KR20210006913A - 제한된 ｃｄ3 결합을 갖는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 및 관련된 방법 및 용도 - Google Patents

제한된 ｃｄ3 결합을 갖는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 및 관련된 방법 및 용도 Download PDF

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KR20210006913A
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브렌단 피. 에클맨
마이클 디. 캐플런
케이틀린 엠. 윌리스
존 씨. 팀머
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인히브릭스, 인크.
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Abstract

본 발명은 일반적으로 제한된 CD3 결합을 갖는 다중특이적 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 다중특이적 폴리펩티드의 구성요소는 비-절단성 링커에 의해서 연결된다. 또한 다양한 치료, 진단 및 예방 증상에서 이들 다중특이적 폴리펩티드를 제조하고 사용하는 방법이 제공된다.

Description

제한된 CD3 결합을 갖는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 및 관련된 방법 및 용도
관련된 출원들에 대한 교차-참조
본 출원은 "제한된 CD3 결합을 갖는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트(construct) 및 관련된 방법 및 용도"라는 명칭으로 하는, 2018년 04월 11일에 출원된 미국 가출원번호 제62/656,331호의 우선권을 주장하며, 상기 가출원의 내용은 그 전체가 본원에서 참고문헌으로 포함된다.
서열목록 참조의 원용
본 출원은 전자형식의 서열목록과 함께 출원된다. 서열목록은 2019년 04월 10일에 생성된, 744952000240SeqList.TXT을 명칭으로 하는 파일로 제공되며, 크기는 212 킬로바이트이다. 서열목록의 전자형식의 정보는 그 전체가 본원에 참고문헌으로 포함된다.
분야
본 발명은 일반적으로 제한된 CD3 결합을 갖는 다중특이적 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드의 구성요소는 비-절단성 링커(non-cleavable linker)에 의해서 연결된다. 또한, 이러한 다중특이적 폴리펩티드를 제조하고 다양한 치료, 진단 및 예방 증상에 사용하는 방법이 제공된다.
표적 세포 고갈(depletion)을 야기하는 치료학적 항체는 일반적으로 Fc-감마-수용체(FcγR) 및 보체 단백질과의 상호작용을 통해 매개되는 효과기(effector) 기능에 의존한다. FcγR을 발현하는 효과기 세포는 주로 선천성 면역계의 세포다. T 세포는 항체 매개 표적 세포 고갈에 관여하는 직접적인 효과기 세포가 아니다.
CD3(분화 클러스터(cluster of differentiation) 3) T-세포 공동-수용체는 ε, γ, δ, 및 ζ 사슬로 지칭되는 4개의 별개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 다합체(multimeric) 단백질이다. CD3 복합체는 T 세포 수용체(TCR)의 항원-결합 a/b 사슬과 비공유적으로 결합하는 T 세포 수용체의 신호전달 모듈로서 작용한다.
CD3의 직접적인 관여(engagement)는 T 세포 활성화를 초래하기 때문에, 이는 다양한 치료 및/또는 진단 증상에 대한 바람직한 표적이다. 이에 따라, CD3/TCR 경로를 표적하는 항체 및 치료제에 대한 요구가 있었다.
본 발명은 제한된 CD3 결합을 나타내는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 제공한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 제 1 구성요소와 CD3-결합 영역을 포함하는 제 2 구성요소로 구성되며, 여기서 상기 제 1 및 제 2 구성요소는 링커, 예를 들어 비-절단성 링커(non-cleavable linker)에 의해 결합되며, 상기 Fc 영역은 CD3-결합 영역에 대해 N-말단에 위치하고; 제 1 및 제 2 구성요소 중 하나 또는 둘 다는 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CD3-결합 영역은 CD3(CD3ε)에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치하고/하거나 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 제 1 구성요소는 제 1 항원 결합 도메인을 포함하고 제 2 구성요소는 제 2 항원 결합 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 항원 결합 도메인은 종양 관련 항원(TAA)에 결합한다. 일부의 경우, 제 1 항원 결합 도메인은 다중특이적 컨스트럭트의 아미노 말단에 위치하고 제 2 항원 결합 도메인은 다중특이적 컨스트럭트의 카복시 말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 제 1 항원 결합 도메인은 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치하고/하거나 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치한다. 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시 말단에 위치된다.
본원에서는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트가 제공되며, 여기서 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로: 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 제 1 항원 결합 도메인; 면역글로불린 Fc 영역; 링커; 예를 들어 비-절단성 링커, CD3(CD3ε)에 결합하는 CD3 결합 영역; 및 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 제 2 항원 결합 도메인을 포함한다. 또한, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트가 제공되며, 여기서 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로: 면역글로불린 Fc 영역; 링커; 예를 들어 비-절단성 링커, CD3(CD3ε)에 결합하는 CD3 결합 영역; 및 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트가 제공되며, 여기서 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로: 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 항원-결합 도메인; 면역글로불린 Fc 영역; 링커; 예를 들어 비-절단성 링커, 및 CD3(CD3ε)에 결합하는 CD3 결합 영역을 포함한다.
상기 제공된 구현예 중의 임의의 일부에서, 상기 링커는 비-절단성 링커이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 프로테아제에 의한 절단에 특이적인 기질 인식 부위를 함유하지 않는 링커이다.
상기 제공된 구현예 중의 일부 어느 것에서, CD3 결합 영역에 대한 N-말단 Fc 영역의 위치 설정은 CD3 결합 영역이 CD3에 결합하는 능력을 감소시키거나 방지한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 제 1 구성요소(구성요소 #1) 및 제 2 구성요소(구성요소 #2)는 연결되고, 항원 결합 도메인(들)이 이의 동족 항원에 결합되지 않는 한, CD3에 대한 결합이 허용되지 않는다. 일부 구현예에서, 구성요소 #1은 적어도 하나의 항원 결합 도메인 및 Fc 영역을 함유한다. 일부 구현예에서, 구성요소 #2는 적어도 하나의 CD3 결합 영역 도메인 및 항원 결합 도메인을 함유하고, 그중 전자는 (상기 다중특이적 컨스트럭트가 구성요소 #1 또는 구성요소 #2의 상기 항원 결합 도메인(들)에 의해서 인식된 항원에 결합될때) CD3에 결합할 수 있다. 따라서, 기술된 바와 같은 상기 Fc 영역에 대한 상기 CD3 결합 영역의 연결은 결합하지 않거나 또는, 그렇지 않은 경우 상기 항원 결합 도메인(들)이 그의 동족 항원(cognate antigen)에 결합되지 않는한 CD3에 관여한다. 이는 T-세포에 대한 CD3 결합 영역의 침투성 결합을 방지하고 대신에 항원 발현 부위에 결합하는 상기 CD3 결합 영역의 능력에 초점을 맞추기 때문에 유리하다. 이는 말초 T-세포의 주요 결합 싱크(sink)를 감소시키거나 또는 제거하여, 잠재적으로 항원 발현 부위, 예를 들어 종양 세포 또는 종양 미세 환경(tumor microenvironment)에서 보다 유리한 분포 및 국소화를 가능하게 하므로, 유익하다.
상기 항원 결합 도메인(들)이 그의 동족 항원에 결합될 때, 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 구성요소 #2를 경유하여 항원-발현 세포와 T-세포 사이에 면역 시냅스를 형성할 수 있다. 이러한 공-관여는 항원 의존성 T-세포 활성화, 세포 독성, 사이토카인 방출, 탈과립 및 증식을 매개한다. 일부 구현예에서, 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 FcηR과 상호작용할 수 있고, 선천성 면역 효과기 기능, 예를 들어 항체 의존 세포성 세포독성(ADCC) 및 항체 의존 세포성 식균작용(ADCP)을 매개할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 보체 단백질(complement protein), 즉 C1q와 상호작용할 수 있고, 보체 의존 세포독성을 매개할 수 있다.
일부 구현예에서,제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 상기 항원 결합 도메인(들)에 의해서 인식된 동족 항원은 종양 관련 항원(TAA)이다.
따라서 상기 제공된 구현예 중에서, 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 면역글로분린 Fc 영역을 포함하는 제 1 구성요소 및 CD3-결합 영역을 포함하는 제 2 구성요소로 구성되되, 상기 제 1 및 제 2 구성요소된 링커, 예를 들어 비-절단성 링커에 의해서 결합되며(coupled), 상기 Fc 영역은 상기 CD3-결합 영역에 대해 N-말단에 위치하고; 상기 제 1 및 제 2 구성요소 중의 하나 또는 둘 다는 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CD3-결합 영역은 CD3(CD3ε)와 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 Fc 영역에 대해 상대적으로 및/또는 상기 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치된다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 구성요소는 제 1 항원 결합 도메인을 포함하고 상기 제 2 구성요소는 제 2 항원 결합 도메인을 포함하되, 각각의 상기 항원 결합 도메인은 종양 관련 항원(TAA)에 결합한다. 일부 경우에, 상기 제 1 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 컨스트럭트의 상기 아미노 말단에 위치되며 상기 제 2 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 컨스트럭트의 상기 카복시 말단에 위치된다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 상기 Fc 영역에 대해 상대적으로 및/또는 상기 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치된다. 제공된 폴리펩티드 컨스트럭트의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 상기 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치된다.
일부 구현예에서, 상기 CD3 결합 영역은 항체 또는 항원 결합 단편이다. 특정 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄 영역(VH) 및 가변 경쇄 영역(VL)을 포함하는 2쇄 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 Fv이다. 특정 구현예에서, 상기 Fv는 상기 VH와 VL 사슬 사이에사슬간 이황화 결합(interchain disulfide bond)을 포함하는 이황화-안정화된 Fv(dsFv)이다.
본원에서 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 제 1 구성요소 및 CD3-결합 영역을 포함하는 제 2 구성요소를 포함하는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트가 제공되되, 상기 CD3-결합 영역은 가변 중쇄 영역(VH) 및 가변 경쇄 영역(VL)을 포함하는 Fv 항체 단편인 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편이며; 상기 Fc는 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체 Fc이고 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 상기 VH 및 VL은 상기 이종이량체 Fc의 반대측 폴리펩티드에 연결되고; 상기 제 1 및 제 2 구성요소는 비-절단성 링커에 의해서 결합되되, 상기 Fc 영역은 상기 CD3-결합 영역에 대해 N-말단에 위치되고; 상기 제 1 구성요소는 제 2 항원 결합 도메인을 포함하되, 각각의 항원 결합 도메인은 종양 관련 항원(TAA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 CD3-결합 영역은 CD3(CD3ε)에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 컨스트럭트의 상기 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치되고 상기 제 2 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 컨스트럭트의 상기 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-발단에 위치된다. 일부 구현예에서, 상기 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로: 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 상기 제 1 항원 결합 도메인; 상기 면역글로불린 Fc 영역; 상기 비-절단성 링커; 상기 CD3 결합 영역이 CD3(CD3ε)에 결합하는 상기 CD3 결합 영역; 및 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 상기 제 2 항원 결합 도메인을 포함한다.
본원에서 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 제 1 구성요소 및 CD3-결합 영역을 포함하는 제 2 구성요소를 포함하는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트가 제공되되, 상기 CD3-결합 영역은 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 포함하는 이황화-안정화된 Fv 항체 단편(dsFv)인 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편이며; 상기 Fc는 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체 Fc이고 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 상기 VH 및 VL은 상기 이종이량체 Fc의 반대측 폴리펩티드에 연결되고; 상기 제 1 및 제 2 구성요소는 비-절단성 링커에 의해서 결합되되, 상기 Fc 영역은 상기 CD3-결합 영역에 대해 N-말단에 위치되고; 상기 제 1 및 제 2 구성요소 중의 하나 또는 둘 다는 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 상기 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치된다. 일부 구현예에서, 상기 CD3-결합 영역은 CD3(CD3ε)에 결합한다.
본원에서 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 제 1 구성요소 및 CD3-결합 영역을 포함하는 제 2 구성요소를 포함하는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트가 제공되되, 상기 CD3-결합 영역은 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 포함하는 Fv 항체 단편인 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편이며; 상기 Fc는 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체 Fc이고 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 상기 VH 및 VL은 상기 이종이량체 Fc의 반대측 폴리펩티드에 연결되고; 상기 제 1 및 제 2 구성요소는 비-절단성 링커에 의해서 결합되되, 상기 Fc 영역은 상기 CD3-결합 영역에 대해 N-말단에 위치되고; 상기 제 1 및 제 2 구성요소 중의 하나 또는 둘 다는 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하되, 상기 항원-결합 도메인은 단일 사슬 항체 단편, 예를 들어 sdAb 또는 scFv이다. 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 상기 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치된다. 일부 구현예에서, 상기 CD3-결합 영역은 CD3(CD3ε)에 결합한다.
본원에 제공된 구현예에서, 상기 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로: 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 상기 제 1 항원 결합 도메인; 상기 면역글로불린 Fc 영역; 상기 비-절단성 링커; 상기 CD3 결합 영역이 CD3(CD3ε)에 결합하는 상기 CD3 결합 영역; 및 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 상기 제 2 항원 결합 도메인을 포함한다.
본원에 제공된 구현예에서, 상기 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로: 상기 면역글로불린 Fc 영역; 상기 비-절단성 링커; 상기 CD3 결합 영역이 CD3(CD3ε)에 결합하는 상기 CD3 결합 영역; 및 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
본원에 제공된 구현예에서, 상기 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로: 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 상기 항원 결합 도메인; 상기 면역글로불린 Fc 영역; 상기 비-절단성 링커; 및 상기 CD3 결합 영역이 CD3(CD3ε)에 결합하는 상기 CD3 결합 영역을 포함한다.
본원에서 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트가 제공되며, 상기 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로: 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 제 1 항원 결합 도메인; 면역글로불린 Fc 영역; 링커, 예를 들어 비-절단성 링커; CD3(CD3ε)에 결합하는 CD3 결합 영역; 및 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 제 2 항원 결합 도메인을 포함한다. 또한 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트가 제공되며, 상기 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로: 면역글로불린 Fc 영역; 링커, 예를 들어 비-절단성 링커; CD3(CD3ε)에 결합하는 CD3 결합 영역; 및 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트가 제공되며, 상기 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로: 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인; 면역글로불린 Fc 영역; 링커, 예를 들어 비-절단성 링커; 및 CD3(CD3ε)에 결합하는 CD3 결합 영역을 포함한다.
일부 측면에서, 항원 결합 도메인, 또는 항원 결합 도메인 각각은 독립적으로 항체 또는 항원 결합 단편, 천연 동족 결합 파트너, 안티칼린(Anticalin)(조작된 리포칼린(engineered lipocalin)), 다르핀(Darpin), 피노머(Fynomer), 센티린(Centyrin)(조작된 피브로네티신 III 도메인(engineered fibroneticin III domain)), 시스틴-노트 도메인(cystine-knot domain), 아필린(Affilin), 아피바디(Affibody), 또는 조작된 CH3 도메인으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 천연 동족 결합 파트너는 TAA의 천연 동족 결합 파트너의 세포외 도메인 또는 이의 결합 단편, 또는 TAA에 대한 결합 활성을 나타내는 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항원-결합 도메인은, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항원 결합 도메인은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체, 및 단일 도메인 경쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항원-결합 도메인은 하나 이상의 단일 도메인 항체(sdAb) 단편, 예를 들어 VHH, VNAR, 조작된 VH 또는 VK 도메인의 하나 이상의 카피를 포함한다. VHH는 낙타 중쇄 전용 항체로부터 제조될 수 있다. VNAR은 연골 어류 중쇄 전용 항체로부터 제조될 수 있다. 인터페이스 공학 및 특정 생식계열 패밀리의 선택을 포함하는, 통상적으로 이종이량체 VH 및 VK 도메인으로부터 단량체 sdAb를 제조하기 위한 다양한 방법이 구현되었다.
일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 항원 결합 도메인은 항원, 예를 들어 종양 관련 항원(TAA)인 항원에 독립적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 항원 결합 도메인, 또는 독립적으로 각각의 상기 항원 결합 도메인은 1-92-LFA-3, 5T4, 알파-4 인테그린, 알파-V 인테그린, 알파4베타1 인테그린, 알파4베타7 인테그린, AGR2, 항-루이스-Y, 아펠린 J 수용체, APRIL, B7-H3, B7-H4, BAFF, BTLA, C5 보체, C-242, CA9, CA19-9, (루이스 a), 탄산무수화효소 9, CD2, CD3, CD6, CD9, CD11a, CD19, CD20, CD22, CD24, CD25, CD27, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD41, CD44, CD44v6, CD47, CD51, CD52, CD56, CD64, CD70, CD71, CD74, CD80, CD81, CD86, CD95, CD117, CD123, CD125, CD132, (IL-2RG), CD133, CD137, CD138, CD166, CD172A, CD248, CDH6, CEACAM5(CEA), CEACAM6(NCA-90), CLAUDIN-3, CLAUDIN-4, cMet, 콜라겐, 크립토, CSFR, CSFR-1, CTLA-4, CTGF, CXCL10, CXCL13, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CYR61, DL44, DLK1, DLL3, DLL4, DPP-4, DSG1, EDA, EDB, EGFR, EGFRviii, 엔도텔린 B 수용체(ETBR), ENPP3, EpCAM, EPHA2, EPHB2, ERBB3, RSV의 F 단백질, FAP, FGF-2, FGF8, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FLT-3, 엽산 수용체 알파(FRα), GAL3ST1, G-CSF, G-CSFR, GD2, GITR, GLUT1, GLUT4, GM-CSF, GM-CSFR, GP IIb/IIIa 수용체, Gp130, GPIIB/IIIA, GPNMB, GRP78, HER2/neu, HER3, HER4, HGF, hGH, HVEM, 히알루로니다아제, ICOS, IFN알파, IFN베타, IFN감마, IgE, IgE 수용체(FceRI), IGF, IGF1R, IL1B, IL1R, IL2, IL11, IL12, IL12p40, IL-12R, IL-12R베타1, IL13, IL13R, IL15, IL17, IL18, IL21, IL23, IL23R, IL27/IL27R(wsx1), IL29, IL-31R, IL31/IL31R, IL2R, IL4, IL4R, IL6, IL6R, 인슐린 수용체, 재기드 리간드, 재기드 1, 재기드 2, KISS1-R, LAG-3, LIF-R, 루이스 X, LIGHT, LRP4, LRRC26, Ly6G6D, LyPD1, MCSP, 메소텔린, MRP4, MUC1, 뮤신-16(MUC16, CA-125), Na/K ATPase, NGF, 니카스트린, 노치 수용체, 노치 1, 노치 2, 노치 3, 노치 4, NOV, OSM-R, OX-40, PAR2, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGFR알파, PDGFR베타, PD-1, PD-L1, PD-L2, 포스파티딜-세린, P1GF, PSCA, PSMA, PSGR, RAAG12, RAGE, SLC44A4, 스핑고신 1 포스페이트, STEAP1, STEAP2, TAG-72, TAPA1, TEM-8, TGF베타, TIGIT, TIM-3, TLR2, TLR4, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TMEM31, TNF알파, TNFR, TNFRS12A, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체, TRK-A, TRK-B, uPAR, VAP1, VCAM-1, VEGF, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, VISTA, WISP-1, WISP-2, 및 WISP-3 중에서 선택된 종양 항원에 결합한다.
일부 구현예에서, Fc 영역은 동종이량체 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 제 1 구성요소의 면역글로불린 Fc 영역은 IgG1 이소타입, IgG2 이소타입, IgG3 이소타입, 및 IgG4 서브클래스로 이루어진 군으로부터 선택된 IgG 이소타입이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 또는 인간 IgG4의 Fc 영역이거나, 면역학적으로 활성인 이의 단편이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함한다. 일부의 경우, Fc 영역은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 2와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함한다. 이러한 임의의 일부 구현예에서, Fc 영역은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 4와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 5와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 Fc 영역은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로부터 유래되는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 상기 Fc 영역은 이종이량체 Fc 영역이다.
일부 구현예에서, 상기 Fc 영역은 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체이며, 상기 이종이량체 Fc 영역의 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드 중의 하나 또는 둘 다는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4의 Fc 영역과 비교하여 이종이량체화를 유도하는 적어도 하나의 변형체(modification)를 포함하는 변이체 Fc 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 변형체는 인간 IgG1의 Fc 영역 내에 있거나 그와 비교된다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 변형체는 서열번호 1에 제시된 Fc 폴리펩티드 또는 그의 면역학적 활성 단편 내에 있거나 그와 비교된다. 일부 경우에, 상기 이종이량체 Fc 영역의 하나 또는 둘다의 Fc 폴리펩티드는 동종이량체 Fc 영역의 폴리펩티드와 비교하여, 선택적으로는 서열번호 1에 제시된 상기 Fc 폴리펩티드 또는 그의 면역학적으로 활성 단편과 비교하여 이종이량체화를 유도하는 적어도 하나의 변형체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이종이량체 Fc 영역의 상기 Fc 폴리펩티드 각각은 독립적으로 적어도 하나의 아미노산 변형체를 포함한다. 일부 경우에, 상기 적어도 하나의 변형체는 입체 변형체(들)(steric modification(s)), 노브-인투-홀 변형체(들)(knob-into-hole modification(s)), 상기 폴리펩티드의 정전 상보성(electrostatic complementarity)을 증가시키는 전하 돌연변이체(들), 상기 등전점를 변경시키는 변형체(들)(pI 변이체), 또는 그들의 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 아미노산 변형체는 폴리펩티드의 정전기적 상보성을 증가시키기 위한 전하 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 Fc 폴리펩티드는 상보적 위치에서 변형체를 포함하며, 여기서 변형체는 다른 폴리펩티드의 상보적 아미노산과 반대 전하를 갖는 아미노산으로 치환되는 것이다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드는 상보적 위치에서 변형체를 포함하며, 여기서 변형체는 다른 폴리펩티드의 상보적 아미노산에 반대 전하를 갖는 아미노산으로 치환되는 것이다. 일부 구현예에서, 적어도 제 1 또는 제 2 Fc 폴리펩티드 각각은 상보적 위치에 변형체를 포함하며, 여기서 변형체는 다른 폴리펩티드의 상보적 아미노산에 반대 전하를 갖는 아미노산으로 치환되는 것이다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드는 각각 상보적 위치에 변형체를 포함하며, 여기서 변형체는 다른 폴리펩티드의 상보적 아미노산에 반대 전화를 갖는 아미노산으로 치환되는 것이다.
일부 구현예에서, 아미노산 변형체는 노브-인투-홀 변형체(knob-into-hole modification)이다.
일부 구현예에서, 이종이량체 Fc의 제 1 Fc 폴리펩티드는 Thr366Ser, Leu368Ala, Tyr407Val, 및 이의 조합 중에서 선택되는 변형체를 포함하고 이종이량체 Fc의 제 2 Fc 폴리펩티드는 변형체 T366W을 포함한다. 일부의 경우, 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드는 추가로 비-시스테인 잔기가 시스테인 잔기로 변형되는 것을 포함하며, 여기서 제 1 폴리펩티드의 변형체는 Ser354 및 Y349 위치 중의 하나이고 제 2 Fc 폴리펩티드의 변형체는 Ser354 및 Y349 위치 중 다른 하나이다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 변형체 T366W/S354C을 포함하고 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 변형체 T366S/L368A/Y407V/Y349C을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 변형체 L368D/K370S를 포함하고 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 변형체 S364K/E357Q를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 변형체 L368D/K370S를 포함하고 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 변형체 S364K/E357Q를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드 중의 적어도 하나는 변형 Q295E/N384D/Q418E/N421D를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종이량체 Fc의 제 1 또는 제 2 Fc 폴리펩티드 중의 하나는 잔기 Ile253에서 변형체를 포함한다. 일부 경우에, 상기 변형체는 Ile253Arg이다. 일부 구현예에서, 상기 이종이량체 Fc의 제 1 또는 제 2 Fc 폴리펩티드 중의 하나는 추가로 잔기 His435의 변형체를 포함한다. 일부 경우에, 상기 변형체는 His435Arg이다.
일부 구현예에서, 상기 Fc 영역, 예를 들어 상기 제 1 및/또는 제 2 Fc 폴리펩티드는 Lys447가 없는 폴리펩티드를 포함한다.
상기 제공된 구현예 중의 어느 것의 일부에서, 상기 이종이량체 Fc의 제 1 폴리펩티드는 서열번호 82, 86 또는 201 중의 임의의 것에 제시된 아미노산의 서열을 포함하고, 상기 이종이량체 Fc의 제 2 폴리펩티드는 서열번호 83, 87, 90, 92, 202 또는 205 중의 임의의 것에 제시된 아미노산의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드 및 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 각각 서열번호 82 및 83; 각각 서열번호 86 및 87; 각각 서열번호 201 및 202; 각각 서열번호 82 및 90; 각각 서열번호 86 및 92; 각각 서열번호 201 및 205로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역글로불린 Fc 영역은 하나 이상의 변형체를 포함하는 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 Fc 영역은 글리코실화를 방지하고, Fc 수용체 상호작용을 변경하며, Fc 수용체 결합을 감소시키고, CD32A와의 상호작용을 향상시키며, 보체 단백질 C1q 결합을 감소시키고, 반감기를 연장하며, FcRn 결합을 개선하고, 항체-의존 세포성 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존 세포독성(CDC)을 변경하며, 이종이량체화를 유도하고, 이량체화를 방지하며, CH3:CH3 경계면에서 동종이량체화(heterodimerization)를 안정화시키고, 이들의 조합을 위한 하나 이상의 변형체를 포함하는, 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, Fc 영역 내의 변형체는 Fc-수용체-감마 수용체에 대한 결합을 감소시키는 반면, 신생아의 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합에 대해 최소한의 영향을 갖는다. 일부 구현예에서, 돌연변이된 또는 변형된 Fc 폴리펩티드는 다음의 돌연변이체를 포함한다: 카밧 번호매김 시스템을 이용하여 Met252Tyr 및 Met428Leu 또는 Met252Tyr 및 Met428Val(M252Y, M428L, 또는 M252Y, M428V).
일부 구현예에서, Fc 영역은 FcRn 결합을 개선시키기 위한 적어도 하나의 변형체를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형체는 Met252, Ser254, Thr256, Met428, Asn434, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 있다. 일부의 경우, 변형체는 Met252Y, Ser254T, Thr256E, Met428L, Met428V, Asn434S, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 있다. 일부 특정 구현예에서, 변형체는 Met252 위치 및 Met428 위치에 있다. 일부의 경우, 변형체는 Met252Y 및 Met428L이다. 일부의 경우, 변형체는 Met252Y 및 Met428V이다.
일부 구현예에서, 이종이량체 Fc의 제 1 폴레펩티드는 서열번호 94, 96 또는 207 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함하고, 이종이량체 Fc의 제 2 폴리펩티드는 서열번호 98, 100, 또는 209 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드 및 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 각각 서열번호 94 및 98; 각각 서열번호 96 및 100; 각각 서열번호 207 및 209로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 Fc 영역은 FcγR 결합을 향상시키기 위한 적어도 하나의 변형체를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부의 경우, 상기 변형체는 Ser239 또는 Ile332에서의 변형이다. 일부 구현예에서, 상기 Fc 영역의 글리코실화는 비변형 Fc 영역과 비교하여 FcγR 결합을 향상시키기 위해 변형된다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 푸코오스 함량이 결여되어 있거나 푸코오스 함량을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 상기 Fc 영역은 효과기 기능(effector function)을 감소시키고/시키거나 Fc 감마 수용체 또는 C1q로부터 선택되는 효과기 분자(effector molecule)에 대한 결합을 감소시키는 적어도 하나의 아미노산 변형체를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형체는 Glu233, Leu234 또는 Leu235 중 하나 이상의 결실이다.
일부 구현예에서, 상기 이종이량체 Fc의 상기 제 1 폴리펩티드는 서열번호 82, 86, 94 또는 96 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함하고, 상기 이종이량체 Fc의 제 2 폴리펩티드는 서열번호 83, 87, 90, 92, 98 또는 100 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 Fc 영역은 효과기 기능을 감소시키고/시키거나 Fc 감마 수용체 또는 Clq로부터 선택된 효과기 분자(effector molecule)에 결합하는 것을 감소시키는 적어도 하나의 아미노산 변형체를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형체는 Glu233, Leu234 또는 Leu235 중 하나 이상의 결실이다. 일부 측면에서, 이종이량체 Fc의 제 1 폴리펩티드는 서열번호 84, 88, 95 또는 97 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함하고 이종이량체 Fc의 제 2 폴리펩티드는 서열번호 85, 89, 91, 93, 99 또는 101 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이종이량체 Fc의 상기 제 1 폴리펩티드는 서열번호 84, 88, 95, 97, 203 또는 208 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함하고 상기 이종이량체 Fc의 상기 제 2 폴리펩티드는 서열번호 85, 89, 91, 93, 99, 101, 204, 206 또는 210 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드 및 상기 제 2 폴리펩티드는 각각 서열번호 84 및 85; 각각 서열번호 88 및 89; 각각 서열번호 203 및 204; 각각 서열번호 95 및 99; 각각 서열번호 97 및 101; 각각 서열번호 208 및 210; 각각 서열번호 84 및 91; 각각 서열번호 88 및 93; 및 각각 서열번호 203 및 206으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CD3 결합 영역은 항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄 영역(VH) 및 가변 경쇄 영역(VL)을 포함한다. 이러한 임의의 일부 구현예에서, CD3 결합 영역은 1가이다.
일부 구현예에서, 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편은 단일 사슬 항체가 아니고, 선택적으로 단일 사슬 가변 단편(scFv)이 아니다. 일부 구현예에서, Fc는 이종이량체 Fc이고 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 VH 및 VL은 이종이량체 Fc의 반대편 폴리펩티드에 연결된다.
일부 구현예에서, CD3 결합 영역은, 적어도 하나의 항원 결합 도메인이 이의 TAA에 결합하지 않는 한, CD3에 결합할 수 없거나 관여(engage)할 수 없고, 또는 실질적으로 CD3에 결합할 수 없거나 관여할 수 없다. 일부 측면에서, CD3 결합 영역은, 적어도 2개의 항원 결합 도메인이 이의 TAA에 결합하지 않는 한, CD3에 결합할 수 없거나 관여할 수 없고, 또는 실질적으로 CD3에 결합할 수 없거나 관여할 수 없다.
일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 폴리펩티드 링커인 링커를 함유한다. 일부 구현예에서, 링커는 최대 25개 아미노산 길이의 폴리펩티드이다. 일부의 경우, 링커는 (약) 2개 내지 24개의 아미노산, 2개 내지 20개의 아미노산, 2개 내지 18개의 아미노산, 2개 내지 14개의 아미노산, 2개 내지 12개의 아미노산, 2개 내지 10개의 아미노산, 2개 내지 8개의 아미노산, 2개 내지 6개의 아미노산, 6개 내지 24개의 아미노산, 6개 내지 20개의 아미노산, 6개 내지 18개의 아미노산, 6개 내지 14개의 아미노산, 6개 내지 12개의 아미노산, 6개 내지 10개의 아미노산, 6개 내지 8개의 아미노산, 8개 내지 24개의 아미노산, 8개 내지 20개의 아미노산, 8개 내지 18개의 아미노산, 8개 내지 14개의 아미노산, 8개 내지 12개의 아미노산, 8개 내지 10개의 아미노산, 10개 내지 24개의 아미노산, 10개 내지 20개의 아미노산, 10개 내지 18개의 아미노산, 10개 내지 14개의 아미노산, 10개 내지 12개의 아미노산, 12개 내지 24개의 아미노산, 12개 내지 20개의 아미노산, 12개 내지 18개의 아미노산, 12개 내지 14개의 아미노산, 14개 내지 24개의 아미노산, 14개 내지 20개의 아미노산, 14개 내지 18개의 아미노산, 18개 내지 24개의 아미노산, 18개 내지 20개의 아미노산 또는 20개 내지 24개의 아미노산의 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 링커는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 길이의 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 상기 링커는 길이 12개 내지 18개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 길이 12개 내지 18개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 길이 15개 내지 18개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 길이 18개의 아미노산이다.
일부 구현예에서, 상기 비-절단성 링커는 프로테아제에 의한 절단에 대해 특이적으로 인식되는 기질 인식 부위를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제는 면역 효과기 세포(immune effector cell)에 의해서, 종양에 의해서 상기 종양 미세 환경 중에 존재하는 세포에 의해서 생성된다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제는 면역 효과기 세포에 의해서 생성되고 상기 면역 효과기 세포는 활성화된 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 또는 NK T 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제는 매트립타아제(matriptase), 기질금속단백질분해효소(matrix metalloprotease; MMP), 그랜자임 B, 및 이들의 조합 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 프로타제는 그랜자임 B이다.
일부 구현에에서, 상기 링커는 아미노산 서열 GS, GGS, GGGGS(서열번호 149), GGGGGS(서열번호 135) 및 그들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 아미노산 서열 (GGS)n을 포함하되, 상기 n은 1 내지 10이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 아미노산 서열 (GGGGS)n(서열번호 173)을 포함하되, 상기 n은 1 내지 10이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 아미노산 서열 (GGGGGS)n(서열번호 172)을 포함하되, 상기 n은 1 내지 4이다.
일부 구현예에서, 상기 링커는 GGS이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 GGGGS(서열번호 149)이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 GGGGGS(서열번호 135)이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 GGSGGS("(GGS)2")(서열번호 10)이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 GGSGGSGGS("(GGS)3")(서열번호 11)이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 GGSGGSGGSGGS("(GGS)4")(서열번호 12)이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 GGSGGSGGSGGSGGS("(GGS)5")(서열번호 13)이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119)이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 GGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 147)이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 170)이거나 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 GGGGG(서열번호 192)이거나 그를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항원 결합 도메인 및 상기 제 1 구성요소의 면역글로불린 Fc 영역(일부 경우에서는 상기 제 1 항원 결합 도메인임)은 하나 이상의 추가 아미노산 링커(본원에서 '인트라-구성요소 링커(intra-component linker)'라 함)를 통해서 작동가능하게 연결된다. 상기 제 1 구성요소의 인트라-구성요소 펩티드 링커('LP1'이라고도 함)은 섹션 II.3에서 기술된 임의의 펩티드 링커일 수 있다. 제 1 구성요소에 존재하는 상기 인트라-구성요소 링커, 즉 상기 Fc 영역과 항원 결합 도메인을 연결하는 것은 다양한 길이, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 인트라-구성요소 링커는 본원에서 GS-링커로 표시되는 아미노산 글리신 및 세린으로 주로 구성된다. 일부 구현예에서, 상기 GS-링커는 GGSGGS, 즉 (GGS)2(서열번호　10); GGSGGSGGS, 즉 (GGS)3(서열번호　11); GGSGGSGGSGGS, 즉 (GGS)4(서열번호　12); 및 GGSGGSGGSGGSGGS, 즉 (GGS)5(서열번호　13)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 적어도 (i) 상기 이종이량체 Fc 영역의 상기 제 1 Fc 폴리펩티드, 상기 링커 및 상기 항-CD3 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 상기 VH 도메인을 포함하는 제 1 폴리펩티드; 및 (ii) 상기 이종이량체 Fc 영역의 상기 제 2 Fc 폴리펩티드, 상기 링커 및 상기 항-CD3 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 상기 VL 도메인의 제 2 폴리펩티드를 포함하되, 상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드의 하나 또는 둘 다는 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 적어도 하나의 항원-결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 상기 VH는 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 상기 적어도 하나의 항원-결합 도메인과 동일한 폴리펩티드 상에 있다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 상기 VL을 포함하는 상기 폴리펩티드는 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 상기 적어도 하나의 항원-결합 도메인을 포함하지 않는다. 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 항원-결합 도메인은 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 상기 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치된다.
일부 구현예에서, 상기 제 2 구성요소는 상기 CD3 결합 영역의 하나 이상의 카피를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항-CD3 결합 도메인은 CD3, 예를 들어 CD3ε에 결합하거나 관여할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 하나 이상의 카피를 포함하는 항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 항체 또는 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체, 및 단일 도메인 경쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 이의 항원-결합 단편의 하나 이상의 카피를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항-CD3 결합 도메인은 CD3ε(본원에서 항-CD3ε Fv 단편으로 언급됨)에 결합하는 Fv 항체 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3ε Fv 항체 단편은 서열번호 32-81, 191, 196-200, 211, 및 212의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3ε Fv 항체 단편은 서열번호 32-81, 191, 196-200, 211, 및 212로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3ε Fv 항체 단편은 서열번호 32-62, 196-198, 및 211의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 및 서열번호 63-81, 191, 199, 200, 및 212로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3ε Fv 항체 단편은 서열번호 32-62, 196-198, 및 211로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열 및 서열번호 63-81, 191, 199, 200, 및 212로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3ε Fv 항체 단편은 이황화 안정화 항-CD3 결합 Fv 단편(dsFv)이다.
일부 구현예에서, 제 1 구성요소는 항원-결합 도메인의 하나 이상의 카피를 포함한다. 특정 구현예에서, 제 1 구성요소는 2개의 항원 결합 도메인과 같은, 적어도 2개의 항원 결합 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 제 1 구성요소의 적어도 2개의 항원 결합 도메인은 동일한 TAA에 결합한다. 일부의 경우, 제 1 구성요소의 적어도 2개의 항원 결합 도메인은 동일한 TAA의 상이한 에피토프들(epitopes)에 결합한다. 일부의 경우, 제 1 구성요소의 적어도 2개의 항원 결합 도메인은 동일한 TAA의 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 제 1 구성요소의 적어도 2개의 항원 결합 도메인은 상이한 TAA들에 결합한다.
일부 구현예에서, 제 2 구성요소는 항원-결합 도메인의 하나 이상의 카피를 포함한다. 특정 구현예에서, 제 2 구성요소는 2개의 항원 결합 도메인과 같은, 적어도 2개의 항원 결합 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 제 2 구성요소의 적어도 2개의 항원 결합 도메인은 동일한 TAA에 결합한다. 일부의 경우, 제 2 구성요소의 적어도 2개의 항원 결합 도메인은 동일한 TAA의 상이한 에피토프들에 결합한다. 일부의 경우, 제 2 구성요소의 적어도 2개의 항원 결합 도메인은 동일한 TAA의 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 제 2 구성요소의 적어도 2개의 항원 결합 도메인은 상이한 TAA들에 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 제 1 구성요소는 제 1 항원 결합 도메인을 함유하고 상기 제 2 구성요소의 상기 항원 결합 도메인은 제 2 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 상기 다중특이적 항원 결합 도메인은 적어도 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인을 포함하되, 상기 제 1 항원 도메인 및 제 2 항원 도메인은 상기 동일한 TAA에 결합한다. 일부 경우에, 상기 제 1 항원 결합 도메인 및 상기 제 2 항원 결합 도메인은 상기 동일한 TAA의 상이한 에피토프와 결합한다. 일부 경우에 있어서, 상기 제 1 항원 도메인 및 제 2 항원 도메인은 상기 동일한 TAA의 동일한 에피토프와 결합한다. 일부 구현에에서, 상기 다중특이적 항원 결합 도메인은 적어도 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인을 포함하되, 상기 제 1 항원 결합 도메인 및 상기 제 2 항원 결합 도메인은 상이한 TAA와 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 제 2 구성요소의 상기 항원 결합 도메인(일부 경우에 상기 제 2 항원 결합 도메인임) 및 상기 CD3 결합 영역은 하나 이상의 추가 아미노산 링커(본원에서 '인트리-구성요소 링커'라고 함)를 통해서 작동가능하게 연결된다.
상기 제 2 구성요소의 인트라-구성요소 펩티드 링커('LP2'라고도 함)은 섹션 II.3에서 기술된 임의의 펩티드 링커일 수 있다. 상기 제 2 구성요소에 존재하는 상기 인트라-구성요소 링커, 즉 상기 CD3 결합 영역과 항원 결합 도메인을 연결하는 것은 다양한 길이, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제 2 구성요소의 상기 인트라-구성요소 링커는 본원에서 GS-링커로 표시되는 아미노산 글리신 및 세린으로 주로 구성된다. 일부 구현예에서, GS-링커는 GGSGGS, 즉, (GGS)2(서열번호 10); GGSGGSGGS, 즉, (GGS)3(서열번호 11); GGSGGSGGSGGS, 즉, (GGS)4(서열번호 12); 및 GGSGGSGGSGGSGGS, 즉, (GGS)5(서열번호 13)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트가 본원에 제공되며, 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 이종이량체 Fc 영역을 포함하는 제 1 구성요소 및 가변 중쇄 영역(VH) 및 가변 경쇄 영역(VL)을 포함하는 항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 제 2 구성요소를 포함하며, 여기서 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 VH 및 VL은 이종이량체 Fc의 반대편 폴리펩티드에 연결되고; 제 1 및 제 2 구성요소는 링커에 의해 결합되며, 이종이량체 Fc 영역은 항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편에 대해 N-말단에 위치하고; 그리고 제 1 및 제 2 구성요소 중 하나 또는 둘 다는 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 링커는 최대 50개의 아미노산 길이의 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 최대 25개의 아미노산 길이의 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 최대 15개의 아미노산 길이의 폴리펩티드이다.
상기 제공된 구현예 중의 어느 것에서, TAA에 결합하는 상기 하나 이상의 항원-결합 도메인은 상기 TAA에 대한 1가, 2가, 3가 또는 4가 결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, TAA에 결합하는 하나이상의 항원 결합 도메인은 독립적으로 sdAb, scFv 또는 Fab로부터 선택된다. 일부 구현예에서, TAA에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인은 VH 및 VL을 함유하는 단일 사슬 항체 단편, 예를 들어 sdAb 또는 scFv와 같은 단일 사슬 분자이다. 일부 구현예에서, TAA에 결합하는 상기 하나 이상의 항원-결합 도메인은 sdAb, 예를 들어 VHH 또는 VHNAR이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인 중 적어도 하나는 VH-CH1(Fd)를 포함하는 제 1 사슬 및 VL-CL을 포함하는 제 2 사슬을 함유하는 Fab이다.
일부 구현예에서, TAA에 결합하는 항원 결합 도메인은 상기 항-CD3 결합 도메인의 VH에 부착된다. 일부 구현예에서, TAA에 결합하는 항원 결합 도메인은 상기 항-CD3 결합 도메인의 VH가 부착되는 이종이량체 Fc의 동일측(예를 들어 노브(knob) 또는 홀(hole))에 부착된다. 일부 구현예에서, TAA에 결합하는 항원 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인의 VH에 부착된 sdAb이다. 일부 구현예에서, TAA에 결합하는 항원 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인의 VH가 부착되는 VHH 또는 VHNAR이다. 일부 구현예에서, TAA에 결합하는 항원 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인의 VH가 부착되는 이종이량체 Fc의 동일측(예를 들어 노브 또는 홀)에 부착되는 VHH 또는 VHNAR이다. 일부 구현예에서, TAA에 결합하는 항원 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인의 VH에 부착된 VHH이다. 일부 구현예에서, TAA에 결합하는 항원 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인의 VH가 부착되는 이종이량체 Fc의 동일측(예를 들어 노브 또는 홀)에 부착된 VHH이다. 일부 구현예에서, TAA에 결합하는 항원 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인의 VH에 부착된 VHNAR이다. 일부 구현예에서, TAA에 결합하는 항원 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인의 VH가 부착되는 상기 동일측(예를 들어 노브 또는 홀) 또는 상기 Fc 도메인에 부착된 VHNAR이다.
일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 적어도, (i) 이종이량체 Fc 영역의 제 1 Fc 폴리펩티드, 링커 및 항-CD3 결합 도메인 또는 항원 결합 단편의 VH 도메인을 포함하는 제 1 폴리펩티드; 및 (ii) 이종이량체 Fc 영역의 제 2 Fc 폴리펩티드, 링커 및 항-CD3 결합 도메인 또는 항원 결합 단편의 VL 도메인을 포함하는 제 2 폴리펩티드를 포함하되, 상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드 중의 하나 또는 둘 다는 종양 관련된 항원(TAA)에 결합하는 적어도 하나의 항원-결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 또는 제 2 폴리펩티드 중의 하나만이 TAA에 결합하는 적어도 하나의 항원-결합 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인(들) 중 적어도 하나는 Fab이다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는: (i) 이종이량체 Fc 영역의 제 1 Fc 폴리펩티드, 링커 및 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 VH 도메인을 포함하는 제 1 폴리펩티드; (ii) 이종이량체 Fc 영역의 제 2 Fc 폴리펩티드, 링커 및 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 VL 도메인을 포함하는 제 2 폴리펩티드 및 (iii) 종양-관련 항원에 결합하는 Fab 항체단편의 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL을 포함하는 제 3 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제 1 및/또는 제 2 폴리펩티드는 Fab 항체 단편의 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL 중 나머지 다른 하나를 더 포함한다. 일부의 경우, 제 1 또는 제 2 폴리펩티드의 단 하나만이 Fab 항체 단편의 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL 중 나머지 다른 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 또는 제 2 폴리펩티드 둘 다는 Fab 항체 단편의 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL 중 나머지 다른 하나를 포함한다. 일부의 경우, Fab 항체 단편의 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL 중 다른 하나는 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치하고/하거나 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 제 1 또는 제 2 폴리펩티드 중의 하나에서 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, Fab 항체 단편의 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL 중 다른 하나는 제 1 폴리펩티드 또는 제 2 폴리펩티드의 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치하고 제 1 또는 제 2 폴리펩티드 중 다른 하나는 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 Fc 영역에 대한 아미노-말단에 위치되고/되거나 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 제 1 또는 제 2 폴리펩티드 중의 하나의 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치되고 제 2 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 컨스트럭트의 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치된다. 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 sdAb이다. 일부 구현예에서, sdAb인 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 컨스트럭트의 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치된다. 일부 구현예에서, sdAb인 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 컨스트럭트의 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 VHH이다. 일부 구현예에서, VHH인 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 컨스트럭트의 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치된다. 일부 구현예에서, VHH인 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 컨스트럭트의 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치된다.
일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 제 1 항원 결합 도메인과 면역글로불린 Fc 폴리펩티드 영역(Fc 영역) 사이에 제 1 연결 펩티드(LP1)를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 항-CD3 결합 도메인(CD3 결합 영역)과 제 2 항원 결합 도메인 사이에 제 2 연결 펩티드(LP2)를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 제 1 항원 결합 도메인과 면역글로불린 Fc 폴리펩티드 영역(Fc 영역) 사이에 제 1 연결 펩티드(LP1) 및 항-CD3 결합 도메인(CD3 결합 영역)과 제 2 항원 결합 도메인 사이에 제 2 연결 펩티드(LP2)를 포함한다.
일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 다음과 같은 구조적 배열을 갖는다: 제 1 항원 결합 도메인 - LP1 - 면역글로불린 Fc 폴리펩티드 링커 영역(Fc 영역) - 링커 - 항-CD3 결합 도메인 - LP2 - 제 2 항원 결합 도메인. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 다음과 같은 구조적 배열을 갖는다: 제 2 항원 결합 도메인 - LP2 - 면역글로불린 Fc 폴리펩티드 링커 영역 - 링커 - 항-CD3 결합 도메인(CD3 결합 영역) - LP1 - 제 1 항원 결합 도메인.
일부 구현예에서, 2개의 연결 펩티드 LP1 및 LP2는 서로 동일하지 않다. 일부의 경우, LP1 또는 LP2는 독립적으로 약 1개 내지 20개의 아미노산 길이의 펩티드이다. 일부 구현예에서, LP1 또는 LP2는 독립적으로 서열번호 10-13, 119, 135, 147, 149에 기재된 바와 같은 임의의 Gly-Ser 링커이거나 이를 포함하는 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 다중특이적 컨스트럭트는 도 1에 나타낸 임의의 구조적 배열을 갖는 컨스트럭트이다. 일부 구현예에서, 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 다음과 같은 구조적 배열을 갖는 이중특이적 컨스트럭트이다. 이중특이적 컨스트럭트의 N-말단 끝은 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 제 1 항원 결합 도메인을 포함한다. 제 1 결합 도메인은 TAA 표적 상의 제 1 에피토프에 결합한다. 제 1 항원 결합 도메인에는 FcηR 상호작용 및/또는 FcRn 상호작용을 조절하는 중심 면역글로불린 Fc 폴리펩티드 영역이 결합된다. 일부 구현예에서, 중심 면역글로불린 Fc 폴리펩티드 영역은 이종이량체이다. 면역글로불린 Fc 폴리펩티드 영역은 면역글로불린 Fc 폴리펩티드 영역의 말단에 대한 위치 C-말단에 위치한 링커에 결합된다. 상기 링커는 Fc 영역에 대해 C-말단에 위치한 항-CD3 결합 서열에 부착되고, 일부의 경우, 제 2 구성요소의 원위 말단에 부착된다. 이중특이적 컨스트럭트의 C-말단은 TAA에 결합하는 제 2 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 2 항원 결합 도메인은 상기 제 1 구성요소 내에 위치된 상기 제 1 항원 결합 도메인과 동일한 TAA에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 제 2 항원 결합 도메인은 상기 TAA 상의 제 2 에피토프와 결합하되, 상기 제 2 에피토프는 상기 TAA 상의 제 1 에피토프와 비-경쟁적(non-competitive)이다. 일부 구현예에서, 상기 제 2 항원 결합 도메인은 상기 제 1 항원 결합 도메인과 구별되는 TAA에 결합한다.
상기 제공된 구현예의 일부 임의의 것에서, 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편은 Fv 항체 단편이다. 일부 구현예에서, Fv 항체 단편은 이황화 안정화 항-CD3 결합 Fv 단편(dsFv)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 서열은 가변 중쇄(VH)와 가변 경쇄(VL) 영역 사이에 이황화 결합을 포함하도록 조작된 것을 갖는 Fv 항체 단편이고, 이에 의해 이황화 안정화 항-CD3 결합 Fv 단편(dsFv)을 생성한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 Fv를 포함하는 VH 및 VL 도메인은 이종이량체 Fc 영역의 반대편 멤버에 작동가능하게 연결된다. 이러한 구현예에서, 항-CD3 Fv는 1가 방식으로 CD3에 결합한다. 제공된 일부 측면에서, 상기 항-CD3 dsFv는 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트가 동족 항원(cognate antigen)에 결합되지 않는한 CD3에 관여하지 않는다.
일부 구현예에서, 이중특이적 컨스트럭트의 제 1 항원 결합 도메인과 제 2 항원 결합 도메인 각각은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 컨스트럭트의 제 1 항원 결합 도메인과 제 2 항원 결합 도메인 각각은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체, 및 단일 도메인 경쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인, 또는 항원 결합 도메인들의 독립적으로 각각은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체, 및 단일 도메인 경쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 컨스트럭트의 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인 각각은 하나 이상의 단일 도메인 항체(sdAb) 단편, 예를 들어 VHH, VNAR, 조작된 VH 또는 VK 도메인의 하나 이상의 카피를 포함한다. VHH는 천연 낙타 중쇄 전용 항체, 중쇄 전용 항체를 생산하는 유전적으로 변형된 설치류, 또는 나이브(naive)/합성 낙타 또는 인간화 낙타 단일 도메인 항체 라이브러리로부터 제조될 수 있다. VNAR은 연골 어류 중쇄 전용 항체로부터 제조될 수 있다. 인터페이스 공학 및 특정 생식계열 패밀리의 선택을 포함하는, 통상적으로 이종이량체 VH 및 VK 도메인으로부터 단량체 sdAb를 제조하기 위한 다양한 방법이 구현되었다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 sdAb이다. 일부 경우에, sdAb는 인간 또는 인간화 sdAb이다. 일부 측면에서, sdAb는 VHH, VNAR, 조작된 VH 도메인 또는 조작된 VK 도메인이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 scFv이다. 일부의 경우, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fab이다.
제공된 임의의 구현예 중 일부에서, 항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편은 아미노산 서열 TYAMN(서열번호 16)을 포함하는 VH CDR1; 아미노산 서열 RIRSKYNNYATYYADSVKD(서열번호 17)를 포함하는 VH CDR2; 아미노산 서열 HGNFGNSYVSWFAY(서열번호 18)를 포함하는 VH CDR3, 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 19)을 포함하는 VL CDR1; 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 20)를 포함하는 VL CDR2; 및 아미노산 서열 ALWYSNLWV(서열번호 21)를 포함하는 VL CDR3를 포함한다.
상기 제공된 임의의 구현예 중 일부에서, 항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편은 아미노산 서열 GFTFNTYAMN(서열번호 211)을 포함하는 VH CDR1; 아미노산 서열 RIRSKYNNYATy(서열번호 212)를 포함하는 VH CDR2; 아미노산 서열 HGNFGNSYVSWFAy(서열번호 18)를 포함하는 VH CDR3, 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 19)을 포함하는 VL CDR1; 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 20)를 포함하는 VL CDR2; 및 아미노산 서열 ALWYSNLWV(서열번호 21)를 포함하는 VL CDR3를 포함한다.
상기 제공된 임의의 구현예 중 일부에서, 항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편은 적어도 아미노산 서열 GFTFNTYAMN(서열번호 211)을 포함하는 VH CDR1; 적어도 아미노산 서열 RIRSKYNNYATy(서열번호 212)를 포함하는 VH CDR2; 적어도 아미노산 서열 HGNFGNSYVSWFAy(서열번호 18)를 포함하는 VH CDR3, 적어도 아미노산 서열 GSSTGAVTTSNYAN(서열번호 229)을 포함하는 VL CDR1; 적어도 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 230)를 포함하는 VL CDR2; 및 적어도 아미노산 서열 ALWYSNLWV(서열번호 225)를 포함하는 VL CDR3를 포함한다.
상기 제공된 임의의 구현예 중 일부에서, 항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호 14, 32-62, 196-198, 및 211의 아미노산 서열 또는 서열번호 14, 32-62, 196-198, 및 211과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 서열을 갖는 VH; 및 서열번호 15, 63-81, 191, 199, 200, 및 212의 아미노산 서열 또는 서열번호 15, 63-81, 191, 199, 200, 및 212와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 서열을 갖는 VL을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편은 Fv이다. 일부 구현예에서, 항-CD3 Fv는, 서열번호 14, 32-43, 45-47, 48, 196 및 211의 아미노산 서열 또는 서열번호 14, 32-43, 45-47, 48, 196 및 211과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 서열을 갖는 VH; 및 서열번호 15, 63, 65-71, 73, 75, 77, 및 199의 아미노산 서열 또는 서열번호 15, 63, 65-71, 73, 75, 77, 및 199와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 서열을 갖는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD3 dsFv는 서열번호 14의 아미노산 서열 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 경우에, 상기 항-CD3 Fv는 서열번호 196의 아미노산 서열 및 서열번호 199의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CD3 결합 도메인의 VH 및 VL 사슬 영역은 각각 독립적으로 적어도 하나의 아미노산 변형체(amino acid modification)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CD3 결합 도메인의 VH 및 VL 사슬 영역의 적어도 하나의 아미노산 변형체는 상기 CD3 결합 도메인의 안정성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 상기 CD3 결합 도메인의 VH 및 VL 사슬 영역의 적어도 하나의 아미노산 변형체는 CD3을 결합하는 상기 CD3 결합 도메인의 안정성을 증가시킨다. 상기 CD3 결합 도메인의 VH 및 VL 사슬 영역의 적어도 하나의 아미노산 변형체는 상기 VH 및 VL 사슬 영역 사이에 이황화 결합을 생성함으로써 상기 CD3 결합 도메인의 안정성을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 상기 CD3 결합 영역은 상기 VH 및 VL 사슬 영역 사이에 이황화 안정화된 결합(disulfide stabilized linkage)을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편은 이황화 안정화된 Fv(dsFv)이다. 일부 구현예에서, 이황화 안정화된 항-CD3 Fv는 카밧 번호매김에 의한 돌연변이체 44 내지 Cys를 갖는 항-CD3 VH 및 돌연변이체 100 내지 Cys를 갖는 항-CD3 VL를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이황화 안정화된 항-CD3 Fv는 카밧 번호매김에 의한 돌연변이체 G44C를 갖는 항-CD3 VH 및 돌연변이체 G100C를 갖는 항-CD3 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이황화 안정화된 항-CD3 Fv는 카밧 번호매김에 의한 위치 105 내지 Cys에서 돌연변이체를 갖는 항-CD3 VH 및 돌연변이체 위치 43 내지 Cys를 갖는 항-CD3 VL을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3 dsFv는, 서열번호 44, 49-62, 197 및 198의 아미노산 서열 또는 서열번호 44, 49-62, 197 및 198과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 서열을 갖는 VH; 및 서열번호 64, 72, 74, 76, 78-81, 191, 200 및 212의 아미노산 서열 또는 서열번호 64, 72, 74, 76, 78-81, 191, 200 및 212와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 서열을 갖는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 상기 항-CD3 dsFv는 서열번호 44의 아미노산 서열 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 dsFv는 서열번호 198의 아미노산 서열 및 서열번호 200의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 dsFv는 서열번호 197의 아미노산 서열 및 서열번호 200의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 다중특이적 컨스트럭트는 또한 다중특이적 컨스트럭트에 결합된 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 치료제이다. 일부 구현예에서, 제제는 검출가능한 모이어티이다. 일부 구현예에서, 검출가능한 모이어티은 진단제이다. 일부 구현예에서, 제제는 링커를 통해 다중특이적 컨스트럭트에 결합된다. 일부 구현예에서, 링커는 비-절단성 링커이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 다중특이적 컨스트럭트는 하나 이상의 추가 제제 또는 추가 제제의 조합과 함께 투여된다. 적합한 추가 제제는 예를 들어 암과 같은 의도된 적용을 위한 현재의 약학 및/또는 외과적 치료법을 포함한다. 예를 들어 다중특이적 컨스트럭트는 추가의 화학요법제 또는 항-신생물제와 함께 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 다중특이적 컨스트럭트와 추가 제제는 단일 치료 조성물로 제형화되고, 다중특이적 컨스트럭트와 추가 제제는 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 다중특이적 컨스트럭트와 추가 제제는 서로 분리되어 있고, 예를 들어 각각 개별적인 치료 조성물로 제형화되며, 그리고 다중특이적 컨스트럭트와 추가 제제는 동시에 투여되거나, 또는 다중특이적 컨스트럭트와 추가 제제는 치료요법 동안 상이한 시간에 투여된다. 예를 들어 다중특이적 컨스트럭트는 추가 제제의 투여 전에 투여되거나, 다중특이적 컨스트럭트는 추가 제제의 투여 후에 투여되거나, 다중특이적 컨스트럭트와 추가 제제는 교대로 투여된다. 본원에 기재된 바와 같이, 다중특이적 컨스트럭트와 추가 제제는 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 투여된다.
일부 구현예에서, 다중특이적 컨스트럭트는 자연발생적으로 하나 이상의 이황화 결합을 함유한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 컨스트럭트는 하나 이상의 이황화 결합을 포함하도록 조작될 수 있다.
본 발명은 또한, 예를 들어 적어도 다중특이적 컨스트럭트의 제 1 구성요소의 적어도 일부를 코딩하는 제 1 핵산 및 다중특이적 컨스트럭트의 제 2 구성요소의 적어도 일부를 코딩하는 제 2 핵산과 같은, 본원에 기재된 다중특이적 컨스트럭트의 적어도 일부를 코딩하는 분리된 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드 및/또는 본원에 기재된 다중특이적 컨스트럭트를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자, 및 이러한 분리된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
제공된 구현예 중에는 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)이 있다. 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 중 임의의 것의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다. 제공된 다중특이적 컨스트럭트 중 임의의 것의 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 제 1 핵산 서열 및 다중특이적 컨스트럭트의 제 2 폴리펩티드를 코딩하는 제 2 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이고, 여기서 제 1 및 제 2 핵산 서열은 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 또는 자가-절단 펩티드 또는 리보솜 스킵핑(skipping)을 야기하는 펩티드를 코딩하는 핵산에 의해 분리된다. 일부의 경우, 제 1 핵산 서열 및 제 2 핵산 서열은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 제 3 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 추가로 다중특이적 컨스트럭트의 제 3 폴리펩티드를 코딩하는 제 3 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 3 핵산은 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 또는 자가-절단 펩티드 또는 리보솜 스킵핑을 야기하는 펩티드를 코딩하는 핵산에 의해 제 1 및/또는 제 2 폴리펩티드로부터 분리되고/되거나 제 3 핵산 서열은 제 1 및/또는 제 2 핵산 서열과 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 자가-절단성 펩티드 또는 리보솜 스킵핑을 야기하는 펩티드를 코딩하는 핵산은 T2A, P2A, E2A 또는 F2A(서열번호 159 내지 164, 또는 서열번호 165에 기재된 서열에 의해 코딩됨)로부터 선택된다.
임의의 제공된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터 또는 진핵생물 벡터이고, 선택적으로 진핵생물 벡터는 포유동물 벡터이다.
임의의 제공된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. 일부의 경우, 세포는 재조합 또는 분리된 것이다. 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 HEK293 또는 CHO 세포이다.
본 발명은 다중특이적 컨스트럭트의 발현을 야기하는 조건 하에서 세포를 배양하여 다중특이적 컨스트럭트를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 세포는 이러한 핵산 분자(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 이러한 벡터를 포함한다.
다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 생산하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 임의의 제공된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 세포에 도입하는 단계 및 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 생산하기 위해 다중특이적 컨스트럭트의 발현을 야기하는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 또한, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 임의의 제공된 세포를 다중특이적 폴리펩티드가 상기 세포에 의해 발현 또는 생산되는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함한다. 일부의 경우, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 HEK293 또는 CHO 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포로부터 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 분리 또는 정제하는 단계를 더 포함한다. 일부의 경우, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 이종이량체이다.
임의의 제공된 방법에 의해 생산되는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트가 본원에 제공된다.
면역 반응을 자극 또는 유도하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 표적 세포와 T 세포를 임의의 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 또는 약학 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 표적 세포는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트에 의해 인식되는 종양 관련 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 종양 관련 항원(TAA)을 발현하는 종양 세포이다.
일부 구현예에서, 접촉은 탈체(ex vivo) 또는 생체 외(in vitro)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 접촉은 대상체의 생체 내(in vivo)에서 수행된다.
치료학적으로 유효한 양의 임의의 제공된 다중특이적 콘쥬게이트 또는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 면역반응을 자극 또는 유도하는 방법이 제공된다. 일부의 경우, 방법은 세포-매개 면역성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 방법은 T-세포 활성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 방법은 세포용해성 T-세포(CTL) 활성을 증가시킨다. 일부 예에서, 면역반응은 종양 또는 암에 대해 증가된다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체의 질병 또는 질환을 치료한다.
본 발명은 또한 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 치료 또는 예방이 요구되는 대상체에 투여함으로써, 하나 이상의 병리의 진행을 치료 예방, 지연시키거나, 다르게는 이의 병태를 개선하거나, 이러한 병리와 관련된 병태를 완화시키는 방법을 제공한다. 치료학적으로 유효한 양의 임의의 제공된 다중특이적 콘쥬게이트 또는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 질병 또는 질환을 치료하는 방법이 본원데 제공된다. 일부 구현예에서, 질병 또는 질환은 종양 또는 암이다.
제공된 방법 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 개체, 예를 들어 치료될 대상체는, 예를 들어 인간 또는 다른 포유동물이다. 제공된 방법 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 비-인간 포유동물, 예를 들어 비-인간 영장류, 반려동물(예를 들어 고양이, 개, 말), 농장동물, 업무동물(work animal), 또는 동물원 동물이다. 일부 구현예에서, 대상체는 설치류이다.
이러한 방법 및 용도의 구현예 중 임의의 것에 사용되는 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 질환의 임의의 단계에서 투여될 수 있다. 예를 들어 이러한 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 초기부터 전이까지 임의의 단계의 암을 앓고 있는 환자에게 투여될 수 있다. 용어 개체 및 환자는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
이러한 방법 및 용도의 구현예 중 임의의 것에 사용되는 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 신보강 치료법(neoadjuvant therapy)을 포함하는 치료요법에 사용될 수 있다.
이러한 방법 및 용도의 구현예 중 임의의 것에 사용되는 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 단독 또는 소분자 억제제, 다른 항체-기반 치료제, 폴리펩티드 또는 펩티드-기반 치료제, 핵산-기반 치료제 및/또는 다른 생물학적 제제를 포함하는, 하나 이상의 추가 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 비-제한적인 예로, 화학요법제, 예를 들어 알킬화제, 항-대사산물, 항-미소관제(anti-microtubule agent), 토포이소머라아제 억제제, 세포독성 항생제, 및 임의의 다른 핵산 손상제와 같은 하나 이상의 추가 제제와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 추가 제제는 탁산, 예를 들어 파클리탁셀(예를 들어 Abraxane®)이다. 일부 구현예에서, 추가 제제는 항-대사산물, 예를 들어 젬시타빈이다. 일부 구현예에서, 추가 제제는 알킬화제, 예를 들어 카보플라틴 또는 시스플라틴과 같은 백금-기반 화학요법이다. 일부 구현예에서, 추가 제제는 표적화 제제, 예를 들어 키나아제 억제제, 예를 들어 소라페닙 또는 엘로티닙이다. 일부 구현예에서, 추가 제제는 표적화 제제, 예를 들어 또 다른 항체, 예를 들어 단일클론 항체(예를 들어 베바시주맙), 이중특이적 항체, 또는 다중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 추가 제제는 프로테아좀 억제제, 예를 들어 보르테조미브 또는 카르필조밉이다. 일부 구현예에서, 추가 제제는 면역 조절제, 예를 들어 레날리도마이드 또는 IL-2이다. 일부 구현예에서, 추가 제제는 방사선이다. 일부 구현예에서, 추가 제제는 통상의 기술자에 의해 치료 표준으로 간주되는 제제이다. 일부 구현예에서, 추가 제제는 통상의 기술자에게 잘 알려진 화학요법제이다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 추가 제제(들)는 단일 조성물로 제형화된다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 추가 제제(들)는 2개 또는 그 이상의 개별적인 조성물로 투여된다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 추가 제제(들)는 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 추가 제제(들)는 순차적으로 투여된다.
일부 구현예에서, 추가 제제(들)는 화학요법제, 예를 들어 도세탁셀, 파클리탁셀, 아브락산(즉, 알부민-접합 파클리탁셀), 독소루비신, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 시스플라틴, 이리노테칸, 및 젬시타빈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법제이다.
일부 구현예에서, 추가 제제(들)는 관문 억제제(checkpoint inhibitor), 키나아제 억제제, 종양 미세 환경에서 억제제를 표적하는 제제, 및/또는 T 세포 또는 NK 작용제이다. 일부 구현예에서, 추가 제제(들)는 단독, 또는 화학요법제 또는 항-신생물제와 같은 다른 추가 제제(들)와 조합된 방사선요법이다. 일부 구현예에서, 추가 제제(들)는 백신, 종양 바이러스, 및/또는 DC-활성화제, 예를 들어 비-제한적인 예로, 톨-유사 수용체(TLR) 작용체 및/또는 α-CD40이다. 일부 구현예에서, 추가 제제(들)는 ADCC를 통해 또는 독소에 대한 직접적인 접합(예를 들어 항체 약물 콘쥬게이트(ADC))을 통해 종양을 사멸시키도록 설계된 종양-표적화된 항체이다.
일부 구현예에서, 관문 억제제는 CTLA-4, LAG-3, PD-1, PDL1, TIGIT, TIM-3, B7H3, B7H4, 및 비스타로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적의 억제제이다. 일부 구현예에서, 키나아제 억제제는 B-RAFi, MEKi, 및 Btk 억제제, 예를 들어 이브루티닙으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 키나아제 억제제는 크리조티닙이다. 일부 구현예에서, 종양 미세 환경 억제제는 IDO 억제제, α-CSF1R 억제제, α-CCR4 억제제, TGF-베타, 골수-유래 억제자 세포, 또는 T-조절 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 작용제는 OX40, GITR, CD137, CD28, ICOS, CD27, 및 HVEM으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 관문 억제제는 CTLA-4, PD-1, 및/또는 PD-L1로부터 선택되는 표적에 결합하는 항체이다. 일부 구현예에서, 관문 억제제는 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체, 및 항-PD-L1 항체, 및/또는 이의 조합이다. 일부 구현예에서, 관문 억제제는 예를 들어 Yervoy™와 같은 항-CTLA4 항체이다. 일부 구현예에서, 관문 억제제는, 예를 들어 Opdivo™ 및/또는 Keytruda™와 같은 항-PD-1 항체이다.
일부 구현예에서, 억제제는 CTLA-4 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 LAG-3 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 PD-1 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 PDL1 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 TIGIT 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 TIM-3 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 B7H3 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 B7H4 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 비스타 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 B-RAFi 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 MEKi 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 Btk 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 이브루티닙이다. 일부 구현예에서, 억제제는 크리조티닙이다. 일부 구현예에서, 억제제는 IDO 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 α-CSF1R 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 α-CCR4 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 TGF-베타이다. 일부 구현예에서, 억제제는 골수-유래 억제자 세포이다. 일부 구현예에서, 억제제는 T-조절 세포이다.
일부 구현예에서, 작용제는 OX40이다. 일부 구현예에서, 작용제는 GITR이다. 일부 구현예에서, 작용제는 CD137이다. 일부 구현예에서, 작용제는 CD28이다. 일부 구현예에서, 작용제는 ICOS이다. 일부 구현예에서, 작용제는 CD27이다. 일부 구현예에서, 작용제는 HVEM이다.
일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 예를 들어 화학요법제, 항-염증제, 및/또는 면역억제제와 같은 하나 이상의 추가 제제와 조합하여 치료 동안 및/또는 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 추가 제제는 단일 치료-조성물로 제형화되고, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 추가 제제는 동시에 투여된다. 다르게는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 추가 제제는 서로 분리되어 있고, 예를 들어 각각은 개별적인 치료 조성물로 제형화되며, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 추가 제제는 동시에 투여되거나, 또는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 추가 제제는 치료요법 동안 상이한 시간에 투여된다. 예를 들어 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 추가 제제의 투여 전에 투여되거나, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 추가 제제의 투여 후에 투여되거나, 또는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 추가 제제는 교대로 투여된다. 본원에 기재된 바와 같이, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 추가 제제는 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 투여된다.
일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 추가 제제(들)는 동시에 투여된다. 예를 들어 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 추가 제제(들)는 단일 조성물로 제형화될 수 있거나 2개 또는 그 이상의 개별적인 조성물로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 추가 제제(들)는 순차적으로 투여되거나, 또는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 추가 제제는 치료요법 동안 상이한 시간에 투여된다.
상기 기재된 요소 이외에, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는, 예를 들어 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 N- 또는 C-말단의 아미노산 서열과 같은 추가 요소를 함유할 수 있다. 예를 들어 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 관심있는 세포 또는 조직으로의 전달을 용이하게 하는 표적화 성분을 포함할 수 있다. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 치료제, 검출가능한 모이어티 또는 진단제와 같은 제제에 접합될 수 있다. 제제의 예는 본원에 기재된다.
다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트과 함께 본원에 기재된 임의의 접합된 제제, 링커 및 다른 구성요소를 또한 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 독소(예를 들어 박테리아, 곰팡이, 식물, 또는 동물 기원의 효소학적 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성콘쥬게이트)와 같은 세포독성제에 접합된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 포함하는 면역콘쥬게이트와 관련이 있다. T 세포-유래 림프종에서와 같이 질병이 있는 T 세포를 표적화하는데 사용하기 위해 적합한 세포독성제는, 예를 들어 돌라스타틴 및 이의 유도체(예를 들어 아우리스타틴 E, AFP, MMAD, MMAF, MMAE)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 돌라스타틴이다. 일부 구현예에서, 제제는 아우리스타틴 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예에서, 제제는 메이탄시노이드(maytansinoid) 또는 메이탄시노이드 유도체이다. 일부 구현예에서, 제제는 DM1 또는 DM4이다. 일부 구현예에서, 제제는 듀오카르마이신 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예에서, 제제는 칼리키아미신 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예에서, 제제는 피롤로벤조디아제핀이다.
일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 세포독성 제제 사이의 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, 링커는 비-절단가능하다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 링커가 존재한다. 2개 이상의 링커는 모두 동일하며, 예를 들어 절단가능 또는 비-절단가능하거나, 또는 2개 이상의 링커는 상이하고, 예를 들어 적어도 하나는 절단가능하고 적어도 하나는 비-절단가능하다.
다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 및 이의 콘쥬게이트는 다양한 장애 및/또는 질병을 치료하기 위한 방법에 유용하다. 질병의 비-제한적인 예는: 모든 종류의 암(유방, 폐, 대장, 전립선, 흑색종, 두경부, 췌장 등), 류마티스 관절염, 크론병, SLE, 심혈관 손상, 허혈 등을 포함한다. 예를 들어 적응증은 T-세포 급성 림프모구백혈병(T-ALL)을 포함하는 백혈병, 다발성 골수종을 포함하는 림프모구성 질병, 폐, 대장, 전립선, 췌장, 및 삼중음성유방암을 포함하는 유방을 포함하는 고형 종양을 포함한다. 예를 들어 적응증은 원발성 종양 기원에 관계없이 암에서의 골 질병 또는 전이; 비-제한적인 예로, ER/PR+ 유방암, Her2+ 유방암, 삼중-음성유방암을 포함하는 유방암; 대장암; 자궁내막암; 위암; 교모세포종; 두경부암, 예를 들어 식도암; 폐암, 예를 들어 비-제한적인 예로, 비-소세포폐암; 다발성 골수종 난소암; 췌장암; 전립선암; 육종, 예를 들어 골육종; 신장암, 예를 들어 비제한적인 예로, 신장 세포 암종; 및/또는 피부암, 예를 들어 비제한적인 예로, 편평세포암, 기저세포암종, 또는 흑색종을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 편평세포암종이다. 일부 구현예에서, 암은 피부 편평세포암종이다. 일부 구현예에서, 암은 식도 편평세포암종이다. 일부 구현예에서, 암은 두경부 편평세포암종이다. 일부 구현예에서, 암은 폐 편평세포암종이다.
본원에 제공된 임의의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 또한 제공된다. 일부의 경우, 약학 조성물은 멸균성이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 및 담체를 포함할 수 있다. 이러한 약학 조성물은 키트, 예를 들어 진단 키트와 같은 키트에 포함될 수 있다.
통상의 기술자는 본 발명의 항체가 다양한 용도를 갖는다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어 본 발명의 단백질은 다양한 장애에 대한 치료제로 사용된다. 본 발명의 항체는 또한 진단 키트에서 시약으로서 또는 진단 도구로서 사용되거나, 또는 이들 항체는 치료 시약을 제조하기 위한 경쟁 어세이에 사용될 수 있다.
도 1은 제한된 CD3 결합을 갖는 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 기본 구성요소의 개략도이다. 항원 결합 도메인(들)은 아미노 및/또는 카복시 말단에 위치한다. 이종이량체 Fc 영역과 같은 Fc 영역은 CD 결합 영역에 대해 N-말단에 위치한다. CD 결합 영역에 근접해 있는 Fc의 이러한 위치 설정은 CD3 결합을 방해한다.
도 2a 및 2b는 2개의 폴리펩티드, 사슬 1 및 사슬 2로 구성된 다양한 FRα-표적화 제한된 CD3 컨스트럭트의 개략도이다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 사슬 1은 이종이량체 Fc "홀"에 연결되며, 비-절단성 링커(cx1356에서 3개의 아미노산 내지 cx681에서 18개의 아미노산)를 경유하여 항-CD3 VL 도메인에 연결되고, 제 2 FRα sdAb에 연결된, FRα sdAb(항원 결합 도메인)을 포함하고; 사슬 2는, 상보적 이종이량체 Fc "노브(knob)"에 연결되고, 위와 동일한 비-절단성 링커를 경유하여 항-CD3 VH 도메인에 연결되며, 제 2 FRα sdAb에 연결된, FRα sdAb을 포함한다. 공-발현될 때 상기 CD3 결합 도메인은 각각 상기 홀 및 노브 상의 상기 VL:VH의 결합을 경유하여 적절히 어셈블리된다(도 2b). 예시적인 항-CD3은 돌연변이체 G100C을 갖는 가변 경쇄(VL) 및 돌연변이체 G44C를 갖는 가변 중쇄(VH)를 포함하는 이황화-안정화된 Fv(dsFv)이다.
도 3a는 2개의 폴리펩티드, 사슬 1 및 사슬 2로 구성된 다양한 B7H3-표적화 제한된 CD3 컨스트럭트의 개략도이다. 사슬 1은, 비-절단성 링커를 경유하여 G100C(상부)에서 변형된 항-CD3 VL 도메인에 연결된 이종이량체 Fc "홀"; 이종이량체 Fc "홀"에 연결되고, 비-절단성 링커를 경유하여 항-CD3 VL 도메인(중간부)에 연결된 B7H3-표적화 sdAb; 또는 이종이량체 Fc "홀"에 연결되고, 비-절단성 링커를 경유하여 G100C에서 변형된 항-CD3 VL 도메인(하부)에 연결된 B7H3-표적화 sdAb 중의 어느 것을 포함한다. 사슬 2는, 상보적 Fc "노브"에 연결되고, 위와 동일한 링커를 경유하여, 제 2 B7H3 sdAb(상부)에 연결된 G44C에서 변형된 항-CD3 VH 도메인에 연결된, B7H3-표적화 sdAb; 상보적 이종이량체 Fc "노브"에 연결되고, 상기 링커를 경유하여 항-CD3 VH 도메인(중간부)에 연결된, B7H3-표적화 sdAb; 또는 상보적 Fc "노브"에 연결되고, 상기 링커를 경유하여 G44C에의해서 변형된 항-CD3 VH 도메인(하부)에 연결된, B7H3-표적화 sdAb 중의 어느 것을 포함한다. 공-발현될 때 상기 CD3 결합 도메인은 각각 상기 홀 및 노브 상의 상기 VL:VH의 결합을 경유하여 적절히 어셈블리된다. 표시되는 경우 상기 VH:VL 상호작용은 VH 도메인의 변형된 잔기 G44C와 VL 도메인의 G100C 사이의 조작된 이황화 결합에 의해 안정화된다.
도 3b는 2개의 폴리펩티드, 사슬 1 및 사슬 2로 구성된 다양한 B7H3-표적화 제한된 CD3 컨스트럭트의 개략도이다. 사슬 1은 비-절단성 링커를 경유하여 G100C(상부)에서 변형된 항-CD3 VL 도메인에 연결된 이종이량체 Fc "홀"을 포함한다. 사슬 2는, 상보적 Fc "노브"에 연결되고, 위와 동일한 링커를 경유하여 G44C에서 변형된 항-CD3 VH 도메인에 연결되며 제 2 B7H3-표적화 sdAb(상부)에 연결된, B7H3-표적화 sdAb; 상기 링커를 경유하여, B7H3-표적화 sdAb(중간부)에 연결된 G44C에서 변형된 항-CD3 VH 도메인에 연결된, 이종이량체 Fc "노브"; 또는 상보적 Fc "노브"에 연결되고, 상기 링커를 경유하여 G44C(하부)에 의해서 변형된 항-CD3 VH 도메인에 연결된, B7H3-표적화 sdAb 중의 어느 것을 포함한다. 공-발현될 때 상기 CD3 결합 도메인은 각각 상기 홀 및 노브 상의 상기 VL:VH의 결합을 경유하여 적절히 어셈블리된다. VH:VL 상호작용은 VH 도메인의 변형된 잔기 G44C와 VL 도메인의 G100C 사이의 조작된 이황화 결합에 의해 안정화된다. 생성되는 컨스트럭트는 2가(상부) 또는 1가(중간부 및 하부) 방식 중의 어느 것으로 B7H3에 관여한다. 본원에서 발현되는 모든 컨스트럭트는 sdAb를 표적화하는 공동 자극 수용체를 포함한다.
도 3c는 3개의 폴리펩티드, 사슬 1, 사슬 2 및 사슬 3으로 구성된 다양한 B7H3-표적화 제한된 CD3 컨스트럭트의 개략도로서, 여기서 B7H3-표적화 도메인은 FAB이다. 사슬 1은 BH73-표적화 VH, 힌지(hinge)를 경유하여 이종이량체 Fc(Fc-Het-1)의 제 1 구성원에 연결되고, 상기 링커를 경유하여, G100C가 없거나(상부) 또는 그것을 포함하는(하부) 항-CD3 VL에 연결된, IgG 컨스턴트 헤비 1(CH1)을 포함한다. 사슬 2는 BH73-표적화 VH, 힌지를 경유하여 이종이량체 Fc(Fc-Het-2)의 제 2 구성원에 연결되고, 상기 링커를 경유하여 G44C가 없거나(상부) 또는 그것을 포함하는(하부) 항-CD3 VH 도메인에 연결된 IgG 컨스턴트 헤비 1(CH1)을 포함한다. 사슬 3은 인간 컨스턴트 라이트(CL) 영역에 연결된 상보적 B7H3-표적화 VL 도메인을 포함한다. 공-발현될 때 상기 CD3 결합 도메인은 상기 상보적 이종이량체 Fc 영역 상의 상기 VL:VH의 결합을 경유하여 적절히 어셈블리된다. 표시되는 경우 상기 VH:VL 상호작용은 VH 도메인의 변형된 잔기 G44C와 VL 도메인의 G100C 사이의 조작된 이황화 결합에 의해 안정화된다.
도 4a는 2개의 폴리펩티드, 사슬 1 및 사슬 2로 구성된 다양한 DLL3-표적화 제한된 CD3 컨스트럭트의 개략도이다. 사슬 1은 공-자극 수용체 표적화 sdAb에 연결된 G100C에서 변형된 항-CD3 VL 도메인에 비-절단성 링커를 경유하여 연결된 이종이량체 Fc "홀"을 포함한다. 사슬 2는, 상보적 Fc "노브"에 연결되고, 상기 링커를 경유하여 제 2-표벅화된 sdAb(상부)에 연결된 G44C에서 변형된 항-CD3 VH 도메인에 연결된 DLL3-표적화 sdAb; 상기 링커를 경유하여, DLL3-표적화 sdAb(중간부)에 연결된 G44C에서 변형된 항-CD3 VH 도메인에 연결된 이종이량체 Fc "노브"; 또는 상보적 이종이량체 Fc "노브"에 연결되고, 상기 링커를 경유하여 G44C(하부)에 의해서 변형된 항-CD3 VH 도메인에 연결된, DDL3-표적화 sdAb 중의 어느 것을 포함한다. 공-발현될 때 상기 CD3 결합 도메인은 각각 상기 홀 및 노브 상의 상기 VL:VH의 결합을 경유하여 적절히 어셈블리된다. VH:VL 상호작용은 VH 도메인의 변형된 잔기 G44C와 VL 도메인의 G100C 사이의 조작된 이황화 결합에 의해 안정화된다. 생성되는 컨스트럭트는 2가(상부) 또는 1가(중간부 및 하부) 방식 중의 어느 것으로 DLL3에 관여한다. 본원에서 발현되는 모든 컨스트럭트는 sdAb를 표적화하는 공동 자극 수용체를 포함한다.
도 4b는 2개의 폴리펩티드, 사슬 1 및 사슬 2로 구성된 다양한 DLL3-표적화 제한된 CD3 컨스트럭트, cx5499의 개략도이다. cx5499는 도 4a(상부)에 도시된 cx5352와 동일하지만 사슬 1의 C-말단 상에 공-자극성 수용체 표적화 sdAb가 없다. 공-발현될 때 상기 CD3 결합 도메인은 각각 상기 홀 및 노브 상의 상기 VL:VH의 결합을 경유하여 적절히 어셈블리된다. VH:VL 상호작용은 VH 도메인의 변형된 잔기 G44C와 VL 도메인의 G100C 사이의 조작된 이황화 결합에 의해 안정화된다. 생성되는 컨스트럭트는 2가(상부) 또는 1가(중간부 및 하부) 방식 중의 어느 것으로 DLL3에 관여한다.
도 5a 내지 5d는 대표적인 FRα-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트, cx1356 및 cx681에 의한 세포 결합을 도시한다. 도 5a 및 도 5c는 Ovcar5 세포(FRα 양성 난소암 세포주)에 대한 결합을 나타낸다. 도 5b 및 도 5d는 T- 세포에 대한 결합의 결여를 도시한다. 도 5a 및 도 5b는 각각의 컨스트럭트의 100nM에서 정규화된 세포수 대 형광의 히스토그램을 표시한다. 제 2 항-인간 APC 항체 전용 대조군은 채워진 블랙 트레이스(filled black trace)로 표시되고, 양성 대조군 항 -CD3 결합은 오픈 트레이스(open trace)로 표시되며, cx1356 및 cx681은 도 5a 및5b에서 회색 음영 트레이스(gray shaded trace)로 표시된다. 다양한 세포 유형에 대한 각각의 컨스트럭트의 전체 적정은 도 5c 및 도 5d에 도시되어 있다.
도 6a 내지 6f는 대표적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트에 의한 세포 결합을 도시한다. 도 6a, 6c 및 6e는 A375 세포(B7H3 양성 인간 흑색종 세포주)에 대한 결합을 나타낸다. 도 6b, 6d 및 6f는 분리된 T 세포에 대한 결합의 결여를 보여준다.
도 7a 내지 7f는 FRα 양성 IGROV1 세포(도 7a, 7c, 7e) 또는 FRα 음성 NCI-H460 세포(도 7b, 7d, 7f)의 존재하에 CD3를 작용시키는 능력에 대한 링커 길이의 영향을 도시한다. 도 7a 및 7b는 각각 항원 양성 및 음성 세포에 대한 다양한 컨스트럭트의 2 nM에 의한 CD3 신호 전달의 동역학을 보여준다. 도 7c 및 7d는 각각 항원 양성 및 음성 세포에 대한 다양한 컨스트럭트의 2 nM에 의한 CD3 작용 능력의 크기를 보여준다. 도 7e 및 7f는 각각 항원 양성 및 음성 세포에 대한 링커 길이가 상이한 다양한 컨스트럭트의 CD3 작용 능력의 효능을 보여준다. Jurkat CD3 NFAT-GFP 리포터 세포주를 사용하여 CD3 신호를 평가했다. 제한된 CD3 결합 단백질은 표적 세포 상의 제 2 항원에 결합할 때 T 세포에서 CD3만 효과적으로 결합하고 클러스터(cluster)한다.
도 8a 내지 8d는 표적 의존적 방식으로 CD3를 작동시키는 대표적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 능력을 도시한다. 도 8a 및 도 8c는 B7H3 양성 A375 세포의 존재하에 CD3 신호 전달을 매개하는 능력을 도시한 반면, 도 8b 및 도 8d는 B7H3 음성 CCRF-CEM 세포의 존재하에 CD3 신호 전달을 매개할 수 없음을 보여준다. Jurkat CD3 NFAT-GFP 리포터 세포주를 사용하여 CD3 효능 작용을 평가하였다.
도 9a는 표적 의존적 방식으로 T-세포 매개 세포 독성을 유도하는 대표적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트(cx3072)의 능력을 도시한다. 표적 세포는 cytoID 적색 라벨로 표지하고 죽어가는 세포는 Caspase 3/7 녹색 시약을 첨가하여 가시화하였다. 세포 독성은 적색 표적 세포와 녹색 염색 세포의 중첩 영역을 결정하여 평가되었다. CRISPR 기술에 의해 생성된 B7H3 음성 A375 세포주를 사용하여 항원 특이적 T 세포 매개 세포 독성을 테스트하였다. cx3072는 이러한 B7H3 결핍 세포의 T 세포 매개 세포 독성을 유도할 수 없었다.
도 9b는 B7H3 양성 A375 세포의 존재하에 T-세포 매개 세포 독성을 유도하는 cx5952의 능력을 나타내지만, B7H3 음성 CCRF-CEM 세포의 존재하에서는 그렇지 않다.
도 10a 및 10b는 표적 의존적 방식으로 T-세포 매개 세포 독성을 유도하는 대표적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 능력을 도시한다. B7H3 양성 A375 세포의 존재하에 T-세포 매개 세포 독성을 유도하는 이들 컨스트럭트의 능력을 도시한 반면, 도 10a는 B7H3 음성 CCRF-CEM 세포의 존재하에 T-세포 매개 세포 독성을 유도하는 이들 컨스트럭트의 능력을 도시한다. 세포 독성은 적색 표적 세포와 녹색 염색 세포의 중첩 영역을 결정하여 평가되었다.
도 10c 및 10d는 표적 의존적 방식으로 T-세포 매개 세포 독성을 유도하는 대표적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 능력을 도시한다. 도 10c는 B7H3 양성 A375 세포의 존재하에 T-세포 매개 세포 독성을 유도하는 이들 컨스트럭트의 능력을 도시한 반면, 도 10c는 B7H3 음성 CCRF-CEM 세포의 존재하에 T-세포 매개 세포 독성을 유도하는 이들 컨스트럭트의 능력을 도시한다. 세포 독성은 적색 표적 세포와 녹색 염색 세포의 중첩 영역을 결정하여 평가되었다.
도 11a 내지 11c는 표적 의존적 방식으로 T-세포 매개 T-세포 활성화를 유도하는 대표적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트(cx5952)의 능력을 도시한다. CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 T-세포 활성화는 T 세포 활성화 마커 CD25(도 11a), CD69(도 11b) 및 CD71(도 11c)의 발현에 의해 평가되었다.
도 11d 내지 11k는 표적 의존적 방식으로 T-세포 활성화를 유도하는 대표적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 능력을 도시한다. B7H3-표적 의존성 CD4+ T-세포 활성화는 T 세포 활성화 마커 CD25(도 11d) 및 CD71(도 11f)의 발현에 의해 나타난다. B7H3-표적-의존성 CD8+ T-세포 활성화는 T 세포 활성화 마커 CD25(도 11h) 및 CD71 (도 11j)의 발현에 의해 나타난다. T-세포 활성화는 CD4+ T 세포(도 11e) 또는 CD8+ T 세포(도 11i)에 나타낸 바와 같이 T 세포 활성화 마커 CD25를 기반으로 하거나 또는 CD4+ T 세포(도 11g) 또는 CD8+ T 세포(도 11k)에 나타낸 바와 같이 T 세포 활성화 마커 CD71을 기반으로 한다.
도 12a는 표적 의존적 방식으로 IFNγ 생산을 유도하는 대표적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 능력을 도시한다. 도 12a는 대표적인 B7H3 표적화 CD3 관여 컨스트럭트의 존재하에 B7H3 양성 A375 세포 및 B7H3 음성 CCRF-CEM 세포의 존재하에 배양된 T-세포로부터의 IFNγ의 생산을 보여준다.
도 12b는 표적 의존적 방식으로 IFNγ 생산을 유도하는 대표적인 B7H3-표적 제한 CD3 관여 컨스트럭트의 능력을 도시한다. 도 12b는 대표적인 B7H3 표적화 CD3 관여 컨스트럭트의 존재하에 B7H3 양성 A375 세포 및 B7H3 음성 CCRF-CEM 세포의 존재하에 배양된 T-세포로부터의 IFNγ의 생산을 보여준다.
도 13a 및 도 13b는 대표적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 세포 결합을 도시한다. cx5187 및 cx5823은 각각 2개의 B7H3 결합 도메인을 포함하는 반면, 복잡한 cx5873 및 cx5965는 각각 하나의 B7H3 결합 도메인을 포함한다. 도 13a는 B7H3 양성 A375 세포에 대한 결합을 보여준다. 도 13b는 B7H3 음성 CCRF-CEM 세포 및 분리된 T-세포에 대한 결합의 결여를 보여준다.
도 13c 및 도 13d는 표적 의존적 방식으로 CD3를 작동시키는 대표적인 B7H3- 표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 능력을 도시한다. 도 13c는 B7H3 양성 A375 세포를 컨스트럭트 햇(construct hat)과 결합시키는 것이 B7H3(cx5873 및 cx5965)에 1가인 컨스트럭트보다 B7H3 (cx5187) 유도된 더 강력한 CD3 신호 전달에 대해 2가이고 2-에피토프임을 보여준다. 도 13d는 B7H3 음성 CCRF-CEM 세포의 존재하에 T-세포의 활성화 부족을 보여준다. Jurkat CD3 NFAT-GFP 리포터 세포주를 사용하여 CD3 효능 작용을 평가하였다.
도 14a 및 14b는 표적 의존적 방식으로 T-세포 매개 세포 독성을 유도하는 대표적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 능력을 도시한다. 도 14a는 B7H3(cx5187)에 대해 2가이고 2-에피토프인 컨스트럭트로 B7H3 양성 A375 세포를 표적화하는 것이 B7H3(cx5873 및 cx5965)에 대해 1가인 컨스트럭트보다 더 강력한 T-세포 매개 세포 독성을 유도함을 보여준다. 도 14b는 B7H3 음성 CCRF-CEM 세포에 대한 T-세포 매개 세포 독성의 결여를 도시한다.
도 15a 내지 15d는 B7H3 양성 A375 세포의 존재하에 T-세포를 활성화시키는 대표적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 관여 분자의 능력을 나타내지만, B7H3 음성 CCRF-CEM 세포의 존재하에서는 그렇지 않다는 것을 도시한다. 도 15a 및 15b는 B7H3(cx5187)에 대해 2가이고 2-에피 토피인 컨스트럭트를 갖는 B7H3 양성 A375 세포를 표적화하는 것이 B7H3(cx5873 및 cx5965)에 1가인 컨스트럭트보다 CD4+ 및 CD8+ T-세포에서 더 강력한 CD25 발현을 유도함을 보여준다. 도 15c 및 15d는 B7H3 음성 CCRF-CEM 세포의 존재하에 CD4+ 및 CD8+ T-세포에 대한 CD25 발현의 결여를 보여준다.
도 16a 및 16b는 B7H3-양성 A375 세포의 존재하에 T-세포 매개 세포 독성을 유도하는 대표적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 능력을 나타내지만(도 16a), CCRF-CEM B7H3-음성 세포의 존재하에서는 그렇지 않다는 것(도 16b)을 입증한다.
도 16c 내지 16j는, CD4 + T 세포에서의 CD25 발현(각각 도 16c 및 16d), CD8+ T 세포에서의 CD25 발현(각각 도 16e 및 16f), CD4+ T 세포에서의 CD71 발현(각각 도 16g 및 16h), CD8+ T 세포에서의 CD71 발현(각각 도 16i 및 16j)에 의해서 평가되는 바와 같이 B7H3-양성 A375 세포의 존재하에서 T 세포 활성화를 유도하는 대표적인 B7H3 표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 능력을 나타내지만 CCRF-CEM B7H3-음성 세포의 존재하에서는 그렇지 않다는 것을 입증한다.
도 16k 및 도 16l은 B7H3-양성 A375 세포의 존재하에 T 세포 사이토카인 생산을 유도하는 대표적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 능력을 나타내지만(도 16k) CCRF-CEM B7H3- 음성 세포의 존재하에서는 그렇지 않다는 것(도 16l)을 증명한다.
도 17a 및 17b는 대표적인 1가 (cx5800 및 cx5801) 및 2가 (cx5352) DLL3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트가 DLL3 발현 세포주 SHP-77에 결합되지만(도 17a) 분리된 T 세포에는 결합되지 않는다는 것(도 17b)을 증명한다. 결합은 유세포 분석에 의해 평가되었다.
도 17c는 DLL3 양성 SHP-77 세포의 존재하에 CD3 신호 전달을 촉진하는 대표적인 DLL3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 능력을 도시한다. DLL3 (cx5352)에 대해 2가 및 2-에피토피인 컨스트럭트를 갖는 DLL3 양성 세포는 DLL3 (cx5800 및 cx5801)에 대해 1가인 컨스트럭트보다 더 강력한 T-세포 활성화를 유도하였다. Jurkat CD3 NFAT-Luciferase 리포터 세포주를 사용하여 CD3 신호를 평가하였다.
도 18a 내지 18e는 DLL3-양성 SHP-77 세포의 존재하에 T-세포 매개 세포 독성 및 T-세포 활성화를 유도하는 대표적인 DLL3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트, cx5499의 능력을 입증한다. 도 18a는 DLL3-양성 SHP-77 세포의 존재하에 T-세포 매개 세포 독성을 유도하는 대표적인 DLL3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 능력을 입증한다. 도 18c 내지 18d는, CD4+ T 세포에서의 CD25 발현(도 18b), CD4+ T 세포에서의 CD69 발현(도 18c), CD8+ T 세포에서의 CD25 발현(도 18d) 및 CD8+ T 세포에서의 CD69 발현(도 18e)에 의해서 평가되는 바와 같이, DLL3-양성 SHP-77 세포의 존재하에 T 세포 활성화를 유도하는 대표적인 DLL3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 능력을 입증한다.
본 발명은 적어도 CD3 및 제 2 항원에 결합하는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 형태로 제한된 T-세포 관여 융합 단백질을 제공한다. 본원에 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 면역글로불린 Fc 영역에 작동가능하게 연결된 항원에 결합하는 항원-결합 도메인의 하나 이상의 카피를 포함하는 적어도 제 1 구성요소, CD3(본원에서 항-CD3 결합 도메인 또는 CD3 결합 영역으로 지칭되며, 이는 본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어임)에 결합하는 적어도 결합 도메인의 하나 이상의 카피를 포함하는 제 2 구성요소, 및 링커, 예를 들어 제 1 구성요소와 제 2 구성요소를 연결하는 폴리펩티드 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 종양 관련 항원(TAA)이다. 일부 구현예에서, 링커는 비-절단성 링커이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 프로테아제에 의해, 예를 들어 그랜자임 B, MMP 또는 마트립타제에 의해 특이적으로 인식되는 기질 인식 부위를 포함하지 않는다.
제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 Fc 영역을 함유하는 제 1 구성요소가 CD3 결합 영역을 함유하는 제 2 구성요소에 대해 N-말단인 배열을 포함한다. 이러한 구현예에서, 제 1 및 제 2 구성요소는 Fc 영역의 말단에 대해 C-말단인 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인(들)은 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 아미노-말단(N-말단) 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인(들)은 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 카복시-말단(C-말단) 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인(들)은 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 N- 및 C-말단 영역 둘 다에 위치한다. 본원에 제공된 바와 같은 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 다양한 배열이 도 1에 제시된다.
제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는, 일단 항원이 항원-결합 도메인을 통해 결합되면, 이러한 컨스트럭트는 CD3에만 실질적으로 결합하기 때문에, 제한된 T-세포 관여 활성을 나타낸다. 이는 본원에 제공된 구현예 및 도면에 예시되며, T 세포의 결합은 거의 또는 전혀 갖지 않으면서, 제한된 CD3 관여 단백질이 TAA 양성 세포에 효율적으로 결합하는 능력을 입증한다. 이러한 독특한 특성은 제한된 CD3 관여 단백질이 주변 T 세포에 결합하지 않고 TAA가 존재하는 부위에 분포되도록 한다. 이 형식은 구성적 CD3 결합이 허용되지 않거나 제거되어, 주변 T-세포 결합을 피하고 항원 결합 도메인에 의해 인식되는 바와 같이 존재하는 부위(들)에 우세한 분포를 허용함으로써, 상당한 이익을 제공한다는 점에서, 다른 CD3 관여 다중특이적 컨스트럭트와 구별된다. 추가로, 다른 CD3 관여 컨스트럭트는 항원-의존적 T-세포 활성화를 매개한다. 그러나 본원에 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 항원-의존적 T-세포 결합 및 활성화 둘 다를 매개한다.
제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 제한된 T-세포 관여 활성은, 일부 측면에서, CD3-결합 영역에 대한 N-말단의 Fc 영역의 위치 설정에 기인한다. 일부 구현예에서, 이러한 위치 설정은 CD3 결합 영역에 의한 CD3 결합을 감소, 감쇠, 약화 및/또는 방지한다. 항원 결합 도메인에 의한 하원 결합의 부재 시, 본원에 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 감소되거나 제거된 CD3 결합 및 T 세포 활성화 능력을 입증한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 항원 결합 도메인(들)에 의해 매개되는 항원 결합 사건의 존재 시, CD3 결합 영역에 의해 CD3에 결합하는 능력이 크게 향상된다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 항원 결합 도메인(들)에 의해 매개되는 항원 결합 이벤트의 존재 시, T 세포를 활성화하는 능력이 크게 향상된다. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 내에서 항원 결합 도메인(들)에 의한 이의 동족 항원의 관여는 후속 T-세포 관여를 초래하고, 세포독성, 사이토카인 방출, 탈과립 및 증식과 같은 항원-의존적 T-세포 활성화를 매개한다. 일부 구현예에서, 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 예를 들어 세포용해성(또는 세포독성) T-세포 활성을 포함하는, T-세포 활성을 향상시키기 위해, 면역반응을 증가시키는데 사용될 수 있다. 면역반응의 조절은, 일부 측면에서, 대상체의 질병 또는 질환을 치료할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 종양 세포 또는 종양 미세 환경의 세포 상의 항원에 결합한다. 일부 측면에서, 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 T-세포 활성과 같은 면역반응, 예를 들어 종양 또는 암에 대한 세포독성 활성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 개체에서 종양 또는 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 말초 혈액에서 CD3을 통한 T-세포의 결합이 없을 것을 보장하는데, 이들 컨스트럭트의 CD3 결합 영역이 Fc 영역의 존재에 의해 제한되거나 다르게는 차단 및/또는 억제되기 때문이다. 따라서, 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 다수의 이점을 제공한다. 일부 측면에서, 이러한 컨스트럭트는 모든 T 세포에 결합함으로써 야기되는 싱크 효과(sink effect)를 제한한다. 일부 측면에서, 이러한 컨스트럭트는 전신성 독성을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는, 예를 들어 종양-관련 항원(TAA) 발현의 부위와 같이 개체에서 원하는 부위에 대한 제어된 생체분포를 허용한다. TAA 발현 부위는, 예를 들어 종양 및 주변 종양 미세 환경을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 CD3 및 하나 이상의 다른 항원에 대해 특이성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 하나 이상의 TAA, 예를 들어 2, 3 또는 4개의 항원 결합 도메인에 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함할 수 있으며, 예를 들어 도 1을 참고한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 동일한 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 하나 이상의 상이한 항원에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하고, 하나 이상의 상이한 항원에 결합하는 추가의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 측면에서, 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 이중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트이고, 이는 이들이 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 항원-결합 도메인의 결합을 통해, CD3 및 다른 항원, 예를 들어 TAA에 결합할 수 있도록 한다. 일부 예에서, 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 제 1 항원-결합 도메인 및 제 2 항원-결합 도멘의 사용을 통해 하나 이상의 TAA의 다가 관여를 제공하는 이중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트이다. 예를 들어 일부 구현예에서, 이중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 제 1 항원-결합 단일 도메인 항체(sdAb) 및 제 2 항원-결합 sdAb를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 CD3에 결합하고 이어서 T-세포를 활성화시키는 능력의 관점에서 2가지 상태로 존재한다: (1) "비활성" 상태는 임의의 또는 모든 항원 결합 도메인(들)의 결합이 없을 때 발생하여, CD3 결합이 제한되고 T-세포 상호작용이 제거되고, (2) "활성" 상태는 임의의 또는 모든 항원 결합 도메인(들)에 의한 항원 결합 시 발생하여, CD3 결합 영역이 CD3에 결합할 수 있고 T-세포 상호작용이 허용된다.
일부 구현예에서, Fc 영역은 링커 또는 링커들을 통해 CD3 결합 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 비-절단성 링커 또는 링커들을 통해, 예를 들어 전술한 것 중 임의의 것을 통해 CD3 결합 영역에 연결된다.
일부 구현예에서, Fc 영역은 동종이량체 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 이종이량체 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 단량체 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 Fc 영역은 FcγR과 상호작용하고, 선천성 면역 효과기 기능, 예를 들어 항체 의존 세포성 세포독성(ADCC) 및 항체 의존 세포성 식균작용(ADCP)을 매개할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 Fc 영역은 보체 단백질, 즉 C1q와 상호작용할 수 있고, 보체 의존 세포독성을 매개할 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 선천성 면역 효과기 및 T-세포를 포함하는 다중 면역 효과기 메카니즘을 허용한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 T-세포 및 NK 세포 매개 세포독성이 동시에 발생하도록 한다. 일부의 경우, 이러한 활성은 주어진 TAA에서 별개의 및/또는 비-경쟁적 에피토프를 표적할 수 있는 제 1 항원 결합 도메인, 예를 들어 제 1 항-TAA 항원 결합 도메인, 및 제 2 항원 결합 도메인, 예를 들어 제 2 항-TAA 항원 결합 도메인이 함유된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트에서 발생할 수 있다.
제한된 CD3 관여 컨스트럭트는 임의의 TAA-결합 도메인과 함께 사용하기에 적합하며, 말초 T-세포와의 상호작용을 회피하고 강력한 TAA-의존성 T-세포 독성을 매개함으로써 종양 또는 종양-마이크로환경 내에서 더 양호한 치료 노출을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 제 2 부분 또는 성분은 TAA가 존재하지 않는 한 T-세포가 활성화되지 않도록 1가 내지 CD3인 CD3 결합 영역을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 현재 이중특이적 치료제에 비해 많은 이점을 제공한다. 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 통상적인 치료 항체, 예를 들어 150kDa 대 125kDa보다 작으며, 이는 더 나은 표적, 예를 들어 종양, 침투를 허용할 것이다. 일부 측면에서, 전체 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 크기는 컨스트럭트에 대해 긴 반감기를 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는, CD3 결합 영역에 의한 CD3 결합이 CD3 관여가 발생하기 전에 TAA 관여에 의존하기 때문에, 감소된 전신 독성 또는 종양 및/또는 종양 미세 환경 외부의 임의의 영역의 독성을 나타낸다.
본원에 인용된 모든 간행물 및 특허 문헌은 이러한 간행물 또는 문헌 각각이 본원에 참고로 포함되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 나타낸 것과 같이, 본원에서 참고로 포함된다. 간행물 및 특허 문헌의 인용은 임의의 것이 관련 선행기술이라는 것을 인정하는 의도가 아니며, 내용이나 날짜에 대한 어떠한 인정으로 여겨지지 않는다. 본 발명은 서면으로 설명되었지만, 통상의 기술자는 본 발명이 다양한 구현예에서 실시될 수 있으며, 전술한 설명 및 하기 예는 예시적인 목적일뿐, 다음의 청구범위를 제한하는 것이 아님을 인식할 것이다.
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 통상의 기술자에게 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 용어 독립체(entity) "하나(a)" 또는 "하나(an)"는 그 독립체의 하나 이상을 지칭한다. 예를 들어 화합물은 하나 이상의 화합물을 지칭한다. 이와 같이, 용어 "하나(a)", "하나(an)", "하나 이상의" 및 "적어도 하나"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 혼성화와 관련하여, 이의 기술에서 사용된 명명법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환(예를 들어 전기천공, 리포펙션)에 대해 표준 기술이 사용된다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업체의 사양에 따라 또는 당해 기술분야에 통상적으로 이루어지거나 본원에 기재된 바와 같이 수행된다. 전술한 기술 및 절차는 일반적으로 당해 기술분야에 널리 알려진 통상적인 방법에 따라 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양하고 일반적인 그리고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어 Sambrook 등의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))을 참고한다. 본원에 기재된 분석화학, 합성 유기화학, 및 의약 및 제약 화학과 관련하여, 이의 실험실 절차 및 기술에 사용된 명명법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 화학 합성, 화학 분석, 약학 제제, 제형, 및 전달, 및 환자의 치료에 대해 표준 기술이 사용된다.
본 발명에 따라 사용되는 바와 같이, 다음의 용어는, 달리 나타내지 않는 한, 다음의 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다:
본원에 사용된, 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린(Ig) 분자의 항원-결합 부분, 즉, 항원에 특이적으로 결합하는(항원과 면역반응하는) 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. "특이적으로 결합한다" 또는 "와 면역반응하는" 또는 "면역특이적으로 결합한다"는 항체가 원하는 항원의 하나 이상의 항원 결정기와 반응하고 다른 폴리펩티드와 반응하지 않거나 훨씬 낮은 친화도 (Kd > 10-6)로 결합하는 것을 의미한다. 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 키메릭, 완전 인간, 도메인 항체, 단일 사슬, Fab, 및 F(ab')2 단편, Fvs, scFvs, 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, "항원-결합 단편"은 관심있는 항원의 적어도 하나의 에피토프에 결합하는 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄의 적어도 하나의 CDR 을 함유한다. 이와 관련하여, 항원-결합 단편은 항원과 결합하는 항체로부터의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 서열의 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 6개 모두의 CDR, 예를 들어 VH 및 VL 을 함유하는 항체에 대해 일반적으로 6개의 CDR(중쇄 및 경쇄의 각각에 대해 "CDR2" 및 "CDR3") 또는 3개의 CDR, 또는 단일 가변 도메인을 함유하는 항체에 대한 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 항원 결합 단편은 단일 도메인 항체, 예를 들어 VHH, VNAR, 조작된 VH 또는 VK 도메인을 포함하는, VH만을 함유하는 것 또는 VL만을 함유하는 것을 포함한다.
기본 항체 구조 단위는 4량체(tetramer)를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각 4량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 "중쇄"(약 50-70 kDa)을 갖는다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식에 역할을 하는 약 100 내지 110게 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카복시-말단 부분은 주로 효과기 기능에 역할을 하는 불변 영역을 정의한다. 일반적으로, 인간으로부터 수득되는 항체 분자는 분자에 존재하는 중쇄의 성질에 의해 서로 상이한, 클래스 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 중 임의의 것에 관한 것이다. 특정 클래스는 또한 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등과 같은 서브클래스를 갖는다. 추가로, 인간에서 경쇄는 카파 사슬 또는 람다 사슬일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"(mAb) 또는 "모노클로날 항체 조성"은 특유의 경쇄 유전자 산물 및 특유의 중쇄 유전자 산물로 이루어진 항체 분자의 단 하나의 분자 종을 함유하는 항체 분자의 집단을 지칭한다. 특히, 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역(CDR)은 집단의 모든 분자에서 동일하다. MAb는 고유한 결합 친화성을 특징으로 하는 항원의 특정 에피토프와 면역반응을 할 수 있는 항원 결합 부위를 함유한다.
용어 "항원-결합 부위" 또는 "결합 부분"은 항원 결합에 참여하는 면역글로불린 분자의 일부를 지칭한다. 항원 결합 부위는 중쇄("H") 및 경쇄("L")의 N-말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "초가변 영역"으로 지칭되는, 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내의 3개의 고도로 다른 범위(highly divergent stretch)는 "프레임워크 영역", 또는 "FR"로 알려진 보다 보존된 플랭킹(flanking) 범위 사이에 삽입된다. 따라서, 용어 "FR"은 면역글로불린의 초가변 영역 사이에서, 그리고 이에 인접하여 자연적으로 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다. 항체 분자에서, 경쇄의 3개의 초가변 영역과 중쇄의 3개의 초가변 영역은 3차원 공간에서 서로에 대해 배치되어 항원-결합 표면을 형성한다. 항원-결합 표면은 결합된 항원의 3차원 표면에 대해 상보적이고, 중쇄 및 경쇄 각각의 3개의 초가변 영역은 "상보성-결정 영역", 또는 "CDRs"로 지칭된다. 각 도메인에 대한 아미노산의 배치는 면역학적 관심 단백질의 카밧 서열의 정의에 따른다(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 및 1991)), 또는 Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia 등의 Nature 342:878-883(1989).
본원에 사용된, 용어 "에피토프"는 항체, 항체 단편 또는 다른 결합 도메인에 의해 표적화된 항원의 임의의 특정 부분을 포함한다. 용어 "에피토프"는 특이적 결합이 지시되는 임의의 단백질 영역을 포함한다. 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함한다. 에피토프 결정인자는 보통 아미노산 또는 당 측면 사슬과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 이루어지며 보통 특이적인 3차원 구조적 특성뿐만 아니라, 특정 전하 특성을 갖는다. 예를 들어 항체는 폴리펩티드의 N-말단, 중심, 또는 C-말단에 대해 형성될 수 있다. 추가로, 항체는 폴리펩티드의 선형 또는 불연속 에피토프에 대해 형성될 수 있다. 해리 상수가 ≤ 1 μM 일 때; 예를 들어 일부 구현예에서 ≤ 100 nM 그리고 일부 구현예에서, ≤ 10 nM 일 때, 그리고 밀접하게 관련되거나 구별되는 다른 단백질에 대한 결합을 나타내지 않을 때, 항체는 항원에 특이적으로 결합한다고 말한다.
본원에 사용된, 용어 "특이적 결합", "면역학적 결합", 및 "면역학적 결합 특성"은 면역글로불린 분자와 면역글로불린이 특이적인 항원 사이에 발생하는 종류의 비-공유 상호작용을 지칭한다. 면역학적 결합 상호작용의 강도, 또는 친화도는 상호작용의 해리 상수(Kd)와 관련하여 표현될 수 있으며, 더 작은 Kd는 더 큰 친화도를 나타낸다. 선택된 폴리펩티드의 면역학적 결합 특성은 당해 기술분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 정량화될 수 있다. 하나의 이러한 방법은 항원-결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리의 속도를 측정하는 것을 수반하며, 여기서 이러한 속도는 복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화도, 및 양 방향으로의 속도에 동일하게 영향을 미치는 기하학적 파라미터에 의존한다. 따라서, "결합 속도 상수"(Kon)와 "해리 속도 상수"(Koff)는 모두 농도 및 실제 결합 및 해리 속도를 계산하여 결정될 수 있다[문헌 「Nature 361:186-87 (1993)」을 참고한다]. Koff/Kon의 비율은 친화성과 관련이 없는 모든 파라미터를 취소할 수 있으며 해리 상수 Kd와 동일하다(일반적으로, 문헌 「Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473」을 참고한다]. 본 발명의 항체는, 결합 상수(Kd)가 방사성 리간드 어세이 또는 통상의 기술자에게 공지된 유사한 어세이와 같은 어세이에 의해 측정된 바와 같이, ≤ 1 μM 일 때, 예를 들어 일부 구현예에서 ≤ 100 nM, 일부 구현예에서 ≤ 10 nM, 일부 구현예에서 ≤ 100 pM 내지 약 1 pM 일 때, EGFR에 특이적으로 결합한다고 말한다.
본원에 사용된 용어 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 게놈, cDNA, 또는 합성 기원 또는 이의 일부 조합의 폴리뉴클레오티드를 의미할 것이며, 그 기원에 의해 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 (1) "분리된 폴리뉴클레오티드"가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 관련이 없거나, (2) 자연에서 연결되지 않은 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되거나, 또는 (3) 더 큰 서열의 일부로 자연에서 발생하지 않는다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 본원에서 나타낸 중쇄 면역글로불린 분자를 코딩하는 핵산 분자, 및 본원에 나타낸 경쇄 면역글로불린 분자를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
본원에서 언급된 용어 "분리된 단백질"은 cDNA, 재조합 RNA, 또는 합성 기원 또는 이의 일부 조합의 단백질을 의미하며, 그 기원에 의해, 또는 유래의 공급원에 의해, "분리된 단백질"은 (1) 자연에서 발견되는 단백질과 관련이 없거나, (2) 동일한 공급원으로부터의 다른 단백질이 없거나, 예를 들어뮤린 단백질이 없거나, (3) 다른 종으로부터 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 자연에서 발생하지 않는다.
용어 "폴리펩티드"는 본원에서 폴리펩티드 서열의 천연 단백질, 단편, 또는 유사체를 언급하는 일반적인 용어로 사용된다. 따라서, 천연 단백질 단편, 및 유사체는 폴리펩티드 속(genus)의 종(species)이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 본원에 제시된 중쇄 면역글로불린 분자, 및 본원에 제시된 경쇄 면역글로불린 분자, 및 중쇄 면역글로불린 분자 및 카파 경쇄 면역글로불린 분자와 같은 경쇄 면역글로불린 분자를 포함하는 조합으로 형성된 항체 분자, 및 그 반대, 뿐만 아니라 이의 단편 및 유사체를 포함한다.
대상에 적용되는 본원에 사용된 용어 "자연-발생"은 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어 자연에서 공급원으로부터 분리될 수 있는 유기체(바이러스 포함) 및 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않았거나 또는 다르게는 자연-발생한 것에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 설명된 구성요소의 위치가 그들이 의도된 방식으로 기능할 수 있게 허용하는 관계에 있는 것을 지칭한다. 코딩 서열에 대해 "작동가능하게 연결된" 제어 서열은 제어 서열과 양립할 수 있는 조건 하에서 코딩 서열의 발현이 달성되는 방식으로 묶인다.
본원에 사용된 용어 "제어 서열"은 이들이 묶인 코딩 서열의 발현 및 처리에 영향을 미치는데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이러한 제어 서열의 성질은 원핵생물에서 숙주 유기체에 따라 다르며, 이러한 제어 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 진핵생물에서의 전사 종결 서열을 포함하고, 일반적으로, 이러한 제어 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "제어 서열"은 존재가 발현 및 처리에 필수적인 모든 구성요소를 최소한 포함하도록 의도되며, 존재가 유리한 추가의 구성요소, 예를 들어 리더 서열 및 융합 파트너 서열 또한 포함할 수 있다. 본원에 언급된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 적어도 10개의 염기의 길이의 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 중의 하나 또는 변형된 형태의 뉴클레오티드의 각각의 유형을 의미한다. 이 용어는 DNA의 단일 및 이중 가닥 형태를 포함한다.
본원에서 언급된 용어 올리고뉴클레오티드는 자연 발생, 및 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 자연 발생, 및 변형된 뉴클레오티드를 포함한다 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 200개 또는 그 이하의 염기의 길이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서브세트이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 10개 내지 60개 염기의 길이이고, 예를 들어 일부 구현예에서, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 내지 40개 염기의 길이이다. 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 단일가닥, 예를 들어 프로브용이지만, 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 유전자 돌연변이체의 구축에 사용하기 위해 이중가닥일 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안테센스 올리고뉴클레오티드 중의 하나이다.
본원에 언급된 용어 "자연 발생 뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 언급된 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 변형되거나 치환된 당 그룹 등을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 언급된 용어 "올리고뉴클레오티드 연결"은 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 포스포로셀레노에이트(phosphoroselerloate), 포스포로디셀레노에이트(phosphorodiselenoate), 포스포로아닐로티오에이트(phosphoroanilothioate), 포스포라닐라데이트(phoshoraniladate), 및 포스포로아미데이트(phosphoronmidate) 등과 같은 올리고뉴클레오티드 연결을 포함한다. 예를 들어 문헌 「LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986)」; 「Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984)」; 「Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988)」; 「Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991)」; 「Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991))」; 「Stec et al. U.S. Patent No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)」을 참고한다. 올리고뉴클레오티드는, 원한다면, 검출용 표지를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 20개의 통상적인 아미노산 및 이의 약어는 통상적인 사용을 따른다. 문헌 「Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991))」을 참고한다. 20개의 통상적인 아미노산의 입체이성질체(예를 들어 D-아미노산), 비천연 아미노산, 예를 들어 α-, α-2기 치환의 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 다른 비통상적인 아미노산은 또한 본 발명의 폴리펩티드에 적합한 구성요소일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예는: 4 하이드록시프롤린, γ-카복시글루탐산, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메테오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, σ-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산(예를 들어 4-하이드록시프롤린)을 포함한다. 본원에 사용된 폴리펩티드 표기법에서, 표준 사용법 및 관례에 따라, 좌측 방향은 아미노 말단 방향이고, 우측 방향은 카복시-말단 방향이다.
유사하게, 달리 명시하지 않는 한, 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 말단은 5' 말단이고, 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 초기 RNA 전사체의 5' 내지 3' 첨가의 방향은 RNA와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 전사 방향 서열 영역으로 지칭되고 RNA 전사체의 5' 내지 5' 말단인 것은 RNA와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역인 "업스트림 서열(upstream sequences)"로 지칭되며 RNA 전사체의 3' 내지 3' 말단인 것은 "다운 스트림 서열(downstream sequences)"로 지칭된다.
폴리펩티드에 적용되는 바와 같이, 용어 "실직적 동일성"은, 2개의 펩티드 서열이, 예를 들어 디폴트 갭 중량을 이용한 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때, 예를 들어 일부 구현예에서, 적어도 90 퍼센트 서열 동일성, 일부 구현예에서, 적어도 95 퍼센트 서열 동일성, 및 일부 구현예에서, 적어도 99 퍼센트 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 다르다.
본원에서 논의된 바와 같이, 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열에서 작은 변이는 본 발명에 포함되는 것으로 고려되며, 예를 들어 아미노산에서의 변이는 적어도 75%, 예를 들어 일부 구현예에서, 적어도 80%, 90%, 95%, 및 일부 구현예에서 99%를 유지하는 것을 제공한다. 특히, 보존적 아미노산 대체가 고려된다. 보존적 대체는 측면 사슬과 관련된 아미노산 패밀리 내에서 발생하는 것이다. 유전자 코딩된 아미노산은 일반적으로 패밀리로 나누어진다: (1) 산성 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산이고; (2) 염기성 아미노산은 리신, 아르기닌, 히스티딘이며; (3) 비-극성 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판이고, 그리고 (4) 비하전 극성 아미노산은 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신이다. 친수성 아미노산은 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 리신, 세린, 및 트레오닌을 포함한다. 소수성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 발린이다. 아미노산의 다른 패밀리는 (i) 지방족-하이드록시 패밀리인 세린 및 트레오닌; (ii) 아미드 함유 패밀리인 아스파라긴 및 글루타민; (iii) 지방족 패밀리인 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 및 (iv) 방향족 패밀리인 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신을 포함한다. 예를 들어 류신을 이소류신 또는 발린으로, 아스파르트산을 글루탐산으로, 트레오닌을 세린으로의 분리된 대체, 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산의 유사한 대체, 특히 대체가 프레임워크 부위 내에 아미노산을 포함하지 않는 경우, 결과적으로 생성된 분자의 결합 또는 특성에 주요 영향을 미치지 않을 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 아미노산 변화가 기능적 펩티드를 초래하는지 여부는 폴리펩티드 유도체의 특이적 활성화를 분석함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 어세이는 본원에 상세하게 기재된다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 통상의 기술자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 단편 또는 유사체의 아미노- 및 카복시-말단 기능적 도메인의 경계 부근에서 발생한다. 구조적 및 기능적 도메인은 공개된 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이터 또는 독점 서열 데이터베이스의 비교로 확인될 수 있다. 공지된 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티프 또는 예상된 단백질 형태 도메인을 확인하기 위해 컴퓨터화된 비교 방법이 사용된다. 공지된 3-차원 구조로 접히는 단백질 서열을 확인하는 방법이 공지되어 있다[문헌 「Bowie et al. Science 253:164 (1991)」 참조]. 따라서, 전술한 예는 통상의 기술자가 본 발명에 따라 구조적 및 기능적 도메인을 정의하는데 사용될 수 있는 서열 모티프 및 구조적 형태를 인식할 수 있다는 것을 입증한다.
일부 구현예에서, 아미노산 치환은: (1) 단백질분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키며, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화도를 변경하고, (4) 결합 친화도를 변경하며, 그리고 (4) 이러한 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변경하는 것이다. 유사체는 자연-발생 펩티드 서열 이외의 서열의 다양한 뮤테인을 포함할 수 있다. 예를 들어 단일 또는 다중 아미노산 치환(예를 들어 보존적 아미노산 치환)은 자연-발생 서열에서 (예를 들어 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드의 부분에서) 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 부모 서열의 구조적 특성을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다(예를 들어 대체 아미노산은 부모 서열에서 발생하는 나선을 파괴하지 않거나 부모 서열을 특징짓는 2차 구조의 다른 종류를 방해하지 않아야 한다). 당해 기술분야에 인식된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌 「Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))」; 「Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))」; 및 「Thornton et al. Nature 354:105 (1991)」에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 다르다.
본원에서 논의된 바와 같이, 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열에서 작은 변이는 본 발명에 포함되는 것으로 고려되며, 예를 들어 아미노산에서의 변이는 적어도 75%, 예를 들어 일부 구현예에서, 적어도 80%, 90%, 95%, 및 일부 구현예에서 99%를 유지하는 것을 제공한다. 특히, 보존적 아미노산 대체가 고려된다. 보존적 대체는 측면 사슬과 관련된 아미노산 패밀리 내에서 발생하는 것이다. 유전자 코딩된 아미노산은 일반적으로 패밀리로 나누어진다: (1) 산성 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산이고; (2) 염기성 아미노산은 리신, 아르기닌, 히스티딘이며; (3) 비-극성 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판이고, 그리고 (4) 비하전 극성 아미노산은 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신이다. 친수성 아미노산은 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 리신, 세린, 및 트레오닌을 포함한다. 소수성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 발린이다. 아미노산의 다른 패밀리는 (i) 지방족-하이드록시 패밀리인 세린 및 트레오닌; (ii) 아미드 함유 패밀리인 아스파라긴 및 글루타민; (iii) 지방족 패밀리인 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 및 (iv) 방향족 패밀리인 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신을 포함한다. 예를 들어 류신을 이소류신 또는 발린으로, 아스파르트산을 글루탐산으로, 트레오닌을 세린으로의 분리된 대체, 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산의 유사한 대체, 특히 대체가 프레임워크 부위 내에 아미노산을 포함하지 않는 경우, 결과적으로 생성된 분자의 결합 또는 특성에 주요 영향을 미치지 않을 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 아미노산 변화가 기능적 펩티드를 초래하는지 여부는 폴리펩티드 유도체의 특이적 활성화를 분석함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 어세이는 본원에 상세하게 기재된다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 통상의 기술자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 단편 또는 유사체의 아미노- 및 카복시-말단 기능적 도메인의 경계 부근에서 발생한다. 구조적 및 기능적 도메인은 공개된 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이터 또는 독점 서열 데이터베이스의 비교로 확인될 수 있다. 공지된 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티프 또는 예상된 단백질 형태 도메인을 확인하기 위해 컴퓨터화된 비교 방법이 사용된다. 공지된 3-차원 구조로 접히는 단백질 서열을 확인하는 방법이 공지되어 있다[문헌 「Bowie et al. Science 253:164 (1991)」 참조]. 따라서, 전술한 예는 통상의 기술자가 본 발명에 따라 구조적 및 기능적 도메인을 정의하는데 사용될 수 있는 서열 모티프 및 구조적 형태를 인식할 수 있다는 것을 입증한다.
일부 구현예에서, 아미노산 치환은: (1) 단백질분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키며, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화도를 변경하고, (4) 결합 친화도를 변경하며, 그리고 (4) 이러한 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변경하는 것이다. 유사체는 자연-발생 펩티드 서열 이외의 서열의 다양한 뮤테인을 포함할 수 있다. 예를 들어 단일 또는 다중 아미노산 치환(예를 들어 보존적 아미노산 치환)은 자연-발생 서열에서 (예를 들어 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드의 부분에서) 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 부모 서열의 구조적 특성을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다(예를 들어 대체 아미노산은 부모 서열에서 발생하는 나선을 파괴하지 않거나 부모 서열을 특징짓는 2차 구조의 다른 종류를 방해하지 않아야 한다). 당해 기술분야에 인식된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌 「Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))」; 및 「Thornton et at. Nature 354:105 (1991)」에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드 단편"은 아미노 말단 및/또는 카복시-말단 결실 및/또는 하나 이상의 내부 결실(들)을 갖는 폴리펩티드를 지칭하지만, 나머지 아미노산 서열이, 예를 들어 전장 cDNA 서열로부터 추론된 자연-발생 서열에서 상응하는 위치와 동일하다. 단편은 전형적으로 적어도 5, 6, 8 또는 10개의 아미노산 길이이고, 예를 들어 일부 구현예에서, 적어도 14개의 아미노산 길이이며, 일부 구현예에서, 적어도 20개의 아미노산 길이이며, 통상적으로 적어도 50개의 아미노산 길이이고, 그리고 일부 구현예에서, 적어도 70개의 아미노산 길이이다. 본원에 사용된 용어 "유사체"는 추론된 아미노산 서열의 일부와 실질적 동일성을 가지고 적절한 결합 조건 하에서, EGFR에 대한 특이적 결합을 갖는, 적어도 25개의 아미노산의 분절로 구성되는 폴리펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 폴리펩티드 유사체는 자연-발생 서열과 관련하여 보존적 아미노산 치환(또는 첨가 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 전형적으로 적어도 20개의 아미노산 길이이고, 예를 들어 일부 구현예에서, 적어도 50개의 아마노산 길이 또는 그 이상이고, 종종 전장의 자연-발생 폴리펩티드만큼 길 수 있다.
용어 "제제"는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질로 제조된 추출물을 나타내기 위해 사용된다.
본원에 사용된, 용어 "표지" 또는 "표지된"은, 예를 들어 방사성표지된 아미노산의 도입 또는 표시된 아비딘(예를 들어 광학적 또는 열량측정법에 의해 검출될 수 있는 형광 마터 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 성분의 폴리펩티드에 부착에 의해 검출가능한 마커의 도입을 지칭한다. 특정 상황에서, 표지 또는 마커는 또한 치료제일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있으며 이를 사용할 수 있다. 폴리펩티드에 대한 표지의 예는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들어 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 표지(예를 들어 형광단, 로다민, 란탄족 인광체), 효소 표지(예를 들어 서양고추냉이 퍼옥시다아제, p-갈락토시다아제, 루시페라아제, 알칼린 포스파타아제), 화학발광, 비오티닐 그룹, 2차 리포터에 의해 인식되는 예정된 폴리펩티드 에피토프(예를 들어 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그). 일부 구현예에서, 표지는 잠재적 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길의 스페이서 암(spacer arm)에 의해 부착된다. 본원에 사용된 용어 "약학 제제 또는 약물"은 환자에게 적절하게 투여될 때 원하는 치료 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물은 세포를 비롯한 2종 이상의 생성물들, 물질들(substance) 또는 화합물들의 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액,액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
상기 용어 "약학적 조성물"은 포유동물 대상체, 종종 인간에서의 약학적 용도에 적합한 조성물을 의미한다. 약학적 조성물은 전형적으로 유효량의 활성제(예를 들어 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트) 및 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한다. 담체, 부형제 또는 희석제는 전형적으로 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제이다.
본원에 사용되는 질병 또는 장애의 "치료", "처치", 또는 "치료요법"은 본 발명의 약제학적 조성물을 단독으로 또는 본원에 기재된 다른 화합물과 조합하여 투여함으로써 임상적 또는 진단 증후의 감소(decreasing), 중지(cessation) 또는 제거(elimination)에 의해 입증되는 바와 같이, 질환 또는 질환 진행을 늦추거나,정지시키거나, 역전시키는 것을 의미한다. 또한 "치료", "처치", 또는 "치료요법"은 급성 또는 만성 질병 또는 장애에서 증후의 심각성의 감소 또는 재발 속도의 감소를 의미한다. 암과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 암의 "치료" 또는, "억제하다", "억제하는" 또는 "억제"는, 표준 기준(standard criteria) 제한되지는 않지만 예를 들어 고형 종양에 대한 반응 평가 기준(Response Evaluation Criteria for Solid Tumors; RECIST)에 의해서 측정된 종양 성장 속도, 종양 성장의 중지, 또는 종양의 크기, 중량, 대사 활성, 또는 부피의 통계적으로 유의한 감소, 또는 무진행 생존(progression free survival; PFS) 또는 전체 생존(overall survival; OS)에서의 통계적으로 유의한 증가 중의 적어도 하나에 관한 것이다. 질병 또는 장애의 "예방하는", "예방(prophylaxis)" 또는 "예방(prevention)"은 질병 또는 장애의 발생 또는 발병 또는 증상의 일부 또는 전부를 예방하기 위해서, 또는 질병 또는 장애의 발명 가능성을 줄이기 위해서 약학적 조성물을 단독으로 또는 다른 화합물과 조합하여 투여하는 것을 의미한다.
상기 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 환자에게 단독으로(즉, 단일 요법(monotherapy)으로) 또는 추가 치료제와 조합하여 투여될 때 예를 들어 질병의 원인을 개선 또는 제거함으로써 질병 진행에서의 유의한 감소에서 통계적으로 유의한 감소를 일으키는 조성물의 양 및/도는 농도를 지칭한다. 유효량은 질병 또는 장애와 관련된 적어도 하나의 증상 또는 생물학적 반응 또는 효과를 저하, 경감 또는 완화시키고, 질병 또는 장애의 진행을 예방하거나, 환자의 신체 기능을 개선하는 양일 수 있다.
본원에 사용된 "실질적으로 순수한"은 대상 종(species)이 존재하는 우세한 종(즉, 몰 기준으로, 조성물에서 임의의 다른 개별 종보다 몰비가 풍부함)이라는 것을 의미하고, 실질적으로 정제된 분획은 대상 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50 퍼센트(몰 기준)를 포함하는 조성물이다.
일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80 퍼센트 이상, 예를 들어 일부 구현예에서, 약 85%, 90%, 95%, 및 99% 이상을 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 대상 종은 본질적인 균질성(오염물 종은 통상적인 검출방법으로 조성물에서 검출될 수 없음)으로 정제되고, 여기서 조성물은 단일 거대분자 종으로 필수적으로 이루어진다.
용어 환자는 인간 및 동물 대상을 포함한다.
본원의 다른 화학 용어는 문헌 「The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))」에 예시된 바와 같이, 당해 기술분야에서 통상적인 사용에 따라 사용된다.
본원에 사용되는 용어 "약"은 이 기술분야의 숙련가에게 용이하게 알려진 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터에 관한 구현예를 포함한다(그리고 기술한다). 예를 들어, 약 X를 참조하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
II. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트
면역글로불린 Fc 영역을 함유하는 제 1 구성요소 및 CD3-결합 영역을 포함하는 제 2 구성요소를 함유하는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트가 본원에 제공되며, 여기서 제 1 및 제 2 구성요소는 링커에 의해 결합되고, Fc 영역은 CD3-결합 영역에 대해 N-말단에 위치하며; 그리고 제 1 및 제 2 구성요소 중 하나 또는 둘 다는 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 비절단성 링커이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 프로테아제에 의한 절단을 위해 특이적으로 인식되는 기질 인식물(substrate recognition)을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로: 면역글로불린 Fc 영역; 링커; CD3(CD3ε)에 결합하는 CD3 결합 영역; 및 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로: 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인; 면역글로불린 Fc 영역; 링커; 및 CD3(CD3ε)에 결합하는 CD3 결합 영역을 함유한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 적어도 TAA에 결합하는 적어도 제 1 항원 결합 도메인 및 TAA에 결합하는 제 2 항원 결합 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는, N-말단부터 C-말단까지 순서대로: 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 제 1 항원 결합 도메인; 면역글로불린 Fc 영역; 링커; CD3(CD3ε)에 결합하는 CD3 결합 영역; 및 종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 제 2 항원 결합 도메인을 함유한다.
본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 구성요소 각각은 하기에 보다 상세하게 기재된다.
1. 항-CD3 결합 도메인
본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 항-CD3 결합 도메인의 하나 이상의 카피를 포함한다. 본 발명의 항-CD3 결합 도메인은 T 세포 상의 CD3ε의 관여를 통해 T 세포를 활성화시킨다. 본 발명의 항-CD3 결합 도메인은 CD3-매개 T 세포 활성화를 작용(agonize), 자극, 활성화 및/또는 다르게는 증강(argument)시킨다. CD3의 생물학적 활성은, 예를 들어 CD3와 T 세포 수용체(TCR)의 항원-결합 서브유닛 사이의 상호작용을 통한 T 세포 활성화 및 다른 신호전달을 포함한다. 예를 들어 본 발명의 항-CD3 결합 도메인은 예를 들어 CD3-매개 T 세포 활성화를 작용, 자극, 활성화 또는 다르게는 증강과 같이 부분적으로 또는 완전히 조절함으로써, T 세포 상의 CD3ε 관여를 통해 T 세포를 완전히 또는 부분적으로 활성화시킨다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항-CD3 결합 도메인은 CD3ε으로도 알려진, CD3의 입실론 사슬에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 항-CD3ε 결합 도메인은 T 세포 상에서 CD3ε의 관여를 통해 T 세포를 활성화시킨다. 본 발명의 항-CD3ε 결합 도메인은, 예를 들어 포유동물 단일클론 항체, 영장류 단일클론 항체, 완전 인간 단일클론 항체, 및 인간화 단일클론 항체 및 키메릭 항체, 및 이의 항원-결합 단편과 같은 단일클론 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3ε 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 하나 이상의 카피를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3ε 결합 도메인은 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, 및 VH CDR3 서열의 조합을 포함하고, 여기서 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, 및 VH CDR3 서열 중 적어도 하나는 적어도 아미노산 서열 TYAMN(서열번호 16)을 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 RIRSKYNNYATYYADSVKD(서열번호 17)를 포함하는 VH CD2 서열; 및 적어도 아미노산 서열 HGNFGNSYVSWFAY(서열번호 18)을 포함하는 VH CDR3 서열로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항-CD3ε 결합 도메인은 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, 및 VH CDR3 서열의 조합을 포함하고, 여기서 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, 및 VH CDR3 서열 중 적어도 하나는 적어도 아미노산 서열 GFTFNTYAMN(서열번호 211)을 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 RIRSKYNNYATY(서열번호 212)를 포함하는 VH CDR2 서열; 및 적어도 아미노산 서열 HGNFGNSYVSWFAY(서열번호 18)을 포함하는 VH CDR3 서열로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 항-CD3ε 결합 도메인은 VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 포함하고, 여기서 VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열 중 적어도 하나는 적어도 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 19)을 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 20)를 포함하는 VL CDR2 서열; 및 적어도 아미노산 서열 ALWYSNLWV(서열번호 21)를 포함하는 VL CDR3 서열로부터 선택된다.
일부 구현예에서 항-CD3ε 결합 도메인은 적어도 아미노산 서열 TYAMN(서열번호 16)을 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 RIRSKYNNYATYYADSVKD(서열번호 17)를 포함하는 VH CDR2 서열; 적어도 아미노산 서열 HGNFGNSYVSWFAY(서열번호 18)를 포함하는 VH CDR3 서열; 적어도 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 19)을 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 20)를 포함하는 VL CDR2 서열; 및 적어도 아미노산 서열 ALWYSNLWV(서열번호 21)를 포함하는 CDR3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서 항-CD3ε 결합 도메인은 적어도 아미노산 서열 GFTFNTYAMN(서열번호 211)을 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 RIRSKYNNYATY(서열번호 212)를 포함하는 VH CDR2 서열; 적어도 아미노산 서열 HGNFGNSYVSWFAY(서열번호 18)를 포함하는 VH CDR3 서열; 적어도 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 19)을 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 20)를 포함하는 VL CDR2 서열; 및 적어도 아미노산 서열 ALWYSNLWV(서열번호 21)를 포함하는 CDR3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서 항-CD3ε 결합 도메인은 적어도 아미노산 서열 GFTFNTYAMN(서열번호 211)을 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 RIRSKYNNYATY(서열번호 212)를 포함하는 VH CDR2 서열; 적어도 아미노산 서열 HGNFGNSYVSWFAY(서열번호 18)를 포함하는 VH CDR3 서열; 적어도 아미노산 서열 GSSTGAVTTSNYAN(서열번호 229)을 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 20)를 포함하는 VL CDR2 서열; 및 적어도 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 225)를 포함하는 CDR3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3ε 결합 도메인은 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, 및 VH CDR3 서열의 조합을 포함하고, 여기서 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, 및 VH CDR3 서열 중 적어도 하나는 아미노산 서열 TYAMN(서열번호 16)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 RIRSKYNNYATYYADSVKD(서열번호 17)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CDR2 서열; 및 아미노산 서열 HGNFGNSYVSWFAY(서열번호 18)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CDR3 서열로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 항-CD3ε 결합 도메인은 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, 및 VH CDR3 서열의 조합을 포함하고, 여기서 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, 및 VH CDR3 서열 중 적어도 하나는 아미노산 서열 GFTFNTYAMN(서열번호 211)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 RIRSKYNNYATY(서열번호 212)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CDR2 서열; 및 아미노산 서열 HGNFGNSYVSWFAY(서열번호 18)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CDR3 서열로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 항-CD3ε 결합 도메인은 VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 포함하고, 여기서 VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열 중 적어도 하나는 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 19)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하는 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 20)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 ALWYSNLWV(서열번호 21)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하는 VL CDR3 서열로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 항-CD3ε 결합 도메인은 아미노산 서열 TYAMN(서열번호 16)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 RIRSKYNNYATYYADSVKD(서열번호 17)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VH CD2 서열; 아미노산 서열 HGNFGNSYVSWFAY(서열번호 18)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VH CDR3 서열, 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 19)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 20)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 ALWYSNLWV(서열번호 21)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VL CDR3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3ε 결합 도메인은 아미노산 서열 GFTFNTYAMN(서열번호 211)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 RIRSKYNNYATY(서열번호 212)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VH CD2 서열; 아미노산 서열 HGNFGNSYVSWFAY(서열번호 18)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VH CDR3 서열, 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 19)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 20)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 ALWYSNLWV(서열번호 21)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VL CDR3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3ε 결합 도메인은 아미노산 서열 GFTFNTYAMN(서열번호 211)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 RIRSKYNNYATY(서열번호 212)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VH CD2 서열; 아미노산 서열 HGNFGNSYVSWFAY(서열번호 18)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VH CDR3 서열, 아미노산 서열 GSSTGAVTTSNYAN(서열번호 229)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 230)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 225)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VL CDR3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서 항-CD3ε 결합 도메인은 적어도 아미노산 서열 GFTFSTYAMN(서열번호 227)을 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 RIRSKYNNYATY(서열번호 228)를 포함하는 VH CDR2 서열; 적어도 아미노산 서열 HGNFGDSYVSWFAY(서열번호 224)를 포함하는 VH CDR3 서열; 적어도 아미노산 서열 GSSTGAVTTSNYAN(서열번호 229)을 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 230)를 포함하는 VL CDR2 서열; 및 적어도 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 225)를 포함하는 CDR3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3ε 결합 도메인은 아미노산 서열 GFTFSTYAMN(서열번호 227)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 RIRSKYNNYATY(서열번호 228)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VH CD2 서열; 아미노산 서열 HGNFGDSYVSWFAY(서열번호 224)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VH CDR3 서열, 아미노산 서열 GSSTGAVTTSNYAN(서열번호 229)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 230)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 225)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VL CDR3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서 항-CD3ε 결합 도메인은 적어도 아미노산 서열 VLWYSNRWV(서열번호 226)을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서 항-CD3ε 결합 도메인은 적어도 아미노산 서열 VLWYSNRWV(서열번호 226)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3ε 결합 도메인은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체, 및 단일 도메인 경쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 CD3ε(본원에서 항-CD3ε Fv 단편으로 지칭됨)에 결합하는 Fv 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3ε Fv 항체 단편은 이황화 안정화 항-CD3 결합 Fv 단편(dsFv)이다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 CD3 결합에 대해 1가이다.
일부 구현예에서, 상기 CD3 결합 영역은 단일 사슬 항체가 아니다. 예를 들어 일부 측면에서, 상기 CD3 결합 영역은 단일 사슬 가변 단편(scFv)이 아니다.
일부 구현예에서, 상기 CD3 결합 영역은 예를 들어 전술한 어느 것과 같은 가변 중쇄(Hv, VH라고도 함) 및 가변 경쇄(Lv, VL이라고도 함)을 함유하는 Fv 항체 단편이다. 상기 구현예의 측면에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 섹션 II.2에 기술된 임의의 것과 같은 상기 Fc 이종이량체의 두 폴리펩티드 사이에서 이종이량체 결합할 수 있는 2개의 상이한 Fc 폴리펩티드를 함유하는 이종이량체 Fc 영역이다. 이러한 구현예에서, 상기 CD3 결합 영역의 상기 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)는 상기 이종이량체 Fc의 반대측 사슬 상에 연결된다.
일부 구현예에서, 항-CD3ε Fv 항체 단편은 서열번호 32-81의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3ε Fv 항체 단편은 서열번호 32-81로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3ε Fv 항체 단편은 서열번호 32-62의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 및 서열번호 63-81로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3ε Fv 항체 단편은 서열번호 32-62로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열 및 서열번호 63-81 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 이의 항-CD3ε 결합 도메인은 서열번호 32 내지 81의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 이의 항-CD3ε 결합 도메인은 서열번호 32 내지 62의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 63 내지 81의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 이의 항-CD3ε 결합 도메인은 중쇄 가변 아미노산 서열과 경쇄 가변 아미노산 서열의 조합을 포함하는 Fv 단편이다. 일부 구현예에서, 이의 항-CD3ε 결합 도메인은 서열번호 14, 15, 32-81, 191, 196-200, 211, 및 212로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 아미노산 서열 및 경쇄 가변 아미노산 서열의 조합을 포함하는 Fv 단편이다. 일부 구현예에서, 이의 항-CD3ε 결합 도메인은 아미노산 서열 14, 15, 32-81, 191, 196-200, 211, 및 212로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 아미노산 서열 및 경쇄 가변 아미노산 서열의 조합을 포함하는 Fv 단편이다. 일부 구현예에서, 이의 항-CD3ε 결합 도메인은 서열번호 32 내지 62의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 아미노산 서열과 서열번호 63 내지 81로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 조합을 포함하는 Fv 단편이다. 일부 구현예에서, 이의 항-CD3ε 결합 도메인은 서열번호 14, 32 내지 62, 196-198, 및 211로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 중쇄 가변 아미노산 서열 및 서열번호 15, 63-81, 191, 199, 200, 및 212로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 경쇄 가변 아미노산 서열의 조합을 포함하는 Fv 단편이다.
일부 구현예에서, 이의 항-CD3ε 결합 도메인은 서열번호 32 내지 81, 191, 196-200, 211, 및 212의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 이의 항-CD3ε 결합 도메인은 서열번호 32 내지 62, 196-198, 및 211의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 63 내지 81, 191, 199, 200, 및 212의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3ε Fv 항체 결합 단편은 서열번호 14, 32-43, 45-47, 48, 196 및 211로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열 및 서열번호 15, 63, 65-71, 73, 75, 77, 및 199로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3ε Fv 항체 단편은 서열번호 14, 32-43, 45-47, 48, 196 및 211의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 서열번호 15, 63, 65-71, 73, 75, 77, 및 199로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3ε 결합 도메인은 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3ε 결합 도메인은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다.
일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 196의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3ε 결합 도메인은 서열번호 199의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 196의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 199의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 196의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3ε 결합 도메인은 서열번호 199의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 196의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 199의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 Fv는 상기 VH-VL　이종이량체가 사슬간 이황화 결합에 의해서 안정화되는 이황화 안정화된 Fv 단편(dsFv)이다. 일부 구현예에서, 상기 사슬간 이황화 결합은 상기 VH 및/또는 VL 사슬의 프레임워크 위치(framework position)에서 위치의 돌연변이에 의해서 조작된다. 일부 구현예에서, 상기 이황화 안정화된 항-CD3 Fv는 카밧 돌연변이에 의한 돌연변이체 44 내지 Cys를 갖는 항-CD3 VH 및 돌연변이체 100 내지 Cys를 갖는 항-CD3 VL을 포함한다. 에를 들어 일부 구현예에서, 상기 VH 사슬은 돌연변이체 G44C를 함유하고 상기 VL 사슬은 각각 카밧 번호매김에 의한 상기 돌연변이체 G100C를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 이황화 안정화된 항-CD3 Fv는 카밧 번호매김에 의한 위치 105 내지 Cys에서 돌연변이체를 갖는 항-CD3 VH 및 돌연변이체 위치 43 내지 Cys를 갖는 항-CD3 VL을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3ε Fv 항체 결합 단편은 서열번호 44, 49-62, 197 및 198로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열 및 서열번호 　64, 72, 74, 76, 78-81, 191, 200 및 212로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열의 조합을 포함한다. 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 Fv는 각각 카밧 번호매김(kabat numbering)에 의한 돌연변이체 G44C를 함유하는 VH 사슬 및 돌연변이체 G100C를 함유하는 VL 사슬을 갖는 dsFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD3ε Fv 항체 단편은 서열번호 44, 49-62, 197 및 198의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 서열번호 64, 72, 74, 76, 78-81, 191, 200 및 212로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 44의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3ε 결합 도메인은 서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 44의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 Fv는 각각 카밧 번호매김에 의한 돌연변이체 G44C를 함유하는 VH 사슬 및 돌연변이체 G100C를 함유하는 VL 사슬을 갖는 dsFv이다. 일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3ε 결합 도메인은 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다.
일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 198의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3ε 결합 도메인은 서열번호 200의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 198의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 200의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 Fv는 각각 카밧 번호매김에 의한 돌연변이체 G44C를 함유하는 VH 사슬 및 돌연변이체 G100C를 함유하는 VL 사슬을 갖는 dsFv이다. 일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 198의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3ε 결합 도메인은 서열번호 200의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 198의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 200의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다.
일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 197의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3ε 결합 도메인은 서열번호 200의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 197의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 200의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 Fv는 각각 카밧 번호매김에 의한 돌연변이체 G44C를 함유하는 VH 사슬 및 돌연변이체 G100C를 함유하는 VL 사슬을 갖는 dsFv이다. 일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 197의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3ε 결합 도메인은 서열번호 200의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 일부 구현예에서, 그의 항-CD3ε Fv 항체 결합 도메인은 서열번호 197의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 200의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다.
2. 면역글로불린 Fc 폴리펩티드:
본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 제 1 구성요소는 면역글로불린 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG1 이소타입, IgG2 이소타입, IgG3 이소타입, 및 IgG4 서브클래스로 이루어진 군으로부터 선택되는 IgG 이소타입이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 Fc이다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 1 내지 6 중 임의의 것의 면역학적 활성 단편인 Fc 사슬을 함유한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 1 내지 6 중 임의의 아미노산 서열 또는 면역학적으로 활성인 이의 단편과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 Fc 폴리펩티드 사슬을 함유한다.
일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 각각 Fc를 함유하는 폴리펩티드들에 의해 형성된 이량체이다. 일부 구현예에서, 동일하거나 실질적으로 동일한 폴리펩티드는 동종이량체를 생성하기 위해 이량체화될 것이다. 일부 구현예에서, 이량체는 다중특이적 폴리펩티드의 2개의 폴리펩티드가 동일한 동종이량체이다. 다른 경우, Fc 영역은 상이한 폴리펩티드가 이종이량체를 생성하기 위해 이량체화될 수 있는 이종이량체화를 촉진하기 위해 돌연변이체 또는 변형된 Fc 도메인에 의해 형성된다. 따라서, 일부 구현예에서, 이량체는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 2개의 폴리펩티드 사슬이 상이한 이종이량체이다. 이종이량체화를 촉진하기 위한 예시적인 변형체는 공지되어 있으며, 하기 기재된 바와 같은 임의의 것을 포함한다.
일반적으로, Fc 영역은 면역글로불린의 주요 기능인, 항원-결합 능력 이외에 보체-의존적 세포독성(CDC) 및 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC)과 같은 효과기 기능을 담당한다. 추가로, Fc 영역에 존재하는 FcRn 서열은 생체 내(in vivo) FcRn 수용체와의 결합에 의해 생체 내(in vivo) 반감기를 증가시킴으로써 혈청에서 IgG 수준을 조절하는 역할을 한다. 일부 구현예에서, 이러한 기능은 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 함께 사용하기 위해 Fc 영역에서 감소 또는 향상과 같이 변경될 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 Fc 영역은 하나 이상의 효과기 기능을 나타낸다. 일부 경우에, Fc 영역은, 예를 들어 ADCC(예를 들어 NK 세포에 의한 그랜자임 B의 방출), ADCP, 및/또는 CDC와 같은 Fc-매개 효과기 기능을 제공할 수 있다. 따라서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트가 절단가능한 링커를 함유하는 일부 구현예에서, 링커의 절단은 각각 생물학적 활성을 갖는 2개의 구성요소를 생성할 수 있다: T 세포 상의 CD3에 결합 및 관여(engage)할 수 있는 CD3-결합 영역 및 표적-특이적 효과기 기능을 나타낼 수 있는 TAA-항원 결합 도메인에 연결된 Fc 영역. 본원에 제공된 특정 구현예에서, 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 비-절단성 링커를 함유하고, 일부 측면에서, 독립적인 Fc-매개된 효과기 기능을 나타낼 수 없다.
일부 구현예에서, Fc 영역은 하나 이상의 효과기 기능을 변경하기 위해 돌연변이체 또는 변형된 Fc 폴리펩티드를 포함한다. 효과기 기능을 감소시키는 것과 같은 변경을 위한 Fc 폴리펩티드에 대한 돌연변이의 다양한 예는 공지되어 있으며, 하기 기재된 바와 같은 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역에서의 아미노산 치환에 대한 언급은, 특정 서열번호에 대한 언급과 함께 기재되지 않는 한, 카밧(Kabat)에 의한 EU 번호매김에 의한 것이다. EU 번호매김은 공지되어 있으며, 가장 최근에 업데이트된 IMGT 과학 차트(IMGT®, international ImMunoGeneTics information system®, http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_ IGHGnber.html (생성: 2001년 05월 17일, 마지막 업데이트: 2013년 01월 10일) 및 문헌 「Kabat E.A. et al. Sequences of Proteins of Immunological interest. 5th ed. US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242(1991)」에 보고된 바와 같은 EU 지표에 따른다.
일부 구현예에서, 감소된 효과기 기능을 나타내는 Fc 영역을 함유하는 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 제한된 CD3 결합이 요구되는 적용에 대해 바람직한 후보일 수 있으나, 특정 효과기 기능(CDC 및 ADCC와 같은)은 불필요하거나 유해하다..생체 외(in vitro) 및/또는 생체 내(in vivo) 세포독성 어세이는 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어 Fc 수용체(FcR) 결합 어세이는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 및/또는 절단된 이의 구성요소가 FcγR 결합이 결여되지만(따라서, ADCC 활성이 결여될 수 있음), FcRn 결합 능력은 유지하도록 하기 위해 수행될 수 있다. ADCC, NK 세포를 매개하기 위한 1차 세포는 FcγRIII만을 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 생체 외(in vitro) 어세이의 비-제한적인 예는 미국특허 제제 5,500,362호[예를 들어 「Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063(1986)」 및 「Hellstrom, I et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502(1985)」 참조]; 미국특허 제5,821,337호[문헌 「Bruggemann, M. et al. J. Exp. Med. 166:1351-1361(1987) 참조]에 기재되어 있다. 다르게는, 비-방사성 어세이 방법이 적용될 수 있다(예를 들어 유세포 분석을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 어세이(CellTechnology, Inc. 캘리포니아, 마운틴뷰; 및 CytoTox 96™ 비-방사성 세포독성 어세이[문헌 「Promega, Madison, Wis.」 참조]. 이러한 어세이에 유용한 효과기 세포는 말초혈액단핵세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 다르게는, 또는 추가적으로, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 생체 내(in vivo), 예를 들어 문헌 「Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)」에 기재된 바와 같은 동물모델에서 평가될 수 있다. C1q 결합 어세이 또한 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 또는 절단된 이의 구성요소가 C1q에 결합할 수 없고 이에 따라 CDC 활성이 결여되어 있다는 것을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어 국제공개공보 제WO2006/029879호 및 제WO2005/100402호의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참고한다. 보체 활성을 평가하기 위해, CDC 어세이가 수행될 수 있다[예를 들어 문헌 「Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)」; 「Cragg, M. S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)」; 및 「Cragg, M. S. and M. J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004))」 참조]. FcRn 결합 및 생체 내(in vivo) 클리어런스/반감기 결정은 또한 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다[예를 들어 문헌 「Petkova, S. B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)」 참조].
일부 구현예에서, 면역글로불린 Fc 영역 또는 면역학적으로 활성인 이의 단편은 IgG 이소타입이다. 예를 들어 융합 단백질의 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG1 이소타입이며, 다음의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00001
일부 구현예에서, 면역글로불린 Fc 영역 또는 면역학적으로 활성인 이의 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 인간 IgG1 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, IgG1 Fc 폴리펩티드 또는 예를 들어 하기에서 기술되는 바와 같은 그의 변이체는 G1 m1 또는 G1 m3 동종(allotype)으로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 Fc 영역은 인간 G1 m1 동종의 아미노산, 예를 들어 서열번호 1에 제시된 것과 같은 위치 356 및 358에서 Asp (D) 및 Leu (L)을 함유하는 잔기를 함유할 수 있다. 일부 경우에, Fc 폴리펩티드는 동종 G1 m1의 잔기를 재구성하기 위해서 아미노산 치환 E356D 및 M358L을 함유할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 Fc 영역은 인간 G1 m3 동종의 아미노산, 예를 들어 서열번호 194 및 195에 제시된 것과 같은 EU 번호매김에 의한 위치 356 및 358에서 잔기 Glu (E) 및 Met (M)를 함유할 수 있다. 일부 경우에, Fc 폴리펩티드는 동종 G1 m3의 잔기를 재구성하기 위해 아미노산 치환 D356E 및 L358M을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 IgG1 Fc 영역은 항체-의존 세포의 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존 세포독성(CDC), 예를 들어 Natsume 등의 2008 Cancer Res, 68(10): 3863-72; Idusogie 등의 2001 J Immunol, 166(4): 2571-5; Moore 등의 2010 mAbs, 2(2): 181-189; Lazar 등의 2006 PNAS, 103(11): 4005-4010, Shields 등의 2001 JBC, 276(9): 6591-6604; Stavenhagen 등의 2007 Cancer Res, 67(18): 8882-8890; Stavenhagen 등의 2008 Advan. Enzyme Regul., 48: 152-164; Alegre 등의 1992 J Immunol, 148: 3461-3468; Reviewed in Kaneko 및 Niwa, 2011 Biodrugs, 25(1):1-11에 제시된 아미노산 변형체를 변경하기 위해 변형되며, 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 인간 IgG1 Fc 영역과 같은 Fc 영역은 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 향상시키기 위해 변형된다. ADCC를 향상시키는 돌연변이의 예는, 예를 들어 Ser239Asp 및 Ile332Glu(S239D, I332E)인, Ser239 및 Ile332에서의 변형체를 포함한다. CDC를 향상시키는 돌연변이의 예는, Lys326 및 Glu333에서의 변형체를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 이들 위치 중의 하나 또는 둘 다에서, 예를 들어 카밧 번호매김 시스템을 이용한 Lys326Ala 및/또는 Glu333AlA(K326A 및 E333A)으로 변형된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 인간 IgG1 Fc 영역 융합 단백질은 N297에서의 N-연결 글리칸-사슬에 결합된 푸코오스가 결여되어 있거나 이를 감소시킨다. FUT8 결핍 세포주에서의 생산; 포유동물 세포 배양 배지에 대한 부가 억제제, 예를 들어 카스타노스페르민; 및 생산 세포주의 대사를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 푸코실화를 방지하는 수많은 방법이 있다. 일부 구현예에서, 인간 IgG1 Fc 영역은 융합 단백질의 글리코실화를 방지하기 위해, 예를 들어 Asn297AlA(N297A) 또는 Asn297Asp(N297D)와 같이 아미노산 Asn297에서 변형된다.
일부 구현예에서, 상기 Fc 영역은 예를 들어 감소된 Fc 수용체 결합을 통해서, 예를 들어 FcγR 결합에 결합하지만 일반적으로 FcRn 결합에는 결합하지 않는 감소된 Fc-매개된 효과기 기능을 제공하도록 변경된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 Fc 영역은 Fc 수용체 결합을 감소시키기 위해 다음의 위치 중의 하나 이상에서 변경된다: Leu 234(L234), Leu235(L235), Asp265(D265), Asp270(D270), Ser298(S298), Asn297(N297), Asn325(N325) orAla327(A327). 예를 들어 Leu 234AlA(L234A), Leu235AlA(L235A), Asp265Asn(D265N), Asp270Asn(D270N), Ser298Asn(S298N), Asn297AlA(N297A), Asn325Glu(N325E) orAla327Ser(A327S). 일부 구현예에서, 융합 단백질의 Fc 영역은 Fc 수용체 상호작용을 변경하기 위해, 예를 들어 Leu235Glu(L235E) 또는 Leu235AlA(L235A)과 같이, 아미노산 Leu235(상기 서열번호 1에서 박스표시 됨, 카밧 번호매김)에서 변형된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 Fc 영역은 Fc 수용체 상호작용을 변경하기 위해 아미노산 Leu234(상기 서열번호 1에서 박스표시 됨, 카밧 번호매김)에서, 예를 들어 Leu234AlA(L234A)와 같이 변형된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 Fc 영역은 아미노산 234 및 235 둘 다에서, 예를 들어 Leu234Ala 및 Leu235AlA(L234A/L235A) 또는 Leu234Val 및 Leu235AlA(L234V/L235A)과 같이 변경된다. 바람직한 구현예에서, Fc 영역 내 변형체는 Fc-수용체-감마 수용체에 대한 결합을 감소시키면서 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합에 최소한의 영향을 미친다.
일부 구현예에서, 인간 IgG Fc 영역은 FcRn 결합을 향상시키기 위해 변형된다. FcRn에 대한 결합을 향상시키는 Fc 돌연변이의 예는 Met252Tyr, Ser254Thr, Thr256Glu(각각 M252Y, S254T, T256E)(카밧 번호매김, Dall'Acqua 등의 2006, J. Biol Chem Vol. 281(33) 23514-23524), Met428Leu 및 Asn434Ser(M428L, N434S)(Zalevsky 등의 2010 Nature Biotech, Vol. 28(2) 157-159)(EU index of Kabat 등의 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest의 EU 지수). 일부 구현예에서, 돌연변이체 또는 변형된 Fc 폴리펩티드는 다음의 돌연변이체를 포함한다: 카밧 번호매김 시스템을 사용한 Met252Tyr 및 Met428Leu 또는 Met252Tyr 및 Met428Val(M252Y, M428L, 또는 M252Y, M428V).
일부 구현예에서, 융합 단백질의 Fc 영역은 Fc 수용체 결합을 감소시키기 위해 다음의 위치 중의 하나 이상에서 아미노산이 결여되어 있다: Glu233(E233), Leu234(L234), 또는 Leu235(L235). 이들 구현예에서, 이러한 3개의 아미노산의 Fc 결실은 보체 단백질 C1q 결합을 감소시킨다.
Figure pct00002
일부 구현예에서, 상기 Fc 영역은 Fc 수용체 결합을 감소시키기 위해 Glu233(E233), Leu234(L234) 또는 Leu235(L235) 중의 하나 이상에서 돌연변이된다. 상기 하나 이상의 돌연변이는 E233P, L234V 및/또는 L235A를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질의 Fc 영역은 Fc 수용체 결합을 감소시키기 위해 Gly236(상기 서열번호 1에서 박스표시 됨)에서 변형된다. 예를 들어 Gly236은 융합 단백딜로부터 결실된다. 일부 구현예에서, 인간 IgG1 Fc 영역은 CD32A와의 상호작용을 향상시키기 위해 아미노산 Gly236에서, 예를 들어 Gly236AlA(G236A)와 같이 변형된다.
특정 구현예에서, 예를 들어 FcγR에 대한 Fc 수용체 결합을 감소시킴으로써, Fc 효과기 기능을 감소시키는 상기 Fc의 돌연변이는 G236R/L328R, E233P/L234V/L235A/G236del/S239K, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G 또는 E233P/G236del/S267K/A327G L234V/L235A/G236del 중으로부터의 돌연변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 IgG1 Fc 영역은 Lys447(Kabat 등의 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest의 EU 지수)이 결여되어 있다.
일부 구현예에서, 융합 또는 면역학적으로 활성인 이의 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 인간 IgG2 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질의 면역글로불린 Fc 영역 또는 면역학적 활성 단편은 다음의 아미노산 서열을 갖는, 인간 IgG2 이소타입이다:
Figure pct00003
일부 구현예에서, 융합 또는 면역학적으로 활성인 이의 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 인간 IgG2 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 IgG2 Fc 영역은 항체의 글리코실화를 방지하기 위해, 예를 들어 Asn297AlA(N297A) 또는 Asn297Asp(N297D)와 같이 아미노산 Asn297(박스표시됨)에서 변현된다. 일부 구현예에서, 인간 IgG2 Fc 영역은 Lys447(Kabat 등의 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest의 EU 지수)이 결여되어 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질의 면역글로불린 Fc 영역 또는 면역학적 활성 단편은 다음의 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG3 이소타입이다:
Figure pct00004
일부 구현예에서, 항체 또는 면역학적으로 활성인 이의 단편은 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 인간 IgG3 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 IgG3 Fc 영역은 항체의 글리코실화를 방지하기 위해 아미노산 Asn297(박스표시 됨, 카밧 번호매김)에서, 예를 들어 Asn297AlA(N297A) 또는 Asn297Asp(N297D)와 같이 변형된다. 일부 구현예에서, 인간 IgG3 Fc 영역은 반감기를 연장하기 위해 아미노산 435에서, 예를 들어 Arg435His(R435H)와 같이 변형된다. 일부 구현예에서, 인간 IgG3 Fc 영역은 Lys447(Kabat 등의 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest의 EU 지수)이 결여되어 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질의 면역글로불린 Fc 영역 또는 면역학적 활성 단편은 다음의 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG4 이소타입이다:
Figure pct00005
일부 구현예에서, 항체 또는 면역학적으로 활성인 이의 단편은 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 인간 IgG4 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질의 면역글로불린 Fc 영역 또는 면역학적 활성 단편은 다음의 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG4 이소타입이다:
Figure pct00006
일부 구현예에서, 항체 또는 면역학적으로 활성인 이의 단편은 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 인간 IgG4 폴리펩티드 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 인간 IgG4 Fc 영역은 Fc 수용체 상호작용을 변경하기 위해 아미노산 235에서, 예를 들어 Leu235Glu(L235E)와 같이 변형된다. 일부 구현예에서, 인간 IgG4 Fc 영역은 항체의 글리코실화를 방지하기 위해 아미노산 Asn297(박스표시 됨, 카밧 번호매김)에서, 예를 들어 Asn297AlA(N297A) 또는 Asn297Asp(N297D)와 같이 변형된다. 일부 구현예에서, 인간 IgG4 Fc 영역은 Lys447(Kabat 등의 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest의 EU 지수)이 결여되어 있다.
일부 구현예에서, 인간 IgG Fc 영역은 CH3:CH3 경계면(interface)에서 동종이량체화를 안정화시키기 위해 Ser354에서 Cys(S354C) 및 Tyr349에서 Cys(Y349C)로의 변형(S354C/Y349C)에 의해 2개의 이황화 결합을 도입함으로써 변형된다.
본원에 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 특정 구현예에서, 인간 IgG Fc 영역은 이종이량체화를 유도하기 위해 변형된다. 다양한 방법이 상보적인 Fc 폴리펩티드의 이종이량체화를 촉진하기 위해 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 「Ridgway et al, Protein Eng. 9:617-621 (1996)」; 「Merchant et al, Nat. Biotechnol. 16(7): 677-81 (1998)」; 「Moore et al. (2011) MAbs, 3:546-57」; 「Von Kreudenstein et al. MAbs, (2013) 5:646-54」; 「Gunasekaran et al. (2010) J. Biol. Chem., 285:19637-46」; 「Leaver-Fay et al. (2016) Structure, 24:641-51」; 「Ha et al. (2016) Frontiers in Immunology, 7:1; Davis et al. (2010) Protein Eng Des Sel, 23:195-202」; 국제공개공보 제WO1998/050431호, 제WO2009/089004호, 제WO2011143545호, 제WO2014/067011호, 제WO2012/058768호, 제WO2018027025호; 공개된 미국 특허출원 제2014/0363426호, 제2015/0307628호, 제2018/0016354호, 제2015/0239991호; 및 미국특허 제5,731,168호, 제7,183,076호, 제9,701,759호, 제9,605,084호, 및 제9,650,446호를 참고한다. Fc 사슬의 이종이량체화를 촉진하는 방법은, "노브-인투-홀(knob-into-hole)" 돌연변이의 세트를 포함하거나 또는 Fc의 정전기적 스티어링(steering)을 초래하여 상이한 폴리펩티드 사슬 사이의 매력적인 상호작용을 촉진하는 돌연변이체를 포함하는 것과 같은, Fc 영역의 돌연변이체 유발을 포함한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 이종이량체의 Fc 폴리펩티드는 Fc 이량체 경계면에 걸쳐 전하 극성을 변경하는 돌연변이체를 포함하여, 정전기적으로 매치된 Fc 사슬의 공동발현이 적합하고 매력적인 상호작용을 지원함으로써 바람직한 Fc 이종이량체 형성을 촉진하는 반면, 적합하지 않은 밀어내는 전하 상호작용은 원치않는 Fc 동종이량체 형성을 억제한다[문헌 「Guneskaran et al. (2010) JBC, 285: 19637-19646」 참조]. 세포에서 공동-발현될 때, 사슬 사이의 결합이 가능하지만, 사슬은 전하의 반발로 실질적으로 자가-결합하지 않는다. 이종이량체 Fc를 제작하기 위한 다른 전략은 인간 IgG 및 IgA CH3 도메인 분절을 혼합하여, 상보적인 CH3 이종이량체를 생성하는 것을 포함하며, 이를 SEED Fc로 지칭한다.
이종이량체화를 위한 방법 및 변이체는 또한 "노브" 및 "홀" 돌연변이체("왜곡(skew)" 변이체라고도 함), "정전기 스티어링(electrostatic steering)" 또는 "전하쌍", 및 pI 변이체에 관한 돌연변이체를 비롯하여 국제공개공보 제WO2014/145806호에 기술된 것들을 포함한다. 이종이량체 변이체는 또한 미국출원공개공보 제US2012/0149876호 또는 제US2018/011883호에 기술된 임의의 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 이종이량체화를 촉진하기 위해 Fc 이종이량체의 폴리펩티드 둘 다는 쌍을 이루거나 상보적인 아미노산 변형체를 함유한다. Fc 융합의 폴리펩티드의 예시적인 쌍의 아미노산 변형체는 표 1에 기재되어 있다.
Figure pct00007
일부 구현예에서, 변형체는 제 1 및 제 2 Fc-함유 폴리펩티드의 복합체화를 촉진하기 위해 돌출부(protuberance)가 공동(cavity)에 위치할 수 있도록 돌출부(노브)를 제 1 Fc 폴리펩티드로 도입하고 공동(홀)을 제 2 Fc 폴리펩티드로 도입하는 것을 포한다. 폴리펩티드에서 돌기 또는 공동을 생성하기 위한 대체 및/또는 변형체를 표적하는 아미노산은 전형적으로 제 2 폴리펩티드의 경계면에서 하나 이상의 아미노산과 상호작용을 하거나 접촉하는 접점(interface) 아미노산이다.일부 구현예에서, 돌출부(홀) 아미노산을 함유하도록 변형된 제 1 Fc 폴리펩티드는 천연 또는 본래의 아미노산을 제 1 Fc 폴리펩티드의 경계면으로부터 돌출한 적어도 하나의 측면 사슬을 가지는 아미노산으로 대체하는 것을 포함하고, 따라서 제 2 폴리펩티드의 인접한 경계면에서 보상 공동(홀)에 위치할 수 있다. 대부분의 경우, 대체 아미노산은 본래의 아미노산 잔기보다 더 큰 측면 사슬 부피를 갖는 것이다. 통상의 기술자는 돌출부를 생성하기 위한 이상적인 대체 아미노산인지 확인하기 위해 아미노산 잔기의 특성을 결정 및/또는 평가하는 방법을 알고 있다. 일부 구현예에서, 돌출부의 형성을 위한 대체 잔기는 자연 발생한 아미노산 잔기이고, 예를 들어 아르기는(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 또는 트립토판(W)을 포함한다. 일부 예에서, 대체를 위해 확인된 본래의 잔기는 예를 들어 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌, 또는 발린과 같은 작은 측면 사슬을 갖는 아미노산 잔기이다.
일부 구현예에서, 공동(홀)을 함유하도록 변형된 제 2 Fc 폴리펩티드는 천연 또는 본래의 아미노산을 제 2 폴리펩티드의 경계면으로부터 오목하게 들어간 적어도 하나의 측면 사슬을 갖는 아미노산으로 대체하는 것을 포함하는 것이고, 따라서 제 1 폴리펩티드의 경계면으로부터 상응하는 돌출부를 수용할 수 있다. 대부분의 경우, 대체 아미노산은 본래 아미노산 잔기보다 더 작은 측면 사슬 부피를 갖는 것이다. 통상의 기술자는 공동 생성하기 위한 이상적인 대체 아미노산인지 확인하기 위해 아미노산 잔기의 특성을 결정 및/또는 평가하는 방법을 알고 있다. 일반적으로, 공동의 형성을 위한 대체 잔기는 자연 발생한 아미노산이고, 예를 들어 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)을 포함한다. 일부 예에서, 대체를 위해 확인된 본래의 아미노산은, 예를 들어 티로신, 아르기닌, 페닐알라닌, 또는 트립토판과 같은 큰 측면 사슬을 갖는 아미노산이다.
인간 IgG1의 CH3 경겨면은, 예를 들어 각각의 표면으로부터 1090 Å2를 매장하는 4개의 역-평행 β-가닥에 위치한 각 도메인 상의 16개의 잔기를 포함한다[예를 들어 문헌 「Deisenhofer et al. (1981)　Biochemistry,　20:2361-2370」; 「Miller et al., (1990)　J Mol. Biol.,　216, 965-973」; 「Ridgway et al., (1996)　Prot. Engin.,　9: 617-621」; 미국특허 제5,731,168호를 참고한다]. 돌출부 또는 공동을 생성하기 위한 CH3 도메인의 변형체는, 예를 들어 미국특허 제5,731,168호; 국제공개공보 제WO98/50431호 및 제WO2005/063816호; 및 문헌 「Ridgway et al., (1996)　Prot. Engin.,　9: 617-621」에 기재되어 있다. 일부 예에서, 돌기 또는 공동을 생성하기 위한 CH3 도메인의 변형체는 전형적으로 2개의 중심 역-평행 β-가닥에 위치한 잔기를 표적으로 한다. 목표는 생성된 돌기가 파트너 CH3 도메인의 보상 공동에 의해 수용되지 않고 주변 용매로 돌출함으로써 수용될 수 있는 위험을 최소화하는 것이다.
예를 들어 일부 구현예에서 이종이량체 Fc는 Thr366에서 CH3 도메인 내 아미노산 변형체를 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 이는 보다 부피가 큰 아미노산, 예를 들어 Try(T366W)로 대체되었을 때, 위치 Thr366, Leu368, 및 Tyr407에서 부피가 덜 큰 아미노산, 예를 들어 각각 Ser, Ala 및 Val(T366S/L368A/Y407V)으로의 아미노산 변형체를 갖는 제 2 CH3 도메인과 우선적으로 쌍을 이룰 수 있다. CH3 변형체를 통한 이종이량체화는 이황화결합의 도입, 예를 들어 반대편 CH3 도메인에서 Ser354에서 Cys(S354C) 및 Tyr349에서 Cys(Y349C)로 변경함으로써 추가로 안정화될 수 있다[문헌 「Carter, 2001 Journal of Immunological Methods, 248: 7-15」에서 검토됨].
특정 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 Fc 이종이량체화를 매개할 수 있는 제 1 및 제 2 Fc를 함유하고 돌연변이체 T366W 및 S354C를 함유하는 제 1 Fc 폴리펩티드 및 돌연변이체 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 함유하는 제 2 Fc 폴리펩티드를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 서열번호 201 또는 207에 제시된 서열을 포함하는 Fc 폴리펩티드로부터 선택되고 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 서열번호 202, 205 또는 209에 제시된 서열을 포함하는 Fc 폴리펩티드로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 서열번호 82, 86, 94 또는 96 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열이거나 또는 그를 포함하고 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 서열번호 83, 87, 90, 92, 98 또는 100 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열이거나 또는 그를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 Fc 폴리펩티드는 Fc-매개된 효과기 기능을 제공하는 특징을 나타낸다. 특정 구현예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 서열번호 201에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함하고 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 서열번호 202 또는 205에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현에에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 서열번호 82에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함하고 제 2 Fc 폴리펩티드는 서열번호 83 또는 90에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현에에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 서열번호 86에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함하고 제 2 Fc 폴리펩티드는 서열번호 87 또는 92에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함한다. 상기 제 1 및 제 Fc 폴리펩티드는 상기 컨스트럭트의 어느 폴리펩티드 상에 포맷될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 제 1 및 제 Fc 폴리펩티드 중의 하나 또는 둘 다는 하나 이상의 아미노산 돌연변이체를 더 포함하여 예를 들어 감소된 Fc 수용체 결합과 같은 하나 이상의 Fc 효과기 기능을 감소시킨다. Fc 효과기 기능을 감소시키는 예시적인 돌연변이체는 기술된 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 변형은 하나 이상의 위치 Glu233(E233), Leu234(L234), 또는 Leu235(L235)의 결실, 예를 들어 아미노산 Glu233(E233), Leu234(L234), 및 Leu235(L235)의 결손일 수 있다. 일부 구현예에서, 제 1 Fc 폴리펩티드는 서열번호 203 또는 208에 제시된 서열을 포함하는 Fc 폴리펩티드로부터 선택되고, 제 2 Fc 폴리펩티드는 서열 204, 206 또는 210에 제시된 서열을 포함하는 Fc 폴리펩티드로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제 1 Fc 폴리펩티드는 서열번호 84, 88, 95 또는 97 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열이거나 또는 그를 포함하고, 제 2 Fc 폴리펩티드는 서열번호 85, 89, 91, 93, 99 또는 101 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열이거나 또는 그를 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 서열번호 203에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함하고 제 2 Fc 폴리펩티드는 서열번호 204 또는 206에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 서열번호 84에 제시된 서열을 이거나 또는 그를 포함하며, 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 서열번호 85 또는 91에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 서열번호 88에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함하며, 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 서열번호 89 또는 93에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함한다. 상기 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드는 상기 컨스트럭트의 폴리펩티드 사슬 상에서 포맷될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드 또는 제 2 Fc 폴리펩티드는 돌연변이체 M252Y 및/또는 M428V를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 서열번호 207에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함하며, 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 서열번호 209에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 서열번호 94에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함하며, 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 서열번호 98에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 서열번호 96에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함하며, 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 서열번호 100에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 서열번호 208에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함하며, 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 서열번호 210에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 서열번호 95에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함하며, 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 서열번호 99에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 서열번호 97에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함하며, 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 서열번호 101에 제시된 서열이거나 또는 그를 포함한다. 상기 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드는 상기 컨스트럭트의 폴리펩티드 사슬 상에서 포맷될 수 있다.
이종이량체의 프로모션(promotion)을 촉진시킬 수 있는 변이체의 추가의 예는, 364K/E357Q 및 L368D/K370S; L368D/K370S 및 S364K; L368E/K370S 및 S364K; T411T/E360E/Q362E 및 D401K; L368D/K370S 및 S364K/E357L, K370S 및 S364K/E357Q 및 T366S/L368A/Y407V 및 T366W 또는 366S/L368A/Y407V/Y349C 및 T366W/S354C로부터의 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드의 임의의 조합 또는 입체 변이체(예를 들어 왜곡 변이체(skew variant))의 쌍이이며, 여기서 각 쌍은 상기 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드에서의 돌연변이체를 나타낸다. 특정 구현예에서, 제공된 컨스트럭트는 돌연변이체의 쌍 L368D/K370S 및 S364K 및 E357Q를 함유하는 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드를 함유한다.
이종이량체의 생성에 사용될 수 있는 추가적인 메카니즘은 때로는 문헌 「Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285(25):19637 (2010)」에 기술된 "정전기 스티어링"으로 언급된다. 이것은 본원에서 종종 "전하 쌍"으로도 언급된다. 이러한 구현예에서, 이종이량체화에 대한 형성을 왜곡(skew)하기 위해 정전기가 사용된다. 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 이들은 또한 pI, 따라서 정제에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 일부 경우에는 π 변이체로도 간주될 수 있다. 그러나 이것들은 이종이량체화를 강제하기 위해 생성되고 정제 도구로서 사용되지 않았기 때문에, '입체 변이체'로 분류된다. 제 1 Fc 폴리펩티드는 돌연변이체 D221E/P228E/L368E를 함유할 수 있으며 제 2 Fc 폴리펩티드는 돌연변이체 D221R/P228R/K409R를 함유할 수 있다. 또다른 구현예에서, 제 1 Fc 폴리펩티드는 돌연변이체 C220E/P228E/368E를 함유할 수 있으며 제 2 Fc 폴리펩티드는 돌연변이체 C220R/E224R/P228R/K409R를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 이종이량체화는 pI 변이체에 의해 촉진될 수 있다. 일부 측면에서, pI 변이체는 단백질의 pI를 증가시키는 것(염기성 변화)을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, pI 변이체는 단백질의 pI를 감소시키는 것(산성 변화)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이들 변이체의 모든 조합은 하나의 Fc 폴리펩티드가 야생형(wild type)일 수 있는 조합, 또는 야생형과는 상당히 상이한 pI를 표시하지 않는 변이체를 포함하여 수행될 수 있으며, 다른 Fc 폴리펩티드는 더 염기성이거나 또는 더 산성일 수 있다. 대안으로, 각각의 Fc 폴리펩티드는 변화될 수 있으며, 1 내지 그 이상의 염기성 및 1 내지 그 이상의 산성이 될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 Fc 폴리펩티드는 돌연변이체 Q295E/N384D/Q418E/N421D를 함유하는 음성 pI 변이체 Fc이다.
일부 구현예에서, 입체 이종이량체화 변이체(예를 들어 노브 및 홀) 및 pI 또는 전하쌍 변이체의 조합이 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 제공된 구조물은 (a) 왜곡 변이체 S364K/E357Q를 포함하는 제 1 Fc 폴리펩티드; 및 (b) 왜곡 변이체 L368D/K370S 및 pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D를 함유하는 제 2 Fc 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드 중의 하나 또는 둘 다는 Fc 이펙터 활성을 감소시키기 위한 추가의 돌연변이체, 예를 들어 예시적인 돌연변이체 E233P/L234V/l235a/G236del/S267K를 함유할 수 있다. Fc 이종이량체화를 매개할 수 있는 상기 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드의 예는 서열번호 l94 및 195에 제시된 서열을 포함한다. 상기 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드는 컨스트럭트의 폴리펩티드 사슬상에서 포맷될 수 있다.
그 결과 생성된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼에서 친화성 크로마토그래피와 같은 임의의 적절한 방법으로 정제될 수 있다. 상이한 폴리펩티드를 코딩하는 2개의 핵산분자가 세포로 형질전환되는 경우, 동종- 및 이종이량체의 형성이 발생할 것이다. 이종이량체 형성이 동종이량체 형성보다 유리하도록 발현을 위한 조건을 조정할 수 있다.
친화성 시약에 대한 이종이량체의 차별적 친화도를 바탕으로 동종이량체로부터 이종이량체를 회수하는 기술이 공지되어 있다. 일부 측면에서, 이러한 기술은 Fc 폴리펩티드 사슬 중 하나가 친화성 시약 단백질 A에 결합하지 않도록 이종이량체를 설계하는 것을 포함한다. 일부의 경우, 폴리펩티드 사슬 중 하나는 Fc 이종이량체의 폴리펩티드 중의 하나에서 단백질 A 시약에 대한 친화성을 제거하거나 감소시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있으며, 예를 들어 국제공개공보 제WO2017/134440호, 제WO2010/151792호, 젠데베르그 등의 문헌 「Jendeberg et al.,(1997) J. Immunol. Methods, 201(1): 25-34」을 참고한다. 이들 구현예 중 일부에서, Fc 영역은 단백질-A 결합을 방지할 수 있도록 이종이량체의 하나의 멤버의 단백질-A 결합 부위에서 변형되어 이종이량체 융합 단백질의 보다 효율적인 정제를 가능하게 한다. 이 결합 부위 내의 예시적인 변형체는, Ile253, 예를 들어 Ile253Arg(I253R)이다. 일부 구현예에서, 변형체는 H435R 또는 H435R/Y436F일 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 이종이량체의 Fc 폴리펩티드는 단백질 G(pA+/pG-)가 아닌, 단백질 A와 결합할 수 있도록 하는 변형체를 함유한다. 예시적인 pA+/pG- 아미노산 변형체는 인간 IgG1과 관련하여 428 위치의 세린, 434 위치의 세린, 선택적으로 436 위치의 히스티딘을 함유하거나, 또는 인간 IgG 2, 3, 또는 4에서 상응하는 위치에 이러한 잔기를 포함하는 Fc를 포함한다. 일부 측면에서, 428, 434 위치 및 선택적으로 436 위치에서 하나의 IgG Fc 폴리펩티드에서의 이러한 아미노산 변형체는 단백질 G의 결합을 감소 또는 방지하여 단백질의 정제를 향상시킨다.
일부 구현예에서, 친화성 시약에 대한 차별적 친화성을 부여하기 위한 임의의 이러한 변형체는 전술한 임의의 하나 이상의 다른 아미노산 변형과 조합될 수 있다. 예를 들어 I253R 변형체는 T366S/L368A/Y407V 변형 또는 T366W 변형 중 하나와 조합될 수도 있다. T366S/L368A/Y407V 변형 Fc는 T336W 변형 Fc의 경우에서와 같이 이량체화 경계면의 입체적 폐쇄가 없기 때문에 동종이량체를 형성할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, I253R 변형체는 T366S/L368A/Y407V 변형 Fc와 조합되어 형성될 수 있는 임의의 동종이량체 Fc의 정제를 허용하지 않는다. 유사한 변형이 T366S/L368A/Y407V 및 H453R를 조합하여 적용될 수 있다.
일부 구현예에서, 이종이량체 분자의 Fc 영역은 전술한 바와 같은 하나 이상의 다른 Fc 돌연변이체를 추가적으로 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 이종이량체 분자는 효과기 기능을 감소시키는 돌연변이체를 갖는 Fc 영역을 함유한다.
일부 구현예에서, 이종이량체 Fc의 하나의 Fc 폴리펩티드는 서열번호 201(예를 들어 서열번호 82), 86, 207(예를 들어 서열번호 94), 또는 96에 제시된 아미노산의 서열을 포함하고, 이종이량체 Fc의 다른 하나의 Fc 폴리펩티드는 서열번호 201(예를 들어 서열번호 83), 87, 205(예를 들어 서열번호 90), 92, 209(예를 들어 서열번호 98), 또는 100에 제시된 아미노산의 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 이종이량체 Fc의 하나의 Fc 폴리펩티드는 서열번호 203(예를 들어 서열번호 84), 88, 208(예를 들어 서열번호 95), 또는 97 중 임의의 것에 제시된 아미노산의 서열을 포함하고, 이종이량체 Fc의 다른 하나의 Fc 폴리펩티드는 서열번호 204(예를 들어 서열번호 85), 89, 206(예를 들어 서열번호 91), 93, 210(예를 들어 서열번호 99), 또는 101 중 임의의 것에 제시된 아미노산의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 IgG Fc 영역은 이량체화를 방지하기 위해 변형된다. 이들 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 단량체이다. 예를 들어 Thr366 잔기에서 하전된 잔기로의 변형, 예를 들어 Thr366Lys, Thr366Arg, Thr366Asp, 또는 Thr366Glu(각각 T366K, T366R, T366D, 또는 T366E)는 CH3-CH3 이량체화를 방지한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질의 Fc 영역은 다음의 위치 중의 하나 이상에서 Fc 수용체 결합을 감소시키기 위해 변경된다: Leu 234(L234), Leu235(L235), Asp265(D265), Asp270(D270), Ser298(S298), Asn297(N297), Asn325(N325) orAla327(A327). 예를 들어 Leu 234AlA(L234A), Leu235AlA(L235A), Asp265Asn(D265N), Asp270Asn(D270N), Ser298Asn(S298N), Asn297AlA(N297A), Asn325Glu(N325E) 또는 Ala327Ser(A327S). 바람직한 구현예에서, Fc 영역 내 변형체는 Fc-수용체-감마 수용체에 대한 결합을 감소시키면서 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합에 최소한의 영향을 미친다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 면역글로불린 힌지 영역으로부터 유래된 폴리펩티드를 함유한다. 힌지 영역은 임의의 인간 IgG 서브클래스로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 융합 단백질은 EPKSSDKTHTCPPC(서열번호 7)의 서열을 갖는 변형된 IgG1 힌지를 함유할 수 있고, 이때 경쇄의 C-말단 시스테인과 이황화를 형성하는 Cys220에서 세린, 예를 들어 Cys220Ser(C220S)으로 돌연변이된다. 다른 구현예에서, 융합 단백질은 서열 DKTHTCPPC(서열번호 8)를 갖는 절단된 힌지를 함유한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 IgG4로부터의 변형된 힌지를 가지며, 이는 가닥 교환을 방지하거나 감소시키기 위해, 예를 들어 서열 ESKYGPPCPPC(서열번호 9)를 갖는, Ser228Pro(S228P)와 같이 변형된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 링커 폴리펩티드를 함유한다. 다른 구현예에서, 융합 단백질은 링커 및 힌지 폴리펩티드를 함유한다.
3. 링커
상기 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 면역글로불린 Fc 영역을 함유하는 제 1 구성요소 및 CD3 결합 영역을 함유하는 제 2 구성요소를 연결 또는 결합하는 링커를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 비절단성 링커이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 프로테아제에 의한 절단에 대해 특이적으로 인식되는 기질 인식 부위를 함유하지 않는다. 따라서 상기 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 링커는 세포외 프로테아제와 같은 프로테아제에 대한 기질로 작용할 수 있는 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 예를 들어 비-절단성 링커는 프로테아제의 절단성 펩티드 서열 내에 놓이는 하나 이상의 펩티드 결합을 함유하는 절단성 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 링커는 Fc 영역이 CD3 결합 영역에 대한 N-말단이되도록 Fc 영역의 C-말단 영역의 끝에 위치한다. 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 이량체와 같은 다량체이기 때문에, 제공된 컨스트럭트는 제 1 Fc 폴리펩티드와 제 1 폴리펩티드의 CD3 결합 영역의 제 1 도메인(예를 들어 VH) 및 제 2 Fc 폴리펩티드와 제 2 폴리펩티드의 CD3 결합 영역의 제 2 도메인(예를 들어 VL)을 연결하는 링커를 함유한다. 전형적으로, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 제 1 및 제 2 폴리펩티드에 존재하는 링커는 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, CD3 결합 도메인의 각 도메인은 동일한 링커와 같은 링커를 통해 Fc의 반대편 폴리펩티드, 예를 들어 이종이량체 Fc에 연결된다.
융합 단백질에 사용하기 위한 다양한 폴리펩티드 링커가 공지되어 있다[예를 들어 문헌 「Chen et al. (2013) Adv. Drug. Deliv. 65:1357-1369」; 및 국제공개공보 제WO2014/099997호, 제WO2000/24884호; 미국특허 제5,258,498호; 미국특허 제5,525,491호; 미국특허 제5,525,491호, 미국특허 제6,132,992호를 참고한다].
일부 구현예에서, CD3 결합 영역이 다중특이적 폴리펩티드 콘쥬게이트의 Fc 영역에 연결될 때, 세포와 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 접촉 시, CD3 결합 영역은 제한되고, 세포, 예를 들어 T 세포의 표면 상의 CD3에 결합 또는 관여할 수 없거나, 실질적으로 결합 또는 관여할 수 없도록, 링커가 선택된다. T 세포 결합, 리포터 시스템을 이용한 NFAT 활성화, 세포용해성 T 세포 활성, 사이토카인 생성 및/또는 T 세포 활성화 마커의 발현을 평가하기 위한 어세이를 포함하는, 다양한 어세이가 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트에 의한 CD3의 결합 또는 관여를 평가하는데 적용될 수 있다. 예시적인 분석이 제공된 구현예에 제시된다. 전형적으로, 링커는 또한 폴리펩티드 컨스트럭트의 정확한 폴딩을 보장하는 것이고, 연결된 폴리펩티드의 활성 또는 기능과 일치하지 않는 전하를 나타내지 않거나 또는 연결된 폴리펩티드의 활성을 방해하거나 변경하는 하나 이상의 도메인의 아미노산 잔기와 결합 또는 다른 상호작용을 형성하지 않는다. 일부 구현예에서, 링커는 폴리펩티드 링커이다. 폴리펩티드 링커는 유연한 flexible) 링커 또는 단단한 링커 또는 이 둘의 조합일 수 있다.
일부 측면에서, 링커는 짧거나, 중간 또는 긴 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 최대 40개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 최대 25개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 적어도 또는 적어도 약 2개의 아미노산 길이이다. 일부 측면에서, 적합한 길이는, 예를 들어 적어도 하나 그리고 전형적으로 약 40개의 아미노산 잔기 미만, 예를 들어 2-25개의 아미노산 잔기, 5-20개의 아미노산 잔기, 5-15개의 아미노산 잔기, 8-12개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 링커는 (약) 2개 내지 24개의 아미노산, 2개 내지 20개의 아미노산, 2개 내지 18개의 아미노산, 2개 내지 14개의 아미노산, 2개 내지 12개의 아미노산, 2개 내지 10개의 아미노산, 2개 내지 8개의 아미노산, 2개 내지 6개의 아미노산, 6개 내지 24개의 아미노산, 6개 내지 20개의 아미노산, 6개 내지 18개의 아미노산, 6개 내지 14개의 아미노산, 6개 내지 12개의 아미노산, 6개 내지 10개의 아미노산, 6개 내지 8개의 아미노산, 8개 내지 24개의 아미노산, 8개 내지 20개의 아미노산, 8개 내지 18개의 아미노산, 8개 내지 14개의 아미노산, 8개 내지 12개의 아미노산, 8개 내지 10개의 아미노산, 10개 내지 24개의 아미노산, 10개 내지 20개의 아미노산, 10개 내지 18개의 아미노산, 10개 내지 14개의 아미노산, 10개 내지 12개의 아미노산, 12개 내지 24개의 아미노산, 12개 내지 20개의 아미노산, 12개 내지 18개의 아미노산, 12개 내지 14개의 아미노산, 14개 내지 24개의 아미노산, 14개 내지 20개의 아미노산, 14개 내지 18개의 아미노산, 18개 내지 24개의 아미노산, 18개 내지 20개의 아미노산 또는 20개 내지 24개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 링커는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 길이이다.
특정 측면에서, 다중특이적 폴리펩티드 콘쥬게이트가 이의 항원, 예를 들어 TAA에 결합될 때, 링커의 길이가 길어질수록 CD3 결합이 더 커진다. 따라서, 일부 측면에서, 링커는 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 초과의 아미노산 길이와 같이, 12개 초과의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 길이가 12개 내지 40개의 아미노산, 12개 내지 30개의 아미노산, 12개 내지 24개의 아미노산, 12개 내지 18개의 아미노산, 12개 내지 15개의 아미노산, 15개 내지 40개의 아미노산, 15개 내지 30개의 아미노산, 15개 내지 24개의 아미노산, 15개 내지 18개의 아미노산, 18개 내지 40개의 아미노산, 18개 내지 30개의 아미노산, 18개 내지 24개의 아미노산, 24개 내지 40개의 아미노산, 24개 내지 30개의 아미노산 또는 30개 내지 40개의 아미노산이다.
링커는 자연-발생, 합성 또는 이 둘의 조합일 수 있다. 특히 적합한 링커 폴리펩티드는 주로 글리신(Gly), 세린(Ser), 알라닌(Ala), 및 트레오닌(Thr)으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 포함한다. 예를 들어 링커는 적어도 Gly, Ser, Ala, 및 Thr으로부터부터 선택되는 아미노산 잔기의 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90%와 같이, 적어도 75%(펩티드 링커에 존재하는 총 잔기의 수에 기초하여 계산됨) 함유할 수 있다. 링커는 또한 Gly, Ser, Ala 및/또는 Thr 잔기만으로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 1-25개의 글리신 잔기, 5-20개의 글리신 잔기, 5-15개의 글리신 잔기, 또는 8-12개의 글리신 잔기를 함유한다. 일부 측면에서, 적합한 펩티드 링커는 전형적으로 적어도 75% 글리신 잔기와 같이, 적어도 50% 글리신 잔기를 함유한다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 글리신 잔기만을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 글리신 및 세린 잔기만을 포함한다.
일부 구현예에서, 이러한 링커는 본원에서 GS-링커로 지칭되는, 글리신 및 세린 아미노산으로 주로 구성된다. 일부 구현예에서, 링커는(GGS)n을 함유하고, 여기서 n은 1 내지 10, 예를 들어 1 내지 5, 예를 들어 1 내지 3이고, 예를 들어 GGS(GGS)n(서열번호 171), 여기서 n은 0 내지 10이다. 특정 구현예에서, 링커는 서열 (GGGGS)n(서열번호 173)을 함유하고, 여기서 n은 1 내지 10이거나 n은 1 내지 5, 예를 들어 1 내지 3이다. 추가의 구현예에서, 링커는 (GGGGGS)n(서열번호 172)을 함유하고, 여기서 n은 1 내지 4, 예를 들어 1 내지 3이다. 링커는 2, 3, 4 또는 5의 반복과 같이 상기 임의의 조합을 포함할 수 있고, GS, GGS, GGGGS, 및/또는 GGGGGS 링커가 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 링커는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개의 아미노산 길이이다.
일부 구현예에서, 링커는 (1-문자 아미노산 코드로): GGS, GGGGS(서열번호 149), 또는 GGGGGS(서열번호 135)이다. 일부 구현예에서, GS-링커는 GGSGGS의 아미노산 서열, 즉, (GGS)2(서열번호 10); GGSGGSGGS, 즉, (GGS)3(서열번호　11); GGSGGSGGSGGS, 즉, (GGS)4(서열번호 12); GGSGGSGGSGGSGGS, 즉, (GGS)5(서열번호 13); GGGGGSGGGGGSGGGGGS, 즉, (G5S)3(서열번호 119), GGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 147) 및 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 170)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 GGGG(서열번호 103)이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 GGGGG(서열번호 192)이다. 상기 예 중 일부에서, 세린은 알라닌(예를 들어 (Gly4Ala) 또는 (Gly3Ala))으로 대체될 수 있다.
일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 GlyxXaa-Glyy-Xaa-Glyz(서열번호 174)를 갖는 펩티드 링커를 포함하고, 여기서 각 Xaa는 독립적으로 알라닌(Ala), 발린(Val), 류신(Leu), 이소류신(Ile), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 트립토판(Trp), 프롤린(Pro), 글리신(Gly), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 시스테엔(Cys), 티로신(Tyr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 리신(Lys), 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 아스파르트산(Asp), 및 글루탐산(Glu)으로부터 선택되고, 여기서 x, y, 및 z는 각각 1 내지 5의 범위의 정수이다. 일부 구현예에서, 각 Xaa는 독립적으로 Ser, Ala, 및 Thr으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 변이에서, x, y, 및 z 각각은 3과 같고 (이에 의해 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly(서열번호 175)을 갖는 펩티드 링커를 생성함), 여기서 각 Xaa는 상기와 같이 선택된다.
일부 구현예에서, 링커는 (SSSSG)n(서열번호 185) 모티프의 반복에 기초한 세린-풍부 링커이고, 여기서 n은 적어도 1이지만, n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9일 수 있다.
일부의 경우, 펩티드 링커에 약간의 강도를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 펩티드 링커의 아미노산 서열에 프롤린 잔기를 포함시킴으로써 성취될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 링커는 펩티드 링커의 아미노산 서열에 적어도 하나의 프롤린을 포함한다. 예를 들어 펩티드 링커는 아미노산 잔기의 적어도 25%(예를 들어 적어도 50% 또는 적어도 75%)가 프롤린 잔기인 아미노산 서열을 가질 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 펩티드 링커는 프롤린 잔기만 포함한다.
일부 측면에서, 펩티드 링커는 하나의 시스테인 잔기와 같이, 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 링커는 적어도 하나의 시스테인 잔기와 Gly, Ser, Ala, 및 Thr으로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기를 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 링커는 글리신 잔기 및 시스테인 잔기, 예를 들어 글리신 잔기 및 시스테인 잔기만을 포함한다. 전형적으로 펩티드 링커 당 단 하나의 시스테인 잔기만이 포함될 것이다. 시스테인 잔기를 포함하는 특정 링커의 하나의 예는 아미노산 서열 Glym-Cys-Glyn을 갖는 펩티드 링커를 포함하고, 여기서 n과 m은 각각 1-12, 예를 들어 3-9, 4-8, 또는 4-7의 정수이다. 특정 변형에서, 이러한 펩티드 링커는 아미노산 서열 GGGGG-C-GGGGG(서열번호 177)를 갖는다.
일부 구현예에서, 융합 단백질의 링커는 구조적 또는 제한적 링커이다. 특정 구현예에서, 구조적 링커는 서열 (AP)n 또는 (EAAAK)n(서열번호 178)을 함유하고, 여기서 n은 2 내지 20, 바람직하게는 4 내지 10이고, AS-(AP)n-GT(서열번호 179) 또는 AS-(EAAAK)n-GT(서열번호 180)를 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 여기서 n은 2 내지 20, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이다. 다른 구현예에서, 링커는 서열 (GGGGA)n(서열번호 181), (PGGGS)n(서열번호 182), (AGGGS)n(서열번호 183) 또는 GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS(서열번호 184)를 포함하고, 여기서 n은 2 내지 20이다. 일부 구현예에서, 링커는 SSSASASSA(서열번호 186), GSPGSPG(서열번호 187), 또는 ATTTGSSPGPT(서열번호 176)이다. 일부 구현예에서, 이러한 링커는 이의 구조로 인해 단백질분해성 분해에 더욱 내성이 있어, 생체 내(in vivo) 주사 시 이점을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 링커는 (소위 비-절단성 링커로 교체가능하게 사용되는) 절단가능한 링커가 아니다. 일부 구현예에서, 링커는 프로테아제에 의해 절단될 수 없다. 일부 구현예에서, 절단가능한 링커가 아닌 링커 또는 프로테아제에 의해 절단될 수 없는 링커는 생체 내(in vivo) 전달 또는 재조합 생산에 일반적으로 안정한 링커이다. 일부 측면에서, 프로테아제에 의해 절단될 수 없는 링커는 바람직하게는 프로테아제의 절단가능한 펩티드 서열 또는 인식 부위 내에 있는 적어도 하나의 펩티드 결합을 함유하지 않는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 비-절단성 링커는 프로테아제에 대한 표적 기질이 아니므로, 동일한 프로테아제에 대한 기질 인식 부위를 함유하는 링커와 비교하여 프로테아제에 의해 우선적으로 또는 특이적으로 절단되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 링커는 특정 프로테아제에 대한 기질 인식 부위 또는 절단 부위를 함유하지 않으며, 이는 프로테아제에 의해 절단되는 프로테아제의 활성 부위에 의해 인식되는 서열이다. 전형적으로, 예를 들어 세린 프로테아제의 경우, 절단가능한 서열은 기질에서 P1-P4 및 P1'-P4' 아미노산으로 구성되며, 여기서 절단은 P1 위치 이후에 발생한다. 전형적으로, 세린 프로테아제에 대한 절단 서열은 많은 프로테아제의 연장된 기질 특이성과 매치시키기 위한 길이는 6개의 잔기이지만, 프로테아제에 따라 더 길거나 더 짧을 수 있다. 전형적으로, 상기 링커는 프로테아제에 의해 인식되는 P1-P1′자를 수 있는 결합 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 비-절단성 링커, 또는 프로테아제에 의한 절단에 대해 특이적으로 인식되는 기질 인식 부위를 함유하는 링커는 상기 프로에테아제의 표적 기질의 절단성보다 덜 절단성이다. 전형적으로, 프로테아제는 다른 비-표적 기질과 비교하여 특정 표적 기질의 절단에 대한 특이성 또는 선호도를 나타낸다. 이러한 특이성의 정도는 서열, 예를 들어 링커의 절단 속도 상수에 기초하여 결정될 수 있고, 이는 이의 기질에 대한 프로테아제의 선호도 및 효소의 효율의 척도이다. 기질의 다양한 농도의 존재 시 시간에 따른 절단의 증가 속도를 결정하는 임의의 방법이 특이성 상수를 계산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 기질은 형광발생 성분에 연결되며, 이는 프로테아제에 의해 절단 시 방출된다. 상이한 프로테아제 농도에서 절단 속도를 결정함으로써, 절단에 대한 특이성 상수(kcat/Km)는 특정 링커에 대한 특정 프로테아제에 대해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 비-절단성 링커, 또는 프로테아제에 의한 절단에 대해 특이적으로 인식되는 기질 인식 부위를 함유하는 링커는, 전부 절단되는 경우 1Х104 M-1S-1 미만, 또는 5Х103 M-1S 미만, 1Х103 M-1S 미만, 또는 1Х102 M-1S 미만 또는 그 이하의 속도로 프로테아제에 의해 특이적으로 절단될 수 있는 링커이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 다중특이적 구조체 내의 링커는, 예를 들어 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP), 시스테인 프로테아제, 세린 프로테아제 및 플라스민 활성화제를 포함하는 프로테아제에 대한 기질 인식 부위를 함유하지 않는다. 특정 구현예에서, 상기 링커는 종양, 활성화된 면역 효과기 세포(예를 들어 T 세포 또는 NK 세포), 또는 종양 미세환경에서의 세포에 의해 생성되는 프로테아제인 프로테아제에 대한 기질 인식 부위를 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 링커는 하기 효소 또는 프로테아제 중의 하나 이상에 의해서 특이적으로 인식되는 기질 인식 부위를 함유하지 않는다: ADAMS, ADAMTS, 예를 들어 ADAM8; ADAM9; ADAM10; ADAM12; ADAM15; ADAM17/TACE; ADAMDEC1; ADAMTS1; ADAMTS4; ADAMTS5; 아스파르트산 프로테아제, 예를 들어 BACE 또는 레닌; 아스파르트산 카텝신(aspartic cathepsin), 예를 들어 카텝신 D 또는 카텝신 E; 카스파아제, 예를 들어 카스파아제 1, 카스파아제 2, 카스파아제 3, 카스파아제 4, 카스파아제 5, 카스파아제 6, 카스파아제 7, 카스파아제 8, 카스파아제 9, 카스파아제 10, 또는 카스파아제 14; 시스테인 카텝신, 예를 들어 카텝신 B, 카텝신 C, 카텝신 K, 카텝신 L, 카텝신 S, 카텝신 V/L2, 카텝신 X/Z/P; 시스테인 프로테이나아제, 예를 들어 크루지페인(Cruzipain); 레구메인(Legumain); 오투베인-2(Otubain-2); KLK, 예를 들어 KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK10, KLK11, KLK13, 또는 KLK14; 금속단백분해효소, 예를 들어 메프린; 네프릴리신; PSMA; BMP-1; MMP, 예를 들어 MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP14, MMP15, MMP16, MMP17, MMP19, MMP20, MMP23, MMP24, MMP26, 또는 MMP27, 세린 프로테아제, 예를 들어 활성화된 단백질 C, 카텝신 A, 카텝신 G, 키마아제, 응고 인자 프로테아제(예를 들어 FVIIa, FIXa, FXa, FXIa, FXIIa), 엘라스타아제, 그랜자임 B, 구아니디노벤조에이타아제(Guanidinobenzoatase), HtrA1, 인간 호중성 엘라스타아제, 락토페린, 마랍신, NS3/4A, PACE4, 플라스민, PSA, tPA, 트롬빈, 트립타아제, uPA; 제II형 트랜스멤브레인 세린 프로테아제(TTSPs), 예를 들어 DESC1, DPP-4, FAP, 헵신, 매트립타아제-2, 매트립타아제, TMPRSS2, TMPRSS3, 또는 TMPRSS4; 및 이의 임의의 조합. 일부 구현예에서, 상기 링커는 그랜자임 B, 마트립타제 또는 MMP, 예를 들어 MMP-2에 의해 특이적으로 인식되는 기질 인식 부위를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 링커는 그랜자임 B에 대한 기질인 아미노산을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 일반식 P4 P3 P2 P1↓ P1'(서열번호 150)를 갖는 아미노산 서열을 함유하지 않으며, 여기서 P4는 아미노산 I, L, Y, M, F, V, 또는 A이고; P3은 아미노산 A, G, S, V, E, D, Q, N, 또는 Y이며; P2는 아미노산 H, P, A, V, G, S, 또는 T이고; P1은 아미노산 D 또는 E이며; 그리고 P1'는 아미노산 I, L, Y, M, F, V, T, S, G 또는 A이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 일반식 P4 P3 P2 P1↓ P1'(서열번호 151)를 갖는 아미노산 서열을 함유하지 않으며, 여기서 P4는 아미노산 I 또는 L이고; P3은 아미노산 E이며; P2는 아미노산 P 또는 A이고; P1은 아미노산 D이며; 그리고 P1'는 아미노산 I, V, T, S, 또는 G이다.
일부 구현예에서, 상기 링커는 아미노산 서열 LEAD(서열번호 22), LEPD(서열번호 142), 또는 LEAE(서열번호 143)을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 아미노산 서열 IEPDI(서열번호 136), LEADT(서열번호 137), IEPDG(서열번호 138), IEPDV(서열번호 139), IEPDS(서열번호 140), IEPDT(서열번호 141), IEPDP(서열번호 144), LEPDG(서열번호 152) 또는 LEADG(서열번호 153)을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 링커는 매트립타아제에 대한 기질인 아미노산을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 서열 P1QAR↓(A/V)(서열번호 154)을 포함하지 않으며, 여기서 P1은 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 서열 RQAR(A/V)(서열번호 155)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 아미노산 서열 RQAR(서열번호 23)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 아미노산 서열 RQARV(서열번호 156)를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 링커는 하나 이상의 기질금속단백질분해효소(MMP)에 대한 기질인 아미노산을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, MMP는 MMP-2이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 일반식 P3 P2 P1↓ P1'(서열번호 157)를 갖는 서열을 함유하지 않으며, 여기서 P3은 P, V 또는 A이고; P2는 Q 또는 D이며; P1은 A 또는 N이고; 그리고 P1'는 L, I 또는 M이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 일반식 P3 P2 P1↓ P1'(서열번호 158)을 함유하지 않으며, 여기서 P3은 P이고; P2는 Q 또는 D이며; P1은 A 또는 N이고; 그리고 P1'는 L 또는 I이다. 일부 구현예에서,상기 링커는 아미노산 서열 PAGL(서열번호 24)를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 링커는, TGLEADGSPAGLGRQARVG(서열번호 25); TGLEADGSRQARVGPAGLG(서열번호 26); TGSPAGLEADGSRQARVGS(서열번호 27); TGPAGLGLEADGSRQARVG(서열번호 28); TGRQARVGLEADGSPAGLG(서열번호 29); TGSRQARVGPAGLEADGS(서열번호 30); 및 TGPAGLGSRQARVGLEADGS(서열번호 31); GPAGLGLEPDGSRQARVG(서열번호 104); GGSGGGGIEPDIGGSGGS(서열번호 105); GGSGGGGLEADTGGSGGS(서열번호 106); GSIEPDIGS(서열번호 107); GSLEADTGS(서열번호 108); GGSGGGGIEPDGGGSGGS(서열번호 109); GGSGGGGIEPDVGGSGGS(서열번호 110); GGSGGGGIEPDSGGSGGS(서열번호 111); GGSGGGGIEPDTGGSGGS(서열번호 112); GGGSLEPDGSGS(서열번호 113); 및 GPAGLGLEADGSRQARVG(서열번호 114), GGEGGGGSGGSGGGS(서열번호 115); GSSAGSEAGGSGQAGVGS(서열번호 116); GGSGGGGLEAEGSGGGGS(서열번호 117); GGSGGGGIEPDPGGSGGS(서열번호 118); TGGSGGGGIEPDIGGSGGS(서열번호 148)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 링커가 아니다.
4. 항원 결합 도메인:
본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 적어도 하나의 항원 결합 도메인, 예를 들어 적어도 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 측면에서, 항원 결합 도메인, 또는 항원 결합 도메인 각각은 독립적으로 항체 또는 항원 결합 단편, 천연 동족 결합 파트너, 안티칼린(조작된 리포칼린), 다르핀(Darpin), 피노머, 센티린(조작된 피브로네티신(fibroneticin) III 도메인), 시스틴-노트(knot) 도메인, 아필린, 아피바디, 또는 조작된 CH3 도메인으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 자연의 동족 결합 파트너는 TAA의 천연 동족 결합 파트너의 세포외 도메인 또는 이의 결합 단편, 또는 TAA에 대한 결합 활성을 나타내는 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, TAA는 포유동물 대상체의 종양 세포 상에 주로 존재하지만 일반적으로 포유동물 대상체의 정상 세포에서 발견되지 않는 카운터-구조(counter-structure)이다. 종양 특이적 항원은 상기 종양 세포에 독점적일 필요는 없지만,종양 관련 항원을 갖는 특정 포유동물의 세포의 백분율은 충분히 높거나 또는 종양 표면 상의 종양 관련 항원의 수준은 항-종양 치료제, 예를 들어 제공된 다중 특이적 폴리펩티드 컨스트럭트에 의해서 표적화될 수 있도록 충분히 높으며, 상기 종양의 영양에 기인한 포유동물의 예방 또는 치료를 제공한다. 일부 구현예에서, 종양을 갖는 포유동물로부터 세포의 랜덤한 통계적 샘플에서, TAA를 디스플레이하는 세포의 적어도 50%가 암성(cancerous)이다. 다른 구현예에서, TAA를 디스플레이하는 세포의 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 암성이다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인, 또는 제 1 항원-결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인과 같은 항원 결합 도메인 각각은 독립적으로 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인, 또는 독립적으로 각각의 항원 결합 도메인은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체, 및 단일 도메인 경쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인, 또는 독립적으로 각각의 항원 결합 도메인, 예를 들어 제 1 항원-결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인은 단일 사슬 항체이다. 일부 예에서, 상기 단일 사슬는 scFv, scAb, 단일 도메인 중쇄 항체, 또는 단일 도메인 경쇄 항체이다. 일부 구현예에서, 각각의 제 1 항원-결합 도메인 및 제 2 항원-결합 도메인은 하나 이상의 단일 도메인 항체(sdAb) 단편, 예를 들어 VHH, VNAR, 조작된 VH 또는 VK 도메인을 포함한다. VHH는 천연 낙타 중쇄 전용 항체, 중쇄 전용 항체를 생성하는 유전적으로 변형된 설치류, 또는 나이브/합성 낙타 또는 인간화 낙타 단일 도메인 항체 라이브러리로부터 제작될 수 있다. VNAR은 연골 어류 중쇄 전용 항체로부터 제작될 수 있다. 인터페이스 공학 및 특정 생식계열 패밀리의 선택을 포함하는, 통상적으로 이종이량체 VH 및 VK 도메인으로부터 단량체 sdAb를 제조하기 위한 다양한 방법이 구현되었다.
일부 구현예에서, 상기 다중특이적 폴리펩티트 컨스트럭트의 상기 항원 결합 도메인 또는 독립적으로 각각의 상기 항원 결합 도메인, 예를 들어 제 1 항원-결합 도메인 및/또는 제 2 항원 결합 도메인은 TAA에 결합하는 적어도 하나의 sdAb 또는 scFv를 함유한다. 일부 구현예에서, TAA에 결합하는 적어도 하나의 scFv 또는 sdAb는 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 CD3 결합 영역에 대해 Fc 영역 및/또는 카복시 말단에 대해 아미노 말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 TAA에 결합하는 단지 하나의 scFv 또는 sdAb만을 함유하며, 이것은 상기 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노 말단 및/또는 상기 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시 말단에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는, 상기 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노 말단 및/또는 상기 CD3 결합 영역에 대해 카르복시 말단에 위치되는, TAA에 결합하는 2개의 scFvs 또는 sdAbs를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 3개의 scFv 또는 sdAb를 함유하며, 여기서 2개는 상기 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 또는 상기 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치되고, 3번째는 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 다른 말단에 위치된다.
일부 구현예에서, 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 이종이량체 Fc 영역의 제 1 Fc 폴리펩티드, 링커, 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어 Fv)의 VH 도메인, 및 종양-관련 항원에 결합하는 scFv 또는 sdAb를 포함하는 제 1 폴리펩티드; 및 상기 이종이량체 fC 영역의 제 2 Fc 폴리펩티드, 상기 링커, 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어 Fv)의 VL 도메인 및, 선택적으로 종양-관련 항원에 결합하는 동일하거나 또는 상이한 scFv 또는 sdAb를 포함하는 제 2 폴리펩티드를 포함한, 2개의 폴리펩티드로부터 형성되거나 또는 그것을 포함한다. TAA에 결합하는 상기 scFv 또는 sdAb는 상기 이종이량체 Fc의 Fc 폴리펩티드에 대해 아미노 말단에 및/또는 상기 CD3 결합 영역의 VH 또는 VL에 대해 카복시-말단에 위치될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 상기 항원 결합 도메인 또는 독립적으로 각각의 항원 결합 도메인은 FABs 또는 scFvs로 어셈블리된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 상기 항원 결합 도메인 또는 독립적으로 각각의 항원 결합 도메인은 단일 도메인 항체(sdAbs)로서 결합 도메인들을 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 항원 결합 도메인 또는 독립적으로 각각의 상기 항원 결합 도메인, 예를 들어 상기 제 1 항원-결합 도메인 및 상기 제 2 항원 결합 도메인은 하나 이상의 사슬을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의, 상기 항원 결합 도메인 또는 독립적으로 각각의 상기 항원 결합 도메인, 예를 들어 상기 제 1 항원-결합 도메인 및/또는 상기 제 2 항원 결합 도메인은 FABs로 어셈블리된 VH 및 VL 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의, 상기 항원 결합 도메인 또는 독립적으로 각각의 상기 항원 결합 도메인, 예를 들어 상기 제 1 항원-결합 도메인 및/또는 상기 제 2 항원 결합 도메인은 TAA에 결합하는 Fab 항체의 VL-CL 및 VH-CH1(Fd)를 함유한다. 일부 구현예에서, VL-CL 및 VH-CH1(Fd)를 함유하는 상기 Fab 항체는 상기 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노 말단에 및/또는 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 상기 CD3 결합 영역에 대하 카복시 말단에 위치된다. 일부 구현예에서, 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 2개의 Fab 항체 단편을 함유하고, 이들은 각각 TAA에 결합하는 VL-CL 및 VH-CH1(Fd)를 함유하며, 그중 하나는 상기 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노 말단에 위치되고 다른 하나는 상기 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시 말단에 위치된다.
일부 구현예에서, 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는, 이종이량체 Fc 영역의 제 1 폴리펩티드, 링커 및 종양-관련 항원에 결합하는 Fab 항체 단편의 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL를 포함하는 제 1 폴리펩티드; 상기 이종이량체 Fc 영역의 제 2 폴리펩티드, 상기 링커 및, 선택적으로 종양-관련 항원에 결합하는 상기 Fab 항체 단편의 동일한 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL를 포함하는 제 2 폴리펩티드; 및 상기 TAA에 결합하는 다른 것을 포함하는 제 3 폴리펩티드를 비롯한 3개 이상의 폴리펩티드로부터 형성되거나 또는 그들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인, 또는 독립적으로 각각의 항원 결합 도메인은 TAA의 천연 동족의 결합 파트너의 세포외 도메인 또는 이의 결합 단편, 또는 TAA에 대한 결합 활성을 나타내는 이의 변이체이거나, 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 항원 결합 도메인, 예를 들어 각각의 제 1 항원-결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인은 동일한 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 각각의 상기 제 1 항원-결합 도메인 및 상기 제 2 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 각각의 항원 결합 도메인, 예를 들어 각각의 제 1 항원-결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인은 동일한 종양 관련 항원(TAA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 각각의 항원 결합 도메인, 예를 들어 각각의 제 1 항원-결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인은 상이한 TAA에 결합한다. 일부 구현예에서, 각각의 항원 결합 도메인, 예를 들어 각각의 제 1 항원-결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인은 동일한 TAA 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 각각의 항원 결합 도메인, 예를 들어 각각의 제 1 항원-결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인은 동일한 TAA 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
일부 구현에에서, 상기 항원 결합 도메인은 상기 TAA에 대한 1가, 2가, 3가, 또는 4가 결합을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 TAA에 대한 2가 결합은 동일한 항원의 동일한 에피토프(예를 들어 모노-에피토픽)에 결합하는 2개의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 TAA에 대한 2가 결합은 동일한 항원의 상이한 에피토프(예를 들어 바이-에피토픽)에 결합하는 2개의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 TAA에 대한 1가 결합은 상기 항원 중의 하나의 에피토프(예를 들어 모노-에피토픽)에 결합하는 하나의 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, TAA는 1-92-LFA-3, 5T4, 알파-4 인테그린, 알파-V 인테그린, 알파4베타1 인테그린, 알파4베타7 인테그린, AGR2, 항-루이스-Y, 아펠린 J 수용체, APRIL, B7-H3, B7-H4, BAFF, BTLA, C5 보체, C-242, CA9, CA19-9, (루이스 a), 탄산무수화효소 9, CD2, CD3, CD6, CD9, CD11a, CD19, CD20, CD22, CD24, CD25, CD27, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD41, CD44, CD44v6, CD47, CD51, CD52, CD56, CD64, CD70, CD71, CD74, CD80, CD81, CD86, CD95, CD117, CD123, CD125, CD132, (IL-2RG), CD133, CD137, CD138, CD166, CD172A, CD248, CDH6, CEACAM5(CEA), CEACAM6(NCA-90), CLAUDIN-3, CLAUDIN-4, cMet, 콜라겐, 크립토, CSFR, CSFR-1, CTLA-4, CTGF, CXCL10, CXCL13, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CYR61, DL44, DLK1, DLL3, DLL4, DPP-4, DSG1, EDA, EDB, EGFR, EGFRviii, 엔도텔린 B 수용체(ETBR), ENPP3, EpCAM, EPHA2, EPHB2, ERBB3, RSV의 F 단백질, FAP, FGF-2, FGF8, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FLT-3, 엽산 수용체 알파(FRα), GAL3ST1, G-CSF, G-CSFR, GD2, GITR, GLUT1, GLUT4, GM-CSF, GM-CSFR, GP IIb/IIIa 수용체, Gp130, GPIIB/IIIA, GPNMB, GRP78, HER2/neu, HER3, HER4, HGF, hGH, HVEM, 히알루로니다아제, ICOS, IFN알파, IFN베타, IFN감마, IgE, IgE 수용체(FceRI), IGF, IGF1R, IL1B, IL1R, IL2, IL11, IL12, IL12p40, IL-12R, IL-12R베타1, IL13, IL13R, IL15, IL17, IL18, IL21, IL23, IL23R, IL27/IL27R(wsx1), IL29, IL-31R, IL31/IL31R, IL2R, IL4, IL4R, IL6, IL6R, 인슐린 수용체, 재기드 리간드, 재기드 1, 재기드 2, KISS1-R, LAG-3, LIF-R, 루이스 X, LIGHT, LRP4, LRRC26, Ly6G6D, LyPD1, MCSP, 메소텔린, MRP4, MUC1, 뮤신-16(MUC16, CA-125), Na/K ATPase, NGF, 니카스트린, 노치 수용체, 노치 1, 노치 2, 노치 3, 노치 4, NOV, OSM-R, OX-40, PAR2, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGFR알파, PDGFR베타, PD-1, PD-L1, PD-L2, 포스파티딜-세린, P1GF, PSCA, PSMA, PSGR, RAAG12, RAGE, SLC44A4, 스핑고신 1 포스페이트, STEAP1, STEAP2, TAG-72, TAPA1, TEM-8, TGF베타, TIGIT, TIM-3, TLR2, TLR4, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TMEM31, TNF알파, TNFR, TNFRS12A, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체, TRK-A, TRK-B, uPAR, VAP1, VCAM-1, VEGF, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, VISTA, WISP-1, WISP-2, 및 WISP-3으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인, 또는 항원 결합 도메인 각각은 독립적으로 종양 관련 항원(TAA) 엽산 수용체 알파(FRα)에 결합한다. 예를 들어 항원 결합 도메인은 FRα에 결합하는 sdAb로 결합 도메인을 함유한다. 예시적인 FRα-결합 sdAb는 서열번호 120, 121, 및 122에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인, 또는 항원 결합 도메인 각각은 독립적으로 종양 관련 항원(TAA) cMET에 결합한다. 예를 들어 항원 결합 도메인은 cMET에 결합하는 sdAb로 결합 도메인을 함유한다. 예시적인 cMET-결합 sdAb는 서열번호 123에 기재되어 있다(미국특허 제9,346,884호).
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인, 또는 항원 결합 도메인 각각은 독립적으로 종양 관련 항원(TAA) B7H3에 결합한다. 예를 들어 항원 결합 도메인은 B7H3에 결합하는 scFv로 결합 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 항원 결합 도메인은 sdAb, 예를 들어 VHH이다. 예시적인 B7H3-결합 sdAb는 서열번호 214-218에 제시된다. 예시적인 B7H3-결합 scFv는 서열번호 124에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VH-CH1(Fd) 및 LC를 포함하는 Fab 항체 단편이거나 이를 함유한다. 예시적인 B7H3 Fd는 서열번호 127에 기재되어 있고, 예시적인 B7H3 LC는 서열번호 128에 기재되어 있다[국제공개공보 제WO2017/030926호 참조].
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인, 또는 항원 결합 도메인 각각은 독립적으로 종양 관련 항원(TAA) CD20에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 항원-결합 도메인은 서열번호 189에 제시된 VH 및 서열번호 190에 제시된 VL 또는 서열번호 189 또는 서열번호 190과 적어도 (약) 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 서열을 함유한다. 예를 들어 항원 결합 도메인은 CD20에 결합하는 scFv로 결합 도메인을 함유한다. 예시적인 CD20-결합 scFv는 서열번호 125, 189, 및 190에 기재되어 있다(미국 공개 번호 US 2005/0123546호).
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인, 또는 항원 결합 도메인 각각은 독립적으로 종양 관련 항원(TAA) DLL3에 결합한다. 예를 들어 항원 결합 도메인은 DLL3에 결합하는 scFv로 결합 도메인을 함유한다. 예시적인 DLL3-결합 scFv는 서열번호 126 및 189에 기재되어 있다(미국 공개 번호 US 2017/0037130호).
일부 구현예에서, 상기 항원 결합 도메인은 sdAb, 예를 들어 VHH이다. 예시적인 DLL3-결합 sdAb는 서열번호 219 또는 서열번호 220 중의 임의의 것에 제시된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 DLL3에 결합하는 Fd 및 LC를 포함하는 Fab 항체 단편이거나 또는 이를 함유한다. 예시적인 DLL3 Fd는 서열번호 133에 기재되어 있고 예시적인 DLL3 LC는 서열번호 134에 기재되어 있다(미국특허 제8,044,178호).
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인, 또는 항원 결합 도메인 각각은 독립적으로 종양 관련 항원(TAA) 5T4에 결합한다. 예시적인 5T4 Fd는 서열번호 129에 기재되어 있고 예시적인 5T4 LC는 서열번호 130에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 항체 결합 도메인은 서열번호 167 및 168에 기재된 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL을 포함한다(미국특허 제8,044,178호).
일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인, 또는 항원 결합 도메인 각각은 독립적으로 종양 관련 항원(TAA) gpNMB에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 Fd 및 LC 사슬을 포함하는 Fab 단편이거나 이를 함유한다. 예시적인 gpNMB Fd는 서열번호 131에 기재되어 있고 예시적인 gpNMB LC는 서열번호 132에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 링커를 통해 Fc 영역 및또는 CD3 결합 영역에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 연결은 링커를 통해 이루어진다. 일구 구현예에서, 링커는 연결 펩티드(LP)이고, 이는 섹션 II.3에 기재된 임의의 유연하거나 또는 단단한 링커를 포함할 수 있지만, 일반적으로 항원 결합 도메인 또는 도메인들을 연결하는 펩티드는 절단가능한 링커가 아니다.
일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 제 1 항원 결합 도메인과 Fc 영역 사이에 제 1 연결 펩티드(LP1)를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 CD 결합 영역과 제 2 항원 결합 도메인 사이에 제 2 연결 펩티드(LP2)를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 제 1 항원 결합 도메인과 Fc 영역 사이에 제 1 연결 펩티드(LP1) 및 CD3 결합 영역과 제 2 항원 결합 도메인 사이에 제 2 연결 펩티드(LP2)를 포함한다. 일부 측면에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 다음과 같이 구조적 배열을 갖는다: 제 1 항원 결합 도메인 - LP1 - Fc 영역 - 링커 - CD3 결합 영역 - LP2 - 제 2 항원 결합 도메인. 일부 구현예에서, 2개의 연결 펩티드는 서로 동일하지 않다.
일부 구현예에서, LP1 또는 LP2는 독립적으로 약 1 내지 20개의 아미노산 길이의 펩티드이다. 일부 구현예에서, LP1 또는 LP2는 독립적으로 서열번호 10-13, 119, 135, 147, 149에 기재된 임의의 Gly-Ser 링커 또는 GGS이거나 이를 포함하는 펩티드이다.
Ⅲ. 약학 조성물
제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 중 임의의 것의 조성물이 본원에 제공된다. 본 발명에 따른 치료제 실체의 투여는 개선된 이동, 전달, 내성 등을 제공하기 위해 제형에 포함되는 적합한 담체, 부형제, 및 다른 제제와 함께 투여될 것임을 이해할 것이다. 다수의 적절한 제형은 모든 약학 화학자에게 공지된 처방서에서 찾을 수 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA(1975)), 특히 Blaug, Seymour가 쓴 챕터 87. 이들 제형은, 예를 들어 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온 또는 음이온) 함유 소포(예를 들어 Lipofectin™), DN 콘쥬게이트, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수적형 에멀젼, 에멀젼 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반-고체 겔, 및 카보왁스를 함유하는 반고체 혼합물을 포함한다. 상기 혼합물 중 임의의 것은, 제형 중 유효성분이 제형에 의해 비활성화되지 않고 제형이 투여 경로와 생리학적으로 양립가능하고 견딜 수 있는 한, 본 발명에 따른 치료 및 요법에 적합할 수 있다. 약학 화학자에게 잘 알려진 제형, 부형제 및 담체와 관련된 추가의 정보에 대해서는 문헌 [Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000)], [Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000)], [Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000)], [Powell 등의 "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311(1998)] 및 여기에 인용된 것을 또한 참조한다.
일부 구현예에서, 본원에서 총괄적으로 치료제(들) 및 이의 유도체, 단편, 유사체 및 동족체로 지칭되는, 다중특이적 폴리펩티드, 접합된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트, 및 이의 조성물은 투여에 적합한 약학 조성물에 혼합될 수 있다. 구성요소의 선택에 대한 지침뿐만 아니라, 이러한 조성물을 제조하는 것과 관련된 원리 및 고려사항이, 예를 들어 문헌 「Remington's Pharmaceutical Sciences: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995」; 「Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994」; 및 「Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York」에 제공된다.
이러한 조성물은 전형적으로 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 또는 이의 콘쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트가 항체의 단편을 포함하는 경우, 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 가장 작은 단편이 사용될 수 있다. 예를 들어 항체의 가변 영역 서열에 기초하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 항체의 능력을 보유하는 펩티드 분자가 설계될 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성 및/또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다(예를 들어 Marasco 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893(1993)를 참고한다).
본원에 사용된, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 약학적 투여와 양립가능한, 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 담체는 당해 분야의 표준 참고문헌인 Remington's Pharmaceutical Sciences의 가장 최신판에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본원에서 참고로 포함된다. 이러한 담체 또는 희석제의 적합한 예는 물, 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 리포좀 및 고정된 오일과 같은 비-수성 비히클 또한 사용될 수 있다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 것을 제외하면, 조성물에서의 이의 사용이 고려된다.
생체 내(in vivo) 투여에 사용되는 제형은 반드시 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과로 용이하게 성취된다.
본 발명의 약학 조성물은 그의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어 정맥내, 피내, 피하, 경구(예를 들어 흡입), 경피(즉, 국소), 점막경유, 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내, 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음의 성분을 포함할 수 있다: 주사용 수(water), 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균된 희석액; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 버퍼, 및 염화나트륨 또는 덱스트로오스와 같은 등장성 조절을 위한 제제. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 투여량 바이알에 넣을 수 있다.
주사용으로 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리식염수, 정균수(bacteriostatic water), Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고 용이한 주사능(syringeability)이 존재하는 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 보관의 조건에서 안정적이어야 하고, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 및 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 포함하는 것이 적합할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시키는 것만으로 야기될 수 있다.
멸균 주사용 용액은, 필요에 따라, 활성 화합물을 필요한 양으로 상기 열거된 하나의 성분 또는 성분의 조합과 함께 적절한 용매에 혼입시킨 다음, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조방법은 유효성분의 분말 및 이전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 임의의 추가적인 바람직한 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결건조이다. 조성물이 동결건조되는 경우, 이 방법을 사용한 멸균은 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 수행될 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 동결건조된 형태 또는 용액으로 저장될 수 있다. 또한, 비경구 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하주사바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백(bag) 또는 바이알에 배치된다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 경구, 경피, 흡입, 정맥내, 동맥내, 근육내, 상처 부위에 직접 적용, 수술 부위에 적용, 복강내, 좌약, 피하, 피내, 경피, 분무, 흉막내, 심실내, 관절내, 안구내, 또는 척수내를 포함하는 임의의 경로를 통해 대상체에 투여된다.
경구 조성물은 일반적으로 비활성화 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐 내에 동봉되거나 정제로 압착될 수 있다. 경구 치료제 투여의 목적으로, 활성 화합물은 부형제와 혼입되어 정제, 트로키제(troches), 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 구강세정제로 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 제조될 수도 있으며, 유체 담체 내 화합물은 경구로 적용되어 휙 지나가 뱉어지거나 삼켜진다. 약학적으로 적합한 결합제 및/또는 보조물질은 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 정제 환제, 캡슐, 트로키제 등은 다음의 성분 중 임의의 것 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 미결정 셀룰로오스, 검 트래거캔스 고무 또는 젤라틴과 같은 바인더(binder); 전분 또는 락토오스와 같은 부형제, 알긴산, 프리모겔(Primogel), 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스(Sterotes)와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 활택제(glidant); 수크로오스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 향료와 같은 착향료.
흡입에 의한 투여의 경우, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 적합한 분사제, 예를 들어 이산화탄소와 같은 가스를 함유하는 가압 용기 또는 디스펜서(dispenser), 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 점막경유 또는 경피 방식으로 이루어질 수 있다. 점막경유 또는 경피 투여의 경우, 침투될 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 당해 기술분야에 일반적으로 공지되어 있으며, 예를 들어 점막경유 투여, 세정제, 담즙산염 및 푸시디산 유도체를 포함한다. 점막경유 투여는 비강 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여의 경우. 활성 화합물은 당해 기술분야에 일반적으로 알려진 연고, 고약(salve), 또는 크림으로 제형화된다.
화합물은 또한 좌약(예를 들어 코코아 버터 및 다른 글리세라이드와 같은 통상적인 좌약 기제와 함께), 또는 직장 전달을 위한 정체 관장의 형태로 제조될 수도 있다.
하나의 구현예에서, 치료제는 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는, 서방/제어 방출 제형과 같이, 신체로부터 화합물이 빠르게 제거되는 것을 보호하는 담체와 함께 제조된다. 생분해성, 생체적합성 폴리머, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리산무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르쏘에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조방법은 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
예를 들어 치료제는 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합으로 제조된 마이크로캡슐에, 예를 들어 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노-입자, 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀션(macroemulsion)에서 각각 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 약학적으로-허용가능한 부형제, 예를 들어 충전제, 바인더, 코팅제, 보존제, 윤활제, 착향료, 감미제, 착색제, 용매, 완충제, 킬레이트제, 또는 안전화제를 포함한다. 약학적으로-허용가능한 충전제의 예는 셀룰로오스, 이염기성 칼슘 포스페이트. 칼슘 카보네이트, 미결정 셀룰로오스, 수크로오스, 락토오스, 글루코오스, 만니톨, 소르비톨, 말톨, 전호화분 전분, 옥수수 전분, 또는 감자 전분을 포함한다. 약학적으로-허용가능한 바인터의 예는 폴리비닐피롤리돈, 전분, 락토오스, 자일리톨, 소르비톨, 말티톨, 젤라틴, 수크로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 메틸셀룰로오스, 또는 셀룰로오스를 포함한다. 약학적으로-허용간으한 코팅제의 예는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC), 셸락, 옥수수 단백질 제인, 또는 젤라틴을 포함한다. 약학적으로-허용가능한 붕괴제는 폴리비닐피롤리돈, 카복시메틸 셀룰로오스, 또는 전분글리콜산나트륨(sodium starch glycolate)을 포함한다. 약학적으로-허용가능한 윤활제의 예는 폴리에틸렌 글리콜, 스테아르산 마그네슘, 또는 스테아르산을 포함한다. 약학적으로-허용가능한 보존제의 예는 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 벤조산, 또는 소르브산을 포함한다. 약학적으로-허용가능한 감미제의 예는 수크로오스, 사카린, 아스파탐, 또는 소르비톨을 포함한다. 약학적으로-허용가능한 완충제의 예는 카보네이트, 시트레이트, 글루코네이트, 아세테이트, 포스페이트, 또는 타르트레이트를 포함한다.
서방성-방출 제제를 제조할 수 있다. 서방성-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고형 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형된 물품의 형태, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐이다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 추가로 생성물의 제어 또는 서방형 방출용 제제, 예를 들어 주사가능한 마이크로스피어, 생-침식성 입자, 폴리머 화합물(폴리락트산, 폴리글리콜산), 비드, 또는 리포좀을 포함한다. 서방형-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올), 폴리락타이드(미국특허번호 3,773,919호), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOTTM(락트산-글리콜산 공중합체 및 초산류프롤리드로 구성된 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체가 100일 넘게 분자의 방출을 가능하게 하는 반면, 특정 하이드로겔은 더 짧은 시간의 기간 동안 단백질을 방출한다.
물질은 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc로부터 상업적으로 수득할 수 있다. 리포좀 현탁액(바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체로 감염된 세포를 표적화하는 리포좀을 포함함)은 또한 약학적으로 허용가능한 담체로 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들어 미국특허번호 4,522,811호에 기재된 바와 같이, 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 경구 또는 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 투여량 단위 형태는 치료될 대상에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하고; 각 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 원하는 치료효과를 생성하도록 계산된, 사전에 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 사양은 활성 화합물 고유의 특성 및 달성되는 특정 치료 효과, 그리고 개인의 치료를 위한 이러한 활성 화합물을 배합하는 기술에 내재된 한계점에 의해 영향을 받고 직접적으로 이에 따라 좌우된다.
본원에 기재된 약학 조성물(또는 제조 물품)을 포함하는 키트가 추가로 제공된다. 약학 조성물은 투여 지침서와 함께 용기, 팩, 또는 디스펜서에 포함될 수 있다. 본원에 기재된 키트는 또한 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 본원에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 지침서와 함께 패키지 삽입물을 비롯한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 또한 포함할 수 있다.
제형은 또한 치료될 특정 적응증, 예를 들어 서로에 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것에 필요한 하나 이상의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 또는 추가로, 조성물은 예를 들어 세포독성제, 사이토카인, 화학요법제, 또는 성장-억제제와 같이 이의 기능을 향상시키는 제제, 또는 성장-억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
일부 구현예에서, 약학 조성물의 투여량은 단일 투여량 또는 반복 투여량이다. 일부 구현예에서, 투여량은 하루에 한 번, 하루에 두 번, 하루에 세 번, 하루에 네 번 또는 그 이상의 횟수로 개체에게 제공된다. 일부 구현예에서, 약 1회 또는 그 이상(예를 들어 약 2회 또는 그 이상, 약 3회 또는 그 이상, 약 4회 또는 그 이상, 약 5회 또는 그 이상, 약 6회 또는 그 이상, 또는 약 7회 또는 그 이상)의 투여량이 1주일에 제공된다. 일부 구현예에서, 며칠, 몇 주, 몇 개월 또는 몇 년에 걸쳐 다중 투여량이 제공된다. 일부 구현예에서, 치료 과정은 약 1회 또는 그 이상의 투여량(예를 들어 약 2회 또는 그 이상의 투여량, 약 3회 또는 그 이상의 투여량, 약 4회 또는 그 이상의 투여량, 약 5회 또는 그 이상의 투여량, 약 7회 또는 그 이상의 투여량, 약 10회 또는 그 이상의 투여량, 약 15회 또는 그 이상의 투여량, 약 25회 또는 그 이상의 투여량, 약 40회 또는 그 이상의 투여량, 약 50회 또는 그 이상의 투여량, 또는 약 100회 또는 그 이상의 투여량)이다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 대상체에 투여된다. 일반적으로, 약학 조성물의 투여량 및 투여 경로는 표준 약학 실무에 따라 대상체의 크기 및 상태에 따라 결정된다. 예를 들어 치료학적 유효 투여량은 세포 배양 어세이 또는 마우스, 래트, 토끼, 개, 돼지, 또는 원숭이와 같은 동물 모델에서 초기에 추정될 수 있다. 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하기 위해 동물 모델이 또한 사용될 수 있다. 이러한 정보는 인간에게 투여하기에 유용한 투여량 및 경로를 결정하는데 사용될 수 있다. 정확한 투여량은 치료를 필요로 하는 개체와 관련된 인자에 비추어 결정될 것이다. 투여량 및 투여는 충분한 수준의 활성 화합물을 제공하거나 또는 원하는 효과를 유지하도록 조정된다. 고려할 수 있는 인자는 질병 상태의 심각도, 대상체의 일반적인 건강 상태, 대상체의 연령, 체중, 및 성별, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감도 및 치료에 대한 반응을 포함한다. 특정 환자에 대한 최적의 투여량과 치료요법은 의약 분야의 통상의 기술자가 질병의 증상에 대해 환자를 모니터링하고 이에 따라 치료법을 조정함으로써 용이하게 결정될 수 있다.
Ⅳ. 사용 및 치료 투여 방법
다중특이적 폴리펩티드의 사용 및 사용방법이 제공된다. 이러한 방법 및 사용은, 예를 들어 이를 함유하는 분자 또는 조성물을 종양 또는 암과 같은 질병, 질환, 또는 장애를 갖는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 치료방법 및 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 분자 및/또는 조성물은 질병 또는 장애의 치료에 영향을 미치는 유효량으로 투여된다. 용도는 이러한 방법 및 치료, 그리고 이러한 치료방법을 수행하기 위한 약제의 제조에서 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 용도를 포함한다.　일부 구현예에서, 방법은 질병 또는 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 개체에 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트, 또는 이를 포함하는 조성물을 투여함으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 이에 의해 방법은 개체에서 질병 또는 질환을 치료한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 제제는 일반적으로 개체에서 질병 또는 병리를 진단, 예후, 모니터링, 치료, 완화 및/또는 예방하는데 적용될 것이다. 치료요법은 표준방법을 사용하여 장애로 고통받는(또는 발병 위험이 있는) 개체, 예를 들어 인간 환자 또는 다른 포유동물을 확인함으로써 수행된다. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 대상체에 투여된다. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 대상체에 투여되며, 일반적으로 표적(들)과의 결합으로 인한 효과를 가질 것이다.
일부 구현예에서, 치료학적 유효량의 임의의 제공된 다중특이적 콘쥬게이트 또는 약학 조성물을 투여함으로써 개체에서 면역반응을 조절하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 면역반응을 조절하는 방법은 개체에서 면역반응을 증가시키거나 향상시킨다. 예를 들어 증가 또는 향상된 반응은 세포-매개 면역성의 증가일 수 있다. 일부 예에서, 방법은 세포용해성 T-세포(CTL) 활성과 같은 T-세포 활성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 조절된(예를 들어 향상된) 면역반응은 종양 또는 암에 대한 것이다.
다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 투여는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 Fc-영역을 통한 FcηR의 관여를 통해 선천성 면역 세포를 활성화시킬 수 있다. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 투여는 ADCC, 사이토카인 방출, 탈과립 및/또는 ADCP를 포함하는, 선천성 면역세포 효과기 기능을 작용, 자극, 활성화 및/또는 증강시킬 수 있다. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트가 절단가능한 링커를 함유하는 예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 투여는 제 1 및 제 2 구성요소를 연결하는 링커(들)가 일단 프로테아제에 의해 절단되면, T-세포를 활성화시켜, 항-CD3 결합 부분이 T 세포 상의 CD3ε에 결합하게 한다. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 투여는 CD3-매개 T 세포 활성화, 세포독성, 사이토카인 방출 및/또는 증식을 작용, 자극, 활성화, 및/또는 증강시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 치료학적 유효량의 임의의 제공된 다중특이적 콘쥬게이트 또는 약학 조성물을 투여함으로써 대상체의 질병 또는 질환을 치료하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 질병 또는 질환은 종양 또는 암이다. 일반적으로, 질병 또는 장애의 완화 또는 치료는 질병 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상 또는 의학적 문제의 감소를 포함한다. 예를 들어 암의 경우, 치료학적으로 유효한 양의 약물은 다음 중 하나 또는 조합을 달성할 수 있다: 암세포의 수를 감소시킴; 종양 크기를 감소시킴; 주변 기관으로의 암세포 침윤을 억제함(즉, 어느 정도 감소 및/또는 정지시킴); 종양 전이를 억제함; 종양 성장을 일부 억제함; 및/또는 암과 관련된 하나 이상의 병태를 어느 정도 경감시킴. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 개체, 예를 들어 인간 또는 다른 포유동물, 예를 들어 비-인간 영장류, 반려동물(예를 들어 고양이, 개, 말), 농장동물, 업무동물(work animal), 또는 동물원 동물의 질병 또는 장애의 발병 또는 재발을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 용어 재체 및 환자는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 포유동물 암세포(예를 들어 인간 암세포)의 성장을 억제하는데 사용될 수 있다. 암을 치료하는 방법은 유효량의 본원에 기재된 임의의 약학 조성물을 암을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 약학 조성물의 유효량은 암의 진행을 억제, 중단, 또는 역전시키기 위해 투여될 수 있다. 인간 암 세포는 생체 내(in vivo), 또는 탈체(ex vivo)에서 치료될 수 있다. 인간 환자의 탈체(ex vivo) 치료에서, 암세포를 함유하는 조직 또는 체액은 신체 외부에서 치료된 다음 조직 또는 체액이 환자에게 다시 도입된다. 일부 구현예에서, 암은 치료학적 조성물을 환자에게 투여함으로써 인간 환자 생체 내(in vivo)에서 치료된다.
비-제한적인 질환의 예는: 모든 종류의 암(유방, 폐, 대장, 전립선, 흑색종, 두경부, 췌장 등), 류마티스 관절염, 크론병, SLE, 심혈관 손상, 허혈 등을 포함한다. 예를 들어 적응증은 T-세포 급성 림프모구백혈병(T-ALL)을 포함하는 백혈병, 다발성 골수종을 포함하는 림프모구성 질병, 폐, 대장, 전립선, 췌장, 및 삼중음성유방암을 포함하는 유방을 포함하는 고형 종양을 포함한다. 예를 들어 적응증은 원발성 종양 기원에 관계없이 암에서의 골 질병 또는 전이; 비-제한적인 예로, ER/PR+ 유방암, Her2+ 유방암, 삼중-음성유방암을 포함하는 유방암; 대장암; 자궁내막암; 위암; 교모세포종; 두경부암, 예를 들어 식도암; 폐암, 예를 들어 비-제한적인 예로, 비-소세포폐암; 다발성 골수종 난소암; 췌장암; 전립선암; 육종, 예를 들어 골육종; 신장암, 예를 들어 비제한적인 예로, 신장 세포 암종; 및/또는 피부암, 예를 들어 비제한적인 예로, 편평세포암, 기저세포암종, 또는 흑색종을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 편평세포암이다. 일부 구현예에서, 암은 피부 편평세포암종이다. 일부 구현예에서, 암은 식도 편평세포암종이다. 일부 구현예에서, 암은 두경부 편평세포암종이다. 일부 구현예에서, 암은 폐 편평세포암종이다.
본 발명의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 치료학적으로 유효한 양은 일반적으로 치료 목적을 달성하는데 필요한 양에 관한 것이다. 상기 언급한 바와 같이, 이는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 이의 표적 항원(들) 사이의 결합 상호작용, 일부의 경우, FcηR-매개 선천성 면역 세포 활성화 또는 CD3-매개 T 세포 활성화를 작용, 자극, 활성화, 및/또는 증강시키는 것일 수 있다. 투여되는데 필요한 양은 또한 이의 특이적 항원(들)에 대한 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 결합 친화도에 의존할 것이고, 또한 투여된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 이것이 투여된 다른 대상체의 자유 부피(free volume)로부터 고갈되는 속도에 의존할 것이다. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 치료학적으로 유효한 투여량을 위한 일반적인 범위는, 비제한적인 예로, 약 0.01 μg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 치료학적으로 유효한 투여량의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트, 비제한적인 예로, 약 0.01 mg/kg 체중 내지 약 5-10 mg/kg 체중일 수 있다. 일반적인 투여 빈도는, 예를 들어 매일 2회 내지 일주일에 1회의 범위일 수 있다.
치료의 효능은 특정 장애를 진단 또는 치료하기 위한 임의의 공지된 방법과 관련하여 결정된다. 원하는 특이성을 갖는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 스크리닝 방법은 효소결합면역흡착분석법(ELISA) 및 관련 기술분야에 공지된 다른 면역학적으로 매개된 기술을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 투여가 면역세포 매개 또는 매개 가능한 바람직하지 않은 면역 반응을 제거, 격리, 또는 비활성화시킴으로써; 보호 면역 반응을 매개하거나 매개할 수 있는 면역세포를 유도, 생성, 또는 자극(turning on)함으로써; 면역세포의 물리적 또는 기능적 특성을 변경함으로써; 또는 이러한 효과의 조합으로 면역학적 활성을 충분히 조절하는지 결정하기 위한 다양한 수단이 공지되어 있다. 면역학적 활성 조절의 측정의 예는 면역세포 집단의 존재 또는 부재의 검사(유세포 분석, 면역조직화학, 조직학, 전자 현미경, 중합효소연쇄반응(PCR)); 신호에 반응하여 증식 또는 분열하는 능력 또는 저항성을 포함하는 면역세포의 기능적 능력의 측정(예를 들어 T-세포 증식 어세이 및 항-CD3 항체, 항-T-세포 수용체 항체, 항-CD28 항체, 칼슘 이온투과담체, 펩티드 또는 단백질 항원이 로딩된 PMA(포르볼-12-미리스테이트 13-아세테이트) 항원 제시 세포로 자극 후 3H-티미딘 혼합을 기반으로 하는 펩스캔(pepscan) 분석; B 세포 증식 어세이); 다른 세포를 죽이거나 용해시키는 능력의 측정(예를 들어 세포독성 T 세포 어세이); 사이토카인, 케모카인, 세포 표면 분자 항체 및 세포의 다른 산물의 측정(예를 들어 유세포 분석, 효소-결합 면역흡착 어세이, 웨스턴 블랏 어세이, 단백질 마이크로어레이 분석, 면역침전분석에 의해); 면역세포의 활성화의 생화학적 마커 또는 면역세포 내 신호전달경로의 측정(예를 들어 티로신, 세린 또는 트레오닌 인산화, 폴리펩티드 절단 및 단백질 복합체의 형성 또는 분리의 웨스턴 블랏 및 면역침전 분석; 단백질 어레이 분석; DNA 어레이 또는 감수잡종형성(subtractive hybridization)을 이용한 DNA 전사, 프로파일링); 아폽토시스, 괴사, 또는 다른 메카니즘에 의한 세포 사멸의 측정(예를 들어 아넥신 V 염색, TUNEL 어세이, DNA 레더링(laddering)을 측정하기 위한 겔 전기영동, 조직학; 형광발생 카스파제 어세이, 카스파제 기질의 웨스턴 블랏 분석); 유전자, 단백질, 및 면역세포에 의해 생성된 다른 분자의 측정(예를 들어 노던 블랏 분석, 중합효소연쇄반응, DNA 마이크로어레이, 단백질 마이크로어레이, 2-차원 겔 전기영동, 웨스턴 블랏 분석, 효소 결합 면역흡착 어세이, 유세포 분석); 및 예를 들어 재발률 또는 질환 중증도를 측정함으로써 자가면역, 신경퇴행성, 및 자가-단백질 또는 자가-폴리펩티드를 수반하는 다른 질환의 개선과 같은 임상적 증상 또는 결과의 측정(임상적 점수, 추가 요법의 사용에 대한 필요성, 기능적 상태, 이미징 연구)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 또한 다양한 진단 및 예방 제형에 유용하다. 하나의 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 상기 언급된 장애 중 하나 이상이 발생할 위험이 있는 환자에 투여된다. 하나 이상의 장애에 대한 환자 또는 기관의 소인은 유전자형, 혈청학적 또는 생화학적 마커를 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 상기 언급된 장애 중 하나 이상과 관련된 임상 적응증으로 진단된 인간 대상체에 투여된다. 진단 시, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 임상 적응증의 효과를 완화하거나 역전시키기 위해 투여된다.
조합 치료법
일부 구현예에서, 본원에서 총괄적으로 치료제(들)로 지칭되는 - 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트, 접합된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트, 및 이의 조성물은 하나 이상의 추가 제제, 또는 추가 제제의 조합과 함께 투여된다. 적합한 추가 제제는 의도된 적용을 위한 현재의 약학 및/또는 외과적 치료법을 포함한다. 예를 들어 치료제(들)은 추가의 화학요법제 또는 항-신생물제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어 치료제(들) 및 추가 제제는 단일 치료 조성물로 제형화되고, 그리고 치료제(들) 및 추가 제제는 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 치료제(들) 및 추가 제제는 서로 분리되어 있고, 예를 들어 각각 개별적인 치료 조성물로 제형화되며, 그리고 치료제(들) 및 추가 제제는 동시에 투여되거나, 또는 치료제(들) 및 추가 제제는 치료요법 동안 상이한 시간에 투여된다. 예를 들어 치료제(들)는 추가 제제의 투여 전에 투여되거나, 치료제(들)는 추가 제제의 투여 후에 투여되거나, 치료제(들) 및 추가 제제는 교대로 투여된다. 본원에 기재된 바와 같이, 치료제(들) 및 추가 제제는 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 추가 제제는 치료제(들)에 결합되거나 다르게는 부착된다. 적합한 추가 제제는 의도된 적용(즉, 사멸, 세포 증식의 방지, 호르몬 요법 또는 유전자 요법)의 목적에 따라 선택된다. 이러한 제제는, 예를 들어 약학 제제, 독소, 독소의 단편, 알킬화제, 효소, 항생제, 항대사성물질, 항증식제, 호르몬, 신경전달물질, DNA, RNA, siRNA, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 RNA, 앱타머, 진단제, 방사선 불투과성 염료, 방사성 동위원소, 형광발생 화합물, 자기(magnetic) 표지, 나노입자, 마커 화합물, 렉틴, 세포막 투과성을 변경시키는 화합물, 광화학 화합물, 소분자, 리포좀, 미셀, 유전자 요법 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 마지막으로, 제제의 조합 또는 상이한 클래스 제제의 조합이 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 병용 요법, 즉, 다른 제제, 예를 들어 자가면역질질환 및 염증성 질환과 같은 병리학적 질병 또는 장애를 치료하는데 유용한 예를 들어 치료제와 조합하여 투여된다. 이와 관련해서 용어 "조합된(in combination)"은 제제가 실질적으로 동시에, 동시에 또는 순차적으로 주어지는 것을 의미한다. 순차적으로 주어지는 경우, 제 2 화합물의 투여의 개시에, 2개의 화합물 중 제 1 화합물은 여전히 치료 부위에서 유효 농도로 검출가능한다.
예를 들어 병용 요법은 하나 이상의 치료제, 예를 들어 하기에 보다 자세히 기재된, 하나 이상의 사이토카인 및 성장인자 억제제, 면역억제제, 항-염증제, 대사 억제제, 효소 억제제, 및/또는 세포독성제 또는 세포정지제와 공동-제형화되거나/되고 공동-투여되는 본 발명의 하나 이상의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 포함할 수 있다. 추가로, 본원에 기재된 하나 이상의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 본원에 기재된 둘 이상의 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 조합 치료법은 유리하게는 적은 투여량의 투여된 치료제를 이용할 수 있으므로, 다양한 단일요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 하나 이상의 항-염증 약물, 면역억제제, 또는 대사 또는 효소 억제제와 함께 공동-제형화되고/되거나 공동-투여될 수 있다. 본원에 기재된 항체와 조합하여 사용될 수 있는 약물 또는 억제제의 비제한적인 예는 하나 이상의: 비스테로이드성 항-염증 약물(들)(NSAIDs), 예를 들어 이부로펜, 테니댑, 나프록센, 멜록시캄, 피록시캄, 디클로페낙, 및 인도메타신; 설파살라진; 프레드니솔론과 같은 코르티코스테로이드; 사이토카인 억제성 항-염증 약물(들)(CSAIDs); 뉴클레오티드 생합성 억제제, 예를 들어 퓨린 생합성 억제제, 엽산 길항제(예를 들어 메토트렉세이트(N-[4-[[(2,4-디아미노-6-프테리디닐)메틸]메틸아미노]벤조일]-L-글루탐산); 및 피리미딘 생합성 억제제, 예를 들어 디하이드로오로테이트 디하이드로게나아제(dihydroorotate dehydrogenase, DHODH) 억제제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 항체와 조합하여 사용하기에 적합한 치료제는 NSAIDs, CSAIDs,(DHODH) 억제제(예를 들어 레플루노미드), 및 엽산 길항제(예를 들어 메토트렉세이트)를 포함한다.
추가 억제제의 예는 하나 이상의: 코르티코스테로이드(경구, 흡입 및 국소 주사); 면역억제제, 예를 들어 사이클로스포린, 타크로리무스(FK-506); 및 mTOR 억제제, 예를 들어 시롤리무스(라파마이신 - RAPAMUNETM 또는 라파마이신 유도체, 예를 들어 가용성 라파마이신 유도체(예를 들어 에스테르 라파마이신 유도체, 예를 들어 CCI-779); TNFα 또는 IL-1과 같은 전염증성 사이토카인에 의한 신호전달을 방해하는 제제(예를 들어 IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나아제 억제제); COX2 억제제, 예를 들어 셀레콕시브, 로페콕시브 및 이의 변이체; 포스포디에스터라아제(phosphodiesterase) 억제제, 예를 들어 R973401(포스포디에스터라아제 제IV형 억제제); 포스포리파아제 억제제, 예를 들어 사이토솔릭 포스포리파아제 2(cPLA2)(예를 들어 트리플루오로메틸 케톤 유사체)의 억제제; 혈관내피세포 성장인자 또는 성장인자 수용체, 예를 들어 VEGF 억제제 및/또는 VEGF-R 억제제; 및 혈관신생 억제제를 포함한다. 본 발명의 항체와 조합하여 사용하기에 적합한 치료제는 면역억제제, 예를 들어 사이클로스포린, 타크로리무스(FK-506); mTOR 억제제, 예를 들어 시롤리무스(라파마이신) 또는 라파마이신 유도체, 예를 들어 가용성 라파마이신 유도체(예를 들어 에스테르 라파마이신 유도체, 예를 들어 CCI-779); COX2 억제제, 예를 들어 셀레콕시브 및 이의 변이체; 및 포스포리파아제 억제제, 예를 들어 사이토솔릭 포스포리파아제 2(cPLA2)의 억제제, 예를 들어 트리플루오로메틸 케톤 유사체이다. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트와 조합될 수 있는 치료제의 추가의 예는 하나 이상의: 6-머캅토퓨린(6-MP); 아자티오프린 설파살라진; 메살라진; 올살라진; 클로로퀸/하이드록시클로로퀸(PLAQUENIL®); 페니실라민; 오로티오말레이트(근육내 및 경구); 아자티오프린; 콜히친; 베타-2 아드레날린수용체 작용제(살부타몰, 터부탈린, 살메테랄); 잔틴(테오필린, 아미노필린); 크로모글리세이트(cromoglycate); 네도크로밀; 케토티펜; 이프라트로피움 및 옥시트로피움; 마이코페놀레이트 모페틸; 아데노신 작용제; 항혈전제; 보체 억제제; 및 아드레날린성 제제를 포함한다.
Ⅴ. 예시적 구현예
제공된 구현예 중에는:
1. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트로서, 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 제 1 구성요소 및 CD3-결합 영역을 포함하는 제 2 구성요소를 포함하고,
여기서, 제 1 및 제 2 구성요소는 비-결합성 링커로 결합되며, Fc 영역은 CD3-결합 영역에 대해 N-말단에 위치하고; 그리고
제 1 및 제 2 구성요소 중 하나 또는 둘 다는 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
2. 제 1 구현예에 있어서, CD3-결합 영역은 CD3(CD3ε)에 결합하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
3. 제 1 구현예 또는 제 2 구현예에 있어서, 항원 결합 도메인은 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치하고/하거나 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
4. 제 1 내지 제 3 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 제 1 구성요소는 제 1 항원 결합 도메인을 포함하고 제 2 구성요소는 제 2 항원 결합 도메인을 포함하며, 항원 결합 도메인들 각각은 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
5. 제 4 구현예에 있어서, 제 1 항원 결합 도메인은 다중특이적 컨스트럭트의 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치하고 제 2 항원 결합 도메인은 다중특이적 컨스트럭트의 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
6. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트로서, 상기 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로:
종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 제 1 항원 결합 도메인;
면역글로불린 Fc 영역;
비-결합성 링커;
CD3(CD3ε)에 결합하는 CD3 결합 영역; 및
종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 제 2 항원 결합 도메인을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
7. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트로서, 상기 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로:
면역글로불린 Fc 영역;
비-결합성 링커;
CD3(CD3ε)에 결합하는 CD3 결합 영역; 및
종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
8. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트로서, 상기 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로:
종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인;
면역글로불린 Fc 영역;
비-결합성 링커; 및
CD3(CD3ε)에 결합하는 CD3 결합 영역을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
9. 제 1 내지 제 8 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 동종이량체 Fc 영역인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
10. 제 1 내지 제 9 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 또는 인간 IgG4의 Fc 영역이거나, 면역학적으로 활성인 이의 단편인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
11. 제 1 내지 제 10 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
12. 제 1 내지 제 10 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 2와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하거나;
Fc 영역은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 4와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하거나; 또는
Fc 영역은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 5와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
13. 제 1 내지 제 6, 제 9 및 제 12 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 이종이량체 Fc 영역인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
14. 제 13 구현예에 있어서, 이종이량체 Fc 영역의 Fc 폴리펩티드 중의 하나 또는 둘 다는 동종이량체 Fc 영역의 폴리펩티드에 비해, 선택적으로 서열번호 1에 기재된 Fc 폴리펩티드 또는 면역학적으로 활성인 이의 단편에 비해, 이종이량체화를 유도하는 적어도 하나의 변형체를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
15. 제 14 구현예에 있어서, 이종이량체 Fc의 Fc 폴리펩티드 각각은 적어도 하나의 아미노산 변형체를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
16. 제 15 구현예에 있어서, 이종이량체 Fc의 Fc 폴리펩티드 각각은 노브-인투-홀(knob-into-hole) 변형체를 포함하거나 폴리펩티드의 정전기적 상보성을 증가시키기 위한 전하 돌연변이체를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
17. 제 16 구현예에 있어서, 아미노산 변형체는 노브-인투-홀(knob-into-hole) 변형인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
18. 제 13 내지 제 17 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 이종이량체 Fc의 제 1 Fc 폴리펩티드는 Thr366Ser, Leu368Ala, Tyr407Val, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 변형체를 포함하고 이종이량체 Fc의 제 2 Fc 폴리펩티드는 변형체 T366W을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
19. 제 18 구현예에 있어서, 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드는 비-시스테인 잔기에서 시스테인 잔기로의 변형체를 추가로 포함하고, 여기서 제 1 폴리펩티드의 변형체는 Ser354 및 Y349 위치 중의 하나이고 제 2 Fc 폴리펩티드의 변형체는 Ser354 및 Y349 위치 중의 다른 하나인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
20. 제 16 구현예에 있어서, 아미노산 변형체는 폴리펩티드의 정전기적 상보성을 증가시키는 전하 돌연변이인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트
21. 제 13 내지 제 16 및 20 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 제 1 및/또는 제 2 Fc 폴리펩티드 또는 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드 각각은 상보적 위치에 변형체를 포함하고, 여기서 변형체는 다른 폴리펩티드의 상보적 아미노산에 반대 전하를 갖는 아미노산으로의 치환인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
22. 제 14 내지 제 21 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 이종이량체 Fc의 제 1 또는 제 2 Fc 폴리펩티드 중의 하나는 Ile253 잔기의 변형체를 추가로 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
23. 제 22 구현예에 있어서, 변형체는 Ile253Arg인 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
24. 제 14 내지 제 23 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 이종이량체 Fc의 제 1 또는 제 2 Fc 폴리펩티드 중의 하나는 잔기 His435의 변형체를 추가로 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
25. 제 24 구현예에 있어서, 변형체는 His435Arg인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
26. 제 1 내지 제 25 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 Lys447이 결여된 폴리펩티드를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
27. 제 1 내지 제 26 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 FcRn 결합을 향상시키는 적어도 하나의 변형체를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
28. 제 27 구현예에 있어서, 변형체는 Met252, Ser254, Thr256, Met428, Asn434, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
29. 제 28 구현예에 있어서, 변형체는 Met252Y, Ser254T, Thr256E, Met428L, Met428V, Asn434S, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
30. 제 28 구현예에 있어서, 변형체는 Met252 위치 및 Met428 위치인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
31. 제 30 구현예에 있어서, 변형체는 Met252Y 및 Met428L인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
32. 제 30 구현예에 있어서, 변형체는 Met252Y and Met428V인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
33. 제 13 내지 제 32 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 이종이량체 Fc의 제 1 폴리펩티드는 서열번호 82, 86, 94 또는 96 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함하고, 이종이량체 Fc의 제 2 폴리펩티드는 서열번호 83, 87, 90, 92, 98 또는 100 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
34. 제 1 내지 제 33 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 효과기 기능을 감소시키고/시키거나 Fc 감마 수용체 또는 C1q로부터 선택되는 효과기 분자에 대한 결합을 감소시키는 적어도 하나의 아미노산 변형체를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
35. 제 34 구현예에 있어서, 하나 이상의 아미노산 변형체는 Glu233, Leu234 또는 Leu235 중 하나 이상의 결실인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
36. 제 13 내지 제 32, 제 34 및 제 35 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 이종이량체 Fc의 제 1 폴리펩티드는 서열번호 84, 88, 95 또는 97 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함하고 이종이량체 Fc의 제 2 폴리펩티드는 서열번호 85, 89, 91, 93, 99 또는 101 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
37. 제 1 내지 제 32 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 FcηR 결합을 향상시키는 적어도 하나의 변형체를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
38. 제 37 구현예에 있어서, 변형체는 Ser239 또는 Ile332에서의 변형인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
39. 제 1 내지 제 32 및 제 37 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역의 글리코실화는 비변형 Fc 영역에 비해 FcηR 결합을 향상시키기 위해 변형되는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
40. 제 39 구현예에 있어서, Fc 영역은 푸코오스 함량이 결여되어 있거나 푸코오스 함량을 감소시키는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
41. 제 1 내지 제 40 구현예에 있어서, CD3 결합 영역은 항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
42. 제 41 구현예에 있어서, 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄 영역(VH) 및 가변 경쇄 영역(VL)을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
43. 제 1 내지 제 42 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, CD3 결합 영역은 1가인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
44. 제 41 내지 제 43 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편은 단일 사슬 항체가 아니고, 선택적으로 단일 사슬 가변 단편(scFv)이 아닌, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
45. 제 42 또는 제 44 구현예에 있어서, Fc는 이종이량체 Fc이고 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 VH 및 VL은 이종이량체 Fc의 반대편 폴리펩티드에 연결되는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
46. 제 1 내지 제 45 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, CD3 결합 영역은, 항원 결합 도메인 중 적어도 하나가 이의 TAA에 결합하지 않는 한, CD3에 결합 또는 관여할 수 없거나, 또는 실질적으로 결합 또는 관여할 수 없는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
47. 제 1 내지 제 46 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, CD3 결합 영역은, 항원 결합 도메인 중 적어도 두 개가 이의 TAA에 결합하지 않는 한, CD3에 결합 또는 관여할 수 없거나, 또는 실질적으로 결합 또는 관여할 수 없는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
48. 제 1 내지 제 47 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 링커는 폴리펩티드 링커인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
49. 제 48 구현예에 있어서, 링커는 최대 25개의 아미노산 길이의 폴리펩티드인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
50. 제 48 구현예 또는 제 49 구현예에 있어서, 링커는 (약) 2개 내지 24개의 아미노산, 2개 내지 20개의 아미노산, 2개 내지 18개의 아미노산, 2개 내지 14개의 아미노산, 2개 내지 12개의 아미노산, 2개 내지 10개의 아미노산, 2개 내지 8개의 아미노산, 2개 내지 6개의 아미노산, 6개 내지 24개의 아미노산, 6개 내지 20개의 아미노산, 6개 내지 18개의 아미노산, 6개 내지 14개의 아미노산, 6개 내지 12개의 아미노산, 6개 내지 10개의 아미노산, 6개 내지 8개의 아미노산, 8개 내지 24개의 아미노산, 8개 내지 20개의 아미노산, 8개 내지 18개의 아미노산, 8개 내지 14개의 아미노산, 8개 내지 12개의 아미노산, 8개 내지 10개의 아미노산, 10개 내지 24개의 아미노산, 10개 내지 20개의 아미노산, 10개 내지 18개의 아미노산, 10개 내지 14개의 아미노산, 10개 내지 12개의 아미노산, 12개 내지 24개의 아미노산, 12개 내지 20개의 아미노산, 12개 내지 18개의 아미노산, 12개 내지 14개의 아미노산, 14개 내지 24개의 아미노산, 14개 내지 20개의 아미노산, 14개 내지 18개의 아미노산, 18개 내지 24개의 아미노산, 18개 내지 20개의 아미노산 또는 20개 내지 24개의 아미노산의 폴리펩티드인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
51. 제 48 내지 제 50 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 링커는 길이가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산인 폴리펩티드인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
52. 제 48 내지 제 51 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 링커는 길이가 3개 내지 18개의 아미노산인 폴리펩티드인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
53. 제 48 내지 제 51 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 링커는 길이가 12개 내지 18개의 아미노산인 폴리펩티드인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
54. 제 48 내지 제 51 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 링커는 길이가 15개 내지 18개의 아미노산인 폴리펩티드인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
55. 이종이량체 Fc 영역을 포함하는 제 1 구성 요소 및 가변 중쇄 영역(VH) 및 가변 경쇄 영역(VL)을 포함하는 항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 제 2 구성 요소를 포함하는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트로서,
여기서,
항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 VH 및 VL은 이종이량체 Fc의 반대편 폴리펩티드에 연결되고;
제 1 및 제 2 구성 요소는 비-절단성 링커로 결합되며, 여기서 이종이량체 Fc 영역은 항-CD3 항체에 대해 N-말단에 위치하고; 그리고
제 1 및 제 2 구성요소 중 하나 또는 둘 다는 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
56. 제 52 내지 제 55 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 비-절단성 링커는 프로테아제에 의한 절단에 대해 특이적으로 인식되는 기질 인식 부위를 함유하지 않는 것인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
57. 제 56 구현예에 있어서, 프로테아제는 면역 효과기 세포, 종양, 또는 종양 미세 환경에 존재하는 세포에 의해 생산되는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
58. 제 57 구현예에 있어서, 프로테아제는 면역 효과기 세포에 의해 생산되고 면역 효과기 세포는 활성화된 T 세포, 자연살해(NK) 세포, 또는 NK T 세포인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
59. 제 56 내지 제 58 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 프로테아제는 매트립타아제(matriptase), 기질금속단백질분해효소(MMP), 그랜자임 B, 및 이들의 조합 중에서 선택되는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
60. 제 59 구현예에 있어서, 프로테아제는 그랜자임 B인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
61. 제 1 내지 제 60 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 비-절단성 링커는 GS, GGS, GGGGS(서열번호 149), GGGGGS(서열번호 135) 및 그들의 조합을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
62. 제 1 내지 제 61 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 비-절단성 링커는 (GGS)n을 포함하되, n은 1 내지 10인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
63. 제 1 내지 제 62 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 비-절단성 링커는 (GGGGS)n(서열번호 173)을 포함하되, n은 1 내지 10인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
64. 제 1 내지 제 62 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 비-절단성 링커는 (GGGGGS)n(서열번호 172)을 포함하되, n은 1 내지 4인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
65. 제 1 내지 제 64 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 비-절단성 링커는 GGS를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
66. 제 1 내지 제 64 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 비-절단성 링커는 GGGGS(서열번호 149)를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
67. 제 1 내지 제 64 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 비-절단성 링커는 GGGGGS(서열번호 135)를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
68. 제 1 내지 제 64 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 비-절단성 링커는 (GGS)2(서열번호 10)를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
69. 제 1 내지 제 64 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 비-절단성 링커는 GGSGGSGGS(서열번호 11)를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
70. 제 1 내지 제 64 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 비-절단성 링커는 GGSGGSGGSGGS(서열번호 12)를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
71. 제 1 내지 제 64 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 비-절단성 링커는 GGSGGSGGSGGSGGS(서열번호 13)를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
72. 제 1 내지 제 64 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 비-절단성 링커는 GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119)를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
73. 제 1 내지 제 64 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 비-절단성 링커는 GGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 147)를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
74. 제 1 내지 제 64 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 비-절단성 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 170)를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
75. 제 45 내지 제 74 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 적어도 (i) 이종이량체 Fc 영역의 제 1 Fc 폴리펩티드, 링커 및 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 VH 도메인을 포함하는 제 1 폴리펩티드; 및 (ii) 이종이량체 Fc 영역의 제 2 Fc 폴리펩티드, 링커 및 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 VL 도메인을 포함하는 제 2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제 1 및 제 2 폴리펩티드 중의 하나 또는 둘 다는 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 적어도 하나의 항원-결합 도메인을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
76. 제 1 내지 제 75 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, TAA에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인은 TAA에 대한 1가, 2가, 3가 또는 4가 결합을 생성하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
77. 제 75 구현예에 있어서, 제 1 또는 제 2 폴리펩티드 중 단 하나만 TAA에 결합하는 적어도 하나의 항원-결합 도메인을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
78. 제 75 구현예 또는 제 77 구현예에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치하고/하거나 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 제 1 또는 제 2 폴리펩티드 중의 하나의 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
79. 제 75 구현예 또는 제 77 구현예에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 다중특이적 컨스트럭트의 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치하고 제 2 항원 결합 도메인은 다중특이적 컨스트럭트의 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
80. 제 1 내지 제 79 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 결합 도메인, 또는 항원 결합 도메인들의 독립적으로 각각은 TAA의 자연의 동족 결합 파트너의 세포외 도메인 또는 이의 결합 단편, 또는 TAA에 대한 결합 활성을 나타내는 그의 변이체를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
81. 제 1 내지 제 79 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 결합 도메인, 또는 항원 결합 도메인들 각각은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체, 및 단일 도메인 경쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
82. 제 81 구현예에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fv, scFv, Fab, 단일 도메인 항체(sdAb), VNAR, 또는 VHH인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
83. 제 81 구현예 또는 제 82 구현예에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 sdAb인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
84. 제 83 구현예에 있어서, sdAb는 인간 또는 인간화 sdAb인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
85. 제 83 구현예 또는 제 84 구현예에 있어서, sdAb는 VHH, VNAR, 조작된 VH 도메인 또는 조작된 VK 도메인인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
86. 제 81 구현예 또는 제 82 구현예에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 scFv인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
87. 제 81 구현예 또는 제 82 구현예에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fab인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
88. 제 87 구현예에 있어서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는:
(i) 이종이량체 Fc 영역의 제 1 Fc 폴리펩티드, 링커 및 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 VH 도메인을 포함하는 제 1 폴리펩티드;
(ii) 이종이량체 Fc 영역의 제 2 Fc 폴리펩티드, 링커 및 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 VL 도메인을 포함하느 제 2 폴리펩티드, 및
(iii) 종양-관련 항원에 결합하는 Fab 항체 단편의 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL을 포함하는 제 3 폴리펩티드를 포함하고,
여기서 제 1 및/또는 제 2 폴리펩티드는 Fab 항체 단편의 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL 중 나머지 다른 하나를 더 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
89. 제 88 구현예에 있어서, 제 1 또는 제 2 폴리펩티드 중 단 하나만 Fab 항체 단편의 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL 중 나머지 다른 하나를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
90. 제 89 구현예에 있어서, 제 1 또는 제 2 폴리펩티드 둘 다는 Fab 항체 단편의 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL 중의 다른 하나를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
91. 제 89 구현예 또는 제 90 구현예에 있어서, Fab 항체 단편의 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL 중 다른 하나는 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치하고/하거나 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 제 1 또는 제 2 폴리펩티드 중의 하나의 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
92. 제 89 내지 제 91 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, Fab 항체 단편의 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL 중의 다른 하나는 제 1 폴리펩티드 또는 제 2 폴리펩티드의 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단 및 제 1 또는 제 2 폴리펩티드 중의 다른 하나의 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
93. 제 1 내지 제 92 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인들의 독립적으로 각각은 1-92-LFA-3, 5T4, 알파-4 인테그린, 알파-V 인테그린, 알파4베타1 인테그린, 알파4베타7 인테그린, AGR2, 항-루이스-Y, 아펠린 J 수용체, APRIL, B7-H3, B7-H4, BAFF, BTLA, C5 보체, C-242, CA9, CA19-9, (루이스 a), 탄산무수화효소 9, CD2, CD3, CD6, CD9, CD11a, CD19, CD20, CD22, CD24, CD25, CD27, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD41, CD44, CD44v6, CD47, CD51, CD52, CD56, CD64, CD70, CD71, CD74, CD80, CD81, CD86, CD95, CD117, CD123, CD125, CD132, (IL-2RG), CD133, CD137, CD138, CD166, CD172A, CD248, CDH6, CEACAM5(CEA), CEACAM6(NCA-90), CLAUDIN-3, CLAUDIN-4, cMet, 콜라겐, 크립토(Cripto), CSFR, CSFR-1, CTLA-4, CTGF, CXCL10, CXCL13, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CYR61, DL44, DLK1, DLL3, DLL4, DPP-4, DSG1, EDA, EDB, EGFR, EGFRviii, 엔도텔린 B 수용체(ETBR), ENPP3, EpCAM, EPHA2, EPHB2, ERBB3, RSV의 단백질 F, FAP, FGF-2, FGF8, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FLT-3, 엽산 수용체 알파(FRα), GAL3ST1, G-CSF, G-CSFR, GD2, GITR, GLUT1, GLUT4, GM-CSF, GM-CSFR, GP IIb/IIIa 수용체, Gp130, GPIIB/IIIA, GPNMB, GRP78, HER2/neu, HER3, HER4, HGF, hGH, HVEM, 히알루로니다아제, ICOS, IFN알파, IFN베타, IFN감마, IgE, IgE 수용체(FceRI), IGF, IGF1R, IL1B, IL1R, IL2, IL11, IL12, IL12p40, IL-12R, IL-12R베타1, IL13, IL13R, IL15, IL17, IL18, IL21, IL23, IL23R, IL27/IL27R(wsx1), IL29, IL-31R, IL31/IL31R, IL2R, IL4, IL4R, IL6, IL6R, 인슐린 수용체, 재기드 리간드(Jagged Ligands), 재기드 1, 재기드 2, KISS1-R, LAG-3, LIF-R, 루이스 X, LIGHT, LRP4, LRRC26, Ly6G6D, LyPD1, MCSP, 메소텔린, MRP4, MUC1, 뮤신-16(MUC16, CA-125), Na/K ATPase, NGF, 니카스트린, 노치(Notch) 수용체, 노치 1, 노치 2, 노치 3, 노치 4, NOV, OSM-R, OX-40, PAR2, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGFR알파, PDGFR베타, PD-1, PD-L1, PD-L2, 포스파티딜-세린, P1GF, PSCA, PSMA, PSGR, RAAG12, RAGE, SLC44A4, 스핑고신 1 포스페이트, STEAP1, STEAP2, TAG-72, TAPA1, TEM-8, TGF베타, TIGIT, TIM-3, TLR2, TLR4, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TMEM31, TNF알파, TNFR, TNFRS12A, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체, TRK-A, TRK-B, uPAR, VAP1, VCAM-1, VEGF, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, VISTA, WISP-1, WISP-2, 및 WISP-3 중에서 선택된 종양 항원에 결합하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
94. 제 1 내지 제 93 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 다중특이적 항원 결합 도메인은 적어도 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인은 동일한 TAA에 결합하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
95. 제 94 구현예에 있어서, 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인은 동일한 TAA의 상이한 에피토프에 결합하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
96. 제 94 구현예에 있어서, 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인은 동일한 TAA의 동일한 에피토프에 결합하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
97. 제 1 내지 제 96 구현예에 있어서, 다중특이적 항원 결합 도메인은 적어도 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인을 포함하고 여기서, 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인은 상이한 TAA에 결합하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
98. 제 5 내지 제 97 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 제 1 항원 결합 도메인과 Fc 영역 사이에 제 1 연결 펩티드(LP1)를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
99. 제 5 내지 제 98 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 CD3 결합 영역과 제 2 항원 결합 도메인 사이에 제 2 연결 펩티드(LP2)를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
100. 제 5 내지 제 99 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 제 1 항원 결합 도메인과 Fc 영역 사이에 제 1 연결 펩티드(LP1) 및 CD3 결합 영역과 제 2 항원 결합 도메인 사이에 제 2 연결 펩티드(LP2)를 포함하고, 여기서 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 다음과 같이 구조적 배열을 갖는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트:
제 1 항원 결합 도메인 - LP1 - Fc 영역 - 링커 - CD3 결합 영역 - LP2 - 제 2 항원 결합 도메인.
101. 제 100 구현예에 있어서, 2개의 연결 펩티드는 서로 동일한, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
102. 제 100 구현예에 있어서, 2개의 연결 펩티드는 서로 동일하지 않은, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
103. 제 98 내지 제 102 구현예에 있어서, LP1 또는 LP2는 독립적으로 약 1개 내지 20개의 아미노산 길이의 펩티드인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
104. 제 103 구현예에 있어서, LP1 또는 LP2는 독립적으로 서열번호 10-13, 119, 135, 147, 149에 기재된 임의의 Gly-Ser 링커 또는 GGS이거나 이를 포함하는 펩티드를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드.
105. 제 41 내지 제 104 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편은 Fv 항체 단편인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
106. 제 105 구현예에 있어서, Fv 항체 단편은 이황화 안정화 항-CD3 결합 Fv 단편(dsFv)을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
107. 제 41 내지 제 106 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서,
항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편은 아미노산 서열 TYAMN (서열번호: 16) 또는 서열번호 211을 포함하는 VH CDR1; 아미노산 서열 RIRSKYNNYATYYADSVKD (서열번호 17) 또는 서열번호 212를 포함하는 VH CDR2; 아미노산 서열 HGNFGNSYVSWFAY (서열번호 18)를 포함하는 VH CDR3, 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN (서열번호 19)을 포함하는 VL CDR1; 아미노산 서열 GTNKRAP (서열번호 20)를 포함하는 VL CDR2; 및 아미노산 서열 ALWYSNLWV (서열번호 21)를 포함하는 VL CDR3을 포함하거나, 또는
항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편은, 적어도 아미노산 서열 GFTFNTYAMN(서열번호　211)을 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 RIRSKYNNYATy(서열번호　212)을 포함하는 VH CDR2 서열; 적어도 아미노산 서열 HGNFGNSYVSWFAy(서열번호　18)을 포함하는 VH CDR3 서열, 적어도 아미노산 서열 GSSTGAVTTSNYAN(서열번호　229)을 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호　230)을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 적어도 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호　225)을 포함하는 VL CDR3 서열을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
108. 제 106 구현예 또는 제 107 구현예에 있어서, 항-CD3 dsFv는:
서열번호 14 및 32-62 중의 임의의 아미노산 서열 또는 서열번호 14 및 32-62 중의 임의의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 갖는 VH; 및
서열번호 15 및 63-81 중 임의의 아미노산 서열 또는 서열번호 14 및 32-62 중 임의의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 갖는 VL;을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
109. 제 106 내지 제 108 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 항-CD3 dsFv는 서열번호 14의 아미노산 서열 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
110. 제 102 내지 제 104 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 항-CD3 dsFv는 서열번호 44의 아미노산 서열 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
111. 제 1 내지 제 109 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 제제에 콘쥬게이트되는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
112. 제 111 구현예에 있어서, 제제는 치료제, 항종양제(antineoplastic agent), 독소 또는 이의 단편, 검출가능한 모이어티 또는 진단제인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
113. 제 112 구현예에 있어서, 제제는 링커를 통해 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트에 콘쥬게이트되는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
114. 제 1 내지 제 113 구현예 중 어느 한 구현예의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들).
115. 제 1 내지 제 113 구현예 중 어느 한 구현예의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 중 임의의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
116. 제 1 내지 제 115 구현예 중 어느 한 구현예의 다중특이적 컨스트럭트의 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 제 1 핵산 서열 및 상기 다중특이적 컨스트럭트의 제 2 폴리펩티드를 코딩하는 제 2 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서 제 1 및 제 2 핵산 서열은 내부 리보솜 도입 부위(IRES), 또는 자가-절단가능한 펩티드 또는 리보솜 스킵핑(skipping)을 초래하는 펩티드를 코딩하는 핵산에 의해 분리되는, 폴리뉴클레오티드.
117. 제 116 구현예에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 제 2 핵산 서열은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
118. 제 116 구현예 또는 제 117 구현예에 있어서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 제 3 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 다중특이적 컨스트럭트의 제 3 폴리펩티드를 코딩하는 제 3 핵산을 더 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
119. 제 118 구현예에 있어서, 제 3 핵산은 내부 리보솜 도입 부위(IRES), 또는 자가-절단 펩티드 또는 리보솜 스킵핑(skipping)을 초래하는 펩티드를 코딩하는 핵산에 의해 제 1 및/또는 제 2 폴리펩티드로부터 분리되고/되거나 제 3 핵산 서열은 제 1 및/또는 제 2 핵산 서열과 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
120. 제 116 내지 제 119 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 자가-절단 펩티드 또는 리보솜 스킵핑(skipping)을 초래하는 펩티드를 코딩하는 핵산은 T2A, P2A, E2A 또는 F2A로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드.
121. 제 114 내지 제 120 구현예 중 어느 한 구현예의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
122. 제 121 구현예에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
123. 제 121 또는 122 구현예에 있어서, 바이러스 벡터 또는 진핵생물 벡터이며, 선택적으로 진핵생물 벡터는 포유동물 벡터인, 벡터.
124. 제 114 내지 제 120 구현예 중 어느 한 구현예의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들, 또는 제 121 내지 제 123 구현예 중 어느 한 구현예의 벡터 또는 벡터들을 포함하는 세포.
125. 제 124 구현예에 있어서, 세포는 재조합 또는 분리된 것인, 세포.
126. 제 125 구현예에 있어서, 세포는 포유동물 세포인, 세포.
127. 제 126 구현예에 있어서, 세포는 HEK293 또는 CHO 세포인, 세포.
128. 제 114 내지 제 120 구현예 중 어느 한 구현예의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들 또는 제 121 내지 제 123 구현예의 중 어느 한 구현예의 벡터 또는 벡터들을 세포에 도입하는 단계 및 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 제조하기 위한 조건 하에 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 제조하는 방법.
129. 제 124 내지 제 127 구현예 중 어느 한 구현예의 세포를 다중특이적 폴리펩티드가 상기 세포에 의해 생산되는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 제조하는 방법.
130. 제 128 또는 제 129 구현예에 있어서, 세포는 포유동물 세포인, 세포.
131. 제 130 구현예에 있어서, 세포는 HEK293 또는 CHO 세포인, 세포.
132. 제 128 구현예 또는 제 129 구현예에 있어서, 세포로부터 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 분리 또는 정제하는 단계를 더 포함하는, 방법.
133. 제 128 내지 제 132 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 이종이량체인, 방법.
134. 제 128 내지 제 133 구현예 중 어느 한 구현예의 방법에 의해 제조되는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
135. 제 1 내지 제 113 구현예 또는 제 134 구현예 중 어느 한 구현예의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
136. 제 135 구현예에 있어서, 멸균된 약학 조성물.
137. 표적 세포와 T 세포를 제 1 내지 제 113 구현예 또는 제 134 구현예 중 어느 한 구현예의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 또는 제 109 구현예 또는 제 110 구현예의 약학 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 면역 반응을 자극 또는 유도하는 방법으로, 상기 표적 세포는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트에 의해 인식되는 종양 관련 항원을 발현하는, 면역 반응을 자극 또는 유도하는 방법.
138. 제 137 구현예에 있어서, 표적 세포는 종양 관련 항원(TAA)을 발현하는 종양 세포인, 방법.
139. 제 137 구현예 또는 제 138 구현예에 있어서, 접촉은 탈체(ex vivo) 또는 생체 외(in vitro)에서 수행되는, 방법.
140. 제 137 내지 제 149 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 접촉은 대상체의 생체 내(in vivo)에서 수행되는, 방법.
141. 제 1 내지 제 113 구현예 또는 제 134 구현예 중 어느 한 구현예의 다중특이적 콘쥬게이트 또는 제 109 구현예 또는 제 110 구현예의 약학 조성물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 내에서 면역 반응을 자극 또는 유도하는 방법.
142. 제 137 내지 제 141에 있어서, 세포-매개 면역을 증가시키는 방법.
143. 제 137 내지 제 142 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, T-세포 활성을 증가시키는, 방법.
144. 제 137 내지 제 143 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 세포 용해성 T-세포(CTL) 활성을 증가시키는, 방법.
145. 제 137 내지 제 144 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 면역 반응은 종양 또는 암에 대해 증가하는, 방법.
146. 제 137 내지 제 145 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 방법은 대상체의 질병 또는 질환을 치료하는, 방법.
147. 제 1 내지 제 113 구현예 중 어느 한 구현예의 다중특이적 콘쥬게이트 또는 제 135 구현예 또는 제 136 구현예의 약학 조성물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 질병 또는 질환을 치료하는 방법.
148. 제 146 구현예 또는 제 147 구현예에 있어서, 질병 또는 질환은 종양 또는 암인, 방법.
149. 제 140-148 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
Ⅵ. 실시예
다음의 실시예는 단지 예시적 목적으로 포함되며 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
실시예 1 : 제한된 CD3 결합을 갖는 다중특이적 컨스트럭트를 생산하는 방법
실시예 1은 제한 CD3 결합을 나타내는 CD3 결합 영역을 함유하는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 제조 및 발현을 기술한다. 다중특이적 컨스트럭트는 도 1, 도 2a 내지 2b, 도 3a 내지 3c 및 도 4a-4b에 나타난 바와 같이, CD3 결합 영역에 링커 (예를 들어 비-절단성 링커)에 의해 결합된 면역글로불린의 이종이량체 Fc 영역, 및 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단 및/또는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 CD3 결합 영역에 대해 카르복시-말단에 위치한 종양 관련 항원 (TAA)에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 함유하는 다양한 구성으로 제작되었다.
A. 컨스트럭트의 설계 및 생성
이종이량체 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 적어도 제 1 폴리펩티드 사슬 및 제 2 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제조되고 발현을 위한 플라스미드로 클로닝되었다. 제 1 폴리펩티드 사슬은 일반적으로 N-말단부터 C-말단까지 순서대로: 제 1 Fc 폴리펩티드(예를 들어 Fc 홀 폴리펩티드); 비-절단성 링커; 및 항-CD3 항체의 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함한다. 제 2 폴리펩티드 사슬은 일반적으로, N-말단부터 C-말단까지 순서대로 제 2Fc 폴리펩티드(예를 들어 Fc 노브(knob) 폴리펩티드); 제 1 폴리펩티드 사슬과 동일한 비-절단성 링커; 및 항-CD3 항체의 가변 중쇄(VH) 도메인을 포함한다. 항-CD3 항체는 이황화-안정화된(dsFv)항체(돌연변이체 G44C 및 VF와 함께 돌연변이체 G44C 및 VF를 갖는 항-CD3 VH)를 포함하거나, 또는 표 El.l 및 표 E1.2에 기재된 바와 같이 비-이황화-안정화된 Fv 항체를 함유하였다. 폴리펩티드 사슬의 이종이량체화를 촉진시키는 다양한 예시적 Fc 폴리펩티드 쌍은 표 El.l 및 표 E1.2에 제시된 바와 같이 사용되었다. 다양한 구성에서, 상기 폴리펩티드 사슬 중의 하나 또는 둘 다는 상기 Fc 도메인에 대한 아미노 말단에서 및/도는 상기 CD3 결합 영역에 대한 카복시 말단에서 하나 이상의 TAA 항원 결합 도메인을 추가로 코딩하였다. 유사한 컨스트럭트가 다른 이종이량체 Fc 구성을 사용하여 생성될 수 있는데, 예를 들어 기술된 바와 같은 다른 노브-투-홀 구조; dsFv 또는 다른 1가 단편을 포함하는 다른 항-CD3 항체를 포함하는 다른 CD3-결합 영역; 또는 scFv, sdAb 또는 Fab 포맷과 같은 다른 TAA 항원-결합 단편이 사용될 수도 있다.
유사한 컨스트럭트 중에서, 비-절단성 링커는 3-18개 범위의 아미노산 크기의 링커를 포함하였다. 예시의 제조된 분자에 사용된 비-절단성 링커의 예는 GGS(예를 들어, 예시적인 컨스트럭트 cx1356에 포함됨), GGSGGS(서열번호 10, 예시적인 컨스트럭트 cx1357에 포함됨), GGSGGSGGS(서열번호 11, 예시적인 컨스트럭트 cx1358에 포함됨), GGSGGSGGSGGS(서열번호 12, 예시적인 컨스트럭트 cx1359에 포함됨), GGSGGSGGSGGSGGS(서열번호 13, 예시적인 컨스트럭트 cx1360에 포함됨), 및 GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119, 예시적인 컨스트럭트 cx5823 및 cx5952에 포함됨) 또는 GGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 147, 예시적인 컨스트럭트 cx681에 포함됨)였다.
TAA에 결합하는 임의의 항원 결합 도메인이 상기 제공된 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트에 사용될 수 있다. 예시적인 생성된 단백질은 폴레이트 수용체 알파(FRα), B7H3(CD276), 또는 델타-유사 3(DLL3)에 결합하는 항원 결합 도메인을 함유하였다. TAA가 단일 사슬 단편, 예를 들어, sdAb 또는 scFv로 제공된 경우, TAA 항원 결합 도메인은 펩티드 링커, 예를 들어, PGGGG (서열번호 102)에 의해 Fc 이종이량체의 하나 또는 둘 다의 폴리펩티드 사슬(예를 들어, 홀 및/또는 노브)에 대한 N-말단에 연결되었고/되었거나 펩티드 링커, 예를 들어, GGGG (서열번호 103)에 의해 CD3 결합 영역의 하나 또는 둘 다의 도메인(예를 들어, VH 및/또는 VL)에 대한 C-말단에 연결되었다. 다른 유사한 펩티드 링커가 사용될 수 있다. TAA가 Fab 항원-결합 단편으로서 제공될 때, 컨스트럭트는 링커 없이 하나 또는 둘 다의 Fc 폴리펩티드에 직접 연결된 VH 및 CH1, 및 VL 및 CL로 구성된 경쇄로 구성되었다. 이들 TAA 결합 Fab는 이종이량체 Fc의 아미노- 또는 카르복시-말단에 위치할 수 있다.
각각 1가, 2가, 3가 또는 4가 결합을 제공하도록 1, 2, 3 또는 4 TAA 항원 결합 도메인을 함유하는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 생성하였다. 일부 경우에, TAA 항원 결합 도메인은 동일하였다(모노-에피토프). 일부 경우에, TAA 항원 결합 도메인은 상이하여, 생성된 다중특이적 폴리펩티드 구조체는 동일한 TAA(2-에피토프)의 상이한 에피토프 또는 동일한 TAA(모노-에피토프)의 동일한 에피토프에 대해 적어도 2개의 상이한 TAA 에 대한 특이성을 나타내었다.
생성된 단백질 중 TAA 항원 결합 도메인이 단일 도메인 항체(sdrabs)로 구성되는 컨스트럭트였다. 비-절단성 링커를 함유하는 예시적인 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 생성하였다. 이들 포함된 컨스트럭트는, 도 2b에서 도시된 바와 같이 cxl356, cxl357, cxl358, cxl359, cxl360, 및 cx68l, 표적화 FRα; 도 3a 및 3b에서 도시된 바와 같이 cx3072, cx5952, cx6079, cx6080, cx608l, cx5823, cx5873, 및 cx5965, 표적화 B7H3로; 그리고 도 4a 및 도 4b에 도시된 바와 같이 cx5352, cx5499, cx5800, 및 cx580l 표적화 DLL3로 지칭된다. 특히, dsFv 항-CD3 항체 및 sdAb의 VH 도메인이 Fc 이종이량체(예를 들어,도 3a에 도시된, cx3072 및 cx5952)의 동일한 측면(예를 들어 홀 또는 노브 측면)에 연결되어 있는 일부 컨스트럭트가 생성되었다. 컨스트럭트는 이황화 안정화된 Fv 없이 조작되거나 또는 항-CD3 항체의 VH 및 VL 도메인을 안정화시키는 이황화 결합으로 조작되었다. 생성된 예시적인 컨스트럭트 중 일부는 4-1BB 공동-자극 수용체(예를 들어 cx5823, cx5873, cx5965, cx5352, cx580l, cx5800)를 표적화하는 sdAb(각각 서열번호 221, 222 및 223에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함함)를 함유하였다. sdAb TAA 도메인을 갖는 예시적인 제한된 CD3 결합 컨스트럭트의 리스트를 하기 표 E1.1(즉, 표 2)에 나타내었다.
표 E1.1: 예시적인 제한된 CD3 관여 컨스트럭트
컨스트럭트 ID 사슬　 N-말단 sdAb (표적) Fc 링커 CD3 결합 도메인 C-말단 sdAb (표적) 이황화 안정화 여부
cx681 1 FRα sdAb1
(SEQ ID NO:120)		 IgG1-노브(서열번호 82, 86 또는 201) GGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 147) VH34(서열번호 198) FRα sdAb2
(서열번호 121)		 yes
2 FRα sdAb1
(서열번호 120)		 IgG1-홀(서열번호 83, 87 또는 202) GGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 147) VL21(서열번호 200) FRα sdAb2
(서열번호 121)
cx1356 1 FRα sdAb1
(서열번호 120)		 IgG1-노브(서열번호 82, 86 또는 201) GGS VH34(서열번호 198) FRα sdAb2
(서열번호 121)		 yes
2 FRα sdAb1
(서열번호 120)		 IgG1-홀(서열번호 83, 87 또는 202) GGS VL21(서열번호 200) FRα sdAb2
(서열번호 121)
cx1357 1 FRα sdAb1
(서열번호 120)		 IgG1-노브(서열번호 82, 86 또는 201) GGSGGS(서열번호 10) VH34(서열번호 198) FRα sdAb2
(서열번호 121)		 yes
2 FRα sdAb1
(서열번호 120)		 IgG1-홀(서열번호 83, 87 또는 202) GGSGGS(서열번호 10) VL21(서열번호 200) FRα sdAb2
(서열번호 121)
cx1358 1 FRα sdAb1
(서열번호 120)		 IgG1-노브(서열번호 82, 86 또는 201) GGSGGSGGS(서열번호 11) VH34(서열번호 198) FRα sdAb2
(서열번호 121)		 yes
2 FRα sdAb1
(서열번호 120)		 IgG1-홀(서열번호 83, 87 또는 202) GGSGGSGGS(서열번호 11) VL21(서열번호 200) FRα sdAb2
(서열번호 121)
cx1359 1 FRα sdAb1
(서열번호 120)		 IgG1-노브(서열번호 82, 86 또는 201) GGSGGSGGSGGS(서열번호 12) VH34(서열번호 198) FRα sdAb2
(서열번호 121)		 yes
2 FRα sdAb1
(서열번호 120)		 IgG1-홀(서열번호 83, 87 또는 202) GGSGGSGGSGGS(서열번호 12) VL21(서열번호 200) FRα sdAb2
(서열번호 121)
cx1360 1 FRα sdAb1
(서열번호 120)		 IgG1-노브(서열번호 82, 86 또는 201) GGSGGSGGSGGSGGS(서열번호 13) VH34(서열번호 198) FRα sdAb2
(서열번호 121)		 yes
2 FRα sdAb1
(서열번호 120)		 IgG1-홀(서열번호 83, 87 또는 202) GGSGGSGGSGGSGGS(서열번호 13) VL21(서열번호 200) FRα sdAb2
(서열번호 121)
cx5823 1 B7H3 sdAb 4
(서열번호 214)		 xELL-노브(서열번호 88) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VH13(서열번호 44) B7H3 sdAb 5
(서열번호 216)		 yes
2 None xELL-홀(서열번호 93) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VL10(서열번호 72) Co-stim 수용체 sdAb
cx5952 1 B7H3 sdAb 4
(서열번호 214)		 xELL-노브(서열번호 88) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VH13(서열번호 44) B7H3 sdAb 5
(서열번호 216)		 yes
2 None xELL-홀(서열번호 93) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VL10(서열번호 72) None
cx6079 1 B7H3 sdAb 4
(서열번호 214)		 Fc-Het-1(서열번호 194) GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 170) VH32(서열번호 196) None no
2 B7H3 sdAb 4
(서열번호 214)		 Fc-Het-2(서열번호 195) GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 170) VL20(서열번호 199) None
cx6080 1 B7H3 sdAb 4
(서열번호 214)		 Fc-Het-1(서열번호 194) GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 170) VH33(서열번호 197) None yes
2 B7H3 sdAb 4
(서열번호 214)		 Fc-Het-2(서열번호 195) GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 170) VL21(서열번호 200) None
cx6081 1 B7H3 sdAb 4
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2 B7H3 sdAb 4
(서열번호 214)		 Fc-Het-2(서열번호 195) GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 170) VL10(서열번호 72) None
cx5841 1 B7H3 sdAb 4
(서열번호 214)		 xELL-노브(서열번호 84, 88 또는 203) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VH13(서열번호 44) B7H3 sdAb 3
(서열번호 217)		 yes
2 None xELL-홀(서열번호 91, 93 또는 206) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VL10(서열번호 72) Co-stim 수용체 sdAb
cx5187 1 B7H3 sdAb 4
(서열번호 214)		 xELL-노브(서열번호 84, 88 또는 203) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VH13(서열번호 44) B7H3 sdAb 3
(서열번호 217)		 yes
2 None xELL-홀(서열번호 91, 93 또는 206) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VL10(서열번호 72) Co-stim 수용체 sdAb
cx5499 1 DLL3 sdAb1
(서열번호 219)		 xELL-노브(서열번호 84, 88 또는 203) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VH13(서열번호 44) DLL3 sdAb 2
(서열번호 220)		 yes
2 None xELL-홀(서열번호 91, 93 또는 206) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VL10(서열번호 72) None
cx3072 1 B7H3 sdAb 2
(서열번호 215)		 IgG1-노브(서열번호 82, 86 또는 201) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VH13(서열번호 44) B7H3 sdAb 1
(서열번호 218)		 yes
2 None IgG1-노브(서열번호 83, 87 또는 202) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VL10(서열번호 72) None
cx5873 1 None xELL-노브(서열번호 84, 88 또는 203) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VH13(서열번호 44) B7H3 sdAb 3
(서열번호 217)		 yes
2 None xELL-홀(서열번호 91, 93 또는 206) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VL10(서열번호 72) Co-stim 수용체 sdAb
cx5965 1 B7H3 sdAb 4
(서열번호 214)		 xELL-노브(서열번호 84, 88 또는 203) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VH13(서열번호 44) none yes
2 None xELL-홀(서열번호 91, 93 또는 206) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VL10(서열번호 72) Co-stim 수용체 sdAb
cx5352 1 DLL3 sdAb 1
(서열번호 219)		 xELL-노브(서열번호 84, 88 또는 203) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VH13(서열번호 44) DLL3 sdAb2
(서열번호 220)		 yes
2 None xELL-홀(서열번호 91, 93 또는 206) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VL10(서열번호 72) Co-stim 수용체 sdAb
cx5800 1 DLL3 sdAb 1
(서열번호 219)		 xELL-노브(서열번호 84, 88 또는 203) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VH13(서열번호 44) None yes
2 None xELL-홀(서열번호 91, 93 또는 206) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VL10(서열번호 72) Co-stim 수용체 sdAb
cx5801 1 None xELL-노브(서열번호 84, 88 또는 203) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VH13(서열번호 44) DLL3 sdAb 2
(서열번호 220)		 yes
2 None xELL-홀(서열번호 91, 93 또는 206) GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119) VL10(서열번호 72) Co-stim 수용체 sdAb
또한 예시적인 생성된 컨스트럭트는 TAA 항원 결합 도메인이 Fab(지정된 MAB 포맷)으로 구성된 컨스트럭트를 포함하였다. 이 실시예에서, 항-B7H3 Fab는 서열번호 127에 제시된 중쇄 Fd 및 서열번호 128에 제시된 경쇄로 구성된 것이 사용되었다. 폴리뉴클레오티드는 비-절단성 링커를 함유하는 예시적인 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 폴리펩티드 사슬을 코딩하도록 생성되었다. 이들은 도 3c에 도시된 바와 같이 cx5067, cx6083, 및 cx6084를 포함하였다. 컨스트럭트는 이황화 안정화된 항-CD3 항체 Fv 없이 조작되거나, 또는 항-CD3 항체(돌연변이체 G44C 및 VF와 돌연변이체 G100C를 갖는 항-CD3 VH)의 VH 및 VF 도메인을 안정화시키는 이황화 결합으로 조작되었다. 예시적인 Fab 컨스트럭트의 리스트가 하기 표 E1.2(즉, 표 3)에 제공된다.
표 E1.2: 예시적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트
컨스트럭트 ID 사슬 N-말단 도메인 Fc 링커 CD3 결합 도메인 C-말단 도메인 이황화 안정화 여부
cx5067 1 B7H3-Fab (서열번호 127, 128) Fc-Het-1(서열번호 194) GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 170) VH32(서열번호 196) None no
2 B7H3-Fab (서열번호 127, 128) Fc-Het-2(서열번호 195) GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 170) VL20(서열번호 199) None
cx6083 1 B7H3-Fab (서열번호 127, 128) Fc-Het-1(서열번호 194) GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 170) VH33(서열번호 197) None yes
2 B7H3-Fab (서열번호 127, 128) Fc-Het-2(서열번호 195) GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 170) VL21(서열번호 200) None
cx6084 1 B7H3-Fab (서열번호 127, 128) Fc-Het-1(서열번호 194) GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 170) VH13(서열번호 44) None yes
2 B7H3-Fab (서열번호 127, 128) Fc-Het-2(서열번호 195) GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 170) VL10(서열번호 72) None
B. 생성된 컨스트럭트의 발현 및 정제
이종이량체 제한 CD3 결합 단백질의 각 사슬을 코딩하는 개별적인 플라스미드를 폴리에틸렌이민을 이용하여 포유동물 세포(HEK293 또는 CHO)에 등 몰비로 일시적으로 형질감염시켰다. 상층액에 분비된 재조합 단백질을 수집하고 3-14일 후, 단백질 A 크로마토그래피로 정제하여 예비의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 또는 플로우-스루 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 중 하나를 수행하였다. 일부 경우에, 이종이량체 단백질은 단백질 A에 결합하지 않도록 위치 I253R 또는 H435R(예를 들어 홀-Fc)에서 이종이량체 Fc의 하나의 사슬에 설계된 돌연변이체로 인하여 정제도중 풍부화(enrich)되었고 따라서 I253R 또는 H435R의 단독이량체는 정제되지 않았다. SEC(Superdex-200 수지를 갖는 AKTA) 또는 FT-HIC(부틸/페닐 세파로오스를 갖는 AKTA)에 의한 제 2 크로마토그래피 단계가 보다 소수성이고 예상 분자량의 2배인 2개의 이종이량체 Fc를 함유하는 바람직하지 않은 교차-쌍으로된 종을 제거하기 위해 사용되었다.
방법은 Fc 이종이량체 Fc와 이황화 안정화 항-CD3 Fv(예를 들어 이황화 안정화된 항-CD3 Fv)의 적절하게 짝 지어진 종을 함유하는 이종이량체 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 생산을 선호하였다. 정제된 이종이량체 제한 CD3 결합 단백질은 안정하였고 4℃ 또는 증가된 단백질 농도에서 연장된 배양 시 교차-쌍의 종을 축적하지 않았다.
실시예 2 : 유세포 측정법에 의해 암세포 및 1차 T 세포에 대한 제한된 CD3 결합 컨스트럭트의 결합의 평가
본 실시예는 T 세포 또는 암 세포에 대한 예시적인 컨스트럭트의 결합을 평가하는 연구를 기술한다. 이들 연구는 T 세포만을 함유하는 단일 배양물 또는 서로 분리하여 암세포만을 함유하는 단일 배양물에서 수행하였다.
A. FR-알파 결합
1차 T 세포의 표면에서 폴레이트 수용체 알파(FRα)내지 CD3 에 대해 유도된 항원-결합 도메인을 함유하는 본 발명의 예시적인 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 결합 및 FRα 발현 세포(Ovcar-5)를 유세포 측정법에 의해 평가하였다. 시험된 컨스트럭트의 종양 항원 결합 도메인은 1차 T 세포에서 발현되지 않는 폴레이트 수용체 알파(FRα)에 결합한다. cxl356 중의 3개의 아미노산의 비-절단성 링커 또는 cx68l 중의 18개의 아미노산의 비절단성 링커를 함유하는 cxl356 및 cx68l을 포함하였다(도 2b 및 표 E1.1 참조).
도 5a 및 도 5b에 기술된 연구를 위해, 각 컨스트럭트, cxl356 또는 cx68l의 100 nM을 사용하여 Ovcar-5 세포 또는 1차 T-세포에 대한 결합에 대해 평가하였다. 항-CD3 항체가 대조군으로서 포함되었다. FRα 발현 세포(Ovcar-5; 도 5c) 또는 단리된 1차 T-세포(FRα 음성; 도 5d) 상의 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 적정을 수행하여 결합을 평가하였다. 형광단-콘쥬게이트된 항-인간 IgG Fc 2차 항체를 사용하여 결합 컨스트럭트를 검출하였다.
Fc와 CD3 결합 도메인의 구성요소 사이에 다양한 링커를 갖는 시험된 FRα-표적화 컨스트럭트는 FRα 발현 세포(Ovcar-5)(도 5a 및 5c)에 결합하는 것으로 밝혀졌으나, T-세포에 결합하는 능력이 부족하다(도 5b 및 5d). 이러한 결과는 단리 중 T 세포 상의 CD3에 대한 결합이 제공된 포맷에서 제한된다는 발견과 일치한다.
B. B7H3 결합
B7H3에 대해 유도된 항원-결합 도메인을 함유하는 예시적인 다중특이적 컨스트럭트의 결합은 B7H3 양성 A375 종양 세포 또는 1 차 T-세포에 대한 결합에 대해 평가되었다. 상기 컨스트럭트는 sdAbs 또는 FABs이고, Fc에 대한 N-말단에만 또는 Fc에 대한 N-말단 및 항-CD3 결합 도메인에 대한 C-말단 둘 다에 위치되는 항원-결합 도메인(들)을 함유하는 것이 생성되었다(도 3a 및 3c 및 표 E1.1 참조). 시험된 컨스트럭트의 다양한 포맷 중에서, sdAb-Fc-dsFV-sdAb(cx3072, cx5952)sdAb-Fc-FV(cx6079), sdAb-Fc-dsFV(cs6080,cx608l), MAB-FV(cx5067) 및 MAB-dsFV(cx6083,cx6084)를 포함하였으되, 여기서 FV는 VH 및 VL 도메인 쌍으로 이루어진 항-CD3 결합 도메인을 나타내고, "ds"는 조작된 인터도메인 이황화 결합을 통해 안정화된 이황화물을 나타낸다.
도 6a 내지 6f는 이들 컨스트럭트가 B7H3에 결합할 수 있지만 단리된 T-세포에는 결합되지 않음을 나타낸다. 결합은 형광단-콘쥬게이트된 항-인간 Fc 2차 항체를 사용하여 유세포 분석법을 통해 전술한 바와 같이 평가하였다. cx3072는 높은 친화도(도 6a)를 갖는 A375 세포에는 결합하지만 단리된 T-세포에는 결합되지 않는다(도 6b). 시험된 sdAb-Fc-dsFV-sdAb(cx5952)는 MAB-FV(Cx5067) 및 MAB-dsFV 컨스트럭트(cx6083, cx6084)를 함유하는 FAB와 비교하여 더 높은 결합 친화도를 나타내었다(도 6c). B7H3-표적화 sdrab 함유 컨스트럭트(cx5952, cx6079, cx6080, 및 cx608l)는 유사한 친화력을 갖는 B7H3 양성 세포(도 6e에 도시됨)에 결합되고, cx5952는 더 높은 최대 결합을 나타낸다. cx6079, cx6080 및 cx608l은 2개의 동일한 B7H3-표적화 sdAb를 포함하는 반면, cx5952 및 cx3072는 상이한 에피토프에 결합하는 2개의 별개의 B7H3-표적화 sdAb를 함유한다. MAB-FV, cx5067은 2개의 동일한 B7H3-표적화 FAB 도메인을 함유한다. 특히 예시적인 B7H3-표적화된 제한된 CD3 관여 컨스트럭트는 도 6b, 6d 및 6f에 도시된 바와 같이 단리된 1차 인간 T-세포를 결합하지 않았다. 이들 결과는 단리시 T 세포 상의 CD3에 대한 결합이 제공된 포맷으로 제한된다는 것을 추가로 뒷받침한다.
실시예 3 : 항원-발현 표적 세포를 갖는 공-배양물에서 CD3 신호전달 활성의 평가 및 활성에 대한 링커 길이의 영향
T-세포 활성화 능력(T-cell activating capacity)에 대한 CD3 결합 영역을 포함하는 구성요소 도메인(VH 및 VL)과 Fc 사이의 다양한 길이 링커의 효과는 Jurkat 리포터 분석을 이용하여 시험하였다. CD3 리포터 세포는 자연적으로 CD3 을 발현하고 NFAT-구동 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하도록 조작되는 Jurkat 세포로부터 개발되었다. CD3의 효능은 NFAT 신호전달 및 녹색 형광의 생성을 초래한다.
항원 표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트를 표적 세포 및 Jurkat CD3 리포터 세포의 공-배양물 상에서 적정하였다. 이 분석에서, 표적 세포는 IGROV1(FRα 양성) 또는 NCI-460(FRα 음성)을 포함하였다. 표적 세포를 발현하는 부착성 항원을 이용하는 리포터 분석을 위해, 표적 세포를 접종하고, 균일한 분배를 위해 실온에서 정치시켰으며, 37℃에서 수 시간동안 인큐베이션하여 리포터 세포 및 항원 표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트를 첨가하기 전에 부착시켰다. 분석 플레이트를 IncuCyte ZOOM 시스템을 사용하여 직렬로 이미지화하고, CD3 리포터 세포 활성화는 웰 중의 총 통합된 녹색 물체로서 GFP 발현을 측정함으로써 결정하였다.
표 E3(즉, 표 4)에 수록된 다양한 길이의 GlySer-계 링커를 함유하는 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된, FRα-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트를 이들 분석에서 사용하였다.
Figure pct00008
도 7a-7f에 나타난 바와 같이, 형광 강도에 의해서 결정되는 T-세포 활성화 능력은 FRα-항원 발현 표적 세포를 갖는 공-배양물에 의존하였다. 링커의 길이와 T-세포 활성화 능력은 양의 상관관계를 가졌다. T-세포 활성화 능력은 링커 길이와 직접적으로 관련이 있는 것으로 나타났으며, 더 짧은 링커는 CD3 결합을 더 크게 제한한다는 것을 나타냈다(도 7a, 7c 및 7e 참조). 중요하게는, 이들 컨스트럭트가 상기 실시예 2에 나타난 바와 같이 분리된 상태 (예를 들어, 표적 TAA에 결합되지 않은 경우 용액 형태)에서 T-세포 결합 능력을 나타내지 않았기 때문에, 컨스트럭트의 T-세포 관여는 TAA-결합에 의존적이다. 추가로, FRα 음성 세포를 갖는 공-배양물에서 관찰가능한 형광은 관측되지 않았다(도 7b, 7d 및 7e). 종합해서, 이들 컨스트럭트는 CD3에 대한 제한되거나 또는 실질적으로 감소된 결합을 나타내었지만, 표적 의존 방식으로 T-세포를 활성화시킬 수 있었다.
실시예 4 : B7H3-표적화된 제한된 CD3 결합 구조물의 T 세포 활성화 활성의 평가
종양-관련 항원-결합 도메인으로서 B7H3-표적화된 sdAb 또는 Fab를 함유하는 컨스트럭트를 T 세포 리포터 분석에서 및 T 세포 독성 분석에서 T-세포 활성화 활성에 대해 평가하였다. 항-B7H3 sdAb(예를 들어 cx5823, cx6079, cx6080, cs608l, cx3072 및 cx5952)인 B7H3-표적화된 제한된 CD3 관여 컨스트럭트 또는 항원-결합 도메인(들)으로서 Fab(예를 들어 cx5067, cx6083 또는 cx6084)로 포맷된 항-B7H3 MAB 컨스트럭트의 활성이 평가되었다(도 3a 내지 3c 및 표 E1.1 참조). Cx5067 및 cx6079를 제외한 모든 시험된 컨스트럭트는 VL G100C와 쌍을 이룬 항-CD3 VH G44C의 변형에 의해 생성된 이황화-안정화된 항-CD3 Fv(dsFv)를 함유하였다. MAB-Fv로 명명된 cx5067의 항-CD3 Fv는 이황화-안정화되지 않았다.
A. T 세포 리퍼터 활성
실시예 3에 기재된 NFAT-GFP CD3 Jurkat 리포터(Reporter)를 사용하여 B7H3-양성 세포(A375) 또는 B7H3 발현이 자연적으로 결여된 비-표적 CCRF-CEM 세포의 존재하에 동시-배양될 때 B7H3-표적화된 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 CD3 길항 특성을 비교하였다. 이 분석에서, 항-B7H3 sdAb 컨스트럭트, cx5823, cx6079, cx6080 및 cx608l, 또는 항-B7H3 Fabs 컨스트럭트, cx5067, cx6083 및 cx6084를 B7H3-표적화 도메인으로 사용하였다. 도 8a에 도시된 바와 같이, B7H3-표적화된 sdAb를 함유하는 컨스트럭트는 항원-의존성 CD3 활성화의 유사한 효능을 나타내었다. 도 8c에 도시된 바와 같이, B7H3-표적화된 sdAb를 함유하는 예시적인 cx5823 컨스트럭트는 B7H3-표적화 Fabs를 함유하는 컨스트럭트에 비해 항원-의존성 CD3 활성화를 매개하는데 우수한 것으로 밝혀졌다. cx5823이 공-자극 수용체에 대한 결합 도메인으로 포맷팅되지만, Jurkat T 세포가 공-자극 수용체를 발현하지 않기 때문에, 상기 성분은 결과의 차이에 기여하지 않을 것 같다. 컨스트럭트 중의 어느 것도 B7H3-음성 CCRF-CEM 세포에 대한 활성을 나타내지 않았다(도 8b 및 8d).
B. 세포 독성
cx3072 및 cx5952(각각 sdAb-dsFv로서 포맷됨), cx6083 및 cx6084(MAB-dsFv), Cx5067(MAB-Fv), cx6079(sdAb-Fv), 및 cx6080 및 cx6081(sdAb-dsFv)을 T-세포-매개된 세포독성 분석에서 시험하였다. 표적 세포는 B7H3 양성 세포주, A375, 및 변형된 A375 세포[여기서, B7H3 유전자는 CRISPR(A375:B7H3 KD)에 의해 붕괴된다], 또는 B7H3 발현이 자연적으로 결핍된 CCRF-CEM 세포 중의 어느 하나를 포함하였다. 표적 세포는 웰 당 1.0x104 개의 세포로 접종시켰고, 균일한 분배를 위해서 실온에서 정치시켰으며 37℃에서 수시간동안 인큐베이션하였다. 1차 T 세포는 건강한 인간 공여자 백반(human donor leukopak)으로부터 분리된 PBMC로부터 음으로 풍부화되었으며, 10:1의 T 세포-대-표적 세포 비로 부가되었다. 세포사멸을 겪는 세포의 핵 DNA를 형광적으로 표지하는 녹색 카스파제-3/7 시약을 첨가하였다. 제한된 CD3 관여 활성을 갖는 다중특이적 컨스트럭트를 공-배양물 상에서 적정하고, 분석 플레이트(assay plate)를 IncuCyte ZOOM 시스템을 사용하여 직렬로 영상화하였다. 표적 세포 사멸은 총 적색/녹색 중첩 물체 영역을 측정함으로써 결정되었다.
도 9a 및 9b에 도시된 바와 같이, sdAb B7H3-표적화된 항원-결합 도메인을 함유하는 예시적인 컨스트럭트 cx3072 및 Cx5952는 B7H3 양성(A375)의 강력한 T-세포-매개 세포독성을 유도하지만 B7H3 음성 세포주를 유도하지 않았다.
Fab B7H3-표적화 도메인(cx5067,cx6083 및 cx6084)을 갖는 예시적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 인게이저(engager)와 비교할 때, 예시적인 cx5952 sdAb B7H3-표적화 제한된 CD3 인게이저는 증강된 표적-의존성 T-세포 세포 독성을 매개하였다(도 10a). 항원-의존성 T-세포 활성화를 강력하게 유도하는 능력과 일치하는, 시험된 컨스트럭트에 대한 B7H3 음성 세포주 CCRF-CEM에 대해 측정가능한 T 세포 독성이 관찰되지 않았다(도 10b). 시험된 컨스트럭트 중에서, 대표적인 MAB-dsFV 컨스트럭트 cx6084 및 cx6083 은 조작된 이황화물을 함유하는 반면, 대표적인 MAB-FV 컨스트럭트 cx5067은 이러한 안정화 개질이 결여되었다. 특히 cx6083 및 cx5067은 항-CD3 FV 도메인(도 3c에 도시됨) 내에서 조작된 이황화물의 존재(cx6083) 또는 부재(cx5067)를 제외하고는 동일하다. 조작된 이황화물은 VH 내의 G44C 및 VL 내의 G100C의 변형에 의해 생성되었다. 도 10a에 도시된 바와 같이, cx6083은 cx5067과 비교하여 표적-의존성 T-세포 독성을 매개하는데 우수한 효능을 나타내었으며, 이는 항-CD3 FV를 포함하는 VH 및 VL 도메인의 적절한 결합을 강화함으로써, 도메인간 이황화물의 혼입이 T-세포 매개 세포 독성에 유익함을 시사한다.
sdAb B7H3-표적화 도메인(cx6079, cx6080 및 cx608l)을 갖는 다른 예시적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 결합제와 비교할 때, 예시적인 cx5952 sdAb B7H3-표적화 제한된 CD3 인게이저는 증강된 표적-의존성 T-세포 세포 독성을 매개하였다(도 10c). 항원-의존성 T-세포 활성화를 강력하게 유도하는 능력과 일치하는, 시험된 컨스트럭트에 대한 B7H3 음성 세포주 CCRF-CEM에 대해 측정가능한 T 세포 독성이 관찰되지 않았다(도 10d). 시험된 컨스트럭트 중에서, sdAb-dsFV 컨스트럭트 cx5952, cx6080 및 cx608l은 조작된 이황화 결합을 함유하는 반면, sdAb-FV 컨스트럭트 cx6079는 이러한 안정화 변형이 결여되었다. 조작된 이황화물은 VH 내의 G44C 및 VL 내의 G100C의 변형에 의해 생성되었다. 특히 cx5952는 2개의 별개의 B7H3 표적화 도메인을 갖도록 조작되고, 하나는 아미노 말단에 위치하고 하나는 카르복시 말단에 위치하였다. cx6079, cx6080 및 cx608l은 2개의 동일한 B7H3 표적 도메인을 갖도록 조작되었으며, 이들 둘 다는 아미노 말단에 위치하였다(도 3a 참조).
C. T 세포 변조(cell modulation)
T 세포 변조를 추가로 평가하기 위해서, 예시적인 다중특이적 CD3 제한된 결합 컨스트럭트는 T 세포 활성화 마커를 조절하는 컨스트럭트의 능력을 모니터링함으로써 평가되었다. T 세포 활성화를 평가하기 위해서, 예시적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 결합 컨스트럭트, cx5952의 존재하에 B7H3 양성(A375) 또는 B7H3 음성 세포주(CCRF-CEM)를 갖는 T 세포의 배양물을 포함하는, T 세포 세포독성 분석으로부터의 현탁 세포를 수집하였다. 세포를 라이브/데드 스테인 및 형광단-콘쥬게이트된 항-CD4, 항-CD8, 항-CD25, 항-CD69, 및/또는 항-CD7l 항체로 염색하였다. SONY SA3800 스펙트럼 분석기를 사용하여 세포를 분석하고 CD25, CD69 또는 CD71의 발현 수준 또는 퍼센트 CD25-, CD69- 또는 CD71-양을 측정함으로써 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 활성화를 측정하였다.
결과는 cx5952의 존재하에 B7H3 양성(a375) 또는 B7H3 음성 세포주(CCRF-CEM)를 갖는 공-배양물에 따른 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상의 CD25 발현(도 11a), CD69 발현(도 11b) 및 CD71 발현(도 11c)에 대해 나타내었다. 결과는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 CD25, CD69 및 CD71의 증가된 발현에 의해 입증되는 바와 같이, cx5952가 CD3 결합을 통한 용량-의존성 B7H3-의존성 T-세포 활성화를 매개한다는 것을 보여주었다
sdAb B7H3-표적화 도메인(cx6079, cx6080 및 cx608l)을 갖는 다른 예시적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 컨스트럭트와 비교할 때, 예시적인 cx5952 sdAb B7H3-표적화 제한된 CD3 인게이저는 CD4+ T 세포(도 11d) 및 CD8+ T 세포(도 11h)에서 CD25의 증가된 발현에 의해서 그리고 CD4+ T 세포(도 11f) 및 CD8+ T 세포(도 11j)에서 CD71의 증가된 발현에 의해서 입증되는 바와 같이 증가된 T 세포 활성화를 매개하였다. B7H3 음성 세포주를 갖는 배양물에서 B7H3-표적화 제한된 CD3 인게이저 컨스트럭트의 존재하에 T 세포 상의 표면 마커의 증가된 발현이 관찰되지 않았다(CD4+ T 세포에 대해서는 도 11g 및 도 11g 및 CD8+ T 세포에 대해서는 도 11k).
D. T 세포 사이토카인 생성
cx5952, cx6083, cx6084 또는 cx5067의 존재하에 T 세포를 B7H3 양성, A375 또는 음성, CCRF-CEM 세포와 공-배양시키는 것을 포함하는 T 세포 세포독성 종양 세포 공동 배양 분석으로부터 상청액을 샌드위치 ELISA에 의해서 IFNγ 함량에 대해 분석하였다. 상청액 샘플의 사이토카인 농도값이 보간된(interpolated) 표준 곡선이 생성되었다. 검출 하한치 미만의 흡광도 값을 갖는 샘플을 최저 표준 농도의 절반과 동일한 사이토카인 농도를 할당하였다. 도 12a에 도시된 바와 같이, 대표적인 sdAb-Fc-dsFV-sdAb 컨스트럭트, cx5952는 활성화된 T-세포로부터 표적-의존성 사이토카인 방출을 유도하는 컨스트럭트, cx6083, cx6084 및 cx5067을 함유하는 시험된 B7H3-표적화된 FAB 보다 우수하였다. 중요하게는, MAB-dsFV 컨스트럭트, cx6083 및 cx6084는 MAB-FV 컨스트럭트 cx5067 보다 우수하였으며, T-세포 기능을 향상시키기 위한 도메인간 이황화 안정화 변형의 중요성을 입증하였다.
sdAb B7H3-표적화 도메인(cx6079,cx6080 및 cx608l)을 갖는 다른 예시적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 컨스트럭트와 비교할 때, 예시적인 cx5952 sdAb B7H3-표적화 제한된 CD3 인게이저는 B7H3-표적 세포 T 세포의 존재하에 실질적으로 증가된 IFNγ의 생성을 매개하지만 B7H3 음성 세포주를 갖는 배양물에서는 그러하지 않았다(도 12f).
E. 요약
이러한 관찰은 본원에 제공된 항원-표적화된 제한된 CD3 포맷이 강력한 B7H3-의존성 T-세포 독성 유발 능력을 유지하면서 단리시 감소된 T-세포 결합이 결핍되거나 그 결합을 나타내지 않는다는 것을 추가로 뒷받침한다. 이론에 근거하는 것은 아니지만, 이러한 결과는, Fab 대신에 항원 표적화된 sdAbs의 이용은 TAA 발현 종양 세포와 CD3 발현 T-세포 사이의 면역 시냅스 거리를 감소시키고 T 세포 활성 및 세포독성을 향상시킬 수 있다는 것을 보여준다. 특히, VL G100C와 쌍을 이루는 항-CD3 VH G44C의 변형에 의해 생성된 사슬간 이황화 결합을 포함하는 것은 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 활성을 크게 향상시킨다는 것이 밝혀졌다. 또한, 다른 sdAb B7H3-표적화 도메인 컨스트럭트와 비교하여 cx5952에 의한 보다 강력한 B7H3-의존성 T 세포 활성은, 항-CD3 결합 도메인에 대한 B7H3-표적화 sdAb C-말단의 위치, 또는 cx5952가 B7H3 상의 2개의 별개의 에피토프에 결합하는 반면, 시험된 다른 컨스트럭트는 2가 방식으로 단일 에피토프에 결합하는 것이 상기 증강된 활성에 기여하였다는 것을 암시한다.
실시예 5 : 단일 또는 다중 B7H3-결합 표적화 도메인을 함유하는 CD3-제한된 다중특이적 컨스트럭트의 평가
(N 또는 C-말단에 위치한) 1가 sdAb 항원-결합 도메인을 함유하는 컨스트럭트의 활성은 N 및 C-말단 모두에 위치한 항원-표적화 sdAb를 함유하는 이중 결합(2가) 컨스트럭트의 활성과 비교하였다. 결합은 실시예 2에 기재된 것과 실질적으로 동일하게 평가하고, T 세포 활성은 실시예 3 및 4 에 기재된 것과 실질적으로 동일하게 Jurkat 리포터 분석 및 T 세포 독성 분석에서 평가하였다.
A. 결합
도 13a에 도시된 바와 같이, 2가 B7H3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트, cx5l87 및 cx5823은 1가 버전, cx5873 및 cx5965와 비교하여 B7H3 양성 A375 세포에 대해 보다 높은 친화성 결합을 나타내었다. 이들 컨스트럭트 중의 어느 것도 B7H3 음성 CCRF-CEM 세포 또는 단리된 T-세포에 대해 검출가능한 결합을 나타내지 않았다(도 13b).
B. T 세포 리포터 활성
1가 또는 2가 방식으로 항원과 결합하는 항원-표적화된 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 B7H3 항원-의존성 CD3 길항 능력은 상기 기재된 것과 실질적으로 동일한 분석에서 CD3-NFAT Jurkat 리포터 세포를 사용하여 평가하였다. 도 3c에 도시된 바와 같이, 실질적으로 증가된 형광 리포터 활성은 예시적인 1가 컨스트럭트 cs5873 및 cx5965에 대한 리포터 활성과 비교하여 예시적인 2가 B7H3-표적화된 컨스트럭트 cx5l87의 존재하에 관찰되었다. 컨스트럭트가 B7H3-음성 CCRF 표적 세포로 공-배양된 Jurkat 리포터 세포와 함께 인큐베이션하였을 때 리포터 활성은 관찰되지 않았다(도 13d).
C. 세포 독성 활성
B7H3-표적화된 CD3 제한된 결합 구조물의 세포독성은 흑색종 세포주, A375 및 T-세포 급성 림프구성 백혈병 세포주, CCRF-CEM에 대해 평가되었으며, 이들은 각각 B7H3 양성 및 음성 세포주로서 사용되었다.
세포 독성은 실시예 4에 기재된 것과 실질적으로 동일하게 평가되었다. 도 14a에 도시된 바와 같이, 예시적인 2가 B7H3-표적화된 제한된 CD3 관여 컨스트럭트, cx5l87은 컨스트럭트, cx5873 및 cx5965의 1가 버전에 비해 향상된 표적-의존성 T-세포 매개 세포 독성을 나타내었다. 이들 분석에서, CCRF-CEM 세포가 표적 세포로서 사용되는 도 14b에 도시된 바와 같이, 표적 세포의 B7H3 발현의 부재하에 세포독성이 관찰되지 않았다.
D. 세포 변조
T 세포 변조는 cx5l87, cx5873 또는 cx5965의 존재하에 B7H3 양성(A375) 또는 B7H3 음성 세포주(CCRF-CEM)를 갖는 T 세포의 배양을 포함하는, 상기 T 세포 세포 독성 분석으로부터 현탁 세포에서 실시예 4에 기재된 것과 실질적으로 동일하게 CD25의 발현을 모니터링함으로써 평가하였다. 도 15a 및 15b에 도시된 바와 같이, 예시적인 2가 B7H3-표적화된 제한된 CD3 관여 컨스트럭트, cx5l87은 CD4 및 CD8 T-세포에 대한 CD25 상향조절의 강화된 효능에 의해 입증되는 바와 같이 컨스트럭트, cx5873 및 cx5965의 1가 버전에 비해 향상된 표적-의존성 T-세포 매개 활성화를 나타내었다. 이들 분석에서, 도 15c 및 15d에 나타낸 바와 같이, 표적 세포의 B7H3 발현의 부재하에 T-세포 활성화가 관찰되지 않았고, 여기서 CCRF-CEM 세포가 표적 세포로서 사용되었다. 이러한 결과는 B7H3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트가 CD4 및 CD8 T-세포 모두의 강력한 항원-의존성 활성화를 유도한다는 것을 입증하였다.
D. 요약
이러한 결과는 2가 항원-표적화된 제한된 CD3 관여 컨스트럭트가 1가 항원-표적화된 제한된 CD3 관여 컨스트럭트 보다 우수한 항원-의존성 CD3 결합 및 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 N 및 C-말단 모두에 위치한 이중 항원-결합 도메인을 함유하는 컨스트럭트가 단일 1가 항원-결합 도메인만을 함유하는 1가 컨스트럭트 보다 우수한 결합 및 T 세포 활성을 갖는다는 발견과 일치한다. 또한 이론에 근거하는 것은 아니지만, sdrabs C-말단 중 하나를 CD3 결합 도메인에 위치시키는 것은, sdAbs가 단지 N-말단에만 위치하는 컨스트럭트에 비해 보다 최적의 면역 시냅스를 형성할 수 있고, 후자는 면역 시냅스 거리를 증가시킬 수 있다.
실시예 6 : B7H3-표적화 sdAb 및 Fab 도메인을 함유하는 CD3-제한된 다중특이적 컨스트럭트의 평가
종양-관련 항원-결합 도메인으로서 B7H3-표적화된 sdAb(들) 또는 Fab를 함유하는 컨스트럭트를 T-세포 활성화 활성에 대해 평가하였다. 항-B7H3 sdAb(예를 들어,cx5952 및 cx6079)로 포맷된 B7H3-표적화된 제한된 CD3 관여 컨스트럭트 또는 항원-결합 도메인(들)으로서 Fab(예를 들어 cx5067, cx6083 또는 cx6084)로 포맷된 항-B7H3 MAB 컨스트럭트의 활성이 평가되었다(도 3a 및 3c 및 표 El.l 및 E1.2 참조). cx6079 및 cx5067을 제외한 모든 시험된 컨스트럭트는 VL G100C와 쌍을 이룬 항-CD3 VH G44C의 변형에 의해 생성된 이황화-안정화된 항-CD3 Fv(dsFv)를 함유하였다. MAB-Fv로 명명된 cx5067의 항-CD3 Fv, 및 sdAb-Fc-Fv로 명명된 cx6079의 항-CD3 Fv는 이황화-안정화되지 않았다. 또한, cx5952는, 하나는 Fc 도메인에 대해 N-말단에 위치하고 하나는 CD3-결합 도메인에 대해 C-말단에 위치하는 2개의 별개의 B7H3-표적화 sdAb 도메인을 함유하도록 조작되었다. 대조적으로, cx6079는 둘 다 Fc 도메인에 대해 N-말단에 위치하는 2개의 동일한 B7H3-표적화 sdAb 도메인을 함유하도록 조작되었다. 3개의 Fab 컨스트럭트 모두의 Fvs는 Fc 도메인에 대해 N-말단에 놓이도록 조작되었다.
A. 세포 독성
B7H3-표적화된 CD3 제한된 결합 컨스트럭트의 세포 독성을 실시예 4에 기재된 것과 실질적으로 동일하게 평가하였다. 세포 독성을 흑색종 세포주, A375 및 T-세포 급성 림프구성 백혈병 세포주, CCRF-CEM에 대해 평가하였으며, 이들은 각각 B7H3 양성 및 음성 세포주로서 사용하였다. 도 16a에 도시된 바와 같이, B7H3-표적화 sdAb, cx5952 및 cx6079로 포맷된 예시적인 제한된 CD3 관여 컨스트럭트는 Fab, cx5067, cx6083 및 cx6084로 포맷된 항-B7H3 MAB 컨스트럭트에 비해 항원-의존성 T-세포 독성을 유도하는데 우수하였다. 특히 cx5952는 cx6079 보다 높은 효능이 있었으며, 이것은 항-CD3 결합 도메인에 대한 B7H3-표적화 sdAb C-말단의 위치 및/또는 상기 증진된 활성에 기여하는 조작된 이황화물을 통한 항-CD3 FV의 안정화를 시사한다. 이들 분석에서, 도 16b 에 도시된 바와 같이, B7H3-음성 CRF-CEM 세포 표적 세포의 존재하에서 세포독성이 관찰되지 않았다.
C. T 세포 변조
T 세포 변조를 추가로 평가하기 위해, 예시적인 다중특이적 CD3 제한된 결합 컨스트럭트를, 실질적으로 실시예 4에 기재된 것과 동일하게 T 세포 활성화 마커를 변조하는 컨스트럭트의 능력을 모니터링함으로써 평가하였다. T 세포 활성화를 평가하기 위해서, 예시적인 B7H3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 존재하에 B7H3 양성(a375) 또는 B7H3 음성 세포주(CCRF-CEM)를 갖는 T 세포의 배양물을 포함하는, 상기 T 세포 세포독성 분석으로부터의 현탁 세포를 수집하였다. 시험된 컨스트럭트는 sdAb(예를 들어 cx5952 및 cx6079)로 포맷된 항-B7H3 컨스트럭트 및 Fab(예를 들어 cx5067, cx6083 및 cx6084)로 포맷된 항-B7H3 컨스트럭트를 포함하였다.
세포를 라이브/데드 스테인(live/dead stain) 및 형광단-콘쥬게이트된 항-CD4, 항-CD8, 항-CD25 및/또는 항-CD7l 항체로 염색하였다. 세포를 SONY SA3800 스펙트럼 분석기를 사용하여 분석하고 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 활성화를 CD25 또는 CD71 또는 CD25- 또는 CD71-양성의 발현 수준을 측정함으로써 결정하였다.
결과는 B7H3 양성(A375) 또는 B7H3 음성 세포주(CCRF-CEM)와 함께 공-배양시킨 후 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상의 CD25 발현(도 16c 내지 16f) 및 CD71 발현(도 16g 내지 16j)에 대해 나타내었다. 결과는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 CD25 및 CD71의 증가된 발현에 의해 입증되는 바와 같이, cx5952가 CD3 결합을 통한 용량-의존성 B7H3-의존성 T-세포 활성화를 매개한다는 것을 보여주었다. cx5952는 다른 B7FI3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트에 비해 가장 효능이 있었고 T-의존성 T-세포 활성화를 유도하였다.
C. T 세포 사이토카인 생성
cx5952, cx6079, cx6083, cx6084 또는 cx5067의 존재하에 B7H3 양성,A375 또는 음성,CCRF-CEM 세포를 갖는 T 세포의 공-배양물 을 포함하는, T 세포 독성 종양 세포 공동-배양 분석으로부터의 상청액을 샌드위치 ELISA에 의해 IFNγ 함량에 대해 분석하였다. 상청액 샘플의 사이토카인 농도 값을 보간하는 표준 곡선을 생성하였다. 상청액 샘플의 사이토카인 농도값을 보간하는 표준 곡선을 생성하였다. 검출 하한치 미만의 흡광도 값을 갖는 샘플에 최저 표준 농도의 절반과 동일한 사이토카인 농도를 할당하였다. 도 16k에 도시된 바와 같이, 대표적인 sdAb-Fc-dsFV-sdAb 컨스트럭트, cx5952는 활성화된 T-세포로부터 표적-의존성 사이토카인 방출을 유도하는, 시험된 B7H3-표적화된 FAB-함유 컨스트럭트, cx6083, cx6084 및 cx5067 보다 우수하였다. 이것은 항원 의존성 세포 독성 및 활성화 분석으로부터의 발견과 일치한다. 중요하게는, MAB-dsFV 컨스트럭트, cx6083 및 cx6084는 MAB-FV 컨스트럭트 cx5067 보다 우수하였으며, T-세포 기능을 향상시키기 위한 도메인간 이황화 안정화 변형의 중요성을 입증하였다.
D. 요약
이들 결과는 항-B7H3 sdAb 결합 도메인으로 포맷된 제한된 항-CD3 컨스트럭트가 Fab B7H3 결합 도메인으로 포맷된 항-B7H3 MAB 컨스트럭트에 비해 항원-의존성 T-세포 독성을 유도하는데 우수함을 입증한다. 또한, cx5952는, CD3 결합 도메인에 대한 B7H3-표적화 sdAb C-말단의 포지션닝, 위치시킨 후, 조작된 이황화물을 통한 항-CD3 FV의 안정호, 또는 이들 둘 다가 증강된 활성에 기여함을 암시한, cx6079 보다 더 강력하였다. 이론에 근거하는 것은 아니지만, sdAbs C-말단 중 하나를 CD3 결합 도메인에 위치시키는 것은 sdarbs가 Fc에 대해 N-말단에만 위치하는 컨스트럭트에 비해 보다 최적의 면역 시냅스를 형성할 수 있고, 후자는 면역 시냅스 거리를 증가시킬 수 있다.
실시예 7 : 단일 또는 다중 항원-결합 DLL3-표적화 도메인을 함유하는 CD3-제한된 다중특이적 컨스트럭트의 평가
본 실시예는 시험관내 분석에서 인간 1차 T 세포 내 예시적인 생성된 DLL3-표적화된 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 평가 및 특징을 기술한다.
항원-결합 도메인(들)으로서 항-DLL3 sdAb(예를 들어 cx5352, cx5800, cx580l, 및 cx5499)로 포맷팅된 DLL3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 결합 및 활성이 평가되었다(도 4a 내지 4b 및 표 E1.1 참조). 모든 시험된 컨스트럭트는 VL G100C와 쌍을 이룬 항-CD3 VH G44C의 변형에 의해 생성된 이황화-안정화된 항-CD3 Fv(dsFv)를 함유하였다. 또한 DLL-3-표적화된 컨스트럭트를 공-자극성 수용체 sdAb 도메인을 함유하지 않는 cx5499를 제외하고는, 공-자극성 수용체 sdAb C-말단을 CD3 dsv에 함유하도록 조작하였다.
A. 결합
실질적으로 실시예 2에 기재된 것 바대로 결합을 평가하였다. 도 17a에 나타낸 바와 같이, 2가 DLL3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트, cx5352는 1가 버전, cx5800 및 cx580l과 비교하여 DLL3 양성, SHP-77 세포에 대해 더 높은 친화성 결합을 나타내었다. 도 17b에 도시된 바와 같이, 시험된 컨스트럭트 중의 어느 것도 DLL3-음성 1차 T 세포에 결합하지 않았다. 이들 결합 분석은 유세포 측정법에 의해 수행하였으며, 여기서 결합된 컨스트럭트는 형광단-콘쥬게이트된 항-인간 IgG Fc 2차 항체를 사용하여 검출하였다.
B. T 세포 리포터 활성
Jurkat 세포 발현 NFAT-구동 루시페라제(NFAT-driven Luciferase)가 사용되고 루시페라제 활성이 모니터링되는 것을 제외하고, 실시예 2와 실질적으로 동일한 리포터 분석으로 T 세포 활성을 평가하였다. Jurkat 세포 발현 NFAT-구동 루시페라제를, DLL3 항원에 대한 항원-결합 도메인을 함유하는 1가 및 2가 컨스트럭트의 존재하에 SHP-77(DLL3-양성) 표적 세포와 공-배양하였다(도 4a 참조). 특히 도 17c에 도시된 바와 같이, 예시적인 2가 컨스트럭트 cx5352는 예시적인 1가 컨스트럭트 cx5800 및 cx580l과 비교하여 이 분석에서 실질적으로 더 큰 루시페라제 활성을 유도하였다. 이들 결과는 B7H3-표적화된 컨스트럭트로 관찰된 결과와 일치하고, 그에 의해서 컨스트럭트의 활성이 특정 표적 항원에 특정되지 않음을 나타낸다.
C. 세포 독성
Cx5499의 세포독성, 그의 아미노 및 카복시 말단에 위치한 2개의 별개의 sdAb 결합 도메인으로 포맷된 DLL3-표적화된 CD3 제한된 결합 컨스트럭트를 실시예 4에 기재된 것과 실질적으로 동일한 분석을 이용하여 DLL3 발현 세포주 SHP-77에 대해 평가하였다. 도 18a에 나타낸 바와 같이, cx5499는 SHP-77 세포주에 대한 강력한 T-세포 매개 세포 독성을 유도하였다.
D. T 세포 변조
T 세포 변조를 추가로 평가하기 위해서, 예시적인 다중특이적 CD3 제한된 결합 컨스트럭트는 T 세포 활성화 마커를 조절하는 컨스트럭트의 능력을 모니터링함으로써 평가되었다. T 세포 활성화를 평가하기 위해서, 예시적인 DLL3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트의 존재하에, cx5449의 존재하에 DLL3 양성 SHP-77 세포를 갖는 T 세포의 배양물을 포함하는, T 세포 세포독성 분석으로부터의 현탁 세포를 수집하였다. 세포를 라이브/데드 스테인 및 형광단-콘쥬게이트된 항-CD4, 항-CD8, 항-CD25, 및/또는 항-CD69 항체로 염색하였다. SONY SA3800 스펙트럼 분석기를 사용하여 세포를 분석하고 CD25, 또는 CD69의 발현 수준 또는 퍼센트 CD25-, 또는 CD69-양을 측정함으로써 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 활성화를 측정하였다.
도 18b 및 도 18d는, 예시적인 DLL3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트, cx5499의 존재하에, DLL3 양성, SHP-77 세포로 T 세포의 배양시 CD4 T 세포 또는 CD8 T 세포 각각 상의 CD25 발현에 대한 결과를 도시한다. 도 18c 및 도 18e는, 예시적인 DLL3-표적화 제한된 CD3 관여 컨스트럭트, cx5499의 존재하에, DLL3 양성, SHP-77 세포로 T 세포의 배양시 CD4 세포 또는 CD8 세포 각각 상의 CD69 발현에 대한 결과를 도시한다. 상기 결과는, CD4+ 및 CD8+ T 세포 상의 CD25 및 CD69의 증가된 발현에 의해서 입증되는 바와 같이 cx5499가 용량-의존성 DLL3-의존성 T-세포 활성화를 매개한 것을 보여준다.
E. 요약
이러한 결과는 항-DLL3 sdAb 결합 도메인르로 포맷된 제한된 항-CD3 컨스트럭트가 DLL3-발현 세포주, SHP-77에 결합할 수 있으며 항원 의존성 T 세포 독성 및 활성화를 유도할 수 있다는 것을 증명한다. 이 결과는 본 개시의 제한된 CD3 관여 컨스트럭트가 다수의 종양 항원을 특이적으로 표적화하고 표적-발현 세포에 대한 T-세포 세포 독성 및 활성화를 유도하는데 광범위한 응용성을 갖는다는 발견과 일치한다.
본 발명은 이의 상세한 설명과 관련하여 기술되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 예시하고자 하는 의도일 뿐 제한하는 것은 아니다. 다른 측면들, 이점들, 및 변형들이 다음의 청구범위의 범위 내에 있다.
서열표
서열번호 서열 설명
1 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1 Fc
2 PAPGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK xELL Fc
3 PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK IgG2 Fc
4 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFKWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST FRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESSGQPEN NYNTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNIFSCSVMH EALHNRFTQK SLSLSPGK IgG3 Fc
5 PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK IgG4 Fc
6 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK IgG4 Fc
7 EPKSSDKTHTCPPC 힌지
8 DKTHTCPPC 힌지
9 ESKYGPPCPPC 힌지
10 GGSGGS (GGS)2
11 GGSGGSGGS (GGS)3
12 GGSGGSGGSGGS (GGS)4
13 GGSGGSGGSGGSGGS (GGS)5
14 EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSA 항-CD3 VH
15 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 항-CD3 VL
16 TYAMN 항-CD3 VH CDR1
17 RIRSKYNNYATYYADSVKD 항-CD3 VH CDR2
18 HGNFGNSYVSWFAY 항-CD3 VH CDR3
19 RSSTGAVTTSNYAN 항-CD3 VL CDR1
20 GTNKRAP 항-CD3 VL CDR2
21 ALWYSNLWV 항-CD3 VL CDR3
22 LEAD 그랜자임 B 기질
23 RQAR 그랜자임 B 기질
24 PAGL MMP 기질
25 TGLEADGSPAGLGRQARVG 링커
26 TGLEADGSRQARVGPAGLG 링커
27 TGSPAGLEADGSRQARVGS 링커
28 TGPAGLGLEADGSRQARVG 링커
29 TGRQARVGLEADGSPAGLG 링커
30 TGSRQARVGPAGLEADGS 링커
31 TGPAGLGSRQARVGLEADGS 링커
32 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH1
33 EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSSLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH2
34 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH3
35 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH4
36 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH5
37 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH6
38 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGDSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH7
39 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVS 항-CD3 VH8
40 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTTVTVSS 항-CD3 VH9
41 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSYFAYWGQGTTVTVSS 항-CD3 VH10
42 EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH11
43 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVKP 항-CD3 VH12
44 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVKP 항-CD3 VH13
45 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGCGTLVTVKP 항-CD3 VH14
46 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH15
47 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH16
48 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH17
49 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH18
50 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH19
51 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKCLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH20
52 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKCLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH21
53 EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSSLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH22
54 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH23
55 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH24
56 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH25
57 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKCLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH26
58 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKCLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGDSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH27
59 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVS 항-CD3 VH28
60 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTTVTVSS 항-CD3 VH29
61 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSYFAYWGQGTTVTVSS 항-CD3 VH30
62 EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 항-CD3 VH31
63 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 항-CD3 VL1
64 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGKSPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGCGTKLEIK 항-CD3 VL2
65 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 항-CD3 VL3
66 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQADDESIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 항-CD3 VL4
67 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSILGNKAALTITGAQADDESIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 항-CD3 VL5
68 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 항-CD3 VL6
69 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 항-CD3 VL7
70 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL 항-CD3 VL8
71 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGGGTKLEIK 항-CD3 VL9
72 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGCGTKLEIK 항-CD3 VL10
73 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQCFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGEGTKLEIK 항-CD3 VL11
74 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGCGTKLTVL 항-CD3 VL12
75 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGKSPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGGGTKLEIK 항-CD3 VL13
76 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGCGTKLTVL 항-CD3 VL14
77 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQADDESIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 항-CD3 VL15
78 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSILGNKAALTITGAQADDESIYFCALWYSNLWVFGCGTKLTVL 항-CD3 VL16
79 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNLWVFGCGTKLTVL 항-CD3 VL17
80 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGCGTKLTVL 항-CD3 VL18
81 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGCGTKLTVL 항-CD3 VL19
82 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPT 노브 Fc
83 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPT 홀 Fc
84 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPT 노브 Fc
85 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPT 홀 Fc
86 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 노브 Fc
87 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 홀 Fc
88 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 노브 Fc
89 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 홀 Fc
90 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPT 홀 Fc
91 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPT 홀 Fc
92 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPG 홀 Fc
93 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPG 홀 Fc
94 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPT 노브 Fc
95 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPT 노브 Fc
96 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPG 노브 Fc
97 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPG 노브 Fc
98 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPT 홀 Fc
99 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPT 홀 Fc
100 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPG 홀 Fc
101 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPG 홀 Fc
102 PGGGG Peptide 링커
103 GGGG Peptide 링커
104 GPAGLGLEPDGSRQARVG 링커
105 GGSGGGGIEPDIGGSGGS 링커
106 GGSGGGGLEADTGGSGGS 링커
107 GSIEPDIGS 링커
108 GSLEADTGS 링커
109 GGSGGGGIEPDGGGSGGS 링커
110 GGSGGGGIEPDVGGSGGS 링커
111 GGSGGGGIEPDSGGSGGS 링커
112 GGSGGGGIEPDTGGSGGS 링커
113 GGGSLEPDGSGS 링커
114 GPAGLGLEADGSRQARVG 링커
115 GGEGGGGSGGSGGGS 링커
116 GSSAGSEAGGSGQAGVGS 링커
117 GGSGGGGLEAEGSGGGGS 링커
118 GGSGGGGIEPDPGGSGGS 링커
119 GGGGGSGGGGGSGGGGGS 링커
120 QLQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDNYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRNNAKGTVYLLMNSLKPEDTAVYYCATELVPACTYSNGRGPLDGMDYWGKGTQVTVKP FR alpha sdAb
121 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSIDATAWYRQAPGKQRELVAIITSSGSTNYPESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCNAITRYGGSTYDFWGQGTLVTVKP FR alpha sdAb
122 EVQPGGSLRLSCAASETFGVVFTLGWYRQAPGKGREFVARVTGTDTVDYAESVKGRFTISSDFARNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCNTGAYWGQGTLVTVKP FR alpha sdAb
123 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFILDYYAIGWFRQAPGKEREGVLCIDASDDITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTGVYYCATPIGLSSSCLLEYDYDYWGQGTLVTVKP cMET sdAb
124 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSDSSAIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCGRGRENIYYGSRLDYWGQGTTVTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPFTFGQGTKLEIK B7H3 scFv
125 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSGSGGGGSGGGGTGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIK CD20 scFv
126 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYVYYSGTTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASIAVTGFYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERVTLSCRASQRVNNNYLAWYQQRPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDRSPLTFGGGTKLEIK DLL3 scFv
127 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSDSSAIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCGRGRENIYYGSRLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC B7H3 Fd
128 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC B7H3 LC
129 EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRQWDYDVRAMNYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 5T4 Fd
130 DIVMTQSHIFMSTSVGDRVSITCKASQDVDTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRLTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 5T4 LC
131 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSFNYYWSWIRHHPGKGLEWIGYIYYSGSTYSNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLTLSSVTAADTAVYYCARGYNWNYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC gpNMB Fd
132 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVDNNLVWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC gpNMB LC
133 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMAWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTASLQIINLKNEDTATYFCARIGDSSPSDYWGQGTTLTVSSSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DLL3 Fd
134 SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVVWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFAGSGYGTDFSFTISTVQAEDLAVYFCQQDYTSPWTFGGGTKLEIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC DLL3 LC
135 GGGGGS 펩티드 링커
136 IEPDI 링커
137 LEADT 링커
138 IEPDG 링커
139 IEPDV 링커
140 IEPDS 링커
141 IEPDT 링커
142 LEPD 링커
143 LEAE 링커
144 IEPDP 링커
145 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSDSSAIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCGRGRENIYYGSRLDYWGQGTTVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE B7-H3 x CD3 이중특이적 DART-A 다이아보디(Diabody)의 제 2 폴리펩티드 사슬
146 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK B7-H3 x CD3 이중특이적 DART-A 다이아보디의 제 3 폴리펩티드 사슬
147 GGSGGGGSGGGGSGGGGS 링커
148 TGGSGGGGIEPDIGGSGGS 링커
149 GGGGS 링커
150 X1 X2 X3 X4 X5 (P4 P3 P2 P1
Figure pct00009
')
X1= I, L, Y, M, F, V, or A; (P4 = I, L, Y, M, F, V, or A)
X2 = A, G, S, V, E, D, Q, N, or Y; (P3 = A, G, S, V, E, D, Q, N, or Y)
X3 = H, P, A, V, G, S, or T; (P2 = H, P, A, V, G, S, or T)
X4 = D or E; (P1 = D or E)
X5 = I, L, Y, M, F, V, T, S, G or A(P1' = I, L, Y, M, F, V, T, S, G or A)		 링커 일치(Linker consensus)
151 X1 E X3 D X5 (P4 P3 P2 P1
Figure pct00010
P1')
X1 = I or L; (P4 = I or L)(P3 = E)
X3 = P or A; (P2 = P or A)
X5 = I, V, T, S, or G (P1' = I, V, T, S, or G)		 링커 일치
152 LEPDG 링커
153 LEADG 링커
154 X1QARX5 (P1QAR
Figure pct00011

X1 = any amino acid; (P1 is any amino acid)X5 = A or V		 링커 일치
155 RQARX5 (RQAR(A/V))
X5 = A or V		 링커 일치
156 RQARV 링커
157 X1X2 X3 X4 (P3 P2 P1
Figure pct00012
')
X1 = P, V or A; (P3 = P, V or A)X2 = Q or D; (P2 = Q or D)
X3 = A or N; (P1 = A or N)
X4 = L, I or M (P1' = L, I or M)		 링커 일치
158 PX2X3X4 (P3 P2 P1
Figure pct00013
')(P3 = P)
X2 = Q or D; (P2 = Q or D)
X3 = A or N; (P1 = A or N)
X4 = L or I (P1' = L or I)		 링커 일치
159 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A
160 ATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A
161 QCTNYALLKLAGDVESNPGP E2A
162 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP F2A
163 EGRGSLLTCGDVEENPGP T2A
164 LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR T2A
165 GGATCTGGAGCAACAAACTTCTCACTACTCAAACAAGCAGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGACCC P2A DNA
166 GSPAGLEADGSRQARVGS 링커
167 EVQLVESGGGL VQPKGSLKLS CAASGFTFNT YAMNWVRQAP GKGLEWVARI RSKSNNYATY YADSVKDRFT ISRDDSQSML YLQMNNLKTE DTAMYXCVRQ WDYDVRAMNY WGQGTSVTVS S 항-5T4 VH
168 DIVMTQSHIF MSTSVGDRVS ITCKASQDVDTAVAWYQQKP GQSPKLLIYW ASTRLTGVPD RFTGSGSGTD FTLTISNVQS
EDLADYFCQQ YSSYPYTFGG GTKLEIK 		항-5T4 VL
169 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYSASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN
WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKDRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP
REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL
SPGK		 B7-H3 x CD3 이중특이적 DART-A 다이아보디의 제 1 폴리펩티드 사슬
170 GGGGSGGGGSGGGGS 링커
171 GGS(GGS)n wherein n is 0 to 10 링커
172 (GGGGGS)nwherein n is 1 to 4 링커
173 (GGGGS)nwherein n is 1 to 10 링커
174 GlyxXaa-Glyy-Xaa-Glyz Xaa is independently selected from A, V, L, I, M, F, W, P, G, S, T, C, Y, N,Q, K, R, H, D, or E
x, y, and z are each integers in the range from 1-5		 링커
175 Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-GlyXaa is independently selected from A, V, L, I, M, F, W, P, G, S, T, C, Y, N,Q, K, R, H, D, or E 링커
176 ATTTGSSPGPT 링커
177 GGGGG-C-GGGGG 링커
178 (EAAAK)nn=2-20 링커
179 AS-(AP)n-GTn=2-20 링커
180 AS-(EAAAK)n-GTn=2-20 링커
181 (GGGGA)nn=2-20 링커
182 (PGGGS)nn=2-20 링커
183 (AGGGS)nn=2-20 링커
184 GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGSn=2-20 링커
185 (SSSSG)nn=1-9 링커
186 SSSASASSA 링커
187 GSPGSPG 링커
188 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSIS SYYWSWIRQP PGKGLEWIGYVYYSGTTNYN PSLKSRVTIS VDTSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCASIAV
TGFYFDYWGQ GTLVTVSSGG GGSGGGGSGG GGSEIVLTQS PGTLSLSPGE
RVTLSCRASQ RVNNNYLAWY QQRPGQAPRL LIYGASSRAT GIPDRFSGSG
SGTDFTLTIS RLEPEDFAVY YCQQYDRSPL TFGGGTKLEI K 		DLL3 scFv
189 QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYAFS YSWINWVRQA PGQGLEWMGRIFPGDGDTDY NGKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARNV
FDGYWLVYWG QGTLVTVSS		 CD20 VH
190 DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSSKSLL HSNGITYLYW YLQKPGQSPQLLIYQMSNLV SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCAQNLELP
YTFGGGTKVE IKRTV		 CD20 VL
191 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGCGTKLTVL 항-CD3 VL35 (CON)
192 GGGGG 링커
193 GGGGSGGGGSGGGGS 링커
194 DKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVKHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCDVSGFYPSDIAVEWESDGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWEQGDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Fc-Het-1
195 DKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVKHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREQMTKNQVKLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Fc-Het-2
196 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGDSYVSWFAYWGQGTLVTVSS CD3-VH32
197 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKCLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGDSYVSWFAYWGQGTLVTVSS CD3-VH33
198 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADTVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGDSYVSWFAYWGQGTLVTV CD3-VH34
199 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGKSPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVL CD3-VL20
200 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGKSPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGCGTKLTVL CD3-VL21
201 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 노브 Fc
202 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 홀 Fc
203 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 노브 Fc
204 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 홀 Fc
205 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSP 홀 Fc
206 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSP 홀 Fc
207 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSP 노브 Fc
208 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSP 노브 Fc
209 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSP 홀 Fc
210 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSP 홀 Fc
211 GFTFNTYAMN
 항-CD3 VH CDR1
212 RIRSKYNNYATY 항-CD3 VH CDR2
213 QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYAFS YSWINWVRQA PGQGLEWMGR IFPGDGDTDY NGKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARNV FDGYWLVYWG QGTLVTVSSG GGGSGGGGSG GGGSDIVMTQ TPLSLPVTPG EPASISCRSS KSLLHSNGIT YLYWYLQKPG QSPQLLIYQM SNLVSGVPDR FSGSGSGTDF TLKISRVEAE DVGVYYCAQN LELPYTFGGG TKVEIK CD20 scFv
214 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGFSFSSNVMMWVRQAPGKGLEWVSTIYSSGTGTFYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRPEDTAVYYCATSGPVRGWGPRSQGTLVTVKP B7H3 sdAb B7h3 hz1A5v51
215 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSTFSSYHMSWFRQAPGKQREPVATSHHGGTTNYAGSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNTLRAEDTAVYYCKADHGYQGRGYWGQGTLVTVKP sdAb B7H3 hz58E05v27
216 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYHMSWFRQAPGKQRELVATSHHGGTTNYAGSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNTLRAEDTAVYYCKADHGYQGRGYWGQGTLVTVKP sdAb B7H3 hz58E05v55
217 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYHMSWFRQAPGKQREPVATSHHGGTTNYAGSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNTLRAEDTAVYYCKADHGYQGRGYWGQGTLVTVKP sdAb B7H3hz58E05v48
218 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAPSERTFSTYTMGWFRQAPGKEREFVAVVNWGGGSKYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAGGAYSGPYYDTRQYTYWGQGTLVTVKPGG sdAb B7H3 hz57B04v24
219 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDTNTIYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLFSRDYEFYWGQGTLVTVKP sdAb DLL3 hz10D9v7
220 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCGPSEIITSDKSMGWVRQAPGKQRNLVAGISNVGSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFENEYWGQGTLVTVKP sdAb DLL3 hz8E7v16
221 GFSFSINAMG 41BB CDR1
222 AIESGRNTV 41BB CDR2
223 LKGNRVVSPSVAY 41BB CDR3
224 HGNFGDSYVSWFAY CD3-VH7, VH33 CDR3
225 ALWYSNHWV CD3-VL2, VL21 CDR3
226 VLWYSNRWV CD3-VL8 CDR3
227 GFTFSTYAMN CD3 VH33 CDR1
228 RIRSKYNNYATY CD3 VH33 CDR1
229 GSSTGAVTTSNYAN CD3 VL21 CDR1
230 GTNKRAP CD3 VL21 CDR2
SEQUENCE LISTING <110> INHIBRX, INC. ECKELMAN, Brendan P. KAPLAN, Michael D. WILLIS, Katelyn M. TIMMER, John C. <120> MULTISPECIFIC POLYPEPTIDE CONSTRUCTS HAVING CONSTRAINED CD3 BINDING AND RELATED METHODS AND USES <130> 744952000240 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> 62/656,331 <151> 2018-04-11 <160> 230 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 Fc <400> 1 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180 185 190 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 2 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> xELL Fc <400> 2 Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 1 5 10 15 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 20 25 30 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 35 40 45 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 50 55 60 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 65 70 75 80 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 85 90 95 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 100 105 110 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 115 120 125 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 130 135 140 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 145 150 155 160 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 165 170 175 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 180 185 190 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 195 200 205 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 3 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG2 Fc <400> 3 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 4 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG3 Fc <400> 4 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180 185 190 Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 5 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 Fc <400> 5 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 115 120 125 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 180 185 190 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 <210> 6 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 Fc <400> 6 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 115 120 125 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 180 185 190 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge <400> 7 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge <400> 8 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge <400> 9 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 1 5 10 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - Linker(GGS)2 <400> 10 Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - Linker (GGS)3 <400> 11 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - Linker (GGS)4 <400> 12 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - Linker (GGS)5 <400> 13 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 14 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic - anti-CD3 VH <400> 14 Glu Val Gln Leu Val 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Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 VH CDR1 <400> 16 Thr Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 VH CDR2 <400> 17 Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Asp <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 VH CDR3 <400> 18 His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 VL CDR1 <400> 19 Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 1 5 10 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 VL CDR2 <400> 20 Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 VL CDR3 <400> 21 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu 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Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 135 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 135 Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 136 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 136 Ile Glu Pro Asp Ile 1 5 <210> 137 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 137 Leu Glu Ala Asp Thr 1 5 <210> 138 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 138 Ile Glu Pro Asp Gly 1 5 <210> 139 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 139 Ile Glu Pro Asp Val 1 5 <210> 140 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 140 Ile Glu Pro Asp Ser 1 5 <210> 141 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 141 Ile Glu Pro Asp Thr 1 5 <210> 142 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 142 Leu Glu Pro Asp 1 <210> 143 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 143 Leu Glu Ala Glu 1 <210> 144 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 144 Ile Glu Pro Asp Pro 1 5 <210> 145 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of B7-H3 x CD3 Bispecific DART-A Diabody <400> 145 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 130 135 140 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 145 150 155 160 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile 165 170 175 Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 180 185 190 Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp 195 200 205 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly 210 215 220 Ser Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 240 Gly Gly Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala 245 250 255 Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu 260 265 270 Lys Glu <210> 146 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Third Polypeptide Chain of B7-H3 x CD3 Bispecific DART-A Diabody <400> 146 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 147 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 147 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 148 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 148 Thr Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Ile Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ser <210> 149 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 149 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 150 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker consensus <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> X1= I, L, Y, M, F, V, or A <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> X2 = A, G, S, V, E, D, Q, N, or Y <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> X3 = H, P, A, V, G, S, or T <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> X4 = D or E <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> X5 = I, L, Y, M, F, V, T, S, G or A <400> 150 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 151 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker consensus <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> X1 = I or L <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> X3 = P or A <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> X5 = I, V, T, S, or G <400> 151 Xaa Glu Xaa Asp Xaa 1 5 <210> 152 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 152 Leu Glu Pro Asp Gly 1 5 <210> 153 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 153 Leu Glu Ala Asp Gly 1 5 <210> 154 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker consensus <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> X1 = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> X5 = A or V <400> 154 Xaa Gln Ala Arg Xaa 1 5 <210> 155 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker consensus <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> X5 = A or V <400> 155 Arg Gln Ala Arg Xaa 1 5 <210> 156 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 156 Arg Gln Ala Arg Val 1 5 <210> 157 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker consensus <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> X1 = P, V or A <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> X2 = Q or D <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> X3 = A or N <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> X4 = L, I or M <400> 157 Xaa Xaa Xaa Xaa 1 <210> 158 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker consensus <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> X2 = Q or D <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> X3 = A or N <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> X4 = L or I <400> 158 Pro Xaa Xaa Xaa 1 <210> 159 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A <400> 159 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 160 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A <400> 160 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 161 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E2A <400> 161 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 162 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F2A <400> 162 Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 163 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A <400> 163 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 164 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A <400> 164 Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg 20 <210> 165 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A <400> 165 ggatctggag caacaaactt ctcactactc aaacaagcag gtgacgtgga ggagaatccc 60 ggaccc 66 <210> 166 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 166 Gly Ser Pro Ala Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val 1 5 10 15 Gly Ser <210> 167 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> anti-5T4 VH <220> <221> misc_feature <222> (97)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 167 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Xaa Cys Val Arg Gln Trp Asp Tyr Asp Val Arg Ala Met Asn Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 168 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> anti-5T4 VL <400> 168 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Ile Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Leu Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 169 <211> 504 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of B7-H3 x CD3 Bispecific DART-A Diabody <400> 169 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 115 120 125 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 130 135 140 Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr 165 170 175 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 180 185 190 Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr 195 200 205 Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val 210 215 220 Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 240 Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala 245 250 255 Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu 260 265 270 Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 275 280 285 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 290 295 300 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 305 310 315 320 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 325 330 335 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 340 345 350 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 355 360 365 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 370 375 380 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 385 390 395 400 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 405 410 415 Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 420 425 430 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 435 440 445 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 450 455 460 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 465 470 475 480 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 485 490 495 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 <210> 170 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 170 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 171 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> REPEAT <222> (4)..(6) <223> repeated 0 to 10 times <400> 171 Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 172 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> REPEAT <222> (1)..(6) <223> repeated 1 to 4 times <400> 172 Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 173 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> Repeated 1 to 10 times <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> Repeated 1 to 5 times <400> 173 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 174 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Repeated 1 to 5 times <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> X2= A, V, L, I, M,F, W, P, G, S, T, C, Y, N,Q, K, R, H, D, or E <220> <221> REPEAT <222> (3)..(3) <223> Repeated 1 to 5 times <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> X4 = A, V, L, I, M,F, W, P, G, S, T, C, Y, N,Q, K, R, H, D, or E <220> <221> REPEAT <222> (5)..(5) <223> Repeated 1 to 5 times <400> 174 Gly Xaa Gly Xaa Gly 1 5 <210> 175 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> X4 = A, V, L, I, M,F, W, P, G, S, T, C, Y, N,Q, K, R, H, D, or E <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> X8 = A, V, L, I, M,F, W, P, G, S, T, C, Y, N,Q, K, R, H, D, or E <400> 175 Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 176 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 176 Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr 1 5 10 <210> 177 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 177 Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 178 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> Repeated 2 to 20 times <400> 178 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 179 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> REPEAT <222> (3)..(4) <223> Repeated 2 to 20 times <400> 179 Ala Ser Ala Pro Gly Thr 1 5 <210> 180 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> REPEAT <222> (3)..(7) <223> Repeated 2 to 20 times <400> 180 Ala Ser Glu Ala Ala Ala Lys Gly Thr 1 5 <210> 181 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> Repeated 2 to 20 times <400> 181 Gly Gly Gly Gly Ala 1 5 <210> 182 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> Repeated 2 to 20 times <400> 182 Pro Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 183 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> Repeated 2 to 20 times <400> 183 Ala Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 184 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> REPEAT <222> (4)..(17) <223> Repeated 2 to 20 times <400> 184 Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Gly Gly Ser 20 <210> 185 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> Repeated 1 to 9 times <400> 185 Ser Ser Ser Ser Gly 1 5 <210> 186 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 186 Ser Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ser Ala 1 5 <210> 187 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 187 Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly 1 5 <210> 188 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DLL3 scFv <400> 188 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Val Tyr Tyr Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ile Ala Val Thr Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu 130 135 140 Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Arg Val Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln 165 170 175 Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile 180 185 190 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 195 200 205 Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 210 215 220 Tyr Asp Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 225 230 235 240 Lys <210> 189 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD20 VH <400> 189 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 190 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD20 VL <400> 190 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val 115 <210> 191 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> anti-CD3 VL35 (CON) <400> 191 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 192 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> linker <400> 192 Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 193 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> linker <400> 193 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 194 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fc-Het-1 <400> 194 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 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Gly Lys 225 <210> 195 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fc-Het-2 <400> 195 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 1 5 10 15 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 20 25 30 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Lys His Glu 35 40 45 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 50 55 60 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 65 70 75 80 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 85 90 95 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 100 105 110 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 115 120 125 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Gln Met Thr Lys Asn Gln Val Lys Leu 130 135 140 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 145 150 155 160 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 165 170 175 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 180 185 190 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 195 200 205 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 210 215 220 Gly Lys 225 <210> 196 <211> 125 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CD3-VH32 <400> 196 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 197 <211> 125 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CD3-VH33 <400> 197 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 198 <211> 123 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CD3-VH34 <400> 198 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala 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Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 201 <211> 225 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Knob Fc <400> 201 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 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Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro 225 <210> 206 <211> 222 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Hole Fc <400> 206 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser 1 5 10 15 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 20 25 30 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 35 40 45 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 50 55 60 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 65 70 75 80 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 85 90 95 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 100 105 110 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu 115 120 125 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 145 150 155 160 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 165 170 175 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 180 185 190 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 195 200 205 Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 210 215 220 <210> 207 <211> 225 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Knob Fc <400> 207 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro 225 <210> 208 <211> 222 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Knob Fc <400> 208 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser 1 5 10 15 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Ser Arg 20 25 30 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 35 40 45 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 50 55 60 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 65 70 75 80 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 85 90 95 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 100 105 110 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 115 120 125 Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys 130 135 140 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 145 150 155 160 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 165 170 175 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 180 185 190 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val His Glu Ala 195 200 205 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 210 215 220 <210> 209 <211> 225 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Hole Fc <400> 209 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro 225 <210> 210 <211> 222 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Hole Fc <400> 210 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser 1 5 10 15 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Ser Arg 20 25 30 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 35 40 45 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 50 55 60 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 65 70 75 80 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 85 90 95 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 100 105 110 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu 115 120 125 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 145 150 155 160 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 165 170 175 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 180 185 190 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val His Glu Ala 195 200 205 Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 210 215 220 <210> 211 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> anti-CD3 VH CDR1 <400> 211 Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn 1 5 10 <210> 212 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> anti-CD3 VH CDR2 <400> 212 Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr 1 5 10 <210> 213 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CD20 scFv <400> 213 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser 130 135 140 Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 145 150 155 160 Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn 180 185 190 Leu Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Val Glu Ile Lys 245 <210> 214 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> B7H3 sdAb B7h3 hz1A5v51 <400> 214 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Val Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Tyr Ser Ser Gly Thr Gly Thr Phe Tyr Ala Glu Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Ser Gly Pro Val Arg Gly Trp Gly Pro Arg Ser Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Lys Pro 115 <210> 215 <211> 117 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> sdAb B7H3 hz58E05v27 <400> 215 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 His Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Pro Val 35 40 45 Ala Thr Ser His His Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gly Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys 85 90 95 Ala Asp His Gly Tyr Gln Gly Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Lys Pro 115 <210> 216 <211> 117 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> sdAb B7H3 hz58E05v55 <400> 216 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 His Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ser His His Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gly Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys 85 90 95 Ala Asp His Gly Tyr Gln Gly Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Lys Pro 115 <210> 217 <211> 117 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> sdAb B7H3 hz58E05v48 <400> 217 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 His Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Pro Val 35 40 45 Ala Thr Ser His His Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gly Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys 85 90 95 Ala Asp His Gly Tyr Gln Gly Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Lys Pro 115 <210> 218 <211> 127 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> sdAb B7H3 hz57B04v24 <400> 218 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Pro Ser Glu Arg Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Val Val Asn Trp Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Glu Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Gly Ala Tyr Ser Gly Pro Tyr Tyr Asp Thr Arg Gln Tyr 100 105 110 Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Gly 115 120 125 <210> 219 <211> 120 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> sdAb DLL3 hz10D9v7 <400> 219 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gly Phe Thr Gly Asp Thr Asn Thr Ile Tyr Ala Glu Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Asp Val Gln Leu Phe Ser Arg Asp Tyr Glu Phe Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro 115 120 <210> 220 <211> 115 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> sdAb DLL3 hz8E7v16 <400> 220 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Pro Ser Glu Ile Ile Thr Ser Asp Lys 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asn Leu Val 35 40 45 Ala Gly Ile Ser Asn Val Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr 85 90 95 Ala Arg Asp Phe Glu Asn Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Lys Pro 115 <210> 221 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 41BB CDR1 <400> 221 Gly Phe Ser Phe Ser Ile Asn Ala Met Gly 1 5 10 <210> 222 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 41BB CDR2 <400> 222 Ala Ile Glu Ser Gly Arg Asn Thr Val 1 5 <210> 223 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 41BB CDR3 <400> 223 Leu Lys Gly Asn Arg Val Val Ser Pro Ser Val Ala Tyr 1 5 10 <210> 224 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CD3-VH7, VH33 CDR3 <400> 224 His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 225 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CD3-VL2, VL21 CDR3 <400> 225 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val 1 5 <210> 226 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CD3-VL8 CDR3 <400> 226 Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val 1 5 <210> 227 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CD3 VH33 CDR1 <400> 227 Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn 1 5 10 <210> 228 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CD3 VH33 CDR2 <400> 228 Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr 1 5 10 <210> 229 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CD3 VL21 CDR1 <400> 229 Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 1 5 10 <210> 230 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CD3 VL21 CDR2 <400> 230 Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro 1 5

Claims (128)

  1. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트(multispecific polypeptide construct)로서,
    상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 제 1 구성요소 및 CD3-결합 영역을 포함하는 제 2 구성요소를 포함하되,
    상기 CD3 결합 영역은 가변 중쇄 영역(VH) 및 가변 경쇄 영역(VL)을 포함하는 Fv 항체 단편인 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편이고;
    상기 Fc는 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체 Fc이고 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 상기 VH 및 VL은 상기 이종이량체 Fc의 반대측 폴리펩티드에 연결되며;
    상기 제 1 및 제 2 구성요소는 비-절단성 링커(non-cleavable linker)에 의해서 결합되되, 상기 Fc 영역은 상기 CD3-결합 영역에 대해 N-말단에 위치되고;
    상기 제 1 구성요소는 제 1 항원 결합 도메인을 포함하고 상기 제 2 구성요소는 제 2 항원 결합 도메인을 포함하되, 각각의 상기 항원 결합 도메인은 종양관련 항원(tumor associated antigen; TAA)에 결합하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 CD3-결합 영역은 CD3(CD3ε)에 결합하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 제 1 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 컨스트럭트의 상기 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치되고 상기 제 2 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 컨스트럭트의 상기 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치되는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로:
    종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 상기 제 1 항원 결합 도메인;
    상기 면역글로불린 Fc 영역;
    상기 비-절단성 링커;
    상기 CD3 결합 영역이 CD3(CD3ε)에 결합하는 상기 CD3 결합 영역; 및
    종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 상기 제 2 항원 결합 도메인
    을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  5. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트로서,
    상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 제 1 구성요소 및 CD3-결합 영역을 포함하는 제 2 구성요소를 포함하되,
    상기 CD3-결합 영역은 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 포함하는 이황화-안정화된 Fv 항체 단편(dsFv)인 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편이며;
    상기 Fc는 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체 Fc이고 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 상기 VH 및 VL은 상기 이종이량체 Fc의 반대측 폴리펩티드에 연결되고;
    상기 제 1 및 제 2 구성요소는 비-절단성 링커에 의해서 결합((coupling)되되, 상기 Fc 영역은 상기 CD3-결합 영역에 대해 N-말단에 위치되고;
    상기 제 1 및 제 2 구성요소 중의 하나 또는 둘 다는 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는,
    다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  6. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트로서,
    상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 제 1 구성요소 및 CD3-결합 영역을 포함하는 제 2 구성요소를 포함하되,
    상기 CD3-결합 영역은 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 포함하는 Fv 항체 단편인 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편이며;
    상기 Fc는 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체 Fc이고 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 상기 VH 및 VL은 상기 이종이량체 Fc의 반대측 폴리펩티드에 연결되고;
    상기 제 1 및 제 2 구성요소는 비-절단성 링커에 의해서 결합되되, 상기 Fc 영역은 상기 CD3-결합 영역에 대해 N-말단에 위치되고;
    상기 제 1 및 제 2 구성요소 중의 하나 또는 둘 다는 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하되, 상기 항원-결합 도메인은 단일 사슬 항체 단편인,
    다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 단일 사슬 항체 단편은 단일 도메인 항체이거나 또는 단일 사슬 가변 단편(single chain variable fragment; scFv)인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD3-결합 영역은 CD3(CD3ε)에 결합하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  9. 제 5 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로:
    종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 상기 제 1 항원 결합 도메인;
    상기 면역글로불린 Fc 영역;
    상기 비-절단성 링커;
    상기 CD3 결합 영역이 CD3(CD3ε)에 결합하는 상기 CD3 결합 영역; 및
    종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 상기 제 2 항원 결합 도메인
    을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  10. 제 5 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로:
    상기 면역글로불린 Fc 영역;
    상기 비-절단성 링커;
    상기 CD3 결합 영역이 CD3(CD3ε)에 결합하는 상기 CD3 결합 영역; 및
    종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 항원 결합 도메인
    을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  11. 제 5 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 다중특이적 컨스트럭트는 N-말단부터 C-말단까지 순서대로:
    종양-관련 항원(TAA)에 결합하는 상기 항원 결합 도메인;
    상기 면역글로불린 Fc 영역;
    상기 비-절단성 링커; 및
    상기 CD3 결합 영역이 CD3(CD3ε)에 결합하는 상기 CD3 결합 영역
    을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 이종이량체 Fc 영역의 상기 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드 중의 하나 또는 둘 다는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4의 Fc 영역과 비교하여 이종이량체화를 유도하는 적어도 하나의 변형체(modification)를 포함하는 변이체 Fc 폴리펩티드인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 이종이량체 Fc 영역의 상기 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드 중의 하나 또는 둘 다는, 인간 IgG1의 Fc 영역과 비교하여, 선택적으로는 서열번호 1에 제시된 상기 Fc 폴리펩티드 또는 그의 면역학적 활성 단편과 비교하여 이종이량체화를 유도하는 적어도 하나의 변형체를 포함하는 변이체 Fc 폴리펩티드인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    상기 이종이량체 Fc의 상기 Fc 폴리펩티드 각각은 독립적으로 적어도 하나의 아미노산 변형체를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 변형체는 입체 변형체(들)(steric modification(s)), 노브-인투-홀 변형체(들)(knob-into-hole modification(s)), 상기 폴리펩티드의 정전 상보성(electrostatic complementarity)을 증가시키는 전하 돌연변이체(들)(pI 변이체), 상기 등전점를 변경시키는 변형체(들), 또는 그들의 조합으로부터 선택되는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 이종이량체 Fc의 상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 Thr366Ser, Leu368Ala, Tyr407Val, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 변형체를 포함하고 상기 이종이량체 Fc의 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 변형체 T366W을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드는 비-시스테인 잔기에서 시스테인 잔기로의 변형체를 추가로 포함하고, 여기서 상기 제 1 폴리펩티드의 상기 변형체는 Ser354 및 Y349 위치 중의 하나이고 상기 제 2 Fc 폴리펩티드의 상기 변형체는 Ser354 및 Y349 위치 중의 다른 하나인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 상기 변형체 T366W/S354C을 포함하고 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 상기 변형체 T366S/L368A/Y407V/Y349C을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  19. 제 1 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 Fc 폴리펩티드는 상기 변형체 L368D/K370S를 포함하고 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 상기 변형체 S364K/E357Q를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  20. 제 1 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드 중의 적어도 하나는 상기 변형체 Q295E/N384D/Q418E/N421D를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 이종이량체 Fc의 상기 제 1 또는 제 2 Fc 폴리펩티드 중의 하나는 잔기 Ile253에서 변형체를 더 포함하되, 선택적으로 상기 변형체는 Ile253Arg이고/이거나; 상기 이종이량체 Fc의 상기 제 1 또는 제 2 Fc 폴리펩티드 중의 하나는 잔기 His435에서 변형체를 더 포함하고, 선택적으로 상기 변형체는 His35Arg인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 또는 제 2 Fc 폴리펩티드 중의 하나 또는 둘 다는 Lys447가 없는 폴리펩티드를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 이종이량체 Fc의 상기 제 1 폴리펩티드는 서열번호 82, 86 또는 201 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함하고, 상기 이종이량체 Fc의 상기 제 2 폴리펩티드는 서열번호 83, 87, 90, 92, 202 또는 205 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 Fc 폴리펩티드 및 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 각각 서열번호 82 및 83; 각각 서열번호 86 및 87; 각각 서열번호 201 및 202; 각각 서열번호 82 및 90; 각각 서열번호 86 및 92; 및 각각 서열번호 201 및 205로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  25. 제 1 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 FcRn 결합을 증강시키는 적어도 하나의 변형체를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 변형체는 Met252Y, Ser254T, Thr256E, Met428L, Met428V, Asn434S, 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 있는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서,
    상기 변형체는 Met252Y 및 Met428L이거나 또는 Met252Y 및 Met428V인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  28. 제 1 항 내지 제 22 항 및 제 25 항 내지 제 27 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 이종이량체 Fc의 상기 제 1 폴리펩티드는 서열번호 94, 96 또는 207 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함하고, 상기 이종이량체 Fc의 상기 제 2 폴리펩티드는 서열번호 98, 100, 또는 209 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 Fc 폴리펩티드 및 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 각각 서열번호 94 및 98; 각각 서열번호 96 및 100; 및 각각 서열번호 207 및 209로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  30. 제 1 항 내지 제 22 항 및 제 25 항 내지 제 27 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 효과기 기능을 감소시키고/시키거나 Fc 감마 수용체 또는 C1q로부터 선택되는 효과기 분자에 대한 결합을 감소시키는 적어도 하나의 아미노산 변형체를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  31. 제 30 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 아미노산 변형체는 Glu233, Leu234 또는 Leu235 중 하나 이상의 결실인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  32. 제 1 항 내지 제 22 항, 제 25 항 내지 제 27 항, 제 30 항 및 제 31 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 이종이량체 Fc의 상기 제 1 폴리펩티드는 서열번호 84, 88, 95, 97, 203 또는 208 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함하고 상기 이종이량체 Fc의 상기 제 2 폴리펩티드는 서열번호 85, 89, 91, 93, 99, 101, 204, 206 또는 210 중의 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  33. 제 1 항 내지 제 22 항, 제 25 항 내지 제 27 항 및 제 30 항 내지 제 32 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 Fc 폴리펩티드 및 상기 제 2 Fc 폴리펩티드는 각각 서열번호 84 및 85; 각각 서열번호 88 및 89; 각각 서열번호 203 및 204; 각각 서열번호 95 및 99; 각각 서열번호 97 및 101; 각각 서열번호 208 및 210; 각각 서열번호 84 및 91; 각각 서열번호 88 및 93; 및 각각 서열번호 203 및 206으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  34. 제 1 항 내지 제 33 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD3 결합 영역은, 상기 항원 결합 도메인 중의 적어도 하나가 그의 TAA에 결합하지 않는 한, CD3에 결합 또는 관여할 수 없거나, 또는 실질적으로 결합 또는 관여할 수 없는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  35. 제 1 항 내지 제 33 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD3 결합 영역은, 상기 항원 결합 도메인 중의 적어도 2개가 그의 TAA에 결합하지 않는 한, CD3에 결합 또는 관여할 수 없거나, 또는 실질적으로 결합 또는 관여할 수 없는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  36. 제 1 항 내지 제 35 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 링커는 폴리펩티드 링커인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  37. 제 36 항에 있어서,
    상기 링커는 최대 25개의 아미노산 길이의 폴리펩티드인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  38. 제 36 항 또는 제 37 항에 있어서,
    상기 링커는 (약) 2개 내지 24개의 아미노산, 2개 내지 20개의 아미노산, 2개 내지 18개의 아미노산, 2개 내지 14개의 아미노산, 2개 내지 12개의 아미노산, 2개 내지 10개의 아미노산, 2개 내지 8개의 아미노산, 2개 내지 6개의 아미노산, 6개 내지 24개의 아미노산, 6개 내지 20개의 아미노산, 6개 내지 18개의 아미노산, 6개 내지 14개의 아미노산, 6개 내지 12개의 아미노산, 6개 내지 10개의 아미노산, 6개 내지 8개의 아미노산, 8개 내지 24개의 아미노산, 8개 내지 20개의 아미노산, 8개 내지 18개의 아미노산, 8개 내지 14개의 아미노산, 8개 내지 12개의 아미노산, 8개 내지 10개의 아미노산, 10개 내지 24개의 아미노산, 10개 내지 20개의 아미노산, 10개 내지 18개의 아미노산, 10개 내지 14개의 아미노산, 10개 내지 12개의 아미노산, 12개 내지 24개의 아미노산, 12개 내지 20개의 아미노산, 12개 내지 18개의 아미노산, 12개 내지 14개의 아미노산, 14개 내지 24개의 아미노산, 14개 내지 20개의 아미노산, 14개 내지 18개의 아미노산, 18개 내지 24개의 아미노산, 18개 내지 20개의 아미노산 또는 20개 내지 24개의 아미노산의 폴리펩티드인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  39. 제 36 항 내지 제 38 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 링커는 길이가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산인 폴리펩티드인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  40. 제 36 항 내지 제 39 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 링커는 길이가 3개 내지 18개의 아미노산인 폴리펩티드인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  41. 제 36 항 내지 제 40 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 링커는 길이가 12개 내지 18개의 아미노산인 폴리펩티드인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  42. 제 36 항 내지 제 40 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 링커는 길이가 15개 내지 18개의 아미노산인 폴리펩티드인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  43. 제 1 항 내지 제 42 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-절단성 링커는 GS, GGS, GGGGS(서열번호 149), GGGGGS(서열번호 135) 및 그들의 조합을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  44. 제 1 항 내지 제 43 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-절단성 링커는 (GGS)n을 포함하되, n은 1 내지 10인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  45. 제 1 항 내지 제 44 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-절단성 링커는 (GGGGS)n(서열번호 173)을 포함하되, n은 1 내지 10인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  46. 제 1 항 내지 제 44 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-절단성 링커는 (GGGGGS)n(서열번호 172)을 포함하되, n은 1 내지 4인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  47. 제 1 항 내지 제 44 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-절단성 링커는 GGS이거나 또는 그를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  48. 제 1 항 내지 제 43 항 및 제 45 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-절단성 링커는 GGGGS(서열번호 149)이거나 또는 그를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  49. 제 1 항 내지 제 43 항 및 제 46 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-절단성 링커는 GGGGGS(서열번호 135)이거나 또는 그를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  50. 제 1 항 내지 제 44 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-절단성 링커는 (GGS)2(서열번호 10)이거나 또는 그를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  51. 제 1 항 내지 제 44 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-절단성 링커는 GGSGGSGGS(서열번호 11)이거나 또는 그를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  52. 제 1 항 내지 제 44 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-절단성 링커는 GGSGGSGGSGGS(서열번호 12)이거나 또는 그를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  53. 제 1 항 내지 제 44 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-절단성 링커는 GGSGGSGGSGGSGGS(서열번호 13)이거나 또는 그를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  54. 제 1 항 내지 제 43 항 및 제 46 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-절단성 링커는 GGGGGSGGGGGSGGGGGS(서열번호 119)이거나 또는 그를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  55. 제 1 항 내지 제 49 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-절단성 링커는 GGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 147)이거나 또는 그를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  56. 제 1 항 내지 제 43 항 및 제 45 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-절단성 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 170)이거나 또는 그를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  57. 제 1 항 내지 제 56 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 적어도 (i) 상기 이종이량체 Fc 영역의 상기 제 1 Fc 폴리펩티드, 상기 링커 및 상기 항-CD3 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 상기 VH 도메인을 포함하는 제 1 폴리펩티드; 및 (ii) 상기 이종이량체 Fc 영역의 상기 제 2 Fc 폴리펩티드, 상기 링커 및 상기 항-CD3 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 상기 VL 도메인을 포함하는 제 2 폴리펩티드를 포함하되, 상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드 중의 하나 또는 둘 다는 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 적어도 하나의 항원-결합 도메인을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  58. 제 1 항 내지 제 57 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편의 상기 VH는 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 상기 적어도 하나의 항원-결합 도메인과 동일한 폴리펩티드 상에 있는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  59. 제 58 항에 있어서,
    상기 항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편의 상기 VL을 포함하는 상기 폴리펩티드는 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 상기 적어도 하나의 항원-결합 도메인을 포함하지 않는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  60. 제 1 항 내지 제 4 항, 제 9 항 및 제 12 항 내지 제 59 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 상기 TAA에 대한 2가, 3가, 또는 4가 결합을 나타내는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  61. 제 5 항 내지 제 8 항 및 제 10 항 내지 제 59 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 상기 TAA에 대한 1가, 2가, 3가 또는 4가 결합을 나타내는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  62. 제 1 항 내지 제 61 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드 중의 하나만이 TAA에 결합하는 상기 적어도 하나의 항원-결합 도메인을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  63. 제 1 항 내지 제 62 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 상기 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치하고/하거나 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 상기 제 1 또는 제 2 폴리펩티드 중의 하나의 상기 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  64. 제 1 항 내지 제 62 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 컨스트럭트의 상기 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치하고 상기 제 2 항원 결합 도메인은 상기 다중특이적 컨스트럭트의 상기 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  65. 제 1 항 내지 제 64 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인, 또는 상기 항원 결합 도메인들의 독립적으로 각각은 상기 TAA의 상기 자연의 동족(native cognate) 결합 파트너의 세포외 도메인 또는 그의 결합 단편, 또는 상기 TAA에 대한 결합 활성을 나타내는 그의 변이체를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  66. 제 1 항 내지 제 5 항 및 제 8 항 내지 제 65 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인, 또는 상기 항원 결합 도메인들의 독립적으로 각각은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체, 및 단일 도메인 경쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  67. 제 66 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Fv, scFv, Fab, 또는 단일 도메인 항체(sdAb)인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  68. 제 1 항 내지 제 67 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 sdAb인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  69. 제 68 항에 있어서,
    상기 sdAb는 인간 또는 인간화 sdAb인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  70. 제 68 항 또는 제 69 항에 있어서,
    상기 sdAb는 VHH, VNAR, 조작된 VH 도메인 또는 조작된 VK 도메인인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  71. 제 1 항 내지 제 67 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 scFv인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  72. 제 1 항 내지 제 5 항 및 제 8 항 내지 제 67 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Fab인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  73. 제 72 항에 있어서,
    상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는,
    (i) 상기 이종이량체 Fc 영역의 상기 제 1 Fc 폴리펩티드, 상기 링커 및 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 상기 VH 도메인을 포함하는 제 1 폴리펩티드;
    (ii) 상기 이종이량체 Fc 영역의 상기 제 2 Fc 폴리펩티드, 상기 링커 및 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 상기 VL 도메인을 포함하는 제 2 폴리펩티드, 및
    (iii) 종양-관련 항원에 결합하는 Fab 항체 단편의 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL을 포함하는 제 3 폴리펩티드를 포함하되,
    상기 제 1 및/또는 제 2 폴리펩티드는 상기 Fab 항체 단편의 상기 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL 중의 다른 하나를 더 포함하는,
    다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  74. 제 73 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드 중의 하나만이 상기 Fab 항체 단편의 상기 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL 중의 다른 하나를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  75. 제 73 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드 둘 다는 상기 Fab 항체 단편의 상기 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL 중의 다른 하나를 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  76. 제 74 항 또는 제 75 항에 있어서,
    상기 Fab 항체 단편의 상기 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL 중의 다른 하나는 상기 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단에 위치하고/하거나 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드 중의 하나의 상기 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  77. 제 74 항 내지 제 76 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fab 항체 단편의 상기 VH-CH1(Fd) 또는 VL-CL 중의 다른 하나는 상기 제 1 폴리펩티드 또는 제 2 폴리펩티드의 상기 Fc 영역에 대해 상대적으로 아미노-말단 및 상기 제 1 또는 제 2 폴리펩티드 중의 다른 하나의 상기 CD3 결합 영역에 대해 상대적으로 카복시-말단에 위치하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  78. 제 1 항 내지 제 77 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인 또는 상기 항원 결합 도메인들의 독립적으로 각각은 1-92-LFA-3, 5T4, 알파-4 인테그린, 알파-V 인테그린, 알파4베타1 인테그린, 알파4베타7 인테그린, AGR2, 항-루이스-Y, 아펠린 J 수용체, APRIL, B7-H3, B7-H4, BAFF, BTLA, C5 보체, C-242, CA9, CA19-9, (루이스 a), 탄산무수화효소 9, CD2, CD3, CD6, CD9, CD11a, CD19, CD20, CD22, CD24, CD25, CD27, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD41, CD44, CD44v6, CD47, CD51, CD52, CD56, CD64, CD70, CD71, CD74, CD80, CD81, CD86, CD95, CD117, CD123, CD125, CD132, (IL-2RG), CD133, CD137, CD138, CD166, CD172A, CD248, CDH6, CEACAM5(CEA), CEACAM6(NCA-90), CLAUDIN-3, CLAUDIN-4, cMet, 콜라겐, 크립토(Cripto), CSFR, CSFR-1, CTLA-4, CTGF, CXCL10, CXCL13, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CYR61, DL44, DLK1, DLL3, DLL4, DPP-4, DSG1, EDA, EDB, EGFR, EGFRviii, 엔도텔린 B 수용체(ETBR), ENPP3, EpCAM, EPHA2, EPHB2, ERBB3, RSV의 단백질 F, FAP, FGF-2, FGF8, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FLT-3, 엽산 수용체 알파(FRα), GAL3ST1, G-CSF, G-CSFR, GD2, GITR, GLUT1, GLUT4, GM-CSF, GM-CSFR, GP IIb/IIIa 수용체, Gp130, GPIIB/IIIA, GPNMB, GRP78, HER2/neu, HER3, HER4, HGF, hGH, HVEM, 히알루로니다아제, ICOS, IFN알파, IFN베타, IFN감마, IgE, IgE 수용체(FceRI), IGF, IGF1R, IL1B, IL1R, IL2, IL11, IL12, IL12p40, IL-12R, IL-12R베타1, IL13, IL13R, IL15, IL17, IL18, IL21, IL23, IL23R, IL27/IL27R(wsx1), IL29, IL-31R, IL31/IL31R, IL2R, IL4, IL4R, IL6, IL6R, 인슐린 수용체, 재기드 리간드(Jagged Ligands), 재기드 1, 재기드 2, KISS1-R, LAG-3, LIF-R, 루이스 X, LIGHT, LRP4, LRRC26, Ly6G6D, LyPD1, MCSP, 메소텔린, MRP4, MUC1, 뮤신-16(MUC16, CA-125), Na/K ATPase, NGF, 니카스트린, 노치(Notch) 수용체, 노치 1, 노치 2, 노치 3, 노치 4, NOV, OSM-R, OX-40, PAR2, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGFR알파, PDGFR베타, PD-1, PD-L1, PD-L2, 포스파티딜-세린, P1GF, PSCA, PSMA, PSGR, RAAG12, RAGE, SLC44A4, 스핑고신 1 포스페이트, STEAP1, STEAP2, TAG-72, TAPA1, TEM-8, TGF베타, TIGIT, TIM-3, TLR2, TLR4, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TMEM31, TNF알파, TNFR, TNFRS12A, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체, TRK-A, TRK-B, uPAR, VAP1, VCAM-1, VEGF, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, VISTA, WISP-1, WISP-2, 및 WISP-3 중에서 선택된 종양 항원에 결합하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  79. 제 1 항 내지 제 78 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 적어도 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인을 포함하되, 상기 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인은 동일한 TAA에 결합하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  80. 제 79 항에 있어서,
    상기 제 1 항원 결합 도메인 및 상기 제 2 항원 결합 도메인은 동일한 TAA의 상이한 에피토프에 결합하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  81. 제 79 항에 있어서,
    상기 제 1 항원 결합 도메인 및 상기 제 2 항원 결합 도메인은 동일한 TAA의 동일한 에피토프에 결합하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  82. 제 1 항 내지 제 78 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 적어도 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인을 포함하되, 상기 제 1 항원 결합 도메인 및 상기 제 2 항원 결합 도메인은 상이한 TAA에 결합하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  83. 제 1 항 내지 제 82 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 아미노산 서열 GFTFNTYAMN(서열번호 211)을 포함하는 VH CDR1; 아미노산 서열 RIRSKYNNYATy(서열번호 212)을 포함하는 VH CD2; 아미노산 서열 HGNFGNSYVSWFAY (서열번호 18)를 포함하는 VH CDR3, 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN (서열번호 19)을 포함하는 VL CDR1; 아미노산 서열 GTNKRAP (서열번호 20)를 포함하는 VL CDR2; 및 아미노산 서열 ALWYSNLWV (서열번호 21)를 포함하는 VL CDR3을 포함하거나, 또는
    상기 항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편은, 적어도 아미노산 서열 GFTFNTYAMN(서열번호　211)을 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 RIRSKYNNYATy(서열번호　212)을 포함하는 VH CDR2 서열; 적어도 아미노산 서열 HGNFGNSYVSWFAy(서열번호　18)을 포함하는 VH CDR3 서열, 적어도 아미노산 서열 GSSTGAVTTSNYAN(서열번호　229)을 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호　230)을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 적어도 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호　225)을 포함하는 VL CDR3 서열을 포함하는,
    다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  84. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 6 항 내지 제 83 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-CD3 Fv는,
    서열번호 14, 32-43, 45-47, 48, 196 및 211 중의 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 14, 32-43, 45-47, 48, 196 및 211 중의 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 갖는 VH; 및
    서열번호 15, 63, 65-71, 73, 75, 77 및 199 중의 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 15, 63, 65-71, 73, 75, 77 및 199 중의 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 갖는 VL
    을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  85. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 6 항 내지 제 84 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-CD3 dsFv는 서열번호 14의 아미노산 서열 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  86. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 6 항 내지 제 84 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-CD3 Fv는 서열번호 196의 아미노산 서열 및 서열번호 199의 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  87. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 6 항 내지 제 83 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fv 항체 단편은 이황화 안정화된 항-CD3 결합 Fv 단편(dsFv)을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  88. 제 5 항 또는 제 87 항에 있어서,
    상기 이황화 안정화된 항-CD3 결합 Fv 단편(dsFv)은, 카밧 번호매김(Kabat numbering)에 의해서, 상기 돌연변이체 G44C를 갖는 VH 사슬 및 상기 돌연변이체 G100C를 갖는 VL 사슬을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  89. 제 5 항, 제 87 항 및 제 88 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-CD3 Fv는,
    서열번호 44, 49 내지 62, 197 및 198 중의 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 44, 49 내지 62, 197 및 198 중의 어느 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 서열을 갖는 VH; 및
    서열번호 64, 72, 74, 76, 78-81, 191, 200 및 212 중의 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 64, 72, 74, 76, 78-81, 191, 200 및 212 중의 어느 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 서열을 갖는 VL
    을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  90. 제 5 항 및 제 87 항 내지 제 89 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-CD3 dsFv는 서열번호 44의 아미노산 서열 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  91. 제 5 항 및 제 87 항 내지 제 89 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-CD3 dsFv는 서열번호 198의 아미노산 서열 및 서열번호 200의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열번호 197의 아미노산 서열 및 서열번호 200의 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  92. 제 1 항 내지 제 91 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 제제에 콘쥬게이트되는(conjugated), 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  93. 제 92 항에 있어서,
    상기 제제는 치료제, 항종양제(antineoplastic agent), 독소 또는 그의 단편, 검출가능한 모이어티(detectable moiety) 또는 진단제인, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  94. 제 93 항에 있어서,
    상기 제제는 링커를 통해 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트에 콘쥬게이트되는, 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  95. 제 1 항 내지 제 94 항 중의 어느 한 항의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들).
  96. 제 1 항 내지 제 94 항 중의 어느 한 항의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 중의 하나의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  97. 제 1 항 내지 제 94 항 중의 어느 한 항의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 제 1 핵산 서열 및 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트의 제 2 폴리펩티드를 코딩하는 제 2 핵산 서열을 포함하되, 상기 제 1 및 제 2 핵산 서열은 내부 리보솜 도입 부위(IRES), 또는 자가-절단 펩티드 또는 리보솜 스킵핑(skipping)을 초래하는 펩티드를 코딩하는 핵산에 의해 분리되는, 폴리뉴클레오티드.
  98. 제 97 항에 있어서,
    상기 제 1 핵산 서열 및 제 2 핵산 서열은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
  99. 제 97 항 또는 제 98 항에 있어서,
    상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 제 3 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 다중특이적 컨스트럭트의 상기 제 3 폴리펩티드를 코딩하는 제 3 핵산을 더 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  100. 제 99 항에 있어서,
    상기 제 3 핵산은 내부 리보솜 도입 부위(IRES), 또는 자가-절단 펩티드 또는 리보솜 스킵핑을 초래하는 펩티드를 코딩하는 핵산에 의해 상기 제 1 및/또는 제 2 폴리펩티드로부터 분리되고/되거나 상기 제 3 핵산 서열은 상기 제 1 및/또는 제 2 핵산 서열과 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
  101. 제 97 항 내지 제 100 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    자가-절단 펩티드 또는 리보솜 스킵핑을 초래하는 펩티드를 코딩하는 상기 핵산은 T2A, P2A, E2A 또는 F2A로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드.
  102. 제 95 항 내지 제 101 항 중의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  103. 제 102 항에 있어서,
    발현 벡터인 벡터.
  104. 제 102 항 또는 제 103 항에 있어서,
    바이러스 벡터 또는 진핵생물 벡터이며, 선택적으로 상기 진핵생물 벡터는 포유동물 벡터인, 벡터.
  105. 제 95 항 내지 제 101 항 중의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들, 또는 제 102 항 내지 제 104 항 중의 어느 한 항의 벡터 또는 벡터들을 포함하는, 세포.
  106. 제 105 항에 있어서,
    상기 세포는 재조합 또는 분리된 것인, 세포.
  107. 제 105 항 또는 제 106 항에 있어서,
    상기 세포는 포유동물 세포인, 세포.
  108. 제 107 항에 있어서,
    상기 세포는 HEK293 또는 CHO 세포인, 세포.
  109. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 제조하는 방법으로서,
    제 95 항 내지 제 101 항 중의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들 또는 제 102 항 내지 제 104 항 중의 어느 한 항의 벡터 또는 벡터들을 세포에 도입하는 단계 및 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 제조하기 위한 조건 하에 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는,
    방법.
  110. 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 제조하는 방법으로서,
    제 105 항 내지 제 108 항 중의 어느 한 항의 세포를 다중특이적 폴리펩티드가 상기 세포에 의해 생산되는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는,
    방법.
  111. 제 109 항 또는 제 110 항에 있어서,
    상기 세포로부터 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트를 분리 또는 정제하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  112. 제 109 항 내지 제 111 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트는 이종이량체인, 방법.
  113. 제 109 항 내지 제 112 항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트.
  114. 제 1 항 내지 제 94 항 또는 제 113 항 중의 어느 한 항의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  115. 제 114 항에 있어서,
    멸균된 약학 조성물.
  116. 면역 반응을 자극 또는 유도하는 방법으로서,
    표적 세포와 T 세포를 제 1 항 내지 제 94 항 또는 제 113 항 중의 어느 한 항의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 또는 제 114 항 또는 제 115 항의 약학 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고,
    상기 표적 세포는 상기 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트에 의해 인식되는 종양 관련 항원을 발현하는,
    방법.
  117. 제 116 항에 있어서,
    상기 표적 세포는 상기 종양 관련 항원(TAA)을 발현하는 종양 세포인, 방법.
  118. 제 116 항 또는 제 117 항에 있어서,
    상기 접촉은 탈체(ex vivo) 또는 생체 외(in vitro)에서 수행되는, 방법.
  119. 제 116 항 내지 제 118 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉은 대상체의 생체 내(in vivo)에서 수행되는, 방법.
  120. 대상체 내에서 면역 반응을 자극 또는 유도하는 방법으로서,
    제 1 항 내지 제 94 항 또는 제 113 항 중의 어느 한 항의 다중특이적 폴리펩티드 컨스트럭트 또는 제 114 항 또는 제 115 항의 약학 조성물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는,
    방법.
  121. 제 116 항 내지 제 120 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    세포-매개 면역을 증가시키는, 방법.
  122. 제 116 항 내지 제 121 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    T-세포 활성을 증가시키는, 방법.
  123. 제 116 항 내지 제 122 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    세포 용해성 T-세포(CTL) 활성을 증가시키는, 방법.
  124. 제 116 항 내지 제 123 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 반응은 종양 또는 암에 대해 증가하는, 방법.
  125. 제 116 항 내지 제 124 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 대상체의 질병 또는 병태를 치료하는, 방법.
  126. 대상체의 질병 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
    제 1 항 내지 제 94 항 또는 제 113 항 중의 어느 한 항의 다중특이적 콘쥬게이트 또는 제 114 항 또는 제 115 항의 약학 조성물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는,
    방법.
  127. 제 125 항 또는 제 126 항에 있어서,
    상기 질병 또는 병태는 종양 또는 암인, 방법.
  128. 제 119 항 내지 제 127 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 인간인, 방법.






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