JP2021520812A - 制約されたｃｄ３結合を有する多重特異性ポリペプチド構築物ならびに関連する方法および使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は概して、制約されたCD3結合を有する多重特異性ポリペプチドに関する。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチドの成分は、非切断可能リンカーによって接続されている。これらの多重特異性ポリペプチドを作製し、多様な治療的適用、診断的適用、および予防的適用において使用する方法も、提供される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、「制約されたCD3結合を有する多重特異性ポリペプチド構築物ならびに関連する方法および使用（MULTISPECIFIC POLYPEPTIDE CONSTRUCTS HAVING CONSTRAINED CD3 BINDING AND RELATED METHODS AND USES）」という名称の2018年4月11日に出願された米国仮出願第62/656,331号に基づく優先権を主張するものであり、その内容は、参照によって事実上その全体が組み入れられる。
配列表の参照による組み入れ
本願は、電子フォーマットで配列表と共に提出される。配列表は、212キロバイトのサイズの2019年4月10日に作成された744952000240SeqList.TXTという名称のファイルとして提供される。配列表の電子フォーマットでの情報は、参照によってその全体が組み入れられる。
分野
本発明は、制約されたCD3結合を有する多重特異性ポリペプチドに一般に関する。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチドの成分は、非切断可能リンカーによって接続されている。これらの多重特異性ポリペプチドを作製し、多様な治療的適用、診断的適用、および予防的適用において使用する方法も、提供される。
背景
標的細胞枯渇を引き起こす治療用抗体は、一般に、Fcγ受容体（FcγR）および補体タンパク質との相互作用を介して媒介されるエフェクター機能に頼っている。FcγRを発現しているエフェクター細胞は、主に、自然免疫系のものである。T細胞は、抗体によって媒介される標的細胞枯渇に関与する直接エフェクター細胞ではない。
CD3（表面抗原分類3）T細胞共受容体は、ε鎖、γ鎖、δ鎖、およびζ鎖と呼ばれる4種の異なるポリペプチド鎖から構成される多量体タンパク質である。CD3複合体は、T細胞受容体（TCR）の抗原結合a/b鎖と非共有結合的に会合する、T細胞受容体のシグナリングモジュールとして役立つ。
CD3の直接係合はT細胞活性化をもたらすため、多様な治療的適用および/または診断的適用のための望ましい標的である。従って、CD3/TCR経路を標的とする抗体および治療薬が必要とされている。
概要
本開示は、制約されたCD3結合を示す多重特異性ポリペプチド構築物を提供する。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、免疫グロブリンFc領域を含む第1の成分およびCD3結合領域を含む第2の成分から構成され、ここで、第1および第2の成分は、非切断可能リンカーのようなリンカーによってカップリングされており、Fc領域は、CD3結合領域に対してN末端側に位置付けられており；第1および第2の成分の一方または両方は、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、CD3結合領域は、CD3（CD3ε）に結合する。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。いくつかの態様において、第1の成分は、第1の抗原結合ドメインを含み、第2の成分は、第2の抗原結合ドメインを含み、ここで、抗原結合ドメインの各々は、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する。いくつかのケースにおいて、第1の抗原結合ドメインは、多重特異性構築物のアミノ末端に位置付けられており、第2の抗原結合ドメインは、多重特異性構築物のカルボキシ末端に位置付けられている。いくつかの態様において、第1の抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。提供された多重特異性ポリペプチド構築物の具体的な態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。
N末端からC末端へ順に、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第1の抗原結合ドメイン；免疫グロブリンFc領域；非切断可能リンカーのようなリンカー；CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第2の抗原結合ドメインを含む多重特異性ポリペプチド構築物が、本明細書中に提供される。N末端からC末端へ順に、免疫グロブリンFc領域；非切断可能リンカーのようなリンカー；CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性ポリペプチド構築物も、提供される。N末端からC末端へ順に、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメイン；免疫グロブリンFc領域；非切断可能リンカーのようなリンカー；およびCD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域を含む多重特異性ポリペプチド構築物が、提供される。
提供された態様のいくつかにおいて、リンカーは、非切断可能リンカーである。いくつかの態様において、リンカーは、プロテアーゼによる切断に特異的な基質認識部位を含有していないリンカーである。
提供された態様のいくつかにおいて、CD3結合領域のN末端側にFc領域を位置付けることは、CD3結合領域のCD3と結合する能力を低下させるかまたは防止する。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物の第1の成分（成分＃1）および第2の成分（成分＃2）は、連結されており、抗原結合ドメインがその同族抗原と結合しない限り、CD3との結合は許可されない。いくつかの態様において、成分＃1は、少なくとも1個の抗原結合ドメインおよびFc領域を含有している。いくつかの態様において、成分＃2は、CD3結合領域および抗原結合ドメインを少なくとも含有しており、前者は、（多重特異性構築物が、成分＃1または成分＃2の抗原結合ドメインによって認識される抗原に結合した時に）CD3に結合することができる。従って、記載されたようなCD3結合領域のFc領域との連結は、抗原結合ドメインがその同族抗原と結合しない限り、多重特異性ポリペプチド構築物が、CD3と結合せず、その他の方法でも係合しないことを確実にする。これは、CD3結合領域のT細胞との全身性の結合を防止し、CD3結合領域の結合能を抗原発現の部位に集中させるため、有利である。これは、末梢T細胞の主要な結合シンクを縮小するかまたは排除し、抗原発現の部位、例えば、腫瘍細胞または腫瘍微小環境へのより好都合な分布および局在を可能にする可能性があるため、有益である。
抗原結合ドメインがその同族抗原と結合した時、多重特異性ポリペプチド構築物は、成分＃2を介して、抗原発現細胞とT細胞との間に免疫シナプスを形成することができる。この同時係合は、抗原依存的なT細胞の活性化、細胞傷害、サイトカイン放出、脱顆粒、および増殖を媒介する。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、FcγRと相互作用し、自然免疫エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ADCC）および抗体依存性細胞貪食（ADCP）を媒介することができる。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、補体タンパク質、即ち、C1qと相互作用し、補体依存性細胞傷害を媒介することができる。
いくつかの態様において、提供された多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメインによって認識される同族抗原は、腫瘍関連抗原（TAA）である。
従って、提供された態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、免疫グロブリンFc領域を含む第1の成分およびCD3結合領域を含む第2の成分から構成され、ここで、第1および第2の成分は、非切断可能リンカーのようなリンカーによってカップリングされており、Fc領域は、CD3結合領域のN末端側に位置付けられており；第1および第2の成分の一方または両方は、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、CD3結合領域は、CD3（CD3ε）に結合する。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。いくつかの態様において、第1の成分は、第1の抗原結合ドメインを含み、第2の成分は、第2の抗原結合ドメインを含み、ここで、抗原結合ドメインの各々は、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する。いくつかのケースにおいて、第1の抗原結合ドメインは、多重特異性構築物のアミノ末端に位置付けられており、第2の抗原結合ドメインは、多重特異性構築物のカルボキシ末端に位置付けられている。いくつかの態様において、第1の抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。提供された多重特異性ポリペプチド構築物の具体的な態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。
いくつかの態様において、CD3結合領域は、抗体または抗原結合断片である。具体的な態様において、抗体または抗原結合断片は、可変重鎖（VH）および可変軽鎖（VL）を含有している二本鎖ポリペプチドである。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、Fvである。具体的な態様において、Fvは、VH鎖とVL鎖との間に鎖間ジスルフィド結合を含有している、ジスルフィドによって安定化されたFv（dsFv）である。
免疫グロブリンFc領域を含む第1の成分およびCD3結合領域を含む第2の成分を含む多重特異性ポリペプチド構築物であって、CD3結合領域が、抗CD3抗体、または可変重鎖領域（VH）および可変軽鎖領域（VL）を含むFv抗体断片である抗原結合断片であり；Fcが、第1のFcポリペプチドおよび第2のFcポリペプチドを含むヘテロ二量体Fcであり、抗CD3抗体または抗原結合断片のVHおよびVLが、ヘテロ二量体Fcの対向するポリペプチドに連結されており；第1および第2の成分が、非切断可能リンカーによってカップリングされており、Fc領域が、CD3結合領域のN末端側に位置付けられており；第1の成分が第1の抗原結合ドメインを含み、第2の成分が第2の抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインの各々が腫瘍関連抗原（TAA）に結合する、多重特異性ポリペプチド構築物が、本明細書中に提供される。いくつかの態様において、CD3結合領域は、CD3（CD3ε）に結合する。いくつかの態様において、第1の抗原結合ドメインは、多重特異性構築物のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、第2の抗原結合ドメインは、多重特異性構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。いくつかの態様において、多重特異性構築物は、N末端からC末端へ順に、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第1の抗原結合ドメイン；免疫グロブリンFc領域；非切断可能リンカー；CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第2の抗原結合ドメインを含む。
免疫グロブリンFc領域を含む第1の成分およびCD3結合領域を含む第2の成分を含む多重特異性ポリペプチド構築物であって、CD3結合領域が、抗CD3抗体、または可変重鎖（VH）および可変軽鎖（VL）を含むジスルフィドによって安定化されたFv抗体断片（dsFv）である抗原結合断片であり；Fcが、第1のFcポリペプチドおよび第2のFcポリペプチドを含むヘテロ二量体Fcであり、抗CD3抗体または抗原結合断片のVHおよびVLが、ヘテロ二量体Fcの対向するポリペプチドに連結されており；第1および第2の成分が非切断可能リンカーによってカップリングされており、Fc領域がCD3結合領域のN末端側に位置付けられており；第1および第2の成分の一方または両方が、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む、多重特異性ポリペプチド構築物が、本明細書中に提供される。提供された多重特異性ポリペプチド構築物の具体的な態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。いくつかの態様において、CD3結合領域は、CD3（CD3ε）に結合する。
免疫グロブリンFc領域を含む第1の成分およびCD3結合領域を含む第2の成分を含む多重特異性ポリペプチド構築物であって、CD3結合領域が、抗CD3抗体、または可変重鎖（VH）および可変軽鎖（VL）を含むFv抗体断片である抗原結合断片であり；Fcが、第1のFcポリペプチドおよび第2のFcポリペプチドを含むヘテロ二量体Fcであり、抗CD3抗体または抗原結合断片のVHおよびVLが、ヘテロ二量体Fcの対向するポリペプチドに連結されており；第1および第2の成分が、非切断可能リンカーによってカップリングされており、Fc領域がCD3結合領域のN末端側に位置付けられており；第1および第2の成分の一方または両方が、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインがsdAbまたはscFvのような単鎖抗体断片である、多重特異性ポリペプチド構築物が、本明細書中に提供される。提供された多重特異性ポリペプチド構築物の具体的な態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。いくつかの態様において、CD3結合領域は、CD3（CD3ε）に結合する。
本明細書中に提供された態様において、多重特異性構築物は、N末端からC末端へ順に、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第1の抗原結合ドメイン；免疫グロブリンFc領域；非切断可能リンカー；CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第2の抗原結合ドメインを含む。
本明細書中に提供された態様において、多重特異性構築物は、N末端からC末端へ順に、免疫グロブリンFc領域；非切断可能リンカー；CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む。
本明細書中に提供された態様において、多重特異性構築物は、N末端からC末端へ順に、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメイン；免疫グロブリンFc領域；非切断可能リンカー；およびCD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域を含む。
N末端からC末端へ順に、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第1の抗原結合ドメイン；免疫グロブリンFc領域；非切断可能リンカーのようなリンカー；CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第2の抗原結合ドメインを含む多重特異性ポリペプチド構築物が、本明細書中に提供される。N末端からC末端へ順に、免疫グロブリンFc領域；非切断可能リンカーのようなリンカー；CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性ポリペプチド構築物も、提供される。N末端からC末端へ順に、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメイン；免疫グロブリンFc領域；非切断可能リンカーのようなリンカー；およびCD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域を含む多重特異性ポリペプチド構築物が、提供される。
いくつかの局面において、抗原結合ドメインは、または抗原結合ドメインの各々は独立に、抗体もしくは抗原結合断片、天然同族結合パートナー、アンチカリン（Anticalin）（改変されたリポカリン）、ダーピン（Darpin）、フィノマー（Fynomer）、センチリン（Centyrin）（改変されたフィブロネクチンIIIドメイン）、シスチンノットドメイン、アフィリン（Affilin）、アフィボディ（Affibody）、または改変されたCH3ドメインより選択される。いくつかの態様において、天然同族結合パートナーには、TAAのネイティブ同族結合パートナーの細胞外ドメインもしくはその結合断片、またはTAAとの結合活性を示すそれらのバリアントが含まれる。
いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、Fab断片、F(ab')2断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、1種または複数種のシングルドメイン抗体（sdAb）断片、例えば、VHH、VNAR、改変されたVHドメイン、または改変されたVKドメインの1コピーまたは複数コピーを含む。VHHは、ラクダ科動物の重鎖のみの抗体から生成され得る。VNARは、軟骨魚類の重鎖のみの抗体から生成され得る。界面改変および特異的な生殖系列ファミリーの選択を含む様々な方法が、従来のヘテロ二量体VHドメインおよびVKドメインから単量体sdAbを生成するために実施されている。
いくつかの態様において、1個または複数個の抗原結合ドメインは、独立に、腫瘍関連抗原（TAA）である抗原に結合する。いくつかの例において、抗原結合ドメインは、または抗原結合ドメインの各々は独立に、1-92-LFA-3、5T4、α4インテグリン、αVインテグリン、α4β1インテグリン、α4β7インテグリン、AGR2、抗ルイスY、アペリンJ受容体、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補体、C-242、CA9、CA19-9（ルイスa）、炭酸脱水酵素9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132（IL-2RG）、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5（CEA）、CEACAM6（NCA-90）、クローディン3、クローディン4、cMet、コラーゲン、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、エンドセリンB受容体（ETBR）、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSVのFタンパク質、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受容体α（FRα）、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受容体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、ヒアルロニダーゼ、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受容体（FceRI）、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R（wsx1）、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、インスリン受容体、Jaggedリガンド、Jagged1、Jagged2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、ルイスX、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、メソテリン、MRP4、MUC1、ムチン16（MUC16、CA-125）、Na/K ATPアーゼ、NGF、ニカストリン（Nicastrin）、ノッチ受容体、ノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、ノッチ4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、ホスファチジルセリン、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、スフィンゴシン1リン酸、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2、およびWISP-3より選択される腫瘍抗原に結合する。
いくつかの態様において、Fc領域は、ホモ二量体Fc領域である。いくつかの態様において、第1の成分の免疫グロブリンFc領域は、IgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、IgG3アイソタイプ、およびIgG4サブクラスからなる群より選択されるIgGアイソタイプである。いくつかの例において、Fc領域は、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、もしくはヒトIgG4のFc領域であるか、またはそれらの免疫活性断片である。いくつかの態様において、Fc領域は、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:1との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含む。いくつかのケースにおいて、Fc領域は、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含む。そのような態様のいくつかにおいて、Fc領域は、SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:4との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの例において、Fc領域は、SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:5との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの例において、Fc領域は、SEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:6との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO:1〜6からなる群より選択されるアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO:1〜6からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO:1〜6からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
いくつかの態様において、Fc領域は、ヘテロ二量体Fc領域である。
いくつかの態様において、Fc領域は、第1のFcポリペプチドおよび第2のFcポリペプチドを含有しているヘテロ二量体であり、ここで、ヘテロ二量体Fc領域の第1および第2のFcポリペプチドの一方または両方は、ヒトIgG1、ヒトIgG2、またはヒトIgG4のFc領域と比較して、ヘテロ二量体化を誘導するための少なくとも1個の修飾を含むバリアントFcポリペプチドである。いくつかの態様において、少なくとも1個の修飾は、ヒトIgG1のFc領域にあるか、またはそれと比較したものである。いくつかの態様において、少なくとも1個の修飾は、SEQ ID NO:1に示されるFcポリペプチドもしくはその免疫活性断片にあるか、またはそれと比較したものである。いくつかのケースにおいて、ヘテロ二量体Fc領域の一方または両方のFcポリペプチドは、ホモ二量体Fc領域のポリペプチドと比較して、任意で、SEQ ID NO:1に示されるFcポリペプチドまたはその免疫活性断片と比較して、ヘテロ二量体化を誘導するための少なくとも1個の修飾を含む。いくつかの態様において、ヘテロ二量体FcのFcポリペプチドの各々は独立に、少なくとも1個のアミノ酸修飾を含む。いくつかのケースにおいて、少なくとも1個の修飾は、立体的修飾、ノブイントゥホール修飾、ポリペプチドの静電的相補性を増加させるための電荷変異、等電点を変更するための修飾（pIバリアント）、またはそれらの組み合わせより選択される。
いくつかの例において、アミノ酸修飾は、ポリペプチドの静電的相補性を増加させるための電荷変異である。いくつかの態様において、第1および/または第2のFcポリペプチドは、他方のポリペプチドの相補的なアミノ酸と反対の電荷を有するアミノ酸への置換である修飾を、相補的な位置に含む。いくつかの態様において、第1または第2のポリペプチドは、他方のポリペプチドの相補的なアミノ酸と反対の電荷を有するアミノ酸への置換である修飾を、相補的な位置に含む。いくつかの態様において、少なくとも第1または第2のFcポリペプチドは、他方のポリペプチドの相補的なアミノ酸と反対の電荷を有するアミノ酸への置換である修飾を、相補的な位置に各々含む。いくつかの態様において、第1および第2のFcポリペプチドは、他方のポリペプチドの相補的なアミノ酸と反対の電荷を有するアミノ酸への置換である修飾を、相補的な位置に各々含む。
いくつかの例において、アミノ酸修飾は、ノブイントゥホール（knob-into-hole）修飾である。
いくつかの態様において、ヘテロ二量体Fcの第1のFcポリペプチドは、Thr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val、およびそれらの組み合わせより選択される修飾を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のFcポリペプチドは、修飾T366Wを含む。いくつかのケースにおいて、第1および第2のFcポリペプチドは、非システイン残基のシステイン残基への修飾をさらに含み、ここで、第1のポリペプチドの修飾は、位置Ser354およびY349の一方にあり、第2のFcポリペプチドの修飾は、位置Ser354およびY349の他方にある。いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドは、修飾T366W/S354Cを含み、第2のFcポリペプチドは、修飾T366S/L368A/Y407V/Y349Cを含む。いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドは、修飾L368D/K370Sを含み、第2のFcポリペプチドは、修飾S364K/E357Qを含む。
いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドは、修飾L368D/K370Sを含み、第2のFcポリペプチドは、修飾S364K/E357Qを含む。
いくつかの態様において、第1および第2のポリペプチドの少なくとも一方は、修飾Q295E/N384D/Q418E/N421Dを含む。
いくつかの態様において、ヘテロ二量体Fcの第1または第2のFcポリペプチドの一方は、残基Ile253における修飾をさらに含む。いくつかの場合において、修飾は、Ile253Argである。いくつかの態様において、ヘテロ二量体Fcの第1または第2のFcポリペプチドの一方は、残基His435における修飾をさらに含む。いくつかの場合において、修飾は、His435Argである。
いくつかの態様において、第1および/または第2のFcポリペプチドのようなFc領域は、Lys447を欠くポリペプチドを含む。
提供された態様のいくつかにおいて、ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドは、SEQ ID NO:82、86、または201のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドは、SEQ ID NO:83、87、90、92、202、または205のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む。いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドおよび第2のFcポリペプチドは、それぞれSEQ ID NO:82および83；それぞれSEQ ID NO:86および87；それぞれSEQ ID NO:201および202；それぞれSEQ ID NO:82および90；それぞれSEQ ID NO:86および92；ならびにそれぞれSEQ ID NO:201および205からなる群より選択される配列を含む。
いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、1個または複数個の修飾を含む、SEQ ID NO:1〜6からなる群より選択されるアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、グリコシル化を防止するため、Fc受容体相互作用を変更するため、Fc受容体結合を低下させるため、CD32Aとの相互作用を増強するため、補体タンパク質C1q結合を低下させるため、半減期を延長するため、FcRn結合を増強するため、抗体依存性細胞傷害（ADCC）および/または補体依存性細胞傷害（CDC）を変更するため、ヘテロ二量体化を誘導するため、二量体化を防止するため、CH3:CH3界面におけるホモ二量体化を安定化するため、ならびにそれらの組み合わせのための1個または複数個の修飾を含む、SEQ ID NO:1〜6からなる群より選択されるアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
いくつかの態様において、Fc領域内の修飾は、Fcγ受容体との結合を低下させるが、新生児型Fc受容体（FcRn）との結合には最小の影響を及ぼす。いくつかの態様において、変異型または修飾型のFcポリペプチドは、Kabatナンバリングシステムを使用して、以下の変異を含む：Met252TyrおよびMet428LeuまたはMet252TyrおよびMet428Val（M252Y、M428L、またはM252Y、M428V）。
いくつかの態様において、Fc領域は、FcRn結合を増強するための少なくとも1個の修飾を含むポリペプチドを含む。いくつかの例において、修飾は、Met252、Ser254、Thr256、Met428、Asn434、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される位置にある。いくつかのケースにおいて、修飾は、Met252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される位置にある。いくつかの具体的な態様において、修飾は、位置Met252および位置Met428にある。いくつかのケースにおいて、修飾は、Met252YおよびMet428Lである。いくつかのケースにおいて、修飾は、Met252YおよびMet428Vである。
いくつかの態様において、ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドは、SEQ ID NO:94、96、または207のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドは、SEQ ID NO:98、100、または209のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む。いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドおよび第2のFcポリペプチドは、それぞれSEQ ID NO:94および98；それぞれSEQ ID NO:96および100；ならびにそれぞれSEQ ID NO:207および209からなる群より選択される配列を含む。
いくつかの態様において、Fc領域は、FcγR結合を増強するための少なくとも1個の修飾を含むポリペプチドを含む。いくつかのケースにおいて、修飾は、Ser239またはIle332における修飾である。いくつかの態様において、Fc領域のグリコシル化は、未修飾のFc領域と比較して、FcγR結合を増強するために修飾される。いくつかの例において、Fc領域は、フコースを欠くかまたは低下したフコース含量を有する。
いくつかの態様において、Fc領域は、エフェクター機能を低下させ、かつ/またはFcγ受容体もしくはC1qより選択されるエフェクター分子との結合を低下させる少なくとも1個のアミノ酸修飾を含むポリペプチドを含む。いくつかの態様において、1個または複数個のアミノ酸修飾は、Glu233、Leu234、またはLeu235のうちの1個または複数個の欠失である。
いくつかの態様において、ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドは、SEQ ID NO:82、86、94、または96のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドは、SEQ ID NO:83、87、90、92、98、または100のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む。いくつかの態様において、Fc領域は、エフェクター機能を低下させ、かつ/またはFcγ受容体もしくはC1qより選択されるエフェクター分子との結合を低下させる少なくとも1個のアミノ酸修飾を含むポリペプチドを含む。いくつかの例において、1個または複数個のアミノ酸修飾は、Glu233、Leu234、またはLeu235のうちの1個または複数個の欠失である。いくつかの局面において、ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドは、SEQ ID NO:84、88、95、または97のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドは、SEQ ID NO:85、89、91、93、99、または101のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む。
いくつかの態様において、ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドは、SEQ ID NO:84、88、95、97、203、または208のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドは、SEQ ID NO:85、89、91、93、99、101、204、206、または210のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む。いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドおよび第2のFcポリペプチドは、それぞれSEQ ID NO:84および85；それぞれSEQ ID NO:88および89；それぞれSEQ ID NO:203および204；それぞれSEQ ID NO:95および99；それぞれSEQ ID NO:97および101；それぞれSEQ ID NO:208および210；それぞれSEQ ID NO:84および91；それぞれSEQ ID NO:88および93；ならびにそれぞれSEQ ID NO:203および206からなる群より選択される配列を含む。
いくつかの態様において、CD3結合領域は、抗CD3抗体または抗原結合断片である。いくつかの態様において、抗CD3抗体または抗原結合断片は、可変重鎖領域（VH）および可変軽鎖領域（VL）を含む。そのような態様のいくつかにおいて、CD3結合領域は、1価である。
いくつかの態様において、抗CD3抗体または抗原結合断片は、単鎖抗体ではなく、任意で、単鎖可変断片（scFv）ではない。いくつかの態様において、Fcは、ヘテロ二量体Fcであり、抗CD3抗体または抗原結合断片を構成するVHおよびVLは、ヘテロ二量体Fcの対向するポリペプチドに連結されている。
いくつかの態様において、CD3結合領域は、抗原結合ドメインのうちの少なくとも1個がそのTAAに結合しない限り、CD3に結合もしくは係合することができないかまたは実質的にできない。いくつかの局面において、CD3結合領域は、抗原結合ドメインのうちの少なくとも2個がそのTAAに結合しない限り、CD3に結合もしくは係合することができないかまたは実質的にできない。
いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、ポリペプチドリンカーであるリンカーを含有している。いくつかの態様において、リンカーは、25アミノ酸長までのポリペプチドである。いくつかのケースにおいて、リンカーは、2〜24アミノ酸、2〜20アミノ酸、2〜18アミノ酸、2〜14アミノ酸、2〜12アミノ酸、2〜10アミノ酸、2〜8アミノ酸、2〜6アミノ酸、6〜24アミノ酸、6〜20アミノ酸、6〜18アミノ酸、6〜14アミノ酸、6〜12アミノ酸、6〜10アミノ酸、6〜8アミノ酸、8〜24アミノ酸、8〜20アミノ酸、8〜18アミノ酸、8〜14アミノ酸、8〜12アミノ酸、8〜10アミノ酸、10〜24アミノ酸、10〜20アミノ酸、10〜18アミノ酸、10〜14アミノ酸、10〜12アミノ酸、12〜24アミノ酸、12〜20アミノ酸、12〜18アミノ酸、12〜14アミノ酸、14〜24アミノ酸、14〜20アミノ酸、14〜18アミノ酸、18〜24アミノ酸、18〜20アミノ酸、もしくは20〜24アミノ酸のポリペプチド、または約2〜24アミノ酸、約2〜20アミノ酸、約2〜18アミノ酸、約2〜14アミノ酸、約2〜12アミノ酸、約2〜10アミノ酸、約2〜8アミノ酸、約2〜6アミノ酸、約6〜24アミノ酸、約6〜20アミノ酸、約6〜18アミノ酸、約6〜14アミノ酸、約6〜12アミノ酸、約6〜10アミノ酸、約6〜8アミノ酸、約8〜24アミノ酸、約8〜20アミノ酸、約8〜18アミノ酸、約8〜14アミノ酸、約8〜12アミノ酸、約8〜10アミノ酸、約10〜24アミノ酸、約10〜20アミノ酸、約10〜18アミノ酸、約10〜14アミノ酸、約10〜12アミノ酸、約12〜24アミノ酸、約12〜20アミノ酸、約12〜18アミノ酸、約12〜14アミノ酸、約14〜24アミノ酸、約14〜20アミノ酸、約14〜18アミノ酸、約18〜24アミノ酸、約18〜20アミノ酸、もしくは約20〜24アミノ酸のポリペプチドである。いくつかの態様において、リンカーは、3アミノ酸長、4アミノ酸長、5アミノ酸長、6アミノ酸長、7アミノ酸長、8アミノ酸長、9アミノ酸長、10アミノ酸長、11アミノ酸長、12アミノ酸長、13アミノ酸長、14アミノ酸長、15アミノ酸長、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、または20アミノ酸長であるポリペプチドである。
いくつかの態様において、リンカーは、3〜18アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、12〜18アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、15〜18アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、18アミノ酸長である。
いくつかの態様において、非切断可能リンカーは、プロテアーゼによって切断のために特異的に認識される基質認識部位を含有していない。いくつかの態様において、プロテアーゼは、免疫エフェクター細胞によって、腫瘍によって、または腫瘍微小環境に存在する細胞によって産生される。いくつかの態様において、プロテアーゼは、免疫エフェクター細胞によって産生され、免疫エフェクター細胞は、活性化T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、またはNK T細胞である。いくつかの態様において、プロテアーゼは、マトリプターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、グランザイムB、およびそれらの組み合わせより選択される。いくつかの態様において、プロテアーゼは、グランザイムBである。
いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列
Figure 2021520812
およびそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列(GGS)n（nは1〜10である）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列(GGGGS)n（SEQ ID NO:173）（nは1〜10である）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、(GGGGGS)n（SEQ ID NO:172）（nは1〜4である）を含む。
いくつかの態様において、リンカーは、GGSであるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、リンカーは、GGGGS（SEQ ID NO:149）であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、リンカーは、GGGGGS（SEQ ID NO:135）であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、リンカーは、GGSGGS（「(GGS)2」）（SEQ ID NO:10）であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、リンカーは、GGSGGSGGS（「(GGS)3」）（SEQ ID NO:11）であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、リンカーは、GGSGGSGGSGGS（「(GGS)4」）（SEQ ID NO:12）であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、リンカーは、
Figure 2021520812
であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、リンカーは、
Figure 2021520812
であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、リンカーは、
Figure 2021520812
であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、リンカーは、
Figure 2021520812
であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、リンカーは、GGGGG（SEQ ID NO:192）であるか、またはそれを含む。
いくつかの態様において、（いくつかのケースにおいて、第1の抗原結合ドメインである）第1の成分の抗原結合ドメインおよび免疫グロブリンFc領域は、（本明細書中で成分内リンカーと呼ばれる）1個または複数個のさらなるアミノ酸リンカーを介して、機能的に連結されている。（LP1とも呼ばれる）第1の成分の成分内ペプチドリンカーは、セクションII.3に記載される任意のもののようなペプチドリンカーであり得る。第1の成分に存在する、即ち、Fc領域と抗原結合ドメインとを連結する、成分内ペプチドリンカーは、様々な長さ、例えば、5アミノ酸長、6アミノ酸長、7アミノ酸長、8アミノ酸長、9アミノ酸長、10アミノ酸長、11アミノ酸長、12アミノ酸長、13アミノ酸長、14アミノ酸長、15アミノ酸長、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、20アミノ酸長であり得る。いくつかの態様において、これらの成分内リンカーは、アミノ酸グリシンおよびセリンから主に構成され、本明細書中でGSリンカーと呼ばれる。いくつかの態様において、GSリンカーは、
Figure 2021520812
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、（i）ヘテロ二量体Fc領域の第1のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体またはその抗原結合断片のVHドメインを含む第1のポリペプチド；ならびに（ii）ヘテロ二量体Fc領域の第2のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体またはその抗原結合断片のVLドメインを含む第2のポリペプチドを少なくとも含み、ここで、第1および第2のポリペプチドの一方または両方は、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する少なくとも1個の抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、抗CD3抗体または抗原結合断片のVHは、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する少なくとも1個の抗原結合ドメインと同一のポリペプチド上にある。いくつかの態様において、抗CD3抗体または抗原結合断片のVLを含むポリペプチドは、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する少なくとも1個の抗原結合ドメインを含有していない。提供された多重特異性ポリペプチド構築物の具体的な態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。
いくつかの態様において、第2の成分は、CD3結合ドメインの1コピーまたは複数コピーを含む。
いくつかの態様において、抗CD3結合ドメインは、CD3εのようなCD3に結合または係合することができる抗体または抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む抗CD3抗体または抗原結合断片である。いくつかの態様において、抗CD3結合ドメインは、Fab断片、F(ab')2断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。
いくつかの態様において、抗CD3結合ドメインは、（本明細書中で抗CD3ε Fv断片と呼ばれる）CD3εと結合するFv断片を含む。
いくつかの態様において、抗CD3ε Fv抗体断片は、SEQ ID NO:32〜81、191、196〜200、211、および212からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε Fv抗体断片は、SEQ ID NO:32〜81、191、196〜200、211、および212からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε Fv抗体断片は、SEQ ID NO:32〜62、196〜198、および211の群より選択されるアミノ酸配列と、SEQ ID NO:63〜81、191、199、200、および212からなる群より選択されるアミノ酸配列との組み合わせを含む。いくつかの態様において、抗CD3ε Fv抗体断片は、SEQ ID NO:32〜62、196〜198、および211からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列と、SEQ ID NO:63〜81、191、199、200、および212からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列との組み合わせを含む。
いくつかの態様において、抗CD3ε Fv抗体断片は、ジスルフィドによって安定化された抗CD3結合Fv断片（dsFv）である。
いくつかの態様において、第1の成分は、抗原結合ドメインの1コピーまたは複数コピーを含む。ある種の態様において、第1の成分は、2個の抗原結合ドメインのような少なくとも2個の抗原結合ドメインを含有している。いくつかの態様において、第1の成分の少なくとも2個の抗原結合ドメインは、同一のTAAに結合する。いくつかのケースにおいて、第1の成分の少なくとも2個の抗原結合ドメインは、同一のTAAの異なるエピトープに結合する。いくつかの場合において、第1の成分の少なくとも2個の抗原結合ドメインは、同一のTAAの同一のエピトープに結合する。いくつかの態様において、第1の成分の少なくとも2個の抗原結合ドメインは、異なるTAAに結合する。
いくつかの態様において、第2の成分は、抗原結合ドメインの1コピーまたは複数コピーを含む。ある種の態様において、第2の成分は、2個の抗原結合ドメインのような少なくとも2個の抗原結合ドメインを含有している。いくつかの態様において、第2の成分の少なくとも2個の抗原結合ドメインは、同一のTAAに結合する。いくつかのケースにおいて、第2の成分の少なくとも2個の抗原結合ドメインは、同一のTAAの異なるエピトープに結合する。いくつかの場合において、第2の成分の少なくとも2個の抗原結合ドメインは、同一のTAAの同一のエピトープに結合する。いくつかの態様において、第2の成分の少なくとも2個の抗原結合ドメインは、異なるTAAに結合する。
いくつかの態様において、第1の成分は、第1の抗原結合ドメインを含有しており、第2の成分の抗原結合ドメインは、第2の抗原結合ドメインである。いくつかの態様において、多重特異性抗原結合ドメインは、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインを少なくとも含み、ここで、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、同一のTAAに結合する。いくつかのケースにおいて、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、同一のTAAの異なるエピトープに結合する。いくつかの場合において、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、同一のTAAの同一のエピトープに結合する。いくつかの態様において、多重特異性抗原結合ドメインは、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインを少なくとも含み、ここで、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、異なるTAAに結合する。
いくつかの態様において、（いくつかのケースにおいて、第2の抗原結合ドメインである）第2の成分の抗原結合ドメインおよびCD3結合領域は、（本明細書中で成分内リンカーと呼ばれる）1個または複数個のさらなるアミノ酸リンカーを介して、機能的に連結されている。（LP2とも呼ばれる）第2の成分の成分内ペプチドリンカーは、セクションII.3に記載される任意のもののようなペプチドリンカーであり得る。第2の成分に存在する、即ち、CD3結合領域と抗原結合ドメインとを連結する、成分内リンカーは、様々な長さ、例えば、5アミノ酸長、6アミノ酸長、7アミノ酸長、8アミノ酸長、9アミノ酸長、10アミノ酸長、11アミノ酸長、12アミノ酸長、13アミノ酸長、14アミノ酸長、15アミノ酸長、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、20アミノ酸長であり得る。いくつかの態様において、第2の成分の成分内リンカーは、アミノ酸グリシンおよびセリンから主に構成され、本明細書中でGSリンカーと呼ばれる。いくつかの態様において、GSリンカーは、アミノ酸配列
Figure 2021520812
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
ヘテロ二量体Fc領域を含む第1の成分、ならびに抗CD3抗体または重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）を含む抗原結合断片を含む第2の成分を含む多重特異性ポリペプチド構築物が、本明細書中に提供され、ここで、抗CD3抗体または抗原結合断片を構成するVHおよびVLは、ヘテロ二量体Fcの対向するポリペプチドに連結されており；第1および第2の成分は、リンカーによってカップリングされており、ヘテロ二量体Fc領域は、抗CD3抗体または抗原結合断片に対してN末端側に位置付けられており；第1および第2の成分の一方または両方は、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む。
いくつかの態様において、リンカーは、50アミノ酸長までのポリペプチドである。いくつかの態様において、リンカーは、25アミノ酸長までのポリペプチドである。いくつかの態様において、リンカーは、15アミノ酸長までのポリペプチドである。
提供された態様のいずれかにおいて、TAAに結合する1個または複数個の抗原結合ドメインは、TAAとの1価、2価、3価、または4価の結合をもたらす。いくつかの態様において、TAAに結合する1個または複数個の抗原結合ドメインは、sdAb、scFv、またはFabより独立に選択される。いくつかの態様において、TAAに結合する1個または複数個の抗原結合ドメインは、VHおよびVLを含有している単鎖抗体断片、例えば、sdAbまたはscFvのような単鎖分子である。いくつかの態様において、TAAに結合する1個または複数個の抗原結合ドメインは、VHHまたはVHNARのようなsdAbである。いくつかの態様において、抗原結合ドメインのうちの少なくとも1個は、VH-CH1（Fd）を含む第1の鎖およびVL-CLを含む第2の鎖を含有しているFabである。
いくつかの態様において、TAAに結合する抗原結合ドメインは、抗CD3結合ドメインのVHに付着している。いくつかの態様において、TAAに結合する抗原結合ドメインは、抗CD3結合ドメインのVHが付着しているヘテロ二量体Fcの同一の側（例えば、ノブまたはホール）に付着している。いくつかの態様において、TAAに結合する抗原結合ドメインは、抗CD3結合ドメインのVHに付着しているsdAbである。いくつかの態様において、TAAに結合する抗原結合ドメインは、抗CD3結合ドメインのVHが付着しているヘテロ二量体Fcドメインの同一の側（例えば、ノブまたはホール）に付着しているsdAbである。いくつかの態様において、TAAに結合する抗原結合ドメインは、抗CD3結合ドメインのVHに付着しているVHHまたはVHNARである。いくつかの態様において、TAAに結合する抗原結合ドメインは、抗CD3結合ドメインのVHが付着しているヘテロ二量体Fcドメインの同一の側（例えば、ノブまたはホール）に付着しているVHHまたはVHNARである。いくつかの態様において、TAAに結合する抗原結合ドメインは、抗CD3結合ドメインのVHに付着しているVHHである。いくつかの態様において、TAAに結合する抗原結合ドメインは、抗CD3結合ドメインのVHが付着しているヘテロ二量体Fcドメインの同一の側（例えば、ノブまたはホール）に付着しているVHHである。いくつかの態様において、TAAに結合する抗原結合ドメインは、抗CD3結合ドメインのVHに付着しているVHNARである。いくつかの態様において、TAAに結合する抗原結合ドメインは、抗CD3結合ドメインのVHが付着しているFcドメインの同一の側（例えば、ノブまたはホール）に付着しているVHNARである。
いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、（i）ヘテロ二量体Fc領域の第1のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVHドメインを含む第1のポリペプチド；ならびに（ii）ヘテロ二量体Fc領域の第2のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVLドメインを含む第2のポリペプチドを少なくとも含み、ここで、第1および第2のポリペプチドの一方または両方は、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する少なくとも1個の抗原結合ドメインを含む。いくつかの場合において、第1または第2のポリペプチドの一方のみが、TAAに結合する少なくとも1個の抗原結合ドメインを含む。
いくつかの態様において、抗原結合ドメインのうちの少なくとも1個は、Fabである。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、（i）ヘテロ二量体Fc領域の第1のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVHドメインを含む第1のポリペプチド；（ii）ヘテロ二量体Fc領域の第2のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVLドメインを含む第2のポリペプチド、ならびに（iii）腫瘍関連抗原に結合するFab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLを含む第3のポリペプチド：を含み、ここで、第1および/または第2のポリペプチドは、Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方をさらに含む。いくつかのケースにおいて、第1または第2のポリペプチドの一方のみが、Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方を含む。いくつかの態様において、第1または第2のポリペプチドの両方が、Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方を含む。いくつかのケースにおいて、Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方は、多重特異性ポリペプチド構築物の第1または第2のポリペプチドの一方のFc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。いくつかの態様において、Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方は、第1のポリペプチドまたは第2のポリペプチドのFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、第1のポリペプチドまたは第2のポリペプチドの他方のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。
いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物の第1または第2のポリペプチドの一方のFc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。いくつかのケースにおいて、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、多重特異性構築物のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、第2の抗原結合ドメインは、多重特異性構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。提供された多重特異性ポリペプチド構築物の具体的な態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、多重特異性構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、sdAbである。いくつかの態様において、sdAbである少なくとも1個の抗原結合ドメインは、多重特異性構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。いくつかの態様において、sdAbである少なくとも1個の抗原結合ドメインは、多重特異性構築物のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられている。いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、VHHである。いくつかの態様において、VHHである少なくとも1個の抗原結合ドメインは、多重特異性構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。いくつかの態様において、VHHである少なくとも1個の抗原結合ドメインは、多重特異性構築物のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられている。
いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、第1の抗原結合ドメインと免疫グロブリンFcポリペプチド領域（Fc領域）との間の第1の連結ペプチド（LP1）を含む。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、抗CD3結合ドメイン（CD3結合領域）と第2の抗原結合ドメインとの間の第2の連結ペプチド（LP2）を含む。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、第1の抗原結合ドメインと免疫グロブリンFcポリペプチド領域（Fc領域）との間の第1の連結ペプチド（LP1）、および抗CD3結合ドメイン（CD3結合領域）と第2の抗原結合ドメインとの間の第2の連結ペプチド（LP2）を含む。
いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、N末端からC末端へ、以下の構造的配置を有する：第1の抗原結合ドメイン - LP1 - 免疫グロブリンFcポリペプチドリンカー領域（Fc領域） - リンカー - 抗CD3結合ドメイン - LP2 - 第2の抗原結合ドメイン。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、N末端からC末端へ、以下の構造的配置を有する：第2の抗原結合ドメイン - LP2 - 免疫グロブリンFcポリペプチドリンカー領域（Fc領域） - リンカー - 抗CD3結合ドメイン（CD3結合領域）- LP1 - 第1の抗原結合ドメイン。
いくつかの態様において、2個の連結ペプチド、LP1およびLP2は、相互に同一ではない。いくつかのケースにおいて、LP1またはLP2は、独立に、約1〜20アミノ酸長のペプチドである。いくつかの例において、LP1またはLP2は、独立に、SEQ ID NO:10〜13、119、135、147、149に示されるGly-Serリンカーであるか、またはそれを含むペプチドを含む。
いくつかの態様において、多重特異性構築物は、図1に示される構造的配置のいずれかを有する構築物である。いくつかの態様において、構築物は、N末端からC末端へ、以下の構造的配置を有する二重特異性構築物である。二重特異性構築物のN末端は、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第1の抗原結合ドメインを含む。第1の結合ドメインは、TAA標的の第1のエピトープに結合する。第1の抗原結合ドメインには、FcγR相互作用および/またはFcRn相互作用を制御する中央の免疫グロブリンFcポリペプチド領域がカップリングされている。いくつかの態様において、中央の免疫グロブリンFcポリペプチド領域は、ヘテロ二量体である。免疫グロブリンFcポリペプチド領域は、免疫グロブリンFcポリペプチド領域の末端に対してC末端側に位置するリンカーにカップリングされている。リンカーは、Fc領域に対してC末端側に位置する、いくつかのケースにおいて、第2の成分の遠位末端にある、抗CD3結合配列に付着している。二重特異性構築物のC末端は、TAAに結合する第2の抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、第2の抗原結合ドメインは、第1の成分に位置する第1の抗原結合ドメインと同一のTAAに結合する。いくつかの態様において、第2の抗原結合ドメインは、TAA上の第2のエピトープに結合し、ここで、第2のエピトープは、TAA上の第1のエピトープと競合しない。いくつかの態様において、第2の抗原結合ドメインは、第1の抗原結合ドメインのものと異なるTAAに結合する。
提供した態様の任意のいくつかにおいて、抗CD3抗体または抗原結合断片は、Fv抗体断片である。いくつかの態様において、Fv抗体断片は、ジスルフィドによって安定化された抗CD3結合Fv断片（dsFv）を含む。いくつかの態様において、抗CD3結合配列は、重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）との間にジスルフィド結合を含め、それによって、ジスルフィドによって安定化された抗CD3結合Fv断片（dsFv）を作製するため、改変されたFv抗体断片である。いくつかの態様において、抗CD3 Fvを構成するVHドメインおよびVLドメインは、ヘテロ二量体Fc領域の対向するメンバーに機能的に連結されている。これらの態様において、抗CD3 Fvは、1価でCD3に結合する。提供するような局面において、多重特異性ポリペプチド構築物が同族の抗原に結合しない限り、抗CD3 dsFvは、CD3と係合しない。
いくつかの態様において、二重特異性構築物の第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々は、抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、二重特異性構築物の第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々は、Fab断片、F(ab')2断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、または抗原結合ドメインの各々は独立に、Fab断片、F(ab')2断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの態様において、二重特異性構築物の第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々は、1つまたは複数のシングルドメイン抗体（sdAb）断片、例えば、VHH、VNAR、改変されたVHドメイン、または改変されたVKドメインの1コピーまたは複数コピーを含む。VHHは、天然のラクダ科動物の重鎖のみの抗体、重鎖のみの抗体を産生する遺伝学的に修飾された齧歯類、またはナイーブ/合成のラクダ科動物もしくはヒト化ラクダ科動物シングルドメイン抗体ライブラリーから生成され得る。VNARは、軟骨魚類の重鎖のみの抗体から生成され得る。界面改変および特異的な生殖系列ファミリーの選択を含む様々な方法が、従来のヘテロ二量体のVHドメインおよびVKドメインから単量体sdAbを生成するために実施されている。
いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、sdAbである。いくつかのケースにおいて、sdAbは、ヒトまたはヒト化sdAbである。いくつかの局面において、sdAbは、VHH、VNAR、改変されたVHドメイン、または改変されたVKドメインである。いくつかの例において、抗体またはその抗原結合断片は、scFvである。いくつかのケースにおいて、抗体またはその抗原結合断片は、Fabである。
提供された態様のいずれかにおいて、抗CD3抗体または抗原結合断片は、アミノ酸配列TYAMN（SEQ ID NO:16）を含むVH CDR1、アミノ酸配列
Figure 2021520812
を含むVH CD2；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を含むVH CDR3；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を含むVL CDR1；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）を含むVL CDR2；およびアミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）を含むVL CDR3を含む。
提供された態様のいくつかにおいて、抗CD3抗体または抗原結合断片は、アミノ酸配列GFTFNTYAMN（SEQ ID NO:211）を含むVH CDR1；アミノ酸配列RIRSKYNNYATY（SEQ ID NO:212）を含むVH CD2；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を含むVH CDR3；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を含むVL CDR1；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）を含むVL CDR2；およびアミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）を含むVL CDR3を含む。
提供された態様のいくつかにおいて、抗CD3抗体または抗原結合断片は、アミノ酸配列GFTFNTYAMN（SEQ ID NO:211）を少なくとも含むVH CDR1配列；アミノ酸配列RIRSKYNNYATY（SEQ ID NO:212）を少なくとも含むVH CDR2配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を少なくとも含むVH CDR3配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を少なくとも含むVL CDR1配列；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:230）を少なくとも含むVL CDR2配列；およびアミノ酸配列ALWYSNHWV（SEQ ID NO:225）を少なくとも含むVL CDR3配列を含む。
提供された態様のいくつかにおいて、抗CD3抗体または抗原結合断片は、SEQ ID NO:14、32〜62、196〜198、および211のいずれかのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:14、32〜62、196〜198、および211のいずれかとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を有するVH；ならびにSEQ ID NO:15、63〜81、191、199、200、および212のいずれかのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:15、63〜81、191、199、200、および212のいずれかとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を有するVLを含む。
いくつかの態様において、抗CD3抗体または抗原結合断片は、Fvである。いくつかの態様において、抗CD3 Fvは、SEQ ID NO:14、32〜43、45〜47、48、196、および211のいずれかのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:14、32〜43、45〜47、48、196、および211のいずれかとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を有するVH；ならびにSEQ ID NO:15、63、65〜71、73、75、77、および199のいずれかのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:15、63、65〜71、73、75、77、および199のいずれかとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を有するVLを含む。いくつかのケースにおいて、抗CD3 dsFvは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む。他のケースにおいて、抗CD3 Fvは、SEQ ID NO:196のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:199のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、CD3結合ドメインのVH鎖領域およびVL鎖領域は、各々独立に、少なくとも1個のアミノ酸修飾を含む。いくつかの態様において、CD3結合ドメインのVH鎖領域およびVL鎖領域の少なくとも1個のアミノ酸修飾は、CD3結合ドメインの安定性を増加させる。いくつかの態様において、CD3結合ドメインのVH鎖領域およびVL鎖領域の少なくとも1個のアミノ酸修飾は、CD3結合ドメインのCD3に結合する能力を増加させる。いくつかの態様において、CD3結合ドメインのVH鎖領域およびVL鎖領域の少なくとも1個のアミノ酸修飾は、VH鎖領域とVL鎖領域との間にジスルフィド連結を作製することによって、CD3結合ドメインの安定性を増加させる。
いくつかの態様において、CD3結合領域は、VH領域とVL領域との間にジスルフィドによって安定化された連結を有する。いくつかの態様において、抗CD3抗体または抗原結合断片は、ジスルフィドによって安定化されたFv（dsFv）である。いくつかの態様において、ジスルフィドによって安定化された抗CD3 Fvは、Kabatナンバリングによって、44位におけるCysへの変異を含む抗CD3 VHおよび100位におけるCysへの変異を含む抗CD3 VLを含む。いくつかの態様において、ジスルフィドによって安定化された抗CD3 Fvは、Kabatナンバリングによって、変異G44Cを含む抗CD3 VHおよび変異G100Cを含む抗CD3 VLを含む。いくつかの態様において、ジスルフィドによって安定化された抗CD3 Fvは、Kabatナンバリングによって、105位におけるCysへの変異を含む抗CD3 VHおよび43位におけるCysへの変異を含む抗CD3 VLを含む。
いくつかの態様において、抗CD3 dsFvは、SEQ ID NO:44、49〜62、197、および198のいずれかのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:44、49〜62、197、および198のいずれかとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を有するVH；ならびにSEQ ID NO:64、72、74、76、78〜81、191、200、および212のいずれかのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:64、72、74、76、78〜81、191、200、および212のいずれかとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を有するVLを含む。いくつかのケースにおいて、抗CD3 dsFvは、SEQ ID NO:44のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:72のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗CD3 dsFvは、SEQ ID NO:198のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:200のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗CD3 dsFvは、SEQ ID NO:197のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:200のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、多重特異性構築物は、多重特異性構築物にコンジュゲートされた薬剤も含む。いくつかの態様において、薬剤は、治療剤である。いくつかの態様において、薬剤は、検出可能モエティである。いくつかの態様において、検出可能モエティは、診断剤である。いくつかの態様において、薬剤は、リンカーを介して多重特異性構築物にコンジュゲートされている。いくつかの態様において、リンカーは、非切断可能リンカーである。
いくつかの態様において、本明細書中に記載された多重特異性構築物は、1種もしくは複数種の付加的な薬剤または付加的な薬剤の組み合わせと共に使用される。適当な付加的な薬剤には、例えば、がんのような意図された適用のための現在の薬学的治療および/または外科的治療が含まれる。例えば、多重特異性構築物は、付加的な化学療法または抗腫瘍剤と共に使用され得る。
いくつかの態様において、多重特異性構築物および付加的な薬剤は、単一の治療用組成物に製剤化され、多重特異性構築物および付加的な薬剤は、同時に投与される。いくつかの態様において、多重特異性構築物および付加的な薬剤は、相互に別々であり、例えば、各々、別々の治療用組成物に製剤化され、多重特異性構築物および付加的な薬剤は、同時に投与されるか、または多重特異性構築物および付加的な薬剤は、処置計画中の異なる時点で投与される。例えば、多重特異性構築物が付加的な薬剤の投与の前に投与されるか、多重特異性構築物が付加的な薬剤の投与の後に投与されるか、または多重特異性構築物および付加的な薬剤が交互に投与される。本明細書中に記載されるように、多重特異性構築物および付加的な薬剤は、単回投与されるかまたは複数回投与される。
いくつかの態様において、多重特異性構築物は、天然に、1つまたは複数のジスルフィド結合を含有している。いくつかの態様において、多重特異性構築物は、1つまたは複数のジスルフィド結合を含むよう改変されていてもよい。
本開示は、本明細書中に記載された多重特異性構築物の少なくとも一部分をコードする単離された核酸分子もしくはポリヌクレオチド、ならびに/または、例えば、少なくとも、多重特異性構築物の第1の成分の少なくとも一部分をコードする第1の核酸および多重特異性構築物の第2の成分の少なくとも一部分をコードする第2の核酸のような、本明細書中に記載された多重特異性構築物をコードする1種もしくは複数種の核酸分子、ならびにこれらの単離された核酸配列を含むベクターも提供する。
提供された態様には、提供された多重特異性ポリペプチド構築物のいずれかをコードするポリヌクレオチドが含まれる。提供された多重特異性ポリペプチド構築物のいずれかのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドも、提供される。提供された多重特異性構築物のいずれかの第1のポリペプチドをコードする第1の核酸配列、および多重特異性構築物の第2のポリペプチドをコードする第2の核酸配列を含むポリヌクレオチドが、さらに提供され、ここで、第1および第2の核酸配列は、配列内リボソーム進入部位（IRES）または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸によって分離されている。いくつかのケースにおいて、第1の核酸配列および第2の核酸配列は、同一のプロモーターに機能的に連結されている。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、第3のポリペプチド鎖を含み、ポリヌクレオチドは、多重特異性構築物の第3のポリペプチドをコードする第3の核酸をさらに含む。いくつかの態様において、第3の核酸は、配列内リボソーム進入部位（IRES）または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸によって、第1および/または第2のポリペプチドから分離されており、かつ/または第3の核酸配列は、第1および/または第2の核酸配列と同一のプロモーターに機能的に連結されている。いくつかの例において、自己切断ペプチドまたはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸は、（SEQ ID NO:159〜164、またはSEQ ID NO:165に示される配列によってコードされる）T2A、P2A、E2A、またはF2Aより選択される。
提供されたポリヌクレオチドのいずれかを含むベクターが、本明細書中に提供される。いくつかの態様において、ベクターは、発現ベクターである。いくつかの例において、ベクターは、ウイルスベクターまたは真核生物ベクターであり、任意で、真核生物ベクターは、哺乳動物ベクターである。
提供されたポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む細胞が、提供される。いくつかのケースにおいて、細胞は、組換えであるかまたは単離されている。いくつかの例において、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの例において、細胞は、HEK293細胞またはCHO細胞である。
本開示は、多重特異性構築物の発現をもたらす条件の下で、そのような核酸配列を含む細胞を培養することによって、多重特異性構築物を作製する方法を提供する。いくつかの態様において、細胞は、そのようなベクターを含む。
提供されたポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを細胞へ導入する工程、および多重特異性ポリペプチド構築物を作製するため、多重特異性構築物の発現をもたらす条件の下で、細胞を培養する工程を含む、多重特異性ポリペプチド構築物を作製する方法が、本明細書中に提供される。多重特異性ポリペプチドが細胞によって発現または産生される条件の下で、提供された細胞のいずれかを培養する工程を含む、多重特異性ポリペプチド構築物を作製する方法も、提供される。いくつかのケースにおいて、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの例において、細胞は、HEK293細胞またはCHO細胞である。いくつかの態様において、方法は、細胞から多重特異性ポリペプチド構築物を単離するかまたは精製する工程をさらに含む。いくつかのケースにおいて、多重特異性ポリペプチド構築物は、ヘテロ二量体である。
提供された方法のいずれかによって作製された多重特異性ポリペプチド構築物が、本明細書中に提供される。
標的細胞およびT細胞を、提供された多重特異性ポリペプチド構築物または薬学的組成物のいずれかと接触させる工程を含む、免疫応答を刺激するかまたは誘導する方法が、本明細書中に提供され、ここで、標的細胞は、多重特異性ポリペプチド構築物によって認識される腫瘍関連抗原を発現している。いくつかの態様において、標的細胞は、腫瘍関連抗原（TAA）を発現する腫瘍細胞である。
いくつかの態様において、接触は、エクスビボまたはインビトロで実施される。いくつかの態様において、接触は、対象においてインビボで実施される。
提供された多重特異性コンジュゲートまたは薬学的組成物のいずれかを、治療的に有効な量で、それを必要とする対象へ投与する工程を含む、対象における免疫応答を刺激するかまたは誘導する方法が提供される。いくつかのケースにおいて、方法は、細胞性免疫を増加させる。いくつかの態様において、方法は、T細胞活性を増加させる。いくつかの態様において、方法は、細胞溶解性T細胞（CTL）活性を増加させる。いくつかの例において、腫瘍またはがんに対する免疫応答が増加する。いくつかの態様において、方法は、対象における疾患または状態を処置する。
本開示は、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物を、そのような処置または防止が望まれる対象へ投与することによって、1種もしくは複数種の病理を処置するか、防止するか、その進行を遅延させるか、もしくは他の方法でその症状を寛解させるか、またはそのような病理に関連した症状を緩和する方法も提供する。提供された多重特異性コンジュゲートまたは薬学的組成物のいずれかを、治療的に有効な量で、それを必要とする対象へ投与する工程を含む、対象における疾患または状態を処置する方法が、本明細書中に提供される。いくつかの態様において、疾患または状態は、腫瘍またはがんである。
提供された方法のいずれかのいくつかの態様において、処置される対象のような対象は、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物である。提供された方法のいずれかのいくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、非ヒト霊長類、ペット（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、家畜、実験動物、または動物園の動物のような非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は、齧歯類である。
これらの方法および使用の態様のいずれかにおいて使用される本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、疾患の任意の段階で投与され得る。例えば、そのような多重特異性ポリペプチド構築物は、初期から転移性までの任意の段階のがんに罹患した患者へ投与され得る。対象および患者という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。
これらの方法および使用の態様のいずれかにおいて使用される本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、ネオアジュバント治療を含む処置計画において使用され得る。
これらの方法および使用の態様のいずれかにおいて使用される本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、単独で投与されてもよいし、または低分子阻害剤、他の抗体に基づく治療、ポリペプチドもしくはペプチドに基づく治療、核酸に基づく治療、および/もしくは他の生物製剤を含む1種もしくは複数種の付加的な薬剤と組み合わせて投与されてもよい。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、非限定的な例として、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞傷害性抗生物質、およびその他の核酸傷害剤のような、化学療法剤のような、1種または複数種の付加的な薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、パクリタクセル（例えば、Abraxane（登録商標））のようなタキサンである。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、ゲムシタビンのような代謝拮抗薬である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、カルボプラチンまたはシスプラチンのような白金に基づく化学療法のようなアルキル化剤である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、キナーゼ阻害剤、例えば、ソラフェニブまたはエルロチニブのような標的指向性薬剤である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、別の抗体、例えば、モノクローナル抗体（例えば、ベバシズマブ）、二重特異性抗体、または多重特異性抗体のような標的指向性薬剤である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、ボルテゾミブまたはカルフィルゾミブのようなプロテアソーム阻害剤である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、レナリドミドまたはIL-2のような免疫調節剤である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、放射線である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、当業者によって標準治療と見なされる薬剤である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、当業者に周知の化学療法剤である。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、単一の組成物に製剤化される。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、2種以上の別々の組成物として投与される。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、同時に投与される。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、連続的に投与される。
いくつかの態様において、付加的な薬剤は、ドセタキセル、パクリタクセル、アブラキサン（即ち、アルブミンとコンジュゲートされたパクリタクセル）、ドキソルビシン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、イリノテカン、およびゲムシタビンからなる群より選択される化学療法剤のような化学療法剤である。
いくつかの態様において、付加的な薬剤は、チェックポイント阻害剤、キナーゼ阻害剤腫瘍微小環境の阻害剤を標的とする薬剤、および/またはT細胞もしくはNKのアゴニストである。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、単独の、または化学療法剤もしく抗腫瘍剤のような別の付加的な薬剤と組み合わせられた放射線治療である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、ワクチン、オンコウイルス、ならびに/または、非限定的な例として、トール様受容体（TLR）アゴニストおよび/もしくはαCD40のようなDC活性化剤である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、ADCCを介して、または毒素との直接コンジュゲーションを介して（例えば、抗体薬物コンジュゲート（ADC））、腫瘍を死滅させるよう設計された腫瘍を標的とする抗体である。
いくつかの態様において、チェックポイント阻害剤は、CTLA-4、LAG-3、PD-1、PDL1、TIGIT、TIM-3、B7H3、B7H4、およびVistaからなる群より選択される標的の阻害剤である。いくつかの態様において、キナーゼ阻害剤は、B-RAFi、MEKi、およびイブルチニブのようなBtk阻害剤からなる群より選択される。いくつかの態様において、キナーゼ阻害剤は、クリゾチニブである。いくつかの態様において、腫瘍微小環境阻害剤は、IDO阻害剤、αCSF1R阻害剤、αCCR4阻害剤、TGFβ、骨髄系由来サプレッサー細胞、またはT制御性細胞からなる群より選択される。いくつかの態様において、アゴニストは、OX40、GITR、CD137、CD28、ICOS、CD27、およびHVEMからなる群より選択される。いくつかの態様において、チェックポイント阻害剤は、CTLA-4、PD-1、および/またはPD-L1より選択される標的に結合する抗体である。いくつかの態様において、チェックポイント阻害剤は、抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体、および抗PD-L1抗体、ならびに/またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様において、チェックポイント阻害剤は、例えば、Yervoy（商標）のような抗CTLA4抗体である。いくつかの態様において、チェックポイント阻害剤は、例えば、Opdivo（商標）および/またはKeytruda（商標）のような抗PD-1抗体である。
いくつかの態様において、阻害剤は、CTLA-4阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、LAG-3阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、PD-1阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、PDL1阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、TIGIT阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、TIM-3阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、B7H3阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、B7H4阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、Vista阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、B-RAFi阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、MEKi阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、Btk阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、イブルチニブである。いくつかの態様において、阻害剤は、クリゾチニブである。いくつかの態様において、阻害剤は、IDO阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、αCSF1R阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、αCCR4阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、TGFβである。いくつかの態様において、阻害剤は、骨髄系由来サプレッサー細胞である。いくつかの態様において、阻害剤は、T制御性細胞である。
いくつかの態様において、アゴニストは、OX40である。いくつかの態様において、アゴニストは、GITRである。いくつかの態様において、アゴニストは、CD137である。いくつかの態様において、アゴニストは、CD28である。いくつかの態様において、アゴニストは、ICOSである。いくつかの態様において、アゴニストは、CD27である。いくつかの態様において、アゴニストは、HVEMである。
いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、例えば、化学療法剤、抗炎症剤、および/または免疫抑制剤のような1種または複数種の付加的な薬剤と組み合わせて、処置の途中および/または後に投与される。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、単一の治療用組成物に製剤化され、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、同時に投与される。あるいは、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、相互に別々であり、例えば、各々が別々の治療用組成物に製剤化され、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、同時に投与されるか、または多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、処置計画中の異なる時点で投与される。例えば、多重特異性ポリペプチド構築物が付加的な薬剤の投与の前に投与されるか、多重特異性ポリペプチド構築物が付加的な薬剤の投与の後に投与されるか、または多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤が交互に投与される。本明細書中に記載されるように、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、単回投与されるかまたは複数回投与される。
いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、同時に投与される。例えば、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、単一の組成物に製剤化されてもよいし、または2種以上の別々の組成物として投与されてもよい。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、連続的に投与されるか、または多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、処置計画中の異なる時点で投与される。
前記の要素に加えて、多重特異性ポリペプチド構築物は、例えば、多重特異性ポリペプチド構築物のN末端側またはC末端側のアミノ酸配列のような付加的な要素を含有していてもよい。例えば、多重特異性ポリペプチド構築物は、関心対象の細胞または組織への送達を容易にするターゲティングモエティを含んでいてよい。多重特異性ポリペプチド構築物は、治療剤、検出可能モエティ、または診断剤のような薬剤にコンジュゲートされていてもよい。薬剤の例は、本明細書中に開示される。
多重特異性ポリペプチド構築物は、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物と共に、コンジュゲートされた薬剤、リンカー、および本明細書中に記載されたその他の成分のいずれかも含んでいてよい。
本開示は、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物に由来する酵素活性毒素、またはそれらの断片）のような細胞傷害性薬剤、または放射性同位体（即ち、ラジオコンジュゲート）にコンジュゲートされた多重特異性ポリペプチド構築物を含むイムノコンジュゲートにも関する。T細胞由来リンパ腫等において疾患T細胞を標的とするために使用するための適当な細胞傷害性薬剤には、例えば、ドラスタチンおよびその誘導体（例えば、アウリスタチンE、AFP、MMAD、MMAF、MMAE）が含まれる。いくつかの態様において、薬剤は、ドラスタチンである。いくつかの態様において、薬剤は、アウリスタチンまたはその誘導体である。いくつかの態様において、薬剤は、マイタンシノイドまたはマイタンシノイド誘導体である。いくつかの態様において、薬剤は、DM1またはDM4である。いくつかの態様において、薬剤は、デュオカルマイシンまたはその誘導体である。いくつかの態様において、薬剤は、カリチアマイシンまたはその誘導体である。いくつかの態様において、薬剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。
いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物と細胞傷害性薬剤との間のリンカーは、切断可能である。いくつかの態様において、リンカーは、非切断可能である。いくつかの態様において、2個以上のリンカーが存在する。2個以上のリンカーは、全て同一であり、例えば、切断可能もしくは非切断可能であるか、または2個以上のリンカーは、異なり、例えば、少なくとも1個が切断可能であり、少なくとも1個が非切断可能である。
多重特異性ポリペプチド構築物およびそのコンジュゲートは、多様な障害および/または疾患を処置する方法において有用である。疾患の非限定的な例には、全ての型のがん（乳がん、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、黒色腫、頭頸部がん、膵臓がん等）、関節リウマチ、クローン病、SLE、心血管傷害、虚血等が含まれる。例えば、適応症には、T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）を含む白血病、多発性骨髄腫を含むリンパ芽球性疾患、ならびに肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、および三種陰性乳がんを含む乳がんを含む固形腫瘍が含まれるであろう。例えば、適応症には、骨疾患もしくは原発腫瘍起源に関わらないがんの転移；非限定的な例として、ER/PR+乳がん、Her2+乳がん、三種陰性乳がんを含む乳がん；結腸直腸がん；子宮内膜がん；胃がん；膠芽腫；食道がんのような頭頸部がん；非限定的な例として、非小細胞肺がんのような肺がん；多発性骨髄腫；卵巣がん；膵臓がん；前立腺がん；骨肉腫のような肉腫；非限定的な例として、腎細胞がんのような腎臓がん；および/または、非限定的な例として、扁平上皮がん、基底細胞がん、もしくは黒色腫のような皮膚がんが含まれる。いくつかの態様において、がんは、扁平上皮がんである。いくつかの態様において、がんは、皮膚扁平上皮がんである。いくつかの態様において、がんは、食道扁平上皮がんである。いくつかの態様において、がんは、頭頸部扁平上皮がんである。いくつかの態様において、がんは、肺扁平上皮がんである。
本明細書中に提供された多重特異性ポリペプチド構築物のいずれかと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物が、提供される。いくつかのケースにおいて、薬学的組成物は、無菌である。本開示による薬学的組成物は、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物および担体を含んでいてよい。これらの薬学的組成物は、例えば、診断キットのようなキットに含まれていてよい。
当業者は、本開示の抗体が多様な使用を有することを認識するであろう。例えば、本開示のタンパク質は、多様な障害のための治療剤として使用される。本開示の抗体は、診断キット内の試薬または診断ツールとしても使用され、またはこれらの抗体は、治療用試薬を生成するため、競合アッセイにおいて使用されてもよい。
図1は、制約されたCD3結合を有する本開示の多重特異性ポリペプチド構築物の基本成分の模式図である。抗原結合ドメインは、アミノ末端および/またはカルボキシ末端に位置付けられている。ヘテロ二量体Fc領域のようなFc領域は、CD3結合領域のN末端側に位置付けられている。このCD3結合領域と非常に近接したFcの位置付けは、CD3結合を妨げる。リンカーは、本明細書中に提供される非切断可能リンカーであり得る。 図2AおよびBは、2種のポリペプチド、鎖1および鎖2から構成された、FRαを標的とする様々な制約CD3構築物の模式図である。図2Aに示されるように、鎖1は、第2のFRα sdAb（抗原結合ドメイン）に連結された抗CD3 VLドメインに（cx1356における3アミノ酸からcx681における18アミノ酸までの範囲の）非切断可能リンカーを介して連結されたヘテロ二量体Fc「ホール」に連結されたFRα sdAbを含有しており；鎖2は、第2のFRα sdAbに連結された抗CD3 VHドメインに前記と同一の非切断可能リンカーを介して連結された相補的なヘテロ二量体Fc「ノブ」に連結されたFRα sdAbを含有している。同時発現させた時、CD3結合ドメインは、それぞれ、ホールおよびノブにおけるVL:VHの会合を介して適切に組み立てられる（図2B）。例示的な抗CD3は、変異G100Cを含む可変軽鎖（VL）および変異G44Cを含む可変重鎖（VH）を含有している、ジスルフィドによって安定化されたFv（dsFv）である。 図3Aは、2種のポリペプチド、鎖1および鎖2から構成された、B7H3を標的とする様々な制約CD3構築物の模式図である。鎖1は、G100Cにおいて修飾された抗CD3 VLドメインに非切断可能リンカーを介して連結されたヘテロ二量体Fc「ホール」（上）；抗CD3 VLドメインに非切断可能リンカーを介して連結されたヘテロ二量体Fc「ホール」に連結されたB7H3を標的とするsdAb（中央）；またはG100Cにおいて修飾された抗CD3 VLドメインに非切断可能リンカーを介して連結されたヘテロ二量体Fc「ホール」に連結されたB7H3を標的とするsdAb（下）のいずれかを含有している。鎖2は、第2のB7H3 sdAbに連結されたG44Cにおいて修飾された抗CD3 VHドメインに前記のリンカーを介して連結された相補的なヘテロ二量体Fc「ノブ」に連結されたB7H3を標的とするsdAb（上）；抗CD3 VHドメインに前記のリンカーを介して連結された相補的なヘテロ二量体Fc「ノブ」に連結されたB7H3を標的とするsdAb（中央）；またはG44Cによって修飾された抗CD3 VHドメインに前記のリンカーを介して連結された相補的なヘテロ二量体Fc「ノブ」に連結されたB7H3を標的とするsdAb（下）のいずれかを含有している。同時発現させた時、CD3結合ドメインは、それぞれ、ホールおよびノブにおけるVL:VHの会合を介して適切に組み立てられる。示された場合、VH:VL相互作用は、VHドメインの修飾型残基G44CとVLドメインのG100Cとの間の改変されたジスルフィド結合によって安定化されている。 図3Bは、2種のポリペプチド、鎖1および鎖2から構成された、B7H3を標的とする様々な制約CD3構築物の模式図である。鎖1は、共刺激受容体を標的とするsdAbに連結されたG100Cにおいて修飾された抗CD3 VLドメインに非切断可能リンカーを介して連結されたヘテロ二量体Fc「ホール」を含有している。鎖2は、第2のB7H3を標的とするsdAbに連結されたG44Cにおいて修飾された抗CD3 VHドメインに前記のリンカーを介して連結された相補的なヘテロ二量体Fc「ノブ」に連結されたB7H3を標的とするsdAb（上）；B7H3を標的とするsdAbに連結されたG44Cにおいて修飾された抗CD3 VHドメインに前記のリンカーを介して連結されたヘテロ二量体Fc「ノブ」（中央）；またはG44Cによって修飾された抗CD3 VHドメインに前記のリンカーを介して連結された相補的なヘテロ二量体Fc「ノブ」に連結されたB7H3を標的とするsdAb（下）のいずれかを含有している。同時発現させた時、CD3結合ドメインは、それぞれ、ホールおよびノブにおけるVL:VHの会合を介して適切に組み立てられる。VH:VL相互作用は、VHドメインの修飾型残基G44CとVLドメインのG100Cとの間の改変されたジスルフィド結合によって安定化されている。得られた構築物は、2価（上）または1価（中央および下）のいずれかでB7H3に係合する。ここでの構築物は、全て、共刺激受容体を標的とするsdAbを含有している。 図3Cは、B7H3ターゲティングドメインがFABである、3種のポリペプチド、鎖1、鎖2、および鎖3から構成されるB7H3を標的とする様々な制約CD3構築物の模式図である。鎖1は、G100Cの修飾を欠く（上）または含有している（下）抗CD3 VLドメインに前記のリンカーを介して連結されたヘテロ二量体Fcの第1のメンバー（Fc-Het-1）にヒンジを介して連結されたBH73を標的とするVH、IgG定常重鎖1（CH1）を含有している。鎖2は、G44Cを欠く（上）または含有している（下）抗CD3 VHドメインに前記のリンカーを介して連結されたヘテロ二量体Fcの第2のメンバー（Fc-Het-2）にヒンジを介して連結されたBH73を標的とするVH、IgG定常重鎖1（CH1）を含有している。鎖3は、ヒトIg定常軽鎖（CL）領域に連結された相補的なB7H3を標的とするVLドメインを含有している。同時発現させた時、CD3結合ドメインは、相補的なヘテロ二量体Fc領域におけるVL:VHの会合を介して適切に組み立てられる。示された場合、VH:VL相互作用は、VHドメインの修飾型残基G44CとVLドメインのG100Cとの間の改変されたジスルフィド結合によって安定化されている。 図4Aは、2種のポリペプチド、鎖1および鎖2から構成される、DLL3を標的とする様々な制約CD3構築物の模式図である。鎖1は、共刺激受容体を標的とするsdAbに連結されたG100Cにおいて修飾された抗CD3 VLドメインに非切断可能リンカーを介して連結されたヘテロ二量体Fc「ホール」を含有している。鎖2は、第2のDLL3を標的とするsdAbに連結されたG44Cにおいて修飾された抗CD3 VHドメインに前記のリンカーを介して連結された相補的なヘテロ二量体Fc「ノブ」に連結されたDLL3を標的とするsdAb（上）；DLL3を標的とするsdAbに連結されたG44Cにおいて修飾された抗CD3 VHドメインに前記のリンカーを介して連結されたヘテロ二量体Fc「ノブ」（中央）；またはG44Cによって修飾された抗CD3 VHドメインに前記のリンカーを介して連結された相補的なヘテロ二量体Fc「ノブ」に連結されたDLL3を標的とするsdAb（下）のいずれかを含有している。同時発現させた時、CD3結合ドメインは、それぞれ、ホールおよびノブにおけるVL:VHの会合を介して適切に組み立てられる。VH:VL相互作用は、VHドメインの修飾型残基G44CとVLドメインのG100Cとの間の改変されたジスルフィド結合によって安定化されている。得られた構築物は、2価（上）または1価（中央および下）のいずれかでDLL3に係合する。ここでの構築物は、全て、共刺激受容体を標的とするsdAbを含有している。 図4Bは、2種のポリペプチド、鎖1および鎖2から構成された、DLL3を標的とする制約CD3構築物cx5499の模式図である。cx5499は、図4A（上）に示されるcx5352と同一であるが、鎖1のC末端に共刺激受容体を標的とするsdAbを欠いている。同時発現させた時、CD3結合ドメインは、それぞれ、ホールおよびノブにおけるVL:VHの会合を介して適切に組み立てられる。VH:VL相互作用は、VHドメインの修飾型残基G44CとVLドメインのG100Cとの間の改変されたジスルフィド結合によって安定化されている。得られた構築物は、2価（上）また1価（中央および下）のいずれかでDLL3に係合する。 図5A〜Dは、FRαを標的とする代表的な制約CD3係合構築物cx1356およびcx681による細胞結合を図示する。図5Aおよび図5Cは、Ovcar5細胞（FRα陽性卵巣がん細胞株）との結合を示す。図5Bおよび図5Dは、T細胞との結合の欠如を図示する。図5Aおよび図5Bは、各構築物の100nMにおける蛍光に対するノーマライズされた細胞数のヒストグラムを示す。図5Aおよび図5Bにおいて、二次抗ヒトAPC抗体のみの対照は、塗りつぶされた黒色トレースで示され、陽性対照の抗CD3結合は、白トレースで示され、cx1356およびcx681は、灰色の影付きのトレースで示される。様々な細胞型における各構築物の完全な滴定が、図5Cおよび図5Dに示される。 図5-1の説明を参照のこと。 図6A〜Fは、B7H3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物による細胞結合を図示する。図6A、C、およびEは、A375細胞（B7H3陽性ヒトメラノーマ細胞株）との結合を示す。図6B、D、およびFは、単離されたT細胞との結合の欠如を示す。 図6-1の説明を参照のこと。 図7A〜Fは、FRα陽性IGROV1細胞（図7A、7C、7E）またはFRα陰性NCI-H460細胞（図7B、7D、7F）の存在下での、CD3を作動させる力に対するリンカー長の影響を図示する。図7A〜Bは、それぞれ、抗原陽性細胞および抗原陰性細胞における2nMの様々な構築物によるCD3シグナリングの動力学を示す。図7C〜Dは、それぞれ、抗原陽性細胞および抗原陰性細胞における2nMの様々な構築物によるCD3作動力の大きさを示す。図7E〜Fは、それぞれ、抗原陽性細胞および抗原陰性細胞における、異なるリンカー長を有する様々な構築物のCD3作動力の効力を示す。Jurkat CD3 NFAT-GFPレポーター細胞株が、CD3シグナリングを評価するために使用された。制約CD3結合タンパク質は、標的細胞上の第2の抗原と結合した時にのみ、T細胞上のCD3に効果的に係合し、クラスタ形成させる。 図7-1の説明を参照のこと。 図7-1の説明を参照のこと。 図8A〜Dは、B7H3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物の標的依存的にCD3を作動させる能力を図示する。図8Aおよび図8Cは、B7H3陽性A375細胞の存在下でのCD3シグナリングを媒介する力を図示し、図8Bおよび図8Dは、B7H3陰性CCRF-CEMの細胞の存在下でのCD3シグナリングを媒介する能力の欠如を示している。Jurkat CD3 NFAT-GFPレポーター細胞株が、CD3作動を評価するために使用された。 図9Aは、B7H3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物（cx3072）の標的依存的にT細胞媒介細胞傷害を誘導する能力を図示する。標的細胞をcytoIDレッド標識によって標識し、死細胞をカスパーゼ3/7グリーン試薬の添加によって可視化した。赤色の標的細胞と緑色の死細胞とのオーバーラップエリアを決定することによって、細胞傷害を評価した。CRISPRテクノロジーによって生成されたB7H3陰性A375細胞株が、抗原特異的なT細胞媒介細胞傷害を試験するために使用された。cx3072は、これらのB7H3欠損細胞のT細胞媒介細胞傷害を誘発することができなかった。図9Bは、cx5952が、B7H3陽性A375細胞の存在下では、T細胞媒介細胞傷害を誘導することができるが、B7H3陰性CCRF-CEM細胞の存在下では、できないことを示す。 図10Aおよび10Bは、B7H3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物の標的依存的にT細胞媒介細胞傷害を誘導する能力を図示する。図10Aは、B7H3陽性A375細胞の存在下での、これらの構築物のT細胞媒介細胞傷害を誘導する力を図示し、図10Bは、B7H3陰性CCRF-CEM細胞の存在下での、これらの構築物のT細胞媒介細胞傷害を誘導する力を図示する。細胞傷害は、赤色の標的細胞と緑色の死細胞とのオーバーラップエリアを決定することによって評価された。図10Cおよび10Dは、B7H3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物の標的依存的にT細胞媒介細胞傷害を誘導する能力を図示する。図10Cは、B7H3陽性A375細胞の存在下での、これらの構築物のT細胞媒介細胞傷害を誘導する力を図示し、図10Cは、B7H3陰性CCRF-CEM細胞の存在下での、これらの構築物のT細胞媒介細胞傷害を誘導する力を図示している。細胞傷害は、赤色の標的細胞と緑色の死細胞とのオーバーラップエリアを決定することによって評価された。 図11A〜Cは、B7H3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物（cx5952）の標的依存的にT細胞媒介T細胞活性化を誘導する能力を図示する。CD4+T細胞またはCD8+T細胞のT細胞活性化を、T細胞活性化マーカーCD25（図11A）、CD69（図11B）、およびCD71（図11C）の発現によって評価した。図11D〜11Kは、B7H3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物の標的依存的にT細胞活性化を誘導する能力を図示する。B7H3標的依存的なCD4+T細胞活性化は、T細胞活性化マーカーCD25（図11D）およびCD71（図11F）の発現によって示される。B7H3標的依存的なCD8+T細胞活性化は、T細胞活性化マーカーCD25（図11H）およびCD71（図11J）の発現によって示される。T細胞活性化は、CD4+T細胞（図11E）もしくはCD8+T細胞（図11I）において示されるT細胞活性化マーカーCD25に基づき、またはCD4+T細胞（図11G）もしくはCD8+T細胞（図11K）において示されるT細胞活性化マーカーCD71に基づき、B7H3陽性細胞の非存在下では観察されなかった。 図11-1の説明を参照のこと。 図11-1の説明を参照のこと。 図11-1の説明を参照のこと。 図11-1の説明を参照のこと。 図12Aは、B7H3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物の標的依存的にIFNγ産生を誘導する能力を図示する。図12Aは、B7H3を標的とする代表的なCD3係合構築物の存在下で、B7H3陽性A375細胞およびB7H3陰性CCRF-CEM細胞の存在下で培養されたT細胞からのIFNγの産生を示す。 図12Bは、B7H3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物の標的依存的にIFNγ産生を誘導する能力を図示する。図12Bは、B7H3を標的とする代表的なCD3係合構築物の存在下で、B7H3陽性A375細胞およびB7H3陰性CCRF-CEM細胞の存在下で培養されたT細胞からのIFNγの産生を示す。 図13Aおよび13Bは、B7H3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物の細胞結合を図示する。cx5187およびcx5823は各々2個のB7H3結合ドメインを含有しており、複合体cx5873およびcx5965は各々1個のB7H3結合ドメインを含有している。図13Aは、B7H3陽性A375細胞との結合を示す。図13Bは、B7H3陰性CCRF-CEM細胞および単離されたT細胞との結合の欠如を示す。 図13Cおよび図13Dは、B7H3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物の標的依存的にCD3を作動させる能力を図示する。図13Cは、B7H3に対して2価であり2エピトープ性である構築物（cx5187）によるB7H3陽性A375細胞の係合が、B7H3に対して1価である構築物（cx5873およびcx5965）より強力なCD3シグナリングを誘導したことを示す。図13Dは、B7H3陰性CCRF-CEM細胞の存在下でのT細胞の活性化の欠如を示す。Jurkat CD3 NFAT-GFPレポーター細胞株が、CD3作動を評価するために使用された。 図14Aおよび図14Bは、B7H3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物の標的依存的にT細胞媒介細胞傷害を誘導する能力を図示する。図14Aは、B7H3に対して2価であり2エピトープ性である構築物（cx5187）によるB7H3陽性A375細胞のターゲティングが、B7H3に対して1価の構築物（cx5873およびcx5965）より強力なT細胞媒介細胞傷害を誘導したことを示す。図14Bは、B7H3陰性CCRF-CEM細胞に対するT細胞媒介細胞傷害の欠如を図示する。 図15A〜Dは、B7H3を標的とする代表的な制約CD3係合分子が、B7H3陽性A375細胞の存在下では、T細胞を活性化することができるが、B7H3陰性CCRF-CEM細胞の存在下では、できないことを図示する。図15Aおよび15Bは、B7H3に対して2価であり2エピトープ性である構築物（cx5187）によるB7H3陽性A375細胞のターゲティングが、B7H3に対して1価の構築物（cx5873およびcx5965）より強力なCD4+T細胞およびCD8+T細胞におけるCD25発現を誘導したことを示す。図15Cおよび15Dは、B7H3陰性CCRF-CEM細胞の存在下でのCD4+T細胞およびCD8+T細胞におけるCD25発現の欠如を示す。 図16Aおよび16Bは、B7H3を標的とする代表的な制約CD3係合構築が、B7H3陽性A375細胞の存在下では、T細胞媒介細胞傷害を誘発することができるが（図16A）、CCRF-CEM B7H3陰性細胞の存在下では、できない（図16B）ことを証明する。図16C〜16Jは、CD4+T細胞におけるCD25の発現（それぞれ、図16Cおよび16D）、CD8+T細胞におけるCD25発現（それぞれ、図16Eおよび16F）、CD4+T細胞におけるCD71発現（それぞれ、図16Gおよび16H）、CD8+T細胞におけるCD71発現（それぞれ、図16Iおよび16J）によって評価されるように、B7H3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物が、B7H3陽性A375細胞の存在下では、T細胞活性化を誘発することができるが、CCRF-CEM B7H3陰性細胞の存在下では、できないことを証明する。図16Kおよび16Lは、B7H3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物が、B7H3陽性A375細胞の存在下では、T細胞サイトカイン産生を誘発することができるが（図16K）、CCRF-CEM B7H3陰性細胞の存在下では、できない（図16L）ことを証明する。 図16-1の説明を参照のこと。 図16-1の説明を参照のこと。 図16-1の説明を参照のこと。 図17Aおよび17Bは、1価（cx5800およびcx5801）および2価（cx5352）のDLL3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物が、DLL3発現細胞株SHP-77には結合するが（図17A）、単離されたT細胞には結合しない（図17B）ことを証明する。結合はフローサイトメトリーによって評価された。 図17Cは、DLL3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物の、DLL3陽性SHP-77細胞の存在下でCD3シグナリングを作動させる能力を図示する。DLL3に対して2価であり2エピトープ性である構築物（cx5352）によるDLL3陽性細胞の係合は、DLL3に対して1価である構築物（cx5800およびcx5801）より強力なT細胞活性化を誘導した。Jurkat CD3 NFATルシフェラーゼレポーター細胞株が、CD3シグナリングを評価するために使用された。 図18A〜18Eは、DLL3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物cx5499の、DLL3陽性SHP-77細胞の存在下でT細胞媒介細胞傷害およびT細胞活性化を誘発する能力を証明する。図18Aは、DLL3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物の、DLL3陽性SHP-77細胞の存在下でT細胞媒介細胞傷害を誘発する能力を証明する。図18C〜18Dは、CD4+T細胞におけるCD25の発現（図18B）、CD4+T細胞におけるCD69発現（図18C）、CD8+T細胞におけるCD25発現（図18D）、およびCD8+T細胞におけるCD69発現（図18E）によって評価される、DLL3を標的とする代表的な制約CD3係合構築物の、DLL3陽性SHP-77細胞の存在下でT細胞活性化を誘発する能力を証明する。 図18-1の説明を参照のこと。
詳細な説明
本開示は、CD3および第2の抗原に少なくとも結合する多重特異性ポリペプチド構築物の形態の制約T細胞係合融合タンパク質を提供する。本明細書中に提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、免疫グロブリンFc領域に機能的に連結された、抗原に結合する抗原結合ドメインの1コピーまたは複数コピーを含む第1の成分、（本明細書中で交換可能に使用される用語である抗CD3結合ドメインまたはCD3結合領域と本明細書中で呼ばれる）少なくともCD3に結合する結合ドメインの1コピーまたは複数コピーを含む第2の成分、および第1の成分と第2の成分とを接合するポリペプチドリンカーのようなリンカーを少なくとも含む。いくつかの態様において、抗原は、腫瘍関連抗原（TAA）である。いくつかの態様において、リンカーは、非切断可能リンカーである。いくつかの態様において、リンカーは、プロテアーゼ、例えばグランザイムB、MMP、またはマトリプターゼであるプロテアーゼによって特異的に認識される基質認識部位を含まない。
提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、Fc領域を含有している第1の成分がCD3結合領域を含有している第2の成分のN末端側にある配置を含む。そのような態様において、第1および第2の成分は、Fc領域の末端のC末端側にあるリンカーを介して接合されている。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のアミノ末端（N末端）領域に位置付けられている。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のカルボキシ末端（C末端）領域に位置付けられている。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のN末端領域およびC末端領域の両方に位置付けられている。本明細書中に提供される多重特異性ポリペプチド構築物の様々な配置は、図1に示される。
提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、抗原が抗原結合ドメインを介して結合した後にのみ、CD3に実質的に結合するため、そのような構築物は、制約されたT細胞係合活性を示す。このことは、制約CD3係合タンパク質が、TAA陽性細胞には効率的に結合することができるが、T細胞とはほとんど乃至全く結合しないことを証明する、本明細書中に提供される実施例および図面において例証される。この独特の特性は、制約CD3係合タンパク質が、末梢T細胞に結合することなく、TAAが存在する部位に分布することを可能にする。このフォーマットは、構成性のCD3結合が許可されないかまたは排除され、末梢T細胞結合を回避し、抗原結合ドメインによって認識される抗原が存在する部位への優先的な分布を可能にすることによって、有意な利益を提供するという点で、他のCD3係合多重特異性構築物とは異なる。さらに、他のCD3係合構築物は、抗原依存性T細胞活性化を媒介する。しかしながら、本明細書中に提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、抗原依存性のT細胞の結合および活性化の両方を媒介する。
提供された多重特異性ポリペプチド構築物の制約されたT細胞係合活性は、いくつかの局面において、CD3結合領域のN末端側にFc領域を位置付けることによる。いくつかの態様において、そのような位置付けは、CD3結合領域によるCD3結合を低下させ、減弱させ、妨害し、かつ/または防止する。抗原結合ドメインによる抗原結合の非存在下では、本明細書中に提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、低下したまたは排除されたCD3結合およびT細胞活性化能力を示す。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメインによって媒介される抗原結合イベントの存在下で、CD3結合領域によるCD3に結合する能力が、大いに増強される。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメインによって媒介される抗原結合イベントの存在下で、T細胞を活性化する能力が、大いに増強される。多重特異性ポリペプチド構築物内の抗原結合ドメインによるその同族抗原の係合は、その後のT細胞係合をもたらし、細胞傷害、サイトカイン放出、脱顆粒、および増殖のような抗原依存性のT細胞活性化を媒介する。いくつかの態様において、提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、免疫応答を増加させるため、例えば、細胞溶解性（または細胞傷害性）T細胞活性を含むT細胞活性を増強するため、使用され得る。免疫応答の調節は、いくつかの局面において、対象における疾患または状態を処置することができる。
いくつかの態様において、1つまたは複数の抗原結合ドメインは、腫瘍細胞または腫瘍微小環境の細胞の抗原に結合する。いくつかの局面において、提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、腫瘍またはがんに対するT細胞活性、例えば、細胞傷害活性のような免疫応答を増加させるために使用され得る。いくつかの態様において、提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、対象における腫瘍またはがんを処置するために使用され得る。
いくつかの態様において、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物のCD3結合領域は、Fc領域の存在によって制約されているか、または他の方法で阻止されかつ/もしくは阻害されているため、これらの構築物は、末梢血中のCD3を介したT細胞の結合が起こらないことを確実にする。従って、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、多数の利点を提供する。いくつかの局面において、これらの構築物は、全てのT細胞の結合によって引き起こされるシンク効果を限定する。いくつかの局面において、これらの構築物は、全身毒性を低下させる。
いくつかの態様において、本開示の提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、例えば、腫瘍関連抗原（TAA）発現の部位のような、対象における所望の部位へのコントロールされた体内分布を可能にする。TAA発現の部位には、例えば、腫瘍および周囲の腫瘍微小環境が含まれる。
いくつかの態様において、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、CD3および1種または複数種の他の抗原に対する特異性を示す。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、2個、3個、または4個の抗原結合ドメインのような、1種または複数種のTAAに結合することができる複数の抗原結合ドメインを含有していてよい。例えば、図1を参照すること。いくつかの態様において、1つまたは複数の抗原結合ドメインは、同一の抗原に結合する。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、同一の抗原の異なるエピトープに結合する複数の抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、1種または複数種の異なる抗原に結合する複数の抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、同一の抗原の異なるエピトープに結合する複数の抗原結合ドメインを含み、1種または複数種の異なる抗原に結合する付加的な抗原結合ドメインも含む。いくつかの局面において、提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメインの結合を介して、CD3、およびTAAのような別の抗原に結合することができるような二重特異性ポリペプチド構築物である。いくつかの例において、提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの使用を通して、1種または複数種のTAAの多価の係合を提供する、二重特異性ポリペプチド構築物である。例えば、いくつかの態様において、二重特異性ポリペプチド構築物は、第1の抗原結合シングルドメイン抗体（sdAb）および第2の抗原結合sdAbを含む。
いくつかの態様において、本明細書中に提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、CD3に結合し、その後、T細胞を活性化する能力に関して、2種の状態で存在する：（1）CD3結合が制約され、T細胞相互作用が除去されるような、「不活性」状態は、抗原結合ドメインのいずれかまたは全ての結合が存在しない時に起こる。（2）CD3結合領域がCD3に結合することができ、T細胞相互作用が可能になるような、「活性」状態は、抗原結合ドメインのいずれかまたは全てによる抗原結合時に起こる。
いくつかの態様において、Fc領域は、リンカーを介してCD3結合ドメインに連結されている。いくつかの態様において、Fc領域は、記載したいずれかのような1つまたは複数の非切断可能リンカーを介してCD3結合領域に連結されている。
いくつかの態様において、Fc領域は、ホモ二量体Fc領域である。いくつかの態様において、Fc領域は、ヘテロ二量体Fc領域である。いくつかの態様において、Fc領域は、単量体Fc領域である。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域は、FcγRと相互作用し、自然免疫エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ADCC）および抗体依存性細胞貪食（ADCP）を媒介することができる。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域は、補体タンパク質、即ち、C1qと相互作用し、補体依存性細胞傷害を媒介することができる。従って、いくつかの局面において、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、自然免疫エフェクターおよびT細胞を含む、複数の免疫エフェクター機序を可能にする。
いくつかの態様において、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、T細胞およびNK細胞によって媒介される細胞傷害が同時に起こることを可能にする。いくつかのケースにおいて、そのような活性は、所定のTAAの異なるかつ/または非競合的なエピトープを標的とすることができる、第1の抗原結合ドメイン、例えば、第1の抗TAA抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメイン、例えば、第2の抗TAA抗原結合ドメインが含有されている多重特異性ポリペプチド構築物において起こり得る。
制約CD3係合構築物は、任意のTAA結合ドメインと共に使用可能であり、末梢T細胞との相互作用を回避し、強力なTAA依存的T細胞の細胞傷害を媒介することによって、腫瘍または腫瘍微小環境におけるより良好な治療曝露を可能にすることが企図される。いくつかの態様において、第2の部分または成分は、TAAが存在しない限り、T細胞の活性化が起こらないよう、CD3に対して1価であるCD3結合領域を含有している。
いくつかの局面において、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、現在の二重特異性治療薬と比べて多数の利点を提供する。本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、従来の治療用抗体より小さく、例えば、150kDaに対して125kDaであり、それは、よりよい標的、例えば、腫瘍への浸透を可能にするであろう。いくつかの局面において、多重特異性ポリペプチド構築物全体のサイズは、構築物の長い半減期を提供する。いくつかの局面において、CD3結合領域によるCD3結合は、CD3係合が起こる前に、TAA係合に依るため、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、低下した全身毒性または腫瘍および/もしくは腫瘍微小環境の外部の区域における毒性を示す。
本明細書中に引用された刊行物および特許文書は、全て、そのような刊行物または文書が各々参照によって本明細書中に組み入れられると具体的に個々に示されたかのごとく、参照によって本明細書中に組み入れられる。刊行物および特許文書の引用は、何かが関係している先行技術であることの承認として意図されず、それの内容または日付に関する承認を構成するものでもない。本発明が説明文書によって記載されたが、当業者は、本発明が、多様な態様において実施され得ること、上記の説明および下記の例が、後述の特許請求の範囲を例示するためのものであって限定するためのものではないことを認識するであろう。
I．定義
他に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。エンティティ（「a」entity）またはエンティティ（「an」entity）という用語は、そのエンティティの1つまたは複数をさす。例えば、化合物（a compound）とは、1種または複数種の化合物をさす。従って、「（a）」、「（an）」、「1または複数」、および「少なくとも1」という用語は、交換可能に使用され得る。さらに、前後関係によって他のことが必要とされない限り、単数形は、複数形を含み、複数形は、単数形を含むものとする。概して、本明細書中に記載された細胞および組織の培養、分子生物学、タンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法、およびそれらの技術は、当技術分野において周知であり一般的に使用されているものである。標準的な技術が、組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織の培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）のために使用される。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書中に記載されたように実施される。上記の技術および手法は、一般に、当技術分野において周知の従来の方法に従って、本明細書中に引用され記述される様々な一般的な参照およびより具体的な参照に記載されたように、実施される。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))を参照すること。本明細書中に記載された分析化学、合成有機化学、ならびに薬化学および製薬化学に関連して利用される命名法、ならびにそれらの実験手法および技術は、当技術分野において周知であり一般的に使用されているものである。標準的な技術が、化学合成、化学的分析、薬学的な調製、製剤化、および送達、ならびに患者の処置のために使用される。
本開示に従って利用されるように、以下の用語は、他に示されない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。
本明細書中で使用されるように、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ig）分子の抗原結合部分、即ち、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有している分子をさす。「特異的に結合する」または「免疫反応する」または「免疫特異的に結合する」とは、抗体が所望の抗原の1つまたは複数の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドとは反応しないか、またははるかに低い親和性（Kd>10-6）で結合することを意味する。抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、完全ヒト、ドメイン抗体、単鎖、Fab、およびF(ab')2断片、Fv、scFv、およびFab発現ライブラリーが含まれるが、これらに限定されるわけではない。典型的には、「抗原結合断片」は、関心対象の抗原の少なくとも1個のエピトープに結合する、免疫グロブリンの重鎖および/または軽鎖の少なくとも1個のCDRを含有している。これに関して、抗原結合断片は、抗原に結合する抗体に由来する可変重鎖（VH）配列および可変軽鎖（VL）配列の1個、2個、3個、4個、5個、または6個全てのCDRを含んでいてよく、一般に、VHおよびVLを含有している抗体については、6個のCDR（重鎖および軽鎖の各々についての「CDR1」、「CDR2」、および「CDR3」）、または単一の可変ドメインを含有している抗体については、3個のCDRを含んでいてよい。抗原結合断片には、シングルドメイン抗体、例えば、VHのみを含有しているもの、またはVLのみを含有しているもの、例えば、VHH、VNAR、改変されたVHドメイン、もしくは改変されたVKドメインが含まれる。
基本の抗体構造単位は、四量体を含むことが公知である。各四量体は、同一の2対のポリペプチド鎖から構成され、各対が、1本の「軽鎖」（約25kDa）および1本の「重鎖」（約50〜70kDa）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主として担う、約100〜110アミノ酸またはそれ以上の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主として担う定常領域を定義する。一般に、ヒトから入手された抗体分子は、クラスIgG、IgM、IgA、IgE、およびIgDのいずれかに関し、それらは、分子内に存在する重鎖の性質によって相互に異なる。ある種のクラスは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、およびその他のようなサブクラスも有する。さらに、ヒトにおいて、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。
「モノクローナル抗体」（mAb）または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書中で使用されるように、独特の軽鎖遺伝子産物および独特の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の1分子種のみを含有している抗体分子の集団をさす。具体的には、モノクローナル抗体の相補性決定領域（CDR）は、集団の全ての分子において同一である。MAbは、独特の結合親和性を特徴とする、抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含有している。
「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分をさす。抗原結合部位は、重（「H」）鎖および軽（「L」）鎖のN末端可変（「V」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる、重鎖および軽鎖のV領域内の高度に多様な3個のストレッチが、「フレームワーク領域」または「FR」として公知の、より保存された隣接するストレッチの間に挿入されている。従って、「FR」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間および隣に天然に見出されるアミノ酸配列をさす。抗体分子において、軽鎖の3個の超可変領域および重鎖の3個の超可変領域は、抗原結合表面を形成するよう、三次元空間において相互に配置される。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の3個の超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」と呼ばれる。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))またはChothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)、Chothia et al. Nature 342: 878-883(1989)の定義に従う。
本明細書中で使用されるように、「エピトープ」という用語には、抗体、抗体断片、またはその他の結合ドメインによって標的とされる抗原の特定の部分が含まれる。「エピトープ」という用語には、特異的な結合が差し向けられる任意のタンパク質領域が含まれる。「エピトープ」という用語には、免疫グロブリンまたはT細胞受容体と特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基が含まれる。エピトープ決定基は、一般的に、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的活性を有する表面基からなり、一般的に、特異的な三次元構造的特徴および特異的な電荷特徴を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのN末端、中央、またはC末端のペプチドに対して産生され得る。さらに、抗体は、ポリペプチドの直鎖状または不連続のエピトープに対して産生され得る。抗体は、解離定数が、≦1μM、例えば、いくつかの態様において、≦100nM、いくつかの態様において、≦10nMである時、抗原に特異的に結合すると言われ、密接に関連するものであっても、異なるものであっても、他のタンパク質との結合は示さない。
本明細書中で使用されるように、「特異的結合」、「免疫学的結合」、および「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間に起こる型の非共有結合性の相互作用をさす。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Kd）によって表され、より小さいKdは、より大きい親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野において周知の方法を使用して定量化され得る。一つのそのような方法は、抗原結合部位/抗原複合体の形成および解離の速度の測定を含み、それらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメーターに依る。従って、「結合速度定数」（Kon）および「解離速度定数」（Koff）の両方が、濃度ならびに会合および解離の実際の速度の計算によって決定され得る（Nature 361:186-87(1993)を参照すること）。Koff/Konの比は、親和性と無関係の全てのパラメーターの相殺を可能にし、解離定数Kdと等しい（概して、Davies et al. (1990)Annual Rev Biochem 59パラメーター73を参照すること）。本開示の抗体は、当業者に公知のラジオリガンド結合アッセイまたは類似のアッセイのようなアッセイによって測定される結合定数（Kd）が、≦1μM、例えば、いくつかの態様において、≦100nM、いくつかの態様において、≦10nM、いくつかの態様において、≦100pM〜約1pMである時、EGFRに特異的に結合すると言われる。
「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用されるように、ゲノム、cDNA、もしくは合成、またはそれらの組み合わせに由来するポリヌクレオチドを意味するものとし、その起源のため、「単離されたポリヌクレオチド」は、（1）「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチドの全部または一部に関連していないか、（2）それが天然に連結されていないポリヌクレオチドに機能的に連結されているか、または（3）より大きい配列の一部として天然に存在しない。本開示によるポリヌクレオチドには、本明細書中に示される重鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、および本明細書中に示される軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子が含まれる。
本明細書中で言及される「単離されたタンパク質」という用語は、cDNA、組換えRNA、もしくは合成、またはそれらのいくつかの組み合わせに由来するタンパク質を意味し、その起源または誘導元のため、「単離されたタンパク質」は、（1）天然に見出されるタンパク質に関連していないか、（2）同一の起源由来の他のタンパク質を含まない、例えば、マウスタンパク質を含まないか、（3）異なる種に由来する細胞によって発現されるか、または（4）天然に存在しない。
「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド配列のネイティブタンパク質、断片、または類似体をさすための一般用語として本明細書中で使用される。従って、ネイティブタンパク質の断片および類似体は、ポリペプチド類の一種である。本開示によるポリペプチドには、本明細書中に示される重鎖免疫グロブリン分子、および本明細書中に示される軽鎖免疫グロブリン分子が含まれ、κ軽鎖免疫グロブリン分子のような軽鎖免疫グロブリン分子と共に重鎖免疫グロブリン分子を含む組み合わせによって形成された抗体分子、およびその逆も含まれ、それらの断片および類似体も含まれる。
物質に適用される「天然に存在する」という用語は、本明細書中で使用されるように、物質が天然に見出され得るという事実をさす。例えば、天然起源から単離され得、実験室において人為的に、またはその他の方法で意図的に修飾されていない、（ウイルスを含む）生物に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列は、天然に存在している。
「機能的に連結された」という用語は、本明細書中で使用されるように、そのように記載された成分の位置が、意図された様式で機能することを許容する関係にあることをさす。コード配列に「機能的に連結された」コントロール配列は、コード配列の発現がコントロール配列と適合性の条件の下で達成されるようライゲートされている。
「コントロール配列」という用語は、本明細書中で使用されるように、ライゲートされているコード配列の発現およびプロセシングを達成するために必要なポリヌクレオチド配列をさす。そのようなコントロール配列の性質は、宿主生物に依って異なり、原核生物においては、そのようなコントロール配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み、真核生物においては、一般に、そのようなコントロール配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。「コントロール配列」という用語には、少なくともその存在が発現およびプロセシングのために必須である全ての成分が含まれるものとし、その存在が有利である付加的な成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含まれ得る。「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で言及されるように、少なくとも10塩基長のヌクレオチド、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれかまたはいずれかの型のヌクレオチドの修飾型を意味する。その用語には、DNAの一本鎖型および二本鎖型が含まれる。
本明細書中で言及されるオリゴヌクレオチドという用語には、天然に存在するヌクレオチド、ならびに天然に存在するオリゴヌクレオチド結合および天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合によって共に連結された修飾型ヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドは、一般に、200塩基以下の長さを含むポリヌクレオチドサブセットである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、10〜60塩基長、例えば、いくつかの態様において、12、13、14、15、16、17、18、19、または20〜40塩基長である。オリゴヌクレオチドは、一般的には、例えば、プローブのため、一本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子変異体の構築において使用するため、二本鎖であってもよい。本開示のオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかである。
本明細書中で言及される「天然に存在するヌクレオチド」という用語には、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが含まれる。本明細書中で言及される「修飾型ヌクレオチド」という用語には、修飾型または置換型の糖基等を有するヌクレオチドが含まれる。本明細書中で言及される「オリゴヌクレオチド結合」という用語には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレルロエート（phosphoroselerloate）、ホスホロジセレノエート（phosphorodiselenoate）、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）、ホスホラニラデート（phoshoraniladate）、ホスホロンミデート（phosphoronmidate）等のようなオリゴヌクレオチド結合が含まれる。例えば、LaPlanche et al Nucl. Acids Res. 14:9081(1986)；Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984)、Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209(1988)、Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991)；Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108(F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991))；Stecら、米国特許第5,151,510号；Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990)を参照すること。所望により、オリゴヌクレオチドは、検出のための標識を含んでいてもよい。
本明細書中で使用されるように、20種の従来のアミノ酸およびそれらの略語は、従来の用法に従う。Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds. ,Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991))を参照すること。20種の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、D-アミノ酸）、α,α二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸、およびその他の非慣習的アミノ酸のような非天然アミノ酸も、本開示のポリペプチドのための適当な成分であり得る。非慣習的アミノ酸の例には、4ヒドロキシプロリン、γカルボキシグルタミン酸、ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N-アセチルリジン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、σ-N-メチルアルギニン、ならびにその他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、4-ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書中で使用されるポリペプチド表示法において、標準的な用法および慣習に従って、左方向はアミノ末端方向であり、右方向はカルボキシ末端方向である。
同様に、他に明示されない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は、5'末端側であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は、5'方向と呼ばれる。新生RNA転写物の5'から3'への付加の方向は、転写方向と呼ばれ、RNAと同一の配列を有し、RNA転写物の5'末端の5'側にあるDNA鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ、RNAと同一の配列を有し、RNA転写物の3'末端の3'側にあるDNA鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
ポリペプチドに適用される「実質的同一性」という用語は、2種のペプチド配列が、デフォルトギャップウェイトを使用して、プログラムGAPまたはBESTFIT等によって、最適に整列化された時、少なくとも80パーセントの配列同一性、例えば、いくつかの態様において、少なくとも90パーセントの配列同一性、いくつかの態様において、少なくとも95パーセントの配列同一性、いくつかの態様において、少なくとも99パーセントの配列同一性を共有することを意味する。
いくつかの態様において、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なっている。
本明細書中に記述されるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列の軽微な変動は、アミノ酸配列の変動が少なくとも75％、例えば、いくつかの態様において、少なくとも80％、90％、95％、いくつかの態様において、99％を維持する限り、本開示に包含されることが企図される。具体的には、保存的アミノ酸置換が企図される。保存的置換とは、側鎖が関連しているアミノ酸のファミリーの内部で起こるものである。遺伝学的にコードされたアミノ酸は、一般に、以下のファミリーに分類される：（1）酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸であり；（2）塩基性アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジンであり；（3）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、（4）非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸には、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、およびトレオニンが含まれる。疎水性アミノ酸には、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが含まれる。アミノ酸の他のファミリーには、（i）脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリンおよびトレオニン；（ii）アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン；（iii）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；ならびに（iv）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが含まれる。例えば、特に、置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を含まない場合には、ロイシンとイソロイシンもしくはバリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、トレオニンとセリンの孤立性の置換、または構造的に関連するアミノ酸同士の類似した置換は、得られた分子の結合または特性に大きい効果を及ぼさないであろうと予想することが合理的である。アミノ酸変化が機能性ペプチドをもたらすか否かは、ポリペプチド誘導体の特異的活性をアッセイすることによって容易に決定され得る。アッセイは、本明細書中に詳細に記載される。抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体は、当業者によって容易に調製され得る。いくつかの態様において、断片または類似体のアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能性ドメインの境界付近に存在する。構造ドメインおよび機能ドメインは、ヌクレオチドおよび/またはアミノ酸の配列データを公のまたは専有の配列データベースと比較することによって同定され得る。コンピューター化比較法が、既知の構造および/または機能を有する他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予測タンパク質コンフォメーションドメインを同定するために使用される。公知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を同定する方法は、公知である。Bowie et al. Science 253:164(1991)。従って、上記の例は、当業者が、本開示に従って、構造ドメインおよび機能ドメインを定義するために使用され得る配列モチーフおよび構造コンフォメーションを認識し得ることを証明する。
いくつかの態様において、アミノ酸置換は、そのような類似体の（1）タンパク質分解に対する感受性を低下させるもの、（2）酸化に対する感受性を低下させるもの、（3）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更するもの、（4）結合親和性を変更するもの、および（4）その他の物理化学的特性または機能的特性を付与するかまたは修飾するものである。類似体には、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々なムテインが含まれ得る。例えば、1つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）が、天然に存在する配列において、例えば、分子間接触形成ドメイン外のポリペプチドの部分において作製され得る。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させるべきでない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に存在するヘリックスを破壊するかまたは親配列を特徴付ける他の型の二次構造を崩壊させる傾向を有するべきでない）。当技術分野において認識されている二次構造および三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed. ,W. H. Freeman and Company, New York (1984))；Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds. ,Garland Publishing, New York, N. Y. (1991))；およびThornton et at. Nature 354:105(1991)に記載されている。
「ポリペプチド断片」という用語は、本明細書中で使用されるように、アミノ末端および/もしくはカルボキシ末端の欠失ならびに/または1つもしくは複数の配列内欠失を有するポリペプチドをさすが、ここで、残りのアミノ酸配列は、例えば、全長cDNA配列から推定される天然に存在する配列における対応する位置と同一である。断片は、典型的には、少なくとも5、6、8、または10アミノ酸長、例えば、いくつかの態様において、少なくとも14アミノ酸長、いくつかの態様において、少なくとも20アミノ酸長、一般的には、少なくとも50アミノ酸長、いくつかの態様において、少なくとも70アミノ酸長である。「類似体」という用語は、本明細書中で使用されるように、適当な結合条件の下で、推定されたアミノ酸配列の一部分との実質的同一性を有しており、EGFRとの特異的結合を有する、少なくとも25アミノ酸のセグメントから構成されるポリペプチドをさす。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に対する保存的アミノ酸置換（または付加もしくは欠失）を含む。類似体は、典型的には、少なくとも20アミノ酸長、例えば、いくつかの態様において、少なくとも50アミノ酸長以上であり、しばしば、全長の天然に存在するポリペプチドと同じ長さであり得る。
「薬剤」という用語は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的材料から作製された抽出物を示すために本明細書中で使用される。
本明細書中で使用されるように、「標識」または「標識された」という用語は、例えば、ポリペプチドへの放射標識されたアミノ酸の組み込み、またはマーキングされたアビジン（例えば、光学的方法もしくは熱量測定法によって検出され得る蛍光マーカーもしくは酵素活性を含有しているストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニルモエティの付着による、検出可能マーカーの組み込みをさす。ある種の状況において、標識またはマーカーも、治療用であってよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が、当技術分野において公知であり、使用され得る。ポリペプチドのための標識の例には、放射性同位体または放射性核種（例えば、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I）、蛍光標識（例えば、フルオロフォア、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、p-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される予め決定されたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、標識は、可能性のある立体障害を低下させるため、様々な長さのスペーサーアームによって付着させられる。「薬学的薬剤または薬物」という用語は、本明細書中で使用されるように、患者へ適切に投与された時に所望の治療効果を誘導することができる化学的化合物または組成物をさす。
本明細書中で使用されるように、組成物とは、細胞を含む、2種以上の生成物、物質、または化合物の任意の混合物をさす。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
「薬学的組成物」という用語は、哺乳動物対象、しばしば、ヒトにおいて薬学的に使用するために適当な組成物をさす。薬学的組成物は、典型的には、有効量の活性薬剤（例えば、多重特異性ポリペプチド構築物）と、担体、賦形剤、または希釈剤とを含む。担体、賦形剤、または希釈剤は、典型的には、それぞれ、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤である。
疾患または障害の「処置すること」、「処置」、または「治療」という用語は、本明細書中で使用されるように、単独で、または本明細書中に記載される別の化合物と組み合わせて、本開示の薬学的組成物を投与することによる、臨床的または診断的な症状の減少、停止、または排除によって証拠付けられる、疾患または障害の進行の緩徐化、中止、または逆転を意味する。「処置すること」、「処置」、または「治療」とは、急性もしくは慢性の疾患もしくは障害における症状の重症度の減少、または再発率の減少も意味する。本明細書中で使用されるように、がんに関して、がんの「処置」、または「阻害する」、「阻害すること」、もしくは「阻害」という用語は、限定されるわけではないが、固形がん効果判定基準（Response Evaluation Criteria for Solid Tumors）（RECIST）のような標準的な基準によって測定される、腫瘍成長の速度の統計的に有意な減少、腫瘍成長の停止、もしくは腫瘍のサイズ、量、代謝活性、もしくは体積の低下、または無増悪生存期間（PFS）もしくは全生存期間（OS）の統計的に有意な増加のうちの少なくとも一つをさす。疾患または障害の「防止すること」、「予防」、または「防止」とは、疾患もしくは障害の発生もしくは発症、もしくは疾患もしくは障害の症状のうちのいくつかもしくは全部を防止するための、または疾患もしくは障害の発症の可能性を減少させるための、単独の、または別の化合物と組み合わせられた、薬学的組成物の投与をさす。
「有効量」または「治療的に有効な量」という用語は、単独で（即ち、単独治療として）、または付加的な治療剤と組み合わせられて、患者へ投与された時に、例えば、疾患の症状および/または原因を寛解させるかまたは排除することによって、疾患進行の統計的に有意な減少を与える、組成物の量および/または濃度をさす。有効量は、疾患もしくは障害に関連した少なくとも一つの症状もしくは生物学的な応答もしくは効果を軽減するか、減らすか、もしくは緩和するか、疾患もしくは障害の進行を防止するか、または患者の身体機能を改善する量であり得る。
本明細書中で使用されるように、「実質的に純粋な」とは、ある物質種が、存在する優勢な種である（即ち、モルベースで、組成物中の他の個々の種より豊富に存在する）ことを意味し、実質的に精製された画分とは、ある物質種が、全高分子種の（モルベースで）少なくとも約50パーセントを構成する組成物である。
概して、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全高分子種の約80パーセント超、例えば、いくつかの態様において、約85％、90％、95％、および99％超を構成するであろう。いくつかの態様において、物質種は、組成物が単一の高分子種から本質的になる（従来の検出法によって、混入種が組成物中に検出され得ない）本質的均質にまで精製される。
患者という用語には、ヒトおよび獣医学的対象が含まれる。
本明細書中の他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker, S. ,Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))によって例証されるような、当技術分野における従来の用法に従って使用される。
「約」という用語は、本明細書中で使用されるように、当業者に容易に公知の、それぞれの値についての一般的な誤差範囲をさす。本明細書中の「約」が付くある値またはパラメーターの言及は、その値またはパラメーター自体に関する態様を含む（記載する）。例えば「約X」に言及する記載には、「X」の記載が含まれる。
II．多重特異性ポリペプチド構築物
免疫グロブリンFc領域を含有している第1の成分およびCD3結合領域を含む第2の成分を含有している多重特異性ポリペプチド構築物が、本明細書中に提供され、ここで、第1および第2の成分はリンカーによってカップリングされており、Fc領域はCD3結合領域のN末端側に位置付けられ；第1および第2の成分の一方または両方は、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、リンカーは、非切断可能リンカーである。いくつかの態様において、リンカーは、プロテアーゼによる切断のために特異的に認識される基質認識を含有しない。
いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、N末端からC末端へ順に、免疫グロブリンFc領域；リンカー；CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含有している。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、N末端からC末端へ順に、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメイン；免疫グロブリンFc領域；リンカー；およびCD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域を含有している。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、TAAに結合する第1の抗原結合ドメイおよびTAAに結合する第2の抗原結合ドメインを少なくとも含有している。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、N末端からC末端へ順に、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第1の抗原結合ドメイン；免疫グロブリンFc領域；リンカー；CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第2の抗原結合ドメインを含有している。
本開示の多重特異性ポリペプチド構築物の成分の各々を、より詳細に以下に説明する。
1．抗CD3結合ドメイン：
本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、抗CD3結合ドメインの1コピーまたは複数コピーを含む。本開示の抗CD3結合ドメインは、T細胞上のCD3εの係合を介してT細胞を活性化する。本開示の抗CD3結合ドメインは、CD3によって媒介されるT細胞活性化を誘起し、刺激し、活性化し、かつ/またはその他の方法で強化する。CD3の生物学的活性には、例えば、CD3とT細胞受容体（TCR）の抗原結合サブユニットとの間の相互作用を通したT細胞活性化およびその他のシグナリングが含まれる。例えば、本開示の抗CD3結合ドメインは、CD3によって媒介されるT細胞活性化を部分的にまたは完全に調節することによって、例えば、誘起するか、刺激するか、活性化するか、またはその他の方法で強化することによって、T細胞上のCD3εの係合を介して、T細胞を完全にまたは部分的に活性化する。
好ましい態様において、本開示の抗CD3結合ドメインは、CD3εとしても公知のCD3のε鎖に特異的に結合する。本開示の抗CD3ε結合ドメインは、T細胞上のCD3εの係合を介してT細胞を活性化する。本開示の抗CD3ε結合ドメインは、例えば、哺乳動物モノクローナル抗体、霊長類モノクローナル抗体、完全ヒトモノクローナル抗体ようなモノクローナル抗体、ならびにヒト化モノクローナル抗体およびキメラ抗体、ならびにそれらの抗原結合断片を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。
いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、VH CDR1配列、VH CDR2配列、およびVH CDR3配列の組み合わせを含み、ここで、VH CDR1配列、VH CDR2配列、およびVH CDR3配列のうちの少なくとも一つは、アミノ酸配列TYAMN（SEQ ID NO:16）を少なくとも含むVH CDR1配列）；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を少なくとも含むVH CD2配列；およびアミノ酸配列
Figure 2021520812
を少なくとも含むVH CDR3配列より選択される。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、VH CDR1配列、VH CDR2配列、およびVH CDR3配列の組み合わせを含み、ここで、VH CDR1配列、VH CDR2配列、およびVH CDR3配列のうちの少なくとも一つは、アミノ酸配列GFTFNTYAMN（SEQ ID NO:211）を少なくとも含むVH CDR1配列；アミノ酸配列RIRSKYNNYATY（SEQ ID NO:212）を少なくとも含むVH CDR2配列；およびアミノ酸配列
Figure 2021520812
を少なくとも含むVH CDR3配列より選択される。
いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、VL CDR1配列、VL CDR2配列、およびVL CDR3配列の組み合わせを含み、ここで、VL CDR1配列、VL CDR2配列、およびVL CDR3配列のうちの少なくとも一つは、アミノ酸配列
Figure 2021520812
を少なくとも含むVL CDR1配列；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）を少なくとも含むVL CDR2配列；およびアミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）を少なくとも含むVL CDR3配列より選択される。
いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、アミノ酸配列TYAMN（SEQ ID NO:16）を少なくとも含むVH CDR1配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を少なくとも含むVH CDR2配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を少なくとも含むVH CDR3配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を少なくとも含むVL CDR1配列；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）を少なくとも含むVL CDR2配列；およびアミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）を少なくとも含むVL CDR3配列を含む。
いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、アミノ酸配列GFTFNTYAMN（SEQ ID NO:211）を少なくとも含むVH CDR1配列；アミノ酸配列RIRSKYNNYATY（SEQ ID NO:212）を少なくとも含むVH CDR2配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を少なくとも含むVH CDR3配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を少なくとも含むVL CDR1配列；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）を少なくとも含むVL CDR2配列；およびアミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）を少なくとも含むVL CDR3配列を含む。
いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、アミノ酸配列GFTFNTYAMN（SEQ ID NO:211）を少なくとも含むVH CDR1配列；アミノ酸配列RIRSKYNNYATY（SEQ ID NO:212）を少なくとも含むVH CDR2配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を少なくとも含むVH CDR3配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を少なくとも含むVL CDR1配列；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:230）を少なくとも含むVL CDR2配列；およびアミノ酸配列ALWYSNHWV（SEQ ID NO:225）を少なくとも含むVL CDR3配列を含む。
いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、VH CDR1配列、VH CDR2配列、およびVH CDR3配列の組み合わせを含み、ここで、VH CDR1配列、VH CDR2配列、およびVH CDR3配列のうちの少なくとも一つは、アミノ酸配列TYAMN（SEQ ID NO:16）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である配列を含むVH CDR1配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である配列を含むVH CD2配列；およびアミノ酸配列
Figure 2021520812
と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である配列を含むVH CDR3配列より選択される。
いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、VH CDR1配列、VH CDR2配列、およびVH CDR3配列の組み合わせを含み、ここで、VH CDR1配列、VH CDR2配列、およびVH CDR3配列のうちの少なくとも一つは、アミノ酸配列GFTFNTYAMN（SEQ ID NO:211）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である配列を含むVH CDR1配列；アミノ酸配列RIRSKYNNYATY（SEQ ID NO:212）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である配列を含むVH CDR2配列；およびアミノ酸配列
Figure 2021520812
と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である配列を含むVH CDR3配列より選択される。
いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、VL CDR1配列、VL CDR2配列、およびVL CDR3配列の組み合わせを含み、ここで、VL CDR1配列、VL CDR2配列、およびVL CDR3配列のうちの少なくとも一つは、アミノ酸配列
Figure 2021520812
と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である配列を含むVL CDR1配列；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である配列を含むVL CDR2配列；およびアミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である配列を含むVL CDR3配列より選択される。
いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、アミノ酸配列TYAMN（SEQ ID NO:16）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVH CDR1配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVH CD2配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVH CDR3配列、アミノ酸配列
Figure 2021520812
と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVL CDR1配列；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVL CDR2配列；およびアミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVL CDR3配列を含む。
いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、アミノ酸配列GFTFNTYAMN（SEQ ID NO:211）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVH CDR1配列；アミノ酸配列RIRSKYNNYATY（SEQ ID NO:212）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVH CDR2配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVH CDR3配列、アミノ酸配列
Figure 2021520812
と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVL CDR1配列；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVL CDR2配列；およびアミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVL CDR3配列を含む。
いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、アミノ酸配列GFTFNTYAMN（SEQ ID NO:211）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVH CDR1配列；アミノ酸配列RIRSKYNNYATY（SEQ ID NO:212）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVH CDR2配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVH CDR3配列、アミノ酸配列
Figure 2021520812
と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVL CDR1配列；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:230）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVL CDR2配列；およびアミノ酸配列ALWYSNHWV（SEQ ID NO:225）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVL CDR3配列を含む。
いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、アミノ酸配列GFTFSTYAMN（SEQ ID NO:227）を少なくとも含むVH CDR1配列；アミノ酸配列RIRSKYNNYATY（SEQ ID NO:228）を少なくとも含むVH CDR2配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を少なくとも含むVH CDR3配列、アミノ酸配列
Figure 2021520812
を少なくとも含むVL CDR1配列；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:230）を少なくとも含むVL CDR2配列；およびアミノ酸配列ALWYSNHWV（SEQ ID NO:225）を少なくとも含むVL CDR3配列を含む。
いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、アミノ酸配列GFTFSTYAMN（SEQ ID NO:227）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVH CDR1配列；アミノ酸配列RIRSKYNNYATY（SEQ ID NO:228）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVH CDR2配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVH CDR3配列、アミノ酸配列
Figure 2021520812
と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVL CDR1配列；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:230）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVL CDR2配列；およびアミノ酸配列ALWYSNHWV（SEQ ID NO:225）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVL CDR3配列を含む。
いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、アミノ酸VLWYSNRWV（SEQ ID NO:226）を少なくとも含むCDR3を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、アミノ酸VLWYSNRWV（SEQ ID NO:226）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるCDR3を含む。
いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、Fab断片、F(ab')2断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、抗CD3結合ドメインは、（本明細書中で抗CD3ε Fv断片と呼ばれる）CD3εに結合するFv抗体断片を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε Fv抗体断片は、ジスルフィドによって安定化された抗CD3結合Fv断片（dsFv）である。いくつかの態様において、抗CD3結合ドメインは、CD3結合について1価である。
いくつかの態様において、CD3結合領域は、単鎖抗体ではない。例えば、いくつかの局面において、CD3結合領域は、単鎖可変断片（scFv）ではない。
いくつかの態様において、CD3結合領域は、記載される任意のもののような、可変重鎖（Hv、VHとも呼ばれる）および可変軽鎖（Lv、VLとも呼ばれる）を含有しているFv抗体断片である。そのような態様の局面において、免疫グロブリンFc領域は、セクションII.2に記載される任意のもののような、Fcヘテロ二量体の両方のポリペプチドの間のヘテロ二量体会合が可能な2種の異なるFcポリペプチドを含有しているヘテロ二量体Fc領域である。そのような態様において、CD3結合領域の可変重鎖（VH）および可変軽鎖（VL）は、ヘテロ二量体Fcの対向する鎖に連結されている。
いくつかの態様において、抗CD3ε Fv抗体断片は、SEQ ID NO:32〜81の群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε Fv抗体断片は、SEQ ID NO:32〜81からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε Fv抗体断片は、SEQ ID NO:32〜62の群より選択されるアミノ酸配列とSEQ ID NO:63〜81からなる群より選択されるアミノ酸配列との組み合わせを含む。いくつかの態様において、抗CD3ε Fv抗体断片は、SEQ ID NO:32〜62の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列と、SEQ ID NO:63〜81からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列との組み合わせを含む。
いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:32〜81の群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域アミノ酸配列と軽鎖可変領域アミノ酸配列との組み合わせを含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:32〜62の群より選択される重鎖可変領域アミノ酸配列とSEQ ID NO:63〜81の群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域アミノ酸配列との組み合わせを含む。
いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、重鎖可変アミノ酸配列と軽鎖可変アミノ酸配列との組み合わせを含むFv断片である。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:14、15、32〜81、191、196〜200、211、および212からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変アミノ酸配列と軽鎖可変アミノ酸配列との組み合わせを含むＦv断片である。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:14、15、32〜81、191、196〜200、211、および212からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変アミノ酸配列と軽鎖可変アミノ酸配列との組み合わせを含むFv断片である。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:14、32〜62、196〜198、および211の群より選択される重鎖可変アミノ酸配列と、SEQ ID NO:15、63〜81、191、199、200、および212からなる群より選択される軽鎖可変アミノ酸配列との組み合わせを含むFv断片である。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:14、32〜62、196〜198、および211からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である重鎖可変アミノ酸配列と、SEQ ID NO:15、63〜81、191、199、200、および212からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である軽鎖可変アミノ酸配列との組み合わせを含むFv断片である。
いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:32〜81、191、196〜200、211、および212の群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域アミノ酸配列と軽鎖可変領域アミノ酸配列との組み合わせを含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:32〜62、196〜198、および211の群より選択される重鎖可変領域アミノ酸配列と、SEQ ID NO:63〜81、191、199、200、および212の群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域アミノ酸配列との組み合わせを含む。
いくつかの態様において、抗CD3ε Fv抗体断片は、SEQ ID NO:14、32〜43、45〜47、48、196、および211からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列と、SEQ ID NO:15、63、65〜71、73、75、77、および199からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列との組み合わせを含む。いくつかの態様において、抗CD3ε Fv抗体断片は、SEQ ID NO:14、32〜43、45〜47、48、196、および211の群より選択されるアミノ酸配列と、SEQ ID NO:15、63、65〜71、73、75、77、および199からなる群より選択されるアミノ酸配列との組み合わせを含む。
いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）、およびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）およびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。
いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:196のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:199のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:196のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）、およびSEQ ID NO:199のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:196のアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:199のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:196のアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）およびSEQ ID NO:199のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。
具体的な態様において、Fvは、VH-VLヘテロ二量体が鎖間ジスルフィド結合によって安定化されている、ジスルフィドによって安定化されたFv（dsFv）である。いくつかの態様において、鎖間ジスルフィド結合は、VH鎖および/またはVL鎖のフレームワーク位置における位置の変異によって改変されている。いくつかの態様において、ジスルフィドによって安定化された抗CD3 Fvは、Kabatナンバリングによって、44位におけるCysへの変異を含む抗CD3 VHおよび100位におけるCysへの変異を含む抗CD3 VLを含む。例えば、いくつかの態様において、各々Kabatナンバリングによって、VH鎖は変異G44Cを含有しており、VL鎖は変異G100Cを含有している。いくつかの態様において、ジスルフィドによって安定化された抗CD3 Fvは、Kabatナンバリングによって、105位におけるCysへの変異を含む抗CD3 VHおよび43位におけるCysへの変異を含む抗CD3 VLを含む。
いくつかの態様において、抗CD3ε Fvは、SEQ ID NO:44、49〜62、197、および198からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列と、SEQ ID NO:64、72、74、76、78〜81、191、200、および212からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列との組み合わせを含む。そのような態様のいくつかにおいて、抗CD3 Fvは、各々Kabatナンバリングによって、変異G44Cを含有しているVH鎖および変異G100Cを含有しているVL鎖を有するdsFvである。いくつかの態様において、抗CD3ε Fv抗体断片は、SEQ ID NO:44、49〜62、197、および198の群より選択されるアミノ酸配列と、SEQ ID NO:64、72、74、76、78〜81、191、200、および212からなる群より選択されるアミノ酸配列との組み合わせを含む。
いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:44のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:72のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:44のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）、およびSEQ ID NO:72のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。そのような態様のいくつかにおいて、抗CD3 Fvは、各々Kabatナンバリングによって、変異G44Cを含有しているVH鎖および変異G100Cを含有しているVL鎖を有するdsFvである。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:72のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）およびSEQ ID NO:72のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。
いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:198のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:200のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:198のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）、およびSEQ ID NO:200のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。そのような態様のいくつかにおいて、抗CD3 Fvは、各々Kabatナンバリングによって、変異G44Cを含有しているVH鎖および変異G100Cを含有しているVL鎖を有するdsFvである。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:198のアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:200のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:198のアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）およびSEQ ID NO:200のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。
いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:197のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:200のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:197のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）、およびSEQ ID NO:200のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。そのような態様のいくつかにおいて、抗CD3 Fvは、各々Kabatナンバリングによって、変異G44Cを含有しているVH鎖および変異G100Cを含有しているVL鎖を有するdsFvである。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:197のアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:200のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:197のアミノ酸配列を含む可変重鎖（VH）およびSEQ ID NO:200のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（VL）を含む。
2．免疫グロブリンFcポリペプチド：
本開示の多重特異性ポリペプチド構築物の第1の成分は、免疫グロブリンFc領域を含む。いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、IgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、IgG3アイソタイプ、およびIgG4サブクラスからなる群より選択されるIgGアイソタイプである。いくつかの態様において、Fc領域は、ヒトFcである。いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO:1〜6からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO:1〜6のいずれかの免疫活性断片であるFc鎖を含有している。いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO:1〜6のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％同一であるFcポリペプチド鎖、またはその免疫活性断片を含有している。
いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、各々Fcを含有しているポリペプチドによって形成された二量体である。いくつかの具体的な態様において、同一のまたは実質的に同一のポリペプチドが、ホモ二量体を作製するために二量体化するであろう。いくつかの態様において、二量体は、多重特異性ポリペプチド構築物の2本のポリペプチドが同一であるホモ二量体である。他のケースにおいて、Fc領域は、異なるポリペプチドが二量体化してヘテロ二量体を与えるヘテロ二量体化を促進するために変異させられたまたは修飾されたFcドメインによって形成される。従って、いくつかの態様において、二量体は、多重特異性ポリペプチド構築物の2本のポリペプチド鎖が異なるヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化を促進するための例示的な修飾は、公知であり、下記のものを含む。
概して、Fc領域は、免疫グロブリンの主要な機能である抗原結合能力に加えて、補体依存性細胞傷害（CDC）および抗体依存性細胞傷害（ADCC）のようなエフェクター機能を担う。さらに、Fc領域に存在するFcRn配列は、インビボFcRn受容体とのコンジュゲーションによって、インビボ半減期を増加させることによって、血清中のIgGレベルを制御する役割を果たす。いくつかの態様において、提供された多重特異性ポリペプチド構築物と共に使用するためのFcにおいて、そのような機能は、変更されていてよく、例えば、低下していてもよいしまたは増強されていてもよい。
いくつかの態様において、提供された多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域は、1種または複数種のエフェクター機能を示す。いくつかのケースにおいて、Fc領域は、例えば、ADCC（例えば、NK細胞によるグランザイムBの放出）、ADCP、および/またはCDCのような、Fcによって媒介されるエフェクター機能を提供することができる。従って、多重特異性ポリペプチド構築物が切断可能リンカーを含有しているいくつかの態様において、リンカーの切断は、T細胞上のCD3に結合し係合することができるCD3結合領域、および標的特異的なエフェクター機能を示すことができるTAA抗原結合ドメインに連結されたFc領域という、生物学的活性を各々有する2種の成分を産生することができる。本明細書に提供する特定の態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、非切断可能リンカーを含み、いくつかの局面では、Fcが介在する独立したエフェクター機能を示さない場合もある。
いくつかの態様において、Fc領域は、1種または複数種のエフェクター機能を変更するために変異させられたまたは修飾されたFcポリペプチドを含む。エフェクター機能を変更するため、例えば、低下させるためのFcポリペプチドの変異の様々な例は、公知であり、下記のものを含む。いくつかの態様において、特定のSEQ ID NOに関して記載されない限り、Fc領域におけるアミノ酸置換の言及は、（Kabatナンバリングとも呼ばれる）KabatによるEUナンバリングによる。EUナンバリングは、公知であり、最新のIMGT Scientific Chart(IMGT（登録商標）,the international ImMunoGeneTics information system（登録商標）、http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html(created:17 May 2001,last updated:10 Jan 2013)およびKabat, E. A. et al. Sequences of Proteins of Immunological interest. 5th ed. US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242 (1991)において報告されたEUインデックスによる。
いくつかの態様において、低下したエフェクター機能を示すFc領域を含有している提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、制約されたCD3結合が望まれるが、（CDCおよびADCCのような）ある種のエフェクター機能が不必要であるかまたは有害である適用のため、望ましい候補であり得る。インビトロおよび/またはインビボの細胞傷害アッセイが、CDC活性および/またはADCC活性の低下/枯渇を確認するために実施され得る。例えば、多重特異性ポリペプチド構築物および/または切断されたその成分が、FcγR結合を欠く（従って、ADCC活性を欠く可能性が高い）が、FcRn結合能力を保持することを確実にするため、Fc受容体（FcR）結合アッセイが実施され得る。ADCCを媒介するための主な細胞、NK細胞は、FcγRIIIのみを発現し、単球は、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。関心対象の分子のADCC活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第5,500,362号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063(1986)を参照すること）およびHellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502(1985)；米国特許第5,821,337号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166: 1351-1361(1987)を参照すること）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法が利用されてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのACTI（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（CellTechnology, I nc. Mountain View, Calif.）；およびCytoTox 96（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Promega, Madison, Wis.）を参照すること）。そのようなアッセイのために有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えば、Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656(1998)に開示されたもののような動物モデルにおいて評価され得る。多重特異性ポリペプチド構築物または切断されたその成分がC1qに結合することができず、従って、CDC活性を欠くことを確認するため、C1q結合アッセイも実施され得る。例えば、WO 2006/029879およびWO 2005/100402のC1q結合ELISAおよびC3c結合ELISAを参照すること。補体活性化を評価するためには、CDCアッセイが実施され得る（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163(1996)；Cragg, M. S. et al., Blood 101:1045-1052(2003)；およびCragg, M. S. and M. J. Glennie, Blood 103:2738-2743(2004)を参照すること）。FcRn結合およびインビボクリアランス/半減期の決定も、当技術分野において公知の方法を使用して実施され得る（例えば、Petkova, S. B. et al., Int'l. Immunol. 18 (12): 1759-1769(2006)を参照すること）。
いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域またはその免疫活性断片は、IgGアイソタイプである。例えば、融合タンパク質の免疫グロブリンFc領域は、以下のアミノ酸配列を有する、ヒトIgG1アイソタイプのものである。
Figure 2021520812
いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域またはその免疫活性断片は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヒトIgG1ポリペプチド配列を含む。
いくつかの態様において、下記の任意のもののような、IgG1 Fcポリペプチドまたはそのバリアントは、G1 m1アロタイプまたはG1 m3アロタイプで作製され得る。いくつかの態様において、Fc領域は、例えば、SEQ ID NO:1に示されるように、356位および358位におけるAsp（D）およびLeu（L）を含有している残基のような、ヒトG1 m1アロタイプのアミノ酸を含有していてもよい。いくつかのケースにおいて、Fcポリペプチドは、アロタイプG1 m1の残基を再構成するため、アミノ酸置換E356DおよびM358Lを含有していてもよい。他の態様において、Fc領域は、例えば、SEQ ID NO:194および195に示されるように、EUナンバリングによって、356位および358位における残基Glu（E）およびMet（M）のようなヒトG1 m3アロタイプのアミノ酸を含有していてもよい。いくつかのケースにおいて、Fcポリペプチドは、アロタイプG1 m3の残基を再構成するため、アミノ酸置換D356EおよびL358Mを含有していてもよい。いくつかの態様において、ヒトIgG1 Fc領域は、抗体依存性細胞傷害（ADCC）および/または補体依存性細胞傷害（CDC）を変更するために修飾される。例えば、Natsume et al., 2008 Cancer Res,68(10): 3863-72；Idusogie et al., 2001 J Immunol, 166 (4):2571-5；Moore et al., 2010 mAbs, 2 (2): 181-189；Lazar et al., 2006 PNAS, 103 (11): 4005-4010、Shields et al., 2001 JBC, 276 (9): 6591-6604；Stavenhagen et al., 2007 Cancer Res,67(18): 8882-8890；Stavenhagen et al.,2008 Advan. Enzyme Regul., 48: 152-164；Alegre et al, 1992 J Immunol, 148: 3461-3468に記載され；Kaneko and Niwa,2011 Biodrugs,25(1):1-11に概説されたアミノ酸修飾。それらの各々の内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様において、ヒトIgG1 Fc領域のようなFc領域は、ADCC活性またはCDC活性を増強するために修飾される。ADCCを増強する変異の例は、Ser239およびIle332における修飾、例えば、Ser239AspおよびIle332Glu（S239D、I332E）を含む。CDCを増強する変異の例には、Lys326およびGlu333における修飾が含まれる。いくつかの態様において、Fc領域は、Kabatナンバリングシステムを使用して、これらの位置の一方または両方において修飾される（例えば、Lys326Alaおよび/またはGlu333Ala（K326AおよびE333A））。
いくつかの態様において、本開示のヒトIgG1 Fc領域融合タンパク質は、N297におけるN結合型グリカン鎖に付着したフコースを欠くかまたは低下したフコースを有する。FUT8欠損細胞株における産生；哺乳動物細胞培養培地への阻害剤、例えば、カスタノスペルミンの添加；および産生細胞株の代謝工学を含むが、これらに限定されるわけではない、フコシル化を防止する多数の方式が存在する。いくつかの態様において、ヒトIgG1 Fc領域は、融合タンパク質のグリコシル化を防止するため、アミノ酸Asn297（ボックス内、Kabatナンバリング）において修飾される（例えば、Asn297Ala（N297A）またはAsn297Asp（N297D））。
いくつかの態様において、Fc領域は、例えば、低下したFc受容体結合、例えば通常FcRn結合ではなくFcγR結合への結合を介して、低下したFc媒介エフェクター機能を提供するよう改変される。いくつかの態様において、融合タンパク質のFc領域は、Fc受容体結合を低下させるため、以下の位置のうちの1つまたは複数において変更される：Leu234（L234）、Leu235（L235）、Asp265（D265）、Asp270（D270）、Ser298（S298）、Asn297（N297）、Asn325（N325）、またはAla327（A327）。例えば、Leu234Ala（L234A）、Leu235Ala（L235A）、Asp265Asn（D265N）、Asp270Asn（D270N）、Ser298Asn（S298N）、Asn297Ala（N297A）、Asn325Glu（N325E）、またはAla327Ser（A327S）。いくつかの態様において、融合タンパク質のFc領域は、Fc受容体相互作用を変更するため、アミノ酸Leu235（前記SEQ ID NO:1のボックス内、Kabatナンバリング）において修飾される（例えば、Leu235Glu（L235E）またはLeu235Ala（L235A））。いくつかの態様において、融合タンパク質のFc領域は、Fc受容体相互作用を変更するため、アミノ酸Leu234（前記SEQ ID NO:1のボックス内、Kabatナンバリング）において修飾される（例えば、Leu234Ala（L234A））。いくつかの態様において、融合タンパク質のFc領域は、アミノ酸234および235の両方において変更される（例えば、Leu234AlaおよびLeu235Ala（L234A/L235A）またはLeu234ValおよびLeu235Ala（L234V/L235A））。好ましい態様において、Fc領域内の修飾は、Fc受容体γ受容体との結合を低下させるが、新生児型Fc受容体（FcRn）との結合に対しては最小の影響を及ぼす。
いくつかの態様において、ヒトIgG Fc領域は、FcRn結合を増強するために修飾される。FcRnとの結合を増強するFc変異の例は、Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu（それぞれ、M252Y、S254T、T256E）（Kabatナンバリング、Dall'Acqua et al 2006,J. Biol Chem Vol. 281(33)23514-23524）、Met428LeuおよびAsn434Ser（M428L、N434S）（Zalevsky et al 2010 Nature Biotech,Vol. 28(2)157-159）（Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological InterestのEUインデックス）である。いくつかの態様において、変異型または修飾型のFcポリペプチドは、Kabatナンバリングシステムを使用して、以下の変異を含む：Met252TyrおよびMet428LeuまたはMet252TyrおよびMet428Val（M252Y、M428LまたはM252Y、M428V）。
いくつかの態様において、融合タンパク質のFc領域は、Fc受容体結合を低下させるため、以下の位置のうちの1つまたは複数におけるアミノ酸を欠いている:Glu233（E233）、Leu234（L234）、またはLeu235（L235）。これらの態様において、これらの3個のアミノ酸のFc欠失は、補体タンパク質C1q結合を低下させる。
Figure 2021520812
いくつかの態様において、Fc領域は、Fc受容体結合を低下させるため、以下の位置のうちの1個または複数個において変異している：Glu233（E233）、Leu234（L234）、またはLeu235（L235）。1個または複数個の変異には、E233P、L234V、および/またはL235Aが含まれ得る。
いくつかの態様において、融合タンパク質のFc領域は、Fc受容体結合を低下させるため、Gly236（前記SEQ ID NO:1のボックス内）において変更される。例えば、Gly236が融合タンパク質から欠失させられる。いくつかの態様において、ヒトIgG1 Fc領域は、CD32Aとの相互作用を増強するため、アミノ酸Gly236において修飾される（例えば、Gly236Ala（G236A））。
具体的な態様において、例えば、Fc受容体のFcγRとの結合の低下を介して、Fcエフェクター機能を低下させるためのFc領域の変異には、G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、またはE233P/L234V/L235A/G236delのいずれかの変異が含まれる。
いくつかの態様において、ヒトIgG1 Fc領域は、Lys447を欠く（Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological InterestのEUインデックス）。
いくつかの態様において、融合物またはその免疫活性断片は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヒトIgG2ポリペプチド配列を含む。
いくつかの態様において、融合タンパク質の免疫グロブリンFc領域またはその免疫活性断片は、以下のアミノ酸配列を有する、ヒトIgG2アイソタイプのものである。
Figure 2021520812
いくつかの態様において、融合物またはその免疫活性断片は、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヒトIgG2ポリペプチド配列を含む。
いくつかの態様において、ヒトIgG2 Fc領域は、アミノ酸Asn297において修飾される（ボックス内、抗体のグリコシル化を防止するため、例えば、Asn297Ala（N297A）またはAsn297Asp（N297D））。いくつかの態様において、ヒトIgG2 Fc領域は、Lys447を欠く（Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological InterestのEUインデックス）。
いくつかの態様において、融合タンパク質の免疫グロブリンFc領域または免疫活性断片は、以下のアミノ酸配列を有する、ヒトIgG3アイソタイプのものである。
Figure 2021520812
いくつかの態様において、抗体またはその免疫活性断片は、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヒトIgG3ポリペプチド配列を含む。
いくつかの態様において、ヒトIgG3 Fc領域は、抗体のグリコシル化を防止するため、アミノ酸Asn297（ボックス内、Kabatナンバリング）において修飾される（例えば、Asn297Ala（N297A）またはAsn297Asp（N297D））。いくつかの態様において、ヒトIgG3 Fc領域は、半減期を延長するため、アミノ酸435において修飾される（例えば、Arg435His（R435H））。いくつかの態様において、ヒトIgG3 Fc領域は、Lys447を欠く（Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological InterestのEUインデックス）。
いくつかの態様において、融合タンパク質の免疫グロブリンFc領域または免疫活性断片は、以下のアミノ酸配列を有するヒトIgG4アイソタイプのものである。
Figure 2021520812
いくつかの態様において、抗体またはその免疫活性断片は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヒトIgG4ポリペプチド配列を含む。
いくつかの態様において、融合タンパク質の免疫グロブリンFc領域または免疫活性断片は、以下のアミノ酸配列を有する、ヒトIgG4アイソタイプのものである。
Figure 2021520812
いくつかの態様において、抗体またはその免疫活性断片は、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヒトIgG4ポリペプチド配列を含む。
他の態様において、ヒトIgG4 Fc領域は、Fc受容体相互作用を変更するため、アミノ酸235において修飾される（例えば、Leu235Glu（L235E））。いくつかの態様において、ヒトIgG4 Fc領域は、抗体のグリコシル化を防止するため、アミノ酸Asn297（ボックス内、Kabatナンバリング）において修飾される（例えば、Asn297Ala（N297A）またはAsn297Asp（N297D））。いくつかの態様において、ヒトIgG4 Fc領域は、Lys447を欠く（Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological InterestのEUインデックス）。
いくつかの態様において、ヒトIgG Fc領域は、Ser354のCysへの変化（S354C）およびTyr349のCysへの変化（Y349C）（S354C/Y349C）によって、2個のジスルフィド結合を導入することによって、CH3:CH3界面におけるホモ二量体化を安定化するために修飾される。
本明細書に提供する多重特異性ポリペプチド構築物の特定の態様において、ヒトIgG Fc領域は、ヘテロ二量体化を誘導するために修飾される。相補的なFcポリペプチドのヘテロ二量体化を促進するための様々な方法が、公知である。例えば、Ridgway et al, Protein Eng. 9:617-621(1996)；Merchant et al, Nat. Biotechnol. 16(7):677-81(1998)；Moore et al. (2011)MAbs,3:546-57；Von Kreudenstein et al. MAbs, (2013)5: 646-54；Gunasekaran et al. (2010) J. Biol. Chem., 285: 19637-46；Leaver-Fay et al. (2016) Structure, 24:641-51；Ha et al. (2016)Frontiers in Immunology,7:1；Davis et al. (2010) Protein Eng Des Sel, 23: 195-202；公開された国際PCT出願番号WO 1998/050431、WO2009/089004、WO2011143545、WO2014/067011、WO2012/058768、WO2018027025；公開された米国特許出願番号US20140363426、US20150307628、US20180016354、US20150239991；ならびに米国特許第5731168号、第7183076号、第9701759号、第9605084号、および第9650446号を参照すること。Fc鎖のヘテロ二量体化を促進する方法には、例えば、「ノブイントゥホール」変異のセットを含めるか、または異なるポリペプチド鎖の間の誘引相互作用にとって有利となるよう、Fcの静電的ステアリングを達成するための変異を含めることによる、Fc領域の変異誘発が含まれる。例えば、いくつかの態様において、ヘテロ二量体のFcポリペプチドは、静電的にマッチしたFc鎖の共発現が、有利な誘引相互作用を支持し、それによって、所望のFcヘテロ二量体の形成を促進し、不利な反発電荷相互作用が、望まれないFcホモ二量体の形成を抑制するよう、Fc二量体界面における電荷極性を変更するための変異を含む（Guneskaran et al., (2010)JBC,285:19637-19646）。細胞において共発現された時、鎖間の会合が可能であるが、電荷反発のため、鎖は実質的に自己会合しない。ヘテロ二量体Fcを生成するための他の戦略には、SEED Fcと呼ばれる、相補的なCH3のヘテロ二量体を作製するためのヒトIgGおよびIgAのCH3ドメインセグメントの混合が含まれる。
ヘテロ二量体化の方法および変法には、（「スキュー（skew）」バリアントとも呼ばれる）「ノブアンドホール（knobs and holes）」変異、「静電的ステアリング」または「電荷対」に関係する変異、およびpIバリアントを含む、公開された国際PCT出願WO2014/145806に記載されたものも含まれる。ヘテロ二量体バリアントには、公開された米国出願番号US2012/0149876またはUS2018/011883に記載される任意のものも含まれる。
いくつかの態様において、ヘテロ二量体化を促進するため、Fcヘテロ二量体の両方のポリペプチドが、ペアのまたは相補的なアミノ酸修飾を含有している。Fc融合物のポリペプチドの例示的なアミノ酸修飾のペアを、表1に示す。
（表１）ヘテロ二量体Fcのアミノ酸のペア
Figure 2021520812
いくつかの態様において、修飾は、第1および第2のFc含有ポリペプチドの複合体化を促進するため、隆起が空洞に位置付けられるよう、第1のFcポリペプチドに隆起（ノブ）を導入し、第2のFcポリペプチドに空洞（ホール）を導入することを含む。ポリペプチドに隆起または空洞を作製するための置換および/または修飾の標的とされるアミノ酸は、典型的には、第2のポリペプチドの界面にある1つまたは複数のアミノ酸と相互作用するかまたは接触する界面アミノ酸である。
いくつかの態様において、隆起（ホール）アミノ酸を含有するよう修飾される第1のFcポリペプチドは、第1のFcポリペプチドの界面から突出し、従って、第2のポリペプチドの近接した界面において代償的な空洞（ホール）に位置付けられる少なくとも1個の側鎖を有するアミノ酸への、ネイティブのまたは最初のアミノ酸の置換を含む。置換アミノ酸は、最初のアミノ酸残基より大きい側鎖体積を有するものであることが最も多い。隆起を作製するための理想的な置換アミノ酸であるものを同定するため、アミノ酸残基の特性を決定しかつ/または評価する方法は、当業者に公知である。いくつかの態様において、隆起の形成のための置換残基は、天然に存在するアミノ酸残基であり、例えば、アルギニン（R）、フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、またはトリプトファン（W）を含む。いくつかの例において、置換のために同定される最初の残基は、例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、またはバリンのような、小さい側鎖を有するアミノ酸残基である。
いくつかの態様において、空洞（ホール）を含有するよう修飾される第2のFcポリペプチドは、第2のポリペプチドの界面から凹んでおり、従って、第1のポリペプチドの界面からの対応する隆起を受け入れることができる少なくとも1個の側鎖を有するアミノ酸への、ネイティブのまたは最初のアミノ酸の置換を含むものである。置換アミノ酸は、最初のアミノ酸残基より小さい側鎖体積を有するものであることが最も多い。空洞の形成のための理想的な置換残基であるものを同定するため、アミノ酸残基の特性を決定しかつ/または評価する方法は、当業者に公知である。一般に、空洞の形成のための置換残基は、天然に存在するアミノ酸であり、例えば、アラニン（A）、セリン（S）、トレオニン（T）、およびバリン（V）を含む。いくつかの例において、置換のために同定される最初のアミノ酸は、例えば、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、またはトリプトファンのような、大きい側鎖を有するアミノ酸である。
ヒトIgG1のCH3界面は、例えば、各表面から1090Å2埋め込まれている4本の逆平行β鎖に位置する各ドメインの16残基を含む（例えば、Deisenhofer et al. (1981)Biochemistry,20:2361-2370；Miller et al., (1990)J Mol. Biol. ,216,965-973；Ridgway et al.,(1996)Prot. Engin. ,9:617-621；米国特許第5,731,168号を参照すること）。隆起または空洞を作製するためのCH3ドメインの修飾は、例えば、米国特許第5,731,168号；国際特許出願WO98/50431およびWO2005/063816；ならびにRidgway et al., (1996)Prot.Engin.617-621に記載されている。いくつかの例において、隆起または空洞を作製するためのCH3ドメインの修飾は、典型的には、2本の中央の逆平行β鎖に位置する残基を標的とする。目標は、作製される隆起が、パートナーCH3ドメインの代償的な空洞に受け入れられるのではなく、周囲の溶媒に突出することによって受け入れられるリスクを最小化することである。
例えば、いくつかの態様において、ヘテロ二量体Fcは、よりかさの大きいアミノ酸、例えば、Tryと交換された時（T366W）、よりかさの小さいアミノ酸、例えば、それぞれ、Ser、Ala、Valへの位置Thr366、Leu368、およびTyr407におけるアミノ酸修飾（T366S/L368A/Y407V）を有する第2のCH3ドメインと優先的に対形成することができる、CH3ドメイン内のThr366にアミノ酸修飾を有するポリペプチドを含む。CH3修飾を介したヘテロ二量体化は、例えば、反対のCH3ドメインにおけるSer354のCysへの変化（S354C）およびTyr349のCysへの変化（Y349C）による、ジスルフィド結合の導入によって、さらに安定化され得る（Carter,2001 Journal of Immunological Methods,248:7-15に概説されている）。
具体的な態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、Fcヘテロ二量体化を媒介することができる第1および第2のFcを含有しており、第1のFcポリペプチドは、変異T366WおよびS354Cを含有しており、第2のFcポリペプチドは、変異T366S、L368A、Y407V、およびY349Cを含有している。いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:201または207に示される配列を含むFcポリペプチドより選択され、第2のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:202、205、または209に示される配列を含むFcポリペプチドより選択される。いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:82、86、94、もしくは96のいずれかに示されるアミノ酸の配列であるか、またはそれを含み、第2のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:83、87、90、92、98、もしくは100のいずれかに示されるアミノ酸の配列であるか、またはそれを含む。
いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、Fcによって媒介されるエフェクター機能を提供する特色を示す。具体的な例において、第1のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:201に示される配列であるか、またはそれを含み、第2のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:202もしくは205であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:82に示される配列であるか、またはそれを含み、第2のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:83もしくは90に示される配列であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:86に示される配列であるか、またはそれを含み、第2のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:87もしくは92に示される配列であるか、またはそれを含む。第1および第2のFcポリペプチドは、構築物のいずれかのポリペプチド鎖においてフォーマットされ得る。
いくつかの態様において、第1および第2のFcポリペプチドの一方または両方は、低下したFc受容体結合のような1種または複数種のFcエフェクター機能をさらに低下させるための1個または複数個のアミノ酸変異をさらに含み得る。Fcエフェクター機能を低下させるための例示的な変異には、記載される任意のものが含まれる。いくつかの態様において、修飾は、Glu233（E233）、Leu234（L234）、およびLeu235（L235）の欠失のような、1個または複数個の位置Glu233（E233）、Leu234（L234）、またはLeu235（L235）の欠失であり得る。いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:203または208に示される配列を含むFcポリペプチドより選択され、第2のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:204、206、または210に示される配列を含むFcポリペプチドより選択される。いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:84、88、95、もしくは97のいずれかに示されるアミノ酸の配列であるか、またはそれを含み、第2のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:85、89、91、93、99、もしくは101のいずれかに示されるアミノ酸の配列であるか、またはそれを含む。
具体的な例において、第1のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:203に示される配列であるか、またはそれを含み、第2のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:204もしくは206であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:84に示される配列であるか、またはそれを含み、第2のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:85もしくは91に示される配列であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:88に示される配列であるか、またはそれを含み、第2のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:89もしくは93に示される配列であるか、またはそれを含む。第1および第2のFcポリペプチドは、構築物のいずれかのポリペプチド鎖においてフォーマットされ得る。
いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドまたは第2のFcポリペプチドは、変異M252Yおよび/またはM428Vをさらに含む。具体的な例において、第1のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:207に示される配列であるか、またはそれを含み、第2のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:209に示される配列であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:94に示される配列であるか、またはそれを含み、第2のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:98に示される配列であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:96に示される配列であるか、またはそれを含み、第2のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:100に示される配列であるか、またはそれを含む。他の例において、第1のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:208に示される配列であるか、またはそれを含み、第2のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:210に示される配列であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:95に示される配列であるか、またはそれを含み、第2のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:99に示される配列であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、第1のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:97に示される配列であるか、またはそれを含み、第2のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:101に示される配列であるか、またはそれを含む。第1および第2のFcポリペプチドは、構築物のいずれかのポリペプチド鎖においてフォーマットされ得る。
ヘテロ二量体の促進を容易にすることができるバリアントの付加的な例は、S364K/E357QおよびL368D/K370S；L368D/K370SおよびS364K；L368E/K370SおよびS364K；T411T/E360E/Q362EおよびD401K；L368D/K370SおよびS364K/E357L、K370SおよびS364K/E357QおよびT366S/L368A/Y407VおよびT366W、または366S/L368A/Y407V/Y349CおよびT366W/S354C（各対は第1のFcポリペプチドおよび第2のFcポリペプチドにおける変異を表す）からの第1のFcポリペプチドおよび第2のFcポリペプチドの立体的バリアント（例えば、スキューバリアント）の任意の組み合わせまたは対である。具体的な態様において、提供された構築物は、変異対L368D/K370SおよびS364KおよびE357Qを含有している第1および第2のFcポリペプチドを含有している。
ヘテロ二量体の生成において使用され得る付加的な機序は、Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285 (25): 19637 (2010)に記載されるような「静電的ステアリング」と時に呼ばれるものである。これは、本明細書中で「電荷対」と時に呼ばれる。この態様においては、ヘテロ二量体化に形成を偏向させるため、静電気学が使用される。当業者が理解するように、これらは、pIに対する効果、従って、精製に対する効果も有し、従って、いくつかのケースにおいて、pIバリアントとも見なされ得る。しかしながら、これらは、ヘテロ二量体化を強制するために生成され、精製ツールとしては使用されなかったため、「立体的バリアント」として分類される。一つの態様において、第1のFcポリペプチドは、変異D221E/P228E/L368Eを含有していてよく、第2のFcポリペプチドは、変異D221R/P228R/K409Rを含有していてよい。別の態様において、第1のFcポリペプチドは、変異C220E/P228E/368Eを含有していてよく、第2のFcポリペプチドは、変異C220R/E224R/P228R/K409Rを含有していてよい。
いくつかの態様において、ヘテロ二量体化は、pIバリアントによって容易にされ得る。いくつかの局面において、pIバリアントには、タンパク質のpIを増加させるもの（塩基性変化）が含まれ得る。他の局面において、pIバリアントには、タンパク質のpIを減少させるもの（酸性変化）が含まれ得る。いくつかのケースにおいて、一方のFcポリペプチドが、野生型、または野生型と有意に異なるpIを示さないバリアントであり得、他方のFcポリペプチドが、より塩基性またはより酸性であり得る組み合わせを含む、これらのバリアントの全ての組み合わせが行われ得る。あるいは、一方をより塩基性に、一方をより酸性に、各Fcポリペプチドを変化させてもよい。いくつかの態様において、少なくとも1個のFcポリペプチドは、変異Q295E/N384D/Q418E/N421Dを含有しているネガティブpIバリアントFcである。
いくつかの態様において、立体的ヘテロ二量体化バリアント（例えば、ノブアンドホール）とpIバリアントまたは電荷対バリアントとの組み合わせが使用され得る。
具体的な態様において、提供された構築物は、（a）スキューバリアントS364K/E357Qを含む第1のFcポリペプチド；および（b）スキューバリアントL368D/K370SおよびpIバリアントN208D/Q295E/N384D/Q418E/N421Dを含有している第2のFcポリペプチドを含有している。いくつかの態様において、第1および第2のポリペプチドの一方または両方は、例示的な変異E233P/L234V/L235A/G236del/S267Kのような、Fcエフェクター活性を低下させるためのさらなる変異を含有していてもよい。Fcヘテロ二量体化を媒介することができるそのような第1のFcポリペプチドおよび第2のFcポリペプチドの例には、SEQ ID NO:194および195に示される配列が含まれる。第1および第2のFcポリペプチドは、構築物のいずれかのポリペプチド鎖においてフォーマットされ得る。
得られた多重特異性ポリペプチド構築物は、例えば、プロテインAカラムまたはプロテインGカラムにおけるアフィニティクロマトグラフィのような、適当な方法によって精製され得る。異なるポリペプチドをコードする2種の核酸分子が細胞へ形質転換された場合、ホモ二量体およびヘテロ二量体の形成が起こるであろう。ヘテロ二量体形成がホモ二量体形成より有利となるよう、発現のための条件を調整することができる。
ヘテロ二量体のアフィニティ試薬に対するディファレンシャルな親和性に基づく、ヘテロ二量体のホモ二量体からの回収のための技術は、公知である。いくつかの局面において、そのような技術には、Fcポリペプチド鎖のうちの一方がアフィニティ試薬プロテインAに結合しないような、ヘテロ二量体の設計が含まれる。いくつかのケースにおいて、ポリペプチド鎖のうちの一方は、Fcヘテロ二量体のポリペプチドのうちの一方においてプロテインA試薬に対する親和性を消失させるかまたは低下させるため、1つまたは複数のアミノ酸置換を含有していてよい。例えば、WO2017134440、WO2010151792、Jendebergら（Jendeberg et al., (1997) J. Immunol. Methods, 201(1): 25-34）を参照すること。これらの態様のいくつかにおいて、Fc領域は、プロテインA結合を防止し、それによって、ヘテロ二量体融合タンパク質のより効率的な精製を可能にするため、ヘテロ二量体の一方のメンバーのプロテインA結合部位において修飾され得る。この結合部位における例示的な修飾は、Ile253、例えば、Ile253Arg（I253R）である。いくつかの態様において、修飾は、H435RまたはH435R/Y436Fであり得る。いくつかの態様において、Fcヘテロ二量体のFcポリペプチドは、プロテインAに結合することができ、プロテインGには結合し得ないような修飾（pA+/pG-）を含有していてよい。例示的なpA+/pG-アミノ酸修飾には、ヒトIgGlに関して、428位にセリン、434位にセリンを含有しており、任意で、436位にヒスチジンを含有しているか、またはヒトIgG 2、3、もしくは4における対応する位置にこれらの残基を含むFcが含まれる。いくつかの局面において、あるIgG Fcポリペプチドの428位、434位におけるそのようなアミノ酸修飾、および、任意で、436位におけるそのようなアミノ酸修飾は、プロテインGの結合を低下させるかまたは防止し、タンパク質の精製を増強する。
いくつかの態様において、アフィニティ試薬に対するディファレンシャルな親和性を付与するそのような修飾のいずれかを、前記の1つまたは複数の他のアミノ酸修飾と組み合わせることができる。例えば、I253R修飾を、T366S/L368A/Y407V修飾またはT366W修飾のいずれかと組み合わせることができる。T366S/L368A/Y407V修飾型Fcは、T336W修飾型Fcのケースにおいては存在する二量体化界面の立体障害が存在しないため、ホモ二量体を形成することができる。従って、いくつかの態様において、形成された可能性のあるホモ二量体Fcの精製が許可されないよう、I253R修飾がT366S/L368A/Y407V修飾Fcと組み合わせられる。類似した修飾が、T366S/L368A/Y407VとH453Rとを組み合わせることによって利用され得る。
いくつかの態様において、ヘテロ二量体分子のFc領域は、さらに、前記のいずれかのような1つまたは複数の他のFc変異を含有していてもよい。いくつかの態様において、ヘテロ二量体分子は、エフェクター機能を低下させる変異を含むFc領域を含有している。
いくつかの態様において、ヘテロ二量体Fcの一方のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:201（例えばSEQ ID NO:82）、86、207（例えばSEQ ID NO:94）、または96のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの他方のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:201（例えばSEQ ID NO:83）、87、205（例えばSEQ ID NO:90）、92、209（例えばSEQ ID NO:98）、または100のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有している。いくつかの態様において、ヘテロ二量体Fcの一方のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:203（例えばSEQ ID NO:84）、88、208（例えばSEQ ID NO:95）、または97のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの他方のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:204（例えばSEQ ID NO:85）、89、206（例えばSEQ ID NO:91）、93、210（例えばSEQ ID NO:99）、または101のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む。
いくつかの態様において、ヒトIgG Fc領域は、二量体化を防止するために修飾される。これらの態様において、本開示の融合タンパク質は、単量体である。例えば、残基Thr366における荷電残基への修飾、例えば、Thr366Lys、Thr366Arg、Thr366Asp、またはThr366Glu（それぞれ、T366K、T366R、T366D、またはT366E）は、CH3-CH3二量体化を防止する。
いくつかの態様において、融合タンパク質のFc領域は、Fc受容体結合を低下させるため、以下の位置のうちの1つまたは複数において変更される：Leu234（L234）、Leu235（L235）、Asp265（D265）、Asp270（D270）、Ser298（S298）、Asn297（N297）、Asn325（N325）、またはAla327（A327）。例えば、Leu234Ala（L234A）、Leu235Ala（L235A）、Asp265Asn（D265N）、Asp270Asn（D270N）、Ser298Asn（S298N）、Asn297Ala（N297A）、Asn325Glu（N325E）、またはAla327Ser（A327S）。好ましい態様において、Fc領域内の修飾は、Fc受容体γ受容体との結合を低下させるが、新生児型Fc受容体（FcRn）との結合に対しては最小の影響を及ぼす。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、免疫グロブリンヒンジ領域に由来するポリペプチドを含有している。ヒンジ領域は、ヒトIgGサブクラスのいずれかより選択され得る。例えば、融合タンパク質は、EPKSSDKTHTCPPC（SEQ ID NO:7）の配列を有する修飾型IgG1ヒンジを含有していてよく、ここで、軽鎖のC末端システインとジスルフィドを形成するCys220は、セリンに変異させられる（例えば、Cys220Ser（C220S））。他の態様において、融合タンパク質は、配列DKTHTCPPC（SEQ ID NO:8）を有する短縮型ヒンジを含有している。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列ESKYGPPCPPC（SEQ ID NO:9）を有する、鎖交換を防止するかまたは低下させるために修飾（例えば、Ser228Pro（S228P））されたIgG4由来の修飾型ヒンジを有する。いくつかの態様において、融合タンパク質は、リンカーポリペプチドを含有している。他の態様において、融合タンパク質は、リンカーおよびヒンジポリペプチドを含有している。
3．リンカー
提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、免疫グロブリンFc領域を含有している第1の成分とCD3結合領域を含有している第2の成分とを接合するかまたはカップリングするリンカーを含有している。いくつかの態様において、リンカーは、非切断可能リンカーである。いくつかの態様において、リンカーは、プロテアーゼによって切断のために特異的に認識される基質認識部位を含有していない。従って、提供された多重特異性ポリペプチド構築物におけるリンカーは、細胞外プロテアーゼのようなプロテアーゼのための基質として役立ち得るアミノ酸配列を含まない。例えば、非切断可能リンカーは、プロテアーゼの切断可能ペプチド配列内に存在する少なくとも1個のペプチド結合を含有している切断配列を含まない。
いくつかの態様において、リンカーは、Fc領域がCD3結合領域のN末端側にあるよう、Fc領域のC末端領域の末端に位置付けられている。提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、二量体のような多量体であるため、提供された構築物は、第1のポリペプチドの第1のFcポリペプチドおよびCD3結合領域の第1のドメイン（例えば、VH）と、第2のポリペプチドの第2のFcポリペプチドおよびCD3結合領域の第2のドメイン（例えば、VL）とを接合するリンカーを含む。典型的には、多重特異性ポリペプチド構築物の第1および第2のポリペプチドに存在するリンカーは、同一である。従って、いくつかの態様において、CD3結合ドメインの各ドメインは、同一のリンカーのようなリンカーを介して、ヘテロ二量体FcのようなFcの対向するポリペプチドと連結されている。
融合タンパク質において使用するための様々なポリペプチドリンカーは、公知である（例えば、Chen et al. (2013)Adv. Drug. Deliv. 65:1357-1369；および国際PCT公開番号WO2014/099997、WO2000/24884；米国特許第5,258,498号；米国特許第5,525,491号；米国特許第5,525,491号、米国特許第6,132,992号を参照すること）。
いくつかの態様において、リンカーは、CD3結合領域が多重特異性ポリペプチドコンジュゲートのFc領域と接合されている時には、CD3結合領域が制約されており、多重特異性ポリペプチド構築物が細胞と接触した時に、細胞、例えば、T細胞の表面上のCD3に結合するかまたは係合することができないかまたは実質的にできないよう、選択される。T細胞結合を評価するためのアッセイ、レポーター系を使用したNFAT活性化、細胞溶解性T細胞活性、サイトカイン産生、および/またはT細胞活性化マーカーの発現を含む、様々なアッセイが、多重特異性ポリペプチド構築物によるCD3の結合または係合を評価するために利用され得る。例示的なアッセイは、提供された実施例において示される。典型的には、リンカーは、ポリペプチド構築物の正確な折り畳みを確実にし、連結されたポリペプチドの活性または機能と調和しない電荷を示さず、連結されたポリペプチドの活性を衰弱させるかもしくは変更する、ドメインのうちの1つまたは複数におけるアミノ酸残基との結合もしくはその他の相互作用を形成しないものでもある。いくつかの態様において、リンカーは、ポリペプチドリンカーである。ポリペプチドリンカーは、可動性リンカーもしくは非可動性リンカー、または両方の組み合わせであり得る。
いくつかの局面において、リンカーは、短いか、中程度であるか、または長いリンカーである。いくつかの態様において、リンカーは、40アミノ酸までの長さである。いくつかの態様において、25アミノ酸までの長さである。いくつかの態様において、リンカーは、少なくとも約2アミノ酸の長さである。いくつかの局面において、適当な長さは、例えば、少なくとも1アミノ酸残基、典型的には、約40アミノ酸残基未満、例えば、2〜25アミノ酸残基、5〜20アミノ酸残基、5〜15アミノ酸残基、8〜12アミノ酸の長さである。いくつかの態様において、リンカーは、約2〜24アミノ酸、2〜20アミノ酸、2〜18アミノ酸、2〜14アミノ酸、2〜12アミノ酸、2〜10アミノ酸、2〜8アミノ酸、2〜6アミノ酸、6〜24アミノ酸、6〜20アミノ酸、6〜18アミノ酸、6〜14アミノ酸、6〜12アミノ酸、6〜10アミノ酸、6〜8アミノ酸、8〜24アミノ酸、8〜20アミノ酸、8〜18アミノ酸、8〜14アミノ酸、8〜12アミノ酸、8〜10アミノ酸、10〜24アミノ酸、10〜20アミノ酸、10〜18アミノ酸、10〜14アミノ酸、10〜12アミノ酸、12〜24アミノ酸、12〜20アミノ酸、12〜18アミノ酸、12〜14アミノ酸、14〜24アミノ酸、14〜20アミノ酸、14〜18アミノ酸、18〜24アミノ酸、18〜20アミノ酸、または20〜24アミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸長である。
ある種の局面において、リンカー長が長いほど、多重特異性ポリペプチドコンジュゲートが、その抗原、例えば、TAAに結合した時のCD3結合が大きくなる。従って、いくつかの局面において、リンカーは、12アミノ酸を超える長さ、例えば、13、14、15、16、17、または18アミノ酸を超える長さである。いくつかの態様において、リンカーは、12〜40アミノ酸長、12〜30アミノ酸、12〜24アミノ酸、12〜18酸、12〜15アミノ酸、15〜40アミノ酸、15〜30アミノ酸、15〜24アミノ酸、15〜18アミノ酸、18〜40アミノ酸、18〜30アミノ酸、18〜24アミノ酸、24〜40アミノ酸、24〜30アミノ酸、または30〜40アミノ酸である。
リンカーは、天然に存在するものであってもよいし、合成であってもよいし、または両方の組み合わせであってもよい。特に適当なリンカーポリペプチドは、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、アラニン（Ala）、およびトレオニン（Thr）より選択されるアミノ酸残基を主に含む。例えば、リンカーは、（ペプチドリンカーに存在する残基の総数に基づき計算された）少なくとも75％、例えば、少なくとも80％、少なくとも85％、または少なくとも90％の、Gly、Ser、Ala、およびThrより選択されるアミノ酸残基を含有していてよい。リンカーは、Gly、Ser、Ala および/またはThrの残基のみからなっていてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、1〜25個のグリシン残基、5〜20個のグリシン残基、5〜15個のグリシン残基、または8〜12個のグリシン残基を含有している。いくつかの局面において、適当なペプチドリンカーは、典型的には、少なくとも50％のグリシン残基、例えば、少なくとも75％のグリシン残基を含有している。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、グリシン残基のみを含む。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、グリシン残基およびセリン残基のみを含む。
いくつかの態様において、これらのリンカーは、アミノ酸グリシンおよびセリンから主に構成され、本明細書中でGSリンカーと呼ばれる。いくつかの態様において、リンカーは、(GGS)n（nは1〜10、例えば、1〜5、例えば、1〜3である）、例えば、GGS(GGS)n（SEQ ID NO:171）（nは0〜10である）を含有している。具体的な態様において、リンカーは、配列(GGGGS)n（SEQ ID NO:173）（nは1〜10であるかまたはnは1〜5、例えば、1〜3である）を含有している。さらなる態様において、リンカーは、(GGGGGS)n（SEQ ID NO:172）（nは1〜4、例えば、1〜3である）を含有している。リンカーは、前記のいずれかの組み合わせを含んでいてよく、例えば、2個、3個、4個、または5個のGSリンカー、GGSリンカー、GGGGSリンカー、および/またはGGGGGSリンカーのリピートが組み合わせられてよい。いくつかの態様において、そのようなリンカーは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、または19アミノ酸長である。
いくつかの態様において、リンカーは、以下の通りである（1文字アミノ酸コード）:GGS、GGGGS（SEQ ID NO:149）、またはGGGGGS（SEQ ID NO:135）。いくつかの態様において、GSリンカーは、
Figure 2021520812
のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、リンカーは、GGGG（SEQ ID NO:103）である。いくつかの態様において、リンカーは、GGGGG（SEQ ID NO:192）である。前記実施例のいくつかにおいて、セリンがアラニンに置換されてもよい（例えば、（Gly4Ala）または（Gly3Ala））。
いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列Glyx-Xaa-Glyy-Xaa-Glyz（SEQ ID NO:174）（Xaaは各々独立にアラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、トリプトファン（Trp）、プロリン（Pro）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、システイン（Cys）、チロシン（Tyr）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）、アスパラギン酸（Asp）、およびグルタミン酸（Glu）より選択され、x、y、およびzは各々1〜5の範囲の整数である）を有するペプチドリンカーを含む。いくつかの態様において、Xaaは、各々独立にSer、Ala、およびThrからなる群より選択される。具体的な変動において、x、y、およびzの各々は、3に等しく、従って、アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly（SEQ ID NO:175）（各Xaaは前記のように選択される）を有するペプチドリンカーを与える。
いくつかの態様において、リンカーは、(SSSSG)n（SEQ ID NO:185）モチーフ（nは少なくとも1であるが、nは2、3、4、5、6、7、8、および9であってもよい）の反復に基づくセリンリッチリンカーである。
いくつかのケースにおいて、ペプチドリンカーにある程度の非可動性を提供することが望ましい場合がある。これは、ペプチドリンカーのアミノ酸配列にプロリン残基を含めることによって達成され得る。従って、いくつかの態様において、リンカーは、ペプチドリンカーのアミノ酸配列内に少なくとも1個のプロリン残基を含む。例えば、ペプチドリンカーは、アミノ酸残基の少なくとも25％（例えば、少なくとも50％または少なくとも75％）がプロリン残基であるアミノ酸配列を有し得る。一つの具体的な態様において、ペプチドリンカーは、プロリン残基のみを含む。
いくつかの局面において、ペプチドリンカーは、少なくとも1個のシステイン残基、例えば、1個のシステイン残基を含む。例えば、いくつかの態様において、リンカーは、少なくとも1個のシステイン残基ならびにGly、Ser、Ala、およびThrからなる群より選択されるアミノ酸残基を含む。いくつかのそのような態様において、リンカーは、グリシン残基およびシステイン残基、例えば、グリシン残基およびシステイン残基のみを含む。典型的には、1個のシステイン残基のみが各ペプチドリンカーに含まれる。システイン残基を含む具体的なリンカーの一例は、アミノ酸配列Glym-Cys-Glyn（nおよびmは各々1〜12、例えば、3〜9、4〜8、または4〜7の整数である）を有するペプチドリンカーを含む。具体的な変動において、そのようなペプチドリンカーは、アミノ酸配列GGGGG-C-GGGGG（SEQ ID NO:177）を有する。
いくつかの態様において、融合タンパク質のリンカーは、構造化されたまたは制約されたリンカーである。具体的な態様において、構造化されたリンカーは、配列(AP)nまたは(EAAAK)n（SEQ ID NO:178）（nは2〜20、好ましくは、4〜10である）、例えば、以下に限定されるわけではないが、AS-(AP)n-GT（SEQ ID NO:179）またはAS-(EAAAK)n-GT（SEQ ID NO:180）（nは2〜20、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15である）を含有している。他の態様において、リンカーは、配列
Figure 2021520812
（nは2〜20である）を含む。いくつかの態様において、リンカーは
Figure 2021520812
である。いくつかの態様において、そのようなリンカーは、その構造のため、タンパク質切断に対してより耐性であり、従って、インビボで注射された時に利点を与え得る。
いくつかの態様において、リンカーは、切断可能リンカーではない（非切断可能リンカーと交換可能に用いられる）。いくつかの態様において、リンカーは、プロテアーゼによって切断可能でない。いくつかの態様において、切断可能リンカーでないかまたはプロテアーゼによって切断可能でないリンカーは、一般にインビボの送達または組換え作製のために安定しているものである。いくつかの局面において、プロテアーゼによって切断可能でないリンカーには、切断可能なペプチド配列またはプロテアーゼの認識部位の内部に好ましくは存在する少なくとも1個のペプチド結合を含有していないものが含まれる。具体的な態様において、非切断可能リンカーは、プロテアーゼの標的基質ではなく、従って、同プロテアーゼの基質認識部位を含有しているリンカーと比較して、プロテアーゼによって優先的にまたは特異的に切断されない。
いくつかの態様において、リンカーは、プロテアーゼによって切断される、プロテアーゼの活性部位によって認識される配列である、特定のプロテアーゼのための基質認識部位または切断部位を含有していない。典型的には、例えば、セリンプロテアーゼのための切断配列は、基質内のP1-P4アミノ酸およびP1'-P4'アミノ酸から構成され、P1位の後で切断が起こる。典型的には、セリンプロテアーゼのための切断配列は、多くのプロテアーゼの拡張された基質特異性にマッチするため、6残基長であるが、プロテアーゼに依って、より長いか、またはより短くてもよい。典型的には、リンカーは、プロテアーゼによって認識される解離可能なP1-P1'結合配列を含まない。
いくつかの局面において、非切断可能リンカー、またはプロテアーゼによって切断のために特異的に認識される基質認識部位を含有していないリンカーは、プロテアーゼによる切断が、プロテアーゼの標的基質の切断より実質的に少ないものである。典型的には、プロテアーゼは、他の非標的基質と比較して、特定の標的基質の切断のための特異性または優先性を示す。そのような特異性の程度は、その基質に対するプロテアーゼの優先性および酵素の効率の尺度である、配列、例えば、リンカー配列の切断の速度定数に基づき、決定され得る。様々な濃度の基質の存在下で、経時的な切断の増加の速度を決定する任意の方法が、特異性定数を計算するために使用され得る。例えば、基質は、蛍光発生モエティに連結され、それは、プロテアーゼによる切断時に放出される。異なるプロテアーゼ濃度における切断の速度を決定することによって、切断についての特異性定数（kcat/Km）が、特定のリンカーに対する特定のプロテアーゼについて決定され得る。いくつかの態様において、非切断可能リンカー、またはプロテアーゼによって切断のために特異的に認識される基質認識部位を含有していないリンカーは、切断されたとしても、1×104M-1S-1未満、5×103M-1S未満、1×103M-1S未満、もしくは1×102M-1S未満、またはそれ以下の速度で、プロテアーゼによって切断されるリンカーである。
いくつかの態様において、本明細書中に提供される多重特異性構築物におけるリンカーは、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、およびプラスミン活性化因子を含むプロテアーゼのための基質認識部位を含有していない。具体的な態様において、リンカーは、腫瘍によって、活性化された免疫エフェクター細胞（例えば、T細胞もしくはNK細胞）によって、または腫瘍微小環境にある細胞によって産生されるプロテアーゼであるプロテアーゼのための基質認識部位を含有していない。
いくつかの態様において、リンカーは、以下の酵素またはプロテアーゼのうちの1種または複数種によって特異的に認識される基質認識部位を含有していない：ADAMS、ADAMTS、例えば、ADAM8；ADAM9；ADAM10；ADAM12；ADAM15；ADAM17/TACE；ADAMDEC1；ADAMTS1；ADAMTS4；ADAMTS5；アスパラギン酸プロテアーゼ、例えば、BACEまたはレニン；アスパラギン酸（aspartic）カテプシン、例えば、カテプシンDまたはカテプシンE；カスパーゼ、例えば、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ3、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ6、カスパーゼ7、カスパーゼ8、カスパーゼ9、カスパーゼ10、またはカスパーゼ14；システインカテプシン、例えば、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンK、カテプシンL、カテプシンS、カテプシンV/L2、カテプシンX/Z/P；システインプロテイナーゼ、例えば、クルジパイン（Cruzipain）；レグマイン；オツバイン（Otubain）2；KLK、例えば、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、またはKLK14；メタロプロテイナーゼ、例えば、メプリン；ネプリライシン；PSMA；BMP-1；MMP、例えば、MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP23、MMP24、MMP26、またはMMP27、セリンプロテアーゼ、例えば、活性化プロテインC、カテプシンA、カテプシンG、キマーゼ、凝固因子プロテアーゼ（例えば、FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa）、エラスターゼ、グランザイムB、グアニジノベンゾアターゼ（Guanidinobenzoatase）、HtrA1、ヒト好中球エラスターゼ、ラクトフェリン、マラプシン（Marapsin）、NS3/4A、PACE4、プラスミン、PSA、tPA、トロンビン、トリプターゼ、uPA；II型膜貫通セリンプロテアーゼ（TTSP）、例えば、DESC1、DPP-4、FAP、ヘプシン、マトリプターゼ2、マトリプターゼ、TMPRSS2、TMPRSS3、またはTMPRSS4；およびそれらのいずれかの組み合わせ。いくつかの態様において、リンカーは、グランザイムB、マトリプターゼ、またはMMP-2のようなMMPによって特異的に認識される基質認識部位を含有していない。
いくつかの態様において、リンカーは、グランザイムBの基質であるアミノ酸を含まない。いくつかの態様において、リンカーは、一般式P4 P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:150）（P4はアミノ酸I、L、Y、M、F、V、またはAであり；P3はアミノ酸A、G、S、V、E、D、Q、N、またはYであり；P2はアミノ酸H、P、A、V、G、S、またはTであり；P1はアミノ酸DまたはEであり；P1'はアミノ酸I、L、Y、M、F、V、T、S、G、またはAである）を有するアミノ酸配列を含有していない。いくつかの態様において、リンカーは、一般式P4 P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:151）（P4はアミノ酸IまたはLであり；P3はアミノ酸Eであり；P2はアミノ酸PまたはAであり；P1はアミノ酸Dであり；P1'はアミノ酸I、V、T、S、またはGである）を有するアミノ酸配列を含有していない。
いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列
Figure 2021520812
を含有していない。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列
Figure 2021520812
を含有していない。
いくつかの態様において、リンカーは、マトリプターゼの基質であるアミノ酸を含まない。いくつかの態様において、リンカーは、配列P1QAR↓(A/V)（SEQ ID NO:154）（P1は任意のアミノ酸である）を含まない。いくつかの態様において、リンカーは、配列RQAR(A/V)（SEQ ID NO:155）を含まない。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列RQAR（SEQ ID NO:23）を含まない。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列RQARV（SEQ ID NO:156）を含まない。
いくつかの態様において、リンカーは、1種または複数種のマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の基質であるアミノ酸を含まない。いくつかの態様において、MMPは、MMP-2である。いくつかの態様において、リンカーは、一般式P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:157）（P3はP、V、またはAであり；P2はQまたはDであり；P1はAまたはNであり；P1'はL、I、またはMである）を有する配列を含有していない。いくつかの態様において、リンカーは、一般式P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:158）（P3はPであり；P2はQまたはDであり；P1はAまたはNであり；P1'はLまたはIである）を含有していない。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列PAGL（SEQ ID NO:24）を含まない。
いくつかの態様において、リンカーは、
Figure 2021520812
として示されるアミノ酸配列を含むリンカーではない。
4．抗原結合ドメイン：
本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、少なくとも1個の抗原結合ドメインを含み、例えば、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインを少なくとも含む。いくつかの局面において、抗原結合ドメインは、または抗原結合ドメインの各々は独立に、抗体もしくは抗原結合断片、天然同族結合パートナー、アンチカリン（改変されたリポカリン）、ダーピン、フィノマー、センチリン（改変されたフィブロネクチンIIIドメイン）、シスチンノットドメイン、アフィリン、アフィボディ、または改変されたCH3ドメインより選択される。いくつかの態様において、天然同族結合パートナーには、TAAのネイティブ同族結合パートナーの細胞外ドメインもしくはその結合断片、またはTAAとの結合活性を示すそれらのバリアントが含まれる。
いくつかの態様において、TAAは、主として、哺乳動物対象の腫瘍細胞上に存在し、一般に、哺乳動物対象の正常細胞上には見出されない対比構造（counter-structure）である。腫瘍特異抗原は、腫瘍細胞に排他的である必要はなく、提供される多重特異性ポリペプチド構築物のような抗腫瘍治療薬によって標的とされ、哺乳動物の腫瘍の効果に対する防止または処置を提供することができるよう、特定の哺乳動物の腫瘍関連抗原を有する細胞の割合が十分に高いか、または腫瘍の表面上の腫瘍関連抗原のレベルが十分に高い。いくつかの態様において、腫瘍を有する哺乳動物に由来する細胞の無作為統計試料において、TAAを示す細胞の少なくとも50％が、がん細胞である。他の態様において、TAAを示す細胞の少なくとも60％、70％、80％、85％、90％、95％、または99％が、がん細胞である。
いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、または第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインの各々は独立に、抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、または抗原結合ドメインの各々は独立に、Fab断片、F(ab')2断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、または第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインの各々は独立に、単鎖抗体である。いくつかの態様において、単鎖は、scFv、scAb、シングルドメイン重鎖抗体、またはシングルドメイン軽鎖抗体である。いくつかの態様において、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々は、1個または複数個のシングルドメイン抗体（sdAb）断片、例えば、VHH、VNAR、改変されたVHドメイン、または改変されたVKドメインを含む。VHHは、天然のラクダ科動物の重鎖のみの抗体、重鎖のみの抗体を産生する遺伝学的に修飾された齧歯類、またはナイーブ/合成のラクダ科動物もしくはヒト化ラクダ科動物シングルドメイン抗体ライブラリーから生成され得る。VNARは、軟骨魚類の重鎖のみの抗体から生成され得る。界面改変および特異的な生殖系列ファミリーの選択を含む様々な方法が、従来のヘテロ二量体VHドメインおよびVKドメインから単量体sdAbを生成するために実施されている。
いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメインは、または第1の抗原結合ドメインおよび/または第2の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインの各々は独立に、TAAに結合する少なくとも1個のsdAbまたはscFvを含有している。いくつかの態様において、TAAに結合する少なくとも1個のscFvまたはsdAbは、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、TAAに結合するscFvまたはsdAbを1個のみ含有しており、それは、Fc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側のいずれかに位置付けられていてよい。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、Fc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられた、TAAに結合する2個のscFvまたはsdAbを含有している。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、3個のscFvまたはsdAbを含有しており、そのうちの2個が、Fc領域に対してアミノ末端側またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられており、第3のものが、多重特異性ポリペプチド構築物の他方の末端に位置付けられている。
いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、ヘテロ二量体Fc領域の第1のFcポリペプチド、リンカー、抗CD3抗体もしくは抗原結合断片（例えば、Fv）のVHドメイン、および腫瘍関連抗原に結合するscFvもしくはsdAbを含む第1のポリペプチド；ならびにヘテロ二量体Fc領域の第2のFcポリペプチド、リンカー、抗CD3抗体もしくは抗原結合断片（例えばFv）のVLドメインを含み、任意で、腫瘍関連抗原に結合する同一のもしくは異なるscFvもしくはsdAbを含む第2のポリペプチドを含む2種のポリペプチドから形成されるか、またはそれらを含む。TAAに結合するscFvまたはsdAbは、ヘテロ二量体FcのFcポリペプチドに対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域のVH鎖もしくはVL鎖に対してカルボキシ末端側に位置付けられていてよい。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメインは、または抗原結合ドメインの各々は独立に、FABまたはscFvとして組み立てられたVH配列およびVL配列を含有している。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメインは、または抗原結合ドメインの各々は独立に、シングルドメイン抗体（sdAb）としての結合ドメインを含有している。
いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、または第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインの各々は独立に、複数の鎖を含有している。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメインは、または第1の抗原結合ドメインおよび/もしくは第2の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインの各々は独立に、FABとして組み立てられたVH配列およびVL配列を含有している。
いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメインは、または第1の抗原結合ドメインおよび/もしくは第2の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインの各々は独立に、TAAに結合するFab抗体のVH-CH1（Fd）およびVL-CLを含有している。いくつかの態様において、VH-CH1（Fd）およびVL-CLを含有しているFab抗体は、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、Fc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側のいずれかに位置付けられていてよい、TAAに結合するVH-CH1（Fd）およびVL-CLを含有しているFab抗体を1個のみ含有している。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、TAAに結合するVH-CH1（Fd）およびVL-CLを各々含有している2個のFab抗体断片を含有しており、一方は、Fc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、他方は、CD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。
いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、ヘテロ二量体Fc領域の第1のFcポリペプチド、リンカー、および腫瘍関連抗原に結合するFab抗体断片のVH-CH1（Fd）もしくはVL-CLを含む第1のポリペプチド；ヘテロ二量体Fc領域の第2のFcポリペプチド、リンカーを含み、任意で、腫瘍関連抗原に結合するFab抗体断片の同一のVH-CH1（Fd）もしくはVL-CLを含む第2のポリペプチド、ならびにTAAに結合するFab抗体断片のVH-CH1（Fd）もしくはVL-CLの他方を含む第3のポリペプチドを含む3種以上のポリペプチドから形成されるか、またはそれらを含む。
いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、または抗原結合ドメインの各々は独立に、TAAのネイティブ同族結合パートナーの細胞外ドメインもしくはその結合断片、もしくはTAAとの結合活性を示すそれらのバリアントであるか、またはそれらを含む。
いくつかの態様において、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々のような抗原結合ドメインの各々は、同一の抗原に結合する。いくつかの態様において、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々は、異なる抗原に結合する。いくつかの態様において、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々のような抗原結合ドメインの各々は、同一の腫瘍関連抗原（TAA）に結合する。いくつかの態様において、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々のような抗原結合ドメインの各々は、異なるTAAに結合する。いくつかの態様において、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々のような抗原結合ドメインの各々は、同一のTAAの異なるエピトープに結合する。いくつかの態様において、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々のような抗原結合ドメインの各々は、同一のTAAの同一のエピトープに結合する。
いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、TAAとの1価、2価、3価、または4価の結合をもたらす。いくつかの態様において、TAAとの2価の結合は、同一の抗原の同一のエピトープに結合する2個の抗原結合ドメインを含む（例えば、1エピトープ性）。いくつかの態様において、TAAとの2価の結合は、同一の抗原の異なるエピトープに結合する2個の抗原結合ドメインを含む（例えば、2エピトープ性）。いくつかの態様において、TAAとの1価の結合は、抗原の1個のエピトープに結合する1個の抗原結合ドメインを含む（例えば、1エピトープ性）。
いくつかの態様において、TAAは、1-92-LFA-3、5T4、α4インテグリン、αVインテグリン、α4β1インテグリン、α4β7インテグリン、AGR2、抗ルイスY、アペリンJ受容体、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補体、C-242、CA9、CA19-9、（ルイスa）、炭酸脱水酵素9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、（IL-2RG）、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5（CEA）、CEACAM6（NCA-90）、クローディン3、クローディン4、cMet、コラーゲン、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、エンドセリンB受容体（ETBR）、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSVのFタンパク質、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受容体α（FRα）、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受容体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、ヒアルロニダーゼ、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受容体（FceRI）、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R（wsx1）、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、インスリン受容体、Jaggedリガンド、Jagged1、Jagged2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、ルイスX、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、メソテリン、MRP4、MUC1、ムチン16（MUC16、CA-125）、Na/K ATPアーゼ、NGF、ニカストリン、ノッチ受容体、ノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、ノッチ4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、ホスファチジルセリン、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、スフィンゴシン-1-リン酸、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2、およびWISP-3より選択される。
いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、または各抗原結合ドメインは独立に、腫瘍関連抗原（TAA）である葉酸受容体α（FRα）に結合する。例えば、抗原結合ドメインは、FRαに結合するsdAbとして結合ドメインを含有している。例示的なFRα結合sdAbは、SEQ ID NO:120、121、および122に示される。
いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、または各抗原結合ドメインは独立に、腫瘍関連抗原（TAA）であるcMETに結合する。例えば、抗原結合ドメインは、cMETに結合するsdAbとして結合ドメインを含有している。例示的なcMET結合sdAbは、SEQ ID NO:123に示される（米国特許第9,346,884号）。
いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、または各抗原結合ドメインは独立に、腫瘍関連抗原（TAA）B7H3に結合する。例えば、抗原結合ドメインは、B7H3に結合するscFvとしての結合ドメインを含有している。例示的なB7H3結合scFvは、SEQ ID NO:124に示される。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、VHHのようなsdAbである。例示的なB7H3結合sdAbは、SEQ ID NO:214〜218のいずれかに示される。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、VH-CH1（Fd）もしくはLCを含むFab抗体断片であるか、またはそれを含有している。例示的なB7H3 Fdは、SEQ ID NO:127に示され、例示的なB7H3 LCは、SEQ ID NO:128に示される（PCT公開番号WO2017/030926）。
いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、または各抗原結合ドメインは独立に、腫瘍関連抗原（TAA）CD20に結合する。いくつかの態様において、そのような抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:189に示されるVHおよびSEQ ID NO:190に示されるVL、またはSEQ ID NO:189もしくはSEQ ID NO:190との少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、98％、もしくは99％、または約85％、90％、95％、96％、97％、98％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を含有している。例えば、抗原結合ドメインは、CD20に結合するscFvとしての結合ドメインを含有している。例示的なCD20結合scFvは、SEQ ID NO:125および213に示される（米国公開番号US2005/0123546）。
いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、または各抗原結合ドメインは独立に、各々腫瘍関連抗原（TAA）DLL3に結合する。例えば、抗原結合ドメインは、DLL3に結合するscFvとしての結合ドメインを含有している。例示的なDLL3結合scFvは、SEQ ID NO:126および188に示される（米国公開番号US2017/0037130）。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、VHHのようなsdAbである。例示的なDLL3結合sdAbは、SEQ ID NO:219に示されるVHまたはSEQ ID NO:220のいずれかに示される。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、DLL3に結合するFdおよびLCを含むFab抗体断片であるか、またはそれを含有している。例示的なDLL3 Fdは、SEQ ID NO:133に示され、例示的なDLL3 LCは、SEQ ID NO:134に示される（米国公開番号US8,044,178）。
いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、または各抗原結合ドメインは独立に、腫瘍関連抗原（TAA）である5T4に結合する。例示的な5T4 Fdは、SEQ ID NO:129に示され、例示的な5T4 LCは、SEQ ID NO:130に示される。いくつかの態様において、抗体結合ドメインは、SEQ ID NO:167および168に示されるVH-CH1（Fd）またはVL-CLを含む（米国特許第8,044,178号）。
いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、または各抗原結合ドメインは独立に、腫瘍関連抗原（TAA）であるgpNMBに結合する。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、Fd鎖およびLC鎖を含むFab断片であるか、またはそれを含有している。例示的なgpNMB Fdは、SEQ ID NO:131に示され、例示的なgpNMB LCは、SEQ ID NO:132に示される。
いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、直接、またはリンカーを介して間接的に、Fc領域および/またはCD3結合領域と連結されている。いくつかの態様において、連結は、リンカーを介している。いくつかの態様において、リンカーは、セクションII.3に記載される可動性または非可動性のリンカーを含み得る連結ペプチド（LP）であるが、概して、抗原結合ドメインを連結するペプチドは、切断可能リンカーでない。
いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、第1の抗原結合ドメインとFc領域との間の第1の連結ペプチド（LP1）を含む。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、CD3結合領域と第2の抗原結合ドメインとの間の第2の連結ペプチド（LP2）を含む。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、第1の抗原結合ドメインとFc領域との間の第1の連結ペプチド（LP1）およびCD3結合領域と第2の抗原結合ドメインとの間の第2の連結ペプチド（LP2）を含む。いくつかの局面において、多重特異性ポリペプチド構築物は、N末端からC末端へ、以下のような構造的配置を有する：第1の抗原結合ドメイン - LP1 - Fc領域 - リンカー - CD3結合領域 - LP2 - 第2の抗原結合ドメイン。いくつかの態様において、2個の連結ペプチドは、相互に同一ではない。
いくつかの態様において、LP1またはLP2は、独立に、約1〜20アミノ酸長のペプチドである。いくつかの態様において、LP1またはLP2は、独立に、SEQ ID NO:10〜13、119、135、147、149、もしくはGGSに示されるGly-Serリンカーであるか、またはそれを含むペプチドである。
III. 薬学的組成物
提供された多重特異性ポリペプチド構築物のいずれかの組成物が、本明細書中に提供される。本開示による治療用エンティティの投与は、改善された移入、送達、耐性等を提供するために製剤へ組み入れられる適当な担体、賦形剤、およびその他の薬剤と共に投与されることが理解されるであろう。多数の適切な製剤が、全ての薬剤師に公知の処方集：Remington's Pharmaceutical Sciences（15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)）、特に、その中のBlaug, Seymourによるチャプター87に見出され得る。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ロウ、油、脂質、（Lipofectin（商標）のような）脂質（陽イオン性または陰イオン性）含有小胞、DNAコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型乳濁液、油中水型乳濁液、カーボワックス（carbowax）（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含有している半固体混合物が含まれる。製剤中の活性成分が、製剤によって不活化されず、製剤が、投与ルートと生理学的に適合性であって、容認されるものであれば、上記の混合物は、いずれも、本開示による処置および治療において適切であり得る。薬剤師に周知の製剤、賦形剤、および担体に関する付加的な情報については、Baldrick P. 「Pharmaceutical excipient development:the need for preclinical guidance.」Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8(2000)、Wang W.「Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.」Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60(2000)、Charman WN「Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.」J Pharm Sci. 89(8):967-78(2000)、Powell et al.「Compendium of excipients for parenteral formulations」PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311(1998)、およびその中の引用も参照すること。
いくつかの態様において、本明細書中で治療薬と集合的に呼ばれる多重特異性ポリペプチド構築物、コンジュゲートされた多重特異性ポリペプチド構築物、およびそれらの組成物、ならびにそれらの誘導体、断片、類似体、および相同体を、投与のために適当な薬学的組成物へ組み入れることができる。そのような組成物の調製に関与する原理および考察、ならびに成分の選択における案内は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences:The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co.,Easton,Pa.:1995；Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa.,1994；およびPeptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4),1991,M. Dekker, New Yorkに提供されている。
そのような組成物は、典型的には、多重特異性ポリペプチド構築物またはそのコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む。多重特異性ポリペプチド構築物が抗体の断片を含む場合、標的タンパク質に特異的に結合する抗体の最も小さい断片を使用することができる。例えば、抗体の可変領域配列に基づき、抗体の標的タンパク質配列に結合する能力を保持しているペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは、化学的に合成され、かつ/または組換えDNAテクノロジーによって作製され得る（例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:7889-7893(1993)を参照すること）。
本明細書中で使用されるように、「薬学的に許容される担体」という用語には、薬学的投与と適合性の全ての任意の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤等が含まれるものとする。適当な担体は、参照によって本明細書中に組み入れられる、当技術領域における標準的な参考書、Remington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の適当な例には、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、および5％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されるわけではない。リポソーム、および不揮発性油のような非水性媒体も、使用され得る。薬理活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性化合物と非適合性でない限り、組成物中に使用されることが企図される。
インビボ投与のために使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。
本開示の薬学的組成物は、その意図された投与ルートと適合性であるよう製剤化される。投与ルートの例には、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば、吸入）、経皮（即ち、局所）投与、経粘膜投与、および直腸投与が含まれる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含んでいてよい：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒のような無菌の希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（EDTA）のようなキレート剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸のような緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような浸透圧の調整のための薬剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基によって調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックから作製された、アンプル、使い捨て注射器、または複数回投与バイアルに封入され得る。
注射可能な使用のために適当な薬学的組成物には、無菌の水性溶液（水溶性）もしくは分散液、または無菌の注射可能な溶液もしくは分散液の即時調製のための無菌の粉末が含まれる。静脈内投与のため、適当な担体には、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF, Parsippany, N.J.）、またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）が含まれる。全てのケースにおいて、組成物は、無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性であるべきである。それは、製造および保管の条件の下で安定していなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、ならびにそれらの適当な混合物を含有している溶媒または分散媒であり得る。適度の流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液のケースにおいては必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くのケースにおいて、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが適当であろう。注射可能組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
無菌の注射可能溶液は、必要に応じて、上に列挙された成分のうちの一つまたは組み合わせと共に、必要とされる量の活性化合物を、適切な溶媒に組み入れた後、濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、基本の分散媒および上に列挙されたもののうち必要な他の成分を含有している無菌の媒体に、活性化合物を組み入れることによって調製される。無菌の注射可能溶液の調製のための無菌の粉末のケースにおいて、調製の方法は、事前に滅菌濾過された溶液から、活性成分＋付加的な所望の成分の粉末を与える真空乾燥および凍結乾燥である。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用した滅菌は、凍結乾燥および再生の前または後のいずれかに実施され得る。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で保管されてもよいしまたは溶液で保管されてもよい。さらに、非経口組成物は、一般に、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルに置かれる。
いくつかの態様において、薬学的組成物は、経口、経皮、吸入、静脈内、動脈内、筋肉内、創傷部位への直接適用、手術部位への適用、腹腔内、坐剤、皮下、皮内、経皮、噴霧、胸膜内、脳室内、関節内、眼内、または脊髄内を含む任意のルートを通して、対象へ投与される。
経口組成物は、一般に、不活性の希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入されてもよいし、または錠剤へと圧縮されてもよい。経口治療的投与のため、活性化合物は、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態に、賦形剤と共に組み入れられ、使用され得る。経口組成物は、液体担体中の化合物が口内に適用され、含嗽され、喀出されるかまたは嚥下される、口内洗浄液として使用するため、液体担体を使用して調製されてもよい。薬学的に適合性の結合剤および/または補助材料が、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は、以下の成分または類似した性質の化合物のいずれかを含有していてよい：結晶セルロース、トラガントゴム、もしくはゼラチンのような結合剤；デンプンもしくは乳糖のような賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Primogel）、もしくはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテス（Sterotes）のような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような流動性改善剤；ショ糖もしくはサッカリンのような甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ風味のような風味剤。
吸入による投与のため、多重特異性ポリペプチド構築物は、適当な噴霧剤、例えば、二酸化炭素のような気体を含有している加圧容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で送達される。
全身投与は、経粘膜または経皮の手段によることもできる。経粘膜投与または経皮投与のため、浸透すべき関門にとって適切な浸透剤が、製剤中に使用される。そのような浸透剤は、当技術分野において一般に公知であり、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、点鼻薬または坐剤の使用を通して達成され得る。経皮投与の場合、活性化合物は、当技術分野において一般に公知の軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。
化合物は、直腸送達のため、（例えば、カカオ脂およびその他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含む）坐剤または停留浣腸の形態に調製されてもよい。
一つの態様において、治療薬は、インプラントおよびマイクロカプセル送達系を含む、徐放性/コントロールドリリース製剤のような、身体からの迅速な排除から化合物を保護する担体によって調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。そのような製剤の調製の方法は、当業者に明白であろう。
例えば、治療薬は、コアセルベーション技術によって、もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンに捕捉されてもよい。
いくつかの態様において、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、増量剤、結合剤、コーティング、保存剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、着色剤、溶媒、緩衝剤、キレート剤、または安定剤を含む。薬学的に許容される増量剤の例には、セルロース、第二リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、結晶セルロース、ショ糖、乳糖、グルコース、マンニトール、ソルビトール、マルトール、アルファ化デンプン、コーンスターチ、またはジャガイモデンプンが含まれる。薬学的に許容される結合剤の例には、ポリビニルピロリドン、デンプン、乳糖、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、ゼラチン、ショ糖、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、またはセルロースが含まれる。薬学的に許容されるコーティングの例には、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、シェラック、トウモロコシタンパク質ゼイン、またはゼラチンが含まれる。薬学的に許容される崩壊剤の例には、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、またはデンプングリコール酸ナトリウムが含まれる。薬学的に許容される滑沢剤の例には、ポリエチレングリコール、ステアリン酸マグネシウム、またはステアリン酸が含まれる。薬学的に許容される保存剤の例には、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、またはソルビン酸が含まれる。薬学的に許容される甘味剤の例には、ショ糖、サッカリン、アスパルテーム、またはソルビトールが含まれる。薬学的に許容される緩衝剤の例には、炭酸、クエン酸、グルコン酸、酢酸、リン酸、または酒石酸が含まれる。
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の適当な例には、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である、抗体を含有している固体疎水性ポリマーの半透マトリックスが含まれる。いくつかの態様において、薬学的組成物は、注射可能マイクロスフェア、生体侵食性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームのような生成物のコントロールドリリースまたは徐放のための薬剤をさらに含む。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、L-グルタミン酸およびγエチル-L-グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、LUPRON DEPOT（商標）（乳酸グリコール酸コポリマーおよびリュープロリド酢酸塩から構成される注射可能マイクロスフェア）のような分解性の乳酸グリコール酸コポリマー、ならびにポリD-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸グリコール酸のようなポリマーは、100日以上にわたる分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルは、より短い期間にわたりタンパク質を放出する。
材料は、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Incから商業的に入手されてもよい。（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含む感染細胞を標的とするリポソームを含む）リポソーム懸濁液も、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号に記載されるように、当業者に公知の方法によって調製され得る。
投与の容易さおよび投薬量の均一性のため、投薬単位形態で経口または非経口の組成物を製剤化することは、特に有利である。投薬単位形態とは、本明細書中で使用されるように、処置される対象のための単位投薬量として適した物理的に不連続の単位をさし；各単位は、必要とされる薬学的担体と共に所望の治療効果を生じるよう計算された予め決定された量の活性化合物を含有している。本開示の投薬単位形態の詳細は、活性化合物の独特の特徴、および達成すべき特定の治療効果、および個体の処置のためのそのような活性化合物の合成の分野に固有の限界によって指示され、それらに直接依存する。
本明細書中に記載された薬学的組成物（または製品）を含むキットが、さらに提供される。薬学的組成物は、投与のための説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサーに含まれ得る。本明細書中に記載されたキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、注射器、および本明細書中に記載された方法を実施するための説明書を含むパッケージインサートを含む、商業的見地および使用者見地から望ましい他の材料も含んでいてよい。
製剤は、処置されている特定の適応症のために必要な複数の多重特異性ポリペプチド構築物、例えば、相互に悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有していてもよい。いくつかの態様において、またはさらに、組成物は、例えば、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、または成長阻害剤のような、その機能を増強する薬剤を含んでいてよい。そのような分子は、意図された目的のために有効な量で組み合わせられて適当に存在する。
いくつかの態様において、薬学的組成物の投薬は、単回投与または反復投与である。いくつかの態様において、投与は、1日1回、1日2回、1日3回、または1日4回以上、対象へ与えられる。いくつかの態様において、約1回以上（例えば、約2回以上、約3回以上、約4回以上、約5回以上、約6回以上、または約7回以上）の投与が、1週間に与えられる。いくつかの態様において、複数回投与は、数日、数週間、数か月、または数年にわたり与えられる。いくつかの態様において、処置の課程は、約1回または複数回（例えば、約2回以上、約3回以上、約4回以上、約5回以上、約7回以上、約10回以上、約15回以上、約25回以上、約40回以上、約50回以上、または約100回以上）の投与である。
いくつかの態様において、薬学的組成物は、対象へ投与される。一般に、薬学的組成物の投薬量および投与ルートは、標準的な薬学的実務に従って、対象のサイズおよび状態によって決定される。例えば、治療的に有効な用量は、最初に、細胞培養アッセイ、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、もしくはサルのような動物モデルのいずれかにおいて評価され得る。動物モデルは、適切な濃度範囲および投与ルートを決定するためにも使用され得る。次いで、そのような情報を、ヒトにおける投与のための有用な用量およびルートを決定するために使用することができる。正確な投薬量は、処置を必要とする対象に関係のある因子を考慮して決定されるであろう。投薬量および投与は、十分なレベルの活性化合物を提供するため、または所望の効果を維持するため、調整される。考慮に入れられ得る因子には、疾患状態の重症度、対象の健康状態、対象の年齢、体重、および性別、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感度、ならびに治療に対する応答が含まれる。特定の患者のための最適の投薬量および処置計画は、疾患の兆候について患者をモニタリングし、それに応じて、処置を調整することによって、医療の当業者によって容易に決定され得る。
IV．使用および治療的投与の方法
多重特異性ポリペプチド構築物を使用する方法およびその使用が提供される。そのような方法および使用には、例えば、分子またはそれを含有している組成物の、腫瘍またはがんのような疾患、状態、または障害を有する対象への投与を含む、治療的な方法および使用が含まれる。いくつかの態様において、分子および/または組成物は、疾患または障害の処置を達成するために有効な量で投与される。使用には、そのような方法および処置における多重特異性ポリペプチド構築物の使用、ならびにそのような治療方法を実施するための医薬の調製における使用が含まれる。いくつかの態様において、方法は、多重特異性ポリペプチド構築物またはそれを含む組成物を、疾患または状態を有するかまたは有すると推測される対象へ投与することによって実施される。いくつかの態様において、方法は、それによって、対象における疾患または状態または障害を処置する。
一つの態様において、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、治療剤として使用され得る。そのような薬剤は、一般に、対象における疾患または病理を診断し、予後判定し、モニタリングし、処置し、緩和し、かつ/または防止するため、利用されるであろう。治療計画は、標準的な方法を使用して、障害に罹患している（または発症するリスクを有する）対象、例えば、ヒト患者またはその他の哺乳動物を同定することによって実施される。多重特異性ポリペプチド構築物は、対象へ投与される。多重特異性ポリペプチド構築物は、対象へ投与され、一般に、標的との結合によって効果を及ぼすであろう。
いくつかの態様において、提供された多重特異性コンジュゲートまたは薬学的組成物のいずれかを、治療的に有効な量で、投与することによって、対象における免疫応答を調節する方法が、本明細書中に提供される。いくつかの態様において、免疫応答を調節する方法は、対象における免疫応答を増加させるかまたは増強する。例えば、増加したまたは増強された応答は、細胞性免疫の増加であり得る。いくつかの例において、方法は、細胞溶解性T細胞（CTL）活性のようなT細胞活性を増加させる。いくつかの態様において、調節された（例えば、増加した）免疫応答は、腫瘍またはがんに対するものである。
多重特異性ポリペプチド構築物の投与は、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域を通したFcγRの係合を介して、自然免疫細胞を活性化することができる。多重特異性ポリペプチド構築物の投与は、ADCC、サイトカイン放出、脱顆粒、および/またはADCPを含む自然免疫細胞エフェクター機能を誘起し、刺激し、活性化し、かつ/または強化することができる。多重特異性ポリペプチド構築物が切断可能リンカーを含有する例において、多重特異性ポリペプチド構築物の投与は、第1および第2の成分を接合するリンカーがプロテアーゼによって切断され、それによって、抗CD3結合部分がT細胞上のCD3εに結合することが可能になった後、T細胞を活性化することができる。多重特異性ポリペプチド構築物の投与は、CD3によって媒介されるT細胞活性化、細胞傷害、サイトカイン放出、および/または増殖を誘起し、刺激し、活性化し、かつ/または強化することができる。
いくつかの態様において、提供された方法は、提供された多重特異性コンジュゲートまたは薬学的組成物のいずれかを、治療的に有効な量で、投与することによって、対象における疾患または状態を処置するためのものである。いくつかの態様において、疾患または状態は、腫瘍またはがんである。一般に、疾患または障害の緩和または処置は、疾患または障害に関連した一つまたは複数の症状または医学的問題の低減を含む。例えば、がんのケースにおいて、治療的に有効な量の薬物は、以下のうちの一つまたは組み合わせを達成することができる：がん細胞の数の低下；腫瘍サイズの低下；末梢器官へのがん細胞浸潤の阻害（即ち、ある程度の減少および/もしくは中止）；腫瘍転移の阻害；腫瘍成長のある程度の阻害；ならびに/またはがんに関連した症状のうちの一つもしくは複数のある程度の軽減。いくつかの態様において、本開示の組成物は、対象、例えば、ヒト、または非ヒト霊長類、ペット（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、家畜、実験動物、もしくは動物園の動物のようなその他の哺乳動物において、疾患または障害の発病または再発を防止するために使用され得る。対象および患者という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。
いくつかの態様において、薬学的組成物は、（ヒトがん細胞のような）哺乳動物がん細胞の成長を阻害するために使用され得る。がんを処置する方法は、本明細書中に記載された薬学的組成物のいずれかを、有効量、がんを有する対象へ投与する工程を含み得る。有効量の薬学的組成物は、がんの進行を阻害するか、停止させるか、または逆転させるために投与され得る。ヒトがん細胞は、インビボまたはエクスビボで処置され得る。ヒト患者のエクスビボ処置においては、がん細胞を含有している組織または液体が、体外で処置され、次いで、組織または液体が、患者へ戻し再導入される。いくつかの態様において、がんは、治療用組成物の患者への投与によって、インビボでヒト患者において処置される。
疾患の非限定的な例には、全ての型のがん（乳がん、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、黒色腫、頭頸部がん、膵臓がん等）、関節リウマチ、クローン病、SLE、心血管傷害、虚血等が含まれる。例えば、適応症には、T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）を含む白血病、多発性骨髄腫を含むリンパ芽球性疾患、ならびに肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、および三種陰性乳がんを含む乳がんを含む固形腫瘍が含まれるであろう。例えば、適応症には、原発腫瘍起源に関わらない、がんにおける骨疾患もしくは転移；非限定的な例として、ER/PR+乳がん、Her2+乳がん、三種陰性乳がんを含む乳がん；結腸直腸がん；子宮内膜がん；胃がん；膠芽腫；食道がんのような頭頸部がん；非限定的な例として、非小細胞肺がんのような肺がん；多発性骨髄腫；卵巣がん；膵臓がん；前立腺がん；骨肉腫のような肉腫；非限定的な例として、腎細胞がんのような腎臓がん；および/または、非限定的な例として、扁平上皮がん、基底細胞がん、もしくは黒色腫のような皮膚がんが含まれる。いくつかの態様において、がんは、扁平上皮がんである。いくつかの態様において、がんは、皮膚扁平上皮がんである。いくつかの態様において、がんは、食道扁平上皮がんである。いくつかの態様において、がんは、頭頸部扁平上皮がんである。いくつかの態様において、がんは、肺扁平上皮がんである。
本開示の多重特異性ポリペプチド構築物の治療的に有効な量は、一般に、治療目的を達成するために必要とされる量に関する。前述のように、これは、ある種のケースにおいて、FcγRによって媒介される自然免疫細胞活性化またはCD3によって媒介されるT細胞活性化を誘起し、刺激し、活性化し、かつ/または強化する、多重特異性ポリペプチド構築物とその標的抗原との間の結合相互作用であり得る。投与される必要がある量は、さらに、多重特異性ポリペプチド構築物の特定の抗原に対する結合親和性に依り、投与された多重特異性ポリペプチド構築物が、それが投与された対象の自由体積から枯渇する速度にも依るであろう。多重特異性ポリペプチド構築物の治療的に有効な用量の一般的な範囲は、例えば、非限定的に、約0.01μg/kg体重〜約10mg/kg体重であり得る。いくつかの態様において、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物の治療的に有効な用量は、例えば、非限定的に、約0.01mg/kg体重から約5〜10mg/kg体重までであり得る。一般的な投薬頻度は、例えば、1日2回〜週1回であり得る。
処置の有効性は、特定の障害を診断するかまたは処置する任意の公知の方法と共に決定される。所望の特異性を保有する多重特異性ポリペプチド構築物のスクリーニングの方法には、当技術分野において公知の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）およびその他の免疫学的に媒介される技術が含まれるが、これらに限定されるわけではない。提供された多重特異性ポリペプチド構築物の投与が、望まれない免疫応答を媒介するかもしくは媒介することができる免疫細胞の排除、隔離、もしくは不活化；防御免疫応答を媒介するかもしくは媒介することができる免疫細胞の誘導、生成、もしくは活性化；免疫細胞の物理的もしくは機能的な特性の変化；またはこれらの効果の組み合わせによって、免疫活性を十分に調節するか否かを決定するため、多様な手段が公知である。免疫活性の調節の測定の例には、（フローサイトメトリー、免疫組織化学、組織学、電子顕微鏡法、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用した）免疫細胞集団の存在または欠如の調査；シグナルに応答して増殖するかまたは分裂する能力または抵抗性を含む免疫細胞の機能的能力の測定（例えば、T細胞増殖アッセイ、および抗CD3抗体、抗T細胞受容体抗体、抗CD28抗体、カルシウムイオノフォア、PMA（ホルボール12-ミリステート13-アセテート）、ペプチドまたはタンパク質抗原が負荷された抗原提示細胞による刺激後の3Hチミジン取り込みに基づくpepscan分析；B細胞増殖アッセイの使用）；（細胞傷害性T細胞アッセイのような）他の細胞を死滅させるかまたは溶解する能力の測定；（例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ、ウエスタンブロット分析、タンパク質マイクロアレイ分析、免疫沈降分析による）サイトカイン、ケモカイン、細胞表面分子、抗体、および細胞の他の生成物の測定；免疫細胞または免疫細胞内のシグナリング経路の活性化の生化学的マーカーの測定（例えば、ウエスタンブロット、およびチロシン、セリン、またはトレオニンのリン酸化の免疫沈降分析、ポリペプチド切断、およびタンパク質複合体の形成または解離；タンパク質アレイ分析；DNAアレイまたはサブトラクティブハイブリダイゼーションを使用したDNA転写プロファイリング）；アポトーシス、壊死、またはその他の機序による細胞死の測定（例えば、アネキシンV染色、TUNELアッセイ、DNAラダー形成を測定するゲル電気泳動、組織学；蛍光発生カスパーゼアッセイ、カスパーゼ基質のウエスタンブロット分析）；免疫細胞によって産生された遺伝子、タンパク質、およびその他の分子の測定（例えば、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応、DNAマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、二次元ゲル電気泳動、ウエスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着アッセイ、フローサイトメトリー）；ならびに、例えば、再発率または疾患重症度を測定することによる、自己タンパク質または自己ポリペプチドを含む自己免疫疾患、神経変性疾患、およびその他の疾患の改善のような臨床的な症状または転帰の測定（臨床スコア、付加的な治療の使用の必要性、機能的状態、画像研究）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
多重特異性ポリペプチド構築物は、多様な診断用および予防用の製剤においても有用である。一つの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、前記の障害のうちの一つまたは複数を発症するリスクを有する患者へ投与される。患者または器官の、障害のうちの一つまたは複数の素因は、遺伝子型マーカー、血清学的マーカー、または生化学的マーカーを使用して決定され得る。
本開示の別の態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、前記の障害のうちの一つまたは複数に関連した臨床的適応症を有すると診断されたヒト個体へ投与される。診断時に、多重特異性ポリペプチド構築物は、臨床的適応症の効果を和らげるかまたは逆転させるために投与される。
併用療法
いくつかの態様において、本明細書中で集合的に治療薬と呼ばれる多重特異性ポリペプチド構築物、コンジュゲートされた多重特異性ポリペプチド構築物、およびそれらの組成物は、1種もしくは複数種の付加的な薬剤または付加的な薬剤の組み合わせと共に投与される。適当な付加的な薬剤には、意図された適用のための現在の医薬および/または外科的治療が含まれる。例えば、治療薬は、付加的な化学療法剤または抗腫瘍剤と共に使用され得る。例えば、治療薬および付加的な薬剤は、単一の治療用組成物へ製剤化され、治療薬および付加的な薬剤は、同時に投与される。いくつかの態様において、治療薬および付加的な薬剤は、相互に別々であり、例えば、各々、別々の治療用組成物へ製剤化され、治療薬および付加的な薬剤は、同時に投与されるか、または治療薬および付加的な薬剤は、処置計画中の異なる時点で投与される。例えば、治療薬が付加的な薬剤の投与の前に投与されるか、治療薬が付加的な薬剤の投与の後に投与されるか、または治療薬および付加的な薬剤が交互に投与される。本明細書中に記載されるように、治療薬および付加的な薬剤は、単回投与されるかまたは複数回投与される。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、治療薬へカップリングされるかまたは他の方法で付着させられる。適当な付加的な薬剤は、意図された適用の目的（即ち、死滅、細胞増殖の防止、ホルモン治療、または遺伝子治療）によって選択される。そのような薬剤には、例えば、薬学的薬剤、毒素、毒素の断片、アルキル化剤、酵素、抗生物質、代謝拮抗薬、抗増殖剤、ホルモン、神経伝達物質、DNA、RNA、siRNA、オリゴヌクレオチド、アンチセンスRNA、アプタマー、診断薬、放射線不透過性色素、放射性同位体、蛍光発生化合物、磁気標識、ナノ粒子、マーカー化合物、レクチン、細胞膜透過性を変更する化合物、光化学的化合物、低分子、リポソーム、ミセル、遺伝子治療ベクター、ウイルスベクター等が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。最後に、薬剤の組み合わせまたは異なるクラスの薬剤の組み合わせが使用されてもよい。
一つの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、併用療法において投与され、即ち、他の薬剤、例えば、自己免疫障害および炎症性疾患のような病理学的状態または障害を処置するため有用である治療剤と組み合わせられる。この情況において「組み合わせ」という用語は、薬剤が、実質的に同時期に、同時にまたは連続的に与えられることを意味する。連続的に与えられる場合、2種の化合物のうちの第1の化合物は、第2の化合物の投与の開始時に、未だ、処置の部位に有効な濃度で検出可能である。
例えば、併用療法には、以下により詳細に記載されるように、1種または複数種の付加的な治療剤、例えば、1種または複数種のサイトカインおよび増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、ならびに/または細胞傷害性薬剤もしくは細胞分裂阻害剤と共に製剤化されかつ/または同時投与される、1種または複数種の本開示の多重特異性ポリペプチド構築物が含まれ得る。さらに、本明細書中に記載された1種または複数種の多重特異性ポリペプチド構築物は、本明細書中に記載された治療剤のうちの2種以上と組み合わせて使用されてもよい。そのような併用療法は、有利に、投与される治療剤のより低い用量を利用し、従って、様々な単独治療に関連した可能性のある毒性または合併症を回避することができる。
他の態様において、1種または複数種の本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、1種または複数種の抗炎症薬、免疫抑制薬、代謝阻害剤、または酵素阻害剤と共に製剤化されかつ/または同時投与され得る。本明細書中に記載された抗体と組み合わせて使用され得る薬物または阻害剤の非限定的な例には、非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）、例えば、イブプロフェン、テニダプ（tenidap）、ナプロキセン、メロキシカム（meloxicam）、ピロキシカム（piroxicam）、ジクロフェナク、およびインドメタシン；スルファサラジン；プレドニゾロンのような副腎皮質ステロイド；サイトカイン抑制性抗炎症薬（CSAID）；ヌクレオチド生合成の阻害剤、例えば、プリン生合成の阻害剤、葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキサート（N-[4-[[(2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル]メチルアミノ]ベンゾイル]-L-グルタミン酸）；ならびにピリミジン生合成の阻害剤、例えば、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（DHODH）阻害剤のうちの1種または複数種が含まれるが、これらに限定されるわけではない。本開示の抗体と組み合わせて使用するために適当な治療剤には、NSAID、CSAID、（DHODH）阻害剤（例えば、レフルノミド）、および葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキサート）が含まれる。
付加的な阻害剤の例には、副腎皮質ステロイド（経口、吸入、および局所注射）；免疫抑制薬、例えば、シクロスポリン、タクロリムス（FK-506）；ならびにmTOR阻害剤、例えば、シロリムス（ラパマイシン-RAPAMUNE（商標））またはラパマイシン誘導体、例えば、可溶性ラパマイシン誘導体（例えば、エステルラパマイシン誘導体、例えば、CCI-779）；TNFαまたはIL-1のような炎症誘発性サイトカインによるシグナリングに干渉する薬剤（例えば、IRAK、NIK、IKK、p38、またはMAPキナーゼ阻害剤）；COX2阻害剤、例えば、セレコキシブ、ロフェコキシブ、およびそれらのバリアント；ホスホジエステラーゼ阻害薬、例えば、R973401（ホスホジエステラーゼIV型阻害剤）；ホスホリパーゼ阻害剤、例えば、サイトゾルホスホリパーゼ2（cPLA2）の阻害剤（例えば、トリフルオロメチルケトン類似体）；血管内皮細胞増殖因子または増殖因子受容体の阻害剤、例えば、VEGF阻害剤および/またはVEGF-R阻害剤；ならびに血管形成の阻害剤のうちの1種または複数種が含まれる。本開示の抗体と組み合わせて使用するために適当な治療剤は、免疫抑制薬、例えば、シクロスポリン、タクロリムス（FK-506）；mTOR阻害剤、例えば、シロリムス（ラパマイシン）またはラパマイシン誘導体、例えば、可溶性ラパマイシン誘導体（例えば、エステルラパマイシン誘導体、例えば、CCI-779）；COX2阻害剤、例えば、セレコキシブおよびそのバリアント；ならびにホスホリパーゼ阻害剤、例えば、サイトゾルホスホリパーゼ2（cPLA2）の阻害剤、例えば、トリフルオロメチルケトン類似体である。多重特異性ポリペプチド構築物と組み合わせられ得る治療剤の付加的な例には、6-メルカプトプリン（6-MP）；アザチオプリンスルファサラジン；メサラジン；オルサラジン；クロロキン/ヒドロキシクロロキン（PLAQUENIL（登録商標））；ペニシラミン；金チオマレイン酸（筋肉内および経口）；アザチオプリン；コルヒチン；β2アドレナリン受容体アゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテロール）；キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）；クロモグリク酸；ネドクロミル；ケトチフェン；イプラトロピウムおよびオキシトロピウム；ミコフェノール酸モフェチル；アデノシンアゴニスト；抗血栓剤；補体阻害剤；ならびにアドレナリン作用薬のうちの1種または複数種が含まれる。
V. 例示的な態様
提供された態様には、以下のものが含まれる。
1. 免疫グロブリンFc領域を含む第1の成分およびCD3結合領域を含む第2の成分を含む多重特異性ポリペプチド構築物であって、
第1および第2の成分が非切断可能リンカーによってカップリングされており、Fc領域がCD3結合領域のN末端側に位置付けられており；
第1および第2の成分の一方または両方が、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む、多重特異性ポリペプチド構築物。
2. CD3結合領域がCD3（CD3ε）に結合する、態様1の多重特異性ポリペプチド構築物。
3. 抗原結合ドメインが、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、態様1または態様2の多重特異性構築物。
4. 第1の成分が第1の抗原結合ドメインを含み、第2の成分が第2の抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインの各々が腫瘍関連抗原（TAA）に結合する、態様1〜3のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
5. 第1の抗原結合ドメインが多重特異性構築物のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、第2の抗原結合ドメインが多重特異性構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、態様4の多重特異性ポリペプチド構築物。
6. N末端からC末端へ順に、以下のものを含む、多重特異性ポリペプチド構築物：
腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第1の抗原結合ドメイン；
免疫グロブリンFc領域；
非切断可能リンカー；
CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および
腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第2の抗原結合ドメイン。
7. N末端からC末端へ順に、以下のものを含む、多重特異性ポリペプチド構築物：
免疫グロブリンFc領域；
非切断可能リンカー；
CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および
腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメイン。
8. N末端からC末端へ順に、以下のものを含む、多重特異性ポリペプチド構築物：
腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメイン；
免疫グロブリンFc領域；
非切断可能リンカー；および
CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域。
9. Fc領域がホモ二量体Fc領域である、態様1〜8のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
10. Fc領域が、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、もしくはヒトIgG4のFc領域であるか、またはそれらの免疫活性断片である、態様1〜9のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
11. Fc領域が、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:1との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含む、態様1〜10のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
12. Fc領域が、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列もしくはSEQ ID NO:2との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含むか；
Fc領域が、SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列もしくはSEQ ID NO:4との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含むか；または
Fc領域が、SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列もしくはSEQ ID NO:5との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含む、
態様1〜10のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
13. Fc領域がヘテロ二量体Fc領域である、態様1〜6、9、および12のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
14. ヘテロ二量体Fc領域の一方または両方のFcポリペプチドが、ホモ二量体Fc領域のポリペプチドと比較して、任意で、SEQ ID NO:1に示されるFcポリペプチドまたはその免疫活性断片と比較して、ヘテロ二量体化を誘導するための少なくとも1個の修飾を含む、態様13の多重特異性ポリペプチド構築物。
15. ヘテロ二量体FcのFcポリペプチドの各々が独立に少なくとも1個のアミノ酸修飾を含む、態様14の多重特異性ポリペプチド構築物。
16. ヘテロ二量体FcのFcポリペプチドの各々がノブイントゥホール修飾を含むかまたはポリペプチドの静電的相補性を増加させるための電荷変異を含む、態様15の多重特異性ポリペプチド構築物。
17. アミノ酸修飾がノブイントゥホール修飾である、態様16の多重特異性ポリペプチド構築物。
18. ヘテロ二量体Fcの第1のFcポリペプチドがThr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val、およびそれらの組み合わせより選択される修飾を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のFcポリペプチドが修飾T366Wを含む、態様13〜17のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
19. 第1および第2のFcポリペプチドが非システイン残基のシステイン残基への修飾をさらに含み、第1のポリペプチドの修飾が位置Ser354およびY349の一方にあり、第2のFcポリペプチドの修飾が位置Ser354およびY349の他方にある、態様18の多重特異性ポリペプチド構築物。
20. アミノ酸修飾がポリペプチドの静電的相補性を増加させるための電荷変異である、態様16の多重特異性ポリペプチド構築物。
21. 第1および/もしくは第2のFcポリペプチドまたは第1および第2のFcポリペプチドの各々が相補的な位置に修飾を含み、ここで、修飾が他方のポリペプチドの相補的なアミノ酸と反対の電荷を有するアミノ酸への置換である、態様13〜16および20のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
22. ヘテロ二量体Fcの第1または第2のFcポリペプチドの一方が残基Ile253における修飾をさらに含む、態様14〜21のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
23. 修飾がIle253Argである、態様22の多重特異性ポリペプチド構築物。
24. ヘテロ二量体Fcの第1または第2のFcポリペプチドの一方が残基His435における修飾をさらに含む、態様14〜23のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
25. 修飾がHis435Argである、態様24の多重特異性ポリペプチド構築物。
26. Fc領域が、Lys447を欠くポリペプチドを含む、態様1〜25のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
27. Fc領域が、FcRn結合を増強するための少なくとも1個の修飾を含むポリペプチドを含む、態様1〜26のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
28. 修飾がMet252、Ser254、Thr256、Met428、Asn434、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される位置にある、態様27の多重特異性ポリペプチド構築物。
29. 修飾がMet252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される位置にある、態様28の多重特異性ポリペプチド構築物。
30. 修飾が位置Met252および位置Met428にある、態様28の多重特異性ポリペプチド構築物。
31. 修飾がMet252YおよびMet428Lである、態様30の多重特異性ポリペプチド構築物。
32. 修飾がMet252YおよびMet428Vである、態様30の多重特異性ポリペプチド構築物。
33. ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドがSEQ ID NO:82、86、94、または96のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドがSEQ ID NO:83、87、90、92、98、または100のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、態様13〜32のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
34. Fc領域が、エフェクター機能を低下させかつ/またはFcγ受容体もしくはC1qより選択されるエフェクター分子との結合を低下させる少なくとも1個のアミノ酸修飾を含むポリペプチドを含む、態様1〜33のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
35. 1つまたは複数のアミノ酸修飾がGlu233、Leu234、またはLeu235のうちの1つまたは複数の欠失である、態様34の多重特異性ポリペプチド構築物。
36. ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドがSEQ ID NO:84、88、95、または97のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドがSEQ ID NO:85、89、91、93、99、または101のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、態様13〜32、34、および35のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
37. Fc領域がFcγR結合を増強するための少なくとも1個の修飾を含むポリペプチドを含む、態様1〜32のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
38. 修飾がSer239またはIle332における修飾である、態様37の多重特異性ポリペプチド構築物。
39. Fc領域のグリコシル化が未修飾のFc領域と比較してFcγR結合を増強するために修飾されている、態様1〜32および37のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
40. Fc領域がフコースを欠くかまたは低下したフコース含量を有する、態様39の多重特異性ポリペプチド構築物。
41. CD3結合領域が抗CD3抗体または抗原結合断片である、態様1〜40のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
42. 抗CD3抗体または抗原結合断片が可変重鎖領域（VH）および可変軽鎖領域（VL）を含む、態様41の多重特異性ポリペプチド構築物。
43. CD3結合領域が1価である、態様1〜42のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
44. 抗CD3抗体または抗原結合断片が単鎖抗体ではなく、任意で、単鎖可変断片（scFv）ではない、態様41〜43のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
45. Fcがヘテロ二量体Fcであり、抗CD3抗体または抗原結合断片を構成するVHおよびVLがヘテロ二量体Fcの対向するポリペプチドに連結されている、態様42または態様44の多重特異性ポリペプチド構築物。
46. 抗原結合ドメインのうちの少なくとも1個がTAAに結合しない限り、CD3結合領域がCD3に結合するかまたは係合することができないかまたは実質的にできない、態様1〜45のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
47. 抗原結合ドメインのうちの少なくとも2個がTAAに結合しない限り、CD3結合領域がCD3に結合するかまたは係合することができないかまたは実質的にできない、態様1〜46のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
48. リンカーがポリペプチドリンカーである、態様1〜47のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
49. リンカーが25アミノ酸長までのポリペプチドである、態様48の多重特異性ポリペプチド構築物。
50. リンカーが、約2〜24アミノ酸、2〜20アミノ酸、2〜18アミノ酸、2〜14アミノ酸、2〜12アミノ酸、2〜10アミノ酸、2〜8アミノ酸、2〜6アミノ酸、6〜24アミノ酸、6〜20アミノ酸、6〜18アミノ酸、6〜14アミノ酸、6〜12アミノ酸、6〜10アミノ酸、6〜8アミノ酸、8〜24アミノ酸、8〜20アミノ酸、8〜18アミノ酸、8〜14アミノ酸、8〜12アミノ酸、8〜10アミノ酸、10〜24アミノ酸、10〜20アミノ酸、10〜18アミノ酸、10〜14アミノ酸、10〜12アミノ酸、12〜24アミノ酸、12〜20アミノ酸、12〜18アミノ酸、12〜14アミノ酸、14〜24アミノ酸、14〜20アミノ酸、14〜18アミノ酸、18〜24アミノ酸、18〜20アミノ酸、または20〜24アミノ酸のポリペプチドである、態様48または態様49の多重特異性ポリペプチド構築物。
51. リンカーが、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸長であるポリペプチドである、態様48〜50のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
52. リンカーが、3〜18アミノ酸長であるポリペプチドである、態様48〜51のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
53. リンカーが、12〜18アミノ酸長であるポリペプチドである、態様48〜51のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
54. リンカーが、15〜18アミノ酸長であるポリペプチドである、態様48〜51のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
55. ヘテロ二量体Fc領域を含む第1の成分ならびに可変重鎖領域（VH）および可変軽鎖領域（VL）を含む抗CD3抗体または抗原結合断片を含む第2の成分を含む多重特異性ポリペプチド構築物であって、
抗CD3抗体または抗原結合断片を構成するVHおよびVLがヘテロ二量体Fcの対向するポリペプチドに連結されており；
第1および第2の成分が非切断可能リンカーによってカップリングされており、ヘテロ二量体Fc領域が抗CD3抗体のN末端側に位置付けられており；
第1および第2の成分の一方または両方が腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む、
多重特異性ポリペプチド構築物。
56. 非切断可能リンカーが、プロテアーゼによる切断のために特異的に認識される基質認識部位を含有しない、態様52〜55のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
57. プロテアーゼが免疫エフェクター細胞によって、腫瘍によって、または腫瘍微小環境に存在する細胞によって産生される、態様56の多重特異性ポリペプチド構築物。
58. プロテアーゼが免疫エフェクター細胞によって産生され、免疫エフェクター細胞が活性化T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、またはNK T細胞である、態様57の多重特異性ポリペプチド構築物。
59. プロテアーゼがマトリプターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、グランザイムB、およびそれらの組み合わせより選択される、態様56〜58のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
60. プロテアーゼがグランザイムBである、態様59の多重特異性ポリペプチド構築物。
61. 非切断可能リンカーが
Figure 2021520812
およびそれらの組み合わせを含む、態様1〜60のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
62. 非切断可能リンカーが(GGS)n（nは1〜10である）を含む、態様1〜61のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
63. 非切断可能リンカーが(GGGGS)n（SEQ ID NO:173）（nは1〜10である）を含む、態様1〜62のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
64. 非切断可能リンカーが(GGGGGS)n（SEQ ID NO:172）（nは1〜4である）を含む、態様1〜62のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
65. 非切断可能リンカーがGGSを含む、態様1〜64のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
66. 非切断可能リンカーがGGGGS（SEQ ID NO:149）を含む、態様1〜64のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
67. 非切断可能リンカーがGGGGGS（SEQ ID NO:135）を含む、態様1〜64のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
68. 非切断可能リンカーが(GGS)2（SEQ ID NO:10）を含む、態様1〜64のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
69. 非切断可能リンカーがGGSGGSGGS（SEQ ID NO:11）を含む、態様1〜64のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
70. 非切断可能リンカーがGGSGGSGGSGGS（SEQ ID NO:12）を含む、態様1〜64のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
71. 非切断可能リンカーが
Figure 2021520812
を含む、態様1〜64のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
72. 非切断可能リンカーが
Figure 2021520812
を含む、態様1〜64のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
73. 非切断可能リンカーが
Figure 2021520812
を含む、態様1〜64のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
74. 非切断可能リンカーが
Figure 2021520812
を含む、態様1〜64のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
75. （i）ヘテロ二量体Fc領域の第1のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVHドメインを含む第1のポリペプチド；ならびに（ii）ヘテロ二量体Fc領域の第2のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVLドメインを含む第2のポリペプチドを少なくとも含む、態様45〜74のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物であって、第1および第2のポリペプチドの一方または両方が、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する少なくとも1個の抗原結合ドメインを含む、多重特異性ポリペプチド構築物。
76. TAAに結合する1つまたは複数の抗原結合ドメインがTAAとの1価、2価、3価、または4価の結合をもたらす、態様1〜75のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
77. 第1または第2のポリペプチドの一方のみが、TAAに結合する少なくとも1個の抗原結合ドメインを含む、態様75の多重特異性ポリペプチド構築物。
78. 少なくとも1個の抗原結合ドメインが、多重特異性ポリペプチド構築物の第1または第2ポリペプチドの一方のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられておりかつ/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、態様75または態様77の多重特異性ポリペプチド構築物。
79. 少なくとも1個の抗原結合ドメインが多重特異性構築物のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、第2の抗原結合ドメインが多重特異性構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、態様75または態様77の多重特異性ポリペプチド構築物。
80. 抗原結合ドメインが、または抗原結合ドメインの各々が独立に、TAAのネイティブ同族結合パートナーの細胞外ドメインもしくはその結合断片、またはTAAとの結合活性を示すそれらのバリアントを含む、態様1〜79のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
81. 抗原結合ドメインが、または抗原結合ドメインの各々が独立に、Fab断片、F(ab')2断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片である、態様1〜79のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
82. 抗体またはその抗原結合断片がFv、scFv、Fab、シングルドメイン抗体（sdAb）、VNAR、またはVHHである、態様81の多重特異性ポリペプチド構築物。
83. 抗体または抗原結合断片がsdAbである、態様81または態様82の多重特異性ポリペプチド構築物。
84. sdAbがヒトsdAbまたはヒト化sdAbである、態様83の多重特異性ポリペプチド構築物。
85. sdAbがVHH、VNAR、改変されたVHドメイン、または改変されたVKドメインである、態様83または態様84の多重特異性ポリペプチド構築物。
86. 抗体またはその抗原結合断片がscFvである、態様81または態様82の多重特異性ポリペプチド構築物。
87. 抗体またはその抗原結合断片がFabである、態様81または態様82の多重特異性ポリペプチド構築物。
88. （i）ヘテロ二量体Fc領域の第1のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVHドメインを含む第1のポリペプチド；
（ii）ヘテロ二量体Fc領域の第2のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVLドメインを含む第2のポリペプチド、ならびに
（iii）腫瘍関連抗原に結合するFab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLを含む第3のポリペプチド
を含む、態様87の多重特異性ポリペプチド構築物であって、第1および/または第2のポリペプチドがFab抗体断片のVH-CH1(Fd)またはVL-CLの他方をさらに含む、多重特異性ポリペプチド構築物。
89. 第1または第2のポリペプチドの一方のみがFab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方を含む、態様88の多重特異性ポリペプチド構築物。
90. 第1または第2のポリペプチドの両方がFab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方を含む、態様89の多重特異性ポリペプチド構築物。
91. Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方が多重特異性ポリペプチド構築物の第1もしくは第2のポリペプチドの一方のFc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、態様89または態様90の多重特異性ポリペプチド構築物。
92. Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方が第1のポリペプチドもしくは第2のポリペプチドのFc領域に対してアミノ末端側および/または第1もしくは第2のポリペプチドの他方のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、態様89〜91のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
93. 抗原結合ドメインが、または抗原結合ドメインの各々が独立に、1-92-LFA-3、5T4、α4インテグリン、αVインテグリン、α4β1インテグリン、α4β7インテグリン、AGR2、抗ルイスY、アペリンJ受容体、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補体、C-242、CA9、CA19-9、（ルイスa）、炭酸脱水酵素9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、（IL-2RG）、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5（CEA）、CEACAM6（NCA-90）、クローディン3、クローディン4、cMet、コラーゲン、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、エンドセリンB受容体（ETBR）、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSVのFタンパク質、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受容体α（FRα）、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受容体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、ヒアルロニダーゼ、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受容体（FceRI）、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R（wsx1）、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、インスリン受容体、Jaggedリガンド、Jagged1、Jagged2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、ルイスX、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、メソテリン、MRP4、MUC1、ムチン16（MUC16、CA-125）、Na/K ATPアーゼ、NGF、ニカストリン、ノッチ受容体、ノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、ノッチ4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、ホスファチジルセリン、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、スフィンゴシン-1-リン酸、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2、およびWISP-3より選択される腫瘍抗原に結合する、態様1〜92のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
94. 多重特異性抗原結合ドメインが第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインを少なくとも含み、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが同一のTAAに結合する、態様1〜93のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
95. 第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが同一のTAAの異なるエピトープに結合する、態様94の多重特異性ポリペプチド構築物。
96. 第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが同一のTAAの同一のエピトープに結合する、態様94の多重特異性ポリペプチド構築物。
97. 多重特異性抗原結合ドメインが第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインを少なくとも含み、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが異なるTAAに結合する、態様1〜96のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
98. 第1の抗原結合ドメインとFc領域との間の第1の連結ペプチド（LP1）を含む、態様5〜97のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
99. CD3結合領域と第2の抗原結合ドメインとの間の第2の連結ペプチド（LP2）を含む、態様5〜98のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
100. 第1の抗原結合ドメインとFc領域との間の第1の連結ペプチド（LP1）およびCD3結合領域と第2の抗原結合ドメインとの間の第2の連結ペプチド（LP2）を含み、N末端からC末端へ以下のような構造的配置：第1の抗原結合ドメイン - LP1 - Fc領域 - 非切断可能リンカー - CD3結合領域 - LP2 - 第2の抗原結合ドメインを有する、態様5〜99のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
101. 2つの連結されたペプチドが、互いに同一である、態様100の多重特異性ポリペプチド構築物。
102. 2個の連結ペプチドが相互に同一でない、態様100の多重特異性ポリペプチド構築物。
103. LP1またはLP2が独立に約1〜20アミノ酸長のペプチドである、態様98〜102のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
104. LP1またはLP2が独立にSEQ ID NO:10〜13、119、135、147、149、またはGGSに示されるGly-Serリンカーであるかまたはそれを含むペプチドを含む、態様103の多重特異性ポリペプチド。
105. 抗CD3抗体または抗原結合断片がFv抗体断片である、態様41〜104のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
106. Fv抗体断片がジスルフィドによって安定化された抗CD3結合Fv断片（dsFv）を含む、態様105の多重特異性ポリペプチド構築物。
107. 抗CD3抗体もしくは抗原結合断片が、アミノ酸配列TYAMN（SEQ ID NO:16）もしくはSEQ ID NO:211を含むVH CDR1、アミノ酸配列
Figure 2021520812
もしくはSEQ ID NO:212を含むVH CDR2；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を含むVH CDR3；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を含むVL CDR1；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）を含むVL CDR2；およびアミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）を含むVL CDR3を含むか；または
抗CD3抗体もしくは抗原結合断片が、アミノ酸配列GFTFNTYAMN（SEQ ID NO:211）を少なくとも含むVH CDR1配列；アミノ酸配列RIRSKYNNYATY（SEQ ID NO:212）を少なくとも含むVH CDR2配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を少なくとも含むVH CDR3配列；アミノ酸配列
Figure 2021520812
を含む少なくともVL CDR1配列；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:230）を少なくとも含むVL CDR2配列；およびアミノ酸配列ALWYSNHWV（SEQ ID NO:225）を少なくとも含むVL CDR3配列を含む、態様41〜106のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
108. 抗CD3 dsFvが、
SEQ ID NO:14および32〜62のいずれかのアミノ酸配列またはSEQ ID NO:14および32〜62のいずれかとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を有するVH；ならびに
SEQ ID NO:15および63〜81のいずれかのアミノ酸配列またはSEQ ID NO:14および32〜62のいずれかとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を有するVL
を含む、態様106または態様107の多重特異性ポリペプチド構築物。
109. 抗CD3 dsFvがSEQ ID NO:14のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、態様106〜108のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
110. 抗CD3 dsFvがSEQ ID NO:44のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:72のアミノ酸配列を含む、態様102〜104のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
111. 薬剤にコンジュゲートされている、態様1〜109のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
112. 薬剤が治療剤、抗腫瘍剤、毒素もしくはその断片、検出可能モエティ、または診断剤である、態様111の多重特異性ポリペプチド構築物。
113. 薬剤がリンカーを介して多重特異性ポリペプチド構築物にコンジュゲートされている、態様112の多重特異性ポリペプチド構築物。
114. 態様1〜113のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド。
115. 態様1〜113のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物のいずれかのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド。
116. 態様1〜115のいずれかの多重特異性構築物の第1のポリペプチドをコードする第1の核酸配列、および多重特異性構築物の第2のポリペプチドをコードする第2の核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、第1および第2の核酸配列が配列内リボソーム進入部位（IRES）または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸によって分離されている、ポリヌクレオチド。
117. 第1の核酸配列および第2の核酸配列が同一のプロモーターに機能的に連結されている、態様116のポリヌクレオチド。
118. 多重特異性ポリペプチド構築物が第3のポリペプチド鎖を含み、ポリヌクレオチドが多重特異性構築物の第3のポリペプチドをコードする第3の核酸をさらに含む、態様116または態様117のポリヌクレオチド。
119. 第3の核酸が配列内リボソーム進入部位（IRES）または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸によって第1および/または第2のポリペプチドから分離されており、かつ/または第3の核酸配列が第1および/もしくは第2の核酸配列と同一のプロモーターに機能的に連結されている、態様118のポリヌクレオチド。
120. 自己切断ペプチドまたはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸がT2A、P2A、E2A、またはF2Aより選択される、態様116〜119のいずれかのポリヌクレオチド。
121. 態様114〜120のいずれかのポリヌクレオチドを含むベクター。
122. 発現ベクターである、態様121のベクター。
123. ウイルスベクターまたは真核生物ベクター、任意で、哺乳動物ベクターである、態様121または122のベクター。
124. 態様114〜120のいずれかのポリヌクレオチドまたは態様121〜123のいずれかのベクターを含む細胞。
125. 組換えであるかまたは単離されたものである、態様124の細胞。
126. 哺乳動物細胞である、態様125の細胞。
127. HEK293細胞またはCHO細胞である、態様126の細胞。
128. 態様114〜120のいずれかのポリヌクレオチドまたは態様121〜123のいずれかのベクターを細胞へ導入する工程、および多重特異性ポリペプチド構築物が産生される条件の下で細胞を培養する工程を含む、多重特異性ポリペプチド構築物を作製する方法。
129. 多重特異性ポリペプチドが細胞によって産生される条件の下で態様124〜127のいずれかの細胞を培養する工程を含む、多重特異性ポリペプチド構築物を作製する方法。
130. 哺乳動物細胞である、態様128または129の細胞。
131. HEK293細胞またはCHO細胞である、態様130の細胞。
132. 多重特異性ポリペプチド構築物を細胞から単離するかまたは精製する工程をさらに含む、態様128または態様129の方法。
133. 多重特異性ポリペプチド構築物がヘテロ二量体である、態様128〜132のいずれかの方法。
134. 態様128〜133のいずれかの方法によって作製された多重特異性ポリペプチド構築物。
135. 態様1〜113または態様134のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
136. 無菌である、態様135の薬学的組成物。
137. 態様1〜113もしくは態様134のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物または態様109もしくは態様110の薬学的組成物と標的細胞およびT細胞を接触させる工程を含む、免疫応答を刺激するかまたは誘導する方法であって、標的細胞が多重特異性ポリペプチド構築物によって認識される腫瘍関連抗原を発現している、方法。
138. 標的細胞が腫瘍関連抗原（TAA）を発現する腫瘍細胞である、態様137の方法。
139. 接触がエクスビボまたはインビトロで実施される、態様137または態様138の方法。
140. 接触が対象においてインビボで実施される、態様137〜149のいずれかの方法。
141. 態様1〜113もしくは態様134のいずれかの多重特異性コンジュゲート、または態様109もしくは態様110の薬学的組成物を、治療的に有効量、それを必要とする対象へ投与する工程を含む、対象における免疫応答を刺激するかまたは誘導する方法。
142. 細胞性免疫を増加させる、態様137〜141のいずれかの方法。
143. T細胞活性を増加させる、態様137〜142のいずれかの方法。
144. 細胞溶解性T細胞（CTL）活性を増加させる、態様137〜143のいずれかの方法。
145. 腫瘍またはがんに対する免疫応答が増加する、態様137〜144のいずれかの方法。
146. 対象における疾患または状態を処置する、態様137〜145のいずれかの方法。
147. 態様1〜113のいずれかの多重特異性コンジュゲートまたは態様135もしくは態様136の薬学的組成物を治療的に有効な量で、それを必要とする対象へ投与する工程を含む、対象における疾患または状態を処置する方法。
148. 疾患または状態が腫瘍またはがんである、態様146または態様147の方法。
149. 対象がヒトである、態様140〜148のいずれかの方法。
VI．実施例
以下の実施例は、例示的な目的のために含まれるに過ぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない。
実施例1．制約されたCD3結合を有する多重特異性構築物を作製する方法
実施例1は、制約されたCD3結合を示すCD3結合領域を含有している多重特異性ポリペプチド構築物の生成および発現を記載する。CD3結合領域にリンカー（例えば、非切断可能リンカー）によってカップリングされた免疫グロブリンのヘテロ二量体Fc領域、ならびに多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられた、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する1個または複数個の抗原結合ドメインを含有するよう、図1、図2A〜2B、図3A〜3C、および図4A〜4Bに示されるような様々な配置で多重特異性構築物を生成した。
A．構築物の設計および生成
ヘテロ二量体多重特異性ポリペプチド構築物の第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖を少なくともコードするポリヌクレオチドを、生成し、発現のためプラスミドにクローニングした。第1のポリペプチド鎖は、一般に、N末端からC末端へ順に、第1のFcポリペプチド（例えば、Fcホールポリペプチド）；非切断可能リンカー；および抗CD3抗体の可変軽鎖（VL）ドメインを含んでいた。第2のポリペプチド鎖は、一般に、N末端からC末端へ順に、第2のFcポリペプチド（例えば、Fcノブポリペプチド）；第1のポリペプチド鎖と同一の非切断可能リンカー；および抗CD3抗体の可変重鎖（VH）ドメインを含んでいた。抗CD3抗体は、表E1.1およびE1.2に示されるように、ジスルフィドによって安定化された（dsFv）抗体（抗CD3の変異G44Cを含むVHおよび変異G100Cを含むVL）を含むか、またはジスルフィドによって安定化されていないFv抗体を含有していた。表E1.1および表E1.2に示されるように、ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を容易にする様々な例示的なFcポリペプチド対が使用された。ポリペプチド鎖の一方または両方は、さらに、様々な配置で、Fcドメインのアミノ末端側および/またはCD3結合領域のカルボキシ末端側に1個または複数個のTAA抗原結合ドメインをコードしていた。記載される任意のもののような、他のノブイントゥホール配置を含む他のヘテロ二量体Fc配置を使用して、類似した構築物が生成されてもよく；dsFvもしくはその他の1価断片を含む、他の抗CD3抗体を含む、他のCD3結合領域；またはscFvフォーマット、sdAbフォーマット、もしくはFabフォーマットのような他のTAA抗原結合断片も使用され得る。
生成された構築物において、非切断可能リンカーは、3〜18アミノ酸の範囲のサイズのリンカーを含んでいた。例示的な生成された分子において使用された非切断可能リンカーの例は、GGS（例えば、例示的な構築物cx1356に含有される）、GGSGGS（SEQ ID NO:10、例示的な構築物cx1357に含有される）、GGSGGSGGS（SEQ ID NO:11、例示的な構築物cx1358に含有される）、GGSGGSGGSGGS（SEQ ID NO:12、例示的な構築物cx1359に含有される）、
Figure 2021520812
、例示的な構築物cx1360に含有される）、ならびに
Figure 2021520812
、例示的な構築物cx5823およびcx5952に含有される）、または
Figure 2021520812
、例示的な構築物cx681に含有される）であった。
TAAに結合する任意の抗原結合ドメインが、提供された多重特異性ポリペプチド構築物において利用され得る。例示的な生成されたタンパク質は、葉酸受容体α（FRα）、B7H3（CD276）、またはδ様3（DLL3）に結合する抗原結合ドメインを含有していた。抗原結合ドメインは、単鎖断片（例えば、sdAbもしくはscFv）を含んでいてもよいし、または2本鎖抗原結合断片（Fab）を含んでいてもよい。TAAが、単鎖断片、例えば、sdAbまたはscFvとして提供された時には、TAA抗原結合ドメインを、N末端において、ペプチドリンカー、例えば、PGGGG（SEQ ID NO:102）によって、Fcヘテロ二量体の一方もしくは両方のポリペプチド鎖（例えば、ホールおよび/もしくはノブ）に連結し、かつ/またはC末端において、ペプチドリンカー、例えば、GGGG（SEQ ID NO:103）によって、CD3結合領域の一方もしくは両方のドメイン（例えば、VHおよび/もしくはVL）に連結した。他の類似したペプチドリンカーが利用されてもよい。TAAがFab抗原結合断片として提供された時には、構築物は、リンカーなしで一方または両方のFcポリペプチドに直接連結されたVHおよびCH1、ならびにVLおよびCLから構成された軽鎖から構成されていた。これらのTAA結合Fabは、ヘテロ二量体Fcのアミノ末端に位置してもよいし、またはカルボキシ末端に位置してもよい。
例えば、それぞれ、1価、2価、3価、または4価の結合を提供するため、1個、2個、3個、または4個のTAA抗原結合ドメインを含有している多重特異性ポリペプチド構築物を生成した。いくつかのケースにおいて、TAA抗原結合ドメインは、同一（1エピトープ性）であった。いくつかのケースにおいて、TAA抗原結合ドメインは、異なっており、従って、生成された多重特異性ポリペプチド構築物は、少なくとも2種の異なるTAA、同一のTAAの異なるエピトープ（2エピトープ性）、または同一のTAAの同一のエピトープ（1エピトープ性）に対する特異性を示した。
生成されたタンパク質には、TAA抗原結合ドメインがシングルドメイン抗体（sdAb）として構成された構築物が含まれていた。非切断可能リンカーを含有している例示的な多重特異性ポリペプチド構築物のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを生成した。これらには、図2Bに図示される、FRαを標的とするcx1356、cx1357、cx1358、cx1359、cx1360、およびcx681と名付けられた構築物；図3Aおよび3Bに図示される、B7H3を標的とするcx3072、cx5952、cx6079、cx6080、cx6081、cx5823、cx5873、およびcx5965；ならびに図4Aおよび4Bに図示される、DLL3を標的とするcx5352、cx5499、cx5800、およびcx5801が含まれていた。注目すべきことに、dsFv抗CD3抗体のVHドメインおよびsdAbが、両方とも、Fcヘテロ二量体の同一の側（例えば、ホール側またはノブ側）に連結されたいくつかの構築物（例えば、図3Aに示されるcx3072およびcx5952）が生成された。構築物は、ジスルフィドによって安定化されたFvを含まないよう改変されるか、または抗CD3抗体のVHドメインおよびVLドメインを安定化するジスルフィド結合を含むよう改変された。生成された例示的な構築物のいくつかは、4-1BB共刺激受容体を標的とする（それぞれ、SEQ ID NO:221、222、および223に示されるCDR1、CDR2、およびCDR3を含有している）sdAbをさらに含有していた（例えば、cx5823、cx5873、cx5965、cx5352、cx5801、cx5800）。sdAb TAAドメインを有する例示的な制約CD3結合構築物のリストは、下記表E1.1に与えられる。
（表Ｅ１．１）例示的な制約CD3係合構築物
Figure 2021520812
Figure 2021520812
Figure 2021520812
Figure 2021520812
例示的な生成された構築物には、TAA抗原結合ドメインが（MABフォーマットと名付けられた）Fabとして構成された構築物も含まれていた。この例において、SEQ ID NO:127に示される重鎖FdおよびSEQ ID NO:128に示される軽鎖から構成される抗B7H3 Fabが使用された。非切断可能リンカーを含有している例示的な多重特異性ポリペプチド構築物のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドが生成された。これらには、図3Cに図示されるcx5067、cx6083、およびcx6084が含まれていた。構築物は、ジスルフィドによって安定化された抗CD3抗体のFvを含まないよう改変されるか、または抗CD3抗体のVHドメインおよびVLドメインを安定化するジスルフィド結合（抗CD3の変異G44Cを含むVHおよび変異G100Cを含むVL）を含むよう改変された。例示的なFab構築物のリストは、下記表E1.2に提供される。
（表Ｅ１．２）例示的なB7H3を標的とする制約CD3係合構築物
Figure 2021520812
B．生成された構築物の発現および精製
ヘテロ二量体制約CD3結合タンパク質の各鎖をコードする別々のプラスミドを、ポリエチレンイミンを使用して、哺乳動物細胞（HEK293またはCHOのいずれか）に等モル比で一過性トランスフェクトした。上清中に分泌された組換えタンパク質を、3〜14日後に収集し、プロテインAクロマトグラフィ後の調製用サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）またはフロースルー疎水性相互作用クロマトグラフィ（HIC）のいずれかによって精製した。いくつかのケースにおいて、プロテインAに結合せず、従って、I253RまたはH435Rのホモ二量体が精製されないよう、ヘテロ二量体Fcの一方の鎖（一般的には、ホールFc）の位置I253RまたはH435Rに設計された変異によって、精製中にヘテロ二量体タンパク質を濃縮した。より疎水性であり、予想分子量の2倍である、2個のヘテロ二量体Fcを含有している不要の交差対合種を除去するため、SEC（Superdex-200樹脂によるAKTA）またはFT-HIC（ブチル/フェニルセファロースによるAKTA）による第2のクロマトグラフィ工程を使用した。
方法は、ヘテロ二量体Fcの適切に対合した種および抗CD3 Fv（例えば、ジスルフィドによって安定化された抗CD3 Fv）を含有しているヘテロ二量体多重特異性ポリペプチド構築物の作製のために好都合であった。精製されたヘテロ二量体制約CD3結合タンパク質は、安定しており、4℃でのインキュベーションの延長またはタンパク質濃度の増加によって、交差対合種は蓄積されなかった。
実施例2：がん細胞および初代T細胞との制約CD3結合構築物の結合の、フローサイトメトリーによる評価
この実施例は、例示的な構築物のT細胞またはがん細胞との結合を評価する研究を記載する。これらの研究は、相互に単離されたT細胞のみまたはがん細胞のみのいずれかを含有している単一培養物において実施された。
A．FRα結合
葉酸受容体α（FRα）に対する抗原結合ドメインを含有している本開示の例示的な多重特異性ポリペプチド構築物の、初代T細胞の表面上のCD3およびFRα発現細胞（Ovcar-5）との結合を、フローサイトメトリーによって評価した。試験された構築物の腫瘍抗原結合ドメインは、初代T細胞上に発現されない葉酸受容体α（FRα）に結合する。試験された構築物は、cx1356およびcx681を含み、cx1356においては3アミノ酸の非切断可能リンカーまたはcx681においては18アミノ酸の非切断可能リンカーを含有していた（図2Bおよび表E1.1を参照すること）。
図5Aおよび5Bに記載された研究のため、100nMの各構築物cx1356またはcx681を使用し、Ovcar-5細胞または初代T細胞のいずれかとの結合について評価した。抗CD3抗体が対照として含まれていた。FRα発現細胞（Ovcar-5；図5C）または単離された初代T細胞（FRα陰性；図5D）のいずれかにおける制約CD3係合構築物の滴定を、結合を評価するために実施した。結合した構築物は、フルオロフォアがコンジュゲートされた抗ヒトIgG Fc二次抗体を使用して検出された。
FcとCD3結合ドメインの成分との間に様々なリンカーを含む、試験されたFRαを標的とする構築物は、FRα発現細胞（Ovcar-5）（図5Aおよび5C）に結合することが見出されたが、T細胞に結合する力は欠いていた（図5Bおよび5D）。これらの結果は、単離されたT細胞上のCD3との結合が、提供されたフォーマットにおいて制約されているという所見と一致している。
B．B7H3結合
B7H3に対する抗原結合ドメインを含有している例示的な多重特異性構築物の結合を、B7H3陽性A375腫瘍細胞または初代T細胞との結合について評価した。sdAbまたはFABのいずれかであり、Fcに対してN末端側にのみ、またはFcに対してN末端側および抗CD3結合ドメインに対してC末端側の両方に位置付けられた抗原結合ドメインを含有している構築物を生成した（図3Aおよび3Cおよび表E1.1を参照すること）。試験された構築物の様々なフォーマットには、以下のものが含まれていた：sdAb-Fc-dsFV-sdAb（cx3072、cx5952）、sdAb-Fc-FV（cx6079）、sdAb-Fc-dsFV（cs6080、cx6081）、MAB-FV（cx5067）、およびMAB-dsFV（cx6083、cx6084）（FVはVHドメインおよびVLドメインの対から構成される抗CD3結合ドメインを表し、「ds」は改変されたドメイン間ジスルフィド結合を介して安定化されたジスルフィドを示す）。
図6A〜Fは、これらの構築物が、B7H3に結合することができるが、単離されたT細胞には結合することができないことを証明する。結合は、フルオロフォアがコンジュゲートされた抗ヒトFc二次抗体を使用したフローサイトメトリーを介して、前記のように評価された。cx3072は、高い親和性でA375細胞に結合したが（図6A）、単離されたT細胞には結合しなかった（図6B）。試験されたsdAb-Fc-dsFV-sdAb（cx5952）は、FAB含有MAB-FV構築物（cx5067）およびMAB-dsFV構築物（cx6083、cx6084）と比較して、より高い結合親和性を示した（図6C）。B7H3を標的とするsdAbを含有している構築物（cx5952、cx6079、cx6080、およびcx6081）は、類似した親和性でB7H3陽性細胞に結合し（図6Eに図示される）、cx5952がより高い最大結合を示した。cx6079、cx6080、およびcx6081は、2個の同一のB7H3を標的とするsdAbを含有しており、cx5952およびcx3072は、異なるエピトープに結合する2種の異なるB7H3を標的とするsdAbを含有している。MAB-FV、cx5067は、2個の同一のB7H3を標的とするFABドメインを含有している。注目すべきことに、図6B、6D、および6Fに図示されるように、例示的なB7H3を標的とする制約CD3係合構築物は、いずれも、単離された初代ヒトT細胞に結合しなかった。これらの結果は、単離されたT細胞上のCD3との結合が、提供されたフォーマットにおいて制約されていることをさらに支持する。
実施例3：抗原発現標的細胞との共培養におけるCD3シグナリング活性および活性に対するリンカー長の影響の評価
FcとCD3結合領域を構成する成分ドメイン（VHおよびVL）との間のリンカーの様々な長さのT細胞活性化力に対する効果を、Jurkatレポーターアッセイを使用して試験した。天然にCD3を発現し、NFATによって駆動される緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するよう改変されたJurkat細胞から、CD3レポーター細胞を開発した。CD3の作動は、NFATシグナリングおよび緑色蛍光の生成をもたらす。
抗原を標的とする制約CD3係合構築物を、標的細胞およびJurkat CD3レポーター細胞の共培養物において滴定した。このアッセイにおいて、標的細胞は、IGROV1（FRα陽性）またはNCI-460（FRα陰性）のいずれかを含んでいた。接着性抗原発現標的細胞を利用したレポーターアッセイのため、標的細胞を播種し、均一な分布のために室温で静置し、接着を可能にするために37℃で数時間インキュベートした後、レポーター細胞および抗原を標的とする制約CD3係合構築物を添加した。アッセイプレートを、IncuCyte ZOOM系を使用して連続的に画像化し、ウェル内の積分された全緑色オブジェクトとしてGFP発現を測定することによって、CD3レポーター細胞活性化を決定した。
表E3にリストされる変動する長さのGlySerに基づくリンカーを含有している、実施例1に記載されたように生成された、FRαを標的とする制約CD3係合構築物を、これらのアッセイにおいて使用した。
（表Ｅ３）試験されたリンカー長
Figure 2021520812
図7A〜7Fに示されるように、蛍光強度によって決定されるT細胞活性化活性は、FRα抗原発現標的細胞との共培養に依存していた。リンカーの長さとT細胞活性化力とは、正に相関していた。T細胞活性化力は、リンカー長に直接関係していることが示され、より短いリンカーは、より大きい程度にCD3結合を制限することが示された（図7A、7C、および7Eを参照すること）。重要なことに、前記実施例2において示されたように、これらの構築物は、単離された（例えば、標的TAAと結合していない時の溶液形態の）T細胞に結合する力を示さなかったため、構築物のT細胞係合は、TAA結合に依存している。さらに、FRα陰性細胞との共培養においては、観察可能な蛍光が測定されなかった（図7B、7D、および7E）。総合すると、これらの構築物は、CD3との制限されたまたは実質的に低下した結合を示すが、標的依存的にT細胞を活性化することができた。
実施例4：B7H3を標的とする制約CD3結合構築物のT細胞活性化活性の評価
腫瘍関連抗原結合ドメインとしてB7H3を標的とするsdAbまたはFabのいずれかを含有している構築物を、T細胞レポーターアッセイおよびT細胞の細胞傷害アッセイにおいて、T細胞活性化活性について評価した。抗原結合ドメインとして、抗B7H3 sdAbを用いてフォーマットされたB7H3を標的とする制約CD3係合構築物（例えば、cx5823、cx6079、cx6080、cs6081、cx3072、およびcx5952）、またはFabを用いてフォーマットされた抗B7H3 MAB構築物（例えば、cx5067、cx6083、もしくはcx6084）の活性を評価した（図3A〜3Cおよび表E1.1を参照すること）。cx5067およびcx6079を除き、全ての試験された構築物が、抗CD3のVL G100Cと対にされたVH G44Cの修飾によって作製された鎖間ジスルフィド結合を含有している、ジスルフィドによって安定化された抗CD3 Fv（dsFv）を含有していた。MAB-Fvと名付けられたcx5067の抗CD3 Fvは、ジスルフィドによって安定化されていなかった。
A．T細胞レポーター活性
B7H3陽性細胞（A375）またはB7H3発現を天然に欠く非標的CCRF-CEM細胞の存在下で共培養された時の、B7H3を標的とする制約CD3係合構築物のCD3作動特性を比較するため、実施例3に記載されたNFAT-GFP CD3 Jurkatレポーターを使用した。このアッセイにおいては、抗B7H3 sdAb構築物cx5823、cx6079、cx6080、およびcx6081、または抗B7H3 Fab構築物cx5067、cx6083、およびcx6084を、B7H3ターゲティングドメインとして使用した。図8Aに示されるように、B7H3を標的とするsdAbを含有している構築物は、抗原依存的CD3活性化の類似した効力を示した。図8Cに示されるように、B7H3を標的とするsdAbを含有している例示的なcx5823構築物は、B7H3を標的とするFabを含有している構築物と比較して、抗原依存的CD3活性化の媒介において優れていることが見出された。cx5823は、共刺激受容体のための結合ドメインを用いてフォーマットされているが、Jurkat T細胞が共刺激受容体を発現しないため、この成分が結果の違いに寄与した可能性は低い。いずれの構築物も、B7H3陰性CCRF-CEM細胞に対しては活性を示さなかった（図8Bおよび8D）。
B．細胞傷害
分子の活性をさらに評価するため、例示的なB7H3を標的とする構築物cx3072およびcx5952（各々sdAb-dsFvとしてフォーマットされた）、cx6083およびcx6084（MAB-dsFv）、cx5067（MAB-Fv）、cx6079（sdAb-Fv）、ならびにcx6080およびcx6081（sdAb-dsFv）を、T細胞媒介細胞傷害アッセイにおいて試験した。標的細胞には、B7H3陽性細胞株A375、およびB7H3遺伝子がCRISPRによって破壊された修飾型A375細胞（A375:B7H3 KD）、または天然にB7H3発現を欠くCCRF-CEM細胞のいずれかが含まれていた。標的細胞を、1ウェル当たり1.0×104細胞で播種し、均一な分布のために室温で静置し、37℃で数時間インキュベートした。初代T細胞を、健常ヒトドナーleukopaksから単離されたPBMCからネガティブ濃縮し、10:1のT細胞-標的細胞比で添加した。アポトーシスを受けている細胞の核DNAを蛍光標識するグリーンカスパーゼ3/7試薬を添加した。制約されたCD3係合活性を有する多重特異性構築物を共培養物において滴定し、アッセイプレートをIncuCyte ZOOM系を使用して連続的に画像化した。標的細胞死を、全赤色/緑色オーバーラップオブジェクトエリアを測定することによって決定した。
図9Aおよび9Bに示されるように、sdAb B7H3を標的とする抗原結合ドメインを含有している例示的な構築物cx3072およびcx5952は、B7H3陽性細胞（A375）の強力なT細胞媒介細胞傷害を誘導したが、B7H3陰性細胞株では誘導しなかった。
B7H3ターゲティングFabドメインを含む、B7H3を標的とする例示的な制約CD3係合因子（cx5067、cx6083、およびcx6084）と比較した時、B7H3を標的とする例示的なsdAb制約CD3係合因子cx5952は、増強された標的依存的T細胞の細胞傷害を媒介した（図10A）。試験された構築物のいずれについても、B7H3陰性細胞株CCRF-CEMに対する測定可能なT細胞の細胞傷害は観察されず、これは、抗原依存的T細胞活性化を強力に誘導する力と一致していた（図10B）。試験された構築物のうち、代表的なMAB-dsFV構築物cx6084およびcx6083は、改変されたジスルフィドを含有しており、代表的なMAB-FV構築物cx5067は、この安定化修飾を欠いていた。注目すべきことに、cx6083およびcx5067は、（図3Cに図示された）抗CD3 FVドメイン内の改変されたジスルフィドの存在（cx6083）または欠如（cx5067）を除き、同一である。改変されたジスルフィドは、VH内のG44CおよびVL内のG100Cの修飾によって作製された。図10Aに示されるように、cx6083は、cx5067と比較して、標的依存的T細胞の細胞傷害の媒介において優れた効力を示し、このことから、ドメイン間ジスルフィドの組み入れが、T細胞媒介細胞傷害において有益であること、それが、抗CD3 FVを構成するVHドメインおよびVLドメインの適切な会合の増強による可能性が高いことが示唆された。
sdAb B7H3ターゲティングドメインを含む、B7H3を標的とする他の例示的な制約CD3係合因子（cx6079、cx6080、およびcx6081）と比較した時、B7H3を標的とする例示的なsdAb制約CD3係合因子cx5952は、増強された標的依存的T細胞の細胞傷害を媒介した（図10C）。試験された構築物のいずれについても、B7H3陰性細胞株CCRF-CEMに対しては、測定可能なT細胞の細胞傷害が観察されず、これは、抗原依存的T細胞活性化を強力に誘導する力と一致していた（図10D）。試験された構築物のうち、sdAb-dsFV構築物cx5952、cx6080、およびcx6081は、改変されたジスルフィド連結を含有しており、sdAb-FV構築物cx6079は、この安定化修飾を欠いていた。改変されたジスルフィドは、VH内のG44CおよびVL内のG100Cの修飾によって作製された。注目すべきことに、cx5952は、2種の異なるB7H3ターゲティングドメインを有するよう改変され、その一方はアミノ末端に位置し、他方はカルボキシ末端に位置していた。cx6079、cx6080、およびcx6081は、2個の同一のB7H3ターゲティングドメインを有するよう改変され、それらは両方ともアミノ末端に位置していた（図3Aを参照すること）。
C．T細胞モジュレーション
T細胞モジュレーションをさらに評価するため、例示的な多重特異性CD3制約結合構築物を、構築物のT細胞活性化マーカーをモジュレートする能力をモニタリングすることによって評価した。T細胞活性化を評価するため、例示的なB7H3を標的とする制約CD3係合構築物cx5952の存在下での、T細胞のB7H3陽性細胞株（A375）またはB7H3陰性細胞株（CCRF-CEM）との培養を含む、前記のT細胞傷害アッセイからの懸濁細胞を収集した。生死判定染料、ならびにフルオロフォアがコンジュゲートされた抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD25、抗CD69抗体、および/または抗CD71抗体によって、細胞を染色した。細胞をSONY SA3800スペクトル型アナライザーを使用して分析し、CD25、CD69、もしくはCD71の発現レベル、またはCD25、CD69、もしくはCD71の陽性率を測定することによって、CD4+T細胞またはCD8+T細胞の活性化を決定した。
cx5952の存在下でのB7H3陽性細胞株（A375）またはB7H3陰性細胞株（CCRF-CEM）との共培養後のCD4+T細胞およびCD8+T細胞におけるCD25発現（図11A）、CD69発現（図11B）、およびCD71発現（図11C）についての結果が示される。結果は、CD4+T細胞およびCD8+T細胞におけるCD25、CD69、およびCD71の増加した発現によって証拠付けられるように、cx5952が、CD3結合を介して用量依存的なB7H3依存的T細胞活性化を媒介することを示した。
B7H3ターゲティングsdAbドメインを含む、B7H3を標的とする他の例示的な制約CD3係合因子（cx6079、cx6080、およびcx6081）と比較した時、B7H3を標的とする例示的なsdAb制約CD3係合因子cx5952は、CD4+T細胞（図11D）およびCD8+T細胞（図11H）におけるCD25の増加した発現、ならびにCD4+T細胞（図11F）およびCD8+T細胞（図11J）におけるCD71の増加した発現によって証拠付けられるように、増加したT細胞活性化を媒介した。T細胞上の表面マーカーの増加した発現は、B7H3陰性細胞株との培養においては、B7H3を標的とする制約CD3係合因子構築物の存在下で観察されなかった（CD4+T細胞については、図11Eおよび11G、CD8+T細胞については、図11Iおよび11K）。
D．T細胞サイトカイン産生
cx5952、cx6083、cx6084、またはcx5067の存在下での、T細胞のB7H3陽性A375細胞または陰性CCRF-CEM細胞との共培養を含むT細胞細胞傷害腫瘍細胞共培養アッセイからの上清を、サンドイッチELISAによってIFNγ含量について分析した。標準曲線を生成し、そこから、上清試料のサイトカイン濃度値を内挿した。検出下限値未満の吸光度値を有する試料には、最低標準濃度のものの半分に等しいサイトカイン濃度を割り当てた。図12Aに示されるように、代表的なsdAb-Fc-dsFV-sdAb構築物cx5952は、試験されたB7H3を標的とするFAB含有構築物cx6083、cx6084、およびcx5067より、活性化されたT細胞からの標的依存的サイトカイン放出の誘発において優れていた。重要なことに、MAB-dsFV構築物cx6083およびcx6084は、MAB-FV構築物cx5067より優れており、このことから、T細胞機能を増強するためのドメイン間ジスルフィド安定化修飾の重要性が証明された。
B7H3ターゲティングsdAbドメインを含む、B7H3を標的とする他の例示的な制約CD3係合因子（cx6079、cx6080、およびcx6081）と比較した時、B7H3を標的とする例示的なsdAb制約CD3係合因子cx5952は、B7H3標的細胞T細胞の存在下で、IFNγの実質的に増加した産生を媒介したが、B7H3陰性細胞株との培養においては、そうでなかった（図12B）。
E．概要
これらの観察は、本明細書中に提供される抗原を標的とする制約CD3フォーマットが、強力なB7H3依存的T細胞の細胞傷害を誘導する力を維持しながら、単離されたT細胞との結合を欠くかまたは低下した結合を示すことをさらに支持する。理論によって拘束されることは望まないが、総合すると、これらの結果は、Fabの代わりに抗原を標的とするsdAbを利用することによって、TAA発現腫瘍細胞とCD3発現T細胞との間の免疫シナプス距離が低下し、T細胞の活性および細胞傷害が増強され得ることを示す。注目すべきことに、抗CD3のVL G100Cと対にされたVH G44Cの修飾によって作製された鎖間ジスルフィド結合を含めることによって、制約CD3係合構築物の活性が大きく増強されることが見出された。さらに、他のsdAb B7H3ターゲティングドメイン構築物と比較して、より強力なcx5952によるB7H3依存的T細胞活性は、B7H3を標的とするsdAbの抗CD3結合ドメインに対してC末端側における位置付け、または試験された他の構築物は2価で単一のエピトープに結合するが、cx5952はB7H3上の2種の異なるエピトープに結合するという事実が、この増強された活性に寄与したことを示唆する。
実施例5：単一または複数のB7H3結合ターゲティングドメインを含有しているCD3制約多重特異性構築物の評価
（N末端またはC末端のいずれかに位置付けられた）1価sdAb抗原結合ドメインを含有している構築物の活性を、N末端およびC末端の両方に位置付けられた、抗原を標的とするsdAbを含有している二重結合（2価）構築物の活性と比較した。実質的に実施例2に記載されるように、結合を評価し、実質的に実施例3および4に記載されるように、JurkatレポーターアッセイおよびT細胞の細胞傷害アッセイにおいて、T細胞活性を評価した。
A．結合
図13Aに示されるように、B7H3を標的とする2価制約CD3係合構築物cx5187およびcx5823は、1価バージョンcx5873およびcx5965と比較して、B7H3陽性A375細胞とのより高い結合親和性を示した。これらの構築物は、いずれも、B7H3陰性CCRF-CEM細胞または単離されたT細胞との検出可能な結合を示さなかった（図13B）。
B．T細胞レポーター活性
1価または2価で抗原に係合する抗原を標的とする制約CD3係合構築物のB7H3抗原依存的なCD3作動力を、実質的に前記のようなアッセイにおいて、CD3-NFAT Jurkatレポーター細胞を使用して評価した。図13Cに示されるように、例示的な1価構築物cs5873およびcx5965についてのレポーター活性と比較して、実質的に増加した蛍光レポーター活性が、B7H3を標的とする例示的な2価の構築物cx5187の存在下で観察された。構築物が、B7H3陰性CCRF標的細胞と共培養されたJurkatレポーター細胞と共にインキュベートされた時には、レポーター活性は観察されなかった（図13D）。
C．細胞傷害活性
B7H3を標的とするCD3制約結合構築物の細胞傷害を、それぞれ、B7H3陽性細胞株およびB7H3陰性細胞株として使用された、メラノーマ細胞株A375およびT細胞急性リンパ芽球性白血病細胞株CCRF-CEMに対して評価した。実質的に実施例4に記載されるように、細胞傷害を評価した。図14Aに示されるように、B7H3を標的とする例示的な2価の制約CD3係合構築物cx5187は、1価バージョンの構築物cx5873およびcx5965と比較して、増強された標的依存的T細胞媒介細胞傷害を示した。これらのアッセイにおいて、CCRF-CEM細胞が標的細胞として使用された図14Bに示されるように、標的細胞のB7H3発現の非存在下では細胞傷害が観察されなかった。
D．T細胞モジュレーション
cx5187、cx5873、またはcx5965の存在下での、T細胞のB7H3陽性細胞株（A375）またはB7H3陰性細胞株（CCRF-CEM）との培養を含む、前記のT細胞の細胞傷害アッセイからの懸濁細胞において、実質的に実施例4に記載されるように、CD25の発現をモニタリングすることによって、T細胞モジュレーションを評価した。図15Aおよび15Bに示されるように、B7H3を標的とする例示的な2価の制約CD3係合構築物cx5187は、CD4 T細胞およびCD8 T細胞におけるCD25アップレギュレーションの増強された効力によって証拠付けられるように、1価バージョンの構築物cx5873およびcx5965と比較して、増強された標的依存的T細胞媒介活性化を示した。これらのアッセイにおいて、CCRF-CEM細胞が標的細胞として使用された図15Cおよび15Dに示されるように、標的細胞のB7H3発現の非存在下では、T細胞活性化が観察されなかった。これらの結果は、B7H3を標的とする制約CD3係合構築物が、CD4 T細胞およびCD8 T細胞の両方の強力な抗原依存的活性化を誘導することを証明した。
D．概要
総合すると、これらの結果は、抗原を標的とする2価の制約CD3係合構築物が、抗原を標的とする1価の制約CD3係合構築物より優れた抗原依存的なCD3結合および活性を示すことを証明する。これらの結果は、N末端およびC末端の両方に位置付けられた二重の抗原結合ドメインを含有している構築物が、単一の1価抗原結合ドメインのみを含有している1価構築物より優れた結合およびT細胞活性を有するという所見と一致している。さらに、理論によって拘束されることは望まないが、sdAbがFcに対してN末端側にのみ位置付けられている構築物は、免疫シナプス距離を増加させ得るため、それと比較して、CD3結合ドメインに対してC末端側にsdAbのうちの1個を位置付けることは、より最適な免疫シナプスを形成し得る。
実施例6：B7H3を標的とするsdAbドメインおよびFabドメインを含有しているCD3制約多重特異性構築物の評価
腫瘍関連抗原結合ドメインとしてB7H3を標的とするsdAbまたはFabのいずれかを含有している構築物を、T細胞活性化活性について評価した。抗原結合ドメインとして、抗B7H3 sdAbを用いてフォーマットされたB7H3を標的とする制約CD3係合構築物（例えば、cx5952およびcx6079）、またはFabを用いてフォーマットされた抗B7H3 MAB構築物（例えば、cx5067、cx6083、もしくはcx6084）の活性を評価した（図3Aおよび3Cならびに表E1.1およびE1.2を参照すること）。cx6079およびcx5067を除き、全ての試験された構築物が、抗CD3のVL G100Cと対にされたVH G44Cの修飾によって作製された鎖間ジスルフィド結合を含有している、ジスルフィドによって安定化された抗CD3 Fv（dsFv）を含有していた。MAB-Fvと名付けられたcx5067の抗CD3 FvおよびsdAb-Fc-Fvと名付けられたcx6079の抗CD3 Fvは、ジスルフィドによって安定化されていなかった。さらに、cx5952は、2種の異なるB7H3を標的とするsdAbドメインを含有するよう改変されており、1個はFcドメインに対してN末端側に位置し、1個はCD3結合ドメインに対してC末端側に位置していた。対照的に、cx6079は、両方ともFcドメインに対してN末端側に位置する、2個の同一のB7H3を標的とするsdAbドメインを含有するよう改変されていた。3種の全てのFab構築物のFvが、Fcドメインに対してN末端側にあるよう改変されていた。
A．細胞傷害
実質的に実施例4に記載されるように、B7H3を標的とするCD3制約結合構築物の細胞傷害を評価した。それぞれ、B7H3陽性細胞株およびB7H3陰性細胞株として使用されたメラノーマ細胞株A375およびT細胞急性リンパ芽球性白血病細胞株CCRF-CEMに対して、細胞傷害を評価した。図16Aに示されるように、B7H3を標的とするsdAbを用いてフォーマットされた例示的な制約CD3係合構築物cx5952およびcx6079は、Fabを用いてフォーマットされた抗B7H3 MAB構築物cx5067、cx6083、およびcx6084と比較して、抗原依存的T細胞の細胞傷害の誘発において優れていた。注目すべきことに、cx5952はcx6079より強力であり、このことから、B7H3を標的とするsdAbの抗CD3結合ドメインのC末端側における位置付け、および/または改変されたジスルフィドを介した抗CD3 FVの安定化が、この増強された活性に寄与することが示唆された。これらのアッセイにおいて、図16Bに示されるように、B7H3陰性CRF-CEM細胞標的細胞の存在下では、細胞傷害が観察されなかった。
B．T細胞モジュレーション
T細胞モジュレーションをさらに評価するため、実質的に実施例4に記載されるように、例示的な多重特異性CD3制約結合構築物を、構築物のT細胞活性化マーカーをモジュレートする能力をモニタリングすることによって評価した。T細胞活性化を評価するため、例示的なB7H3を標的とする制約CD3係合構築物の存在下での、T細胞のB7H3陽性細胞株（A375）またはB7H3陰性細胞株（CCRF-CEM）との培養を含む前記のT細胞の細胞傷害アッセイからの懸濁細胞を収集した。試験された構築物には、sdAbを用いてフォーマットされた抗B7H3構築物（例えば、cx5952およびcx6079）、ならびにFabを用いてフォーマットされた抗B7H3構築物（例えば、cx5067、cx6083、およびcx6084）が含まれていた。
生死判定染料、ならびにフルオロフォアがコンジュゲートされた抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD25抗体、および/または抗CD71抗体によって、細胞を染色した。細胞を、SONY SA3800スペクトル型アナライザーを使用して分析し、CD25もしくはCD71の発現レベルまたはCD25もしくはCD71の陽性率を測定することによって、CD4+T細胞またはCD8+T細胞の活性化を決定した。
記載された構築物の存在下でB7H3陽性細胞株（A375）またはB7H3陰性細胞株（CCRF-CEM）と共培養した後のCD4+T細胞およびCD8+T細胞におけるCD25発現（図16C〜F）およびCD71発現（図16G〜J）について、結果が示される。結果は、CD4+T細胞およびCD8+T細胞におけるCD25およびCD71の増加した発現によって証拠付けられるように、cx5952が、CD3結合を介して用量依存的なB7H3依存的T細胞活性化を媒介することを示した。cx5952は、他のB7H3を標的とする制約CD3係合構築物と比べて、T依存的T細胞活性化の誘導において最も強力であった。
C．T細胞サイトカイン産生
cx5952、cx6079、cx6083、cx6084、またはcx5067の存在下でのT細胞のB7H3陽性A375細胞またはB7H3陰性CCRF-CEM細胞との共培養を含むT細胞細胞傷害腫瘍細胞共培養アッセイからの上清を、サンドイッチELISAによってIFNγ含量について分析した。標準曲線を生成し、そこから、上清試料のサイトカイン濃度値を内挿した。検出下限値未満の吸光度値を有する試料には、最低標準濃度のものの半分に等しいサイトカイン濃度を割り当てた。図16Kに示されるように、代表的なsdAb-Fc-dsFV-sdAb構築物cx5952は、活性化されたT細胞からの標的依存的サイトカイン放出の誘発において、試験されたB7H3を標的とするFAB含有構築物cx6083、cx6084、およびcx5067より優れていた。これは、抗原依存的細胞傷害アッセイおよび活性化アッセイからの所見と一致している。重要なことに、MAB-dsFV構築物cx6083およびcx6084は、MAB-FV構築物cx5067より優れており、このことから、T細胞機能を増強するためのドメイン間ジスルフィド安定化修飾の重要性が証明された。
D．概要
総合すると、これらの結果は、抗B7H3 sdAb結合ドメインを用いてフォーマットされた制約抗CD3構築物が、Fab B7H3結合ドメインによってフォーマットされた抗B7H3 MAB構築物と比較して、抗原依存的T細胞の細胞傷害の誘発において優れていたことを証明する。さらに、cx5952はcx6079より強力であり、このことから、B7H3を標的とするsdAbのCD3結合ドメインに対してC末端側における位置付け、改変されたジスルフィドを介した抗CD3 FVの安定化、または両方が、増強された活性に寄与することが示唆された。理論によって拘束されることは望まないが、sdAbがFcに対してN末端側にのみ位置付けられている構築物は、免疫シナプス距離を増加させ得るため、それと比較して、sdAbのうちの1個をCD3結合ドメインに対してC末端側に位置付けることは、より最適な免疫シナプスを形成し得る。
実施例7:単一または複数の抗原結合DLL3ターゲティングドメインを含有しているCD3制約多重特異性構築物の評価
この実施例は、例示的な生成されたDLL3を標的とする制約CD3係合構築物の、インビトロアッセイにおけるヒト初代T細胞における評価および特徴決定を記載する。
抗原結合ドメインとして、抗DLL3 sdAbを用いてフォーマットされたDLL3を標的とする制約CD3係合構築物（例えば、cx5352、cx5800、cx5801、およびcx5499）の結合および活性を評価した（図4A〜4Bおよび表E1.1を参照すること）。全ての試験された構築物が、抗CD3のVL G100Cと対にされたVH G44Cの修飾によって作製された鎖間ジスルフィド結合を含有している、ジスルフィドによって安定化された抗CD3 Fv（dsFv）を含有していた。さらに、DLL-3を標的とする構築物は、共刺激受容体sdAbドメインを含有していなかったcx5499を除き、CD3 dsFvに対してC末端側に共刺激受容体sdAbを含有するよう改変されていた。
A．結合
実質的に実施例2に記載されたように、結合を評価した。図17Aに示されるように、DLL3を標的とする2価制約CD3係合構築物cx5352は、1価バージョンcx5800およびcx5801と比較して、DLL3陽性SHP-77細胞とのより高い結合親和性を示した。図17Bに図示されるように、試験された構築物は、いずれも、DLL3陰性初代T細胞との結合を示さなかった。これらの結合アッセイは、フルオロフォアがコンジュゲートされた抗ヒトIgG Fc二次抗体を使用して、結合した構築物が検出される、フローサイトメトリーによって実施された。
A．T細胞レポーター活性
NFATによって駆動されるルシフェラーゼを発現するJurkat細胞が使用され、ルシフェラーゼ活性がモニタリングされたことを除き、実質的に実施例2に記載されるように、T細胞活性をレポーターアッセイにおいて評価した。NFATによって駆動されるルシフェラーゼCD3 Jurkatレポーター細胞を、DLL3抗原に対する抗原結合ドメインを含有している1価および2価の構築物の存在下で、SHP-77（DLL3陽性）標的細胞と共培養した（図4Aを参照すること）。具体的には、図17Cに示されるように、例示的な2価構築物cx5352は、例示的な1価構築物cx5800およびcx5801と比較して、実質的に大きいルシフェラーゼ活性を、このアッセイにおいて誘導した。これらの結果は、B7H3を標的とする構築物によって観察された結果と一致しており、従って、構築物の活性が特定の標的抗原に特異的ではないことを示している。
C．細胞傷害
アミノ末端およびカルボキシ末端に位置する2種の異なるsdAb結合ドメインを用いてフォーマットされたDLL3を標的とするCD3制約結合構築物cx5499の細胞傷害を、実質的に実施例4に記載されたようなアッセイを使用して、DLL3発現細胞株SHP-77に対して評価した。図18Aに示されるように、cx5499は、SHP-77細胞株に対する強力なT細胞媒介細胞傷害を誘導した。
D．T細胞モジュレーション
T細胞モジュレーションをさらに評価するため、例示的な多重特異性CD3制約結合構築物を、構築物のT細胞活性化マーカーをモジュレートする能力をモニタリングすることによって評価した。T細胞活性化を評価するため、DLL3を標的とする例示的な制約CD3係合構築物の存在下での、cx5499の存在下での、T細胞のDLL3陽性SHP-77細胞との培養を含む、前記のT細胞の細胞傷害アッセイからの懸濁細胞を収集した。生死判定染料、ならびにフルオロフォアがコンジュゲートされた抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD25抗体、および/または抗CD69抗体によって、細胞を染色した。細胞を、SONY SA3800スペクトル型アナライザーを使用して分析し、CD25もしくはCD69の発現レベルまたはCD25もしくはCD69の陽性率を測定することによって、CD4+T細胞またはCD8+T細胞の活性化を決定した。
図18Bおよび図18Dは、DLL3を標的とする例示的な制約CD3係合構築物cx5499の存在下で、T細胞をDLL3陽性SHP-77細胞と共に培養した時の、CD4 T細胞またはCD8 T細胞におけるCD25発現についての結果を、それぞれ図示する。図18Cおよび図18Eは、DLL3を標的とする例示的な制約CD3係合構築物cx5499の存在下で、T細胞をDLL3陽性SHP-77細胞と共に培養した時の、CD4細胞またはCD8 T細胞におけるCD69発現についての結果を、それぞれ図示する。結果は、CD4+T細胞およびCD8+T細胞におけるCD25およびCD69の増加した発現によって証拠付けられるように、cx5499がCD3結合を介して用量依存的なDLL3依存的T細胞活性化を媒介することを示した。
E．概要
総合すると、これらの結果は、抗DLL3 sdAb結合ドメインを用いてフォーマットされた制約抗CD3構築物が、DLL3発現細胞株SHP-77に結合し、抗原依存的なT細胞の細胞傷害および活性化を誘発することができることを証明している。この結果は、本開示の制約CD3係合構築物が、多数の腫瘍抗原を特異的に標的とし、標的発現細胞に対するT細胞の細胞傷害および活性化を誘発するための広い適用可能性を有するという所見と一致している。
本発明をその詳細な説明と共に記載したが、上記の説明は、本開示を例示するためのものであって、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本開示の範囲を限定するためのものではない。他の局面、利点、および修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
配列の表
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Claims (128)

  1. 免疫グロブリンFc領域を含む第1の成分とCD3結合領域を含む第2の成分とを含む、多重特異性ポリペプチド構築物であって、
    CD3結合領域が、抗CD3抗体、または可変重鎖領域（VH）および可変軽鎖領域（VL）を含むFv抗体断片である抗原結合断片であり；
    Fcが、第1のFcポリペプチドおよび第2のFcポリペプチドを含むヘテロ二量体Fcであり、抗CD3抗体または抗原結合断片のVHおよびVLが、ヘテロ二量体Fcの対向するポリペプチドに連結されており；
    第1および第2の成分が非切断可能リンカーによってカップリングされており、Fc領域がCD3結合領域に対してN末端側に位置付けられており；かつ
    第1の成分が第1の抗原結合ドメインを含み、第2の成分が第2の抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインの各々が腫瘍関連抗原（TAA）に結合する、
    多重特異性ポリペプチド構築物。
  2. CD3結合領域がCD3（CD3ε）に結合する、請求項1記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  3. 第1の抗原結合ドメインが、多重特異性構築物のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、第2の抗原結合ドメインが、多重特異性構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、請求項1または請求項2記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  4. N末端からC末端へ順に、
    腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第1の抗原結合ドメイン；
    免疫グロブリンFc領域；
    非切断可能リンカー；
    CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および
    腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第2の抗原結合ドメイン
    を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  5. 免疫グロブリンFc領域を含む第1の成分とCD3結合領域を含む第2の成分とを含む、多重特異性ポリペプチド構築物であって、
    CD3結合領域が、抗CD3抗体、または可変重鎖（VH）および可変軽鎖（VL）を含むジスルフィドによって安定化されたFv抗体断片（dsFv）である抗原結合断片であり；
    Fcが、第1のFcポリペプチドおよび第2のFcポリペプチドを含むヘテロ二量体Fcであり、抗CD3抗体または抗原結合断片のVHおよびVLが、ヘテロ二量体Fcの対向するポリペプチドに連結されており；
    第1および第2の成分が非切断可能リンカーによってカップリングされており、Fc領域がCD3結合領域のN末端側に位置付けられており；かつ
    第1および第2の成分の一方または両方が、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む、
    多重特異性ポリペプチド構築物。
  6. 免疫グロブリンFc領域を含む第1の成分とCD3結合領域を含む第2の成分とを含む、多重特異性ポリペプチド構築物であって、
    CD3結合領域が、抗CD3抗体、または可変重鎖（VH）および可変軽鎖（VL）を含むFv抗体断片である抗原結合断片であり；
    Fcが、第1のFcポリペプチドおよび第2のFcポリペプチドを含むヘテロ二量体Fcであり、抗CD3抗体または抗原結合断片のVHおよびVLが、ヘテロ二量体Fcの対向するポリペプチドに連結されており；
    第1および第2の成分が非切断可能リンカーによってカップリングされており、Fc領域がCD3結合領域のN末端側に位置付けられており；かつ
    第1および第2の成分の一方または両方が、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインが単鎖抗体断片である、
    多重特異性ポリペプチド構築物。
  7. 単鎖抗体断片が、シングルドメイン抗体であるか、または単鎖可変断片（scFv）である、請求項6記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  8. CD3結合領域がCD3（CD3ε）に結合する、請求項5〜7のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  9. N末端からC末端へ順に、
    腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第1の抗原結合ドメイン；
    免疫グロブリンFc領域；
    非切断可能リンカー；
    CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および
    腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第2の抗原結合ドメイン
    を含む、請求項5〜8のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  10. N末端からC末端へ順に、
    免疫グロブリンFc領域；
    非切断可能リンカー；
    CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および
    腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメイン
    を含む、請求項5〜8のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  11. N末端からC末端へ順に、
    腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメイン；
    免疫グロブリンFc領域；
    非切断可能リンカー；および
    CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域
    を含む、請求項5〜8のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  12. ヘテロ二量体Fc領域の第1および第2のFcポリペプチドの一方または両方が、ヒトIgG1、ヒトIgG2、またはヒトIgG4のFc領域と比較して、ヘテロ二量体化を誘導するための少なくとも1個の修飾を含むバリアントFcポリペプチドである、請求項1〜11のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  13. ヘテロ二量体Fc領域の第1および第2のFcポリペプチドの一方または両方が、ヒトIgG1のFc領域と比較して、任意で、SEQ ID NO:1に示されるFcポリペプチドまたはその免疫活性断片と比較して、ヘテロ二量体化を誘導するための少なくとも1個の修飾を含むバリアントFcポリペプチドである、請求項1〜12のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  14. ヘテロ二量体FcのFcポリペプチドの各々が独立に少なくとも1個のアミノ酸修飾を含む、請求項12または請求項13記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  15. 少なくとも1個の修飾が、立体的修飾、ノブイントゥホール（knob-into-hole）修飾、ポリペプチドの静電的相補性を増加させるための電荷変異、等電点を変更するための修飾（pIバリアント）、またはそれらの組み合わせより選択される、請求項12〜14のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  16. ヘテロ二量体Fcの第1のFcポリペプチドが、Thr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val、およびそれらの組み合わせより選択される修飾を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のFcポリペプチドが修飾T366Wを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  17. 第1および第2のFcポリペプチドが、非システイン残基のシステイン残基への修飾をさらに含み、第1のポリペプチドの修飾が、位置Ser354およびY349の一方にあり、第2のFcポリペプチドの修飾が、位置Ser354およびY349の他方にある、請求項16記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  18. 第1のFcポリペプチドが修飾T366W/S354Cを含み、第2のFcポリペプチドが修飾T366S/L368A/Y407V/Y349Cを含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  19. 第1のFcポリペプチドが修飾L368D/K370Sを含み、第2のFcポリペプチドが修飾S364K/E357Qを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  20. 第1および第2のポリペプチドの少なくとも一方が、修飾Q295E/N384D/Q418E/N421Dを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  21. ヘテロ二量体Fcの第1もしくは第2のFcポリペプチドの一方が、残基Ile253における修飾をさらに含み、任意で、修飾がIle253Argであり；かつ/または
    ヘテロ二量体Fcの第1もしくは第2のFcポリペプチドの一方が、残基His435における修飾をさらに含み、任意で、修飾がHis35Argである、
    請求項1〜20のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  22. 第1および第2のFcポリペプチドの一方または両方が、Lys447を欠くポリペプチドを含む、請求項1〜21のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  23. ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドが、SEQ ID NO:82、86、または201のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドが、SEQ ID NO:83、87、90、92、202、または205のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、請求項1〜22のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  24. 第1のFcポリペプチドおよび第2のFcポリペプチドが、それぞれSEQ ID NO:82および83；それぞれSEQ ID NO:86および87；それぞれSEQ ID NO:201および202；それぞれSEQ ID NO:82および90；それぞれSEQ ID NO:86および92；ならびにそれぞれSEQ ID NO:201および205からなる群より選択される配列を含む、請求項1〜23のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  25. Fc領域が、FcRn結合を増強するための少なくとも1個の修飾を含むポリペプチドを含む、請求項1〜22のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  26. 修飾が、Met252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される位置にある、請求項25記載の多重特異性融合ポリペプチド構築物。
  27. 修飾が、Met252YおよびMet428Lであるか、またはMet252YおよびMet428Vである、請求項25または請求項26記載の多重特異性融合ポリペプチド構築物。
  28. ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドが、SEQ ID NO:94、96、または207のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドが、SEQ ID NO:98、100、または209のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、請求項1〜22および請求項25〜27のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  29. 第1のFcポリペプチドおよび第2のFcポリペプチドが、それぞれSEQ ID NO:94および98；それぞれSEQ ID NO:96および100；ならびにそれぞれSEQ ID NO:207および209からなる群より選択される配列を含む、請求項1〜28のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  30. Fc領域が、
    エフェクター機能を低下させ、かつ/またはFcγ受容体もしくはC1qより選択されるエフェクター分子との結合を低下させる、少なくとも1個のアミノ酸修飾を含む、ポリペプチド
    を含む、請求項1〜22および25〜27のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  31. 1個または複数個のアミノ酸修飾が、Glu233、Leu234、またはLeu235のうちの1個または複数個の欠失である、請求項30記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  32. ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドが、SEQ ID NO:84、88、95、97、203、または208のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドが、SEQ ID NO:85、89、91、93、99、101、204、206、または210のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、請求項1〜22、25〜27、30、および31のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  33. 第1のFcポリペプチドおよび第2のFcポリペプチドが、それぞれSEQ ID NO:84および85；それぞれSEQ ID NO:88および89；それぞれSEQ ID NO:203および204；それぞれSEQ ID NO:95および99；それぞれSEQ ID NO:97および101；それぞれSEQ ID NO:208および210；それぞれSEQ ID NO:84および91；それぞれSEQ ID NO:88および93；ならびにそれぞれSEQ ID NO:203および206からなる群より選択される配列を含む、請求項1〜22、25〜27、および30〜32のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  34. 抗原結合ドメインのうちの少なくとも1個がそのTAAに結合しない限り、CD3結合領域がCD3に結合もしくは係合することができないかまたは実質的にできない、請求項1〜33のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  35. 抗原結合ドメインのうちの少なくとも2個がTAAに結合しない限り、CD3結合領域がCD3に結合もしくは係合することができないかまたは実質的にできない、請求項1〜33のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  36. リンカーがポリペプチドリンカーである、請求項1〜35のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  37. リンカーが、最長25アミノ酸長のポリペプチドである、請求項36記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  38. リンカーが、2〜24アミノ酸、2〜20アミノ酸、2〜18アミノ酸、2〜14アミノ酸、2〜12アミノ酸、2〜10アミノ酸、2〜8アミノ酸、2〜6アミノ酸、6〜24アミノ酸、6〜20アミノ酸、6〜18アミノ酸、6〜14アミノ酸、6〜12アミノ酸、6〜10アミノ酸、6〜8アミノ酸、8〜24アミノ酸、8〜20アミノ酸、8〜18アミノ酸、8〜14アミノ酸、8〜12アミノ酸、8〜10アミノ酸、10〜24アミノ酸、10〜20アミノ酸、10〜18アミノ酸、10〜14アミノ酸、10〜12アミノ酸、12〜24アミノ酸、12〜20アミノ酸、12〜18アミノ酸、12〜14アミノ酸、14〜24アミノ酸、14〜20アミノ酸、14〜18アミノ酸、18〜24アミノ酸、18〜20アミノ酸、もしくは20〜24アミノ酸のポリペプチド、または約2〜24アミノ酸、約2〜20アミノ酸、約2〜18アミノ酸、約2〜14アミノ酸、約2〜12アミノ酸、約2〜10アミノ酸、約2〜8アミノ酸、約2〜6アミノ酸、約6〜24アミノ酸、約6〜20アミノ酸、約6〜18アミノ酸、約6〜14アミノ酸、約6〜12アミノ酸、約6〜10アミノ酸、約6〜8アミノ酸、約8〜24アミノ酸、約8〜20アミノ酸、約8〜18アミノ酸、約8〜14アミノ酸、約8〜12アミノ酸、約8〜10アミノ酸、約10〜24アミノ酸、約10〜20アミノ酸、約10〜18アミノ酸、約10〜14アミノ酸、約10〜12アミノ酸、約12〜24アミノ酸、約12〜20アミノ酸、約12〜18アミノ酸、約12〜14アミノ酸、約14〜24アミノ酸、約14〜20アミノ酸、約14〜18アミノ酸、約18〜24アミノ酸、約18〜20アミノ酸、もしくは約20〜24アミノ酸のポリペプチドである、請求項36または請求項37記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  39. リンカーが、3アミノ酸長、4アミノ酸長、5アミノ酸長、6アミノ酸長、7アミノ酸長、8アミノ酸長、9アミノ酸長、10アミノ酸長、11アミノ酸長、12アミノ酸長、13アミノ酸長、14アミノ酸長、15アミノ酸長、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、または20アミノ酸長であるポリペプチドである、請求項36〜38のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  40. リンカーが、3〜18アミノ酸長であるポリペプチドである、請求項36〜39のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  41. リンカーが、12〜18アミノ酸長であるポリペプチドである、請求項36〜40のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  42. リンカーが、15〜18アミノ酸長であるポリペプチドである、請求項36〜40のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  43. 非切断可能リンカーが
    Figure 2021520812
    およびそれらの組み合わせを含む、請求項1〜42のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  44. 非切断可能リンカーが(GGS)nを含み、nが1〜10である、請求項1〜43のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  45. 非切断可能リンカーが(GGGGS)n（SEQ ID NO:173）を含み、nが1〜10である、請求項1〜44のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  46. 非切断可能リンカーが(GGGGGS)n（SEQ ID NO:172）を含み、nが1〜4である、請求項1〜44のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  47. 非切断可能リンカーが、GGSであるか、またはそれを含む、請求項1〜44のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  48. 非切断可能リンカーが、GGGGS（SEQ ID NO:149）であるか、またはそれを含む、請求項1〜43および45のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  49. 非切断可能リンカーが、GGGGGS（SEQ ID NO:135）であるか、またはそれを含む、請求項1〜43および46のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  50. 非切断可能リンカーが、(GGS)2（SEQ ID NO:10）であるか、またはそれを含む、請求項1〜44のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  51. 非切断可能リンカーが、GGSGGSGGS（SEQ ID NO:11）であるか、またはそれを含む、請求項1〜44のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  52. 非切断可能リンカーが、GGSGGSGGSGGS（SEQ ID NO:12）であるか、またはそれを含む、請求項1〜44のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  53. 非切断可能リンカーが、
    Figure 2021520812
    であるか、またはそれを含む、請求項1〜44のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  54. 非切断可能リンカーが、
    Figure 2021520812
    であるか、またはそれを含む、請求項1〜43および46のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  55. 非切断可能リンカーが、
    Figure 2021520812
    であるか、またはそれを含む、請求項1〜49のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  56. 非切断可能リンカーが、
    Figure 2021520812
    であるか、またはそれを含む、請求項1〜43および45のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  57. （i）ヘテロ二量体Fc領域の第1のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体またはその抗原結合断片のVHドメインを含む、第1のポリペプチド；ならびに
    （ii）ヘテロ二量体Fc領域の第2のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体またはその抗原結合断片のVLドメインを含む、第2のポリペプチド
    を少なくとも含み、
    第1および第2のポリペプチドの一方または両方が、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する少なくとも1個の抗原結合ドメインを含む、
    請求項1〜56のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  58. 抗CD3抗体または抗原結合断片のVHが、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する少なくとも1個の抗原結合ドメインと同一のポリペプチド上にある、請求項1〜57のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  59. 抗CD3抗体または抗原結合断片のVLを含むポリペプチドが、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する少なくとも1個の抗原結合ドメインを含有していない、請求項58記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  60. TAAとの2価、3価、または4価の結合を示す、請求項1〜4、9、および12〜59のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  61. TAAとの1価、2価、3価、または4価の結合を示す、請求項5〜8および10〜59のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  62. 第1および第2のポリペプチドの一方のみが、TAAに結合する少なくとも1個の抗原結合ドメインを含む、請求項1〜61のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  63. 少なくとも1個の抗原結合ドメインが、多重特異性ポリペプチド構築物の第1または第2のポリペプチドの一方のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、かつ/または多重特異性ポリペプチド構築物の第1または第2のポリペプチドの一方のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、請求項1〜62のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  64. 少なくとも1個の抗原結合ドメインが、多重特異性構築物のFc領域に対してアミノ末端に位置付けられており、第2の抗原結合ドメインが、多重特異性構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられている、請求項1〜62のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  65. 抗原結合ドメインが、または抗原結合ドメインの各々が独立に、TAAのネイティブ同族結合パートナーの細胞外ドメインもしくはその結合断片、またはTAAとの結合活性を示すそれらのバリアントを含む、請求項1〜64のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  66. 抗原結合ドメインが、または抗原結合ドメインの各々が独立に、Fab断片、F(ab')2断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片である、請求項1〜5および8〜65のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  67. 抗体またはその抗原結合断片が、Fv、scFv、Fab、またはシングルドメイン抗体（sdAb）である、請求項66記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  68. 抗体またはその抗原結合断片がsdAbである、請求項1〜67のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  69. sdAbが、ヒトsdAbまたはヒト化sdAbである、請求項68記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  70. sdAbが、VHH、VNAR、改変されたVHドメイン、または改変されたVKドメインである、請求項68または請求項69記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  71. 抗体またはその抗原結合断片がscFvである、請求項1〜67のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  72. 抗体またはその抗原結合断片がFabである、請求項1〜5および8〜67のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  73. （i）ヘテロ二量体Fc領域の第1のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVHドメインを含む、第1のポリペプチド；
    （ii）ヘテロ二量体Fc領域の第2のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVLドメインを含む、第2のポリペプチド、ならびに
    （iii）腫瘍関連抗原に結合するFab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLを含む、第3のポリペプチド
    を含み、
    第1および/または第2のポリペプチドが、Fab抗体断片の該VH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方をさらに含む、
    請求項72記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  74. 第1および第2のポリペプチドの一方のみが、Fab抗体断片の前記VH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方を含む、請求項73記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  75. 第1および第2のポリペプチドの両方が、Fab抗体断片の前記VH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方を含む、請求項73記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  76. Fab抗体断片の前記VH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方が、多重特異性ポリペプチド構築物の第1および第2のポリペプチドの一方のFc領域に対してアミノ末端側、および/または多重特異性ポリペプチド構築物の第1および第2のポリペプチドの一方のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、請求項74または請求項75記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  77. Fab抗体断片の前記VH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方が、第1のポリペプチドまたは第2のポリペプチドのFc領域に対してアミノ末端側、および第1または第2のポリペプチドの他方のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、請求項74〜76のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  78. 抗原結合ドメインが、または抗原結合ドメインの各々が独立に、1-92-LFA-3、5T4、α4インテグリン、αVインテグリン、α4β1インテグリン、α4β7インテグリン、AGR2、抗ルイスY、アペリンJ受容体、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補体、C-242、CA9、CA19-9（ルイスa）、炭酸脱水酵素9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132（IL-2RG）、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5（CEA）、CEACAM6（NCA-90）、クローディン3、クローディン4、cMet、コラーゲン、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、エンドセリンB受容体（ETBR）、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSVのFタンパク質、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受容体α（FRα）、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受容体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、ヒアルロニダーゼ、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受容体（FceRI）、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R（wsx1）、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、インスリン受容体、Jaggedリガンド、Jagged1、Jagged2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、ルイスX、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、メソテリン、MRP4、MUC1、ムチン16（MUC16、CA-125）、Na/K ATPアーゼ、NGF、ニカストリン（Nicastrin）、ノッチ受容体、ノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、ノッチ4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、ホスファチジルセリン、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、スフィンゴシン1リン酸、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2、およびWISP-3より選択される腫瘍抗原に結合する、請求項1〜77のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  79. 第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインを少なくとも含み、
    第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが、同一のTAAに結合する、
    請求項1〜78のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  80. 第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが、同一のTAAの異なるエピトープに結合する、請求項79記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  81. 第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが、同一のTAAの同一のエピトープに結合する、請求項79記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  82. 第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインを少なくとも含み、
    第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが異なるTAAに結合する、
    請求項1〜78のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  83. 抗CD3抗体またはその抗原結合断片が、
    アミノ酸配列GFTFNTYAMN（SEQ ID NO:211）を含むVH CDR1；
    アミノ酸配列RIRSKYNNYATY（SEQ ID NO:212）を含むVH CD2；
    アミノ酸配列
    Figure 2021520812
    を含むVH CDR3；
    アミノ酸配列
    Figure 2021520812
    を含むVL CDR1；
    アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）を含むVL CDR2；および
    アミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）を含むVL CDR3
    を含むか；または
    抗CD3抗体または抗原結合断片が、
    アミノ酸配列GFTFNTYAMN（SEQ ID NO:211）を少なくとも含むVH CDR1配列；
    アミノ酸配列RIRSKYNNYATY（SEQ ID NO:212）を少なくとも含むVH CDR2配列；
    アミノ酸配列
    Figure 2021520812
    を少なくとも含むVH CDR3配列；
    アミノ酸配列
    Figure 2021520812
    を少なくとも含むVL CDR1配列；
    アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:230）を少なくとも含むVL CDR2配列；および
    アミノ酸配列ALWYSNHWV（SEQ ID NO:225）を少なくとも含むVL CDR3配列
    を含む、
    請求項1〜82のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  84. 抗CD3 Fvが、
    SEQ ID NO:14、32〜43、45〜47、48、196、および211のいずれかのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:14、32〜43、45〜47、48、196、および211のいずれかと少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を示す配列を有する、VH；ならびに
    SEQ ID NO:15、63、65〜71、73、75、77、および199のいずれかのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:15、63、65〜71、73、75、77、および199のいずれかと少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を示す配列を有する、VL
    を含む、請求項1〜4および6〜83のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  85. 抗CD3 dsFvが、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、請求項1〜4および6〜84のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  86. 抗CD3 Fvが、SEQ ID NO:196のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:199のアミノ酸配列を含む、請求項1〜4および6〜84のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  87. Fv抗体断片が、ジスルフィドによって安定化された抗CD3結合Fv断片（dsFv）を含む、請求項1〜4および6〜83のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  88. ジスルフィドによって安定化された抗CD3結合Fv断片（dsFv）が、Kabatナンバリングによって、変異G44Cを含むVH鎖と、変異G100Cを含むVL鎖とを含む、請求項5または請求項87記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  89. 抗CD3 Fvが、
    SEQ ID NO:44および49〜62、197、および198のいずれかのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:44および49〜62、197、および198のいずれかと少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を示す配列を有する、VH；ならびに
    SEQ ID NO:64、72、74、76、78〜81、191、200、および212のいずれかのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:64、72、74、76、78〜81、191、200、および212のいずれかと少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を示す配列を有する、VL
    を含む、請求項5、87、および88のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  90. 抗CD3 dsFvが、SEQ ID NO:44のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:72のアミノ酸配列を含む、請求項5および87〜89のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  91. 抗CD3 dsFvが、SEQ ID NO:198のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:200のアミノ酸配列を含むか、またはSEQ ID NO:197のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:200のアミノ酸配列を含む、請求項5および87〜89のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  92. 薬剤にコンジュゲートされている、請求項1〜91のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  93. 薬剤が、治療剤、抗腫瘍剤、毒素もしくはその断片、検出可能モエティ、または診断剤である、請求項92記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  94. 薬剤が、リンカーを介して多重特異性ポリペプチド構築物にコンジュゲートされている、請求項93記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
  95. 請求項1〜94のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物をコードする、ポリヌクレオチド。
  96. 請求項1〜94のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物のいずれかのポリペプチド鎖をコードする、ポリヌクレオチド。
  97. 請求項1〜94のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物の第1のポリペプチドをコードする第1の核酸配列と、多重特異性ポリペプチド構築物の第2のポリペプチドをコードする第2の核酸配列とを含む、ポリヌクレオチドであって、
    第1および第2の核酸配列が、配列内リボソーム進入部位（IRES）によって、または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸によって、分離されている、
    ポリヌクレオチド。
  98. 第1の核酸配列および第2の核酸配列が、同一のプロモーターに機能的に連結されている、請求項97記載のポリヌクレオチド。
  99. 多重特異性ポリペプチド構築物が第3のポリペプチド鎖を含み、ポリヌクレオチドが、多重特異性ポリペプチド構築物の第3のポリペプチドをコードする第3の核酸をさらに含む、請求項97または請求項98記載のポリヌクレオチド。
  100. 第3の核酸が、配列内リボソーム進入部位（IRES）によって、または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸によって、第1および/または第2のポリペプチドから分離されており、かつ/または第3の核酸配列が、第1および/または第2の核酸配列と同一のプロモーターに機能的に連結されている、請求項99記載のポリヌクレオチド。
  101. 自己切断ペプチドまたはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸が、T2A、P2A、E2A、またはF2Aより選択される、請求項97〜100のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  102. 請求項95〜101のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  103. 発現ベクターである、請求項102記載のベクター。
  104. ウイルスベクターまたは真核生物ベクターであり、
    任意で、真核生物ベクターが哺乳動物ベクターである、
    請求項102または103記載のベクター。
  105. 請求項95〜101のいずれか一項記載の1種もしくは複数種のポリヌクレオチド、または請求項102〜104のいずれか一項記載の1種もしくは複数種のベクターを含む、細胞。
  106. 組換えであるかまたは単離されている、請求項105記載の細胞。
  107. 哺乳動物細胞である、請求項105または請求項106記載の細胞。
  108. HEK293細胞またはCHO細胞である、請求項107記載の細胞。
  109. 請求項95〜101のいずれか一項記載の1種もしくは複数種のポリヌクレオチドまたは請求項102〜104のいずれか一項記載の1種もしくは複数種のベクターを細胞に導入する工程、および
    多重特異性ポリペプチド構築物が産生される条件の下で該細胞を培養する工程
    を含む、多重特異性ポリペプチド構築物を作製する方法。
  110. 前記細胞によって多重特異性ポリペプチドが産生される条件の下で、請求項105〜108のいずれか一項記載の細胞を培養する工程
    を含む、多重特異性ポリペプチド構築物を作製する方法。
  111. 多重特異性ポリペプチド構築物を細胞から単離するかまたは精製する工程をさらに含む、請求項109または請求項110記載の方法。
  112. 多重特異性ポリペプチド構築物がヘテロ二量体である、請求項109〜111のいずれか一項記載の方法。
  113. 請求項109〜112のいずれか一項記載の方法によって作製された、多重特異性ポリペプチド構築物。
  114. 請求項1〜94または請求項113のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
  115. 無菌である、請求項114記載の薬学的組成物。
  116. 標的細胞およびT細胞を、請求項1〜94もしくは請求項113のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物または請求項114もしくは請求項115記載の薬学的組成物と接触させる工程を含み、
    標的細胞が、多重特異性ポリペプチド構築物によって認識される腫瘍関連抗原を発現している、
    免疫応答を刺激するかまたは誘導する方法。
  117. 標的細胞が、腫瘍関連抗原（TAA）を発現している腫瘍細胞である、請求項116記載の方法。
  118. 接触させる工程が、エクスビボまたはインビトロで実施される、請求項116または請求項117記載の方法。
  119. 接触させる工程が、対象においてインビボで実施される、請求項116〜118のいずれか一項記載の方法。
  120. 請求項1〜94もしくは請求項113のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物または請求項114もしくは請求項115の薬学的組成物を、治療的に有効な量で、それを必要とする対象へ投与する工程
    を含む、対象において免疫応答を刺激するかまたは誘導する方法。
  121. 細胞性免疫を増加させる、請求項116〜120のいずれか一項記載の方法。
  122. T細胞活性を増加させる、請求項116〜121のいずれか一項記載の方法。
  123. 細胞溶解性T細胞（CTL）活性を増加させる、請求項116〜122のいずれか一項記載の方法。
  124. 腫瘍またはがんに対する免疫応答が増加する、請求項116〜123のいずれか一項記載の方法。
  125. 対象における疾患または状態を処置する、請求項116〜124のいずれか一項記載の方法。
  126. 請求項1〜94もしくは請求項113のいずれか一項記載の多重特異性コンジュゲートまたは請求項114もしくは請求項115記載の薬学的組成物を、治療的に有効な量で、それを必要とする対象へ投与する工程
    を含む、対象における疾患または状態を処置する方法。
  127. 疾患または状態が腫瘍またはがんである、請求項125または請求項126記載の方法。
  128. 対象がヒトである、請求項119〜127のいずれか一項記載の方法。
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