CN113166262A - Pd-1单结构域抗体及其治疗组合物 - Google Patents

Pd-1单结构域抗体及其治疗组合物 Download PDF

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Abstract

本文提供了特异性地结合PD‑1的结合多肽。更具体地，本文提供了结合PD‑1的融合蛋白，其包括多价的和/或多特异性的构建体和嵌合抗原受体。还提供了含有所述多肽的药物组合物，编码所述多肽的核酸分子及其载体和细胞，以及所提供的PD‑1结合多肽用于治疗疾病和病症(诸如癌症)的使用方法和用途。

Description

PD-1单结构域抗体及其治疗组合物
相关申请
本申请要求2018年10月11日提交的美国临时申请号62/744,615和2019年1月11日提交的美国临时申请号62/791,152的权益，其内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开内容总体上提供了特异性地结合PD-1的结合多肽。更具体地说，本公开内容涉及至少结合PD-1的融合蛋白，包括多价的和/或多特异性的构建体和嵌合分子。本公开内容还提供了编码所述多肽的核酸分子及其载体和细胞，以及提供的PD-1结合多肽用于治疗疾病和病症诸如癌症的使用方法和用途。
背景技术
PD-1是免疫细胞调节分子的免疫球蛋白超家族的一个成员。它在活化的T-细胞的表面上表达。PD-1在活化的T-细胞上的表达被肿瘤微环境中的肿瘤细胞和间质细胞通过PD-L1靶向以抑制免疫应答，从而使阻断或靶向PD-1的药剂成为合乎需要的治疗靶标。需要改进的靶向PD-1的治疗分子和药剂。本文提供了满足这样的需求的实施方案。
附图说明
图1A-1G描绘了18H10和它的人源化变体hz18H10或1-14与表达人PD-1的FreeStyle 293细胞(图1A、1D、1E、1F、1G)、食蟹猴PD-1(图1B)或小鼠PD-1(图1C)的结合。还评估并显示了与未转染的(293)细胞的结合。
图2的图描绘了18H10和它的人源化变体hz18H10v7与活化的人T细胞的结合。通过流式细胞计量术定量了与活化的T细胞结合的试验物。
图3的图描绘了18H10、它的人源化变体hz18H10v7或1-14在Jurkat报道萤光素酶测定系统中阻断PD1/PDL1介导的T细胞受体(TCR)信号传递的抑制的能力。图3A描绘了18H10和hz18H10v7的PD1阻断，而图3B描绘了1-14的PD1阻断。
具体实施方式
本文提供了特异性地结合PD-1的多肽，在下文中也称为PD-1-结合多肽。在某些实施方案中，所提供的结合多肽包含至少一个结合PD-1的VHH结构域。在某些实施方案中，本文提供的PD-1-结合多肽包含一、二、三、四、五、六、七或八个各自分别结合PD-1的VHH结构域。在某些实施方案中，本文提供的PD-1-结合多肽包含一、二、三或四个结合PD-1的VHH结构域。在某些实施方案中，所述PD-1-结合多肽是单特异性的。在某些实施方案中，所述PD-1-结合多肽是多特异性的。例如，所提供的PD-1-结合多肽包括结合一种或多种除了PD-1以外的靶蛋白的多肽，所述多肽可以包含至少一个结合PD-1的VHH结构域和一个或多个另外的结合结构域，诸如一个或多个另外的VHH结构域。
在某些实施方案中，PD-1-结合多肽包含至少一个结合PD-1的VHH结构域和一个Fc结构域。在某些实施方案中，本文提供的PD-1-结合多肽包含一、二、三或四个结合PD-1的VHH结构域和一个Fc结构域。在某些实施方案中，Fc结构域在生理条件下介导PD-1-结合多肽的二聚化，使得形成使PD-1结合位点的数目倍增的二聚体。例如，包含三个结合PD-1的VHH结构域和一个Fc区的PD-1-结合多肽作为单体是三价的，但是在生理条件下，Fc区可以介导二聚化，使得PD-1-结合多肽在这样的条件下作为六价二聚体存在。
程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)是一种I型膜蛋白，并且是T细胞调节剂PD-1的扩展CD28/CTLA-4家族的成员(The EMBO Journal(1992),第11卷,第11期,第3887-3895页)。据报道，在髓样细胞(包括通过来自抗原受体的刺激活化的T细胞或B淋巴细胞)或活化的巨噬细胞中观察到PD-1在周围的表达(International Immunology(1996),第18卷，第5期,第765-772页)。还已经证实，通过IFN-γ刺激上调PD-1在细胞表面上的表达。已经鉴定了PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体PD-1和PDL-2，并已证实在与PD-1结合后下调T细胞活化和细胞因子分泌(Freeman等人(2000)J.Exp.Med.192:1027-34；Latchman等人(2001)Nat.Immunol.2:261-8；Carter等人(2002)Eur.J.Immunol.32:634-43；Ohigashi等人(2005)Clin.Cancer Res.11:2947-53)。PD-1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)都是结合PD-1的B7同系物。PD-L1和PD-L2通常在T细胞、B细胞和髓样细胞的表面上表达。PD-L1和PD-L2是免疫活化的负调节剂，并能够通过与PD-1受体的相互作用下调免疫应答。在一些方面，PD-1在NK细胞和T细胞(包括CD4+和CD8+T细胞)上表达，由此PD-1的结合可以抑制活化细胞活化、增殖和/或繁殖。
人PD-1的示例性序列如下所示：
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL(SEQ IDNO:286,信号序列标有下划线)
在某些情况下，所提供的PD-1结合多肽直接地阻断或抑制PD-L1/L2和PD-1之间的相互作用。在某些实施方案中，所提供的抑制或减少PD-Ll和/或PD-L2和PD-1之间的相互作用的分子会调节免疫应答。尽管抑制性信号的传递可能导致免疫细胞应答的下调(以及总体免疫应答的相应下调)，但是阻断免疫细胞中的抑制性信号会导致免疫细胞应答的上调(以及免疫应答的相应上调)。在某些情况下，通过增强免疫应答实现的调节可以用于治疗某些其中免疫应答被抑制的疾病或病症，诸如癌症。在某些实施方案中，所提供的PD-1结合多肽可以用作治疗剂以抑制或减少肿瘤细胞生长或存活。
提供了多种PD-1多肽结合形式。在某些实施方案中，本文提供的PD-1多肽是二价的，诸如通过与Fc蛋白融合。在某些实施例中，PD-1结合多肽包括PD-1 VHH-Fc多肽。在某些实施方案中，所述Fc是表现出免疫效应子活性的Fc，诸如一种或多种效应子功能诸如抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性的细胞的吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性的细胞毒性(CDC)。在其它实施方案中，所述PD-1多肽可以是含有至少一种另外分子的多特异性多肽。在某些实施方案中，所述另外分子能够结合肿瘤相关的微环境中的另一种分子，诸如肿瘤相关抗原或免疫细胞，例如T细胞。在特定实施方案中，所提供的PD-1多肽结合形式会阻断PD-1和PD-L1和/或PD-L1之间的相互作用，和/或减少、抑制或遏制细胞(诸如T细胞)中由PD-1介导的抑制性信号。
在某些实施方案中，所提供的PD-1-结合多肽可以用于刺激受试者中的免疫应答，在某些方面，这会治疗受试者中的疾病或障碍，诸如癌症。在某些方面，本文提供的PD-1-结合多肽(诸如PD-1-Fc)可以结合表达PD-1的细胞并阻断它们与免疫突触中的邻近细胞(例如肿瘤细胞)上的PD-L1和/或PD-L2的相互作用，在某些方面，这可以在环境中诱导主动免疫应答。在某些情况下，主动免疫应答可以抑制癌细胞的生长(例如，阻断细胞周期进展)。
在其它方面，本文还提供了表现出多特异性结合的VHH-结合多肽。在某些情况下，所述结合多肽包括表现出对PD-1和肿瘤相关抗原(TAA)的双重亲和力的多肽。可替换地或额外地，PD-1结合多肽包括表现出对PD-1和T细胞抗原(诸如CD3)的亲和力的多肽。在某些方面，这样的多特异性分子能够在结合肿瘤或T细胞后结合或活化在肿瘤位点处的T细胞，并同时阻断PD-1和PD-L1/PD-L2的相互作用以减少T细胞中的抑制性信号。具体地，本文提供的这样的分子包括表现出受限的CD3结合的分子。本文还提供了经工程改造的细胞，诸如经工程改造的T细胞，所述细胞表达嵌合抗原受体且能够分泌PD-1结合多肽。
在本申请中提及的所有出版物，包括专利文献、科学文章和数据库，出于所有目的通过引用整体并入，达到如同每篇单独的出版物个别地通过引用并入相同的程度。如果本文提出的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其它出版物中提出的定义相反或以其它方式不一致，则本文提出的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本领域技术人员通常较好地理解并通常使用常规方法采用本文描述或参考的技术和规程，例如，在以下文献中描述的广泛使用的方法：Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel,等人.编,(2003))；系列METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.):PCR 2:APRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor编(1995)),Harlowand Lane,编(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,and ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney,编(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,编,1984)；Methodsin Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,编,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney),编,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,和D.G.Newell,编,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell,编)；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos,编,1987)；PCR:The Polymerase ChainReaction,(Mullis等人,编,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人,编,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.,编,IRL Press,1988-1989)；MonoclonalAntibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean,编,Oxford UniversityPress,2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold SpringHarbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra,编,HarwoodAcademic Publishers,1995)；和Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人,编,J.B.Lippincott Company,1993)；和它们的更新版本。
在本文中使用的段落标题仅仅用于组织目的，不应解释为限制描述的主题。
I.定义
除非另有定义，否则与本公开内容结合使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步，除非上下文另外要求或明确指出，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。对于各种来源或参考之间定义的任何冲突，以本文提供的定义为准。
应当理解，本文所述的本发明的实施方案包括“由实施方案组成”和/或”基本上由实施方案组成”。如本文中使用的，除非另外指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式。术语“或”在本文中的应用并不意味着暗示替代方案是相互排斥的。
在本申请中，“或”的使用是指“和/或”，除非明确说明或本领域技术人员会理解。在多个从属权利要求的上下文中，“或”的使用向回指超过一个在先独立或从属权利要求。
本文中使用的术语“约”表示在该技术领域中的技术人员容易知道的各个值的通常误差范围。提及“约”，本文中的值或参数包括(且描述)指向该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可以互换使用，并表示核苷酸的聚合物。这样的核苷酸的聚合物可以含有天然的和/或非天然的核苷酸，并且包括、但不限于DNA、RNA和PNA。“核酸序列”表示在核酸分子或多核苷酸中包含的核苷酸的线性序列。
本文中使用的术语“分离的多核苷酸”应当指基因组、cDNA或合成起源或它们的某种组合的多核苷酸，其由于其来源(1)与在自然界中发现的多核苷酸的全部或部分不相关，(2)可操作地连接至其在自然界中不连接的多核苷酸，或(3)在自然界中不作为更大序列的一部分存在。
术语“多肽”和“蛋白”互换使用以表示氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。这样的氨基酸残基的聚合物可以含有天然的或非天然的氨基酸残基，并且包括、但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。该定义涵盖全长蛋白及其片段。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如，糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，为了本公开内容的目的，“多肽”表示这样的蛋白：其包括对天然序列的修饰，诸如缺失、添加和置换(本质上通常是保守的)，只要该蛋白保持所需的活性即可。这些修饰可能是故意的，如通过定位诱变，或可能是偶然的，诸如通过产生蛋白的宿主的突变或由PCR扩增导致的错误。
本文所指的术语“分离的蛋白”是指，主题蛋白(1)不含至少一些通常在自然界中与它一起发现的其它蛋白，(2)基本上不含来自相同来源的其它蛋白，例如来自相同物种，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)已经与至少约50％的在自然界中与它相关的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其它物质分离，(5)与在自然界中与“分离的蛋白”相关的蛋白的部分不相关(通过共价或非共价相互作用)，(6)与在自然界中与它无关的多肽可操作地相关(通过共价或非共价相互作用)，或(7)在自然界中不存在。这样的分离的蛋白可以由基因组DNA、cDNA、mRNA或其它RNA编码，或可以具有合成起源，或它们的任意组合。在某些实施方案中，分离的蛋白是基本上纯的或基本上不含有在其天然环境中发现的会干扰其使用(治疗、诊断、预防、研究或其它方式)的蛋白或多肽或其它污染物。
本文中使用的“基本上纯的”是指，目标物质是存在的优势物质(即，以摩尔计，它比组合物中的任何其它个别物质更丰富)，并且基本上纯化的级分是这样的组合物：其中目标物质占存在的所有大分子物质的至少约50％(以摩尔计)。通常，基本上纯的组合物将占存在于组合物中的所有大分子物质的超过约80％，例如，在某些实施方案中，超过约85％、90％、95％和99％。在某些实施方案中，将目标物质纯化至基本上同质(通过常规检测方法在组合物中不可检测出污染物物质)，其中该组合物基本上由单一大分子物质组成。
本文中使用的术语“可操作地连接”表示，如此描述的组分的位置处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系。“可操作地连接”至编码序列的控制序列以这样的方式连接：在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
术语“特异性地结合”抗原或表位是本领域中充分理解的术语，且确定这样的特异性结合的方法也是本领域众所周知的。如果与替代细胞或物质相比分子更经常地、更快速地、以更大的持续时间和/或以更大的亲和力与特定细胞或物质反应或结合，就说所述分子表现出“特异性结合”或“优先地结合”。如果抗体比它结合其它物质以更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更大的持续时间结合，则单结构域抗体(sdAb)或含有VHH的多肽“特异性地结合”或“优先地结合”靶标。例如，特异性地或优先地结合PD-1表位的sdAb或含有VHH的多肽是与它结合其它PD-1表位或非-PD-1表位相比以更大亲和力、亲合力、更容易和/或以更久的持续时间结合该表位的sdAb或含有VHH的多肽。通过阅读该定义还理解：例如，特异性地或优先地结合第一靶标的sdAb或含有VHH的多肽可以或可以不特异性地或优先地结合第二靶标。这样，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管它可以包括)排它结合。通常，但不一定，提及的结合是指优先结合。“特异性”表示结合蛋白的选择性地结合抗原的能力。
本文中使用的术语“表位”表示抗原结合分子(例如，sdAb或含有VHH的多肽)所结合的靶分子(例如，抗原，诸如蛋白、核酸、碳水化合物或脂质)上的位点。表位经常包括分子(诸如氨基酸)的化学活性表面基团、多肽或糖侧链，并具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以由靶分子的连续的和/或紧靠的非连续残基(例如氨基酸、核苷酸、糖、脂质部分)形成。由连续残基(例如氨基酸、核苷酸、糖、脂质部分)形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位可以包括、但不限于至少3个、至少5个或8-10个残基(例如氨基酸或核苷酸)。在某些实施方案中，表位的长度小于20个残基(例如，氨基酸或核苷酸)，小于15个残基或小于12个残基。如果两种抗体表现出对抗原的竞争性结合，则它们可以结合抗原内的相同表位。在某些实施方案中，通过与抗原结合分子上的CDR残基的某个最小距离，可以鉴定表位。在某些实施方案中，可以通过上述距离来鉴定表位，并且进一步限于抗原结合分子的残基和抗原残基之间的键(例如氢键)中所涉及的那些残基。也可以通过各种扫描来鉴定表位，例如丙氨酸或精氨酸扫描可以指示抗原结合分子可以与之相互作用的一个或多个残基。除非明确指出，否则作为表位的一组残基并不排除其它残基成为特定抗原结合分子的表位的一部分。相反，这样的组的存在表示表位的最小系列(或物质的集合)。因而，在某些实施方案中，被鉴定为表位的一组残基指定与抗原相关的最小表位，而不是关于抗原上的表位的残基的排它性清单。
“非线性表位”或“构象表位”包含在对所述表位特异性的抗原结合分子所结合的抗原性蛋白内的非连续多肽、氨基酸和/或糖。在某些实施方案中，至少一个残基将与表位的其它所示残基不连续；但是，一个或多个残基也可以与其它残基连续。
“线性表位”包含在对所述表位特异性的抗原结合分子所结合的抗原性蛋白内的连续多肽、氨基酸和/或糖。应当指出，在某些实施方案中，并非在线性表位内的每个残基都需要被抗原结合分子直接结合(或参与键)。在某些实施方案中，线性表位可以来自使用由线性表位的序列有效地组成的肽的免疫接种，或者来自与蛋白的其余部分相对分离的蛋白的结构部分(使得抗原结合分子可以相互作用，至少主要)，正如与该序列部分。
术语“抗体”和“抗原结合分子”以最宽的含义互换使用，且涵盖包含抗体-样抗原结合结构域的各种多肽，包括、但不限于常规抗体(通常包含至少一个重链和至少一个轻链)，单结构域抗体(sdAb，仅包含一条链，其通常类似于重链)，含有VHH的多肽(包含至少一个仅重链抗体可变结构域或VHH的多肽)和任何前述物质的片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性。在某些实施方案中，抗体包含二聚化结构域。这样的二聚化结构域包括、但不限于重链恒定结构域(包含CH1、铰链、CH2和CH3，其中CH1通常与轻链恒定结构域CL配对，而铰链介导二聚化)和Fc结构域(包含铰链、CH2和CH3，其中铰链介导二聚化)。
术语抗体也包括、但不限于嵌合抗体、人源化抗体和各种物种(诸如骆驼科(包括美洲驼羊)、鲨鱼、小鼠、人、食蟹猴等)的抗体。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与所述抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个CDR。(参见，例如，Kindt等人.Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性，例如单结构域抗体，诸如VHH。此外，结合特定抗原的抗体可以使用来自结合所述抗原的抗体的VH或VL结构域分离，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
“抗体片段”或“抗原结合片段”表示不同于常规或完整抗体的分子，其包含常规或完整抗体的一部分，该部分至少含有结合抗原的可变区。抗体片段的例子包括但不限于：Fv、单链Fv(sdFv)、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双体；直链抗体；仅包含VH区域(VHH)的单结构域抗体。
如本文中使用的，关于结合分子的“单价”表示具有对靶抗原具有特异性的单个抗原识别位点的结合分子。单价结合分子的例子包括例如单价抗体片段、具有抗体样结合特性的蛋白性结合分子或MHC分子。单价抗体片段的例子包括、但不限于Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)。
术语“单结构域抗体”、“sdAb”、“VHH”在本文中互换地用于表示具有单个单体结构域抗原结合/识别结构域的抗体。这样的抗体包括骆驼科抗体或鲨鱼抗体。在某些实施方案中，VHH包含三个CDR和四个框架区，命名为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在某些实施方案中，VHH可以在N-端或C-端被截短，使得其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些框架区中的一个或两个，只要VHH基本维持抗原结合和特异性即可。
术语“含有VHH的多肽”表示包含至少一个VHH结构域的多肽。在某些实施方案中，VHH多肽包含二、三或四个或更多个VHH结构域，其中每个VHH结构域可以相同或不同。在某些实施方案中，含有VHH的多肽包含Fc结构域。在某些这样的实施方案中，VHH多肽可以形成二聚体。含有VHH的多肽的非限制性结构包括VHH1-Fc、VHH1-VHH2-Fc和VHH1-VHH2-VHH3-Fc，其中VHH1、VHH2和VHH3可以相同或不同。在这样的结构的一些实施方案中，一个VHH可通过接头连接至另一个VHH，或一个VHH可通过接头连接至Fc。在某些这样的实施方案中，接头包含1-20个氨基酸，优选1-20个主要由甘氨酸和任选的丝氨酸组成的氨基酸。在某些实施方案中，当含有VHH的多肽包含Fc时，其形成二聚体。因此，如果结构VHH1-VHH2-Fc形成二聚体，则认为它是四价的(即，该二聚体具有四个VHH结构域)。类似地，如果结构VHH1-VHH2-VHH3-Fc形成二聚体，则认为它是六价的(即，该二聚体具有六个VHH结构域)。
本文中使用的PD-1-结合多肽是特异性地结合PD-1的多肽或蛋白。通常，本文中的PD-1-结合多肽是含有VHH的多肽，其含有至少一个结合PD-1的VHH结构域。PD-1-结合多肽包括缀合物，包括融合蛋白。PD-1-结合多肽包括融合蛋白，包括含有Fc结构域的融合蛋白。在某些实施方案中，PD-1-结合多肽含有二、三、或四个或更多个VHH结构域，其各自特异性地结合PD-1，其中每个VHH结构域可以相同或不同。在某些实施方案中，PD-1-结合多肽是多价的。在某些实施方案中，PD-1-结合多肽是多特异性的。在某些情况下，PD-1-结合多肽可以含有一个或多个另外的结构域，其结合一个或多个其它的或另外的除PD-1以外的抗原。
术语“单克隆抗体”表示基本上同质的抗体群体的抗体(包括sdAb或含有VHH的多肽)，也就是说，除了可能以微小量存在的可能的天然存在的突变以外，构成所述群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，单克隆抗体的样品可以结合抗原上的相同表位。修饰词“单克隆的”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，单克隆抗体可以通过首先由Kohler和Milstein,1975,Nature 256:495描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备，例如在美国专利号4,816,567中描述。单克隆抗体也可以从使用例如McCafferty等人,1990,Nature 348:552-554描述的技术产生的噬菌体文库中分离。
术语“CDR”表示通过本领域技术人员的至少一种鉴定方式定义的互补性决定区。给定的CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任一种容易地确定，包括以下文献所描述的方案：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745.”(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A和Plückthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”JMol Biol,2001年6月8日；309(3):657-70,(“Aho”编号方案)；和Martin等人,“Modelingantibody hypervariable loops:a combined algorithm,”PNAS,1989,86(23):9268-9272,(“AbM”编号方案)。
给定的CDR或FR的边界可能会随用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号均基于最常见的抗体区域序列长度，其中插入处带有插入字母，例如，“30a”，并且在某些抗体中出现缺失。两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。AbM方案是基于Oxford Molecular的AbM抗体建模软件所使用的在Kabat和Chothia定义之间的折衷方案。
在某些实施方案中，可以根据Chothia编号方案、Kabat编号方案、Kabat和Chothia的组合、AbM定义和/或contact定义中的任一种来定义CDR。VHH包含三个CDR，分别称为CDR1、CDR2和CDR3。下表1列出了分别由Kabat、Chothia、AbM和Contact方案鉴定的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia编号方案列出了残基编号。FR位于CDR之间，例如，FR-H1位于CDR-H1之前，FR-H2位于CDR-H1和CDR-H2之间，FR-H3位于CDR-H2和CDR-H3之间，诸如此类。应当指出，由于所示的Kabat编号方案将插入放在H35A和H35B处，当使用所示的Kabat编号惯例编号时Chothia CDR-H1环的末端在H32和H34之间变化，取决于环的长度。
Figure BDA0003110879870000101
Figure BDA0003110879870000111
1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD
2-Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948
因而，除非另外指出，否则给定抗体或其区域(诸如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单个指出的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)应当理解为涵盖由前述方案中的任一个定义的(或特定的)互补决定区。例如，当声明特定的CDR(例如，CDR-H3)在给定的VHH氨基酸序列中含有相应CDR的氨基酸序列时，应当理解，这样的CDR在VHH内具有相应的CDR(例如，CDR-H3)的序列，如由前述方案中的任一个定义的。在某些实施方案中，指定了特定的CDR序列。使用各种编号方案描述了提供的抗体的示例性CDR序列(参见例如表1)，尽管应理解，所提供的抗体可以包括根据其它前述编号方案或熟练的技术人员已知的其它编号方案中的任一种所述的CDR。
本文中使用的“缀合物”、“缀合”或其语法变体表示，通过本领域已知的任何接合或连接方法将两种或更多种化合物接合或连接在一起从而导致另一种化合物的形成。它还可以表示通过将两种或更多种化合物接合或连接在一起而产生的化合物。例如，直接地或间接地连接至一个或多个化学部分或多肽的VHH结构域是示例性缀合物。这样的缀合物包括融合蛋白、通过化学缀合物产生的那些以及通过任何其它方法产生的那些。
免疫球蛋白Fc融合体(“Fc-融合体”)，诸如VHH-Fc，是包含一个或多个可操作地连接至免疫球蛋白的Fc区的VHH结构域的分子。免疫球蛋白Fc区可以间接地或直接地连接至一个或多个VHH结构域。各种接头是本领域已知的，并且可以任选地用于将Fc连接至融合配偶体以产生Fc-融合体。在某些这样的实施方案中，接头包含1-20个氨基酸，优选1-20个主要由甘氨酸和任选的丝氨酸组成的氨基酸。可以将相同物种的Fc-融合体二聚化以形成Fc-融合体同源二聚体，或使用不同的物种来形成Fc-融合体异源二聚体。在某些实施方案中，Fc是哺乳动物Fc诸如人Fc。
本文中使用的术语“重链恒定区”表示包含至少三个重链恒定结构域、CH1、铰链、CH2和CH3的区域。当然，除非另有说明，否则在术语“重链恒定区”的范围内涵盖在结构域内的不改变功能的缺失和变化。非限制性的示例性重链恒定区包括γ、δ和α。非限制性的示例性重链恒定区也包括ε和μ。每个重恒定区对应于抗体同种型。例如，包含γ恒定区的抗体是IgG抗体，包含δ恒定区的抗体是IgD抗体，而包含α恒定区的抗体是IgA抗体。此外，包含μ恒定区的抗体是IgM抗体，包含ε恒定区的是IgE抗体。某些同种型可以进一步细分为亚类。例如，IgG抗体包括、但不限于IgG1(包含γ1恒定区)、IgG2(包含γ2恒定区)、IgG3(包含γ3恒定区)和IgG4(包含γ4恒定区)抗体；IgA抗体包括、但不限于IgA1(包含α1恒定区)和IgA2(包含α2恒定区)抗体；和IgM抗体包括、但不限于IgM1和IgM2。
本文中使用的“Fc区”表示包含CH2和CH3的重链恒定区的一部分。在某些实施方案中，Fc区包含铰链、CH2和CH3。在不同的实施方案中，当Fc区包含铰链时，铰链介导两个含Fc的多肽之间的二聚化。Fc区可以属于本文讨论的任何抗体重链恒定区同种型。在某些实施方案中，Fc区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性的“效应子功能”包括Fc受体结合；Clq结合和补体依赖性的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B-细胞受体)的下调；和B-细胞活化，等。这样的效应子功能通常需要将Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合，并且可以使用各种测定来评估。
“天然序列Fc区”包含与在自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非-A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4Fc区以及它们的天然存在的变体。
“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。在某些实施方案中，“变体Fc区”包含这样的氨基酸序列：其由于至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列，但保留了天然序列Fc区的至少一种效应子功能。在某些实施方案中，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸置换，例如，约一个至约十个氨基酸置换，且优选在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中的约一个至约五个氨基酸置换。在某些实施方案中，本文的变体Fc区将与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％序列同一性，与其具有至少约90％序列同一性，与其具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
一般而言，在免疫球蛋白重链或其部分(诸如Fc区)中的残基的编号是如在Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的EU索引中的编号。“如在Kabat中的EU索引”表示人IgG1 EU抗体的残基编号。
“Fc受体”或“FcR”描述了与抗体的Fc区结合的受体。在某些实施方案中，FcγR是天然人FcR。在某些实施方案中，FcR是结合IgG抗体(γ受体)的FcR，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括那些受体的等位基因变体和交替剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其细胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见，例如，Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR综述在，例如，Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。其它FcR，包括在将来要鉴定的FcR，在本文中被术语“FcR”所涵盖。例如，术语“Fc受体”或“FcR”也包括新生儿受体FcRn，其负责母体IgG向胎儿的转移(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))和免疫球蛋白的体内稳态的调节。测量与FcRn的结合的方法是已知的(参见，例如，Ghetie和Ward,Immunol.Today 18(12):592-598(1997)；Ghetie等人,Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997)；Hinton等人,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人)。
本文中使用的“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架，如本文中讨论的。衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在某些实施方案中，跨单个抗原结合结构域(诸如VHH)中的所有人框架，氨基酸变化的数目小于10，或小于9，或小于8，或小于7，或小于6，或小于5，或小于4，或小于3。
本文中使用的“嵌合抗原受体”或“CAR”表示经工程改造的受体，其通过抗原结合结构域将抗原特异性引入经其工程改造的细胞(例如T细胞诸如原初T细胞、中央记忆T细胞、效应子记忆T细胞或它们的组合)，从而将抗原结合结构域的抗原结合特性与T-细胞的T细胞活性(例如裂解能力和自我更新)结合在一起。CAR通常包括细胞外抗原结合结构域(胞外结构域)、跨膜结构域和细胞内的信号传递结构域。细胞内的信号传递结构域通常含有至少一个ITAM信号传递结构域，例如衍生自CD3ζ，和任选的至少一个共刺激信号传递结构域，例如衍生自CD28或4-1BB。
“亲和力”表示分子(例如，抗体或含有VHH的多肽)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力或表观亲和力通常可分别由解离常数(KD)或KD-表观来表示。可通过本领域已知的常用方法(例如，ELISA KD、KinExA、流式细胞计量术和/或表面等离子体共振装置)来测量亲和力，所述常用方法包括本文描述的那些。这样的方法包括、但不限于包含
Figure BDA0003110879870000141
或流式细胞计量术的方法。
本文中使用的术语“KD”表示抗原结合分子/抗原相互作用的平衡解离常数。当本文中使用术语“KD”时，它包括KD和KD-表观。
在某些实施方案中，如下测量抗原结合分子的KD：通过流式细胞计量术使用表达抗原的细胞系，并将在每种抗体浓度测量的平均荧光拟合至非线性单位点结合方程式(Prism Software graphpad)。在某些这样的实施方案中，KD是KD-表观。
术语“生物活性”表示分子的任何一种或多种生物学特性(无论是在体内发现为天然存在的，还是通过重组方式提供或实现的)。生物学特性包括、但不限于结合配体、诱导或增加细胞增殖(诸如T细胞增殖)以及诱导或增加细胞因子的表达。
“亲和力成熟的”含有VHH的多肽表示，与不具有这样的改变的亲本含有VHH的多肽相比，在一个或多个CDR中具有一个或多个改变的含有VHH的多肽，这样的改变导致含有VHH的多肽对抗原的亲和力的改善。
本文中使用的“人源化的VHH”表示其中一个或多个框架区已基本上被人框架区替代的VHH。在某些情况下，人免疫球蛋白的某些框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化的VHH可以包含在原始VHH和人框架序列中均未发现的残基，但被包括在内以进一步完善和优化VHH或含有VHH的多肽性能。在某些实施方案中，人源化的含有VHH的多肽包含人Fc区。如将理解的，人源化序列可以通过其基本序列来鉴定，并且不一定表示产生抗体的过程。
本文中使用的术语“基本上相似”或“基本上相同”表示两个或多个数值之间的足够高的相似度，使得在通过所述值测量的生物学特征的范围内，本领域技术人员会认为两个或多个数值之间的差异具有很小或没有生物学和/或统计学显著性。在某些实施方案中，两个或更多个基本相似的值相差不超过5％、10％、15％、20％、25％或50％中的约任何一个。
多肽“变体”是指在比对所述序列，如果必要的话引入间隙以实现最大序列同一性百分比，且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分后，与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物活性多肽。这样的变体包括例如其中在多肽的N-或C-端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。在某些实施方案中，变体将具有至少约80％氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，变体将具有至少约90％氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，变体将与天然序列多肽具有至少约95％氨基酸序列同一性。
如本文中使用的，关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”被定义为，比对所述序列，如果必要的话引入间隙以实现最大序列同一性百分比，且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分后，与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的在候选序列中的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术中的多种方式实现，例如，使用公众可得到的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在所对比的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
氨基酸置换可以包括、但不限于将多肽中的一种氨基酸用另一种氨基酸替换。表2中显示了示例性置换。可以将氨基酸置换引入目标抗体中，并关于期望的活性来筛选产物，例如，保留的/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
Figure BDA0003110879870000151
Figure BDA0003110879870000161
氨基酸可以根据共同的侧链特性分组：
(1)疏水的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守置换需要将这些分类之一的成员交换为另一个分类的成员。
术语“载体”用于描述可被工程改造成含有可在宿主细胞中繁殖的克隆的一种或多种多核苷酸的多核苷酸。载体可以包括以下元件中的一种或多种：复制起点，一种或多种调节目标多肽表达的调节序列(例如，启动子和/或增强子)，和/或一种或多种可选择的标记基因(例如，抗生素抗性基因和可以用于比色测量测定中的基因，例如，β-半乳糖苷酶)。术语“表达载体”表示用于在宿主细胞中表达目标多肽的载体。
“宿主细胞”表示可以是或已经是载体或分离的多核苷酸的接受者的细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。示例性的真核细胞包括哺乳动物细胞，诸如灵长类动物或非-灵长类动物动物细胞；真菌细胞，诸如酵母；植物细胞；和昆虫细胞。非限制性的示例性哺乳动物细胞包括、但不限于NSO细胞、
Figure BDA0003110879870000162
细胞(Crucell)和293和CHO细胞和它们的衍生物，诸如293-6E、CHO-DG44、CHO-K1、CHO-S和CHO-DS细胞。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，且所述后代可以由于天然的、偶然的或故意的突变不一定与原始母代细胞完全相同(在形态学上或在基因组DNA补体上)。宿主细胞包括用本文提供的一种或多种多核苷酸在体内转染的细胞。
本文中使用的术语“分离的”表示已经与通常在自然界中与它一起发现或产生的至少一些组分分离的分子。例如，当多肽与在其中产生它的细胞的至少某些组分分离时，该多肽被称为“分离的”。在表达后由细胞分泌多肽的情况下，将含有多肽的上清液与产生该多肽的细胞物理分离，被认为是在“分离”该多肽。类似地，当它不是更大的多核苷酸(通常在自然界中发现它在其中)(例如，在DNA多核苷酸的情况下，基因组DNA或线粒体DNA)的一部分时，或与在其中产生它的细胞的至少某些组分分离时(例如在RNA多核苷酸的情况下)，多核苷酸被称作“分离的”。因此，被包含在宿主细胞内的载体中的DNA多核苷酸可以被称为“分离的”。
术语“个体”和“受试者”在本文中互换地用于表示动物；例如哺乳动物。术语患者包括人和兽医受试者。在某些实施方案中，提供了治疗哺乳动物的方法，包括、但不限于，人类、啮齿类动物、猿猴、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪、绵羊、山羊、哺乳动物实验动物、哺乳动物耕作动物、哺乳动物运动动物和哺乳动物宠物。该受试者可以是雄性或雌性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成年和老年受试者。在某些实施例中，“个体”或“受试者”表示需要治疗疾病或障碍的个体或受试者。在某些实施方案中，要接受治疗的受试者可以是患者，这表明以下事实：该受试者已被鉴定为患有与治疗有关的障碍，或具有感染该障碍的足够风险。在特定实施方案中，受试者是人，诸如人患者。
本文中使用的“疾病”或“障碍”表示需要和/或期望治疗的病症。
除非另有说明，否则术语“肿瘤细胞”、“癌细胞”、“癌症”、“肿瘤”和/或“赘生物”在本文中可互换地使用，并且表示表现出失控的生长和/或异常的增加的细胞存活和/或细胞凋亡的抑制(其干扰身体器官和系统的正常功能)的一个细胞(或多个细胞)。该定义包括良性和恶性癌症、息肉、增生、以及休眠的肿瘤或微转移灶。
术语“癌症”和“肿瘤”涵盖实体癌和血液学/淋巴癌，并且还涵盖恶性的、恶化前的和良性的瘤，诸如发育异常。同样，该定义包括具有不受免疫系统的阻碍(例如免疫逃避和免疫逃逸机制)的异常增殖的细胞(例如病毒感染的细胞)。示例性的癌症包括、但不限于：基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统的癌症；子宫内膜癌；食管癌；眼癌；头和颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内赘生物；肾脏或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)；黑素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口腔和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统的癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统的癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、以及B-细胞淋巴瘤(包括低等级/滤泡非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中间等级/滤泡NHL；中间等级弥散性NHL；高等级成免疫细胞性NHL；高等级成淋巴细胞性NHL；高等级小无核裂细胞NHL；巨大肿块(bulky disease)NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS有关的淋巴瘤；和沃尔登斯特伦巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；以及其它癌和肉瘤；和移植后淋巴组织增生障碍(PTLD),以及与瘢痣病有关的异常血管增殖、水肿(诸如与脑肿瘤有关的水肿)和Meigs氏综合征。
本文中使用的术语“非肿瘤细胞”表示正常细胞或组织。示例性的非肿瘤细胞包括、但不限于：T-细胞，B-细胞，天然杀伤(NK)细胞，天然杀伤T(NKT)细胞，树突细胞，单核细胞，巨噬细胞，上皮细胞，成纤维细胞，肝细胞，间质性肾细胞，成纤维细胞-样滑膜细胞，成骨细胞，和位于乳房、骨骼肌、胰腺、胃、卵巢、小肠、胎盘、子宫、睾丸、肾、肺、心脏、脑、肝、前列腺、结肠、淋巴样器官、骨中的细胞，以及骨衍生的间质干细胞。本文中使用的术语“位于周围的细胞或组织”表示不位于肿瘤细胞附近和/或肿瘤微环境内的非肿瘤细胞。
本文中使用的术语“在肿瘤微环境内的细胞或组织”表示围绕和/或供给肿瘤细胞的细胞、分子、细胞外基质和/或血管。在肿瘤微环境内的示例性细胞或组织包括、但不限于：肿瘤脉管系统；肿瘤浸润性淋巴细胞；成纤维细胞网状细胞；内皮祖细胞(EPC)；癌症相关的成纤维细胞；周细胞；其它间质细胞；细胞外基质(ECM)的组分；树突细胞；抗原呈递细胞；T-细胞；调节性T-细胞(Treg细胞)；巨噬细胞；嗜中性粒细胞；骨髓-衍生的抑制细胞(MDSC)和位于肿瘤近端的其它免疫细胞。用于鉴定肿瘤细胞和/或位于肿瘤微环境内的细胞/组织的方法是本领域众所周知的，如下文所述。
在某些实施方案中，“增加”或“减少”分别表示统计上显著的增加或减少。如技术人员将清楚的，“调节”还可涉及：与相同条件但不存在试验试剂相比，实现靶标或抗原对其配体、结合配偶体、用于结合成同多聚体的或杂多聚体形式的配偶体或底物中的一种或多种的亲和力、亲合力、特异性和/或选择性的改变(其可以是增加或减少)；实现靶标或抗原对所述靶标或抗原所存在的培养基或环境中一种或多种条件(诸如pH、离子强度、辅因子的存在等)的敏感性的变化(其可以是增加或减少)；和/或细胞增殖或细胞因子产生。这可以以任何合适的方式和/或使用本身已知的或本文描述的任何合适的测定法来确定，取决于所涉及的靶标。
本文中使用的“免疫应答”意在涵盖足以抑制或预防疾病(例如，癌症或癌症转移)的发作或改善所述疾病的症状的细胞和/或体液免疫应答。“免疫应答”可以涵盖先天性和适应性免疫系统的方面。
本文中使用的术语“治疗”疾病、障碍或病症是用于获得有益或期望的临床结果的方案。本文中使用的“治疗”涵盖为了哺乳动物(包括人)中的疾病对治疗剂的任何施用或应用。为了本公开内容的目的，有益的或期望的临床结果包括、但不限于以下任何一种或多种：减轻一种或多种症状，减轻疾病程度，预防或延迟疾病的扩散(例如，转移，例如转移至肺部或淋巴结)，预防或延迟疾病的复发，延迟或减慢疾病进展，改善疾病状态，抑制疾病或疾病的进展，抑制或减慢疾病或其进展，阻止其发展，和减轻(无论是部分的还是全部的)。“治疗”也涵盖增殖性疾病的病理后果的减轻。本文提供的方法涵盖治疗的这些方面中的任何一个或多个。与上述内容一致，术语“治疗”不需要百分之百去除障碍的所有方面。
如本文在癌症的上下文中所使用的，术语“治疗”或“抑制”癌症、癌症的“抑制”表示以下至少一种：肿瘤生长速率的统计上显著的降低，肿瘤生长的停止，或肿瘤的大小、质量、代谢活性或体积的减小，如通过标准规范(例如，但不限于，实体瘤的应答评价标准(RECIST))测量的，或无进展生存期(PFS)或总生存期(OS)的统计上显著的增加。
“改善”是指与不施用治疗剂相比减轻或改善一种或多种症状。“改善”还包括症状的持续时间的缩短或减少。
疾病或障碍的“预防”或“阻止”表示单独地或与另一种化合物组合地施用药物组合物，以预防疾病或障碍的发生或发作或者疾病或障碍的一些或全部症状，或减轻疾病或障碍的发作的可能性。
术语“抑制”表示任何表型特征的减少或停止，或该特征的发生率、程度或可能性的减少或停止。“减少”或“抑制”是，与参考相比，降低、减少或阻止活性、功能和/或量。在某些实施方案中，“减少”或“抑制”是指造成10％或更大的总减少的能力。在某些实施方案中，“减少”或“抑制”是指造成50％或更大的总减少的能力。在某些实施方案中，“减少”或“抑制”是指造成75％、85％、90％、95％或更大的总减少的能力。在某些实施方案中，相对于相同时间段上的对照，在一段时间上抑制或减少上述量。
本文中使用的“延迟疾病的发展”是指延迟、阻碍、减慢、延缓、稳定、抑制和/或推迟疾病(例如癌症)的发展。该延迟可以具有不同的时间长度，取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。本领域技术人员显而易见，充分或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会发生该疾病。例如，晚期癌症，例如转移的发展，可能被延迟。
本文中使用的“预防”包括针对可能易患该疾病但尚未被诊断出患有该疾病的受试者中疾病的发生或复发提供预防。除非另外指出，否则术语“减少”、“抑制”或“预防”并非表示或要求在所有时间内(但是仅在所测量的时间段内)完全预防。
术语“抗癌剂”在本文中以它的最宽含义使用，表示用于治疗一种或多种癌症的药剂。这样的药剂的示例性类别包括、但不限于化学治疗剂、抗癌生物制品(诸如细胞因子、受体细胞外结构域-Fc融合体和抗体)、辐射疗法、CAR-T疗法、治疗性寡核苷酸(诸如反义寡核苷酸和siRNA)和溶瘤病毒。
术语“生物样品”是指得自活物或以前的活物的一定量的物质。这样的物质包括、但不限于血液、(例如，全血)、血浆、血清、尿、羊水、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其它细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾。
术语“对照”或“参考”表示已知不含分析物(“阴性对照”)或包含分析物(“阳性对照”)的组合物。阳性对照可以包含已知浓度的分析物。
术语“有效量”或“治疗有效量”表示含有活性成分(例如sdAb或含有VHH的多肽)的组合物的量和/或浓度，所述组合物在单独地(即，作为单一疗法)或与额外的治疗剂组合地施用给患者时，产生疾病进展的统计上显著的下降，例如，通过改善或消除症状和/或疾病的原因。有效量可以是这样的量：其解除、减少或减轻与疾病或障碍有关的至少一种症状或生物应答或效应，预防疾病或障碍的进展，或改善患者的身体功能。包含活性剂的组合物的治疗有效量可以根据诸如以下因素而变化：个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及活性剂在个体中引起期望应答的能力等。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过活性剂的任何毒性或有害作用的量。可以在一次或多次施用中递送治疗有效量。治疗有效量表示在所需的剂量和时间段内有效达到期望的治疗和/或预防结果的量。
本文中使用的组合物表示两种或更多种产物、物质或化合物的任何混合物，包括细胞。它可以是溶液、混悬液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或它们的任意组合。
术语“药物制剂”和“药物组合物”表示这样的制品：其形式允许活性成分的生物活性是有效的，并且其不包含对将向其施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分。因此，它是适合用于在哺乳动物受试者(通常是人)中的药物用途的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性剂(例如，sdAb或含有VHH的多肽)和载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂或稀释剂通常分别是药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。这样的制剂可以是无菌的。
“药学上可接受的载体”表示用于与治疗剂一起使用的本领域常规的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料、制剂助剂或载体，它们一起构成用于施用给受试者的“药物组合物”。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且与制剂的其它成分相容。药学上可接受的载体适合于所采用的制剂。
与一种或多种其它治疗剂“组合”施用包括以任何顺序的同时(并行)和依次施用。
术语“并行”在本文中用于表示两种或更多种治疗剂的施用，其中至少部分施用在时间上重叠，或者其中一种治疗剂的施用相对于其它治疗剂的施用处于短时间段内，或者其中两种药剂的治疗效果重叠至少一段时间。
术语“依次”在本文中用于表示在时间上不重叠的两种或多种治疗剂的施用，或者其中所述药剂的治疗效果不重叠。
本文中使用的“与……结合”表示除另一种治疗方式之外的一种治疗方式的施用。因此，“与……结合”表示在向个体施用其它治疗方式之前、过程中或之后施用一种治疗方式。
术语“包装说明书”用于表示治疗性产品的商业包装中通常包括的指令，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法的信息，含有关于这样的治疗产品的使用的指示和/或警告。
“制成品”是包含至少一种试剂(例如，用于治疗疾病或障碍(例如，癌症)的药物，或用于特异性检测本文所述的生物标志物的探针)的任何制品(例如，包装或容器)或试剂盒。在某些实施方案中，制成品或试剂盒作为用于执行本文描述的方法的单元被促销、分配或出售。
术语“标记物”和“可检测标记物”是指这样的部分：其连接至例如抗体或抗原以使特异性结合对的成员之间的反应(例如，结合)是可检测的。特异性结合对的标记的成员被称为“可检测地标记的”。因而，术语“标记的结合蛋白”表示具有掺入的标记物的蛋白，所述标记物提供了结合蛋白的鉴定。在某些实施方案中，标记物是可检测的标志物，其可产生可通过视觉或仪器手段检测的信号，例如，放射性地标记的氨基酸的掺入或附着于生物素基部分的多肽，所述生物素基部分可以被标记的抗生物素蛋白(例如，抗生蛋白链菌素，其含有可以通过光学或比色测量方法检测到的荧光标志物或酶活性)检测到。用于多肽的标记物的例子包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm)；色原体、荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标记；生物素基基团；被二级报告物识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)；和磁性试剂，例如钆螯合物。通常用于免疫测定的标记物的代表性实例包括产生光的部分，例如吖啶鎓化合物，以及产生荧光的部分，例如荧光素。在这点上，部分自身可能不是可检测地标记的，但是与另一个部分反应后，可能变得可检测。
II.结合PD-1的VHH结构域
本文提供了PD-1-结合多肽，其为含有VHH的多肽，该多肽含有至少一个特异性地结合PD-1的VHH结构域。在某些实施方案中，所述VHH结构域结合人PD-1。在某些实施方案中，所述VHH结构域结合食蟹猴PD-1。在某些实施方案中，所述VHH结构域结合鼠PD-1。在某些实施方案中，所述含有VHH的多肽包含本文提供的VHH结构域的多个拷贝。在这样的实施方案中，含有VHH的多肽可以包含相同VHH结构域的多个拷贝。在某些实施方案中，含有VHH的多肽可以包含不同的、但是识别PD-1上的相同表位的VHH结构域的多个拷贝。含有VHH的多肽可以以多种形式形成，包括在下面部分III中描述的任一种。
VHH结构域是抗体片段，其是能够选择性结合特定抗原的单个单体可变抗体结构域。由于仅12-15kDa的分子量，VHH结构域(也称为单结构域抗体)比由两条重蛋白链和两条轻链组成的普通抗体(150-160kDa)小得多，甚至小于Fab片段(约50kDa，一条轻链和一半重链)和单链可变片段(约25kDa，两个可变结构域，一个来自轻链，一个来自重链)。
单结构域抗体是这样的抗体：其互补决定区是单结构域多肽的一部分。例子包括、但不限于：重链抗体，天然不含轻链的抗体，衍生自常规4-链抗体的单结构域抗体，经工程改造的抗体和除衍生自抗体的那些以外的单结构域支架。单结构域抗体可以衍生自任何物种，包括、但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼羊、羊驼、骆马、原驼、鲨鱼、山羊、兔和/或牛科动物。在某些实施方案中，本文所用的单结构域抗体是天然存在的单结构域抗体，其称为缺乏轻链的重链抗体。为了清楚起见，这种源自天然缺乏轻链的重链抗体的可变结构域在本文中称为VHH，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。这样的VHH分子可以源自在骆驼科物种中产生的抗体，例如在骆驼、美洲驼羊、单峰骆驼、羊驼、骆马和原驼中产生。除骆驼科外的其它物种可能产生天然缺乏轻链的重链抗体；这样的VHH是在本公开内容的范围内。
筛选对PD-1具有所需特异性的VHH结构域(包括VHH-结合多肽)的方法包括、但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶测定、流式细胞计量术和本领域已知的其它免疫学介导的技术。
在本文提供的VHH结构域中包括PD-1 VHH(美洲驼羊或羊驼衍生的)和人源化的序列，例如下文所述的任一种。
在某些实施方案中，结合PD-1的VHH结构域可以是人源化的。人源化抗体(诸如含有VHH的多肽)可用作治疗分子，因为人源化抗体会减少或消除对非人抗体的人免疫应答，所述人免疫应答可以导致对抗体治疗剂的免疫应答和降低的治疗剂有效性。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中CDR(或其部分)衍生自非人抗体，且FR(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在某些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，衍生出CDR残基的抗体)的相应残基置换，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法综述在例如Almagro和Fransson,(2008)Front.Biosci.13:1619-1633中，并进一步描述在例如Riechmann等人,(1988)Nature 332:323-329；Queen等人,(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA 86:10029-10033；美国专利号5,821,337,7,527,791,6,982,321,和7,087,409；Kashmiri等人,(2005)Methods 36:25-34；Padlan,(1991)Mol.Immunol.28:489-498(描述了“表面重建”)；Dall'Acqua等人,(2005)Methods 36:43-60(描述了“FR改组”)；和Osbourn等人,(2005)Methods 36:61-68andKlimka等人,(2000)Br.J.Cancer,83:252-260(描述了FR改组的“指导选择”方案)。
可以用于人源化的人框架区包括、但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等人(1993)J.Immunol.151:2296)；从重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生出的框架区(参见，例如，Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285；和Presta等人(1993)J.Immunol,151:2623)；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson,(2008)Front.Biosci.13:1619-1633)；和从筛选FR文库衍生出的框架区(参见，例如，Baca等人,(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684和Rosok等人,(1996)J.Biol.Chem.271:22611-22618)。通常，将VHH的FR区替换为人FR区以制成人源化的VHH。在某些实施方案中，人FR的某些FR残基被替换以改善人源化的VHH的一种或多种特性。具有这样的替换残基的VHH结构域在本文中仍称为“人源化的”。
本文提供了结合PD-1的VHH结构域，其包含被包含在以下氨基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3：选自SEQ ID NO:251-267或284中的任一个的VHH氨基酸序列，或与选自SEQ IDNO:251-267或284中的任一个的VHH区域氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本文提供的PD-1 VHH结构域含有被包含在SEQ ID NO:284所示的VHH结构域中的CDR1、CDR2、CDR3，或与SEQ ID NO:284所示的VHH区域氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述PD-1 VHH结构域具有在SEQ ID NO:284中所示的氨基酸序列或与在SEQID NO:284中所示的氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述PD-1 VHH结构域是在SEQ ID NO:284中所示的氨基酸序列的人源化变体。
在某些实施方案中，本文提供的PD-1 VHH结构域含有被包含在SEQ ID NO:312所示的VHH结构域中的CDR1、CDR2、CDR3，或与在SEQ ID NO:312中所示的VHH区域氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述PD-1 VHH结构域具有在SEQ ID NO:312中所示的氨基酸序列或与在SEQ ID NO:312中所示的氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述PD-1 VHH结构域是在SEQID NO:312中所示的氨基酸序列的人源化变体。
在某些实施方案中，本文提供的PD-1 VHH结构域含有在SEQ ID NO:268、272、273或313中的任一个中所示的CDR1、在SEQ ID NO:278或314中所示的CDR2和在SEQ ID NO:283或315中所示的CDR3。
在某些实施方案中，本文提供的PD-1 VHH结构域含有分别在SEQ ID NO:272、278和283中所示的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方案中，本文提供的PD-1 VHH结构域含有分别在SEQ ID NO:268、278和283中所示的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方案中，本文提供的PD-1 VHH结构域含有分别在SEQ ID NO:272、278和283中所示的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方案中，本文提供的PD-1 VHH结构域含有分别在SEQ ID NO:273、278和283中所示的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方案中，本文提供的PD-1 VHH结构域含有分别在SEQ ID NO:313、314和315中所示的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些方面，结合PD-1的VHH结构域包含被包含在以下氨基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3：选自SEQ ID NO:251-267中的任一个的VHH氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:251-267中的任一个的VHH区域氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些情况下，所提供的PD-1 VHH结构域是人源化变体，其具有在SEQ ID NO:251-267中的任一个中所示的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:251-267中的任一个的VHH区域氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，PD-1人源化的VHH结构域具有在SEQ ID NO:251-267中的任一个中所示的氨基酸序列。
本文提供了结合PD-1的VHH结构域，其包含被包含在以下氨基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3：选自SEQ ID NO:287、288、289或290中的任一个的VHH氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:296、297、298或299中的任一个的VHH区域氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述PD-1 VHH结构域是在SEQ ID NO:296、297、298或299中所示的氨基酸序列的人源化变体。
在某些实施方案中，本文提供的PD-1 VHH结构域含有在SEQ ID NO:300、303、306或309中的任一个中所示的CDR1，在SEQ ID NO:301、304、307或310中所示的CDR2，在SEQ IDNO:302、305、308或311中所示的CDR3。在某些实施方案中，本文提供的PD-1 VHH结构域含有在SEQ ID NO:300中所示的CDR1，在SEQ ID NO:301中所示的CDR2，和在SEQ ID NO:302中所示的CDR3；本文提供的PD-1 VHH结构域含有在SEQ ID NO:303中所示的CDR1，在SEQ ID NO:304中所示的CDR2，和在SEQ ID NO:305中所示的CDR3；本文提供的PD-1 VHH结构域含有SEQID NO:306的CDR1，在SEQ ID NO:307中所示的CDR2,和在SEQ ID NO:308中所示的CDR3；或本文提供的PD-1 VHH结构域含有在SEQ ID NO:309中所示的CDR1，在SEQ ID NO:310中所示的CDR2,和在SEQ ID NO:311中所示的CDR3。
III.含有PD-1-结合多肽的融合蛋白和缀合物
本文提供了含有PD-1-结合多肽的融合蛋白和缀合物，所述PD-1-结合多肽含有至少一个特异性地结合PD-1的VHH结构域，所述VHH结构域直接地或间接地连接至一个或多个另外的结构域或部分。在某些实施方案中，本公开内容的融合蛋白或缀合物是由单一多肽组成。在其它实施方案中，本公开内容的融合蛋白或缀合物是由超过一种多肽组成。在某些实施方案中，本公开内容的PD-1-结合多肽包含至少一个特异性地结合PD-1的VHH结构域。在某些方面，所述PD-1-结合多肽是多价的。在某些实施方案中，所述PD-1-结合多肽包括特异性地结合PD-1的VHH结构域的两个或更多个拷贝，例如，特异性地结合PD-1的VHH结构域的三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或六个或更多个拷贝。在某些方面，所述PD-1-结合多肽是多特异性的。例如，在某些情况下，一个或多个另外的结构域可以是结合一个或更多个其它抗原或蛋白的一个或多个另外的结合结构域。
在某些实施方案中，本公开内容的PD-1-结合多肽包括通过氨基酸接头可操作地连接的两个或更多个多肽序列。在某些实施方案中，这些接头主要由氨基酸甘氨酸和丝氨酸组成，在本文中表示为GS-接头。本公开内容的融合蛋白的GS-接头可以具有各种长度，例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸的长度。在某些实施方案中，所述GS-接头包含选自以下的氨基酸序列：GGSGGS，即，(GGS)2(SEQ ID NO:1)；GGSGGSGGS，即，(GGS)3(SEQ ID NO:2)；GGSGGSGGSGGS，即，(GGS)4(SEQ ID NO:3)；和GGSGGSGGSGGSGGS，即，(GGS)5(SEQ ID NO:4)。在某些实施方案中，所述接头是包含甘氨酸残基的柔性接头，例如，作为非限制性例子，GG、GGG、GGGG(SEQ ID NO:5)、GGGGG(SEQ ID NO:6)和GGGGGG(SEQID NO:7)。在某些实施方案中，所述PD-1-结合多肽包括GS-接头和甘氨酸接头的组合。
A.Fc融合体
本文提供了PD-1-结合多肽，其为含有至少一个本文提供的结合PD-1的VHH结构域和一个Fc结构域的融合蛋白。在某些实施方案中，本文提供的PD-1-结合多肽包含一、二、三或四个结合PD-1的VHH结构域和一个Fc结构域。
在某些实施方案中，免疫球蛋白Fc区向融合蛋白中的掺入可以在某些方面由两个多肽组成，所述两个多肽一起形成二聚体。在某些实施方案中，Fc结构域在生理条件下介导PD-1-结合多肽的二聚化，诸如当从细胞表达时，使得形成使PD-1结合位点的数目倍增的二聚体。例如，包含三个结合PD-1的VHH结构域和一个Fc区的PD-1-结合多肽作为单体是三价的，但是Fc区可以介导二聚化，使得PD-1-结合多肽在这样的条件下作为六价二聚体存在。在某些实施方案中，将PD-1 VHH结构域融合至IgG Fc区且在这些实施方案中，融合蛋白是每个分子具有两个PD-1 VHH结构域的二价体。在某些实施方案中，将两个PD-1结合结构域(2x)融合至IgG Fc区且在这些实施方案中，融合蛋白是每个分子具有四个PD-1 VHH结构域的四价体。在某些实施方案中，将三个PD-1 VHH结构域(3x)融合至IgG Fc区且在这些实施方案中，融合蛋白是每个分子具有六个PD-1 VHH结构域的六价体。
在某些实施方案中，所述多价PD-1-结合多肽是二价体。在某些实施方案中，本公开内容的二价PD-1-结合多肽包括具有下述结构的PD-1-结合多肽的两个拷贝：(PD-1VHH)-接头-Fc。在某些实施方案中，所述多价PD-1-结合多肽是四价体。在某些实施方案中，本公开内容的四价PD-1-结合多肽包括具有下述结构的PD-1-多肽的两个拷贝：(PD-1VHH)-接头-(PD-1 VHH)-接头-Fc。在某些实施方案中，所述多价PD-1-结合多肽是六价体。在某些实施方案中，本公开内容的六价PD-1-结合多肽包括具有下述结构的PD-1-多肽的两个拷贝：(PD-1 VHH)-接头-(PD-1 VHH)-接头-(PD-1 VHH)-接头-Fc。
在某些情况下，Fc区的CH3结构域可以用作同源二聚化结构域，使得得到的融合蛋白由两个相同的多肽形成。在其它情况下，Fc区的CH3二聚体界面区域可以突变从而实现异源二聚化。例如，异源二聚化结构域可以掺入融合蛋白中，使得构建体是不对称的融合蛋白。
在提供的实施方案中的任一个中，PD-1 VHH结构域可以是如上所述的任一种。在某些实施方案中，PD-1 VHH结构域是结合PD-1的人源化的VHH结构域。
在不同的实施方案中，在PD-1-结合多肽中包括的Fc结构域是人Fc结构域，或衍生自人Fc结构域。在某些实施方案中，所述融合蛋白含有免疫球蛋白Fc区。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是选自IgG1同种型、IgG2同种型、IgG3同种型和IgG4亚类的IgG同种型。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区或其免疫学上有活性的片段是IgG同种型。例如，融合蛋白的免疫球蛋白Fc区属于人IgG1同种型，其具有氨基酸序列：
Figure BDA0003110879870000271
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区或其免疫学上有活性的片段包含与SEQID NO:8的氨基酸序列具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的人IgG1多肽序列。
在其中本公开内容的融合蛋白包括Fc多肽的某些实施方案中，Fc多肽被突变或修饰。在某些情况下，突变包括一个或更多个氨基酸置换以降低Fc多肽的效应子功能。已知Fc多肽的突变的各种实例以改变(例如降低)效应子功能，包括如下所述的任一种。在某些实施方案中，除非参考特定SEQ ID NO描述，否则通过Kabat的EU编号(也称为Kabat编号)来提及Fc区中的氨基酸置换。EU编号是已知的，并根据最近更新的IMGT Scientific Chart(
Figure BDA0003110879870000281
the international ImMunoGeneTics information
Figure BDA0003110879870000282
http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html(创建:2001年5月17日，最近更新:2013年1月10日)和在Kabat,E.A.等人.Sequences of Proteins ofImmunological interest.第5版美国卫生和人类服务部(US Department of Health andHuman Services),NIH公开号91-3242(1991)中报告的EU索引。
在某些实施方案中，对于其中期望PD-1或CD3结合但某些效应子功能(例如CDC和ADCC)是不必要的或有害的应用，表现出降低的效应子功能的Fc区可能是合乎需要的候选物。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保多特异性多肽构建体和/或其切割组分缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在美国专利号5,500,362中描述了用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例(参见，例如，Hellstrom,I.等人.Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。可替换地，可以采用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞计量术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(Cell Technology,Inc.MountainView,Calif.；和CytoTox 96TM非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,Wis.)。用于这样的测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可替换地，或另外地，可以在体内评估目标分子的ADCC活性，例如，在动物模型中，诸如在Clynes等人.Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的。也可以进行C1q结合测定以确认多特异性多肽构建体或其切割组分不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见，例如，在WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见，例如，Petkova,S.B.等人,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
在某些实施方案中，修饰人IgG Fc区以改变抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性的细胞毒性(CDC)，例如，在以下文献中描述的氨基酸修饰：Natsume等人,2008 Cancer Res,68(10):3863-72；Idusogie等人,2001 J Immunol,166(4):2571-5；Moore等人,2010 mAbs,2(2):181-189；Lazar等人,2006 PNAS,103(11):4005-4010,Shields等人,2001 JBC,276(9):6591-6604；Stavenhagen等人,2007 Cancer Res,67(18):8882-8890；Stavenhagen等人,2008 Advan.Enzyme Regul.,48:152-164；Alegre等人,1992J Immunol,148:3461-3468；Reviewed in Kaneko and Niwa,2011 Biodrugs,25(1):1-11。
增强ADCC的突变的例子包括在Ser239和Ile332处的修饰，例如Ser239Asp和Ile332Glu(S239D,I332E)。增强CDC的突变的例子包括在Lys326和Glu333处的修饰。在某些实施方案中，使用Kabat编号系统在这些位置中的一个或两个处修饰Fc区，例如Lys326Ala和/或Glu333Ala(K326A和E333A)。
在某些实施方案中，在以下位置中的一个或多个处改变融合蛋白的Fc区以减少Fc受体结合：Leu 234(L234)、Leu235(L235)、Asp265(D265)、Asp270(D270)、Ser298(S298)、Asn297(N297)、Asn325(N325)orAla327(A327)或Pro329(P329)。例如，Leu 234Ala(L234A)、Leu235Ala(L235A)、Leu235Glu(L235E)、Asp265Asn(D265N)、Asp265Ala(D265A)、Asp270Asn(D270N)、Ser298Asn(S298N)、Asn297Ala(N297A)、Pro329Ala(P329A)或Pro239Gly(P329G)、Asn325Glu(N325E)或Ala327Ser(A327S)。在优选的实施方案中，在Fc区内的修饰会降低与Fc-受体-γ受体的结合，同时对与新生儿Fc受体(FcRn)的结合具有最小影响。
在某些实施方案中，所述人IgG1 Fc区在氨基酸Asn297(Kabat编号)处被修饰以防止融合蛋白的糖基化，例如，Asn297Ala(N297A)或Asn297Asp(N297D)。在某些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸Leu235(Kabat编号)处被修饰以改变Fc受体相互作用，例如，Leu235Glu(L235E)或Leu235Ala(L235A)。在某些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸Leu234(Kabat编号)处被修饰以改变Fc受体相互作用，例如，Leu234Ala(L234A)。在某些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸Leu234(Kabat编号)处被修饰以改变Fc受体相互作用，例如，Leu235Glu(L235E)。在某些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸234和235处被改变，例如，Leu234Ala和Leu235Ala(L234A/L235A)或Leu234Val和Leu235Ala(L234V/L235A)。在某些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸234、235和297处被改变，例如，Leu234Ala、Leu235Ala、Asn297Ala(L234A/L235A/N297A)。在某些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸234、235和329处被改变，例如，Leu234Ala、Leu235Ala、Pro239Ala(L234A/L235A/P329A)。在某些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸Asp265(Kabat编号)处被修饰以改变Fc受体相互作用，例如Asp265Ala(D265A)。在某些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸Pro329(Kabat编号)处被修饰以改变Fc受体相互作用，例如Pro329Ala(P329A)或Pro329Gly(P329G)。在某些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸265和329处被改变，例如，Asp265Ala和Pro329Ala(D265A/P329A)或Asp265Ala和Pro329Gly(D265A/P329G)。在某些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸234、235和265处被改变，例如，Leu234Ala、Leu235Ala、Asp265Ala(L234A/L235A/D265A)。在某些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸234、235和329处被改变，例如，Leu234Ala、Leu235Ala、Pro329Gly(L234A/L235A/P329G)。在某些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在氨基酸234、235、265和329处被改变，例如，Leu234Ala、Leu235Ala、Asp265Ala、Pro329Gly(L234A/L235A/D265A/P329G)。在某些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区在Gly235处被改变以减少Fc受体结合。例如，其中Gly235从融合蛋白删除。在某些实施方案中，所述人IgG1 Fc区在氨基酸Gly236处被修饰以增强与CD32A的相互作用，例如，Gly236Ala(G236A)。在某些实施方案中，所述人IgG1 Fc区缺少Lys447(Kabat等人1991Sequences of Proteins ofImmunological Interest的EU索引)。
在某些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区缺少在一个或更多个下述位置处的氨基酸以减少Fc受体结合：Glu233(E233)、Leu234(L234)或Leu235(L235)。在某些实施方案中，所述融合蛋白的Fc区缺少在一个或更多个下述位置处的氨基酸：Glu233(E233)、Leu234(L234)或Leu235(L235)，和在Asp265(D265)、Asn297(N297)或Pro329(P329)中的一个或更多个处被修饰以减少Fc受体结合。例如，在PD-1-结合多肽中包括的Fc区衍生自人Fc结构域，且包含与IgG1 E233、L234和L235对应的在较低铰链中的三个氨基酸缺失。在某些方面，这样的Fc多肽不会接合FcγR且因而被称作“效应子沉默”或“效应子无效”。例如，这三个氨基酸的Fc缺失会减少补体蛋白C1q结合。在某些实施方案中，含有具有这三个氨基酸的Fc缺失的Fc区的多肽保持结合FcRn且因此具有延长的半衰期和与FcRn介导的重复利用有关的胞吞转运作用。这样的修饰的Fc区被称作“Fc xELL”或“Fc缺失”且具有下述氨基酸序列：
Figure BDA0003110879870000311
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区或其免疫学上有活性的片段包含与SEQID NO:9的氨基酸序列具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的人IgG1多肽序列。
在某些实施方案中，所述人IgG Fc区被修饰以增强FcRn结合。增强与FcRn的结合的Fc突变的例子是Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu(分别M252Y、S254T、T256E)(Kabat编号,Dall’Acqua等人2006,J.Biol Chem第281(33)卷23514-23524)、Met428Leu和Asn434Ser(M428L、N434S)(Zalevsky等人2010 Nature Biotech,第28(2)卷157-159)或Met252Ile、Thr256Asp、Met428Leu(分别M252I、T256D、M428L)、(Kabat等人1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest的EU索引)。
在某些实施方案中，在PD-1-结合多肽中包括的Fc结构域衍生自人Fc结构域且包含突变M252Y和M428V，在本文中被称作“Fc-YV”。在某些实施方案中，所述突变的或修饰的Fc多肽包括下述突变：使用Kabat编号系统，M252Y和M428L。在某些实施方案中，这样的突变增强在核内体的酸性pH(接近6.5)与FcRn的结合，同时丧失在中性pH(约7.2)的可检测的结合，从而允许增强的FcRn介导的重复利用和延长的半衰期。
在某些实施方案中，在PD-1-结合多肽中包括的Fc结构域衍生自人Fc结构域且包含突变以诱导异源二聚化。在某些实施方案中，这样的突变包括被称作“凸起”和“孔洞”突变的那些。例如，在Thr366处具有在CH3结构域内的氨基酸修饰，其当用更庞大的氨基酸替换时，例如，Try(T366W)，能够优先地与在位置Thr366、Leu368和Tyr407处具有向更小体积的氨基酸(例如，分别Ser、Ala和Val)的氨基酸修饰((T366S/L368A/Y407V))的第二个CH3结构域配对。在某些实施方案中，所述“凸起”Fc结构域包含突变T366W。在某些实施方案中，所述“孔洞”Fc结构域包含突变T366S、L368A和Y407V。通过CH3修饰实现的异源二聚化可以通过二硫键的引入而进一步稳定化，例如通过在相对的CH3结构域上将Ser354改变成Cys(S354C)和将Y349改变成Cys(Y349C)(综述在Carter,2001 Journal of ImmunologicalMethods,248:7-15)。在某些实施方案中，用于异源二聚化的Fc结构域包含另外的突变，诸如在异源二聚体Fc对的第一个成员上的突变S354C，其与异源二聚体Fc对的第二个成员上的对应突变Y349C形成不对称的二硫化物。在某些实施方案中，异源二聚体Fc对的一个成员包含修饰H435R或H435K以在维持FcRn结合的同时阻止蛋白A结合。在某些实施方案中，异源二聚体Fc对的一个成员包含修饰H435R或H435K，而异源二聚体Fc对的第二个成员在H435处未修饰。在不同的实施方案中，所述孔洞Fc结构域包含修饰H435R或H435K(在某些情况下，当所述修饰是H435R时，被称作“孔洞-R”)，而凸起Fc结构域不包含。在某些情况下，相对于可能存在的同源二聚体孔洞Fc结构域，孔洞-R突变会改善异源二聚体的纯化。
在某些实施方案中，所述人IgG Fc区被修饰以阻止二聚化。在这些实施方案中，本公开内容的融合蛋白是单体的。例如在残基Thr366处向带电荷的残基的修饰，例如Thr366Lys、Thr366Arg、Thr366Asp或Thr366Glu(分别T366K、T366R、T366D或T366E)，会阻止CH3-CH3二聚化。
在某些实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白Fc区或免疫学上有活性的片段属于人IgG2同种型，其具有氨基酸序列：
Figure BDA0003110879870000321
在某些实施方案中，所述融合体或其免疫学上有活性的片段包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的人IgG2多肽序列。
在某些实施方案中，所述人IgG2 Fc区在氨基酸Asn297处被修饰(例如以防止抗体的糖基化，例如，Asn297Ala(N297A)或Asn297Asp(N297D)。在某些实施方案中，所述人IgG2Fc区缺少Lys447(Kabat等人1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest的EU索引)。
在某些实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白Fc区或免疫学上有活性的片段属于人IgG3同种型，其具有氨基酸序列：
Figure BDA0003110879870000331
在某些实施方案中，所述抗体或其免疫学上有活性的片段包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的人IgG3多肽序列。
在某些实施方案中，所述人IgG3 Fc区在氨基酸Asn297(Kabat编号)处被修饰以防止抗体的糖基化，例如，Asn297Ala(N297A)或Asn297Asp(N297D)。在某些实施方案中，所述人IgG3 Fc区在氨基酸435处被修饰以延长半衰期，例如，Arg435His(R435H)。在某些实施方案中，所述人IgG3Fc区缺少Lys447(Kabat等人1991Sequences of Proteins ofImmunological Interest的EU索引)。
在某些实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白Fc区或免疫学上有活性的片段属于人IgG4同种型，其具有氨基酸序列：
Figure BDA0003110879870000332
在某些实施方案中，所述抗体或其免疫学上有活性的片段包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的人IgG4多肽序列。
在某些实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白Fc区或免疫学上有活性的片段属于人IgG4同种型，其具有氨基酸序列：
Figure BDA0003110879870000341
在某些实施方案中，所述抗体或其免疫学上有活性的片段包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的人IgG4多肽序列。
在某些实施方案中，所述人IgG4 Fc区在氨基酸235处被修饰以改变Fc受体相互作用，例如，Leu235Glu(L235E)。在某些实施方案中，所述人IgG4 Fc区在氨基酸Asn297(Kabat编号)处被修饰以防止抗体的糖基化，例如，Asn297Ala(N297A)或Asn297Asp(N297D)。在某些实施方案中，所述人IgG4 Fc区缺少Lys447(Kabat等人1991Sequences of Proteins ofImmunological Interest的EU索引)。
在某些实施方案中，所述融合蛋白含有从免疫球蛋白铰链区衍生出的多肽。铰链区可以选自人IgG亚类中的任一种。例如，融合蛋白可以含有具有EPKSSDKTHTCPPC(SEQ IDNO:14)的序列的经修饰的IgG1铰链，其中与轻链的C-端半胱氨酸形成二硫键的Cys220被突变成丝氨酸，例如，Cys220Ser(C220S)。在其它实施方案中，所述融合蛋白含有具有序列DKTHTCPPC(SEQ ID NO:15)的截短的铰链。
在某些实施方案中，所述融合蛋白具有来自IgG4的经修饰的铰链，其被修饰以防止或减少链交换，例如，Ser228Pro(S228P)，其具有序列ESKYGPPCPPC(SEQ ID NO:16)。在某些实施方案中，所述融合蛋白含有接头多肽。在其它实施方案中，所述融合蛋白含有接头和铰链多肽。
在某些实施方案中，所述Fc区缺少或具有在N297处连接至N-连接的聚糖链的还原的岩藻糖。存在许多防止岩藻糖基化的方法，包括、但不限于在FUT8缺陷型细胞系中生产；向哺乳动物细胞培养基中添加抑制剂，例如澳粟精胺；和生产细胞系的代谢工程。
在某些实施方案中，所述Fc区被工程改造以消除在人类中发现的现有抗体的识别。在某些实施方案中，本公开内容的含有VHH的多肽通过位置Leu11的突变被修饰，例如Leu11Glu(L11E)或Leu11Lys(L11K)。在其它实施方案中，本公开内容的单结构域抗体通过在羧基端区域中的变化被修饰，例如末端序列具有序列GQGTLVTVKPGG(SEQ ID NO:17)或GQGTLVTVEPGG(SEQ ID NO:18)或其修饰。在某些实施方案中，本公开内容的含有VHH的多肽通过位置11的突变和在羧基端区域中的变化被修饰。
在某些实施方案中，本公开内容的融合蛋白的一个或更多个多肽通过氨基酸接头可操作地连接。在某些实施方案中，这些接头主要由氨基酸甘氨酸和丝氨酸组成，在本文中表示为GS-接头。本公开内容的融合蛋白的GS-接头可以具有各种长度，例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸的长度。
在某些实施方案中，所述GS-接头包含选自以下的氨基酸序列：GGSGGS，即，(GGS)2(SEQ ID NO:1)；GGSGGSGGS，即，(GGS)3(SEQ ID NO:2)；GGSGGSGGSGGS，即，(GGS)4(SEQ IDNO:3)；和GGSGGSGGSGGSGGS，即，(GGS)5(SEQ ID NO:4)。在某些实施方案中，所述接头是包含甘氨酸残基的柔性接头，例如，作为非限制性例子，GG、GGG、GGGG(SEQ ID NO:5)、GGGGG(SEQ ID NO:6)和GGGGGG(SEQ ID NO:7)。在某些实施方案中，所述融合蛋白可以包括GS-接头和甘氨酸接头的组合。
B.缀合物
本文提供了缀合物，其含有至少一个本文提供的特异性地结合PD-1的VHH结构域和一个或更多个其它部分。所述其它部分可以是治疗剂，诸如细胞毒性剂，或可以是检测剂。在某些实施方案中，所述部分可以是靶向部分、小分子药物(小于500道尔顿摩尔质量的非多肽药物)、毒素、细胞抑制剂、细胞毒性剂、免疫抑制剂、适合用于诊断目的的放射性试剂、用于治疗目的的放射性金属离子、前药-活化酶、增加生物半衰期的试剂或诊断试剂或可检测的试剂。
在某些实施方案中，所述缀合物是抗体药物缀合物(ADC，也称为免疫缀合物)，其含有缀合至治疗剂的本文提供的一个或更多个PD-1 VHH结构域，所述治疗剂是细胞毒性的、细胞生长抑制性的或以其它方式提供某种治疗益处。在某些实施方案中，所述细胞毒性剂是化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)。在某些实施方案中，本公开内容的所提供的抗体药物缀合物允许药物部分靶向递送至肿瘤。在某些情况下，这可以导致肿瘤细胞的靶向杀死。
在某些实施方案中，提供了一种PD-1-结合缀合物，其包含与治疗剂缀合的本文提供的至少一个PD-1 VHH结构域。在某些实施方案中，所述治疗剂包括，例如，道诺霉素、多柔比星、甲氨蝶呤和长春地辛(Rowland等人,Cancer Immunol.Immunother.21:183-187,1986)。在某些实施方案中，所述治疗剂具有细胞内活性。在某些实施方案中，所述PD-1-结合缀合物被内化且所述治疗剂是阻断细胞的蛋白合成、由此导致细胞死亡的细胞毒素。在某些实施方案中，所述治疗剂是包含具有核糖体-灭活活性的多肽的细胞毒素，包括、例如，白树毒素、bouganin、皂草素、蓖麻蛋白、蓖麻蛋白A链、异株腹泻毒蛋白、白喉毒素、局限曲菌素、假单胞菌属外毒素A及其变体。在某些实施方案中，在治疗剂是包含具有核糖体-灭活活性的多肽的细胞毒素的情况下，为了使蛋白对细胞具有细胞毒性，PD-1-结合缀合物在结合靶细胞后必须被内化。
在某些实施方案中，提供了一种PD-1-结合缀合物，其包含与毒素缀合的本文提供的至少一个PD-1 VHH结构域。在某些实施方案中，所述毒素包括，例如，细菌毒素诸如白喉毒素，植物毒素诸如篦麻毒素，小分子毒素诸如格尔德霉素(Mandler等人,J.Nat.CancerInst.92(19):1573-1581(2000)；Mandler等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028(2000)；Mandler等人,Bioconjugate Chem.13:786-791(2002))，美坦辛类(EP1391213；Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996))，和卡奇霉素(Lode等人,Cancer Res.58:2928(1998)；Hinman等人,Cancer Res.53:3336-3342(1993))。毒素可能通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性和细胞生长抑制作用。
在某些实施方案中，提供了一种PD-1-结合缀合物，其包含与标记缀合的本文提供的至少一个PD-1 VHH结构域，所述标记可以间接地或直接地产生可检测信号。这些IgSF缀合物可以用于研究或诊断应用，诸如用于癌症的体内检测。所述标记优选地能够直接地或间接地产生可检测信号。例如，所述标记可以是不透射线的或放射性同位素，诸如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I；荧光(荧光团)或化学发光的(生色团)化合物，诸如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；酶，诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；成像剂；或金属离子。在某些实施方案中，所述标记是用于闪烁法研究的放射性原子，例如99Tc或123I，或用于核磁共振(NMR)成像(也被称作磁共振成像，MRI)的自旋标记，诸如锆-89、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。锆-89可以与多种金属螯合剂络合和缀合至抗体，例如，用于PET成像(WO 2011/056983)。
使用本领域已知的任何方法可以制备PD-1-结合缀合物。参见，例如，WO 2009/067800、WO 2011/133886和美国专利申请公开号2014322129，通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，所述连接可以是共价的或非共价的，例如，通过生物素-抗生蛋白链菌素非共价相互作用。在某些实施方案中，1、2、3、4、5个或更多个部分(它们可以相同或不同)缀合、连接或融合至PD-1 VHH结构域以形成PD-1-结合缀合物。在某些实施方案中，使用各种分子生物或化学缀合和本领域已知的和下面描述的连接方法，可以将这样的部分连接至VHH结构域。在某些实施方案中，接头诸如肽接头、可切割的接头、不可切割的接头或辅助缀合反应的接头可以用于将效应子部分连接或缀合至变体多肽或免疫调节性蛋白。
在某些实施方案中，通过接头(L)将PD-1 VHH结构域缀合至一个或更多个部分，例如每个VHH约1个至约20个药物部分。在某些实施方案中，所述PD-1-结合缀合物包含下述组分：(VHH结构域)、(L)q和(部分)m，其中所述VHH结构域是所描述的VHH结构域中的任一种，其能够如所述特异性地结合PD-1；L是用于将蛋白或多肽连接至所述部分的接头；m至少是1；q是0或更大；且得到的PD-1-结合缀合物结合PD-1。在特定实施方案中，m是1至4且q是0至8。
所述接头可以由一个或更多个接头组分组成。为了抗体和药物部分的共价连接，接头通常具有两个反应性官能团，即在反应意义上的二价。可用于连接两个或更多个功能或生物活性部分(诸如肽、核酸、药物、毒素、抗体、半抗原和报告基团)的二价接头试剂是已知的，并且已经描述了其所得缀合物的方法(Hermanson,G.T.(1996)BioconjugateTechniques；Academic Press:New York,第234-242页)。
示例性的接头组分包括6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧基羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-I羧酸酯(“SMCC”)和N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。
在某些实施方案中，所述接头可以包含氨基酸残基。示例性的氨基酸接头组分包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性的三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。构成氨基酸接头组分的氨基酸残基包括天然存在的残基，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。可以在它们被特定酶进行酶切割的选择性方面设计和优化氨基酸接头组分，例如，肿瘤相关的蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D、以及纤溶酶蛋白酶。
使用多种双功能的蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如二甲基己二亚氨酸酯HCl)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺基底物)、醛(诸如戊二醛)、二-叠氮基化合物(诸如双(对-叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、二-重氮鎓衍生物(诸如二-(对-重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性的氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)，可以制备VHH结构域和细胞毒性剂的缀合物。
通过多种方法可以制备抗体药物缀合物，诸如本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂。在一个实施方案中，方法包括：(1)使VHH结构域的亲核基团通过共价键与二价接头试剂反应，以形成VHH-L，然后与药物部分D反应；和(2)使药物部分的亲核基团通过共价键与二价接头试剂反应，以形成D-L，然后与VHH结构域的亲核基团反应。
在抗体(包括VHH结构域)上的亲核基团包括、但不限于：(i)N-端胺基，(ii)侧链胺基，例如赖氨酸，(iii)侧链巯基，例如半胱氨酸，和(iv)在抗体被糖基化的情况下，糖羟基或氨基。胺、巯基和羟基是亲核的且能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键，所述接头试剂包括：(i)活性酯诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酰卤；(ii)烷基和苄基卤化物诸如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基。通过赖氨酸与2-亚氨基硫杂环戊烷(Traut氏试剂)的反应从而导致胺向巯基的转化，可以将另外的亲核基团引入抗体中。通过引入一、二、三、四个或更多个半胱氨酸残基(例如，制备包含一个或更多个非天然的半胱氨酸氨基酸残基的突变体抗体)，可以将反应性巯基引入抗体(或其片段)。
通过修饰抗体(诸如VHH结构域)以引入亲电子部分，所述亲电子部分可以与接头试剂或药物上的亲核取代基反应，也可以生产缀合物，诸如抗体药物缀合物。可以将糖基化的抗体的糖氧化，例如，用高碘酸盐氧化试剂，以形成醛或酮基团，其可以连接接头试剂或药物部分的胺基。得到的亚胺希夫碱基团可以形成稳定的键，或可以被还原，例如，用硼氢化物试剂，以形成稳定的胺键。在一个实施方案中，糖基化的抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以在蛋白中产生羰基(醛和酮)基团，该基团可以与药物上的适当基团反应(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，含有N-端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白可以与偏高碘酸钠反应，从而导致醛在第一个氨基酸的位置的产生。这样的醛可以与药物部分或接头亲核体反应。
同样地，在药物部分上的亲核基团包括、但不限于：胺、巯基、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基，其能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键，所述接头试剂包括：(i)活性酯诸如NHS酯、HOBi酯、卤代甲酸酯和酰卤；(ii)烷基和苄基卤化物诸如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基。
可替换地，可以制备含有VHH结构域和细胞毒性剂的融合蛋白，例如通过重组技术或肽合成。DNA的长度可以包含编码缀合物的两个部分的相应区域，它们彼此相邻或被编码不破坏缀合物的期望性能的接头肽的区域隔开。
C.多特异性形式
本文提供了多特异性的PD-1-结合多肽，其含有至少一个结合PD-1的VHH结构域和一个或多个另外的结合结构域。通常，一个或多个另外的结构域结合除PD-1以外的第二抗原或蛋白。在某些方面，其它抗原或蛋白可以是在肿瘤上表达的抗原、在免疫细胞(诸如T细胞)上表达的分子或受体(例如CD3)、或另外的抑制性受体(例如CTLA-4、LAG3、TIM3、VISTA、TIGIT、SIRPα、NKG2A、B7H3、B7H4)或活化受体(例如OX40、GITR、41BB、CD40、CD27、CD28或ICOS)，或将另外的特异性赋予靶细胞(例如CD8或CD4)。在某些实施方案中，一个或多个另外的结构域是对第二抗原或蛋白特异性的抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中，所述另外的结构域是VHH结构域。
在某些实施方案中，多特异性的PD-1-结合多肽包含至少一个结合PD-1的VHH结构域和至少一个另外的结合第二抗原或蛋白的结合结构域。在某些实施方案中，该第二抗原是肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤微环境相关抗原(TMEAA)。在某些实施方案中，该第二抗原是免疫调节性抗原，其中所述抗原参与增强或减弱免疫细胞中的信号传递途径。
在某些情况下，多特异性的PD-1-结合多肽可以进一步含有Fc结构域，诸如上述的任一种。在某些实施方案中，本文提供的多特异性的PD-1-结合多肽包含至少一个结合PD-1的VHH结构域、至少一个另外的结合第二抗原或蛋白的结合结构域、和一个Fc结构域。在某些实施方案中，Fc结构域在生理条件下介导多特异性的PD-1-结合多肽的二聚化，使得形成使PD-1和另外抗原或蛋白的结合位点的数目倍增的二聚体。
下面描述了非限制性的示例性的多特异性的PD-1-结合多肽。
1.双特异性的T细胞接合物
在某些实施方案中，所述PD-1-结合多肽是双特异性构建体，其为或包含本文提供的至少一个PD-1 VHH结构域和至少一个另外的结合分子，所述结合分子能够结合在T细胞上表达的表面分子。在某些实施方案中，所述表面分子是T细胞的活化组分，诸如T细胞受体复合物的组分。在特定方面，所述表面分子是在T细胞上表达的活化性T细胞抗原且能够在与抗原结合分子相互作用后诱导T细胞活化。例如，在某些方面，抗原结合分子与活化性T细胞抗原的相互作用可以通过触发T细胞受体复合物的信号传递级联而诱导T细胞活化。测量T细胞活化的合适测定是已知的，且包括测量或评估一种或更多种活化标志物的增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性活性和/或表达的任何测定。在某些实施方案中，这样的PD-1-结合多肽与它的两种靶标(在靶细胞上表达的PD-1和在T细胞上表达的T细胞分子，例如活化性T细胞抗原)的同时或接近同时结合可以导致靶细胞和T细胞之间的短暂相互作用，由此导致T细胞的活化(例如细胞毒性活性)和靶细胞的随后裂解。
在某些实施方案中，所述T表面分子，诸如活化性T细胞抗原，是CD3或是CD2。具体地，所提供的双特异性的PD-1-结合多肽能够特异性地结合在人T细胞上表达的活化性T细胞抗原，诸如人CD3或人CD3。在特定方面，对活化性T细胞抗原(例如CD3或CD2)具有特异性的另外结合结构域是抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中，PD-1-结合多肽可以是双特异性抗体T细胞-接合物，其含有至少一个特异性地结合PD-1的PD-1VHH结构域和另外的结合分子，所述结合分子是对T细胞的活化组分(例如T细胞表面分子，例如CD3或CD2)具有特异性的抗体或抗原结合片段。
双特异性抗体T细胞-接合物包括双特异性T细胞接合物(BiTE)分子，其含有通过柔性接头融合的串联scFv分子(参见例如Nagorsen和Bauerle,Exp Cell Res 317,1255-1260(2011)；通过例如柔性接头彼此融合的串联scFv分子，并且其进一步含有由能够稳定结合的第一个和第二个亚基组成的Fc结构域(WO2013026837)；双体及其衍生物，包括串联双体(Holliger等人,Prot Eng 9,299-305(1996)；Kipriyanov等人,J Mol Biol 293,41-66(1999))；双重亲和力重新靶向(DART)分子，其可以包括具有C-端二硫键的双体形式；或triomabs，其包括完整杂合小鼠/大鼠IgG分子(Seimetz等人,Cancer Treat Rev 36,458-467(2010)。使用本文提供的PD-1 VHH结构域中的任一种，可以产生以上分子中的任一种的类似形式。
在某些实施方案中，对活化性T细胞抗原具有特异性的另外结合结构域是选自Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、二硫键稳定化的Fv片段(dsFv)、scAb、dAb、单结构域重链抗体(VHH)或单结构域轻链抗体的抗原结合片段。在某些实施方案中，所述另外结合结构域对于结合活化性T细胞抗原(诸如CD2或CD3)而言是单价的。
在某些实施方案中，所述另外结合结构域能够结合CD3或CD3复合物。CD3复合物是成熟的T-淋巴细胞中的至少五个膜结合的多肽的复合物，它们彼此和与T-细胞受体非共价地结合。CD3复合物包括γ、δ、ε、ζ和η链(也被称作亚基)。在某些实施方案中，所述另外的结合分子是能够特异性地结合CD3或CD3复合物的抗体或抗原结合片段，也称为CD3-结合结构域。在某些实施方案中，能够结合CD3或CD3复合物的CD3-结合结构域包括抗-CD3 Fab片段、抗-CD3 F(ab')2片段、抗-CD3 Fv片段、抗-CD3 scFv、抗-CD3 dsFv、抗-CD3 scAb、抗-CD3dAb、抗-CD3单结构域重链抗体(VHH)和抗-CD3单结构域轻链抗体的一个或多个拷贝。在某些实施方案中，所述抗-CD3结合结构域对于结合CD3而言是单价的。
在某些情况下，所述CD3-结合结构域识别CD3ε-链。在某些实施方案中，所述抗-CD3ε结合结构域包括抗-CD3εFab片段、抗-CD3εF(ab')2片段、抗-CD3εFv片段、抗-CD3εscFv、抗-CD3εdsFv、抗-CD3εscAb、抗-CD3εdAb、抗-CD3ε单结构域重链抗体(VHH)和抗-CD3ε单结构域轻链抗体的一个或多个拷贝。在某些实施方案中，所述抗-CD3ε结合结构域对于结合CD3ε而言是单价的。
针对CD3或CD3复合物的示例性单克隆抗体包括、但不限于OKT3、SP34、UCHT1或64.1或其抗原结合片段(参见例如，June,等人,J.Immunol.136:3945-3952(1986)；Yang,等人,J.Immunol.137:1097-1100(1986)；和Hayward,等人,Immunol.64:87-92(1988))。在某些方面，在T细胞上的CD3的分簇，例如，通过固定化的或细胞定位的或连接的抗-CD3-抗体，导致与T细胞受体的接合类似的T细胞活化，但是独立于其克隆典型特异性。在一个实施方案中，所述CD3-结合结构域单价地和特异性地结合CD3抗原，并且衍生自OKT3(ORTHOCLONE-OKT3TM(莫罗单抗-CD3)；人源化的OKT3(美国专利号7,635,475和公开的国际申请号WO2005040220)；SP34(Pessano等人.The EMBO Journal.4:337-344,1985)；SP34的人源化变体(WO2015001085)；替利珠单抗TM(MGA031,Eli Lilly)；在US2011/0275787中描述的抗-CD3结合分子；UCHT1(Pollard等人.1987 J Histochem Cytochem.35(11):1329-38；WO2000041474)；NI0401(WO2007/033230)；维西珠单抗(美国专利号5,834,597)；BC-3(Anasetti等人,Transplantation 54:844(1992)；H2C(描述在PCT公开号WO2008/119567)；V9(描述在Rodrigues等人,Int J Cancer Suppl 7,45-50(1992)和美国专利号6,054,297))。其它抗-CD3抗体也可以用在本文提供的构建体中，包括在国际公开的PCT申请号WO199404679、WO2008119567、WO2015095392、WO2016204966、WO2019133761、公开的专利申请号US20170369563、US20180194842、US20180355038、美国专利号7,728,114、7,381,803、7,994,289中描述的任一种。
在某些实施方案中，所述CD3-结合结构域含有在SEQ ID NO:19中所示的可变重(VH)链和/或在SEQ ID NO:20中所示的可变轻链，或与这些序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％同一性的VH和/或VL序列，并特异性地结合CD3。在某些实施方案中，所述CD3-结合结构域含有在SEQ ID NO:19中所示的可变重(VH)链的CDRH1、CDRH2和CDRH3以及在SEQ ID NO:20中所示的可变轻链的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在某些情况下，所述CD3-结合区域包含在SEQ ID NO:209中所示的VH序列的人源化形式和在SEQ ID NO:210中所示的VL序列的人源化形式。在某些实施方案中，CD3-结合区域可以含有在SEQ ID NO 21、22、23中的任一个中所示的人源化的OKT3衍生的VH结构域序列和/或在SEQ ID NO 24、25、26中的任一个中所示的VL结构域序列，或与这些序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％同一性的VH和/或VL序列，并特异性地结合CD3。在某些实施方案中，所述CD3-结合结构域是Fab、scFv、Fv或dsFv，其中含有以上VH和VL序列的任意组合，特别是在SEQ ID NO:21、22、23中的任一个中所示的VH序列和在SEQ ID NO:24、25、26中的任一个中所示的VL序列的任意组合。
在某些实施方案中，所述抗-CD3ε结合结构域包括：VH CDR1序列，其至少包括氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:29)；VH CD2序列，其至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:30)；VH CDR3序列，其至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:31)；VL CDR1序列，其至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:32)；VL CDR2序列，其至少包括氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:33)；和VL CDR3序列，其至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:34)。在某些实施方案中，所述CD3-结合结构域是Fab、scFv、Fv或dsFv，其中含有VH CDR1序列，其至少包括氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:29)；VH CD2序列，其至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:30)；VH CDR3序列，其至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:31)；VL CDR1序列，其至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:32)；VL CDR2序列，其至少包括氨基酸序列GTNKRAP(SEQ IDNO:33)；和VL CDR3序列，其至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:34)。
在某些实施方案中，所述CD3-结合结构域含有在SEQ ID NO:27中所示的可变重(VH)链和/或在SEQ ID NO:28中所示的可变轻链，或与这些序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％同一性的VH和/或VL序列，并特异性地结合CD3。在某些实施方案中，所述CD3-结合结构域含有在SEQ ID NO:27中所示的可变重(VH)链的CDRH1、CDRH2和CDRH3以及在SEQ ID NO:28中所示的可变轻链的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在某些实施方案中，所述CD3-结合结构域含有分别在SEQ ID NO:29、30和31中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3以及分别在SEQ ID NO:32、33和34中所示的可变轻链的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在某些情况下，所述CD3-结合区域包含在SEQ ID NO:27中所示的VH序列的人源化形式和在SEQ ID NO:28中所示的VL序列的人源化形式。在某些实施方案中，CD3-结合区域可以含有在SEQ ID NO 35-65中的任一个中所示的人源化的VH结构域序列和/或在SEQ ID NO:66-84中的任一个中所示的VL结构域序列，或与这些序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％同一性的VH和/或VL序列，并特异性地结合CD3。在某些实施方案中，所述抗-CD3ε结合结构域包括含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的可变重链(Hv)和含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的可变轻链(Lv)。
在某些实施方案中，所述CD3-结合结构域是Fab、scFv、Fv或dsFv，其中含有以上VH和VL序列的任意组合，特别是在SEQ ID NO:35-65中的任一个中所示的VH序列和在SEQ IDNO:66-84中的任一个中所示的VL序列的任意组合。在某些实施方案中，所述抗-CD3结合结构域是Fab、scFv、Fv或dsFv，其中含有包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在某些实施方案中，所述CD3-结合结构域含有在SEQ ID NO:313、314、317或318中的任一个中所示的可变重(VH)链。在某些实施方案中，所述CD3-结合结构域含有在SEQ IDNO:315、316、319或320中的任一个中所示的可变轻(VL)链。
所提供的双特异性构建体可以以许多形式中的任一种形成，所示形式含有至少一个PD-1 VHH结构域和至少一个对活化性T细胞抗原具有特异性的另外结构域，诸如CD3-结合结构域。
在一个实施方案中，所述双特异性构建体是含有至少一个所述的PD-1VHH结构域的双特异性单结构域抗体-连接的Fab(S-Fab)，所述PD-1 VHH结构域直接地或间接地连接至对T细胞活化抗原(例如CD3)具有特异性的Fab抗原结合片段(诸如抗-CD3 Fab)。针对T细胞活化抗原的Fab，例如抗-CD3 Fab，可以含有所述的VH和VL序列中的任一种。在某些实施方案中，所述PD-1 VHH结构域连接至抗-CD3 Fab的VH或VL链的C-端。在某些实施方案中，所述S-Fab可以进一步被修饰，诸如通过缀合聚乙二醇(PEG)、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物、蛋白(诸如白蛋白)、聚谷氨酸或PAS化(PASylation)(Pan等人(2018)International Journal of Nanomedicine,2018:3189-3201)。
在另一个实施方案中，所述双特异性构建体是scFv-单结构域抗体，其中所述构建体含有至少一个所述的PD-1 VHH，所述PD-1 VHH直接地或间接地连接至含有对T细胞活化抗原(例如CD3)具有特异性的VH和VL抗原结合结构域的scFv。针对T细胞活化抗原的scFv，例如抗-CD3 scFv，可以含有所述的VH和VL序列中的任一种。在某些实施方案中，所述VHH结构域和所述scFv通过接头(诸如肽接头)连接。在某些实施方案中，所述肽接头可以是如本文中所述的肽接头。在某些实施方案中，所述VHH结构域和所述scFv各自任选地通过铰链区或接头(例如肽接头)连接至Fc区，诸如Fc区的N-端。Fc区可以是本文描述的任一种，诸如人Fc区或其变体，例如人IgG1 Fc区或其变体。在特定实施例中，Fc区由变体Fc结构域(例如变体人IgG1结构域)形成，所述变体Fc结构域被突变或修饰以促进异源二聚化，其中不同的多肽可以二聚化以产生异源二聚体。
在另一个实施方案中，所述CD3-结合结构域是单结构域抗体，诸如是特异性地结合CD3的VHH结构域。单结构域抗体(包括结合CD3的VHH结构域)是已知的，参见例如公开的美国专利申请号US20160280795。在某些实施方案中，所述CD3-结合结构域是在SEQ ID NO:85中所示的抗-CD3 VHH，或与SEQ ID NO:85表现出至少60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％同一性的序列，并特异性地结合CD3。在这样的方面，本文提供的双特异性构建体可以包括至少一个PD-1 VHH结构域和至少一个CD3 VHH结构域。为了形成构建体，在某些情况下，将每个VHH结构域任选地通过铰链区或接头(例如肽接头)连接至Fc区，诸如Fc区的N-端。Fc区可以是本文描述的任一种，诸如人Fc区或其变体，例如人IgG1 Fc区或其变体。在特定实施例中，Fc区由变体Fc结构域(例如变体人IgG1结构域)形成，所述变体Fc结构域被突变或修饰以促进异源二聚化，其中不同的多肽可以二聚化以产生异源二聚体。
在以上实施方案中，促进异源二聚化的Fc区的示例性修饰是已知的，包括如下例如表3所述的任一种。在某些实施方案中，异源二聚体Fc的一个Fc多肽包含在SEQ ID NO:103、107、115或117中的任一个中所示的氨基酸序列，且异源二聚体Fc的其它Fc多肽含有在SEQ ID NO:104、108、111、113、119或121中的任一个中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，异源二聚体Fc的一个Fc多肽包含在SEQ ID NO:105、109、116或118中的任一个中所示的氨基酸序列，且异源二聚体Fc的其它Fc多肽包含在SEQ ID NO:106、110、112、114、120或122中的任一个中所示的氨基酸序列。
2.受限制的CD3多特异性构建体
在某些实施方案中，所述PD-1-结合多肽是多特异性多肽构建体，其为受限制的结合T-细胞的融合蛋白。在特定方面，本文提供的受限制的多特异性构建体结合活化性T细胞抗原，诸如CD3，和PD-1。通常，所提供的受限制的多特异性多肽构建体还含有至少一个抗原结合结构域，其结合肿瘤相关抗原(TAA)。本文提供的受限制的多特异性多肽构建体至少包括：包括免疫球蛋白Fc区的第一组分，包括至少一个结合CD3的结合结构域(在本文中被称作抗-CD3结合结构域或CD3结合结构域，它们是在本文中可互换地使用的术语)的一个或多个拷贝的第二组分，和连接所述第一组分和所述第二组分的接头，诸如多肽接头。在所提供的多特异性多肽构建体中，所述第一组分和第二组分中的一个或两个含有至少一个所提供的结合PD-1的VHH结构域，且所述第一组分和第二组分中的一个或两个含有至少一个TAA抗原结合结构域，其当在结合抗原后接合时，使得受限的CD3结合区域基本上能够结合CD3。
在某些实施方案中，本文提供的受限制的多特异性多肽构建体在结合CD3和随后活化T-细胞的能力方面以两种状态存在：(1)当不存在任何或所有抗原结合结构域与PD-1的结合时，发生“无活性的”状态，使得CD3结合受到限制且T-细胞相互作用被避免或减少，和(2)在任何或所有抗原结合结构域结合抗原后发生“活性”状态，使得CD3结合区域能够结合CD3并允许T-细胞相互作用。
在某些实施方案中，所述Fc区通过一个或多个接头连接至CD3结合结构域。在某些实施方案中，所述Fc区通过不可切割的一个或多个接头连接至CD3结合区域。在某些实施方案中，所述Fc区通过可切割的接头或在其它方面不稳定的一个或多个接头连接至CD3结合区域。在某些实施方案中，可切割的接头是在有蛋白酶存在下可以特异性地切割的接头。在某些方面，在可切割的接头的切割后发生增强的CD3结合。在某些这样的方面，通过几种机制可以进一步放大“活性”状态，包括通过连接CD3结合区域和Fc区的接头的切割。在某些实施方案中，所述可切割的接头是含有蛋白酶的底物识别位点的接头。在某些实施方案中，其中所述Fc区和所述CD3结合区域通过可切割的接头连接，在接头内切割后可以发生增强的CD3结合。
进一步，在其中Fc区和CD3结合区域通过可切割的接头可操作地连接的方面，在Fc区和CD3结合区域之间的接头的切割可以将受限制的多特异性多肽构建体分成第一组分和第二组分。取决于受限制的多特异性多肽构建体的组成，第一组分和第二组分可以具有不同的功能性。在某些实施方案中，所述Fc区是表现出一种或更多种效应子功能(诸如ADCC、CDC或ADCP功能)的区域。在这样的实施例中，本公开内容的受限制的多特异性多肽构建体可以用于生产自放大系统。例如，在某些方面，蛋白酶可切割的接头在Fc和CD3结合结构域的组分之间的掺入，能够通过允许CD3结合结构域的完全暴露而放大T-细胞活化能力。取决于包括的具体接头，放大步骤可以由肿瘤相关的蛋白酶或由抗原依赖性的T-细胞活化后释放的粒酶介导。如果包括肿瘤蛋白酶可切割的接头，所述放大由肿瘤或肿瘤-微环境介导。然而，如果包括粒酶B可切割的接头，所述放大可以是在抗原依赖性活化后由T-细胞自介导。此外，在其中在构建体中包括效应子实现的Fc的情况下，放大可以由从NK细胞释放的粒酶介导，所述释放通过ADCC机制发生。
所提供的受限制的多特异性多肽构建体包括这样的构型：其中含有Fc区的第一组分是在含有CD3结合区域的第二组分的N-端。在这样的一个实施方案中，第一组分和第二组分通过接头连接，所述接头是在Fc区的末端的C-端。在某些实施方案中，所述至少一个PD-1VHH结构域位于多特异性多肽构建体的氨基端(N-端)区域上。在某些实施方案中，所述至少一个PD-1 VHH结构域位于多特异性多肽构建体的羧基端(C-端)区域上。在某些实施方案中，所述受限制的多特异性多肽构建体含有仅一个PD-1 VHH结构域，其位于多特异性多肽构建体的N-或C-端区域上。在某些实施方案中，至少一个TAA抗原结合结构域位于多特异性多肽构建体的氨基端(N-端)区域上。在某些实施方案中，所述至少一个TAA抗原结合结构域位于多特异性多肽构建体的羧基端(C-端)区域上。在某些实施方案中，所述受限制的多特异性多肽构建体含有至少两个TAA抗原结合结构域，其位于多特异性多肽构建体的N-和C-端区域上。
在某些实施方案中，所述受限制的多特异性多肽构建体是二聚体，其中通过两个多肽链之间的共价或非共价相互作用而形成二聚化。在某些实施方案中，所述两个多肽链通过例如链间二硫键彼此共价键合。在某些实施方案中，所述Fc区通过链间二硫键介导二聚化。在特定实施方案中，受限制的多特异性多肽构建体含有异源二聚体Fc区，其中，在某些情况下，多特异性多肽构建体的多肽链是不同的(异源二聚体)。在异源二聚体多特异性多肽构建体的特定实施例中，CD3-结合区域是含有VH和VL链的双链多肽，诸如是含有VH和VL的Fv抗体片段。在某些实施方案中，所述Fv抗体片段包括二硫键稳定化的抗-CD3结合Fv片段(dsFv)。
在某些实施方案中，受限制的多特异性多肽构建体从两个多肽形成或包括两个多肽，包括：第一多肽，其包含异源二聚体Fc区的第一Fc多肽、接头(例如可切割的或不可切割的接头)、抗-CD3抗体或抗原结合片段(例如Fv)的VH结构域；和第二多肽，其包含异源二聚体Fc区的第二Fc多肽、接头(例如可切割的或不可切割的接头)、抗-CD3抗体或抗原结合片段(例如Fv)的VL结构域。在某些实施方案中，所述第一多肽含有一个或两个结合PD-1的VHH结构域。在某些实施方案中，所述第二多肽含有一个或两个结合PD-1的VHH结构域。在某些实施方案中，受限制的多特异性多肽构建体含有仅一个PD-1 VHH结构域。在某些实施方案中，所述第一多肽含有一个或两个TAA抗原结合结构域。在某些实施方案中，所述第二多肽含有一个或两个TAA抗原结合结构域。在某些实施方案中，受限制的多特异性多肽构建体含有至少两个TAA抗原结合结构域。在某些情况下，至少一个TAA抗原结合结构域位于Fc多肽的N-端，且至少一个TAA抗原结合结构域位于CD3-结合区域的链的C-端。在特定实施方案中，所述至少一个结合PD-1的VHH结构域是在异源二聚体分子的单独多肽上，所述单独多肽不同于含有最后至少一个(例如两个)TAA抗原结合结构域的多肽。
在某些实施方案中，受限制的多特异性多肽构建体含有至少两个TAA抗原结合结构域和至少一个结合PD-1的VHH结构域。在某些实施方案中，受限制的多特异性多肽构建体含有(1)第一多肽，其按N-端至C-端的顺序包含：第一TAA抗原结合结构域、异源二聚体Fc区的第一Fc多肽、接头(例如可切割的或不可切割的接头)、抗-CD3抗体或抗原结合片段(例如Fv或dsFv)的链(例如VH或VL)和第二TAA抗原结合结构域；和(2)第二多肽，其按N-端至C-端的顺序包含：异源二聚体Fc区的第二Fc多肽、相同接头(例如相同的可切割的或不可切割的接头)、抗-CD3抗体或抗原结合片段的其它链(VH或VL中的另一个)和结合PD-1的VHH结构域。在某些实施方案中，受限制的多特异性多肽构建体含有(1)第一多肽，其按N-端至C-端的顺序包含：第一TAA抗原结合结构域、异源二聚体Fc区的第一Fc多肽、接头(例如可切割的或不可切割的接头)、抗-CD3抗体或抗原结合片段(例如Fv或dsFv)的链(例如VH或VL)和第二TAA抗原结合结构域；和(2)第二多肽，其按N-端至C-端的顺序包含：结合PD-1的VHH结构域、异源二聚体Fc区的第二Fc多肽、相同接头(例如相同的可切割的或不可切割的接头)和抗-CD3抗体或抗原结合片段的其它链(VH或VL中的另一个)。
在某些实施方案中，所述第一多肽或第二多肽或第一多肽和第二多肽二者进一步包括结合共刺激性受体的共刺激性受体结合区域(CRBR)。在某些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽的CRBR可以位于Fc多肽的N-端和/或CD3-结合区域的链的C-端。
在某些实施方案中，受限制的多特异性多肽构建体含有至少两个结合TAA的抗原结合结构域、一个结合共刺激性受体的共刺激性受体结合区域(CRBR)和一个结合PD-1的VHH结构域。在某些实施方案中，受限制的多特异性多肽构建体含有(1)第一多肽，其按N-端至C-端的顺序包含：第一TAA抗原结合结构域、异源二聚体Fc区的第一Fc多肽、接头(例如可切割的接头)、抗-CD3抗体或抗原结合片段(例如Fv或dsFv)的链(例如VH或VL)和第二TAA抗原结合结构域；和(2)第二多肽，其按N-端至C-端的顺序包含：结合PD-1或CRBR的VHH结构域之一、异源二聚体Fc区的第二Fc多肽、相同接头(例如相同的可切割的接头)、抗-CD3抗体或抗原结合片段的其它链(VH或VL中的另一个)和结合PD-1或CRBR的VHH结构域中的另一个。
在下面更详细地描述本公开内容的多特异性多肽构建体的每种组分。
a.抗原结合结构域
本公开内容的多特异性多肽构建体包括至少一个抗原结合结构域，诸如至少第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域。在某些方面，所述抗原结合结构域，或独立地每个抗原结合结构域，选自抗体或抗原结合片段、天然的(或自然的)同源结合配偶体、Anticalin(经工程改造的脂质运载蛋白)、Darpin、Fynomer、Centyrin(经工程改造的fibroneticin III结构域)、胱氨酸-结结构域、Affilin、Affibody或经工程改造的CH3结构域。在某些实施方案中，所述天然同源结合配偶体包含TAA的天然同源结合配偶体的细胞外结构域或其结合片段，或其表现出对TAA的结合活性的变体。
在某些实施方案中，所述抗原结合结构域，或独立地每个抗原结合结构域，诸如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，包括抗体或其抗原结合片段的一个或多个拷贝。在某些实施方案中，所述抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域，诸如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，包括选自以下的抗体或其抗原结合片段的一个或多个拷贝：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
在某些实施方案中，所述抗原结合结构域，或独立地每个抗原结合结构域，诸如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，是单链抗体。在某些实施例中，所述单链是scFv、scAb、单结构域重链抗体或单结构域轻链抗体。
在某些实施方案中，所述抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域，诸如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，包括一个或更多个单结构域抗体(sdAb)片段，例如VHH、VNAR、经工程改造的VH或VK结构域。VHH可以从天然的骆驼科仅重链抗体、生产仅重链抗体的遗传修饰的啮齿类动物或原初的/合成的骆驼科或人源化骆驼科单结构域抗体文库产生。VNAR可以从软骨鱼仅重链抗体产生。已经实现多种方法从常规异源二聚体VH和VK结构域产生单体sdAb，包括界面工程和特定种系家族的选择。
在某些实施方案中，多特异性多肽构建体的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域(诸如第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域)含有至少一个结合TAA的sdAb或scFv。在某些实施方案中，所述至少一个结合TAA的scFv或sdAb位于多特异性多肽构建体的相对于Fc区的氨基端和/或相对于CD3结合区域的羧基端。在某些实施方案中，所述多特异性多肽构建体含有仅一个结合TAA的scFv或sdAb，其可以位于相对于Fc区的氨基端和/或相对于CD3结合区域的羧基端。在某些实施方案中，所述多特异性多肽构建体含有两个结合TAA的scFv或sdAb，位于相对于Fc区的氨基端和/或相对于CD3结合区域的羧基端。在某些实施方案中，所述多特异性多肽构建体含有三个scFv或sdAb，其中两个位于相对于Fc区的氨基端或相对于CD3结合区域的羧基端，且第三个位于多特异性多肽构建体的另一端。
在某些实施方案中，所述多特异性多肽构建体从两个多肽形成或包括两个多肽，包括：第一多肽，其包含异源二聚体Fc区的第一Fc多肽、接头、抗-CD3抗体或抗原结合片段(例如Fv)的VH结构域和结合肿瘤相关抗原的scFv或sdAb；和第二多肽，其包含异源二聚体Fc区的第二Fc多肽、接头、抗-CD3抗体或抗原结合片段(例如Fv)的VL结构域和任选的相同的或不同的结合肿瘤相关抗原的scFv或sdAb。结合TAA的scFv或sdAb可以位于相对于异源二聚体Fc的Fc多肽的氨基端和/或相对于CD3结合区域的VH或VL链的羧基端。多特异性多肽构建体的第一多肽和/或第二多肽中的至少一个也包括结合PD-1的VHH结构域，诸如在本公开内容中所述的任一种。在某些方面，多特异性多肽构建体的第一多肽和/或第二多肽中的至少一个还可以包括所述的结合共刺激受体的CRBR或其链。
在某些实施方案中，多特异性多肽构建体的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域(诸如第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域)含有作为单结构域抗体(sdAb)的结合结构域。
在某些实施方案中，所述抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域，诸如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，含有超过一个链。在某些实施方案中，多特异性多肽构建体的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域(诸如第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域)含有组装为FAB的VH和VL序列。
在某些实施方案中，多特异性多肽构建体的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域(诸如第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域)含有结合TAA的Fab抗体的VH-CH1(Fd)和VL-CL。在某些实施方案中，含有VH-CH1(Fd)和VL-CL的Fab抗体位于多特异性多肽构建体的相对于Fc区的氨基端和/或相对于CD3结合区域的羧基端。在某些实施方案中，所述多特异性多肽构建体含有仅一个Fab抗体，其含有结合TAA的VH-CH1(Fd)和VL-CL，其可以位于相对于Fc区的氨基端和/或相对于CD3结合区域的羧基端。在某些实施方案中，所述多特异性多肽构建体含有两个Fab抗体片段，每个含有结合TAA的VH-CH1(Fd)和VL-CL，其中一个位于相对于Fc区的氨基端且另一个位于相对于CD3结合区域的羧基端。
在某些实施方案中，所述多特异性多肽构建体从三个或更多个多肽形成或包括三个或更多个多肽，包括：第一多肽，其包含异源二聚体Fc区的第一Fc多肽、接头和结合肿瘤相关抗原的Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL；第二多肽，其包含异源二聚体Fc区的第二Fc多肽、接头和任选的相同的结合肿瘤相关抗原的Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL；和第三多肽，其包含结合TAA的Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一个。
在某些实施方案中，所述抗原结合结构域，或独立地每个抗原结合结构域，是或包括TAA的天然(或自然)同源结合配偶体的细胞外结构域或其结合片段，或其表现出对TAA的结合活性的变体。
在某些实施方案中，所述抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域，诸如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，结合相同的抗原。在某些实施方案中，存在超过一个结合TAA的抗原结合结构域，且每个抗原结合结构域，诸如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，结合不同的抗原。在某些实施方案中，每个抗原结合结构域，诸如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，结合相同的肿瘤相关抗原(TAA)。在某些实施方案中，每个抗原结合结构域，诸如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，结合不同的TAA。在某些实施方案中，每个抗原结合结构域，诸如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，结合相同TAA上的不同表位。在某些实施方案中，每个抗原结合结构域，诸如第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，结合相同TAA上的相同表位。
在某些实施方案中，所述抗原结合结构域，或独立地每个结合TAA的抗原结合结构域，导致与TAA的单价、二价、三价或四价结合。
在某些实施方案中，所述TAA选自：1-92-LFA-3、5T4、α-4整联蛋白、α-V整联蛋白、α4β1整联蛋白、α4β7整联蛋白、AGR2、抗-Lewis-Y、Apelin J受体、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5补体、C-242、CA9、CA19-9、(Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5(CEA)、CEACAM6(NCA-90)、封闭蛋白-3、封闭蛋白-4、cMet、胶原、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、内皮缩血管肽B受体(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV的F蛋白、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、叶酸盐受体α(FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、透明质酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受体(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R(wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰岛素受体、Jagged配体、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、间皮素、MRP4、MUC1、粘蛋白-16(MUC16、CA-125)、Na/K ATP酶、NGF、Nicastrin、Notch受体、Notch1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂酰-丝氨酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、鞘氨醇1磷酸酯、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、转铁蛋白、转铁蛋白受体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2和WISP-3。
在某些实施方案中，至少一个抗原结合结构域，或独立地每个抗原结合结构域，结合肿瘤相关抗原(TAA)叶酸盐受体α(FRα)。例如，抗原结合结构域含有结合结构域作为结合FRα的sdAb。示例性的结合FRα的sdAb如在SEQ ID NO:86、87或88中所示。在所提供的多特异性多肽构建体中的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域可以与任何前述SEQ IDNo具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合FRα。
在某些实施方案中，至少一个抗原结合结构域，或独立地每个抗原结合结构域，结合肿瘤相关抗原(TAA)cMET。例如，抗原结合结构域含有结合结构域作为结合cMET的sdAb。示例性的结合cMET的sdAb如在SEQ ID NO:89(美国专利号9,346,884)中所示。在所提供的多特异性多肽构建体中的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域可以与前述SEQID No具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合cMET。
在某些实施方案中，至少一个抗原结合结构域，或独立地每个抗原结合结构域，结合肿瘤相关抗原(TAA)B7H3。例如，抗原结合结构域含有结合结构域作为结合B7H3的scFv。在某些实施方案中，所述抗原结合结构域是或含有包含VH-CH1(Fd)和LC的Fab抗体片段。示例性的B7H3 Fd描述在PCT公开号WO2017/030926中。
在某些实施方案中，至少一个抗原结合结构域，或独立地每个抗原结合结构域，结合肿瘤相关抗原(TAA)CD20。例如，抗原结合结构域含有结合结构域作为结合CD20的scFv。示例性的结合CD20的scFv如在SEQ ID NO:90中所示，或含有在SEQ ID NO:91和92中所示的VL和VH(美国公开号US 2005/0123546)。在所提供的多特异性多肽构建体中的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域可以与前述SEQ ID NO中的任一个具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合CD20。
在某些实施方案中，至少一个抗原结合结构域，或独立地每个抗原结合结构域，结合肿瘤相关抗原(TAA)DLL3。例如，抗原结合结构域含有结合结构域作为结合DLL3的scFv。示例性的结合DLL3的scFv如在SEQ ID NO:93和94中所示(美国公开号US 2017/0037130)。在某些实施方案中，所述抗原结合结构域是或含有Fab抗体片段，其包含结合DLL3的Fd和LC。示例性的DLL3 Fd如在SEQ ID NO:95中所示，且示例性的DLL3 LC如在SEQ ID NO:96中所示(美国专利号US 8,044,178)。在所提供的多特异性多肽构建体中的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域可以与前述SEQ ID NO中的任一个具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合DLL3。
在某些实施方案中，至少一个抗原结合结构域，或独立地每个抗原结合结构域，结合肿瘤相关抗原(TAA)5T4。示例性的5T4 Fd如在SEQ ID NO:97中所示，且示例性的5T4 LC如在SEQ ID NO:98中所示。在某些实施方案中，所述抗体结合结构域包含在SEQ ID NO:99和100中所示的VH和VL(美国专利号US 8,044,178)。在所提供的多特异性多肽构建体中的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域可以与前述SEQ ID NO中的任一个具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合5T4。
在某些实施方案中，至少一个抗原结合结构域，或独立地每个抗原结合结构域，结合肿瘤相关抗原(TAA)gpNMB。在某些实施方案中，所述抗原结合结构域是或含有Fab片段，其包含Fd和LC链。示例性的gpNMB Fd如在SEQ ID NO:101中所示，且示例性的gpNMB LC如在SEQ ID NO:102中所示。在所提供的多特异性多肽构建体中的抗原结合结构域或独立地每个抗原结合结构域可以与前述SEQ ID NO中的任一个具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合gpNMB。
在某些实施方案中，所述抗原结合结构域直接地或通过接头间接地连接至Fc区和/或连接至CD3结合区域。在某些实施方案中，连接是通过接头。在某些实施方案中，所述接头是连接肽(LP)，其可以包括所述的任何柔性的或刚性的接头。在某些实施方案中，所述接头选自：GGSGGS，即，(GGS)2(SEQ ID NO:1)；GGSGGSGGS，即，(GGS)3(SEQ ID NO:2)；GGSGGSGGSGGS，即，(GGS)4(SEQ ID NO:3)；和GGSGGSGGSGGSGGS，即，(GGS)5(SEQ ID NO:4)。在某些实施方案中，所述接头是包含甘氨酸残基的柔性接头，例如，作为非限制性例子，GG、GGG、GGGG(SEQ ID NO:5)、GGGGG(SEQ ID NO:6)和GGGGGG(SEQ ID NO:7)。在某些实施方案中，所述接头包括GS-接头和甘氨酸接头的组合。
b.Fc区
受限制的多特异性多肽构建体包括免疫球蛋白Fc区。通常，受限制的多特异性多肽构建体是由多肽形成的二聚体，每个多肽含有Fc。Fc多肽可以是如上所述的任一种。在特定实施方案中，所述Fc区由Fc结构域形成，所述Fc结构域被突变或修饰以促进异源二聚化，其中不同的多肽可以二聚化以产生异源二聚体。因而，在某些实施方案中，所述二聚体是异源二聚体，其中多特异性多肽构建体的两个多肽链是不同的。
已知多种用于促进互补Fc多肽的异源二聚化的方法，参见例如Ridgway等人,Protein Eng.9:617-621(1996)；Merchant等人,Nat.Biotechnol.16(7):677-81(1998)；Moore等人(2011)MAbs,3:546-57；Von Kreudenstein等人MAbs,(2013)5:646-54；Gunasekaran等人(2010)J.Biol.Chem.,285:19637-46；Leaver-Fay等人(2016)Structure,24:641-51；Ha等人(2016)Frontiers in Immunology,7:1；Davis等人(2010)Protein EngDes Sel,23:195-202；公开的国际PCT申请号WO 1998/050431、WO 2009/089004、WO2011143545 WO 2014/067011、WO 2012/058768、WO2018027025；公开的美国专利申请号US20140363426、US20150307628、US20180016354、US20150239991；和美国专利号US5731168、US7183076、US9701759、US9605084和US9650446。促进Fc链的异源二聚化的方法包括Fc区的诱变，诸如通过包括一组“凸起-进入-孔洞”突变，或包括突变以实现Fc的静电操纵从而有利于不同多肽链之间的吸引力相互作用。例如，在某些实施方案中，异源二聚体的Fc多肽包括突变以改变Fc二聚体界面之间的电荷极性，使得静电匹配的Fc链的共表达支持有利的吸引力相互作用，由此促进期望的Fc异源二聚体形成，而不利的排斥性电荷相互作用遏制不希望的Fc同源二聚体形成(Guneskaran等人(2010)JBC,285:19637-19646)。当在细胞中共表达时，链之间的结合是可能的，但是链由于电荷排斥基本上不会自结合。用于产生异源二聚体Fc的其它策略包括将人IgG和IgA CH3结构域区段混合以产生互补CH3异源二聚体，其被称作SEED Fc。
在某些实施方案中，为了促进异源二聚化，Fc异源二聚体的两个多肽含有配对的或互补的氨基酸修饰。Fc融合体的多肽的示例性的配对的氨基酸修饰如在表3中所示。
Figure BDA0003110879870000541
Figure BDA0003110879870000551
在某些实施方案中，修饰包括突出物(凸起)向第一Fc多肽中的引入和腔体(孔洞)向第二Fc多肽中的引入，使得突出物可定位在腔体中以促进第一和第二含Fc的多肽的络合。为了在多肽中产生突出物或腔体被替换和/或修饰靶向的氨基酸通常是界面氨基酸，其与第二多肽的界面中的一个或多个氨基酸相互作用或接触。
在某些实施方案中，被修饰成含有突出物(孔洞)氨基酸的第一Fc多肽包括用特定氨基酸替换天然或原始氨基酸，所述特定氨基酸具有至少一个从第一Fc多肽的界面伸出的侧链，且因此可定位在第二多肽的邻近界面中的互补腔体(孔洞)中。绝大多数情况下，替换氨基酸是具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸。本领域技术人员知道如何确定和/或评估氨基酸残基的性能以鉴别作为建立突出物的理想替换氨基酸的那些。在某些实施方案中，用于形成突出物的替换残基是天然存在的氨基酸残基，且包括，例如，精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)。在某些实施例中，为替换鉴别的原始残基是具有小侧链的氨基酸残基，例如，丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
在某些实施方案中，被修饰成含有腔体(孔洞)的第二Fc多肽是包括用特定氨基酸替换天然或原始氨基酸的Fc多肽，所述特定氨基酸具有至少一个从第二多肽的界面凹陷的侧链，且因而能够适应来自第一多肽的界面的相应突出物。绝大多数情况下，替换氨基酸是具有比原始氨基酸残基更小侧链体积的氨基酸。本领域技术人员知道如何确定和/或评估氨基酸残基的性能以鉴别作为形成腔体的理想替换残基的那些。通常，用于形成腔体的替换残基是天然存在的氨基酸残基，且包括，例如，丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。在某些实施例中，为替换鉴别的原始氨基酸是具有大侧链的氨基酸，例如，酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
例如，人IgG1的CH3界面包含位于四个反向平行的β-链上的每个结构域上的十六个残基，其从每个表面埋入10902(参见例如，Deisenhofer等人(1981)Biochemistry,20:2361-2370；Miller等人,(1990)J Mol.Biol.,216,965-973；Ridgway等人,(1996)Prot.Engin.,9:617-621；美国专利号5,731,168)。为了建立突出物或腔体对CH3结构域的修饰描述在，例如，美国专利号5,731,168；国际专利申请WO98/50431和WO 2005/063816；和Ridgway等人,(1996)Prot.Engin.,9:617-621。在某些实施例中，为了建立突出物或腔体对CH3结构域的修饰通常靶向位于两个中央反向平行的β-链上的残基。目的是使以下风险最小化：建立的突出物可以通过伸出到周围溶剂中而适应，而不是通过伸出到配偶体CH3结构域中的互补腔体中而适应。
例如，在某些实施方案中，所述异源二聚体Fc包括在Thr366处具有在CH3结构域内的氨基酸修饰的多肽，其当用更庞大的氨基酸替换时，例如，Try(T366W)，能够优先地与第二个CH3结构域配对，所述第二个CH3结构域具有在位置Thr366、Leu368和Tyr407处向更小体积的氨基酸(例如，分别Ser、Ala和Val)的氨基酸修饰(T366S/L368A/Y407V)。通过引入二硫键，例如通过在相对CH3结构域上将Ser354变成Cys(S354C)和将Tyr349变成Cys(Y349C)，可以进一步稳定化经由CH3修饰的异源二聚化(综述在Carter,2001Journal ofImmunological Methods,248:7-15)。
通过任意合适的方法，例如，通过在蛋白A或蛋白G柱上的亲和色谱法，可以纯化得到的受限制的多特异性多肽构建体。当将编码不同多肽的两个核酸分子转化到细胞中时，会发生同源二聚体和异源二聚体的形成。可以调节表达条件，使得异源二聚体形成优于同源二聚体形成。
基于异源二聚体对亲和试剂的差异亲和力从同源二聚体回收异源二聚体的技术是已知的。在某些方面，这样的技术包括设计异源二聚体，使得Fc多肽链之一不结合亲和试剂蛋白A。在某些情况下，多肽链之一可以含有一个或多个氨基酸置换以消除或降低对Fc异源二聚体的多肽之一中的蛋白A试剂的亲和力，参见例如WO2017134440、WO2010151792、Jendeberg等人(Jendeberg等人,(1997)J.Immunol.Methods,201(1):25-34。在这些实施方案的一些中，可以在异源二聚体的一个成员上的蛋白-A结合位点处修饰Fc区，从而防止蛋白-A结合，并由此能够更有效地纯化异源二聚体融合蛋白。在该结合位点内的示例性修饰是Ile253，例如Ile253Arg(I253R)。在某些实施方案中，所述修饰可以是H435R或H435R/Y436F。在某些实施方案中，Fc异源二聚体的Fc多肽可以含有修饰，使得其能够结合蛋白A但不结合蛋白G(pA+/pG-)。示例性的pA+/pG-氨基酸修饰包括：参考人IgGl在位置428含有丝氨酸、在位置434含有丝氨酸、任选地在位置436含有组氨酸的Fc，或在人IgG 2、3或4中在对应的位置包含这些残基的Fc。在某些方面，在位置428、434和任选的436处在IgG Fc多肽中的这样的氨基酸修饰会减少或阻止蛋白G的结合，从而增强蛋白的纯化。
在某些实施方案中，赋予对亲和试剂的差别亲和力的任何这样的修饰可以与上述的任何一种或多种其它氨基酸修饰组合。例如，可以将I253R修饰与T366S/L368A/Y407V修饰组合，或者与T366W修饰组合。T366S/L368A/Y407V修饰的Fc能够形成同源二聚体，因为不存在二聚化界面的空间阻塞，如T336W修饰的Fc的情况那样。因此，在某些实施方案中，将I253R修饰与T366S/L368A/Y407V修饰的Fc组合以禁止纯化可能已经形成的任何同源二聚体Fc。通过组合T366S/L368A/Y407V和H453R，可以采用类似的修饰。
在某些实施方案中，异源二聚体分子的Fc区另外可以含有一个或多个其它Fc突变，诸如上述的任一种。在某些实施方案中，所述异源二聚体分子含有具有降低效应子功能的突变的Fc区。
在某些实施方案中，异源二聚体Fc的一个Fc多肽包含在SEQ ID NO:103、107、115或117中的任一个中所示的氨基酸序列，且异源二聚体Fc的其它Fc多肽含有在SEQ ID NO:104、108、111、113、119或121中的任一个中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，异源二聚体Fc的一个Fc多肽包含在SEQ ID NO:105、109、116或118中的任一个中所示的氨基酸序列，且异源二聚体Fc的其它Fc多肽包含在SEQ ID NO:106、110、112、114、120或122中的任一个中所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所提供的多特异性多肽构建体的Fc区表现出一种或更多种效应子功能。在某些情况下，所述Fc区能够提供Fc介导的效应子功能，例如，ADCC(例如，NK细胞对粒酶B的释放)、ADCP和/或CDC。一般而言，Fc区负责效应子功能，诸如补体依赖性的细胞毒性(CDC)和抗体依赖性的细胞细胞毒性(ADCC)，以及抗原结合能力，后者是免疫球蛋白的主要功能。另外，通过缀合至体内FcRn受体而增加体内半衰期，存在于Fc区中的FcRn序列起调节血清中的IgG水平的作用。在其中多特异性多肽构建体含有可切割的接头的某些实施方案中，接头的切割可以产生两种各自具有生物活性的组分：CD3-结合区域，其能够结合和接合T细胞上的CD3，其在某些方面也可以含有CRBR(用于诱导T细胞上的共刺激信号)和/或结合PD-1的VHH结构域(用于阻断T细胞上的抑制性信号)；和连接至TAA抗原结合结构域的Fc区，其可以表现出靶标特异性的效应子功能。
在某些实施方案中，所述Fc区包括被突变或修饰以改变一种或更多种效应子功能的Fc多肽。因而，在某些情况下，在用于与所提供的受限制的多特异性多肽构建体一起使用的Fc中，可以改变(例如减弱或增强)效应子功能，诸如ADCC、ADCP和/或CDC中的一种或更多种。减弱效应子功能的示例性突变包括如上所述的任一种。
c.CD3结合结构域
受限制的多特异性多肽构建体包括CD3结合结构域。本公开内容的抗-CD3结合结构域通过接合T细胞上的CD3或CD3复合物的成员而活化T细胞。在优选的实施方案中，本公开内容的抗-CD3结合结构域特异性地结合CD3的ε链，也被称作CD3ε。本公开内容的抗-CD3ε结合结构域通过接合T细胞上的CD3ε而活化T细胞。本公开内容的抗-CD3结合结构域激动、刺激、活化和/或以其它方式增进CD3介导的T细胞活化。CD3的生物活性包括，例如，T细胞活化以及通过CD3与T-细胞受体(TCR)的抗原结合亚基之间的相互作用实现的其它信号传递。例如，通过部分地或完全地调节(例如，激动、刺激、活化或以其它方式增进)CD3介导的T细胞活化，本公开内容的抗-CD3结合结构域通过接合T细胞上的CD3ε而完全地或部分地活化T细胞。
CD3结合结构域可以是如上所述的任一种。在特定实施方案中，所述CD3结合结构域是结合CD3ε的Fv抗体片段(在本文中被称作抗-CD3εFv片段)。在某些实施方案中，所述抗-CD3εFv抗体片段是二硫键稳定化的抗-CD3结合Fv片段(dsFv)。在某些实施方案中，所述抗-CD3结合结构域对于结合CD3而言是单价的。
在某些实施方案中，所述CD3结合区域是含有可变重链(Hv,也称为VH)和可变轻链(Lv,也称为VL)的Fv抗体片段，诸如所述的任一种。在这样的实施方案的方面，免疫球蛋白Fc区是含有两个不同Fc多肽的异源二聚体Fc区，所述Fc多肽能够实现Fc异源二聚体的两个多肽之间的异源二聚体结合，诸如所述的任一种。在这样的实施方案中，CD3结合区域的可变重链(VH)和可变轻链(VL)连接在异源二聚体Fc的相对链上。
在某些实施方案中，所述CD3结合区域是SP34的Fv或dsFv(Pessano等人.The EMBOJournal.4:337-344,1985)或SP34的人源化变体的Fv或dsFv(WO2015001085)。
在某些实施方案中，其抗-CD3ε结合结构域是包括重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列的组合的Fv或dsFv片段。在某些实施方案中，所述CD3-结合结构域是Fv或dsFv片段，其中含有：VH CDR1序列，其至少包括氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:29)；VH CD2序列，其至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:30)；VH CDR3序列，其至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:31)；VL CDR1序列，其至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:32)；VL CDR2序列，其至少包括氨基酸序列GTNKRAP(SEQ IDNO:33)；和VL CDR3序列，其至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:34)。在某些实施方案中，其抗-CD3ε结合结构域是包括选自SEQ ID NO:35-65的重链可变氨基酸序列和选自SEQ ID NO:66-84、285的轻链可变氨基酸序列的Fv或dsFv片段。在某些实施方案中，其抗-CD3ε结合结构域是这样的Fv或dsFv片段：其包括与选自SEQ ID NO:35-65的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的重链可变氨基酸序列和与选自SEQ ID NO:66-84、285的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗-CD3结合结构域是Fv或dsFv，其中含有包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:285的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
d.接头
受限制的多特异性多肽构建体含有接头，所述接头连接或偶联含有免疫球蛋白Fc区的第一组分和含有CD3结合区域的第二组分。在某些实施方案中，所述接头位于Fc区的C-端区域的末端，使得Fc区是在CD3结合区域的N-端。应当理解，因为所提供的受限制的多特异性多肽构建体是多聚体，诸如含有第一多肽和第二多肽(其一起形成第一组分和第二组分)的二聚体，所提供的构建体包括连接第一多肽的Fc部分和CD3结合区域的接头以及连接第二多肽的Fc部分和CD3结合区域的接头。在某些实施方案中，所述第一多肽包括异源二聚体Fc区的第一Fc多肽、接头和CD3结合区域的第一结构域(例如VH)，且所述第二多肽包括异源二聚体Fc区的第二Fc多肽、接头和CD3结合区域的第二结构域(例如VL)。通常，存在于受限制的多特异性多肽构建体的第一多肽和第二多肽中的接头是相同的。因而，在某些实施方案中，CD3结合结构域的每个结构域通过接头(诸如相同接头)连接至Fc(诸如异源二聚体Fc)的相对多肽。
用于用在融合蛋白中的多种多肽接头是已知的(参见例如Chen等人(2013)Adv.Drug.Deliv.65:1357-1369；和国际PCT公开号WO 2014/099997,WO2000/24884；美国专利号5,258,498；美国专利号5,525,491；美国专利号5,525,491,美国专利号6,132,992)。
在某些实施方案中，选择接头，使得当CD3结合区域连接至多特异性多肽缀合物的Fc区时，CD3结合区域被限制并且在多特异性多肽构建体与细胞接触后不能或基本上不能结合或接合在细胞(例如T细胞)的表面上的CD3。可以使用多种测定法来评估多特异性多肽构建体对CD3的结合或接合，包括评估T细胞结合、使用报道系统的NFAT活化、细胞裂解性T细胞活性、细胞因子产生和/或T细胞活化标志物的表达的测定法。在提供的实施例中显示了示例性测定。通常，接头也是确保多肽构建体的正确折叠的接头，不会显示与所连接多肽的活性或功能不一致的电荷，也不会与一个或更多个结构域中的氨基酸残基形成会阻碍或改变所连接多肽的活性的键或其它相互作用。在某些实施方案中，所述接头是多肽接头。所述多肽接头可以是柔性接头或刚性接头或二者的组合。在某些方面，所述接头是短、中或长接头。在某些实施方案中，所述接头是至多40个氨基酸的长度。在某些实施方案中，所述接头是至多25个氨基酸的长度。在某些实施方案中，所述接头是至少或是至少约2个氨基酸的长度。在某些方面，合适的长度是，例如，至少一个且通常小于约40个氨基酸残基的长度，诸如2-25个氨基酸残基、5-20个氨基酸残基、5-15个氨基酸残基、8-12个氨基酸。在某些实施方案中，所述接头是从或从约2至24个氨基酸、2至20个氨基酸、2至18个氨基酸、2至14个氨基酸、2至12个氨基酸、2至10个氨基酸、2至8个氨基酸、2至6个氨基酸、6至24个氨基酸、6至20个氨基酸、6至18个氨基酸、6至14个氨基酸、6至12个氨基酸、6至10个氨基酸、6至8个氨基酸、8至24个氨基酸、8至20个氨基酸、8至18个氨基酸、8至14个氨基酸、8至12个氨基酸、8至10个氨基酸、10至24个氨基酸、10至20个氨基酸、10至18个氨基酸、10至14个氨基酸、10至12个氨基酸、12至24个氨基酸、12至20个氨基酸、12至18个氨基酸、12至14个氨基酸、14至24个氨基酸、14至20个氨基酸、14至18个氨基酸、18至24个氨基酸、18至20个氨基酸或20至24个氨基酸。在某些实施方案中，所述接头是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度。
在某些方面，当多特异性多肽缀合物结合至其抗原(例如TAA)时，接头长度越长，CD3结合越大。因而，在某些方面，所述接头是大于12个氨基酸的长度，诸如大于13、14、15、16、17或18个氨基酸的长度。在某些实施方案中，所述接头是12至40个氨基酸的长度，12至30个氨基酸、12至24个氨基酸、12至18个氨基酸、12至15个氨基酸、15至40个氨基酸、15至30个氨基酸、15至24个氨基酸、15至18个氨基酸、18至40个氨基酸、18至30个氨基酸、18至24个氨基酸、24至40个氨基酸、24至30个氨基酸或30至40个氨基酸。
所述接头可以是天然存在的、合成的或二者的组合。特别合适的接头多肽主要包括选自甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)和苏氨酸(Thr)的氨基酸残基。例如，所述接头可以含有至少75％(基于存在于肽接头中的残基的总数来计算)诸如至少80％、至少85％或至少90％的选自Gly、Ser、Ala和Thr的氨基酸残基。所述接头也可以仅由Gly、Ser、Ala和/或Thr残基组成。在某些实施方案中，所述接头含有1-25个甘氨酸残基、5-20个甘氨酸残基、5-15个甘氨酸残基或8-12个甘氨酸残基。在某些方面，合适的肽接头通常含有至少50％的甘氨酸残基，诸如至少75％的甘氨酸残基。在某些实施方案中，肽接头仅包含甘氨酸残基。在某些实施方案中，肽接头仅包含甘氨酸和丝氨酸残基。
在某些实施方案中，这些接头主要由氨基酸甘氨酸和丝氨酸组成，在本文中表示为GS-接头。在某些实施方案中，所述接头含有(GGS)n，其中n是1至10，诸如1至5，例如1至3，诸如GGS(GGS)n(SEQ ID NO:123)，其中n是0至10。在特定实施方案中，所述接头含有序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:123)，其中n是1至10或n是1至5，诸如1至3。在其它实施方案中，所述接头含有(GGGGGS)n(SEQ ID NO:124)，其中n是1至4，诸如1至3。所述接头可以包括以上任意的组合，诸如可以组合2、3、4或5个GS、GGS、GGGGS和/或GGGGGS接头的重复序列。在某些实施方案中，这样的接头是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸的长度。
在某些实施方案中，所述接头是(以单字母氨基酸代码)：GGS、GGGGS(SEQ ID NO:125)或GGGGGS(SEQ ID NO:126)。在某些实施方案中，所述GS-接头包含以下氨基酸序列：GGSGGS，即，(GGS)2(SEQ ID NO:1)；GGSGGSGGS，即，(GGS)3(SEQ ID NO:2)；GGSGGSGGSGGS，即，(GGS)4(SEQ ID NO:3)；GGSGGSGGSGGSGGS，即，(GGS)5(SEQ ID NO:4)；GGGGGSGGGGGSGGGGGS，即，(G5S)3(SEQ ID NO:127),GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:129)和GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:128)。在某些实施方案中，所述接头是GGGG(SEQ ID NO:5)。在以上实施例中的任何一些中，可以用丙氨酸替换丝氨酸(例如，(Gly4Ala)或(Gly3Ala))。
在某些实施方案中，所述接头包括具有氨基酸序列GlyxXaa-Glyy-Xaa-Glyz(SEQID NO:130)的肽接头，其中每个Xaa独立地选自丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸盐(Asp)和谷氨酸盐(Glu)，且其中x、y和z各自是在1-5范围内的整数。在某些实施方案中，每个Xaa独立地选自Ser、Ala和Thr。在一个具体的变体中，x、y和z中的每一个等于3(由此产生具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:131)的肽接头，其中每个Xaa如上选择。
在某些实施方案中，所述接头是基于(SSSSG)y(SEQ ID NO:132)基序的重复的富含丝氨酸的接头，其中y至少是1，尽管y可以是2、3、4、5、6、7、8和9。
在某些情况下，可能合乎需要的是，在肽接头中提供某种刚度。这可以通过在肽接头的氨基酸序列中包括脯氨酸残基来实现。因此，在某些实施方案中，接头在肽接头的氨基酸序列中包含至少一个脯氨酸残基。例如，肽接头可以具有这样的氨基酸序列，其中至少25％(例如，至少50％或至少75％)的氨基酸残基是脯氨酸残基。在一个特定实施方案中，所述肽接头仅包含脯氨酸残基。
在某些方面，肽接头包含至少一个半胱氨酸残基，诸如一个半胱氨酸残基。例如，在某些实施方案中，接头包含至少一个半胱氨酸残基和选自Gly、Ser、Ala和Thr的氨基酸残基。在某些这样的实施方案中，接头包含甘氨酸残基和半胱氨酸残基，诸如仅甘氨酸残基和半胱氨酸残基。通常，每个肽接头仅包括一个半胱氨酸残基。包含半胱氨酸残基的具体接头的一个例子包括具有氨基酸序列Glym-Cys-Glyn的肽接头，其中n和m各自是1-12的整数，例如，3-9、4-8或4-7。在一个具体的变体中，这样的肽接头具有氨基酸序列GGGGG-C-GGGGG(SEQ ID NO:133)。
在某些实施方案中，所述融合蛋白的接头是结构化的或受限制的接头。在特定实施方案中，所述结构化的接头含有序列(AP)n或(EAAAK)n(SEQ ID NO:134)，其中n是2至20，优选4至10，包括、但不限于，AS-(AP)n-GT(SEQ ID NO:135)或AS-(EAAAK)n-GT(SEQ ID NO:136)，其中n是2至20，诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在其它实施方案中，所述接头包含序列(GGGGA)n(SEQ ID NO:137)、(PGGGS)n(SEQ ID NO:138)、(AGGGS)n(SEQ IDNO:139)或GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS(SEQ ID NO:140，其中n是2至20。在某些实施方案中，所述接头是SSSASASSA(SEQ ID NO:141)、GSPGSPG(SEQ ID NO:142)或ATTTGSSPGPT(SEQID NO:143)。在某些实施方案中，由于它们的结构，这样的接头可以更耐受蛋白水解性降解，由此当体内注射时提供一个优点。
在某些实施方案中，所述接头不是可切割的接头，也称为不可切割的接头。在某些实施方案中，所述接头不可被蛋白酶切割。在某些实施方案中，不是可切割的接头或不可被蛋白酶切割的接头是通常对于体内递送或重组生产而言稳定的接头。在某些方面，不可被蛋白酶切割的接头包括不含有至少一个肽键的接头，所述肽键优选位于蛋白酶的可切割肽序列或识别位点内。在特定实施方案中，不可切割的接头不是蛋白酶的靶底物，使得与含有相同蛋白酶的底物识别位点的接头相比，它不被蛋白酶优先地或特异性地切割。
在某些实施方案中，所述接头不含有特定蛋白酶的底物识别位点或切割位点，所述位点是被蛋白酶切割的、被蛋白酶的活性位点识别的序列。通常，例如，对于丝氨酸蛋白酶，切割序列由底物中的P1-P4和P1′-P4′氨基酸组成，其中切割发生在P1位置之后。通常，丝氨酸蛋白酶的切割序列为六个残基的长度以匹配许多蛋白酶的延长的底物特异性，但是取决于蛋白酶可以更长或更短。通常，接头不包括被蛋白酶识别的P1-P1′易切断的键序列。在某些方面，不可切割的接头或不包含被蛋白酶特异性识别以切割的底物识别位点的接头是这样的接头：蛋白酶对它的切割大幅小于蛋白酶对靶底物的切割。
在某些实施方案中，所述接头是可切割的接头。在某些方面，可切割的接头是诸如上述的任一种的接头，其进一步包含序列，该序列是蛋白酶的底物，因为存在至少一个在生理条件下可断裂的键。在某些情况下，可切割的接头在体内所存在的特定条件下易于切割或对切割敏感，例如在暴露于细胞外蛋白酶之后，包括在体内细胞环境中存在的那些条件。在某些情况下，蛋白酶可以存在于特定的生理微环境中，例如肿瘤微环境中，从而限制可能发生切割的位点。
与另一种非靶标底物相比，蛋白酶通常表现出对特定靶标底物的切割的特异性或优先性。这样的特异性程度可以基于序列(例如接头)的切割的速率常数来确定，它是蛋白酶对其底物的偏爱和酶效率的量度。在有不同浓度底物存在下确定切割随时间增加的速率的任何方法都可以用于计算特异性常数。例如，将底物连接至发荧光部分，该发荧光部分在被蛋白酶切割后被释放。通过确定在不同蛋白酶浓度下的切割速率，可以确定关于特定蛋白酶对特定接头的切割的特异性常数(kcat/Km)。在某些实施方案中，可切割的接头是能够以约至少1×104M-1S-1或至少5×104M-1S、至少10×104M-1S、至少10×105M-1S或更大的速率被蛋白酶特异性地切割的接头。
在某些实施方案中，本公开内容的受限制的多特异性多肽构建体包括连接第一组分和第二组分的可切割的接头。在某些实施方案中，所述可切割的接头包括可以充当蛋白酶(经常是细胞外蛋白酶)的底物的氨基酸序列。例如，可切割的接头可以包括至少一个肽键的切割序列，其优选位于蛋白酶的可切割的肽序列内。合适的蛋白酶包括例如基质金属蛋白酶(MMP)、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和纤溶酶活化剂，它们在疾病诸如类风湿性关节炎或癌症中以强化的方式形成或活化，从而导致过度的组织降解、炎症和转移。在特定的实施方案中，所述蛋白酶是由肿瘤、活化的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)或肿瘤微环境中的细胞产生的蛋白酶。在某些实施方案中，所述蛋白酶是粒酶B、matriptase或MMP，诸如MMP-2。
可以基于蛋白酶来选择可切割的接头，所述蛋白酶由与表达靶标的细胞邻近的肿瘤产生，和/或由与多特异性多肽构建体的期望靶标共定位在组织中的肿瘤产生。在文献中报道了在许多癌症例如实体瘤中具有已知底物的蛋白酶的水平增加。参见，例如，La Rocca等人,(2004)British J.of Cancer 90(7):1414-1421。
在某些实施方案中，连接受限制的多特异性多肽构建体的第一组分和第二组分的可切割接头被蛋白酶切割，所述蛋白酶由被所述组分之一活化的免疫效应细胞产生。例如，包含效应子启动的或增强的IgG Fc区的多特异性多肽构建体在与靶抗原接合时能够引发ADCC。ADCC的中心是粒酶B和穿孔蛋白从效应细胞(即NK细胞和细胞毒性的T-细胞)的释放。释放后，粒酶B以穿孔蛋白依赖性方式进入靶细胞，在其中它介导细胞凋亡。重要的是，粒酶B在效应细胞和靶细胞之间的细胞外突触中具有活性。在某些实施方案中，连接多特异性多肽构建体的第一组分和第二组分的可切割接头被粒酶B切割。在由多特异性多肽构建体的组分之一介导的效应细胞活化的过程中，粒酶B被释放。在某些实施方案中，粒酶B和其它蛋白酶可以由免疫效应细胞产生，包括活化的T细胞或NK细胞。在某些实施方案中，在多特异性多肽构建体与TAA结合后由CD3接合对T细胞的活化可以释放这样的蛋白酶，其然后可以切割特定的可切割的接头，从而增强或增加CD3结合分子的接合CD3的活性。在某些实施方案中，当以未切割状态结合至TAA时，所述切割可以扩增或增加由多特异性构建体实现的活性。
示例性的底物包括、但不限于可被以下酶或蛋白酶中的一种或多种切割的底物：ADAMS，ADAMTS，例如ADAM8；ADAM9；ADAM10；ADAM12；ADAM15；ADAM17/TACE；ADAMDEC1；ADAMTS1；ADAMTS4；ADAMTS5；天冬氨酸蛋白酶，例如，BACE或肾素；天冬氨酸组织蛋白酶，例如，组织蛋白酶D或组织蛋白酶E；天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，例如，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶2，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶4，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶5，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶6，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶7，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶10，或天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶14；半胱氨酸组织蛋白酶，例如，组织蛋白酶B，组织蛋白酶C，组织蛋白酶K，组织蛋白酶L，组织蛋白酶S，组织蛋白酶V/L2，组织蛋白酶X/Z/P；半胱氨酸蛋白水解酶，例如，Cruzipain；Legumain；Otubain-2；KLK，例如，KLK4，KLK5，KLK6，KLK7，KLK8，KLK10，KLK11，KLK13，或KLK14；金属蛋白水解酶，例如，Meprin；肾胰岛素残基溶酶；PSMA；BMP-1；MMP，例如，MMP1，MMP2，MMP3，MMP7，MMP8，MMP9，MMP10，MMP11，MMP12，MMP13，MMP14，MMP15，MMP16，MMP17，MMP19，MMP20，MMP23，MMP24，MMP26，或MMP27，丝氨酸蛋白酶，例如，活化的蛋白C，组织蛋白酶A，组织蛋白酶G，胰凝乳蛋白酶，凝固因子蛋白酶(例如，FVIIa，FIXa，FXa，FXIa，FXIIa)，弹性蛋白酶，粒酶B，Guanidinobenzoatase，HtrA1，人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，乳铁蛋白，Marapsin，NS3/4A，PACE4，纤溶酶，PSA，tPA，凝血酶，类胰蛋白酶，uPA；II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)，例如，DESC1，DPP-4，FAP，Hepsin，Matriptase-2，Matriptase，TMPRSS2，TMPRSS3，或TMPRSS4；和它们的任意组合。
在某些实施方案中，所述可切割的接头被多种蛋白酶切割，例如，2种或更多种蛋白酶、3种或更多种蛋白酶、4种或更多种蛋白酶，诸如此类。
在某些实施方案中，选择可切割的接头用于与特定蛋白酶一起使用，例如已知由邻近表达靶标的细胞的肿瘤产生的蛋白酶和/或由与多特异性多肽构建体的靶标共定位的肿瘤产生的蛋白酶。
在某些实施方案中，所述可切割的接头含有特异性蛋白酶的底物识别位点或切割位点，其是被蛋白酶切割的、被蛋白酶的活性位点识别的序列。通常，例如，对于丝氨酸蛋白酶，切割序列由底物中的P1-P4和P1′-P4′氨基酸组成，其中切割发生在P1位置之后。通常，丝氨酸蛋白酶的切割序列为六个残基的长度以匹配许多蛋白酶的延长的底物特异性，但是取决于蛋白酶可以更长或更短。通常，可切割的接头包括被蛋白酶识别的P1-P1′易切断的键序列。在某些方面，可切割的接头被工程改造以引入能够被特异性蛋白酶切割的肽键，例如通过引入蛋白酶的底物识别位点序列或切割序列。
在某些实施方案中，所述可切割的接头包括两个或更多个底物序列的组合。在某些实施方案中，每个底物序列被相同的蛋白酶切割。在某些实施方案中，至少两个底物序列被不同的蛋白酶切割。在某些实施方案中，所述可切割的接头包含作为粒酶B的底物的氨基酸。在某些实施方案中，粒酶B可切割的接头含有具有通式P4 P3 P2 P1↓P1’(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列，其中P4是氨基酸I、L、Y、M、F、V或A；P3是氨基酸A、G、S、V、E、D、Q、N或Y；P2是氨基酸H、P、A、V、G、S或T；P1是氨基酸D或E；且P1’是氨基酸I、L、Y、M、F、V、T、S、G或A。在某些实施方案中，粒酶B可切割的接头含有具有通式P4 P3 P2 P1↓P1’(SEQ ID NO:145)的氨基酸序列，其中P4是氨基酸I或L；P3是氨基酸E；P2是氨基酸P或A；P1是氨基酸D；且P1’是氨基酸I、V、T、S或G。
在某些实施方案中，粒酶B的底物包含氨基酸序列LEAD(SEQ ID NO:146)、LEPG(SEQ ID NO:147)或LEAE(SEQ ID NO:148)。在某些实施方案中，所述可切割的接头含有氨基酸序列所述可切割的接头包含氨基酸序列IEPDI(SEQ ID NO:149)、LEPDG(SEQ ID NO:150)、LEADT(SEQ ID NO:151)、IEPDG(SEQ ID NO:152)、IEPDV(SEQ ID NO:153)、IEPDS(SEQID NO:154)、IEPDT(SEQ ID NO:155)、IEPDP(SEQ ID NO:144)、LEPDG(SEQ ID NO:152)或LEADG(SEQ ID NO:153)。
在某些实施方案中，所述可切割的接头包含作为matriptase的底物的氨基酸。在某些实施方案中，所述可切割的接头包含序列P4QAR↓(A/V)(SEQ ID NO:156)，其中P4是任何氨基酸。在某些实施方案中，所述可切割的接头包含序列RQAR(A/V)(SEQ ID NO:157)。在某些实施方案中，所述matriptase的底物包含氨基酸序列RQAR(SEQ ID NO:158)。在某些实施方案中，所述可切割的接头包含氨基酸序列RQARV(SEQ ID NO:159)。
在某些实施方案中，所述可切割的接头包含作为一种或更多种基质金属蛋白酶(MMP)的底物的氨基酸。在某些实施方案中，所述MMP是MMP-2。在某些实施方案中，所述可切割的接头含有通式P3 P2 P1↓P1’(SEQ ID NO:160)，其中P3是P、V或A；P2是Q或D；P1是A或N；且P1’是L、I或M。在某些实施方案中，所述可切割的接头含有通式P3 P2 P1↓P1’(SEQ IDNO:161)，其中P3是P；P2是Q或D；P1是A或N；且P1’是L或I。在某些实施方案中，所述MMP的底物包含氨基酸序列PAGL(SEQ ID NO:162)。
在某些实施方案中，所述可切割的接头包含作为粒酶B的底物的氨基酸序列与作为matriptase的底物的氨基酸序列的组合。在某些实施方案中，所述可切割的接头包含氨基酸序列LEAD(SEQ ID NO:146)和氨基酸序列RQAR(SEQ ID NO:158)的组合。
在某些实施方案中，所述可切割的接头包含作为粒酶B的底物的氨基酸序列与作为MMP的底物的氨基酸序列的组合。在某些实施方案中，所述可切割的接头包含氨基酸序列LEAD(SEQ ID NO:146)和氨基酸序列PAGL(SEQ ID NO:162)的组合。
在某些实施方案中，所述可切割的接头包含作为matriptase的底物的氨基酸序列与作为MMP的底物的氨基酸序列的组合。在某些实施方案中，所述可切割的接头包含氨基酸序列RQAR(SEQ ID NO:158)和氨基酸序列PAGL(SEQ ID NO:162)的组合。
在某些实施方案中，所述可切割的接头包含作为粒酶B的底物的氨基酸序列、作为matriptase的底物的氨基酸序列与作为MMP的底物的氨基酸序列的组合。在某些实施方案中，所述可切割的接头包含作为粒酶B的底物的氨基酸序列与作为MMP的底物的氨基酸序列的组合。在某些实施方案中，所述可切割的接头包含氨基酸序列LEAD(SEQ ID NO:146)、氨基酸序列RQAR(SEQ ID NO:158)和氨基酸序列PAGL(SEQ ID NO:162)的组合。
所述可切割的接头可以包括任何已知的接头。在Be’liveau等人(2009)FEBSJournal,276、美国公开的申请号US20160194399、US20150079088、US20170204139、US20160289324、US20160122425、US20150087810、US20170081397、美国专利号US9644016中描述了可切割的接头的例子。
在某些实施方案中，所述可切割的接头包含选自以下的氨基酸序列：TGLEADGSPAGLGRQARVG(SEQ ID NO:163)；TGLEADGSRQARVGPAGLG(SEQ ID NO:164)；TGSPAGLEADGSRQARVGS(SEQ ID NO:162)；TGPAGLGLEADGSRQARVG(SEQ ID NO:166)；TGRQARVGLEADGSPAGLG(SEQ ID NO:167)；TGSRQARVGPAGLEADGS(SEQ ID NO:168)；和TGPAGLGSRQARVGLEADGS(SEQ ID NO:169)；GPAGLGLEPDGSRQARVG(SEQ ID NO:170)；GGSGGGGIEPDIGGSGGS(SEQ ID NO:171)；GGSGGGGLEADTGGSGGS(SEQ ID NO:172)；GSIEPDIGS(SEQ ID NO:173)；GSLEADTGS(SEQ ID NO:174)；GGSGGGGIEPDGGGSGGS(SEQ ID NO:175)；GGSGGGGIEPDVGGSGGS(SEQ ID NO:176)；GGSGGGGIEPDSGGSGGS(SEQ ID NO:177)；GGSGGGGIEPDTGGSGGS(SEQ ID NO:178)；GGGSLEPDGSGS(SEQ IDNO:179)；和GPAGLGLEADGSRQARVG(SEQ ID NO:180),GGEGGGGSGGSGGGS(SEQ ID NO:181)；GSSAGSEAGGSGQAGVGS(SEQ ID NO:182)；GGSGGGGLEAEGSGGGGS(SEQ ID NO:183)；GGSGGGGIEPDPGGSGGS(SEQ ID NO:184)；TGGSGGGGIEPDIGGSGGS(SEQ ID NO:185)。
e.抗-PD-1 VHH结构域
本公开内容的受限制的多特异性多肽构建体包括至少一个来自本文提供的任一种的PD-1 VHH结构域。在某些实施方案中，所述PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:245-287、294-299和312-315中的任一个中所示的氨基酸序列。
在特定实施方案中，受限制的多特异性多肽构建体含有至少两个PD-1 VHH结构域，诸如所述的任一种。在某些情况下，至少一个PD-1 VHH结构域位于相对于异源二聚体Fc的Fc多肽的氨基端，且至少一个PD-1 VHH结构域位于相对于CD3结合区域的VH或VL链的羧基端。在某些方面，两个PD-1 VHH结构域中的每个是相同的。
在特定实施方案中，受限制的多特异性多肽构建体仅含有PD-1结构域。在某些情况下，所述PD-1 VHH结构域位于相对于异源二聚体Fc的Fc多肽的氨基端。在某些实施方案中，所述PD-1 VHH结构域位于相对于CD3结合区域的VH或VL链的羧基端。
在某些实施方案中，所述抗-PD-1 VHH结构域直接地或通过接头间接地连接至Fc区和/或连接至CD3结合区域。在某些实施方案中，连接是通过接头。在某些实施方案中，所述接头是连接肽(LP)，其可以包括所述的任何柔性的或刚性的接头。在某些实施方案中，所述接头选自：GGSGGS，即，(GGS)2(SEQ ID NO:244)；GGSGGSGGS，即，(GGS)3(SEQ ID NO:245)；GGSGGSGGSGGS，即，(GGS)4(SEQ ID NO:246)；和GGSGGSGGSGGSGGS，即，(GGS)5(SEQ ID NO:247)。在某些实施方案中，所述接头是包含甘氨酸残基的柔性接头，例如，作为非限制性例子，GG、GGG、GGGG(SEQ ID NO:248)、GGGGG(SEQ ID NO:249)和GGGGGG(SEQ ID NO:7)。在某些实施方案中，所述接头包括GS-接头和甘氨酸接头的组合。
f.共刺激性结合结构域
本公开内容的多特异性多肽构建体包括一个或更多个共刺激性受体结合区域(CRBR)，其结合共刺激受体。在某些实施方案中，所提供的多特异性多肽构建体的一个或更多个CRBR结合在T细胞上表达的共刺激性受体。在某些实施方案中，所述共刺激性受体在活化的T细胞的表面上上调、诱导或表达。在某些方面，所述CRBR结合共刺激性受体并刺激共刺激性受体。在某些实施方案中，共刺激性受体与多特异性多肽的CRBR的激动性结合诱导T细胞中的下游信号传递以在接合CD3后增强或增加T细胞活化或功能性。在某些实施方案中，所述CRBR或独立地每个CRBR是抗体或抗原结合片段、共刺激性受体的天然同源结合配偶体、Anticalin(经工程改造的脂质运载蛋白)、Darpin、Fynomer、Centyrin(经工程改造的fibroneticin III结构域)、胱氨酸-结结构域、Affilin、Affibody或经工程改造的CH3结构域。
在某些实施方案中，所述CRBR或独立地每个CRBR，诸如第一CRBR和第二CRBR，包括抗体或其抗原结合片段的一个或多个拷贝。在某些实施方案中，所述CRBR或独立地每个CRBR，诸如第一抗原结合结构域和第二CRBR，包括选自以下的抗体或其抗原结合片段的一个或多个拷贝：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
在某些实施方案中，所述CRBR或独立地每个CRBR，诸如第一CRBR和第二CRBR，是单链抗体。在某些实施例中，所述单链是scFv、scAb、单结构域重链抗体或单结构域轻链抗体。
在某些实施方案中，所述CRBR或独立地每个CRBR，诸如第一CRBR和第二CRBR，包括一个或更多个单结构域抗体(sdAb)片段，例如VHH、VNAR、经工程改造的VH或VK结构域。VHH可以从天然的骆驼科仅重链抗体、生产仅重链抗体的遗传修饰的啮齿类动物或原初的/合成的骆驼科或人源化骆驼科单结构域抗体文库产生。VNAR可以从软骨鱼仅重链抗体产生。已经实现多种方法从常规异源二聚体VH和VK结构域产生单体sdAb，包括界面工程和特定种系家族的选择。
在某些实施方案中，多特异性多肽构建体的CRBR或独立地每个CRBR(诸如第一CRBR和/或第二CRBR)含有至少一个结合共刺激受体的sdAb或scFv。在某些实施方案中，所述至少一个结合共刺激受体的scFv或sdAb位于多特异性多肽构建体的相对于Fc区的氨基端和/或相对于CD3结合区域的羧基端。在某些实施方案中，所述多特异性多肽构建体含有仅一个结合共刺激受体的scFv或sdAb，其可以位于相对于Fc区的氨基端和/或相对于CD3结合区域的羧基端。在某些实施方案中，所述多特异性多肽构建体含有两个结合共刺激受体的scFv或sdAb，其位于相对于Fc区的氨基端和/或相对于CD3结合区域的羧基端。
在某些实施方案中，所述多特异性多肽构建体从两个多肽形成或包括两个多肽，包括：第一多肽，其包含异源二聚体Fc区的第一Fc多肽、接头、抗-CD3抗体或抗原结合片段(例如Fv)的VH结构域和结合共刺激受体的scFv或sdAb；和第二多肽，其包含异源二聚体Fc区的第二Fc多肽、接头、抗-CD3抗体或抗原结合片段(例如Fv)的VL结构域和任选的另一种相同的或不同的结合共刺激受体的scFv或sdAb。结合共刺激受体的scFv或sdAb可以位于相对于异源二聚体Fc的Fc多肽的氨基端和/或相对于CD3结合区域的VH或VL链的羧基端。多特异性多肽构建体的第一多肽和/或第二多肽中的至少一个也包括在II.4部分中描述的结合TAA的抗原结合结构域或其链。在某些实施方案中，所述结合TAA的抗原结合结构域是scFv或sdAb且被包括作为多特异性多肽构建体的第一多肽和/或第二多肽的一部分。在某些实施方案中，所述结合TAA的抗原结合结构域是Fab，且所述多特异性多肽构建体另外从第三多肽形成，其中至少第一多肽和第二多肽包括结合TAA的Fab的链(例如Fab的VH-CH1或VL-CL)，且第三多肽含有结合TAA的Fab的其它链(例如Fab的VH-CH1或VL-CL中的另一个)。
在某些实施方案中，所述CRBR或独立地每个CRBR，诸如第一CRBR和/或第二CRBR，含有超过一个链。在某些实施方案中，多特异性多肽构建体的CRBR或独立地每个CRBR(诸如第一CRBR和/或第二CRBR)含有组装为FAB的VH和VL序列。
在某些实施方案中，多特异性多肽构建体的CRBR抗原结合结构域或独立地每个CRBR抗原结合结构域(诸如第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域)含有结合共刺激受体的Fab抗体的VH-CH1(Fd)和VL-CL。在某些实施方案中，含有VH-CH1(Fd)和VL-CL的Fab抗体位于多特异性多肽构建体的相对于Fc区的氨基端和/或相对于CD3结合区域的羧基端。在某些实施方案中，所述多特异性多肽构建体含有仅一个结合共刺激受体的Fab抗体(其含有VH-CH1(Fd)或VL-CL)，其可以位于相对于Fc区的氨基端和/或相对于CD3结合区域的羧基端。在某些实施方案中，所述多特异性多肽构建体含有两个结合共刺激受体的Fab抗体片段，每个含有VH-CH1(Fd)和VL-CL，其中一个位于相对于Fc区的氨基端且另一个位于相对于CD3结合区域的羧基端。
在某些实施方案中，所述多特异性多肽构建体从三个或更多个多肽形成或包括三个或更多个多肽，包括：第一多肽，其包含异源二聚体Fc区的第一Fc多肽、接头和结合共刺激受体的Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL；第二多肽，其包含异源二聚体Fc区的第二Fc多肽、接头和任选的相同的结合共刺激受体的Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL；和第三多肽，其包含结合共刺激受体的Fab抗体片段的VH-CH1(Fd)或VL-CL中的另一个。多特异性多肽构建体的第一、第二和/或第三多肽也可以包括PD-1 VHH结构域，诸如所述的任一种。
在某些实施方案中，所述CRBR或独立地每个CRBR是或包括共刺激性受体的天然的(自然的)同源结合配偶体(例如天然配体)或其表现出与共刺激性受体的结合活性的变体。
在某些实施方案中，所提供的多特异性多肽构建体的一个或更多个CRBR结合在T细胞上表达的共刺激性受体。在某些实施方案中，存在超过一个结合共刺激受体的CRBR，且每个CRBR(诸如第一CRBR和第二CRBR)结合相同的共刺激性受体。在某些实施方案中，每个CRBR(诸如第一CRBR和第二CRBR)结合不同的共刺激性受体。在某些实施方案中，每个CRBR(诸如第一CRBR和第二CRBR)结合相同共刺激性受体上的不同表位。在某些实施方案中，每个CRBR(诸如第一抗原-CRBR和CRBR)结合相同共刺激性受体上的相同表位。
在某些实施方案中，所述CRBR或独立地每个结合共刺激性受体的CRBR导致与共刺激性受体的单价、二价、三价或四价结合。
在某些实施方案中，所述共刺激性受体在T细胞上表达，诸如得自受试者的原代T细胞。在某些实施方案中，所述共刺激性受体在人T细胞上表达，诸如得自受试者的原代人T细胞。
在某些实施方案中，所述共刺激性受体是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员。在某些实施方案中，所述共刺激受体是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员。在某些实施方案中，所述共刺激受体是B7家族受体的成员。
在某些实施方案中，所述共刺激性受体选自41BB(CD137)、OX40(CD134)、CD27、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、CD28、ICOS、CD40、B-细胞活化因子受体(BAFF-R)、B-细胞成熟抗原(BCMA)、跨膜活化剂和CAML相互作用物(TACI)和NKG2D。在某些实施方案中，所述共刺激性受体选自41BB、OX40、GITR、ICOS或CD28。在某些实施方案中，所述共刺激性受体选自41BB、OX40或GITR。
在某些实施方案中，所述共刺激受体是41BB。在某些实施方案中，所述共刺激受体是OX40。在某些实施方案中，所述共刺激受体是GITR。在某些实施方案中，所述共刺激受体是ICOS。在某些实施方案中，所述共刺激受体是CD28。
在某些实施方案中，多特异性多肽的CRBR是或包含对共刺激性受体的激动性结合分子。CRBR可以结合共刺激性受体，并引发、诱导或刺激反应或活性，其与由受体的天然配体引发、诱导或刺激的反应或活性相似或相同。在某些方面，CRBR与共刺激性受体的结合会诱导或刺激下游信号，所述下游信号是由受体的天然配体引发、诱导或刺激的信号的超过5％、超过10％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％或超过100％。
在某些实施方案中，所述一个或更多个CRBR是结合共刺激性受体41BB(CD137)、OX40(CD134)、CD27、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、CD28、ICOS、CD40、B-细胞活化因子受体(BAFF-R)、B-细胞成熟抗原(BCMA)的抗体或其片段。在某些实施方案中，所述一个或更多个CRBR是结合共刺激性受体41BB、OX40、GITR、ICOS或CD28的抗体或其片段。在某些实施方案中，所述一个或更多个CRBR是结合共刺激性受体41BB、OX40或GITR的抗体或其片段。结合41BB、OX40和GITR的示例性多肽分别描述在PCT公开号WO2017123650、WO2017123673和WO2017015623中。在某些实施方案中，所述一个或更多个CRBR是结合共刺激性受体的单结构域抗体(sdAb)，诸如在PCT公开号WO2017123650、WO2017123673和WO2017015623中描述的那些。
在某些实施例中，所述共刺激性受体结合区域(CRBR)结合或包含41BB(CD137)、OX40(CD134)、CD27、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、CD28、ICOS、CD40、B-细胞活化因子受体(BAFF-R)、B-细胞成熟抗原(BCMA)、跨膜活化剂和CAML相互作用物(TACI)、NKG2D的天然同源结合配偶体。在某些实施方案中，所述天然同源结合配偶体选自41BB配体(41BBL)、OX40L(CD252)、CD70、GITR配体/TNFSF18、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、ICOS配体(ICOSL)、CD154(CD40L)、B-细胞活化因子(BAFF)、A增殖诱导配体(APRIL)、NKG2D配体或其功能片段。
CRBR的示例性序列如在表4中所示。
在某些实施方案中，至少一个CRBR或独立地每个CRBR结合共刺激性受体41BB。在某些实施例中，所述CRBR是或含有对41BB具有特异性或结合41BB的抗体或抗原结合片段，诸如含有VH和VL的sdAb或片段(例如scFv)。在某些实施方案中，至少一个CRBR或独立地每个CRBR是41BB的天然配体或是其功能结合片段。在某些实施方案中，至少一个CRBR或独立地每个CRBR是Anticalin。这样的结合41BB的CRBR的示例性例子如在SEQ ID NO:186-210中的任一个中所示。在某些实施方案中，所述结合41BB的CRBR含有在SEQ ID NO:187、189和191中的任一个中所示的VH和在SEQ ID NO:188、190或192中的任一个中所示的VL。所提供的多特异性多肽构建体中的CRBR或独立地每个CRBR可以与前述SEQ ID NO中的任一个具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合41BB。
在某些实施方案中，至少一个CRBR或独立地每个CRBR结合共刺激性受体OX40。在某些实施例中，所述CRBR是或含有对OX40具有特异性或结合OX40的抗体或抗原结合片段，诸如含有VH和VL的sdAb或片段(例如scFv)。在某些实施方案中，至少一个CRBR或独立地每个CRBR是OX40的天然配体或是其功能结合片段。这样的结合OX40的CRBR示例性例子如在SEQ ID NO:211-220中的任一个中所示。在某些实施方案中，所述结合OX40的CRBR含有在SEQ ID NO:216和218中的任一个中所示的VH和在SEQ ID NO:217和219中的任一个中所示的VL。所提供的多特异性多肽构建体中的CRBR或独立地每个CRBR可以与前述SEQ ID NO中的任一个具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合OX40。
在某些实施方案中，至少一个CRBR或独立地每个CRBR结合共刺激性受体GITR。在某些实施例中，所述CRBR是或含有对GITR具有特异性或结合GITR的抗体或抗原结合片段，诸如含有VH和VL的sdAb或片段(例如scFv)。在某些实施方案中，至少一个CRBR或独立地每个CRBR是GITR的天然配体或是其功能结合片段。这样的结合GITR的CRBR的示例性例子如在SEQ ID NO:221-230中的任一个中所示。在某些实施方案中，所述结合GITR的CRBR含有在SEQ ID NO:222、224、226和228中的任一个中所示的VH和在SEQ ID NO:223、225、227和229中的任一个中所示的VL。所提供的多特异性多肽构建体中的CRBR或独立地每个CRBR可以与前述SEQ ID NO中的任一个具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合GITR。
在某些实施方案中，至少一个CRBR或独立地每个CRBR结合共刺激性受体CD27。在某些实施例中，所述CRBR是或含有对CD27具有特异性或结合CD27的抗体或抗原结合片段，诸如含有VH和VL的sdAb或片段(例如scFv)。在某些实施方案中，至少一个CRBR或独立地每个CRBR是CD27的天然配体或是其功能结合片段。这样的结合CD27的CRBR的示例性例子如在SEQ ID NO:231中的任一个中所示。在某些实施方案中，所述结合CD27的CRBR含有在SEQ IDNO:232中所示的VH和在SEQ ID NO:233中所示的VL。所提供的多特异性多肽构建体中的CRBR或独立地每个CRBR可以与前述SEQ ID NO中的任一个具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并结合CD27。
在某些实施方案中，至少一个CRBR或独立地每个CRBR结合共刺激性受体ICOS。在某些实施例中，所述CRBR是或含有对ICOS具有特异性或结合ICOS的抗体或抗原结合片段，诸如含有VH和VL的sdAb或片段(例如scFv)。在某些实施方案中，至少一个CRBR或独立地每个CRBR是ICOS的天然配体或是其功能结合片段。示例性的结合ICOS的CRBR序列如在SEQ IDNO:234中所示。
在某些实施方案中，至少一个CRBR或独立地每个CRBR结合共刺激性受体CD28。在某些实施例中，所述CRBR是或含有对CD28具有特异性或结合CD28的抗体或抗原结合片段，诸如含有VH和VL的sdAb或片段(例如scFv)。在某些实施方案中，至少一个CRBR或独立地每个CRBR是CD28的天然配体或是其功能结合片段。示例性的结合CD28的CRBR序列如在SEQ IDNO:235中所示。
Figure BDA0003110879870000741
Figure BDA0003110879870000751
Figure BDA0003110879870000761
在某些实施方案中，一个或更多个CRBR直接地或通过接头间接地连接至Fc区和/或连接至CD3结合区域。在某些实施方案中，连接是通过接头。在某些实施方案中，所述接头是连接肽(LP)，其可以包括如本文中所述的任何柔性的或刚性的接头，尽管通常连接CRBR或区域的肽不是可切割的接头。
在某些实施方案中，所述多特异性多肽构建体包含在CRBR和Fc区之间的连接肽(LP)。在某些实施方案中，所述多特异性多肽构建体包含在CD3结合区域和CRBR之间的连接肽(LP)。
3.NK募集
在某些实施方案中，所述PD-1-结合多肽是双特异性构建体，其为或包含本文提供的至少一个PD-1 VHH结构域和至少一个另外的结合分子，所述结合分子能够结合在天然杀伤(NK)细胞上表达的表面分子和/或募集NK细胞。在特定方面，所述多特异性构建体是对PD-1和NK细胞表面分子双特异性的。在某些实施方案中，所述表面分子是CD16(FcγRIII)。具体地，所提供的双特异性的PD-1-结合多肽能够特异性地结合在人NK细胞上表达的NK活化受体，诸如人CD16a。
CD16(已知参与抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)的某些IgG的Fc部分的低亲和力受体)是负责NK细胞对靶细胞裂解的触发的最佳表征的膜受体(Mandelboim等人,1999,PNAS 96:5640-5644)。通常，大多数(大约90％)的人NK细胞表达低密度的CD56(CD56dim)和高水平的FcγRIII(CD16)(Cooper等人,2001,Trends Immunol.22:633-640)。人FcγRIII作为两种异形体CD16a(FcγRIIIA)和CD16b(FcγRIIIB)存在，它们在它们的细胞外免疫球蛋白结合区域中具有96％序列同一性(van de Winkel和Capel,1993,Immunol.Today 14(5):215-221)。在特定实施方案中，所述另外的结合分子能够特异性地结合CD16a。
CD16a在巨噬细胞、肥大细胞和NK细胞上作为跨膜受体表达。在NK细胞上，CD16a的α链与含有FcεRIγ-链和/或T-细胞受体(TCR)/CD3ζ-链的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)结合以介导信号传递(Wirthmueller等人,1992,J.Exp.Med.175:1381-1390)。已经在NK细胞中观察到CD16a与γ和ζ链的同源二聚体和异源二聚体的不同组合的相互作用，从而指示通过NK细胞中的CD16a复合物的变异经由不同的信号传递途径介导信号传递的能力(Anderson等人,1990,PNAS 87(6):2274-2278；Ackerly等人,1992,Int.J.CancerSuppl.7:11-14)。已经证实表达FcγR的效应细胞参与通过ADCC破坏肿瘤细胞。例如，CD16a与诸如能够特异性地结合CD16a的激动剂结合分子的接合可以导致表达CD16a的NK细胞的活化，由此引起生物应答，特别是信号传递应答。在某些情况下，所述结合分子能够通过它与这样的细胞的结合触发细胞杀伤，其方式类似于抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)。
在特定实施例中，PD-1-结合多肽包括可以特异性地结合PD-1和CD16a的双特异性分子，其可以将NK细胞靶向至带有这样的抗原的细胞，使得带有抗原的细胞可以通过NK细胞介导的细胞杀伤而根除。例如，特异性地结合在肿瘤细胞上表达的PD-1的结合分子可以将NK-细胞靶向至肿瘤细胞。在某些情况下，由结合CD16a的结合分子造成的NK细胞的活化可以导致肿瘤细胞的杀伤。
在某些实施方案中，对活化性NK细胞受体(诸如CD16a)特异性的另外结合结构域是选自Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、二硫键稳定化的Fv片段(dsFv)、scAb、dAb、单结构域重链抗体(VHH)或单结构域轻链抗体的抗原结合片段。在某些实施方案中，所述另外结合结构域对于结合活化性T NK细胞受体(诸如CD16a)而言是单价的。
在某些情况下，所述另外结合结构域识别CD16a。在某些实施方案中，所述抗-CD16a结合结构域包括抗-CD16 Fab片段、抗-CD16a F(ab')2片段、抗-CD16a Fv片段、抗-CD16a scFv、抗-CD16a dsFv、抗-CD16a scAb、抗-CD16a dAb、抗-CD16a单结构域重链抗体(VHH)和抗-CD16a单结构域轻链抗体的一个或多个拷贝。在某些实施方案中，所述抗-CD16a结合结构域对于结合CD16a而言是单价的。在某些实施方案中，所述BH73-结合多肽是结合BH73并激活CD16a的活性的双特异性构建体。
对CD16a特异性的抗体及其抗原结合片段是已知的，且包括，例如，NM3E2(McCall等人(1999)Mol.Immunol.,36:433-045。其它抗-CD16a抗体也可以用在本文提供的构建体中，包括在以下文献中描述的任一种：公开的美国专利申请号US10160280795；美国专利号9,701,750；Behar等人(2008)Protein Eng Des Sel.21:1-10；Arndt等人,(1999)Blood94:2562-2568。在特定实施例中，所述抗-CD16a是抗-CD16a scFv。在某些实施方案中，所述抗-CD16a是被包括在TandAb分子中的抗-CD16a抗体(参见例如Reush等人(2014)Mabs,6:727-738)。在某些方面，所述抗-CD16a是在美国专利号9,035,026中描述的抗-CD16a或抗原结合片段，诸如scFv。
所提供的双特异性构建体可以以许多形式中的任一种形成，所述形式含有至少一个PD-1 VHH结构域和至少一个对活化性NK细胞受体特异性的另外结构域，诸如CD16a-结合结构域。
在一个实施方案中，所述双特异性构建体是双特异性单结构域抗体-连接的Fab(S-Fab)，其含有至少一个所述的PD-1 VHH结构域，该结构域直接地或间接地连接至对NK细胞活化受体(例如CD16a)特异性的Fab抗原结合片段，诸如抗-CD16a Fab。在某些实施方案中，所述PD-1 VHH结构域连接至抗-C16a Fab的VH或VL链的C-端。在某些实施方案中，所述S-Fab可以进一步被修饰，诸如通过缀合聚乙二醇(PEG)、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物、蛋白(诸如白蛋白)、聚谷氨酸或PAS化(PASylation)(Pan等人(2018)International Journal of Nanomedicine,2018:3189-3201)。
在另一个实施方案中，所述双特异性构建体是scFv-单结构域抗体，其中所述构建体含有至少一个所述的PD-1 VHH，所述PD-1 VHH直接地或间接地连接至scFv，所述scFv含有对NK细胞活化受体(例如CD16a)特异性的抗原结合结构域的VH和VL。针对NK细胞活化受体的scFv，例如抗-CD16a scFv，可以含有所述的VH和VL序列中的任一种。在某些实施方案中，所述VHH结构域和所述scFv通过接头(诸如肽接头)连接。在某些实施方案中，所述肽接头可以是如本文中所述的肽接头。在某些实施方案中，所述VHH结构域和所述scFv各自任选地通过铰链区或接头(例如肽接头)连接至Fc区，诸如Fc区的N-端。Fc区可以是本文描述的任一种，诸如人Fc区或其变体，例如人IgG1 Fc区或其变体。在特定实施例中，Fc区由变体Fc结构域(例如变体人IgG1结构域)形成，所述变体Fc结构域被突变或修饰以促进异源二聚化，其中不同的多肽可以二聚化以产生异源二聚体。
在另一个实施方案中，对NK细胞活化受体(例如CD16a)特异性的抗原结合结构域是单结构域抗体，诸如是特异性地结合CD16a的VHH结构域。单结构域抗体(包括结合CD16a的VHH结构域)是已知的，参见例如公开的美国专利申请号US20160280795。在这样的方面，本文提供的双特异性构建体可以包括至少一个PD-1 VHH结构域和至少一个CD16a VHH结构域。为了形成构建体，在某些情况下，将每个VHH结构域任选地通过铰链区或接头(例如肽接头)连接至Fc区，诸如Fc区的N-端。Fc区可以是本文描述的任一种，诸如人Fc区或其变体，例如人IgG1 Fc区或其变体。在特定实施例中，Fc区由变体Fc结构域(例如变体人IgG1结构域)形成，所述变体Fc结构域被突变或修饰以促进异源二聚化，其中不同的多肽可以二聚化以产生异源二聚体。
在以上实施方案中，促进异源二聚化的Fc区的示例性修饰是已知的，包括如下例如表1所述的任一种。在某些实施方案中，异源二聚体Fc的一个Fc多肽包含在SEQ ID NO:103、107、115或117中的任一个中所示的氨基酸序列，且异源二聚体Fc的其它Fc多肽含有在SEQ ID NO:104、108、111、113、119或121中的任一个中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，异源二聚体Fc的一个Fc多肽包含在SEQ ID NO:105、109、116或118中的任一个中所示的氨基酸序列，且异源二聚体Fc的其它Fc多肽包含在SEQ ID NO:106、110、112、114、120或122中的任一个中所示的氨基酸序列。
4.细胞因子融合体和/或细胞因子受体靶向
在某些实施方案中，所述PD-1-结合多肽是作为细胞因子-抗体融合蛋白(也称为PD-1 VHH-细胞因子融合体)的多特异性多肽构建体。在某些方面，本文提供的至少一个PD-1 VHH结构域直接地或间接地连接至至少一种细胞因子，诸如干扰素。在特定实施方案中，所述细胞因子是能够表现出抗增殖活性、细胞凋亡活性和/或抗病毒活性的干扰素。在某些实施方案中，本文提供的PD-1 VHH-细胞因子融合体的干扰素能够结合由IFNAR1和/或2组成的受体。多种测定中的任一种可以用于评估这样的融合蛋白的以下作用：结合IFNAR1和/或2，减少或降低癌细胞的生长速率和/或增殖速率，减小肿瘤大小，消除肿瘤或诱导癌细胞的死亡(例如通过细胞凋亡)。这样的测定包括使用已知表达PD-1的各种癌细胞系的体外测定或采用动物肿瘤模型的体内测定。
在某些实施方案中，所述干扰素是I型干扰素，诸如人I型干扰素或其变体。在某些方面，所述人I型干扰素是作为截短的人I型干扰素或人突变体I型干扰素的变体。在某些实施方案中，所述I型干扰素或其变体是野生型人IFN-α(IFN-α；α2和天然的更高亲和力变体诸如α14),干扰素β(IFN-β)以及它们的突变体和/或截短形式。在某些实施方案中，所述干扰素是II型干扰素，诸如人II型干扰素或其变体。在某些方面，所述人II型干扰素是作为截短的人II型干扰素或人突变体II型干扰素的变体。在某些实施方案中，所述II型干扰素或其变体是野生型人干扰素γ(IFN-γ)以及它们的突变体和/或截短形式。在某些实施方案中，所提供的细胞因子-抗体融合蛋白可以用于抑制表达或过表达PD-1的靶细胞(例如癌细胞)的生长和/或增殖。
在某些实施方案中，所述PD-1 VHH-细胞因子融合蛋白在形式上类似于在以下文献中描述的任一种：国际PCT公开的申请号WO2014194100；美国专利号9,803,021；Valedkarimi等人(2017)Biomed Pharmacother.,95:731-742；或Young等人(2014)SeminOncol.,41:623-636。
在特定实施方案中，所述干扰素，例如I型干扰素，诸如人I型干扰素(例如IFN-α、IFN-β或IFN-γ)，是具有天然或野生型干扰素的内源性结合亲和力和/或活性的干扰素，优选地在天然野生型干扰素(以其分离形式)的至少60％或至少或至少约80％的水平，诸如至少90％、95％、98％、99％、100％，或更大的水平。
干扰素和干扰素突变体是众所周知的和确定地表征的细胞因子的集合(参见例如，WO 2002/095067；WO 2002/079249；WO 2002/101048；WO 2002/095067；WO 2002/083733；WO 2002/086156；WO 2002/083733；WO 2003/000896；WO 2002/101048；WO 2002/079249；WO 2003/000896；WO 2004/022593；WO2004/022747；WO 2003/023032；WO 2004/022593，以及Kim等人(2003)Cancer Lett.189(2):183-188；Hussain等人(2000)J.Interferon Cytokine Res.20(9):763-768；Hussain等人(1998)J.InterferonCytokine Res.18(7):469-477；Nyman等人(1988)Biochem.J.329(Pt 2):295-302；Golovleva等人(1997)J.Interferon Cytokine Res.17(10):637-645；Hussain等人(1997)J.Interferon Cytokine Res.17(9):559-566；Golovleva等人(1997)Hum.Hered.47(4):185-188；Kita等人(1991)J.Interferon Cytokine Res.17(3):135-140；Golovleva等人(1996)Am.J.Hum.Genet.59(3):570-578；Hussain等人(1996)J.Interferon CytokineRes.16(7):523-529；Linge等人(1995)Biochim Biophys Acta。这些中的任一种可以用在所提供的细胞因子-抗体融合蛋白中。
在某些实施方案中，所述干扰素是人I型干扰素。基因/蛋白的人干扰素家族的等位基因是已知的，参见例如Pestka(10983)Arch Biochem Biophys.,221:1-37；Diaz等人(1994)Genomics,22:540-52；Pestka(1986)Meth.Enzymol,199:3-4；和Krause等人(2000)J.Biol.Chem.,275:22995-3004。
在某些实施方案中，所述干扰素是全长IFN-α(例如人IFN-α)、全长IFN-β(例如人IFN-β)或全长IFN-γ(例如人IFN-γ)。在某些实施方案中，所述干扰素是生物活性的截短的IFN-α(例如人IFN-α)、生物活性的截短的IFN-β(例如人IFN-β)或生物活性的截短的IFN-γ(例如人IFN-γ)。在某些实施方案中，生物活性的截短的干扰素含有野生型或自然干扰素的氨基酸的连续序列，其在N-和/或C-端被截短且包含的长度是天然或野生型干扰素的长度的至少或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多。可以使用用于评估干扰素的生物活性的多种标准测定中的任一种。例如，通过测量针对特定试验病毒的抗病毒活性，可以测定IFN-α活性。用于测定IFN-α活性的试剂盒是商购可得的(参见，例如，爱尔兰Neutekbio的ILITETMαβ试剂盒)。在某些方面，所述IFN-α是IFN-a2a(例如Acc.No.CAA23805)、IFN-a-c(Acc.No.P01566)、IFN-a-d(Acc.No.AAB59403)；IFNa-5(Acc.No.CAA26702)；IFNa-6(Acc.No.AA26704)；IFNa-4(Acc.No.NP_066546)；IFNa-4b(Acc.No.CAA26701)；IFNa-I(Acc.No.AAA52725)；IFNa-J(Acc.No.CAA23792)；IFNa-H(Acc.No.CAA23794)；IFNa-F(Acc.No.AAA52718)；IFNa-7(Acc.No.CAA26903)，或是其生物活性片段。在某些方面，所述IFN-β是在Acc.No.AAC41702中所示的IFN-β或是其生物活性片段。在某些方面，所述IFN-γ是在Acc.No.P01579中所示的IFN-γ或是其生物活性片段。
在某些实施方案中，所提供的PD-1 VHH-细胞因子融合体含有变体或突变体干扰素α2(IFNa2)。某些突变体包括在位置57处的His和/或在位置58处的E和/或在位置61处的Q的突变。在某些实施方案中，所述突变体包括突变H57Y和/或E58N和/或Q61S。在某些实施方案中，所述突变体包括具有突变H57Y、E58N和Q61S(YNS)的突变的IFNa2(参见，例如，Kalie等人(2007)J.Biol.Chem.,282:11602-11611)。在其它实施方案中，突变体包括在位置57处的His和/或在位置58处的E和/或在位置61处的Q向A(丙氨酸)的突变。在某些实施方案中，所述突变体包括具有突变H57A、E58A和Q61A(HEQ)的突变的IFNa2(参见，例如，Jaitin等人(2006)Mo/.Cellular Biol,26(5):1888-1897)。在某些实施方案中，所述突变体干扰素包含在位置57处的His向A、Y或M的突变，和/或在位置58处的E向A或N或D或L的突变，和/或在位置61处的Q向A或S或L或D的突变。在某些实施方案中，突变体包括干扰素α8(IFN-a8)的突变体，诸如具有与以下对应的氨基酸置换的变体：R145向V、I或L，和/或A146向N或S，和/或M149向Y，例如R145V/A146N/M149Y)、R145I、/A146S/M149Y或R145L/A146S/M149Y(参见，例如，Yamamoto等人.(2009)J.Interferon&cytokine Res,29:161-170。
在某些实施方案中，所提供的PD-1 VHH-细胞因子融合体包含含有丝氨酸的突变体或变体IFN-β，所述丝氨酸置换在氨基酸17处的天然存在的半胱氨酸(参见，例如，Hawkins等人(1985)Cancer Res.,45,5914-5920)。
在某些实施方案中，所提供的PD-1 VHH-细胞因子融合体含有截短的干扰素。在一个实施方案中，截短的干扰素包括具有直到前15氨基端氨基酸残基和/或直到最后10-13个羧基端氨基酸残基的缺失的人IFN-α，其已经被证实保留天然或野生型人IFN-α的活性(参见例如Ackerman(1984)Proc.Natl.Acad.Sci,USA,81:1045-1047)。在某些实施方案中，截短的人IFN-α具有缺失的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个羧基端氨基酸残基和/或缺失的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基端氨基酸残基。
在某些实施方案中，所提供的PD-1 VHH-细胞因子融合体含有截短的干扰素，诸如在公开的美国专利申请号US2009/0025106中所述。在某些实施方案中，所提供的PD-1 VHH-细胞因子融合体含有包含N-和/或C-端缺失的截短的IFN-γ，诸如在Lundell等人(1991)Protein Neg.,4:335-341；Pan等人(1987)Eur.J.Biochem.,166:145-149中所述。
在某些实施方案中，与未修饰的、通常野生型蛋白相比，所述干扰素(例如人干扰素)是耐受蛋白酶解的突变体干扰素，参见例如美国专利号7,998,469；美国专利号8,052,964；美国专利号4,832,959美国专利号6,120,762；WO1992/008737；和EP219781。
在所提供的PD-1 VHH-细胞因子融合蛋白的方面，抗体和细胞因子(例如干扰素)直接连接或通过接头(诸如肽接头)间接连接。所述连接可以是向VHH结构域的N-或C-端，只要所述连接不会干扰抗体与PD-1的结合。可以使用本文描述的任何接头，例如肽接头。在某些实施方案中，所述接头是包含选自以下的氨基酸序列的GS-接头：GGSGGS，即，(GGS)2(SEQID NO:1)；GGSGGSGGS，即，(GGS)3(SEQ ID NO:2)；GGSGGSGGSGGS，即，(GGS)4(SEQ ID NO:3)；和GGSGGSGGSGGSGGS，即，(GGS)5(SEQ ID NO:4)。在某些实施方案中，所述接头是包含甘氨酸残基的柔性接头，例如，作为非限制性例子，GG、GGG、GGGG(SEQ ID NO:5)、GGGGG(SEQ IDNO:6)和GGGGGG(SEQ ID NO:7)。在某些实施方案中，所述融合蛋白可以包括GS-接头和甘氨酸接头的组合。
D.经工程改造的细胞
本文提供了经工程改造的细胞，其表达本文描述的所提供的PD-1结合分子中的任一种。在特定实施例中，所提供的PD-1结合分子由细胞分泌。在某些实施方案中，所述PD-1结合分子(例如含有本文提供的抗-PD-1VHH结构域)包含信号肽(例如，抗体信号肽)或其它有效的信号序列以使结构域到达细胞外。当PD-1结合分子包含信号肽并由经工程改造的细胞表达时，所述信号肽造成免疫调节性蛋白被经工程改造的细胞分泌。通常，信号肽或信号肽的部分在分泌时从结合分子切割。PD-1结合分子可以由核酸(其可以是表达载体的一部分)编码。在某些实施方案中，所述PD-1结合分子由细胞(诸如免疫细胞，例如原代免疫细胞)表达和分泌。
在某些实施方案中，所提供的经工程改造的细胞进一步含有嵌合抗原受体(CAR)。CAR是通常含有细胞外靶向/结合部分的合成受体，所述细胞外靶向/结合部分在单个融合分子中与一个或更多个信号传递结构域结合并且在细胞(诸如T细胞)的表面上表达。因而，CAR在单个融合分子中组合了抗原特异性和T细胞活化性能。第一代CAR通常包括CD3ζ或Fcl受体γ链的细胞质区域作为它们的信号传递结构域。已经在具有卵巢癌、肾癌、淋巴瘤和神经母细胞瘤的患者中在I期临床研究中试验了第一代CAR，其中它们已经诱导了适度的应答(综述在Sadelain等人,Curr Opin Immunol,21(2):215-223,2009)。第二代CAR(其含有共刺激分子诸如CD28和CD3ζ的信号传递结构域)提供双重信号传递以指导组合的活化和共刺激信号。第三代CAR是更复杂的，具有三个或更多个信号传递结构域(综述在Sadelain等人,Cancer Discovery(3),388-398,2013和Dotti等人,Immuno.Rev,257(1),1-36,2014)。
在某些实施方案中，CAR含有细胞外结构域，其包含对肿瘤抗原特异性的一个或更多个抗原结合结构域。在某些方面，对TAA特异性的肿瘤抗原和/或抗原结合结构域可以是如本文中所述的任一种。CAR构建体包括含有一个或更多个细胞外抗原结合结构域的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传递区域。在某些情况下，所述细胞外抗原结合结构域是scFv或单结构域抗体(VHH)。一般而言，形成CAR的抗原结合单位的细胞外抗原结合结构域以足够的亲和力“结合”或“能够结合”(即靶向)靶抗原，使得CAR可用在靶向表达靶抗原的细胞或组织的疗法中。
CAR的跨膜结构域是通常穿过、或能够穿过或跨越质膜的结构域，并直接地或间接地(例如经由间隔物，诸如免疫球蛋白铰链序列)连接至细胞外抗原结合结构域和含有细胞内信号传递结构域的内质部分。在一个实施方案中，CAR的跨膜结构域是跨膜蛋白(例如I型跨膜蛋白)的跨膜区域、人工疏水序列或它们的组合。在一个实施方案中，所述跨膜结构域包含CD3ζ结构域或CD28跨膜结构域。其它跨膜结构域将是本领域技术人员显而易见的，并且可以与本文提供的CAR的实施方案结合使用。
本文提供的CAR的细胞内信号传递区域含有一个或更多个细胞内信号传递结构域，其在接合CAR的抗原结合结构域后，例如在结合抗原后，将信号传递至T细胞。在某些实施方案中，所述细胞内区域含有细胞内信号传递结构域，它是或含有ITAM信号传递结构域。示例性的细胞内信号传递结构域包括，例如，从T-细胞受体复合物的ζ链或它的同系物中的任一种(例如，η链、FcsRIy和β链、MB 1(Iga)链、B29(Ig)链等)、人CD3ζ链、CD3多肽(Δ、δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和参与T-细胞转导的其它分子(诸如CD2、CD5、OX40和CD28)衍生出的信号传递结构域。在特定实施方案中，所述细胞内信号传递区域含有从人CD3ζ链衍生出的细胞内信号传递结构域。
在某些实施方案中，所述胞内结构域包含CD3-ζ信号传递结构域。在某些实施方案中，所述CD3-ζ信号传递结构域包含在SEQ ID NO:236中所示的氨基酸序列或表现出与SEQID NO:236的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多序列同一性的氨基酸序列，并保留T细胞信号传递的活性。
在某些实施方案中，CAR的细胞内信号传递区域可以进一步含有从共刺激分子衍生出的细胞内信号传递结构域。在这样的实施例中,在抗原特异性的接合后，这样的信号传递结构域可以增强CAR-T细胞活性，诸如通过增强记忆细胞的增殖、存活和/或发育，例如，与仅含有含信号传递结构域的ITAM的CAR(例如CD3ζ)相比。在某些实施方案中，所述共刺激性结构域是从选自以下的蛋白得到的功能性信号传递结构域：CD28、CD137(4-IBB)、CD134(OX40)、DapIO、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD1 la/CD18)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或它们的组合。在特定实施方案中，所述共刺激信号传递结构域衍生自或得自人蛋白。在某些方面，所述共刺激信号传递结构域衍生自或得自人CD28或人CD137(4-IBB)。
在某些实施方案中，所述共刺激信号传递结构域衍生自CD28或4-1BB，并且包含在SEQ ID NO:237-240中的任一个中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:237-240的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多序列同一性的氨基酸序列，并保留T细胞共刺激信号传递的活性。
在特定实施方案中，所述CAR进一步包含连接细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域的铰链或间隔物区域。该铰链或间隔物区域可以用于实现得到的CAR的不同长度和柔性。可以使用的铰链或间隔物区域的例子包括、但不限于抗体的Fc片段或其片段或衍生物、抗体的铰链区或其片段或衍生物、抗体的CH2区域、抗体的CH3区域、人工间隔物序列(例如肽序列)或它们的组合。其它铰链或间隔物区域将是本领域技术人员显而易见的且可以使用。在一个实施方案中，所述铰链是lgG4铰链或CD8A铰链。
在某些实施方案中，所述间隔物和跨膜结构域是从CD8衍生出的铰链和跨膜结构域，诸如具有在SEQ ID NO:241-243中所示的示例性序列或表现出与SEQ ID NO:241-243的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。
本文还提供了分离的核酸构建体，其包含编码本文提供的PD-1结合分子的多核苷酸。本文还提供了分离的核酸构建体，其包含编码CAR且编码本文提供的PD-1结合分子的多核苷酸。在某些方面，编码CAR的第一核酸与编码PD-1结合分子的第二核酸被双顺反子元件诸如IRES或核糖体跳跃序列(例如T2A或P2A)隔开。在某些方面，所述构建体是用于在细胞中表达PD-1结合分子和/或CAR的表达载体。所述表达载体可以是病毒载体。病毒载体技术是本领域众所周知的，且描述在，例如，Sambrook等人(Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,2013)。已经开发了许多用于将基因转移到哺乳动物细胞中的基于病毒的系统。例如，使用逆转录病毒，例如腺病毒载体。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
在另一个方面，还提供了包含如上所述的一种或多种核酸构建体的分离的细胞或细胞群体。还提供了已被遗传修饰以表达本文提供的PD-1结合分子和/或CAR的分离的细胞或细胞群体。因此，本文提供了遗传工程改造的细胞，其包含(例如稳定表达)本文提供的CAR。在一个实施方案中，所述细胞选自T细胞、天然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、造血干细胞和/或多能胚胎/诱导的干细胞。在某些情况下，所述细胞是T细胞，诸如CD4和/或CD8 T细胞。在某些实施方案中，所述细胞是受试者自体的。例如，在某些实施方案中，可以从患者分离T细胞(也称为原代T细胞)用于用CAR核酸构建体工程改造，例如转染或转导。
在一个示例性实例中，可以将原代T-细胞离体纯化(CD4细胞或CD8细胞或两者)，并用TCR/CD28激动剂(诸如抗-CD3/抗-CD28包被的珠子)刺激。2或3天活化过程后，通过标准的慢病毒或逆转录病毒转导方案或质粒电穿孔策略，可以将编码CAR的重组表达载体稳定地引入原代T细胞中。例如，通过使用抗-表位标签或与天然亲本分子交叉反应的抗体的流式细胞计量术，可以关于PD-1结合分子的分泌和/或CAR表达来监测细胞。表达CAR的T-细胞可以通过用抗-表位标签抗体分选进行富集，或根据用途进行富集用于高表达或低表达。
通过多种手段，可以关于适当功能测定PD-1结合分子和/或CAR经工程改造的T-细胞。在某些情况下，体外细胞毒性、增殖或细胞因子测定(例如，IFN-γ表达)可以用于评估经工程改造的T-细胞的功能。示例性的标准终点是肿瘤系的％裂解、经工程改造的T-细胞的增殖或在培养物上清液中的IFN-γ蛋白表达。在某些情况下，可以评估在CAR的刺激(例如通过抗原)后刺激T-细胞的活化的能力，例如，通过监测活化标志物诸如CD69、CD44或CD62L的表达、增殖和/或细胞因子产生。
本文还提供了用于在受试者中预防和/或治疗疾病或病症(诸如癌症)的方法，其包括给受试者施用本文提供的经工程改造的细胞。通常，所述受试者需要用药学活性量的本发明的细胞和/或药物组合物治疗疾病或病症。
IV.多肽表达和生产
提供了核酸分子，其包含编码所提供的sdAb和PD-1-结合多肽中的任一种的多核苷酸。在某些实施方案中，所提供的核酸序列和具体地DNA序列编码本文提供的融合蛋白。在前述实施方案中的任一个中，核酸分子也可以编码指导PD-1-结合多肽的分泌的前导序列，所述前导序列通常被切割，使得它不存在于分泌的多肽中。前导序列可以是天然重链(或VHH)前导序列，或可以是另一种异源前导序列。
可以使用本领域常规的重组DNA技术来构建核酸分子。在某些实施方案中，核酸分子是适合在所选宿主细胞中表达的表达载体。
提供了载体，其包含编码本文所述的PD-1-结合多肽的核酸。这样的载体包括、但不限于：DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在某些实施方案中，选择载体，其针对在期望的细胞类型(诸如CHO或CHO-衍生的细胞)中或在NSO细胞中表达多肽而优化。示例性的这类载体描述在，例如，Running Deer等人,Biotechnol.Prog.20:880-889(2004)。
具体地，编码期望的PD-1-结合多肽(诸如融合蛋白)的DNA载体可以用于促进制备本文所述的PD-1-结合多肽的方法并获得大量。可以将DNA序列插入适当的表达载体，即含有用于转录和翻译所插入的蛋白编码序列的必需元件的载体。可以利用多种宿主-载体系统来表达蛋白编码序列。这些包括被病毒(例如，痘苗病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统；被病毒(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物，诸如含酵母载体的酵母，或用细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。取决于所使用的宿主-载体系统，可以使用许多合适的转录和翻译元件中的任一种。
本公开内容也提供了通过在导致多肽表达的条件下培养细胞来生产PD-1-结合多肽的方法，其中所述细胞包含编码本文所述的PD-1-结合多肽的分离的核酸分子，和/或包含这些分离的核酸序列的载体。
在某些实施方案中，可以在以下细胞中表达PD-1-结合多肽：原核细胞，诸如细菌细胞；或真核细胞，诸如真菌细胞(诸如酵母)，植物细胞，昆虫细胞，和哺乳动物细胞。这样的表达可以例如根据本领域已知的规程进行。可以用于表达多肽的示例性真核细胞包括、但不限于：COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、DG44。Lec13 CHO细胞和FUT8 CHO细胞；
Figure BDA0003110879870000871
细胞(Crucell)；和NSO细胞。在某些实施方案中，可以在酵母中表达PD-1-结合多肽。参见，例如，美国公开号US 2006/0270045 A1。在某些实施方案中，基于它对多肽进行期望的翻译后修饰的能力来选择特定的真核宿主细胞。例如，在某些实施方案中，CHO细胞产生的多肽的唾液酸化水平高于在293细胞中产生的相同多肽。
可以通过任何方法来完成一种或多种核酸(例如载体)向期望的宿主细胞中的导入，所述方法包括、但不限于磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性的示例性方法描述于例如Sambrook等人,MolecularCloning,A Laboratory Manual,第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)。根据任何合适的方法，可以在期望的宿主细胞中瞬时或稳定转染核酸。
还提供了包含本文所述的任何核酸或载体的宿主细胞。在某些实施方案中，提供了表达本文所述的PD-1-结合多肽的宿主细胞。可以通过任何合适的方法纯化在宿主细胞中表达的PD-1-结合多肽。这样的方法包括、但不限于使用亲和基质或疏水相互作用色谱法。合适的亲和配体包括ROR1ECD和结合Fc区的试剂。例如，蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或抗体亲和柱可以用于结合Fc区并纯化包含Fc区的PD-1-结合多肽。疏水性相互作用色谱法，例如丁基或苯基柱，也可能适用于纯化某些多肽诸如抗体。离子交换色谱法(例如阴离子交换色谱法和/或阳离子交换色谱法)也可能适用于纯化某些多肽诸如抗体。混合模式色谱法(例如反相/阴离子交换、反相/阳离子交换、亲水相互作用/阴离子交换、亲水相互作用/阳离子交换等)也可能适用于纯化某些多肽诸如抗体。许多纯化多肽的方法是本领域已知的。
在某些实施方案中，在无细胞系统中产生PD-1-结合多肽。非限制性的示例性无细胞系统描述于，例如，Sitaraman等人,Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45(2004)；Endo等人,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)。
在某些实施方案中，提供了通过上述方法制备的PD-1-结合多肽。在某些实施方案中，在宿主细胞中制备PD-1-结合多肽。在某些实施方案中，在无细胞系统中制备PD-1-结合多肽。在某些实施方案中，纯化PD-1-结合多肽。在某些实施方案中，提供了包含PD-1-结合多肽的细胞培养基。
在某些实施方案中，提供了包含通过上述方法制备的抗体的组合物。在某些实施方案中，所述组合物包含在宿主细胞中制备的PD-1-结合多肽。在某些实施方案中，所述组合物包含在无细胞系统中制备的PD-1-结合多肽。在某些实施方案中，所述组合物包含纯化的PD-1-结合多肽。
V.药物组合物和制剂
本文提供了药物组合物，其含有本文提供的PD-1-结合多肽或表达它们的经工程改造的细胞中的任一种。在某些实施方案中，PD-1-结合多肽，诸如本公开内容的融合蛋白(在本文中也被称作“活性化合物”)及其衍生物、片段、类似物和同系物，可以掺入适合施用的药物组合物中。在某些实施方案中，含有本文提供的PD-1-结合多肽的表达嵌合受体(诸如嵌合抗原受体)的经工程改造的细胞可以掺入适合施用的药物组合物中。
这样的组合物通常含有药学上可接受的载体。本文中使用的术语“药学上可接受的载体”意图包括与药物施用相容的任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(本领域中的标准参考教科书，其通过引用并入本文)的最近版中描述了合适的载体。这样的载体或稀释剂的合适例子包括、但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性媒介物诸如不挥发性油。这样的介质和试剂用于药学活性物质的用途是本领域众所周知的。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容以外，预见到其在所述组合物中的应用。还可将补充性活性化合物掺入所述组合物中。
将本公开内容的药物组合物配制成与它的预期施用途径相容。施用途径的例子包括胃肠外，例如，静脉内、真皮内、皮下、肿瘤内、口服(例如，吸入)、透皮(即，局部)、透粘膜和直肠施用。用于胃肠外、真皮内或皮下应用的溶液或混悬液可以包括以下组分：无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节张度的试剂诸如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱(诸如盐酸或氢氧化钠)调节pH。可以将胃肠外制剂包封在由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多次剂量瓶中。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑制细菌的水、CREMOPHOR ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，所述组合物必须是无菌的，且应当是流动的以达到存在容易注射性的程度。它在制备和贮存条件下必须是稳定的，并且必须被保存免于微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和它们的合适混合物的溶剂或分散介质。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣剂诸如卵磷脂通过维持所需的粒度(在分散系的情况下)和通过使用表面活性剂。微生物的作用的阻止可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂实现，例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇、氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
可以如下制备无菌可注射溶液：将所需量的活性化合物掺入到含有一种或多种以上列出的成分的适当溶剂中，根据需要然后过滤除菌。通常，通过将所述活性化合物掺入无菌媒介物来制备分散体，所述媒介物含有基本分散介质和来自上文列举的那些的所需其它成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，制备方法是产生活性成分与任何另外的期望成分的粉末的真空干燥和冷冻干燥，所述期望成分来自其以前无菌过滤的溶液。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用的载体。它们可以包封在明胶胶囊剂中或压成片剂。为了口服治疗施用的目的，可以将活性化合物和赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。口服组合物也可使用液体载体制备用作漱口剂，其中在流体载体中的化合物口服地施用，在漱口后吐出或咽下。可以包括药学上适合的粘合剂和/或辅料，作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有任意下述成分或相似性质的化合物：粘合剂诸如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂诸如淀粉或乳糖；崩解剂诸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂诸如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂诸如胶体二氧化硅；甜味剂诸如蔗糖或糖精；或矫味剂诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙味矫味剂。
就吸入施用而言，将化合物以气溶胶喷雾的形式从压力容器或分配器(其含有合适的推进剂，例如，气体诸如二氧化碳)或喷雾器中递送。
全身施用还可以是通过透粘膜或透皮方式。关于透粘膜或透皮给药，在制剂中使用适合要渗透的屏障的穿透剂。该穿透剂是本领域中普遍已知的，并且对于透粘膜给药而言，包括例如去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。透粘膜给药可以通过使用鼻喷雾或栓剂而完成。对于透皮给药，将活性化合物配制成本领域普遍已知的软膏剂、油膏剂、凝胶或乳膏剂。
也可以以用于直肠递送的栓剂(例如具有常规栓剂基质，如可可脂和其它甘油酯)或保留灌肠剂的形式，配制所述化合物。
在一个实施方案中，将活性化合物与载体一起制备，所述载体会保护化合物免于从身体中快速消除，诸如控释制剂，包括植入剂和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。本领域技术人员会明白用于制备这样的制剂的方法。所述材料还可以商业上得自AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.。脂质体混悬液也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如在美国专利号4,522,811中所述。
特别有利的是，为了施用容易和剂量均匀以剂量单位形式配制口服或胃肠外组合物。本文中使用的剂量单位形式表示适合作为要治疗的受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有与所需药用载体组合的经计算会产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。关于本公开内容的剂量单位形式的规范取决于且直接依赖于活性化合物的独有特征以及要实现的特定治疗效果,和本领域中固有的为了治疗个体配制这样的活性化合物的限制。
药物组合物可以与施用说明书一起包含在试剂盒、容器、包装或分配器中。这些药物组合物可以与使用说明书一起包含在诊断试剂盒中。
以有效治疗或预防特定适应症的量施用药物组合物。治疗有效量通常取决于所治疗的受试者的体重、他或她的身体或健康状况、要治疗的病症的广泛性或所治疗的受试者的年龄。在某些实施方案中，可以以每剂在约50μg/kg体重至约50mg/kg体重的范围内的量施用药物组合物。在某些实施方案中，可以以每剂在约100μg/kg体重至约50mg/kg体重的范围内的量施用药物组合物。在某些实施方案中，可以以每剂在约100μg/kg体重至约20mg/kg体重的范围内的量施用药物组合物。在某些实施方案中，可以以每剂在约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重的范围内的量施用药物组合物。
在某些实施方案中，可以以每剂在约10mg至约1,000mg的范围内的量施用药物组合物。在某些实施方案中，可以以每剂在约20mg至约500mg的范围内的量施用药物组合物。在某些实施方案中，可以以每剂在约20mg至约300mg的范围内的量施用药物组合物。在某些实施方案中，可以以每剂在约20mg至约200mg的范围内的量施用药物组合物。
可以根据需要将药物组合物施用给受试者。在某些实施方案中，将有效剂量的药物组合物施用给受试者一次或多次。在不同的实施方案中，将有效剂量的药物组合物施用给受试者每个月一次，每个月小于一次，例如，每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次。在其它实施方案中，施用有效剂量的药物组合物每个月超过一次，例如，每两周一次、每周一次、每周两次、每周三次、每天一次或每天多次。将有效剂量的药物组合物施用给受试者至少一次。在某些实施方案中，可以施用有效剂量的药物组合物多次，包括至少一个月、至少六个月或至少一年的阶段。在某些实施方案中，根据需要将药物组合物施用给受试者以减轻病症的一种或多种症状。
VI.治疗方法和用途
本文描述的PD-1-结合多肽或表达它们的经工程改造的细胞可用于多种治疗、诊断和预防适应症。例如，PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞可用于治疗受试者中的多种疾病和障碍。这样的方法和用途包括治疗方法和用途，例如，涉及将所述分子或经工程改造的细胞或含有它们的组合物施用给具有疾病、病症或障碍(诸如肿瘤或癌症)的受试者。在某些实施方案中，所述分子或经工程改造的细胞以有效量施用以实现疾病或障碍的治疗。用途包括含有PD-1-结合多肽的分子或经工程改造的细胞在这样的方法和治疗中的用途，以及为了实现这样的治疗方法在制备药物中的用途。在某些实施方案中，通过将PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞或包含它们的组合物施用给具有或疑似具有疾病或病症的受试者来实现所述方法。在某些实施方案中，所述方法由此治疗所述受试者中的疾病或病症或障碍。
在一个实施方案中，本公开内容的PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞可以用作治疗剂。这样的试剂通常将用于诊断、预后、监测、治疗、减轻和/或预防受试者中的疾病或病理。通过使用标准方法鉴定受试者，例如患有障碍(或处于发生障碍的风险中)的人患者或其它哺乳动物，实施治疗方案。在某些情况下，选择已知、被怀疑或已被鉴定为具有表达PD-1的肿瘤的受试者。将PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞施用给受试者。将PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞施用给受试者，并且由于其与靶标的结合而通常具有作用。
在某些实施方案中，所提供的PD-1多肽多特异性多肽构建体或经工程改造的细胞当施用给受试者时能够调节(例如增加)免疫应答，例如通过在细胞中的CD3和/或CD3信号的接合和/或通过阻断PD-1和PD-L1/PD-L2的相互作用。在某些实施方案中，本文提供了通过施用治疗有效量的所提供的多特异性构建体或经工程改造的细胞或其药物组合物来调节受试者中的免疫应答的方法。在某些实施方案中，调节免疫应答的方法增加或增强受试者中的免疫应答。例如，增加或增强的应答可以是细胞介导的免疫的增加。在某些实施例中，所述方法增加T-细胞活性，诸如细胞裂解性T-细胞(CTL)活性。在某些实施方案中，所述调节的(例如，增加的)免疫应答是针对肿瘤或癌症。
在某些实施方案中，PD-1-结合多肽(诸如PD-1-Fc融合蛋白或含有Fc区的多特异性构建体)的施用可以通过多特异性多肽构建体的Fc-区域经由FcγR的接合而活化先天性免疫细胞。这样的多特异性多肽构建体的施用可以激动、刺激、活化和/或增加先天性免疫细胞效应子功能，包括ADCC、细胞因子释放、去粒和/或ADCP。在受限制的多特异性多肽构建体的情况下，一旦连接第一组分和第二组分的接头被蛋白酶切割和/或在结合靶细胞(例如肿瘤细胞)上的肿瘤抗原后，这样的多特异性多肽构建体的施用可以活化T-细胞，由此允许抗-CD3结合部分结合T细胞上的CD3ε。在某些情况下，多特异性多肽构建体的施用可以激动、刺激、活化和/或增加CD3介导的T细胞活化、细胞毒性、细胞因子释放和/或增殖。
在某些实施方案中，通过施用治疗有效量的所提供的PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞或其药物组合物中的任一种，所提供的方法用于治疗受试者中的疾病或病症。在某些实施方案中，所述疾病或病症是肿瘤或癌症。通常，疾病或障碍的减轻或治疗涉及与疾病或障碍有关的一种或多种症状或医学问题的减轻。例如，在癌症的情况下，治疗有效量的药物可以实现以下一项或多项：减少癌细胞的数目；减小肿瘤大小；抑制(即，在某种程度上减少和/或停止)癌细胞向周围器官的浸润；抑制肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上解除与癌症有关的一种或多种症状。在某些实施方案中，本公开内容的组合物可以用于预防受试者中的疾病或障碍的发作或复发，例如，人或其它哺乳动物，诸如非人灵长类动物、伴侣动物(例如，猫、狗、马)、耕作动物、工作动物或动物园动物。术语受试者和患者在本文中可互换地使用。
在某些实施方案中，所述PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞或其药物组合物可以用于抑制哺乳动物癌细胞(诸如人癌细胞)的生长。一种治疗癌症的方法可以包括向患有癌症的受试者施用有效量的本文所述的任何药物组合物。可以施用有效量的药物组合物以抑制、停止或逆转癌症的进展。可以在体内或离体治疗人癌细胞。在人患者的离体治疗中，将含有癌细胞的组织或流体在体外处理，并然后将所述组织或流体重新引回患者体内。在某些实施方案中，通过将治疗性组合物施用进患者中在人患者体内治疗癌症。
疾病的非限制性例子包括：所有类型的癌症(乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、黑素瘤、头颈癌、胰腺癌等)，类风湿性关节炎，克罗恩氏病，SLE，心血管损伤，缺血，等。例如，适应症将包括白血病，包括T-细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)，成淋巴细胞性疾病，包括多发性骨髓瘤，和实体瘤，包括肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌，包括三重阴性的乳腺癌。例如，适应症包括骨疾病或癌症转移，无论原发肿瘤起源；乳腺癌，包括，作为非限制性例子，ER/PR+乳腺癌，Her2+乳腺癌，三重阴性的乳腺癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌；胃癌；胶质母细胞瘤；头颈癌，诸如食管癌；肺癌，诸如作为非限制性例子，非小细胞性肺癌；多发性骨髓瘤卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；肉瘤，诸如骨肉瘤；肾癌，诸如作为非限制性例子，肾细胞癌；和/或皮肤癌，诸如作为非限制性例子，鳞状细胞癌，基底细胞癌，或黑素瘤。在某些实施方案中，所述癌症是鳞状细胞癌。在某些实施方案中，所述癌症是皮肤鳞状细胞癌。在某些实施方案中，所述癌症是食管鳞状细胞癌。在某些实施方案中，所述癌症是头和颈鳞状细胞癌。在某些实施方案中，所述癌症是肺鳞状细胞癌。
在某些实施方案中，所述PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞或其药物组合物可用于治疗、改善癌症或其它赘生性病症，减轻其症状，和/或延迟其进展。在某些实施方案中，所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、子宫/宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食管癌、胃肠癌、胰腺癌、结直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、胚细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统的赘生物、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤和病毒相关的癌症。在某些实施方案中，所述癌症是转移性癌症、顽固性癌症或复发性癌症。
在某些实施方案中，本公开内容的PD-1-结合多肽(诸如融合蛋白或多特异性多肽构建体)的治疗有效量总体上涉及实现治疗目的所需的量。通常，医师可以确定要施用的本公开内容的组合物的精确量，并考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异。
在某些实施方案中，治疗有效剂量可以是，作为非限制性例子，从约0.01μg/kg体重至约10mg/kg体重。在某些实施方案中，所述治疗有效剂量可以是，作为非限制性例子，从约0.01mg/kg体重至约5-10mg/kg体重。常见施用频率可以在例如从每天两次到每周一次的范围内。
在某些实施方案中，施用治疗量的本公开内容的经工程改造的细胞组合物。通常可以说，可以以104-109个细胞/kg体重(诸如105-106个细胞/kg体重)的剂量施用包含如本文中所述的经工程改造的细胞(例如，T细胞)的药物组合物，包括在那些范围内的所有整数值。经工程改造的细胞组合物(诸如T细胞组合物)也可以在这些剂量施用多次。通过使用免疫疗法中公知的输注技术(参见，例如，Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)，可以施用所述细胞。通过监测患者的疾病征象并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
结合任何已知的用于诊断或治疗特定障碍的方法来确定治疗的有效性。用于筛选具有所需特异性的PD-1-结合多肽或含有它们的经工程改造的细胞的方法包括、但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)和本领域已知的其它免疫学介导的技术。已知多种方法来确定所提供的PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞的施用是否如下充分调节免疫活性：消除、隔离或灭活介导或能够介导不希望的免疫应答的免疫细胞；诱导、产生或开启介导或能够介导保护性免疫应答的免疫细胞；改变免疫细胞的物理或功能特性；或这些效果的组合。免疫活性调节的测量实例包括、但不限于：检查免疫细胞群体是否存在(使用流式细胞计量术、免疫组织化学、组织学、电子显微术、聚合酶链式反应(PCR))；测量免疫细胞的功能能力，包括响应于信号而增殖或分裂的能力或抗性(诸如使用T-细胞增殖测定和pepscan分析，其基于用抗-CD3抗体、抗-T-细胞受体抗体、抗-CD28抗体、钙离子载体、负载了肽或蛋白抗原的PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸盐13-乙酸盐)抗原呈递细胞刺激后的3H-胸苷掺入；B细胞增殖测定)；测量杀死或裂解其它细胞的能力(诸如细胞毒性的T细胞测定)；测量细胞因子、趋化因子、细胞表面分子、抗体和其它细胞产物(例如，通过流式细胞计量术、酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析、蛋白微阵列分析、免疫沉淀分析)；测量免疫细胞活化或免疫细胞内的信号传递途径的生化标志物(例如，酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化的蛋白质印迹和免疫沉淀分析，多肽切割，以及蛋白复合物的形成或解离；蛋白阵列分析；DNA转录，使用DNA阵列的绘图或减除杂交)；测量由细胞凋亡、坏死或其它机制引起的细胞死亡(例如，膜联蛋白V染色，TUNEL测定，凝胶电泳以测量DNA梯形，组织学；发荧光的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶测定，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶底物的蛋白质印迹分析)；测量由免疫细胞产生的基因、蛋白和其它分子(例如，RNA印迹分析、聚合酶链式反应、DNA微阵列、蛋白微阵列、二维凝胶电泳、蛋白质印迹分析、酶联免疫吸附测定、流式细胞计量术)；和测量临床症状或结果，诸如自身免疫、神经变性、以及涉及自体蛋白或自体多肽的其它疾病的改善(临床评分，对使用其它疗法的要求，功能状态，成像研究)，例如通过测量复发率或疾病严重程度。
所提供的PD-1-结合多肽也可用于多种诊断和预防制剂。在一个实施方案中，将PD-1-结合多肽施用给处于发生一种或更多种前述障碍的风险中的患者。使用遗传型、血清学或生化标志物可以确定患者的或器官的向一种或更多种障碍的倾向。
在本公开内容的另一个实施方案中，将PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞施用给诊断出与一种或更多种前述障碍有关的临床适应症的人个体。在诊断后，施用这样的治疗剂以减轻或逆转临床适应症的作用。
联合疗法
本公开内容的PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞可以单独施用或与其它治疗模式(例如其它抗癌剂)组合施用。可以在其它治疗模式之前、基本上同时或之后(即，并行地或依次)提供它们。在某些实施方案中，本文所述的治疗方法可以进一步包括施用：辐射疗法、化学疗法、疫苗接种、靶向肿瘤疗法、CAR-T疗法、溶瘤病毒疗法、癌症免疫疗法、细胞因子疗法、外科手术切除、染色质修饰、消融、冷冻疗法、针对肿瘤靶标的反义剂、针对肿瘤靶标的siRNA剂、针对肿瘤靶标的微RNA剂或抗癌剂/肿瘤剂或生物制剂，诸如抗体、细胞因子或受体细胞外结构域-Fc融合体。
在某些实施方案中，将本文提供的PD-1-结合多肽与一种或更多种化学治疗剂、CAR-T(嵌合抗原受体T-细胞)疗法、溶瘤病毒疗法、细胞因子疗法和/或靶向其它检验点分子的试剂(诸如VISTA、gpNMB、B7H4、HHLA2、CD73、CTLA4、TIGIT等)并行地施用。
在某些实施方案中，本公开内容的PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞与其它抗肿瘤剂组合使用，诸如抗-HER-2抗体，抗-CD20抗体，表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂)，HER1/EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼
Figure BDA0003110879870000961
血小板衍生的生长因子抑制剂(例如，
Figure BDA0003110879870000962
(甲磺酸伊马替尼))，COX-2抑制剂(例如，塞来考昔)，干扰素，CTLA4抑制剂(例如，抗-CTLA抗体伊匹木单抗
Figure BDA0003110879870000963
)，PD-1抑制剂(例如，抗-PD1抗体，BMS-936558)，PDL1抑制剂(例如，抗-PDL1抗体，MPDL3280A)，PDL2抑制剂(例如，抗-PDL2抗体)，细胞因子，结合以下靶标ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA、PD-1、PDL1、PDL2、CTLA4或VEGF受体中的一种或多种的拮抗剂(例如，中和抗体)，TRAIL/Apo2和其它生物活性药剂和有机化学药剂等。
在某些实施方案中，将本文提供的PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞与PD-1/PD-L1疗法并行地施用。PD-1/PD-L1疗法的例子包括：纳武单抗(BMS)；皮地利珠单抗(CureTech,CT-011),派姆单抗(Merck)；度伐单抗(Medimmune/AstraZeneca)；阿特朱单抗(Genentech/Roche)；阿维鲁单抗(Pfizer)；AMP-224(Amplimmune)；BMS-936559；AMP-514(Amplimmune)；MDX-1105(Merck)；TSR-042(Tesaro/AnaptysBio,ANB-011)；STI-A1010(Sorrento Therapeutics)；STI-A1110(Sorrento Therapeutics)；和针对程序性死亡-1(PD-1)或程序性死亡配体1(PD-L1)的其它药剂。
在某些实施方案中，本公开内容的PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞可以与化学治疗剂组合使用。化学治疗剂的例子包括、但不限于：烷化剂诸如塞替派和
Figure BDA0003110879870000964
环磷酰胺；磺酸烷基酯诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酸胺和三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物托泊替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括它的合成类似物阿多来新、卡泽来新和比泽来新)；念珠藻环肽(尤其是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成的类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosurea)诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素类诸如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素，特别是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωI1(参见，例如，Agnew,ChemIntl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐，诸如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和有关的色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、
Figure BDA0003110879870000971
多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸盐、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；抗肾上腺类诸如氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦；叶酸补充剂诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依洛尼塞；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美坦辛类诸如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；
Figure BDA0003110879870000972
多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(特别是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；尿烷(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如，
Figure BDA0003110879870000973
紫杉醇(Bristol-Myers SquibbOncology,Princeton,N.J.),
Figure BDA0003110879870000974
即紫杉醇的不含Cremophor的、白蛋白工程改造的纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois),和
Figure BDA0003110879870000975
多西紫杉醇(
Figure BDA0003110879870000976
-Poulenc Rorer,Antony,法国)；瘤可宁(Chloranbucil)；
Figure BDA0003110879870000981
吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；
Figure BDA0003110879870000982
长春瑞滨；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar,CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和亚叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维A酸类诸如视黄酸；卡培他滨；考布他汀；亚叶酸(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如，厄洛替尼
Figure BDA0003110879870000983
)和VEGF-A的抑制剂，以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
其它非限制性的示例性化学治疗剂包括抗激素剂，其起作用以调节或抑制激素对癌症的作用，诸如抗雌激素剂和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括、例如，他莫昔芬(包括
Figure BDA0003110879870000984
他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY117018、奥那司酮和
Figure BDA0003110879870000985
托瑞米芬；抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中的雌激素产生，例如，4(5)-咪唑类、氨鲁米特、
Figure BDA0003110879870000986
乙酸甲地孕酮、
Figure BDA0003110879870000987
依西美坦、福美坦(formestanie)、法倔唑、
Figure BDA0003110879870000988
伏氯唑、
Figure BDA0003110879870000989
来曲唑和
Figure BDA00031108798700009810
阿那曲唑；和抗雄激素类诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制涉入异常细胞增殖的信号传递途径中的基因(例如，PKC-α、Ralf和H-Ras)的表达的那些；核酶诸如VEGF表达抑制剂(例如，
Figure BDA00031108798700009811
核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗诸如基因疗法疫苗，例如，
Figure BDA00031108798700009812
疫苗、
Figure BDA00031108798700009813
疫苗和
Figure BDA00031108798700009814
疫苗；
Figure BDA00031108798700009815
(阿地白介素)rIL-2；
Figure BDA00031108798700009816
拓扑异构酶1抑制剂；
Figure BDA00031108798700009817
GnRH激动剂；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在某些实施方案中，将PD-1-结合多肽和另外的药剂配制在单一治疗组合物中，并同时施用PD-1-结合多肽和另外的药剂。可替换地，将PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞和另外的药剂彼此分开，例如，将每种配制成单独的治疗组合物，并同时施用PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞和另外的药剂，或在治疗方案过程中在不同时间施用PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞和另外的药剂。例如，在施用另外的药剂之前施用PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞，在施用另外的药剂之后施用PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞，或以交替方式施用PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞和另外的药剂。可以以单剂量或以多剂量施用PD-1-结合多肽和另外的药剂。
在某些实施方案中，同时施用PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞和另外的药剂。例如，可以将PD-1-结合多肽和另外的药剂配制在单一组合物中或作为两种或更多种分开的组合物施用。在某些实施方案中，依次施用PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞和另外的药剂，或在治疗方案过程中在不同时间施用PD-1-结合多肽或经工程改造的细胞和另外的药剂。
VII.示例性实施方案
提供的实施方案包括：
1.一种PD-1-结合多肽构建体，其包含至少一个特异性地结合PD-1的仅重链可变结构域(PD-1 VHH结构域)和一个或多个另外的结合除PD-1以外的靶标的结合结构域。
2.实施方案1的PD-1-结合构建体，其中所述至少一个VHH结构域包含：包含选自SEQ ID NO:268、272、273和313的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQ ID NO:278或314中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:283或315中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
3.一种PD-1-结合构建体，其包含至少一个仅重链可变结构域(PD-1VHH结构域)，该结构域包含：包含选自SEQ ID NO:268、272、273和313的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQ ID NO:278或314中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:283中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
4.实施方案1-3中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述PD-1是人PD-1。
5.实施方案1-4中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域是人源化的。
6.实施方案1、2、4和5中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结合结构域结合免疫细胞上的活化受体。
7.实施方案6的PD-1-结合多肽构建体，其中所述免疫细胞是T细胞。
8.实施方案6或实施方案7的PD-1-结合多肽构建体，其中所述活化受体是CD3(CD3ε)。
9.实施方案8的PD-1-结合多肽构建体，所述构建体是对PD-1和CD3双特异性的。
10.实施方案9的PD-1-结合多肽构建体，其中所述免疫细胞是天然杀伤(NK)细胞。
11.实施方案6或实施方案10的PD-1-结合多肽构建体，其中所述活化受体是CD16(CD16a)。
12.实施方案11的PD-1-结合多肽构建体，所述构建体是对PD-1和CD16a双特异性的。
13.实施方案1、2、4和5中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)。
14.实施方案1、2、4和5中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结合结构域结合细胞因子受体。
15.实施方案1、2和4-14中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
16.实施方案1、2和4-15中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结合结构域是单价的。
17.实施方案16的PD-1-结合多肽构建体，其中所述抗体或其抗原结合片段是Fv、二硫键稳定化的Fv(dsFv)、scFv、Fab、单结构域抗体(sdAb)、VNAR或VHH。
18.实施方案14的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结合结构域是细胞因子或是能够结合细胞因子受体的其截短片段或变体。
19.实施方案18的PD-1-结合多肽构建体，其中所述细胞因子是作为I型干扰素或II型干扰素的干扰素，是I型干扰素的截短片段或变体，或是II型干扰素的截短片段或变体。
20.实施方案19的PD-1-结合多肽构建体，其中：
所述I型干扰素是IFN-α或IFN-β或是其截短片段或变体；或者
所述II型干扰素是IFN-γ或是其截短片段或变体。
21.实施方案1-20中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述多肽包含免疫球蛋白Fc区。
22.实施方案1、2和4-21中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述多肽包含连接所述至少一个单结构域抗体和所述一个或多个另外的结合结构域的免疫球蛋白Fc区。
23.实施方案1-22中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，所述构建体是二聚体。
24.实施方案21-23中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述Fc区是同源二聚体Fc区。
25.实施方案21-24中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述Fc区包含在SEQID NO:8、10、11、12或13中的任一个中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:8、10、11、12或13中的任一个的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
26.实施方案21-24中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述Fc区是人IgG1。
27.实施方案26的PD-1-结合多肽构建体，其中所述Fc区包含在SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:8的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
28.实施方案21-23中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述Fc区是异源二聚体Fc区。
29.实施方案21-28中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述Fc区表现出效应子功能。
30.实施方案21-29中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述Fc区包含含有一个或更多个氨基酸修饰的多肽，所述氨基酸修饰减少效应子功能和/或减少与选自Fcγ受体或C1q的效应分子的结合。
31.实施方案30的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或更多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或更多个的缺失。
32.实施方案30或实施方案31的PD-1-结合多肽构建体，其中所述Fc区包含在SEQID NO:9中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:9的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
33.实施方案1-32中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1VHH结构域包含在SEQ ID NO:251-267或284中的任一个中所示的序列或表现出与SEQ IDNO:251-267或284中的任一个的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
34.实施方案1-33中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1VHH结构域包含在以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:284，(ii)SEQ ID NO:284的人源化变体，或(iii)表现出与SEQ ID NO:284的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
35.实施方案1-34中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1VHH结构域包含在SEQ ID NO:284中所示的序列。
36.实施方案1-34中的任一个的PD-1-结合多肽，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含：包含选自SEQ ID NO:268、272和273的氨基酸序列的CDR1；包含在SEQ ID NO:278中所示的氨基酸序列的CDR2；和包含在SEQ ID NO:283中所示的氨基酸序列的CDR3。
37.实施方案1-34和36中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含：分别在SEQ ID NO:268、278和283中、分别在SEQ ID NO:272、278和283中、或分别在SEQ ID NO:273、278和283中所示的CDR1、CDR2和CDR3。
38.实施方案1-34、36和37中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:251-267中的任一个中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:251-267的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
39.实施方案1-34和36-38的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:251-267中的任一个中所示的氨基酸序列。
40.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:257中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:257的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
41.实施方案1-34和36-40中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:257中所示的氨基酸序列。
42.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:251中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:251的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
43.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:252中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:252的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
44.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:253中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:253的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
45.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:254中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:254的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
46.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:255中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:255的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
47.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:256中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:256的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
48.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:258中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:258的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
49.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:259中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:259的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
50.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:260中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:260的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
51.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:261中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:261的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
52.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:262中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:262的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
53.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:263中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:263的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
54.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:264中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:264的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
55.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:265中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:265的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
56.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:266中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:266的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
57.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:267中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:267的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
58.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含与SEQ ID NO:251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267或284的至少95％序列同一性，并结合PD-1。
59.实施方案1-34和36-39中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域是如在SEQ ID NO:251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267或284中所示。
60.一种多特异性多肽构建体，其包含：(a)第一组分，其包含含有第一Fc多肽和第二Fc多肽的异源二聚体Fc区，和(b)第二组分，其包含含有可变重链区域(VH)和可变轻链区域(VL)的抗-CD3抗体或抗原结合片段，其中：
构成抗-CD3抗体或抗原结合片段的VH和VL连接至异源二聚体Fc的相对多肽；
所述第一组分和第二组分通过接头偶联，其中所述异源二聚体Fc区位于抗-CD3抗体的N-端；
所述第一组分和第二组分中的一个或两个包含至少一个结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域；和
所述第一组分和第二组分中的一个或两个包含至少一个仅重链可变结构域(PD-1VHH结构域)。
61.实施方案60的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体至少包含：(i)第一多肽，其包含异源二聚体Fc区的第一Fc多肽、接头以及抗-CD3抗体或抗原结合片段的VH或VL结构域；和(ii)第二多肽，其包含异源二聚体Fc区的第二Fc多肽、接头、任选的与在第一多肽中存在的相同的接头、和抗-CD3抗体或抗原结合片段的VH或VL结构域中的另一个，
其中所述第一多肽和第二多肽中的一个或两个独立地包含至少一个结合TAA的抗原结合结构域和至少一个PD-1 VHH结构域。
62.实施方案60或实施方案61的多特异性多肽构建体，其中与同源二聚体Fc区的多肽相比，任选地与在SEQ ID NO:245中所示的Fc多肽或其免疫学活性片段相比，异源二聚体Fc区的第一和第二Fc多肽中的一个或两个包含至少一个修饰以诱导异源二聚化。
63.实施方案62的多特异性多肽构建体，其中异源二聚体Fc的第一和第二Fc多肽中的每个独立地包含至少一个氨基酸修饰。
64.实施方案63的多特异性多肽构建体，其中异源二聚体Fc的第一和第二Fc多肽中的每个包含凸起-进入-孔洞修饰或包含电荷突变以增加多肽的静电互补性。
65.实施方案64的多特异性多肽构建体，其中所述氨基酸修饰是凸起-进入-孔洞修饰。
66.实施方案60-65中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述异源二聚体Fc的第一Fc多肽包含选自Thr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val和它们的组合的修饰，且所述异源二聚体Fc的第二Fc多肽包含修饰Thr366Trp。
67.实施方案66的多特异性多肽，其中所述第一和第二Fc多肽进一步包含非-半胱氨酸残基向半胱氨酸残基的修饰，其中所述第一多肽的修饰是在位置Ser354和Tyr349之一处，且第二Fc多肽的修饰是在位置Ser354和Tyr349中的另一个处。
68.实施方案60-64中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述氨基酸修饰是电荷突变以增加多肽的静电互补性。
69.实施方案60-64和68中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述第一和/或第二Fc多肽或所述第一和第二Fc多肽中的每一个包含在互补位置的修饰，其中所述修饰是用具有相反电荷的氨基酸替换其它多肽的互补氨基酸。
70.实施方案60-69中的任一个的多特异性多肽构建体，其中异源二聚体Fc的第一或第二Fc多肽之一进一步包含在残基Ile253处的修饰。
71.实施方案70的多特异性多肽构建体，其中所述修饰是Ile253Arg。
72.实施方案60-71中的任一个的多特异性多肽构建体，其中异源二聚体Fc的第一或第二Fc多肽之一进一步包含在残基His435处的修饰。
73.实施方案72的多特异性多肽构建体，其中所述修饰是His435Arg。
74.实施方案60-73中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述Fc区包含缺少Lys447的多肽。
75.实施方案60-74中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述Fc区包含含有至少一个修饰以增强FcRn结合的多肽。
76.实施方案75的多特异性多肽构建体，其中所述修饰是在选自以下的位置：Met252、Ser254、Thr256、Met428、Asn434和它们的组合。
77.实施方案76的多特异性多肽构建体，其中所述修饰是在选自以下的位置：Met252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S和它们的组合。
78.实施方案76的多特异性多肽构建体，其中所述修饰是在位置Met252和在位置Met428。
79.实施方案78的多特异性多肽构建体，其中所述修饰是Met252Y和Met428L。
80.实施方案76的多特异性多肽构建体，其中所述修饰是Met252Y和Met428V。
81.实施方案60-80中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述异源二聚体Fc的第一多肽包含在SEQ ID NO:103、107、115或117中的任一个中所示的氨基酸序列，且所述异源二聚体Fc的第二多肽包含在SEQ ID NO:104、108、111、113、119或121中的任一个中所示的氨基酸序列。
82.实施方案1-81中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述Fc区包含含有至少一个氨基酸修饰的多肽，所述氨基酸修饰减少效应子功能和/或减少与选自Fcγ受体或C1q的效应分子的结合。
83.实施方案82的多特异性多肽构建体，其中所述一个或更多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或更多个的缺失。
84.实施方案60-83中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述异源二聚体Fc的第一多肽包含在SEQ ID NO:105、109、116或118中的任一个中所示的氨基酸序列，且所述异源二聚体Fc的第二多肽包含在SEQ ID NO:106、110、112、114、120或122中的任一个中所示的氨基酸序列。
85.实施方案60-84中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述抗-CD3抗体或抗原结合片段是单价的。
86.实施方案60-85中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述抗-CD3抗体或抗原结合片段不是单链抗体，任选地不是单链可变片段(scFv)。
87.实施方案60-86中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述抗-CD3抗体或抗原结合片段是Fv抗体片段。
88.实施方案87的多特异性多肽构建体，其中所述Fv抗体片段包含二硫键稳定化的抗-CD3结合Fv片段(dsFv)。
89.实施方案60-88中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述抗-CD3抗体或抗原结合片段包含：包含氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:29)的VH CDR1；包含氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:30)的VH CD2；包含氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ IDNO:31)的VH CDR3；包含氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:32)的VL CDR1；包含氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:33)的VL CDR2；和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:34)的VL CDR3。
90.实施方案60-89中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述抗-CD3抗体或抗原结合片段包含：
VH，其具有SEQ ID NO:35-65中的任一个的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:35-65中的任一个的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；和
VL，其具有SEQ ID NO:66-85和293中的任一个的氨基酸序列或表现出与SEQ IDNO:66-85和293中的任一个的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
91.实施方案60-90中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述抗-CD3抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列和SEQ ID NO:75的氨基酸序列。
92.实施方案60-90中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述抗-CD3抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列和SEQ ID NO:285的氨基酸序列。
93.实施方案60-92中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1VHH结构域位于多特异性多肽构建体的相对于Fc区的氨基端和/或相对于CD3结合区域的羧基端。
94.实施方案60-93中的任一个的多特异性多肽构建体，其中
所述第一多肽包含：按N-端至C-端的顺序，结合TAA的第一抗原结合结构域、包含异源二聚体Fc区的第一Fc多肽的第一多肽、接头、抗-CD3抗体或抗原结合片段的VH或VL结构域、以及结合TAA的第二抗原结合结构域；和
所述第二多肽包含至少一个PD-1 VHH结构域且包含：按N-端至C-端的顺序，异源二聚体Fc区的第二Fc多肽、接头、任选的与在第一多肽中存在的相同的接头、和抗-CD3抗体或抗原结合片段的VH或VL结构域中的另一个，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域位于相对于Fc区的氨基端和/或相对于CD3结合区域的羧基端。
95.实施方案60-94中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体仅包含一个特异性地结合PD-1的PD-1 VHH结构域。
96.实施方案60-95中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述PD-1 VHH结构域位于相对于多特异性构建体的Fc区的氨基端。
97.实施方案60-96中的任一个的多特异性多肽构建体，其中
所述第一多肽包含：按N-端至C-端的顺序，结合TAA的第一抗原结合结构域、包含异源二聚体Fc区的第一Fc多肽的第一多肽、接头、抗-CD3抗体或抗原结合片段的VH或VL结构域、以及结合TAA的第二抗原结合结构域；和
所述第二多肽包含：按N-端至C-端的顺序，异源二聚体Fc区的第二Fc多肽、接头、任选的与在第一多肽中存在的相同的接头、抗-CD3抗体或抗原结合片段的VH或VL结构域中的另一个以及PD-1 VHH结构域。
98.实施方案60-95中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述PD-1 VHH结构域位于相对于多特异性构建体的Fc区的氨基端。
99.实施方案60-95和98中的任一个的多特异性多肽构建体，其中
所述第一多肽包含：按N-端至C-端的顺序，结合TAA的第一抗原结合结构域、包含异源二聚体Fc区的第一Fc多肽的第一多肽、接头、抗-CD3抗体或抗原结合片段的VH或VL结构域、以及结合TAA的第二抗原结合结构域；和
所述第二多肽包含：按N-端至C-端的顺序，PD-1 VHH结构域、异源二聚体Fc区的第二Fc多肽、接头、任选的与在第一多肽中存在的相同的接头、和抗-CD3抗体或抗原结合片段的VH或VL结构域中的另一个。
100.实施方案60-99中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1VHH结构域包含在SEQ ID NO:251-267或284中的任一个中所示的序列或表现出与SEQ IDNO:251-267或284中的任一个的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
101.实施方案60-100中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1VHH结构域包含在以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:284，(ii)SEQ ID NO:284的人源化变体，或(iii)表现出与SEQ ID NO:284的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
102.实施方案60-101中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1VHH结构域包含在SEQ ID NO:284中所示的序列。
103.实施方案60-101中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1VHH结构域包含：包含选自SEQ ID NO:268、272和273的氨基酸序列的CDR1；包含在SEQ IDNO:278中所示的氨基酸序列的CDR2；和包含在SEQ ID NO:283中所示的氨基酸序列的CDR3。
104.实施方案60-100和103中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含：分别在SEQ ID NO:268、278和283中、分别在SEQ ID NO:272、278和283中或分别在SEQ ID NO:273、278和283中所示的CDR1、CDR2和CDR3。
105.实施方案60-100、103和104中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:251-267中的任一个中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:251-267的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
106.实施方案60-100和103-105的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1VHH结构域包含在SEQ ID NO:251-267中的任一个中所示的氨基酸序列。
107.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:257中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:257的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
108.实施方案60-100和103-107中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:257中所示的氨基酸序列。
109.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:251中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:251的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
110.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:252中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:252的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
111.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:253中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:253的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
112.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:254中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:254的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
113.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:255中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:255的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
114.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:256中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:256的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
115.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:258中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:258的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
116.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:259中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:259的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
117.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:260中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:260的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
118.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:261中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:261的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
119.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:262中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:262的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
120.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:263中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:263的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
121.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:264中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:264的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
122.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:265中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:265的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
123.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:266中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:266的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
124.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:267中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:267的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
125.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含表现出与SEQ ID NO:251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267或284的至少95％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
126.实施方案60-100和103-106中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域是如在SEQ ID NO:251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267或284中所示。
127.实施方案60-126中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述第一组分和第二组分中的一个或两个包含至少一个结合共刺激性受体的共刺激性受体结合区域(CRBR)。
128.实施方案127的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个共刺激性受体结合区域(CRBR)位于多特异性多肽构建体的相对于Fc区的氨基端和/或相对于CD3结合区域的羧基端。
129.实施方案127或实施方案128的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体仅包含一个共刺激性受体结合区域(CRBR)。
130.实施方案127-129中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体包含两个共刺激性受体结合区域(CRBR)，任选地它们是相同的或不同的。
131.实施方案127-129中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个共刺激性受体结合区域(CRBR)是或包含共刺激性受体的天然同源结合配偶体的细胞外结构域或其结合片段，或其表现出与共刺激性受体的结合活性的变体。
132.实施方案127-130中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个共刺激性受体结合区域(CRBR)是选自以下的抗体或其抗原结合片段：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
133.实施方案132的多特异性多肽构建体，其中所述抗体或其抗原结合片段是Fv、scFv、Fab、单结构域抗体(sdAb)、VNAR或VHH。
134.实施方案1132或实施方案133的多特异性多肽构建体，其中所述抗体或抗原结合片段是sdAb。
135.实施方案134的多特异性多肽构建体，其中所述sdAb是人或人源化的sdAb。
136.实施方案127-135中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个共刺激性受体结合区域(CRBR)结合选自以下的共刺激性受体：41BB(CD137)、OX40(CD134)、CD27、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、CD28、ICOS、CD40、B-细胞活化因子受体(BAFF-R)、B-细胞成熟抗原(BCMA)、跨膜活化剂和CAML相互作用物(TACI)和NKG2D。
137.实施方案127-136中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个共刺激性受体结合区域(CRBR)结合选自以下的共刺激性受体：41BB(CD137)、OX40(CD134)和糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)。
138.实施方案127-137中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个共刺激性受体结合区域(CRBR)包含在SEQ ID NO:210中所示的氨基酸序列或与在SEQ ID NO:210中所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，并结合4-1BB。
139.实施方案60-138中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体包含结合TAA的第一和第二抗原结合结构域。
140.实施方案139的多特异性多肽构建体，其中所述抗原结合结构域结合相同的肿瘤相关抗原(TAA)。
141.实施方案139或实施方案149的多特异性多肽构建体，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合相同TAA的不同或不重叠表位和/或竞争对相同TAA的结合。
142.实施方案139的多特异性多肽构建体，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合不同的TAA。
143.实施方案139-142中的任一个的多特异性多肽构建体，其中一个抗原结合结构域位于相对于Fc区的氨基端且一个抗原结合结构域位于相对于CD3结合区域的羧基端。
144.实施方案60-143中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述结合TAA的抗原结合结构域、或独立地每个结合TAA的抗原结合结构域包含TAA的天然同源结合配偶体的细胞外结构域或其结合片段、或其表现出对TAA的结合活性的变体。
145.实施方案60-143中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述结合TAA的抗原结合结构域、或独立地每个结合TAA的抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。
146.实施方案145的多特异性多肽构建体，其中所述抗体或其抗原结合片段是Fv、scFv、Fab、单结构域抗体(sdAb)、VNAR或VHH。
147.实施方案145或实施方案146的多特异性多肽构建体，其中所述抗体或抗原结合片段是sdAb。
148.实施方案147的多特异性多肽构建体，其中所述sdAb是人或人源化的sdAb。
149.实施方案60-148中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述抗原结合结构域、或独立地每个抗原结合结构域结合选自以下的肿瘤抗原：1-92-LFA-3,5T4,α-4整联蛋白,α-V整联蛋白,α4β1整联蛋白,α4β7整联蛋白,AGR2,抗-Lewis-Y,Apelin J受体,APRIL,B7-H3,B7-H4,BAFF,BTLA,C5补体,C-242,CA9,CA19-9,(Lewis a),碳酸酐酶9,CD2,CD3,CD6,CD9,CD11a,CD19,CD20,CD22,CD24,CD25,CD27,CD28,CD30,CD33,CD38,CD40,CD40L,CD41,CD44,CD44v6,CD47,CD51,CD52,CD56,CD64,CD70,CD71,CD74,CD80,CD81,CD86,CD95,CD117,CD123,CD125,CD132,(IL-2RG),CD133,CD137,CD138,CD166,CD172A,CD248,CDH6,CEACAM5(CEA),CEACAM6(NCA-90),封闭蛋白-3,封闭蛋白-4,cMet,胶原,Cripto,CSFR,CSFR-1,CTLA-4,CTGF,CXCL10,CXCL13,CXCR1,CXCR2,CXCR4,CYR61,DL44,DLK1,DLL3,DLL4,DPP-4,DSG1,EDA,EDB,EGFR,EGFRviii,内皮缩血管肽B受体(ETBR),ENPP3,EpCAM,EPHA2,EPHB2,ERBB3,RSV的F蛋白,FAP,FGF-2,FGF8,FGFR1,FGFR2,FGFR3,FGFR4,FLT-3,叶酸盐受体α(FRα),GAL3ST1,G-CSF,G-CSFR,GD2,GITR,GLUT1,GLUT4,GM-CSF,GM-CSFR,GP IIb/IIIa受体,Gp130,GPIIB/IIIA,GPNMB,GRP78,HER2/neu,HER3,HER4,HGF,hGH,HVEM,透明质酸酶,ICOS,IFNα,IFNβ,IFNγ,IgE,IgE受体(FceRI),IGF,IGF1R,IL1B,IL1R,IL2,IL11,IL12,IL12p40,IL-12R,IL-12Rβ1,IL13,IL13R,IL15,IL17,IL18,IL21,IL23,IL23R,IL27/IL27R(wsx1),IL29,IL-31R,IL31/IL31R,IL2R,IL4,IL4R,IL6,IL6R,胰岛素受体,Jagged配体,Jagged 1,Jagged 2,KISS1-R,LAG-3,LIF-R,Lewis X,LIGHT,LRP4,LRRC26,Ly6G6D,LyPD1,MCSP,间皮素,MRP4,MUC1,粘蛋白-16(MUC16,CA-125),Na/K ATP酶,NGF,Nicastrin,Notch受体,Notch 1,Notch 2,Notch 3,Notch 4,NOV,OSM-R,OX-40,PAR2,PDGF-AA,PDGF-BB,PDGFRα,PDGFRβ,PD-1,PD-L1,PD-L2,磷脂酰-丝氨酸,P1GF,PSCA,PSMA,PSGR,RAAG12,RAGE,SLC44A4,鞘氨醇1磷酸酯,STEAP1,STEAP2,TAG-72,TAPA1,TEM-8,TGFβ,TIGIT,TIM-3,TLR2,TLR4,TLR6,TLR7,TLR8,TLR9,TMEM31,TNFα,TNFR,TNFRS12A,TRAIL-R1,TRAIL-R2,转铁蛋白,转铁蛋白受体,TRK-A,TRK-B,uPAR,VAP1,VCAM-1,VEGF,VEGF-A,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,VEGFR1,VEGFR2,VEGFR3,VISTA,WISP-1,WISP-2,和WISP-3。
150.实施方案139-149中的任一个的多特异性多肽构建体，其中：
所述第一多肽包含：按N-端至C-端的顺序，结合TAA的第一抗原结合结构域、包含异源二聚体Fc区的第一Fc多肽的第一多肽、接头、抗-CD3抗体或抗原结合片段的VH或VL结构域、以及结合TAA的第二抗原结合结构域；和
所述第二多肽包含：按N-端至C-端的顺序，PD-1 VHH结构域或CRBR之一、异源二聚体Fc区的第二Fc多肽、接头、任选的与在第一多肽中存在的相同的接头、抗-CD3抗体或抗原结合片段的VH或VL结构域中的另一个、以及PD-1 VHH结构域或CRBR中的另一个。
151.实施方案60-150中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述接头是肽或多肽接头，任选地其中所述接头是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度。
152.实施方案60-151中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述接头是不可切割的接头。
153.实施方案152的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割的接头包含GS、GGS、GGGGS(SEQ ID NO:125)、GGGGGS(SEQ ID NO:126)和它们的组合。
154.实施方案60-153中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述接头是或包含序列GGGGGSGGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:127)。
155.实施方案60-151中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述接头是可切割的接头。
156.实施方案155的多特异性多肽构建体，其中所述可切割的接头是作为蛋白酶的底物起作用的多肽。
157.实施方案156的多特异性多肽构建体，其中所述蛋白酶由免疫效应细胞、肿瘤或存在于肿瘤微环境中的细胞产生。
158.实施方案156或实施方案157的多特异性多肽构建体，其中所述蛋白酶由免疫效应细胞产生，且所述免疫效应细胞是活化的T细胞、天然杀伤(NK)细胞或NK T细胞。
159.实施方案156-158中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述蛋白酶选自matriptase、基质金属蛋白酶(MMP)、粒酶B和它们的组合。
160.实施方案159的多特异性多肽构建体，其中所述蛋白酶是粒酶B。
161.实施方案156-160中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述可切割的接头包含氨基酸序列GGSGGGGIEPDIGGSGGS(SEQ ID NO:171)。
162.一种分离的结合PD-1的单结构域抗体，所述抗体包含：包含选自SEQ ID NO:268、272和273的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQ ID NO:278中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:283中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
163.实施方案162的分离的单结构域抗体，其包含在SEQ ID NO:251-267或284中的任一个中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:251-267或284中的任一个的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
164.实施方案162或实施方案163的分离的单结构域抗体，其中所述单结构域抗体包含在以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:284，(ii)SEQ ID NO:284的人源化变体，或(iii)表现出与SEQ ID NO:284的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
165.实施方案162-164中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含在SEQ ID NO:284中所示的序列。
166.实施方案162-164中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含：包含选自SEQ ID NO:268、272和273的氨基酸序列的CDR1；包含在SEQ ID NO:278中所示的氨基酸序列的CDR2；和包含在SEQ ID NO:283中所示的氨基酸序列的CDR3。
167.实施方案162-164和166中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含分别在SEQ ID NO:268、278和283中、分别在SEQ ID NO:272、278和283中或分别在SEQ IDNO:273、278和283中所示的CDR1、CDR2和CDR3。
168.实施方案162-164、166和167中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:251-267中的任一个中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:251-267的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
169.实施方案162-164和166-168中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含在SEQ ID NO:251-267中的任一个中所示的氨基酸序列。
170.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:257中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:257的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
171.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:257中所示的氨基酸序列。
172.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:251中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:251的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
173.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:252中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:252的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
174.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:253中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:253的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
175.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:254中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:254的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
176.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:255中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:255的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
177.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:256中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:256的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
178.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:258中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:258的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
179.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:259中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:259的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
180.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:260中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:260的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
181.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:261中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:261的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
182.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:262中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:262的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
183.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:263中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:263的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
184.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:264中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:264的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
185.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:265中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:265的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
186.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:266中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:266的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
187.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述至少一个PD-1sdAb包含在SEQ ID NO:267中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:267的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
188.实施方案162-164和166-169中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含在SEQ ID NO:251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267或284中所示的氨基酸序列。
189.一种多核苷酸，其编码实施方案1-59中的任一个的PD-1-结合多肽。
190.一种多核苷酸，其编码实施方案60-161中的任一个的多特异性多肽构建体。
191.一种多核苷酸，其包含：编码实施方案60-161中的任一个的多特异性构建体的第一多肽的第一核酸序列和编码所述多特异性构建体的第二多肽的第二核酸序列，其中所述第一和第二核酸序列被内核糖体进入位点(IRES)隔开，或编码自切割肽或造成核糖体跳跃的肽的核酸。
192.实施方案191的多核苷酸，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至相同启动子。
193.实施方案192的多核苷酸，其中所述编码自切割肽或造成核糖体跳跃的肽的核酸选自T2A、P2A、E2A或F2A。
194.一种多核苷酸，其编码实施方案162-188中的任一个的单结构域抗体。
195.一种载体，其包含实施方案189-194中的任一个的多核苷酸。
196.实施方案195的载体，所述载体是表达载体。
197.实施方案195或实施方案196的载体，所述载体是病毒载体或真核载体，任选地其中所述真核载体是哺乳动物载体。
198.一种细胞，其包含实施方案189-194中的任一个的一种或多种多核苷酸或实施方案195-197中的任一个的载体。
199.实施方案198的细胞，其中所述细胞是重组的或分离的。
200.实施方案199的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
201.一种生产多肽的方法，所述方法包括向细胞中引入实施方案189-194中的任一个的一种或多种多核苷酸或实施方案195-197中的任一个的载体，和在产生多特异性多肽构建体的条件下培养所述细胞。
202.实施方案201的方法，所述方法进一步包括从所述细胞分离或纯化所述多肽。
203.通过实施方案201或实施方案202的方法生产的多肽。
204.一种经工程改造的免疫细胞，其包含结合分子，所述结合分子包含实施方案1-59中的任一个的结合分子或实施方案162-188中的任一个的单结构域抗体，任选地其中所述结合分子可从所述细胞中分泌。
205.实施方案204的经工程改造的细胞，所述细胞进一步包含嵌合抗原受体(CAR)。
206.实施方案204或实施方案205的经工程改造的免疫细胞，其中所述细胞是淋巴细胞。
207.实施方案205-206中的任一个的经工程改造的免疫细胞，其中所述细胞是T细胞或天然杀伤(NK)细胞。
208.实施方案205-207中的任一个的经工程改造的免疫细胞，其中所述CAR包含含有结合TAA的抗原结合结构域的细胞外结构域、跨膜结构域；和细胞内信号传递结构域。
209.实施方案208的经工程改造的免疫细胞，其中所述细胞内信号传递结构域包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)信号传递结构域，任选地其中所述细胞内信号传递结构域是或包含CD3ζ信号传递结构域，任选地是或包含人CD3ζ信号传递结构域。
210.实施方案209的经工程改造的免疫细胞，其中所述细胞内信号传递结构域进一步包含共刺激分子的信号传递结构域。
211.一种药物组合物，其包含实施方案1-59中的任一个的PD-1-结合多肽、实施方案60-161中的任一个的多特异性多肽构建体、实施方案162-188中的任一个的单结构域抗体或实施方案204-210中的任一个的经工程改造的免疫细胞。
212.实施方案211的药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体。
213.实施方案211或实施方案212的药物组合物，所述药物组合物是无菌的。
214.一种在受试者中刺激或诱导免疫应答的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用实施方案1-59中的任一个的PD-1-结合多肽、实施方案60-161中的任一个的多特异性多肽构建体、实施方案162-188中的任一个的单结构域抗体或实施方案204-210中的任一个的经工程改造的免疫细胞或实施方案211-213的药物组合物。
215.实施方案214的方法，其中针对肿瘤或癌症的免疫应答增加，任选地表达PD-1的肿瘤或癌症。
216.实施方案214或实施方案215的方法，其中所述方法治疗受试者中的疾病或病症。
217.一种治疗受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方案1-59中的任一个的PD-1-结合多肽、实施方案60-161中的任一个的多特异性多肽构建体、实施方案162-188中的任一个的单结构域抗体或实施方案204-210中的任一个的经工程改造的免疫细胞或实施方案211-213的药物组合物。
218.实施方案216或实施方案217的方法，其中所述疾病或病症是肿瘤或癌症。
219.实施方案214-218中的任一个的方法，其中所述受试者是人。
220.实施方案1的PD-1-结合构建体，其中所述至少一个VHH结构域包含：包含在SEQ ID NO:300中所示的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQ ID NO:301中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:302中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
221.实施方案1的PD-1-结合构建体，其中所述至少一个VHH结构域包含：包含在SEQ ID NO:303中所示的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQ ID NO:304中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:305中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
222.实施方案1的PD-1-结合构建体，其中所述至少一个VHH结构域包含：包含在SEQ ID NO:306中所示的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQ ID NO:307中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:308中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
223.实施方案1的PD-1-结合构建体，其中所述至少一个VHH结构域包含：包含在SEQ ID NO:309中所示的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQ ID NO:310中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:311中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
224.一种PD-1-结合构建体，其包含至少一个仅重链可变结构域(PD-1VHH结构域)，该结构域包含：包含在SEQ ID NO:300中所示的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQ ID NO:301中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:302中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
225.一种PD-1-结合构建体，其包含至少一个仅重链可变结构域(PD-1VHH结构域)，该结构域包含：包含在SEQ ID NO:303中所示的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQ ID NO:304中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:305中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
226.一种PD-1-结合构建体，其包含至少一个仅重链可变结构域(PD-1VHH结构域)，该结构域包含：包含在SEQ ID NO:306中所示的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQ ID NO:307中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:308中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
227.一种PD-1-结合构建体，其包含至少一个仅重链可变结构域(PD-1VHH结构域)，该结构域包含：包含在SEQ ID NO:309中所示的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQ ID NO:310中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:311中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
228.实施方案220-227中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述PD-1是人PD-1。
229.实施方案220-228中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域是人源化的。
230.实施方案220-224和228-229中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结合结构域结合免疫细胞上的活化受体。
231.实施方案230的PD-1-结合多肽构建体，其中所述免疫细胞是T细胞。
232.实施方案230或实施方案231的PD-1-结合多肽构建体，其中所述活化受体是CD3(CD3ε)。
233.实施方案232的PD-1-结合多肽构建体，所述构建体是对PD-1和CD3双特异性的。
234.实施方案233的PD-1-结合多肽构建体，其中所述免疫细胞是天然杀伤(NK)细胞。
235.实施方案230或实施方案234的PD-1-结合多肽构建体，其中所述活化受体是CD16(CD16a)。
236.实施方案235的PD-1-结合多肽构建体，所述构建体是对PD-1和CD16a双特异性的。
237.实施方案220-224和228-229中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)。
238.实施方案220-224和228-229中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结合结构域结合细胞因子受体。
239.实施方案220-224和228-238中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
240.实施方案220-224和228-239中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结合结构域是单价的。
241.实施方案240的PD-1-结合多肽构建体，其中所述抗体或其抗原结合片段是Fv、二硫键稳定化的Fv(dsFv)、scFv、Fab、单结构域抗体(sdAb)、VNAR或VHH。
242.实施方案238的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结合结构域是细胞因子或是能够结合细胞因子受体的其截短片段或变体。
243.实施方案242的PD-1-结合多肽构建体，其中所述细胞因子是作为I型干扰素或II型干扰素的干扰素，是I型干扰素的截短片段或变体，或是II型干扰素的截短片段或变体。
244.实施方案243的PD-1-结合多肽构建体，其中：
所述I型干扰素是IFN-α或IFN-β或是其截短片段或变体；或者
所述II型干扰素是IFN-γ或是其截短片段或变体。
245.实施方案220-244中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述多肽包含免疫球蛋白Fc区。
246.实施方案220-224和228-245中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述多肽包含连接至少一个单结构域抗体和一个或多个另外的结合结构域的免疫球蛋白Fc区。
247.实施方案220-246中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，所述构建体是二聚体。
248.实施方案245-247中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述Fc区是同源二聚体Fc区。
249.实施方案245-248中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述Fc区包含在SEQ ID NO:8、10、11、12或13中的任一个中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:8、10、11、12或13中的任一个的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
250.实施方案245-248中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述Fc区是人IgG1。
251.实施方案250的PD-1-结合多肽构建体，其中所述Fc区包含在SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:8的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
252.实施方案245-247中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述Fc区是异源二聚体Fc区。
253.实施方案245-252中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述Fc区表现出效应子功能。
254.实施方案245-253中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述Fc区包含含有一个或更多个氨基酸修饰的多肽，所述氨基酸修饰减少效应子功能和/或减少与选自Fcγ受体或C1q的效应分子的结合。
255.实施方案254的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或更多个氨基酸修饰是Glu233、Leu234或Leu235中的一个或更多个的缺失。
256.实施方案254或实施方案255的PD-1-结合多肽构建体，其中所述Fc区包含在SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:9的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
257.实施方案220-256中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:296-299中的任一个中所示的序列或表现出与SEQ IDNO:296-299中的任一个的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
258.实施方案220-257中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:296，(ii)SEQ ID NO:296的人源化变体，或(iii)表现出与SEQ ID NO:296的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
259.实施方案220-258中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:296中所示的序列。
260.实施方案220-258中的任一个的PD-1-结合多肽，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含：包含在SEQ ID NO:300中所示的氨基酸序列的CDR1；包含在SEQ ID NO:301中所示的氨基酸序列的CDR2；和包含在SEQ ID NO:302中所示的氨基酸序列的CDR3。
261.实施方案220-258和260 36中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含分别在SEQ ID NO:300、301和302中所示的CDR1、CDR2和CDR3。
262.实施方案220-257中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:297，(ii)SEQ ID NO:297的人源化变体，或(iii)表现出与SEQ ID NO:297的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
263.实施方案220-257和262中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:297中所示的序列。
264.实施方案220-257和262中的任一个的PD-1-结合多肽，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含：包含在SEQ ID NO:303中所示的氨基酸序列的CDR1；包含在SEQ ID NO:304中所示的氨基酸序列的CDR2；和包含在SEQ ID NO:305中所示的氨基酸序列的CDR3。
265.实施方案220-257、262和264中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含分别在SEQ ID NO:303、304和305中所示的CDR1、CDR2和CDR3。
266.实施方案220-257中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:298，(ii)SEQ ID NO:298的人源化变体，或(iii)表现出与SEQ ID NO:298的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
267.实施方案220-257和266中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:297中所示的序列。
268.实施方案220-257和266中的任一个的PD-1-结合多肽，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含：包含在SEQ ID NO:306中所示的氨基酸序列的CDR1；包含在SEQ ID NO:307中所示的氨基酸序列的CDR2；和包含在SEQ ID NO:308中所示的氨基酸序列的CDR3。
269.实施方案220-257、266和268中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含分别在SEQ ID NO:306、307和308中所示的CDR1、CDR2和CDR3。
270.实施方案220-257中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:299，(ii)SEQ ID NO:299的人源化变体，或(iii)表现出与SEQ ID NO:299的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
271.实施方案220-257和270中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:299中所示的序列。
272.实施方案220-257和270中的任一个的PD-1-结合多肽，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含：包含在SEQ ID NO:309中所示的氨基酸序列的CDR1；包含在SEQ ID NO:310中所示的氨基酸序列的CDR2；和包含在SEQ ID NO:311中所示的氨基酸序列的CDR3。
273.实施方案220-257、270和272中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含分别在SEQ ID NO:309、310和311中所示的CDR1、CDR2和CDR3。
274.实施方案220-258、260-262、264-266、268-270和272-273中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含与SEQ ID NO:296-299的至少95％序列同一性，并结合PD-1。
275.实施方案220-258、260-262、264-266、268-270和272-274中的任一个的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域是如在SEQ ID NO:296-299中所示。
276.实施方案60-99中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1VHH结构域包含在SEQ ID NO:296-299中的任一个中所示的序列或表现出与SEQ ID NO:296-299中的任一个的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
277.实施方案60-99或276中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:296，(ii)SEQ ID NO:296的人源化变体，或(iii)表现出与SEQ ID NO:296的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
278.实施方案60-99、276或277中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:296中所示的序列。
279.实施方案60-99、276或277中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含：包含在SEQ ID NO:300中所示的氨基酸序列的CDR1；包含在SEQID NO:301中所示的氨基酸序列的CDR2；和包含在SEQ ID NO:302中所示的氨基酸序列的CDR3。
280.实施方案60-99、276、277或279中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含分别在SEQ ID NO:300、301和302中所示的CDR1、CDR2和CDR3。
281.实施方案60-99或276中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:297，(ii)SEQ ID NO:297的人源化变体，或(iii)表现出与SEQ ID NO:297的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
282.实施方案60-99、276或281中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:297中所示的序列。
283.实施方案60-99、276或281中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含：包含在SEQ ID NO:303中所示的氨基酸序列的CDR1；包含在SEQID NO:304中所示的氨基酸序列的CDR2；和包含在SEQ ID NO:305中所示的氨基酸序列的CDR3。
284.实施方案60-99、276、281或283中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含分别在SEQ ID NO:303、304和305中所示的CDR1、CDR2和CDR3。
285.实施方案60-99或276中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:298，(ii)SEQ ID NO:298的人源化变体，或(iii)表现出与SEQ ID NO:298的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
286.实施方案60-99、276或285中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:297中所示的序列。
287.实施方案60-99、276或285中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含：包含在SEQ ID NO:306中所示的氨基酸序列的CDR1；包含在SEQID NO:307中所示的氨基酸序列的CDR2；和包含在SEQ ID NO:308中所示的氨基酸序列的CDR3。
288.实施方案60-99、276、285或287中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含分别在SEQ ID NO:306、307和308中所示的CDR1、CDR2和CDR3。
289.实施方案60-99或276中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:299，(ii)SEQ ID NO:299的人源化变体，或(iii)表现出与SEQ ID NO:299的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
290.实施方案60-99、276或289中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含在SEQ ID NO:299中所示的序列。
291.实施方案60-99、276或289中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含：包含在SEQ ID NO:309中所示的氨基酸序列的CDR1；包含在SEQID NO:310中所示的氨基酸序列的CDR2；和包含在SEQ ID NO:311中所示的氨基酸序列的CDR3。
292.实施方案60-99、276、289或291中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含分别在SEQ ID NO:300、301和302中所示的CDR1、CDR2和CDR3。
293.实施方案60-99或276-292中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域包含表现出与SEQ ID NO:296、297、298或299的至少95％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
294.实施方案60-99或276-292中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个PD-1 VHH结构域是如在SEQ ID NO:296、297、298或299中所示。
295.实施方案276-294中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述第一组分和第二组分中的一个或两个包含至少一个结合共刺激性受体的共刺激性受体结合区域(CRBR)。
296.实施方案295的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个共刺激性受体结合区域(CRBR)位于多特异性多肽构建体的相对于Fc区的氨基端和/或相对于CD3结合区域的羧基端。
297.实施方案295或实施方案296的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体仅包含一个共刺激性受体结合区域(CRBR)。
298.实施方案295-297中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体包含两个共刺激性受体结合区域(CRBR)，任选地它们是相同的或不同的。
299.实施方案295-297中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个共刺激性受体结合区域(CRBR)是或包含共刺激性受体的天然同源结合配偶体的细胞外结构域或其结合片段，或其表现出与共刺激性受体的结合活性的变体。
300.实施方案295-298中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个共刺激性受体结合区域(CRBR)是选自以下的抗体或其抗原结合片段：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
301.实施方案300的多特异性多肽构建体，其中所述抗体或其抗原结合片段是Fv、scFv、Fab、单结构域抗体(sdAb)、VNAR或VHH。
302.实施方案300或实施方案301的多特异性多肽构建体，其中所述抗体或抗原结合片段是sdAb。
303.实施方案302的多特异性多肽构建体，其中所述sdAb是人或人源化的sdAb。
304.实施方案295-303中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个共刺激性受体结合区域(CRBR)结合选自以下的共刺激性受体：41BB(CD137)、OX40(CD134)、CD27、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、CD28、ICOS、CD40、B-细胞活化因子受体(BAFF-R)、B-细胞成熟抗原(BCMA)、跨膜活化剂和CAML相互作用物(TACI)和NKG2D。
305.实施方案295-304中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个共刺激性受体结合区域(CRBR)结合选自以下的共刺激性受体：41BB(CD137)、OX40(CD134)和糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)。
306.实施方案295-305中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述至少一个共刺激性受体结合区域(CRBR)包含在SEQ ID NO:210中所示的氨基酸序列或与在SEQ ID NO:210中所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，并结合4-1BB。
307.实施方案276-306中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体包含结合TAA的第一和第二抗原结合结构域。
308.实施方案307的多特异性多肽构建体，其中所述抗原结合结构域结合相同的肿瘤相关抗原(TAA)。
309.实施方案307或实施方案308的多特异性多肽构建体，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合相同TAA的不同或不重叠表位和/或竞争对相同TAA的结合。
310.实施方案307的多特异性多肽构建体，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合不同的TAA。
311.实施方案307-310中的任一个的多特异性多肽构建体，其中一个抗原结合结构域位于相对于Fc区的氨基端且一个抗原结合结构域位于相对于CD3结合区域的羧基端。
312.实施方案276-311中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述结合TAA的抗原结合结构域、或独立地每个结合TAA的抗原结合结构域包含TAA的天然同源结合配偶体的细胞外结构域或其结合片段、或其表现出对TAA的结合活性的变体。
313.实施方案276-311中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述结合TAA的抗原结合结构域、或独立地每个结合TAA的抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。
314.实施方案313的多特异性多肽构建体，其中所述抗体或其抗原结合片段是Fv、scFv、Fab、单结构域抗体(sdAb)、VNAR或VHH。
315.实施方案313或实施方案314的多特异性多肽构建体，其中所述抗体或抗原结合片段是sdAb。
316.实施方案315的多特异性多肽构建体，其中所述sdAb是人或人源化的sdAb。
317.实施方案276-316中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述抗原结合结构域、或独立地每个抗原结合结构域结合选自以下的肿瘤抗原：1-92-LFA-3,5T4,α-4整联蛋白,α-V整联蛋白,α4β1整联蛋白,α4β7整联蛋白,AGR2,抗-Lewis-Y,Apelin J受体,APRIL,B7-H3,B7-H4,BAFF,BTLA,C5补体,C-242,CA9,CA19-9,(Lewis a),碳酸酐酶9,CD2,CD3,CD6,CD9,CD11a,CD19,CD20,CD22,CD24,CD25,CD27,CD28,CD30,CD33,CD38,CD40,CD40L,CD41,CD44,CD44v6,CD47,CD51,CD52,CD56,CD64,CD70,CD71,CD74,CD80,CD81,CD86,CD95,CD117,CD123,CD125,CD132,(IL-2RG),CD133,CD137,CD138,CD166,CD172A,CD248,CDH6,CEACAM5(CEA),CEACAM6(NCA-90),封闭蛋白-3,封闭蛋白-4,cMet,胶原,Cripto,CSFR,CSFR-1,CTLA-4,CTGF,CXCL10,CXCL13,CXCR1,CXCR2,CXCR4,CYR61,DL44,DLK1,DLL3,DLL4,DPP-4,DSG1,EDA,EDB,EGFR,EGFRviii,内皮缩血管肽B受体(ETBR),ENPP3,EpCAM,EPHA2,EPHB2,ERBB3,RSV的F蛋白,FAP,FGF-2,FGF8,FGFR1,FGFR2,FGFR3,FGFR4,FLT-3,叶酸盐受体α(FRα),GAL3ST1,G-CSF,G-CSFR,GD2,GITR,GLUT1,GLUT4,GM-CSF,GM-CSFR,GP IIb/IIIa受体,Gp130,GPIIB/IIIA,GPNMB,GRP78,HER2/neu,HER3,HER4,HGF,hGH,HVEM,透明质酸酶,ICOS,IFNα,IFNβ,IFNγ,IgE,IgE受体(FceRI),IGF,IGF1R,IL1B,IL1R,IL2,IL11,IL12,IL12p40,IL-12R,IL-12Rβ1,IL13,IL13R,IL15,IL17,IL18,IL21,IL23,IL23R,IL27/IL27R(wsx1),IL29,IL-31R,IL31/IL31R,IL2R,IL4,IL4R,IL6,IL6R,胰岛素受体,Jagged配体,Jagged 1,Jagged 2,KISS1-R,LAG-3,LIF-R,Lewis X,LIGHT,LRP4,LRRC26,Ly6G6D,LyPD1,MCSP,间皮素,MRP4,MUC1,粘蛋白-16(MUC16,CA-125),Na/K ATP酶,NGF,Nicastrin,Notch受体,Notch 1,Notch 2,Notch 3,Notch 4,NOV,OSM-R,OX-40,PAR2,PDGF-AA,PDGF-BB,PDGFRα,PDGFRβ,PD-1,PD-L1,PD-L2,磷脂酰-丝氨酸,P1GF,PSCA,PSMA,PSGR,RAAG12,RAGE,SLC44A4,鞘氨醇1磷酸酯,STEAP1,STEAP2,TAG-72,TAPA1,TEM-8,TGFβ,TIGIT,TIM-3,TLR2,TLR4,TLR6,TLR7,TLR8,TLR9,TMEM31,TNFα,TNFR,TNFRS12A,TRAIL-R1,TRAIL-R2,转铁蛋白,转铁蛋白受体,TRK-A,TRK-B,uPAR,VAP1,VCAM-1,VEGF,VEGF-A,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,VEGFR1,VEGFR2,VEGFR3,VISTA,WISP-1,WISP-2,和WISP-3。
318.实施方案310-317中的任一个的多特异性多肽构建体，其中：
所述第一多肽包含：按N-端至C-端的顺序，结合TAA的第一抗原结合结构域、包含异源二聚体Fc区的第一Fc多肽的第一多肽、接头、抗-CD3抗体或抗原结合片段的VH或VL结构域、以及结合TAA的第二抗原结合结构域；和
所述第二多肽包含：按N-端至C-端的顺序，PD-1 VHH结构域或CRBR之一、异源二聚体Fc区的第二Fc多肽、接头、任选的与在第一多肽中存在的相同的接头、抗-CD3抗体或抗原结合片段的VH或VL结构域中的另一个、以及PD-1 VHH结构域或CRBR中的另一个。
319.实施方案276-318中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述接头是肽或多肽接头，任选地其中所述接头是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度。
320.实施方案276-319中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述接头是不可切割的接头。
321.实施方案320的多特异性多肽构建体，其中所述不可切割的接头包含GS、GGS、GGGGS(SEQ ID NO:125)、GGGGGS(SEQ ID NO:126)和它们的组合。
322.实施方案276-321中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述接头是或包含序列GGGGGSGGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:127)。
323.实施方案276-319中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述接头是可切割的接头。
324.实施方案323的多特异性多肽构建体，其中所述可切割的接头是作为蛋白酶的底物起作用的多肽。
325.实施方案324的多特异性多肽构建体，其中所述蛋白酶由免疫效应细胞、肿瘤或存在于肿瘤微环境中的细胞产生。
326.实施方案324或实施方案325的多特异性多肽构建体，其中所述蛋白酶由免疫效应细胞产生，且所述免疫效应细胞是活化的T细胞、天然杀伤(NK)细胞或NK T细胞。
327.实施方案324-326中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述蛋白酶选自matriptase、基质金属蛋白酶(MMP)、粒酶B和它们的组合。
328.实施方案327的多特异性多肽构建体，其中所述蛋白酶是粒酶B。
329.实施方案324-328中的任一个的多特异性多肽构建体，其中所述可切割的接头包含氨基酸序列GGSGGGGIEPDIGGSGGS(SEQ ID NO:171)。
330.一种分离的结合PD-1的单结构域抗体，所述抗体包含：包含在SEQ ID NO:300中所示的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQ ID NO:301中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:302中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
331.实施方案330的分离的单结构域抗体，其包含在SEQ ID NO:296中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:296中的任一个的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
332.实施方案330或实施方案331的分离的单结构域抗体，其中所述单结构域抗体包含在以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:296，(ii)SEQ ID NO:296的人源化变体，或(iii)表现出与SEQ ID NO:296的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
333.实施方案330-332中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含在SEQ ID NO:296中所示的序列。
334.实施方案330-332中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含：包含在SEQ ID NO:300中所示的氨基酸序列的CDR1；包含在SEQ ID NO:301中所示的氨基酸序列的CDR2；和包含在SEQ ID NO:302中所示的氨基酸序列的CDR3。
335.实施方案330-332和334中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含分别在SEQ ID NO:300、301和302中所示的CDR1、CDR2和CDR3。
336.一种分离的结合PD-1的单结构域抗体，所述抗体包含：包含在SEQ ID NO:303中所示的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQ ID NO:304中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:305中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
337.实施方案336的分离的单结构域抗体，其包含在SEQ ID NO:297中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:297中的任一个的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
338.实施方案336或实施方案337的分离的单结构域抗体，其中所述单结构域抗体包含在以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:297，(ii)SEQ ID NO:297的人源化变体，或(iii)表现出与SEQ ID NO:297的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
339.实施方案336-338中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含在SEQ ID NO:297中所示的序列。
340.实施方案336-338中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含：包含在SEQ ID NO:303中所示的氨基酸序列的CDR1；包含在SEQ ID NO:304中所示的氨基酸序列的CDR2；和包含在SEQ ID NO:305中所示的氨基酸序列的CDR3。
341.实施方案336-338和340中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含分别在SEQ ID NO:303、304和305中所示的CDR1、CDR2和CDR3。
342.一种分离的结合PD-1的单结构域抗体，所述抗体包含：包含在SEQ ID NO:306中所示的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQ ID NO:307中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:308中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
343.实施方案342的分离的单结构域抗体，其包含在SEQ ID NO:298中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:298中的任一个的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
344.实施方案342或实施方案343的分离的单结构域抗体，其中所述单结构域抗体包含在以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:298，(ii)SEQ ID NO:298的人源化变体，或(iii)表现出与SEQ ID NO:298的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
345.实施方案342-344中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含在SEQ ID NO:298中所示的序列。
346.实施方案342-344中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含：包含在SEQ ID NO:306中所示的氨基酸序列的CDR1；包含在SEQ ID NO:307中所示的氨基酸序列的CDR2；和包含在SEQ ID NO:308中所示的氨基酸序列的CDR3。
347.实施方案342-344和346中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含分别在SEQ ID NO:306、307和308中所示的CDR1、CDR2和CDR3。
348.一种分离的结合PD-1的单结构域抗体，所述抗体包含：包含在SEQ ID NO:309中所示的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQ ID NO:310中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:311中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
349.实施方案348的分离的单结构域抗体，其包含在SEQ ID NO:299中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:299中的任一个的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
350.实施方案348或实施方案349的分离的单结构域抗体，其中所述单结构域抗体包含在以下所示的序列：(i)SEQ ID NO:299，(ii)SEQ ID NO:299的人源化变体，或(iii)表现出与SEQ ID NO:299的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
351.实施方案348-350中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含在SEQ ID NO:299中所示的序列。
352.实施方案348-350中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含：包含在SEQ ID NO:309中所示的氨基酸序列的CDR1；包含在SEQ ID NO:310中所示的氨基酸序列的CDR2；和包含在SEQ ID NO:311中所示的氨基酸序列的CDR3。
353.实施方案348-350和352中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含分别在SEQ ID NO:309、310和311中所示的CDR1、CDR2和CDR3。
354.实施方案330-332、334-338、340-344、346-350和352-353中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含在SEQ ID NO:296-299中的任一个中所示的氨基酸序列。
355.实施方案330-332、334-338、340-344、346-350和352-354中的任一个的分离的单结构域抗体，其中所述sdAb包含在SEQ ID NO:296、297、298或299中所示的氨基酸序列。
356.一种多核苷酸，其编码实施方案220-275中的任一个的PD-1-结合多肽。
357.一种多核苷酸，其编码实施方案276-329中的任一个的多特异性多肽构建体。
358.一种多核苷酸，其包含：编码实施方案276-329中的任一个的多特异性构建体的第一多肽的第一核酸序列和编码所述多特异性构建体的第二多肽的第二核酸序列，其中所述第一和第二核酸序列被内核糖体进入位点(IRES)隔开，或编码自切割肽或造成核糖体跳跃的肽的核酸。
359.实施方案358的多核苷酸，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至相同启动子。
360.实施方案359的多核苷酸，其中所述编码自切割肽或造成核糖体跳跃的肽的核酸选自T2A、P2A、E2A或F2A。
361.一种多核苷酸，其编码实施方案330-355中的任一个的单结构域抗体。
362.一种载体，其包含实施方案356-361中的任一个的多核苷酸。
363.实施方案362的载体，所述载体是表达载体。
364.实施方案362或实施方案363的载体，所述载体是病毒载体或真核载体，任选地其中所述真核载体是哺乳动物载体。
365.一种细胞，其包含实施方案356-361中的任一个的一种或多种多核苷酸或实施方案362-364中的任一个的载体。
366.实施方案365的细胞，其中所述细胞是重组的或分离的。
367.实施方案366的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
368.一种生产多肽的方法，所述方法包括向细胞中引入实施方案356-361中的任一个的一种或多种多核苷酸或实施方案362-364中的任一个的载体，和在产生多特异性多肽构建体的条件下培养所述细胞。
369.实施方案368的方法，所述方法进一步包括从所述细胞分离或纯化所述多肽。
370.通过实施方案368或实施方案369的方法生产的多肽。
371.一种经工程改造的免疫细胞，其包含结合分子，所述结合分子包含实施方案220-275中的任一个的结合分子或实施方案330-355中的任一个的单结构域抗体，任选地其中所述结合分子可从所述细胞中分泌。
372.实施方案371的经工程改造的细胞，所述细胞进一步包含嵌合抗原受体(CAR)。
373.实施方案371或实施方案372的经工程改造的免疫细胞，其中所述细胞是淋巴细胞。
374.实施方案372-373中的任一个的经工程改造的免疫细胞，其中所述细胞是T细胞或天然杀伤(NK)细胞。
375.实施方案372-374中的任一个的经工程改造的免疫细胞，其中所述CAR包含含有结合TAA的抗原结合结构域的细胞外结构域、跨膜结构域；和细胞内信号传递结构域。
376.实施方案375的经工程改造的免疫细胞，其中所述细胞内信号传递结构域包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)信号传递结构域，任选地其中所述细胞内信号传递结构域是或包含CD3ζ信号传递结构域，任选地是或包含人CD3ζ信号传递结构域。
377.实施方案376的经工程改造的免疫细胞，其中所述细胞内信号传递结构域进一步包含共刺激分子的信号传递结构域。
378.一种药物组合物，其包含实施方案220-275中的任一个的PD-1-结合多肽、实施方案276-329中的任一个的多特异性多肽构建体、实施方案330-355中的任一个的单结构域抗体或实施方案371-377中的任一个的经工程改造的免疫细胞。
379.实施方案378的药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体。
380.实施方案378或实施方案379的药物组合物，所述药物组合物是无菌的。
381.一种在受试者中刺激或诱导免疫应答的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用实施方案220-275中的任一个的PD-1-结合多肽、实施方案276-329中的任一个的多特异性多肽构建体、实施方案330-355中的任一个的单结构域抗体或实施方案371-377中的任一个的经工程改造的免疫细胞或实施方案378-380的药物组合物。
382.实施方案381的方法，其中针对肿瘤或癌症的免疫应答增加，任选地表达PD-1的肿瘤或癌症。
383.实施方案381或实施方案382的方法，其中所述方法治疗受试者中的疾病或病症。
384.一种治疗受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方案220-275中的任一个的PD-1-结合多肽、实施方案276-329中的任一个的多特异性多肽构建体、实施方案330-355中的任一个的单结构域抗体或实施方案371-377中的任一个的经工程改造的免疫细胞或实施方案378-380的药物组合物。
385.实施方案384或实施方案385的方法，其中所述疾病或病症是肿瘤或癌症。
386.实施方案381-385中的任一个的方法，其中所述受试者是人。
VIII.实施例
下述实施例仅仅为了例证目的而包括且无意限制本发明的范围。
实施例1：PD-1sdAb的制备
通过免疫接种美洲驼羊和羊驼，制备靶向人PD-1的单结构域抗体。将美洲驼羊和羊驼用如下所示的人PD-1细胞外结构域(ECD；在SEQ ID NO:286中所示的人PD-1的氨基酸25-167，例如UniProt No.Q15116)的重组形式免疫：
LDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRSAGQFQ
产生特定抗-PD1抗体滴度以后，从来自免疫的动物的500mL血液中分离美洲驼羊/羊驼外周血单核细胞(PBMC)，并使用Qiagen RNeasy Maxi Kit分离总mRNA，并随后使用Thermo Superscript IV逆转录酶和寡-dT引物转化成第一链cDNA。使用cDNA作为模板通过PCR特异性地扩增单结构域抗体(sdAb；也称为VHH)序列，并作为sdAb-Fc-AGA2融合蛋白克隆进酵母表面展示载体中。Fc为人IgG1 Fc(在SEQ ID NO:8中所示)。
将展示这些sdAb的酵母文库如下富集：使用PD-1ECD的重组形式进行磁珠分离，随后进行荧光活化细胞分选(FACS)。将分选的酵母铺板，并将分离的菌落挑入96-孔板中并在培养基中培养，所述培养基将表达从表面展示的sdAb-Fc转换为分泌到培养基中。示例性的鉴定的sdAb如在表E1中所示。
Figure BDA0003110879870001371
Figure BDA0003110879870001381
实施例2：骆驼科衍生的PD-1sdAb的人源化
使用人VH3-23种系作为支架，人源化示例性的骆驼科衍生的PD-1sdAb,18H10。对可溶性、特异性、稳定性和/或亲和力做出贡献的骆驼科残基保持未修饰。另外，所有人源化变体含有Leu11Glu(L11E)的修饰以及Ser112Lys(S112K)和Ser113Pro(S113P)的羧基端修饰，因为已知这些会阻止或减少针对sdAb的现有ADA的识别(如在US20160207981中所述)。
表E2显示了示例性的PD-1sdAb人源化变体。
Figure BDA0003110879870001382
Figure BDA0003110879870001391
实施例3：通过流式细胞计量术评估sdAb与表达PD-1的细胞的结合
评估了纯化的sdAb-Fc对表达PD-1的细胞的特异性和相对亲和力。为了瞬时转染293细胞，将freeStyle 293细胞以1x106个细胞/mL重新悬浮在新鲜FreeStyle 293表达培养基中。每次转染将细胞接种进50mL并在制备转染试剂时在振荡器上在37℃温育。将50μg每种转染质粒稀释进500μL OptiMEM中。在每次转染的单独试管中，将150μg聚乙烯亚胺(PEI；75μL的2mg/mL溶液)加入500μL OptiMEM中，并然后与DNA:OptiMEM溶液1:1混合。使DNA和PEI在室温络合15分钟。然后将DNA:PEI复合物逐滴加入准备的FreeStyle 293细胞的烧瓶中并通过涡旋进行混合。将转染的细胞在37℃振荡器中温育过夜以允许蛋白表达。使用的转染质粒编码人、食蟹猴和鼠起源的柠檬色-标记的全长PD1蛋白。
使用瞬时转染的表达PD-1的细胞通过流式细胞计量术评估在实施例1和2中描述的示例性的PD-1-sdAb-Fc融合蛋白的结合。将未转染的FreeStyle 293细胞或瞬时转染的FreeStyle 293细胞在FACS缓冲液(1x TBS,0.01％FBS,0.002％叠氮化钠)中稀释至0.5x10x106个细胞/mL，并以100μL/孔铺板在96-孔圆底测定板中。将测定板在约750rpm离心5分钟，然后将上清液除去并如下加入第一抗体稀释液。将滴定稀释的抗体加入含有293细胞的测定板。将细胞在抗体稀释液中在4℃温育30分钟。30-分钟温育以后，将测定板在约750rpm离心5分钟，用150μL FACS缓冲液洗涤，并在约750rpm再次离心5分钟。将洗液除去，并加入50μL/孔的在FACS缓冲液中1:1000稀释的Alexa Fluor 647缀合的驴-抗-人IgG，并在4℃温育20分钟。然后将测定板在750rpm离心5分钟，用150μL FACS缓冲液洗涤，并在750rpm再次离心5分钟。将洗液除去，并将细胞重新悬浮在30μL/孔的FACS缓冲液中用于通过流式细胞计量术(iQue Intellicyte)分析。
关于18H10(源自美洲驼羊的亲本；SEQ ID NO:284)、人源化变体18H10(SEQ IDNO:251-257、259-260和262-266)或1-14(SEQ ID NO:312)与表达人PD-1的细胞(huPD1-FL293)、表达食蟹猴PD-1的细胞(cynoPD1-FL 293)、表达小鼠PD-1的细胞(muPD1-FL 293)或非表达(UT 293)细胞的结合，示例性的结果如在图1A-1G中所示。
实施例4：通过流式细胞计量术评估PD-1sdAb与活化的人T细胞的结合
通过流式细胞计量术评估了PD-1-sdAb-Fc融合蛋白与活化的人T细胞的结合。
为了富集和活化人T细胞，使用密度梯度离心从人供体血液分离外周血单核细胞(PBMC)。将血液样品用PBS/2％FBS(1:2)稀释，并将30mL稀释的血液在15mL Lymphoprep密度梯度介质上分层。离心后，将在血浆和Lymphoprep的相间的PBMC层除去，并使用红血细胞裂解缓冲液在室温裂解剩余的红血细胞5分钟。将非-T细胞群体用针对CD14、CD16、CD19、CD20、CD36、CD56、CD123、TCRγ/δ的生物素化的抗-谱系标志物抗体标记(20分钟,室温)，并使用磁性抗生蛋白链菌素颗粒除去。保留含有T细胞级分的未结合的细胞上清液。通过将它们以约2x106细胞/mL培养基的密度铺板在用1μg/mL小鼠抗-人CD3(OKT3)包被的组织培养板中，将富集的人T细胞活化3天。将活化的T细胞在PBS中洗涤一次，然后进一步用在结合测定中。
基本上如在实施例3中所述通过流式细胞计量术评估和定量结合，但是与活化的人T细胞的结合除外，将在167nM至0.00847nM范围内的18H10(SEQ ID NO:284)、人源化的18H10(hzv7；SEQ ID NO:257)或1-14(SEQ ID NO:312)的四倍、10-点系列稀释物用于温育，如在图2中所示，发现所试验的示例性的PD-1-靶向构建体和人源化变体结合富集的和活化的人T细胞。
实施例5：使用报道测定评估PD-1/PD-L1阻断
将表达PD-1的Jurkat效应子报道细胞系(其中TCR接合导致萤光素酶报道基因的转录)用于评估示例性的靶向PD-1的sdAb的阻断PD-1和PD-L1的相互作用的能力。在所述测定中，将表达PD-L1的aAPC/CHOK1细胞与Jurkat报道细胞一起共培养以提供TCR-特异性的活化信号，同时通过效应细胞上的PD-1的接合抑制该信号。监测PD-1sdAb的阻断受抑制的信号和增强TCR接合的能力。
在测定前一天，将表达PD-L1的aAPC/CHOK1细胞铺板在100μl补充了10％FBS的Ham氏F12中。在测定当天，将所有培养基抛弃并用40μL含有试验蛋白的滴定物的测定培养基(RPMI 1640，补充了1％FBS)替换，所述滴定物含有18H10(SEQ ID NO:41)或人源化的18H10(hzv7；SEQ ID NO:14)(开始浓度:50nM,1:4滴定)。然后将Jurkat PD-1报道细胞加入平板(40μL)并将平板温育6h(37℃,5％CO2在控湿气氛中)。温育后，将等体积的BioGlo萤光素酶测定底物加入孔中并在室温温育10分钟，并评估和分析发光。
如在图3A和B中所示，如TCR接合和萤光素酶转录的存在所指示的，观察了示例性的试验蛋白18H10(SEQ ID NO:284)、人源化的18H10(hzv7；SEQ ID NO:257)或1-14(SEQ IDNO:312)对PD-1/PD-L1的阻断。
实施例6：用抗-PD1 sdAb生产靶向TAA的受限制的CD3结合蛋白的方法
制备了多特异性多肽构建体，其含有：表现出受限的CD3结合的、二硫键稳定化的抗-CD3 Fv结合区域，异源二聚体Fc结构域，位于相对于Fc区的氨基端和/或相对于CD3结合区域的羧基端的一个或更多个TAA抗原结合结构域，和位于相对于Fc区的氨基端和/或相对于CD3结合区域的羧基端的、含有针对PD-1的单结构域抗体(sdAb)的抑制性受体结合区域(IRBR)。在某些情况下，将多特异性多肽构建体制备成含有至少一个共刺激性受体结合区域(CRBR)，例如针对41BB，其位于相对于Fc区的氨基端和/或相对于CD3结合区域的羧基端。
在示例性的构建体中，制备了至少编码异源二聚体多特异性多肽构建体的第一多肽链和第二多肽链的多核苷酸并克隆进质粒中用于表达。第一多肽链通常包括，按从N-端至C-端的顺序，Fc孔洞多肽(例如在SEQ ID NO:112中所示，或在某些情况下，在SEQ ID NO:114中所示)；可切割的或不可切割的接头，诸如含有蛋白酶的一个或更多个底物识别位点的接头；和dsFv抗-CD3抗体的可变轻(VL)结构域(例如在SEQ ID NO:285中所示)。第二多肽链通常包括，按从N-端至C-端的顺序，Fc凸起多肽(例如在SEQ ID NO:105中所示，或在某些情况下，在SEQ ID NO:109中所示)；与第一多肽链相同的可切割的接头或相同的不可切割的接头；和dsFv抗-CD3抗体的可变重结构域(例如在SEQ ID NO:47中所示)。用示例性的不可切割的接头GGGGGSGGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:127)或示例性的可切割的接头GGSGGGGIEPDIGGSGGS(SEQ ID NO:171)(其含有粒酶B的底物识别位点)制备构建体。在不同的构型中，多肽链中的一个或两个另外编码在Fc结构域的氨基端和/或在CD3结合区域的羧基端的PD-1sdAb(例如SEQ ID NO:284或SEQ ID NO:257)，和/或在Fc结构域的氨基端和/或CD3结合区域的羧基端的4-1BB sdAb(例如SEQ ID NO:210)共刺激性受体结合结构域。
使用聚乙烯亚胺将编码异源二聚体的受限制的CD3结合蛋白的每条链的单独质粒以等摩尔比瞬时转染进哺乳动物细胞(HEK293或CHO)中。在3-7天后收集分泌进上清液中的重组蛋白，并将分泌的重组蛋白通过蛋白A色谱法纯化，随后进行制备型尺寸排阻色谱法(SEC)或穿流疏水相互作用色谱法(HIC)。由于在位置I253R或H435R设计在异源二聚体Fc的一条链中的突变(通常孔洞-Fc)，使得它不结合蛋白A，选择性地纯化异源二聚体蛋白。使用在SEC(具有Superdex-200树脂的AKTA)或FT-HIC(具有丁基/苯基琼脂糖的AKTA)上的第二个色谱步骤除去不希望的交叉配对的含有两种异源二聚体Fc的物质，所述异源二聚体Fc是更疏水的且是预期分子量的两倍。
所述方法有利于所述的含有异源二聚体Fc和二硫键稳定化的抗-CD3Fv的适当配对物质的异源二聚体多特异性多肽构建体的生产(例如在SEQ ID NO:47中所示的具有突变G44C的抗-CD3 VH和在SEQ ID NO:285中所示的具有突变G100C的VL)。经纯化的异源二聚体的受限制的CD3结合蛋白是稳定的，且在4℃长期温育后或在增加的蛋白浓度不会积累交叉配对的物质。
本发明无意在范围上限于特定公开的实施方案，所述实施方案为了例如举例说明本发明的不同方面而提供。对描述的组合物和方法的不同修改将从本文中的描述和教导显而易见。可以实践这样的变化，而不脱离本公开内容的真实范围和精神，且意图落入本公开内容的范围内。
序列
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Claims (28)

1.一种PD-1-结合多肽构建体，其包含至少一个特异性地结合PD-1的仅重链可变结构域(PD-1VHH结构域)。
2.一种PD-1-结合多肽构建体，其包含至少一个特异性地结合PD-1的仅重链可变结构域(PD-1VHH结构域)和一个或多个另外的结合除PD-1以外的靶标的结合结构域。
3.根据权利要求1所述的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个VHH结构域包含：包含选自SEQ ID NO:268、272、273和313的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQID NO:278或314中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:283或315中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
4.一种PD-1-结合构建体，其包含至少一个仅重链可变结构域(PD-1VHH结构域)，所述结构域包含：包含选自SEQ ID NO:268、272、273和313的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQ ID NO:278或314中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:283或315中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
5.根据权利要求1、2、3或4中的任一项所述的PD-1-结合多肽构建体，其中所述特异性地结合PD-1的PD-1VHH结构域阻断PD-1和PD-L1的相互作用。
6.根据权利要求2所述的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结合结构域结合共刺激性分子。
7.根据权利要求2所述的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结合结构域结合T-细胞表面标志物。
8.根据权利要求7所述的PD-1-结合多肽构建体，其中所述T-细胞表面标志物是CD8。
9.根据权利要求7所述的PD-1-结合多肽构建体，其中所述T-细胞表面标志物是CD4。
10.根据权利要求2所述的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结合结构域结合除PD1以外的免疫检验点。
11.根据权利要求2所述的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结合结构域结合免疫细胞上的活化受体。
12.根据权利要求2所述的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)。
13.根据权利要求2所述的PD-1-结合多肽构建体，其中所述一个或多个另外的结合结构域结合细胞因子受体。
14.根据权利要求1、2、3或4中的任一项所述的PD-1-结合多肽构建体，其中所述多肽包含免疫球蛋白Fc区。
15.根据权利要求1、2、3或4中的任一项所述的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1VHH结构域包含在SEQ ID NO:251-267、284或312中的任一个中所示的序列或表现出与SEQ ID NO:251-267、284或312中的任一个的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
16.根据权利要求1或2中的任一项所述的PD-1-结合多肽构建体，其中所述至少一个PD-1VHH结构域包含分别在SEQ ID NO:268、278和283中、分别在SEQ ID NO:272、278和283中或分别在SEQ ID NO:273、278和283中所示的CDR1、CDR2和CDR3。
17.一种分离的结合PD-1的单结构域抗体，所述抗体包含：包含选自SEQ ID NO:268、272、273和313的氨基酸序列的互补性决定区1(CDR1)；包含在SEQ ID NO:278或314中所示的氨基酸序列的互补性决定区2(CDR2)；和包含在SEQ ID NO:283或315中所示的氨基酸序列的互补性决定区3(CDR3)。
18.根据权利要求17所述的分离的单结构域抗体，其包含在SEQ ID NO:251-267或284中的任一个中所示的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:251-267、284或312中的任一个的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并结合PD-1。
19.根据权利要求18所述的分离的单结构域抗体，其中sdAb包含在SEQ ID NO:251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、284或312中所示的氨基酸序列。
20.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-4中的任一项所述的PD-1-结合多肽。
21.一种多核苷酸，其编码根据权利要求17-19中的任一项所述的单结构域抗体。
22.一种载体，其包含根据权利要求20-21中的任一项所述的多核苷酸。
23.一种细胞，其包含根据权利要求20-21中的任一项所述的一种或多种多核苷酸或根据权利要求22所述的载体。
24.一种生产多肽的方法，所述方法包括：向细胞中引入根据权利要求20-21中的任一项所述的一种或多种多核苷酸或根据权利要求22所述的载体，以及在产生多肽构建体的条件下培养所述细胞。
25.一种经工程改造的免疫细胞，其包含结合分子，所述结合分子包含根据权利要求1-4中的任一项所述的结合分子或根据权利要求17-19中的任一项所述的单结构域抗体，任选地其中所述结合分子可从所述细胞中分泌。
26.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-4中的任一项所述的PD-1-结合多肽、根据权利要求17-19中的任一项所述的单结构域抗体或根据权利要求25所述的经工程改造的免疫细胞。
27.一种在受试者中刺激或诱导免疫应答的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用根据权利要求1-4中的任一项所述的PD-1-结合多肽、根据权利要求17-19中的任一项所述的单结构域抗体或根据权利要求25所述的经工程改造的免疫细胞或根据权利要求26所述的药物组合物。
28.一种治疗受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-4中的任一项所述的PD-1-结合多肽、根据权利要求17-19中的任一项所述的单结构域抗体或根据权利要求25所述的经工程改造的免疫细胞或根据权利要求26所述的药物组合物。
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