CN113214402B - 分离的抗原结合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种分离的抗原结合蛋白及其应用，所述抗原结合蛋白包含第一靶向部分和第二靶向结合部分，所述第一靶向部分包含特异性结合Lewis Y的抗体或其抗原结合片段，所述第二靶向部分包含特异性结合CD3蛋白的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二靶向部分位于所述第一靶向部分的C端。本申请还提供了所述抗原结合蛋白在治疗疾病或病症中的应用。

Description

分离的抗原结合蛋白及其应用
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种靶向Lewis Y和CD3的双特异性抗体及其用途。
背景技术
在治疗癌症领域，双特异性抗体取得了巨大的发展，目前已经有超过20种不同的商业化双特异性抗体平台，其中一些双特异性抗体已获得上市或者用于临床中不同疾病的研究。在这些双特异性抗体中，T细胞型双特异性抗体由于其强有力的激活机体免疫系统，被广泛研究用于各种癌症的治疗。这种典型的双特异性抗体通常一个结合臂结合T细胞上的CD3，另一个结合臂结合肿瘤细胞上的特异性抗原，这样可以募集T细胞至肿瘤细胞周围进而激活T细胞释放细胞因子、颗粒酶、穿孔素等。
Lewis Y是一种II型血型相关的双岩藻糖基化的寡糖.Lewis Y高表达于很多种上皮细胞来源的肿瘤，如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、胃癌或肝癌等，并且其表达往往和癌症的临床上病理等级和癌症进展相关。靶向Lewis Y的免疫疗法对于上皮细胞来源的肿瘤具有非常重大的应用前景，并且一些已经用于临床研究，如单克隆抗体、抗体偶联药物、免疫毒素和CAR-T，但没有Lewis Y双特异性抗体的临床研究。
发明内容
本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，所述分离的抗原结合蛋白包含第一靶向部分和第二靶向结合部分，所述第一靶向部分能够特异性结合Lewis Y，所述第二靶向部分能够特异性结合CD3蛋白。本申请所述的抗原结合蛋白具有至少一种选自下组的特点：(1)易表达纯化，(2)与Lewis Y结合亲和活性高，(3)能够有效介导的T细胞激活，(4)能够有效介导介导免疫细胞释放细胞因子(例如，IL-2和IFN-γ)，(5)能够有效介导T细胞增殖和细胞间黏附，和(6)抑制肿瘤生长。
本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，所述分离的抗原结合蛋白包含第一靶向部分和第二靶向结合部分，所述第一靶向部分包含特异性结合Lewis Y的抗体或其抗原结合片段，所述第二靶向部分包含特异性结合CD3蛋白的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分位于所述第一靶向部分的N端或C端。在某些实施方式中，所述第二靶向部分位于所述第一靶向部分的N端。在某些实施方式中，所述第二靶向部分位于所述第一靶向部分的C端。
在某些实施方式中，所述抗体选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含HCDR1，且所述HCDR1包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含HCDR2，且所述HCDR2包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含HCDR3，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含VH，且所述VH包括框架区H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:8或50所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含VH，且所述VH包括框架区H-FR2，其中所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:9或51所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含VH，且所述VH包括框架区H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:10或52所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含VH，且所述VH包括框架区H-FR4，其中所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:11或35所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含抗体重链可变区VH，且所述VH包含SEQID NO:4或49所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含VL，且所述VL包括框架区L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:19或39所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含VL，且所述VL包括框架区L-FR2，其中所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:20或56所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含VL，且所述VL包括框架区L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:21或57所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含VL，且所述VL包括框架区L-FR4，其中所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:22或58所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含抗体轻链可变区VL，且所述VL包含SEQID NO:15或55所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含HCDR1，且所述HCDR1包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含HCDR2，且所述HCDR2包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含HCDR3，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含VH，且所述VH包括框架区H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含VH，且所述VH包括框架区H-FR2，其中所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含VH，且所述VH包括框架区H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含VH，且所述VH包括框架区H-FR4，其中所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含抗体重链可变区VH，且所述VH包含SEQID NO:28所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含VL，且所述VL包括框架区L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含VL，且所述VL包括框架区L-FR2，其中所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含VL，且所述VL包括框架区L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含VL，且所述VL包括框架区L-FR4，其中所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含抗体轻链可变区VL，且所述VL包含SEQID NO:43所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分为scFv。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含所述第一靶向部分的VH，且所述第二多肽链包含所述第一靶向部分的VL、所述第二靶向部分的VH和所述第二靶向部分的VL。
在某些实施方式中，所述第一多肽链还包含抗体重链恒定区，所述抗体重链恒定区源自IgG恒定区。
在某些实施方式中，所述第一多肽链还包含抗体重链恒定区，所述抗体重链恒定区源自IgG1恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体重链恒定区包含SEQ ID NO:3或48所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一多肽链包含抗体重链。
在某些实施方式中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:2、24或47所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一多肽链由包含SEQ ID NO:1、23和46中任一项所示的核苷酸序列的核酸分子编码。
在某些实施方式中，在所述第二多肽链中，所述第一靶向部分的VL位于所述第二靶向部分的VH的N端，所述第二靶向部分的VL位于所述第二靶向部分的VH的C端。
在某些实施方式中，在所述第二多肽链中，所述第一靶向部分的VL位于所述第二靶向部分的VL的N端，所述第二靶向部分的VH位于所述第二靶向部分的VL的C端。
在某些实施方式中，所述第二多肽链还包含抗体轻链恒定区。
在某些实施方式中，所述第二多肽链还包含抗体轻链恒定区，所述抗体轻链恒定区源自Igκ恒定区和/或Igλ恒定区。
在某些实施方式中，所述第二多肽链还包含抗体轻链恒定区，所述抗体轻链恒定区源自Igκ恒定区，且包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，自N端至C端，所述第二多肽链依次包含所述第一靶向部分的VL、所述抗体轻链恒定区、所述第二靶向部分的VH和所述第二靶向部分的VL。
在某些实施方式中，自N端至C端，所述第二多肽链依次包含所述第一靶向部分的VL、所述抗体轻链恒定区、所述第二靶向部分的VL和所述第二靶向部分的VH。
在某些实施方式中，在所述第二多肽链中，所述第二靶向部分的VL和所述第二靶向部分的VH直接或间接连接以形成scFv。
在某些实施方式中，在所述第二多肽链中，所述第二靶向部分的VL和所述第二靶向部分的VH通过连接子连接。
在某些实施方式中，所述连接子包含SEQ ID NO:44-45中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分为scFv，且所述第二靶向部分包含SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在所述第二多肽链中，所述抗体轻链恒定区和所述第二靶向部分的scFv直接或间接连接。
在某些实施方式中，在所述第二多肽链中，所述抗体轻链恒定区和所述第二靶向部分的scFv通过连接子间接连接。
在某些实施方式中，所述连接子包含SEQ ID NO:44-45中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:26或54所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二多肽链由包含SEQ ID NO:25或53所示的核苷酸序列的核酸分子编码。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白包含两条所述第一多肽链和两条所述第二多肽链。
另一方面，本申请提供了分离的一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码所述的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了载体，所述载体包含所述核酸分子。
另一方面，本申请提供了细胞，所述细胞包含所述核酸分子或所述载体。
另一方面，本申请提供了多肽，所述多肽包含所述抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了免疫缀合物，所述免疫缀合物包含所述抗原结合蛋白或所述多肽。
另一方面，本申请提供了制备所述抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得所述抗原结合蛋白表达的条件下，培养所述细胞。
另一方面，本申请提供了药物组合物，所述药物组合物包含所述抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述多肽和/或所述免疫缀合物，以及任选地药学上可接受的载剂。
另一方面，本申请提供了所述抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述多肽、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括Lewis Y阳性肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括上皮细胞来源的肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括胃癌和/或乳腺癌。
另一方面，本申请提供了所述抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述多肽、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物，其用于预防、缓解或治疗肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括Lewis Y阳性肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括上皮细胞来源的肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括胃癌和/或乳腺癌。
另一方面，本申请提供了预防、缓解或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用所述抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述多肽、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括Lewis Y阳性肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括上皮细胞来源的肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括胃癌和/或乳腺癌。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是本申请所述抗原结合蛋白m3s193 BsAb结构示意图及SDS-PAGE检测结果，其中(A)IgG-[L]-scfv结构的m3s193 BsAb，(B)SDS-PAGE检测m3s193 mAb，(C)SDS-PAGE检测m3s193 BsAb，泳道1是纯化前的上清，泳道2是纯化后的流穿，泳道3是洗脱的目的蛋白。
图2显示的是本申请所述抗原结合蛋白m3s193 BsAb能够结合Lewis Y阳性的靶细胞。
图3显示的是本申请所述抗原结合蛋白m3s193 BsAb与Lewis Y阳性的靶细胞和CD3阳性的靶细胞具有较高的亲和力。
图4显示的是本申请所述抗原结合蛋白m3s193 BsAb能够介导体外细胞毒性。
图5显示的是本申请所述抗原结合蛋白m3s193 BsAbb介导的T细胞激活。
图6显示的是本申请所述抗原结合蛋白m3s193 BsAb介导的细胞因子IFN-γ和IL-2释放。
图7显示的是本申请所述抗原结合蛋白m3s193 BsAb介导的T细胞增殖及细胞间黏，其中，(A)m3s193 BsAb介导的T细胞增殖，(B)m3s193 BsAb介导的不同剂量下的细胞间黏附。
图8显示的是5组中的每只小鼠体内的NCI-N87肿瘤生长曲线。
图9显示的是施用PBS，m3s193 mAb，以及不同剂量m3s193 BsAb后的每组小鼠的平均肿瘤生长折线图(平均值±标准误差)，显著性分析是通过t检验法分析实验组与PBS组及单抗组的p值。
图10显示的是施用PBS，m3s193 mAb，以及不同剂量m3s193 BsAb后的瘤块的照片。
图11显示的是施用PBS，m3s193 mAb，以及不同剂量m3s193 BsAb后的五组小鼠的体重变化折线图(平均值±标准误差)。
图12显示的是施用PBS,m3s193 mAb,以及不同剂量m3s193 BsAb后的小鼠瘤块的重量直方图(平均值±标准误差)；*，**和***代表和PBS组的显著性差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。#，##和###代表和单抗组的显著性差异，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。
图13显示的是治疗型动物模型评估m3s193 BsAb的抗肿瘤活性的结果，其中，(A)流式细胞仪检测小鼠外周血中人CD45阳性细胞的含量，(B)两组实验中每只小鼠的肿瘤生长折线图，(C)两组实验的小鼠肿瘤平均生长折线图(平均值±标准误差)，(D)两组小鼠体内肿瘤块剥离后的拍照图，(E)两组小鼠的肿瘤块重量平均直方图(平均值±标准误差)。
图14显示的是h3s193 BsAb和m3s193 BsAb体外活性评估结果，(A)流式细胞仪检测两种抗原结合蛋白的靶细胞结合能力，(B)两种抗原结合蛋白体外介导的人PBMCs对靶细胞的毒性。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“第一靶向部分”通常是指在本申请的分离的抗原结合蛋白中，能够特异性识别和/或结合Lewis Y的部分。所述第一靶向部分可以指导包含其的分子或与其连接的分子(例如，本申请的分离的抗原结合蛋白)递送至表面表达Lewis Y的细胞、细胞群、组织或器官。例如，所述靶向部分可以包括但不限于抗体或其片段、肽、激素、生长因子、细胞因子和任何其它天然的或非天然的配体。例如，所述第一靶向部分可以是能够特异性结合Lewis Y的抗体、抗原结合片段，或其他基于抗体的分子或化合物。
在本申请中，术语“第二靶向部分”通常是指在本申请的分离的抗原结合蛋白中，能够特异性识别和/或结合CD3蛋白的部分。所述第二靶向部分可以指导包含其的分子或与其连接的分子(例如，本申请的分离的抗原结合蛋白)递送至表面表达CD3蛋白的细胞、细胞群、组织或器官。例如，所述靶向部分可以包括但不限于抗体或其片段、肽、激素、生长因子、细胞因子和任何其它天然的或非天然的配体。例如，所述第一靶向部分可以是能够特异性结合CD3蛋白的抗体、抗原结合片段，或其他基于抗体的分子或化合物。
在本申请中，术语“第一多肽链”通常是指本申请所述分离的抗原结合蛋白中，包含第一靶向部分的抗体重链可变区VH的氨基酸链。第一多肽链的氨基酸之间通常通过肽键连接。在本申请中，第一多肽链还可以包含与VH连接的铰链区和/或Fc区；所述铰链区可以与所述VH源自不同的物种或个体，可以源自不同类型的IgG；所述Fc区也可以与所述VH源自不同的物种或个体，可以源自不同类型的IgG；同样的，所述铰链区可以与所述Fc区源自不同的物种或个体，可以源自不同类型的IgG。例如，所述第一多肽链可以是抗Lewis Y抗体的重链。
在本申请中，术语“第二多肽链”通常是指本申请所述分离的抗原结合蛋白中，包含第一靶向部分的抗体重链可变区VL的氨基酸链。所述第二多肽链还可以包含本申请的第二靶向部分的抗体轻链可变区VL，以及第二靶向部分的抗体重链可变区VH。第二多肽链的氨基酸之间通常通过肽键连接。在本申请中，第二多肽链还可以包含与VL连接的轻链恒定区。在本申请中，所述第一多肽链和第二多肽链之间可以通过共价键(例如，二硫键)或非共价键连接。
在本申请中，术语“抗原结合蛋白”通常是指包含结合抗原部分的蛋白质，以及任选地允许结合抗原的部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或骨架部分。抗原结合蛋白可典型地包含抗体轻链可变区(VL)、抗体重链可变区(VH)或上述两者，及其功能性片段。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗原结合蛋白的实例包括但不限于抗体、抗原结合片段、免疫缀合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物或融合蛋白等，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
在本申请中，术语“抗体”通常是指对指定蛋白质或肽或其片段有反应性的蛋白。在本申请中，“抗体”涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示所期望的生物活性。抗体可以是鼠、人、人源化、嵌合抗体，或源于其它物种。抗体可以是来自任何类的抗体，包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，及来自任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4)的抗体。抗体可具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的重链恒定区。抗体还可具有选自例如kappa(κ)或lambda(λ)的轻链。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键链间连接的至少两个重链和两个轻链的糖蛋白。每个重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区域可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL包含按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列的三个CDR和四个FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指抗体分子的某部分，该部分包含氨基酸残基，该氨基酸残基与抗原相互作用并赋予抗体对于抗原的特异性和亲和力。抗原结合片段的实例可包括但不限于Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。在本申请中，术语“Fab”通常是指含有重链可变结构域和轻链可变结构域的片段，并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)；术语“Fab’”通常是指在重链CH1结构域的羧基端添加少量残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)而不同于Fab的片段；术语“F(ab')2”通常是指Fab’的二聚体，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。术语“Fv”通常是指含有完整抗原识别与结合位点的最小抗体片段。在某些情形中，该片段可以由一个重链可变区和一个轻链可变区以紧密非共价结合的二聚体组成；术语“dsFv”通常是指二硫键稳定的Fv片段，其单个轻链可变区与单个重链可变区之间的键是二硫键。术语“dAb片段”通常是指由VH结构域组成的抗体片段。在本申请中，术语“scFv”通常是指抗体的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域共价连接(可选地通过肽连接子)配对形成的单价分子；此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-连接子-VH-COOH或NH2-VH-连接子-VL-COOH。
在本申请中，术语“可变区”或“可变结构域”通常是指参与抗体与抗原的结合的抗体重链或轻链的结构域。在本申请中，术语“可变”通常是指，抗体的可变结构域的序列的某些部分变化强烈，形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。变异性并非均匀地分布在抗体的整个可变区中。它集中在轻链可变区和重链可变区中的三个区段，被称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)，分别为LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。可变域中更高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(H-FR1，H-FR2，H-FR3，H-FR4，L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4)，大部分采用β-折叠构型，通过三个CDR结构环区连接。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点。
在本领域中，可以通过多种方法来编码抗体的可变区或划分抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat编号方案和定义规则(参见，Kabat等人，免疫学的蛋白质序列，第五版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991))，基于结构环区域位置的Chothia编号方案和定义规则(参见，A1-Lazikani等人，JMol Biol 273:927-48,1997)，efranc等人的基于种系V基因的氨基酸序列比对的IMGT编号方案和定义规则，还有Honneger’s编号方案(AHo’s)，Martin编号方案，Gelfand编号方案等，可参见Mathieu Dondelinger等人，Understanding the Significance and Implications of Antibody Numbering andAntigen-Binding Surface/Residue Definition,Front.Immunol.,16October 2018。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指其中可变区源自一个物种，而恒定区源自另一个物种的抗体。通常，可变区源自实验动物诸如啮齿动物的抗体(“亲本抗体”)，且恒定区源自人类抗体，使得所得嵌合抗体与亲本(例如小鼠来源)抗体相比，在人类个体中引发不良免疫反应的可能性降低。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指非人抗体(例如小鼠抗体)的CDR区以外的部分或全部有的氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中，氨基酸的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的，只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白(受体抗体)中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类动物)的CDR区残基替换。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。
在本申请中，术语“全人源抗体”通常是指所有部分(包括抗体的可变区和恒定区)均由人类来源的基因所编码的抗体。本领域获得全人源抗体的方法可以有噬菌体展示技术、转基因小鼠技术、核糖体展示技术和RNA-多肽技术等。
在本申请中，术语“结合”、“特异性结合”或“对…特异性的”通常是指可测量且可再现的相互作用，诸如抗原和抗体之间的结合，其可以确定在存在分子(包括生物学分子)的异质群体的情况中靶物的存在。例如，抗体通过其抗原结合域与表位结合，并且该结合需要抗原结合域和表位之间的一些互补性。例如，特异性结合靶物(其可以是表位)的抗体是以比其结合其它靶物更大的亲和力、亲合力、更容易和/或以更大的持续时间结合此靶物的抗体。当抗体相比于其将结合随机的、不相关的表位而言更容易通过其抗原结合域与表位结合时，抗体被称为“特异性结合”该抗原。
在本申请中，术语“连接子”通常是指接合或连接2个或更多个离散的分开的单体域的部分。连接子可以是肽连接子，其包含通过肽键连接的2个或更多氨基酸残基的多肽，且用于连接一个或多个抗原结合部分。例如，所述连接子可以是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，x＝3且n＝3、4、5、6、7、8、9或10，或x＝4且n＝3、4、5、6、7、8、9或10。例如，所述连接子可以是(G)n，其中G＝甘氨酸，n为3-20的正整数。
在本申请中，术语“上皮细胞来源的肿瘤”通常是指与上皮细胞(例如，在皮肤以及各器官、腔道表面的细胞)增殖异常相关的肿瘤，其通常从上皮组织(包括被覆上皮、腺上皮活染感觉上皮)发生。上皮细胞来源的肿瘤也可称为“上皮性肿瘤”或“上皮细胞肿瘤”。本申请的上皮细胞来源的肿瘤可以包括原发部位为上皮组织的肿瘤，和转移至上皮组织的肿瘤。包括特别是指表达Lewis Y抗原的上皮细胞。上皮细胞来源的肿瘤可以包括乳腺癌、卵巢癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝癌和/或前列腺癌等。
在本申请中，术语“实体瘤”通常是指指代异常的组织生长或团块，其通常不含有囊肿或液性区。实体瘤可以是良性(非癌性)或恶性(癌性)的。
在本申请中，术语“双特异性抗体”通常是指在单个抗体分子内具有两种不同抗原的结合位点的抗体。应当理解，除了权威的抗体结构之外的其他分子可以构建成具有两种结合特异性。还将理解的是，通过双特异性抗体的抗原结合可以是同时的或顺序的。三体细胞瘤和杂交杂交瘤是可以分泌双特异性抗体的细胞系的两个实例。双特异性抗体也可以通过重组方法构建。
在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常是指不干扰活性成分的生物活性的有效性的一种或多种非毒性材料。这类制剂常规地可以含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体、以及任选地其他治疗剂。这类药学上可接受的载剂还可以含有适合于给予人的相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质。
在本申请中，术语“CD3”通常是指CD3链(CD3γ、CD3δ、CD3ζ和/或CD3ε)或CD3蛋白质多亚基复合体。术语“CD3”指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，包括哺乳动物，诸如灵长动物(例如人)、非人灵长动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”和未加工的蛋白质以及源自细胞中的加工的任何形式的蛋白质或一种或多种CD3链(多肽)(例如成熟多肽)。该术语还涵盖CD3的天然发生变体和同等型，例如剪接变体或等位变体。例如，CD3γ、CD3δ和CD3ε链的描述和序列可分别参见Uniprot数据库登录号P09693、P04234和P07766。
在本申请中，术语“Lewis Y”通常是指一种寡糖，尤其是一种II型血型相关的双岩藻糖基化的四糖。Lewis Y的化学结构是Fucɑ1→2Galβ1→4[Fucɑ1→3]GlcNAcβ1→R，由α1,2-岩藻糖转移酶在糖链末端催化形成。Lewis Y主要表达于胚胎期，在成年人体内，正常生理条件下主要表达于粒细胞或者表皮细胞表面。Lewis Y可以以一种糖脂的形式锚定在浆细胞膜表面，或者偶联到其他细胞表面受体上，如EGFR、CD47、CD44和CD147。然而，Lewis Y高表达于很多种上皮细胞来源的肿瘤，如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、胃癌和肝癌等。本申请所述Lewis Y包括天然的Lewis Y，还包括修饰(例如，糖基化修饰、去糖基化修饰、基团取代)的Lewis Y，以及各种变体、结晶体、异构体等。
在本申请中，术语“Lewis Y阳性肿瘤”通常是指包含具有高于正常的Lewis水平的癌细胞的癌症或肿瘤。可以通过检测Lewis Y的表达和/或活性水平，检测相关糖基化酶(例如α1,2-岩藻糖转移酶)的表达和/或活性水平来直接或间接检测Lewis水平。在本领域中，可以使用例如抗Lewis Y抗体，通过例如免疫组织化学法、免疫细胞化学染色法、免疫荧光法、免疫沉淀、流式细胞术PCR、western blot、原位杂交等多种方法检测Lewis Y水平，并(通过与正常细胞比较)判断某一样品(细胞、组织等)是否为Lewis阳性。Lewis Y阳性肿瘤可包括实体瘤或非实体瘤。Lewis Y阳性肿瘤可以包括上皮细胞来源的肿瘤。Lewis Y阳性肿瘤可以包括淋巴瘤、白血病和血液瘤。
在本申请中，术语“多肽”或“蛋白质”可互换地使用，通常是指氨基酸残基的聚合物。该术语也适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物、以及天然存在的氨基酸聚合物。该术语也可包括修饰的氨基酸聚合物，例如，通过添加糖残基以形成糖蛋白或被磷酸化修饰。多肽和蛋白质可由天然存在的和非重组的细胞或由遗传工程改造的或重组的细胞产生，并且可包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子、或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”和“蛋白质”特别包括本申请所述的抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。
在本申请中，当说到蛋白质、多肽和/或核酸分子时，还包括该蛋白质、多肽和/或核酸分子的同源物。术语“同源物”通常是指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的氨基酸序列或核苷酸序列。术语“同源性”可以等同于序列“同一性”。同源序列可以包括可以与主题序列是至少80％、85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。同源性可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，也可以在序列同一性方面表达同源性。在本申请中，提及的氨基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。
在本申请中，术语“分离的”通常是指大体上不含其天然存在的环境中通常伴随或与之相互作用的组分的生物材料(例如病毒、核酸或蛋白质)。所述分离的生物材料任选地包含在其天然环境(例如，核酸或蛋白质)中所述生物材料未发现具有的另外的材料。在本申请中，当涉及蛋白质时，“分离”通常是指所述的分子从发现该分子天然存在的整个生物体中分离和分开，或基本不存在其它相同类型的生物大分子。当涉及核酸分子时，它与天然与其结合的序列完全或部分分离，或该核酸具有与其结合的异源序列，或该核算从染色体分离。
在本申请中，术语“免疫缀合物”通常是指抗原结合蛋白与其它活性剂连接形成的物质，其他活性剂可以是小分子活性剂，例如化疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针或光谱探针。
在本申请中，术语“核酸”分子通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中，术语“细胞”通常是指可以包含或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗原结合蛋白的个体细胞、细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的、意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞。在某些情形中，所述细胞可以是哺乳动物细胞。
在本申请中，术语“药物组合物”通常是指这样的制剂，其以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对将施用所述组合物的对象具有不可接受的毒性的另外的成分。
在本申请中，术语“治疗”通常是指期望改变所治疗个体的天然病程，且可为实现防治或在临床病变过程中进行的临床介入。合乎需要的治疗效果包括但不限于防止疾病发生或复发性、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病状态以及缓和或改善预后。在一些情形中，本申请的抗原结合蛋白(例如，抗CD3和Lewis Y的双特异性抗体)可用来延迟疾病发展或减缓疾病进展。
在本申请中，术语“施用”通常是指向受试者(例如，患者)给予一定剂量的化合物(例如，抗癌治疗剂)或药物组合物(例如，包含抗癌治疗剂的药物组合物)的方法。施用可通过任何合适的方式进行，包括肠胃外、肺内和鼻内，以及(如果局部治疗需要)损伤内施用。胃肠外输注包括例如肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论恶性还是良性)以及所有癌前和癌性细胞和组织。在本申请中，所述肿瘤可以为细胞和组织的Lewis Y抗原高表达的肿瘤。肿瘤可包括实体瘤和/或非实体瘤(例如，血液瘤、白血病、淋巴瘤)。
在本申请中，术语“在……之间”通常是指某种氨基酸片段的C端与第一氨基酸片段的N端直接或间接连接，并且其N端与第二氨基酸片段的C端直接或间接连接。在轻链中，例如，所述L-FR2的N末端与所述LCDR1的C末端直接或间接相连，且所述L-FR2的C末端与所述LCDR2的N末端直接或间接相连。又例如，所述L-FR3的N末端与所述LCDR2的C末端直接或间接相连，且所述L-FR3的C末端与所述LCDR3的N末端直接或间接相连。在重链中，例如，所述H-FR2的N末端与所述HCDR1的C末端直接或间接相连，且所述H-FR2的C末端与所述HCDR2的N末端直接或间接相连。又例如，所述H-FR3的N末端与所述HCDR2的C末端直接或间接相连，且所述H-FR3的C末端与所述HCDR3的N末端直接或间接相连。在本申请中，“第一氨基酸片段”和“第二氨基酸片段”可以为相同或不同的任意一段氨基酸片段。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
发明详述
一方面，本申请提供一种分离的抗原结合蛋白，所述分离的抗原结合蛋白包含第一靶向部分和第二靶向结合部分，所述第一靶向部分能够特异性结合Lewis Y，所述第二靶向部分能够特异性结合CD3蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的所述第一靶向部分可以在所述第二靶向部分的N端，或者所述第一靶向部分可以在所述第二靶向部分的C端。
第一靶向部分
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含特异性结合Lewis Y抗原的抗体或其抗原结合片段。例如，所述特异性结合Lewis Y抗原的抗体可以选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。例如，所述特异性结合Lewis Y抗原的抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含HCDR1，且所述HCDR1包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含HCDR2，且所述HCDR2包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含HCDR3，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3可以依次包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3可以依次包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，且所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可以依次包含SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含框架区H-FR1，其中所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含框架区H-FR2，其中所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含框架区H-FR3，其中所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含框架区H-FR4，其中所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，且所述H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4可依次包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含抗体重链可变区VH，且所述VH可包含SEQID NO:4所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含框架区L-FR1，其中所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含框架区L-FR2，其中所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含框架区L-FR3，其中所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含框架区L-FR4，其中所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，且所述L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4可依次包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQID NO:22所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含抗体轻链可变区VL，且所述VL可包含SEQID NO:15所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含抗体重链可变区VH和抗体轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含框架区H-FR1，其中所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含框架区H-FR2，其中所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含框架区H-FR3，其中所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含框架区H-FR4，其中所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，且所述H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4可依次包含SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQID NO:35所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含抗体重链可变区VH，且所述VH可包含SEQID NO:49所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含框架区L-FR1，其中所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含框架区L-FR2，其中所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含框架区L-FR3，其中所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含框架区L-FR4，其中所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，且所述L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4可依次包含SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和SEQID NO:58所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含抗体轻链可变区VL，且所述VL可包含SEQID NO:55所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含抗体重链可变区VH和抗体轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以是Fab。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含抗体重链恒定区。例如，所述抗体重链恒定区可以源自IgG恒定区。例如，所述抗体重链恒定区可以源自IgG1恒定区。
在本申请中，与天然存在的IgG恒定区相比，所述抗体重链恒定区可以包含氨基酸突变，所述氨基酸突变可以是有助于提高本申请所述分离的抗原结合蛋白的稳定性的突变。例如，所述氨基酸突变可以是有助于本申请的抗原结合蛋白的多肽链之间形成二硫键的氨基酸突变。例如，所述第一靶向部分的重链恒定区的突变可以包含下组的氨基酸突变(EU编码)：L234A、L235A和P329G。
例如，所述第一靶向部分的重链恒定区可以包含SEQ ID NO:3或48所示的氨基酸突变。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含抗体重链，且所述抗体重链可以包含SEQID NO:2、24和47中任一项所示的氨基酸序列。例如，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一靶向部分可包含抗体重链，且所述抗体重链可包含SEQ ID NO:24或47所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含抗体轻链恒定区。例如，所述抗体轻链恒定区可以源自Igλ恒定区。例如，所述抗体轻链恒定区可以源自Igκ恒定区。
例如，所述第一靶向部分的轻链恒定区可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸突变。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含抗体轻链，且所述抗体轻链可以包含SEQID NO:13或59所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含抗体重链和抗体轻链，且所述抗体重链可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含抗体重链和抗体轻链，且所述抗体重链可包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可以包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
第二靶向部分
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含特异性结合CD3蛋白的抗体或其抗原结合片段。例如，所述特异性结合CD3蛋白的抗体可以选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。例如，所述特异性结合CD3蛋白的抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含HCDR1，且所述HCDR1包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含HCDR2，且所述HCDR2包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含HCDR3，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3可以依次包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3可以依次包含SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，且所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可以依次包含SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含框架区H-FR1，其中所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含框架区H-FR2，其中所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含框架区H-FR3，其中所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含框架区H-FR4，其中所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，且所述H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4可依次包含SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQID NO:35所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含抗体重链可变区VH，且所述VH可包含SEQID NO:28所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含框架区L-FR1，其中所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含框架区L-FR2，其中所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含框架区L-FR3，其中所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含框架区L-FR4，其中所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，且所述L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4可依次包含SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQID NO:42所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含抗体轻链可变区VL，且所述VL可包含SEQID NO:43所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含抗体重链可变区VH和抗体轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以是scFv。在本申请中，所述第二靶向部分的VH和VL可以直接或间接连接。在本申请中，所述第二靶向部分的VH和VL可以通过连接子(肽连接子)连接。例如，所述第二靶向部分的VH和VL之间的所述连接子可包含的氨基酸序列可以为(G4S)n，且所述n为3、4、5、6、7、8、9或10。例如，所述第二靶向部分的VH和VL之间的所述连接子可以包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以是scFv，且所述第二靶向部分的VH的C端可以与所述第二靶向部分的VL的N端相连。在本申请中，所述第二靶向部分可以是scFv，且所述第二靶向部分的VL的C端与所述第二靶向部分的VH的N端相连。
在本申请中，所述第二靶向部分可以是scFv，且所述第二靶向部分的VH的C端可以与所述第二靶向部分的VL的N端通过肽连接子相连。例如，所述肽连接子的氨基酸序列可以为SEQ ID NO:45。例如，所述第二靶向部分可包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
两个靶向部分的连接方式
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含所述第一靶向部分和所述第二靶向部分。
在本申请中，所述第一靶向部分可以是Fab，所述第二靶向部分可以是scFv。
在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二靶向部分可以位于所述第一靶向部分的重链可变区的N端。在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二靶向部分可以位于所述第一靶向部分的轻链可变区的N端。在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二靶向部分可以位于所述第一靶向部分的重链可变区的C端。在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第二靶向部分可以位于所述第一靶向部分的轻链可变区的C端。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一靶向部分可以包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，且所述第一靶向部分的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可以依次包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17和SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，且所述第二靶向部分可以包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，且所述第二靶向部分的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可以依次包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37和SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白中，所述第一靶向部分可以包含VH和VL，所述第二靶向部分可以包含VH和VL，且所述第一靶向部分的VH可以包含SEQ ID NO:4或49所示的氨基酸序列，所述第一靶向部分的VL可以SEQ ID NO:15或55所示的氨基酸序列，所述第二靶向部分的VH可以包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，且所述第二靶向部分的VL可以包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含第一多肽链和第二多肽链。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第一多肽链可包含所述第一靶向部分的VH，且所述第一靶向部分的VH可包含SEQ ID NO:4或49所示的氨基酸序列。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第一多肽链还可包含所述第一靶向部分的重链恒定区，所述第一靶向部分的重链恒定区可以包含3或48所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第一多肽链可以包含所述第一靶向部分的抗体重链，且所述第一靶向部分的抗体重链可以包含SEQ ID NO:2、24和47中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第二多肽链可包含所述第一靶向部分的VL，所述第二靶向部分的VH和所述第二靶向部分的VL。
在本申请中，在所述第二多肽链中，所述第二靶向部分的VH和所述第二靶向部分的VL可以形成scFv。所述第二靶向部分的scFv可以位于所述第一靶向部分的VL的N端，或者所述第二靶向部分的scFv可以位于所述第一靶向部分的VL的C端。
在某些情形中，在所述第二多肽链中，所述第一靶向部分的VL可以位于所述第二靶向部分的VH的N端，所述第二靶向部分的VL可以位于所述第二靶向部分的VH的C端。在某些情形中，在所述第二多肽链中，所述第一靶向部分的VL可以位于所述第二靶向部分的VL的N端，所述第二靶向部分的VH可以位于所述第二靶向部分的VL的C端。
在本申请中，在所述第二多肽链中，所述第一靶向部分的VL可以包含SEQ ID NO:15或55所示的氨基酸序列，所述第二靶向部分的VH可以包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，且所述第二靶向部分的VL可以包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第二多肽链还可以包含所述第一靶向部分的抗体轻链。在某些情形中，自N端至C端，所述第二多肽链可以依次包含所述第一靶向部分的VL、所述第一靶向部分的抗体轻链恒定区、所述第二靶向部分的VH和所述第二靶向部分的VL。在某些情形中，自N端至C端，所述第二多肽链可以依次包含所述第一靶向部分的VL、所述第一靶向部分的轻链恒定区、所述第二靶向部分的VL和所述第二靶向部分的VH。
在本申请中，在所述第二多肽链中，所述第一靶向部分的轻链恒定区可以包含SEQID NO:14所示的氨基酸序列。
在本申请中，在所述分离的抗原结合蛋白的第二多肽链中，所述第二靶向部分的scFv的N端可以和所述第一靶向部分的抗体轻链恒定区的C端直接或间接连接，或者，所述第二靶向部分的scFv的C端可以和所述第一靶向部分的抗体轻链恒定区的N端直接或间接连接。
在本申请中，所述第二靶向部分的scFv可以和所述第一靶向部分的抗体轻链恒定区通过连接子(例如，肽连接子)相连。例如，所述第二靶向部分的scFv和所述第一靶向部分的抗体轻链恒定区之间的所述连接子可包含的氨基酸序列可以为(G4S)n，且所述n为3、4、5、6、7、8、9或10。例如，所述第二靶向部分的scFv和所述第一靶向部分的抗体轻链恒定区之间的所述连接子可以包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
在本申请中，自N端至C端，所述第二多肽链可以依次包含所述第一靶向部分的VL、所述第一靶向部分的抗体轻链恒定区、所述第二靶向部分的VH、连接子2和所述第二靶向部分的VL。在本申请中，自N端至C端，所述第二多肽链可以依次包含所述第一靶向部分的VL、所述第一靶向部分的抗体轻链恒定区、连接子1、所述第二靶向部分的scFv。
例如，所述scFv可以包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二多肽链可以包含SEQ ID NO:26或54所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链可包含SEQ ID NO:2、24或47中任一项所示的氨基酸序列，且所述第二多肽链可包含SEQ ID NO:26或54所示的氨基酸序列。
例如，所述分离的抗原结合蛋白的所述第一多肽链可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，且所述第二多肽链可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的所述第一多肽链可包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，且所述第二多肽链可包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含至少两条所述第一多肽链和至少两条所述第二多肽链。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含两条所述第一多肽链和两条所述第二多肽链。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以具有两条所述第一多肽链和两条所述第二多肽链。
在本申请中，在所述抗原结合蛋白的合成过程中，所述重链和/或轻链的N端还可以包含信号肽。信号肽通常能够引导细胞中新合成的蛋白质向分泌通路转移。所述信号肽可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。当新合成的蛋白质进入内质网腔,而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除。因此，分泌后分离纯化的所述分离的抗原结合蛋白的轻链和/或重链可以不包含信号肽。
核酸、载体、细胞和制备方法
在另一个方面，本申请还提供了一种或多种核酸分子。所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述的抗原结合蛋白。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述抗原结合蛋白，也可以编码其中的一部分(例如，HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、轻链、重链、第一多肽链和第二多肽链中的一种或多种)。
本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过同源重组克隆产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
例如，所述核酸分子可以包含SEQ ID NO:1、12、23、25、46和53中任一项所示的核苷酸序列。
在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述抗体、抗原结合片段的核酸，这些方法包括但不限于，采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR。
在另一个方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。例如，所述载体为表达载体。例如，所述载体为哺乳动物表达载体。例如，所述载体可以为质粒。
在另一个方面，本申请提供了细胞，所述细胞可包含本申请所述的一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种载体。在某些实施方式中，每种或每个细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，所述细胞可以是哺乳动物细胞，例如，所述细胞可以是293细胞。
在另一个方面，本申请提供了制备所述的抗原结合蛋白的方法。所述方法可包括，在使得所述的抗原结合蛋白表达的条件下，培养所述本申请所述的宿主细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
多肽、药物组合物和免疫缀合物
另一方面，本申请提供了一种多肽，所述多肽包含所述的抗原结合蛋白，还可以包含其他功能性氨基酸序列。所述抗原结合蛋白与其他功能性氨基酸序列可以共价连接或非共价连接。
另一方面，本申请提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物可以包含所述的抗原结合蛋白，以及其它活性剂。其他活性剂可以是小分子活性剂，例如化疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针或光谱探针。
在另一个方面，本申请提供了一种药物组合物，其可包含本申请所述抗原结合蛋白、所述多肽、所述核酸分子、所述载体、所述细胞和/或所述免疫缀合物，以及任选地药学上可接受的载剂(carrier)。所述药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒性，本申请中的药物组合物还可含有多于一种活性化合物，通常为不会不利地影响彼此的具有互补活性的那些活性化合物。此类药物的类型和有效量取决于例如制剂中存在的拮抗剂的量和类型，以及受试者的临床参数。
所述药物组合物可以用于抑制肿瘤生长。例如，本申请的药物组合物可以抑制或延缓疾病的发展或进展，可以减小肿瘤大小(甚至基本消除肿瘤)，和/或可以减轻和/或稳定疾病状态。本申请所述的药物组合物可以包含预防和/或治疗有效量的所述抗原结合蛋白。所述预防和/或治疗有效量是能够预防和/或治疗(至少部分治疗)患有或具有发展风险的受试者中的疾病或病症和/或其任何并发症而所需的剂量。
另一方面，本申请提供了一种试剂盒，所述试剂盒可以包含本申请所述的抗原结合蛋白、多肽、细胞、载体、核酸分子、免疫缀合物和/或本申请所述的药物组合物。其可在单一常用容器中包括本申请所述的抗原结合蛋白、多肽、细胞、载体、核酸分子、免疫缀合物，和/或药物组合物，也可任选地与一种或多种治疗剂组合，任选地一起配制于试剂盒中。
另一方面，本申请提供了一种给药装置，所述给药装置可以用来施用本申请所述的抗原结合蛋白、多肽、细胞、载体、核酸分子、免疫缀合物，和/或药物组合物。
方法和用途
另一方面，本申请提供了所述抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述多肽、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。所述肿瘤生长受到抑制，或肿瘤体积减少。
另一方面，本申请提供了所述抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述多肽、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物，其用于预防、缓解或治疗肿瘤。
另一方面，本申请提供了预防、缓解或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用所述抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述多肽、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物。
在本申请中，所述肿瘤可以包括Lewis Y异常表达的肿瘤。在本申请中，所述肿瘤可以包括Lewis Y高表达的肿瘤。在本申请中，所述肿瘤可以包括Lewis Y阳性肿瘤。
在本申请中，所述肿瘤可以包括实体瘤。在本申请中，所述肿瘤可以包括上皮细胞来源的肿瘤。在本申请中，所述肿瘤可以包括上皮性肿瘤。在本申请中，所述肿瘤可以包括上皮细胞肿瘤。在本申请中，所述肿瘤可以包括乳腺癌、卵巢癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝癌和/或前列腺癌。
在本申请中，所述肿瘤可以包括非实体瘤。在本申请中，所述肿瘤可以包括血液瘤、淋巴瘤和/或白血病。
在本申请中，所述肿瘤可以为胃癌和/或乳腺癌。
另一方面，本申请提供了介导免疫细胞活化的方法，所述方法包括施用所述抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述多肽、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物。在本申请中，所述免疫细胞为T细胞。
另一方面，本申请提供了介导免疫细胞分泌细胞因子的方法，所述方法包括施用所述抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述多肽、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物。所述免疫细胞可以为T细胞。所述细胞因子可以为IL-2和/或IFN-γ。
另一方面，本申请提供了介导免疫细胞增殖的方法，所述方法包括施用所述抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述多肽、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物。在本申请中，所述免疫细胞为T细胞。
另一方面，本申请提供了介导免疫细胞间黏附的方法，所述方法包括施用所述抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述多肽、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物。在本申请中，所述免疫细胞为T细胞。
另一方面，本申请提供了如下实施方案：
1.分离的抗原结合蛋白，其包含第一靶向部分和第二靶向部分，所述第一靶向部分包含特异性结合Lewis Y的抗体或其抗原结合片段，所述第二靶向部分包含特异性结合CD3蛋白的抗体或其抗原结合片段。
2.根据实施方案1所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分位于所述第一靶向部分的N端或C端。
3.根据实施方案1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的抗原结合蛋白，其中抗原结合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分包含HCDR1，且所述HCDR1包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分包含HCDR2，且所述HCDR2包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分包含HCDR3，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分包含VH，且所述VH包括框架区H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:8或50所示的氨基酸序列。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分包含VH，且所述VH包括框架区H-FR2，其中所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:9或51所示的氨基酸序列。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分包含VH，且所述VH包括框架区H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:10或52所示的氨基酸序列。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分包含VH，且所述VH包括框架区H-FR4，其中所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:11或35所示的氨基酸序列。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分包含抗体重链可变区VH，且所述VH包含SEQ ID NO:4或49所示的氨基酸序列。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分包含VL，且所述VL包括框架区L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:19或39所示的氨基酸序列。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分包含VL，且所述VL包括框架区L-FR2，其中所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:20或56所示的氨基酸序列。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分包含VL，且所述VL包括框架区L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:21或57所示的氨基酸序列。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分包含VL，且所述VL包括框架区L-FR4，其中所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:22或58所示的氨基酸序列。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分包含抗体轻链可变区VL，且所述VL包含SEQ ID NO:15或55所示的氨基酸序列。
21.根据实施方案1-20中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含HCDR1，且所述HCDR1包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
22.根据实施方案1-21中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含HCDR2，且所述HCDR2包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。
23.根据实施方案1-22中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含HCDR3，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含VH，且所述VH包括框架区H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
25.根据实施方案1-23中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含VH，且所述VH包括框架区H-FR2，其中所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含VH，且所述VH包括框架区H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
27.根据实施方案1-26中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含VH，且所述VH包括框架区H-FR4，其中所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
28.根据实施方案1-27中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含抗体重链可变区VH，且所述VH包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
29.根据实施方案1-28中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
30.根据实施方案1-29中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
31.根据实施方案1-39中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
32.根据实施方案1-31中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含VL，且所述VL包括框架区L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
33.根据实施方案1-32中任一项所述抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含VL，且所述VL包括框架区L-FR2，其中所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。
34.根据实施方案1-33中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含VL，且所述VL包括框架区L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
35.根据实施方案1-34中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含VL，且所述VL包括框架区L-FR4，其中所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
36.根据实施方案1-35中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含抗体轻链可变区VL，且所述VL包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
37.根据实施方案1-36中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分为scFv。
38.根据实施方案37所述的抗原结合蛋白，在所述第二靶向部分中，所述VH和所述VL之间通过连接子连接。
39.根据实施方案1-36中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
40.根据实施方案32-39中任一项所述的抗原结合蛋白，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含所述第一靶向部分的VH，且所述第二多肽链包含所述第一靶向部分的VL、所述第二靶向部分的VH和所述第二靶向部分的VL。
41.根据实施方案40所述的抗原结合蛋白，其中所述第一多肽链还包含抗体重链恒定区，所述抗体重链恒定区源自IgG恒定区。
42.根据实施方案41所述的抗原结合蛋白，其中所述第一多肽链还包含抗体重链恒定区，所述抗体重链恒定区源自IgG1恒定区。
43.根据实施方案42所述的抗原结合蛋白，其中所述抗体重链恒定区包含SEQ IDNO:3或48所示的氨基酸序列。
44.根据实施方案40-43中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一多肽链包含抗体重链。
45.根据实施方案40-44中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQ ID NO:2、24和47中任一项所示的氨基酸序列。
46.根据实施方案40-45中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一多肽链由包含SEQ ID NO:1、23和46中任一项所示的核苷酸序列的核酸分子编码。
47.根据实施方案40-46中任一项所述的抗原结合蛋白，其中在所述第二多肽链中，所述第一靶向部分的VL位于所述第二靶向部分的VH的N端，所述第二靶向部分的VL位于所述第二靶向部分的VH的C端。
48.根据实施方案40-47中任一项所述的抗原结合蛋白，其中在所述第二多肽链中，所述第一靶向部分的VL位于所述第二靶向部分的VL的N端，所述第二靶向部分的VH位于所述第二靶向部分的VL的C端。
49.根据实施方案40-48中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含抗体轻链恒定区。
50.根据实施方案40-49所述的抗原结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含抗体轻链恒定区，所述抗体轻链恒定区源自Igκ恒定区和/或Igλ恒定区。
51.根据实施方案40-50中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含抗体轻链恒定区，所述抗体轻链恒定区源自Igκ恒定区，且包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
52.根据实施方案40-51中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二多肽链包含抗体轻链，且所述抗体轻链包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
53.根据实施方案40-52中任一项所述的抗原结合蛋白，其中自N端至C端，所述第二多肽链依次包含所述第一靶向部分的VL、所述抗体轻链恒定区、所述第二靶向部分的VH和所述第二靶向部分的VL。
54.根据实施方案40-53中任一项所述的抗原结合蛋白，其中自N端至C端，所述第二多肽链依次包含所述第一靶向部分的VL、所述抗体轻链恒定区、所述第二靶向部分的VL和所述第二靶向部分的VH。
55.根据实施方案40-54中任一项所述的抗原结合蛋白，其中在所述第二多肽链中，所述第二靶向部分的VL和所述第二靶向部分的VH直接或间接连接以形成scFv。
56.根据实施方案40-55中任一项所述的抗原结合蛋白，其中在所述第二多肽链中，所述第二靶向部分的VL和所述第二靶向部分的VH通过连接子连接。
57.根据实施方案56所述的抗原结合蛋白，其中所述连接子包含SEQ ID NO:44-45中任一项所示的氨基酸序列。
58.根据实施方案1-57中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分为scFv，且所述第二靶向部分包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
59.根据实施方案40-58中任一项所述的抗原结合蛋白，其中在所述第二多肽链中，所述抗体轻链恒定区和所述第二靶向部分的scFv直接或间接连接。
60.根据实施方案40-59中任一项所述的抗原结合蛋白，其中在所述第二多肽链中，所述抗体轻链恒定区和所述第二靶向部分的scFv通过连接子间接连接。
61.根据实施方案60所述的抗原结合蛋白，其中所述连接子包含SEQ ID NO:44-45中任一项所示的氨基酸序列。
62.根据实施方案40-61中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二多肽链包含SEQ ID NO:26或54所示的氨基酸序列。
63.根据实施方案40-62中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二多肽链由包含SEQ ID NO:25或53所示的核苷酸序列的核酸分子编码。
64.根据实施方案40-63中任一项所述的抗原结合蛋白，其包含两条所述第一多肽链和两条所述第二多肽链。
65.根据实施方案1-64中任一项所述的抗原结合蛋白，其为双特异性抗体。
66.分离的一种或多种核酸分子，其编码实施方案1-65中任一项所述的抗原结合蛋白。
67.载体，其包含根据实施方案66所述的核酸分子。
68.细胞，其包含根据实施方案66所述的核酸分子或根据实施方案67所述的载体。
69.多肽，其包含实施方案1-65中任一项所述的抗原结合蛋白。
70.免疫缀合物，其包含实施方案1-65中任一项所述的抗原结合蛋白或实施方案69所述的多肽。
71.制备实施方案1-65中任一项所述的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得实施方案1-65中任一项所述的抗原结合蛋白表达的条件下，培养根据实施方案68所述的细胞。
72.药物组合物，其包含实施方案1-65中任一项所述的抗原结合蛋白、实施方案66所述的核酸分子、实施方案67所述的载体、实施方案68所述的细胞、实施方案69所述的多肽和/或实施方案70所述的免疫缀合物，以及任选地药学上可接受的载剂。
73.实施方案1-65中任一项所述的抗原结合蛋白、实施方案66所述的核酸分子、实施方案67所述的载体、实施方案68所述的细胞、实施方案69所述的多肽、实施方案70所述的免疫缀合物和/或实施方案72所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
74.根据实施方案73所述的用途，其中所述肿瘤包括Lewis Y阳性肿瘤。
75.根据实施方案73-74中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤。
76.根据实施方案73-75中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括上皮细胞来源的肿瘤。
77.根据实施方案73-76中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括胃癌和/或乳腺癌。
78.实施方案1-65中任一项所述的抗原结合蛋白、实施方案66所述的核酸分子、实施方案67所述的载体、实施方案68所述的细胞、实施方案69所述的多肽、实施方案70所述的免疫缀合物和/或实施方案72所述的药物组合物，其用于预防、缓解或治疗肿瘤。
79.根据实施方案78所述的方法，其中所述肿瘤包括Lewis Y阳性肿瘤。
80.根据实施方案78-79中任一项所述的方法，其中所述肿瘤包括实体瘤。
81.根据实施方案78-80中任一项所述的方法，其中所述肿瘤包括上皮细胞来源的肿瘤。
82.根据实施方案78-81中任一项所述的方法，其中所述肿瘤包括胃癌和/或乳腺癌。
83.预防、缓解或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用实施方案1-65中任一项所述的抗原结合蛋白、实施方案66所述的核酸分子、实施方案67所述的载体、实施方案68所述的细胞、实施方案69所述的多肽、实施方案70所述的免疫缀合物和/或实施方案72所述的药物组合物。
84.根据实施方案83所述的抗原结合蛋白、核酸分子、载体、细胞、多肽、免疫缀合物和/或药物组合物，其中所述肿瘤包括Lewis Y阳性肿瘤。
85.根据实施方案83-84中任一项所述的抗原结合蛋白、核酸分子、载体、细胞、多肽、免疫缀合物和/或药物组合物，其中所述肿瘤包括实体瘤。
86.根据实施方案83-85中任一项所述的抗原结合蛋白、核酸分子、载体、细胞、多肽、免疫缀合物和/或药物组合物，其中所述肿瘤包括上皮细胞来源的肿瘤。
87.根据实施方案83-86中任一项所述的抗原结合蛋白、核酸分子、载体、细胞、多肽、免疫缀合物和/或药物组合物，其中所述肿瘤包括胃癌和/或乳腺癌。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请发明的各个技术方案，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1抗原结合蛋白的制备
方法：载体构建和蛋白纯化
Lewis Y单抗的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)来源于鼠单克隆抗体序列3s193(美国专利公开号US5874060A)。我们将合成的VH和VL通过PCR克隆到正常的人IgG1,κ抗体骨架中，形成Lewis Y单抗(命名为m3s193 mAb)。在m3s193 mAb基础上引入L234A，L235A，P329G突变，并将anti-CD3的scfv通过(G4S)3序列连接到m3s193 mAb的轻链末端形成IgG-[L]-scFv结构，这样构建的分子即为靶向Lewis Y和CD3的双特异性抗体(命名为m3s193 BsAb)。其中scFv来源于huOKT3的重链可变区和轻链可变区，中间通过(G4S)6序列连接而成(huOKT3的序列可参见Adair,J.R.,et al.,Humanization of the murine anti-human CD3 monoclonal antibody OKT3.Hum Antibodies Hybridomas,1994.5(1-2):p.41-7)。m3s193 mAb和m3s193 BsAb信息如表1所示。所有抗体的多肽序列通过同源重组克隆到pcDNA3.4载体中。
构建好的载体通过瞬时基因表达方法转染293F细胞。在6-7天培养后，细胞活力会下降到50-60％，这时我们收集细胞上清并用MabSelect SuRe亲和层析柱进行纯化。纯化后的蛋白通过SDS-PAGE检测还原和非还原的蛋白条带，并用PBS透析目标蛋白，再进行0.22μm无菌过滤并保存在-80℃冰箱。
表1抗体信息
Figure BDA0003099071010000341
结果：m3s193 BsAb双特异性抗体易表达纯化
图1的A显示的是IgG-[L]-scFv结构的抗原结合蛋白具有对称的分子结构，其含有正常的抗体重链以及其轻链通过(G4S)3连接肽连接结合CD3的scFv。图1的B是m3s193 mAb进行SDS-PAGE检测的结果，非还原胶可以明显观察到唯一的目的条带(约150kDa)，还原胶可以明显观察到两条目的条带，分别是50kDa的抗体重链和25kDa的抗体轻链。图1的C是m3s193 BsAb进行SDS-PAGE检测的结果，非还原胶和还原胶都具有明显的目的条带，分别为分子量200kDa和50kDa。还原胶只观察到一个条带，这是由于轻链连上scFv后增加了其分子量，使其具有和重链相近的分子量(约50kDa)，因此在这10％浓度的还原胶上只看到一个条带。通过灰度值计算抗体的纯度在95％以上，可以用于后续的体内外活性评估。
实施例2本申请抗原结合蛋白m3s193 BsAb能够结合Lewis Y阳性的靶细胞
靶细胞的结合活性检测
选择4株Lewis Y阳性的肿瘤细胞MCF-7，T47D，MDA-MA-231和NCI-N87，在2×105个靶细胞中加入终浓度50μg/mL纯化好的m3s193 mAb和m3s193 BsAb，在4℃冰箱中孵育30分钟。孵育结束后，细胞用流式缓冲液洗两遍，再加入二抗(Goat anti-Human IgG(H+L)Secondary Antibody,FITC(TheromFisherTM))，在4℃冰箱中避光孵育30分钟。孵育结束后用流式缓冲液洗两遍并用流式细胞仪检测。
结果显示m3s193 mAb和m3s193 BsAb都能结合四株肿瘤细胞(图2)。其中，对于MDA-MB-231细胞，m3s193 BsAb具有比m3s193 mAb更强的结合活性。
靶细胞的亲和力检测
结合活性的检测初步验证了表达的抗体具有生物学功能，下一步我们通过流式细胞仪进一步检测Lewis Y单抗和抗原结合蛋白对细胞的亲和力。检测方法如实施例2，蛋白药物进行5倍梯度稀释，终浓度从500nM至0.0064nM，在4℃冰箱中孵育30分钟。对于Jurkat细胞，细胞密度为2×105个/孔，m3s193 BsAb浓度从500nM进行5倍梯度稀释至0.032nM，在4℃冰箱中孵育30分钟。孵育结束后加入二抗并用流式细胞仪检测。
结果如图3所示，对于四种肿瘤细胞株，m3s193 BsAb具有和m3s193 mAb相似的细胞结合能力(EC50在nM级)，这表明IgG-[L]-scFv结构的抗原结合蛋白能够保留母本单抗的高亲和力。然而，对于MDA-MB-231细胞，我们发现了与结合实验相一致的结果，即m3s193BsAb对于MDA-MB-231细胞具有比m3s193 mAb更强的亲和力。此外，我们也检测了m3s193BsAb对于Jurkat细胞的亲和力，尽管结合CD3分子的是scFv，但结果显示其结合Jurkat的EC50值同样较低，说明本申请的抗原结合蛋白亲和CD3的能力较强。
实施例3本申请抗原结合蛋白m3s193 BsAb具有较好的体外细胞毒性
评估抗体的结合及亲和活性后，我们评估了单抗和抗原结合蛋白的体外细胞毒性，我们以huPBMCs作为效应细胞来杀伤Lewis Y阳性的肿瘤细胞。我们选择3.2中的四株细胞，通过不同的抗体浓度用LDH试剂盒检测抗体介导的效应细胞杀伤能力。具体来说，靶细胞接种至96孔板中过夜培养(无酚红RPMI 1640+5％FBS)，纯化的抗体用培养基(无酚红RPMI1640+2％FBS)10倍梯度稀释后加入到铺好细胞的孔板中，新鲜分离的huPBMCs按照效靶比(E:T)10:1用完全培养基(无酚红RPMI 1640+10％FBS)加入到上述孔板中，将上述孔板放置恒温细胞培养箱中静置培养。孵育结束后，离心取上清用Cytotoxic
Figure BDA0003099071010000362
Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit(LDH；Promega)试剂盒检测体外活性，计算公式如下：cytotoxicity％＝(experimental lysis–spontaneous effector lysis-spontaneoustarget lysis)/(maximum target lysis-spontaneous target lysis)×100。
如图4所示，对于MCF-7和T47D细胞，m3s193 BsAb和m3s193 mAb具有相似的体外细胞毒性，其EC50值相近，但整体上m3s193 BsAb的EC50值会低一些且最大杀伤窗口会更大一些。然而，对于MDA-MB-231和NCI-N87细胞，m3s193 BsAb具有比m3s193 mAb更强的体外杀伤活性，其EC50值更低，杀伤窗口更大。
实施例4本申请抗原结合蛋白m3s193 BsAb介导T细胞活化
T细胞型双特异性抗体能够激活T细胞表达CD69，因此，我们也通过流式细胞仪检测了m3s193 BsAb激活T细胞的能力。方法同实施例3：NCI-N87细胞，抗体药以及huPBMCs共孵育20h后，将孔板中的混合细胞取出，加入流式抗体CD8-FITC，CD4-PE(Sino Biological)和CD69-APC(BD Biosciences)来检测CD8+和CD4+T细胞上的CD69表达量，分析CD69表达的百分比和中位荧光强度。
结果如图5所示，m3s193 BsAb在100ng/mL剂量下就已经可以最大限度地激活CD8+和CD4+T细胞表达CD69，且CD69的表达量(Median APC-A)很高。而单抗m3s193 mAb在10,000ng/mL剂量下仍不能激活CD8+和CD4+T细胞表达CD69。这表明，本申请的抗原结合蛋白由于其scFv结合T细胞而能够诱导很强的T细胞活化，而单抗由于不能结合T细胞因此不能诱导T细胞的活化。
实施例5本申请抗原结合蛋白m3s193 BsAb介导细胞因子IL-2和IFN-γ释放
本实施例验证活化的T细胞能够释放IL-2来进一步促进T细胞的增殖，以及释放IFN-γ来介导抗肿瘤活性。方法如下：NCI-N87细胞，抗体药以及huPBMCs共孵育20h后，将孔板水平离心，1,500转/分钟，10分钟，取培养上清并冷冻于-80℃冰箱中。细胞因子的检测用ELISA试剂盒
Figure BDA0003099071010000361
按照使用说明书进行检测。
如图6所示，m3s193 BsAb能够介导很强的细胞因子IL-2和IFN-γ的释放，而m3s193 mAb组没有检测到细胞因子的释放。这进一步表明新构建的Lewis Y抗原结合蛋白(m3s193 BsAb)具有较强的T细胞活化能力，并能促进细胞因子的释放发挥抗肿瘤效应。
实施例6本申请抗原结合蛋白m3s193 BsAb介导的T细胞增殖和细胞间黏附
T细胞增殖
为了验证T细胞型双特异性抗体能够促进T细胞的增殖，增加T细胞的比例进一步放大其杀伤活性，我们通过流式细胞仪检测Lewis Y单抗和抗原结合蛋白对T细胞增殖的能力。方法如下：huPBMCs用终浓度1μM的CFSE染料进行标记，标记好的huPBMCs按照10:1的比例与NCI-N87共孵育(方法同2.5)，抗体的终浓度为100ng/mL。赋予结束后，取出细胞并用鼠抗人CD3 APC-labeled(Sino Biological)的抗体于4℃冰箱中避光孵育30分钟，再用流式细胞仪分析CD3+T的增殖比例(即计算低荧光强度的细胞比例)。
m3s193 BsAb介导的细胞黏附
此外，我们还比较了Lewis Y单抗和抗原结合蛋白介导细胞黏附的能力，在体外条件下，由于Jurkat细胞表达CD3，因此，我们选择Jurkat细胞代替T细胞来评估抗体介导的细胞黏附。方法如下：Lewis Y阳性的NCI-N87细胞用CellTrace CFSE(Invitrogen)染料进行标记(终浓度0.5μM)。CD3阳性的Jurkat细胞用PKH26标记试剂盒(Sigma；PKH26GL)根据说明书进行标记，将两种标记好的细胞(1×106/mL)等比例混匀，再加入不同浓度的抗体药物10，100和1,000ng/mL，在4℃冰箱中避光孵育30分钟。孵育结束后用流式细胞仪进行检测，细胞黏附的比例通过统计流式直方图中右上方的双阳性细胞的比例获得，即CFSE+PKH26+双阳性占所有细胞的比例。
结果如图7A所示，在第一天时，m3s93 mAb和m3S193 BsAb对T细胞都具有较弱的增殖能力，T细胞的增殖比例不到2％。但从第二天开始，m3S193 BsAb组的T细胞增殖比例逐步上升，达到10％，而m3s93 mAb仍然不到2％。到第三天时，m3s193 BsAb组的T细胞增殖比例已经达到25％，而m3s93 mAb组只有2％-3％。到第四天时，m3s193 BsAb组已经达到近40％的增殖比例，而m3s93 mAb组只有5％左右。这些数据表明，在共孵育肿瘤细胞和huPBMCs两天后，m3s193 BsAb就能促进T细胞的增殖，且随着孵育时间的增加，增殖的T细胞逐步变多，而m3s93 mAb促进T细胞增殖的能力较弱。
如图7B所示，随着剂量的提高(10，100，1,000ng/mL)，m3s193 BsAb介导的细胞间黏附比例逐步提高，从5％-15％。而m3s193 mAb随着剂量的提高，并不能增强细胞间的黏附比例，和不给药组的比例相近。这些结果表明，IgG-[L]-scFv结构的Lewis Y抗原结合蛋白能够介导细胞间的黏附，进而具备募集T细胞的能力。因此，m3s193 BsAb可以作为T细胞连接器将T细胞和肿瘤靶细胞相连接进而引发机体的免疫反应。
实施例7 m3s193 BsAb抗体介导较强的动物体内抗肿瘤活性
本实施例进一步选择胃癌细胞株NCI-N87用于动物体内药效的评估。
预防型动物模型药效评估
北京维通利华公司购买的6-8周雌性NOD/SCID小鼠，在上海交通大学动物实验中心药学院分中心SPF级饲养条件下饲养。首先我们对NOD/SCID小鼠按照1:3的效靶比接种NCI-N87和huPBMCs混合细胞悬液，并进行抗体药物的治疗。共分为5组，分别为PBS组，m3s193 mAb(20μg/只)组及三个剂量的m3s193 BsAb组(0.8，4，20μg/只)，每组五只小鼠。胃癌细胞NCI-N87接种量为5×106个细胞，新鲜分离的huPBMCs按照效靶比(E:T)1:3的比例混合进肿瘤细胞悬液中，在小鼠右侧腋下皮下注射0.1mL混合细胞悬液。接种当天，尾静脉注射0.2mL低(0.8μg/只)、中(4μg/只)、高(20μg/只)三个剂量的抗体药物或者无菌PBS，一周两次给药，一周两次测量小鼠肿瘤生长大小，并绘制肿瘤生长折线图。
如图8所示，PBS组小鼠体内肿瘤逐步生长，m3s193 mAb组的肿瘤也逐步生长，但生长趋势只比PBS组稍微缓慢一些。而m3s193 BsAb组的三个不同剂量，低剂量组的肿瘤生长速度明显慢于m3s193 mAb，且随着剂量的提高，肿瘤的生长速度更缓慢。通过图9可以更加显著地观察到各组之间的差异。m3s193 mAb在高剂量(20μg/只)下不能影响肿瘤的生长，和PBS组之间没有显著性(p>0.05)。但低剂量(0.8μg/只)m3s193 BsAb组的肿瘤生长曲线和PBS组具有显著性差异(p<0.05)，当进一步提高m3s193 BsAb剂量至中剂量(4μg/只)时，其肿瘤生长曲线的显著性更大，与PBS组及m3s193 mAb组的p值都小于0.01。当使用高剂量(20μg/只)的m3s193 BsAb时(和m3s193 mAb相同剂量)，其与PBS组的显著性进一步提高(p<0.001)，与m3s193 mAb显著性维持不变(p<0.01)。通过比较试验结束后小鼠体内的瘤块大小(图10)，发现和肿瘤生长曲线相似的结果，即m3s193 BsAb具有抗肿瘤活性，能够抑制小鼠体内胃癌肿瘤的生长，而m3s193 mAb不具有抗肿瘤活性。此外，通过监测小鼠的体重，5组小鼠之间的体重并没有显著性差异，这表明，IgG-[L]-scFv结构的Lewis Y抗原结合蛋白没有明显的毒副作用(图11)。而瘤块的重量也进一步说明了m3s193 BsAb具有更强的抗肿瘤活性(图12)。
治疗型动物模型药效评估
预防型动物模型已经显示出在人为将huPBMCs强制浸润到肿瘤内后，m3s193 BsAb具有很强的抗肿瘤活性，而m3s193 mAb基本不具有抗肿瘤活性。为了进一步确定在没有强制浸润huPBMCs时m3s193 BsAb是否仍具有抗肿瘤活性。我们设计了治疗型动物模型实验，先将胃癌细胞NCI-N87注射到NOG小鼠皮下，接种量为5×106个细胞，待肿瘤生长至100mm3时(约3天)，再通过尾静脉注射huPBMCs并于三天后再进行药物的治疗，每只小鼠尾静脉注射100μg抗原结合蛋白m3s193 BsAb或者0.2mL PBS作为对照组，给药周期为每隔两天给一次药，并测量小鼠肿瘤大小绘制生长折线图。
如图13A所示，首先我们检测了huPBMCs在小鼠体内的重建情况，通过流式分析小鼠外周血中人CD45阳性细胞的含量，我们发现两组共16只小鼠的外周血中都检测到人CD45阳性细胞，这表明，huPBMCs在所有小鼠体内重构成功。
首先比较两组实验中每只小鼠的肿瘤生长折线图(图13B)，PBS组中每只小鼠的肿瘤呈现正常生长的趋势，而m3s193 BsAb组中的每只小鼠的肿瘤生长折线图呈现先上升后下降的趋势，这表明，随着huPBMCs在小鼠体内重构的成功，以及药物的治疗，m3s193 BsAb能够消除小鼠体内已经存在的肿瘤块。图13C也可以更明显地观察到两组之间肿瘤生长的差异。图13D和13E分别是两组实验的肿瘤块大小及肿瘤块体重，也可以更直观地反映出靶向Lewis Y的T细胞抗原结合蛋白(m3s193 BsAb)能够缩小小鼠体内的肿瘤块，甚至可能清除掉小鼠体内的肿瘤细胞。通过治疗型动物实验，m3s193 BsAb能够介导外周血中的huPBMCs对肿瘤细胞的杀伤，具有非常有效的抗肿瘤活性。
实施例8人源化的Lewis抗体h3s193用于制备双特异性抗体
根据实施例1的方法制备人源化的Lewis抗体h3s193的IgG-[L]-scFv双特异性抗体(称为h3s193 BsAb)，分离纯化，检测h3s193 BsAb的体外活性。
首先我们评估了两种Lewis Y序列来源的靶向Lewis Y的T细胞双特异性抗体的细胞结合能力(图14A)。结果表明m3s193 BsAb和h3s193 BsAb一样，均具有与MDA-MB-231细胞结合能力，其EC50值分别为3422ng/mL(17.11nM)，102190ng/mL(510.9nM)。此外，两种抗原结合蛋白对MDA-MB-231细胞具有结合丰度，m3s193 BsAb的最高剂量的中位荧光强度(Median FITC-A)接近33000，而h3s193 BsAb为15000。初步的细胞结合实验表明h3s193BsAb也具有靶细胞结合活性，但其对靶细胞的结合能力弱于m3s193 BsAb。
为进一步评估两种抗原结合蛋白介导的细胞毒性，我们采用人PBMCs与MDA-MB-231细胞和两种抗原结合蛋白共孵育，通过细胞毒性检测试剂盒检测两种抗原结合蛋白的杀伤活性。如图14B所示，m3s193 BsAb介导的体外效应细胞杀伤的EC50值为23.98ng/mL，h3s193BsAb为155.9ng/mL。这表明h3s193 BsAb和m3s193 BsAb均能够介导人PBMCs杀伤肿瘤细胞，且m3s193 BsAb具有更优越的细胞杀伤活性。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
杰库（上海）生物医药研究有限公司
杰科（天津）生物医药有限公司
<120> 分离的抗原结合蛋白及其应用
<130> 0093-PA-015
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 mAb重链核苷酸序列
<400> 1
atgggttgga gcctcatctt gctcttcctt gtcgctgttg ctacgcgtgt ccactccgag 60
gtgaagctgg tggagtctgg aggaggactg gtgcagccag gaggaagcct gaagctgtcc 120
tgcgccacct ctggcttcac cttcagcgac tactatatgt actgggtgag acagacccca 180
gagaagcgcc tggagtgggt ggcctacatg tccaacgtgg gcgctatcac cgactatcct 240
gatacagtga agggccggtt caccatctct agggataatg ctaagagcac actgtacctg 300
cagatgagcc ggctgaggtc cgaggacacc gccatgtact attgtgctag aggcacacgc 360
gatggctcct ggtttgccta ttggggccag ggcaccctgg tgacagtgtc tgctgcgtcg 420
acgaaggggc ccagcgtgtg cccgctggcc cccagcagca agagcaccag cggcgggacc 480
gccgccctgg gctgcctcgt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcgtggaac 540
agcggcgcgc tgacgagcgg ggtccacacc ttcccggccg tgctgcagag cagcggcctc 600
tactcgctga gcagcgtggt caccgtgccc agcagcagcc tggggaccca gacgtacatc 660
tgcaacgtga accacaagcc ctcgaacacc aaggtcgaca agaaggtgga gcccaagagc 720
tgcgacaaga cccacacctg cccgccctgc cccgcccccg agctcctggg cgggcccagc 780
gtgttcctgt tcccgcccaa gcccaaggac acgctcatga tcagccgcac ccccgaggtc 840
acctgcgtgg tggtcgacgt gagccacgag gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtc 900
gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagccgcggg aggagcagta caactcgacg 960
taccgcgtcg tgagcgtgct gaccgtcctg caccaggact ggctcaacgg caaggagtac 1020
aagtgcaagg tgagcaacaa ggccctgccc gcgcccatcg agaagaccat cagcaaggcc 1080
aaggggcagc cccgggagcc gcaggtgtac accctgcccc ccagccgcga cgagctcacg 1140
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtg aagggcttct acccctcgga catcgccgtg 1200
gagtgggaga gcaacgggca gccggagaac aactacaaga ccaccccgcc cgtcctcgac 1260
agcgacggca gcttcttcct gtacagcaag ctgacggtgg acaagtcgcg gtggcagcag 1320
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtcatgcac gaggccctcc acaaccacta cacccagaag 1380
agcctgagcc tgagccccgg gtga 1404
<210> 2
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 mAb重链
<400> 2
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Met Ser Asn Val Gly Ala Ile Thr Asp Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Arg Asp Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Cys
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 3
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 重链恒定区
<400> 3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Cys Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 mAb VH
<400> 4
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Met Ser Asn Val Gly Ala Ile Thr Asp Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Arg Asp Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Lewis Y HCDR1
<400> 5
Asp Tyr Tyr Met Tyr
1 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Lewis Y HCDR2
<400> 6
Tyr Met Ser Asn Val Gly Ala Ile Thr Asp Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Lewis Y HCDR3
<400> 7
Gly Thr Arg Asp Gly Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 H-FR1
<400> 8
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 H-FR2
<400> 9
Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 10
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 H-FR3
<400> 10
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 H-FR4
<400> 11
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 12
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 mAb轻链核苷酸序列
<400> 12
atgggttgga gcctcatctt gctcttcctt gtcgctgttg ctacgcgtgt ccactccgac 60
gtgctgatga cccagacacc actgtccctg cccgtgagcc tgggcgatca ggcctctatc 120
agctgccgga gctcccagag gatcgtgcac tccaacggca atacctacct ggagtggtat 180
ctgcagaagc caggccagtc tcccaagctg ctgatctaca aggtgagcaa cagattctcc 240
ggcgtgcctg accgcttttc cggctctggc agcggcaccg atttcacact gaagatctcc 300
agggtggagg ctgaggacct gggcgtgtac tattgttttc agggctctca cgtgcccttc 360
acctttggca gcggcacaaa gctggagatc aagagaaccg tggccgcccc cagcgtcttc 420
atcttcccgc cctgcgacga gcagctgaag tcgggcacgg ccagcgtggt gtgcctcctg 480
aacaacttct acccccgcga ggcgaaggtc cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 540
gggaacagcc aggagagcgt gaccgagcag gactcgaagg acagcaccta cagcctcagc 600
agcaccctga cgctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtctacgc ctgcgaggtg 660
acccaccagg ggctctcgag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgctga 717
<210> 13
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 mAb轻链
<400> 13
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Cys Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 14
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Lewis Y 轻链恒定区
<400> 14
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Cys Asp Glu Gln Leu Lys
1 5 10 15
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
20 25 30
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
35 40 45
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
65 70 75 80
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
85 90 95
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100
<210> 15
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 mAb VL
<400> 15
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val
115
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Lewis Y LCDR1
<400> 16
Arg Ser Ser Gln Arg Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Lewis Y LCDR2
<400> 17
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Lewis Y LCDR3
<400> 18
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr
1 5
<210> 19
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 L-FR1
<400> 19
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 L-FR2
<400> 20
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 21
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 L-FR3
<400> 21
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 L-FR4
<400> 22
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val
1 5 10
<210> 23
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 BsAb第一多肽链核苷酸序列
<400> 23
atgggttgga gcctcatctt gctcttcctt gtcgctgttg ctacgcgtgt ccactccgag 60
gtgaagctgg tggagtctgg aggaggactg gtgcagccag gaggaagcct gaagctgtcc 120
tgcgccacct ctggcttcac cttcagcgac tactatatgt actgggtgag acagacccca 180
gagaagcgcc tggagtgggt ggcctacatg tccaacgtgg gcgctatcac cgactatcct 240
gatacagtga agggccggtt caccatctct agggataatg ctaagagcac actgtacctg 300
cagatgagcc ggctgaggtc cgaggacacc gccatgtact attgtgctag aggcacacgc 360
gatggctcct ggtttgccta ttggggccag ggcaccctgg tgacagtgtc tgctgcgtcg 420
acgaaggggc ccagcgtgtg cccgctggcc cccagcagca agagcaccag cggcgggacc 480
gccgccctgg gctgcctcgt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcgtggaac 540
agcggcgcgc tgacgagcgg ggtccacacc ttcccggccg tgctgcagag cagcggcctc 600
tactcgctga gcagcgtggt caccgtgccc agcagcagcc tggggaccca gacgtacatc 660
tgcaacgtga accacaagcc ctcgaacacc aaggtcgaca agaaggtgga gcccaagagc 720
tgcgacaaga cccacacctg cccgccctgc cccgcccccg aggccgccgg cgggcccagc 780
gtgttcctgt tcccgcccaa gcccaaggac acgctcatga tcagccgcac ccccgaggtc 840
acctgcgtgg tggtcgacgt gagccacgag gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtc 900
gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagccgcggg aggagcagta caactcgacg 960
taccgcgtcg tgagcgtgct gaccgtcctg caccaggact ggctcaacgg caaggagtac 1020
aagtgcaagg tgagcaacaa ggccctgggc gcgcccatcg agaagaccat cagcaaggcc 1080
aaggggcagc cccgggagcc gcaggtgtac accctgcccc ccagccgcga cgagctcacg 1140
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtg aagggcttct acccctcgga catcgccgtg 1200
gagtgggaga gcaacgggca gccggagaac aactacaaga ccaccccgcc cgtcctcgac 1260
agcgacggca gcttcttcct gtacagcaag ctgacggtgg acaagtcgcg gtggcagcag 1320
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtcatgcac gaggccctcc acaaccacta cacccagaag 1380
agcctgagcc tgagccccgg gtga 1404
<210> 24
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 BsAb第一多肽链
<400> 24
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Met Ser Asn Val Gly Ala Ile Thr Asp Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Arg Asp Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Cys
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 25
<211> 1530
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 BsAb第二多肽链核苷酸序列
<400> 25
atgggttgga gcctcatctt gctcttcctt gtcgctgttg ctacgcgtgt ccactccgac 60
gtgctgatga cccagacacc actgtccctg cccgtgagcc tgggcgatca ggcctctatc 120
agctgccgga gctcccagag gatcgtgcac tccaacggca atacctacct ggagtggtat 180
ctgcagaagc caggccagtc tcccaagctg ctgatctaca aggtgagcaa cagattctcc 240
ggcgtgcctg accgcttttc cggctctggc agcggcaccg atttcacact gaagatctcc 300
agggtggagg ctgaggacct gggcgtgtac tattgttttc agggctctca cgtgcccttc 360
acctttggca gcggcacaaa gctggagatc aagagaaccg tggccgcccc cagcgtcttc 420
atcttcccgc cctgcgacga gcagctgaag tcgggcacgg ccagcgtggt gtgcctcctg 480
aacaacttct acccccgcga ggcgaaggtc cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 540
gggaacagcc aggagagcgt gaccgagcag gactcgaagg acagcaccta cagcctcagc 600
agcaccctga cgctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtctacgc ctgcgaggtg 660
acccaccagg ggctctcgag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgcggagga 720
ggaggcagcg gaggaggcgg aagcggagga ggaggaagcc aggtgcagct ggtgcagtct 780
gggggaggcg tggtccagcc tgggaggtcc ctgagactct cctgtaaggc ttctggctac 840
acctttacta ggtacacgat gcactgggtc cgccaggctc caggcaagtg cctggagtgg 900
attggataca ttaatcctag ccgtggttat actaattaca atcagaagtt caaggaccga 960
ttcaccatct ccagagacaa ctccaagaac acggcgtttc tgcaaatgga cagcctgaga 1020
cccgaggaca cgggtgtgta tttctgtgcg agatattatg atgatcatta ctgtcttgac 1080
tactggggcc aaggcacccc tgtcacagtc tcctcaggcg gaggcggatc tggcggagga 1140
ggatctggcg gcggcggatc tggaggcgga ggatctggag gaggcggcag cggaggcgga 1200
ggttctgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 1260
gtcaccatca cttgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgaactggta tcagcagacc 1320
ccagggaaag cccctaagcg ctggatctac gacacatcca aactggcttc tggggtccca 1380
tcaaggttca gtggaagtgg atctgggaca gattatactt tcaccatcag cagcctgcag 1440
cctgaagata ttgcaacata ttactgtcag cagtggagta gtaacccatt cacgtttggc 1500
tgtggtacca aactgcagat tacccgctga 1530
<210> 26
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m3s193 BsAb第二多肽链
<400> 26
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Cys Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser
275 280 285
Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile
290 295 300
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu
305 310 315 320
Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp
325 330 335
His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser
340 345 350
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
355 360 365
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
370 375 380
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
385 390 395 400
Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
405 410 415
Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp
420 425 430
Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
435 440 445
Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
450 455 460
Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe
465 470 475 480
Gly Cys Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg
485 490
<210> 27
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3 scFv（VH-VL）
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
145 150 155 160
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser
165 170 175
Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro
180 185 190
Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser
195 200 205
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser
210 215 220
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser
225 230 235 240
Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg
245 250 255
<210> 28
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> huOKT3 VH
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> huOKT3 HCDR1
<400> 29
Arg Tyr Thr Met His
1 5
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> huOKT3 HCDR2
<400> 30
Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> huOKT3 HCDR3
<400> 31
Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 32
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> huOKT3 H-FR1
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 33
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> huOKT3 H-FR2
<400> 33
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 34
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> huOKT3 H-FR3
<400> 34
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln
1 5 10 15
Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> huOKT3 h3s193 H-FR4
<400> 35
Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> huOKT3 LCDR1
<400> 36
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> huOKT3 LCDR2
<400> 37
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> huOKT3 LCDR3
<400> 38
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
1 5
<210> 39
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3s193 huOKT3 L-FR1
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> huOKT3 L-FR2
<400> 40
Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 41
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> huOKT3 L-FR3
<400> 41
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> huOKT3 L-FR4
<400> 42
Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg
1 5 10
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> huOKT3 VL
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg
100 105
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> (G4S)3
<400> 44
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 45
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> (G4S)6
<400> 45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 46
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3s193 BsAb重链核苷酸序列
<400> 46
atgggttgga gcctcatctt gctcttcctt gtcgctgttg ctacgcgtgt ccactccgag 60
gtgcagctgg tggagtccgg aggaggagtg gtgcagccag gccggtctct gagactgtct 120
tgcagcacct ccggcttcac attttctgac tactatatgt actgggtgag gcaggcacca 180
ggcaagggac tggagtgggt ggcctacatg agcaacgtgg gcgccatcac cgactatcct 240
gatacagtga agggccggtt caccatctct agagacaaca gcaagaatac actgtttctg 300
cagatggaca gcctgagacc agaggatacc ggcgtgtact tctgtgccag gggcacacgc 360
gatggctcct ggtttgccta ttggggccag ggcacccccg tgacagtgag ctccgcgtcg 420
acgaaggggc ccagcgtgtg cccgctggcc cccagcagca agagcaccag cggcgggacc 480
gccgccctgg gctgcctcgt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcgtggaac 540
agcggcgcgc tgacgagcgg ggtccacacc ttcccggccg tgctgcagag cagcggcctc 600
tactcgctga gcagcgtggt caccgtgccc agcagcagcc tggggaccca gacgtacatc 660
tgcaacgtga accacaagcc ctcgaacacc aaggtcgaca agaaggtgga gcccaagagc 720
tgcgacaaga cccacacctg cccgccctgc cccgcccccg aggccgccgg cgggcccagc 780
gtgttcctgt tcccgcccaa gcccaaggac acgctcatga tcagccgcac ccccgaggtc 840
acctgcgtgg tggtcgacgt gagccacgag gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtc 900
gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagccgcggg aggagcagta caactcgacg 960
taccgcgtcg tgagcgtgct gaccgtcctg caccaggact ggctcaacgg caaggagtac 1020
aagtgcaagg tgagcaacaa ggccctgggc gcgcccatcg agaagaccat cagcaaggcc 1080
aaggggcagc cccgggagcc gcaggtgtac accctgcccc ccagccgcga cgagctcacg 1140
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtg aagggcttct acccctcgga catcgccgtg 1200
gagtgggaga gcaacgggca gccggagaac aactacaaga ccaccccgcc cgtcctcgac 1260
agcgacggca gcttcttcct gtacagcaag ctgacggtgg acaagtcgcg gtggcagcag 1320
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtcatgcac gaggccctcc acaaccacta cacccagaag 1380
agcctgagcc tgagccccgg gtga 1404
<210> 47
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3s193 BsAb重链
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Met Ser Asn Val Gly Ala Ile Thr Asp Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Arg Asp Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Cys
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 48
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3s193 重链恒定区
<400> 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Cys Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 49
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3s193 VH
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Met Ser Asn Val Gly Ala Ile Thr Asp Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Arg Asp Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3s193 H-FR1
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3s193 H-FR2
<400> 51
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 52
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3s193 H-FR3
<400> 52
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln
1 5 10 15
Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 53
<211> 1530
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3s193 BsAb轻链核苷酸序列
<400> 53
atgggttgga gcctcatctt gctcttcctt gtcgctgttg ctacgcgtgt ccactccgac 60
atccagatga cacagtctcc tagctccctg agcgcctccg tgggcgatag ggtgaccatc 120
acatgccggt ctagccagag aatcgtgcac tccaacggca atacatacct ggagtggtat 180
cagcagaccc ccggcaaggc ccctaagctg ctgatctaca aggtgtctaa caggttcagc 240
ggagtgccat cccgcttttc tggcagcggc tccggcacag acttcacctt tacaatctcc 300
tctctgcagc cagaggatat cgccacctac tattgtttcc agggcagcca cgtgcccttc 360
acctttggcc agggcacaaa gctgcagatc accagaaccg tggccgcccc cagcgtcttc 420
atcttcccgc cctgcgacga gcagctgaag tcgggcacgg ccagcgtggt gtgcctcctg 480
aacaacttct acccccgcga ggcgaaggtc cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 540
gggaacagcc aggagagcgt gaccgagcag gactcgaagg acagcaccta cagcctcagc 600
agcaccctga cgctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtctacgc ctgcgaggtg 660
acccaccagg ggctctcgag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgcggagga 720
ggaggcagcg gaggaggcgg aagcggagga ggaggaagcc aggtgcagct ggtgcagtct 780
gggggaggcg tggtccagcc tgggaggtcc ctgagactct cctgtaaggc ttctggctac 840
acctttacta ggtacacgat gcactgggtc cgccaggctc caggcaagtg cctggagtgg 900
attggataca ttaatcctag ccgtggttat actaattaca atcagaagtt caaggaccga 960
ttcaccatct ccagagacaa ctccaagaac acggcgtttc tgcaaatgga cagcctgaga 1020
cccgaggaca cgggtgtgta tttctgtgcg agatattatg atgatcatta ctgtcttgac 1080
tactggggcc aaggcacccc tgtcacagtc tcctcaggcg gaggcggatc tggcggagga 1140
ggatctggcg gcggcggatc tggaggcgga ggatctggag gaggcggcag cggaggcgga 1200
ggttctgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 1260
gtcaccatca cttgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgaactggta tcagcagacc 1320
ccagggaaag cccctaagcg ctggatctac gacacatcca aactggcttc tggggtccca 1380
tcaaggttca gtggaagtgg atctgggaca gattatactt tcaccatcag cagcctgcag 1440
cctgaagata ttgcaacata ttactgtcag cagtggagta gtaacccatt cacgtttggc 1500
tgtggtacca aactgcagat tacccgctga 1530
<210> 54
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3s193 BsAb轻链
<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Cys Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser
245 250 255
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
260 265 270
Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr
275 280 285
Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
290 295 300
Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu
305 310 315 320
Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys
325 330 335
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
370 375 380
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
385 390 395 400
Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln
405 410 415
Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys
420 425 430
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
435 440 445
Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr
450 455 460
Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly
465 470 475 480
Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg
485
<210> 55
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3s193 VL
<400> 55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
100 105 110
<210> 56
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3s193 L-FR2
<400> 56
Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 57
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3s193 L-FR3
<400> 57
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3s193 L-FR4
<400> 58
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
1 5 10
<210> 59
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3s193 mAb轻链
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Cys Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 60
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 信号肽
<400> 60
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
1 5 10 15
Val His Ser

Claims (6)

1.分离的抗原结合蛋白，其包含第一靶向部分和第二靶向部分，所述第一靶向部分包含特异性结合Lewis Y的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一靶向部分包含抗体重链可变区VH，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述HCDR1为SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列，所述HCDR2为SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列，且所述HCDR3为SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列，其中所述第一靶向部分包含抗体轻链可变区VL，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1为SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列，所述LCDR2为SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，且所述LCDR3为SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列，所述第二靶向部分包含特异性结合CD3蛋白的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二靶向部分包含抗体重链可变区VH，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1为SEQ ID NO: 29所示的氨基酸序列，所述HCDR2为SEQ ID NO: 30所示的氨基酸序列，且所述HCDR3为SEQ ID NO: 31所示的氨基酸序列，其中所述第二靶向部分包含抗体轻链可变区VL，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，且所述LCDR1为SEQ ID NO: 36所示的氨基酸序列，所述LCDR2为SEQ ID NO: 37所示的氨基酸序列，且所述LCDR3为SEQ ID NO: 38所示的氨基酸序列，其中所述第二靶向部分位于所述第一靶向部分的C端。
2.根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含所述第一靶向部分的VH，且所述第二多肽链包含所述第一靶向部分的VL、所述第二靶向部分的VH和所述第二靶向部分的VL。
3.根据权利要求2所述的抗原结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQ ID NO: 2、24和47中任一项所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求2-3中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二多肽链包含SEQ IDNO: 26或54所示的氨基酸序列。
5.药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的抗原结合蛋白，以及任选地药学上可接受的载剂。
6.权利要求1-4中任一项所述的抗原结合蛋白和/或权利要求5所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗胃癌。
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