CN112218686A - 具有受限cd3结合的多特异性多肽构建体以及相关方法和用途 - Google Patents

具有受限cd3结合的多特异性多肽构建体以及相关方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明总体上涉及具有受限CD3结合的多特异性多肽。在一些实施方案中，所述多特异性多肽的组分通过不可切割接头连接。还提供了制备这些多特异性多肽和在多种治疗性、诊断性和预防性适应症中使用这些多特异性多肽的方法。

Description

具有受限CD3结合的多特异性多肽构建体以及相关方法和 用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年4月11日提交的标题为“具有受限CD3结合的多特异性多肽构建体以及相关方法和用途(MULTISPECIFIC POLYPEPTID E CONSTRUCTS HAVING CONSTRAINEDCD3 BINDING AND RELA TED METHODS AND USES)”的美国临时申请62/656,331的优先权，出于所有目的将所述临时申请的内容通过引用以其整体并入。
通过引用并入序列表
本申请是与电子格式的序列表一起提交的。序列表以2019年4月10日创建、大小为212千字节的名为744952000240SeqList.TXT的文件提供。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
本发明总体上涉及具有受限CD3结合的多特异性多肽。在一些实施方案中，所述多特异性多肽的组分通过不可切割接头连接。还提供了制备这些多特异性多肽和在多种治疗性、诊断性和预防性适应症中使用这些多特异性多肽的方法。
背景技术
导致靶细胞耗尽的治疗性抗体通常依赖于经由与Fc-γ受体(FcγR)和补体蛋白相互作用介导的效应子功能。表达FcγR的效应细胞主要是先天免疫系统的那些。T细胞不是参与抗体介导的靶细胞耗尽的直接效应细胞。
CD3(分化簇3)T细胞共受体是一种多聚体蛋白，其由四条不同的多肽链(称为ε、γ、δ和ζ链)构成。CD3复合物充当T细胞受体的与T细胞受体(TCR)的抗原结合a/b链非共价缔合的信号传导模块。
由于CD3的直接接合导致T细胞激活，因此它是多种治疗性和/或诊断性适应症的理想靶标。因此，需要靶向CD3/TCR途径的抗体和治疗剂。
发明内容
本公开文本提供了展现出受限CD3结合的多特异性多肽构建体。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体由包含免疫球蛋白Fc区的第一组分和包含CD3结合区的第二组分构成，其中所述第一组分和所述第二组分通过接头如不可切割接头偶联，其中所述Fc区位于所述CD3结合区的N末端；并且所述第一组分和所述第二组分中的一种或两种包含结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域位于相对于所述多特异性多肽构建体的Fc区的氨基末端和/或位于相对于所述多特异性多肽构建体的CD3结合区的羧基末端。在一些实施方案中，所述第一组分包含第一抗原结合结构域，并且所述第二组分包含第二抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域中的每一个结合肿瘤相关抗原(TAA)。在一些情况下，所述第一抗原结合结构域位于所述多特异性构建体的氨基末端，并且所述第二抗原结合结构域位于所述多特异性构建体的羧基末端。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域位于相对于所述多特异性多肽构建体的Fc区的氨基末端和/或位于相对于所述多特异性多肽构建体的CD3结合区的羧基末端。在所提供的多特异性多肽构建体的特定实施方案中，至少一个抗原结合结构域位于相对于所述多特异性多肽构建体的CD3结合区的羧基末端。
本文提供了多特异性多肽构建体，其中所述多特异性构建体从N末端到C末端按顺序包含：结合肿瘤相关抗原(TAA)的第一抗原结合结构域；免疫球蛋白Fc区；接头，如不可切割接头；结合CD3(CD3ε)的CD3结合区；和结合肿瘤相关抗原(TAA)的第二抗原结合结构域。还提供了多特异性多肽构建体，其中所述多特异性构建体从N末端到C末端按顺序包含：免疫球蛋白Fc区；接头，如不可切割接头；结合CD3(CD3ε)的CD3结合区；和结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。提供了多特异性多肽构建体，其中所述多特异性构建体从N末端到C末端按顺序包含：结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域；免疫球蛋白Fc区；接头，如不可切割接头；和结合CD3(CD3ε)的CD3结合区。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述接头是不可切割接头。在一些实施方案中，所述接头是不含有特异于由蛋白酶切割的底物识别位点的接头。
在任何所提供的实施方案中的一些中，使所述Fc区位于所述CD3结合区的N末端降低或防止了所述CD3结合区结合CD3的能力。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体的第一组分(1号组分)和第二组分(2号组分)被连接并且不允许结合至CD3，除非所述一个或多个抗原结合结构域与其同源抗原结合。在一些实施方案中，1号组分含有至少一个抗原结合结构域和Fc区。在一些实施方案中，2号组分至少含有CD3结合区结构域和抗原结合结构域，其中的前者能够结合CD3(当所述多特异性构建体与由1号组分或2号组分的一个或多个抗原结合结构域识别的抗原结合时)。因此，如所描述的，所述CD3结合区与所述Fc区的连接确保了所述多特异性多肽构建体不结合或以其他方式接合CD3，除非所述一个或多个抗原结合结构域与其同源抗原结合。这是有利的，因为这防止所述CD3结合区与T细胞的系统性结合，而是使得集中于所述CD3结合区结合至抗原表达的位点的能力。这是有益的，因为它减少或消除了外周T细胞的主要结合槽，潜在地允许在抗原表达位点(例如肿瘤细胞或肿瘤微环境)更有利的分布和定位。
当一个或多个抗原结合结构域与其同源抗原结合时，所述多特异性多肽构建体经由2号组分能够在抗原表达细胞与T细胞之间形成免疫突触。此共接合介导了抗原依赖性T细胞激活、细胞毒性、细胞因子释放、脱粒和增殖。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体能够与FcγR相互作用并介导先天免疫效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体能够与补体蛋白即C1q相互作用，并介导补体依赖性细胞毒性。
在一些实施方案中，由所提供的多特异性多肽构建体的一个或多个抗原结合结构域识别的同源抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。
因此，在所提供的实施方案中，所述多特异性多肽构建体由包含免疫球蛋白Fc区的第一组分和包含CD3结合区的第二组分构成，其中所述第一组分和所述第二组分通过接头如不可切割接头偶联，其中所述Fc区位于所述CD3结合区的N末端；并且所述第一组分和所述第二组分中的一种或两种包含结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域位于相对于所述多特异性多肽构建体的Fc区的氨基末端和/或位于相对于所述多特异性多肽构建体的CD3结合区的羧基末端。在一些实施方案中，所述第一组分包含第一抗原结合结构域，并且所述第二组分包含第二抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域中的每一个结合肿瘤相关抗原(TAA)。在一些情况下，所述第一抗原结合结构域位于所述多特异性构建体的氨基末端，并且所述第二抗原结合结构域位于所述多特异性构建体的羧基末端。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域位于相对于所述多特异性多肽构建体的Fc区的氨基末端和/或位于相对于所述多特异性多肽构建体的CD3结合区的羧基末端。在所提供的多特异性多肽构建体的特定实施方案中，至少一个抗原结合结构域位于相对于所述多特异性多肽构建体的CD3结合区的羧基末端。
在一些实施方案中，所述CD3结合区是抗体或抗原结合片段。在特定实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是含有可变重链(VH)和可变轻链(VL)的两链多肽。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是Fv。在特定实施方案中，所述Fv是在VH链与VL链之间含有链间二硫键的二硫化物稳定的Fv(dsFv)。
本文提供了多特异性多肽构建体，其包含含有免疫球蛋白Fc区的第一组分和含有CD3结合区的第二组分，其中所述CD3结合区是抗CD3抗体或抗原结合片段，所述抗CD3抗体或抗原结合片段是包含可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)的Fv抗体片段；所述Fc是包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚体Fc，并且所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH和VL连接至所述异二聚体Fc的相对多肽；所述第一组分和所述第二组分通过不可切割接头偶联，其中所述Fc区位于所述CD3结合区的N末端，并且所述第一组分包含第一抗原结合结构域，并且所述第二组分包含第二抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域中的每一个结合肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方案中，所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域位于相对于所述多特异性构建体的Fc区的氨基末端，并且所述第二抗原结合结构域位于相对于所述多特异性构建体的CD3结合区的羧基末端。在一些实施方案中，所述多特异性构建体从N末端到C末端按顺序包含：结合肿瘤相关抗原(TAA)的第一抗原结合结构域；免疫球蛋白Fc区；不可切割接头；CD3结合区，其中所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)；和结合肿瘤相关抗原(TAA)的第二抗原结合结构域。
本文提供了多特异性多肽构建体，其包含含有免疫球蛋白Fc区的第一组分和含有CD3结合区的第二组分，其中：所述CD3结合区是抗CD3抗体或抗原结合片段，所述抗CD3抗体或抗原结合片段是含有可变重链(VH)和可变轻链(VL)的二硫化物稳定的Fv抗体片段(dsFv)；所述Fc是包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚体Fc，并且所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH和VL连接至所述异二聚体Fc的相对多肽；所述第一组分和所述第二组分通过不可切割接头偶联，其中所述Fc区位于所述CD3结合区的N末端；并且所述第一组分和所述第二组分中的一种或两种包含结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。在所提供的多特异性多肽构建体的特定实施方案中，至少一个抗原结合结构域位于相对于所述多特异性多肽构建体的CD3结合区的羧基末端。在一些实施方案中，所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)。
本文提供了多特异性多肽构建体，其包含含有免疫球蛋白Fc区的第一组分和含有CD3结合区的第二组分，其中：所述CD3结合区是抗CD3抗体或抗原结合片段，所述抗CD3抗体或抗原结合片段是含有可变重链(VH)和可变轻链(VL)的Fv抗体片段；所述Fc是包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚体Fc，并且所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH和VL连接至所述异二聚体Fc的相对多肽；所述第一组分和所述第二组分通过不可切割接头偶联，其中所述Fc区位于所述CD3结合区的N末端；并且所述第一组分和所述第二组分中的一种或两种包含结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域是单链抗体片段，如sdAb或scFv。在所提供的多特异性多肽构建体的特定实施方案中，至少一个抗原结合结构域位于相对于所述多特异性多肽构建体的CD3结合区的羧基末端。在一些实施方案中，所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)。
在本文提供的实施方案中，所述多特异性构建体从N末端到C末端按顺序包含：结合肿瘤相关抗原(TAA)的第一抗原结合结构域；免疫球蛋白Fc区；不可切割接头；CD3结合区，其中所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)；和结合肿瘤相关抗原(TAA)的第二抗原结合结构域。
在本文提供的实施方案中，所述多特异性构建体从N末端到C末端按顺序包含：免疫球蛋白Fc区；不可切割接头；CD3结合区，其中所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)；和结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。
在本文提供的实施方案中，所述多特异性构建体从N末端到C末端按顺序包含：结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域；免疫球蛋白Fc区；不可切割接头；和CD3结合区，其中所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)。
本文提供了多特异性多肽构建体，其中所述多特异性构建体从N末端到C末端按顺序包含：结合肿瘤相关抗原(TAA)的第一抗原结合结构域；免疫球蛋白Fc区；接头，如不可切割接头；结合CD3(CD3ε)的CD3结合区；和结合肿瘤相关抗原(TAA)的第二抗原结合结构域。还提供了多特异性多肽构建体，其中所述多特异性构建体从N末端到C末端按顺序包含：免疫球蛋白Fc区；接头，如不可切割接头；结合CD3(CD3ε)的CD3结合区；和结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。提供了多特异性多肽构建体，其中所述多特异性构建体从N末端到C末端按顺序包含：结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域；免疫球蛋白Fc区；接头，如不可切割接头；和结合CD3(CD3ε)的CD3结合区。
在一些方面，所述抗原结合结构域、或独立地所述抗原结合结构域中的每一个选自抗体或抗原结合片段、天然同源结合配偶体、抗运载蛋白(Anticalin)(工程化脂质运载蛋白)、Darpin、Fynomer、Centyrin(工程化纤连蛋白III结构域)、半胱氨酸-杵结构域、Affilin、亲和体(Affibody)、或工程化CH3结构域。在一些实施方案中，所述天然同源结合配偶体包含所述TAA的天然同源结合配偶体的细胞外结构域或其结合片段，或其展现出与所述TAA的结合活性的变体。
在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域包括抗体或其抗原结合片段的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域包括选自以下的抗体或其抗原结合片段的一个或多个拷贝：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体、和单结构域轻链抗体。在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域包括一个或多个单结构域抗体(sdAb)片段(例如VHH、VNAR、工程化VH或VK结构域)的一个或多个拷贝。VHH可以由骆驼科动物仅重链抗体产生。VNAR可以由软骨鱼仅重链抗体产生。已实施了各种方法以从常规异二聚体VH和VK结构域产生单体sdAb，所述方法包括特异性种系家族的界面工程化和选择。
在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域独立地结合为肿瘤相关抗原(TAA)的抗原。在一些例子中，所述抗原结合结构域、或独立地所述抗原结合结构域中的每一个结合选自以下的肿瘤抗原：1-92-LFA-3、5T4、α-4整合素、α-V整合素、α4β1整合素、α4β7整合素、AGR2、抗路易斯-Y、爱佩琳J受体、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5补体、C-242、CA9、CA19-9(路易斯a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5(CEA)、CEACAM6(NCA-90)、密封蛋白-3、密封蛋白-4、cMet、胶原蛋白、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、内皮素B受体(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV的F蛋白、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、叶酸受体α(FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、透明质酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受体(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R(wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰岛素受体、Jagged配体、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、路易斯X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、间皮素、MRP4、MUC1、粘蛋白-16(MUC16、CA-125)、Na/K ATP酶、NGF、呆蛋白、Notch受体、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂酰丝氨酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、鞘氨醇1磷酸酯、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、转铁蛋白、转铁蛋白受体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2、和WISP-3。
在一些实施方案中，所述Fc区是同二聚体Fc区。在一些实施方案中，所述第一组分的免疫球蛋白Fc区是选自以下的IgG同种型的：IgG1同种型、IgG2同种型、IgG3同种型和IgG4亚类。在一些例子中，所述Fc区是人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4的Fc区，或者是其免疫活性片段。在一些实施方案中，所述Fc区包含含有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或与SEQID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述Fc区包含含有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在任何此类实施方案中的一些中，所述Fc区包含含有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些例子中，所述Fc区包含含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:5具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些例子中，所述Fc区包含含有SEQID NO:6所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:6具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是包含源自选自SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是包含选自SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是包含与选自SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，所述Fc区是异二聚体Fc区。
在一些实施方案中，所述Fc区是含有第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚体，其中所述异二聚体Fc区的第一Fc多肽和第二Fc多肽中的一种或两种是变体Fc多肽，所述变体Fc多肽与人IgG1、人IgG2或人IgG4的Fc区相比包含至少一个修饰以诱导异二聚化。在一些实施方案中，所述至少一个修饰是在人IgG1的Fc区中，或与之相比的。在一些实施方案中，所述至少一个修饰是在SEQ ID NO:1所示的Fc多肽或其免疫活性片段中，或与之相比的。在一些情况下，与同二聚体Fc区的多肽相比，任选地与SEQ ID NO:1所示的Fc多肽或其免疫活性片段相比，所述异二聚体Fc区的一种或两种Fc多肽包含至少一个修饰以诱导异二聚化。在一些实施方案中，所述异二聚体Fc的Fc多肽中的每一种独立地包含至少一个氨基酸修饰。在一些情况下，所述至少一个修饰选自一个或多个立体修饰、一个或多个杵臼结构(knob-into-hole)修饰、增加所述多肽的静电互补性的一个或多个电荷突变、改变等电点的一个或多个修饰(pI变体)、或其组合。
在一些例子中，所述氨基酸修饰是电荷突变以增加所述多肽的静电互补性。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽包含互补位置的修饰，其中所述修饰是用具有与另一多肽的互补氨基酸相反电荷的氨基酸替代。在一些实施方案中，所述第一多肽或所述第二多肽包含互补位置的修饰，其中所述修饰是用具有与另一多肽的互补氨基酸相反电荷的氨基酸替代。在一些实施方案中，至少所述第一Fc多肽或所述第二Fc多肽各自包含互补位置的修饰，其中所述修饰是用具有与另一多肽的互补氨基酸相反电荷的氨基酸替代。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽各自包含互补位置的修饰，其中所述修饰是用具有与另一多肽的互补氨基酸相反电荷的氨基酸替代。
在一些例子中，所述氨基酸修饰是杵臼结构修饰。
在一些实施方案中，所述异二聚体Fc的所述第一Fc多肽包含选自Thr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val及其组合的修饰，并且所述异二聚体Fc的第二Fc多肽包含修饰T366W。在一些情况下，所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽进一步包含非半胱氨酸残基至半胱氨酸残基的修饰，其中所述第一多肽的修饰是在位置Ser354和Y349中的一个处，并且所述第二Fc多肽的修饰是在位置Ser354和Y349中的另一个处。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽包含修饰T366W/S354C，并且所述第二Fc多肽包含修饰T366S/L368A/Y407V/Y349C。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽包含修饰L368D/K370S，并且所述第二Fc多肽包含修饰S364K/E357Q。
在一些实施方案中，所述第一Fc多肽包含修饰L368D/K370S，并且所述第二Fc多肽包含修饰S364K/E357Q。
在一些实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽中的至少一种包含修饰Q295E/N384D/Q418E/N421D。
在一些实施方案中，所述异二聚体Fc的第一Fc多肽或第二Fc多肽中的一种进一步包含在残基Ile253处的修饰。在一些情况下，修饰是Ile253Arg。在一些实施方案中，所述异二聚体Fc的第一Fc多肽或第二Fc多肽中的一种进一步包含在残基His435处的修饰。在一些情况下，修饰是His435Arg。
在一些实施方案中，所述Fc区(如所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽)包含缺乏Lys447的多肽。
在一些任何所提供的实施方案中，所述异二聚体Fc的第一多肽包含SEQ ID NO:82、86或201中任一个所示的氨基酸序列，并且所述异二聚体Fc的第二多肽包含SEQ ID NO:83、87、90、92、202或205中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽包含选自以下的序列：分别为SEQ ID NO:82和83；分别为SEQ ID NO:86和87；分别为SEQ ID NO:201和202；分别为SEQ ID NO:82和90；分别为SEQ ID NO:86和92；以及分别为SEQ ID NO:201和205。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是包含源自选自SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽，其包含一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是包含源自选自SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽，其包含一个或多个修饰以防止糖基化、改变Fc受体相互作用、降低Fc受体结合、增强与CD32A的相互作用、降低补体蛋白C1q结合、延长半衰期、增强FcRn结合、改变抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)、诱导异二聚化、防止二聚化、稳定CH3:CH3界面处的同二聚化及其组合。
在一些实施方案中，所述Fc区内的修饰降低了与Fc受体-γ受体的结合，同时对与新生儿Fc受体(FcRn)的结合具有最小影响。在一些实施方案中，所述突变或修饰的Fc多肽包括以下突变：使用Kabat编号系统，Met252Tyr和Met428Leu或Met252Tyr和Met428Val(M252Y、M428L或M252Y、M428V)。
在一些实施方案中，所述Fc区包含含有至少一个修饰以增强FcRn结合的多肽。在一些例子中，所述修饰是在选自以下的位置：Met252、Ser254、Thr256、Met428、Asn434及其组合。在一些情况下，所述修饰是在选自以下的位置：Met252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S及其组合。在一些特定实施方案中，所述修饰是在位置Met252和位置Met428。在一些情况下，所述修饰是Met252Y和Met428L。在一些情况下，所述修饰是Met252Y和Met428V。
在一些实施方案中，所述异二聚体Fc的第一多肽包含SEQ ID NO:94、96或207中任一个所示的氨基酸序列，并且所述异二聚体Fc的第二多肽包含SEQ ID NO:98、100或209中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽包含选自以下的序列：分别为SEQ ID NO:94和98；分别为SEQ ID NO:96和100；以及分别为SEQ IDNO:207和209。
在一些实施方案中，所述Fc区包含多肽，所述多肽包含至少一个修饰以增强FcγR结合。在一些情况下，所述修饰是在Ser239或Ile332处的修饰。在一些实施方案中，与未经修饰的Fc区相比，所述Fc区的糖基化经修饰以增强FcγR结合。在一些例子中，所述Fc区无岩藻糖含量或具有降低的岩藻糖含量。
在一些实施方案中，所述Fc区包含含有至少一个氨基酸修饰的多肽，所述至少一个氨基酸修饰降低效应子功能和/或降低与选自Fcγ受体或C1q的效应分子的结合。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中一个或多个的缺失。
在一些实施方案中，所述异二聚体Fc的第一多肽包含SEQ ID NO:82、86、94或96中任一个所示的氨基酸序列，并且所述异二聚体Fc的第二多肽包含SEQ ID NO:83、87、90、92、98或100中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述Fc区包含含有至少一个氨基酸修饰的多肽，所述至少一个氨基酸修饰降低效应子功能和/或降低与选自Fcγ受体或C1q的效应分子的结合。在一些例子中，所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中一个或多个的缺失。在一些方面，所述异二聚体Fc的第一多肽包含SEQ ID NO:84、88、95或97中任一个所示的氨基酸序列，并且所述异二聚体Fc的第二多肽包含SEQ ID NO:85、89、91、93、99或101中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述异二聚体Fc的第一多肽包含SEQ ID NO:84、88、95、97、203或208中任一个所示的氨基酸序列，并且所述异二聚体Fc的第二多肽包含SEQ ID NO:85、89、91、93、99、101、204、206或210中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽包含选自以下的序列：分别为SEQ ID NO:84和85；分别为SEQID NO:88和89；分别为SEQ ID NO:203和204；分别为SEQ ID NO:95和99；分别为SEQ ID NO:97和101；分别为SEQ ID NO:208和210；分别为SEQ ID NO:84和91；分别为SEQ ID NO:88和93；以及分别为SEQ ID NO:203和206。
在一些实施方案中，所述CD3结合区是抗CD3抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段包含可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)。在任何此类实施方案中的一些中，所述CD3结合区是单价的。
在一些实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段不是单链抗体，任选地不是单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，所述Fc是异二聚体Fc，并且构成所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH和VL连接至所述异二聚体Fc的相对多肽。
在一些实施方案中，所述CD3结合区不能或基本上不能结合或接合CD3，除非所述抗原结合结构域中的至少一个与其TAA结合。在一些方面，所述CD3结合区不能或基本上不能结合或接合CD3，除非所述抗原结合结构域中的至少两个与其TAA结合。
在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体含有为多肽接头的接头。在一些实施方案中，所述接头是长度为最多25个氨基酸的多肽。在一些情况下，所述接头是从或从约2至24个氨基酸、2至20个氨基酸、2至18个氨基酸、2至14个氨基酸、2至12个氨基酸、2至10个氨基酸、2至8个氨基酸、2至6个氨基酸、6至24个氨基酸、6至20个氨基酸、6至18个氨基酸、6至14个氨基酸、6至12个氨基酸、6至10个氨基酸、6至8个氨基酸、8至24个氨基酸、8至20个氨基酸、8至18个氨基酸、8至14个氨基酸、8至12个氨基酸、8至10个氨基酸、10至24个氨基酸、10至20个氨基酸、10至18个氨基酸、10至14个氨基酸、10至12个氨基酸、12至24个氨基酸、12至20个氨基酸、12至18个氨基酸、12至14个氨基酸、14至24个氨基酸、14至20个氨基酸、14至18个氨基酸、18至24个氨基酸、18至20个氨基酸或20至24个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，接头是长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的多肽。
在一些实施方案中，所述接头的长度为3至18个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头的长度为12至18个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头的长度为15至18个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头是长度为18个氨基酸的多肽。
在一些实施方案中，所述不可切割接头不含有由蛋白酶特异性识别以切割的底物识别位点。在一些实施方案中，所述蛋白酶由免疫效应细胞、由肿瘤或由存在于肿瘤微环境中的细胞产生。在一些实施方案中，所述蛋白酶由免疫效应细胞产生，并且所述免疫效应细胞是激活的T细胞、自然杀伤(NK)细胞或NK T细胞。在一些实施方案中，所述蛋白酶选自蛋白裂解酶(matriptase)、基质金属蛋白酶(MMP)、颗粒酶B及其组合。在一些实施方案中，所述蛋白酶是颗粒酶B。
在一些实施方案中，所述接头包含氨基酸序列GS、GGS、GGGGS(SEQ ID NO:149)、GGGGGS(SEQ ID NO:135)及其组合。在一些实施方案中，所述接头包含氨基酸序列(GGS)n，其中n是1至10。在一些实施方案中，所述接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:173)，其中n是1至10。在一些实施方案中，所述接头包含(GGGGGS)n(SEQ ID NO:172)，其中n是1至4。
在一些实施方案中，所述接头是或包含GGS。在一些实施方案中，所述接头是或包含GGGGS(SEQ ID NO:149)。在一些实施方案中，所述接头是或包含GGGGGS(SEQ ID NO:135)。在一些实施方案中，所述接头是或包含GGSGGS(“(GGS)2”)(SEQ ID NO:10)。在一些实施方案中，所述接头是或包含GGSGGSGGS(“(GGS)3”)(SEQ ID NO:11)。在一些实施方案中，所述接头是或包含GGSGGSGGSGGS(“(GGS)4”)(SEQ ID NO:12)。在一些实施方案中，所述接头是或包含GGSGGSGGSGGSGGS(“(GGS)5”)(SEQ ID NO:13)。在一些实施方案中，所述接头是或包含GGGGGSGGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:119)。在一些实施方案中，所述接头是或包含GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:147)。在一些实施方案中，所述接头是或包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:170)。在一些实施方案中，所述接头是或包含GGGGG(SEQ IDNO:192)。
在一些实施方案中，所述第一组分(其在一些情况下是所述第一抗原结合结构域)的抗原结合结构域和免疫球蛋白Fc区经由一个或多个其他氨基酸接头(在本文中称为组分内接头)可操作地连接。所述第一组分的组分内肽接头(也称为LP1)可以是如章节II.3中所述的任何肽接头的肽接头。存在于所述第一组分中，即连接所述Fc区和抗原结合结构域的组分内接头可以具有各种长度，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸。在一些实施方案中，这些组分内接头主要由氨基酸甘氨酸和丝氨酸构成，在本文中表示为GS接头。在一些实施方案中，所述GS接头包含选自以下的氨基酸序列：GGSGGS，即(GGS)2(SEQ ID NO:10)；GGSGGSGGS，即(GGS)3(SEQ ID NO:11)；GGSGGSGGSGGS，即(GGS)4(SEQ ID NO:12)；和GGSGGSGGSGGSGGS，即(GGS)5(SEQ ID NO:13)。
在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体至少包含(i)第一多肽，所述第一多肽包含所述异二聚体Fc区的第一Fc多肽、所述接头和所述抗CD3抗体或其抗原结合片段的VH结构域；和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含所述异二聚体Fc区的第二Fc多肽、所述接头和所述抗CD3抗体或其抗原结合片段的VL结构域，其中所述第一多肽和所述第二多肽中的一种或两种包含至少一个结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH与所述至少一个结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域在同一多肽上。在一些实施方案中，包含所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VL的所述多肽不含有所述至少一个结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。在所提供的多特异性多肽构建体的特定实施方案中，至少一个抗原结合结构域位于相对于所述多特异性多肽构建体的CD3结合区的羧基末端。
在一些实施方案中，所述第二组分包括所述CD3结合区的一个或多个拷贝。
在一些实施方案中，所述CD3结合区是抗CD3抗体或抗原结合片段，所述抗CD3抗体或抗原结合片段包括能够结合或接合CD3(如CD3ε)的抗体或其抗原结合片段的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，所述抗CD3结合结构域包括选自以下的抗体或其抗原结合片段的一个或多个拷贝：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体、和单结构域轻链抗体。
在一些实施方案中，所述抗CD3结合结构域包括结合CD3ε的Fv抗体片段(在本文中称为抗CD3εFv片段)。
在一些实施方案中，所述抗CD3εFv抗体片段包括选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:32-81、191、196-200、211和212。在一些实施方案中，所述抗CD3εFv抗体片段包括与选自SEQ ID NO:32-81、191、196-200、211和212的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD3εFv抗体片段包括选自SEQ ID NO:32-62、196-198和211的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:63-81、191、199、200和212的氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，所述抗CD3εFv抗体片段包括与选自SEQ ID NO:32-62、196-198和211的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列和与选自SEQ ID NO:63-81、191、199、200和212的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的组合。
在一些实施方案中，所述抗CD3εFv抗体片段是二硫化物稳定的抗CD3结合Fv片段(dsFv)。
在一些实施方案中，所述第一组分包括抗原结合结构域的一个或多个拷贝。在某些实施方案中，所述第一组分含有至少两个抗原结合结构域，如两个抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述第一组分的至少两个抗原结合结构域结合相同TAA。在一些情况下，所述第一组分的至少两个抗原结合结构域结合相同TAA的不同表位。在一些情况下，所述第一组分的至少两个抗原结合结构域结合相同TAA的相同表位。在一些实施方案中，所述第一组分的至少两个抗原结合结构域结合不同TAA。
在一些实施方案中，所述第二组分包括抗原结合结构域的一个或多个拷贝。在某些实施方案中，所述第二组分含有至少两个抗原结合结构域，如两个抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述第二组分的至少两个抗原结合结构域结合相同TAA。在一些情况下，所述第二组分的至少两个抗原结合结构域结合相同TAA的不同表位。在一些情况下，所述第二组分的至少两个抗原结合结构域结合相同TAA的相同表位。在一些实施方案中，所述第二组分的至少两个抗原结合结构域结合不同TAA。
在一些实施方案中，所述第一组分含有第一抗原结合结构域，并且所述第二组分的抗原结合结构域是第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述多特异性抗原结合结构域至少包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合相同TAA。在一些情况下，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合相同TAA的不同表位。在一些情况下，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合相同TAA的相同表位。在一些实施方案中，所述多特异性抗原结合结构域至少包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合不同TAA。
在一些实施方案中，所述第二组分的抗原结合结构域(其在一些情况下是第二抗原结合结构域)和CD3结合区经由一个或多个其他氨基酸接头(在本文中称为组分内接头)可操作地连接。所述第二组分的组分内肽接头(也称为LP2)可以是如章节II.3中所述的任何肽接头的肽接头。存在于所述第二组分中，即连接所述CD3结合区和抗原结合结构域的组分内接头可以具有各种长度，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸。在一些实施方案中，所述第二组分的组分内接头主要由氨基酸甘氨酸和丝氨酸构成，在本文中表示为GS接头。在一些实施方案中，所述GS接头包含选自以下的氨基酸序列：GGSGGS，即(GGS)2(SEQ ID NO:10)；GGSGGSGGS，即(GGS)3(SEQ ID NO:11)；GGSGGSGGSGGS，即(GGS)4(SEQ ID NO:12)；和GGSGGSGGSGGSGGS，即(GGS)5(SEQ ID NO:13)。
本文提供了多特异性多肽构建体，所述多特异性多肽构建体包含含有异源二聚体Fc区的第一组分和含有抗CD3抗体或抗原结合片段的第二组分，所述抗CD3抗体或抗原结合片段包含可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)，其中：构成所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH和VL连接至所述异二聚体Fc的相对多肽；所述第一组分和所述第二组分通过接头偶联，其中所述异二聚体Fc区位于所述抗CD3抗体或抗原结合片段的N末端；并且所述第一组分和所述第二组分中的一种或两种包含结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，所述接头是长度为最多50个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，所述接头是长度为最多25个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，所述接头是长度为最多15个氨基酸的多肽。
在任何所提供的实施方案中，所述一个或多个结合TAA的抗原结合结构域导致与所述TAA的单价、二价、三价或四价结合。在一些实施方案中，所述一个或多个结合TAA的抗原结合结构域独立地选自sdAb、scFv或Fab。在一些实施方案中，所述一个或多个结合TAA的抗原结合结构域是单链分子，如含有VH和VL的单链抗体片段，例如sdAb或scFv。在一些实施方案中，所述一个或多个结合TAA的抗原结合结构域是sdAb，如VHH或VHNAR。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域中的至少一个是包含含有VH-CH1(Fd)的第一链和含有VL-CL的第二链的Fab。
在一些实施方案中，所述结合TAA的抗原结合结构域附接至所述抗CD3结合结构域的VH。在一些实施方案中，所述结合TAA的抗原结合结构域附接至所述异二聚体Fc的与所述抗CD3结合结构域的VH附接的同一侧(例如，杵或臼)。在一些实施方案中，所述结合TAA的抗原结合结构域是sdAb，其附接至所述抗CD3结合结构域的VH。在一些实施方案中，所述结合TAA的抗原结合结构域是sdAb，其附接至所述异二聚体Fc结构域的与所述抗CD3结合结构域的VH附接的同一侧(例如，杵或臼)。在一些实施方案中，所述结合TAA的抗原结合结构域是VHH或VHNAR，其附接至所述抗CD3结合结构域的VH。在一些实施方案中，所述结合TAA的抗原结合结构域是VHH或VHNAR，其附接至所述异二聚体Fc结构域的与所述抗CD3结合结构域的VH附接的同一侧(例如，杵或臼)。在一些实施方案中，所述结合TAA的抗原结合结构域是VHH，其附接至所述抗CD3结合结构域的VH。在一些实施方案中，所述结合TAA的抗原结合结构域是VHH，其附接至所述异二聚体Fc结构域的与所述抗CD3结合结构域的VH附接的同一侧(例如，杵或臼)。在一些实施方案中，所述结合TAA的抗原结合结构域是VHNAR，其附接至所述抗CD3结合结构域的VH。在一些实施方案中，所述结合TAA的抗原结合结构域是VHNAR，其附接至所述Fc结构域的与所述抗CD3结合结构域的VH附接的同一侧(例如，杵或臼)。
在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体至少包含(i)第一多肽，所述第一多肽包含所述异二聚体Fc区的第一Fc多肽、所述接头和所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH结构域；和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含所述异二聚体Fc区的第二Fc多肽、所述接头和所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VL结构域，其中所述第一多肽和所述第二多肽中的一种或两种包含至少一个结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。在一些情况下，所述第一多肽或所述第二多肽中仅一种包含所述至少一个结合TAA的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域中的至少一个是Fab。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含所述异二聚体Fc区的第一Fc多肽、所述接头和所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH结构域；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含所述异二聚体Fc区的第二Fc多肽、所述接头和所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VL结构域；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含结合肿瘤相关抗原的Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽进一步包含所述Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一种。在一些情况下，所述第一多肽或所述第二多肽中的仅一种包含所述Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一种。在一些实施方案中，所述第一多肽或所述第二多肽二者均包含所述Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一种。在一些情况下，所述Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一种位于相对于所述多特异性多肽构建体的第一多肽或第二多肽中的一种的Fc区的氨基末端和/或位于相对于所述多特异性多肽构建体的第一多肽或第二多肽中的一种的CD3结合区的羧基末端。在一些实施方案中，所述Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一种位于相对于所述第一多肽或所述第二多肽的Fc区的氨基末端并且位于相对于所述第一多肽或所述第二多肽中的另一种的CD3结合区的羧基末端。
在一些实施方案中，所述至少一个抗原结合结构域位于相对于所述多特异性多肽构建体的第一多肽或第二多肽中的一种的Fc区的氨基末端和/或位于相对于所述多特异性多肽构建体的第一多肽或第二多肽中的一种的CD3结合区的羧基末端。在一些情况下，所述至少一个抗原结合结构域位于相对于所述多特异性构建体的Fc区的氨基末端，并且所述第二抗原结合结构域位于相对于所述多特异性构建体的CD3结合区的羧基末端。在所提供的多特异性多肽构建体的特定实施方案中，至少一个抗原结合结构域位于相对于所述多特异性多肽构建体的CD3结合区的羧基末端。在一些实施方案中，所述至少一个抗原结合结构域是sdAb。在一些实施方案中，所述至少一个为sdAb的抗原结合结构域位于所述多特异性构建体的CD3结合区的羧基末端。在一些实施方案中，所述至少一个为sdAb的抗原结合结构域位于所述多特异性构建体的Fc区的氨基末端。在一些实施方案中，所述至少一个抗原结合结构域是VHH。在一些实施方案中，所述至少一个为VHH的抗原结合结构域位于所述多特异性构建体的CD3结合区的羧基末端。在一些实施方案中，所述至少一个为VHH的抗原结合结构域位于所述多特异性构建体的Fc区的氨基末端。
在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体包含在所述第一抗原结合结构域与所述免疫球蛋白Fc多肽区(Fc区)之间的第一连接肽(LP1)。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体包含在所述抗CD3结合结构域(CD3结合区)与所述第二抗原结合结构域之间的第二连接肽(LP2)。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体包含在所述第一抗原结合结构域与所述免疫球蛋白Fc多肽区(Fc区)之间的第一连接肽(LP1)和在所述抗CD3结合结构域(CD3结合区)与第二抗原结合结构域之间的第二连接肽(LP2)。
在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体从N末端到C末端具有如下结构排列：第一抗原结合结构域-LP1-免疫球蛋白Fc多肽接头区(Fc区)-接头-抗CD3结合结构域-LP2-第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体从N末端到C末端具有如下结构排列：第二抗原结合结构域-LP2-免疫球蛋白Fc多肽接头区(Fc区)-接头-抗CD3结合结构域(CD3结合区)-LP1-第一抗原结合结构域。
在一些实施方案中，所述两个连接肽LP1和LP2彼此不相同。在一些情况下，LP1或LP2独立地是长度为约1至20个氨基酸的肽。在一些例子中，LP1或LP2独立地包括为或包含如SEQ ID NO:10-13、119、135、147、149所示的任何Gly-Ser接头的肽。
在一些实施方案中，所述多特异性构建体是具有图1中所示的任何结构排列的构建体。在一些实施方案中，所述构建体是从N末端到C末端具有如下结构排列的双特异性构建体。所述双特异性构建体的N末端包括结合肿瘤相关抗原(TAA)的第一抗原结合结构域。所述第一结合结构域结合TAA靶标上的第一表位。与所述第一抗原结合结构域偶联的是调节FcγR相互作用和/或FcRn相互作用的中心免疫球蛋白Fc多肽区。在一些实施方案中，所述中心免疫球蛋白Fc多肽区是异二聚体的。所述免疫球蛋白Fc多肽区与位于所述免疫球蛋白Fc多肽区端的C末端位置的接头偶联。所述接头附接至位于所述Fc区的C末端的、在一些情况下在所述第二组分的远端的抗CD3结合序列。所述双特异性构建体的C末端包括结合TAA的第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域与位于是第一组分内的所述第一抗原结合结构域结合相同TAA。在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域结合所述TAA上的第二表位，其中所述第二表位与所述TAA上的第一表位无竞争性。在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域结合与所述第一抗原结合结构域不同的TAA。
在一些任何所提供的实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段是Fv抗体片段。在一些实施方案中，所述Fv抗体片段包括二硫化物稳定的抗CD3结合Fv片段(dsFv)。在一些实施方案中，所述抗CD3结合序列是Fv抗体片段，所述Fv抗体片段经工程化以在可变重链(VH)与可变轻链(VL)区域之间包括二硫键，从而产生二硫化物稳定的抗CD3结合Fv片段(dsFv)。在一些实施方案中，构成所述抗CD3 Fv的VH和VL结构域可操作地连接至异二聚体Fc区的相对成员。在这些实施方案中，所述抗CD3 Fv以单价方式结合CD3。在如提供的方面，所述抗CD3 dsFv不接合CD3，除非所述多特异性多肽构建体与同源抗原结合。
在一些实施方案中，所述双特异性构建体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的每一个均包括抗体或其抗原结合片段的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，所述双特异性构建体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的每一个均包括选自以下的抗体或其抗原结合片段的一个或多个拷贝：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体、和单结构域轻链抗体。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域、或独立地所述抗原结合结构域中的每一个是选自以下的抗体或其抗原结合片段：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体、和单结构域轻链抗体。在一些实施方案中，所述双特异性构建体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的每一个包括一个或多个单结构域抗体(sdAb)片段(例如VHH、VNAR、工程化VH或VK结构域)的一个或多个拷贝。VHH可以从天然骆驼科动物仅重链抗体、产生仅重链抗体的经基因修饰的啮齿动物、或幼稚/合成的骆驼科动物或人源化骆驼科动物单结构域抗体库产生。VNAR可以由软骨鱼仅重链抗体产生。已实施了各种方法以从常规异二聚体VH和VK结构域产生单体sdAb，所述方法包括特异性种系家族的界面工程化和选择。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是sdAb。在一些情况下，所述sdAb是人sdAb或人源化sdAb。在一些方面，所述sdAb是VHH、VNAR、工程化VH结构域或工程化VK结构域。在一些例子中，所述抗体或其抗原结合片段是scFv。在一些情况下，所述抗体或其抗原结合片段是Fab。
在一些任何所提供的实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段包含含有氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:16)的VH CDR1；含有氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ IDNO:17)的VH CD2；含有氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:18)的VH CDR3；含有氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:19)的VL CDR1；含有氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:20)的VL CDR2；以及含有氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:21)的VL CDR3。
在一些任何所提供的实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段包含含有氨基酸序列GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:211)的VH CDR1；含有氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ IDNO:212)的VH CD2；含有氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:18)的VH CDR3；含有氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:19)的VL CDR1；含有氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:20)的VL CDR2；以及含有氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:21)的VL CDR3。
在一些任何所提供的实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段包含至少包括氨基酸序列GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:211)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ ID NO:212)的VH CDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQID NO:18)的VH CDR3序列；至少包括氨基酸序列GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:229)的VLCDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:230)的VL CDR2序列；以及至少包括氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:225)的VL CDR3序列。
在一些任何所提供的实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段包含：具有SEQID NO:14、32-62、196-198和211中任一个的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:14、32-62、196-198和211中的任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的VH；和具有SEQ ID NO:15、63-81、191、199、200和212中任一个的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:15、63-81、191、199、200和212中的任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的VL。
在一些实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段是Fv。在一些实施方案中，所述抗CD3 Fv包含：具有SEQ ID NO:14、32-43、45-47、48、196和211中任一个的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:14、32-43、45-47、48、196和211中的任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的VH；和具有SEQ ID NO:15、63、65-71、73、75、77和199中任一个的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:15、63、65-71、73、75、77和199中的任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的VL。在一些情况下，所述抗CD3 dsFv包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列和SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在其他情况下，所述抗CD3 Fv包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列和SEQ ID NO:199的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述CD3结合结构域的VH和VL链区各自独立地包含至少一个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述CD3结合结构域的VH和VL链区的所述至少一个氨基酸修饰增加了所述CD3结合结构域的稳定性。在一些实施方案中，所述CD3结合结构域的VH和VL链区的所述至少一个氨基酸修饰增加了所述CD3结合结构域结合CD3的能力。在一些实施方案中，所述CD3结合结构域的VH和VL链区的所述至少一个氨基酸修饰通过在VH链区与VL链区之间形成二硫键而增加了所述CD3结合结构域的稳定性。
在一些实施方案中，所述CD3结合区具有在VH区与VL区之间的二硫化物稳定的连接。在一些实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段是二硫化物稳定的Fv(dsFv)。在一些实施方案中，根据Kabat编号，所述二硫化物稳定的抗CD3 Fv包含具有至Cys的突变44的抗CD3 VH和具有至Cys的突变100的抗CD3 VL。在一些实施方案中，根据Kabat编号，所述二硫化物稳定的抗CD3 Fv包含具有突变G44C的抗CD3 VH和具有突变G100C的抗CD3 VL。在一些实施方案中，根据Kabat编号，所述二硫化物稳定的抗CD3Fv包含具有在位置105的突变的抗CD3 VH和具有至Cys的位置43突变的抗CD3 VL。
在一些实施方案中，所述抗CD3 dsFv包含：具有SEQ ID NO:44、49-62、197和198中任一个的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:44、49-62、197和198中任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的VH；和具有SEQ ID NO:64、72、74、76、78-81、191、200和212中任一个的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:64、72、74、76、78-81、191、200和212中任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的VL。在一些情况下，所述抗CD3 dsFv包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列和SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD3 dsFv包含SEQID NO:198的氨基酸序列和SEQ ID NO:200的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD3dsFv包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列和SEQ ID NO:200的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述多特异性构建体还包括缀合至所述多特异性构建体的药剂。在一些实施方案中，所述药剂是治疗剂。在一些实施方案中，所述药剂是可检测部分。在一些实施方案中，所述可检测部分是诊断剂。在一些实施方案中，所述药剂经由接头缀合至所述多特异性构建体。在一些实施方案中，所述接头是不可切割接头。
在一些实施方案中，本文描述的多特异性构建体与一种或多种另外的药剂或另外的药剂的组合联合使用。合适的另外的药剂包括用于预期应用例如像癌症的当前医药和/或手术疗法。例如，所述多特异性构建体可以与另外的化学治疗剂或抗瘤剂联合使用。
在一些实施方案中，将所述多特异性构建体和另外的药剂配制成单一治疗性组合物，并且同时给予所述多特异性构建体和所述另外的药剂。在一些实施方案中，所述多特异性构建体和另外的药剂彼此分开，例如，各自配制成单独的治疗性组合物，并且同时给予所述多特异性构建体和所述另外的药剂，或者在治疗方案期间的不同时间给予所述多特异性构建体和所述另外的药剂。例如，在给予所述另外的药剂之前给予所述多特异性构建体，在给予所述另外的药剂之后给予所述多特异性构建体，或者以交替的方式给予所述多特异性构建体和所述另外的药剂。如本文所述，将所述多特异性构建体和所述另外的药剂以单剂量或多剂量给予。
在一些实施方案中，所述多特异性构建体天然含有一个或多个二硫键。在一些实施方案中，所述多特异性构建体可以经工程化以包括一个或多个二硫键。
本公开文本还提供了编码本文所述的多特异性构建体的至少一部分的分离的核酸分子或多核苷酸，和/或编码本文所述的多特异性构建体的一个或多个核酸分子，例如像至少编码所述多特异性构建体的第一组分的至少一部分的第一核酸和编码所述多特异性构建体的第二组分的至少一部分的第二核酸，以及包括这些分离的核酸序列的载体。
所提供的实施方案是编码任何所提供的多特异性多肽构建体的一种或多种多核苷酸。还提供了编码任何所提供的多特异性多肽构建体的多肽链的多核苷酸。还提供了多核苷酸，其包含编码任何所提供的多特异性构建体的第一多肽的第一核酸序列和编码所述多特异性构建体的第二多肽的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列被内部核糖体进入位点(IRES)或者编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的序列分开。在一些情况下，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列可操作地连接至相同启动子。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体包含第三多肽链，并且所述多核苷酸进一步包含编码所述多特异性构建体的第三多肽的第三核酸。在一些实施方案中，所述第三核酸与所述第一多肽和/或所述第二多肽被内部核糖体进入位点(IRES)或者编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核酸分开，和/或所述第三核酸序列可操作地连接至与所述第一核酸序列和/或所述第二核酸序列相同的启动子。在一些例子中，所述编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核酸选自T2A、P2A、E2A或F2A(SEQ ID NO:159-164，或由SEQ ID NO:165所示的序列编码)。
本文提供了载体，其包含任何所提供的多核苷酸。在一些实施方案中，所述载体是表达载体。在一些例子中，所述载体是病毒载体或真核载体，任选地其中所述真核载体是哺乳动物载体。
提供了细胞，其包含任何所提供的多核苷酸或载体。在一些情况下，所述细胞是重组的或分离的。在一些例子中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些例子中，所述细胞是HEK293或CHO细胞。
本公开文本提供了通过以下方式来产生多特异性构建体的方法：在导致所述多特异性构建体表达的条件下培养细胞，其中所述细胞包含这样的一种或多种核酸分子。在一些实施方案中，所述细胞包含这种载体。
本文提供了产生多特异性多肽构建体的方法，所述方法包括将任何所提供的多核苷酸或载体引入细胞中，并且在导致所述多特异性构建体表达的条件下培养所述细胞以产生所述多特异性多肽构建体。还提供了产生多特异性多肽构建体的方法，所述方法包括在其中由任何所提供的细胞表达或产生所述多特异性多肽的条件下培养所述细胞。在一些情况下，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些例子中，所述细胞是HEK293或CHO细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述细胞中分离或纯化所述多特异性多肽构建体。在一些情况下，所述多特异性多肽构建体是异二聚体。
本文提供了通过任何所提供的方法产生的多特异性多肽构建体。
本文提供了刺激或诱导免疫应答的方法，所述方法包括使靶细胞和T细胞与任何所提供的多特异性多肽构建体或药物组合物接触，所述靶细胞表达由所述多特异性多肽构建体识别的肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，所述靶细胞是表达所述肿瘤相关抗原(TAA)的肿瘤细胞。
在一些实施方案中，所述接触是离体或体外进行的。在一些实施方案中，所述接触是在受试者体内进行的。
提供了在受试者中刺激或诱导免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的任何所提供的多特异性缀合物或药物组合物。在一些情况下，所述方法增加细胞介导的免疫性。在一些实施方案中，所述方法增加T细胞活性。在一些实施方案中，所述方法增加细胞溶解性T细胞(CTL)活性。在一些例子中，所述免疫应答是针对肿瘤或癌症增加的。在一些实施方案中，所述方法治疗所述受试者的疾病或病症。
本公开文本还提供了通过以下方式治疗、预防一种或多种病理症状、延迟所述症状的进展或以其他方式改善所述症状或缓和与此类病理相关的症状的方法：向期望这种治疗或预防的受试者给予本公开文本的多特异性多肽构建体。本文提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的任何所提供的多特异性缀合物或药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病或病症是肿瘤或癌症。
在任何所提供的方法的一些实施方案中，所述受试者(如待治疗的受试者)是例如人或其他哺乳动物。在任何所提供的方法的一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者是非人哺乳动物，如非人灵长类动物、伴侣动物(例如，猫、犬、马)、农场动物、工作动物或动物园动物。在一些实施方案中，所述受试者是啮齿动物。
在这些方法和用途的任何实施方案中使用的本公开文本的多特异性多肽构建体可以在所述疾病的任何阶段给予。例如，可以将这种多特异性多肽构建体给予至患有任何阶段(自早期至转移)的癌症的患者。术语受试者和患者在本文中可互换使用。
在这些方法和用途的任何实施方案中使用的本公开文本的多特异性多肽构建体可以用于包括新辅助疗法的治疗方案中。
在这些方法和用途的任何实施方案中使用的本公开文本的多特异性多肽构建体可以单独给予或与一种或多种另外的药剂(包括小分子抑制剂、其他基于抗体的疗法、基于多肽或肽的疗法、基于核酸的疗法和/或其他生物制剂)组合给予。在一些实施方案中，将多特异性多肽构建体与一种或多种另外的药剂组合给予，作为非限制性例子，所述一种或多种另外的药剂如化学治疗剂如烷化剂、抗代谢物、抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、细胞毒性抗生素和任何其他核酸破坏剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂是紫杉烷，如紫杉醇(例如，
Figure BDA0002817785800000271
)。在一些实施方案中，所述另外的药剂是抗代谢物，如吉西他滨(gemcitabine)。在一些实施方案中，所述另外的药剂是烷化剂，如基于铂的化学疗法，如卡铂或顺铂。在一些实施方案中，所述另外的药物是靶向剂，如激酶抑制剂，例如索拉非尼(sorafenib)或埃罗替尼(erlotinib)。在一些实施方案中，所述另外的药剂是靶向剂，如另一种抗体，例如单克隆抗体(例如贝伐单抗(bevacizumab))、双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方案中，所述另外的药剂是蛋白酶体抑制剂，如硼替佐米(bortezomib)或卡非佐米(carfilzomib)。在一些实施方案中，所述另外的药剂是免疫调节剂，如来那度胺(lenolidominde)或IL-2。在一些实施方案中，所述另外的药剂是辐射。在一些实施方案中，所述另外的药剂是本领域技术人员视为护理标准的药剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂是本领域技术人员熟知的化学治疗剂。在一些实施方案中，将所述多特异性多肽构建体和所述一种或多种另外的药剂配制成单一组合物。在一些实施方案中，将所述多特异性多肽构建体和所述一种或多种另外的药剂作为两种或更多种单独的组合物给予。在一些实施方案中，同时给予所述多特异性多肽构建体和所述一种或多种另外的药剂。在一些实施方案中，顺序给予所述多特异性多肽构建体和所述一种或多种另外的药剂。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的药剂是化学治疗剂，如选自以下的化学治疗剂：多西他赛、紫杉醇、abraxane(即，白蛋白缀合型紫杉醇)、多柔比星、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂、顺铂、伊立替康(irinotecan)、和吉西他滨。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的药剂是检查点抑制剂、激酶抑制剂、靶向肿瘤微环境中的抑制剂的药剂、和/或T细胞或NK激动剂。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的药剂是放射疗法，其是单独的或与其他一种或多种另外的药剂(如化学治疗剂或抗瘤剂)组合。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的药剂是疫苗、癌病毒和/或DC激活剂，作为非限制性例子，如toll样受体(TLR)激动剂和/或α-CD40。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的药剂是被设计为经由ADCC或经由与毒素的直接缀合(例如，抗体药物缀合物(ADC))杀伤肿瘤的肿瘤靶向抗体。
在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是选自CTLA-4、LAG-3、PD-1、PDL1、TIGIT、TIM-3、B7H3、B7H4和Vista的靶标的抑制剂。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂选自B-RAFi、MEKi和Btk抑制剂(如依鲁替尼)。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是克唑替尼(crizotinib)。在一些实施方案中，所述肿瘤微环境抑制剂选自IDO抑制剂、α-CSF1R抑制剂、α-CCR4抑制剂、TGF-β、髓源性抑制细胞、或T调节细胞。在一些实施方案中，所述激动剂选自OX40、GITR、CD137、CD28、ICOS、CD27和HVEM。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是结合选自CTLA-4、PD-1和/或PD-L1的靶标的抗体。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体和/或其组合。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是抗CTLA4抗体，例如像YervoyTM。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是抗PD-1抗体，例如像OpdivoTM和/或KeytrudaTM。
在一些实施方案中，所述抑制剂是CTLA-4抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是LAG-3抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是PDL1抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是TIGIT抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是TIM-3抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是B7H3抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是B7H4抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是Vista抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是B-RAFi抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是MEKi抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是Btk抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是依鲁替尼。在一些实施方案中，所述抑制剂是克唑替尼。在一些实施方案中，所述抑制剂是IDO抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是α-CSF1R抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是α-CCR4抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是TGF-β。在一些实施方案中，所述抑制剂是髓源性抑制细胞。在一些实施方案中，所述抑制剂是T调节细胞。
在一些实施方案中，所述激动剂是OX40。在一些实施方案中，所述激动剂是GITR。在一些实施方案中，所述激动剂是CD137。在一些实施方案中，所述激动剂是CD28。在一些实施方案中，所述激动剂是ICOS。在一些实施方案中，所述激动剂是CD27。在一些实施方案中，所述激动剂是HVEM。
在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体在治疗期间和/或之后与一种或多种另外的药剂(例如像化学治疗剂、抗炎剂和/或免疫抑制剂)组合给予。在一些实施方案中，将所述多特异性多肽构建体和所述另外的药剂配制成单一治疗性组合物，并且同时给予所述多特异性多肽构建体和所述另外的药剂。可替代地，所述多特异性多肽构建体和另外的药剂彼此分开，例如，各自配制成单独的治疗性组合物，并且同时给予所述多特异性多肽构建体和所述另外的药剂，或者在治疗方案期间的不同时间给予所述多特异性构建体和所述另外的药剂。例如，在给予所述另外的药剂之前给予所述多特异性多肽构建体，在给予所述另外的药剂之后给予所述多特异性多肽构建体，或者以交替的方式给予所述多特异性多肽构建体和所述另外的药剂。如本文所述，将所述多特异性多肽构建体和所述另外的药剂以单剂量或多剂量给予。
在一些实施方案中，同时给予所述多特异性多肽构建体和所述一种或多种另外的药剂。例如，可以将所述多特异性多肽构建体和一种或多种另外的药剂配制成单一组合物或作为两种或更多种单独的组合物给予。在一些实施方案中，将所述多特异性多肽构建体和所述一种或多种另外的药剂顺序给予，或者在治疗方案期间的不同时间给予所述多特异性多肽构建体和所述另外的药剂。
除上述要素之外，所述多特异性多肽构建体可以含有另外的要素，例如像所述多特异性多肽构建体的N或C末端的氨基酸序列。例如，多特异性多肽构建体可以包括靶向部分，以有利于递送至目的细胞或组织。可以将多特异性多肽构建体缀合至如治疗剂、可检测部分或诊断剂的药剂。本文中公开了药剂的例子。
多特异性多肽构建体还可包括本文所述的任何缀合剂、接头和其他组分，以及本公开文本的多特异性多肽构建体。
本公开文本还涉及免疫缀合物，所述免疫缀合物包含缀合至细胞毒性剂如毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)的多特异性多肽构建体。用于在靶向如在T细胞来源的淋巴瘤中的患病T细胞中使用的合适细胞毒性剂包括例如多拉司他汀(dolastatins)及其衍生物(例如澳瑞司他汀E(auristatin E)、AFP、MMAD、MMAF、MMAE)。在一些实施方案中，所述药剂是多拉司他汀。在一些实施方案中，所述药剂是澳瑞司他汀或其衍生物。在一些实施方案中，所述药剂是类美登素(maytansinoid)或类美登素衍生物。在一些实施方案中，所述药剂是DM1或DM4。在一些实施方案中，所述药剂是倍癌霉素(duocarmycin)或其衍生物。在一些实施方案中，所述药剂是卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物。在一些实施方案中，所述药剂是吡咯苯并二氮杂卓。
在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体与所述细胞毒性剂之间的接头是可切割的。在一些实施方案中，所述接头是不可切割的。在一些实施方案中，存在两个或更多个接头。所述两个或更多个接头均相同，例如均可切割或不可切割，或者所述两个或更多个接头是不同的，例如至少一个可切割和至少一个不可切割。
所述多特异性多肽构建体及其缀合物可用于治疗多种障碍和/或疾病的方法中。疾病的非限制性例子包括：所有类型的癌症(乳腺癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、头颈癌、胰腺癌等)、类风湿性关节炎、克罗恩病、SLE、心血管损伤、缺血等。例如、适应症将包括白血病(包括T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL))、淋巴母细胞疾病(包括多发性骨髓瘤)和实体瘤(包括肺癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌(包括三阴性乳腺癌))。例如，适应症包括骨病或癌症转移，不管原发性肿瘤起源；乳腺癌，作为非限制性例子，包括ER/PR+乳腺癌、Her2+乳腺癌、三阴性乳腺癌；结直肠癌；子宫内膜癌；胃癌；胶质母细胞瘤；头颈癌，如食道癌；肺癌，作为非限制性例子，如非小细胞肺癌；多发性骨髓瘤卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；肉瘤，如骨肉瘤；肾癌，作为非限制性例子，如肾细胞癌；和/或皮肤癌，作为非限制性例子，如鳞状细胞癌、基底细胞癌或黑色素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症是皮肤鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症是食管鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症是头颈部鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症是肺鳞状细胞癌。
还提供了药物组合物，其包含本文所提供的任何多特异性多肽构建体、和药学上可接受的载体。在一些情况下，所述药物组合物是无菌的。根据本公开文本的药物组合物可以包括本公开文本的多特异性多肽构建体和载体。这些药物组合物可以包括在试剂盒，例如像诊断试剂盒中。
本领域技术人员将了解，本公开文本的抗体具有多种用途。例如，本公开文本的蛋白质用作多种障碍的治疗剂。本公开文本的抗体还用作诊断试剂盒中的试剂或用作诊断工具，或者这些抗体可以用于竞争测定中以产生治疗试剂。
附图说明
图1是具有受限CD3结合的本公开文本的多特异性多肽构建体的基本组分的示意图。一个或多个抗原结合结构域位于氨基和/或羧基末端。Fc区(如异二聚体Fc区)位于CD3结合区的N末端。Fc靠近CD3结合区的这种定位阻碍了CD3结合。接头可以是如本文提供的不可切割接头。
图2A和B是由两条多肽即链1和链2构成的各种FRα靶向性受限CD3构建体的示意图。如图2A所示，链1含有FRαsdAb(抗原结合结构域)，其连接至异二聚体Fc“臼”，所述异二聚体Fc“臼”经由不可切割接头(范围从cx1356中的3个氨基酸至cx681中的18个氨基酸)连接至抗CD3 VL结构域，所述抗CD3 VL结构域连接至第二FRαsdAb；并且链2含有FRαsdAb，其连接至互补的异二聚体Fc“杵”，所述异二聚体Fc“杵”经由如上的相同不可切割接头连接至抗CD3 VH结构域，所述抗CD3 VH结构域连接至第二FRαsdAb。当共表达时，CD3结合结构域经由分别在臼和杵上的VL:VH的缔合而适当地组装(图2B)。示例性抗CD3是二硫化物稳定的Fv(dsFv)，其含有具有突变G100C的可变轻(VL)链和具有突变G44C的可变重(VH)链。
图3A是由两条多肽即链1和链2构成的各种B7H3靶向性受限CD3构建体的示意图。链1含有经由不可切割接头连接至在G100C处修饰的抗CD3 VL结构域的异二聚体Fc“臼”(顶部)；连接至异二聚体Fc“臼”的B7H3靶向性sdAb，所述异二聚体Fc“臼”经由不可切割接头连接至抗CD3 VL结构域(中间)；或连接至异二聚体Fc“臼”的B7H3靶向性sdAb，所述异二聚体Fc“臼”经由不可切割接头连接至在G100C处修饰的抗CD3 VL结构域(底部)。链2含有靶向B7H3的sdAb，其连接至互补异二聚体Fc“杵”，所述互补异二聚体Fc“杵”经由如上的接头连接至在G44C处修饰的抗CD3 VH结构域，所述抗CD3VH结构域连接至第二B7H3 sdAb(顶部)；靶向B7H3的sdAb，其连接至互补异二聚体Fc“杵”，所述互补异二聚体Fc“杵”经由如上的接头连接至抗CD3 VH结构域(中间)；或靶向B7H3的sdAb，其连接至互补异二聚体Fc“杵”，所述互补异二聚体Fc“杵”经由如上的接头连接至被G44C修饰的抗CD3 VH结构域(底部)。当共表达时，CD3结合结构域经由分别在臼和杵上的VL:VH的缔合而适当地组装。在指示的情况下，VH:VL相互作用是通过VH结构域中的修饰残基G44C与VL结构域中的G100C之间的工程化二硫键稳定化的。
图3B是由两条多肽即链1和链2构成的各种B7H3靶向性受限CD3构建体的示意图。链1含有异二聚体Fc“臼”，其经由不可切割接头连接至在G100C处修饰的抗CD3 VL结构域，所述抗CD3 VL结构域连接至共刺激受体靶向性sdAb。链2含有靶向B7H3的sdAb，其连接至互补异二聚体Fc“杵”，所述互补异二聚体Fc“杵”经由如上的接头连接至在G44C处修饰的抗CD3 VH结构域，所述抗CD3 VH结构域连接至第二靶向B7H3的sdAb(顶部)；异源二聚体Fc“杵”，其经由如上的接头连接至在G44C处修饰的抗CD3 VH结构域，所述抗CD3 VH结构域连接至靶向B7H3的sdAb(中间)；或靶向B7H3的sdAb，其连接至互补异二聚体Fc“杵”，所述互补异二聚体Fc“杵”经由如上的接头连接至被G44C修饰的抗CD3 VH结构域(底部)。当共表达时，CD3结合结构域经由分别在臼和杵上的VL:VH的缔合而适当地组装。VH:VL相互作用是通过VH结构域中的修饰残基G44C与VL结构域中的G100C之间的工程化二硫键稳定化的。所得的构建体以二价(顶部)或单价(中间和底部)方式接合B7H3。本文的所有构建体均表达含有共刺激受体靶向性sdAb。
图3C是由三条多肽即链1、链2和链3构成的各种B7H3靶向性受限CD3构建体的示意图，其中B7H3靶向结构域是FAB。链1含有BH73靶向性VH、经由铰链连接至异二聚体Fc的第一成员(Fc-Het-1)的IgG恒定重链1(CH1)，所述异二聚体Fc的第一成员经由如上的接头连接至缺乏(顶部)或含有(底部)G100C修饰的抗CD3 VL结构域。链2含有BH73靶向性VH、经由铰链连接至异二聚体Fc的第二成员(Fc-Het-2)的IgG恒定重链1(CH1)，所述异二聚体Fc的第二成员经由如上的接头连接至缺乏(顶部)或含有(底部)G44C修饰的抗CD3 VH结构域。链3含有连接至人Ig恒定轻(CL)区的互补的B7H3靶向性VL结构域。当共表达时，CD3结合结构域经由互补异二聚体Fc区上的VL:VH的缔合而适当地组装。在指示的情况下，VH:VL相互作用是通过VH结构域中的修饰残基G44C与VL结构域中的G100C之间的工程化二硫键稳定化的。
图4A是由两条多肽即链1和链2构成的各种DLL3靶向性受限CD3构建体的示意图。链1含有异二聚体Fc“臼”，其经由不可切割接头连接至在G100C处修饰的抗CD3 VL结构域，所述抗CD3 VL结构域连接至共刺激受体靶向性sdAb。链2含有靶向DLL3的sdAb，其连接至互补异二聚体Fc“杵”，所述互补异二聚体Fc经由如上的接头连接至在G44C处修饰的抗CD3 VH结构域，所述抗CD3 VH结构域连接至第二靶向DLL3的sdAb(顶部)；异源二聚体Fc“杵”，其经由如上的接头连接至在G44C处修饰的抗CD3 VH结构域，所述抗CD3 VH结构域连接至靶向DLL3的sdAb(中间)；或靶向DLL3的sdAb，其连接至互补异二聚体Fc“杵”，所述互补异二聚体Fc“杵”经由如上的接头连接至被G44C修饰的抗CD3 VH结构域(底部)。当共表达时，CD3结合结构域经由分别在臼和杵上的VL:VH的缔合而适当地组装。VH:VL相互作用是通过VH结构域中的修饰残基G44C与VL结构域中的G100C之间的工程化二硫键稳定化的。所得的构建体以二价(顶部)或单价(中间和底部)方式接合DLL3。本文的所有构建体均表达含有共刺激受体靶向性sdAb。
图4B是由两条多肽即链1和链2构成的DLL3靶向性受限CD3构建体cx5499的示意图。cx5499与图4A(顶部)中所示的cx5352相同，但在链1的C末端缺乏共刺激受体靶向性sdAb。当共表达时，CD3结合结构域经由分别在臼和杵上的VL:VH的缔合而适当地组装。VH:VL相互作用是通过VH结构域中的修饰残基G44C与VL结构域中的G100C之间的工程化二硫键稳定化的。所得的构建体以二价(顶部)或单价(中间和底部)方式接合DLL3。
图5A-D描绘了由代表性FRα靶向性受限CD3接合构建体cx1356和cx681进行的细胞结合。图5A和图5C示出了与Ovcar5细胞(FRα阳性卵巢癌细胞系)的结合。图5B和图5D描绘了与T细胞结合的缺乏。图5A和图5B显示了100nM每种构建体下的归一化细胞计数与荧光关系的直方图。在图5A和图5B中，仅二级抗人APC抗体对照示于填充的黑色迹线中，而阳性对照抗CD3结合示于空迹线中，并且cx1356和cx681示于灰色阴影迹线中。在各种细胞类型上每种构建体的完全滴定示于图5C和图5D中。
图6A-F描绘了由代表性B7H3靶向性受限CD3接合构建体进行的细胞结合。图6A、C和E示出了与A375细胞(B7H3阳性人黑色素瘤细胞系)的结合。图6B、D和F示出了与分离的T细胞的结合的缺乏。
图7A-F描绘了在FRα阳性IGROV1细胞(图7A、7C、7E)或FRα阴性NCI-H460细胞(图7B、7D、7F)的存在下，接头长度对激动CD3的能力的影响。图7A-B分别示出了2nM各种构建体在抗原阳性和阴性细胞上的CD3信号传导的动力学。图7C-D分别示出了2nM各种构建体在抗原阳性和阴性细胞上的CD3激动能力的大小。图7E-F分别示出了具有不同接头长度的各种构建体在抗原阳性和阴性细胞上的CD3激动能力的效力。将Jurkat CD3NFAT-GFP报告细胞系用于评估CD3信号传导。受限CD3结合蛋白仅在与靶细胞上的第二抗原结合时才有效地接合并聚集T细胞上的CD3。
图8A-D描绘了代表性B7H3靶向性受限CD3接合构建体以靶标依赖性的方式激动CD3的能力。图8A和图8C描绘了在B7H3阳性A375细胞的存在下介导CD3信号传导的能力，而图8B和图8D示出了在B7H3阴性CCRF-CEM细胞的存在下没有介导CD3信号传导的能力。将Jurkat CD3NFAT-GFP报告细胞系用于评估CD3激动作用。
图9A描绘了代表性B7H3靶向性受限CD3接合构建体(cx3072)以靶标依赖性方式诱导T细胞介导的细胞毒性的能力。用cytoID红色标记来标记靶细胞，并且通过添加半胱天冬酶3/7绿色试剂使死亡细胞可视化。通过确定红色靶细胞和绿色死亡细胞的重叠面积来评估细胞毒性。将通过CRISPR技术产生的B7H3阴性A375细胞系用于测试抗原特异性T细胞介导的细胞毒性。cx3072不能引发T细胞介导的对这些B7H3缺陷细胞的细胞毒性。
图9B示出了在B7H3阳性A375细胞的存在下cx5952诱导T细胞介导的细胞毒性的能力，但是在B7H3阴性CCRF-CEM细胞的存在下并没有所述能力。
图10A和图10B描绘了代表性B7H3靶向性受限CD3接合构建体以靶标依赖性方式诱导T细胞介导的细胞毒性的能力。图10A描绘了这些构建体在B7H3阳性A375细胞的存在下诱导T细胞介导的细胞毒性的能力，而图10B描绘了这些构建体在B7H3阴性CCRF-CEM细胞的存在下诱导T细胞介导的细胞毒性的能力。通过确定红色靶细胞和绿色死亡细胞的重叠面积来评估细胞毒性。
图10C和图10D描绘了代表性B7H3靶向性受限CD3接合构建体以靶标依赖性方式诱导T细胞介导的细胞毒性的能力。图10C描绘了这些构建体在B7H3阳性A375细胞的存在下诱导T细胞介导的细胞毒性的能力，而图10D描绘了这些构建体在B7H3阴性CCRF-CEM细胞的存在下诱导T细胞介导的细胞毒性的能力。通过确定红色靶细胞和绿色死亡细胞的重叠面积来评估细胞毒性。
图11A-C描绘了代表性B7H3靶向性受限CD3接合构建体(cx5952)以靶标依赖性方式诱导T细胞介导的T细胞激活的能力。通过T细胞激活标记物CD25(图11A)、CD69(图11B)和CD71(图11C)的表达来评估CD4+或CD8+ T细胞的T细胞激活。
图11D至图11K描绘了代表性B7H3靶向性受限CD3接合构建体以靶标依赖性方式诱导T细胞激活的能力。通过T细胞激活标记物CD25(图11D)和CD71(图11F)的表达示出了B7H3靶标依赖性CD4+ T细胞激活。通过T细胞激活标记物CD25(图11H)和CD71(图11J)的表达示出了B7H3靶标依赖性CD8+ T细胞激活。基于如CD4+ T细胞(图11E)或CD8+ T细胞(图11I)中所示的T细胞激活标记物CD25或基于如CD4+ T细胞(图11G)或CD8+ T细胞(图11K)中所示的T细胞激活标记物CD71，在不存在B7H3阳性细胞的情况下，未观察到T细胞激活。
图12A描绘了代表性B7H3靶向性受限CD3接合构建体以靶标依赖性方式诱导IFNγ产生的能力。图12A示出了在代表性B7H3靶向性CD3接合构建体的存在下，来自与B7H3阳性A375细胞一起培养和在B7H3阴性CCRF-CEM细胞的存在下培养的T细胞的IFNγ产生。
图12B描绘了代表性B7H3靶向性受限CD3接合构建体以靶标依赖性方式诱导IFNγ产生的能力。图12B示出了在代表性B7H3靶向性CD3接合构建体的存在下，来自与B7H3阳性A375细胞一起培养和在B7H3阴性CCRF-CEM细胞存在下培养的T细胞的IFNγ产生。
图13A和图13B描绘了代表性B7H3靶向性受限CD3接合构建体的细胞结合。cx5187和cx5823各自含有两个B7H3结合结构域，而复杂的cx5873和cx5965各自含有一个B7H3结合结构域。图13A示出了与B7H3阳性A375细胞的结合。图13B示出了与B7H3阴性CCRF-CEM细胞和分离的T细胞的结合的缺乏。
图13C和图13D描绘了代表性B7H3靶向性受限CD3接合构建体以靶标依赖性的方式激动CD3的能力。图13C显示，与对B7H3为单价的构建体(cx5873和cx5965)相比，用对B7H3为二价且为双表位的构建体(cx5187)接合B7H3阳性A375细胞诱导更有效的CD3信号传导。图13D示出了在B7H3阴性CCRF-CEM细胞的存在下T细胞的激活的缺乏。将Jurkat CD3 NFAT-GFP报告细胞系用于评估CD3激动作用。
图14A和图14B描绘了代表性B7H3靶向性受限CD3接合构建体以靶标依赖性方式诱导T细胞介导的细胞毒性的能力。图14A显示，与对B7H3为单价的构建体(cx5873和cx5965)相比，用对B7H3为二价且为双表位的构建体(cx5187)靶向B7H3阳性A375细胞诱导更有效的T细胞介导的细胞毒性。图14B描绘了针对B7H3阴性CCRF-CEM细胞缺乏T细胞介导的细胞毒性。
图15A-D描绘了在B7H3阳性A375细胞的存在下代表性B7H3靶向性受限CD3接合分子激活T细胞的能力，但是在B7H3阴性CCRF-CEM细胞的存在下并没有所述能力。图15A和图15B显示，与对B7H3为单价的构建体(cx5873和cx5965)相比，用对B7H3为二价且为双表位的构建体(cx5187)靶向B7H3阳性A375细胞诱导更有效的在CD4+和CD8+ T细胞上的CD25表达。图15C和图15D示出了在B7H3阴性CCRF-CEM细胞的存在下CD4+和CD8+ T细胞上CD25表达的缺乏。
图16A和图16B展示了在B7H3阳性A375细胞的存在下代表性B7H3靶向性受限CD3接合构建体引发T细胞介导的细胞毒性的能力(图16A)，但在CCRF-CEM B7H3阴性细胞的存在下并没有所述能力(图16B)。
图16C至图16J展示了在B7H3阳性A375细胞的存在下代表性B7H3靶向性受限CD3接合构建体引发T细胞激活的能力，但是在CCRF-CEM B7H3阴性细胞的存在下并没有所述能力，如通过以下评估的：CD4+ T细胞上CD25的表达(分别为图16C和图16D)、CD8+ T细胞上的CD25表达(分别为图16E和图16F)、CD4+ T细胞上的CD71表达(分别为图16G和图16H)、CD8+T细胞上的CD71表达(分别为图16I和图16J)。
图16K和图16L展示了在B7H3阳性A375细胞的存在下代表性B7H3靶向性受限CD3接合构建体引发T细胞细胞因子产生的能力(图16K)，但在CCRF-CEM B7H3阴性细胞的存在下并没有所述能力(图16L)。
图17A和图17B展示了单价(cx5800和cx5801)和二价(cx5352)DLL3靶向性受限CD3接合构建体与表达DLL3的细胞系SHP-77结合(图17A)，但不与分离的T细胞结合(图17B)。通过流式细胞术评估结合。
图17C描绘了在DLL3阳性SHP-77细胞的存在下，代表性DLL3靶向性受限CD3接合构建体激动CD3信号传导的能力。与对DLL3为单价的构建体(cx5800和cx5801)相比，用对DLL3为二价和双表位的构建体(cx5352)接合DLL3阳性细胞诱导更有效的T细胞激活。将JurkatCD3 NFAT-萤光素酶报告细胞系用于评估CD3信号传导。
图18A至图18E展示了在DLL3阳性SHP-77细胞的存在下，代表性DLL3靶向性受限CD3接合构建体cx5499引发T细胞介导的细胞毒性和T细胞激活的能力。图18A展示了在DLL3阳性SHP-77细胞的存在下，代表性DLL3靶向性受限CD3接合构建体引发T细胞介导的细胞毒性的能力。图18C至图18D展示了在DLL3阳性SHP-77细胞的存在下，代表性DLL3靶向性受限CD3接合构建体引发T细胞激活的能力，如通过以下评估的：在CD4+ T细胞上CD25的表达(图18B)、CD4+ T细胞上的CD69表达(图18C)、CD8+ T细胞上的CD25表达(图18D)和CD8+ T细胞上的CD69表达(图18E)。
具体实施方式
本公开文本提供了呈至少结合CD3和第二抗原的多特异性多肽构建体形式的受限T细胞接合融合蛋白。本文提供的多特异性多肽构建体至少包括第一组分，所述第一组分包括可操作地连接至免疫球蛋白Fc区、结合抗原的抗原结合结构域的一个或多个拷贝；第二组分，所述第二组分包括至少一个结合CD3的结合结构域(在本文中称为抗CD3结合结构域或CD3结合区，其是在本文中可互换使用的术语)的一个或多个拷贝；和连接第一组分与第二组分的接头，如多肽接头。在一些实施方案中，所述抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方案中，所述接头是不可切割接头。在一些实施方案中，所述接头不含有由蛋白酶特异性识别的底物识别位点，所述蛋白酶如为颗粒酶B、MMP或蛋白裂解酶(matriptase)的蛋白酶。
所提供的多特异性多肽构建体包括其中含有Fc区的第一组分在含有CD3结合区的第二组分的N末端的构型。在这种实施方案中，第一组分和第二组分经由在Fc区端的C末端的接头连接。在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域位于多特异性多肽构建体的氨基末端(N末端)区上。在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域位于多特异性多肽构建体的羧基末端(C末端)区上。在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域位于多特异性多肽构建体的N末端区和C末端区二者上。如本文提供的多特异性多肽构建体的各种构型示出在图1中。
所提供的多特异性多肽构建体展现出受限T细胞接合活性，因为一旦抗原经由抗原结合结构域结合，此类构建体仅基本上结合至CD3。这个示例于本文提供的实施例和图中，所述实施例和图展示出受限CD3接合蛋白有效地结合TAA阳性细胞、同时几乎不结合T细胞的能力。此独特特性允许受限CD3接合蛋白分布至存在TAA的位点，而不结合至外周T细胞。此形式与其他CD3接合多特异性构建体的不同之处在于不允许或消除组成型CD3结合，从而通过避免外周T细胞结合并允许优先分布至存在如由抗原结合结构域识别的抗原的一个或多个位点来提供显著益处。此外，其他CD3接合构建体介导抗原依赖性T细胞激活。然而，本文提供的多特异性多肽构建体介导抗原依赖性T细胞结合和激活二者。
在一些方面，所提供的多特异性多肽构建体的受限T细胞接合活性归因于Fc区在CD3结合区的N末端的定位。在一些实施方案中，这种定位降低、减弱、阻抑和/或防止由CD3结合区进行的CD3结合。在不存在由抗原结合结构域进行的抗原结合的情况下，本文提供的多特异性多肽构建体展示出降低或消除的CD3结合和T细胞激活能力。在一些实施方案中，在由多特异性多肽构建体的一个或多个抗原结合结构域介导的抗原结合事件的存在下，由CD3结合区结合CD3的能力大大增强。在一些实施方案中，在由多特异性多肽构建体的一个或多个抗原结合结构域介导的抗原结合事件的存在下，激活T细胞的能力大大增强。由多特异性多肽构建体内的一个或多个抗原结合结构域对其同源抗原的接合导致随后的T细胞接合并介导抗原依赖性T细胞激活，如细胞毒性、细胞因子释放、脱粒和增殖。在一些实施方案中，所提供的多特异性多肽构建体可以用于增加免疫应答，如增强T细胞活性，包括细胞溶解性(或细胞毒性)T细胞活性。在一些方面，免疫应答的调节可以治疗受试者的疾病或病症。
在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域结合肿瘤细胞或肿瘤微环境的细胞上的抗原。在一些方面，所提供的多特异性多肽构建体可以用于增加针对肿瘤或癌症的免疫应答，如T细胞活性，例如细胞毒性活性。在一些实施方案中，所提供的多特异性多肽构建体可以用于治疗受试者的肿瘤或癌症。
在一些实施方案中，本公开文本的多特异性多肽构建体确保不存在经由外周血中的CD3对T细胞的结合，因为这些构建体的CD3结合区因Fc区的存在受限或以其他方式被阻断和/或抑制。因此，本公开文本的多特异性多肽构建体提供了许多优点。在一些方面，这些构建体限制了由结合所有T细胞引起的下沉效应(sink effect)。在一些方面，这些构建体降低了全身性毒性。
在一些实施方案中，本公开文本的所提供多特异性多肽构建体允许受控地生物分布至受试者的所需部位，例如像肿瘤相关抗原(TAA)表达的部位。TAA表达的部位包括例如肿瘤和周围的肿瘤微环境。
在一些实施方案中，本公开文本的多特异性多肽构建体展现出对CD3和一种或多种其他抗原的特异性。在一些实施方案中，多特异性多肽构建体可以含有能够结合一种或多种TAA的多于一个抗原结合结构域，如2、3或4个抗原结合结构域，参见例如图1。在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域结合相同抗原。在一些实施方案中，多特异性多肽构建体包括结合相同抗原上的不同表位的多于一个抗原结合结构域。在一些实施方案中，多特异性多肽构建体包括结合一种或多种不同抗原的多于一个抗原结合结构域。在一些实施方案中，多特异性多肽构建体包括结合相同抗原上的不同表位的多于一个抗原结合结构域，以及包括结合一种或多种不同抗原的另外的抗原结合结构域。在一些方面，所提供的多特异性多肽构建体是双特异性多肽构建体，由此使得它们能够经由多特异性多肽构建体的抗原结合结构域的结合而结合至CD3和另一抗原(如TAA)。在一些例子中，所提供的多特异性多肽构建体是双特异性多肽构建体，其通过使用第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域提供对一个或多个TAA的多价接合。例如，在一些实施方案中，双特异性多肽构建体包括第一抗原结合单结构域抗体(sdAb)和第二抗原结合sdAb。
在一些实施方案中，就结合CD3并随后激活T细胞的能力而言，本文提供的多特异性多肽构建体以两种状态存在：(1)在未由所述一个或多个抗原结合结构域中的任一种或全部进行结合时，发生“无活性”状态，由此使得CD3结合受限且排除T细胞相互作用，和(2)在由所述一个或多个抗原结合结构域中的任一种或全部进行抗原结合时，发生“活性”状态，由此使得CD3结合区能够结合CD3并允许T细胞相互作用。
在一些实施方案中，Fc区经由一个或多个接头连接至CD3结合结构域。在一些实施方案中，Fc区经由一个或多个不可切割接头(如所述的任一种)连接至CD3结合区。
在一些实施方案中，所述Fc区是同二聚体Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区是异二聚体Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区是单体Fc区。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体的Fc区能够与FcγR相互作用并介导先天免疫效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体的Fc区能够与补体蛋白即C1q相互作用，并介导补体依赖性细胞毒性。因此，在一些方面，本公开文本的多特异性多肽构建体允许多重免疫效应子机制，包括先天免疫效应子和T细胞。
在一些实施方案中，本公开文本的多特异性多肽构建体允许T细胞和NK细胞介导的细胞毒性同时发生。在一些情况下，这种活性可以在多特异性多肽构建体中发生，所述多特异性多肽构建体中含有可以靶向给定TAA上的不同和/或非竞争性表位的第一抗原结合结构域(例如第一抗TAA抗原结合结构域)和第二抗原结合结构域(例如第二抗TAA抗原结合域)。
设想受限CD3接合构建体适合与任何TAA结合结构域一起使用，从而通过避免与外周T细胞的相互作用并介导有效的TAA依赖性T细胞的细胞毒性而允许在肿瘤或肿瘤微环境内更佳的治疗性暴露。在一些实施方案中，第二部分或组分含有对CD3为单价的CD3结合区，由此使得除非存在TAA，否则不会激活T细胞。
在一些方面，本公开文本的多特异性多肽构建体提供了优于当前双特异性治疗剂的许多优点。本公开文本的多特异性多肽构建体小于常规治疗性抗体(例如150kDa相比于125kDa)，这将允许更佳靶标(肿瘤)渗透。在一些方面，整个多特异性多肽构建体的大小为构建体提供了长的半衰期。在一些方面，本公开文本的多特异性多肽构建体展现出降低的全身性毒性或肿瘤和/或肿瘤微环境之外的任何区域的毒性，这是因为由CD3结合区进行的CD3结合取决于在发生CD3接合之前的TAA接合。
本文引用的所有出版物和专利文件都通过引用并入本文，如同每个这种出版物或文件均被明确地且单独地被指明通过引用并入本文一样。出版物和专利文件的引用并非旨在承认任一种是相关现有技术，其也不欲构成对此类出版物和专利文件的内容或日期的任何承认。现已通过书面描述阐述了本发明，本领域技术人员将认识到，本发明可在各种实施方案中实践并且前述说明和以下实施例用于说明目的，而不限制后面的权利要求。
I.定义
除非另外定义，否则结合本公开文本使用的科学和技术术语应具有由本领域普通技术人员通常所理解的含义。术语“一个/种(a)”实体或“一个/种(an)”实体是指一个/一种或多个/多种该实体。例如，化合物是指一种或多种化合物。因此，术语“一个/一种(a/an)”、“一个/一种或多个/多种(one or more)”以及“至少一个/一种(at least one)”可以互换使用。此外，除非另外通过上下文要求，否则单数的术语应包括复数并且复数术语应包括单数。通常，与本文所述的细胞及组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交结合使用的命名法及其技术是本领域中熟知且常用的那些。对于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如电穿孔、脂质转染)，使用标准技术。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书或如本领域通常实现或如本文所述进行。前述技术和程序总体上根据本领域中熟知的常规方法并且如本说明书全篇所引用和讨论的各个通用和更具体参考文献中所述来进行。参见例如Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,冷泉港,纽约州(1989))。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学化学和药物化学结合使用的命名法及其实验室程序和技术是本领域中熟知且常用的那些。对于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗，使用标准技术。
除非另有说明，否则如根据本公开文本所用，以下术语应理解为具有以下含义：
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的抗原结合部分，即含有特异性结合抗原(与抗原免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“与……免疫反应”或“免疫特异性结合”意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原性决定簇反应，并且不与其他多肽反应或以低得多的亲和力(Kd>10-6)结合。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、完全人抗体、结构域抗体、单链抗体、Fab和F(ab')2片段、Fv、scFv和Fab表达文库。通常，“抗原结合片段”含有免疫球蛋白重链和/或轻链的与目的抗原的至少一个表位结合的至少一个CDR。就这一点而言，抗原结合片段可以包含来自结合抗原的抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列的1、2、3、4、5个或全部6个CDR，如对于含有VH和VL的抗体通常包含六个CDR(对于重链和轻链中的每一条为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”)，或对于含有单可变结构域的抗体包含三个CDR。抗原结合片段包括单结构域抗体，如仅含有VH或仅含有VL的那些，包括例如VHH、VNAR、工程化VH或VK结构域。
已知基本的抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每一对具有一个“轻”(约25kDa)链和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100个至110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分限定恒定区，主要负责效应子功能。通常，自人获得的抗体分子涉及种类IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任一种，其因分子中存在的重链的性质彼此不同。某些类别也具有亚类，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。此外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。
如本文所用，术语“单克隆抗体”(mAb)或“单克隆抗体组合物”是指含有抗体分子的仅一种分子种类的抗体分子群体，所述抗体分子的仅一种分子种类由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成。特别地，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在群体的所有分子中都是相同的。MAb含有能够与抗原的特定表位免疫反应的抗原结合位点，其特征在于对抗原的独特结合亲和力。
术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重(“H”)和轻(“L”)链的N末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。在重链和轻链的V区内的三个高度发散的区段(称为“高变区”)插入称为“框架区”或“FR”的更保守的侧翼区段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中高变区之间和附近的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此布置以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补，并且重链和轻链中的每一条的三个高变区称为“互补决定区”或“CDR”。每个结构域的氨基酸分配是按照以下的定义：Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,贝塞斯达,马里兰州(1987和1991))，或Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987)，Chothia等人Nature 342:878-883(1989)。
如本文所用，术语“表位”包括由抗体、抗体片段或其他结合结构域靶向的抗原的任何特定部分。术语“表位”包括特异性结合所针对的任何蛋白质区。术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。例如，可以产生针对多肽的N末端、中心或C末端肽的抗体。此外，可以产生针对多肽的线性或不连续表位的抗体。当解离常数≤1μM；例如，在一些实施方案中，≤100nM，并且在一些实施方案中，≤10nM，并且不显示与紧密相关或不同的其他蛋白质的结合时，抗体被认为特异性地结合抗原。
如本文所用，术语“特异性结合”、“免疫结合”和“免疫结合特性”是指在免疫球蛋白分子与免疫球蛋白特异性针对的抗原之间发生的类型的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以表示为相互作用的解离常数(Kd)，其中较小的Kd表示较大的亲和力。可以使用本领域熟知的方法定量所选多肽的免疫结合特性。一种这样的方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力以及同样影响两个方向上的速率的几何参数。因此，“缔合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)二者均可以通过计算浓度和实际的缔合和解离速率来确定。(参见Nature 361:186-87(1993))。Koff/Kon的比率使得可以取消所有与亲和力无关的参数，并且等于解离常数Kd。(通常参见Davies等人(1990)Annual Rev Biochem 59:439-473)。如通过如放射性配体结合测定或本领域技术人员已知的类似测定的测定所测量的，当结合常数(Kd)为≤1μM时，例如在一些实施方案中为≤100nM，在一些实施方案中为≤10nM，并且在一些实施方案中为≤100pM至约1pM，则认为本公开文本的抗体特异性地结合EGFR。
如本文所用，术语“分离的多核苷酸”应意指基因组、cDNA或合成来源或其某种组合的多核苷酸，根据其来源，所述“分离的多核苷酸”(1)不与在自然界中发现其所在的多核苷酸的全部或一部分缔合，(2)可操作地连接至在自然界中其并不连接的多核苷酸，或(3)在自然界中不作为更大序列的一部分存在。根据本公开文本的多核苷酸包括编码本文所示的重链免疫球蛋白分子的核酸分子，以及编码本文所示的轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。
本文提及的术语“分离的蛋白质”意指cDNA、重组RNA或合成来源或其某种组合的蛋白质，根据其来源或衍生源，“分离的蛋白质”(1)不与在自然界中发现的蛋白质缔合，(2)不含来自同一来源的其他蛋白质，例如不含鼠类蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。
术语“多肽”在本文中用作通用术语，是指多肽序列的天然蛋白质、片段或类似物。因此，天然蛋白质片段和类似物是多肽属的种类。根据本公开文本的多肽包含本文所示的重链免疫球蛋白分子和本文所示的轻链免疫球蛋白分子，以及由包含重链免疫球蛋白分子与轻链免疫球蛋白分子(如κ轻链免疫球蛋白分子)的组合形成的抗体分子且反之亦然，以及其片段和类似物。
如本文所用，应用于对象的术语“天然存在的”是指对象可以在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的可以从自然界中的来源分离且尚未经实验室的人员有意修饰或以其他方式修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指如此描述的组分的位置处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。“可操作地连接”至编码序列的控制序列以使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列表达的方式连接。
如本文所用，术语“控制序列”是指实现与它们连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。此类控制序列的性质根据原核生物中的宿主生物体而不同，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和真核生物中的转录终止序列，通常，此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在至少包括其存在对于表达和加工必不可少的所有组分，并且还可以包括其存在是有利的另外的组分，例如前导序列和融合配偶体序列。如本文中提及的术语“多核苷酸”意指长度为至少10个碱基的核苷酸，其是核糖核苷酸或脱氧核苷酸，或者是任一类型核苷酸的修饰形式。所述术语包括单链和双链形式的DNA。
本文提及的术语“寡核苷酸”包括通过天然存在的和非天然存在的寡核苷酸连接而连接在一起的天然存在的和修饰的核苷酸。寡核苷酸是通常包含200个碱基或更少的长度的多核苷酸亚组。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为10至60个碱基，例如在一些实施方案中长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个碱基。寡核苷酸通常是单链的，例如用于探针，但是寡核苷酸可以是双链的，例如用于构建基因突变体。本公开文本的寡核苷酸是有义或反义寡核苷酸。
本文提及的术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文提及的术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰的或取代的糖基团等的核苷酸。本文提及的术语“寡核苷酸连接”包括如以下的寡核苷酸连接：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代缩苯胺磷酸酯、缩苯胺磷酸酯、氨基磷酰酯等。参见例如LaPlanche等人Nucl.Acids Res.14:9081(1986)；Stec等人J.Am.Chem.Soc.106:6077(1984)；Stein等人Nucl.Acids Res.16:3209(1988)；Zon等人Anti Cancer Drug Design 6:539(1991)；Zon等人Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,第87-108页(F.Eckstein编辑,Oxford University Press,牛津英格兰(1991))；Stec等人美国专利号5,151,510；Uhlmann和Peyman Chemical Reviews 90:543(1990)。如果需要，寡核苷酸可以包括用于检测的标记。
如本文所用，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology-ASynthesis(第2版,E.S.Golub和D.R.Gren编辑,Sinauer Associates,Sunderland7 Mass.(1991))。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)；非天然氨基酸(如α-,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸)也可以是本公开文本的多肽的合适组分。非常规氨基酸的例子包括：4羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸以及其他类似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽表示法中，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向并且右手方向是羧基末端方向。
类似地，除非另有说明，否则单链多核苷酸序列的左手端是5'端，双链多核苷酸序列的左手方向称为5'方向。新生RNA转录物的5'至3'添加方向称为转录方向，DNA链上具有与RNA相同的序列且在RNA转录物的5'端的5'处的序列区称为“上游序列”，DNA链上具有与RNA相同的序列且在RNA转录物的3'端的3'处的序列区称为“下游序列”。
应用于多肽时，术语“基本同一性”意指两个肽序列当如通过GAP或BESTFIT程序使用默认空位权重最佳比对时，享有至少80％的序列同一性，例如，在一些实施方案中，至少90％的序列同一性，在一些实施方案中，至少95％的序列同一性，并且在一些实施方案中，至少99％的序列同一性。
在一些实施方案中，不相同的残基位置通过保守氨基酸取代而不同。
如本文所讨论，设想抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的微小变化被本公开文本涵盖，前提条件是氨基酸序列中的变化保持至少75％，例如，在一些实施方案中，至少80％、90％、95％，并且在一些实施方案中99％。特别地，设想保守氨基酸替代。保守替代是在其侧链中相关的氨基酸家族内发生的那些。遗传编码的氨基酸通常分为以下家族：(1)酸性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸，以及(4)不带电荷的极性氨基酸是甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。其他氨基酸家族包括：(i)丝氨酸和苏氨酸，其是脂肪族羟基家族；(ii)天冬酰胺和谷氨酰胺，其是含有酰胺的家族；(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，其是脂肪族的家族；以及(iv)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其是芳香族的家族。例如，可以合理地预期孤立地用异亮氨酸或缬氨酸替代亮氨酸、用谷氨酸替代天冬氨酸、用丝氨酸替代苏氨酸、或用结构上相关的氨基酸类似地替代氨基酸不会对所得分子的结合或特性具有重大影响，尤其是在替代不涉及框架位点内的氨基酸时。氨基酸改变是否导致功能性肽可以通过测定多肽衍生物的比活性而容易地确定。本文详细描述了测定。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可以由本领域普通技术人员容易地制备。在一些实施方案中，片段或类似物的氨基和羧基末端出现在功能结构域的边界附近。可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库进行比较来鉴定结构和功能结构域。使用计算机化比较方法来鉴定在已知结构和/或功能的其他蛋白质中出现的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie等人Science253:164(1991)。因此，前述例子证明，本领域技术人员可识别可用于定义根据本公开文本的结构和功能结构域的序列基序和结构构象。
在一些实施方案中，氨基酸取代是以下的那些：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，以及(4)赋予或改变此类类似物的其他物理化学或功能特性。类似物可以包括具有并非天然存在的肽序列的序列的各种突变蛋白。例如，可以在天然存在的序列中(例如，在形成分子间接触的一个或多个结构域外的多肽部分中)进行单一或多个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应实质上改变亲本序列的结构特征(例如，替代氨基酸不应倾向于中断亲本序列中出现的螺旋，或破坏亲本序列所特有的其他类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级和三级结构的例子描述于以下文献中：Proteins,Structures andMolecular Principles(Creighton编辑,W.H.Freeman and Company,纽约(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编辑,Garland Publishing,纽约,纽约州(1991))；和Thornton等人Nature 354:105(1991)。
如本文所用，术语“多肽片段”是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失和/或一个或多个内部缺失的多肽，但是其中剩余的氨基酸序列与从例如全长cDNA序列推断的天然存在的序列中的相应位置相同。片段通常为至少5、6、8或10个氨基酸长，例如，在一些实施方案中，至少14个氨基酸长，在一些实施方案中，至少20个氨基酸长，通常至少50个氨基酸长，并且在一些实施方案中，至少70个氨基酸长。如本文所用，术语“类似物”是指由至少25个氨基酸的区段构成的多肽，所述区段与推断的氨基酸序列的一部分具有实质同一性并且在合适的结合条件下对EGFR具有特异性结合。通常，多肽类似物相对于天然存在的序列包含保守氨基酸取代(或添加或缺失)。类似物通常为至少20个氨基酸长，例如，在一些实施方案中，至少50个氨基酸长或更长，并且经常可以与全长天然存在的多肽一样长。
术语“药剂”在本文中用于表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物。
如本文所用，术语“标记”或“标记的”是指掺入可检测的标记物，例如通过掺入放射性标记的氨基酸或附接至具有生物素基部分的多肽，所述生物素基部分可以通过加标记的抗生物素蛋白(例如，含有可通过光学或量热方法检测的荧光标记物或酶活性的链霉抗生物素蛋白)检测。在一些情况下，标记或标记物也可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法在本领域是已知的并且可以被使用。用于多肽的标记的例子包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如，荧光团、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、p-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基团、由二级报告物识别的预定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔区臂附接以减少潜在的空间位阻。如本文所用，术语“药用剂或药物”是指在适当给予至患者时能够诱导所需治疗效果的化学化合物或组合物。
如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或其任何组合。
术语“药物组合物”是指适用于哺乳动物受试者(通常为人)中的医药用途的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性剂(例如，多特异性多肽构建体)和载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂或稀释剂通常分别是药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
如本文所用，术语疾病或障碍的“治疗”(“treating”、“treatment”)或“疗法”意指通过给予单独的或与如本文所述另一化合物组合的本公开文本的药物组合物来减慢、停止或逆转疾病或障碍的进展，如通过临床或诊断症状的减少、中止或消除所证实的。“治疗”(“treating”、“treatment”)或“疗法”还意指急性或慢性疾病或障碍中症状的严重程度降低或复发率降低。如本文在癌症的背景下所用，术语癌症的“治疗”或“抑制”(“inhibit”、“inhibiting”或“inhibition”)是指以下各项中的至少一种：肿瘤生长速率的统计学上显著的降低；肿瘤停止生长；或肿瘤的大小、质量、代谢活动或体积的减少，如通过标准准则(例如但不限于实体肿瘤的反应评价准则(RECIST))测量的；或无进展存活期(PFS)或总存活期(OS)的统计学上显著的增加。疾病或障碍的“预防”(“preventing”、“prophylaxis”或“prevention”)是指给予单独的或与另一化合物组合的药物组合物，以防止疾病或障碍或疾病或障碍的一些或所有症状出现或发作，或减少疾病或障碍发作的可能性。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指组合物当单独(即作为单一疗法)或与另外的治疗剂组合给予至患者时，对疾病进展(例如通过改善或消除疾病症状和/或病因)产生统计学上显著的降低的量和/或浓度。有效量可以是缓解、减轻或缓和与疾病或障碍相关的至少一种症状或生物反应或效应，防止疾病或障碍的进展，或改善患者的身体功能的量。
如本文所用，“基本上纯的”意指目标物质是存在的主要物质(即，基于摩尔，其比组合物中的任何其他单独物质更丰富)，且基本上纯化的级分是其中目标物质包含占存在的所有大分子物质的至少约50％(基于摩尔)的组合物。
通常，基本上纯的组合物将占组合物中存在的所有大分子物质的多于约80％，例如，在一些实施方案中，多于约85％、90％、95％和99％。在一些实施方案中，将目标物质纯化至本质上同质(通过常规检测方法不能检测到组合物中的污染物质)，其中组合物基本上由单一大分子物质组成。
术语患者包括人和兽医学受试者。
本文中的其他化学术语是根据本领域的常规用法使用的，如McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(Parker,S.编辑,McGraw-Hill,旧金山(1985))所示例的。
如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
II.多特异性多肽构建体
本文提供了多特异性多肽构建体，其包含含有免疫球蛋白Fc区的第一组分和含有CD3结合区的第二组分，其中所述第一组分和所述第二组分通过接头偶联，其中所述Fc区位于所述CD3结合区的N末端；并且所述第一组分和所述第二组分中的一种或两种包含结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述接头是不可切割接头。在一些实施方案中，所述接头不含有由蛋白酶特异性识别以切割的底物识别位点。
在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体从N末端到C末端按顺序含有：免疫球蛋白Fc区；接头；结合CD3(CD3ε)的CD3结合区；和结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体从N末端到C末端按顺序含有：结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域；免疫球蛋白Fc区；接头；和结合CD3(CD3ε)的CD3结合区。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体至少含有结合TAA的第一抗原结合结构域和结合TAA的第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述多特异性多肽构建体从N末端到C末端按顺序含有：结合肿瘤相关抗原(TAA)的第一抗原结合结构域；免疫球蛋白Fc区；接头；结合CD3(CD3ε)的CD3结合区；和结合肿瘤相关抗原(TAA)的第二抗原结合结构域。
下文更详细地描述了本公开文本的多特异性多肽构建体的每个组分。
1.抗CD3结合结构域：
本公开文本的多特异性多肽构建体包括抗CD3结合结构域的一个或多个拷贝。本公开文本的抗CD3结合结构域通过接合T细胞上的CD3ε来激活T细胞。本公开文本的抗CD3结合结构域激动、刺激、激活和/或以其他方式增大CD3介导的T细胞激活。CD3的生物活性包括例如通过CD3与T细胞受体(TCR)的抗原结合亚基之间的相互作用进行的T细胞激活和其他信号传导。例如，本公开文本的抗CD3结合结构域通过接合T细胞上的CD3ε，通过部分或完全调节(例如激动、刺激、激活或以其他方式增大)CD3介导的T细胞激活来完全或部分激活T细胞。
在优选的实施方案中，本公开文本的抗CD3结合结构域特异性地结合CD3的ε链(也称为CD3ε)。本公开文本的抗CD3ε结合结构域通过接合T细胞上的CD3ε来激活T细胞。本公开文本的抗CD3ε结合结构域包括单克隆抗体，例如像哺乳动物单克隆抗体、灵长类单克隆抗体、完全人单克隆抗体以及人源化单克隆抗体和嵌合抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括抗体或其抗原结合片段的一个或多个拷贝。
在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:16)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:17)的VH CD2序列；以及至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:18)的VH CDR3序列。在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VHCDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:211)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ ID NO:212)的VH CDR2序列；以及至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:18)的VH CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:19)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:20)的VL CDR2序列；以及至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:21)的VLCDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括至少包括氨基酸序列TYAMN(SEQ IDNO:16)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:17)的VHCDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:18)的VH CDR3序列；至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:19)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:20)的VL CDR2序列；以及至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:21)的VLCDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括至少包括氨基酸序列GFTFNTYAMN(SEQID NO:211)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ ID NO:212)的VHCDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:18)的VH CDR3序列；至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:19)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:20)的VL CDR2序列；以及至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:21)的VLCDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括至少包括氨基酸序列GFTFNTYAMN(SEQID NO:211)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ ID NO:212)的VHCDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:18)的VH CDR3序列；至少包括氨基酸序列GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:229)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:230)的VL CDR2序列；以及至少包括氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ IDNO:225)的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:16)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的序列的VH CDR1序列；包括与氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ IDNO:17)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的序列的VH CDR2序列；和包括与氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:18)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的序列的VH CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:211)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的序列的VH CDR1序列；包括与氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ IDNO:212)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的序列的VH CDR2序列；和包括与氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:18)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的序列的VH CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:19)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的序列的VL CDR1序列；包括与氨基酸序列GTNKRAP(SEQ IDNO:20)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的序列的VL CDR2序列；和包括与氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:21)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的序列的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括与氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:16)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VH CDR1序列；与氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:17)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VH CD2序列；与氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQID NO:18)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VHCDR3序列；与氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:19)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR1序列；与氨基酸序列GTNKRAP(SEQID NO:20)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VLCDR2序列；以及与氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:21)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括与氨基酸序列GFTFNTYAMN(SEQ IDNO:211)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VHCDR1序列；与氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ ID NO:212)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VH CDR2序列；与氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:18)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VH CDR3序列；与氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:19)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR1序列；与氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:20)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR2序列；以及与氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:21)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括与氨基酸序列GFTFNTYAMN(SEQ IDNO:211)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VHCDR1序列；与氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ ID NO:212)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VH CDR2序列；与氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:18)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VH CDR3序列；与氨基酸序列GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:229)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR1序列；与氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:230)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR2序列；以及与氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:225)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括至少包括氨基酸序列GFTFSTYAMN(SEQID NO:227)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ ID NO:228)的VHCDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGDSYVSWFAY(SEQ ID NO:224)的VH CDR3序列；至少包括氨基酸序列GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:229)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:230)的VL CDR2序列；以及至少包括氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ IDNO:225)的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括与氨基酸序列GFTFSTYAMN(SEQ IDNO:227)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VHCDR1序列；与氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ ID NO:228)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VH CDR2序列；与氨基酸序列HGNFGDSYVSWFAY(SEQ ID NO:224)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VH CDR3序列；与氨基酸序列GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:229)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR1序列；与氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:230)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR2序列；以及与氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:225)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括至少包括氨基酸VLWYSNRWV(SEQ IDNO:226)的CDR3。在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括与氨基酸VLWYSNRWV(SEQ IDNO:226)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的CDR3。
在一些实施方案中，所述抗CD3ε结合结构域包括选自以下的抗体或其抗原结合片段的一个或多个拷贝：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体、和单结构域轻链抗体。在一些实施方案中，所述抗CD3结合结构域包括结合CD3ε的Fv抗体片段(在本文中称为抗CD3εFv片段)。在一些实施方案中，所述抗CD3εFv抗体片段是二硫化物稳定的抗CD3结合Fv片段(dsFv)。在一些实施方案中，抗CD3结合结构域对于结合CD3为单价的。
在一些实施方案中，CD3结合区不是单链抗体。例如，在一些方面，CD3结合区不是单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，CD3结合区是含有可变重链(Hv，也称为VH)和可变轻链(Lv，也称为VL)的Fv抗体片段，如所述的任一种。在此类实施方案的方面中，免疫球蛋白Fc区是异二聚体Fc区，其含有能够在Fc异二聚体的两条多肽之间进行异二聚体缔合的两个不同Fc多肽，如章节II.2中所述的任一种。在此类实施方案中，CD3结合区的可变重链(VH)和可变轻链(VL)连接在异二聚体Fc的相对链上。
在一些实施方案中，抗CD3εFv抗体片段包括选自SEQ ID NO:32-81的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD3εFv抗体片段包括与选自SEQ ID NO:32-81的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD3εFv抗体片段包括选自SEQ ID NO:32-62的氨基酸序列与选自SEQ IDNO:63-81的氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，抗CD3εFv抗体片段包括与选自SEQ IDNO:32-62的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列和与选自SEQ ID NO:63-81氨基酸序列的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的组合。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有选自SEQ ID NO:32-81的氨基酸序列的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括选自SEQ ID NO:32-62的重链可变区氨基酸序列和含有选自SEQ IDNO:63-81的氨基酸序列的轻链可变区氨基酸序列的组合。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域是Fv片段，所述Fv片段包括重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域是Fv片段，所述Fv片段包括重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列的组合，所述重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列包含与选自SEQ ID NO:14、15、32-81、191、196-200、211和212的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域是Fv片段，其包括重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列的组合，所述重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:14、15、32-81、191、196-200、211和212的氨基酸序列。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域是Fv片段，所述Fv片段包括选自SEQ ID NO:14、32-62、196-198和211的重链可变氨基酸序列和选自SEQ ID NO:15、63-81、191、199、200和212的轻链可变氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域是Fv片段，所述Fv片段包括与选自SEQ ID NO:14、32-62、196-198和211的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的重链可变氨基酸序列和与选自SEQ ID NO:15、63-81、191、199、200和212的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的轻链可变氨基酸序列的组合。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的组合，所述重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列包含选自SEQID NO:32-81、191、196-200、211和212的氨基酸序列。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括选自SEQ ID NO:32-62、196-198和211的重链可变区氨基酸序列和含有选自SEQID NO:63-81、191、199、200和212的氨基酸序列的轻链可变区氨基酸序列的组合。
在一些实施方案中，抗CD3εFv抗体片段包括与选自SEQ ID NO:14、32-43、45-47、48、196和211的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列和与选自SEQ ID NO:15、63、65-71、73、75、77和199的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，抗CD3εFv抗体片段包括选自SEQ ID NO:14、32-43、45-47、48、196和211的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:15、63、65-71、73、75、77和199的氨基酸序列的组合。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:196的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:199的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:196的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有与SEQ ID NO:199的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:196的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:199的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:196的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有SEQ ID NO:199的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在特定实施方案中，Fv是二硫化物稳定的Fv片段(dsFv)，其中VH-VL异二聚体通过链间二硫键稳定。在一些实施方案中，通过VH和/或VL链的框架位置中的位置突变来工程化链间二硫键。在一些实施方案中，根据Kabat编号，所述二硫化物稳定的抗CD3 Fv包含具有至Cys的突变44的抗CD3 VH和具有至Cys的突变100的抗CD3 VL。例如，在一些实施方案中，VH链含有突变G44C，并且VL链含有突变G100C，每个所述突变均根据kabat编号。在一些实施方案中，根据Kabat编号，所述二硫化物稳定的抗CD3 Fv包含具有在位置105的突变的抗CD3VH和具有至Cys的位置43突变的抗CD3VL。
在一些实施方案中，抗CD3εFv抗体片段包括与选自SEQ ID NO:44、49-62、197和198的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列和与选自SEQ ID NO:64、72、74、76、78-81、191、200和212的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的组合。在任何此类实施方案中的一些中，抗CD3Fv是dsFv，所述dsFv具有含有突变G44C的VH链和含有突变G100C的VL链，每一种突变均根据kabat编号。在一些实施方案中，抗CD3εFv抗体片段包括选自SEQ ID NO:44、49-62、197和198的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:64、72、74、76、78-81、191、200和212的氨基酸序列的组合。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:44的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:72的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:44的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有与SEQ ID NO:72的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在任何此类实施方案中的一些中，抗CD3Fv是dsFv，所述dsFv具有含有突变G44C的VH链和含有突变G100C的VL链，每一种突变均根据kabat编号。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:198的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:200的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:198的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有与SEQ ID NO:200的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在任何此类实施方案中的一些中，抗CD3Fv是dsFv，所述dsFv具有含有突变G44C的VH链和含有突变G100C的VL链，每一种突变均根据kabat编号。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:198的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:200的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:198的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有SEQ ID NO:200的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:197的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:200的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有与SEQ ID NO:197的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有与SEQ ID NO:200的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在任何此类实施方案中的一些中，抗CD3Fv是dsFv，所述dsFv具有含有突变G44C的VH链和含有突变G100C的VL链，每一种突变均根据kabat编号。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:197的氨基酸序列的可变重链(VH)。在一些实施方案中，抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:200的氨基酸序列的可变轻链(VL)。在一些实施方案中，其抗CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:197的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有SEQ ID NO:200的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
2.免疫球蛋白Fc多肽：
本公开文本的多特异性多肽构建体的第一组分包括免疫球蛋白Fc区。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc区是选自以下的IgG同种型：IgG1同种型、IgG2同种型、IgG3同种型和IgG4亚类。在一些实施方案中，Fc区是人Fc。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是包含选自SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区含有Fc链，所述Fc链为SEQ ID No:1-6中任一个的免疫活性片段。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区含有与SEQ ID NO:1-6中任一个的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的Fc多肽链或其免疫活性片段。
在一些实施方案中，多特异性多肽构建体是由各自含有Fc的多肽形成的二聚体。在一些具体的实施方案中，相同或基本上相同的多肽将被二聚化以产生同二聚体。在一些实施方案中，二聚体是其中多特异性多肽构建体的两条多肽相同的同二聚体。在其他情况下，Fc区由Fc结构域形成，所述Fc结构域被突变或修饰以促进异二聚化，其中不同的多肽可以被二聚化以产生异二聚体。因此，在一些实施方案中，二聚体是其中多特异性多肽构建体的两条多肽链不同的异二聚体。促进异二聚化的示例性修饰是已知的，包括如下文所述的任一种。
通常，除了作为免疫球蛋白的主要功能的抗原结合能力之外，Fc区还负责效应子功能，如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。此外，Fc区中存在的FcRn序列通过与体内FcRn受体缀合增加体内半衰期而起到调节血清中IgG水平的作用。在一些实施方案中，可以在Fc中改变(如降低或增强)此类功能以与所提供的多特异性多肽构建体一起使用。
在一些实施方案中，所提供的多特异性多肽构建体的Fc区展现出一种或多种效应子功能。在一些情况下，Fc区能够提供Fc介导的效应子功能，例如像ADCC(例如，由NK细胞释放颗粒酶B)、ADCP和/或CDC。因此，在其中多特异性多肽构建体含有可切割接头的一些实施方案中，接头的切割可以产生两个各自具有生物学活性的组分：能够结合并接合T细胞上的CD3的CD3结合区和可展现出靶标特异性效应子功能、连接至TAA抗原结合结构域的Fc区。在本文提供的特定实施方案中，多特异性多肽构建体含有不可切割接头，并且在一些方面可能不展现出独立的Fc介导的效应子功能。
在一些实施方案中，Fc区包括被突变或修饰以改变一种或多种效应子功能的Fc多肽。已知Fc多肽突变(以改变(如降低)效应子功能)的各种例子，包括如下文所述的任一种。在一些实施方案中，除非参考特定的SEQ ID NO进行描述，否则对Fc区中的氨基酸取代的提及是根据Kabat的E U编号(也称为Kabat编号)。EU编号是已知的，并且按照最新更新的IMGTScientific Chart(
Figure BDA0002817785800000631
国际ImMunoGeneTics
Figure BDA0002817785800000632
http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html(创建：2001年5月17日，最后更新：2013年1月10日)和如Kabat,E.A.等人Sequences of Protei ns of Immunologicalinterest.第5版美国卫生和公众服务部,NIH公开号91-3242(1991)中报告的EU索引。
在一些实施方案中，所提供的含有展现出降低的效应子功能的Fc区的多特异性多肽构建体对于其中需要受限CD3结合但某些效应子功能(如CDC和ADCC)是不必要或有害的应用而言可能是理想候选物。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保多特异性多肽构建体和/或其切割组分缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγR II和FcγRIII。用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性例子描述于以下文献中：美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337(参见Bruggema nn,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。可替代地，可以使用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology公司，山景城，加利福尼亚州)；和CytoTox 96TM非放射性细胞毒性测定(Promega，麦迪逊，威斯康辛州)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可以在体内(例如在动物模型中，如Clynes等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中)评估目的分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定以证实多特异性多肽构建体和/或其切割组分不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glenni e,Blood 103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等人,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc区或其免疫活性片段是IgG同种型。例如，融合蛋白的免疫球蛋白Fc区是人IgG1同种型的，具有氨基酸序列：
Figure BDA0002817785800000641
在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc区或其免疫活性片段包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人IgG1多肽序列。
在一些实施方案中，可以将IgG1 Fc多肽或其变体(如下文所述的任一种)制备为G1 m1或G1 m3同种异型。在一些实施方案中，Fc区可以含有人G1 m1同种异型的氨基酸，如在位置356和358处含有Asp(D)和Leu(L)的残基，例如如SEQ ID NO:1所示。在一些情况下，Fc多肽可以含有氨基酸取代E356D和M358L以重构同种异型G1 m1的残基。在其他实施方案中，Fc区可以含有人G1 m3同种异型的氨基酸，例如根据EU编号在位置356和358处的残基Glu(E)和Met(M)，例如如SEQ ID NO:194和195所示。在一些情况下，Fc多肽可以含有氨基酸取代D356E和L358M以重构同种异型G1m3的残基。在一些实施方案中，人IgG1 Fc区经修饰以改变抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，Natsume等人,2008Cancer Res,68(10):3863-72；Idusogie等人,2001J Immunol,166(4):2571-5；Moore等人,2010mAb,2(2):181-189；Lazar等人,2006PNAS,103(11):4005-4010；Shields等人,2001JBC,276(9):6591-6604；Stavenhagen等人,2007Cancer Res,67(18):8882-8890；Stavenhagen等人,2008Advan.Enzyme Regul.,48:152-164；Alegre等人,1992J Immunol,148:3461-3468所述的；Kaneko和Niwa,2011Biodrugs,25(1):1-11中综述的氨基酸修饰，将每个文献的内容特此通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，Fc区(如人IgG1 Fc区)经修饰以增强ADCC活性或CDC活性。增强ADCC的突变的例子包括在Ser239和Ile332处的修饰，例如Ser239Asp和Ile332Glu(S239D、I332E)。增强CDC的突变的例子包括在Lys326和Glu333处的修饰。在一些实施方案中，在使用Kabat编号系统的这些位置中的一个或两个处修饰Fc区，例如Lys326Ala和/或Glu333Ala(K326A和E333A)。
在一些实施方案中，本公开文本的人IgG1 Fc区融合蛋白没有或具有减少的在N297处附接至N-连接的聚糖链的岩藻糖。存在多种方式来防止岩藻糖基化，包括但不限于在FUT8缺陷型细胞系中产生；向哺乳动物细胞培养基中添加抑制剂，例如栗精胺(Castanospermine)；和对生产细胞系进行代谢工程。在一些实施方案中，人IgG1 Fc区在氨基酸Asn297(加框，Kabat编号)处经修饰以防止融合蛋白的糖基化，例如Asn297Ala(N297A)或Asn297Asp(N297D)。
在一些实施方案中，Fc区经改变以提供降低的Fc介导的效应子功能，如经由降低的Fc受体结合，例如与FcγR结合，但总体上没有FcRn结合。在一些实施方案中，在以下位置中的一个或多个处改变融合蛋白的Fc区以降低Fc受体结合：Leu 234(L234)、Leu235(L235)、Asp265(D265)、Asp270(D270)、Ser298(S298)、Asn297(N297)、Asn325(N325)或Ala327(A327)。例如，Leu 234Ala(L234A)、Leu235Ala(L235A)、Asp265Asn(D265N)、Asp270Asn(D270N)、Ser298Asn(S298N)、Asn297Ala(N297A)、Asn325Glu(N325E)或Ala327Ser(A327S)。在一些实施方案中，融合蛋白的Fc区在氨基酸Leu235(在上文SEQ IDNO:1中加框，Kabat编号)处经修饰以改变Fc受体相互作用，例如Leu235Glu(L235E)或Leu235Ala(L235A)。在一些实施方案中，融合蛋白的Fc区在氨基酸Leu234(在上文SEQ IDNO:1中加框，Kabat编号)处经修饰以改变Fc受体相互作用，例如Leu234Ala(L234A)。在一些实施方案中，融合蛋白的Fc区在氨基酸234和235二者处改变，例如Leu234Ala和Leu235Ala(L234A/L235A)或Leu234Val和Leu235Ala(L234V/L235A)。在优选的实施方案中，Fc区内的修饰降低了与Fc受体-γ受体的结合，同时对与新生儿Fc受体(FcRn)的结合具有最小影响。
在一些实施方案中，人IgG Fc区经修饰以增强FcRn结合。增强与FcRn的结合的Fc突变的例子是Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu(分别为M252Y、S254T、T256E)(Kabat编号，Dall'Acqua等人2006,J.Biol Chem第281卷(33)23514-23524)，Met428Leu和Asn434Ser(M428L、N434S)(Zalevsky等人2010Nature Biotech,第28卷(2)157-159(Kabat等人1991Sequences of Proteins of Immunological Interest的EU索引)。在一些实施方案中，所述突变或修饰的Fc多肽包括以下突变：使用Kabat编号系统，Met252Tyr和Met428Leu或Met252Tyr和Met428Val(M252Y、M428L或M252Y、M428V)。
在一些实施方案中，融合蛋白的Fc区在以下位置中的一个或多个处缺乏氨基酸以降低Fc受体结合：Glu233(E233)、Leu234(L234)或Leu235(L235)。在这些实施方案中，这三个氨基酸的Fc缺失降低了补体蛋白C1q结合。
Figure BDA0002817785800000661
在一些实施方案中，Fc区在以下位置中的一个或多个处突变以降低Fc受体结合：Glu233(E233)、Leu234(L234)或Leu235(L235)。所述一个或多个突变可以包括E233P、L234V和/或L235A。
在一些实施方案中，融合蛋白的Fc区在Gly236处经改变(在上文SEQ ID NO:1中加框)以降低Fc受体结合。例如，其中从融合蛋白中缺失Gly236。在一些实施方案中，人IgG1Fc区在氨基酸Gly236处经修饰以增强与CD32A的相互作用，例如Gly236Ala(G236A)。
在特定实施方案中，用于降低Fc效应子功能(例如经由降低Fc受体与FcγR的结合)的Fc区的突变包括来自以下中的任一种的突变：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236缺失/S239K、E233P/L234V/L235A/G236缺失/S267K、E233P/L234V/L235A/G236缺失/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236缺失/S267K/A327G或E233P/L234V/L235A/G236缺失。
在一些实施方案中，人IgG1 Fc区缺乏Lys447(Kabat等人1991Sequences ofProteins of Immunological Interest的EU索引)。
在一些实施方案中，融合物或其免疫活性片段包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人IgG2多肽序列。
在一些实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白Fc区或免疫活性片段是人IgG2同种型的，具有氨基酸序列：
Figure BDA0002817785800000671
在一些实施方案中，融合物或其免疫活性片段包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人IgG2多肽序列。
在一些实施方案中，人IgG2 Fc区在氨基酸Asn297(加框)处经修饰，以防止抗体的糖基化，例如，Asn297Ala(N297A)或Asn297Asp(N297D)。在一些实施方案中，人IgG2 Fc区缺乏Lys447(Kabat等人1991Sequences of Proteins of Immunological Interest的EU索引)。
在一些实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白Fc区或免疫活性片段是人IgG3同种型的，具有氨基酸序列：
Figure BDA0002817785800000672
在一些实施方案中，抗体或其免疫活性片段包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人IgG3多肽序列。
在一些实施方案中，人IgG3 Fc区在氨基酸Asn297(加框，Kabat编号)处经修饰以防止抗体的糖基化，例如，Asn297Ala(N297A)或Asn297Asp(N297D)。在一些实施方案中，人IgG3 Fc区在氨基酸435处经修饰以延长半衰期，例如Arg435His(R435H)。在一些实施方案中，人IgG3 Fc区缺乏Lys447(Kabat等人1991Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest的EU索引)。
在一些实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白Fc区或免疫活性片段是人IgG4同种型的，具有氨基酸序列：
Figure BDA0002817785800000681
在一些实施方案中，抗体或其免疫活性片段包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人IgG4多肽序列。
在一些实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白Fc区或免疫活性片段是人IgG4同种型的，具有氨基酸序列：
Figure BDA0002817785800000682
在一些实施方案中，抗体或其免疫活性片段包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人IgG4多肽序列。
在其他实施方案中，人IgG4 Fc区在氨基酸235处经修饰以改变Fc受体相互作用，例如Leu235Glu(L235E)。在一些实施方案中，人IgG4 Fc区在氨基酸Asn297(加框，Kabat编号)处经修饰以防止抗体的糖基化，例如，Asn297Ala(N297A)或Asn297Asp(N297D)。在一些实施方案中，人IgG4 Fc区缺乏Lys447(Kabat等人1991Sequences of Proteins ofImmunological Interest的EU索引)。
在一些实施方案中，在CH3:CH3表面处通过将Ser354变为Cys(S354C)和将Tyr349变为Cys(Y349C)(S354C/Y349C)引入两个二硫键来修饰人IgG Fc区以稳定同二聚化。
在本文提供的多特异性多肽构建体的特定实施方案中，人IgG Fc区经修饰以诱导异二聚化。已知各种用于促进互补Fc多肽的异二聚化的方法，参见例如Ridgway等人,Protein Eng.9:617-621(1996)；Merchant等人,Nat.Biotechnol.16(7):677-81(1998)；Moore等人(2011)MAb,3:546-57；Von Kreudenstein等人MAb,(2013)5:646-54；Gunasekaran等人(2010)J.Biol.Chem.,285:19637-46；Leaver-Fay等人(2016)Structure,24:641-51；Ha等人(2016)Frontiers in Immunology,7:1；Davis等人(2010)Protein EngDes Sel,23:195-202；公开的国际PCT申请号WO 1998/050431、WO 2009/089004、WO2011143545、WO 2014/067011、WO 2012/058768、WO 2018027025；公开的美国专利申请号US20140363426、US 20150307628、US 20180016354、US 20150239991；和美国专利号US5731168、US 7183076、US 9701759、US 9605084和US 9650446。促进Fc链异二聚化的方法包括诱变Fc区，如通过包括一组“杵臼结构”突变或包括突变以实现Fc的静电操纵以有利于不同多肽链之间的吸引相互作用。例如，在一些实施方案中，异二聚体的Fc多肽包括突变以改变跨Fc二聚体界面的电荷极性，由此使得静电匹配的Fc链的共表达支持有利的吸引相互作用，从而促进所需的Fc异二聚体形成，而不利的排斥电荷相互作用抑制不需要的Fc同二聚体形成(Guneskaran等人(2010)JBC,285:19637-19646)。当在细胞中共表达时，链之间的缔合是可能的，但是由于电荷排斥，所述链基本上不自我缔合。用于产生异二聚体Fc的其他策略包括混合人IgG和IgA CH3结构域区段以产生互补CH3异二聚体，其称为SEED Fc。
用于异二聚化的方法和变体还包括公开的国际PCT申请WO2014/145806中所述的那些，包括“杵和臼”突变(也称为“偏斜”变体)、与“静电操纵”或“电荷对”有关的突变以及pI变体。异二聚体变体还包括美国公开的申请号US 2012/0149876或US 2018/011883中所述的任一种。
在一些实施方案中，为了促进异二聚化，Fc异源二聚体的两种多肽均含有成对的或互补的氨基酸修饰。Fc融合物的多肽的示例性成对氨基酸修饰示于表1中。
Figure BDA0002817785800000701
在一些实施方案中，修饰包括将突起(杵)引入第一Fc多肽中并将腔(臼)引入第二Fc多肽中，使得突起可定位在腔中以促进第一含Fc的多肽和第二含Fc的多肽的复合。被靶向用于替代和/或修饰以在多肽中产生突起或腔的氨基酸通常是与第二多肽的界面中的一个或多个氨基酸相互作用或接触的界面氨基酸。
在一些实施方案中，经修饰以含有突起(臼)氨基酸的第一Fc多肽包括用具有至少一个侧链的氨基酸替代天然或原始氨基酸，所述至少一个侧链从第一Fc多肽的界面突出，因此可位于第二多肽的相邻界面中的补偿腔(臼)中。最常见的是，替代氨基酸是具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸。本领域技术人员了解如何测定和/或评估氨基酸残基的特性以鉴定产生突起的理想替代氨基酸。在一些实施方案中，用于形成突起的替代残基是天然存在的氨基酸残基，并且包括例如精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)。在一些例子中，经鉴定用于替代的原始残基是具有小侧链的氨基酸残基，例如像丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
在一些实施方案中，经修饰以含有腔(臼)的第二Fc多肽是包括用具有至少一个侧链的氨基酸替代天然或原始氨基酸的多肽，所述至少一个侧链从第二多肽的界面凹进，因此能够从第一多肽的界面容纳相应的突起。最常见的是，替代氨基酸是具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸。本领域技术人员了解如何测定和/或评估氨基酸残基的特性以鉴定对于形成腔而言理想的替代残基。通常，用于形成腔的替代残基是天然存在的氨基酸，并且包括例如丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。在一些例子中，经鉴定用于替代的原始氨基酸是具有大侧链的氨基酸，例如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
例如，人IgG1的CH3界面包括位于四个反平行β链上的每个结构域上的十六个残基，所述每个结构域从每个表面掩埋1090
Figure BDA0002817785800000711
(参见例如Deisenhofer等人(1981)Biochemistry,20:2361-2370；Miller等人,(1990)J Mol.Biol.,216,965-973；Ridgway等人,(1996)Prot.Engin.,9:617-621；美国专利号5,731,168)。例如，用于产生突起或腔而对CH3结构域的修饰描述于例如美国专利号5,731,168；国际专利申请WO98/50431和WO 2005/063816；和Ridgway等人,(1996)Prot.Engin.,9:617-621中。在一些例子中，用于产生突起或腔而对CH3结构域的修饰通常靶向位于两个中心反平行β链上的残基。目的是最小化以下风险，即产生的突起可通过突出到周围溶剂中而被容纳而不是由配偶体CH3结构域中的补偿腔容纳。
例如，在一些实施方案中，异二聚体Fc包括CH3结构域内在Thr366处具有氨基酸修饰的多肽，当用较大体积氨基酸(例如Try(T366W))替代时，所述多肽能够优先与在位置Thr366、Leu368和Tyr407处具有较小体积氨基酸的氨基酸修饰(例如分别为Ser、Ala和Val(T366S/L368A/Y407V))的第二CH3结构域配对。可通过引入二硫键，例如通过在相对的CH3结构域上将Ser354变为Cys(S354C)并将Tyr349变为Cys(Y349C)进一步稳定经由CH3修饰进行的异二聚化(综述于Carter,2001Journal of Immunological Methods,248:7-15中)。
在特定实施方案中，多特异性多肽构建体含有能够介导Fc异二聚化的第一和Fc第二Fc，所述第一Fc和所述第二Fc包含含有突变T366W和S354C的第一Fc多肽和含有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的第二Fc多肽。在一些实施方案中，第一Fc多肽选自包含SEQID NO:201或207所示的序列的Fc多肽，并且第二Fc多肽选自包含SEQ ID NO:202、205或209所示的序列的Fc多肽。在一些实施方案中，第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:82、86、94或96中任一个所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:83、87、90、92、98或100中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc多肽展现出提供Fc介导的效应子功能的特征。在特定例子中，第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:201所示的序列，并且第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:202或205。在一些实施方案中，第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:82所示的序列，并且第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:83或90所示的序列。在一些实施方案中，第一Fc多肽是或包含SEQID NO:86所示的序列，并且第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:87或92所示的序列。第一Fc多肽和第二Fc多肽可以格式化在构建体的任一多肽链上。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽中的一种或两种可以进一步包括一个或多个氨基酸突变，以进一步降低一种或多种Fc效应子功能，如降低的Fc受体结合。降低Fc效应子功能的示例性突变包括所描述的任一种。在一些实施方案中，修饰可以是Glu233(E233)、Leu234(L234)或Leu235(L235)中一个或多个位置的缺失，如氨基酸Glu233(E233)、Leu234(L234)和Leu235(L235)的缺失。在一些实施方案中，第一Fc多肽选自包含SEQ IDNO:203或208所示的序列的Fc多肽，并且第二Fc多肽选自包含SEQ ID NO:204、206或210所示的序列的Fc多肽。在一些实施方案中，第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:84、88、95或97中任一个所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:85、89、91、93、99或101中任一个所示的氨基酸序列。
在特定例子中，第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:203所示的序列，并且第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:204或206。在一些实施方案中，第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:84所示的序列，并且第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:85或91所示的序列。在一些实施方案中，第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:88所示的序列，并且第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:89或93所示的序列。第一Fc多肽和第二Fc多肽可以格式化在构建体的任一多肽链上。
在一些实施方案中，第一Fc多肽或第二Fc多肽进一步包括突变M252Y和/或M428V。在特定的例子中，第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:207所示的序列，并且第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:209所示的序列。在一些实施方案中，第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:94所示的序列，并且第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:98所示的序列。在一些实施方案中，第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:96所示的序列，并且第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:100所示的序列。在其他例子中，第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:208所示的序列，并且第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:210所示的序列。在一些实施方案中，第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:95所示的序列，并且第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:99所示的序列。在一些实施方案中，第一Fc多肽是或包含SEQ ID NO:97所示的序列，并且第二Fc多肽是或包含SEQ ID NO:101所示的序列。第一Fc多肽和第二Fc多肽可以格式化在构建体的任一多肽链上。
可以有利于促成异二聚体的变体的另外的例子是来自以下中的第一Fc多肽和第二Fc多肽的任何组合或任何对的空间变体(例如偏斜变体)：S364K/E357Q和L368D/K370S；L368D/K370S和S364K；L368E/K370S和S364K；T411T/E360E/Q362E和D401K；L368D/K370S和S364K/E357L；K370S和S364K/E357Q；以及T366S/L368A/Y407V和T366W或366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C)，其中每对代表第一个Fc多肽和第二个Fc多肽中的突变。在特定实施方案中，所提供的构建体包含含有突变对L368D/K370S以及S364K和E357Q的第一Fc多肽以及第二Fc多肽。
可用于产生异二聚体的另外的机制有时称为“静电操纵”，如Gu nasekaran等人,J.Biol.Chem.285(25):19637(2010)中所述。这在本文中有时称为“电荷对”。在此实施方案中，利用静电使形成偏斜向异二聚化。如本领域技术人员将了解的，这些也可能对pI具有影响，并因此对纯化具有影响，因此在一些情况下也可以认为是pI变体。然而，由于这些被产生用以迫使异二聚化并且不用作纯化工具，因此将它们归类为“空间变体”。在一个实施方案中，第一Fc多肽可以含有突变D221E/P228E/L368E，并且第二Fc多肽可以含有突变D221R/P228R/K409R。在另一个实施方案中，第一Fc多肽可以含有突变C220E/P228E/368E，并且第二Fc多肽可以含有突变C220R/E224R/P228R/K409R。
在一些实施方案中，异二聚化可以通过pI变体促进。在一些方面，pI变体可以包括增加蛋白质的pI(碱性变化)的那些。在其他方面，pI变体可以包括降低蛋白质的pI(酸性变化)的那些。在一些情况下，可以进行这些变体的所有组合，包括以下组合，其中一种Fc多肽可以是野生型或者不显示与野生型显著不同的pI的变体，而另一种Fc多肽可以是更加碱性或更加酸性的。可替代地，可以改变每种Fc多肽，一种改变为更加碱性的并且一种改变为更加酸性的。在一些实施方案中，至少一种Fc多肽是含有突变Q295E/N384D/Q418E/N421D的阴性pI变体Fc。
在一些实施方案中，可以使用空间异二聚化变体(例如杵和臼)和pI或电荷对变体的组合。
在特定实施方案中，所提供的构建体含有(a)包含偏斜变体S364K/E357Q的第一Fc多肽；和b)包含偏斜变体L368D/K370S和pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D的第二Fc多肽。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽中的一种或两种可以含有进一步的突变以降低Fc效应子活性，如示例性突变E233P/L234V/L235A/G236缺失/S267K。能够介导Fc异二聚化的这种第一Fc多肽和第二Fc多肽的例子包含SEQ ID NO:194和195所示的序列。第一Fc多肽和第二Fc多肽可以格式化在构建体的任一多肽链上。
所得的多特异性多肽构建体可以通过任何合适的方法，例如像通过蛋白A或蛋白G柱上的亲和色谱纯化。在将编码不同多肽的两个核酸分子转化到细胞中的情况下，将形成同二聚体和异二聚体。可以调节表达条件，使得异二聚体形成比同二聚体形成更有利。
基于异二聚体对亲和试剂的不同亲和力从同二聚体中回收异二聚体的技术是已知的。在一些方面，此类技术包括设计异二聚体为使得Fc多肽链之一不结合至亲和试剂蛋白A。在一些情况下，多肽链之一可以含有一个或多个氨基酸取代以消除或降低Fc异二聚体的多肽之一对蛋白A试剂的亲和力，参见例如WO 2017134440、WO 2010151792、Jendeberg等人(Jen deberg等人,(1997)J.Immunol.Methods,201(1):25-34。在这些实施方案中的一些中，Fc区可以在异二聚体的一个成员上的蛋白A结合位点处经修饰，以防止蛋白A结合，从而能够更有效地纯化异二聚体融合蛋白。在此结合位点内的示例性修饰是Ile253，例如Ile253Arg(I253R)。在一些实施方案中，修饰可以是H435R或H435R/Y436F。在一些实施方案中，Fc异二聚体的Fc多肽可含有修饰，使得其能够结合蛋白A但不结合蛋白G(pA+/pG-)。示例性的pA+/pG-氨基酸修饰包括在位置428处含有丝氨酸、在位置434处含有丝氨酸和任选地在位置436处含有组氨酸的Fc，参照人IgG1或在人IgG 2、3、或4的相应位置处包含这些残基。在一些方面，一种IgG Fc多肽中在位置428、434和任选的436处的此类氨基酸修饰降低或防止蛋白G的结合，从而增强蛋白质的纯化。
在一些实施方案中，赋予对亲和试剂的差异亲和力的任何此类修饰可以与上文所述的任何一种或多种其他氨基酸修饰组合。例如，I253R修饰可以与T366S/L368A/Y407V修饰或与T366W修饰组合。T366S/L368A/Y407V修饰的Fc能够形成同二聚体，因为不存在如同在T336W修饰的Fc的情况下二聚化界面的空间闭塞。因此，在一些实施方案中，将I253R修饰与T366S/L368A/Y407V修饰的Fc组合，从而不允许纯化可能已经形成的任何同二聚体Fc。可以通过组合T366S/L368A/Y407V和H453R来采用类似的修饰。
在一些实施方案中，异二聚体分子的Fc区另外可含有一种或多种其他Fc突变，如上文所述的任一种。在一些实施方案中，异二聚体分子含有具有降低效应子功能的突变的Fc区。
在一些实施方案中，异二聚体Fc的一种Fc多肽包含SEQ ID NO:201(例如SEQ IDNO:82)、86、207(例如SEQ ID NO:94)或96中任一个所示的氨基酸序列，并且异二聚体Fc的另一Fc多肽含有SEQ ID NO:201(例如SEQ ID NO:83)、87、205(例如SEQ ID NO:90)、92、209(例如SEQ ID NO:98)或100中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，异二聚体Fc的一种Fc多肽包含SEQ ID NO:203(例如SEQ ID NO:84)、88、208(例如SEQ ID NO:95)或97中任一个所示的氨基酸序列，并且异二聚体Fc的另一Fc多肽包含SEQ ID NO:204(例如SEQ IDNO:85)、89、206(例如SEQ ID NO:91)、93、210(例如SEQ ID NO:99)或101中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，人IgG Fc区经修饰以防止二聚化。在这些实施方案中，本公开文本的融合蛋白是单体的。例如，在残基Thr366处修饰为带电荷残基，例如Thr366Lys、Thr366Arg、Thr366Asp或Thr366Glu(分别为T366K、T366R、T366D或T366E)会防止CH3-CH3二聚化。
在一些实施方案中，在以下位置中的一个或多个处改变融合蛋白的Fc区以降低Fc受体结合：Leu 234(L234)、Leu235(L235)、Asp265(D265)、Asp270(D270)、Ser298(S298)、Asn297(N297)、Asn325(N325)或Ala327(A327)。例如，Leu 234Ala(L234A)、Leu235Ala(L235A)、Asp265Asn(D265N)、Asp270Asn(D270N)、Ser298Asn(S298N)、Asn297Ala(N297A)、Asn325Glu(N325E)或Ala327Ser(A327S)。在优选的实施方案中，Fc区内的修饰降低了与Fc受体-γ受体的结合，同时对与新生儿Fc受体(FcRn)的结合具有最小影响。
在一些实施方案中，融合蛋白含有源自免疫球蛋白铰链区的多肽。铰链区可以选自人IgG亚类中的任一种。例如，融合蛋白可以含有具有EPKSSDKTHTCPPC(SEQ ID NO:7)的序列的修饰IgG1铰链，其中与轻链的C末端半胱氨酸形成二硫化物的Cys220突变为丝氨酸，例如Cys220Ser(C220S)。在其他实施方案中，融合蛋白含有具有序列DKTHTCPPC(SEQ IDNO:8)的截短铰链。
在一些实施方案中，融合蛋白具有来自IgG4的具有序列ESKYGPPCPPC(SEQ ID NO:9)的修饰铰链，其经修饰以防止或减少链交换，例如Ser228Pro(S228P)。在一些实施方案中，融合蛋白含有接头多肽。在其他实施方案中，融合蛋白含有接头和铰链多肽。
3.接头
所提供的多特异性多肽构建体含有接头，所述接头连接或偶联含有免疫球蛋白Fc区的第一组分和含有CD3结合区的第二组分。在一些实施方案中，所述接头是不可切割接头。在一些实施方案中，所述接头不含有由蛋白酶特异性识别以切割的底物识别位点。因此，所提供的多特异性多肽构建体中的接头不包括可以充当用于蛋白酶(如细胞外蛋白酶)的底物的氨基酸序列。例如，不可切割接头不包括含有位于蛋白酶的可切割肽序列内的至少一个肽键的切割序列。
在一些实施方案中，接头位于Fc区的C末端区的末端，由此使得Fc区在CD3结合区的N末端。因为所提供的多特异性多肽构建体是多聚体(如二聚体)，所以所提供的构建体包括连接第一多肽的第一Fc多肽与CD3结合区的第一结构域(例如VH)以及第二多肽的第二Fc多肽与CD3结合区的第二结构域(例如VL)的接头。通常，存在于多特异性多肽构建体的第一多肽和第二多肽中的接头是相同的。因此，在一些实施方案中，CD3结合结构域的每个结构域经由接头(如相同接头)连接至Fc(如异二聚体Fc)的相对多肽。
用于融合蛋白中的各种多肽接头是已知的(参见例如Chen等人(2013)Adv.Drug.Deliv.65:1357-1369；以及国际PCT公开号WO 2014/099997、WO2000/24884；美国专利号5,258,498；美国专利号5,525,491；美国专利号5,525,491，美国专利号6,132,992)。
在一些实施方案中，选择接头以使得当CD3结合区与多特异性多肽缀合物的Fc区连接时，CD3结合区受限，并且在多特异性多肽构建体与细胞接触时，不能或基本上不能结合或接合细胞(例如T细胞)表面上的CD3。可以采用多种测定来评估多特异性多肽构建体对CD3的结合或接合，所述多种测定包括用于评估T细胞结合、使用报告物系统的NFAT激活、细胞溶解性T细胞活性、细胞因子产生和/或T细胞激活标记物的表达的测定。在所提供的实施例中示出了示例性测定。通常，接头也是确保多肽构建体正确折叠的接头，不展现出与所连接多肽的活性或功能不一致的电荷，或不与一个或多个结构域中的氨基酸残基形成将阻碍或改变所连接多肽的活性的键或其他相互作用。在一些实施方案中，接头是多肽接头。多肽接头可以是柔性接头或刚性接头或二者的组合。
在一些方面，接头是短的、中等或长的接头。在一些实施方案中，接头的长度为至多40个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至多25个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少或至少约2个氨基酸。在一些方面，合适的长度是例如至少一个且通常少于约40个氨基酸残基的长度，如2-25个氨基酸残基、5-20个氨基酸残基、5-15个氨基酸残基、8-12个氨基酸。在一些实施方案中，接头是从或从约2至24个氨基酸、2至20个氨基酸、2至18个氨基酸、2至14个氨基酸、2至12个氨基酸、2至10个氨基酸、2至8个氨基酸、2至6个氨基酸、6至24个氨基酸、6至20个氨基酸、6至18个氨基酸、6至14个氨基酸、6至12个氨基酸、6至10个氨基酸、6至8个氨基酸、8至24个氨基酸、8至20个氨基酸、8至18个氨基酸、8至14个氨基酸、8至12个氨基酸、8至10个氨基酸、10至24个氨基酸、10至20个氨基酸、10至18个氨基酸、10至14个氨基酸、10至12个氨基酸、12至24个氨基酸、12至20个氨基酸、12至18个氨基酸、12至14个氨基酸、14至24个氨基酸、14至20个氨基酸、14至18个氨基酸、18至24个氨基酸、18至20个氨基酸或20至24个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
在一些方面，接头长度越长，则当多特异性多肽缀合物与其抗原(例如TAA)结合时的CD3结合越强。因此，在一些方面，接头的长度大于12个氨基酸，如长度大于13、14、15、16、17或18个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为12至40个氨基酸、12至30个氨基酸、12至24个氨基酸、12至18个氨基酸、12至15个氨基酸、15至40个氨基酸、15至30个氨基酸、15至24个氨基酸、15至18个氨基酸、18至40个氨基酸、18至30个氨基酸、18至24个氨基酸、24至40个氨基酸、24至30个氨基酸或30至40个氨基酸。
接头可以是天然存在的、合成的或二者的组合。特别合适的接头多肽主要包括选自甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)和苏氨酸(Thr)的氨基酸残基。例如，接头可以含有至少75％(基于肽接头中存在的残基的总数计算)，如至少80％、至少85％或至少90％的选自Gly、Ser、Ala和Thr的氨基酸残基。接头也可以仅由Gly、Ser、Ala和/或Thr残基组成。在一些实施方案中，接头含有1-25个甘氨酸残基、5-20个甘氨酸残基、5-15个甘氨酸残基或8-12个甘氨酸残基。在一些方面，合适的肽接头通常含有至少50％甘氨酸残基，如至少75％甘氨酸残基。在一些实施方案中，肽接头仅包含甘氨酸残基。在一些实施方案中，肽接头仅包含甘氨酸和丝氨酸残基。
在一些实施方案中，这些接头主要由氨基酸甘氨酸和丝氨酸构成，在本文中表示为GS接头。在一些实施方案中，接头含有(GGS)n，其中n是1至10，如1至5，例如1至3，如GGS(GGS)n(SEQ ID NO:171)，其中n是0至10。在特定实施方案中，接头含有序列(GGGGS)n(SEQID NO:173)，其中n是1至10或n是1至5，如1至3。在另外的实施方案中，接头包含(GGGGGS)n(SEQ ID NO:172)，其中n是1至4，如1至3。接头可以包括上述中任一种的组合，如可以组合2、3、4或5个GS、GGS、GGGGS和/或GGGGGS接头的重复。在一些实施方案中，这种接头的长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸。
在一些实施方案中，接头是(以单字母的氨基酸代码表示)：GGS、GGGGS(SEQ IDNO:149)或GGGGGS(SEQ ID NO:135)。在一些实施方案中，GS接头包含以下的氨基酸序列：GGSGGS，即(GGS)2(SEQ ID NO:10)；GGSGGSGGS，即(GGS)3(SEQ ID NO:11)；GGSGGSGGSGGS，即(GGS)4(SEQ ID NO:12)；GGSGGSGGSGGSGGS，即(GGS)5(SEQ ID NO:13)；GGGGGSGGGGGSGGGGGS，即(G5S)3(SEQ ID NO:119)；GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:147)和GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:170)。在一些实施方案中，接头是GGGG(SEQ ID NO:103)。在一些实施方案中，接头是GGGGG(SEQ ID NO:192)。在任何以上例子中的一些中，丝氨酸可以被丙氨酸替代(例如(Gly4Ala)或(Gly3Ala))。
在一些实施方案中，接头包括具有氨基酸序列GlyxXaa-Glyy-Xa a-Glyz(SEQ IDNO:174)的肽接头，其中每个Xaa独立地选自丙氨酸(Al a)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Se r)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(A sp)和谷氨酸(Glu)，并且其中x、y和z各自为范围1-5内的整数。在一些实施方案中，每个Xaa独立地选自Ser、Ala和Thr。在一个具体的变型中，x、y和z中的每一个等于3(从而产生具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gl y-Xaa-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:175的肽接头，其中每个Xaa如上所述选择。
在一些实施方案中，接头是基于(SSSSG)n(SEQ ID NO:185)基序的重复的富含丝氨酸的接头，其中n是至少1，但是n可以是2、3、4、5、6、7、8和9。
在一些情况下，可能希望向肽接头中提供一些刚性。这可以通过在肽接头的氨基酸序列中包括脯氨酸残基来实现。因此，在一些实施方案中，接头在肽接头的氨基酸序列中包含至少一个脯氨酸残基。例如，肽接头可以具有氨基酸序列，其中至少25％(例如，至少50％或至少75％)的氨基酸残基是脯氨酸残基。在一个特定实施方案中，肽接头仅包含脯氨酸残基。
在一些方面，肽接头包含至少一个半胱氨酸残基，如一个半胱氨酸残基。例如，在一些实施方案中，接头包含至少一个半胱氨酸残基和选自Gly、Ser、Ala和Thr的氨基酸残基。在一些此类实施方案中，接头包含甘氨酸残基和半胱氨酸残基，如仅甘氨酸残基和半胱氨酸残基。通常，每个肽接头仅包括一个半胱氨酸残基。包含半胱氨酸残基的具体接头的一个例子包括具有氨基酸序列Glym-Cys-Glyn的肽接头，其中n和m各自是1-12，例如3-9、4-8或4-7的整数。在具体的变型中，这种肽接头具有氨基酸序列GGGGG-C-GGGGG(SEQ ID NO:177)。
在一些实施方案中，融合蛋白的接头是结构化或受限接头。在特定实施方案中，结构化接头含有序列(AP)n或(EAAAK)n(SEQ ID NO:178)，其中n是2至20，优选4至10，包括但不限于AS-(AP)n-GT(SEQ ID NO:179)或AS-(EAAAK)n-GT(SEQ ID NO:180)，其中n是2至20，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在其他实施方案中，接头包含序列(GGGGA)n(SEQ ID NO:181)、(PGGGS)n(SEQ ID NO:182)、(AGGGS)n(SEQ ID NO:183)或GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS(SEQ ID NO:184)，其中n是2至20。在一些实施方案中，接头是SSSASASSA(SEQ ID NO:186)、GSPGSPG(SEQ ID NO:187)、或ATTTGSSPGPT(SEQ ID NO:176)。在一些实施方案中，此类接头由于其结构可对蛋白水解降解更具抗性，由此在体内注射时具有优点。
在一些实施方案中，接头不是可切割接头(与不可切割接头可互换使用)。在一些实施方案中，接头是不可被蛋白酶切割的。在一些实施方案中，并非可切割接头或不能被蛋白酶切割的接头是通常对于体内递送或重组生产稳定的接头。在一些方面，不能被蛋白酶切割的接头包括不含有优选位于蛋白酶的可切割肽序列或识别位点内的至少一个肽键的那些接头。在特定实施方案中，不可切割接头不是蛋白酶的靶底物，由此使得与含有相同蛋白酶的底物识别位点的接头相比，其并不被蛋白酶优先或特异性切割。
在一些实施方案中，接头不含有特定蛋白酶的底物识别位点或切割位点，所述底物识别位点或切割位点是被蛋白酶切割、由蛋白酶的活性位点识别的序列。通常，例如，对于丝氨酸蛋白酶，切割序列由底物中的P1-P4和P1'-P4'氨基酸组成，其中切割发生在P1位置之后。通常，丝氨酸蛋白酶的切割序列的长度为六个残基，以匹配许多蛋白酶的扩大的底物特异性，但是根据蛋白酶而定可更长或更短。通常，接头不包括由蛋白酶识别的P1-P1'易裂键序列。
在一些方面，不可切割接头或不包含由蛋白酶特异性识别以切割的底物识别位点的接头是其由蛋白酶的切割明显小于蛋白酶对靶底物的切割的接头。通常，相比于另一种非靶底物，蛋白酶对特定靶底物的切割展现出特异性或优先性。这种特异性程度可以基于序列(例如接头序列)的切割速率常数确定，所述切割速率常数是蛋白酶对其底物的优先性和酶效率的度量。用于确定在各种浓度的底物的存在下切割随时间增加的速率的任何方法都可以用于计算特异性常数。例如，将底物连接至荧光部分，所述荧光部分在被蛋白酶切割后被释放。通过确定在不同蛋白酶浓度下的切割速率，可以确定针对特定蛋白酶对特定接头的切割特异性常数(kcat/Km)。在一些实施方案中，不可切割接头或不含有由蛋白酶特异性识别以切割的底物识别位点的接头是这样的接头，如果完全切割，则所述接头以小于1×104M-1S-1、或小于5×103M-1S、小于1×103M-1S、或小于1×102M-1S或更小的速率被蛋白酶切割。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性构建体中的接头不含有蛋白酶的底物识别位点，所述蛋白酶包括例如基质金属蛋白酶(MMP)、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和纤溶酶激活物。在特定实施方案中，接头不含有蛋白酶的底物识别位点，所述蛋白酶是由肿瘤、激活的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)或肿瘤微环境中的细胞产生的蛋白酶。
在一些实施方案中，接头不含有由以下酶或蛋白酶中的一种或多种特异性识别的底物识别位点：ADAMS、ADAMTS，例如ADAM8；ADAM9；ADAM10；ADAM12；ADAM15；ADAM17/TACE；ADAMDEC1；ADAMTS1；ADAMTS4；ADAMTS5；天冬氨酸蛋白酶，例如BACE或肾素；天冬氨酸组织蛋白酶，例如组织蛋白酶D或组织蛋白酶E；半胱天冬酶，例如半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10或半胱天冬酶14；半胱氨酸组织蛋白酶，例如组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V/L2、组织蛋白酶X/Z/P；半胱氨酸蛋白酶，例如克鲁兹蛋白酶(Cruzipain)；豆荚蛋白酶(Legumain)；Otubain-2；KLK，例如KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13或KLK14；金属蛋白酶，例如Meprin；脑啡肽酶；PSMA；BMP-1；MMP，例如MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP23、MMP24、MMP26或MMP27；丝氨酸蛋白酶，例如激活蛋白C、组织蛋白酶A、组织蛋白酶G、糜酶、凝血因子蛋白酶(例如FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa)、弹性蛋白酶、颗粒酶B、胍基苯甲酸酯酶、HtrA1、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、乳铁蛋白、Marapsin、NS3/4A、PACE4、纤溶酶、PSA、tPA、凝血酶、类胰蛋白酶(Tryptase)、uPA；II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)，例如DESC1、DPP-4、FAP、肝素、蛋白裂解酶(MAatriptase)-2、蛋白裂解酶(Matriptase)、TMPRSS2、TMPRSS3或TMPRSS4；及其任何组合。在一些实施方案中，接头不含有由颗粒酶B、蛋白裂解酶(matriptase)或MMP(如MMP-2)特异性识别的底物识别位点。
在一些实施方案中，接头不包含为颗粒酶B的底物的氨基酸。在一些实施方案中，接头不含有具有通式P4 P3 P2 P1↓P1'(SEQ ID NO:150)的氨基酸序列，其中P4是氨基酸I、L、Y、M、F、V或A；P3是氨基酸A、G、S、V、E、D、Q、N或Y；P2是氨基酸H、P、A、V、G、S或T；P1是氨基酸D或E；并且P1'是氨基酸I、L、Y、M、F、V、T、S、G或A。在一些实施方案中，接头不含有具有通式P4 P3 P2 P1↓P1'(SEQ ID NO:151)的氨基酸序列，其中P4是氨基酸I或L；P3是氨基酸E；P2是氨基酸P或A；P1是氨基酸D；并且P1'是氨基酸I、V、T、S或G。
在一些实施方案中，接头不含有氨基酸序列LEAD(SEQ ID NO:22)、LEPD(SEQ IDNO:142)或LEAE(SEQ ID NO:143)。在一些实施方案中，接头不含有氨基酸序列IEPDI(SEQID NO:136)、LEADT(SEQ ID NO:137)、IEPDG(SEQ ID NO:138)、IEPDV(SEQ ID NO:139)、IEPDS(SEQ ID NO:140)、IEPDT(SEQ ID NO:141)、IEPDP(SEQ ID NO:144)、LEPDG(SEQ IDNO:152)或LEADG(SEQ ID NO:153)。
在一些实施方案中，接头不包含为蛋白裂解酶(matriptase)的底物的氨基酸。在一些实施方案中，接头不包含序列P1QAR↓(A/V)(SEQ ID NO:154)，其中P1是任何氨基酸。在一些实施方案中，接头不包含序列RQAR(A/V)(SEQ ID NO:155)。在一些实施方案中，接头不包含氨基酸序列RQAR(SEQ ID NO:23)。在一些实施方案中，接头不包含氨基酸序列RQARV(SEQ ID NO:156)。
在一些实施方案中，接头不包含为一种或多种基质金属蛋白酶(MMP)的底物的氨基酸。在一些实施方案中，MMP是MMP-2。在一些实施方案中，接头不含有具有通式P3 P2 P1↓P1'的序列(SEQ ID NO:157)，其中P3是P、V或A；P2是Q或D；P1是A或N；并且P1'是L、I或M。在一些实施方案中，接头不含有通式P3 P2 P1↓P1'(SEQ ID NO:158)，其中P3是P；P2是Q或D；P1是A或N；并且P1'是L或I。在一些实施方案中，接头不包含氨基酸序列PAGL(SEQ ID NO:24)。
在一些实施方案中，接头不是包含如以下所示的氨基酸序列的接头：TGLEADGSPAGLGRQARVG(SEQ ID NO:25)；TGLEADGSRQARVGPAGLG(SEQ ID NO:26)；TGSPAGLEADGSRQARVGS(SEQ ID NO:27)；TGPAGLGLEADGSRQARVG(SEQ ID NO:28)；TGRQARVGLEADGSPAGLG(SEQ ID NO:29)；TGSRQARVGPAGLEADGS(SEQ ID NO:30)；TGPAGLGSRQARVGLEADGS(SEQ ID NO:31)；GPAGLGLEPDGSRQARVG(SEQ ID NO:104)；GGSGGGGIEPDIGGSGGS(SEQ ID NO:105)；GGSGGGGLEADTGGSGGS(SEQ ID NO:106)；GSIEPDIGS(SEQ ID NO:107)；GSLEADTGS(SEQ ID NO:108)；GGSGGGGIEPDGGGSGGS(SEQ ID NO:109)；GGSGGGGIEPDVGGSGGS(SEQ ID NO:110)；GGSGGGGIEPDSGGSGGS(SEQ ID NO:111)；GGSGGGGIEPDTGGSGGS(SEQ ID NO:112)；GGGSLEPDGSGS(SEQ ID NO:113)；和GPAGLGLEADGSRQARVG(SEQ ID NO:114)、GGEGGGGSGGSGGGS(SEQ ID NO:115)；GSSAGSEAGGSGQAGVGS(SEQ ID NO:116)；GGSGGGGLEAEGSGGGGS(SEQ ID NO:117)；GGSGGGGIEPDPGGSGGS(SEQ ID NO:118)；TGGSGGGGIEPDIGGSGGS(SEQ ID NO:148)。
4.抗原结合结构域：
本公开文本的多特异性多肽构建体包括至少一个抗原结合结构域，如至少第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域。在一些方面，所述抗原结合结构域、或独立地所述抗原结合结构域中的每一个选自抗体或抗原结合片段、天然同源结合配偶体、抗运载蛋白(Anticalin)(工程化脂质运载蛋白)、Darpin、Fynomer、Centyrin(工程化纤连蛋白III结构域)、半胱氨酸-杵结构域、Affilin、亲和体(Affibody)、或工程化CH3结构域。在一些实施方案中，所述天然同源结合配偶体包含所述TAA的天然同源结合配偶体的细胞外结构域或其结合片段，或其展现出与所述TAA的结合活性的变体。
在一些实施方案中，TAA是主要存在于哺乳动物受试者的肿瘤细胞上但通常在哺乳动物受试者的正常细胞上未发现的反结构。肿瘤特异性抗原不必是肿瘤细胞所独有的，但具有肿瘤相关抗原的特定哺乳动物细胞的百分比足够高或肿瘤表面上肿瘤相关抗原的水平足够高，以使其可以被抗肿瘤治疗剂如所提供的多特异性多肽构建体靶向，并且向哺乳动物提供针对肿瘤效应的预防或治疗。在一些实施方案中，在来自具有肿瘤的哺乳动物的细胞的随机统计样品中，展示TAA的细胞的至少50％是癌性的。在其他实施方案中，展示TAA的细胞的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％是癌性的。
在一些实施方案中，抗原结合结构域、或独立地抗原结合结构域中的每一个(如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域)包括抗体或其抗原结合片段的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，抗原结合结构域、或独立地抗原结合结构域中的每一个包括选自以下的抗体或其抗原结合片段的一个或多个拷贝：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体、和单结构域轻链抗体。在一些实施方案中，抗原结合结构域、或独立地抗原结合结构域中的每一个(如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域)是单链抗体。在一些例子中，单链是scFv、scAb、单结构域重链抗体或单结构域轻链抗体。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的每一个包括一个或多个单结构域抗体(sdAb)片段(例如VHH、VNAR、工程化VH或VK结构域)。VHH可以从天然骆驼科动物仅重链抗体、产生仅重链抗体的经基因修饰的啮齿动物、或幼稚/合成的骆驼科动物或人源化骆驼科动物单结构域抗体库产生。VNAR可以由软骨鱼仅重链抗体产生。已实施了各种方法以从常规异二聚体VH和VK结构域产生单体sdAb，所述方法包括特异性种系家族的界面工程化和选择。
在一些实施方案中，多特异性多肽构建体的抗原结合结构域、或独立地抗原结合结构域中的每一个(如第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域)含有至少一个结合TAA的sdAb或scFv。在一些实施方案中，至少一个结合TAA的scFv或sdAb位于相对于多特异性多肽构建体的Fc区的氨基末端和/或位于相对于多特异性多肽构建体的CD3结合区的羧基末端。在一些实施方案中，多特异性多肽构建体仅含有一个结合TAA的scFv或sdAb，所述scFv或sdAb可以位于相对于Fc区的氨基末端和/或位于相对于CD3结合区的羧基末端。在一些实施方案中，多特异性多肽构建体含有两个结合TAA的scFv或sdAb，所述scFv或sdAb位于相对于Fc区的氨基末端和/或位于相对于CD3结合区的羧基末端。在一些实施方案中，多特异性多肽构建体含有三个scFv或sdAb，其中两个位于相对于Fc区的氨基末端或位于相对于CD3结合区的羧基末端，并且第三个位于多特异性多肽构建体的另一端。
在一些实施方案中，多特异性多肽构建体由两条多肽形成或包括两条多肽，所述两条多肽包括第一多肽，所述第一多肽包含异二聚体Fc区的第一Fc多肽、接头、抗CD3抗体的VH结构域或抗原结合片段(例如Fv)、和结合肿瘤相关抗原的scFv或sdAb；和第二多肽，所述第二多肽包含异二聚体Fc区的第二Fc多肽、接头、抗CD3抗体的VL结构域或抗原结合片段(例如Fv)、和任选的结合肿瘤相关抗原的相同或不同scFv或sdAb。结合TAA的scFv或sdAb可以位于相对于异二聚体Fc的Fc多肽的氨基末端和/或位于相对于CD3结合区的VH或VL链的羧基末端。在一些实施方案中，多特异性多肽构建体的抗原结合结构域、或独立地抗原结合结构域中的每一个含有组装成FAB或scFv的VH和VL序列。在一些实施方案中，多特异性多肽构建体的抗原结合结构域、或独立地抗原结合结构域中的每一个含有作为单结构域抗体(sdAb)的结合结构域。
在一些实施方案中，抗原结合结构域、或独立地抗原结合结构域中的每一个(如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域)含有多于一条链。在一些实施方案中，多特异性多肽构建体的抗原结合结构域、或独立地抗原结合结构域中的每一个(如第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域)含有组装为FAB的VH和VL序列。
在一些实施方案中，多特异性多肽构建体的抗原结合结构域、或独立地抗原结合结构域中的每一个(如第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域)含有结合TAA的Fab抗体的VH-CH1(Fd)和VL-CL。在一些实施方案中，含有VH-CH1(Fd)和VL-CL的Fab抗体位于相对于多特异性多肽构建体的Fc区的氨基末端和/或位于相对于多特异性多肽构建体的CD3结合区的羧基末端。在一些实施方案中，多特异性多肽构建体仅含有一个结合TAA的含有VH-CH1(Fd)和VL-CL的Fab抗体，所述Fab抗体可以位于相对于Fc区的氨基末端和/或位于相对于CD3结合区的羧基末端。在一些实施方案中，多特异性多肽构建体含有两个结合TAA的各自含有VH-CH1(Fd)和VL-CL的Fab抗体片段，其中一个位于相对于Fc区的氨基末端，并且另一个位于相对于CD3结合区的羧基末端。
在一些实施方案中，多特异性多肽构建体由三种或更多种多肽形成或包括三种或更多种多肽，所述三种或更多种多肽包括第一多肽，所述第一多肽包含异二聚体Fc区的第一Fc多肽、接头、和结合肿瘤相关抗原结合的Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL；第二多肽，所述第二多肽包含异二聚体Fc区的第二Fc多肽、接头、和任选的结合肿瘤相关抗原结合的Fab抗体片段的相同VH-CH1(Fd)或VL-CL；以及第三多肽，所述第三多肽包含结合TAA的Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一种。
在一些实施方案中，抗原结合结构域、或独立地抗原结合结构域中的每一个是或包括TAA的天然同源结合配偶体的细胞外结构域或其结合片段，或其展现出与TAA的结合活性的变体。
在一些实施方案中，抗原结合结构域中的每一个(如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的每一个)均结合相同抗原。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的每一个结合不同抗原。在一些实施方案中，抗原结合结构域中的每一个(如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的每一个)均结合相同肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方案中，抗原结合结构域中的每一个(如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的每一个)结合不同TAA。在一些实施方案中，抗原结合结构域中的每一个(如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的每一个)结合相同TAA上的不同表位。在一些实施方案中，抗原结合结构域中的每一个(如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的每一个)结合相同TAA上的相同表位。
在一些实施方案中，抗原结合结构域导致与TAA的单价、二价、三价或四价结合。在一些实施方案中，与TAA的二价结合包含结合相同抗原的相同表位(例如单表位)的两个抗原结合结构域。在一些实施方案中，与TAA的二价结合包含结合相同抗原的不同表位(例如，双表位)的两个抗原结合结构域。在一些实施方案中，与TAA的单价结合包含结合抗原的一个表位(例如单表位)的一个抗原结合结构域。
在一些实施方案中，TAA选自：1-92-LFA-3、5T4、α-4整合素、α-V整合素、α4β1整合素、α4β7整合素、AGR2、抗路易斯-Y、爱佩琳J受体、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5补体、C-242、CA9、CA19-9(路易斯a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5(CEA)、CEACAM6(NCA-90)、密封蛋白-3、密封蛋白-4、cMet、胶原蛋白、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、内皮素B受体(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV的F蛋白、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、叶酸受体α(FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、透明质酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受体(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R(wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰岛素受体、Jagged配体、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、路易斯X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、间皮素、MRP4、MUC1、粘蛋白-16(MUC16、CA-125)、Na/K ATP酶、NGF、呆蛋白、Notch受体、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂酰丝氨酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、鞘氨醇1磷酸酯、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、转铁蛋白、转铁蛋白受体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2、和WISP-3。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合结构域、或独立地每个抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)叶酸受体α(FRα)。例如，抗原结合结构域含有作为结合FRα的sdAb的结合结构域。示例性FRα结合sdAb示出于SEQ ID NO:120、121和122中。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合结构域、或独立地每个抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)cMET。例如，抗原结合结构域含有作为结合cMET的sdAb的结合结构域。示例性cMET结合sdAb示出于SEQ ID NO:123中(美国专利号9,346,884)。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合结构域、或独立地每个抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)B7H3。例如，抗原结合结构域含有作为结合B7H3的scFv的结合结构域。示例性B7H3结合scFv示出于SEQ ID NO:124中。在一些实施方案中，抗原结合结构域是sdAb，如VHH。示例性B7H3结合sdAb示出于SEQ ID NO:214-218中。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或含有包含VH-CH1(Fd)和LC的Fab抗体片段。示例性B7H3 Fd示出于SEQ IDNO:127中，并且示例性B7H3 LC示出于SEQ ID NO:128(PCT公开号WO2017/030926)中。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合结构域、或独立地每个抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)CD20。在一些实施方案中，这种抗原结合结构域含有SEQ ID NO:189所示的VH和SEQ ID NO:190所示的VL或展现出与SEQ ID NO:189或SEQ ID NO:190的至少或至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、98％或99％序列同一性的序列。例如，抗原结合结构域含有作为结合CD20的scFv的结合结构域。示例性CD20结合scFv示出于SEQ ID NO:125和213中(美国公开号US 2005/0123546)。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合结构域、或独立地每个抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)DLL3。例如，抗原结合结构域含有作为结合DLL3的scFv的结合结构域。示例性DLL3结合scFv示出于SEQ ID NO:126和188中(美国公开号US 2017/0037130)。在一些实施方案中，抗原结合结构域是sdAb，如VHH。示例性DLL3结合sdAb示出于SEQ ID NO:219或SEQ ID NO:220中的任一个中。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或含有结合DLL3的包含Fd和LC的Fab抗体片段。示例性DLL3 Fd示出于SEQ ID NO:133中列出，并且示例性DLL3 LC示出于SEQ ID NO:134中(美国专利号US 8,044,178)。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合结构域、或独立地每个抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)5T4。示例性5T4 Fd示出于SEQ ID NO:129中，并且示例性5T4 LC示出于SEQ ID NO:130中。在一些实施方案中，抗体结合结构域包含如SEQ ID NO:167和168所示的VH-CH1(Fd)或VL-CL(美国专利号US 8,044,178)。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合结构域、或独立地每个抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)gpNMB。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或含有包含Fd和LC链的Fab片段。示例性gpNMB Fd示出于SEQ ID NO:131中，并且示例性gpNMB LC示出于SEQ IDNO:132中。
在一些实施方案中，抗原结合结构域直接或经由接头间接连接至Fc区和/或CD3结合区。在一些实施方案中，连接是经由接头。在一些实施方案中，接头是连接肽(LP)，其可以包括如章节II.3中所述的任何柔性或刚性接头，但是通常连接一个或多个抗原结合结构域的肽不是可切割接头。
在一些实施方案中，多特异性多肽构建体包含在第一抗原结合结构域与Fc区之间的第一连接肽(LP1)。在一些实施方案中，多特异性多肽构建体包含在CD3结合区与第二抗原结合结构域之间的第二连接肽(LP2)。在一些实施方案中，多特异性多肽构建体包含在第一抗原结合结构域与Fc区之间的第一连接肽(LP1)和在CD3结合区与第二抗原结合结构域之间的第二连接肽(LP2)。在一些方面，多特异性多肽构建体从N末端到C末端具有如下结构排列：第一抗原结合结构域-LP1-Fc区-接头-CD3结合区-LP2-第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，两个连接肽彼此不相同。
在一些实施方案中，LP1或LP2独立地是长度为约1至20个氨基酸的肽。在一些实施方案中，LP1或LP2独立地是为或包含如SEQ ID NO:10-13、119、135、147、149或GGS所示的任何Gly-Ser接头的肽。
III.药物组合物
本文提供了任何所提供的多特异性多肽构建体的组合物。应了解，根据本公开文本的治疗实体的给予将与掺入配制品中以提供改善的转移、递送、耐受性等的合适的载体、赋形剂和其他药剂一起给予。在所有药物化学家都知道的配方中可以找到许多适当的配制品：Remington’s Pharmaceutical Sciences(第15版,Mack Publishing Company,宾夕法尼亚州伊斯顿(1975))，特别是其中Blaug,Seymour的第87章。这些配制品包括例如粉末、糊剂、软膏、凝胶、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(如LipofectinTM)、DNA缀合物、无水吸收膏、水包油和油包水乳液、乳液卡波蜡(carbowax)(具有不同分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有卡波蜡的半固体混合物。任何前述混合物都可适于根据本公开文本的治疗和疗法，前提条件是配制品中的活性成分不因配制而失活且配制品与给予途径在生理上相容且可耐受。关于与药物化学家熟知的配制品、赋形剂和载剂相关的额外信息，还参见Baldrick P.“Pharmaceutical excipient development:the need for preclinicalguidance.”Regul.Toxicol Pharmacol.32(2):210-8(2000)；Wang W.“Lyophilizationand development of solid protein pharmaceuticals.”Int.J.Pharm.203(1-2):1-60(2000)；Charman WN“Lipids,lipophilic drugs,and oral drug delivery-someemerging concepts.”J Pharm Sci.89(8):967-78(2000)；Powell等人“Compendium ofexcipients for parenteral formulations”PDA J Pharm Sci Technol.52:238-311(1998)和其中的引用。
在一些实施方案中，可以将多特异性多肽构建体、缀合的多特异性多肽构建体及其组合物(在本文中统称为一种或多种治疗剂及其衍生物、片段、类似物和同源物)掺入适于给予的药物组合物中。制备此类组合物所涉及的原理和考虑因素以及组分的选择指南提供于以下中：例如Remington’s Pharmaceutical Sciences:The Science And PracticeOf Pharmacy第19版(Alfonso R.Gennaro等人编辑)Mack Pub.Co.,宾夕法尼亚州伊斯顿:1995；Drug Absorption Enhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,AndTrends,Harwood Academic Publishers,Langhorne,宾夕法尼亚州,1994；和Peptide AndProtein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences,第4卷),1991,M.Dekker,纽约。
此类组合物通常包含多特异性多肽构建体或其缀合物、和药学上可接受的载体。当多特异性多肽构建体包括抗体的片段时，可以使用特异性结合至靶蛋白的抗体的最小片段。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计保留抗体结合靶蛋白序列的能力的肽分子。此类肽可以化学合成和/或通过重组DNA技术产生。(参见例如Marasco等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7889-7893(1993))。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给予相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载体描述于本领域中的标准参考文本Remington’s Pharmaceutical Sciences的最新版本中，将所述文献通过引用并入本文。此类载体或稀释剂的合适例子包括但不限于水、盐水、林格氏溶液(ringer’s solution)、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水性媒介物，如固定油。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则设想其在组合物中的用途。
用于体内给予的配制品必须是无菌的。这可以通过无菌过滤膜过滤容易地实现。
配制本公开文本的药物组合物以与其预期的给予途径相容。给予途径的例子包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、透皮(即局部)、透粘膜和直肠给予。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液(如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐)，以及用于调节张力的试剂(如氯化钠或右旋糖)。可用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节pH。可以将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内给予，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，帕西帕尼，新泽西州)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。其在制造和储存条件下必须稳定并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过以下方式维持适当流动性：通过使用诸如卵磷脂等包衣，在分散液情况下通过维持所需粒径，以及通过使用表面活性剂。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂以及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，合适的是在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量掺入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，之后过滤灭菌。通常，分散液是通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，所述真空干燥和冷冻干燥由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。在冻干组合物的情况下，可以在冻干和重构之前或之后使用此方法进行灭菌。用于肠胃外给予的组合物可以以冻干形式或溶液形式储存。此外，通常将肠胃外组合物置于具有无菌进入口的容器中，所述容器例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉输液袋或小瓶。
在一些实施方案中，将药物组合物通过任何途径给予受试者，包括口服、透皮、吸入、静脉内、动脉内、肌内、直接施用于伤口部位、施用于外科手术部位、腹膜内、通过栓剂、皮下、皮内、经皮、通过雾化、胸膜内、心室内、关节内、眼内或脊柱内。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。可以将它们封装于明胶胶囊中或压成片剂。出于口服治疗性给予的目的，可以将活性化合物与赋形剂一起掺入，并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用流体载体来制备以用作漱口剂，其中流体载体中的化合物经口施用并漱口，并且被吐出或被吞下。可以包括药学上相容的结合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有以下成分或具有类似性质的化合物中的任一种：粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂。
对于通过吸入给予，从加压容器或分配器(其含有合适的推进剂，例如气体(如二氧化碳))或者喷雾器以气溶胶喷雾剂形式递送多特异性多肽构建体。
全身性给予也可以通过经粘膜或透皮方式进行。对于经粘膜或透皮给予，在配制品中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域中已知的，并且例如就经粘膜给予而言，包括洗涤剂、胆盐、以及梭链孢酸衍生物。经粘膜给予可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于经皮给予，将活性化合物配制成如本领域中通常已知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。
也可以将化合物制备为呈栓剂(例如，与常规栓剂基质如可可脂和其他甘油酯一起)或保留灌肠剂的形式以供直肠递送。
在一个实施方案中，治疗剂是用保护化合物免于从身体迅速消除的载体制备的，如持续/控制释放配制品，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。此类配制品的制备方法对本领域技术人员而言是清楚的。
例如，治疗剂可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合反应制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊以及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，包埋在胶体药物递送系统中(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)，或包埋在粗乳液中。
在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的赋形剂，例如填充剂、粘合剂、包衣、防腐剂、润滑剂、调味剂、甜味剂、着色剂、溶剂、缓冲剂、螯合剂或稳定剂。药学上可接受的填充剂的例子包括纤维素、磷酸氢钙、碳酸钙、微晶纤维素、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、麦芽酚、预胶化淀粉、玉米淀粉或马铃薯淀粉。药学上可接受的粘合剂的例子包括聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、乳糖、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、明胶、蔗糖、聚乙二醇、甲基纤维素或纤维素。药学上可接受的包衣的例子包括羟丙基甲基纤维素(HPMC)、虫胶、玉米蛋白玉米醇溶蛋白或明胶。药学上可接受的崩解剂的例子包括聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素或羟基乙酸淀粉钠。药学上可接受的润滑剂的例子包括聚乙二醇、硬脂酸镁或硬脂酸。药学上可接受的防腐剂的例子包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸或山梨酸。药学上可接受的甜味剂的例子包括蔗糖、糖精、阿斯巴甜或山梨糖醇。药学上可接受的缓冲剂的例子包括碳酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、乙酸盐、磷酸盐或酒石酸盐。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成型制品(例如薄膜)或微胶囊的形式。在一些实施方案中，药物组合物还包含用于控制或持续释放产物的药剂，如可注射的微球、生物可侵蚀的颗粒、聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠粒或脂质体。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙烯基乙酸酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球))和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白质持续较短时间段。
所述材料也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.商购获得。脂质体悬浮液(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法，例如如美国专利号4,522,811中所述的方法来制备。
尤其有利的是以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物，以便于给予和剂量的均匀。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算与所需的药物载体联合可产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本公开文本的剂量单位形式的规格取决于且直接依赖于以下因素：活性化合物的独特特征和所要实现的特定治疗效果，和在复合这种活性化合物用于治疗个体的领域中固有的限制。
进一步提供了包含本文所述的药物组合物(或制品)的试剂盒。药物组合物可以与给予说明书一起包括在容器、包装或分配器中。本文所述的试剂盒还可包括商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器以及具有针对执行本文所述任何方法的说明书的包装插页。
配制品还可以含有所治疗的特定适应症所必需的多于一种多特异性多肽构建体，例如具有互补活性且彼此没有不利影响的那些。在一些实施方案中，或此外，组合物可以包含增强其功能的药剂，例如像细胞毒性剂、细胞因子、化学治疗剂或生长抑制剂。此类分子适合地以对预期目的有效的量组合存在。
在一些实施方案中，药物组合物的剂量是单剂量或重复剂量。在一些实施方案中，向受试者每天一次、每天两次、每天三次或每天四次或每天更多次给予剂量。在一些实施方案中，在一周内给予约1或更多(如约2或更多、约3或更多、约4或更多、约5或更多、约6或更多或约7或更多)个剂量。在一些实施方案中，在数天、数周、数月或数年的历程中给予多剂量。在一些实施方案中，治疗历程为约1或更多个剂量(例如约2或更多个剂量、约3或更多个剂量、约4或更多个剂量、约5或更多个剂量、约7或更多个剂量、约10或更多个剂量、约15或更多个剂量、约25或更多个剂量、约40或更多个剂量、约50或更多个剂量或约100或更多个剂量)。
在一些实施方案中，将药物组合物给予受试者。通常，根据标准药学实践，根据受试者的体型和状况确定药物组合物的剂量和给予途径。例如，最初可以在细胞培养测定中或在动物模型如小鼠、大鼠、兔、狗、猪或猴中估算治疗有效剂量。动物模型还可用于确定适当的浓度范围和给予途径。这种信息随后可用于确定在人中的可用剂量和给予途径。确切剂量将根据与需要治疗的受试者相关的因素来确定。调整剂量和给予以提供足够水平的活性化合物或以维持所需效果。可以考虑的因素包括疾病状态的严重程度、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、给予的时间和频率、一种或多种药物组合、反应敏感性以及对疗法的反应。特定患者的最佳剂量和治疗方案可由医学领域技术人员通过监测患者的疾病体征和相应地调整治疗而容易地确定。
IV.使用方法和治疗性给予
还提供了使用多特异性多肽构建体的方法及其用途。此类方法和用途包括治疗性方法和用途，例如，涉及将分子或含有所述分子的组合物给予至患有疾病、病症或障碍(如肿瘤或癌症)的受试者。在一些实施方案中，以实现疾病或障碍的治疗的有效量给予分子和/或组合物。用途包括多特异性多肽构建体在此类方法和治疗中以及在制备药物以实施此类治疗性方法中的用途。在一些实施方案中，通过向患有或怀疑患有疾病或病症的受试者给予多特异性多肽构建体或包含所述多特异性多肽构建体的组合物来进行所述方法。在一些实施方案中，所述方法由此治疗受试者的疾病或病症或障碍。
在一个实施方案中，本公开文本的多特异性多肽构建体可以用作治疗剂。此类药剂通常将用于诊断、预后、监测、治疗、缓和和/或预防受试者的疾病或病状。治疗方案是通过使用标准方法鉴定患有(或有风险患)障碍的受试者(例如人患者或其他哺乳动物)来实施。将多特异性多肽构建体给予至受试者。将多特异性多肽构建体给予至受试者，并且通常会由于其与一种或多种靶标的结合而具有作用。
在一些实施方案中，本文提供了通过给予治疗有效量的任何所提供的多特异性缀合物或药物组合物来调节受试者的免疫应答的方法。在一些实施方案中，调节免疫应答的方法增加或增强受试者的免疫应答。例如，增加或增强的应答可以是细胞介导的免疫性的增加。在一些例子中，所述方法增加T细胞活性，如细胞溶解性T细胞(CTL)活性。在一些实施方案中，调节的(例如，增加的)免疫应答是针对肿瘤或癌症的。
多特异性多肽构建体的给予可以经由通过多特异性多肽构建体的Fc区对FcγR的接合来激活先天免疫细胞。多特异性多肽构建体的给予可以激动、刺激、激活和/或增大先天免疫细胞效应子功能，包括ADCC、细胞因子释放、脱粒和/或ADCP。在其中多特异性多肽构建体含有可切割接头的例子中，一旦连接第一组分和第二组分的一个或多个接头由蛋白酶切割，从而允许抗CD3结合部分结合T细胞上的CD3ε，则多特异性多肽构建体的给予可以激活T细胞。多特异性多肽构建体的给予可以激动、刺激、激活和/或增大CD3介导的T细胞激活、细胞毒性、细胞因子释放和/或增殖。
在一些实施方案中，所提供的方法用于通过给予治疗有效量的任何所提供的多特异性缀合物或药物组合物来治疗受试者的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是肿瘤或癌症。通常，减轻或治疗疾病或障碍涉及减轻与所述疾病或障碍相关的一种或多种症状或医学问题。例如，在癌症的情况下，药物的治疗有效量可以实现以下中的一种或组合：减少癌细胞的数量；减少肿瘤大小；抑制(即在一定程度上减少和/或停止)癌细胞向外周器官中的浸润；抑制肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。在一些实施方案中，本公开文本的组合物可用于预防受试者(如人或其他哺乳动物，例如非人灵长类动物、伴侣动物(例如猫、犬、马)、农场动物、工作动物或动物园动物)的疾病或障碍的发作或复发。术语受试者和患者在本文中可互换使用。
在一些实施方案中，药物组合物可用于抑制哺乳动物癌细胞(如人癌细胞)的生长。治疗癌症的方法可包括向患有癌症的受试者给予有效量的本文所述的任何药物组合物。可给予有效量的药物组合物以抑制、中止或逆转癌症的进展。可在体内或离体处理人癌细胞。在人患者的离体治疗中，含有癌细胞的组织或流体是在体外处理，并且之后将所述组织或流体再引回患者体内。在一些实施方案中，通过将治疗组合物给予患者在人患者体内治疗癌症。
疾病的非限制性例子包括：所有类型的癌症(乳腺癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、头颈癌、胰腺癌等)、类风湿性关节炎、克罗恩病、SLE、心血管损伤、缺血等。例如、适应症将包括白血病(包括T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL))、淋巴母细胞疾病(包括多发性骨髓瘤)和实体瘤(包括肺癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、和乳腺癌(包括三阴性乳腺癌))。例如，适应症包括骨病或癌症转移，不管原发性肿瘤起源；乳腺癌，作为非限制性例子，包括ER/PR+乳腺癌、Her2+乳腺癌、三阴性乳腺癌；结直肠癌；子宫内膜癌；胃癌；胶质母细胞瘤；头颈癌，如食道癌；肺癌，作为非限制性例子，如非小细胞肺癌；多发性骨髓瘤卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；肉瘤，如骨肉瘤；肾癌，作为非限制性例子，如肾细胞癌；和/或皮肤癌，作为非限制性例子，如鳞状细胞癌、基底细胞癌或黑色素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症是皮肤鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症是食管鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症是头颈部鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症是肺鳞状细胞癌。
本公开文本的多特异性多肽构建体的治疗有效量通常涉及实现治疗目的所需的量。如上所述，这可能是多特异性多肽构建体与其一种或多种靶抗原之间的结合相互作用，在某些情况下，其激动、刺激、激活和/或增大FcγR介导的先天免疫细胞激活或CD3介导的T细胞激活。所需的给予量将进一步取决于多特异性多肽构建体对其一种或多种特异性抗原的结合亲和力，并且还将取决于所给予的多特异性多肽构建体从其所给予的其他受试者的自由体积耗尽的速率。作为非限制性例子，多特异性多肽构建体的治疗有效剂量的常见范围可以是约0.01μg/kg体重至约10mg/kg体重。在一些实施方案中，作为非限制性例子，本公开文本的多特异性多肽构建体的治疗有效剂量可以是约0.01mg/kg体重至约5-10mg/kg体重。常见的给予频率可以例如在每日两次至每周一次的范围内。
结合任何已知的用于诊断或治疗特定障碍的方法来确定治疗的有效性。筛选具有所需特异性的多特异性多肽构建体的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)和本领域内已知的其他免疫介导的技术。已知多种手段用于确定给予所提供的多特异性多肽构建体是否通过以下方式充分调节免疫活性：消除、隔离或灭活介导或能够介导不希望的免疫应答的免疫细胞；诱导、产生或开启介导或能够介导保护性免疫应答的免疫细胞；改变免疫细胞的物理或功能特性；或这些效应的组合。免疫活性调节的测量的例子包括但不限于检查免疫细胞群的存在或不存在(使用流式细胞术、免疫组织化学、组织学、电子显微镜、聚合酶链式反应(PCR))；测量免疫细胞的功能能力，包括响应于信号进行增殖或分裂的能力或抵抗响应于信号的增殖或分裂(如用抗CD3抗体、抗T细胞受体抗体、抗CD28抗体、钙离子载体、载有肽或蛋白质抗原的PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)抗原呈递细胞刺激后，使用基于3H-胸苷掺入的T细胞增殖测定和肽扫描分析；B细胞增殖测定)；测量杀死或裂解其他细胞的能力(如细胞毒性T细胞测定)；测量细胞因子、趋化因子、细胞表面分子、抗体和细胞的其他产物(例如，通过流式细胞术、酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析、蛋白质微阵列分析、免疫沉淀分析)；测量免疫细胞或免疫细胞内信号传导途径的激活的生化标记物(例如蛋白质印迹和免疫沉淀分析酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化、多肽切割以及蛋白质复合物的形成或解离；蛋白质阵列分析；DNA转录、使用DNA阵列或消减杂交的分析)；通过细胞凋亡、坏死或其他机制测量细胞死亡(例如，膜联蛋白V染色、TUNEL测定、用于测量DNA梯度的凝胶电泳、组织学；荧光半胱天冬酶测定、半胱天冬酶底物的蛋白质印迹分析)；测量由免疫细胞产生的基因、蛋白质和其他分子(例如，RNA印迹分析、聚合酶链式反应、DNA微阵列、蛋白质微阵列、2维凝胶电泳、蛋白质印迹分析、酶联免疫吸附测定、流式细胞术)；以及测量临床症状或结果，如自身免疫疾病、神经退行性疾病和其他涉及自身蛋白质或自身多肽的疾病的改善(临床评分、使用其他疗法的要求、功能状态、影像学研究)，例如，通过测量复发率或者疾病严重程度。
多特异性多肽构建体也可用于多种诊断性和预防性配制品中。在一个实施方案中，将多特异性多肽构建体给予至有患前述障碍中的一种或多种的风险的患者。可以使用基因型、血清学或生化标记物确定患者或器官对一种或多种障碍的易患性。
在本公开文本的另一个实施方案中，将多特异性多肽构建体给予至被诊断为患有与前述障碍中的一种或多种相关的临床适应症的人个体。在诊断后，给予多特异性多肽构建体以减轻或逆转临床适应症的效应。
组合疗法
在一些实施方案中，将多特异性多肽构建体、缀合的多特异性多肽构建体及其组合物(在本文中统称为一种或多种治疗剂)与一种或多种另外的药剂或另外的药剂的组合联合给予。合适的另外的药剂包括用于预期应用的当前医药和/或手术疗法。例如，所述一种或多种治疗剂可以与另外的化学治疗剂或抗瘤剂联合使用。例如，将所述一种或多种治疗剂和另外的药剂配制成单一治疗性组合物，并且同时给予所述一种或多种治疗剂和另外的药剂。在一些实施方案中，所述一种或多种治疗剂和另外的药剂彼此分开，例如，各自配制成单独的治疗性组合物，并且同时给予所述一种或多种治疗剂和所述另外的药剂，或者在治疗方案期间的不同时间给予所述一种或多种治疗剂和所述另外的药剂。例如，在给予所述另外的药剂之前给予所述一种或多种治疗剂，在给予所述另外的药剂之后给予所述一种或多种治疗剂，或者以交替的方式给予所述一种或多种治疗剂和所述另外的药剂。如本文所述，将所述一种或多种治疗剂和所述另外的药剂以单剂量或多剂量给予。在一些实施方案中，所述另外的药剂被偶联或以其他方式附接至一种或多种治疗剂。根据预期应用的目的(即杀伤、细胞增殖的预防、激素疗法或基因疗法)选择合适的另外的药剂。此类药剂可以包括但不限于例如药用剂、毒素、毒素片段、烷化剂、酶、抗生素、抗代谢物、抗增殖剂、激素、神经递质、DNA、RNA、siRNA、寡核苷酸、反义RNA、适配体、诊断剂、不透射线的染料、放射性同位素、荧光化合物、磁性标记、纳米颗粒、标记化合物、凝集素、改变细胞膜通透性的化合物、光化学化合物、小分子、脂质体、胶束、基因疗法载体、病毒载体等。最后，可以使用药剂的组合或不同种类的药剂的组合。
在一个实施方案中，将多特异性多肽构建体以组合疗法给予，即与可用于治疗病理病症或障碍(如自身免疫性障碍和炎性疾病)的其他药剂(例如治疗剂)组合给予。在本上下文中，术语“组合”意指基本上同步地(同时或顺序地)给予药剂。如果顺序给予，则在开始给予第二化合物时，两种化合物中的第一种仍然可在治疗部位被以有效浓度检测到。
例如，组合疗法可以包括与一种或多种另外的治疗剂(例如一种或多种细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂和/或细胞毒性剂或细胞抑制剂，如下文更详细描述的)共同配制和/或共同给予的一种或多种本公开文本的多特异性多肽构建体。此外，本文所述的一种或多种多特异性多肽构建体可以与本文所述的治疗剂中的两种或更多种组合使用。此类组合疗法可以有利地利用较低剂量的所给予的治疗剂，从而避免了与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。
在其他实施方案中，可以将本公开文本的一种或多种多特异性多肽构建体与一种或多种抗炎药、免疫抑制剂或代谢抑制剂或酶抑制剂共同配制和/或共同给予。可以与本文所述的抗体组合使用的药物或抑制剂的非限制性例子包括但不限于以下中的一种或多种：一种或多种非甾体抗炎药(NSAID)，例如布洛芬、替尼达普(tenidap)、萘普生(naproxen)、美洛昔康(meloxicam)、吡罗昔康(piroxicam)、双氯芬酸和吲哚美辛(indomethacin)；柳氮磺胺吡啶；皮质类固醇，如泼尼松龙；一种或多种细胞因子抑制性抗炎药(CSAID)；核苷酸生物合成的抑制剂，例如嘌呤生物合成的抑制剂、叶酸拮抗剂(例如甲氨蝶呤(N-[4-[[(2,4-二氨基-6-哌啶基)甲基]甲基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸)；以及嘧啶生物合成的抑制剂，例如二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)抑制剂。与本公开文本的抗体组合使用的合适治疗剂包括NSAID、CSAID、(DHODH)抑制剂(例如来氟米特(leflunomide))和叶酸拮抗剂(例如甲氨蝶呤)。
另外的抑制剂的例子包括以下中的一种或多种：皮质类固醇(口服、吸入和局部注射)；免疫抑制剂，例如环孢菌素、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)；和mTOR抑制剂，例如西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素-RAPAMUNETM或雷帕霉素衍生物，例如可溶性雷帕霉素衍生物(例如，酯雷帕霉素衍生物，例如CCI-779)；通过促炎性细胞因子(如TNFα或IL-1)干扰信号传导的药剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)；COX2抑制剂，例如塞来考昔(celecoxib)、罗非考昔(rofecoxib)及其变体；磷酸二酯酶抑制剂，例如R973401(IV型磷酸二酯酶抑制剂)；磷脂酶抑制剂，例如胞质磷脂酶2(cPLA2)的抑制剂(例如三氟甲基酮类似物)；血管内皮细胞生长因子或生长因子受体的抑制剂，例如VEGF抑制剂和/或VEGF-R抑制剂；以及血管生成抑制剂。与本公开文本的抗体组合使用的合适治疗剂是免疫抑制剂，例如环孢菌素、他克莫司(FK-506)；mTOR抑制剂，例如西罗莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素衍生物，例如，可溶性雷帕霉素衍生物(例如，酯雷帕霉素衍生物，例如，CCI-779)；COX2抑制剂，例如塞来考昔及其变体；以及磷脂酶抑制剂，例如胞质磷脂酶2(cPLA2)的抑制剂，例如三氟甲基酮类似物。可以与多特异性多肽构建体组合的治疗剂的另外的例子包括以下中的一种或多种：6-巯基尿嘧啶(6-MP)；硫唑嘌呤柳氮磺胺吡啶；美沙拉秦(mesalazine)；奥沙拉秦(olsalazine)；氯喹/羟基氯喹
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青霉胺；金硫苹果酸盐(aurothiornalate)(肌内和口服)；硫唑嘌呤；秋水仙碱(coichicine)；β-2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇；特普他林(terbutaline)；沙美特罗(salmeteral))；黄嘌呤(茶碱、氨茶碱)；色甘酸盐；奈多罗米(nedocromil)；酮替芬；异丙托铵和氧托溴铵(oxitropium)；吗替麦考酚酯；腺苷激动剂；抗血栓剂；补体抑制剂和肾上腺素能剂。
V.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种多特异性多肽构建体，所述多特异性多肽构建体包含含有免疫球蛋白Fc区的第一组分和含有CD3结合区的第二组分，其中：
所述第一组分和所述第二组分通过不可切割接头偶联，其中所述Fc区位于所述CD3结合区的N末端；并且
所述第一组分和所述第二组分中的一种或两种包含结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。
2.根据实施方案1所述的多特异性多肽构建体，其中所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的多特异性构建体，其中所述抗原结合结构域位于相对于所述多特异性多肽构建体的Fc区的氨基末端和/或位于相对于所述多特异性多肽构建体的CD3结合区的羧基末端。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一组分包含第一抗原结合结构域，并且所述第二组分包含第二抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域中的每一个结合肿瘤相关抗原(TAA)。
5.根据实施方案4所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一抗原结合结构域位于相对于所述多特异性构建体的Fc区的氨基末端，并且所述第二抗原结合结构域位于相对于所述多特异性构建体的CD3结合区的羧基末端。
6.一种多特异性多肽构建体，其中所述多特异性构建体从N末端到C末端按顺序包含：
结合肿瘤相关抗原(TAA)的第一抗原结合结构域；
免疫球蛋白Fc区；
不可切割接头；
结合CD3(CD3ε)的CD3结合区；以及
结合肿瘤相关抗原(TAA)的第二抗原结合结构域。
7.一种多特异性多肽构建体，其中所述多特异性构建体从N末端到C末端按顺序包含：
免疫球蛋白Fc区；
不可切割接头；
结合CD3(CD3ε)的CD3结合区；以及
结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。
8.一种多特异性多肽构建体，其中所述多特异性构建体从N末端到C末端按顺序包含：
结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域；
免疫球蛋白Fc区；
不可切割接头；以及
结合CD3(CD3ε)的CD3结合区。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fc区是同二聚体Fc区。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fc区是人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4的Fc区，或是其免疫活性片段。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fc区包含含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
12.根据实施方案1-10中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fc区包含含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的多肽；
所述Fc区包含含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的多肽；或者
所述Fc区包含含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
13.根据实施方案1-6、9和12中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fc区是异二聚体Fc区。
14.根据实施方案13所述的多特异性多肽构建体，其中与同二聚体Fc区的多肽相比，任选地与SEQ ID NO:1所示的Fc多肽或其免疫活性片段相比，所述异二聚体Fc区的一种或两种Fc多肽包含至少一个修饰以诱导异二聚化。
15.根据实施方案14所述的多特异性多肽构建体，其中所述异二聚体Fc的Fc多肽中的每一种独立地包含至少一个氨基酸修饰。
16.根据实施方案15所述的多特异性多肽构建体，其中所述异二聚体Fc的Fc多肽中的每一种包含杵臼结构修饰或包含电荷突变以增加所述多肽的静电互补性。
17.根据实施方案16所述的多特异性多肽构建体，其中所述氨基酸修饰是杵臼结构修饰。
18.根据实施方案13-17中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述异二聚体Fc的第一Fc多肽包含选自Thr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val及其组合的修饰，并且所述异二聚体Fc的第二Fc多肽包含修饰T366W。
19.根据实施方案18所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽进一步包含非半胱氨酸残基至半胱氨酸残基的修饰，其中所述第一多肽的修饰是在位置Ser354和Y349中的一个处，并且所述第二Fc多肽的修饰是在位置Ser354和Y349中的另一个处。
20.根据实施方案16所述的多特异性多肽构建体，其中所述氨基酸修饰是电荷突变以增加所述多肽的静电互补性。
21.根据实施方案13-16和20中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽或所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽中的每一种包含互补位置的修饰，其中所述修饰是用具有与另一多肽的互补氨基酸相反电荷的氨基酸替代。
22.根据实施方案14-21中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述异二聚体Fc的第一Fc多肽或第二Fc多肽中的一种进一步包含在残基Ile253处的修饰。
23.根据实施方案22所述的多特异性多肽构建体，其中所述修饰是Ile253Arg。
24.根据实施方案14-23中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述异二聚体Fc的第一Fc多肽或第二Fc多肽中的一种进一步包含在残基His435处的修饰。
25.根据实施方案24所述的多特异性多肽构建体，其中所述修饰是His435Arg。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fc区包含缺乏Lys447的多肽。
27.根据实施方案1-26中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fc区包含含有至少一个修饰以增强FcRn结合的多肽。
28.根据实施方案27所述的多特异性多肽构建体，其中所述修饰是在选自以下的位置：Met252、Ser254、Thr256、Met428、Asn434及其组合。
29.根据实施方案28所述的多特异性多肽构建体，其中所述修饰是在选自以下的位置：Met252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S及其组合。
30.根据实施方案28所述的多特异性多肽构建体，其中所述修饰是在位置Met252和位置Met428。
31.根据实施方案30所述的多特异性多肽构建体，其中所述修饰是Met252Y和Met428L。
32.根据实施方案30所述的多特异性多肽构建体，其中所述修饰是Met252Y和Met428V。
33.根据实施方案13-32中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述异二聚体Fc的第一多肽包含SEQ ID NO:82、86、94或96中任一个所示的氨基酸序列，并且所述异二聚体Fc的第二多肽包含SEQ ID NO:83、87、90、92、98或100中任一个所示的氨基酸序列。
34.根据实施方案1-33中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fc区包含含有至少一个氨基酸修饰的多肽，所述至少一个氨基酸修饰降低效应子功能和/或降低与选自Fcγ受体或C1q的效应分子的结合。
35.根据实施方案34所述的多特异性多肽构建体，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中一个或多个的缺失。
36.根据实施方案13-32、34和35中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述异二聚体Fc的第一多肽包含SEQ ID NO:84、88、95或97中任一个所示的氨基酸序列，并且所述异二聚体Fc的第二多肽包含SEQ ID NO:85、89、91、93、99或101中任一个所示的氨基酸序列。
37.根据实施方案1-32中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fc区包含含有至少一个修饰以增强FcγR结合的多肽。
38.根据实施方案37所述的多特异性多肽构建体，其中所述修饰是在Ser239或Ile332处的修饰。
39.根据实施方案1-32和37中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中与未经修饰的Fc区相比，所述Fc区的糖基化经修饰以增强FcγR结合。
40.根据实施方案39所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fc区无岩藻糖含量或具有降低的岩藻糖含量。
41.根据实施方案1-40中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述CD3结合区是抗CD3抗体或抗原结合片段。
42.根据实施方案41所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗CD3抗体或抗原结合片段包含可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)。
43.根据实施方案1-42中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述CD3结合区是单价的。
44.根据实施方案41-43中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗CD3抗体或抗原结合片段不是单链抗体，任选地不是单链可变片段(scFv)。
45.根据实施方案42或实施方案44所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fc是异二聚体Fc，并且构成所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH和VL连接至所述异二聚体Fc的相对多肽。
46.根据实施方案1-45中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述CD3结合区不能或基本上不能结合或接合CD3，除非所述抗原结合结构域中的至少一个与其TAA结合。
47.根据实施方案1-46中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述CD3结合区不能或基本上不能结合或接合CD3，除非所述抗原结合结构域中的至少两个与其TAA结合。
48.根据实施方案1-47中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述接头是多肽接头。
49.根据实施方案48所述的多特异性多肽构建体，其中所述接头是长度为最多25个氨基酸的多肽。
50.根据实施方案48或实施方案49所述的多特异性多肽构建体，其中所述接头是从或从约2至24个氨基酸、2至20个氨基酸、2至18个氨基酸、2至14个氨基酸、2至12个氨基酸、2至10个氨基酸、2至8个氨基酸、2至6个氨基酸、6至24个氨基酸、6至20个氨基酸、6至18个氨基酸、6至14个氨基酸、6至12个氨基酸、6至10个氨基酸、6至8个氨基酸、8至24个氨基酸、8至20个氨基酸、8至18个氨基酸、8至14个氨基酸、8至12个氨基酸、8至10个氨基酸、10至24个氨基酸、10至20个氨基酸、10至18个氨基酸、10至14个氨基酸、10至12个氨基酸、12至24个氨基酸、12至20个氨基酸、12至18个氨基酸、12至14个氨基酸、14至24个氨基酸、14至20个氨基酸、14至18个氨基酸、18至24个氨基酸、18至20个氨基酸或20至24个氨基酸的多肽。
51.根据实施方案48-50中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述接头是长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的多肽。
52.根据实施方案48-51中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述接头是长度为3至18个氨基酸的多肽。
53.根据实施方案48-51中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述接头是长度为12至18个氨基酸的多肽。
54.根据实施方案48-51中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述接头是长度为15至18个氨基酸的多肽。
55.一种多特异性多肽构建体，所述多特异性多肽构建体包含含有异二聚体Fc区的第一组分和含有抗CD3抗体或抗原结合片段的第二组分，所述抗CD3抗体或抗原结合片段包含可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)，其中：
构成所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH和VL连接至所述异二聚体Fc的相对多肽；
所述第一组分和所述第二组分通过不可切割接头偶联，其中所述异二聚体Fc区位于所述抗CD3抗体的N末端；并且
所述第一组分和所述第二组分中的一种或两种包含结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。
56.根据实施方案52-55中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头不含有由蛋白酶特异性识别以切割的底物识别位点。
57.根据实施方案56所述的多特异性多肽构建体，其中所述蛋白酶由免疫效应细胞、由肿瘤或由存在于肿瘤微环境中的细胞产生。
58.根据实施方案57所述的多特异性多肽构建体，其中所述蛋白酶由免疫效应细胞产生，并且所述免疫效应细胞是激活的T细胞、自然杀伤(NK)细胞或NK T细胞。
59.根据实施方案56-58中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述蛋白酶选自蛋白裂解酶(matriptase)、基质金属蛋白酶(MMP)、颗粒酶B及其组合。
60.根据实施方案59所述的多特异性多肽构建体，其中所述蛋白酶是颗粒酶B。
61.根据实施方案1-60中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含GS、GGS、GGGGS(SEQ ID NO:149)、GGGGGS(SEQ ID NO:135)及其组合。
62.根据实施方案1-61中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含(GGS)n，其中n是1至10。
63.根据实施方案1-62中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:173)，其中n是1至10。
64.根据实施方案1-62中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含(GGGGGS)n(SEQ ID NO:172)，其中n是1至4。
65.根据实施方案1-64中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含GGS。
66.根据实施方案1-64中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含GGGGS(SEQ ID NO:149)。
67.根据实施方案1-64中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含GGGGGS(SEQ ID NO:135)。
68.根据实施方案1-64中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含(GGS)2(SEQ ID NO:10)。
69.根据实施方案1-64中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含GGSGGSGGS(SEQ ID NO:11)。
70.根据实施方案1-64中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:12)。
71.根据实施方案1-64中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含GGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:13)。
72.根据实施方案1-64中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含GGGGGSGGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:119)。
73.根据实施方案1-64中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:147)。
74.根据实施方案1-64中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:170)。
75.根据实施方案45-74中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体至少包含(i)第一多肽，所述第一多肽包含所述异二聚体Fc区的第一Fc多肽、所述接头和所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH结构域；和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含所述异二聚体Fc区的第二Fc多肽、所述接头和所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VL结构域，其中所述第一多肽和所述第二多肽中的一种或两种包含至少一个结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。
76.根据实施方案1-75中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中一个或多个结合TAA的抗原结合结构域导致与所述TAA的单价、二价、三价或四价结合。
77.根据实施方案75所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一多肽或所述第二多肽中仅一种包含所述至少一个结合TAA的抗原结合结构域。
78.根据实施方案75或实施方案77所述的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个抗原结合结构域位于相对于所述多特异性多肽构建体的第一多肽或第二多肽中的一种的Fc区的氨基末端和/或位于相对于所述多特异性多肽构建体的第一多肽或第二多肽中的一种的CD3结合区的羧基末端。
79.根据实施方案75或实施方案77所述的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个抗原结合结构域位于相对于所述多特异性构建体的Fc区的氨基末端，并且所述第二抗原结合结构域位于相对于所述多特异性构建体的CD3结合区的羧基末端。
80.在根据实施方案1-79中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗原结合结构域、或独立地所述抗原结合结构域中的每一个包含所述TAA的天然同源结合配偶体的细胞外结构域或其结合片段，或其展现出与所述TAA的结合活性的变体。
81.根据实施方案1-79中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗原结合结构域、或独立地所述抗原结合结构域中的每一个是选自以下的抗体或其抗原结合片段：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体、和单结构域轻链抗体。
82.根据实施方案81所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗体或其抗原结合片段是Fv、scFv、Fab、单结构域抗体(sdAb)、VNAR或VHH。
83.根据实施方案81或实施方案82所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗体或抗原结合片段是sdAb。
84.根据实施方案83所述的多特异性多肽构建体，其中所述sdAb是人sdAb或人源化sdAb。
85.根据实施方案83或实施方案84所述的多特异性多肽构建体，其中所述sdAb是VHH、VNAR、工程化VH结构域或工程化VK结构域。
86.根据实施方案81或实施方案82所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗体或其抗原结合片段是scFv。
87.根据实施方案81或实施方案82所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗体或其抗原结合片段是Fab。
88.根据实施方案87所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含所述异二聚体Fc区的第一Fc多肽、所述接头和所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH结构域；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含所述异二聚体Fc区的第二Fc多肽、所述接头和所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VL结构域；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含结合肿瘤相关抗原的Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽进一步包含所述Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一种。
89.根据实施方案88所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一多肽或所述第二多肽中的仅一种包含所述Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一种。
90.根据实施方案89所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一多肽或所述第二多肽二者均包含所述Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一种。
91.根据实施方案89或实施方案90所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一种位于相对于所述多特异性多肽构建体的第一多肽或第二多肽中的一种的Fc区的氨基末端和/或位于相对于所述多特异性多肽构建体的第一多肽或第二多肽中的一种的CD3结合区的羧基末端。
92.根据实施方案89-91中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一种位于相对于所述第一多肽或所述第二多肽的Fc区的氨基末端并且位于相对于所述第一多肽或所述第二多肽中的另一种的CD3结合区的羧基末端。
93.根据实施方案1-92中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗原结合结构域、或独立地所述抗原结合结构域中的每一个结合选自以下的肿瘤抗原：1-92-LFA-3、5T4、α-4整合素、α-V整合素、α4β1整合素、α4β7整合素、AGR2、抗路易斯-Y、爱佩琳J受体、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5补体、C-242、CA9、CA19-9(路易斯a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5(CEA)、CEACAM6(NCA-90)、密封蛋白-3、密封蛋白-4、cMet、胶原蛋白、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、内皮素B受体(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV的F蛋白、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、叶酸受体α(FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、透明质酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受体(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R(wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰岛素受体、Jagged配体、Jagged 1、Jagged2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、路易斯X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、间皮素、MRP4、MUC1、粘蛋白-16(MUC16、CA-125)、Na/K ATP酶、NGF、呆蛋白、Notch受体、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂酰丝氨酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、鞘氨醇1磷酸酯、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、转铁蛋白、转铁蛋白受体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2、和WISP-3。
94.根据实施方案1-93中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性抗原结合结构域至少包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合相同TAA。
95.根据实施方案94所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合相同TAA的不同表位。
96.根据实施方案94所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合相同TAA的相同表位。
97.根据实施方案1-96中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性抗原结合结构域至少包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合不同TAA。
98.根据实施方案5-97中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体包含在所述第一抗原结合结构域与所述Fc区之间的第一连接肽(LP1)。
99.根据实施方案5-98中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体包含在所述CD3结合区与所述第二抗原结合结构域之间的第二连接肽(LP2)。
100.根据实施方案5-99中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体包含在所述第一抗原结合结构域与所述Fc区之间的第一连接肽(LP1)以及在所述CD3结合区与所述第二抗原结合结构域之间的第二连接肽(LP2)，并且其中所述多特异性多肽构建体从N末端到C末端具有如下结构排列：第一抗原结合结构域-LP1-Fc区-不可切割接头-CD3结合区-LP2-第二抗原结合结构域。
101.根据实施方案100所述的多特异性多肽构建体，其中所述两个连接肽彼此相同。
102.根据实施方案100所述的多特异性多肽构建体，其中所述两个连接肽彼此不相同。
103.根据实施方案98-102中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中LP1或LP2独立地是长度为约1至20个氨基酸的肽。
104.根据实施方案103所述的多特异性多肽，其中LP1或LP2独立地包括为或包含如SEQID NO:10-13、119、135、147、149或GGS所示的任何Gly-Ser接头的肽。
105.根据实施方案41-104中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗CD3抗体或抗原结合片段是Fv抗体片段。
106.根据实施方案105所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fv抗体片段包括二硫化物稳定的抗CD3结合Fv片段(dsFv)。
107.根据实施方案41-106中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中：
所述抗CD3抗体或抗原结合片段包含含有氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:16)或SEQ IDNO:211的VH CDR1；含有氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:17)或SEQ ID NO:212的VH CDR2；含有氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:18)的VH CDR3；含有氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:19)的VL CDR1；含有氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:20)的VL CDR2；以及含有氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:21)的VL CDR3；或者
所述抗CD3抗体或抗原结合片段包含至少包括氨基酸序列GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:211)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ ID NO:212)的VH CDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:18)的VH CDR3序列；至少包括氨基酸序列GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:229)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP(SEQ IDNO:230)的VL CDR2序列；以及至少包括氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:225)的VL CDR3序列。
108.根据实施方案106或实施方案107所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗CD3dsFv包含：
具有SEQ ID NO:14和32-62中任一个的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:14和32-62中的任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的VH；以及
具有SEQ ID NO:15和63-81中任一个的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:14和32-62中的任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的VL。
109.根据实施方案106-108中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗CD3dsFv包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列和SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
110.根据实施方案102-104中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗CD3dsFv包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列和SEQ ID NO:72的氨基酸序列。
111.根据实施方案1-109中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体缀合至药剂。
112.根据实施方案111所述的多特异性多肽构建体，其中所述药剂是治疗剂、抗瘤剂、毒素或其片段、可检测部分或诊断剂。
113.根据实施方案112所述的多特异性多肽构建体，其中所述药剂经由接头缀合至所述多特异性多肽构建体。
114.多核苷酸，其编码根据实施方案1-113中任一项所述的多特异性多肽构建体。
115.一种多核苷酸，其编码根据实施方案1-113中任一项所述的任何多特异性多肽构建体的多肽链。
116.一种多核苷酸，其包含编码根据实施方案1-115中任一项所述的多特异性构建体的第一多肽的第一核酸序列和编码所述多特异性构建体的第二多肽的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列被内部核糖体进入位点(IRES)或者编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的序列分开。
117.根据实施方案116所述的多核苷酸，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列可操作地连接至相同启动子。
118.根据实施方案116或实施方案117所述的多核苷酸，其中所述多特异性多肽构建体包含第三多肽链，并且所述多核苷酸进一步包含编码所述多特异性构建体的第三多肽的第三核酸。
119.根据实施方案118所述的多核苷酸，其中所述第三核酸与所述第一多肽和/或所述第二多肽被内部核糖体进入位点(IRES)或者编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核酸分开，和/或所述第三核酸序列可操作地连接至与所述第一核酸序列和/或所述第二核酸序列相同的启动子。
120.根据实施方案116-119中任一项所述的多核苷酸，其中所述编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核酸选自T2A、P2A、E2A或F2A。
121.一种载体，其包含根据实施方案114-120中任一项所述的多核苷酸。
122.根据实施方案121所述的载体，其是表达载体。
123.根据实施方案121或122所述的载体，其是病毒载体或真核载体，任选地其中所述真核载体是哺乳动物载体。
124.一种细胞，其包含根据实施方案114-120中任一项所述的一种或多种多核苷酸或根据实施方案121-123中任一项所述的一种或多种载体。
125.根据实施方案124所述的细胞，其中所述细胞是重组的或分离的。
126.根据实施方案125所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
127.根据实施方案126所述的细胞，其中所述细胞是HEK293或CHO细胞。
128.一种产生多特异性多肽构建体的方法，所述方法包括将根据实施方案114-120中任一项所述的一种或多种多核苷酸或根据实施方案121-123中任一项所述的一种或多种载体引入细胞中，并且在产生所述多特异性多肽构建体的条件下培养所述细胞。
129.一种产生多特异性多肽构建体的方法，所述方法包括在其中由根据实施方案124-127中任一项所述的细胞产生所述多特异性多肽的条件下培养所述细胞。
130.根据实施方案128或129所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
131.根据实施方案130所述的细胞，其中所述细胞是HEK293或CHO细胞。
132.根据实施方案128或实施方案129所述的方法，其进一步包括从所述细胞中分离或纯化所述多特异性多肽构建体。
133.根据实施方案128-132中任一项所述的方法，其中所述多特异性多肽构建体是异二聚体。
134.一种多特异性多肽构建体，其通过根据实施方案128-133中任一项所述的方法产生。
135.一种药物组合物，其包含根据实施方案1-113或实施方案134中任一项所述的多特异性多肽构建体、和药学上可接受的载体。
136.根据实施方案135所述的药物组合物，其是无菌的。
137.一种刺激或诱导免疫应答的方法，所述方法包括使靶细胞和T细胞与根据实施方案1-113或实施方案134中任一项所述的多特异性多肽构建体或根据实施方案109或实施方案110所述的药物组合物接触，所述靶细胞表达由所述多特异性多肽构建体识别的肿瘤相关抗原。
138.根据实施方案137所述的方法，其中所述靶细胞是表达所述肿瘤相关抗原(TAA)的肿瘤细胞。
139.根据实施方案137或实施方案138所述的方法，其中所述接触是离体或体外进行的。
140.根据实施方案137-149中任一项所述的方法，其中所述接触是在受试者体内进行的。
141.一种在受试者中刺激或诱导免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的根据实施方案1-113或实施方案134中任一项所述的多特异性缀合物或根据实施方案109或实施方案110所述的药物组合物。
142.根据实施方案137-141中任一项所述的方法，其增加细胞介导的免疫性。
143.根据实施方案137-142中任一项所述的方法，其增加T细胞活性。
144.根据实施方案137-143中任一项所述的方法，其增加细胞溶解性T细胞(CTL)活性。
145.根据实施方案137-144中任一项所述的方法，其中所述免疫应答是针对肿瘤或癌症增加的。
146.根据实施方案137-145中任一项所述的方法，其中所述方法治疗所述受试者的疾病或病症。
147.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的根据实施方案1-113中任一项所述的多特异性缀合物或根据实施方案135或实施方案136所述的药物组合物。
148.根据实施方案146或实施方案147所述的方法，其中所述疾病或病症是肿瘤或癌症。
149.根据实施方案140-148中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
VI.实施例
以下实施例被包括在内仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1：产生具有受限CD3结合的多特异性构建体的方法
实施例1描述了含有展现出受限CD3结合的CD3结合区的多特异性多肽构建体的产生和表达。如图1、图2A至图2B、图3A至图3C及图4A至图4B所示，将多特异性构建体以各种构型产生，以含有通过接头(例如不可切割接头)偶联至CD3结合区的免疫球蛋白的异二聚体Fc区、和一个或多个结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域位于相对于多特异性多肽构建体的Fc区的氨基末端和/或位于相对于多特异性多肽构建体的CD3结合区的羧基末端。
A.构建体的设计和产生
产生至少编码异二聚体多特异性多肽构建体的第一多肽链和第二多肽链的多核苷酸，并将其克隆到质粒中进行表达。第一多肽链通常从N末端到C末端按顺序包括第一Fc多肽(例如Fc臼多肽)；不可切割接头；和抗CD3抗体的可变轻(VL)结构域。第二多肽链通常从N末端到C末端按顺序包括第二Fc多肽(例如Fc杵多肽)；与第一多肽链情况下相同的不可切割接头；和抗CD3抗体的可变重(VH)结构域。抗CD3抗体包括二硫化物稳定的(dsFv)抗体(具有突变G44C的抗CD3 VH和具有突变G100C的VL)或含有非二硫化物稳定的Fv抗体，如表E1.1和E1.2所示。如表E1.1和表E1.2所示，使用了各种示例性Fc多肽对促进多肽链的异二聚化。多肽链中的一条或两条另外编码在Fc结构域的氨基末端和/或在CD3结合区的羧基末端的呈各种构型的一个或多个TAA抗原结合结构域。可以使用其他异二聚体Fc构型产生相似的构建体，包括其他杵臼结构构型，如所述的任一种；也可以使用其他CD3结合区，包括其他抗CD3抗体，包括dsFv或其他单价片段；或其他TAA抗原结合片段，如scFv、sdAb或Fab形式。
在产生的构建体中，不可切割接头包括大小在3-18个氨基酸范围内的接头。在产生的示例性分子中使用的不可切割接头的例子是GGS(例如包含在示例性构建体cx1356中)、GGSGGS(SEQ ID NO:10，包含在示例性构建体cx1357中)、GGSGGSGGS(SEQ ID NO:11，包含在示例性构建体cx1358中)、GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:12，包含在示例性构建体cx1359中)、GGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:13，包含在示例性构建体cx1360中)和GGGGGSGGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:119，包含在示例性构建体cx5823和cx5952中)或GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:147，包含在示例性构建体cx681中)。
可以在所提供的多特异性多肽构建体中使用结合TAA的任何抗原结合结构域。产生的示例性蛋白质含有结合叶酸受体α(FRα)、B7H3(CD276)或δ样3(DLL3)的抗原结合结构域。抗原结合结构域可以包括单链片段(例如，sdAb或scFv)或两链抗原结合片段(Fab)。当TAA作为单链片段(例如sdAb或scFv)提供时，TAA抗原结合结构域通过肽接头(例如PGGGG(SEQ ID NO:102))在Fc异二聚体的一条或两条多肽链(例如，臼和/或杵)的N末端连接和/或通过肽接头(例如GGGG(SEQ ID NO:103))在CD3结合区的一个或两个结构域(例如VH和/或VL)的C末端连接。可以使用其他类似的肽接头。当TAA作为Fab抗原结合片段提供时，构建体由在没有接头的情况下直接连接至一条或两条Fc多肽的VH和CH1，以及由VL和CL构成的轻链构成。这些结合TAA的Fab可以位于异二聚体Fc的氨基或羧基末端。
产生了含有1、2、3或4个TAA抗原结合结构域的多特异性多肽构建体，如以分别提供单价、二价、三价或四价结合。在一些情况下，TAA抗原结合结构域是相同的(单表位的)。在一些情况下，TAA抗原结合结构域是不同的，由此使得所产生的多特异性多肽构建体展现出对至少两种不同的TAA的特异性，展现出对相同TAA的不同表位(双表位)或相同TAA的相同表位(单表位)的特异性。
所产生的蛋白质是其中TAA抗原结合结构域构成为单结构域抗体(sdAb)的构建体。产生了多核苷酸以编码含有不可切割接头的示例性多特异性多肽构建体的多肽链。这些包括命名为以下的构建体：cx1356、cx1357、cx1358、cx1359、cx1360和cx681(靶向FRα，如图2B中所描绘)；cx3072、cx5952、cx6079、cx6080、cx6081、cx5823、cx5873和cx5965(靶向B7H3，如图3A和图3B中所描绘)；以及cx5352、cx5499、cx5800和cx5801(靶向DLL3，如图4A和图4B中所描绘)。值得注意的是，产生了一些构建体，其中dsFv抗CD3抗体的VH结构域和sdAb均连接至Fc异二聚体的同一侧(例如臼或杵侧)(例如，图3A中所示的cx3072和cx5952)。将构建体工程化为没有二硫化物稳定的Fv，或工程化为具有稳定抗CD3抗体的VH和VL结构域的二硫键。所产生的一些示例性构建体另外含有靶向4-1BB共刺激受体的sdAb(分别含有SEQ ID No:221、222和223所示的CDR1、CDR2和CDR3)(例如cx5823、cx5873、cx5965、cx5352、cx5801、cx5800)。下表E1.1中给出了具有sdAb TAA结构域的示例性受限CD3结合构建体的列表。
Figure BDA0002817785800001191
Figure BDA0002817785800001201
Figure BDA0002817785800001211
Figure BDA0002817785800001221
Figure BDA0002817785800001231
Figure BDA0002817785800001241
产生的示例性构建体还包括其中TAA抗原结合结构域构成为Fab的构建体(命名为MAB形式)。在此例子中，使用了抗B7H3 Fab，其由SEQ ID NO:127所示的重链Fd和SEQ IDNO:128所示的轻链构成。产生了多核苷酸以编码含有不可切割接头的示例性多特异性多肽构建体的多肽链。这些包括cx5067、cx6083和cx6084，如图3C所描绘。将构建体工程化为没有二硫化物稳定的抗CD3抗体Fv或工程化为具有稳定抗CD3抗体的VH和VL结构域(具有突变G44C的抗CD3 VH和具有突变G100C的VL)的二硫键。下表E1.2中提供了示例性Fab构建体的列表。
Figure BDA0002817785800001242
Figure BDA0002817785800001251
B.产生的构建体的表达和纯化
使用聚乙烯亚胺将编码异二聚体受限CD3结合蛋白的每一条链的单独质粒以等摩尔比率瞬时转染至哺乳动物细胞(HEK293或CHO)中。3-14天后收集分泌至上清液中的重组蛋白，并通过蛋白A色谱、之后通过制备型尺寸排阻色谱(SEC)或流通疏水相互作用色谱(HIC)纯化。在一些情况下，由于突变被设计到异二聚体Fc的一条链中(在位置I253R或H435R处)(例如在臼-Fc中)使得其不结合蛋白A、且因此不纯化I253R或H435R的同二聚体，因此在纯化期间富集异二聚体蛋白。使用通过SEC(具有Superdex-200树脂的AKTA)或FT-HIC(采用丁基/苯基琼脂糖凝胶的AKTA)进行的第二色谱步骤去除含有两个异二聚体Fc的不期望的交叉配对物质，所述交叉配对物质疏水性更高且是预期分子量的两倍。
所述方法倾向于产生异二聚体多特异性多肽构建体，其含有异二聚体Fc和抗CD3Fv(例如二硫化物稳定的抗CD3 Fv)的适当配对物质。在4℃或增加的蛋白质浓度下延长孵育时，纯化的异二聚体受限CD3结合蛋白是稳定的且不累积交叉配对物质。
实施例2：通过流式细胞术对受限CD3结合构建体与癌细胞和原代T细胞的结合的评估
此实施例描述了评估示例性构建体与T细胞或癌细胞的结合的研究。这些研究是在含有彼此单独的仅T细胞或仅癌细胞的单一培养物中进行的。
A.FR-α结合
通过流式细胞术评估了含有针对叶酸受体α(FRα)的抗原结合结构域的本公开文本的示例性多特异性多肽构建体与原代T细胞表面上的CD3和FRα表达细胞(Ovcar-5)的结合。所测试的构建体的肿瘤抗原结合结构域结合不在原代T细胞上表达的叶酸受体α(FRα)。所测试的构建体包括cx1356和cx681，其在cx1356中含有3个氨基酸的不可切割接头或在cx681中含有18个氨基酸的不可切割接头(参见图2B和表E1.1)。
对于图5A和图5B中所述的研究，使用100nM每种构建体cx1356或cx681并评估其与Ovcar-5细胞或原代T细胞的结合。包括抗CD3抗体以作为对照。进行在FRα表达细胞(Ovcar-5；图5C)或单独的原代T细胞(FRα阴性；图5D)上的受限CD3接合构建体的滴定以评估结合。使用荧光团缀合的抗人IgG Fc二抗检测结合的构建体。
发现所测试的在Fc与CD3结合结构域的组分之间具有各种接头的FRα靶向构建体结合FRα表达细胞(Ovcar-5)(图5A和图5C)，但缺乏结合T细胞的能力(图5B和图5D)。这些结果与以下发现一致：与单独的T细胞上的CD3的结合在所提供的形式中受限。
B.B7H3结合
评估含有针对B7H3的抗原结合结构域的示例性多特异性构建体与B7H3阳性A375肿瘤细胞或原代T细胞的结合。产生了含有一个或多个抗原结合结构域的构建体，所述一个或多个抗原结合结构域是sdAb或FAB，并且仅位于Fc的N末端或者位于Fc的N末端和抗CD3结合结构域的C末端(参见图3A和图3C和表E1.1)。所测试的各种形式的构建体包括：sdAb-Fc-dsFV-sd Ab(cx3072、cx5952)、sdAb-Fc-FV(cx6079)、sdAb-Fc-dsFV(cs6080、cx6081)、MAB-FV(cx5067)和MAB-dsFV(cx6083、cx6084)，其中FV表示由VH和VL结构域对构成的抗CD3结合结构域，并且“ds”表示经由工程化的结构域间二硫键稳定的二硫化物。
图6A-F证明了这些构建体能够结合B7H3，但不能结合单独的T细胞。如上所述，使用荧光团缀合的抗人Fc二抗经由流式细胞术评估结合。cx3072以高亲和力结合A375细胞(图6A)，但不结合单独的T细胞(图6B)。与含有FAB的MAB-FV(cx5067)和MAB-dsFV构建体(cx6083、cx6084)相比，所测试的sdAb-Fc-dsFV-sdAb(cx5952)显示出更高的结合亲和力(图6C)。含有B7H3靶向性sdAb的构建体(cx5952、cx6079、cx6080和cx6081)以相似亲和力与B7H3阳性细胞结合(如图6E中所描绘)，其中cx5952显示出更高的最大结合。cx6079、cx6080和cx6081含有两个相同的B7H3靶向性sdAb，而cx5952和cx3072含有两个不同的结合不同表位的B7H3靶向性sdAb。MAB-FV cx5067含有两个相同的B7H3靶向FAB结构域。值得注意的是，没有一个示例性靶向B7H3的受限CD3接合构建体结合了单独的原代人T细胞，如图6B、图6D和图6F中所描绘。这些结果进一步支持了：与单独的T细胞上的CD3的结合在所提供的形式中受限。
实施例3：对与表达抗原的靶细胞的共培养物中CD3信号传导活性的评估以及接头长度 对活性的影响
使用Jurkat报告物测定测试了Fc与构成CD3结合区的组分结构域(VH和VL)之间的各种长度接头对T细胞激活能力的影响。CD3报告细胞是从Jurkat细胞开发而来的，所述报告细胞自然表达CD3并经工程化以表达NFAT驱动的绿色荧光蛋白(GFP)。CD3的激动作用导致NFAT信号传导以及绿色荧光的产生。
将抗原靶向性受限CD3接合构建体滴定到靶细胞和Jurkat CD3报告细胞的共培养物上。在此测定中，靶细胞包括IGROV1(FRα阳性)或NCI-460(FRα阴性)。对于利用贴壁性抗原表达靶细胞的报告物测定，接种靶细胞，使其在室温下沉降以便均匀分布，并且在37℃下孵育若干小时以允许在添加报告细胞和抗原靶向性受限CD3接合构建体之前贴壁。使用IncuCyte ZOOM系统对测定板进行连续成像，并通过以孔中的总积分的绿色对象测量GFP表达来确定CD3报告细胞激活。
在这些测定中使用了如实施例1中所述产生的FRα靶向性受限CD3接合构建体，这些构建体含有如表E3中列出的各种长度的基于GlySer的接头。
Figure BDA0002817785800001281
如图7A至图7F中所示，如由荧光强度确定的T细胞激活活性取决于与表达FRα抗原的靶细胞的共培养。接头的长度和T细胞激活能力呈正相关。显示T细胞激活能力与接头长度直接相关，表明较短的接头更大程度地限制CD3结合(参见图7A、图7C和图7E)。重要的是，构建体的T细胞接合取决于TAA结合，因为这些构建体如上文在实施例2所示未展示出单独的(如未与靶TAA结合时的溶液形式)T细胞结合能力。此外，在与FRα阴性细胞的共培养物中未测量到可观察到的荧光(图7B、图7D和图7E)。总之，这些构建体显示出受限或明显降低的与CD3的结合，但仍能够以靶标依赖性方式激活T细胞。
实施例4：对靶向B7H3的受限CD3结合构建体的T细胞激活活性的评估
在T细胞报告物测定和T细胞细胞毒性测定中，评估含有靶向B7H3的sdAb或Fab作为肿瘤相关抗原结合结构域的构建体的T细胞激活活性。评估用作为一个或多个抗原结合结构域的抗B7H3 sdAb格式化的靶向B7H3的受限CD3接合构建体(例如cx5823、cx6079、cx6080、cs6081、cx3072和cx5952)或用作为一个或多个抗原结合结构域的Fab格式化的抗B7H3MAB构建体(例如cx5067、cx6083或cx6084)的活性(参见图3A至图3C和表E1.1)。除cx5067和cx6079外，所有所测试的构建体均含有二硫化物稳定的抗CD3 Fv(dsFv)，其含有通过抗CD3 VH G44C与VL G100C的配对修饰而产生的链间二硫键。cx5067(命名为MAB-Fv)的抗CD3 Fv不是二硫化物稳定的。
A.T细胞报告物活性
使用实施例3中所述的NFAT-GFP CD3 Jurkat报告物比较在B7H3阳性细胞(A375)或天然缺乏B7H3表达的非靶标CCRF-CEM细胞的存在下共培养时的靶向B7H3的受限CD3接合构建体的CD3激动特性。在此测定中，将抗B7H3 sdAb构建体cx5823、cx6079、cx6080和cx6081或抗B7H3 Fab构建体cx5067、cx6083和cx6084用作B7H3靶向结构域。如图8A中所示，含有靶向B7H3的sdAb的构建体显示出抗原依赖性CD3激活的相似效力。如图8C中所示，发现与含有靶向B7H3的Fab的构建体相比，含有靶向B7H3的sdAb的示例性cx5823构建体在介导抗原依赖性CD3激活方面是优越的。尽管用针对共刺激受体的结合结构域格式化cx5823，但此组分不太可能导致结果差异，因为Jurkat T细胞不表达共刺激受体。没有一个构建体展示出对B7H3阴性CCRF-CEM细胞的活性(图8B和图8D)。
B.细胞毒性
为了进一步评估分子的活性，在T细胞介导的细胞毒性测定中测试示例性靶向B7H3的构建体cx3072和cx5952(各自均格式化为sdAb-dsFv)、cx6083和cx6084(MAB-dsFv)、cx5067(MAB-Fv)、cx6079(sdAb-Fv)以及cx6080和cx 6081(sdAb-dsFv)。靶细胞包括B7H3阳性细胞系A375和修饰的A375细胞(其中B7H3基因被CRISPR破坏(A375:B7H3KD))或天然缺乏B7H3表达的CCRF-CEM细胞。将靶细胞以1.0x104个细胞/孔接种，使其在室温下沉降以便均匀分布，并且在37℃下孵育若干小时。从自健康人供体leukopak分离的PBMC中阴性富集原代T细胞，并将其以10:1的T细胞与靶细胞比率添加。添加绿色半胱天冬酶-3/7试剂，所述试剂用荧光标记经历凋亡的细胞的核DNA。将具有受限CD3接合活性的多特异性构建体滴定到共培养物上，并使用IncuCyte ZOOM系统对测定板进行连续成像。通过测量总的红色/绿色重叠对象面积来确定靶细胞死亡。
如图9A和图9B所示，示例性含有sdAb B7H3靶向性抗原结合结构域的构建体cx3072和cx5952诱导了B7H3阳性(A375)而非B7H3阴性细胞系的强效T细胞介导的细胞毒性。
当与具有Fab B7H3靶向结构域的示例性B7H3靶向性受限CD3接合体(cx5067、cx6083和cx6084)相比时，示例性cx5952 sdAb B7H3靶向性受限CD3接合体介导了增强的靶标依赖性T细胞细胞毒性(图10A)。对于任何测试的构建体，未观察到针对B7H3阴性细胞系CCRF-CEM的可测量的T细胞细胞毒性，这与强效诱导抗原依赖性T细胞激活的能力一致(图10B)。在所测试的构建体中，代表性MAB-dsFV构建体cx6084和cx6083含有工程化二硫化物，而代表性MAB-FV构建体cx5067缺乏这种稳定化修饰。值得注意的是，除了在抗CD3 FV结构域内工程化二硫化物的存在(cx6083)或不存在(cx5067)之外，cx6083和cx5067是相同的(图3C中所描绘)。工程化二硫化物是通过VH内G44C和VL内G100C的修饰产生的。如图10A中所示，与cx5067相比，cx6083在介导靶标依赖性T细胞细胞毒性方面显示出优越的效力，这表明结构域间二硫化物的掺入在T细胞介导的细胞毒性方面是有益的，这可能是通过增强构成抗CD3 FV的VH和VL结构域的适当缔合来实现的。
当与具有sdAb B7H3靶向结构域的其他示例性B7H3靶向性受限CD3接合体(cx6079、cx6080和cx6081)相比时，示例性cx5952 sdAb B7H3靶向性受限CD3接合体介导了增强的靶标依赖性T细胞细胞毒性(图10C)。对于任何测试的构建体，未观察到针对B7H3阴性细胞系CCRF-CEM的可测量的T细胞细胞毒性，这与强效诱导抗原依赖性T细胞激活的能力一致(图10D)。在所测试的构建体中，sdAb-dsFV构建体cx5952、cx6080和cx6081含有工程化二硫键，而sdAb-FV构建体cx6079缺乏这种稳定化修饰。工程化二硫化物是通过VH内G44C和VL内G100C的修饰产生的。值得注意的是，cx5952被工程化为具有两个不同的B7H3靶向结构域，一个位于氨基末端并且一个位于羧基末端。cx6079、cx6080和cx6081被工程化为具有两个相同的B7H3靶向结构域，二者均位于氨基末端(参见图3A)。
C.T细胞调节
为了进一步评估T细胞调节，通过监测构建体调节T细胞激活标记物的能力来评估示例性多特异性CD3受限结合构建体。为了评估T细胞激活，收集来自以上T细胞细胞毒性测定的悬浮细胞，所述测定涉及在示例性靶向B7H3的受限CD3接合构建体cx5952的存在下，将T细胞与B7H3阳性(A375)或B7H3阴性细胞系(CCRF-CEM)一起培养。用live/dead染色剂和荧光团缀合的抗CD4、抗CD8、抗CD25、抗CD69和/或抗CD71抗体对细胞进行染色。使用SONYSA3800光谱分析仪分析细胞，并通过测量CD25、CD69或CD71的表达水平或CD25、CD69或CD71阳性百分比来确定CD4+或CD8+T细胞激活。
示出了在cx5952的存在下与B7H3阳性(A375)或B7H3阴性细胞系(CCRF-CEM)共培养后CD4+和CD8+ T细胞上的CD25表达(图11A)、CD69表达(图11B)和CD71表达(图11C)的结果。结果显示，cx5952经由CD3结合介导了剂量依赖性的B7H3依赖性T细胞激活，如通过CD4+和CD8+ T细胞中CD25、CD69和CD71的增加表达所证实的。
当与具有sdAb B7H3靶向结构域的其他示例性B7H3靶向性受限CD3接合体((cx6079、cx6080和cx6081))相比时，示例性cx5952 sdAb B7H3靶向性受限CD3接合体介导了增加的T细胞激活，如通过CD4+ T细胞(图11D)和CD8+ T细胞(图11H)中CD25的增加表达及CD4+ T细胞(图11F)和CD8+ T细胞(图11J)中CD71的增加表达所证实的。在与B7H3阴性细胞系的培养物中，在B7H3靶向性受限CD3接合体构建体的存在下，未观察到T细胞上表面标记物的增加表达(对于CD4+ T细胞为图11E和图11G，并且对于CD8+ T细胞为图11I和图11K)。
D.T细胞细胞因子产生
通过夹心ELISA分析来自T细胞细胞毒性肿瘤细胞共培养测定的上清液的IFNγ含量，所述测定涉及在cx5952、cx6083、cx6084或cx5067的存在下将T细胞与B7H3阳性、A375或阴性CCRF-CEM细胞共培养。产生上清液样品的细胞因子浓度值进行内插的标准曲线。向吸光度值低于检测下限的样品分配等于最低标准浓度的一半的细胞因子浓度。如图12A中所示，在从激活的T细胞引发靶标依赖性细胞因子释放方面，代表性sdAb-Fc-dsFV-sdAb构建体cx5952优于所测试的含有靶向B7H3的FAB的构建体cx6083、cx6084和cx5067。重要的是，MAB-dsFV构建体cx6083和cx6084优于MAB-FV构建体cx5067，这证明了结构域间二硫化物稳定化修饰对增强T细胞功能的重要性。
当与具有sdAb B7H3靶向结构域的其他示例性B7H3靶向性受限CD3接合体(cx6079、cx6080和cx6081)相比时，示例性cx5952 sdAb B7H3靶向性受限CD3接合体在B7H3靶细胞T细胞的存在下介导了IFNγ的明显增加的产生，但在与B7H3阴性细胞系的培养中并没有如此介导(图12B)。
E.总结
这些观察结果进一步支持了：本文提供的靶向抗原的受限CD3形式缺乏或展现出降低的单独的T细胞结合，同时保持强效的B7H3依赖性T细胞细胞毒性诱导能力。不希望受理论的束缚，这些结果一起显示使用靶向抗原的sdAb代替Fab可以减少TAA表达肿瘤细胞与CD3表达T细胞之间的免疫突触距离，并增强T细胞活性和细胞毒性。值得注意的是，发现通过抗CD3VH G44C与VL G100C的配对修饰而产生的链间二硫键的包括大大增强了受限CD3接合构建体的活性。此外，与其他sdAb B7H3靶向结构域构建体相比，cx5952的B7H3依赖性T细胞活性更强效表明B7H3靶向性sdAb在抗CD3结合结构域的C末端的定位，或者cx5952结合B7H3上的两个不同表位而所测试的其他构建体以二价方式结合单一表位的事实有助于这种增强的活性。
实施例5：对含有单一或多个B7H3结合靶向结构域的CD3受限多特异性构建体的评估
将含有单价sdAb抗原结合结构域(位于N末端或C末端)的构建体的活性与含有位于N末端和C末端二者的抗原靶向sdAb的双结合(二价)构建体的活性进行比较。基本上如实施例2中所述评估结合，并且在基本上如实施例3和4中所述的Jurkat报告物测定和T细胞细胞毒性测定中评估T细胞活性。
A.结合
如图13A中所示，与单价型式cx5873和cx5965相比，二价的B7H3靶向性受限CD3接合构建体cx5187和cx5823显示出与B7H3阳性A375细胞的更高亲和力结合。这些构建体中没有一种显示出与B7H3阴性CCRF-CEM细胞或单独的T细胞的任何可检测结合(图13B)。
B.T细胞报告物活性
在基本上如上所述的测定中，使用CD3-NFAT Jurkat报吿细胞评估以单价或二价方式与抗原接合的靶向抗原的受限CD3接合构建体的B7H3抗原依赖性CD3激动能力。如图13C中所示，与示例性单价构建体cs5873和cx5965的报告物活性相比，在示例性靶向B7H3的二价构建体cx5187的存在下观察到明显增加的荧光报告物活性。当将构建体和与B7H3阴性CCRF靶细胞共培养的Jurkat报告细胞一起孵育时，没有观察到报告物活性(图13D)。
C.细胞毒性活性
评估了靶向B7H3的CD3受限结合构建体对黑色素瘤细胞系A375和T细胞急性淋巴母细胞性白血病细胞系CCRF-CEM(其分别用作B7H3阳性和阴性细胞系)的细胞毒性。基本上如实施例4所述评估细胞毒性。如图14A中所示，与构建体cx5873和cx5965的单价型式相比，示例性靶向B7H3的二价受限CD3接合构建体cx5187显示出增强的靶标依赖性T细胞介导的细胞毒性。在这些测定中，在不存在靶细胞的B7H3表达的情况下未观察到细胞毒性，如图14B中所示，其中将CCRF-CEM细胞用作靶细胞。
D.T细胞调节
通过基本上如实施例4所述，在来自以上T细胞细胞毒性测定的悬浮细胞中监测CD25的表达来评估T细胞调节，所述测定涉及在cx5187、cx5873或cx5965的存在下将T细胞与B7H3阳性(A375)或B7H3阴性细胞系(CCRF-CEM)一起培养。如图15A和图15B中所示，与构建体cx5873和cx5965的单价型式相比，示例性靶向B7H3的二价受限CD3接合构建体cx5187显示出增强的靶标依赖性T细胞介导的激活，如通过CD4和CD8 T细胞上CD25上调的增强效力所证实的。在这些测定中，在不存在靶细胞的B7H3表达的情况下未观察到T细胞激活，如图15C和图15D中所示，其中将CCRF-CEM细胞用作靶细胞。这些结果证明，B7H3靶向性受限CD3接合构建体诱导了CD4和CD8 T细胞二者的强效抗原依赖性激活。
D.总结
总之，这些结果证明，与靶向抗原的单价受限CD3接合构建体相比，靶向抗原的二价受限CD3接合构建体显示出优越的抗原依赖性CD3结合和活性。这些结果与以下发现相一致：与仅含有单一单价抗原结合结构域的单价构建体相比，含有位于N末端和C末端二者处的双抗原结合结构域的构建体具有优越的结合和T细胞活性。此外，不希望受理论的束缚，与其中sdAb仅位于Fc的N末端的构建体相比，将sdAb中的一个定位于CD3结合结构域的C末端可以形成更最佳的免疫突触，因为前者可能增加免疫突触距离。
实施例6：对含有B7H3靶向性sdAb和Fab结构域的CD3受限多特异性构建体的评估
评估含有靶向B7H3的一个或多个sdAb或Fab作为肿瘤相关抗原结合结构域的构建体的T细胞激活活性。评估用作为一个或多个抗原结合结构域的抗B7H3 sdAb格式化的靶向B7H3的受限CD3接合构建体(例如cx5952和cx6079)或用作为一个或多个抗原结合结构域的Fab格式化的抗B7H3 MAB构建体(例如cx5067、cx6083或cx6084)的活性(参见图3A和图3C和表E1.1和E1.2)。除cx6079和cx5067外，所有所测试的构建体均含有二硫化物稳定的抗CD3Fv(dsFv)，其含有通过抗CD3 VH G44C与VL G100C的配对修饰而产生的链间二硫键。cx5067(命名为MAB-Fv)的抗CD3 Fv和cx6079(命名为sdAb-Fc-Fv)的抗CD3 Fv不是二硫化物稳定的。另外，cx5952被工程化为含有两个不同的B7H3靶向性sdAb结构域，其中一个位于Fc结构域的N末端并且一个位于CD3结合结构域的C末端。相比之下，cx6079被工程化为含有两个相同的B7H3靶向性sdAb结构域，二者均位于Fc结构域的N末端。所有三种Fab构建体的Fv被工程化为在Fc结构域的N末端。
A.细胞毒性
基本上如实施例4中所述评估靶向B7H3的CD3受限结合构建体的细胞毒性。评估了对黑色素瘤细胞系A375和T细胞急性淋巴母细胞性白血病细胞系CCRF-CEM(其分别用作B7H3阳性和阴性细胞系)的细胞毒性。如图16A中所示，与用Fab格式化的抗B7H3 MAB构建体cx5067、cx6083和cx6084相比，用B7H3靶向性sdAb格式化的示例性受限CD3接合构建体cx5952和cx6079在引发抗原依赖性T细胞细胞毒性方面是优越的。值得注意的是，cx5952比cx6079更强效，这表明将B7H3靶向性sdAb定位于抗CD3结合结构域的C末端和/或经由工程化二硫化物稳定抗CD3 FV有助于此增强的活性。在这些测定中，在B7H3阴性CRF-CEM细胞靶细胞的存在下未观察到细胞毒性，如图16B中所示。
B.T细胞调节
为了进一步评估T细胞调节，基本上如实施例4中所述，通过监测构建体调节T细胞激活标记物的能力来评估示例性多特异性CD3受限结合构建体。为了评估T细胞激活，收集来自以上T细胞细胞毒性测定的悬浮细胞，所述测定涉及在示例性靶向B7H3的受限CD3接合构建体的存在下，将T细胞与B7H3阳性(A375)或B7H3阴性细胞系(CCRF-CEM)一起培养。所测试的构建体包括用sdAb格式化的抗B7H3构建体(例如cx5952和cx6079)和用Fab格式化的抗B7H3构建体(例如cx5067、cx6083和cx6084)
用live/dead染色剂和荧光团缀合的抗CD4、抗CD8、抗CD25和/或抗CD71抗体对细胞进行染色。使用SONY SA3800光谱分析仪分析细胞，并通过测量CD25或CD71的表达水平或CD25或CD71阳性百分比来确定CD4+或CD8+ T细胞激活。
示出了在所述构建体的存在下与B7H3阳性(A375)或B7H3阴性细胞系(CCRF-CEM)共培养后CD4+和CD8+ T细胞上的CD25表达(图16C-F)和CD71表达(图16G-J)的结果。结果表明，cx5952经由CD3结合介导了剂量依赖性的B7H3依赖性T细胞激活，如通过CD4+和CD8+ T细胞中CD25和CD71的增加表达所证实的。与其他靶向B7H3的受限CD3接合构建体相比，cx5952在诱导T依赖性T细胞激活方面是最强效的。
C.T细胞细胞因子产生
通过夹心ELISA分析来自T细胞细胞毒性肿瘤细胞共培养测定的上清液的IFNγ含量，所述测定涉及在cx5952、cx6079、cx6083、cx6084或cx5067的存在下将T细胞与B7H3阳性、A375或阴性CCRF-CEM细胞共培养。产生上清液样品的细胞因子浓度值进行内插的标准曲线。向吸光度值低于检测下限的样品分配等于最低标准浓度的一半的细胞因子浓度。如图16K中所示，在从激活的T细胞引发靶标依赖性细胞因子释放方面，代表性sdAb-Fc-dsFV-sdAb构建体cx5952优于所测试的含有靶向B7H3的FAB的构建体cx6083、cx6084和cx5067。这与从抗原依赖性细胞毒性和激活测定中得到的发现是一致的。重要的是，MAB-dsFV构建体cx6083和cx6084优于MAB-FV构建体cx5067，这证明了结构域间二硫化物稳定化修饰对增强T细胞功能的重要性。
D.总结
总之，这些结果证明，与用Fab B7H3结合结构域格式化的抗B7H3 MAB构建体相比，用抗B7H3 sdAb结合结构域格式化的受限抗CD3构建体在引发抗原依赖性T细胞细胞毒性方面是优越的。此外，该cx5952比cx6079更强效，这表明将B7H3靶向性sdAb定位于CD3结合结构域的C末端、经由工程化二硫化物稳定抗CD3 FV、或二者有助于增强的活性。不希望受理论的束缚，与其中sdAb仅位于Fc的N末端的构建体相比，将sdAb中的一个定位于CD3结合结构域的C末端可以形成更最佳的免疫突触，因为前者可能增加免疫突触距离。
实施例7：对含有单一或多个抗原结合DLL3靶向结构域的CD3受限多特异性构建体的评 估
此实施例描述了在人原代T细胞体外测定中对示例性产生的靶向DLL3的受限CD3接合构建体的评估和表征。
评估了用作为一个或多个抗原结合结构域的抗DLL3 sdAb格式化的靶向DLL3的受限CD3接合构建体(例如cx5352、cx5800、cx5801和cx5499)的结合和活性(参见图4A至图4B和表E1.1)。所有所测试的构建体均含有二硫化物稳定的抗CD3 Fv(dsFv)，其含有通过抗CD3 VH G44C与VL G100C的配对修饰而产生的链间二硫键。此外，靶向DLL-3的构建体被工程化为在CD3 dsFv的C末端含有共刺激受体sdAb，但cx5499除外，cx5499不含有此共刺激受体sdAb结构域。
A.结合
基本上如实施例2中所述评估结合。如图17A中所示，与单价型式cx5800和cx5801相比，二价的DLL3靶向性受限CD3接合构建体cx5352显示出与DLL3阳性SHP-77细胞的更高亲和力结合。如图17B中所描绘，所测试的构建体中没有一种显示出与DLL3阴性原代T细胞的结合。通过流式细胞术进行这些结合测定，其中使用荧光团缀合的抗人IgG Fc二抗检测结合的构建体。
A.T细胞报告物活性
在基本上如实施例2中所述的报告物测定中评估T细胞活性，不同的是使用表达NFAT驱动的萤光素酶的Jurkat细胞并监测萤光素酶活性。在含有针对DLL3抗原的抗原结合结构域的单价和二价构建体的存在下，将NFAT驱动的萤光素酶CD3 Jurkat报告细胞与SHP-77(DLL3阳性)靶细胞共培养(参见图4A)。具体地，如图17C中所示，与示例性单价构建体cx5800和cx5801相比，示例性二价构建体cx5352在此测定中诱导明显更高的萤光素酶活性。这些结果与关于靶向B7H3的构建体观察到的结果一致，从而表明构建体的活性不是对特定靶抗原具有特异性的。
C.细胞毒性
使用基本上如实施例4中所述的测定，评估cx5499，即用位于其氨基末端和羧基末端的两个不同sdAb结合结构域格式化的靶向DLL3的CD3受限结合构建体对DLL3表达细胞系SHP-77的细胞毒性。如图18A中所示，cx5499诱导强效的针对SHP-77细胞系的T细胞介导的细胞毒性。
D.T细胞调节
为了进一步评估T细胞调节，通过监测构建体调节T细胞激活标记物的能力来评估示例性多特异性CD3受限结合构建体。为了评估T细胞激活，收集来自以上T细胞细胞毒性测定的悬浮细胞，所述测定涉及在cx5499的存在下，在示例性靶向DLL3的受限CD3接合构建体的存在下，将T细胞与DLL3阳性SHP-77细胞一起培养。用live/dead染色剂和荧光团缀合的抗CD4、抗CD8、抗CD25和/或抗CD69抗体对细胞进行染色。使用SONY SA3800光谱分析仪分析细胞，并通过测量CD25或CD69的表达水平或CD25或C69阳性百分比来确定CD4+或CD8+ T细胞激活。
图18B和图18D描绘了在示例性靶向DLL3的受限CD3接合构建体cx5499的存在下，将T细胞与DLL3阳性SHP-77细胞一起培养后，分别在CD4 T细胞或CD8 T细胞上的CD25表达的结果。图18C和图18E描绘了在示例性靶向DLL3的受限CD3接合构建体cx5499的存在下，将T细胞与DLL3阳性SHP-77细胞一起培养后，分别在CD4细胞或CD8 T细胞上的CD69表达的结果。结果显示，cx5499经由CD3结合介导了剂量依赖性的DLL3依赖性T细胞激活，如通过CD4+和CD8+ T细胞上CD25和CD69的增加表达所证实的。
E.总结
总之，这些结果证明，用抗DLL3 sdAb结合结构域格式化的受限抗CD3构建体能够结合至DLL3表达细胞系SHP-77，并引发抗原依赖性T细胞细胞毒性和激活。此结果与以下发现一致：本公开文本的受限CD3接合构建体具有广泛的适用性，以特异性地靶向许多肿瘤抗原并引发针对靶标表达细胞的T细胞细胞毒性和激活。
虽然已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是前面的描述旨在说明而不是限制本公开文本的范围，本公开文本的范围由所附权利要求的范围定义。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。
序列表
Figure BDA0002817785800001391
Figure BDA0002817785800001401
Figure BDA0002817785800001411
Figure BDA0002817785800001421
Figure BDA0002817785800001431
Figure BDA0002817785800001441
Figure BDA0002817785800001451
Figure BDA0002817785800001461
Figure BDA0002817785800001471
Figure BDA0002817785800001481
Figure BDA0002817785800001491
Figure BDA0002817785800001501
Figure BDA0002817785800001511
Figure BDA0002817785800001521
Figure BDA0002817785800001531
Figure BDA0002817785800001541
Figure BDA0002817785800001551
序列表
<110> 印希比股份有限公司
ECKELMAN, Brendan P.
KAPLAN, Michael D.
WILLIS, Katelyn M.
TIMMER, John C.
<120> 具有受限CD3结合的多特异性多肽构建体以及相关方法和用途
<130> 744952000240
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> 62/656,331
<151> 2018-04-11
<160> 230
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 Fc
<400> 1
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
115 120 125
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 2
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> xELL Fc
<400> 2
Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
1 5 10 15
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
20 25 30
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
35 40 45
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
50 55 60
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
65 70 75 80
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
85 90 95
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
100 105 110
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
115 120 125
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
130 135 140
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
145 150 155 160
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
165 170 175
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
180 185 190
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
195 200 205
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 3
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2 Fc
<400> 3
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 4
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG3 Fc
<400> 4
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 5
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 Fc
<400> 5
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210> 6
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 Fc
<400> 6
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 7
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 8
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 9
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
1 5 10
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 - 接头(GGS)2
<400> 10
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 - 接头 (GGS)3
<400> 11
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 - 接头 (GGS)4
<400> 12
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 - 接头 (GGS)5
<400> 13
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 14
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 - 抗CD3 VH
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120 125
<210> 15
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL
<400> 15
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH CDR1
<400> 16
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH CDR2
<400> 17
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH CDR3
<400> 18
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL CDR1
<400> 19
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL CDR2
<400> 20
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL CDR3
<400> 21
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 22
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 颗粒酶B底物
<400> 22
Leu Glu Ala Asp
1
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 颗粒酶B底物
<400> 23
Arg Gln Ala Arg
1
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP底物
<400> 24
Pro Ala Gly Leu
1
<210> 25
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 25
Thr Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Pro Ala Gly Leu Gly Arg Gln Ala
1 5 10 15
Arg Val Gly
<210> 26
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 26
Thr Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Gly Pro Ala
1 5 10 15
Gly Leu Gly
<210> 27
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 27
Thr Gly Ser Pro Ala Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gln Ala Arg
1 5 10 15
Val Gly Ser
<210> 28
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 28
Thr Gly Pro Ala Gly Leu Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gln Ala
1 5 10 15
Arg Val Gly
<210> 29
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 29
Thr Gly Arg Gln Ala Arg Val Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Pro Ala
1 5 10 15
Gly Leu Gly
<210> 30
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 30
Thr Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Gly Pro Ala Gly Leu Glu Ala Asp
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 31
Thr Gly Pro Ala Gly Leu Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Gly Leu Glu
1 5 10 15
Ala Asp Gly Ser
20
<210> 32
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH1
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 33
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH2
<400> 33
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 34
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH3
<400> 34
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 35
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH4
<400> 35
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 36
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH5
<400> 36
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 37
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH6
<400> 37
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 38
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH7
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 39
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH8
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120
<210> 40
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH9
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 41
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH10
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 42
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH11
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 43
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH12
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120 125
<210> 44
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH13
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120 125
<210> 45
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH14
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Cys Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120 125
<210> 46
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH15
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 47
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH16
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 48
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH17
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 49
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH18
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 50
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH19
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 51
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH20
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 52
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH21
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 53
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH22
<400> 53
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 54
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH23
<400> 54
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 55
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH24
<400> 55
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 56
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH25
<400> 56
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
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Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH26
<400> 57
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
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115 120 125
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<220>
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
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65 70 75 80
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
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65 70 75 80
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<220>
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
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Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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<220>
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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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<220>
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Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
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Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Gly
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Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 109
<212> PRT
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
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Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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<400> 77
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
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Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<211> 109
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 78
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
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Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
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65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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Leu Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL17
<400> 79
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
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Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
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50 55 60
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Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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Leu Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 80
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL18
<400> 80
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 81
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL19
<400> 81
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Arg Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 82
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 杵Fc
<400> 82
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Thr
225
<210> 83
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 臼Fc
<400> 83
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Arg Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
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50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Thr
225
<210> 84
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 杵Fc
<400> 84
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 101
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 臼Fc
<400> 101
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 102
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 102
Pro Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 103
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 103
Gly Gly Gly Gly
1
<210> 104
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 104
Gly Pro Ala Gly Leu Gly Leu Glu Pro Asp Gly Ser Arg Gln Ala Arg
1 5 10 15
Val Gly
<210> 105
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 105
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Ile Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 106
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 106
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Leu Glu Ala Asp Thr Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 107
Gly Ser Ile Glu Pro Asp Ile Gly Ser
1 5
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 108
Gly Ser Leu Glu Ala Asp Thr Gly Ser
1 5
<210> 109
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 109
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 110
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Val Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 111
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 111
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 112
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 112
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Thr Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 113
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 113
Gly Gly Gly Ser Leu Glu Pro Asp Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 114
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 114
Gly Pro Ala Gly Leu Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gln Ala Arg
1 5 10 15
Val Gly
<210> 115
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 115
Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 116
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 116
Gly Ser Ser Ala Gly Ser Glu Ala Gly Gly Ser Gly Gln Ala Gly Val
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 117
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 117
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Leu Glu Ala Glu Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 118
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 118
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Pro Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 119
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 119
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 120
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FRα sdAb
<400> 120
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Lys Gly Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Leu Val Pro Ala Cys Thr Tyr Ser Asn Gly Arg Gly Pro
100 105 110
Leu Asp Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Lys
115 120 125
Pro
<210> 121
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FRα sdAb
<400> 121
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asp
20 25 30
Ala Thr Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ile Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Pro Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Ile Thr Arg Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115
<210> 122
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FRα sdAb
<400> 122
Glu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu
1 5 10 15
Thr Phe Gly Val Val Phe Thr Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly
20 25 30
Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Val Thr Gly Thr Asp Thr Val Asp
35 40 45
Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Phe Ala
50 55 60
Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
65 70 75 80
Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
85 90 95
Val Thr Val Lys Pro
100
<210> 123
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cMET sdAb
<400> 123
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Leu Cys Ile Asp Ala Ser Asp Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Pro Ile Gly Leu Ser Ser Ser Cys Leu Leu Glu Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120 125
<210> 124
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H3 scFv
<400> 124
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
145 150 155 160
Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg
180 185 190
Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 125
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20 scFv
<400> 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu
130 135 140
Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
145 150 155 160
Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr
165 170 175
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser
180 185 190
Asn Leu Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 126
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3 scFv
<400> 126
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val Tyr Tyr Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Ile Ala Val Thr Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu
130 135 140
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
145 150 155 160
Arg Val Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
165 170 175
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
225 230 235 240
Lys
<210> 127
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H3 Fd
<400> 127
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys
225
<210> 128
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H3 LC
<400> 128
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 129
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5T4 Fd
<400> 129
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Gln Trp Asp Tyr Asp Val Arg Ala Met Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys
225
<210> 130
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5T4 LC
<400> 130
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Ile Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Leu Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 131
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> gpNMB Fd
<400> 131
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Phe
20 25 30
Asn Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg His His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Ser Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Thr Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Tyr Asn Trp Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 132
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> gpNMB LC
<400> 132
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asn Asn
20 25 30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 133
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3 Fd
<400> 133
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Ser
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ile Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Gly Asp Ser Ser Pro Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 134
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3 LC
<400> 134
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 135
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 135
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 136
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 136
Ile Glu Pro Asp Ile
1 5
<210> 137
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 137
Leu Glu Ala Asp Thr
1 5
<210> 138
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 138
Ile Glu Pro Asp Gly
1 5
<210> 139
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 139
Ile Glu Pro Asp Val
1 5
<210> 140
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 140
Ile Glu Pro Asp Ser
1 5
<210> 141
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 141
Ile Glu Pro Asp Thr
1 5
<210> 142
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 142
Leu Glu Pro Asp
1
<210> 143
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 143
Leu Glu Ala Glu
1
<210> 144
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 144
Ile Glu Pro Asp Pro
1 5
<210> 145
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7-H3 x CD3双特异性DART-A双抗体的第二多肽链
<400> 145
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
130 135 140
Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile
165 170 175
Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
180 185 190
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly
210 215 220
Ser Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Gly Gly Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala
245 250 255
Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu
260 265 270
Lys Glu
<210> 146
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7-H3 x CD3双特异性DART-A双抗体的的第三多肽链
<400> 146
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 147
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 147
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 148
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 148
Thr Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Ile Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ser
<210> 149
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 149
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 150
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头共有序列
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> X1= I、L、Y、M、F、V或A
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> X2 = A、G、S、V、E、D、Q、N或Y
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> X3 = H、P、A、V、G、S或T
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> X4 = D或E
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> X5 = I、L、Y、M、F、V、T、S、G或A
<400> 150
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 151
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头共有序列
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> X1 = I或L
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> X3 = P或A
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> X5 = I、V、T、S或G
<400> 151
Xaa Glu Xaa Asp Xaa
1 5
<210> 152
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 152
Leu Glu Pro Asp Gly
1 5
<210> 153
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 153
Leu Glu Ala Asp Gly
1 5
<210> 154
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头共有序列
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> X1 = 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> X5 = A或V
<400> 154
Xaa Gln Ala Arg Xaa
1 5
<210> 155
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头共有序列
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> X5 = A或V
<400> 155
Arg Gln Ala Arg Xaa
1 5
<210> 156
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 156
Arg Gln Ala Arg Val
1 5
<210> 157
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头共有序列
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> X1 = P、V或A
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> X2 = Q或D
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> X3 = A或N
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> X4 = L、I或M
<400> 157
Xaa Xaa Xaa Xaa
1
<210> 158
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头共有序列
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> X2 = Q或D
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> X3 = A或N
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> X4 = L或I
<400> 158
Pro Xaa Xaa Xaa
1
<210> 159
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 159
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 160
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 160
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 161
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A
<400> 161
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 162
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 162
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 163
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 163
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 164
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 164
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 165
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 165
ggatctggag caacaaactt ctcactactc aaacaagcag gtgacgtgga ggagaatccc 60
ggaccc 66
<210> 166
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 166
Gly Ser Pro Ala Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 167
<211> 122
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗5T4 VH
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(97)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 167
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Xaa Cys Val Arg Gln Trp Asp Tyr Asp Val Arg Ala Met Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 168
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗5T4 VL
<400> 168
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Ile Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Leu Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 169
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7-H3 x CD3双特异性DART-A双抗体的第一多肽链
<400> 169
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
130 135 140
Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
165 170 175
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
180 185 190
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
195 200 205
Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val
210 215 220
Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala
245 250 255
Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu
260 265 270
Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
275 280 285
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
290 295 300
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
305 310 315 320
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
325 330 335
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
340 345 350
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
355 360 365
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
370 375 380
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
385 390 395 400
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
405 410 415
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
420 425 430
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
435 440 445
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
450 455 460
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
465 470 475 480
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
485 490 495
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500
<210> 170
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 170
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 171
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (4)..(6)
<223> 重复0至10次
<400> 171
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 172
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (1)..(6)
<223> 重复1至4次
<400> 172
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 173
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (1)..(5)
<223> 重复1至10次
<220>
<221> 重复序列
<222> (1)..(5)
<223> 重复1至5次
<400> 173
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 174
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (1)..(1)
<223> 重复1至5次
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> X2= A、V、L、I、M、F、W、P、G、S、T、C、Y、N、Q、K、R、H、D或E
<220>
<221> 重复序列
<222> (3)..(3)
<223> 重复1至5次
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> X4 = A、V、L、I、M、F、W、P、G、S、T、C、Y、N、Q、K、R、H、D或E
<220>
<221> 重复序列
<222> (5)..(5)
<223> 重复1至5次
<400> 174
Gly Xaa Gly Xaa Gly
1 5
<210> 175
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> X4 = A、V、L、I、M、F、W、P、G、S、T、C、Y、N、Q、K、R、H、D或E
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> X8 = A、V、L、I、M、F、W、P、G、S、T、C、Y、N、Q、K、R、H、D或E
<400> 175
Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 176
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 176
Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr
1 5 10
<210> 177
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 177
Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 178
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (1)..(5)
<223> 重复2至20次
<400> 178
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 179
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (3)..(4)
<223> 重复2至20次
<400> 179
Ala Ser Ala Pro Gly Thr
1 5
<210> 180
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (3)..(7)
<223> 重复2至20次
<400> 180
Ala Ser Glu Ala Ala Ala Lys Gly Thr
1 5
<210> 181
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (1)..(5)
<223> 重复2至20次
<400> 181
Gly Gly Gly Gly Ala
1 5
<210> 182
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (1)..(5)
<223> 重复2至20次
<400> 182
Pro Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 183
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (1)..(5)
<223> 重复2至20次
<400> 183
Ala Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 184
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (4)..(17)
<223> 重复2至20次
<400> 184
Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Gly Gly Ser
20
<210> 185
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (1)..(5)
<223> 重复1至9次
<400> 185
Ser Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 186
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 186
Ser Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ser Ala
1 5
<210> 187
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 187
Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly
1 5
<210> 188
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3 scFv
<400> 188
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val Tyr Tyr Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Ile Ala Val Thr Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu
130 135 140
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
145 150 155 160
Arg Val Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
165 170 175
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
225 230 235 240
Lys
<210> 189
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20 VH
<400> 189
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 190
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20 VL
<400> 190
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val
115
<210> 191
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL35 (对照)
<400> 191
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 192
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 192
Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 193
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 193
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 194
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-Het-1
<400> 194
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
20 25 30
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Lys His Glu
35 40 45
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
50 55 60
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Glu Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
65 70 75 80
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
85 90 95
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
100 105 110
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
115 120 125
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
130 135 140
Thr Cys Asp Val Ser Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
145 150 155 160
Glu Ser Asp Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
165 170 175
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Glu Gln Gly Asp Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
195 200 205
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
Gly Lys
225
<210> 195
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-Het-2
<400> 195
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
20 25 30
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Lys His Glu
35 40 45
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
50 55 60
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
65 70 75 80
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
85 90 95
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
100 105 110
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
115 120 125
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Gln Met Thr Lys Asn Gln Val Lys Leu
130 135 140
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
145 150 155 160
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
165 170 175
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
195 200 205
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
Gly Lys
225
<210> 196
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-VH32
<400> 196
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 197
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-VH33
<400> 197
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 198
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-VH34
<400> 198
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
115 120
<210> 199
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-VL20
<400> 199
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 200
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-VL21
<400> 200
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 201
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 杵Fc
<400> 201
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 202
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 臼Fc
<400> 202
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Arg Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 203
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 杵Fc
<400> 203
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
<210> 204
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 臼Fc
<400> 204
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Arg Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
<210> 205
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 臼Fc
<400> 205
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 206
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 臼Fc
<400> 206
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
<210> 207
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 杵Fc
<400> 207
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 208
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 杵Fc
<400> 208
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
<210> 209
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 臼Fc
<400> 209
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 210
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 臼Fc
<400> 210
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
<210> 211
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH CDR1
<400> 211
Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 212
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH CDR2
<400> 212
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
1 5 10
<210> 213
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20 scFv
<400> 213
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser
130 135 140
Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
145 150 155 160
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn
180 185 190
Leu Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 214
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B7H3 sdAb B7h3 hz1A5v51
<400> 214
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Val Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Tyr Ser Ser Gly Thr Gly Thr Phe Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Ser Gly Pro Val Arg Gly Trp Gly Pro Arg Ser Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Lys Pro
115
<210> 215
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> sdAb B7H3 hz58E05v27
<400> 215
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
His Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Pro Val
35 40 45
Ala Thr Ser His His Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Ala Asp His Gly Tyr Gln Gly Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Lys Pro
115
<210> 216
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> sdAb B7H3 hz58E05v55
<400> 216
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
His Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ser His His Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Ala Asp His Gly Tyr Gln Gly Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Lys Pro
115
<210> 217
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> sdAb B7H3
hz58E05v48
<400> 217
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
His Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Pro Val
35 40 45
Ala Thr Ser His His Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Ala Asp His Gly Tyr Gln Gly Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Lys Pro
115
<210> 218
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> sdAb B7H3 hz57B04v24
<400> 218
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Pro Ser Glu Arg Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Val Val Asn Trp Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Gly Ala Tyr Ser Gly Pro Tyr Tyr Asp Thr Arg Gln Tyr
100 105 110
Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Gly
115 120 125
<210> 219
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> sdAb DLL3 hz10D9v7
<400> 219
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Gly Phe Thr Gly Asp Thr Asn Thr Ile Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Val Gln Leu Phe Ser Arg Asp Tyr Glu Phe Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120
<210> 220
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> sdAb DLL3 hz8E7v16
<400> 220
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Pro Ser Glu Ile Ile Thr Ser Asp Lys
20 25 30
Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asn Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Asn Val Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
85 90 95
Ala Arg Asp Phe Glu Asn Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Lys Pro
115
<210> 221
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 41BB CDR1
<400> 221
Gly Phe Ser Phe Ser Ile Asn Ala Met Gly
1 5 10
<210> 222
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 41BB CDR2
<400> 222
Ala Ile Glu Ser Gly Arg Asn Thr Val
1 5
<210> 223
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 41BB CDR3
<400> 223
Leu Lys Gly Asn Arg Val Val Ser Pro Ser Val Ala Tyr
1 5 10
<210> 224
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-VH7、VH33 CDR3
<400> 224
His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 225
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-VL2、VL21 CDR3
<400> 225
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val
1 5
<210> 226
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-VL8 CDR3
<400> 226
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 227
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VH33 CDR1
<400> 227
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 228
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VH33 CDR2
<400> 228
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
1 5 10
<210> 229
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VL21 CDR1
<400> 229
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 230
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VL21 CDR2
<400> 230
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5

Claims (128)

1.一种多特异性多肽构建体，所述多特异性多肽构建体包含含有免疫球蛋白Fc区的第一组分和含有CD3结合区的第二组分，其中：
所述CD3结合区是抗CD3抗体或抗原结合片段，所述抗CD3抗体或抗原结合片段是包含可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)的Fv抗体片段；
所述Fc是包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚体Fc，并且所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH和VL连接至所述异二聚体Fc的相对多肽；
所述第一组分和所述第二组分通过不可切割接头偶联，其中所述Fc区位于所述CD3结合区的N末端；并且
所述第一组分包含第一抗原结合结构域，并且所述第二组分包含第二抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域中的每一个结合肿瘤相关抗原(TAA)。
2.根据权利要求1所述的多特异性多肽构建体，其中所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一抗原结合结构域位于相对于所述多特异性构建体的Fc区的氨基末端，并且所述第二抗原结合结构域位于相对于所述多特异性构建体的CD3结合区的羧基末端。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性构建体从N末端到C末端按顺序包含：
结合肿瘤相关抗原(TAA)的所述第一抗原结合结构域；
所述免疫球蛋白Fc区；
所述不可切割接头；
所述CD3结合区，其中所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)；以及
结合肿瘤相关抗原(TAA)的所述第二抗原结合结构域。
5.一种多特异性多肽构建体，所述多特异性多肽构建体包含含有免疫球蛋白Fc区的第一组分和含有CD3结合区的第二组分，其中：
所述CD3结合区是抗CD3抗体或抗原结合片段，所述抗CD3抗体或抗原结合片段是包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)的二硫化物稳定的Fv抗体片段(dsFv)；
所述Fc是包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚体Fc，并且所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH和VL连接至所述异二聚体Fc的相对多肽；
所述第一组分和所述第二组分通过不可切割接头偶联，其中所述Fc区位于所述CD3结合区的N末端；并且
所述第一组分和所述第二组分中的一种或两种包含结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。
6.一种多特异性多肽构建体，所述多特异性多肽构建体包含含有免疫球蛋白Fc区的第一组分和含有CD3结合区的第二组分，其中：
所述CD3结合区是抗CD3抗体或抗原结合片段，所述抗CD3抗体或抗原结合片段是包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)的Fv抗体片段；
所述Fc是包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚体Fc，并且所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH和VL连接至所述异二聚体Fc的相对多肽；
所述第一组分和所述第二组分通过不可切割接头偶联，其中所述Fc区位于所述CD3结合区的N末端；并且
所述第一组分和所述第二组分中的一种或两种包含结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域是单链抗体片段。
7.根据权利要求6所述的多特异性多肽构建体，其中所述单链抗体片段是单结构域抗体或是单链可变片段(scFv)。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性构建体从N末端到C末端按顺序包含：
结合肿瘤相关抗原(TAA)的所述第一抗原结合结构域；
所述免疫球蛋白Fc区；
所述不可切割接头；
所述CD3结合区，其中所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)；以及
结合肿瘤相关抗原(TAA)的所述第二抗原结合结构域。
10.根据权利要求5-8中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性构建体从N末端到C末端按顺序包含：
所述免疫球蛋白Fc区；
所述不可切割接头；
所述CD3结合区，其中所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)；以及
结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。
11.根据权利要求5-8中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性构建体从N末端到C末端按顺序包含：
结合肿瘤相关抗原(TAA)的所述抗原结合结构域；
所述免疫球蛋白Fc区；
所述不可切割接头；以及
所述CD3结合区，其中所述CD3结合区结合CD3(CD3ε)。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述异二聚体Fc区的第一Fc多肽和第二Fc多肽中的一种或两种是变体Fc多肽，所述变体Fc多肽与人IgG1、人IgG2或人IgG4的Fc区相比包含至少一个修饰以诱导异二聚化。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述异二聚体Fc区的第一Fc多肽和第二Fc多肽中的一种或两种是变体Fc多肽，所述变体Fc多肽与人IgG1的Fc区相比，任选地与SEQ ID NO:1所示的Fc多肽或其免疫活性片段相比包含至少一个修饰以诱导异二聚化。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的多特异性多肽构建体，其中所述异二聚体Fc的Fc多肽中的每一种独立地包含至少一个氨基酸修饰。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个修饰选自一个或多个立体修饰、一个或多个杵臼结构修饰、增加所述多肽的静电互补性的一个或多个电荷突变、改变等电点的一个或多个修饰(pI变体)、或其组合。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述异二聚体Fc的第一Fc多肽包含选自Thr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val及其组合的修饰，并且所述异二聚体Fc的第二Fc多肽包含修饰T366W。
17.根据权利要求16所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽进一步包含非半胱氨酸残基至半胱氨酸残基的修饰，其中所述第一多肽的修饰是在位置Ser354和Y349中的一个处，并且所述第二Fc多肽的修饰是在位置Ser354和Y349中的另一个处。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一Fc多肽包含修饰T366W/S354C，并且所述第二Fc多肽包含修饰T366S/L 368A/Y407V/Y349C。
19.根据权利要求1-15中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一Fc多肽包含修饰L368D/K370S，并且所述第二Fc多肽包含修饰S364K/E357Q。
20.根据权利要求1-15中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一多肽和所述第二多肽中的至少一种包含修饰Q295E/N384D/Q418E/N421D。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中：
所述异二聚体Fc的第一Fc多肽或第二Fc多肽中的一种进一步包含在残基Ile253处的修饰，任选地其中所述修饰是Ile253Arg；和/或所述异二聚体Fc的第一Fc多肽或第二Fc多肽中的一种进一步包含在残基His435处的修饰，任选地其中所述修饰是His35Arg。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽中的一种或两种包含缺乏Lys447的多肽。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述异二聚体Fc的第一多肽包含SEQ ID NO:82、86或201中任一个所示的氨基酸序列，并且所述异二聚体Fc的第二多肽包含SEQ ID NO:83、87、90、92、202或205中任一个所示的氨基酸序列。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽包含选自以下的序列：分别为SEQ ID NO:82和83；分别为SEQ ID NO:86和87；分别为SEQ ID NO:201和202；分别为SEQ ID NO:82和90；分别为SEQ ID NO:86和92；以及分别为SEQ ID NO:201和205。
25.根据权利要求1-22中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fc区包含含有至少一个修饰以增强FcRn结合的多肽。
26.根据权利要求25所述的多特异性融合多肽构建体，其中所述修饰是在选自以下的位置：Met252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S及其组合。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的多特异性融合多肽构建体，其中所述修饰是Met252Y和Met428L或是Met252Y和Met428V。
28.根据权利要求1-22和25-27中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述异二聚体Fc的第一多肽包含SEQ ID NO:94、96或207中任一个所示的氨基酸序列，并且所述异二聚体Fc的第二多肽包含SEQ ID NO:98、100或209中任一个所示的氨基酸序列。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽包含选自以下的序列：分别为SEQ ID NO:94和98；分别为SEQ ID NO:96和100；以及分别为SEQ ID NO:207和209。
30.根据权利要求1-22和25-27中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fc区包含含有至少一个氨基酸修饰的多肽，所述至少一个氨基酸修饰降低效应子功能和/或降低与选自Fcγ受体或C1q的效应分子的结合。
31.根据权利要求30所述的多特异性多肽构建体，其中所述一个或多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中一个或多个的缺失。
32.根据权利要求1-22、25-27、30和31中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述异二聚体Fc的第一多肽包含SEQ ID NO:84、88、95、97、203或208中任一个所示的氨基酸序列，并且所述异二聚体Fc的第二多肽包含SEQ ID NO:85、89、91、93、99、101、204、206或210中任一个所示的氨基酸序列。
33.根据权利要求1-22、25-27和30-32中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽包含选自以下的序列：分别为SEQ ID NO:84和85；分别为SEQID NO:88和89；分别为SEQ ID NO:203和204；分别为SEQ ID NO:95和99；分别为SEQ ID NO:97和101；分别为SEQ ID NO:208和210；分别为SEQ ID NO:84和91；分别为SEQ ID NO:88和93；以及分别为SEQ ID NO:203和206。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述CD3结合区不能或基本上不能结合或接合CD3，除非所述抗原结合结构域中的至少一个与其TAA结合。
35.根据权利要求1-33中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述CD3结合区不能或基本上不能结合或接合CD3，除非所述抗原结合结构域中的至少两个与其TAA结合。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述接头是多肽接头。
37.根据权利要求36所述的多特异性多肽构建体，其中所述接头是长度为最多25个氨基酸的多肽。
38.根据权利要求36或权利要求37所述的多特异性多肽构建体，其中所述接头是从或从约2至24个氨基酸、2至20个氨基酸、2至18个氨基酸、2至14个氨基酸、2至12个氨基酸、2至10个氨基酸、2至8个氨基酸、2至6个氨基酸、6至24个氨基酸、6至20个氨基酸、6至18个氨基酸、6至14个氨基酸、6至12个氨基酸、6至10个氨基酸、6至8个氨基酸、8至24个氨基酸、8至20个氨基酸、8至18个氨基酸、8至14个氨基酸、8至12个氨基酸、8至10个氨基酸、10至24个氨基酸、10至20个氨基酸、10至18个氨基酸、10至14个氨基酸、10至12个氨基酸、12至24个氨基酸、12至20个氨基酸、12至18个氨基酸、12至14个氨基酸、14至24个氨基酸、14至20个氨基酸、14至18个氨基酸、18至24个氨基酸、18至20个氨基酸或20至24个氨基酸的多肽。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述接头是长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的多肽。
40.根据权利要求36-39中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述接头是长度为3至18个氨基酸的多肽。
41.根据权利要求36-40中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述接头是长度为12至18个氨基酸的多肽。
42.根据权利要求36-40中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述接头是长度为15至18个氨基酸的多肽。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含GS、GGS、GGGGS(SEQ ID NO:149)、GGGGGS(SEQ ID NO:135)及其组合。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含(GGS)n，其中n是1至10。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:173)，其中n是1至10。
46.根据权利要求1-44中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头包含(GGGGGS)n(SEQ ID NO:172)，其中n是1至4。
47.根据权利要求1-44中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头是或包含GGS。
48.根据权利要求1-43和45中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头是或包含GGGGS(SEQ ID NO:149)。
49.根据权利要求1-43和46中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头是或包含GGGGGS(SEQ ID NO:135)。
50.根据权利要求1-44中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头是或包含(GGS)2(SEQ ID NO:10)。
51.根据权利要求1-44中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头是或包含GGSGGSGGS(SEQ ID NO:11)。
52.根据权利要求1-44中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头是或包含GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:12)。
53.根据权利要求1-44中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头是或包含GGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:13)。
54.根据权利要求1-43和46中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头是或包含GGGGGSGGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:119)。
55.根据权利要求1-49中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头是或包含GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:147)。
56.根据权利要求1-43和45中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割接头是或包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:170)。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体至少包含(i)第一多肽，所述第一多肽包含所述异二聚体Fc区的第一Fc多肽、所述接头和所述抗CD3抗体或其抗原结合片段的VH结构域；和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含所述异二聚体Fc区的第二Fc多肽、所述接头和所述抗CD3抗体或其抗原结合片段的VL结构域，其中所述第一多肽和所述第二多肽中的一种或两种包含至少一个结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH与所述至少一个结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域在同一多肽上。
59.根据权利要求58所述的多特异性多肽构建体，其中包含所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VL的所述多肽不含有所述至少一个结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域。
60.根据权利要求1-4、9和12-59中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体展现出与所述TAA的二价、三价或四价结合。
61.根据权利要求5-8和10-59中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体展现出与所述TAA的单价、二价、三价或四价结合。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一多肽和所述第二多肽中的仅一种包含所述至少一个结合TAA的抗原结合结构域。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个抗原结合结构域位于相对于所述多特异性多肽构建体的第一多肽或第二多肽中的一种的Fc区的氨基末端和/或位于相对于所述多特异性多肽构建体的第一多肽或第二多肽中的一种的CD3结合区的羧基末端。
64.根据权利要求1-62中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个抗原结合结构域位于相对于所述多特异性构建体的Fc区的氨基末端，并且所述第二抗原结合结构域位于相对于所述多特异性构建体的CD3结合区的羧基末端。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗原结合结构域、或独立地所述抗原结合结构域中的每一个包含所述TAA的天然同源结合配偶体的细胞外结构域或其结合片段，或其展现出与所述TAA的结合活性的变体。
66.根据权利要求1-5和8-65中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗原结合结构域、或独立地所述抗原结合结构域中的每一个是选自以下的抗体或其抗原结合片段：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体、和单结构域轻链抗体。
67.根据权利要求66所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗体或其抗原结合片段是Fv、scFv、Fab、或单结构域抗体(sdAb)。
68.根据权利要求1-67中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗体或其抗原结合片段是sdAb。
69.根据权利要求68所述的多特异性多肽构建体，其中所述sdAb是人sdAb或人源化sdAb。
70.根据权利要求68或权利要求69所述的多特异性多肽构建体，其中所述sdAb是VHH、VNAR、工程化VH结构域或工程化VK结构域。
71.根据权利要求1-67中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗体或其抗原结合片段是scFv。
72.根据权利要求1-5和8-67中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗体或其抗原结合片段是Fab。
73.根据权利要求72所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含所述异二聚体Fc区的第一Fc多肽、所述接头和所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VH结构域；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含所述异二聚体Fc区的第二Fc多肽、所述接头和所述抗CD3抗体或抗原结合片段的VL结构域；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含结合肿瘤相关抗原的Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽进一步包含所述Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一种。
74.根据权利要求73所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一多肽和所述第二多肽中的仅一种包含所述Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一种。
75.根据权利要求73所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一多肽和所述第二多肽二者均包含所述Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一种。
76.根据权利要求74或权利要求75所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一种位于相对于所述多特异性多肽构建体的第一多肽和第二多肽中的一种的Fc区的氨基末端和/或位于相对于所述多特异性多肽构建体的第一多肽和第二多肽中的一种的CD3结合区的羧基末端。
77.根据权利要求74-76中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一种位于相对于所述第一多肽或所述第二多肽的Fc区的氨基末端以及位于相对于所述第一多肽或所述第二多肽中的另一种的CD3结合区的羧基末端。
78.根据权利要求1-77中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗原结合结构域、或独立地所述抗原结合结构域中的每一个结合选自以下的肿瘤抗原：1-92-LFA-3、5T4、α-4整合素、α-V整合素、α4β1整合素、α4β7整合素、AGR2、抗路易斯-Y、爱佩琳J受体、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5补体、C-242、CA9、CA19-9(路易斯a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5(CEA)、CEACAM6(NCA-90)、密封蛋白-3、密封蛋白-4、cMet、胶原蛋白、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、内皮素B受体(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV的F蛋白、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、叶酸受体α(FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、透明质酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受体(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R(wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰岛素受体、Jagged配体、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、路易斯X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、间皮素、MRP4、MUC1、粘蛋白-16(MUC16、CA-125)、Na/K ATP酶、NGF、呆蛋白、Notch受体、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂酰丝氨酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、鞘氨醇1磷酸酯、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、转铁蛋白、转铁蛋白受体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2、和WISP-3。
79.根据权利要求1-78中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体至少包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合相同的TAA。
80.根据权利要求79所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合相同TAA的不同表位。
81.根据权利要求79所述的多特异性多肽构建体，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合相同TAA的相同表位。
82.根据权利要求1-78中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中多特异性多肽构建体至少包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合不同TAA。
83.根据权利要求1-82中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中：
所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:211)的VH CDR1；含有氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ ID NO:212)的VH CD2；含有氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:18)的VH CDR3；含有氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:19)的VL CDR1；含有氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:20)的VL CDR2；以及含有氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:21)的VL CDR3；或者
所述抗CD3抗体或抗原结合片段包含至少包括氨基酸序列GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:211)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATY(SEQ ID NO:212)的VH CDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:18)的VH CDR3序列；至少包括氨基酸序列GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:229)的VLCDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP(SEQ IDNO:230)的VLCDR2序列；以及至少包括氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:225)的VL CDR3序列。
84.根据权利要求1-4和6-83中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗CD3 Fv包含：
具有SEQ ID NO:14、32-43、45-47、48、196和211中任一个的氨基酸序列或展现出与SEQID NO:14、32-43、45-47、48、196和211中的任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的VH；以及
具有SEQ ID NO:15、63、65-71、73、75、77和199中任一个的氨基酸序列或展现出与SEQID NO:15、63、65-71、73、75、77和199中的任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的VL。
85.根据权利要求1-4和6-84中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗CD3dsFv包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列和SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
86.根据权利要求1-4和6-84中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗CD3 Fv包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列和SEQ ID NO:199的氨基酸序列。
87.根据权利要求1-4和6-83中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述Fv抗体片段包括二硫化物稳定的抗CD3结合Fv片段(dsFv)。
88.根据权利要求5或权利要求87所述的多特异性多肽构建体，其中根据Kabat编号，所述二硫化物稳定的抗CD3结合Fv片段(dsFv)包含具有突变G44C的VH和具有突变G100C的VL。
89.根据权利要求5、87和88中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗CD3 Fv包含：
具有SEQ ID NO:44和49-62、197和198中任一个的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:44和49-62、197和198中的任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的VH；以及
具有SEQ ID NO:64、72、74、76、78-81、191、200和212中任一个的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:64、72、74、76、78-81、191、200和212中的任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的VL。
90.根据权利要求5和87-89中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗CD3dsFv包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列和SEQ ID NO:72的氨基酸序列。
91.根据权利要求5和87-89中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述抗CD3dsFv包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列和SEQ ID NO:200的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列和SEQ ID NO:200的氨基酸序列。
92.根据权利要求1-91中任一项所述的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体缀合至药剂。
93.根据权利要求92所述的多特异性多肽构建体，其中所述药剂是治疗剂、抗瘤剂、毒素或其片段、可检测部分或诊断剂。
94.根据权利要求93所述的多特异性多肽构建体，其中所述药剂经由接头缀合至所述多特异性多肽构建体。
95.多核苷酸，其编码根据权利要求1-94中任一项所述的多特异性多肽构建体。
96.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-94中任一项所述的任何多特异性多肽构建体的多肽链。
97.一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求1-94中任一项所述的多特异性多肽构建体的第一多肽的第一核酸序列和编码所述多特异性多肽构建体的第二多肽的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列被内部核糖体进入位点(IRES)或者编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核酸分开。
98.根据权利要求97所述的多核苷酸，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列可操作地连接至相同启动子。
99.根据权利要求97或权利要求98所述的多核苷酸，其中所述多特异性多肽构建体包含第三多肽链，并且所述多核苷酸进一步包含编码所述多特异性多肽构建体的第三多肽的第三核酸。
100.根据权利要求99所述的多核苷酸，其中所述第三核酸与所述第一多肽和/或所述第二多肽被内部核糖体进入位点(IRES)或者编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核酸分开，和/或所述第三核酸序列可操作地连接至与所述第一核酸序列和/或所述第二核酸序列相同的启动子。
101.根据权利要求97-100中任一项所述的多核苷酸，其中所述编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核酸选自T2A、P2A、E2A或F2A。
102.一种载体，其包含根据权利要求95-101中任一项所述的多核苷酸。
103.根据权利要求102所述的载体，所述载体是表达载体。
104.根据权利要求102或103所述的载体，所述载体是病毒载体或真核载体，任选地其中所述真核载体是哺乳动物载体。
105.一种细胞，其包含根据权利要求95-101中任一项所述的一种或多种多核苷酸或根据权利要求102-104中任一项所述的一种或多种载体。
106.根据权利要求105所述的细胞，其中所述细胞是重组的或分离的。
107.根据权利要求105或权利要求106所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
108.根据权利要求107所述的细胞，其中所述细胞是HEK293或CHO细胞。
109.一种产生多特异性多肽构建体的方法，所述方法包括将根据权利要求95-101中任一项所述的一种或多种多核苷酸或根据权利要求102-104中任一项所述的一种或多种载体引入细胞中，并且在产生所述多特异性多肽构建体的条件下培养所述细胞。
110.一种产生多特异性多肽构建体的方法，所述方法包括在其中由根据权利要求105-108中任一项所述的细胞产生所述多特异性多肽的条件下培养所述细胞。
111.根据权利要求109或权利要求110所述的方法，其进一步包括从所述细胞中分离或纯化所述多特异性多肽构建体。
112.根据权利要求109-111中任一项所述的方法，其中所述多特异性多肽构建体是异二聚体。
113.一种多特异性多肽构建体，其通过根据权利要求109-112中任一项所述的方法产生。
114.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-94或权利要求113中任一项所述的多特异性多肽构建体、和药学上可接受的载体。
115.根据权利要求114所述的药物组合物，其是无菌的。
116.一种刺激或诱导免疫应答的方法，所述方法包括使靶细胞和T细胞与根据权利要求1-94或权利要求113中任一项所述的多特异性多肽构建体或根据权利要求114或权利要求115所述的药物组合物接触，所述靶细胞表达由所述多特异性多肽构建体识别的肿瘤相关抗原。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述靶细胞是表达所述肿瘤相关抗原(TAA)的肿瘤细胞。
118.根据权利要求116或权利要求117所述的方法，其中所述接触是离体或体外进行的。
119.根据权利要求116-118中任一项所述的方法，其中所述接触是在受试者体内进行的。
120.一种在受试者中刺激或诱导免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的根据权利要求1-94或权利要求113中任一项所述的多特异性多肽构建体或根据权利要求114或权利要求115所述的药物组合物。
121.根据权利要求116-120中任一项所述的方法，其增加细胞介导的免疫性。
122.根据权利要求116-121中任一项所述的方法，其增加T细胞活性。
123.根据权利要求116-122中任一项所述的方法，其增加细胞溶解性T细胞(CTL)活性。
124.根据权利要求116-123中任一项所述的方法，其中所述免疫应答是针对肿瘤或癌症增加的。
125.根据权利要求116-124中任一项所述的方法，其中所述方法治疗所述受试者的疾病或病症。
126.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的根据权利要求1-94或权利要求113中任一项所述的多特异性缀合物或根据权利要求114或权利要求115所述的药物组合物。
127.根据权利要求125或权利要求126所述的方法，其中所述疾病或病症是肿瘤或癌症。
128.根据权利要求119-127中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
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