下、經皮內、經皮、藉由噴霧、經胸膜內、經心室內、經關節內、經眼內或經脊骨內。
口服組合物一般包含惰性稀釋劑或可食用載劑。其可封閉於明膠膠囊中或壓縮成錠劑。出於口服治療投與之目的,活性化合物可與賦形劑合併及呈錠劑、口含錠或膠囊之形式使用。口服組合物亦可使用用作漱口劑之流動載劑製備,其中流動載劑中之組合物經口施覆及快速溶解並咳出或吞下。可包含醫藥上相容黏合劑及/或佐劑物質作為組合物之部分。錠劑、丸劑、膠囊、口含錠及類似者可含有下列成分中之任一者或相似性質之化合物:黏合劑,諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠;賦形劑,諸如澱粉或乳糖;崩解劑,諸如藻酸、澱粉羥基乙酸鈉(Primogel)或玉米澱粉;潤滑劑,諸如硬脂酸鎂或Sterote;助流劑,諸如膠體二氧化矽;甜味劑,諸如蔗糖或糖精;或調味劑,諸如薄荷、水楊酸甲酯或橙味。
針對藉由吸入之投與,多重特異性多肽構築體呈氣溶膠噴霧形式自壓力容器或含有適宜推進劑,例如,氣體(諸如二氧化碳)之分配器或噴霧器遞送。
全身投與亦可藉由經黏膜或經皮方法。針對經黏膜或經皮投與,調配物中使用適用於待滲透之障礙之滲透劑。此等滲透劑一般係此項技術中已知,且包括(例如)針對經黏膜投與,洗滌劑、膽汁鹽及夫西地酸(fusidic acid)衍生物。經黏膜投與可通過使用鼻噴霧或栓劑實現。針對經皮投與,將活性化合物調配成如此項技術中一般已知之軟膏、藥膏、凝膠或乳霜。
化合物亦可呈栓劑(例如,含有習知栓劑基質,諸如可哥油及其他甘油酯)或保留灌腸劑之形式製備用於直腸遞送。
於一實施例中,治療劑可利用載劑製備,該等載劑將保護化合物免於自身體快速消除,諸如持續/可控釋放調配物,包括移植物及微膠囊遞送系統。可使用可生物降解、生物相容聚合物,諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。製備此等調配物之方法將對熟習此項技術者顯而易見。
例如,治療劑可(例如)藉由凝聚技術或藉由介面聚合陷留於所製備之微膠囊(例如,各自為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(異丁酸甲酯)微膠囊)中,於膠狀藥物遞送系統(例如,脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或於粗乳液中。
於一些實施例中,醫藥組合物包含醫藥上可接受之賦形劑,例如,填料、黏合劑、塗料、防腐劑、潤滑劑、調味劑、甜味劑、著色劑、溶劑、緩衝劑、螯合劑及穩定劑。醫藥上可接受之填料之實例包括纖維素、磷酸氫鈣、碳酸鈣、微晶纖維素、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、麥芽酚、預凝膠澱粉、玉米澱粉或馬鈴薯澱粉。醫藥上可接受之黏合劑之實例包括聚乙烯吡咯啶酮、澱粉、乳糖、木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇、明膠、蔗糖、聚乙二醇、甲基纖維素或纖維素。醫藥上可接受之塗料之實例包括羥丙基甲基纖維素(HPMC)、蟲漆、玉米蛋白或明膠。醫藥上可接受之崩解劑之實例包括聚乙烯吡咯啶酮、羧甲基纖維素或澱粉乙醇酸鈉。醫藥上可接受之潤滑劑之實例包括聚乙二醇、硬脂酸鎂或硬脂酸。醫藥上可接受之防腐劑之實例包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸或山梨酸。醫藥上可接受之甜味劑之實例包括蔗糖、糖精、阿斯巴甜(aspartame)或山梨醇。醫藥上可接受之緩衝劑之實例包括碳酸鹽、檸檬酸鹽、葡萄酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽或酒石酸鹽。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適宜實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半透基質,該等基質係呈成型物品(例如,薄膜或微膠囊)之形式。於一些實施例中,醫藥組合物還包含用於產品之可控或持續釋放之物劑,諸如可注射微球、可生物侵蝕粒子、聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠或脂質體。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如,聚(2-羥乙基-異丁酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利案第3,773,919號)、L-麩胺酸與L-麩胺酸γ乙酯之共聚物、非可降解乙烯乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM
(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮脯利特(leuprolide)組成之可注射微球))及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物能歷時100天釋放分子,但是某些水凝膠釋放蛋白質持續更短時間段。
材料亦可自Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc.市面上獲得。脂質體懸浮液(包括將具有單株抗體之受感染細胞靶向病毒抗原之脂質體)亦可用作醫藥上可接受之載劑。此等可根據熟習此項技術者已知之方法(例如,如美國專利案第4,522,811號中所述)製備。
以劑量單位形式調配口服或非經腸組合物以便於劑量之投與及均勻性係特別有利。如本文中所用,劑量單位形式係指適於作為待治療之個體之單位劑量之物理離散單元;各單元含有經計算以產生所需治療效果之預定量之活性化合物與所需活性載劑聯合。本發明之劑量單位形式之規格藉由以下及直接依賴於以下指定:活性化合物之獨特特徵及待達成之特定治療效果,及複合此活性化合物用於治療個體之技術之固有限制。
進一步提供套組,該等套組包含本文中所述之醫藥組合物(或製品)。醫藥組合物可連同投與說明書包含於容器、包裝或分配器中。本文中所述套組亦可包含自商業及使用者立場所需之其他材料,包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器及具有進行本文中所述任何方法之說明之包裝插入物。
調配物亦可含有針對正在治療之特定適應症所需之一種以上多重特異性多肽構築體,例如,具有彼此無不利影響之互補活性之彼等。於一些實施例中,或此外,組合物可包含增強其功能之藥劑,諸如,例如,細胞毒性劑、細胞激素、化療劑或生長抑制劑。此等分子以對預期目的有效之量適宜存在於組合中。
於一些實施例中,醫藥組合物之劑量為單一劑量或重複劑量。於一些實施例中,每天一次、每天兩次、每天三次或每天四次或更多次對個體給予劑量。於一些實施例中,一週內給予約1或多個(諸如約2或更多個、約3或更多個、約4或更多個、約5或更多個、約6或更多個、或約7或更多個)劑量。於一些實施例中,歷時數天、數週、數月或數年之過程給予多個劑量。於一些實施例中,治療過程為約1或多個劑量(諸如約2或更多個劑量、約3或更多個劑量、約4或更多個劑量、約5或更多個劑量、約7或更多個劑量、約10或更多個劑量、約15或更多個劑量、約25或更多個劑量、約40或更多個劑量、約50或更多個劑量、或約100或更多個劑量)。
於一些實施例中,對個體投與醫藥組合物。一般而言,根據個體之大小及病狀,根據標準醫藥實踐確定醫藥組合物之投與劑量及途徑。例如,可於細胞培養分析中或於動物模型(諸如小鼠、大鼠、兔、狗、豬或猴)中初步估計治療有效劑量。亦可使用動物模型測定投與之適宜濃度範圍及途徑。然後可使用此資訊確定用於人類中投與之有用劑量及途徑。精確劑量將根據與需治療個體有關之因素確定。調整劑量及投與以提供活性化合物之充足含量或維持所需效果。可考慮之因素包括疾病狀態之嚴重度、個體之一般健康、個體之年齡、體重及性別、投與時間及頻率、藥物組合、反應靈敏性及對療法之反應。針對特定患者之最佳劑量及治療方案可藉由熟習醫藥技術者藉由監測患者疾病徵兆及調整相應治療容易確定。IV. 使用方法及治療投與
亦提供使用方法及多重特異性多肽構築體之用途。此等方法及用途包括治療方法及用途,例如,涉及對患有疾病、病狀或病症(諸如腫瘤或癌症)之個體投與分子或含其之組合物。於一些實施例中,以有效治療疾病或病症之有效量投與分子及/或組合物。用途包括於此等方法及治療中及於製備藥劑中使用多重特異性多肽構築體以進行此等治療方法。於一些實施例中,該等方法藉由對患有或懷疑患有疾病或病狀之個體投與多重特異性多肽構築體或包含其之組合物來進行。於一些實施例中,該等方法從而治療個體之疾病或病狀或病症。
於一實施例中,本發明之多重特異性多肽構築體可用作治療劑。一般將採用此等藥劑診斷、預測、監測、治療、減輕及/或預防個體之疾病或病理。治療方案藉由使用標準方法識別患有(或有發展風險)病症之個體(例如,人類患者或其他哺乳動物)來進行。對個體投與多重特異性多肽構築體。多重特異性多肽構築體對個體投與及一般將具有效果,因為其與靶結合。
於一些實施例中,本文中提供一種藉由投與治療上有效量之所提供多重特異性結合物或醫藥組合物中之任一者來調節個體之免疫反應之方法。於一些實施例中,調節免疫反應之方法增加或增強個體之免疫反應。例如,增加或增強反應可為細胞介導之免疫之增加。於一些實例中,該方法增加T-細胞活性,諸如溶細胞T-細胞(CTL)活性。於一些實施例中,經調節之(例如,增加之)免疫反應係針對腫瘤或癌症。
多重特異性多肽構築體之投與可經由通過多重特異性多肽構築體之Fc區接合FcγR活化先天免疫細胞。多重特異性多肽構築體之投與可促效、刺激、活化及/或增強先天免疫細胞效應功能,包括ADCC、細胞激素釋放、脫粒及/或ADCP。於多重特異性多肽構築體含有可裂解連接子之實例中,一旦連接第一組分及第二組分之連接子藉由蛋白酶裂解,多重特異性多肽構築體之投與可活化T細胞,從而允許抗CD3結合部分結合T細胞上之CD3ε。多重特異性多肽構築體之投與可促效、刺激、活化及/或增強CD3介導之T細胞活性、細胞毒性、細胞激素釋放及/或增殖。
於一些實施例中,所提供方法為藉由投與治療上有效量之所提供多重特異性結合物或醫藥組合物中之任一者來治療個體之疾病或病狀。於一些實施例中,該疾病或病狀為腫瘤或癌症。一般而言,疾病或病症之減輕或治療涉及減輕一或多種症狀或與該疾病或病症相關之醫療問題。例如,於癌症之情況下,藥物之治療上有效量可實現下列中之一者或組合:減少癌細胞之數目;減少腫瘤大小;抑制(即,減少至某種程度及/或停止)癌細胞浸潤至外周器官;抑制腫瘤轉移;抑制腫瘤生長至某種程度;及/或緩解與癌症相關之症狀中之一或多者至某種程度。於一些實施例中,可使用本發明之組合物預防個體(例如,人類或其他哺乳動物,諸如非人類靈長類動物、伴生動物(例如,貓、狗、馬)、農場動物、工作動物或動物園動物)之疾病或病症之發作或復發。本文中可交換使用術語個體及患者。
於一些實施例中,可使用醫藥組合物抑制哺乳動物癌細胞(諸如人類癌細胞)之生長。治療癌症之方法可包括對患有癌症之個體投與有效量之本文中所述醫藥組合物中之任一者。可投與有效量之醫藥組合物以抑制、停止或逆轉癌症之進展。可活體內或離體治療人類癌細胞。於人類患者之離體治療中,在體外處理含有癌細胞之組織或流體及然後將該等組織或流體再引入回該患者中。於一些實施例中,於人類患者中於活體內藉由投與治療組合物至患者中來治療癌症。
疾病之非限制性實例包括:所有類型之癌症(乳癌、肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、頭頸癌、胰癌等)、類風濕性關節炎、克羅恩氏病、SLE、心血管損傷、缺血等。例如,適應症將包括白血病(包括T-細胞急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL))、淋巴母細胞性疾病(包括多發性骨髓瘤)、及實體腫瘤(包括肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、胰癌及乳癌(包括三陰性乳癌))。例如,適應症包括骨病或癌症之轉移,不管原發性腫瘤來源;乳癌,舉非限制性實例而言包括ER/PR+乳癌、Her2+乳癌、三陰性乳癌;結腸直腸癌;子宮內膜癌;胃癌;膠質母細胞瘤;頭頸癌,諸如食道癌;肺癌,經由非限制實例諸如非小細胞肺癌;多發性骨髓瘤卵巢癌;胰癌;前列腺癌;肉瘤,諸如骨肉瘤;腎癌,舉非限制性實例而言諸如腎細胞癌;及/或皮膚癌,經由非限制實例諸如鱗狀細胞癌、基底細胞癌或黑色素瘤。於一些實施例中,該癌症為鱗狀細胞癌。於一些實施例中,該癌症為皮膚鱗狀細胞癌。於一些實施例中,該癌症為食道鱗狀細胞癌。於一些實施例中,該癌症為頭頸鱗狀細胞癌。於一些實施例中,該癌症為肺鱗狀細胞癌。
本發明之多重特異性多肽構築體之治療上有效量一般係指達成治療目標所需之量。如上所指出,此可為多重特異性多肽構築體與其靶抗原之間之結合相互作用,於某些情況下,該結合相互作用促效、刺激、活化及/或增強FcγR介導之先天免疫細胞活化或CD3介導之T細胞活化。此外,投與所需之量將依賴於多重特異性多肽構築體對其特異性抗原之結合親和力,及亦將依賴於所投與多重特異性多肽構築體自游離體積其他個體耗盡之速率,對該個體投與該多重特異性多肽構築體。舉非限制性實例而言,多重特異性多肽構築體之治療上有效劑量之常見範圍可為約0.01 µg/kg體重至約10 mg/kg體重。於一些實施例中,舉非限制性實例而言,本發明之多重特異性多肽構築體之治療上有效劑量可為約0.01 mg/kg體重至約5至10 mg/kg體重。常見給藥頻率可為(例如)每日兩次至一週一次之範圍。
結合用於診斷或治療特定病症之任何已知方法測定治療有效性。篩選具有所需特異性之多重特異性多肽構築體之方法包括(但不限於)酶聯免疫吸附分析(ELISA)及此項技術中已知之其他免疫介導之技術。已知各種方法用於測定所提供多重特異性多肽構築體之投與是否藉由以下充分調節免疫活性:消除、隔離或滅活介導或能介導非所需免疫反應之免疫細胞;誘導、產生或開啟介導或能介導保護性免疫反應之免疫細胞;改變免疫細胞之物理或功能性質;或此等作用之組合。量測免疫活性之調節之實例包括(但不限於)檢查免疫細胞群體之存在或不存在(使用流動式細胞測量術、免疫組織化學、組織學、電子顯微鏡、結合酶鏈反應(PCR));量測免疫細胞之功能容量,包括對信號反應之能力或抗增殖或分裂(諸如使用T-細胞增殖分析及於利用抗CD3抗體、抗T-細胞受體抗體、抗CD28抗體、鈣離子載體、用肽負載之PMA (12-豆蔻酸佛波酯13-乙酸佛波酯)抗原呈遞細胞刺激後,基於3H-胸苷併入之肽掃描分析;B細胞增殖分析);量測殺死或裂解其他細胞之能力(諸如細胞毒性T細胞分析);量測細胞之細胞激素、趨化因子、細胞表面分子、抗體及其他產物(例如,藉由流動式細胞測量術、酶聯免疫吸附分析、西方墨點法(Western blot)分析、蛋白質微陣列分析、免疫沉澱分析);量測活化免疫細胞之生化標誌物或免疫細胞內之信號傳導路徑(例如,酪胺酸、絲胺酸或蘇胺酸磷酸化之西方墨點法及免疫沉澱分析、多肽裂解及蛋白質複合體之形成或解離;蛋白質陣列分析;使用DNA陣列或消減雜交之DNA轉錄、增殖);量測藉由細胞凋亡、壞疽或其他機制之細胞死亡(例如,膜聯蛋白(annexin) V染色、TUNEL分析、量測DNA梯級之凝膠電泳、組織學;螢光半胱天冬酶分析、半胱天冬酶受質之西方墨點法分析);量測藉由免疫細胞產生之基因、蛋白質及其他分子(例如,北方墨點法(Northern blot)分析、聚合酶鏈反應、DNA微陣列、蛋白質微陣列、2-尺寸凝膠電泳、西方墨點法分析、酶聯免疫吸附分析、流動式細胞測量術);及(例如)藉由量測復發率或疾病嚴重度來量測臨床症狀或結果,諸如自身免疫、神經組織退化及涉及自體蛋白或自體多肽之其他疾病之改善(臨床分數、使用額外療法之要求、功能狀態、成像研究)。
多重特異性多肽構築體亦可用於各種診斷性及預防性調配物中。於一實施例中,對有發展上述病症中之一或多者之風險之患者投與多重特異性多肽構築體。可使用遺傳型、血清學或生化標誌物測定患者或器官對病症中之一或多者之預先傾向性。
於本發明之另一實施例中,對診斷患有與上述病症中之一或多者相關之臨床適應症之人類個體投與多重特異性多肽構築體。在診斷後,投與多重特異性多肽構築體以減輕或逆轉臨床適應症之影響。組合療法
於一些實施例中,多重特異性多肽構築體、結合之多重特異性多肽構築體及其組合(本文中統稱為治療劑)聯合一或多種額外藥劑或額外藥劑之組合進行投與。適宜額外藥劑包括用於預期應用之目前醫藥及/或手術療法。例如,該(等)治療劑可聯合額外化療劑或抗腫瘤劑使用。例如,將該(等)治療劑及額外藥劑調配成單治療組合物,及同時該(等)治療劑及額外藥劑。於一些實施例中,該(等)治療劑及額外藥劑彼此分離,例如,將各者調配成分開治療組合物,及同時投與該(等)治療劑及額外藥劑,或在治療方案期間之不同時間投與該(等)治療劑及額外藥劑。例如,在投與額外藥劑之前投與該(等)治療劑,在投與額外藥劑後投與該(等)治療劑,或以交替方式投與該(等)治療劑及額外藥劑。如本文中所述,以單一劑量或以多個劑量投與該(等)治療劑及額外藥劑。於一些實施例中,將額外藥劑偶合或以其他方式連接至該(等)治療劑。根據預期應用之目的(即,殺死、防止細胞增殖、激素療法或基因療法)選擇適宜額外藥劑。此等藥劑可包括(但不限於)例如,醫藥劑、毒素、毒素片段、烷基化劑、酵素、抗生素、抗代謝物、抗增殖劑、激素、神經遞體、DNA、RNA、siRNA、寡核苷酸、反義RNA、適體、診斷劑、不透射線染料、放射性同位素、螢光化合物、磁性標籤、奈米粒子、標記化合物、凝集素、改變細胞膜滲透性之化合物、光化學化合物、小分子、脂質體、膠束、基因療法載體、病毒載體及類似者。最後,可使用藥劑之組合或不同類別藥劑之組合。
於一實施例中,於組合療法中,即,與其他藥劑(例如,可用於治療病理病狀或病症(諸如自體免疫病症及發炎疾病)之治療劑)組合投與多重特異性多肽構築體。於此上下文中,術語「組合(in combination)」意指實質上同時,同時或依序給予藥劑。若依序給予,則在投與第二種化合物發生時,兩種化合物中之第一種在治療部位處在有效濃度下仍可檢測。
例如,組合療法可包括本發明之一或多種多重特異性多肽構築體與如下更詳細描述之一或多種額外治療劑(例如,一或多種細胞激素及生長因子抑制劑、免疫抑制劑、抗發炎劑、代謝抑制劑、酵素抑制劑及/或細胞毒性或細胞抑制劑)共同調配及/或共同投與。此外,本文中所述之一或多種多重特異性多肽構築體可與本文中所述治療劑中之兩者或更多者組合使用。此等組合療法可有利地利用所投與治療劑之更低劑量,從而避免與各種單藥療法相關之可能毒性或併發症。
於其他實施例中,本發明之一或多種多重特異性多肽構築體可與一或多種抗發炎藥物、免疫抑制劑或代謝抑制劑或酵素抑制劑共同調配及/或共同投與。可與本文中所述抗體組合使用之藥物或抑制劑之非限制性實例包括(但不限於)下列中之一或多者:非類固醇抗發炎藥物(NSAID),例如,布洛芬(ibuprofen)、替尼達帕(tenidap)、萘普生(naproxen)、美洛昔康(meloxicam)、吡羅昔康(piroxicam)、雙氯芬酸(diclofenac)及吲哚美辛(indomethacin);柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine);皮質類固醇,諸如潑尼松龍(prednisolone);細胞激素抑制抗發炎藥物(CSAID);核苷酸生物合成抑制劑,例如,嘌呤生物合成抑制劑、葉酸拮抗劑(例如,胺甲喋呤(methotrexate) (N-[4-[[(2,4-二胺基-6-喋啶基)甲基]甲基胺基]苯甲醯基]-L-麩胺酸);及嘧啶生物合成抑制劑,例如,雙氫乳清酸脫氫酶(DHODH)抑制劑。用於與本發明抗體組合使用之適宜治療劑包括NSAID、CSAID、(DHODH)抑制劑(例如,來氟米特(leflunomide))及葉酸拮抗劑(例如,胺甲喋呤)。
額外抑制劑之實例包括下列中之一或多者:皮質類固醇(口服、吸入及局部注射);免疫抑制劑,例如,環孢黴素(cyclosporin)、他克莫司(tacrolimus) (FK-506);及mTOR抑制劑,例如,西羅莫司(sirolimus) (雷帕黴素(rapamycin) - RAPAMUNETM
或雷帕黴素衍生物,例如,可溶性雷帕黴素衍生物(例如,雷帕黴素酯衍生物,例如,CCI-779));干預藉由促發炎細胞激素(諸如TNFα或IL-1)信號傳導之藥劑(例如,IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑);COX2抑制劑,例如,塞來考昔(celecoxib)、羅非考昔(rofecoxib)及其變異體;磷酸二酯酶抑制劑,例如,R973401 (磷酸二酯酶IV型抑制劑);磷脂酶抑制劑,例如,細胞溶質磷脂酶2 (cPLA2)之抑制劑(例如,三氟甲基酮類似物);血管內皮細胞生長因子或生長因子受體之抑制劑,例如,VEGF抑制劑及/或VEGF-R抑制劑;及血管生成抑制劑。用於與本發明抗體組合使用之適宜治療劑為免疫抑制劑,例如,環孢黴素、他克莫司(FK-506);mTOR抑制劑,例如,西羅莫司(雷帕黴素)或雷帕黴素衍生物,例如,可溶性雷帕黴素衍生物(例如,雷帕黴素酯衍生物,例如,CCI-779);COX2抑制劑,例如,塞來考昔及其變異體;及磷脂酶抑制劑,例如,細胞溶質磷脂酶2 (cPLA2)之抑制劑(例如,三氟甲基酮類似物)。可與多重特異性多肽構築體組合之治療劑之額外實例包括下列中之一或多者:6-巰基嘌呤(6-MP)、硫唑嘌呤(azathioprine sulphasalazine)、美沙拉嗪(mesalazine)、奧沙拉嗪(olsalazine)、氯喹(chloroquine)/羥化氯喹(PLAQUENIL®
)、青黴胺(pencillamine)、硫代蘋果酸金(aurothiornalate) (肌肉內及口服)、咪唑硫嘌呤(azathioprine)、秋水仙鹼(coichicine)、β-2腎上腺素受體促效劑(沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline)、沙美特羅(salmeteral))、黃嘌呤(xanthine) (茶鹼(theophylline)、阿尼茶鹼(arninophylline))、色甘酸酯(cromoglycate)、奈多羅米(nedocromil)、酮替芬(ketotifen)、異丙托銨(ipratropium)及氧托溴銨(oxitropium)、麥考酚酸嗎乙酯(mycophenolate mofetil)、腺苷促效劑、抗血栓劑、補體抑制劑及腎上腺素劑。V. 示例性實施例
所提供實施例為:
1.一種多重特異性多肽構築體,該多重特異性多肽構築體包含包含免疫球蛋白Fc區之第一組分及包含CD3結合區之第二組分,其中:
該第一組分及該第二組分藉由非可裂解連接子偶合,其中該Fc區經定位至該CD3結合區之N端;及
該第一組分及該第二組分中之一者或二者包含結合腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域。
2.如實施例1之多重特異性多肽構築體,其中該CD3結合區結合CD3 (CD3ε)。
3.如實施例1或實施例2之多重特異性構築體,其中該抗原結合域相對於該Fc區胺基端定位及/或相對於該多重特異性多肽構築體之CD3結合區羧基端定位。
4.如實施例1至3中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該第一組分包含第一抗原結合域及該第二組分包含第二抗原結合域,其中該等抗原結合域各者結合腫瘤相關抗原(TAA)。
5.如實施例4之多重特異性多肽構築體,其中該第一抗原結合域相對於該多重特異性構築體之Fc區胺基端定位及該第二抗原結合域相對於該多重特異性構築體之CD3結合區羧基端定位。
6.一種多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性構築體以自N端至C端之順序包含:
結合至腫瘤相關抗原(TAA)之第一抗原結合域;
免疫球蛋白Fc區;
非可裂解連接子;
結合CD3 (CD3ε)之CD3結合區;及
結合腫瘤相關抗原(TAA)之第二抗原結合域。
7.一種多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性構築體以自N端至C端之順序包含:
免疫球蛋白Fc區;
非可裂解連接子;
結合CD3 (CD3ε)之CD3結合區;及
結合腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域。
8.一種多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性構築體以自N端至C端之順序包含:
結合至腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域;
免疫球蛋白Fc區;
非可裂解連接子;及
結合CD3 (CD3ε)之CD3結合區。
9.如實施例1至8中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該Fc區為異二聚體Fc區。
10.如實施例1至9中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該Fc區為人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4之Fc區,或為其免疫活性片段。
11.如實施例1至10中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該Fc區包含多肽,該多肽包含SEQ ID NO: 1中所述之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 1至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性之胺基酸序列。
12.如實施例1至10中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該Fc區包含多肽,該多肽包含SEQ ID NO: 2中所述之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 2至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性之胺基酸序列。
該Fc區包含多肽,該多肽包含SEQ ID NO: 4中所述之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性之胺基酸序列;或
該Fc區包含多肽,該多肽包含SEQ ID NO: 5中所述之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 5至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性之胺基酸序列。
13.如實施例1至6、9及12中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該Fc區為異二聚體Fc區。
14.如實施例13之多重特異性多肽構築體,其中該異二聚體Fc區之一種或兩種Fc多肽相較於異二聚體Fc區之多肽,視情況相較於SEQ ID NO: 1中所述之Fc多肽或其免疫活性片段包含至少一個修飾以誘導異二聚化。
15.如實施例14之多重特異性多肽構築體,其中該異二聚體Fc之Fc多肽各者獨立地包含至少一個胺基酸修飾。
16.如實施例15之多重特異性多肽構築體,其中該異二聚體Fc之Fc多肽各者包含杵臼修飾或包含電荷突變以增加該等多肽之靜電互補性。
17.如實施例16之多重特異性多肽構築體,其中該胺基酸修飾為杵臼修飾。
18.如實施例13至17中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該異二聚體Fc之第一Fc多肽包含選自Thr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val及其組合之修飾及該異二聚體Fc之第二Fc多肽包含修飾T366W。
19.如實施例18之多重特異性多肽構築體,其中該第一Fc多肽及第二Fc多肽還包含非半胱胺酸至半胱胺酸之修飾,其中該第一多肽之修飾係在位置Ser354及Y349中之一者處及該第二Fc多肽之修飾係在位置Ser354及Y349中之另一者處。
20.如實施例16之多重特異性多肽構築體,其中該胺基酸修飾為電荷突變以增加該等多肽之靜電互補性。
21.如實施例13至16及20中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該第一Fc多肽及/或第二Fc多肽或該第一Fc多肽及第二Fc多肽各者包含互補位置中之修飾,其中該修飾為經具有與另一多肽之互補胺基酸相反電荷之胺基酸置換。
22.如實施例14至21中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該異二聚體Fc之第一Fc多肽或第二Fc多肽中之一者還包含殘基Ile253處之修飾。
23.如實施例22之多重特異性多肽構築體,其中該修飾為Ile253Arg。
24.如實施例14至23中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該異二聚體Fc之第一Fc多肽或第二Fc多肽中之一者還包含殘基His435處之修飾。
25.如實施例24之多重特異性多肽構築體,其中該修飾為His435Arg。
26.如實施例1至25中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該Fc區包含缺少Lys447之多肽。
27.如實施例1至26中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該Fc區包含包含至少一個修飾以增強FcRn結合之多肽。
28.如實施例27之多重特異性多肽構築體,其中該修飾係在選自由Met252、Ser254、Thr256、Met428、Asn434及其組合組成之群之位置處。
29.如實施例28之多重特異性多肽構築體,其中該修飾係在選自由Met252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S及其組合組成之群之位置處。
30.如實施例28之多重特異性多肽構築體,其中該修飾係在位置Met252及在位置Met428處。
31.如實施例30之多重特異性多肽構築體,其中該修飾為Met252Y及Met428L。
32.如實施例30之多重特異性多肽構築體,其中該修飾為Met252Y及Met428V。
33.如實施例13至32中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該異二聚體Fc之第一多肽包含SEQ ID NO: 82、86、94或96中之任一者中所述之胺基酸序列,及該異二聚體Fc之第二多肽包含SEQ ID NO: 83、87、90、92、98或100中之任一者中所述之胺基酸序列。
34.如實施例1至33中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該Fc區包含包含至少一個胺基酸修飾之多肽,該修飾降低效應功能及/或降低結合至選自Fc γ受體或C1q之效應分子。
35.如實施例34之多重特異性多肽構築體,其中該一或多個胺基酸修飾為缺失Glu233、Leu234或Leu235中之一或多者。
36.如實施例13至32、34及35中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該異二聚體Fc之第一多肽包含SEQ ID NO: 84、88、95或97中之任一者中所述之胺基酸序列及該異二聚體Fc之第二多肽包含SEQ ID NO: 85、89、91、93、99或101中之任一者中所述之胺基酸序列。
37.如實施例1至32中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該Fc區包含包含至少一個修飾以增強FcγR結合之多肽。
38.如實施例37之多重特異性多肽構築體,其中該修飾為在Ser239或Ile332處之修飾。
39.如實施例1至32及37中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該Fc區之糖基化經修飾以相較於未經修飾之Fc區增強FcγR結合。
40.如實施例39之多重特異性多肽構築體,其中該Fc區缺少或具有降低之海藻糖含量。
41.如實施例1至40中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該CD3結合區為抗CD3抗體或抗原結合片段。
42.如實施例41之多重特異性多肽構築體,其中該抗CD3抗體或抗原結合片段包含可變重鏈區(VH)及可變輕鏈區(VL)。
43.如實施例1至42中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該CD3結合區係一價。
44.如實施例41至43中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗CD3抗體或其抗原結合片段非單鏈抗體,視情況非單鏈可變片段(scFv)。
45.如實施例42或實施例44之多重特異性多肽構築體,其中該Fc為異二聚體Fc及該包含抗CD3抗體或抗原結合片段之VH及VL連接至該異二聚體Fc之相反多肽。
46.如實施例1至45中任一項之多重特異性多肽構築體,其中除非該抗原結合域中之至少一者結合至其TAA,否則該CD3結合區不能或實質上不能結合或接合CD3。
47.如實施例1至46中任一項之多重特異性多肽構築體,其中除非該抗原結合域中之至少兩者結合至其TAA,否則該CD3結合區不能或實質上不能結合或接合CD3。
48.如實施例1至47中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該連接子為多肽連接子。
49.如實施例48之多重特異性多肽構築體,其中該連接子為長度至多25個胺基酸之多肽。
50.如實施例48或實施例49之多重特異性多肽構築體,其中該連接子為以下之多肽:約2至24個胺基酸、2至20個胺基酸、2至18個胺基酸、2至14個胺基酸、2至12個胺基酸、2至10個胺基酸、2至8個胺基酸、2至6個胺基酸、6至24個胺基酸、6至20個胺基酸、6至18個胺基酸、6至14個胺基酸、6至12個胺基酸、6至10個胺基酸、6至8個胺基酸、8至24個胺基酸、8至20個胺基酸、8至18個胺基酸、8至14個胺基酸、8至12個胺基酸、8至10個胺基酸、10至24個胺基酸、10至20個胺基酸、10至18個胺基酸、10至14個胺基酸、10至12個胺基酸、12至24個胺基酸、12至20個胺基酸、12至18個胺基酸、12至14個胺基酸、14至24個胺基酸、14至20個胺基酸、14至18個胺基酸、18至24個胺基酸、18至20個胺基酸或20至24個胺基酸。
51.如實施例48至50中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該連接子為長度3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸之多肽。
52.如實施例48至51中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該連接子為長度3至18個胺基酸之多肽。
53.如實施例48至51中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該連接子為長度12至18個胺基酸之多肽。
54.如實施例48至51中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該連接子為長度15至18個胺基酸之多肽。
55.一種多重特異性多肽構築體,該多重特異性多肽構築體包含包含異二聚體Fc區之第一組分及包含包含可變重鏈區(VH)及可變輕鏈區(VL)之抗CD3抗體或抗原結合片段之第二組分,其中:
包含抗CD3抗體或抗原結合片段之VH及VL連接至該異二聚體Fc之相反多肽;
該第一組分及該第二組分藉由非可裂解連接子偶合,其中該異二聚體Fc區經定位至該抗CD3抗體之N端;及
該第一組分及該第二組分中之一者或二者包含結合腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域。
56.如實施例52至55中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子不含有針對藉由蛋白酶裂解特異性識別之受質識別位點。
57.如實施例56之多重特異性多肽構築體,其中該蛋白酶藉由免疫效應細胞、藉由腫瘤或藉由存在於腫瘤微環境中之細胞產生。
58. 如實施例57之多重特異性多肽構築體,其中該蛋白酶藉由免疫效應細胞產生及該免疫效應細胞為經活化T細胞、自然殺手(NK)細胞或NK T細胞。
59.如實施例56至58中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該蛋白酶係選自蛋白裂解酶、基質金屬蛋白酶(MMP)、顆粒酶B及其組合。
60.如實施例59之多重特異性多肽構築體,其中該蛋白酶為顆粒酶B。
61.如實施例1至60中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括GS、GGS、GGGGS (SEQ ID NO: 149)、GGGGGS (SEQ ID NO: 135)及其組合。
62.如實施例1至61中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括(GGS)n,其中n為1至10。
63.如實施例1至62中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括(GGGGS)n (SEQ ID NO: 173),其中n為1至10。
64.如實施例1至62中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括(GGGGGS)n (SEQ ID NO: 172),其中n為1至4。
65.如實施例1至64中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括GGS。
66.如實施例1至64中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括GGGGS (SEQ ID NO: 149)。
67.如實施例1至64中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括GGGGGS (SEQ ID NO: 135)。
68.如實施例1至64中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括(GGS)2 (SEQ ID NO: 10)。
69.如實施例1至64中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11)。
70.如實施例1至64中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 12)。
71.如實施例1至64中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括GGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 13)。
72.如實施例1至64中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括GGGGGSGGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 119)。
73.如實施例1至64中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 147)。
74.如實施例1至64中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 170)。
75.如實施例45至74中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性多肽構築體包含至少(i)包含異二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子及抗CD3抗體或抗原結合片段之VH域之第一多肽;及(ii)包含異二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子及抗CD3抗體或抗原結合片段之VL域之第二多肽,其中該第一多肽及該第二多肽中之一者或二者包含結合至腫瘤相關抗原(TAA)之至少一個抗原結合域。
76.如實施例1至75中任一項之多重特異性多肽構築體,其中結合TAA之一或多個抗原結合域導致與該TAA之一價、二價、三價或四價結合。
77.如實施例75之多重特異性多肽構築體,其中僅該第一多肽或該第二多肽中之一者包含結合TAA之至少一個抗原結合域。
78.如實施例75或實施例77之多重特異性多肽構築體,其中該至少一個抗原結合域相對於該Fc區胺基端定位及/或相對於該多重特異性多肽構築體之第一多肽或第二多肽中之一者之C3結合區羧基端定位。
79.如實施例75或實施例77之多重特異性多肽構築體,其中該至少一個抗原結合域相對於該多重特異性構築體之Fc區胺基端定位及該第二抗原結合域相對於該多重特異性構築體之CD3結合區羧基端定位。
80.如實施例1至79中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗原結合域或該等抗原結合域各者獨立地包含TAA或展示與該TAA之結合活性之其變異體之初始同源結合搭檔的細胞外域或其結合片段。
81.如實施例1至79中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗原結合域或該等抗原結合域各者獨立地為選自由以下組成之群之抗體或其抗原結合片段:Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體及單域輕鏈抗體。
82.如實施例81之多重特異性多肽構築體,其中該抗體或其抗原結合片段為Fv、scFv、Fab、單域抗體(sdAb)、VNAR或VHH。
83.如實施例81或實施例82之多重特異性多肽構築體,其中該抗體或抗原結合片段為sdAb。
84.如實施例83之多重特異性多肽構築體,其中該sdAb為人類或人源化sdAb。
85.如實施例83或實施例84之多重特異性多肽構築體,其中該sdAb為VHH、VNAR、經工程改造之VH域或經工程改造之VK域。
86.如實施例81或實施例82之多重特異性多肽構築體,其中該抗體或其抗原結合片段為scFv。
87.如實施例81或實施例82之多重特異性多肽構築體,其中該抗體或其抗原結合片段為Fab。
88.如實施例87之多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性多肽構築體包含:
(i)包含異二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子及抗CD3抗體或抗原結合片段之VH域之第一多肽;
(ii)包含異二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子及抗CD3抗體或抗原結合片段之VL域之第二多肽,及
(iii)包含結合至腫瘤相關抗原之Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL之第三多肽,其中該第一多肽及/或第二多肽還包含Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL中之另一者。
89.如實施例88之多重特異性多肽構築體,其中僅該第一多肽或該第二多肽中之一者包含Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL中之另一者。
90.如實施例89之多重特異性多肽構築體,其中該第一多肽或該第二多肽均包含Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL中之另一者。
91.如實施例89或實施例90之多重特異性多肽構築體,其中該Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL中之另一者相對於Fc區胺基端定位及/或相對於該多重特異性多肽構築體之第一多肽或第二多肽中之一者之CD3結合區羧基端定位。
92.如實施例89至91中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL中之另一者相對於該第一多肽或該第二多肽之Fc區胺基端定位及相對於該第一多肽或該第二多肽中之另一者之CD3結合區羧基端定位。
93.如實施例1至92中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗原結合域或該等抗原結合域各者獨立地結合至選自以下之腫瘤抗原:1-92-LFA-3、5T4、α-4整聯蛋白、α-V整聯蛋白、α4β1整聯蛋白、α4β7整聯蛋白、AGR2、抗Lewis-Y、Apelin J受體、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補體、C-242、CA9、CA19-9、(Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5 (CEA)、CEACAM6 (NCA-90)、CLAUDIN-3、CLAUDIN-4、cMet、膠原蛋白、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、內皮素B受體(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV之F蛋白、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受體α (FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受體、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、透明質酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受體(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R (wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰島素受體、Jagged配位體、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、間皮素、MRP4、MUC1、黏蛋白-16 (MUC16、CA-125)、Na/K ATPase、NGF、呆蛋白、Notch受體、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂醯基-絲胺酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、1-磷酸鞘胺醇、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2及WISP-3。
94.如實施例1至93中任一項之多重特異性多肽構築體,其中多重特異性抗原結合域包含至少第一抗原結合域及第二抗原結合域,其中該第一抗原結合域及第二抗原結合域結合至相同TAA。
95.如實施例94之多重特異性多肽構築體,其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域結合相同TAA之不同抗原決定基。
96.如實施例94之多重特異性多肽構築體,其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域結合相同TAA之相同抗原決定基。
97.如實施例1至96中任一項之多重特異性多肽構築體,其中多重特異性抗原結合域包含至少第一抗原結合域及第二抗原結合域,其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域結合不同TAA。
98.如實施例5至97中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性多肽構築體包含第一抗原結合域與Fc區之間之第一連接肽(LP1)。
99.如實施例5至98中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性多肽構築體包含CD3結合區與第二抗原結合域之間之第二連接肽(LP2)。
100.如實施例5至99中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性多肽構築體包含第一抗原結合域與Fc區之間之第一連接肽(LP1)及CD3結合區與第二抗原結合域之間之第二連接肽(LP2),且其中該多重特異性多肽構築體具有如下自N端至C端之結構排列:第一抗原結合域–LP1- Fc區–非可裂解連接子–CD3結合區–LP2–第二抗原結合域。
101.如實施例100之多重特異性多肽構築體,其中該等兩個連接肽彼此相同。
102.如實施例100之多重特異性多肽構築體,其中該等兩個連接肽彼此不相同。
103.如實施例98至102中任一項之多重特異性多肽構築體,其中LP1或LP2獨立地為長度約1至20個胺基酸之肽。
104.如實施例103之多重特異性多肽,其中LP1或LP2獨立地包含肽,該肽為或包含如SEQ ID NO: 10-13、119、135、147、149或GGS中所述之任何Gly-Ser連接子。
105.如實施例41至104中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗CD3抗體或抗原結合片段為Fv抗體片段。
106.如實施例105之多重特異性多肽構築體,其中該Fv抗體片段包括經二硫鍵穩定之抗CD3結合Fv片段(dsFv)。
107.如實施例41至106中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗CD3抗體或抗原結合片段包含包含胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 16)之VH CDR1;包含胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 17)之VH CDR2;包含胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 18)之VH CDR3,包含胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 19)之VL CDR1;包含胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 20)之VL CDR2;及包含胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 21)之VL CDR3。
108.如實施例106或實施例107之多重特異性多肽構築體,其中該抗CD3 dsFv包含:
VH,其具有SEQ ID NO: 14及32-62中之任一者之胺基酸序列或展示與SEQ ID NO: 14及32-62中之任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之序列;及
VL,其具有SEQ ID NO: 15及63-81中之任一者之胺基酸序列或展示與SEQ ID NO: 14及32-62中之任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之序列。
109.如實施例106至108中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗CD3 dsFv包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列及SEQ ID NO: 15之胺基酸序列。
110.如實施例102至104中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗CD3 dsFv包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列及SEQ ID NO: 72之胺基酸序列。
111.如實施例1至109中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性多肽構築體結合至藥劑。
112.如實施例111之多重特異性多肽構築體,其中該藥劑為治療劑、抗腫瘤劑、毒素或其片段、可檢測部分或診斷劑。
113.如實施例112之多重特異性多肽構築體,其中該藥劑經由連接子結合至該多重特異性多肽構築體。
114.一種多核苷酸,其編碼如實施例1至113中任一項之多重特異性多肽構築體。
115.一種多核苷酸,其編碼如實施例1至113中任一項之多重特異性多肽構築體中之任一者之多肽鏈。
116.一種多核苷酸,其包含編碼如實施例1至115中任一項之多重特異性構築體之第一多肽之第一核酸序列及編碼該多重特異性構築體之第二多肽之第二核酸序列,其中該第一核酸序列及第二核酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或編碼自我裂解肽或造成核糖體跳躍之肽之核酸分離。
117.如實施例116之多核苷酸,其中該第一核酸序列及第二核酸序列以可操作方式連接至相同啟動子。
118.如實施例116或實施例117之多核苷酸,其中該多重特異性多肽構築體包含第三多肽鏈,且該多核苷酸還包含編碼該多重特異性構築體之第三多肽之第三核酸。
119.如實施例118之多核苷酸,其中該第三核酸藉由內部核糖體進入位點(IRES)或編碼自我裂解肽或造成核糖體跳躍之肽之核酸自該第一多肽及/或第二多肽分離及/或該第三核酸序列以可操作方式連接至與該第一核酸序列及/或第二核酸序列相同之啟動子。
120.如實施例116至119中任一項之多核苷酸,其中該編碼自我裂解肽或造成核糖體跳躍之肽之核酸係選自T2A、P2A、E2A或F2A。
121.一種載體,其包含如實施例114至120中任一項之多核苷酸。
122.如實施例121之載體,其為表現載體。
123.如實施例121或122之載體,其為病毒載體或真核載體,視情況其中該真核載體為哺乳動物載體。
124.一種細胞,其包含如實施例114至120中任一項之多核苷酸或如實施例121至123中任一項之載體。
125.如實施例124之細胞,其中該細胞經重組或單離。
126.如實施例125之細胞,其中該細胞為哺乳動物細胞。
127.如實施例126之細胞,其中該細胞為HEK293或CHO細胞。
128.一種產生多重特異性多肽構築體之方法,該方法包括將如實施例114至120中任一項之多核苷酸或如實施例121至123中任一項之載體引入細胞中並在產生該多重特異性多肽構築體之條件下培養該細胞。
129.一種產生多重特異性多肽構築體之方法,該方法包括在藉由細胞產生該多重特異性多肽之條件下培養如實施例124至127中任一項之細胞。
130.如實施例128或129之細胞,其中該細胞為哺乳動物細胞。
131.如實施例130之細胞,其中該細胞為HEK293或CHO細胞。
132.如實施例128或實施例129之方法,其還包括自細胞單離或純化該多重特異性多肽構築體。
133.如實施例128至132中任一項之方法,其中該多重特異性多肽構築體為異二聚體。
134.一種多重特異性多肽構築體,其藉由如實施例128至133中任一項之方法產生。
135.一種醫藥組合物,其包含如實施例1至113中任一項或如實施例134之多重特異性多肽構築體及醫藥上可接受之載劑。
136.如實施例135之醫藥組合物,其係無菌。
137.一種刺激或誘導免疫反應之方法,該方法包括使靶細胞及T細胞與如實施例1至113中任一項或如實施例134之多重特異性多肽構築體或如實施例109或實施例110之醫藥組合物接觸,該表現腫瘤相關抗原之靶細胞藉由該多重特異性多肽構築體識別。
138.如實施例137之方法,其中該靶細胞為表現腫瘤相關抗原(TAA)之腫瘤細胞。
139.如實施例137或實施例138之方法,其中離體或於活體外進行該接觸。
140.如實施例137至149中任一項之方法,其中於個體中於活體內進行該接觸。
141.一種刺激或誘導個體之免疫反應之方法,該方法包括對有需要之個體投與治療上有效量之如實施例1至113中任一項或如實施例134之多重特異性結合物或如實施例109或實施例110之醫藥組合物。
142.如實施例137至141中任一項之方法,其增加細胞介導之免疫。
143.如實施例137至142中任一項之方法,其增加T-細胞活性。
144.如實施例137至143中任一項之方法,其增加溶細胞T-細胞(CTL)活性。
145.如實施例137至144中任一項之方法,其中對腫瘤或癌症增加該免疫反應。
146.如實施例137至145中任一項之方法,其中該方法治療個體之疾病或病狀。
147.一種治療個體之疾病或病狀之方法,該方法包括對有需要之個體投與治療上有效量之如實施例1至113中任一項之多重特異性結合物或如實施例135或實施例136之醫藥組合物。
148.如實施例146或實施例147之方法,其中該疾病或病狀為腫瘤或癌症。
149.如實施例140至148中任一項之方法,其中該個體為人類。VI. 實例
僅出於說明性目的包含下列實例且不意欲限制本發明之範圍。實例 1. 製備具有經受限 CD3 結合的多重特異性構築體之方法
實例1描述含有CD3結合區之多重特異性多肽構築體之產生及表現,該CD3結合區展示經受限CD3結合。如圖 1 、圖 2A 至 2B 、圖 3A 至 3C 及圖 4
中所示,多重特異性構築體呈各種構型產生以含有藉由連接子(例如,非可裂解連接子)偶合至CD3結合區之免疫球蛋白之異二聚體Fc區,及結合腫瘤相關抗原(TAA)之一或多個抗原結合域,該抗原結合域相對於Fc區胺基端定位及/或相對於多重特異性多肽構築體之CD3結合區羧基端定位。A. 設計及產生構築體
將編碼異二聚多重特異性多肽構築體之至少第一多肽鏈及第二多肽鏈之多核苷酸產生及選殖至質粒中用於表現。該第一多肽鏈以自N端至C端之順序一般包含第一Fc多肽(例如,Fc穴多肽);非可裂解連接子;及抗CD3抗體之可變輕(VL)域。該第二多肽鏈以自N端至C端之順序一般包含第二Fc多肽(例如,Fc隆突多肽);與第一多肽鏈相同之非可裂解連接子;及抗CD3抗體之可變重(VH)域。抗CD3抗體包含經二硫鍵穩定(dsFv)之抗體(具有突變G44C之抗CD3 VH及具有突變G100C之VL)或含有未經二硫鍵穩定之Fv抗體,如表E1.1及 E1.2中所述。使用促進多肽鏈之異二聚化之各種示例性Fc多肽對,如表E1.1及表E1.2中所述。多肽鏈中之一者或二者以各種構型額外編碼一或多個TAA抗原結合域胺基端至Fc域及/或羧基端至CD3結合域。類似構築體可使用其他異二聚體Fc構型(包括其他杵臼構型,諸如所述任一者)產生;亦可使用其他CD3結合區(包括其他抗CD3抗體,包括dsFv或其他一價片段);或其他TAA抗原結合片段,諸如,scFv、sdAb或Fab形式。
在所產生之構築體中,非可裂解連接子包括大小3至18個胺基酸範圍之連接子。用於示例性所產生分子中之非可裂解連接子之實例為GGS (例如,含於示例性構築體cx1356中)、GGSGGS (SEQ ID NO: 10,含於示例性構築體cx1357中)、GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11,含於示例性構築體cx1358中)、GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 12,含於示例性構築體cx1359中)、GGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 13,含於示例性構築體cx1360中)及GGGGGSGGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 119,含於示例性構築體cx5823及cx5952中)或GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 147,含於示例性構築體cx681中)。
可於所提供之多重特異性多肽構築體中採用結合至TAA之任何抗原結合域。示例性所產生之蛋白質含有結合葉酸受體α (FRα)、B7H3 (CD276)或類δ3 (DLL3)之抗原結合域。該抗原結合域可包含單鏈片段(例如,sdAb或scFv)或雙鏈抗原結合片段(Fab)。當將TAA提供為單鏈片段(例如,sdAb或scFv)時,TAA抗原結合域在N端處藉由肽連接子(例如,PGGGG (SEQ ID NO: 102))連接至Fc異二聚體之一或兩個多肽鏈(例如,穴及/或隆突)及/或在C端處藉由肽連接子(例如,GGGG (SEQ ID NO: 103))連接至CD3結合區之一或兩個域(例如,VH 及/或VL)。可採用其他類似肽連接子。當將TAA提供為Fab抗原結合片段時,構築體由直接連接至一或兩個Fc多肽而無連接子之VH及CH1,以及由VL及CL組成之輕鏈組成。此等結合Fab之TAA可位於異二聚體Fc之胺基端或羧基端。
產生含有1、2、3或4個TAA抗原結合域之多重特異性多肽構築體,諸如以提供一價、二價、三價或四價結合。於一些情況下,TAA抗原結合域係相同。於一些情況下,TAA抗原結合域係不同,使得所產生之多重特異性多肽構築體展示對至少兩個不同TAA、對相同TAA之不同抗原決定基或對相同TAA之相同抗原決定基之特異性。
所產生之蛋白質為構築體,其中該TAA抗原結合域組成為單域抗體(sdAb)。產生多核苷酸以編碼含有非可裂解連接子之示例性多重特異性多肽構築體之多肽鏈。此等包括指定為以下之構築體:cx1356、cx1357、cx1358、cx1359、cx1360、及cx681,靶向FRα,如圖 2B
中所述;cx3072、cx5952、cx6079、cx6080、cx6081、cx5823、cx5873及cx5965,靶向B7H3,如圖 3A
及3B
中所述;及cx5352、cx5499、cx5800及cx5801,靶向DLL3,如圖 4
中所述。應注意,產生一些構築體,其中dsFv 抗CD3抗體及sdAb之VH域均連接至Fc異二聚體之
同側(例如,穴或隆突側) (例如,cx3072及cx5952,如圖 3A
中所示)
。構築體在無二硫鍵穩定之Fv下經工程改造或經使抗CD3抗體之VH及VL域穩定之二硫鍵工程改造。所產生之示例性構築體中之一些額外含有靶向共刺激受體之sdAb (例如,cx5823、cx5873、cx5965、cx5352、cx5801、cx5800)。下表 E1.1
中提供具有sdAb TAA域之示例性經受限CD3結合構築體之列表。表 E1.1
示例性所產生之構築體亦包括構築體,其中該TAA抗原結合域組成為Fab (稱為MAB形式)。於此實例中,使用由SEQ ID NO: 127中所述之重鏈Fd及SEQ ID NO: 128中所述之輕鏈組成之抗B7H3 Fab。產生多核苷酸以編碼含有非可裂解連接子之示例性多重特異性多肽構築體之多肽鏈。此等包括如圖 3C
中所述之cx5067、cx6083及cx6084。構築體在無二硫鍵穩定之Fv下經工程改造或經使抗CD3抗體之VH及VL域穩定之二硫鍵工程改造。下表 E1.2
中提供示例性Fab構築體之列表。 B. 所產生之構築體之表現及純化
使用聚伸乙基亞胺將編碼異二聚體經受限CD3結合蛋白之各鏈之單獨質粒以等莫耳比率短暫轉染至哺乳動物細胞(HEK293或CHO)中。於3至14天後收集分泌至上清液中之重組蛋白,及藉由蛋白A層析法,接著藉由製備型尺寸排阻層析法(SEC)或流過疏水性相互作用層析法(HIC)純化。於一些情況下,在純化期間將異二聚蛋白質濃化,由於設計至異二聚體Fc之一條鏈在位置I253R或H435R處(例如,於穴-Fc中)之突變使得其不結合蛋白A,及因此I253R或H435R之均二聚體未經純化。使用藉由SEC (利用Superdex-200樹脂之AKTA)或FT-HIC (利用丁基/苯基瓊脂糖之AKTA)之第二層析步驟以移除含有兩個異二聚體Fc之非所需交叉配對物質,該等Fc係更疏水性及兩倍於預期分子量。
該方法有利於產生異二聚多重特異性多肽構築體,其含有異二聚體Fc及抗CD3 Fv (例如,經二硫鍵穩定之抗CD3 Fv)之適當配對物質。經純化之異二聚體經受限CD3結合蛋白係穩定及在4℃下之延長培育或增加蛋白濃度下後不累積交叉配對物質。
實例2:藉由流動式細胞測量術評估經受限CD3結合構築體與癌細胞及初級T細胞之結合
此實例描述評估示例性構築體與T細胞或癌細胞之結合之研究。於單一培養物中進行此等研究,該等培養物含有彼此單離之僅T細胞或僅癌細胞。A. FR - α 結合
藉由流動式細胞測量術評估含有針對葉酸受體α (FRα)之抗原結合域之本發明示例性多重特異性多肽構築體與初級T細胞表面上之CD3或與表現FRα之細胞(Ovcar-5)之結合。所測試構築體之腫瘤抗原結合域結合葉酸受體α (FRα),該葉酸受體α不在初級T細胞上表現。所測試構築體包括cx1356及cx681,其含有cx1356中之3個胺基酸之非可裂解連接子或cx681中之18個胺基酸之非可裂解連接子(參見圖2B及表E1.1)。
針對圖5A及5B中所述之研究,使用100 nM之各構築體(cx1356或cx681)及評估與Ovcar-5細胞或初級T細胞之結合。包含抗CD3抗體作為對照。進行表現FRα之細胞(Ovcar-5;圖 5C
)或經單離之初級T細胞(FRα陰性;圖 5D
)上之經受限CD3接合構築體之滴定以評估結合。使用螢光團結合之抗人類IgG Fc二級抗體檢測結合之構築體。
發現具有Fc與CD3結合域之組分之間之各種連接子之所測試靶向FRα之構築體會結合表現FRα之細胞(Ovcar-5) (圖 5A
及5C
),但是缺少結合T細胞之能力(圖 5B
及5D
)。此等結果與結合至單離之T細胞上之CD3於所提供形式中經受限之發現結果一致。B. B7H3 結合
評估含有針對B7H3之抗原結合域之示例性多重特異性構築體之結合,用於結合至B7H3陽性A375腫瘤細胞或初級T-細胞。產生含有抗原結合域之構築體,該(等)抗原結合域為sdAb或FAB,且定位在Fc之僅N端或Fc之N端及抗CD3結合域之C端二者(參見圖 3A
及3C
及表E1.1)。所測試構築體之各種形式中包括:sdAb-Fc-dsFV-sdAb (cx3072、cx5952)、sdAb-Fc-FV (cx6079)、sdAb-Fc-dsFV (cs6080、cx6081)、MAB-FV (cx5067)及MAB-dsFV (cx6083、cx6084),其中該FV表示由VH及VL域對組成之抗CD3結合域及「ds」表示經由經工程改造之域間二硫鍵穩定之二硫化物。
圖 6A 至 F
證明此等構築體能結合至B7H3但是不結合至單離之T-細胞。如上所述經由流動式細胞測量術使用螢光團-結合之抗人類Fc二級抗體評估結合。cx3072以高親和力結合至A375細胞(圖6A)
但是不結合至經單離之T-細胞(圖6B)
。所測試之sdAb-Fc-dsFV-sdAb (cx5952)顯示相較於含MAB-FV之FAB (cx5067)及MAB-dsFV構築體(cx6083、cx6084)更高的結合親和力(圖6C
)。含有靶向B7H3之sdAb之構築體(cx5952、cx6079、cx6080及cx6081)以類似親和力結合至B7H3陽性細胞(圖6E),其中cx5952顯示更高的最大結合。cx6079、cx6080及cx6081含有兩個相同靶向B7H3之sdAb,然而cx5952及cx3072含有兩個結合不同抗原決定基的不同的靶向B7H3之sdAb。MAB-FV (cx5067)含有兩個相同靶向B7H3之FAB域。應注意,示例性靶向B7H3之經受限CD3接合構築體中無一者結合r初級人類T-細胞,如圖 6B 、 6D 及 6F
中所述。此等結果進一步支援結合至單離之T細胞上之CD3於所提供形式中經受限。實例 3 :評估具有表現抗原之靶細胞之共培養物中之 CD3 T- 細胞活性及連接子長度對活性之影響
使用Jurkat報告基因分析,測試Fc與包含CD3結合區之組分域(VH及VL)之間之各種長度連接子對T-細胞活化能力之影響。Jurkat細胞表現NFAT驅動之綠色螢光蛋白(GFP)。CD3之促效導致NFAT信號傳導及產生綠色螢光。
將靶向抗原之經受限CD3接合構築體滴定至靶細胞及表現NFAT驅動之綠色螢光蛋白(GFP)之經工程改造之Jurkat細胞之共培養物上。於此分析中,靶細胞包括IGROV1 (FRα陽性)或NCI-460 (FRα陰性)。針對利用貼附表現抗原之靶細胞之報告基因分析,接種靶細胞,允許在室溫下靜置以均勻分佈,及在37℃下培育若干小時以允許貼附,然後添加報告基因細胞及靶向抗原之經受限CD3接合構築體。將分析板使用IncuCyte ZOOM系統連續成像及藉由量測所積分之總綠色物體測定CD3報告基因細胞活化。
如圖 7A 至 7F
中所示,如藉由螢光強度所測定之T-細胞活化活性係依賴於與表現FRα-抗原之靶細胞之共培養物。連接子長度與T-細胞活化能力正相關。顯示T-細胞活化能力與連接子長度直接相關,其指示更短連接子在更大程度上限制CD3結合(參見圖: 7A 、 7C
及7E
)。重要的是,構築體之T-細胞接合係依賴於TAA結合,因為此等構築體不證明單離(例如,當未結合至靶TAA時之溶液形式)之T-細胞結合能力,如上實例2中所示。此外,於與FRα陰性細胞之共培養物中未量測到可觀察之螢光(圖 7B 、 7D
及7E
)。共同地,此等構築體顯示受限或實質降低之與CD3之結合,尚能以靶依賴性方式活化T-細胞。
實例4:評估靶向B7H3之經受限CD3結合構築體之T細胞活化活性
於T細胞報告基因分析及T細胞細胞毒性分析中評估含有靶向B7H3之sdAb或Fab作為腫瘤相關抗原結合域之構築體的T-細胞活化活性。評估利用抗B7H3 sdAb作為抗原結合域形式化之靶向B7H3之經受限CD3接合構築體(例如,cx5823、cx6079、cx6080、cs6081、cx3072及cx5952)或利用Fab作為抗原結合域形式化之抗B7H3 MAB構築體(例如,cx5067、cx6083或cx6084)之活性(參見圖 3A 至 3C
及表E1.1)。所有測試之構築體(除了cx5067)含有經二硫鍵穩定之抗CD3 Fv (dsFv),該抗CD3 Fv含有藉由與VL G100C配對之抗CD3 VH G44C之修飾創建之鏈間二硫鍵。cx5067之抗CD3 Fv (指定為MAB-Fv)未經二硫鍵穩定。A.T 細胞報告基因活性
使用實例3中所述之NFAT-GFP CD3 Jurkat報告基因比較當在B7H3陽性細胞(A375)或天然缺少B7H3表現之非靶CCRF-CEM細胞之存在下共培養時,靶向B7H3之經受限CD3接合構築體之CD3促效性。於此分析中,將抗B7H3 sdAb構築體(cx5823、cx6079、cx6080及cx6081)或抗B7H3 Fab構築體(cx5067、cx6083及cx6084)用作靶向B7H3之域。如圖 8A
中所示,含有靶向B7H3之sdAb之構築體顯示抗原依賴性CD3活化之類似效能。如圖 8C
中所示,發現含有靶向B7H3之sdAb之示例性cx5823構築體相較於含有靶向B7H3之Fab之構築體在介導抗原依賴性CD3活化方面更優異。雖然cx5823經共刺激受體之結合域形式化,此組分不可能促進結果之差異,因為Jurkat T細胞不表現共刺激受體。無一種構築體證明針對B7H3陰性CCRF-CEM細胞之活性(圖 8B
及8D
)。B. 細胞毒性
為進一步評估分子之活性,於T-細胞介導之細胞毒性分析中測試示例性靶向B7H3之構築體cx3072及cx5952 (各者經形式化為sdAb-dsFv)、cx6083及cx6084 (MAB-dsFv)、cx5067 (MAB-Fv)、cx6079 (sdAb-Fv)及cx6080及cx6081 (sdAb-dsFv)。將靶細胞用CytoID紅進行螢光標記。靶細胞包括B7H3陽性細胞系、A375及任一種經修飾之A375細胞,其中B7H3基因藉由CRISPR擾亂,或天然缺少B7H3表現之CCRF-CEM細胞。將靶細胞以1.0 x 104
個細胞/孔接種,允許在室溫下靜置以均勻分佈,及在37℃下培育若干小時。將初級T細胞自健康人類供體leukopak單離之PBMC負濃化及以10:1 T細胞-對-靶細胞比率添加。添加綠色半胱天冬酶-3/7試劑,其螢光標記正經歷細胞凋亡之細胞之核DNA。將具有經受限CD3接合活性之多重特異性構築體滴定至共培養物上及將分析板使用IncuCyte ZOOM相同連續成像。藉由量測總紅色/綠色重疊物體面積測定靶細胞死亡。
如圖 9A
及9B
中所示,含有sdAb 靶向B7H3之抗原結合域之示例性構築體cx3072及cx5952誘導強效T-細胞介導之B7H3陽性細胞系(A375)之細胞毒性,而非B7H3陰性細胞系。
當與具有Fab 靶向B7H3之域之示例性靶向B7H3之經受限CD3接合子(cx5067、cx6083及cx6084)比較時,示例性cx5952 (sdAb 靶向B7H3之經受限CD3接合子)介導增強之靶依賴性T-細胞細胞毒性(圖 10A
)。針對所測試構築體中之任一者,未觀察到針對B7H3陰性細胞系CCRF-CEM可量測之T細胞細胞毒性,與強效誘導抗原依賴性T-細胞活化之能力一致(圖 10B
)。在所測試之構築體中,代表性MAB-dsFV構築體cx6084及cx6083含有經工程改造之二硫鍵,然而代表性MAB-FV構築體cx5067缺少此穩定修飾。應注意,cx6083與cx5067係相同,不同之處在於抗CD3 FV域內之經工程改造之二硫鍵之存在(cx6083)或不存在(cx5067) (圖 3C
中所述)。經工程改造之二硫鍵藉由修飾VH內之G44C及VL內之G100C來創建。如圖 10A
中所示,cx6083顯示於介導靶依賴性T-細胞細胞毒性中相較於cx5067更優越之效能,表明域間二硫鍵之併入可能藉由增強包含抗CD3 FV之VH及VL域之適當締合而有益於T細胞介導之細胞毒性。
當與含有sdAb 靶向B7H3之域之其他示例性靶向B7H3之經受限CD3接合子(cx6079、cx6080及cx6081)比較時,示例性cx5952 (sdAb 靶向B7H3之經受限CD3接合子)介導增強之靶依賴性T-細胞細胞毒性(圖 10C)
。針對所測試構築體中之任一者,未觀察到針對B7H3陰性細胞系CCRF-CEM可量測之T細胞細胞毒性,與強效誘導抗原依賴性T-細胞活化之能力一致(圖 10D
)。在所測試之構築體中,sdAb-dsFV構築體cx5952、cx6080及cx6081含有經工程改造之二硫鍵,然而sdAb-FV構築體cx6079缺少此穩定修飾。經工程改造之二硫鍵藉由修飾VH內之G44C及VL內之G100C來創建。應注意,cx5952經工程改造以具有兩個不同靶向B7H3之域,一個位於胺基端及一個位於羧基端。cx6079、cx6080及cx6081經工程改造以具有兩個相同靶向B7H3之域,均位於胺基端(參見圖 3A)
。如圖 10C
中所示,cx5952較其他構築體更強效,表明抗CD3結合域的靶向B7H3之sdAb C端定位或cx5952結合B7H3上之兩個不同抗原決定基之事實,然而所測試之其他構築體以二價方式結合至單一抗原決定基,促進此增強之活性。C.T 細胞調節
為進一步評估T細胞調節,藉由監測構築體調節T細胞活化標誌物之能力來評估示例性多重特異性CD3經受限結合構築體。為評估T細胞活化,收集來自以上T細胞細胞毒性分析之懸浮細胞,該等分析涉及在示例性靶向B7H3之經受限CD3接合構築體(cx5952)之存在下,培養T細胞與B7H3陽性(A375)或B7H3陰性細胞系(CCRF-CEM)。將細胞用活/死著色劑及螢光團結合之抗CD4、抗CD8、抗CD25、抗CD69及/或抗CD71抗體染色。使用SONY SA3800光譜分析儀分析細胞及藉由量測CD25、CD69或CD71之表現水平或CD25陽性、CD69陽性或CD71陽性百分比來測定CD4+或CD8+ T細胞活化。
顯示在cx5952之存在下,與B7H3陽性細胞系(A375)或B7H3陰性細胞系(CCRF-CEM)共培養後,CD4+及CD8+ T細胞上之CD25表現(圖 11A)
、CD69表現(圖 11B
)及CD71表現(圖 11C
)之結果。該等結果顯示cx5952介導劑量依賴性B7H3依賴性經由CD3結合之T-細胞活化,如由CD4+及CD8+ T細胞中之CD25、CD69及CD71之增加之表現所證明。.D. T 細胞細胞激素產生
藉由夾心ELISA分析來自T細胞細胞毒性腫瘤細胞共培養分析之上清液的IFNγ含量,該等分析涉及在cx5952、cx6083、cx6084或cx5067之存在下,共培養T細胞與B7H3陽性、A375或陰性CCRF-CEM細胞。生成標準曲線,自該曲線插入上清液樣品之細胞激素濃度值。將具有檢測下限以下之吸光度值之樣品分配等於最低標準濃度之細胞激素濃度一半之細胞激素濃度。如圖 12
中所示,代表性sdAb-Fc-dsFV-sdAb構築體(cx5952)在引起靶依賴性細胞激素自經活化T-細胞釋放方面優於所測試之含有靶向B7H3之FAB之構築體(cx6083、cx6084及cx5067)。重要的是,MAB-dsFV構築體(cx6083及cx6084)優於MAB-FV 構築體(cx5067),證明域間二硫鍵穩定修飾對增強T-細胞功能之重要性。E. 總結
此等觀察結果進一步支援本文中所提供之靶向抗原之經受限CD3形式缺少或展示降低之單離之T-細胞結合,同時維持強效B7H3依賴性T-細胞細胞毒性誘導能力。不希望受理論束縛,此等結果一起顯示利用靶向抗原之sdAb而非Fab可減少表現TAA之腫瘤細胞與表現CD3之T-細胞之間之免疫突觸距離且增強T細胞活性及細胞毒性。應注意,發現藉由修飾與VL G100C配對之抗CD3 VH G44C創建之鏈間二硫鍵之納入極大增強經受限CD3接合構築體之活性。
實例5:評估含有單個或多個抗原結合靶向域之CD3經受限多重特異性構築體
將含有一價sdAb抗原結合域(定位在N端或C端處)之構築體之活性與含有定位在N端及C端二者處之靶向抗原之sdAb之雙重結合構築體的活性進行比較。大體上如實例2中所述評估結合及大體上如實例3及4中所述於Jurkat報告基因分析及T細胞細胞毒性分析中評估T細胞活性,不同之處在於針對靶向DLL3之構築體,使用NFAT驅動之螢光素酶CD3 Jurkat報告基因細胞。A. 結合
如圖 13A
中所示,二價靶向B7H3之經受限CD3接合構築體(cx5187及cx5823)顯示相較於一價形式(cx5873及cx5965)與B7H3陽性A375細胞更高親和力結合。此等構築體中無一者顯示與B7H3陰性CCRF-CEM細胞或經單離T-細胞之任何可檢測結合(圖 13B
)。B. T 細胞報告基因活性
使用CD3-NFAT Jurkat報告基因細胞評估以一價或二價方式接合抗原之靶向抗原之經受限CD3接合構築體之B7H3抗原依賴性CD3促效能力。如圖 13C
中所示,觀察到在示例性二價靶向B7H3之構築體cx5187之存在下,相較於示例性一價構築體cs5873及cx5965之報告基因活性實質增加之螢光報告基因活性。當用與B7H3陰性CCRF靶細胞共培養之Jurkat報告基因細胞培育構築體時,未觀察到報告基因活性(圖 13D
)。
於分析中觀察到類似結果,該分析涉及在含有針對替代抗原DLL3之抗原結合域之一價及二價構築體之存在下,共培養NFAT驅動之螢光素酶CD3 Jurkat報告基因細胞與SHP-77 (DLL3陽性)靶細胞(參見圖4)。具體而言,如圖 13E
中所示,示例性二價構築體cx5352於此分析中相較於示例性一價構築體cx5800及cx5801誘導實質上更大螢光素酶活性。此等結果指示構築體之活性對特定靶抗原不具特異性。C. 細胞毒性活性
對各自用作B7H3陽性及陰性細胞系之黑色素瘤細胞系(A375)及T-細胞急性淋巴母細胞性白血病細胞系(CCRF-CEM)評估靶向B7H3之CD3經受限結合構築體之細胞毒性。如圖 14A
中所示,示例性二價靶向B7H3之經受限CD3接合構築體(cx5187)顯示相較於構築體之一價形式(cx5873及cx5965)增強之靶依賴性T-細胞介導之細胞毒性。於此等分析中,在不存在靶細胞之B7H3表現下,未觀察到細胞毒性,如圖 14B
中所示,其中將CCRF-CEM細胞用作靶細胞。D. T 細胞調節
藉由監測來自以上T細胞細胞毒性分析之懸浮細胞中之CD25表現來評估T細胞調節,該等分析涉及在cx5187、cx5873或cx5965之存在下,培養T細胞與B7H3陽性細胞系(A375)或B7H3陰性細胞系(CCRF-CEM)。如圖 15A
中所示,示例性二價靶向B7H3之經受限CD3接合構築體(cx5187)顯示相較於構築體之一價形式(cx5873及cx596)增強之靶依賴性T-細胞介導之活化,如由CD4及CD8 T-細胞上之CD25上調之增強的效能所證明。於此等分析中,在不存在靶細胞之B7H3表現下,未觀察到T-細胞活化,如圖 15B
中所示,其中將CCRF-CEM細胞用作靶細胞。此等結果證明靶向B7H3之經受限CD3接合構築體誘導CD4及CD8 T-細胞二者之強效抗原依賴性活化。E. 總結
同時,此等結果證明二價靶向抗原之經受限CD3接合構築體顯示較一價靶向抗原之經受限CD3接合構築體更優越抗原依賴性CD3結合及活性。此等結果與含有定位在N端及C端二者處之雙重抗原結合域之構築體具有較僅含有單個一價抗原結合域之一價構築體更優越結合及T細胞活性之發現結果一致。此外,不希望受理論束縛,sdAb中之一者定位至CD3結合域之C端可相較於其中sdAb經定位至僅Fc之N端之構築體形成更佳免疫突觸,因為後者可增加免疫突觸距離。
圖 1
為具有經受限CD3結合之本發明之多重特異性多肽構築體之基本組分的示意圖。該(等)抗原結合域在胺基及/或羧基端定位。Fc區(諸如異二聚體Fc區)定位至CD3結合區的N端。緊鄰CD3結合區之Fc之此定位阻礙CD3結合。
圖 2A
及B
為由兩種多肽(鏈1及鏈2)組成之各種靶向FRα之經受限CD3構築體的示意圖。鏈1含有連接至異二聚體Fc「穴」之FRα sdAb (抗原結合域),該Fc「穴」經由非可裂解連接子(範圍自cx1356中之3個胺基酸至cx681中之18個胺基酸)連接至抗CD3 VL域,該抗CD3 VL域連接至第二FRα sdAb。鏈2含有連接至互補異二聚體Fc「隆突」之FRα sdAb,該互補異二聚體Fc「隆突」經由與上相同之非可裂解連接子連接至抗CD3 VH域,該抗CD3 VH域連接至第二FRα sdAb。當共同表現時,該CD3結合域各自經由穴及隆突上之VL:VH之締合適當組裝。示例性抗CD3為經二硫鍵穩定之Fv (dsFv),其含有具有突變G100C之可變輕(VL)鏈及具有突變G44C之可變重(VH)鏈。
圖 3A
為由兩種多肽(鏈1及鏈2)組成之各種靶向B7H3之經受限CD3構築體的示意圖。鏈1含有經由非可裂解連接子連接至在G100C處修飾之抗CD3 VL域之異二聚體Fc「穴」(頂部);連接至異二聚體Fc「穴」之靶向B7H3之sdAb,該異二聚體Fc「穴」經由非可裂解連接子連接至抗CD3 VL域(中間);或連接至異二聚體Fc「穴」之靶向B7H3之sdAb,該異二聚體Fc「穴」經由非可裂解連接子連接至在G100C處修飾之抗CD3 VL域(底部)。鏈2含有連接至互補異二聚體Fc「隆突」之靶向B7H3之sdAb,該互補異二聚體Fc「隆突」經由如上連接子連接至在G44C處修飾之抗CD3 VH域,該抗CD3 VH域連接至第二B7H3 sdAb (頂部);連接至互補異二聚體Fc「隆突」之靶向B7H3之sdAb,該互補異二聚體Fc「隆突」經由如上連接子連接至抗CD3 VH域(中間);或連接至互補異二聚體Fc「隆突」之靶向B7H3之sdAb,該互補異二聚體Fc「隆突」經由如上連接子連接至藉由G44C修飾之抗CD3 VH域(底部)。當共同表現時,該CD3結合域各自經由穴及隆突上之VL:VH之締合適當組裝。在表示VH:VL相互作用之情況下,其藉由VH域中之經修飾之殘基G44C與VL域中之G100C之間之經工程改造之二硫鍵穩定。
圖 3B
為由兩種多肽(鏈1及鏈2)組成之各種靶向B7H3之經受限CD3構築體的示意圖。鏈1含有經由非可裂解連接子連接至在G100C處修飾之抗CD3 VL域之異二聚體Fc「穴」,該抗CD3 VL域連接至靶向共刺激受體之sdAb。鏈2含有連接至互補異二聚體Fc「隆突」之靶向B7H3之sdAb,該互補異二聚體Fc「隆突」經由如上連接子連接至在G44C處修飾之抗CD3 VH域,該抗CD3 VH域連接至第二靶向B7H3之sdAb (頂部);經由如上連接子連接至在G44C處修飾之抗CD3 VH域之異二聚體Fc「隆突」,該抗CD3 VH域連接至靶向B7H3之sdAb (中間);或連接至互補異二聚體Fc「隆突」之靶向B7H3之sdAb,該互補異二聚體Fc「隆突」經由如上連接子連接至藉由G44C修飾之抗CD3 VH域(底部)。當共同表現時,該CD3結合域各自經由穴及隆突上之VL:VH之締合適當組裝。VH:VL相互作用藉由VH域中之經修飾之殘基G44C與VL域中之G100C之間之經工程改造之二硫鍵穩定。所得構築體為呈二價(頂部)或一價(中間及底部)方式之接合B7H3。本文中表現之所有構築體含有靶向共刺激受體之sdAb。
圖 3C
為由三種多肽(鏈1、鏈2及鏈3)組成之各種靶向B7H3之經受限CD3構築體的示意圖,其中該靶向B7H3之域為FAB。鏈1含有靶向BH73之VH、經由鉸鏈連接至異二聚體Fc之第一成員(Fc-Het-1)之IgG恆定重1 (CH1),該異二聚體Fc之第一成員經由如上連接子連接至抗CD3 VL域,該抗CD3 VL域缺少(頂部)或含有G100C之修飾(底部)。鏈2含有靶向BH73之VH、經由鉸鏈連接至異二聚體Fc之第二成員(Fc-Het-2)之IgG恆定重1 (CH1),該異二聚體Fc之第二成員經由如上連接子連接至抗CD3 VH域,該抗CD3 VH域缺少(頂部)或含有G44C之修飾(底部)。鏈3含有連接至人類Ig恆定輕(CL)區之互補靶向B7H3之VL域。當共同表現時,該CD3結合域經由互補異二聚體Fc區上之VL:VH之締合適當組裝。在表示VH:VL相互作用之情況下,其藉由VH域中之經修飾之殘基G44C與VL域中之G100C之間之經工程改造之二硫鍵穩定
圖 4
為由兩種多肽(鏈1及鏈2)組成之各種靶向DLL3之經受限CD3構築體的示意圖。鏈1含有經由非可裂解連接子連接至在G100C處修飾之抗CD3 VL域之異二聚體Fc「穴」,該抗CD3 VL域連接至靶向共刺激受體之sdAb。鏈2含有連接至互補異二聚體Fc「隆突」之靶向DLL3之sdAb,該互補異二聚體Fc「隆突」經由如上連接子連接至在G44C處修飾之抗CD3 VH域,該抗CD3 VH域連接至第二靶向DLL3之sdAb (頂部);經由如上連接子連接至在G44C處修飾之抗CD3 VH域之異二聚體Fc「隆突」,該抗CD3 VH域連接至靶向DLL3之sdAb (中間);或連接至互補異二聚體Fc「隆突」之靶向DLL3之sdAb,該互補異二聚體Fc「隆突」經由如上連接子連接至藉由G44C修飾之抗CD3 VH域(底部)。當共同表現時,該CD3結合域各自經由穴及隆突上之VL:VH之締合適當組裝。VH:VL相互作用藉由VH域中之經修飾之殘基G44C與VL域中之G100C之間之經工程改造之二硫鍵穩定。所得構築體為呈二價(頂部)或一價(中間及底部)方式之接合DLL3。本文中表現之所有構築體含有靶向共刺激受體之sdAb。
圖 5A 至 D
描述藉由代表性靶向FRα之經受限CD3接合構築體(cx1356及cx681)之細胞結合。圖 5A
及圖 5C
顯示結合至Ovcar5細胞(FRα陽性卵巢癌細胞系)。圖 5B
及圖 5D
描述缺少結合至T-細胞。圖 5A
及圖 5B
顯示在100 nM之各構築體下,正規化細胞計數相對於螢光之柱狀圖。於圖 5A
及圖 5B
中,僅二級抗人類APC抗體對照以填充黑色跡線顯示,而陽性對照抗CD3結合以開口跡線顯示,及cx1356及cx681以灰色陰影跡線顯示。各構築體對各種細胞類型之全效價示於圖 5C
及圖 5D
中。
圖 6A 至 F
描述藉由代表性靶向B7H3之經受限CD3接合構築體之細胞結合。圖 6A 、 C
及E
顯示結合至A375細胞(B7H3陽性人類黑色素瘤細胞系)。圖 6B 、 D
及F
顯示缺少結合至經單離之T細胞。
圖 7A 至 F
描述在FRα陽性IGROV1細胞(圖 7A 、 7C 、 7E
),或FRα陰性NCI-H460細胞(圖 7B 、 7D 、 7F
)之存在下,連接子長度對刺激CD3之能力之影響。圖 7A 至 B
顯示2 nM之各種構築體各自對抗原陽性及陰性細胞之CD3信號傳導之動力學。圖 7C 至 D
顯示2 nM之各種構築體各自對抗原陽性及陰性細胞之CD3刺激能力之量級。圖 7E 至 F
顯示具有不同連接子長度之各種構築體各自對抗原陽性及陰性細胞之CD3刺激能力之效能。使用Jurkat CD3 NFAT-GFP報告基因細胞系評估CD3信號傳導。當結合至靶細胞上之第二抗原時,經受限CD3結合蛋白僅有效接合並叢集T細胞上之CD3。
圖 8A 至 D
描述代表性靶向B7H3之經受限CD3接合構築體以靶依賴性方式刺激CD3的能力。圖 8A
及圖 8C
描述在B7H3陽性A375細胞之存在下介導CD3信號傳導之能力,而圖 8B
及圖 8D
顯示在B7H3陰性CCRF-CEM細胞之存在下,不能介導CD3信號傳導。使用Jurkat CD3 NFAT-GFP報告基因細胞系評估CD3促效。
圖 9A
描述代表性靶向B7H3之經受限CD3接合構築體(cx3072)以靶依賴性方式誘導T-細胞介導之細胞毒性之能力。將靶細胞用cytoID紅色標籤標記及藉由添加半胱天冬酶3/7綠色試劑使死亡細胞可見。細胞毒性藉由測定紅色靶細胞與綠色死亡細胞之重疊面積來評估。使用藉由CRISPR技術產生之B7H3陰性A375細胞系測試抗原特異性T-細胞介導之細胞毒性。cx3072不能引起此等B7H3缺乏細胞之T-細胞介導之細胞毒性。圖 9B
顯示cx5952在B7H3陽性A375細胞之存在下誘導T-細胞介導之細胞毒性之能力,但是在B7H3陰性CCRF-CEM細胞之存在下,不誘導。
圖 10A
及10B
描述代表性靶向B7H3之經受限CD3接合構築體以靶依賴性方式誘導T-細胞介導之細胞毒性之能力。圖 10A
描述此等構築體在B7H3陽性A375細胞之存在下誘導T-細胞介導之細胞毒性之能力,而圖 10B
描述此等構築體在B7H3陰性CCRF-CEM細胞之存在下誘導T-細胞介導之細胞毒性之能力。細胞毒性藉由測定紅色靶細胞與綠色死亡細胞之重疊面積來評估。
圖 10C
及10D
描述代表性靶向B7H3之經受限CD3接合構築體以靶依賴性方式誘導T-細胞介導之細胞毒性之能力。圖 10C
描述此等構築體在B7H3陽性A375細胞之存在下誘導T-細胞介導之細胞毒性之能力,而圖 10D
描述此等構築體在B7H3陰性CCRF-CEM細胞之存在下誘導T-細胞介導之細胞毒性之能力。細胞毒性藉由測定紅色靶細胞與綠色死亡細胞之重疊面積來評估。
圖 11A 至 C
描述代表性靶向B7H3之經受限CD3接合構築體(cx5952)以靶依賴性方式誘導T-細胞介導之細胞毒性及T-細胞活化之能力。細胞毒性藉由測定紅色靶細胞及綠色死亡細胞之重疊面積來評估。圖 11A 至 C
顯示cx5952以靶依賴性方式活化CD4及CD8 T-細胞之能力。T-細胞活化藉由T細胞活化標誌物CD25 (圖 11A
)、CD69 (圖 11B
)及CD71 (圖 11C
)之表現來評估。
圖 12
描述代表性靶向B7H3之經受限CD3接合構築體以靶依賴性方式誘導IFNγ產生之能力。圖 12
顯示在B7H3陽性A375細胞之存在下及在B7H3陰性CCRF-CEM細胞之存在下,自T-細胞產生IFNγ。
圖 13A
及13B
描述代表性靶向B7H3之經受限CD3接合構築體之細胞結合。cx5187及cx5823各者含有兩個B7H3結合域,而複合體cx5873及cx5965各者含有一個B7H3結合域。圖 13A
顯示結合至B7H3陽性A375細胞。圖 13B
顯示缺少結合至B7H3陰性CCRF-CEM細胞及經單離T-細胞。
圖 13C
及圖 13D
描述代表性靶向B7H3之經受限CD3接合構築體以靶依賴性方式刺激CD3之能力。圖 13C
顯示利用二價及B7H3雙抗原決定基分子(cx5187)接合B7H3陽性A375細胞較一價B7H3構築體(cx5873及cx5965)誘導更強效CD3信號傳導。圖 13D
顯示在B7H3陰性CCRF-CEM細胞之存在下,缺少T-細胞之活化。使用Jurkat CD3 NFAT-GFP報告基因細胞系評估CD3促效。
圖 13E
描述代表性靶向DLL3之經受限CD3接合構築體在DLL3陽性細胞SHP-77之存在下刺激CD3信號傳導之能力。利用二價及DLL3雙抗原決定基構築體(cx5352)接合DLL3陽性細胞較一價DLL3構築體(cx5800及cx5801)誘導更強效T-細胞活化。使用Jurkat CD3 NFAT-螢光素酶報告基因細胞系來評估CD3信號傳導。
圖 14A
及圖 14B
描述代表性靶向B7H3之經受限CD3接合構築體以靶依賴性方式誘導T-細胞介導之細胞毒性之能力。圖 14A
顯示利用二價及B7H3雙抗原決定基之構築體(cx5187)靶向B7H3陽性A375細胞較一價B7H3構築體(cx5873及cx5965)誘導更強效T-細胞介導之細胞毒性。圖 14B
描述對B7H3陰性CCRF-CEM細胞缺少T-細胞介導之細胞毒性。
圖 15A 至 B
描述在B7H3陽性A375細胞之存在下,代表性靶向B7H3之經受限CD3接合分子活化T-細胞之能力,但是在B7H3陰性CCRF-CEM細胞之存在下不活化T-細胞。圖 15A
顯示利用二價及B7H3雙抗原決定基之構築體(cx5187)靶向B7H3陽性A375細胞較一價B7H3之構築體(cx5873及cx5965)誘導CD4及CD8 T-細胞之更強效CD25表現。圖 15B
顯示在B7H3陰性CCRF-CEM細胞之存在下缺少CD4及CD8 T-細胞之CD25表現。
Claims (128)
- 一種多重特異性多肽構築體,該多重特異性多肽構築體包含包含免疫球蛋白Fc區之第一組分及包含CD3結合區之第二組分,其中: 該CD3結合區為包含可變重鏈區(VH)及可變輕鏈區(VL)之抗CD3抗體或抗原結合片段,該抗原結合片段為Fv抗體片段; 該Fc為包含第一Fc多肽及第二Fc多肽之異二聚體Fc且該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH及VL連接至該異二聚體Fc之相反多肽; 該第一組分及該第二組分藉由非可裂解連接子偶合,其中該Fc區經定位至該CD3結合區之N端;及 該第一組分包含第一抗原結合域及該第二組分包含第二抗原結合域,其中該等抗原結合域各者結合至腫瘤相關抗原(TAA)。
- 如請求項1之多重特異性多肽構築體,其中該CD3結合區結合CD3 (CD3ε)。
- 如請求項1或請求項2之多重特異性多肽構築體,其中該第一抗原結合域相對於該多重特異性構築體之該Fc區胺基端定位及該第二抗原結合域相對於該多重特異性構築體之該CD3結合區羧基端定位。
- 如請求項1至3中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性構築體以自N端至C端之順序包含以下: 結合至腫瘤相關抗原(TAA)之該第一抗原結合域; 該免疫球蛋白Fc區; 該非可裂解連接子; 該CD3結合區,其中該CD3結合區結合CD3 (CD3ε);及 結合至腫瘤相關抗原(TAA)之該第二抗原結合域。
- 一種多重特異性多肽構築體,該多重特異性多肽構築體包含包含免疫球蛋白Fc區之第一組分及包含CD3結合區之第二組分,其中: 該CD3結合區為包含可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)之抗CD3抗體或抗原結合片段,該抗原結合片段為經二硫鍵穩定之Fv抗體片段(dsFv); 該Fc為包含第一Fc多肽及第二Fc多肽之異二聚體Fc且該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH及VL連接至該異二聚體Fc之相反多肽; 該第一組分及該第二組分藉由非可裂解連接子偶合,其中該Fc區經定位至該CD3結合區之N端;及 該第一組分及該第二組分中之一者或二者包含結合至腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域。
- 一種多重特異性多肽構築體,該多重特異性多肽構築體包含包含免疫球蛋白Fc區之第一組分及包含CD3結合區之第二組分,其中: 該CD3結合區為包含可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)之抗CD3抗體或抗原結合片段,該抗原結合片段為Fv抗體片段; 該Fc為包含第一Fc多肽及第二Fc多肽之異二聚體Fc且該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH及VL連接至該異二聚體Fc之相反多肽; 該第一組分及該第二組分藉由非可裂解連接子偶合,其中該Fc區經定位至該CD3結合區之N端;及 該第一組分及該第二組分中之一者或二者包含結合至腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域,其中該抗原結合域為單鏈抗體片段。
- 如請求項6之多重特異性多肽構築體,其中該單鏈抗體片段為單域抗體或為單鏈可變片段(scFv)。
- 如請求項5至7中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該CD3結合區結合CD3 (CD3ε)。
- 如請求項5至8中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性構築體以自N端至C端之順序包含以下: 結合至腫瘤相關抗原(TAA)之該第一抗原結合域; 該免疫球蛋白Fc區; 該非可裂解連接子; 該CD3結合區,其中該CD3結合區結合CD3 (CD3ε);及 結合至腫瘤相關抗原(TAA)之該第二抗原結合域。
- 如請求項5至8中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性構築體以自N端至C端之順序包含以下: 該免疫球蛋白Fc區; 該非可裂解連接子; 該CD3結合區,其中該CD3結合區結合CD3 (CD3ε);及 結合至腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域。
- 如請求項5至8中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性構築體以自N端至C端之順序包含以下: 結合至腫瘤相關抗原(TAA)之該抗原結合域; 該免疫球蛋白Fc區; 該非可裂解連接子;及 該CD3結合區,其中該CD3結合區結合CD3 (CD3ε)。
- 如請求項1至11中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該異二聚體Fc區之該第一Fc多肽及第二Fc多肽中之一者或二者為變異體Fc多肽,該變異體Fc多肽相較於人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4之Fc區包含至少一個修飾以誘導異二聚體化。
- 如請求項1至12中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該異二聚體Fc區之該第一Fc多肽及第二Fc多肽中之一者或二者為變異體Fc多肽,該變異體Fc多肽相較於人類IgG1之Fc區,視情況相較於SEQ ID NO: 1中所闡述之Fc多肽或其免疫活性片段包含至少一個修飾以誘導異二聚體化。
- 如請求項12或請求項13之多重特異性多肽構築體,其中該異二聚體Fc之該等Fc多肽各者獨立地包含至少一個胺基酸修飾。
- 如請求項12至14中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該至少一個修飾係選自立體修飾、杵臼(knob-into-hole)修飾、增加該等多肽之靜電互補性之電荷突變、改變等電點之修飾(pI變異體)或其組合。
- 如請求項1至15中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該異二聚體Fc之該第一Fc多肽包含選自Thr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val及其組合之修飾及該異二聚體Fc之該第二Fc多肽包含修飾T366W。
- 如請求項16之多重特異性多肽構築體,其中該第一Fc多肽及第二Fc多肽還包含非半胱胺酸殘基至半胱胺酸殘基之修飾,其中該第一多肽之該修飾係在該位置Ser354及Y349中之一者處及該第二Fc多肽之該修飾係在該位置Ser354及Y349中之另一處。
- 如請求項1至17中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該第一Fc多肽包含該等修飾T366W/S354C及該第二Fc多肽包含該等修飾T366S/L368A/Y407V/Y349C。
- 如請求項1至15中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該第一Fc多肽包含該等修飾L368D/K370S及該第二Fc多肽包含該等修飾S364K/E357Q。
- 如請求項1至15中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該第一多肽及該第二多肽中之至少一者包含該等修飾Q295E/N384D/Q418E/N421D。
- 如請求項1至20中任一項之多重特異性多肽構築體,其中: 該異二聚體Fc之該第一Fc多肽或第二Fc多肽中之一者還包含殘基Ile253處之修飾,視情況其中該修飾為Ile253Arg;及/或該異二聚體Fc之該第一Fc多肽或第二Fc多肽中之一者還包含殘基His435處之修飾,視情況其中該修飾為His35Arg。
- 如請求項1至21中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該第一Fc多肽及第二Fc多肽中之一者或二者包含缺少Lys447之多肽。
- 如請求項1至22中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該異二聚體Fc之該第一多肽包含於SEQ ID NO: 82、86或201中之任一者中所闡述之胺基酸序列,及該異二聚體Fc之該第二多肽包含於SEQ ID NO: 83、87、90、92、202或205中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
- 如請求項1至23中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該第一Fc多肽及該第二Fc多肽包含選自由以下組成之群之序列:分別為SEQ ID NO: 82及83;分別為SEQ ID NO: 86及87;分別為SEQ ID NO: 201及202;分別為SEQ ID NO: 82及90;分別為SEQ ID NO: 86及92;及分別為SEQ ID NO: 201及205。
- 如請求項1至22中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該Fc區包含多肽,該多肽包含至少一個修飾以增強FcRn結合。
- 如請求項25之多重特異性融合多肽構築體,其中該修飾係在選自由以下組成之群之位置處:Met252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S及其組合。
- 如請求項25或請求項26之多重特異性融合多肽構築體,其中該修飾為Met252Y及Met428L或為Met252Y及Met428V。
- 如請求項1至22及25至27中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該異二聚體Fc之該第一多肽包含於SEQ ID NO: 94、96或207中之任一者中所闡述之胺基酸序列,及該異二聚體Fc之該第二多肽包含於SEQ ID NO: 98、100或209中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
- 如請求項1至28中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該第一Fc多肽及該第二Fc多肽包含選自由以下組成之群之序列:分別為SEQ ID NO: 94及98;分別為SEQ ID NO: 96及100;及分別為SEQ ID NO: 207及209。
- 如請求項1至22及25至27中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該Fc區包含多肽,該多肽包含至少一個胺基酸修飾,該修飾降低效應功能及/或減少結合至選自Fc γ受體或C1q之效應分子。
- 如請求項30之多重特異性多肽構築體,其中該一或多個胺基酸修飾為缺失Glu233、Leu234或Leu235中之一或多者。
- 如請求項1至22、25至27、30及31中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該異二聚體Fc之該第一多肽包含於SEQ ID NO: 84、88、95、97、203或208中之任一者中所闡述之胺基酸序列,及該異二聚體Fc之該第二多肽包含於SEQ ID NO: 85、89、91、93、99、101、204、206或210中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
- 如請求項1至22、25至27及30至32中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該第一Fc多肽及該第二Fc多肽包含選自由以下組成之群之序列:分別為SEQ ID NO: 84及85;分別為SEQ ID NO: 88及89;分別為SEQ ID NO: 203及204;分別為SEQ ID NO: 95及99;分別為SEQ ID NO: 97及101;分別為SEQ ID NO: 208及210;分別為SEQ ID NO: 84及91;分別為SEQ ID NO: 88及93;及分別為SEQ ID NO: 203及206。
- 如請求項1至33中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該CD3結合區不能或實質上不能結合或接合CD3,除非該抗原結合域中之至少一者結合至其TAA。
- 如請求項1至33中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該CD3結合區不能或實質上不能結合或接合CD3,除非該抗原結合域中之至少兩者結合至其TAA。
- 如請求項1至35中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該連接子為多肽連接子。
- 如請求項36之多重特異性多肽構築體,其中該連接子為長度至多25個胺基酸之多肽。
- 如請求項36或請求項37之多重特異性多肽構築體,其中該連接子為以下之多肽:約2至24個胺基酸、2至20個胺基酸、2至18個胺基酸、2至14個胺基酸、2至12個胺基酸、2至10個胺基酸、2至8個胺基酸、2至6個胺基酸、6至24個胺基酸、6至20個胺基酸、6至18個胺基酸、6至14個胺基酸、6至12個胺基酸、6至10個胺基酸、6至8個胺基酸、8至24個胺基酸、8至20個胺基酸、8至18個胺基酸、8至14個胺基酸、8至12個胺基酸、8至10個胺基酸、10至24個胺基酸、10至20個胺基酸、10至18個胺基酸、10至14個胺基酸、10至12個胺基酸、12至24個胺基酸、12至20個胺基酸、12至18個胺基酸、12至14個胺基酸、14至24個胺基酸、14至20個胺基酸、14至18個胺基酸、18至24個胺基酸、18至20個胺基酸或20至24個胺基酸。
- 如請求項36至38中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該連接子為長度3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸之多肽。
- 如請求項36至39中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該連接子為長度3至18個胺基酸之多肽。
- 如請求項36至40中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該連接子為長度12至18個胺基酸之多肽。
- 如請求項36至40中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該連接子為長度15至18個胺基酸之多肽。
- 如請求項1至42中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括GS、GGS、GGGGS (SEQ ID NO: 149)、GGGGGS (SEQ ID NO: 135)及其組合。
- 如請求項1至43中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括(GGS)n,其中n為1至10。
- 如請求項1至44中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括(GGGGS)n (SEQ ID NO: 173),其中n為1至10。
- 如請求項1至44中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子包括(GGGGGS)n (SEQ ID NO: 172),其中n為1至4。
- 如請求項1至44中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子為或包括GGS。
- 如請求項1至43及45中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子為或包括GGGGS (SEQ ID NO: 149)。
- 如請求項1至43及46中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子為或包括GGGGGS (SEQ ID NO: 135)。
- 如請求項1至44中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子為或包括(GGS)2 (SEQ ID NO: 10)。
- 如請求項1至44中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子為或包括GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11)。
- 如請求項1至44中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子為或包括GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 12)。
- 如請求項1至44中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子為或包括GGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 13)。
- 如請求項1至43及46中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子為或包括GGGGGSGGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 119)。
- 如請求項1至49中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子為或包括GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 147)。
- 如請求項1至43及45中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該非可裂解連接子為或包括GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 170)。
- 如請求項1至56中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性多肽構築體包含至少(i)包含該異二聚體Fc區之該第一Fc多肽、該連接子及該抗CD3抗體或其抗原結合片段之該VH域之第一多肽;及(ii)包含該異二聚體Fc區之該第二Fc多肽、該連接子及該抗CD3抗體或其抗原結合片段之該VL域之第二多肽,其中該第一多肽及該第二多肽中之一者或二者包含結合至腫瘤相關抗原(TAA)之至少一個抗原結合域。
- 如請求項1至57中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH係在與該結合至腫瘤相關抗原(TAA)之至少一個抗原結合域相同之多肽上。
- 如請求項58之多重特異性多肽構築體,其中該包含該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VL之多肽不含有該結合至腫瘤相關抗原(TAA)之至少一個抗原結合域。
- 如請求項1至4、9及12至59中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性多肽構築體展示與該TAA之二價、三價或四價結合。
- 如請求項5至8及10至59中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性多肽構築體展示與該TAA之一價、二價、三價或四價結合。
- 如請求項1至61中任一項之多重特異性多肽構築體,其中僅該第一多肽及該第二多肽中之一者包含該結合TAA之至少一個抗原結合域。
- 如請求項1至62中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該至少一個抗原結合域相對於該Fc區胺基端定位及/或相對於該多重特異性多肽構築體之該第一多肽或該第二多肽中之一者之該CD3結合區羧基端定位。
- 如請求項1至62中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該至少一個抗原結合域相對於該多重特異性構築體之該Fc區胺基端定位及該第二抗原結合域相對於該多重特異性構築體之該CD3結合區羧基端定位。
- 如請求項1至64中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗原結合域或該等抗原結合域各者獨立地包含該TAA之該初始同源結合搭檔或展示對該TAA之結合活性之其變異體之細胞外域或其結合片段。
- 如請求項1至5及8至65中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗原結合域或該等抗原結合域各者獨立地為選自由以下組成之群之抗體或其抗原結合片段:Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體、及單域輕鏈抗體。
- 如請求項66之多重特異性多肽構築體,其中該抗體或其抗原結合片段為Fv、scFv、Fab或單域抗體(sdAb)。
- 如請求項1至67中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗體或其抗原結合片段為sdAb。
- 如請求項68之多重特異性多肽構築體,其中該sdAb為人類或人源化sdAb。
- 如請求項68或請求項69之多重特異性多肽構築體,其中該sdAb為VHH、VNAR、經工程改造之VH域或經工程改造之VK域。
- 如請求項1至67中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗體或其抗原結合片段為scFv。
- 如請求項1至5及8至67中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗體或其抗原結合片段為Fab。
- 如請求項72之多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性多肽構築體包含: (i)包含該異二聚體Fc區之該第一Fc多肽、該連接子及該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH域之第一多肽; (ii)包含該異二聚體Fc區之該第二Fc多肽、該連接子及該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VL域之第二多肽;及 (iii)包含結合至腫瘤相關抗原之Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL之第三多肽,其中該第一多肽及/或第二多肽還包含該Fab抗體片段之該VH-CH1 (Fd)或VL-CL中之另一者。
- 如請求項73之多重特異性多肽構築體,其中僅該第一多肽及該第二多肽中之一者包含該Fab抗體片段之該VH-CH1 (Fd)或VL-CL中之另一者。
- 如請求項73之多重特異性多肽構築體,其中該第一多肽及該第二多肽均包含該Fab抗體片段之該VH-CH1 (Fd)或VL-CL中之另一者。
- 如請求項74或請求項75之多重特異性多肽構築體,其中該Fab抗體片段之該VH-CH1 (Fd)或VL-CL中之另一者相對於該Fc區胺基端定位及/或相對於該多重特異性多肽構築體之該第一多肽及該第二多肽中之一者之該CD3結合區羧基端定位。
- 如請求項74至76中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該Fab抗體片段之該VH-CH1 (Fd)或VL-CL中之另一者相對於該第一多肽或該第二多肽之該Fc區胺基端定位及相對於該第一多肽或該第二多肽中之另一者之該CD3結合區羧基端定位。
- 如請求項1至77中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗原結合域或該等抗原結合域各者獨立地結合至選自以下之腫瘤抗原:1-92-LFA-3、5T4、α-4整聯蛋白(integrin)、α-V整聯蛋白、α4β1整聯蛋白、α4β7整聯蛋白、AGR2、抗Lewis-Y、Apelin J受體、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補體、C-242、CA9、CA19-9、(Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5 (CEA)、CEACAM6 (NCA-90)、CLAUDIN-3、CLAUDIN-4、cMet、膠原蛋白、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、內皮素(Endothelin) B受體(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV之F蛋白、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受體α (FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受體、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、透明質酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受體(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R (wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰島素受體、Jagged配位體、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、間皮素(Mesothelin)、MRP4、MUC1、黏蛋白(Mucin)-16 (MUC16、CA-125)、Na/K ATPase、NGF、呆蛋白、Notch受體、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂醯基-絲胺酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、1-磷酸鞘胺醇(Sphingosine)、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、轉鐵蛋白(Transferrin)、轉鐵蛋白受體、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2及WISP-3。
- 如請求項1至78中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性多肽構築體包含至少第一抗原結合域及第二抗原結合域,其中該第一抗原結合域及第二抗原結合域結合至相同TAA。
- 如請求項79之多重特異性多肽構築體,其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域結合該相同TAA之不同抗原決定基。
- 如請求項79之多重特異性多肽構築體,其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域結合該相同TAA之相同抗原決定基。
- 如請求項1至78中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性多肽構築體包含至少第一抗原結合域及第二抗原結合域,其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域結合不同TAA。
- 如請求項1至82中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗CD3抗體或其抗原結合片段包含以下:包含胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 16)之VH CDR1、包含胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 17)之VH CDR2、包含胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 18)之VH CDR3、包含胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 19)之VL CDR1、包含胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 20)之VL CDR2、及包含胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 21)之VL CDR3。
- 如請求項1至4及6至83中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗CD3 Fv包含: VH,其具有SEQ ID NO: 14、32-43、45-47、196及211中之任一者之胺基酸序列或展示與SEQ ID NO: 14、32-43、45-47、196及211中之任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之序列;及 VL,其具有SEQ ID NO: 15、63、65-71、73、75、77及199中之任一者之胺基酸序列或展示與SEQ ID NO: 15、63、65-71、73、75、77及199中之任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之序列。
- 如請求項1至4及6至84中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗CD3 dsFv包含該SEQ ID NO: 14之胺基酸序列及該SEQ ID NO: 15之胺基酸序列。
- 如請求項1至4及6至84中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗CD3 Fv包含該SEQ ID NO: 196之胺基酸序列及該SEQ ID NO: 199之胺基酸序列。
- 如請求項1至4及6至83中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該Fv抗體片段包含經二硫鍵穩定之抗CD3結合Fv片段(dsFv)。
- 如請求項5或請求項87之多重特異性多肽構築體,其中該經二硫鍵穩定之抗CD3結合Fv片段(dsFv)包含具有突變G44C之VH鏈及具有突變G100C之VL鏈,該突變藉由kabat編號。
- 87及88中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗CD3 Fv包含: VH,其具有SEQ ID NO: 44及49-62、197及198中之任一者之胺基酸序列或展示與SEQ ID NO: 44及49-62、197及198中之任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之序列;及 VL,其具有SEQ ID NO: 64、72、74、76、78-81、191、200及212中之任一者之胺基酸序列或展示與SEQ ID NO: 64、72、74、76、78-81、191、200及212中之任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之序列。
- 如請求項5及87至89中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗CD3 dsFv包含該SEQ ID NO: 44之胺基酸序列及該SEQ ID NO: 72之胺基酸序列。
- 如請求項5及87至89中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該抗CD3 dsFv包含該SEQ ID NO: 198之胺基酸序列及該SEQ ID NO: 200之胺基酸序列。
- 如請求項1至91中任一項之多重特異性多肽構築體,其中該多重特異性多肽構築體結合至藥劑。
- 如請求項92之多重特異性多肽構築體,其中該藥劑為治療劑、抗腫瘤劑、毒素或其片段、可檢測部分或診斷劑。
- 如請求項93之多重特異性多肽構築體,其中該藥劑經由連接子結合至該多重特異性多肽構築體。
- 一種多核苷酸,其編碼如請求項1至94中任一項之多重特異性多肽構築體。
- 一種多核苷酸,其編碼如請求項1至94中任一項之多重特異性多肽構築體中之任一者之多肽鏈。
- 一種多核苷酸,其包含編碼如請求項1至94中任一項之多重特異性多肽構築體之第一多肽之第一核酸序列及編碼該多重特異性多肽構築體之第二多肽之第二核酸序列,其中該第一核酸序列及第二核酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或編碼自我裂解肽或引起核糖體跳躍之肽之核酸分離。
- 如請求項97之多核苷酸,其中該第一核酸序列及第二核酸序列以可操作方式連接至相同啟動子。
- 如請求項97或請求項98之多核苷酸,其中該多重特異性多肽構築體包含第三多肽鏈,且該多核苷酸還包含編碼該多重特異性多肽構築體之該第三多肽之第三核酸。
- 如請求項99之多核苷酸,其中該第三核酸藉由內部核糖體進入位點(IRES)或編碼自我裂解肽或引起核糖體跳躍之肽之核酸自該第一多肽及/或該第二多肽分離及/或該第三核酸序列以可操作方式連接至與該第一核酸序列及/或該第二核酸序列相同之啟動子。
- 如請求項97至100中任一項之多核苷酸,其中該編碼自我裂解肽或引起核糖體跳躍之肽之核酸係選自T2A、P2A、E2A或F2A。
- 一種載體,其包含如請求項95至101中任一項之多核苷酸。
- 如請求項102之載體,其為表現載體。
- 如請求項102或103之載體,其為病毒載體或真核載體,視情況其中該真核載體為哺乳動物載體。
- 一種細胞,其包含如請求項95至101中任一項之多核苷酸,或如請求項102至104中任一項之載體。
- 如請求項105之細胞,其中該細胞經重組或單離。
- 如請求項106之細胞,其中該細胞為哺乳動物細胞。
- 如請求項107之細胞,其中該細胞為HEK293或CHO細胞。
- 一種製備多重特異性多肽構築體之方法,該方法包括向細胞中引入如請求項95至101中任一項之多核苷酸或如請求項102至104中任一項之載體及在產生該多重特異性多肽構築體之條件下培養該細胞。
- 一種產生多重特異性多肽構築體之方法,該方法包括在藉由細胞產生該多重特異性多肽之條件下培養如請求項105至108中任一項之細胞。
- 如請求項109或請求項110之方法,其還包括自該細胞單離或純化該多重特異性多肽構築體。
- 如請求項109至111中任一項之方法,其中該多重特異性多肽構築體為異二聚體。
- 一種多重特異性多肽構築體,其藉由如請求項109至112中任一項之方法製備。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項1至94中任一項或如請求項113之多重特異性多肽構築體及醫藥上可接受之載劑。
- 如請求項114之醫藥組合物,其係無菌。
- 一種刺激或誘導免疫反應之方法,該方法包括使靶細胞及T細胞與如請求項1至94中任一項或如請求項113之多重特異性多肽構築體及如請求項114或請求項115之醫藥組合物接觸,該靶細胞表現藉由該多重特異性多肽構築體識別之腫瘤相關抗原。
- 如請求項116之方法,其中該靶細胞為表現該腫瘤相關抗原(TAA)之腫瘤細胞。
- 如請求項116或請求項117之方法,其中離體或活體外進行該接觸。
- 如請求項116至118中任一項之方法,其中於個體中活體內進行該接觸。
- 一種刺激或誘導個體之免疫反應之方法,該方法包括對有需要之個體投與治療上有效量之如請求項1至94中任一項或如請求項113之多重特異性多肽構築體或如請求項114或請求項115之醫藥組合物。
- 如請求項116至120中任一項之方法,其增加細胞介導之免疫。
- 如請求項116至121中任一項之方法,其增加T-細胞活性。
- 如請求項116至122中任一項之方法,其增加溶細胞T-細胞(CTL)活性。
- 如請求項116至123中任一項之方法,其中增加針對腫瘤或癌症之該免疫反應。
- 如請求項116至124中任一項之方法,其中該方法治療該個體之疾病或病狀。
- 一種治療個體之疾病或病狀之方法,該方法包括對有需要之個體投與治療上有效量之如請求項1至94中任一項或如請求項113之多重特異性結合物或如請求項114或請求項115之醫藥組合物。
- 如請求項125或請求項126之方法,其中該疾病或病狀為腫瘤或癌症。
- 如請求項119至127中任一項之方法,其中該個體為人類。
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