JP2024024031A

JP2024024031A - Ｐｄ－１単一ドメイン抗体およびその治療用組成物

Info

Publication number: JP2024024031A
Application number: JP2023222989A
Authority: JP
Inventors: パンディットラジェイ; Pandit Rajay; ティマージョン; Timmer John; サナブリアアンジェリカ; SANABRIA Angelica; サルズメイヤーフロリアン; Sulzmaier Florian; エクケルマンブレンダン; Eckelman Brendan
Original assignee: InhibRx Inc
Current assignee: InhibRx Inc
Priority date: 2018-10-11
Filing date: 2023-12-28
Publication date: 2024-02-21
Also published as: CN113166262A; AU2019356573A1; WO2020077257A1; EP3864049A1; TW202028247A; US11208485B2; CA3115285A1; JP7453219B2; US20200190193A1; US11945869B2; US20220162316A1; JP2022512653A

Abstract

【課題】ＰＤ－１単一ドメイン抗体およびその治療用組成物を提供すること。【解決手段】ＰＤ－１に特異的に結合する結合ポリペプチドが本明細書に提供される。より具体的には、ＰＤ－１に結合する、多価ならびに／または多重特異性構築物およびキメラ抗原受容体を含む、融合タンパク質が本明細書に提供される。また、ポリペプチドを含有する医薬組成物、ポリペプチドをコードする核酸分子およびそのベクターならびに細胞、および癌などの疾患ならびに状態を治療するための提供されたＰＤ－１結合ポリペプチドの使用方法および使用も提供する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願
本出願は、２０１８年１０月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／７４４，６１５号、および２０１９年１月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／７９１，１５２号の利益を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本開示は概して、ＰＤ－１に特異的に結合する結合ポリペプチドを提供する。より具体的には、本開示は、少なくともＰＤ－１に結合する、多価ならびに／または多重特異性構築物およびキメラ分子を含む、融合タンパク質に関する。本開示はまた、ポリペプチドをコードする核酸分子およびそのベクターおよび細胞、ならびに癌などの疾患および状態を治療するための提供されたＰＤ－１結合ポリペプチドの使用方法および使用も提供する。

ＰＤ－１は、免疫細胞調節分子の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。これは、活性化Ｔ細胞の表面上に発現される。活性化Ｔ細胞上のＰＤ－１の発現は、腫瘍微小環境中の腫瘍細胞および間質細胞によるＰＤ－Ｌ１によって標的化とされて、免疫応答を抑制し、それによってＰＤ－１を遮断するかまたは標的とする薬剤を望ましい治療目標にする。ＰＤ－１を標的とする改善された治療用分子および薬剤が必要とされる。そのようなニーズを満たす実施形態が本明細書に提供される。

ヒトＰＤ－１（図１Ａ、図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｆ、図１Ｇ）、カニクイザルＰＤ－１（図１Ｂ）、またはマウスＰＤ－１（図１Ｃ）を発現するＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞への、１８Ｈ１０およびそのヒト化バリアントｈｚ１８Ｈ１０または１－１４の結合を示す。未トランスフェクト（２９３）細胞への結合も評価し、示す。同上。同上。同上。同上。同上。同上。活性化ヒトＴ細胞への１８Ｈ１０およびそのヒト化バリアントｈｚ１８Ｈ１０ｖ７の結合を示すグラフである。活性化Ｔ細胞への試験物質の結合を、フローサイトメトリーによって定量化した。Ｊｕｒｋａｔレポータールシフェラーゼアッセイシステムにおける、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達のＰＤ１／ＰＤＬ１媒介性抑制を阻害する１８Ｈ１０、そのヒト化バリアントｈｚ１８Ｈ１０ｖ７または１－１４の能力を示すグラフである。図３Ａが１８Ｈ１０およびｈｚ１８Ｈ１０ｖ７によるＰＤ１遮断を示す一方で、図３Ｂは、１－１４によるＰＤ１遮断を示す。同上。

ＰＤ－１に特異的に結合するポリペプチド（以下、ＰＤ－１結合ポリペプチドとも呼ばれる）が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、提供される結合ポリペプチドは、ＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１結合ポリペプチドは、各々がＰＤ－１に個々に結合する１、２、３、４、５、６、７、または８個のＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－１に結合する１、２、３、または４個のＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、単一特異性である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、多重特異性である。例えば、提供されるＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインと、ＰＤ－１以外の１つ以上の標的タンパク質に結合する１つ以上の追加のＶＨＨドメインなどの１つ以上の追加の結合ドメインとを含んでもよいポリペプチドを含む。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ＰＤ－１に特異的に結合する少なくとも１つの重鎖のみの可変ドメイン（ＰＤ－１ＶＨＨドメイン）を含む、ＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。
（項目２）
ＰＤ－１に特異的に結合する少なくとも１つの重鎖のみの可変ドメイン（ＰＤ－１ＶＨＨドメイン）と、ＰＤ－１以外の標的に結合する１つ以上の追加の結合ドメインと、を含む、ＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。
（項目３）
前記少なくとも１つのＶＨＨドメインが、配列番号２６８、２７２、２７３、および３１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号２７８または３１４に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号２８３または３１５に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、項目１に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。
（項目４）
配列番号２６８、２７２、２７３、および３１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号２７８または３１４に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号２８３または３１５に記載される選択されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、少なくとも１つの重鎖のみの可変ドメイン（ＰＤ－１ＶＨＨドメイン）を含む、ＰＤ－１結合構築物。
（項目５）
ＰＤ－１に特異的に結合する前記ＰＤ－１ＶＨＨドメインが、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を遮断する、項目１、２、３、または４のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。
（項目６）
前記１つ以上の追加の結合ドメインが、共刺激分子に結合する、項目２に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。
（項目７）
前記１つ以上の追加の結合ドメインが、Ｔ細胞表面マーカーに結合する、項目２に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。
（項目８）
前記Ｔ細胞表面マーカーが、ＣＤ８である、項目７に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。
（項目９）
前記Ｔ細胞表面マーカーが、ＣＤ４である、項目７に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。
（項目１０）
前記１つ以上の追加の結合ドメインが、ＰＤ１以外の免疫チェックポイントに結合する、項目２に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。
（項目１１）
前記１つ以上の追加の結合ドメインが、免疫細胞上の活性化受容体に結合する、項目２に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。
（項目１２）
前記１つ以上の追加のドメインが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する、項目２に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。
（項目１３）
前記１つ以上の追加の結合ドメインが、サイトカイン受容体に結合する、項目２に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。
（項目１４）
前記ポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃ領域を含む、項目１、２、３、または４のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。
（項目１５）
前記少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５１～２６７、２８４、もしくは３１２のいずれかに記載される配列、または配列番号２５１～２６７、２８４、もしくは３１２のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、項目１、２、３、または４のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。
（項目１６）
前記少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、それぞれ配列番号２６８、２７８、および２８３、それぞれ配列番号２７２、２７８、および２８３、またはそれぞれ配列番号２７３、２７８、および２８３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、項目１または２に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。
（項目１７）
配列番号２６８、２７２、２７３、および３１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号２７８または３１４に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号２８３または３１５に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、ＰＤ－１に結合する単離された単一ドメイン抗体。
（項目１８）
配列番号２５１～２６７もしくは２８４のいずれかに記載されるアミノ酸配列、または配列番号２５１～２６７、２８４、もしくは３１２のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、項目１７に記載の単離された単一ドメイン抗体。
（項目１９）
前記ｓｄＡｂが、配列番号２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２８４、または３１２に記載されるアミノ酸の配列を含む、項目１８に記載の単離された単一ドメイン抗体。
（項目２０）
項目１～４のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド（複数可）。
（項目２１）
項目１７～１９のいずれかに記載の単一ドメイン抗体をコードする、ポリヌクレオチド（複数可）。
（項目２２）
項目２０または２１に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目２３）
項目２０もしくは２１に記載のポリヌクレオチド（複数可）、または項目２２に記載のベクターを含む、細胞。
（項目２４）
ポリペプチドを産生する方法であって、細胞に、項目２０もしくは２１に記載のポリヌクレオチド（複数可）、または項目２２に記載のベクターを導入することと、前記ポリペプチド構築物を産生するための条件下で前記細胞を培養することと、を含む、方法。
（項目２５）
項目１～４のいずれかに記載の結合分子または項目１７～１９のいずれかに記載の単一ドメイン抗体を含む結合分子を含む、操作された免疫細胞であって、任意選択的に、前記結合分子が、前記細胞から分泌可能である、操作された免疫細胞。
（項目２６）
項目１～４のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド、項目１７～１９のいずれかに記載の単一ドメイン抗体、または項目２５に記載の操作された免疫細胞を含む、医薬組成物。
（項目２７）
対象における免疫応答を刺激または誘発する方法であって、それを必要とする対象に、項目１～４のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド、項目１７～１９のいずれかに記載の単一ドメイン抗体、または項目２５に記載の操作された免疫細胞、または項目２６に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
（項目２８）
対象における疾患または状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の項目１～４のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド、項目１７～１９のいずれかに記載の単一ドメイン抗体、または項目２５に記載の操作された免疫細胞、または項目２６に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインと、Ｆｃドメインとを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－１に結合する１、２、３、または４個のＶＨＨドメインと、Ｆｃドメインとを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＰＤ－１結合部位の数を２倍にする二量体が形成されるように、生理学的条件下でＰＤ－１結合ポリペプチドの二量体化を媒介する。例えば、ＰＤ－１に結合する３つのＶＨＨドメインと、Ｆｃ領域とを含むＰＤ－１結合ポリペプチドは、単量体として三価であるが、生理学的条件下では、Ｆｃ領域は、二量体化を媒介してもよく、このため、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、そのような条件下で六価二量体として存在する。

プログラム細胞死タンパク質－１（ＰＤ－１）は、Ｉ型膜タンパク質であり、Ｔ細胞調節因子ＰＤ－１の拡張ＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーのメンバーである（ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ（１９９２），ｖｏｌ．１１，ｉｓｓｕｅ１１，ｐ．３８８７－３８９５）。末梢でのＰＤ－１発現は、抗原受容体からの刺激によって活性化されたＴ細胞もしくはＢリンパ球、または活性化マクロファージを含む骨髄細胞において観察されることが報告されている（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９６），ｖｏｌ．１８，ｉｓｓｕｅ５，ｐ．７６５－７７２）。細胞表面上のＰＤ－１の発現はまた、ＩＦＮ－γ刺激を介して上方制御されることも示されている。ＰＤ－１に対する２つの細胞表面糖タンパク質リガンド、ＰＤ－１およびＰＤＬ－２が同定されており、ＰＤ－１に結合すると、Ｔ細胞活性化およびサイトカイン分泌を下方制御することが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎｅｔａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１０２７－３４、Ｌａｔｃｈｍａｎｅｔａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２６１－８、Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６３４－４３、Ｏｈｉｇａｓｈｉｅｔａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１１：２９４７－５３）。ＰＤ－１（Ｂ７－Ｈ１）およびＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ）の両方が、ＰＤ－１に結合するＢ７相同体である。ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２は通常、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および骨髄細胞の表面上に発現される。ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２は、免疫活性化の負の調節因子であり、ＰＤ－１受容体との相互作用を介して免疫応答を下方制御することが可能である。いくつかの態様では、ＰＤ－１は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含むＮＫ細胞およびＴ細胞上に発現され、それによってＰＤ－１の関与は、活性化細胞活性化、増殖、および／または増加を阻害することができる。

ヒトＰＤ－１の例示的な配列は、以下のように記載される：

場合によっては、提供されるＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２とＰＤ－１との間の相互作用を直接遮断または阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌｌおよび／またはＰＤ－Ｌ２とＰＤ－１との間の相互作用を阻害または低減する、提供される分子は、免疫応答を調節する。阻害シグナルの伝達は、免疫細胞応答の下方調節（および結果として全体的な免疫応答の下方調節）をもたらし得るが、免疫細胞における阻害シグナルの遮断は、免疫細胞応答の上方調節（および結果として免疫応答の上方調節）をもたらす。場合によっては、免疫応答の強化による調節を使用して、癌などの免疫応答が抑制される特定の疾患または状態を治療することができる。いくつかの実施形態では、提供されるＰＤ－１結合ポリペプチドは、腫瘍細胞の増殖または生存を阻害または低減するための治療薬として使用され得る。

様々なＰＤ－１ポリペプチド結合フォーマットが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１ポリペプチドは、Ｆｃタンパク質との融合などによって二価である。いくつかの実施例では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－１ＶＨＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）などの１つ以上のエフェクター機能などの免疫エフェクター活性を示すＦｃである。他の実施形態では、ＰＤ－１ポリペプチドは、少なくとも１つの追加の分子を含有する多重特異性ポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態では、追加の分子は、腫瘍関連抗原または免疫細胞、例えばＴ細胞など、腫瘍関連微小環境中の別の分子に関与することが可能である。特定の実施形態では、提供されるＰＤ－１ポリペプチド結合フォーマットは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断し、かつ／またはＴ細胞などの細胞においてＰＤ－１によって媒介される阻害シグナルを低減、阻害、もしくは抑制する。

いくつかの実施形態では、提供されるＰＤ－１結合ポリペプチドは、対象において免疫応答を刺激するために使用されてもよく、いくつかの態様では、対象において癌などの疾患または障害を治療する。いくつかの態様では、ＰＤ－１－Ｆｃなどの本明細書に提供されるＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－１発現細胞に結合し、免疫シナプス中の隣接する細胞、例えば、いくつかの態様において環境中で活性免疫応答を誘発することができる腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２とのＰＤ－１発現細胞の相互作用を遮断することができる。場合によっては、活性免疫応答は、癌性細胞の増殖を阻害（例えば、細胞周期の進行を遮断）することができる。

他の態様では、多重特異性結合を示すＶＨＨ結合ポリペプチドも本明細書に提供される。場合によっては、結合ポリペプチドは、ＰＤ－１および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する二重親和性を示すポリペプチドを含む。代替的または追加的に、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－１およびＣＤ３などのＴ細胞抗原に対する親和性を示すポリペプチドを含む。いくつかの態様では、そのような多重特異性分子は、腫瘍またはＴ細胞に結合すると腫瘍の部位でＴ細胞に関与するかまたはそれを活性化すると同時に、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２との相互作用を遮断して、Ｔ細胞における阻害シグナルを低減することができる。特に、本明細書に提供されるそのような分子の中には、抑制されたＣＤ３結合を示す分子がある。また、キメラ抗原受容体を発現し、ＰＤ－１結合ポリペプチドを分泌することが可能である、操作されたＴ細胞などの操作された細胞が本明細書に提供される。

本出願において言及される特許文書、科学論文、およびデータベースを含むすべての刊行物は、各個々の刊行物が参照により個々に組み込まれた場合と同じ程度まで、すべての目的のために参照によりそれらの全体が組み込まれる。本明細書に記載される定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、公開出願、および他の刊行物に記載される定義に反しているか、またはそうでなければ矛盾する場合、本明細書に記載される定義が、参照により本明細書に組み込まれる定義より優先する。

本明細書に記載または参照される技術および手順は、概して、当業者によって十分に理解され、例えば、以下に記載される広く利用される方法などの従来の方法を使用して一般的に採用されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ３ｒｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））、ｔｈｅｓｅｒｉｅｓＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ２：ＡＰＲＡＣＴＩＣＡＬＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓａｎｄＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒｅｄｓ．（１９９５））、ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄＡＮＩＭＡＬＣＥＬＬＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））、ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＮｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），ｅｄ．，１９８７）、ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒａｎｄＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、ＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３－８）Ｊ．ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒａｎｄＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒａｎｄＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ：ＴｈｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙａｎｄＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄａｎｄＣ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，２０００）、ＵｓｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗａｎｄＤ．Ｌａｎｅ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９９９）、ＴｈｅＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉａｎｄＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，ＨａｒｗｏｏｄＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、およびＣａｎｃｅｒ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＣｏｍｐａｎｙ，１９９３）、ならびにそれらの最新版。

本明細書で使用されるセクション見出しは、構成的な目的のためだけであり、記載される主題を制限するものとして解釈されるべきではない。

Ｉ．定義
別段の定義がない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈による別段の要求または別段の明示的な指示がない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。様々な出典または参考文献間の定義におけるいかなる矛盾についても、本明細書に提供される定義が制御する。

本明細書に記載される本発明の実施形態は、実施形態「からなる」および／または「から本質的にからなる」を含むことが理解される。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段の指示がない限り、複数の参照を含む。本明細書における「または」という用語の使用は、代替案が相互に排他的であることを暗示することを意味していない。

本出願では、「または」の使用は、当業者によって明示的に記載または理解されない限り、「および／または」を意味する。複数の従属請求項の文脈において、「または」の使用は、２つ以上の先行する独立請求項または従属請求項を指す。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、本技術分野の当業者に容易に知られるそれぞれの値に対する通常の誤差範囲を指す。本明細書の「約」値またはパラメータに対する言及は、その値またはパラメータ自体に関する実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。

「核酸分子」、「核酸」、および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用されてもよく、ヌクレオチドのポリマーを指す。ヌクレオチドのそのようなポリマーは、天然および／または非天然ヌクレオチドを含有してもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。「核酸配列」は、核酸分子またはポリヌクレオチド中に含まれるヌクレオチドの直鎖状配列を指す。

本明細書で使用される場合、「単離ポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成起源、またはそれらの何らかの組み合わせのポリヌクレオチドを意味するものとし、それは、その起源によって、（１）自然界に見られるポリヌクレオチドのすべてまたは一部分と関連していないか、（２）自然界で連結されていないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているか、または（３）より大きい配列の一部として自然界に存在しない。

「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用され、最小の長さに限定されない。アミノ酸残基のそのようなポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含有してもよく、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、および多量体が挙げられるが、これらに限定されない。完全長タンパク質およびその断片の両方が定義によって包含される。これらの用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本開示の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対する欠失、付加、および置換（本質的には概して保存的）などの修飾を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的変異導入を介するように意図的であってもよいか、またはタンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅によるエラーを介するように偶発的であり得る。

本明細書で言及される「単離タンパク質」という用語は、対象タンパク質が、（１）典型的には自然界に見られるであろう少なくともいくつかの他のタンパク質を含まない、（２）同じ供給源、例えば同じ種からの他のタンパク質を本質的に含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、（４）それが自然界で関連しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、もしくは他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離されている、（５）「単離タンパク質」が自然界で関連しているタンパク質の部分と（共有結合性もしくは非共有結合性相互作用によって）関連していない、（６）それが自然界で関連していないポリペプチドと（共有結合性もしくは非共有結合性相互作用によって）作動可能に関連している、または（７）自然界に存在しないことを意味する。そのような単離タンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは他のＲＮＡによってコードされてもよいか、または合成起源であってもよいか、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。特定の実施形態では、単離タンパク質は、実質的に純粋であるか、またはその使用（治療的、診断的、予防的、研究、もしくはその他の方法）を妨げるであろう、その自然環境中に見られるタンパク質もしくはポリペプチドもしくは他の汚染物質を実質的に含まない。

本明細書で使用される場合、「実質的に純粋」とは、目的種が、存在する優勢種であり（すなわち、モル基準で、組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である）、実質的に精製された画分が、その目的種が存在するすべての高分子種の（モル基準で）少なくとも約５０％を構成する組成物であることを意味する。概して、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約８０％超、例えば、いくつかの実施形態では、約８５％、９０％、９５％、および９９％超を構成する。いくつかの実施形態では、目的種は、本質的な均質性まで精製され（従来の検出方法によって組成物中で汚染種を検出することができない）、組成物は、単一の高分子種から本質的になる。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、そのように記載される構成成分の位置が、それらが意図される様式で機能することを可能にする関係にあることを指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるような方法でライゲーションされる。

抗原またはエピトープに「特異的に結合する」という用語は、当該技術分野で十分に理解されている用語であり、そのような特異的結合を決定する方法も当該技術分野で周知である。分子は、それが代替の細胞または物質とよりも特定の細胞または物質とより頻繁に、より迅速に、より長時間、かつ／またはより大きい親和性で反応または関連する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言われる。単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはＶＨＨ含有ポリペプチドは、それが他の物質に結合するよりも大きい親和性、結合力で、より容易に、かつ／またはより長時間結合する場合、標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。例えば、ＰＤ－１エピトープに特異的または優先的に結合するｓｄＡｂまたはＶＨＨ含有ポリペプチドは、それが他のＰＤ－１エピトープまたは非ＰＤ－１エピトープに結合するよりも大きい親和性、結合力で、より容易に、かつ／またはより長時間このエピトープに結合するｓｄＡｂまたはＶＨＨ含有ポリペプチドである。また、この定義を読むことによって、例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合するｓｄＡｂまたはＶＨＨ含有ポリペプチドが、第２の標的に特異的または優先的に結合する場合があるか、または結合しない場合があることも理解される。そのため、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも排他的結合を必要とするわけではない（それを含むことができるが）。概して、必ずしもではないが、結合への言及は、選択的結合を意味する。「特異性」は、抗原に選択的に結合する結合タンパク質の能力を指す。

本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗原結合分子（例えば、ｓｄＡｂまたはＶＨＨ含有ポリペプチド）が結合する標的分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、または脂質などの抗原）上の部位を指す。エピトープは多くの場合、アミノ酸、ポリペプチド、または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グループを含み、特定の三次元構造特性ならびに特定の電荷特性を有する。エピトープは、標的分子の連続残基および／または並列した非連続残基（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、糖、脂質部分）の両方から形成され得る。連続残基（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、糖、脂質部分）から形成されるエピトープが、典型的には、変性溶媒への曝露時に保持される一方で、三次折り畳みによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒を用いた処理時に失われる。エピトープは、少なくとも３個、少なくとも５個、または８～１０個の残基（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、エピトープは、長さが２０個未満の残基（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）、１５個未満の残基、または１２個未満の残基である。２つの抗体は、抗原に対して競合的結合を示す場合、抗原内の同じエピトープに結合し得る。いくつかの実施形態では、エピトープは、抗原結合分子上のＣＤＲ残基に対する特定の最小距離によって同定され得る。いくつかの実施形態では、エピトープは、上記の距離によって同定されてもよく、抗原結合分子の残基と抗原残基との間の結合（例えば、水素結合）に関与する残基にさらに限定される。エピトープは、様々なスキャンによっても同定され得、例えば、アラニンまたはアルギニンのスキャンは、抗原結合分子が相互作用し得る１つ以上の残基を示すことができる。明示的に示されない限り、エピトープとしての残基のセットは、他の残基を特定の抗原結合分子のエピトープの一部であることから除外しない。むしろ、このようなセットの存在は、エピトープの最小シリーズ（または種のセット）を示す。したがって、いくつかの実施形態では、エピトープとして同定される残基のセットは、抗原上のエピトープの残基の排他的リストではなく、抗原にとって非常に適切である最小エピトープを示す。

「非線形エピトープ」または「立体構造エピトープ」は、エピトープに特異的な抗原結合分子が結合する抗原性タンパク質内の非連続ポリペプチド、アミノ酸、および／または糖を含む。いくつかの実施形態では、残基の少なくとも１つは、エピトープの他の顕著な残基と非連続的である。しかしながら、残基の１つ以上は、他の残基と連続的であってもよい。

「線形エピトープ」は、エピトープに特異的な抗原結合分子が結合する抗原性タンパク質内の連続ポリペプチド、アミノ酸、および／または糖を含む。いくつかの実施形態では、線形エピトープ内の残基のすべてが、抗原結合分子によって直接結合される（または結合に関与する）必要はないことに留意されたい。いくつかの実施形態では、線形エピトープは、線形エピトープの配列で効果的に構成されたペプチドを用いた免疫化、またはタンパク質の残りの部分から比較的単離されたタンパク質の構造セクション（抗原結合分子が少なくとも主に、その配列セクションとだけ相互作用することができるように）からのものであり得る。

「抗体」および「抗原結合分子」という用語は、最も広い意味で互換的に使用され、抗体様抗原結合ドメインを含む様々なポリペプチドを包含し、所望の抗原結合活性を示す限り、従来の抗体（典型的には、少なくとも１つの重鎖および少なくとも１つの軽鎖を含む）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、１つの鎖のみを含み、それは典型的には重鎖と類似している）、ＶＨＨ含有ポリペプチド（少なくとも１つの重鎖のみの抗体可変ドメインまたはＶＨＨを含むポリペプチド）、ならびに前述の任意の断片が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体は、二量体化ドメインを含む。そのような二量体化ドメインとしては、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含み、ＣＨ１が典型的には、軽鎖定常ドメイン、ＣＬと対になる一方で、ヒンジは二量体化を媒介する）、およびＦｃドメイン（ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含み、ヒンジは二量体化を媒介する）が挙げられるが、これらに限定されない。

抗体という用語はまた、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびラクダ科（ラマを含む）、サメ、マウス、ヒト、カニクイザルなどの様々な種の抗体を含むが、これらに限定されない。

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体を抗原に結合することに関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖（それぞれＶ_ＨおよびＶ_Ｌ）の可変領域は概して、類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つのＣＤＲを含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔｅｔａｌ．ＫｕｂｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈｅｄ．，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．，ｐａｇｅ９１（２００７）を参照されたい）。単一のＶ_ＨまたはＶ_Ｌドメインは、抗原結合特異性、例えば、ＶＨＨなどの単一ドメイン抗体を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体からのＶ_ＨまたはＶ_Ｌドメインを使用して単離されて、それぞれ相補的なＶ_ＬまたはＶ_Ｈドメインのライブラリーをスクリーニングし得る。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されたい。

「抗体断片」または「抗原結合断片」は、抗原に結合する少なくとも可変領域を含有する普通または無傷抗体の一部分を含む、普通または無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、抗体、線形抗体、Ｖ_Ｈ領域のみを含む単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、結合分子に関連する「一価」とは、標的抗原に特異的である単一抗原認識部位を有する結合分子を指す。一価結合分子の例としては、例えば、一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子、またはＭＨＣ分子が挙げられる。一価抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、および単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）が挙げられる。

「単一ドメイン抗体」、「ｓｄＡｂ」、「ＶＨＨ」という用語は、本明細書において互換的に使用されて、単一単量体ドメイン抗原結合／認識ドメインを有する抗体を指す。そのような抗体は、ラクダ科抗体またはサメ抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＨは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４と指定された、３つのＣＤＲおよび４つのフレームワーク領域を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＨは、ＶＨＨが抗原結合および特異性を実質的に維持する限り、部分的なＦＲ１および／またはＦＲ４のみを含むか、またはそれらのフレームワーク領域の一方もしくは両方を欠くように、Ｎ末端またはＣ末端で切断されてもよい。

「ＶＨＨ含有ポリペプチド」という用語は、少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＶＨＨポリペプチドは、２、３、または４個以上のＶＨＨドメインを含み、各ＶＨＨドメインは、同一であってもよいか、または異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ＶＨＨ含有ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む。いくつかのそのような実施形態では、ＶＨＨポリペプチドは、二量体を形成してもよい。ＶＨＨ含有ポリペプチドの非限定的な構造としては、ＶＨＨ_１－Ｆｃ、ＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－Ｆｃ、およびＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－ＶＨＨ_３－Ｆｃが挙げられ、式中、ＶＨＨ_１、ＶＨＨ_２、およびＶＨＨ_３は同一であってもよいか、または異なっていてもよい。そのような構造のいくつかの実施形態では、１つのＶＨＨがリンカーによって別のＶＨＨに接続されてもよいか、または１つのＶＨＨがリンカーによってＦｃに接続されてもよい。いくつかのそのような実施形態では、リンカーは、１～２０個のアミノ酸、好ましくは、グリシンおよび任意選択的にセリンから構成される１～２０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＨ含有ポリペプチドがＦｃを含む場合、それは二量体を形成する。したがって、構造ＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－Ｆｃが二量体を形成する場合、それは四価であるとみなされる（すなわち、二量体は４つのＶＨＨドメインを有する）。同様に、構造ＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－ＶＨＨ_３－Ｆｃが二量体を形成する場合、それは六価であるとみなされる（すなわち、二量体は６つのＶＨＨドメインを有する）。

本明細書で使用される場合、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－１に特異的に結合するポリペプチドまたはタンパク質である。典型的には、本明細書のＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインを含有するＶＨＨ含有ポリペプチドである。ＰＤ－１結合ポリペプチドは、融合タンパク質を含むコンジュゲートを含む。ＰＤ－１結合ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含有するものを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、各々がＰＤ－１に特異的に結合する２、３、または４個以上のＶＨＨドメインを含有し、各ＶＨＨドメインは、同一であってもよいか、または異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、多価である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、多重特異性である。場合によっては、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－１以外の１つ以上のさらなるまたは追加の抗原に結合する、１つ以上の追加のドメインを含有してもよい。

「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体集団の抗体（ｓｄＡｂまたはＶＨＨ含有ポリペプチドを含む）を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、微量で存在し得る自然発生的な変異の可能性を除いて同一である。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一抗原部位に向けられる。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に向けられる異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられる。したがって、モノクローナル抗体の試料は、抗原上の同じエピトープに結合することができる。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られたものとしての抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製されてもよいか、または米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような組み換えＤＮＡ方法によって作製されてもよい。モノクローナル抗体はまた、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙｅｔａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２－５５４に記載される技術を使用して生成されたファージライブラリーから単離されてもよい。

「ＣＤＲ」という用語は、当業者に対する少なくとも１つの同定様式によって定義される相補性決定領域を示す。所与のＣＤＲまたはＦＲの正確なアミノ酸配列境界は、以下によって記載されるものを含む、多数の周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定され得る：Ｋａｂａｔｅｔａｌ．（１９９１），“ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈＥｄ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（“Ｋａｂａｔ”ｎｕｍｂｅｒｉｎｇｓｃｈｅｍｅ）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉｅｔａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ２７３，９２７－９４８（“Ｃｈｏｔｈｉａ”ｎｕｍｂｅｒｉｎｇｓｃｈｅｍｅ）、ＭａｃＣａｌｌｕｍｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６），“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２，７３２－７４５”。（“Ｃｏｎｔａｃｔ”ｎｕｍｂｅｒｉｎｇｓｃｈｅｍｅ）、ＬｅｆｒａｎｃＭＰｅｔａｌ．，“ＩＭＧＴｕｎｉｑｕｅｎｕｍｂｅｒｉｎｇｆｏｒｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎａｎｄＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎｓａｎｄＩｇｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙＶ－ｌｉｋｅｄｏｍａｉｎｓ，”ＤｅｖＣｏｍｐＩｍｍｕｎｏｌ，２００３Ｊａｎ；２７（１）：５５－７７（“ＩＭＧＴ”ｎｕｍｂｅｒｉｎｇｓｃｈｅｍｅ）、ＨｏｎｅｇｇｅｒＡａｎｄＰｌｕｃｋｔｈｕｎＡ，“Ｙｅｔａｎｏｔｈｅｒｎｕｍｂｅｒｉｎｇｓｃｈｅｍｅｆｏｒｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎｓ：ａｎａｕｔｏｍａｔｉｃｍｏｄｅｌｉｎｇａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｔｏｏｌ，”ＪＭｏｌＢｉｏｌ，２００１Ｊｕｎ８；３０９（３）：６５７－７０，（“Ａｈｏ”ｎｕｍｂｅｒｉｎｇｓｃｈｅｍｅ）、およびＭａｒｔｉｎｅｔａｌ．，“Ｍｏｄｅｌｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｌｏｏｐｓ：ａｃｏｍｂｉｎｅｄａｌｇｏｒｉｔｈｍ，”ＰＮＡＳ，１９８９，８６（２３）：９２６８－９２７２，（“ＡｂＭ”ｎｕｍｂｅｒｉｎｇｓｃｈｅｍｅ）。

所与のＣＤＲまたはＦＲの境界は、同定に使用されるスキームに応じて異なり得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは、構造アラインメントに基づくが、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは、構造情報に基づく。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａスキームの両方のナンバリングは、最も一般的な抗体領域配列長に基づいており、挿入は、挿入文字、例えば「３０ａ」によって対応し、一部の抗体には欠失が現れる。２つのスキームは、特定の挿入および欠失（インデル）を異なる位置に配置し、異なるナンバリングをもたらす。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは、複雑な結晶構造の分析に基づいており、多くの点で、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームと類似している。ＡｂＭスキームは、ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されるものに基づく、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの定義間の妥協策である。

いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム、Ｋａｂａｔナンバリングスキーム、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの組み合わせ、ＡｂＭ定義、および／またはｃｏｎｔａｃｔ定義のいずれかに従って定義され得る。ＶＨＨは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と指定された３つのＣＤＲを含む。以下の表１は、それぞれＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、およびＣｏｎｔａｃｔスキームによって同定されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３の例示的な位置境界を列挙する。ＣＤＲ－Ｈ１については、残基ナンバリングは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームの両方を使用して列挙される。ＦＲは、ＣＤＲの間に位置し、例えば、ＦＲ－Ｈ１はＣＤＲ－Ｈ１の前に位置し、ＦＲ－Ｈ２はＣＤＲ－Ｈ１とＣＤＲ－Ｈ２との間に位置し、ＦＲ－Ｈ３はＣＤＲ－Ｈ２とＣＤＲ－Ｈ３との間に位置するなどである。示されるＫａｂａｔナンバリングスキームは、挿入をＨ３５ＡおよびＨ３５Ｂに配置するため、示されるＫａｂａｔナンバリング規則を使用してナンバリングされたときのＣｈｏｔｈｉａＣＤＲ－Ｈ１ループの末端は、ループの長さに応じてＨ３２とＨ３４との間で異なることに留意されたい。

したがって、別段の指定がない限り、所与の抗体またはその領域、例えば、その可変領域の「ＣＤＲ」、または「相補性決定領域」、または個々の指定のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）は、前述のスキームのいずれかによって定義されるような相補性決定領域（または特定の相補性決定領域）を包含すると理解されるべきである。例えば、特定のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ３）が、所与のＶＨＨアミノ酸配列中に対応するＣＤＲのアミノ酸配列を含有すると記載される場合、そのようなＣＤＲが、前述のスキームのいずれかによって定義されるように、ＶＨＨ内の対応するＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ３）の配列を有することが理解される。いくつかの実施形態では、特定のＣＤＲ配列が指定される。提供される抗体の例示的なＣＤＲ配列は、様々なナンバリングスキームを使用して記載されるが（例えば、表１を参照）、提供される抗体が、他の前述のナンバリングスキームまたは当業者に既知の他のナンバリングスキームのいずれかに従って、記載されるようなＣＤＲを含むことができることが理解される。

本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」、「コンジュゲーション」、またはその文法上の変化形は、当該技術分野で既知の任意の結合または連結方法による、別の化合物の形成をもたらす２つ以上の化合物の結合または連結を指す。また、２つ以上の化合物を結合または連結することによって生成される化合物を指すこともできる。例えば、１つ以上の化学部分またはポリペプチドに直接または間接的に連結されたＶＨＨドメインは、例示的なコンジュゲートである。そのようなコンジュゲートには、融合タンパク質、化学コンジュゲートによって産生されるもの、および任意の他の方法によって産生されるものが含まれる。

ＶＨＨ－Ｆｃなどの免疫グロブリンＦｃ融合体（Ｆｃ融合体）は、免疫グロブリンのＦｃ領域に作動可能に連結された１つ以上のＶＨＨドメインを含む分子である。免疫グロブリンＦｃ領域は、１つ以上のＶＨＨドメインに間接的にまたは直接連結されてもよい。様々なリンカーが当該技術分野で既知であり、任意選択的に、Ｆｃを融合パートナーに連結してＦｃ融合体を生成するために使用され得る。いくつかのそのような実施形態では、リンカーは、１～２０個のアミノ酸、好ましくは、グリシンおよび任意選択的にセリンから構成される１～２０個のアミノ酸を含む。同一種のＦｃ融合体は、二量体化されてＦｃ融合ホモ二量体を形成することができるか、または非同一種を使用してＦｃ融合ヘテロ二量体を形成することができる。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ヒトＦｃなどの哺乳動物Ｆｃである。

本明細書で使用される場合、「重鎖定常領域」という用語は、少なくとも３つの重鎖定常ドメイン、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３を含む領域を指す。当然のことながら、ドメイン内の非機能改変欠失および改変は、別段の指定がない限り、「重鎖定常領域」という用語の範囲内に包含される。非限定的な例示的な重鎖定常領域としては、γ、δ、およびαが挙げられる。非限定的な例示的な重鎖定常領域としては、εおよびμも挙げられる。各重鎖定常領域は、抗体アイソタイプに対応する。例えば、γ定常領域を含む抗体は、ＩｇＧ抗体であり、δ定常領域を含む抗体は、ＩｇＤ抗体であり、α定常領域を含む抗体は、ＩｇＡ抗体である。さらに、μ定常領域を含む抗体は、ＩｇＭ抗体であり、ε定常領域を含む抗体は、ＩｇＥ抗体である。特定のアイソタイプは、サブクラスにさらに細分され得る。例えば、ＩｇＧ抗体としては、ＩｇＧ１（γ_１定常領域を含む）、ＩｇＧ２（γ_２定常領域を含む）、ＩｇＧ３（γ_３定常領域を含む）、およびＩｇＧ４（γ_４定常領域を含む）抗体が挙げられるが、これらに限定されず、ＩｇＡ抗体としては、ＩｇＡ１（α_１定常領域を含む）およびＩｇＡ２（α_２定常領域を含む）が挙げられるが、これらに限定されず、ＩｇＭとしては、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」は、ＣＨ２およびＣＨ３を含む重鎖定常領域の一部分を指す。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。様々な実施形態では、Ｆｃ領域がヒンジを含む場合、ヒンジは、２つのＦｃ含有ポリペプチド間の二量体化を媒介する。Ｆｃ領域は、本明細書に記載される任意の抗体重鎖定常領域アイソタイプのものであってもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。

「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」としては、Ｆｃ受容体結合、Ｃｌｑ結合ならびに補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、およびＢ細胞活性化などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は、概して、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされることを必要とし、様々なアッセイを使用して評価され得る。

「天然配列Ｆｃ領域」は、自然界に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域としては、天然配列ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（非ＡおよびＡアロタイプ）、天然配列ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域、ならびに天然配列ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域、ならびにその自然発生的なバリアントが挙げられる。

「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により天然配列Ｆｃ領域とは異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により天然配列Ｆｃ領域とは異なるが、それでもなおその天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域における約１～約１０個のアミノ酸置換、好ましくは、約１～約５個のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、本明細書のバリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、それと少なくとも約９０％の配列同一性、それと少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。

概して、Ｆｃ領域などの免疫グロブリン重鎖またはその一部分の残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）にあるようなＥＵインデックスのものである。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。

「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明する。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲは、天然ヒトＦｃＲである。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、対立遺伝子バリアントおよびそれらの受容体のオルタナティブスプライシング型を含む、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。（例えば、Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３－２３４（１９９７）を参照されたい）。ＦｃＲは、例えば、ＲａｖｅｔｃｈａｎｄＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ９：４５７－９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２５－３４（１９９４）、およびｄｅＨａａｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０－４１（１９９５）で考察されている。将来同定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書の「ＦｃＲ」という用語によって包含される。例えば、「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語はまた、新生児受容体、ＦｃＲｎも含み、これは、胎児への母体ＩｇＧの輸送（Ｇｕｙｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））、ならびに免疫グロブリンの恒常性の制御に関与する。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は既知である（例えば、ＧｈｅｔｉｅａｎｄＷａｒｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１８（１２）：５９２－５９８（１９９７）、Ｇｈｅｔｉｅｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５（７）：６３７－６４０（１９９７）、Ｈｉｎｔｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３－６２１６（２００４）、ＷＯ２００４／９２２１９（Ｈｉｎｔｏｎｅｔａｌ．）を参照されたい）。

本明細書で使用される場合、「受容体ヒトフレームワーク」は、本明細書で考察されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク由来の重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク由来の受容体ヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含むことができるか、またはアミノ酸配列変化を含むことができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化の数は、ＶＨＨなどの単一抗原結合ドメイン中のヒトフレームワークのすべてにわたって、１０未満、または９未満、または８未満、または７未満、または６未満、または５未満、または４未満、または３未満である。

本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、抗原結合ドメインを介して、それが操作される細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせなどのＴ細胞）上に抗原特異性を導入し、したがって、抗原結合ドメインの抗原結合特性をＴ細胞活性（例えば、溶解能力および自己再生）と組み合わせる、操作された受容体を指す。ＣＡＲは典型的には、細胞外抗原結合ドメイン（エクトドメイン）、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは概して、例えばＣＤ３ゼータ由来の、少なくとも１つのＩＴＡＭシグナル伝達ドメイン、および任意選択的に、例えばＣＤ２８または４－１ＢＢ由来の、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含有する。

「親和性」は、分子（例えば、抗体またはＶＨＨ含有ポリペプチド）の単一結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計の強度を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性または見かけの親和性は、それぞれ解離定数（Ｋ_Ｄ）またはＫ_Ｄ－_{ａｐｐａｒｅｎｔ}によって表され得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野で既知の共通の方法（例えば、ＥＬＩＳＡＫ_Ｄ、ＫｉｎＥｘＡ、フローサイトメトリー、および／または表面プラズモン共鳴デバイスなど）によって測定され得る。そのような方法としては、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）、またはフローサイトメトリーを伴う方法が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において使用される場合、「Ｋ_Ｄ」という用語は、抗原結合分子／抗原相互作用の平衡解離定数を指す。「Ｋ_Ｄ」という用語が本明細書で使用される場合、それはＫ_ＤおよびＫ_Ｄ－_{ａｐｐａｒｅｎｔ}を含む。

いくつかの実施形態では、抗原結合分子のＫ_Ｄは、抗原発現細胞株を使用してフローサイトメトリーによって測定され、各抗体濃度で測定された平均蛍光を非線形１部位結合方程式にフィッティングする（ＰｒｉｓｍＳｏｆｔｗａｒｅｇｒａｐｈｐａｄ）。いくつかのそのような実施形態では、Ｋ_Ｄは、Ｋ_{Ｄ－ａｐｐａｒｅｎｔ}である。

「生物学的活性」という用語は、分子の任意の１つ以上の生物学的特性を指す（インビボで見られるように天然に存在するか、または組み換え手段によって提供もしくは可能となるかを問わず）。生物学的特性としては、リガンドへの結合、細胞増殖の誘発または増加（Ｔ細胞増殖など）、およびサイトカインの発現の誘発または増加が挙げられるが、これらに限定されない。

「親和性成熟」ＶＨＨ含有ポリペプチドは、そのような改変を有しない親ＶＨＨ含有ポリペプチドと比較して、１つ以上のＣＤＲにおける１つ以上の改変を有するＶＨＨ含有ポリペプチドを指し、そのような改変は、抗原に対するＶＨＨ含有ポリペプチドの親和性の改善をもたらす。

本明細書で使用される場合、「ヒト化ＶＨＨ」は、１つ以上のフレームワーク領域がヒトフレームワーク領域と実質的に置き換えられているＶＨＨを指す。場合によっては、ヒト免疫グロブリンの特定のフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化ＶＨＨは、元のＶＨＨにもヒトフレームワーク配列にも存在しないが、ＶＨＨまたはＶＨＨ含有ポリペプチドの性能をさらに改善および最適化するために含まれる残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒト化ＶＨＨ含有ポリペプチドは、ヒトＦｃ領域を含む。理解されるように、ヒト化配列は、その一次配列によって同定され得、抗体が作られたプロセスを必ずしも示すものではない。

本明細書で使用される場合、「実質的に類似している」または「実質的に同じ」という用語は、当業者が、２つ以上の値の間の差を、当該値によって測定された生物学的特徴の文脈内で生物学的および／または統計的有意性がほとんどまたは全くないとみなすような、２つ以上の数値の間の十分に高度な類似性を示す。いくつかの実施形態では、２つ以上の実質的に類似した値は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または５０％のいずれか１つ以下異なる。

ポリペプチド「バリアント」は、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せず、最大の配列同一性パーセントを達成するために、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、天然配列ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのようなバリアントには、例えば、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に、１つ以上のアミノ酸残基が付加または欠失されるポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、バリアントは、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントは、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントは、天然配列ポリペプチドと少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。

本明細書で使用される場合、ペプチド、ポリペプチド、または抗体配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」および「相同性」は、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せず、最大の配列同一性パーセントを達成するために、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、特定のペプチドまたはポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的でのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術の範囲内である様々な方法で達成され得る。当業者は、比較されている配列の完全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。

アミノ酸置換は、ポリペプチド中の１つのアミノ酸を別のアミノ酸と置き換えることを含み得るが、これに限定されない。例示的な置換を表２に示す。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入されてもよく、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善について、生成物がスクリーニングされてもよい。

アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ化され得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。

「ベクター」という用語は、宿主細胞中で繁殖し得るクローニングされたポリヌクレオチド（複数可）を含有するように操作され得るポリヌクレオチドを説明するために使用される。ベクターは、以下の要素のうちの１つ以上を含むことができる：複製の起源、目的のポリペプチドの発現を制御する１つ以上の制御配列（例えば、プロモータおよび／もしくはエンハンサーなど）、ならびに／または１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子、および比色アッセイ、例えば、β－ガラクトシダーゼなどで使用され得る遺伝子など）。「発現ベクター」という用語は、宿主細胞中に目的のポリペプチドを発現するために使用されるベクターを指す。

「宿主細胞」は、ベクターまたは単離ポリヌクレオチドのレシピエントであり得るか、またはそうであった細胞を指す。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。例示的な真核細胞としては、霊長類または非霊長類動物細胞などの哺乳動物細胞、酵母などの真菌細胞、植物細胞、および昆虫細胞が挙げられる。非限定的な例示的な哺乳動物細胞としては、ＮＳＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、ならびに２９３およびＣＨＯ細胞、ならびに２９３－６Ｅ、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｓ、およびＣＨＯ－ＤＳ細胞などのそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、子孫は、自然変異、偶発的変異、または意図的な変異のため、元の親細胞と（形態またはゲノムＤＮＡ補体において）必ずしも完全に同一ではない場合がある。宿主細胞は、本明細書に提供されるポリヌクレオチド（複数可）を用いてインビボでトランスフェクトされた細胞を含む。

本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、典型的には自然界に見られるか、または産生される構成成分のうちの少なくとも一部から分離された分子を指す。例えば、ポリペプチドは、それが産生された細胞の構成成分のうちの少なくとも一部から分離されたとき、「単離された」と称される。ポリペプチドが発現後に細胞によって分泌される場合、産生した細胞からポリペプチドを含有する上清を物理的に分離することは、ポリペプチドを「単離する」とみなされる。同様に、ポリヌクレオチドは、それが典型的には自然界に見られるより大きいポリヌクレオチドの一部（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドの場合、ゲノムＤＮＡもしくはミトコンドリアＤＮＡなど）ではない場合、または例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドの場合、それが産生された細胞の構成成分のうちの少なくとも一部から分離されている場合、「単離された」と称される。したがって、宿主細胞内のベクターに含有されるＤＮＡポリヌクレオチドは、「単離された」と称され得る。

「個体」および「対象」という用語は、本明細書において互換的に使用されて、動物、例えば哺乳動物を指す。患者という用語は、ヒトおよび獣医学の対象を含む。いくつかの実施形態では、ヒト、齧歯類、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、哺乳類実験動物、哺乳類家畜、哺乳類スポーツ動物、および哺乳類ペットを含む哺乳動物を治療する方法が提供される。対象は、男性または女性であってもよく、幼児、若年、青年、成人、および高齢者の対象を含む任意の好適な年齢であってもよい。いくつかの実施例では、「個体」または「対象」は、疾患または障害の治療を必要とする個体または対象を指す。いくつかの実施形態では、治療を受ける対象は、対象が治療に関連性がある障害を有するか、または障害に罹患する十分なリスクがあるという事実を示す患者であり得る。特定の実施形態では、対象は、ヒト患者などのヒトである。

本明細書で使用される場合、「疾患」または「障害」は、治療が必要とされる、かつ／または望ましい状態を指す。

別段の指定がない限り、「腫瘍細胞」、「癌細胞」、「癌」、「腫瘍」、および／または「新生物」という用語は、本明細書において互換的に使用され、制御されない増殖、および／または細胞生存の異常な増加、および／または身体の器官および系の正常な機能を妨げるアポトーシスの阻害を示す細胞（複数可）を指す。この定義には、良性および悪性の癌、ポリープ、過形成、ならびに休眠腫瘍または微小転移が含まれる。

「癌」および「腫瘍」という用語は、固形癌および血液癌／リンパ腺癌を包含し、また異形成などの悪性、前悪性、および良性の増殖も包含する。また、この定義には、免疫系（例えば、ウイルス感染細胞）によって妨げられない異常な増殖（例えば、免疫回避および免疫逃避機構）を有する細胞も含まれる。例示的な癌としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨肉腫；脳ならびに中枢神経系癌；乳癌；腹膜癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸直腸癌；結合組織癌；消化器系癌；子宮内膜癌；食道癌；眼の癌；頭頸部癌；胃癌（ｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒ）（消化管癌を含む）；膠芽腫；肝臓癌（ｈｅｐａｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ）；肝癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）；上皮内新生物；腎臓癌または腎癌；喉頭癌；白血病；肝臓癌（ｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ）；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、ならびに肺扁平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽腫；口腔癌（唇、舌、口、ならびに咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系癌；唾液腺癌；肉腫；皮膚癌；扁平上皮癌；胃癌（ｓｔｏｍａｃｈｃａｎｃｅｒ）；精巣癌；甲状腺癌；子宮癌もしくは子宮内膜癌；泌尿器系癌；外陰部癌；ホジキンリンパ腫ならびに非ホジキンリンパ腫、およびＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む）を含むリンパ腫；小リンパ球性リンパ腫（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤性病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンストレームマクログロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および他の癌腫ならびに肉腫；および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、およびメーグス症候群。

本明細書で使用される場合、「非腫瘍細胞」という用語は、正常な細胞または組織を指す。例示的な非腫瘍細胞としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、間質性腎臓細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、骨芽細胞、ならびに乳房、骨格筋、膵臓、胃、卵巣、小腸、胎盤、子宮、精巣、腎臓、肺、心臓、脳、肝臓、前立腺、結腸、リンパ器官、骨、および骨由来間葉系幹細胞に位置する細胞。本明細書で使用される場合、「末梢に位置する細胞または組織」という用語は、腫瘍細胞の近くおよび／または腫瘍微小環境内に位置しない非腫瘍細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「腫瘍微小環境内の細胞または組織」という用語は、腫瘍細胞を囲む、および／または腫瘍細胞に供給する細胞、分子、細胞外マトリックス、および／または血管を指す。腫瘍微小環境内の例示的な細胞または組織としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：腫瘍脈管構造；腫瘍浸潤リンパ球；線維芽細網細胞；血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）；癌関連線維芽細胞；周皮細胞；他の間質細胞；細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構成成分；樹状細胞；抗原提示細胞；Ｔ細胞；制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）；マクロファージ；好中球；骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、および腫瘍の近位に位置する他の免疫細胞。腫瘍細胞、および／または腫瘍微小環境内に位置する細胞／組織を特定する方法は、本明細書で以下に記載されるように、当該技術分野で周知である。

いくつかの実施形態では、「増加」または「減少」はそれぞれ、統計的に有意な増加または減少を意味する。当業者に明らかになるように、「調節すること」は、同じ条件であるが試験薬が存在しないものと比較して、標的または抗原のそのリガンド、結合パートナー、ホモ多量体もしくはヘテロ多量体形態への会合のためのパートナー、または基質のうちの１つ以上に対する親和性、結合力、特性、および／または選択性の変化（増加または減少のいずれかであり得る）をもたらすこと、標的または抗原が存在する培地または環境における１つ以上の条件（ｐＨ、イオン強度、補因子の存在など）に対する標的または抗原の感受性の変化（増加または減少のいずれかであり得る）をもたらすこと、ならびに／または細胞増殖またはサイトカイン産生をもたらすことも伴い得る。これは、関与する標的に応じて、それ自体が既知の、もしくは本明細書に記載される、任意の好適な様式で、かつ／または任意の好適なアッセイを使用して決定され得る。

本明細書で使用される場合、「免疫応答」とは、疾患（例えば、癌または癌転移）を阻害する、またはその発症を予防する、またはその症状を改善するのに充分である細胞性および／または液性免疫応答を包含することが意図される。「免疫応答」は、自然免疫系および適応免疫系の両方の態様を包含し得る。

本明細書で使用される場合、疾患、障害、または状態の「治療すること」、「治療」、または「療法」という用語は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本明細書で使用される場合、「治療」は、ヒトを含む哺乳動物における疾患のための治療薬の任意の投与または適用を包含する。本開示の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果としては、以下のいずれか１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない：１つ以上の症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の広がり（例えば、転移、例えば、肺またはリンパ節への転移）の予防または遅延、疾患の再発の予防または遅延、疾患進行の遅延または減速、病態の改善、疾患または疾患の進行の阻害、疾患またはその進行の阻害または減速、その発症の停止、および寛解（部分か完全かを問わず）。また、増殖性疾患の病理学的結果の低減も「治療」に包含される。本明細書に提供される方法は、治療のこれらの態様のいずれか１つ以上を企図する。上記に従って、治療という用語は、障害のすべての態様の１００パーセントの除去を必要としない。

癌の文脈において本明細書で使用される場合、癌の「治療」、または「阻害する」、「阻害すること」、もしくは「阻害」という用語は、以下のうちの少なくとも１つを指す：固形腫瘍の反応評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）、または無増悪生存期間（ＰＦＳ）もしくは全生存期間（ＯＳ）の統計的に有意な延長などが挙げられるが、これらに限定されない標準的な基準によって測定される、腫瘍増殖速度の統計的に有意な減少、腫瘍増殖の停止、または腫瘍のサイズ、質量、代謝活性、もしくは体積の低減。

「改善すること」とは、治療薬を投与しない場合と比較して、１つ以上の症状の低下または改善を意味する。「改善すること」はまた、症状の期間の短縮または低減を含む。

疾患または障害の「予防すること」、「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」、または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、疾患もしくは障害または疾患もしくは障害の症状の一部もしくはすべての発生もしくは発症を予防するため、または疾患もしくは障害の発症の可能性を低下させるために、単独または別の化合物との組み合わせのいずれかでの医薬組成物の投与を指す。

「阻害」または「阻害する」という用語は、任意の表現型特性の減少もしくは停止、またはその特性の発生率、程度、もしくは可能性の減少もしくは停止を指す。「低減」または「阻害」することは、参照と比較して活性、機能、および／または量を減少させる、低減する、または停止することである。いくつかの実施形態では、「低減する」または「阻害する」とは、１０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。いくつかの実施形態では、「低減する」または「阻害する」とは、５０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。いくつかの実施形態では、「低減する」または「阻害する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。いくつかの実施形態では、上述の量は、ある期間にわたって、同じ期間にわたる対照と比較して阻害されるか、または減少する。

本明細書で使用される場合、「疾患の発症の遅延」は、疾患（癌など）の発症を延ばす、妨げる、減速する、遅らせる、安定化する、抑制する、かつ／または延期することを意味する。この遅延は、治療されている疾患および／または個体の病歴に応じて、異なる長さの時間であり得る。当業者に明らかであるように、十分または有意な遅延は、個体が疾患を発症しないという点で、実質的に予防を包含し得る。例えば、転移の発症などの末期癌が遅延され得る。

本明細書で使用される場合、「予防すること（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」は、疾患にかかりやすい可能性があるが、疾患とまだ診断されていない対象における疾患の発生または再発に関する予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）を提供することを含む。別段の定めがない限り、「低減する」、「阻害する」、または「予防する」という用語は、すべての時間にわたる完全な予防を意味または要求するものではなく、測定されている期間のみにわたる。

「抗癌剤」という用語は、１つ以上の癌の治療で使用される薬剤を指すために、本明細書においてその最も広い意味で使用される。そのような薬剤の例示的なクラスとしては、化学療法薬、抗癌生物製剤（サイトカイン、受容体細胞外ドメイン－Ｆｃ融合体、および抗体など）、放射線療法、ＣＡＲ－Ｔ療法、治療用オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡなど）、ならびに腫瘍溶解性ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。

「生物学的試料」という用語は、生きているものまたは以前に生きていたものに由来するある量の物質を意味する。そのような物質としては、血液（例えば、全血）、血漿、血清、尿、羊水、滑液、内皮細胞、白血球、単球、他の細胞、器官、組織、骨髄、リンパ節、および脾臓が挙げられるが、これらに限定されない。

「対照」または「参照」という用語は、分析物を含有しない（「陰性対照」）、または分析物を含有する（「陽性対照」）ことが知られている組成物を指す。陽性対照は、既知の濃度の分析物を含み得る。

「有効量」または「治療有効量」という用語は、単独で（すなわち、単剤療法として）、または追加の治療薬と組み合わせてのいずれかで患者に投与された場合、例えば、疾患の症状および／または原因の改善または排除によって、疾患進行の統計的に有意な減少をもたらす、活性成分（例えば、ｓｄＡｂまたはＶＨＨ含有ポリペプチド）を含有する組成物の量および／または濃度を指す。有効量は、疾患もしくは障害に関連する少なくとも１つの症状または生物学的応答もしくは効果を緩和する、低下させる、もしくは軽減する、または疾患もしくは障害の進行を予防する、または患者の身体機能を改善する量であり得る。活性薬剤を含有する組成物の治療有効量は、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する活性薬剤の能力などの要因に応じて異なり得る。治療有効量はまた、治療上有益な効果が活性薬剤の任意の毒作用または有害作用を上回るものでもある。治療有効量は、１つ以上の投与で送達されてもよい。治療有効量は、望ましい治療結果および／または予防結果を達成するために必要な投与量および期間での有効な量を指す。

本明細書で使用される場合、組成物は、細胞を含む２つ以上の生成物、物質、または化合物の任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。

「医薬製剤」および「医薬組成物」という用語は、活性成分（複数可）の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、製剤が投与される対象に対して許容できないほど有毒である追加の構成成分を含有しない、調製物を指す。したがって、それは、哺乳動物対象、しばしばヒトにおける医薬用途に好適な組成物である。医薬組成物は典型的には、有効量の活性剤（例えば、ｓｄＡｂまたはＶＨＨ含有ポリペプチド）、および担体、賦形剤、または希釈剤を含む。担体、賦形剤、または希釈剤は典型的には、それぞれ薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤である。そのような製剤は、滅菌されていてもよい。

「薬学的に許容される担体」は、対象への投与のための「医薬組成物」を一緒に含む治療薬と併用するための、当該技術分野で従来的な非毒性の固体、半固体、または液体の充填剤、希釈剤、封入材料、製剤補助剤、または担体を指す。薬学的に許容される担体は、採用される投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、製剤の他の成分と適合性がある。薬学的に許容される担体は、採用される製剤に適している。

１つ以上のさらなる治療薬「と組み合わせた」投与は、任意の順序での同時（併用）および連続投与を含む。

「同時に」という用語は、本明細書において、投与の少なくとも一部が時間において重複する、または１つの治療薬の投与が、他の治療薬の投与に対して短い期間内にある、または両方の薬剤の治療効果が少なくともある期間にわたって重複する、２つ以上の治療薬の投与を指すために使用される。

「連続的に」という用語は、本明細書において、時間において重複しない、または薬剤の治療効果が重複しない、２つ以上の治療薬の投与を指すために使用される。

本明細書で使用される場合、「と併せて」とは、別の治療モダリティに加えた１つの治療モダリティの投与を指す。したがって、「と併せて」とは、個体への他の治療モダリティの投与の前、最中、または後の１つの治療モダリティの投与を意味する。

「添付文書」という用語は、適応症、用法、投与量、投与、併用療法に関する情報を含む治療用製品の市販パッケージに通常含まれる説明書を指し、そのような治療用製品の使用に関するジカチオンおよび／または警告を含むために使用される。

「製品」は、少なくとも１つの試薬、例えば、疾患もしくは障害（例えば、癌）の治療のための薬剤、または本明細書に記載されるバイオマーカーを特異的に検出するためのプローブを含む任意の製造物（例えば、パッケージもしくは容器）またはキットである。いくつかの実施形態では、製造物またはキットは、本明細書に記載される方法を実施するためのユニットとして促進、流通、または販売される。

「標識」および「検出可能な標識」という用語は、例えば、抗体または抗原に結合されて、特異的結合対のメンバー間の反応（例えば、結合）を検出可能な状態にする部分を意味する。特異的結合対の標識されたメンバーは、「検出可能に標識された」と称される。したがって、「標識された結合タンパク質」という用語は、結合タンパク質の同定を提供する標識が組み込まれたタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、標識は、視覚的手段または機器による手段、例えば、放射性標識アミノ酸の組み込み、またはマークされたアビジン（例えば、光学的方法または比色法によって検出され得る蛍光マーカーもしくは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの結合によって検出可能であるシグナルを発生させることができる、検出可能なマーカーである。ポリペプチドの標的の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１７７Ｌｕ、^１６６Ｈｏ、または^１５３Ｓｍ）；色原体、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド発光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；化学発光マーカー；ビオチニル基；二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）；およびガドリニウムキレートなどの磁性剤。免疫測定法に一般的に採用される標識の代表例としては、光を発生させる部分、例えば、アクリジニウム化合物、および蛍光を発生させる部分、例えば、フルオレセインが挙げられる。この点に関して、部分自体は、検出可能に標識されていないが、さらに別の部分と反応すると検出可能になり得る。

ＩＩ．ＰＤ－１に結合するＶＨＨドメイン
ＰＤ－１に特異的に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインを含有するＶＨＨ含有ポリペプチドである、ＰＤ－１結合ポリペプチドが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨＨドメインは、ヒトＰＤ－１に結合する。いくつかの実施形態では、ＶＨＨドメインは、カニクイザルＰＤ－１に結合する。いくつかの実施形態では、ＶＨＨドメインは、マウスＰＤ－１に結合する。いくつかの実施形態では、ＶＨＨ含有ポリペプチドは、本明細書に提供されるＶＨＨドメインの複数のコピーを組み込む。そのような実施形態では、ＶＨＨ含有ポリペプチドは、同じＶＨＨドメインの複数のコピーを組み込んでもよい。いくつかの実施形態では、ＶＨＨ含有ポリペプチドは、異なっているが、同じＰＤ－１上の同じエピトープを認識するＶＨＨドメインの複数のコピーを組み込んでもよい。ＶＨＨ含有ポリペプチドは、以下のセクションＩＩＩに記載される任意のものを含む、様々なフォーマットでフォーマットされ得る。

ＶＨＨドメインは、特定の抗原に選択的に結合することが可能である単一単量体可変抗体ドメインである抗体断片である。分子量がわずか１２～１５ｋＤａで、ＶＨＨドメイン（単一ドメイン抗体とも呼ばれる）は、２つの重タンパク質鎖および２つの軽鎖から構成される共通抗体（１５０～１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さく、Ｆａｂ断片（約５０ｋＤａ、１つの軽鎖および半分の重鎖）ならびに単鎖可変断片（約２５ｋＤａ、２つの可変ドメイン、軽鎖からの１つおよび重鎖からの１つ）よりもさらに小さい。

単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である。例としては、重鎖抗体、軽鎖を天然に欠く抗体、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、および抗体由来のもの以外の単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーナ、グアナコ、サメ、ヤギ、ウサギ、および／またはウシが挙げられるが、これらに限定されない任意の種に由来し得る。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠く重鎖抗体として既知の自然発生的な単一ドメイン抗体である。明確にするために、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体由来のこの可変ドメインは、ＶＨＨとして本明細書において既知であり、それを４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別する。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、ビクーナ、およびグアナコにおいて作られた抗体に由来し得る。ラクダ科以外の他の種は、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体を産生し得る。そのようなＶＨＨは、本開示の範囲内である。

ＰＤ－１に対する所望の特異性を有するＶＨＨ結合ポリペプチドを含むＶＨＨドメインのスクリーニング方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素アッセイ、フローサイトメトリー、および当該技術分野内で既知の他の免疫学的媒介技術が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に提供される提供されたＶＨＨドメインの中は、以下に記載されるいずれかのような、ＰＤ－１ＶＨＨ（ラマまたはアルパカ由来）およびヒト化配列がある。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１に結合するＶＨＨドメインは、ヒト化されてもよい。ヒト化抗体（ＶＨＨ含有ポリペプチドなど）は、非ヒト抗体に対するヒトの免疫応答を低減または排除するため、ヒト化抗体は、治療用分子として有用であり、これは、抗体治療薬に対する免疫応答、および治療薬の有効性の減少をもたらし得る。概して、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（またはその一部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはその一部分）がヒト抗体配列に由来している、１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意選択的に、ヒト定常領域の少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。

ヒト化抗体およびその作製方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏａｎｄＦｒａｎｓｓｏｎ，（２００８）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３で考察され、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３－３２９、Ｑｕｅｅｎｅｔａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９－１００３３、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、および同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉｅｔａｌ．，（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：２５－３４、Ｐａｄｌａｎ，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（「再表面化」について記載）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａｅｔａｌ．，（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：４３－６０（「ＦＲシャッフリング」について記載）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎｅｔａｌ．，（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：６１－６８、およびＫｌｉｍｋａｅｔａｌ．，（２０００）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（ＦＲシャッフリングに対する「誘導選択」アプローチについて記載）にさらに記載されている。

ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓｅｔａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６を参照）、重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５、およびＰｒｅｓｔａｅｔａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１：２６２３を参照）、ヒト成熟（体細胞変異した）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、ＡｌｍａｇｒｏａｎｄＦｒａｎｓｓｏｎ，（２００８）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３を参照）、ならびにＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａｅｔａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４、およびＲｏｓｏｋｅｔａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８を参照）。典型的には、ＶＨＨのＦＲ領域は、ヒトＦＲ領域で置き換えられて、ヒト化ＶＨＨを作製する。いくつかの実施形態では、ヒト化ＶＨＨの１つ以上の特性を改善するために、ヒトＦＲの特定のＦＲ残基が置き換えられる。そのような置き換えられた残基を有するＶＨＨドメインは、本明細書では依然として「ヒト化」と称される。

配列番号２５１～２６７もしくは２８４のいずれかから選択されるＶＨＨアミノ酸配列、または配列番号２５１～２６７もしくは２８４のいずれか１つから選択されるＶＨＨ領域アミノ酸と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列中に含有されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、ＰＤ－１に結合するＶＨＨドメインが本明細書に提供される。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１ＶＨＨドメインは、配列番号２８４に記載されるＶＨＨドメイン、または配列番号２８４に記載される選択されたＶＨＨ領域アミノ酸と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列中に含有されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含有する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ＶＨＨドメインは、配列番号２８４に記載されるアミノ酸配列、または配列番号２８４に記載される選択されたアミノ酸と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ＶＨＨドメインは、配列番号２８４に記載されるアミノ酸配列のヒト化バリアントである。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１ＶＨＨドメインは、配列番号３１２に記載されるＶＨＨドメイン、または配列番号３１２に記載される選択されたＶＨＨ領域アミノ酸と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列中に含有されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含有する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ＶＨＨドメインは、配列番号３１２に記載されるアミノ酸配列、または配列番号３１２に記載される選択されたアミノ酸と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ＶＨＨドメインは、配列番号３１２に記載されるアミノ酸配列のヒト化バリアントである。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１ＶＨＨドメインは、配列番号２６８、２７２、２７３、または３１３のいずれか１つに記載されるＣＤＲ１、配列番号２７８または３１４に記載されるＣＤＲ２、および配列番号２８３または３１５に記載されるＣＤＲ３を含有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１ＶＨＨドメインは、それぞれ配列番号２７２、２７８、および２８３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１ＶＨＨドメインは、それぞれ配列番号２６８、２７８、および２８３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１ＶＨＨドメインは、それぞれ配列番号２７２、２７８、および２８３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１ＶＨＨドメインは、それぞれ配列番号２７３、２７８、および２８３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１ＶＨＨドメインは、それぞれ配列番号３１３、３１４、および３１５に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含有する。

いくつかの態様では、ＰＤ－１に結合するＶＨＨドメインは、配列番号２５１～２６７のいずれかから選択されるＶＨＨアミノ酸配列、または配列番号２５１～２６７のいずれか１つから選択されるＶ_ＨＨ領域アミノ酸と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列中に含有されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。

場合によっては、提供されるＰＤ－１ＶＨＨドメインは、配列番号２５１～２６７のいずれかに記載されるアミノ酸配列、または配列番号２５１～２６７のいずれか１つから選択されるＶＨＨ領域アミノ酸と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、ヒト化バリアントである。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ヒト化ＶＨＨドメインは、配列番号２５１～２６７のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列を有する。

配列番号２８７、２８８、２８９、もしくは２９０のいずれかから選択されるＶＨＨアミノ酸配列、または配列番号２９６、２９７、２９８、もしくは２９９のいずれか１つから選択されるＶＨＨ領域アミノ酸と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列中に含有されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、ＰＤ－１に結合するＶＨＨドメインが本明細書に提供される。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ＶＨＨドメインは、配列番号２９６、２９７、２９８、または２９９に記載されるアミノ酸配列のヒト化バリアントである。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１ＶＨＨドメインは、配列番号３００、３０３、３０６、または３０９のいずれか１つに記載されるＣＤＲ１、配列番号３０１、３０４、３０７、または３１０に記載されるＣＤＲ２、配列番号３０２、３０５、３０８、または３１１に記載されるＣＤＲ３を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１ＶＨＨドメインは、配列番号３００に記載されるＣＤＲ１、配列番号３０１に記載されるＣＤＲ２、および配列番号３０２に記載されるＣＤＲ３を含有するか、本明細書に提供されるＰＤ－１ＶＨＨドメインは、配列番号３０３に記載されるＣＤＲ１、配列番号３０４に記載されるＣＤＲ２、および配列番号３０５に記載されるＣＤＲ３を含有するか、本明細書に提供されるＰＤ－１ＶＨＨドメインは、配列番号３０６に記載されるＣＤＲ１、配列番号３０７に記載されるＣＤＲ２、および配列番号３０８に記載されるＣＤＲ３を含有するか、または本明細書に提供されるＰＤ－１ＶＨＨドメインは、配列番号３０９に記載されるＣＤＲ１、配列番号３１０に記載されるＣＤＲ２、および配列番号３１１に記載されるＣＤＲ３を含有する。

ＩＩＩ．ＰＤ－１結合ポリペプチドを含有する融合タンパク質およびコンジュゲート
本明細書において、１つ以上の追加のドメインまたは部分に直接または間接的に連結されたＰＤ－１に特異的に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインを含有するＰＤ－１結合ポリペプチドを含有する、融合タンパク質およびコンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質またはコンジュゲートは、単一ポリペプチドから構成される。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質またはコンジュゲートは、２つ以上のポリペプチドから構成される。いくつかの実施形態では、本開示のＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－１に特異的に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインを組み込む。いくつかの態様では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、多価である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－１に特異的に結合するＶＨＨドメインの２つ以上のコピー、例えば、ＰＤ－１に特異的に結合するＶＨＨドメインの３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上のコピーを含む。特定の態様では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、多重特異性である。例えば、場合によっては、１つ以上の追加のドメインは、１つ以上のさらなる抗原またはタンパク質に結合する１つ以上の追加の結合ドメインであってもよい。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＤ－１結合ポリペプチドは、アミノ酸リンカーを介して作動可能に連結された２つ以上のポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、これらのリンカーは、本明細書においてＧＳリンカーとして示される、アミノ酸グリシンおよびセリンから主に構成される。本開示の融合タンパク質のＧＳリンカーは、様々な長さ、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、ＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_２（配列番号１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_３（配列番号２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_４（配列番号３）、およびＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_５（配列番号４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、非限定的な例として、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ（配列番号５）、ＧＧＧＧＧ（配列番号６）、およびＧＧＧＧＧＧ（配列番号７）などのグリシン残基を含む可動性リンカーである。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＧＳリンカーとグリシンリンカーとの組み合わせを含む。

Ａ．Ｆｃ融合体
本明細書に提供されるＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインと、Ｆｃドメインとを含有する融合タンパク質である、ＰＤ－１結合ポリペプチドが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－１に結合する１、２、３、または４個のＶＨＨドメインと、Ｆｃドメインと、を含む。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質への免疫グロブリンＦｃ領域の組み込みは、いくつかの態様では、一緒に二量体を形成する２つのポリペプチドから構成され得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＰＤ－１結合部位の数を２倍にする二量体が形成されるように、細胞から発現される場合などの生理学的条件下でＰＤ－１結合ポリペプチドの二量体化を媒介する。例えば、ＰＤ－１に結合する３つのＶＨＨドメインと、Ｆｃ領域と、を含むＰＤ－１結合ポリペプチドは、単量体として三価であるが、Ｆｃ領域は、二量体化を媒介してもよく、このため、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、そのような条件下で六価二量体として存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ＶＨＨドメインは、ＩｇＧＦｃ領域に融合され、これらの実施形態では、融合タンパク質は、分子当たり２つのＰＤ－１ＶＨＨドメインを有する二価である。いくつかの実施形態では、２つのＰＤ－１結合ドメイン（２×）は、ＩｇＧＦｃ領域に融合され、これらの実施形態では、融合タンパク質は、分子当たり４つのＰＤ－１ＶＨＨドメインを有する四価である。いくつかの実施形態では、３つのＰＤ－１ＶＨＨドメイン（３×）は、ＩｇＧＦｃ領域に融合され、これらの実施形態では、融合タンパク質は、分子当たり６つのＰＤ－１ＶＨＨドメインを有する六価である。

いくつかの実施形態では、多価ＰＤ－１結合ポリペプチドは、二価である。いくつかの実施形態では、本開示の二価ＰＤ－１結合ポリペプチドは、以下の構造を有するＰＤ－１結合ポリペプチドの２つのコピーを含む：（ＰＤ－１ＶＨＨ）－リンカー－Ｆｃ。いくつかの実施形態では、多価ＰＤ－１結合ポリペプチドは、四価である。いくつかの実施形態では、本開示の四価ＰＤ－１結合ポリペプチドは、以下の構造を有するＰＤ－１－ポリペプチドの２つのコピーを含む：（ＰＤ－１ＶＨＨ）－リンカー－（ＰＤ－１ＶＨＨ）－リンカー－Ｆｃ。いくつかの実施形態では、多価ＰＤ－１結合ポリペプチドは、六価である。いくつかの実施形態では、本開示の六価ＰＤ－１結合ポリペプチドは、以下の構造を有するＰＤ－１結合ポリペプチドの２つのコピーを含む：（ＰＤ－１ＶＨＨ）－リンカー－（ＰＤ－１ＶＨＨ）－リンカー－（ＰＤ－１ＶＨＨ）－リンカー－Ｆｃ。

場合によっては、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインがホモ二量体化ドメインとして使用され得、このため、結果として得られる融合タンパク質は、２つの同一のポリペプチドから形成される。他の場合では、Ｆｃ領域のＣＨ３二量体界面領域は、ヘテロ二量体化を可能にするように変異され得る。例えば、ヘテロ二量体化ドメインは、構築物が非対称融合タンパク質であるように、融合タンパク質に組み込まれ得る。

提供される実施形態のいずれかにおいて、ＰＤ－１ＶＨＨドメインは、上記のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ＶＨＨドメインは、ＰＤ－１に結合するヒト化ＶＨＨドメインである。

様々な実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチド中に含まれるＦｃドメインは、ヒトＦｃドメインであるか、またはヒトＦｃドメインに由来する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ領域を含有する。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、ＩｇＧ３アイソタイプ、およびＩｇＧ４サブクラスからなる群から選択されるＩｇＧアイソタイプである。

いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域またはその免疫学的に活性な断片は、ＩｇＧアイソタイプである。例えば、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域は、以下のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１アイソタイプである：
ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８）

いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒトＩｇＧ１ポリペプチド配列を含む。

本開示の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含むいくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、変異または修飾される。場合によっては、変異は、Ｆｃポリペプチドのエフェクター機能を低減するための１つ以上のアミノ酸置換を含む。以下に記載されるいずれかを含む、エフェクター機能を改変する、例えば、低減するためのＦｃポリペプチドに対する変異の様々な例が既知である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域内のアミノ酸置換への言及は、特定の配列番号を参照して記載されない限り、ＫａｂａｔによるＥＵナンバリング（Ｋａｂａｔナンバリングとも呼ばれる）によるものである。ＥＵナンバリングは既知であり、最新のＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ（ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ（作成：２００１年５月１７日、最終更新：２０１３年１月１０日）、およびＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔａｌ．ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈｅｄ．ＵＳＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ公開番号９１－３２４２（１９９１）で報告されているＥＵインデックスに従っている。

いくつかの実施形態では、低減されたエフェクター機能を示すＦｃ領域は、ＰＤ－１またはＣＤ３結合が望ましいが、特定のエフェクター機能（ＣＤＣおよびＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途のための望ましい候補であり得る。ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／減少を確認するために、インビトロおよび／またはインビボ細胞傷害性アッセイが実施され得る。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、多重特異性ポリペプチド構築物および／またはその切断された構成成分が、ＦｃγＲ結合を欠く（したがってＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確実にするために、実施され得る。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介するための初代細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照）、およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１４９９－１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。代替的に、非放射性アッセイ方法が採用されてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．、およびＣｙｔｏＴｏｘ９６（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を参照）。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価され得る。Ｃ１ｑ結合アッセイも、多重特異性ポリペプチド構築物またはその切断された構成成分がＣ１ｑに結合することができず、したがってＣＤＣ活性を欠くことを確認するために実施され得る。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが実施され得る（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１０１：１０４５－１０５２（２００３）、およびＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄＭ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ１０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照）。ＦｃＲｎ結合およびインビボクリアランス／半減期の決定も、当該技術分野で既知の方法を使用して実施され得る（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）を参照）。

いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧＦｃ領域は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を改変するために修飾され、例えば、Ｎａｔｓｕｍｅｅｔａｌ．，２００８ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，６８（１０）：３８６３－７２、Ｉｄｕｓｏｇｉｅｅｔａｌ．，２００１ＪＩｍｍｕｎｏｌ，１６６（４）：２５７１－５、Ｍｏｏｒｅｅｔａｌ．，２０１０ｍＡｂｓ，２（２）：１８１－１８９、Ｌａｚａｒｅｔａｌ．，２００６ＰＮＡＳ，１０３（１１）：４００５－４０１０、Ｓｈｉｅｌｄｓｅｔａｌ．，２００１ＪＢＣ，２７６（９）：６５９１－６６０４、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎｅｔａｌ．，２００７ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，６７（１８）：８８８２－８８９０、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎｅｔａｌ．，２００８Ａｄｖａｎ．ＥｎｚｙｍｅＲｅｇｕｌ．，４８：１５２－１６４、Ａｌｅｇｒｅｅｔａｌ，１９９２ＪＩｍｍｕｎｏｌ，１４８：３４６１－３４６８、ＲｅｖｉｅｗｅｄｉｎＫａｎｅｋｏａｎｄＮｉｗａ，２０１１Ｂｉｏｄｒｕｇｓ，２５（１）：１－１１に記載されているアミノ酸修飾である。

ＡＤＣＣを強化する変異の例としては、Ｓｅｒ２３９およびＩｌｅ３３２での修飾、例えば、Ｓｅｒ２３９ＡｓｐおよびＩｌｅ３３２Ｇｌｕ（Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）が挙げられる。ＣＤＣを強化する変異の例としては、Ｌｙｓ３２６およびＧｌｕ３３３での修飾が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、これらの位置、例えば、Ｌｙｓ３２６Ａｌａおよび／またはＧｌｕ３３３Ａｌａ（Ｋ３２６ＡおよびＥ３３３Ａ）の一方または両方で、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用して修飾される。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、以下の位置のうちの１つ以上で改変されて、Ｆｃ受容体結合を低減する：Ｌｅｕ２３４（Ｌ２３４）、Ｌｅｕ２３５（Ｌ２３５）、Ａｓｐ２６５（Ｄ２６５）、Ａｓｐ２７０（Ｄ２７０）、Ｓｅｒ２９８（Ｓ２９８）、Ａｓｎ２９７（Ｎ２９７）、Ａｓｎ３２５（Ｎ３２５）、またはＡｌａ３２７（Ａ３２７）、またはＰｒｏ３２９（Ｐ３２９）。例えば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ）、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３５Ａ）、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ（Ｌ２３５Ｅ）、Ａｓｐ２６５Ａｓｎ（Ｄ２６５Ｎ）、Ａｓｐ２６５Ａｌａ（Ｄ２６５Ａ）、Ａｓｐ２７０Ａｓｎ（Ｄ２７０Ｎ）、Ｓｅｒ２９８Ａｓｎ（Ｓ２９８Ｎ）、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）、Ｐｒｏ３２９Ａｌａ（Ｐ３２９Ａ）、またはＰｒｏ２３９Ｇｌｙ（Ｐ３２９Ｇ）、Ａｓｎ３２５Ｇｌｕ（Ｎ３２５Ｅ）、またはＡｌａ３２７Ｓｅｒ（Ａ３２７Ｓ）。好ましい実施形態では、Ｆｃ領域内の修飾は、Ｆｃ受容体－ガンマ受容体への結合を低減する一方で、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合への影響は最小限である。

いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域は、アミノ酸Ａｓｎ２９７（Ｋａｂａｔナンバリング）で修飾されて、融合タンパク質のグリコシル化、例えば、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）またはＡｓｎ２９７Ａｓｐ（Ｎ２９７Ｄ）を防止する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、アミノ酸Ｌｅｕ２３５（Ｋａｂａｔナンバリング）で修飾されて、Ｆｃ受容体相互作用を改変する（例えば、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ（Ｌ２３５Ｅ）またはＬｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３５Ａ））。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、アミノ酸Ｌｅｕ２３４（Ｋａｂａｔナンバリング）で修飾されて、Ｆｃ受容体相互作用を改変する（例えば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ））。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、アミノ酸Ｌｅｕ２３４（Ｋａｂａｔナンバリング）で修飾されて、Ｆｃ受容体相互作用を改変する（例えば、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ（Ｌ２３５Ｅ））。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、アミノ酸２３４および２３５の両方で改変される（例えば、Ｌｅｕ２３４ＡｌａおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）またはＬｅｕ２３４ＶａｌおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ））。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、２３４、２３５、および２９７のアミノ酸で改変される（例えば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｎ２９７Ａ））。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、２３４、２３５、および３２９のアミノ酸で改変される（例えば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ、Ｐｒｏ２３９Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ａ））。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、アミノ酸Ａｓｐ２６５（Ｋａｂａｔナンバリング）で修飾されて、Ｆｃ受容体相互作用を改変する（例えば、Ａｓｐ２６５Ａｌａ（Ｄ２６５Ａ））。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、アミノ酸Ｐｒｏ３２９（Ｋａｂａｔナンバリング）で修飾されて、Ｆｃ受容体相互作用を改変する（例えば、Ｐｒｏ３２９Ａｌａ（Ｐ３２９Ａ）またはＰｒｏ３２９Ｇｌｙ（Ｐ３２９Ｇ））。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、アミノ酸２６５および３２９の両方で改変される（例えば、Ａｓｐ２６５ＡｌａおよびＰｒｏ３２９Ａｌａ（Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ）またはＡｓｐ２６５ＡｌａおよびＰｒｏ３２９Ｇｌｙ（Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ｇ））。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、２３４、２３５、および２６５のアミノ酸で改変される（例えば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ、Ａｓｐ２６５Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ａ））。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、２３４、２３５、および３２９のアミノ酸で改変される（例えば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ））。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、２３４、２３５、２６５、および３２９のアミノ酸で改変される（例えば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ、Ａｓｐ２６５Ａｌａ、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｇｌｙ２３５で改変されて、Ｆｃ受容体結合を低減する。例えば、Ｇｌｙ２３５は、融合タンパク質から欠失している。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域は、アミノ酸Ｇｌｙ２３６で修飾されて、ＣＤ３２Ａとの相互作用を強化する（例えば、Ｇｌｙ２３６Ａｌａ（Ｇ２３６Ａ））。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｌｙｓ４４７を欠く（Ｋａｂａｔｅｔａｌ１９９１ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔのＥＵインデックス）。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、以下の位置の１つ以上でアミノ酸を欠いて、Ｆｃ受容体結合を低減する：Ｇｌｕ２３３（Ｅ２３３）、Ｌｅｕ２３４（Ｌ２３４）、またはＬｅｕ２３５（Ｌ２３５）。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、以下の位置：Ｇｌｕ２３３（Ｅ２３３）、Ｌｅｕ２３４（Ｌ２３４）、またはＬｅｕ２３５（Ｌ２３５）の１つ以上でアミノ酸を欠いており、Ａｓｐ２６５（Ｄ２６５）、Ａｓｎ２９７（Ｎ２９７）、またはＰｒｏ３２９（Ｐ３２９）の１つ以上で修飾されて、Ｆｃ受容体結合を低減する。例えば、ＰＤ－１結合ポリペプチド中に含まれるＦｃ領域は、ヒトＦｃドメインに由来し、ＩｇＧ１Ｅ２３３、Ｌ２３４、およびＬ２３５に対応する下部ヒンジの３つのアミノ酸欠失を含む。いくつかの態様では、そのようなＦｃポリペプチドは、ＦｃγＲに関与しないため、「エフェクターサイレント」または「エフェクターヌル」と称される。例えば、これらの３つのアミノ酸のＦｃ欠失は、補体タンパク質Ｃ１ｑ結合を低減する。いくつかの実施形態では、これらの３つのアミノ酸のＦｃ欠失を有するＦｃ領域を有するポリペプチドは、ＦｃＲｎへの結合を保持し、したがって、ＦｃＲｎ媒介性再循環に関連する半減期およびトランスサイトーシスを増大させている。そのような修飾Ｆｃ領域は、「ＦｃｘＥＬＬ」または「Ｆｃ欠失」と称され、以下のアミノ酸配列を有する：
ＰＡＰＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９）

いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒトＩｇＧ１ポリペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧＦｃ領域は、ＦｃＲｎ結合を強化するように修飾される。ＦｃＲｎへの結合を強化するＦｃ変異の例は、Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ、Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ、Ｔｈｒ２５６Ｇｌｕ（それぞれＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）（Ｋａｂａｔナンバリング、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａｅｔａｌ２００６，Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍＶｏｌ．２８１（３３）２３５１４－２３５２４）、Ｍｅｔ４２８ＬｅｕおよびＡｓｎ４３４Ｓｅｒ（Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ）（Ｚａｌｅｖｓｋｙｅｔａｌ２０１０ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ，Ｖｏｌ．２８（２）１５７－１５９）、またはＭｅｔ２５２Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２５６Ａｓｐ、Ｍｅｔ４２８Ｌｅｕ（それぞれＭ２５２Ｉ、Ｔ２５６Ｄ、Ｍ４２８Ｌ）（Ｋａｂａｔｅｔａｌ１９９１ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔのＥＵインデックス）である。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチド中に含まれるＦｃドメインは、ヒトＦｃドメインに由来し、本明細書において「Ｆｃ－ＹＶ」と称される変異Ｍ２５２ＹおよびＭ４２８Ｖを含む。いくつかの実施形態では、変異または修飾Ｆｃポリペプチドは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用した以下の変異を含む：Ｍ２５２ＹおよびＭ４２８Ｌ。いくつかの実施形態では、そのような変異は、エンドソームの酸性ｐＨ（ほぼ６．５）でＦｃＲｎへの結合を強化する一方で、中性ｐＨ（約７．２）で検出可能な結合を失い、ＦｃＲｎ媒介性再循環の強化および半減期の延長を可能にする。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチド中に含まれるＦｃドメインは、ヒトＦｃドメインに由来し、ヘテロ二量体化を誘発する変異を含む。いくつかの実施形態では、そのような変異は、「ノブ：および「ホール」変異と称されるものを含む。例えば、Ｔｈｒ３６６でＣＨ３ドメイン内にアミノ酸修飾を有することは、よりかさ高いアミノ酸、例えば、Ｔｒｙ（Ｔ３６６Ｗ）で置き換えらえた場合、位置Ｔｈｒ３６６、Ｌｅｕ３６８、およびＴｙｒ４０７におけるあまりかさ高くないアミノ酸、例えば、それぞれＳｅｒ、Ａｌａ、およびＶａｌ（Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）へのアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３ドメインと優先的に対になることが可能である。いくつかの実施形態では、「ノブ」Ｆｃドメインは、変異Ｔ３６６Ｗを含む。いくつかの実施形態では、「ホール」Ｆｃドメインは、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む。ＣＨ３修飾を介したヘテロ二量体化は、ジスルフィド結合の導入によって、例えば、反対側のＣＨ３ドメイン上でＳｅｒ３５４をＣｙｓ（Ｓ３５４Ｃ）およびＹ３４９をＣｙｓ（Ｙ３４９Ｃ）に変化させることによって、さらに安定化され得る（Ｃａｒｔｅｒ，２００１ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，２４８：７－１５で考察されている）。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化に使用されるＦｃドメインは、ヘテロ二量体Ｆｃ対の第１のメンバー上の変異Ｓ３５４Ｃなどの追加の変異を含み、これは、ヘテロ二量体Ｆｃ対の第２のメンバー上の対応する変異Ｙ３４９Ｃを有する非対称ジスルフィドを形成する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ対の１つのメンバーは、ＦｃＲｎ結合を維持しながら、プロテインＡ結合を防止するための修飾Ｈ４３５ＲまたはＨ４３５Ｋを含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ対の１つのメンバーが修飾Ｈ４３５ＲまたはＨ４３５Ｋを含む一方で、ヘテロ二量体Ｆｃ対の第２のメンバーは、Ｈ４３５で修飾されない。様々な実施形態では、ホールＦｃドメインは、修飾Ｈ４３５ＲまたはＨ４３５Ｋを含む（修飾がＨ４３５Ｒである場合、「ホール－Ｒ」と称される）が、ノブＦｃドメインは含まない。場合によっては、ホール－Ｒ変異は、存在し得るホモ二量体ホールＦｃドメインよりもヘテロ二量体の精製を改善する。

いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧＦｃ領域は、二量体化を防止するように修飾される。これらの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、単量体である。例えば、残基Ｔｈｒ３６６での荷電残基への修飾、例えば、Ｔｈｒ３６６Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３６６Ａｒｇ、Ｔｈｒ３６６Ａｓｐ、またはＴｈｒ３６６Ｇｌｕ（それぞれＴ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｒ、Ｔ３６６Ｄ、またはＴ３６６Ｅ）は、ＣＨ３－ＣＨ３二量体化を防止する。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域または免疫学的に活性な断片は、以下のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ２アイソタイプである：
ＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１０）

いくつかの実施形態では、融合体またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒトＩｇＧ２ポリペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域は、アミノ酸Ａｓｎ２９７で修飾される（例えば、抗体のグリコシル化を防止するため、例えば、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）またはＡｓｎ２９７Ａｓｐ（Ｎ２９７Ｄ））。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域は、Ｌｙｓ４４７を欠く（Ｋａｂａｔｅｔａｌ１９９１ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔのＥＵインデックス）。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域または免疫学的に活性な断片は、以下のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ３アイソタイプである：
ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＫＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１１）

いくつかの実施形態では、抗体またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒトＩｇＧ３ポリペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域は、アミノ酸Ａｓｎ２９７（Ｋａｂａｔナンバリング）で修飾されて、抗体のグリコシル化、例えば、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）またはＡｓｎ２９７Ａｓｐ（Ｎ２９７Ｄ）を防止する。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域は、アミノ酸４３５で修飾されて、半減期を延長させる（例えば、Ａｒｇ４３５Ｈｉｓ（Ｒ４３５Ｈ））。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域は、Ｌｙｓ４４７を欠く（Ｋａｂａｔｅｔａｌ１９９１ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔのＥＵインデックス）。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域または免疫学的に活性な断片は、以下のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ４アイソタイプである：
ＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１２）

いくつかの実施形態では、抗体またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒトＩｇＧ４ポリペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域または免疫学的に活性な断片は、以下のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ４アイソタイプである：
ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１３）

いくつかの実施形態では、抗体またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒトＩｇＧ４ポリペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域は、アミノ酸２３５で修飾されて、Ｆｃ受容体相互作用を改変する（例えば、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ（Ｌ２３５Ｅ）。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域は、アミノ酸Ａｓｎ２９７（Ｋａｂａｔナンバリング）で修飾されて、抗体のグリコシル化、例えば、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）またはＡｓｎ２９７Ａｓｐ（Ｎ２９７Ｄ）を防止する。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域は、Ｌｙｓ４４７を欠く（Ｋａｂａｔｅｔａｌ１９９１ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔのＥＵインデックス）。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリンヒンジ領域由来のポリペプチドを含有する。ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧサブクラスのいずれかから選択され得る。例えば、融合タンパク質は、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号１４）の配列を有する修飾ＩｇＧ１ヒンジを含有してもよく、ここで、軽鎖のＣ末端システインとジスルフィドを形成するＣｙｓ２２０中では、セリンに変異される（例えば、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ（Ｃ２２０Ｓ））。他の実施形態では、融合タンパク質は、配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号１５）を有する切断ヒンジを含有する。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、例えば、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣ（配列番号１６）を有する鎖交換、例えば、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ（Ｓ２２８Ｐ）を防止または低減するように修飾される、ＩｇＧ４由来の修飾ヒンジを有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、リンカーポリペプチドを含有する。他の実施形態では、融合タンパク質は、リンカーポリペプチドおよびヒンジポリペプチドを含有する。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｎ２９７でＮ連結グリカン鎖に結合されたフコースを欠くか、またはそれを低減している。フコシル化を防止する方法は多数あり、ＦＵＴ８欠損細胞株における産生、哺乳動物細胞培養培地への添加阻害剤、例えば、カスタノスペルミン、および産生細胞株の代謝工学が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトに見られる既存の抗体による認識を排除するように操作される。いくつかの実施形態では、本開示のＶＨＨ含有ポリペプチドは、位置Ｌｅｕ１１の変異、例えば、Ｌｅｕ１１Ｇｌｕ（Ｌ１１Ｅ）またはＬｅｕ１１Ｌｙｓ（Ｌ１１Ｋ）によって修飾される。他の実施形態では、本開示の単一ドメイン抗体は、カルボキシ末端領域の変化によって修飾され、例えば、末端配列は、配列ＧＱＧＴＬＶＴＶＫＰＧＧ（配列番号１７）もしくはＧＱＧＴＬＶＴＶＥＰＧＧ（配列番号１８）、またはその修飾を有する。いくつかの実施形態では、本開示のＶＨＨ含有ポリペプチドは、１１位の変異およびカルボキシ末端領域の変化によって修飾される。

いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質の１つ以上のポリペプチドは、アミノ酸リンカーを介して作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、これらのリンカーは、本明細書においてＧＳリンカーとして示される、アミノ酸グリシンおよびセリンから主に構成される。本開示の融合タンパク質のＧＳリンカーは、様々な長さ、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０アミノ酸長であり得る。

いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、ＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_２（配列番号１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_３（配列番号２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_４（配列番号３）、およびＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_５（配列番号４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、非限定的な例として、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ（配列番号５）、ＧＧＧＧＧ（配列番号６）、およびＧＧＧＧＧＧ（配列番号７）などのグリシン残基を含む可動性リンカーである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＧＳリンカーとグリシンリンカーとの組み合わせを含むことができる。

Ｂ．コンジュゲート
本明細書に提供されるＰＤ－１に特異的に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインと、１つ以上のさらなる部分とを含有するコンジュゲートが、本明細書に提供される。さらなる部分は、細胞傷害性薬剤などの治療薬であってもよいか、または検出剤であってもよい。いくつかの実施形態では、部分は、標的化部分、小分子薬剤（５００ダルトン未満のモル質量の非ポリペプチド薬剤）、毒素、細胞増殖抑制剤、細胞傷害性薬剤、免疫抑制剤、診断目的に好適な放射性薬剤、治療目的のための放射性金属イオン、プロドラッグ活性化酵素、生物学的半減期を延長させる薬剤、または診断用もしくは検出可能な薬剤であり得る。

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、細胞傷害性、細胞増殖抑制性であるか、または別の方法で何らかの治療的利益を提供する治療薬にコンジュゲートされた、本明細書に提供される１つ以上のＰＤ－１ＶＨＨドメインを含有する、抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ、イムノコンジュゲートとも呼ばれる）である。いくつかの実施形態では、細胞傷害性薬剤は、化学療法薬、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはその断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）である。いくつかの実施形態では、本開示の提供される抗体薬剤コンジュゲートは、腫瘍への薬剤部分の標的化送達を可能にする。場合によっては、これは、腫瘍細胞の標的化死滅をもたらし得る。

いくつかの実施形態では、治療薬とコンジュゲートされた本明細書に提供される少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインを含む、ＰＤ－１結合コンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態では、治療薬としては、例えば、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、およびビンデシンが挙げられる（Ｒｏｗｌａｎｄｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２１：１８３－１８７，１９８６）。いくつかの実施形態では、治療薬は、細胞内活性を有する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合コンジュゲートは内在化され、治療薬は、細胞のタンパク質合成を遮断し、その中で細胞死をもたらす細胞毒素である。いくつかの実施形態では、治療薬は、例えば、ゲロニン、ボウガニン、サポリン、リシン、リシンＡ鎖、ブリオジン、ジフテリア毒素、レストリクトシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、およびそれらのバリアントを含む、リボソーム不活性化活性を有するポリペプチドを含む細胞毒素である。いくつかの実施形態では、治療薬がリボソーム不活性化活性を有するポリペプチドを含む細胞毒素である場合、ＰＤ－１結合コンジュゲートは、タンパク質が細胞にとって細胞傷害性であるために、標的細胞への結合時に内在化されなければならない。

いくつかの実施形態では、毒素とコンジュゲートされた本明細書に提供される少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインを含む、ＰＤ－１結合コンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態では、毒素としては、例えば、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシンなどの小分子毒素（Ｍａｎｄｌｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．９２（１９）：１５７３－１５８１（２０００）、Ｍａｎｄｌｅｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１０：１０２５－１０２８（２０００）、Ｍａｎｄｌｅｒｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．１３：７８６－７９１（２００２））、メイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３、Ｌｉｕｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８－８６２３（１９９６））、およびカリケアマイシン（Ｌｏｄｅｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５８：２９２８（１９９８）、Ｈｉｎｍａｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５３：３３３６－３３４２（１９９３））が挙げられる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構によって、その細胞傷害効果および細胞増殖抑制効果を発揮し得る。

いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルを間接的にまたは直接発生させることができる標識とコンジュゲートされた、本明細書に提供される少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインを含む、ＰＤ－１結合コンジュゲートが提供される。これらのＩｇＳＦコンジュゲートは、癌のインビボ検出などの研究または診断用途に使用され得る。標識は好ましくは、直接または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを発生させることが可能である。例えば、標識は、放射線不透過性、もしくは３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉなどの放射性同位体；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリンなどの蛍光（フルオロフォア）もしくは化学発光（発色団）化合物；アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素；造影剤；または金属イオンであり得る。いくつかの実施形態では、標識は、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、９９Ｔｃもしくは１２３Ｉ、またはジルコニウム－８９、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄などの核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても既知）のためのスピン標識である。ジルコニウム－８９は、例えば、ＰＥＴ画像法のために、様々な金属キレート剤に複合体化され、抗体にコンジュゲートされてもよい（ＷＯ２０１１／０５６９８３）。

ＰＤ－１結合コンジュゲートは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して調製され得る。例えば、ＷＯ２００９／０６７８００、ＷＯ２０１１／１３３８８６、および米国特許出願公開第２０１４３２２１２９号（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、結合は、共有結合性または非共有結合性であり得、例えば、ビオチン－ストレプトアビジン非共有結合性相互作用を介してもよい。いくつかの実施形態では、同一であってもよいか、または異なっていてもよい１、２、３、４、５個、またはそれ以上の部分が、ＰＤ－１ＶＨＨドメインにコンジュゲート、連結、または融合されて、ＰＤ－１結合コンジュゲートを形成する。いくつかの実施形態では、そのような部分は、当該技術分野で既知であり、以下に記載される様々な分子生物学的または化学的なコンジュゲーションおよび連結方法を使用して、ＶＨＨドメインに結合され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカー、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、またはコンジュゲーション反応を補助するリンカーなどのリンカーを使用して、エフェクター部分をバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質に連結またはコンジュゲートすることができる。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ＶＨＨドメインは、リンカー（Ｌ）を介して、１つ以上の部分、例えば、ＶＨＨ当たり約１～約２０個の薬剤部分とコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合コンジュゲートは、以下の構成成分：（ＶＨＨドメイン）、（Ｌ）_ｑ、および（部分）_ｍを含み、ここで、ＶＨＨドメインは、記載されるＰＤ－１に特異的に結合することが可能な記載されるＶＨＨドメインのいずれかであり、Ｌは、タンパク質またはポリペプチドをその部分に連結するためのリンカーであり、ｍは少なくとも１であり、ｑは０以上であり、得られるＰＤ－１結合コンジュゲートは、ＰＤ－１に結合する。特定の実施形態では、ｍは１～４であり、ｑは０～８である。

リンカーは、１つ以上のリンカー構成成分から構成されてもよい。抗体および薬剤部分の共有結合については、リンカーは典型的には、２つの反応性官能基、すなわち、反応性の意味で二価性を有する。ペプチド、核酸、薬剤、毒素、抗体、ハプテン、およびレポーター基などの２つ以上の機能的または生物学的に活性な部分を結合するのに有用である二価リンカー試薬は既知であり、方法が、それらの結果として生じるコンジュゲートについて記載されている（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ：ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐ２３４－２４２）。

例示的なリンカー構成成分としては、６－マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン－シトルリン（「ｖａｌ－ｃｉｔ」）、アラニン－フェニルアラニン（「ａｌａ－ｐｈｅ」）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、Ｎ－スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－Ｉカルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、およびＮ－スクシンイミジル（４－ヨード－アセチル）アミノベンゾエート（「ＳＩＡＢ」）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸残基を含んでもよい。例示的なアミノ酸リンカー構成成分としては、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、またはペンタペプチドが挙げられる。例示的なジペプチドとしては、バリン－シトルリン（ｖｃまたはｖａｌ－ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（ａｆまたはａｌａ－ｐｈｅ）が挙げられる。例示的なトリペプチドとしては、グリシン－バリン－シトルリン（ｇｌｙ－ｖａｌ－ｃｉｔ）、およびグリシン－グリシン－グリシン（ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ）が挙げられる。アミノ酸リンカー構成成分を含むアミノ酸残基としては、天然のもの、ならびに微量アミノ酸および非天然アミノ酸類似体、例えば、シトルリンが挙げられる。アミノ酸リンカー構成成分は、プラスミンプロテアーゼでの特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼであるカテプシンＢ、Ｃ、およびＤによる酵素切断に対する選択性において設計および最適化され得る。

ＶＨＨドメインと細胞傷害性薬剤とのコンジュゲートは、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性エステル（ジスクシンイミジル基質など）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネートなど）、およびビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製され得る。

抗体薬剤コンジュゲートは、当業者に既知の有機化学反応、条件、および試薬などの様々な方法によって調製され得る。一実施形態では、方法は、（１）共有結合を介した、ＶＨＨ－Ｌを形成するための二価リンカー試薬とのＶＨＨドメインの求核基の反応、続く薬剤部分Ｄとの反応、および（２）共有結合を介した、Ｄ－Ｌを形成するための二価リンカー試薬との薬剤部分の求核基の反応、続くＶＨＨドメインの求核基との反応を含む。

ＶＨＨドメインを含む抗体上の求核基としては、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン、および（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖ヒドロキシル基またはアミノ基が挙げられるが、これらに限定されない。アミン、チオール、およびヒドロキシル基は、求核性であり、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基（（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、および酸ハロゲン化物などの活性エステル、（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのアルキルおよびベンジルハロゲン化物、（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基を含む）と共有結合を形成するように反応することが可能である。追加の求核基は、アミンのチオールへの変換をもたらす２－イミノチオラン（Ｔｒａｕｔの試薬）とリジンとの反応を介して、抗体に導入され得る。反応性チオール基は、１、２、３、４個、またはそれ以上のシステイン残基を導入することによって（例えば、１つ以上の非天然システインアミノ酸残基を含む変異抗体を調製することによって）、抗体（またはその断片）に導入されてもよい。

抗体薬剤コンジュゲートなどのコンジュゲートはまた、ＶＨＨドメインなどの抗体の修飾によって産生されて、求電子部分を導入してもよく、これは、リンカー試薬または薬剤上で求核置換基と反応し得る。グリコシル化抗体の糖は、例えば、過ヨウ素酸酸化試薬で酸化されて、アルデヒドまたはケトン基を形成してもよく、これは、リンカー試薬または薬剤部分のアミン基と反応し得る。結果として得られるイミンシッフ塩基は、安定した連結を形成し得るか、または例えば、ホウ化水素試薬によって還元されて、安定したアミン連結を形成し得る。一実施形態では、ガラクトースオキシダーゼ（ｇｌａｃｔｏｓｅｏｘｉｄａｓｅ）または（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかと、グリコシル化抗体の炭水化物部分との反応は、薬剤上の適切な基と反応することができるタンパク質中のカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基を生じさせ得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。別の実施形態では、Ｎ末端セリンまたはトレオニン残基を含有するタンパク質は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応し、第１のアミノ酸の代わりにアルデヒドの産生をもたらすことができる。そのようなアルデヒドは、薬剤部分またはリンカー求核試薬と反応することができる。

同様に、薬剤部分上の求核基としては、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基（（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｉエステル、ハロホルメート、および酸ハロゲン化物などの活性エステル、（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのアルキルおよびベンジルハロゲン化物、（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基を含む）と共有結合を形成するように反応することが可能な、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基が挙げられるが、これらに限定されない。

代替的に、ＶＨＨドメインと細胞傷害性薬剤とを含有する融合タンパク質は、例えば、組み換え技術またはペプチド合成によって作製され得る。ＤＮＡの長さは、互いに隣接しているか、またはコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離された、コンジュゲートの２つの部分をコードするそれぞれの領域を含んでもよい。

Ｃ．多重特異性フォーマット
ＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインと、１つ以上の追加の結合ドメインとを含有する多重特異性である、ＰＤ－１結合ポリペプチドが本明細書に提供される。典型的には、１つ以上の追加のドメインは、ＰＤ－１以外の第２の抗原またはタンパク質に結合する。いくつかの態様では、さらなる抗原またはタンパク質は、腫瘍上に発現される抗原、またはＴ細胞、例えばＣＤ３などの免疫細胞上に発現される分子もしくは受容体、または追加の阻害受容体（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰα、ＮＫＧ２Ａ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４）、または活性化受容体（例えば、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４１ＢＢ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、もしくはＩＣＯＳ）であり得るか、または標的細胞（例えば、ＣＤ８またはＣＤ４）に追加の特異性を付与するためのものであり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加のドメインは、第２の抗原またはタンパク質に特異的な抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、追加のドメインは、ＶＨＨドメインである。

いくつかの実施形態では、多重特異性ＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインと、第２の抗原またはタンパク質に結合する少なくとも１つの追加の結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、この第２の抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍微小環境関連抗原（ＴＭＥＡＡ）である。いくつかの実施形態では、この第２の抗原は、免疫調節抗原であり、当該抗原は、免疫細胞におけるシグナル伝達経路の強化または減衰に関与する。

場合によっては、多重特異性ＰＤ－１結合ポリペプチドは、上記のいずれかなどのＦｃドメインをさらに含有することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される多重特異性ＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインと、第２の抗原またはタンパク質に結合する少なくとも１つの追加の結合ドメインと、Ｆｃドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＰＤ－１および追加の抗原またはタンパク質に対する結合部位の数を２倍にする二量体が形成されるように、生理学的条件下で多重特異性ＰＤ－１結合ポリペプチドの二量体化を媒介する。

非限定的な例示的な多重特異性ＰＤ－１結合ポリペプチドが以下に記載される。

１．二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、本明細書に提供される少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメイン、およびＴ細胞上に発現される表面分子に結合することが可能な少なくとも１つの追加の結合分子であるか、またはこれらを含む、二重特異性構築物である。いくつかの実施形態では、表面分子は、Ｔ細胞受容体複合体の構成成分などのＴ細胞の活性化構成成分である。特定の態様では、表面分子は、Ｔ細胞上に発現され、抗原結合分子との相互作用時にＴ細胞活性化を誘発することが可能である、活性化Ｔ細胞抗原である。例えば、いくつかの態様では、抗原結合分子と活性化Ｔ細胞抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを引き起こすことによってＴ細胞活性化を誘発し得る。Ｔ細胞活性化を測定するための好適なアッセイは既知であり、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害活性、および／または１つ以上の活性化マーカーの発現を測定または評価するための任意のアッセイを含む。いくつかの実施形態では、そのようなＰＤ－１結合ポリペプチドの、その標的である標的細胞上に発現されるＰＤ－１、およびＴ細胞上に発現されるＴ細胞分子、例えば、活性化Ｔ細胞抗原の両方への同時またはほぼ同時の結合は、標的細胞とＴ細胞との間の一時的な相互作用をもたらし、それによって、Ｔ細胞の活性化、例えば、細胞傷害活性、およびその後の標的細胞の溶解をもたらし得る。

いくつかの実施形態では、活性化Ｔ細胞抗原などのＴ表面分子は、ＣＤ３であるか、またはＣＤ２である。具体的には、提供される二重特異性ＰＤ－１結合ポリペプチドは、ヒトＣＤ３またはヒトＣＤ３などのヒトＴ細胞上に発現される活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合することが可能である。特定の態様では、活性化Ｔ細胞抗原（例えば、ＣＤ３またはＣＤ２）に特異的である追加の結合ドメインは、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－１に特異的に結合する少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインと、Ｔ細胞の活性化構成成分（例えば、Ｔ細胞表面分子、例えば、ＣＤ３またはＣＤ２）に特異的な抗体または抗原結合断片である追加の結合分子とを含有する、二重特異性抗体Ｔ細胞エンゲージャーであり得る。

二重特異性抗体Ｔ細胞エンゲージャーは、可動性リンカーによって融合されるタンデムｓｃＦｖ分子を含有する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子（例えば、ＮａｇｏｒｓｅｎａｎｄＢａｕｅｒｌｅ，ＥｘｐＣｅｌｌＲｅｓ３１７，１２５５－１２６０（２０１１）を参照）、例えば、可動性リンカーによって互いに融合され、安定した会合が可能な第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインをさらに含有する、タンデムｓｃＦｖ分子（ＷＯ２０１３／０２６８３７）、タンデムダイアボディを含むダイアボディおよびその誘導体（Ｈｏｌｌｉｇｅｒｅｔａｌ，ＰｒｏｔＥｎｇ９，２９９－３０５（１９９６）、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖｅｔａｌ，ＪＭｏｌＢｉｏｌ２９３，４１－６６（１９９９））、Ｃ末端ジスルフィド架橋を有するダイアボディフォーマットを含み得る二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）分子、または全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子を含むトリオマブ（Ｓｅｉｍｅｔｚｅｔａｌ，ＣａｎｃｅｒＴｒｅａｔＲｅｖ３６，４５８－４６７（２０１０）である。本明細書に提供されるＰＤ－１ＶＨＨドメインのいずれかを使用して、上記の分子のいずれかの類似のフォーマットが生成され得る。

いくつかの実施形態では、活性化Ｔ細胞抗原に特異的な追加の結合ドメインは、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体（ＶＨＨ）、または単一ドメイン軽鎖抗体から選択される抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、追加の結合ドメインは、ＣＤ２またはＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原に結合することに対して一価である。

いくつかの実施形態では、追加の結合ドメインは、ＣＤ３またはＣＤ３複合体に結合することが可能である。ＣＤ３複合体は、互いおよびＴ細胞受容体に非共有結合的に会合している、成熟Ｔリンパ球中の少なくとも５つの膜結合ポリペプチドの複合体である。ＣＤ３複合体には、ガンマ鎖、デルタ鎖、イプシロン鎖、ゼータ鎖、およびエータ鎖（サブユニットとも称される）が含まれる。いくつかの実施形態では、追加の結合分子は、ＣＤ３結合ドメインとも呼ばれる、ＣＤ３またはＣＤ３複合体に特異的に結合することが可能な抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３またはＣＤ３複合体に結合することが可能なＣＤ３結合ドメインは、抗ＣＤ３Ｆａｂ断片、抗ＣＤ３Ｆ（ａｂ’）_２断片、抗ＣＤ３Ｆｖ断片、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、抗ＣＤ３ｄｓＦｖ、抗ＣＤ３ｓｃＡｂ、抗ＣＤ３ｄＡｂ、抗ＣＤ３単一ドメイン重鎖抗体（ＶＨＨ）、および抗ＣＤ３単一ドメイン軽鎖抗体の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に結合することに対して一価である。

場合によっては、ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３ε鎖を認識する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３ε結合ドメインは、抗ＣＤ３ε Ｆａｂ断片、抗ＣＤ３ε Ｆ（ａｂ’）_２断片、抗ＣＤ３ε Ｆｖ断片、抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖ、抗ＣＤ３ε ｄｓＦｖ、抗ＣＤ３ε ｓｃＡｂ、抗ＣＤ３ε ｄＡｂ、抗ＣＤ３ε単一ドメイン重鎖抗体（ＶＨＨ）、および抗ＣＤ３ε単一ドメイン軽鎖抗体の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３ε結合ドメインは、ＣＤ３εに結合することに対して一価である。

ＣＤ３またはＣＤ３複合体に対する例示的なモノクローナル抗体としては、ＯＫＴ３、ＳＰ３４、ＵＣＨＴ１、もしくは６４．１、またはその抗原結合断片が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｊｕｎｅ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：３９４５－３９５２（１９８６）、Ｙａｎｇ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０９７－１１００（１９８６）、およびＨａｙｗａｒｄ，ｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．６４：８７－９２（１９８８）を参照）。いくつかの態様では、例えば、固定化または細胞局在化または連結された抗ＣＤ３抗体による、Ｔ細胞上のＣＤ３のクラスタリングは、Ｔ細胞受容体の関与と類似したＴ細胞活性化をもたらすが、そのクローンの典型的な特異性とは独立している。一実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３抗原に一価的かつ特異的に結合し、ＯＫＴ３（ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ－ＯＫＴ３（商標）（ムロモナブ－ＣＤ３）、ヒト化ＯＫＴ３（米国特許第７，６３５，４７５号および公開国際出願第ＷＯ２００５／０４０２２０号）、ＳＰ３４（Ｐｅｓｓａｎｏｅｔａｌ．ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ．４：３３７－３４４，１９８５）、ＳＰ３４のヒト化バリアント（ＷＯ２０１５／００１０８５）、Ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ（商標）（ＭＧＡ０３１，ＥｌｉＬｉｌｌｙ）、ＵＳ２０１１／０２７５７８７に記載される抗ＣＤ３結合分子、ＵＣＨＴ１（Ｐｏｌｌａｒｄｅｔａｌ．１９８７ＪＨｉｓｔｏｃｈｅｍＣｙｔｏｃｈｅｍ．３５（１１）：１３２９－３８、ＷＯ２０００／０４１４７４）、ＮＩ０４０１（ＷＯ２００７／０３３２３０）、ビジリズマブ（米国特許第５，８３４，５９７号）、ＢＣ－３（Ａｎａｓｅｔｔｉｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ５４：８４４（１９９２）、Ｈ２Ｃ（ＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１１９５６７号に記載）、Ｖ９（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓｅｔａｌ．，ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒＳｕｐｐｌ７，４５－５０（１９９２）および米国特許第６，０５４，２９７号に記載）に由来する。他の抗ＣＤ３抗体も、本明細書に提供される構築物で使用され得、国際公開ＰＣＴ出願第ＷＯ１９９４／０４６７９号、同第ＷＯ２００８／１１９５６７号、同第ＷＯ２０１５／０９５３９２号、同第ＷＯ２０１６／２０４９６６号、同第ＷＯ２０１９／１３３７６１号、公開特許出願第ＵＳ２０１７／０３６９５６３号、同第ＵＳ２０１８／０１９４８４２号、同第ＵＳ２０１８／０３５５０３８号、米国特許第７，７２８，１１４号、同第７，３８１，８０３号、同第７，９９４，２８９号に記載されるいずれかを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号１９に記載される可変重（ＶＨ）鎖、および／もしくは配列番号２０に記載される可変軽鎖、またはこれらの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列を含有し、ＣＤ３に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号１９に記載される可変重（ＶＨ）鎖のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と、配列番号２０に記載されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３可変軽鎖とを含有する。場合によっては、ＣＤ３結合領域は、配列番号２０９に記載されるＶＨ配列のヒト化バージョンと、配列番号２１０に記載されるＶＬ配列のヒト化バージョンと、を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合領域は、配列番号２１、２２、２３のいずれか１つに記載されるヒト化ＯＫＴ３由来ＶＨドメイン配列、および／もしくは配列番号２４、２５、２６のいずれか１つに記載されるＶＬドメイン配列、またはこれらの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するＶＨおよび／もしくはＶＬ配列を含有してもよく、ＣＤ３に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、上記のＶＨ配列とＶＬ配列との任意の組み合わせ、特に配列番号２１、２２、２３のいずれかに記載されるＶＨ配列と配列番号２４、２５、２６のいずれかに記載されるＶＬ配列との任意の組み合わせが含有される、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、またはｄｓＦｖである。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３ε結合ドメインは、少なくともアミノ酸配列ＴＹＡＭＮ（配列番号２９）を含むＶＨＣＤＲ１配列、少なくともアミノ酸配列ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号３０）を含むＶＨＣＤ２配列、少なくともアミノ酸配列ＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号３１）を含むＶＨＣＤＲ３配列、少なくともアミノ酸配列ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号３２）を含むＶＬＣＤＲ１配列、少なくともアミノ酸配列ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号３３）を含むＶＬＣＤＲ２配列、および少なくともアミノ酸配列ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号３４）を含むＶＬ
ＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、少なくともアミノ酸配列ＴＹＡＭＮ（配列番号２９）を含むＶＨＣＤＲ１配列、少なくともアミノ酸配列ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号３０）を含むＶＨＣＤ２配列、少なくともアミノ酸配列ＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号３１）を含むＶＨＣＤＲ３配列、少なくともアミノ酸配列ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号３２）を含むＶＬＣＤＲ１配列、少なくともアミノ酸配列ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号３３）を含むＶＬＣＤＲ２配列、および少なくともアミノ酸配列ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号３４）を含むＶＬＣＤＲ３配列が含有される、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、またはｄｓＦｖである。

いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号２７に記載される可変重（ＶＨ）鎖、および／もしくは配列番号２８に記載される可変軽鎖、またはこれらの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列を含有し、ＣＤ３に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号２７に記載される可変重（ＶＨ）鎖のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と、配列番号２８に記載されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３可変軽鎖とを含有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、それぞれ配列番号２９、３０、および３１に記載されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と、それぞれ配列番号３２、３３、および３４に記載されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３可変軽鎖とを含有する。場合によっては、ＣＤ３結合領域は、配列番号２７に記載されるＶＨ配列のヒト化バージョンと、配列番号２８に記載されるＶＬ配列のヒト化バージョンと、を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合領域は、配列番号３５～６５のいずれか１つに記載されるヒト化ＶＨドメイン配列、および／もしくは配列番号６６～８４のいずれか１つに記載されるＶＬドメイン配列、またはこれらの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するＶＨおよび／もしくはＶＬ配列を含有してもよく、ＣＤ３に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、その抗ＣＤ３ε結合ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｈｖ）と、配列番号７５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｌｖ）と、を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、上記のＶＨ配列とＶＬ配列との任意の組み合わせ、特に配列番号３５～６５のいずれかに記載されるＶＨ配列と配列番号６６～８４のいずれかに記載されるＶＬ配列との任意の組み合わせが含有される、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、またはｄｓＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）、および配列番号７５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）が含有される、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、またはｄｓＦｖである。

いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号３１３、３１４、３１７、または３１８のいずれか１つに記載される可変重（ＶＨ）鎖を含有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号３１５、３１６、３１９、または３２０のいずれか１つに記載される可変軽（ＶＬ）鎖を含有する。

提供される二重特異性構築物は、少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインと、ＣＤ３結合ドメインなどの活性化Ｔ細胞抗原に特異的な少なくとも１つの追加のドメインとを含有する、多数のフォーマットのいずれかでフォーマットされ得る。

一実施形態では、二重特異性構築物は、例えば、抗ＣＤ３Ｆａｂなどの、Ｔ細胞活性化抗原、例えばＣＤ３に特異的なＦａｂ抗原結合断片に直接または間接的に連結された、記載される少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインを含有する、二重特異性単一ドメイン抗体連結Ｆａｂ（Ｓ－Ｆａｂ）である。Ｔ細胞活性化抗原に対するＦａｂ、例えば、抗ＣＤ３Ｆａｂは、記載されるＶＨ配列およびＶＬ配列のいずれかを含有し得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ＶＨＨドメインは、抗ＣＤ３ＦａｂのＶＨ鎖またはＶＬ鎖のＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、Ｓ－Ｆａｂは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマー、タンパク質（アルブミンなど）、ポリグルタミン酸、またはＰＡＳｙｌａｔｉｏｎとのコンジュゲーションなどによってさらに修飾され得る（Ｐａｎｅｔａｌ．（２０１８）ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１８：３１８９－３２０１）。

別の実施形態では、二重特異性構築物は、その構築物が、Ｔ細胞活性化抗原、例えば、ＣＤ３に特異的な抗原結合ドメインのＶＨおよびＶＬを含有するｓｃＦｖに直接または間接的に連結された、記載される少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨを含有する、ｓｃＦｖ－単一ドメイン抗体である。Ｔ細胞活性化抗原に対するｓｃＦｖ、例えば、抗ＣＤ３ｓｃＦｖは、記載されるＶＨ配列およびＶＬ配列のいずれかを含有し得る。いくつかの実施形態では、ＶＨＨドメインおよびｓｃＦｖは、ペプチドリンカーなどのリンカーによって接続される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、本明細書に記載されるペプチドリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、ＶＨＨドメインおよびｓｃＦｖは各々、任意選択的にヒンジ領域またはリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して、Ｆｃ領域のＮ末端などのＦｃ領域に接続される。Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域またはそのバリアント、例えば、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域またはそのバリアントなど、本明細書に記載されるいずれかであり得る。特定の実施例では、Ｆｃ領域は、異なるポリペプチドが二量体化されてヘテロ二量体をもたらすことができるヘテロ二量体化を促進するように変異または修飾される、バリアントＦｃドメイン、例えば、バリアントヒトＩｇＧ１ドメインによって形成される。

さらなる実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的に結合するＶＨＨドメインなどの単一ドメイン抗体である。ＣＤ３に結合するＶＨＨドメインを含む単一ドメイン抗体は既知であり、例えば、公開された米国特許出願第ＵＳ２０１６／０２８０７９５号を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号８５に記載される抗ＣＤ３ＶＨＨであるか、または配列番号８５と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を示す配列であり、ＣＤ３に特異的に結合する。そのような態様では、本明細書に提供される二重特異性構築物は、少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインと少なくとも１つのＣＤ３ＶＨＨドメインとを含み得る。構築物をフォーマットするために、場合によっては、各ＶＨＨドメインは、任意選択的にヒンジ領域またはリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して、Ｆｃ領域のＮ末端などのＦｃ領域に接続される。Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域またはそのバリアント、例えば、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域またはそのバリアントなど、本明細書に記載されるいずれかであり得る。特定の実施例では、Ｆｃ領域は、異なるポリペプチドが二量体化されてヘテロ二量体をもたらすことができるヘテロ二量体化を促進するように変異または修飾される、バリアントＦｃドメイン、例えば、バリアントヒトＩｇＧ１ドメインによって形成される。

上記の実施形態では、ヘテロ二量体化を促進するためのＦｃ領域の例示的な修飾は既知であり、例えば、以下の表３に記載されるいずれかを含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃの一方のＦｃポリペプチドは、配列番号１０３、１０７、１１５、または１１７のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Ｆｃの他方のＦｃポリペプチドは、配列番号１０４、１０８、１１１、１１３、１１９、または１２１のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含有する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃの一方のＦｃポリペプチドは、配列番号１０５、１０９、１１６、または１１８のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Ｆｃの他方のＦｃポリペプチドは、配列番号１０６、１１０、１１２、１１４、１２０、または１２２のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含む。

２．拘束されたＣＤ３多重特異性構築物
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、拘束されたＴ細胞係合融合タンパク質である多重特異性ポリペプチド構築物である。特定の態様では、本明細書に提供される拘束された多重特異性構築物は、ＣＤ３およびＰＤ－１などの活性化Ｔ細胞抗原に結合する。典型的には、提供される拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインも含有する。本明細書に提供される拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、免疫グロブリンＦｃ領域を含む少なくとも第１の構成成分と、ＣＤ３に結合する少なくとも結合ドメイン（本明細書において互換的に使用される用語である、抗ＣＤ３結合ドメインまたはＣＤ３結合ドメインと本明細書において称される）の１つ以上のコピーを含む第２の構成成分と、第１の構成成分および第２の構成成分を結合するポリペプチドリンカーなどのリンカーと、を含む。提供される多重特異性ポリペプチド構築物において、第１および第２の構成成分のうちの一方または両方は、ＰＤ－１に結合する少なくとも１つの提供されるＶＨＨドメインを含有し、第１および第２の構成成分のうちの一方または両方は、少なくとも１つのＴＡＡ抗原結合ドメインを含有し、これは抗原に結合すると、拘束されたＣＤ３結合領域を実質的にＣＤ３に結合することが可能な状態にする。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、ＣＤ３に結合し、その後にＴ細胞を活性化する能力に関して、２つの状態で存在する：（１）ＰＤ－１に対する抗原結合ドメイン（複数可）のいずれかまたはすべての結合がない場合に、「不活性」状態が生じ、これにより、ＣＤ３結合が拘束され、Ｔ細胞相互作用が排除または低減される、および（２）抗原結合ドメイン（複数可）のいずれかまたはすべてによる抗原結合時に「活性」状態が生じ、これにより、ＣＤ３結合領域がＣＤ３に結合することが可能となり、Ｔ細胞相互作用が可能になる。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、リンカー（複数可）を介してＣＤ３結合ドメインに連結される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、切断不可能なリンカー（複数可）を介してＣＤ３結合領域に連結される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、切断可能なリンカー、またはそうでなければ不安定性リンカー（複数可）を介してＣＤ３結合領域に連結される。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、プロテアーゼの存在下で特異的に切断され得るリンカーである。いくつかの態様では、切断可能なリンカーの切断後にＣＤ３結合が強化される。いくつかのそのような態様では、ＣＤ３結合領域およびＦｃ領域を結合するリンカーの切断を含む、いくつかの機構を介して、「活性」状態は、さらに増幅され得る。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、プロテアーゼの基質認識部位を含有するリンカーである。Ｆｃ領域およびＣＤ３結合領域が切断可能なリンカーによって連結されるいくつかの実施形態では、ＣＤ３結合の強化は、リンカー（複数可）内の切断後に生じ得る。

さらに、Ｆｃ領域およびＣＤ３結合領域が切断可能なリンカーによって作動可能に連結される態様では、Ｆｃ領域とＣＤ３結合領域との間のリンカー（複数可）の切断は、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物を第１の構成成分および第２の構成成分に分離し得る。拘束された多重特異性ポリペプチド構築物の組成に応じて、第１および第２の構成成分は、別個の機能性を有してもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、またはＡＤＣＰ機能などの１つ以上のエフェクター機能を示す領域である。そのような実施例では、本開示の拘束された多重特異性ポリペプチド構築物を使用して、自己増幅系を産生することができる。例えば、いくつかの態様では、ＦｃとＣＤ３結合ドメインの構成成分との間のプロテアーゼ切断可能なリンカーの組み込みは、ＣＤ３結合ドメインの完全な曝露を可能にすることによって、Ｔ細胞活性化能力の増幅を可能にする。含まれる特定のリンカーに応じて、増幅ステップは、腫瘍関連プロテアーゼによって、または抗原依存性Ｔ細胞活性化後に放出されるグランザイムによって媒介され得る。腫瘍プロテアーゼ切断可能なリンカーが含まれる場合、増幅は、腫瘍または腫瘍微小環境によって媒介される。一方で、グランザイムＢ切断可能なリンカーが含まれる場合、増幅は、抗原依存性活性化後にＴ細胞によって自己媒介され得る。さらに、エフェクターで可能となるＦｃが構築物に含まれる場合、増幅は、ＡＤＣＣ機構を介して生じるＮＫ細胞から放出されたグランザイムによって媒介され得る。

提供される拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、Ｆｃ領域を含有する第１の構成成分がＣＤ３結合領域を含有する第２の構成成分のＮ末端である配置を含む。そのような実施形態では、第１および第２の構成成分は、Ｆｃ領域のＣ末端であるリンカーを介して結合される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のアミノ末端（Ｎ末端）領域上に位置付けられる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のカルボキシ末端（Ｃ末端）領域上に位置付けられる。いくつかの実施形態では、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、多重特異性ポリペプチド構築物のＮ末端領域またはＣ末端領域のいずれかに位置付けられる１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインのみを含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＴＡＡ抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のアミノ末端（Ｎ末端）領域上に位置付けられる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＴＡＡ抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のカルボキシ末端（Ｃ末端）領域上に位置付けられる。いくつかの実施形態では、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、多重特異性ポリペプチド構築物のＮ末端領域およびＣ末端領域の両方に位置付けられる、少なくとも２つのＴＡＡ抗原結合ドメインを含有する。

いくつかの実施形態では、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、二量体化が２つのポリペプチド鎖間の共有結合性または非共有結合性相互作用によって形成される、二量体である。いくつかの実施形態では、２つのポリペプチド鎖は、例えば、鎖間ジスルフィド結合によって互いに共有結合される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、鎖間ジスルフィド結合を介して二量体化を媒介する。特定の実施形態では、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、場合によっては、多重特異性ポリペプチド構築物のポリペプチド鎖が異なる（ヘテロ二量体）、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有する。ヘテロ二量体多重特異性ポリペプチド構築物の特定の実施例では、ＣＤ３結合領域は、ＶＨおよびＶＬを含有するＦｖ抗体断片など、ＶＨおよびＶＬ鎖を含有する２つの鎖ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｆｖ抗体断片は、ジスルフィド安定化抗ＣＤ３結合Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）を含む。

いくつかの実施形態では、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第１のＦｃポリペプチド、リンカー（例えば、切断可能または切断不可能なリンカー）、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片（例えば、Ｆｖ）のＶＨドメインを含む第１のポリペプチドと、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第２のＦｃポリペプチド、リンカー（例えば、切断可能または切断不可能なリンカー）、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片（例えば、Ｆｖ）のＶＬドメインを含む第２のポリペプチドとを含む、２つのポリペプチドから形成されるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ＰＤ－１に結合する１つまたは２つのＶＨＨドメインを含有する。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、ＰＤ－１に結合する１つまたは２つのＶＨＨドメインを含有する。いくつかの実施形態では、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインのみを含有する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、１つまたは２つのＴＡＡ抗原結合ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、１つまたは２つのＴＡＡ抗原結合ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、少なくとも２つのＴＡＡ抗原結合ドメインを含有する。場合によっては、少なくとも１つのＴＡＡ抗原結合ドメインは、ＦｃポリペプチドのＮ末端に位置し、少なくとも１つのＴＡＡ抗原結合ドメインは、ＣＤ３結合領域の鎖のＣ末端に位置する。特定の実施形態では、ＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインは、最後の少なくとも１つ、例えば、２つのＴＡＡ抗原結合ドメインを含有するポリペプチドとは別個のヘテロ二量体分子のポリペプチド上にある。

いくつかの実施形態では、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、少なくとも２つのＴＡＡ抗原結合ドメインと、ＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインとを含有する。いくつかの実施形態では、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、（１）Ｎ末端からＣ末端への順序で、第１のＴＡＡ抗原結合ドメイン、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第１のＦｃポリペプチド、リンカー（例えば、切断可能または切断不可能なリンカー）、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片（例えば、ＦｖまたはｄｓＦｖ）の鎖（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、および第２のＴＡＡ抗原結合ドメインを含む第１のポリペプチドと、（２）Ｎ末端からＣ末端への順序で、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第２のＦｃポリペプチド、同じリンカー（例えば、同じ切断可能または切断不可能なリンカー）、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片の他方の鎖（ＶＨまたはＶＬの他方）、およびＰＤ－１に結合するＶＨＨドメインを含む第２のポリペプチドとを含有する。いくつかの実施形態では、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、（１）Ｎ末端からＣ末端への順序で、第１のＴＡＡ抗原結合ドメイン、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第１のＦｃポリペプチド、リンカー（例えば、切断可能または切断不可能なリンカー）、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片（例えば、ＦｖまたはｄｓＦｖ）の鎖（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、および第２のＴＡＡ抗原結合ドメインを含む第１のポリペプチドと、（２）Ｎ末端からＣ末端への順序で、ＰＤ－１に結合するＶＨＨドメイン、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第２のＦｃポリペプチド、同じリンカー（例えば、同じ切断可能または切断不可能なリンカー）、および抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片の他方の鎖（ＶＨまたはＶＬの他方）を含む第２のポリペプチドとを含有する。

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドもしくは第２のポリペプチド、または第１および第２のポリペプチドの両方は、共刺激受容体に結合する共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のポリペプチドのＣＲＢＲは、ＦｃポリペプチドのＮ末端、および／またはＣＤ３結合領域の鎖のＣ末端に位置し得る。

いくつかの実施形態では、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、ＴＡＡに結合する少なくとも２つの抗原結合ドメインと、共刺激受容体に結合する共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）と、ＰＤ－１に結合するＶＨＨドメインとを含有する。いくつかの実施形態では、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、（１）Ｎ末端からＣ末端への順序で、第１のＴＡＡ抗原結合ドメイン、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第１のＦｃポリペプチド、リンカー（例えば、切断可能なリンカー）、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片（例えば、ＦｖまたはｄｓＦｖ）の鎖（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、および第２のＴＡＡ抗原結合ドメインを含む第１のポリペプチドと、（２）Ｎ末端からＣ末端への順序で、ＰＤ－１またはＣＲＢＲに結合するＶＨＨドメインの一方、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第２のＦｃポリペプチド、同じリンカー（例えば、同じ切断可能なリンカー）、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片の他方の鎖（ＶＨまたはＶＬの他方）、およびＰＤ－１またはＣＲＢＲに結合するＶＨＨドメインの他方を含む第２のポリペプチドとを含有する。

本開示の多重特異性ポリペプチド構築物の構成成分の各々は、以下により詳細に記載される。

ａ．抗原結合ドメイン
本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、少なくとも第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインなどの、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様では、抗原結合ドメイン、または抗原結合ドメインの各々は独立して、抗体もしくは抗原結合断片、天然（ｎａｔｕｒａｌ）（または天然（ｎａｔｉｖｅ））同族結合パートナー、アンチカリン（操作されたリポカリン）、Ｄａｒｐｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒ、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（操作されたフィブロネチシンＩＩＩドメイン）、シスチン－ノットドメイン、Ａｆｆｉｌｉｎ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ、または操作されたＣＨ３ドメインから選択される。いくつかの実施形態では、天然同族結合パートナーは、ＴＡＡの天然同族結合パートナーの細胞外ドメインもしくはその結合断片、またはＴＡＡへの結合活性を示すそのバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン、または第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインなどの抗原結合ドメインの各々は独立して、抗体またはその抗原結合断片の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン、または第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインなどの抗原結合ドメインの各々は独立して、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、および単一ドメイン軽鎖抗体からなる群から選択される、抗体またはその抗原結合断片の１つ以上のコピーを含む。

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン、または第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインなどの抗原結合ドメインの各々は独立して、単鎖抗体である。いくつかの実施例では、単鎖は、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、または単一ドメイン軽鎖抗体である。

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン、または第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインなどの抗原結合ドメインの各々は独立して、１つ以上の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）断片、例えば、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、操作されたＶＨまたはＶＫドメインを含む。ＶＨＨは、天然ラクダ科重鎖のみの抗体、重鎖のみの抗体を産生する遺伝子操作されたげっ歯類、またはナイーブ／合成のラクダ科もしくはヒト化ラクダ科の単一ドメイン抗体ライブラリーから生成され得る。ＶＮＡＲは、軟骨魚重鎖のみの抗体から生成され得る。界面工学および特定の生殖系列ファミリーの選択を含む様々な方法が、従来的にヘテロ二量体のＶＨおよびＶＫドメインから単量体ｓｄＡｂを生成するために実装されてきた。

いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメイン、または第１の抗原結合ドメインおよび／もしくは第２の抗原結合ドメインなどの抗原結合ドメインの各々は独立して、ＴＡＡに結合する少なくとも１つのｓｄＡｂまたはｓｃＦｖを含有する。いくつかの実施形態では、ＴＡＡに結合する少なくとも１つのｓｃＦｖまたはｓｄＡｂは、多重特異性ポリペプチド構築物のＦｃ領域に対してアミノ末端に、かつ／またはＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられる。いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物は、ＴＡＡに結合する１つのｓｃＦｖまたはｓｄＡｂのみを含有し、これは、Ｆｃ領域に対してアミノ末端、および／またはＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端のいずれかに位置付けられ得る。いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物は、Ｆｃ領域に対してアミノ末端に、かつ／またはＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられる、ＴＡＡに結合する２つのｓｃＦｖまたはｓｄＡｂを含有する。いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物は、３つのｓｃＦｖまたはｓｄＡｂを含有し、そのうち２つは、Ｆｃ領域に対してアミノ末端に、またはＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられ、第３のものは、多重特異性ポリペプチド構築物の他方の末端に位置付けられる。

いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第１のＦｃポリペプチド、リンカー、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片（例えば、Ｆｖ）のＶＨドメイン、および腫瘍関連抗原に結合するｓｃＦｖまたはｓｄＡｂを含む第１のポリペプチドと、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第２のＦｃポリペプチド、リンカー、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片（例えば、Ｆｖ）のＶＬドメイン、および任意選択的に腫瘍関連抗原に結合する同じまたは異なるｓｃＦｖまたはｓｄＡｂを含む第２のポリペプチドと、を含む、２つのポリペプチドから形成されるか、またはそれらを含む。ＴＡＡに結合するｓｃＦｖまたはｓｄＡｂは、ヘテロ二量体ＦｃのＦｃポリペプチドに対してアミノ末端に、かつ／またはＣＤ３結合領域のＶＨ鎖もしくはＶＬ鎖に対してカルボキシ末端に位置付けられ得る。多重特異性ポリペプチド構築物の第１および／または第２のポリペプチドの少なくとも１つは、本開示に記載されるいずれかなどの、ＰＤ－１に結合するＶＨＨドメインも含む。いくつかの態様では、多重特異性ポリペプチド構築物の第１および／または第２のポリペプチドの少なくとも１つは、記載されるように共刺激性受容体またはその鎖に結合するＣＲＢＲも含み得る。

いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメイン、または第１の抗原結合ドメインおよび／もしくは第２の抗原結合ドメインなどの抗原結合ドメインの各々は独立して、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）として結合ドメインを含有する。

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン、または第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインなどの抗原結合ドメインの各々は独立して、２つ以上の鎖を含有する。いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメイン、または第１の抗原結合ドメインおよび／もしくは第２の抗原結合ドメインなどの抗原結合ドメインの各々は独立して、ＦＡＢとして集合したＶＨおよびＶＬ配列を含有する。

いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメイン、または第１の抗原結合ドメインおよび／もしくは第２の抗原結合ドメインなどの抗原結合ドメインの各々は独立して、ＴＡＡに結合するＦａｂ抗体のＶＨ－ＣＨ１（Ｆｄ）およびＶＬ－ＣＬを含有する。いくつかの実施形態では、ＶＨ－ＣＨ１（Ｆｄ）およびＶＬ－ＣＬを含有するＦａｂ抗体は、多重特異性ポリペプチド構築物のＦｃ領域に対してアミノ末端に、かつ／またはＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられる。いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物は、Ｆｃ領域に対してアミノ末端、および／またはＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端のいずれかに位置付けられ得る、ＴＡＡに結合する、ＶＨ－ＣＨ１（Ｆｄ）およびＶＬ－ＣＬを含有する１つのＦａｂ抗体のみを含有する。いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物は、一方がＦｃ領域に対してアミノ末端に位置付けられ、他方がＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられる、ＴＡＡに結合する、各々がＶＨ－ＣＨ１（Ｆｄ）およびＶＬ－ＣＬを含有する２つのＦａｂ抗体断片を含有する。

いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第１のＦｃポリペプチド、リンカー、および腫瘍関連抗原に結合するＦａｂ抗体断片のＶＨ－ＣＨ１（Ｆｄ）またはＶＬ－ＣＬを含む第１のポリペプチドと、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第２のＦｃポリペプチド、リンカー、および任意選択的に、腫瘍関連抗原に結合するＦａｂ抗体断片の同じＶＨ－ＣＨ１（Ｆｄ）またはＶＬ－ＣＬを含む第２のポリペプチドと、ＴＡＡに結合するＦａｂ抗体断片のＶＨ－ＣＨ１（Ｆｄ）またはＶＬ－ＣＬの他方を含む第３のポリペプチドと、を含む、３つ以上のポリペプチドから形成されるか、またはそれらを含む。

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン、または抗原結合ドメインの各々は独立して、ＴＡＡの天然（ｎａｔｕｒａｌ）（または天然（ｎａｔｉｖｅ））同族結合パートナーの細胞外ドメインもしくはその結合断片、またはＴＡＡへの結合活性を示すそのバリアントであるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン、または第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインなどの抗原結合ドメインの各々は独立して、同じ抗原に結合する。いくつかの実施形態では、ＴＡＡに結合する２つ以上の抗原結合ドメインが存在し、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインなどの抗原結合ドメインの各々は、異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインなどの抗原結合ドメインの各々は、同じ腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインなどの抗原結合ドメインの各々は、異なるＴＡＡに結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインなどの抗原結合ドメインの各々は、同じＴＡＡ上の異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインなどの抗原結合ドメインの各々は、同じＴＡＡ上の同じエピトープに結合する。

いくつかの実施形態では、ＴＡＡに結合する抗原結合ドメイン、または抗原結合ドメインの各々は独立して、ＴＡＡに対する一価、二価、三価、または四価結合をもたらす。

いくつかの実施形態では、ＴＡＡは、１－９２－ＬＦＡ－３、５Ｔ４、アルファ－４インテグリン、アルファ－Ｖインテグリン、アルファ４ベータ１インテグリン、アルファ４ベータ７インテグリン、ＡＧＲ２、抗Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、アペリンＪ受容体、ＡＰＲＩＬ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＡＦＦ、ＢＴＬＡ、Ｃ５補体、Ｃ－２４２、ＣＡ９、ＣＡ１９－９、（Ｌｅｗｉｓａ）、炭酸脱水酵素９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３２、（ＩＬ－２ＲＧ）、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１７２Ａ、ＣＤ２４８、ＣＤＨ６、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ－９０）、ＣＬＡＵＤＩＮ－３、ＣＬＡＵＤＩＮ－４、ｃＭｅｔ、コラーゲン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＳＦＲ、ＣＳＦＲ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＹＲ６１、ＤＬ４４、ＤＬＫ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、ＤＰＰ－４、ＤＳＧ１、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ３、ＲＳＶのＦタンパク質、ＦＡＰ、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ８、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ－３、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）、ＧＡＬ３ＳＴ１、Ｇ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦＲ、ＧＤ２、ＧＩＴＲ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、Ｇｐ１３０、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＧＰＮＭＢ、ＧＲＰ７８、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＧＦ、ｈＧＨ、ＨＶＥＭ、ヒアルロニダーゼ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒベータ１、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２３、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７／ＩＬ２７Ｒ（ｗｓｘ１）、ＩＬ２９、ＩＬ－３１Ｒ、ＩＬ３１／ＩＬ３１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、インスリン受容体、Ｊａｇｇｅｄリガンド、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、ＫＩＳＳ１－Ｒ、ＬＡＧ－３、ＬＩＦ－Ｒ、ＬｅｗｉｓＸ、ＬＩＧＨＴ、ＬＲＰ４、ＬＲＲＣ２６、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ、ＬｙＰＤ１、ＭＣＳＰ、メソテリン、ＭＲＰ４、ＭＵＣ１、ムチン－１６（ＭＵＣ１６、ＣＡ－１２５）、Ｎａ／ＫＡＴＰａｓｅ、ＮＧＦ、ニカストリン、Ｎｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、ＮＯＶ、ＯＳＭ－Ｒ、ＯＸ－４０、ＰＡＲ２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦＲアルファ、ＰＤＧＦＲベータ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ホスファチジル－セリン、Ｐ１ＧＦ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ、ＲＡＡＧ１２、ＲＡＧＥ、ＳＬＣ４４Ａ４、スフィンゴシン１リン酸、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＡＰＡ１、ＴＥＭ－８、ＴＧＦベータ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＭＥＭ３１、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＲ、ＴＮＦＲＳ１２Ａ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、ＴＲＫ－Ａ、ＴＲＫ－Ｂ、ｕＰＡＲ、ＶＡＰ１、ＶＣＡＭ－１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＷＩＳＰ－１、ＷＩＳＰ－２、およびＷＩＳＰ－３からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメイン、または独立して各抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）葉酸受容体アルファ（ＦＲα）に結合する。例えば、抗原結合ドメインは、ＦＲαに結合するｓｄＡｂとして結合ドメインを含有する。例示的なＦＲα結合ｓｄＡｂは、配列番号８６、８７、または８８に記載される。提供される多重特異性ポリペプチド構築物中の抗原結合ドメイン、または独立して各抗原結合ドメインは、上記の配列番号のいずれかと少なくとも８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ＦＲαに結合することができる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメイン、または独立して各抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ｃＭＥＴに結合する。例えば、抗原結合ドメインは、ｃＭＥＴに結合するｓｄＡｂとして結合ドメインを含有する。例示的なｃＭＥＴ結合ｓｄＡｂは、配列番号８９に記載される（米国特許第９，３４６，８８４号）。提供される多重特異性ポリペプチド構築物中の抗原結合ドメイン、または独立して各抗原結合ドメインは、上記の配列番号と少なくとも８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ｃＭＥＴに結合することができる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメイン、または独立して各抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）Ｂ７Ｈ３に結合する。例えば、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合するｓｃＦｖとして結合ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＶＨ－ＣＨ１（Ｆｄ）およびＬＣを含むＦａｂ抗体断片であるか、またはそれを含有する。例示的なＢ７Ｈ３Ｆｄは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０３０９２６号に記載される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメイン、または独立して各抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ＣＤ２０に結合する。例えば、抗原結合ドメインは、ＣＤ２０に結合するｓｃＦｖとして結合ドメインを含有する。例示的なＣＤ２０結合ｓｃＦｖは、配列番号９０に記載されるか、または配列番号９１および９２に記載されるＶＬおよびＶＨを含有する（米国公開第ＵＳ２００５／０１２３５４６号）。提供される多重特異性ポリペプチド構築物中の抗原結合ドメイン、または独立して各抗原結合ドメインは、上記の配列番号のいずれかと少なくとも８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ＣＤ２０に結合することができる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメイン、または独立して各抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ＤＬＬ３に結合する。例えば、抗原結合ドメインは、ＤＬＬ３に結合するｓｃＦｖとして結合ドメインを含有する。例示的なＤＬＬ３結合ｓｃＦｖは、配列番号９３および９４に記載される（米国公開第ＵＳ２０１７／００３７１３０号）。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＤＬＬ３に結合するＦｄおよびＬＣを含むＦａｂ抗体断片であるか、またはそれを含有する。例示的なＤＬＬ３Ｆｄは、配列番号９５に記載され、例示的なＤＬＬ３ＬＣは、配列番号９６に記載される（米国特許第ＵＳ８，０４４，１７８号）。提供される多重特異性ポリペプチド構築物中の抗原結合ドメイン、または独立して各抗原結合ドメインは、上記の配列番号のいずれかと少なくとも８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ＤＬＬ３に結合することができる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメイン、または独立して各抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）５Ｔ４に結合する。例示的な５Ｔ４Ｆｄは、配列番号９７に記載され、例示的な５Ｔ４ＬＣは、配列番号９８に記載される。いくつかの実施形態では、抗体結合ドメインは、配列番号９９および１００に記載されるＶＨおよびＶＬを含む（米国特許第ＵＳ８，０４４，１７８号）。提供される多重特異性ポリペプチド構築物中の抗原結合ドメイン、または独立して各抗原結合ドメインは、上記の配列番号のいずれかと少なくとも８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、５Ｔ４に結合することができる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメイン、または独立して各抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ｇｐＮＭＢに結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆｄ鎖およびＬＣ鎖を含むＦａｂ断片であるか、またはそれを含有する。例示的なｇｐＮＭＢＦｄは、配列番号１０１に記載され、例示的なｇｐＮＭＢＬＣは、配列番号１０２に記載される。提供される多重特異性ポリペプチド構築物中の抗原結合ドメイン、または独立して各抗原結合ドメインは、上記の配列番号のいずれかと少なくとも８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ｇｐＮＭＢに結合することができる。

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、直接またはリンカーを介して間接的に、Ｆｃ領域および／またはＣＤ３結合領域に連結される。いくつかの実施形態では、連結は、リンカーを介している。いくつかの実施形態では、リンカーは、記載される任意の可動性または剛性リンカーを含み得る、連結ペプチド（ＬＰ）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_２（配列番号１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_３（配列番号２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_４（配列番号３）、およびＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_５（配列番号４）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは、非限定的な例として、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ（配列番号５）、ＧＧＧＧＧ（配列番号６）、およびＧＧＧＧＧＧ（配列番号７）などのグリシン残基を含む可動性リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＳリンカーとグリシンリンカーとの組み合わせを含む。

ｂ．Ｆｃ領域
拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、免疫グロブリンＦｃ領域を含む。概して、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、各々がＦｃを含有するポリペプチドによって形成される二量体である。Ｆｃポリペプチドは、上記に記載されるいずれかであり得る。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、異なるポリペプチドが二量体化されてヘテロ二量体をもたらすことができるヘテロ二量体化を促進するように変異または修飾されるＦｃドメインによって形成される。したがって、いくつかの実施形態では、二量体は、多重特異性ポリペプチド構築物の２つのポリペプチド鎖が異なるヘテロ二量体である。

相補的Ｆｃポリペプチドのヘテロ二量体化を促進するための様々な方法が、既知であり、例えば、Ｒｉｄｇｗａｙｅｔａｌ，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．９：６１７－６２１（１９９６）、Ｍｅｒｃｈａｎｔｅｔａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（７）：６７７－８１（１９９８）、Ｍｏｏｒｅｅｔａｌ．（２０１１）ＭＡｂｓ，３：５４６－５７、ＶｏｎＫｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．ＭＡｂｓ，（２０１３）５：６４６－５４、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎｅｔａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５：１９６３７－４６、Ｌｅａｖｅｒ－Ｆａｙｅｔａｌ．（２０１６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２４：６４１－５１、Ｈａｅｔａｌ．（２０１６）ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７：１、Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．（２０１０）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ，２３：１９５－２０２、公開国際ＰＣＴ出願第ＷＯ１９９８／０５０４３１号、同第ＷＯ２００９／０８９００４号、同第ＷＯ２０１１／１４３５４５号、同第ＷＯ２０１４／０６７０１１号、同第ＷＯ２０１２／０５８７６８号、同第ＷＯ２０１８／０２７０２５号、公開された米国特許出願第ＵＳ２０１４／０３６３４２６号、同第ＵＳ２０１５／０３０７６２８号、同第ＵＳ２０１８／００１６３５４号、同第ＵＳ２０１５／０２３９９９１号、ならびに米国特許第ＵＳ５７３１１６８号、同第ＵＳ７１８３０７６号、同第ＵＳ９７０１７５９号、同第ＵＳ９６０５０８４号、および同第ＵＳ９６５０４４６を参照されたい。Ｆｃ鎖のヘテロ二量体化を促進する方法は、「ノブイントゥホール」変異のセットを含むこと、またはＦｃの静電的ステアリングをもたらして、異なるポリペプチド鎖間の吸引相互作用に有利に働く変異を含むことなどによる、Ｆｃ領域の変異導入を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ二量体界面にわたって電荷極性を変化させる変異を含み、これにより、静電的に適合したＦｃ鎖の共発現が好ましい吸引相互作用を支持し、それにより望ましいＦｃヘテロ二量体形成を促進する一方で、好ましくない反発電荷相互作用は、望ましくないＦｃホモ二量体形成を抑制する（Ｇｕｎｅｓｋａｒａｎｅｔａｌ．（２０１０）ＪＢＣ，２８５：１９６３７－１９６４６）。細胞内で共発現された場合、鎖間の会合は可能であるが、鎖は、電荷反発のため実質的には自己会合しない。ヘテロ二量体Ｆｃを生成するための他の戦略には、ヒトＩｇＧおよびＩｇＡＣＨ３ドメインセグメントを混合して、相補的ＣＨ３ヘテロ二量体を作ることを含み、これはＳＥＥＤＦｃと称される。

いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化を促進するために、Ｆｃヘテロ二量体の両方のポリペプチドが、対になった、または相補的なアミノ酸修飾を含有する。Ｆｃ融合体のポリペプチドの例示的な対になったアミノ酸修飾を表３に記載する。

いくつかの実施形態では、修飾は、第１のＦｃポリペプチドへの突起（ノブ）の導入と、第２のＦｃポリペプチドへの空洞（ホール）の導入とを含み、これにより、突起は、第１および第２のＦｃ含有ポリペプチドの複合体化を促進するように空洞内に位置付け可能である。ポリペプチド中に突起または空洞を作るための置き換えおよび／または修飾の標的となるアミノ酸は、典型的には、第２のポリペプチドの界面において１つ以上のアミノ酸と相互作用または接触する界面アミノ酸である。

いくつかの実施形態では、突起（ホール）アミノ酸を含有するように修飾される第１のＦｃポリペプチドは、第１のＦｃポリペプチドの界面から突出し、したがって、第２のポリペプチドの隣接する界面において代償的空洞（ホール）に位置付け可能である、少なくとも１つの側鎖を有するアミノ酸による、天然または元のアミノ酸の置き換えを含む。ほとんどの場合、置換アミノ酸は、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸である。当業者は、アミノ酸残基の特性を決定および／または評価して、理想的な置換アミノ酸であるアミノ酸を同定して、突起を作る方法を認識している。いくつかの実施形態では、突起の形成のための置換残基は、天然アミノ酸残基であり、例えば、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）を含む。いくつかの実施例では、置き換えのために同定される元の残基は、例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、またはバリンなどの小さい側鎖を有するアミノ酸残基である。

いくつかの実施形態では、空洞（ホール）を含有するように修飾される第２のＦｃポリペプチドは、第２のポリペプチドの界面からくぼんでおり、したがって、第１のポリペプチドの界面からの対応する突起を収容することが可能である、少なくとも１つの側鎖を有するアミノ酸による、天然または元のアミノ酸の置き換えを含む。ほとんどの場合、置換アミノ酸は、元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸である。当業者は、アミノ酸残基の特性を決定および／または評価して、空洞の形成のための理想的な置換残基である残基を同定する方法を認識している。概して、空洞の形成のための置換残基は、天然アミノ酸であり、例えば、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、およびバリン（Ｖ）を含む。いくつかの実施例では、置き換えのために同定される元のアミノ酸は、例えば、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、またはトリプトファンなどの大きい側鎖を有するアミノ酸である。

ヒトＩｇＧ１のＣＨ３界面は、例えば、各表面から１０９０ Å２を埋める４つの逆平行β鎖上に位置する各ドメイン上に１６個の残基を含む（例えば、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒｅｔａｌ．（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０：２３６１－２３７０、Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，（１９９０）ＪＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１６，９６５－９７３、Ｒｉｄｇｗａｙｅｔａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．，９：６１７－６２１、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）。突起または空洞を作るためのＣＨ３ドメインの修飾は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、国際特許出願第ＷＯ９８／５０４３１号および同第ＷＯ２００５／０６３８１６号、ならびにＲｉｄｇｗａｙｅｔａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．，９：６１７－６２１に記載されている。いくつかの実施例では、突起または空洞を作るためのＣＨ３ドメインの修飾は、典型的には、２つの逆平行β鎖上に位置する残基に標的化される。目的は、作られる突起が、パートナーＣＨ３ドメインの代償的空洞によって収容されるのではなく、周囲の溶媒中に突出することによって収容され得るリスクを最小限に抑えることである。

例えば、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｔｈｒ３６６でＣＨ３ドメイン内にアミノ酸修飾を有するポリペプチドを含み、これは、よりかさ高いアミノ酸、例えば、Ｔｒｙ（Ｔ３６６Ｗ）で置き換えらえた場合、位置Ｔｈｒ３６６、Ｌｅｕ３６８、およびＴｙｒ４０７におけるあまりかさ高くないアミノ酸、例えば、それぞれＳｅｒ、Ａｌａ、およびＶａｌ（Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）へのアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３ドメインと優先的に対になることが可能である。ＣＨ３修飾を介したヘテロ二量体化は、ジスルフィド結合の導入によって、例えば、反対側のＣＨ３ドメイン上でＳｅｒ３５４をＣｙｓ（Ｓ３５４Ｃ）およびＴｙｒ３４９をＣｙｓ（Ｙ３４９Ｃ）に変化させることによって、さらに安定化され得る（Ｃａｒｔｅｒ，２００１ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，２４８：７－１５で考察されている）。

得られる拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上のアフィニティークロマトグラフィーなどの任意の好適な方法によって精製され得る。異なるポリペプチドをコードする２つの核酸分子が細胞に形質転換される場合、ホモ二量体およびヘテロ二量体の形成が生じる。発現の条件は、ヘテロ二量体形成がホモ二量体形成よりも有利であるように調整され得る。

親和性試薬に対するヘテロ二量体の差次的親和性に基づくホモ二量体からのヘテロ二量体の回収技術は、既知である。いくつかの態様では、そのような技術には、Ｆｃポリペプチド鎖の１つが親和性試薬プロテインＡに結合しないようにヘテロ二量体を設計することが含まれる。場合によっては、ポリペプチド鎖の１つは、Ｆｃヘテロ二量体のポリペプチドの１つにおいて、プロテインＡ試薬に対する親和性を排除または低減するための、１つ以上のアミノ酸置換を含有することができ、例えば、ＷＯ２０１７／１３４４４０、ＷＯ２０１０／１５１７９２、Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇｅｔａｌ．（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇｅｔａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１（１）：２５－３４）を参照されたい。これらの実施形態のいくつかでは、Ｆｃ領域は、プロテインＡ結合を防止し、それによってヘテロ二量体融合タンパク質のより効率的な精製を可能にするように、ヘテロ二量体の１つのメンバー上のプロテインＡ結合部位で修飾されてもよい。この結合部位内の例示的な修飾は、Ｉｌｅ２５３、例えば、Ｉｌｅ２５３Ａｒｇ（Ｉ２５３Ｒ）である。いくつかの実施形態では、修飾は、Ｈ４３５ＲまたはＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆであってもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃヘテロ二量体のＦｃポリペプチドは、タンパク質ＧではなくプロテインＡに結合することが可能であるような修飾（ｐＡ＋／ｐＧ－）を含有することができる。例示的なｐＡ＋／ｐＧ－アミノ酸修飾は、ヒトＩｇＧｌに関して４２８位にセリン、４３４位にセリン、および任意選択的に４３６位にヒスチジンを含有するか、またはヒトＩｇＧ２、３、もしくは４の対応する位置にこれらの残基を含む、Ｆｃを含む。いくつかの態様では、４２８位、４３４位、および任意選択的に４３６位での１つのＩｇＧＦｃポリペプチドにおけるそのようなアミノ酸修飾は、プロテインＧの結合を低減または防止し、タンパク質の精製を強化する。

いくつかの実施形態では、親和性試薬に差次的親和性を付与するような修飾のいずれかは、上記の任意の１つ以上の他のアミノ酸修飾と組み合わされ得る。例えば、Ｉ２５３Ｒ修飾は、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ修飾またはＴ３６６Ｗ修飾のいずれかと組み合わせされてもよい。Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ修飾Ｆｃは、Ｔ３３６Ｗ修飾Ｆｃの場合に存在するような二量体化界面の立体閉塞がないため、ホモ二量体を形成することが可能である。したがって、いくつかの実施形態では、Ｉ２５３Ｒ修飾は、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ修飾Ｆｃと組み合わされて、形成された可能性がある任意のホモ二量体Ｆｃの精製を不可能にする。Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７ＶおよびＨ４５３Ｒを組み合わせることによって、類似の修飾が採用され得る。

いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子のＦｃ領域はさらに、上記のいずれかなどの、１つ以上の他のＦｃ変異を含有することができる。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子は、エフェクター機能を低減する変異を有するＦｃ領域を含有する。

いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃの一方のＦｃポリペプチドは、配列番号１０３、１０７、１１５、または１１７のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Ｆｃの他方のＦｃポリペプチドは、配列番号１０４、１０８、１１１、１１３、１１９、または１２１のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含有する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃの一方のＦｃポリペプチドは、配列番号１０５、１０９、１１６、または１１８のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Ｆｃの他方のＦｃポリペプチドは、配列番号１０６、１１０、１１２、１１４、１２０、または１２２のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含む。

いくつかの実施形態では、提供される多重特異性ポリペプチド構築物のＦｃ領域は、１つ以上のエフェクター機能を示す。場合によっては、Ｆｃ領域は、例えば、ＡＤＣＣ（例えば、ＮＫ細胞によるグランザイムＢの放出）、ＡＤＣＰ、および／またはＣＤＣなどのＦｃ媒介性エフェクター機能を提供することが可能である。概して、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンの主な機能である抗原結合能力に加えて、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能に関与している。追加的に、Ｆｃ領域中に存在するＦｃＲｎ配列は、インビボＦｃＲｎ受容体へのコンジュゲーションによってインビボ半減期を延長させることによって、血清中のＩｇＧレベルを制御する役割を果たす。多重特異性ポリペプチド構築物が切断可能なリンカーを含有するいくつかの実施形態では、リンカーの切断は、各々が生物学的活性を有する２つの構成成分を産生することができる：Ｔ細胞上でＣＤ３に結合および関与することが可能なＣＤ３結合領域（これはいくつかの態様では、Ｔ細胞上の共刺激シグナルを誘発するためのＣＲＢＲ、および／またはＴ細胞上の阻害シグナルを遮断するためのＰＤ－１に結合するＶＨＨドメインを含有することができる）、ならびに標的特異的エフェクター機能を示すことができるＴＡＡ抗原結合ドメインに連結されたＦｃ領域。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、１つ以上のエフェクター機能を改変するように変異または修飾されるＦｃポリペプチドを含む。したがって、場合によっては、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、および／またはＣＤＣの１つ以上などのエフェクター機能は、提供される拘束された多重特異性ポリペプチド構築物と使用するために、Ｆｃ中で改変、例えば、低減または強化され得る。エフェクター機能を低減するための例示的な変異としては、上記のいずれかが挙げられる。

ｃ．ＣＤ３結合ドメイン
拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、ＣＤ３結合ドメインを含む。本開示の抗ＣＤ３結合ドメインは、Ｔ細胞上のＣＤ３またはＣＤ３複合体のメンバーの関与を介して、Ｔ細胞を活性化する。好ましい実施形態では、本開示の抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３εとしても既知のＣＤ３のイプシロン鎖に特異的に結合する。本開示の抗ＣＤ３ε結合ドメインは、Ｔ細胞上のＣＤ３εの関与を介して、Ｔ細胞を活性化する。本開示の抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化をアゴナイズ、刺激し、活性化、および／または別の方法で増強する。ＣＤ３の生物学的活性としては、例えば、Ｔ細胞活性化、およびＣＤ３とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の抗原結合サブユニットとの間の相互作用を介した他のシグナル伝達が挙げられる。例えば、本開示の抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化を部分的または完全に調節、例えば、アゴナイズ、刺激、活性化、または別の方法で増強することによって、Ｔ細胞上のＣＤ３εの関与を介して、Ｔ細胞を完全または部分的に活性化する。

ＣＤ３結合ドメインは、上記のいずれかであり得る。特定の実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３εに結合するＦｖ抗体断片（本明細書では、抗ＣＤ３ε Ｆｖ断片と称される）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３ε Ｆｖ抗体断片は、ジスルフィド安定化抗ＣＤ３結合Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に結合することに対して一価である。

いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合領域は、記載されるいずれかなどの、可変重鎖（Ｈｖ、ＶＨとも呼ばれる）および可変軽鎖（Ｌｖ、ＶＬとも呼ばれる）を含有するＦｖ抗体断片である。そのような実施形態の態様では、免疫グロブリンＦｃ領域は、記載されるいずれかなどの、Ｆｃヘテロ二量体の両方のポリペプチド間のヘテロ二量体会合が可能な２つの異なるＦｃポリペプチドを含有する、ヘテロ二量体Ｆｃ領域である。そのような実施形態では、ＣＤ３結合領域の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）は、ヘテロ二量体Ｆｃの反対側の鎖上で連結される。

いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合領域は、ＳＰ３４のＦｖもしくはｄｓＦｖ（Ｐｅｓｓａｎｏｅｔａｉ．ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ．４：３３７－３４４，１９８５）、またはＳＰ３４のヒト化バリアント（ＷＯ２０１５／００１０８５）である。

いくつかの実施形態では、その抗ＣＤ３ε結合ドメインは、重鎖可変アミノ酸配列と軽鎖可変アミノ酸配列との組み合わせを含む、ＦｖまたはｄｓＦｖ断片である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、少なくともアミノ酸配列ＴＹＡＭＮ（配列番号２９）を含むＶＨＣＤＲ１配列、少なくともアミノ酸配列ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号３０）を含むＶＨＣＤ２配列、少なくともアミノ酸配列ＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号３１）を含むＶＨＣＤＲ３配列、少なくともアミノ酸配列ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号３２）を含むＶＬＣＤＲ１配列、少なくともアミノ酸配列ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号３３）を含むＶＬＣＤＲ２配列、および少なくともアミノ酸配列ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号３４）を含むＶＬＣＤＲ３配列が含有される、ＦｖまたはｄｓＦｖ断片である。いくつかの実施形態では、その抗ＣＤ３ε結合ドメインは、配列番号３５～６５の群から選択される重鎖可変アミノ酸配列と、配列番号６６～８４、２８５からなる群から選択される軽鎖可変アミノ酸配列と、を含む、ＦｖまたはｄｓＦｖ断片である。いくつかの実施形態では、その抗ＣＤ３ε結合ドメインは、配列番号３５～６５の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上同一である重鎖可変アミノ酸配列と、配列番号６６～８４、２８５のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上同一であるアミノ酸配列と、を含む、ＦｖまたはｄｓＦｖ断片である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）、および配列番号２８５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）が含有される、ＦｖまたはｄｓＦｖである。

ｄ．リンカー
拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、免疫グロブリンＦｃ領域を含有する第１の構成成分、およびＣＤ３結合領域を含有する第２の構成成分を結合または連結するリンカーを含有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｆｃ領域がＣＤ３結合領域のＮ末端にあるように、Ｆｃ領域のＣ末端領域の末端に位置付けられる。提供される拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、第１および第２の構成成分を一緒に形成する第１および第２のポリペプチドを含有する二量体などの多量体であるため、提供される構築物は、第１のポリペプチドのＦｃ部分およびＣＤ３結合領域を結合するリンカーと、第２のポリペプチドのＦｃ部分およびＣＤ３結合領域を結合するリンカーとを含むことが理解される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第１のＦｃポリペプチド、リンカー、およびＣＤ３結合領域の第１のドメイン（例えば、ＶＨ）を含み、第２のポリペプチドは、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第２のＦｃポリペプチド、リンカー、およびＣＤ３結合領域の第２のドメイン（例えば、ＶＬ）を含む。典型的には、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物の第１および第２のポリペプチド中に存在するリンカーは、同一である。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインの各ドメインは、例えば、同じリンカーなどのリンカーを介して、ヘテロ二量体ＦｃなどのＦｃの反対側のポリペプチドに連結される。

融合タンパク質で使用するための様々なポリペプチドリンカーが既知である（例えば、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．（２０１３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．６５：１３５７－１３６９、および国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０９９９９７号、同第ＷＯ２０００／２４８８４号、米国特許第５，２５８，４９８号、米国特許第５，５２５，４９１号、米国特許第５，５２５，４９１号、米国特許第６，１３２，９９２号を参照）。

いくつかの実施形態では、リンカーは、ＣＤ３結合領域が多重特異性ポリペプチドコンジュゲートのＦｃ領域に結合される場合、細胞と多重特異性ポリペプチド構築物との接触時に、ＣＤ３結合領域が拘束され、例えば、Ｔ細胞などの細胞の表面上でＣＤ３に結合または関与することができない、または実質的にできないように選択される。Ｔ細胞結合、レポーター系を使用したＮＦＡＴ活性化、細胞溶解性Ｔ細胞活性、サイトカイン産生、および／またはＴ細胞活性化マーカーの発現を評価するためのアッセイを含む、多重特異性ポリペプチド構築物によるＣＤ３の結合または関与を評価するための様々なアッセイが採用され得る。例示的なアッセイを、提供される実施例に示す。典型的には、リンカーはまた、ポリペプチド構築物の正しい折り畳みを確実にし、連結ポリペプチドの活性もしくは機能と矛盾する電荷を示さないか、または連結ポリペプチドの活性を妨げるかもしくは改変するドメインの１つ以上におけるアミノ酸残基との結合もしくは他の相互作用を形成しないものである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ポリペプチドリンカーである。ポリペプチドリンカーは、可動性リンカーもしくは剛性リンカー、または両方の組み合わせであってもよい。いくつかの態様では、リンカーは、短いリンカー、中程度のリンカー、または長いリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大４０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大２５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは最小であるか、または少なくとも約２アミノ酸長である。いくつかの態様では、好適な長さは、例えば、少なくとも１、および典型的には２～２５アミノ酸残基、５～２０アミノ酸残基、５～１５アミノ酸残基、８～１２アミノ酸などの約４０アミノ酸残基未満の長さである。いくつかの実施形態では、リンカーは、約２～２４個のアミノ酸、２～２０個のアミノ酸、２～１８個のアミノ酸、２～１４個のアミノ酸、２～１２個のアミノ酸、２～１０個のアミノ酸、２～８個のアミノ酸、２～６個のアミノ酸、６～２４個のアミノ酸、６～２０個のアミノ酸、６～１８個のアミノ酸、６～１４個のアミノ酸、６～１２個のアミノ酸、６～１０個のアミノ酸、６～８個のアミノ酸、８～２４個のアミノ酸、８～２０個のアミノ酸、８～１８個のアミノ酸、８～１４個のアミノ酸、８～１２個のアミノ酸、８～１０個のアミノ酸、１０～２４個のアミノ酸、１０～２０個のアミノ酸、１０～１８個のアミノ酸、１０～１４個のアミノ酸、１０～１２個のアミノ酸、１２～２４個のアミノ酸、１２～２０個のアミノ酸、１２～１８個のアミノ酸、１２～１４個のアミノ酸、１４～２４個のアミノ酸、１４～２０個のアミノ酸、１４～１８個のアミノ酸、１８～２４個のアミノ酸、１８～２０個のアミノ酸、または２０～２４個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、リンカーの長さは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長である。

ある特定の態様では、リンカーの長さが長いほど、多重特異性ポリペプチドコンジュゲートが、その抗原、例えば、ＴＡＡに結合する場合のＣＤ３結合は大きい。したがって、いくつかの態様では、リンカーは、１３、１４、１５、１６、１７、または１８アミノ酸長を超えるなど、１２アミノ酸長を超える。いくつかの実施形態では、リンカーは、１２～４０アミノ酸長、１２～３０個のアミノ酸、１２～２４個のアミノ酸、１２～１８個のアミノ酸、１２～１５個のアミノ酸、１５～４０個のアミノ酸、１５～３０個のアミノ酸、１５～２４個のアミノ酸、１５～１８個のアミノ酸、１８～４０個のアミノ酸、１８～３０個のアミノ酸、１８～２４個のアミノ酸、２４～４０個のアミノ酸、２４～３０個のアミノ酸、または３０～４０個のアミノ酸である。

リンカーは、自然発生的、合成、または両方の組み合わせであり得る。特に好適なリンカーポリペプチドは、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）、およびトレオニン（Ｔｈｒ）から選択されるアミノ酸残基を主に含む。例えば、リンカーは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、およびＴｈｒから選択されるアミノ酸残基の少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％など、少なくとも７５％（ペプチドリンカー中に存在する残基の総数に基づいて計算される）を含有してもよい。リンカーはまた、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、および／またはＴｈｒ残基のみからなってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、１～２５個のグリシン残基、５～２０個のグリシン残基、５～１５個のグリシン残基、または８～１２個のグリシン残基を含有する。いくつかの態様では、好適なペプチドリンカーは、典型的には、少なくとも７５％のグリシン残基などの少なくとも５０％のグリシン残基を含有する。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシン残基のみを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシンおよびセリン残基のみを含む。

いくつかの実施形態では、これらのリンカーは、本明細書においてＧＳリンカーとして示される、アミノ酸グリシンおよびセリンから主に構成される。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは１～５、例えば１～３など、１～１０である）、例えば、ＧＧＳ（ＧＧＳ）ｎ（配列番号１２３）（式中、ｎは０～１０である）を含有する。特定の実施形態では、リンカーは、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１２３）を含有し、式中、ｎは１～１０であるか、またはｎは１～３など、１～５である。さらなる実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１２４）を含有し、式中、ｎは１～３など、１～４である。リンカーは、上記のいずれかの組み合わせを含むことができ、例えば、２、３、４、または５つのＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、および／またはＧＧＧＧＧＳリンカーの反復が組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、そのようなリンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９アミノ酸長である。

いくつかの実施形態では、リンカーは、（１文字アミノ酸コードで）：ＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２５）、またはＧＧＧＧＧＳ（配列番号１２６）である。いくつかの実施形態では、ＧＳ－リンカーは、ＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_２（配列番号１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_３（配列番号２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_４（配列番号３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_５（配列番号４）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ、すなわち、（Ｇ５Ｓ）_３（配列番号１２７）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２９）、およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２８）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧ（配列番号５）である。上記の実施例のいずれかのいくつかにおいて、セリンは、アラニンで置き換えられ得る（例えば、（Ｇｌｙ４Ａｌａ）または（Ｇｌｙ３Ａｌａ））

いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ_ｘＸａａ－Ｇｌｙ_ｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ_ｚ（配列番号１３０）を有するペプチドリンカーを含み、式中、各Ｘａａは独立して、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパルテート（Ａｓｐ）、およびグルタミン酸（Ｇｌｕ）から選択され、式中、ｘ、ｙ、およびｚは各々、１～５の範囲内の整数である。いくつかの実施形態では、各Ｘａａは独立して、Ｓｅｒ、Ａｌａ、およびＴｈｒからなる群から選択される。特定の変化形では、ｘ、ｙ、およびｚの各々は、３に等しく（それによって、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号１３１）を有するペプチドリンカーをもたらす）、式中、各Ｘａａは、上記のとおりに選択される。

いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＳＳＳＳＧ）ｙ（配列番号１３２）モチーフの反復に基づくセリンリッチリンカーであり、式中、ｙは少なくとも１であるが、ｙは２、３、４、５、６、７、８、および９であってもよい。

場合によっては、ペプチドリンカーにある程度の剛性を提供することが望ましい場合がある。これは、ペプチドリンカーのアミノ酸配列中にプロリン残基を含むことによって達成され得る。したがって、いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーのアミノ酸配列中に少なくとも１つのプロリン残基を含む。例えば、ペプチドリンカーは、アミノ酸残基の少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％または少なくとも７５％）がプロリン残基であるアミノ酸配列を有することができる。１つの特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、プロリン残基のみを含む。

いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、１つのシステイン残基など、少なくとも１つのシステイン残基を含む。例えば、いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのシステイン残基と、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、およびＴｈｒからなる群から選択されるおよびアミノ酸残基とを含む。いくつかのそのような実施形態では、リンカーは、グリシン残基およびシステイン残基のみなど、グリシン残基およびシステイン残基を含む。典型的には、１つのペプチドリンカー当たり１つのシステイン残基のみが含まれる。システイン残基を含む特定のリンカーの一例は、アミノ酸配列Ｇｌｙ_ｍ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ_ｎを有するペプチドリンカーを含み、式中、ｎおよびｍは各々、１～１２、例えば３～９、４～８、または４～７の整数である。特定の変化形では、そのようなペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＧ－Ｃ－ＧＧＧＧＧ（配列番号１３３）を有する。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のリンカーは、構造化または拘束されたリンカーである。特定の実施形態では、構造化リンカーは、配列（ＡＰ）ｎまたは（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号１３４）（式中、ｎは２～２０、好ましくは４～１０である）を含有し、ＡＳ－（ＡＰ）ｎ－ＧＴ（配列番号１３５）またはＡＳ－（ＥＡＡＡＫ）ｎ－ＧＴ（配列番号１３６）（式中、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５など、２～２０である）が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＡ）ｎ（配列番号１３７）、（ＰＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１３８）、（ＡＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１３９）、またはＧＧＳ－（ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ）ｎ－ＧＧＳ（配列番号１４０）を含み、式中、ｎは２～２０である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＳＳＳＡＳＡＳＳＡ（配列番号１４１）、ＧＳＰＧＳＰＧ（配列番号１４２）、またはＡＴＴＴＧＳＳＰＧＰＴ（配列番号１４３）である。いくつかの実施形態では、そのようなリンカーは、その構造により、タンパク質分解分解に対してより耐性があり、それによってインビボで注射されたときに利点を提供し得る。

いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーではなく、切断不可能なリンカーとも呼ばれる。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロテアーゼによって切断可能ではない。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーではないか、またはプロテアーゼによって切断可能ではないリンカーは、インビボ送達または組み換え産生に対して概して安定したリンカーである。いくつかの態様では、プロテアーゼによって切断可能ではないリンカーは、好ましくは、プロテアーゼの切断可能なペプチド配列または認識部位内にある、少なくとも１つのペプチド結合を含有しないリンカーを含む。特定の実施形態では、切断不可能なリンカーは、プロテアーゼの標的基質ではなく、これにより、リンカーは、同じプロテアーゼの基質認識部位を含有するリンカーと比較して、プロテアーゼによって優先的または特異的に切断されない。

いくつかの実施形態では、リンカーは、特定のプロテアーゼの基質認識部位または切断部位を含有せず、これは、プロテアーゼによって切断されるプロテアーゼの活性部位によって認識される配列である。典型的には、例えば、セリンプロテアーゼについて、切断配列は、基質中のＰ１－Ｐ４およびＰ１’－Ｐ４’アミノ酸で構成され、切断は、Ｐ１位置の後に生じる。典型的には、セリンプロテアーゼの切断配列は、多くのプロテアーゼの伸長した基質特異性に適合するように６残基の長さであるが、プロテアーゼに応じてより長くてもまたは短くてもよい。典型的には、リンカーは、プロテアーゼによって認識されるＰ１－Ｐ１’の切れやすい結合配列を含まない。いくつかの態様では、切断不可能なリンカー、またはプロテアーゼによる切断について特異的に認識される基質認識部位を含有しないリンカーは、プロテアーゼによる切断がプロテアーゼの標的基質の切断よりも実質的に少ないリンカーである。

いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。いくつかの態様では、切断可能なリンカーは、生理学的条件下で破壊され得る少なくとも１つの結合の存在により、プロテアーゼの基質である配列をさらに含む、上記のいずれかなどのリンカーである。場合によっては、切断可能なリンカーは、インビボで細胞環境中に存在するものを含む、細胞外プロテアーゼへの曝露の後などにインビボで存在する特定の条件下で、切断の影響を受けやすいか、または切断に感受性である。場合によっては、プロテアーゼは、腫瘍微小環境などの特定の生理学的微小環境裕に存在し、それによって、切断が生じ得る部位を制限し得る。

プロテアーゼは、典型的には、別の非標的基質と比較して、特定の標的基質の切断に対する特異性または選択性を示す。そのような特異性の程度は、プロテアーゼのその基質に対する選択性および酵素の効率の尺度である、配列、例えばリンカーの切断速度定数に基づいて決定され得る。様々な濃度の基質の存在下で経時的な切断の増加率を決定する任意の方法を使用して、特異性定数を計算することができる。例えば、基質は、プロテアーゼによる切断時に放出される蛍光発生部分に連結される。異なるプロテアーゼ濃度での切断速度を決定することによって、切断に対する特異性定数（ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ）が、特定のリンカーに対する特定のプロテアーゼについて決定され得る。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、少なくとも約１×１０^４Ｍ^－１Ｓ^－１、または少なくとも５×１０^４Ｍ^－１Ｓ、少なくとも１０×１０^４Ｍ^－１Ｓ、少なくとも１０×１０^５Ｍ^－１Ｓ以上の速度で、プロテアーゼによって特異的に切断されることが可能であるリンカーである。

いくつかの実施形態では、本開示の拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、第１および第２の構成成分を結合する切断可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、プロテアーゼ、通常は細胞外プロテアーゼの基質として機能することができるアミノ酸配列を含む。例えば、切断可能なリンカーは、好ましくはプロテアーゼの切断可能なペプチド配列内にある、少なくとも１つのペプチド結合を含有する切断配列を含んでもよい。好適なプロテアーゼとしては、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、およびプラスミン活性化因子が挙げられ、これらは、関節リウマチまたは癌などの疾患において強化された形で形成または活性化されて、過剰な組織分解、炎症、および転移をもたらす。特定の実施形態では、プロテアーゼは、腫瘍、活性化免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞）、または腫瘍微小環境中の細胞によって産生されるプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、グランザイムＢ、マトリプターゼ、またはＭＭＰ－２などのＭＭＰである。

切断可能なリンカーは、標的を発現する細胞に近接する腫瘍によって産生され、かつ／または多重特異性ポリペプチド構築物の所望の標的と組織中で共局在化される腫瘍によって産生される、プロテアーゼに基づいて選択されてもよい。多数の癌、例えば、固形腫瘍において既知の基質を有するプロテアーゼのレベルの上昇に関する文献の報告がある。例えば、ＬａＲｏｃｃａｅｔａｌ，（２００４）ＢｒｉｔｉｓｈＪ．ｏｆＣａｎｃｅｒ９０（７）：１４１４－１４２１を参照されたい。

いくつかの実施形態では、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物の第１および第２の構成成分を結合する切断可能なリンカーは、構成成分の１つによって活性化される免疫エフェクター細胞によって産生されるプロテアーゼによって切断される。例えば、エフェクターで可能となるか、または増強されるＩｇＧＦｃ領域を包含する多重特異性ポリペプチド構築物は、標的抗原と関与したときにＡＤＣＣを引き起こすことが可能である。ＡＤＣＣの中心は、エフェクター細胞、すなわちＮＫ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞からのグランザイムＢおよびパーフォリンの放出である。グランザイムＢは放出すると、パーフォリン依存的に標的細胞に入り、そこでアポトーシスを媒介する。重要なことに、グランザイムＢは、エフェクター細胞と標的細胞との間の細胞外シナプス内で活性である。いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物の第１および第２の構成成分を結合する切断可能なリンカーは、グランザイムＢによって切断される。グランザイムＢは、多重特異性ポリペプチド構築物の構成成分の１つによって媒介されるエフェクター細胞活性化中に放出される。いくつかの実施形態では、グランザイムＢおよび他のプロテアーゼは、活性化Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含む免疫エフェクター細胞によって産生され得る。いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物によるＴＡＡの結合時のＣＤ３関与によるＴ細胞の活性化は、そのようなプロテアーゼを放出し得、これは次いで、特定の切断可能なリンカーを切断し、それによってＣＤ３結合分子の活性を増強するかまたは増加させて、ＣＤ３に関与し得る。いくつかの実施形態では、切断は、切断されていない状態でＴＡＡに結合されたときに、多重特異性構築物によって達成される活性を増幅または増加させることができる。

例示的な基質としては、以下の酵素またはプロテアーゼの１つ以上によって切断可能な基質が挙げられるが、これらに限定されない：ＡＤＡＭＳ、ＡＤＡＭＴＳ、例えば、ＡＤＡＭ８；ＡＤＡＭ９；ＡＤＡＭ１０；ＡＤＡＭ１２；ＡＤＡＭ１５；ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ；ＡＤＡＭＤＥＣ１；ＡＤＡＭＴＳ１；ＡＤＡＭＴＳ４；ＡＤＡＭＴＳ５；アスパルテートプロテアーゼ、例えば、ＢＡＣＥまたはレニン；アスパラギン酸カテプシン、例えば、カテプシンＤまたはカテプシンＥ；カスパーゼ、例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、またはカスパーゼ１４；システインカテプシン、例えば、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ／Ｌ２、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ；システインプロテアーゼ、例えば、クルジパイン；レグマイン；オツバイン－２；ＫＬＫ、例えば、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、またはＫＬＫ１４；メタロプロテアーゼ、例えば、メプリン；ネプリライシン；ＰＳＭＡ；ＢＭＰ－１；ＭＭＰ、例えば、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２３、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２６、またはＭＭＰ２７、セリンプロテアーゼ、例えば、活性化プロテインＣ、カテプシンＡ、カテプシンＧ、キマーゼ、凝固因子プロテアーゼ（例えば、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ）、エラスターゼ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾエターゼ、ＨｔｒＡ１、ヒト好中球エラスターゼ、ラクトフェリン、マラプシン、ＮＳ３／４Ａ、ＰＡＣＥ４、プラスミン、ＰＳＡ、ｔＰＡ、トロンビン、トリプターゼ、ｕＰＡ；ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）、例えば、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ－２、マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、またはＴＭＰＲＳＳ４；およびそれらの任意の組み合わせ。

いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、例えば、２個以上のプロテアーゼ、３個以上のプロテアーゼ、４個以上のプロテアーゼなどの複数のプロテアーゼによって切断される。

いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、特定のプロテアーゼ、例えば、標的を発現する細胞に近接する腫瘍によって産生され、かつ／または多重特異性ポリペプチド構築物の標的と共局在化される腫瘍によって産生されることが既知である、プロテアーゼとの使用のために選択される。

いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、特定のプロテアーゼの基質認識部位または切断部位を含有し、これは、プロテアーゼによって切断されるプロテアーゼの活性部位によって認識される配列である。典型的には、例えば、セリンプロテアーゼについて、切断配列は、基質中のＰ１－Ｐ４およびＰ１’－Ｐ４’アミノ酸で構成され、切断は、Ｐ１位置の後に生じる。典型的には、セリンプロテアーゼの切断配列は、多くのプロテアーゼの伸長した基質特異性に適合するように６残基の長さであるが、プロテアーゼに応じてより長くてもまたは短くてもよい。典型的には、切断可能なリンカーは、プロテアーゼによって認識されるＰ１－Ｐ１’の切れやすい結合配列を含む。いくつかの態様では、切断可能なリンカーは、例えば、プロテアーゼの基質認識部位配列または切断配列を導入することによって、特定のプロテアーゼによって切断されることが可能なペプチド結合を導入するように操作される。

いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、２つ以上の基質配列の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、各基質配列は、同じプロテアーゼによって切断される。いくつかの実施形態では、基質配列の少なくとも２つは、異なるプロテアーゼによって切断される。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、グランザイムＢの基質であるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、グランザイムＢ切断可能なリンカーは、一般式Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１ ↓ Ｐ１’（配列番号１４４）を有するアミノ酸配列を含有し、式中、Ｐ４はアミノ酸Ｉ、Ｌ、Ｙ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、またはＡであり、Ｐ３はアミノ酸Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｎ、またはＹであり、Ｐ２はアミノ酸Ｈ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｇ、Ｓ、またはＴであり、Ｐ１はアミノ酸ＤまたはＥであり、Ｐ１’はアミノ酸Ｉ、Ｌ、Ｙ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｔ、Ｓ、Ｇ、またはＡである。いくつかの実施形態では、グランザイムＢ切断可能なリンカーは、一般式Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１ ↓ Ｐ１’（配列番号１４５）を有するアミノ酸配列を含有し、式中、Ｐ４はアミノ酸ＩまたはＬであり、Ｐ３はアミノ酸Ｅであり、Ｐ２はアミノ酸ＰまたはＡであり、Ｐ１はアミノ酸Ｄであり、Ｐ１’はアミノ酸Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ｓ、またはＧである。

いくつかの実施形態では、グランザイムＢの基質は、アミノ酸配列ＬＥＡＤ（配列番号１４６）、ＬＥＰＧ（配列番号１４７）、またはＬＥＡＥ（配列番号１４８）を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、アミノ酸配列を含有し、切断可能なリンカーは、アミノ酸配列ＩＥＰＤＩ（配列番号１４９）、ＬＥＰＤＧ（配列番号１５０）、ＬＥＡＤＴ（配列番号１５１）、ＩＥＰＤＧ（配列番号１５２）、ＩＥＰＤＶ（配列番号１５３）、ＩＥＰＤＳ（配列番号１５４）、ＩＥＰＤＴ（配列番号１５５）、ＩＥＰＤＰ（配列番号１４４）、ＬＥＰＤＧ（配列番号１５２）、またはＬＥＡＤＧ（配列番号１５３）を含む。

いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、マトリプターゼの基質であるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列Ｐ４ＱＡＲ↓（Ａ／Ｖ）（配列番号１５６）を含み、式中、Ｐ４は任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列ＲＱＡＲ（Ａ／Ｖ）（配列番号１５７）を含む。いくつかの実施形態では、マトリプターゼの基質は、アミノ酸配列ＲＱＡＲ（配列番号１５８）を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、アミノ酸配列ＲＱＡＲＶ（配列番号１５９）を含む。

いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、１つ以上のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の基質であるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＭＭＰはＭＭＰ－２である。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、一般式Ｐ３Ｐ２Ｐ１ ↓ Ｐ１’（配列番号１６０）を含有し、式中、Ｐ３はＰ、Ｖ、またはＡであり、Ｐ２はＱまたはＤであり、Ｐ１はＡまたはＮであり、Ｐ１’はＬ、Ｉ、またはＭである。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、一般式Ｐ３Ｐ２Ｐ１ ↓ Ｐ１’（配列番号１６１）を含有し、式中、Ｐ３はＰであり、Ｐ２はＱまたはＤであり、Ｐ１はＡまたはＮであり、Ｐ１’はＬまたはＩである。いくつかの実施形態では、ＭＭＰの基質は、アミノ酸配列ＰＡＧＬ（配列番号１６２）を含む。

いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、グランザイムＢの基質であるアミノ酸配列と、マトリプターゼの基質であるアミノ酸配列との組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、アミノ酸配列ＬＥＡＤ（配列番号１４６）と、アミノ酸配列ＲＱＡＲ（配列番号１５８）との組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、グランザイムＢの基質であるアミノ酸配列と、ＭＭＰの基質であるアミノ酸配列との組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、アミノ酸配列ＬＥＡＤ（配列番号１４６）と、アミノ酸配列ＰＡＧＬ（配列番号１６２）との組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、マトリプターゼの基質であるアミノ酸配列と、ＭＭＰの基質であるアミノ酸配列との組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、アミノ酸配列ＲＱＡＲ（配列番号１５８）と、アミノ酸配列ＰＡＧＬ（配列番号１６２）との組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、グランザイムＢの基質であるアミノ酸配列と、マトリプターゼの基質であるアミノ酸配列と、ＭＭＰの基質であるアミノ酸配列との組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、グランザイムＢの基質であるアミノ酸配列と、ＭＭＰの基質であるアミノ酸配列との組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、アミノ酸配列ＬＥＡＤ（配列番号１４６）と、アミノ酸配列ＲＱＡＲ（配列番号１５８）と、アミノ酸配列ＰＡＧＬ（配列番号１６２）との組み合わせを含む。

切断可能なリンカーは、任意の既知のリンカーを含み得る。切断可能なリンカーの例は、Ｂｅ’ｌｉｖｅａｕｅｔａｌ．（２００９）ＦＥＢＳＪｏｕｒｎａｌ，２７６、米国公開出願第ＵＳ２０１６／０１９４３９９号、同第ＵＳ２０１５／００７９０８８号、同第ＵＳ２０１７／０２０４１３９号、同第ＵＳ２０１６／０２８９３２４号、同第ＵＳ２０１６／０１２２４２５号、同第ＵＳ２０１５／００８７８１０号、同第ＵＳ２０１７／００８１３９７号、米国特許第ＵＳ９６４４０１６号に記載されている。

いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、ＴＧＬＥＡＤＧＳＰＡＧＬＧＲＱＡＲＶＧ（配列番号１６３）、ＴＧＬＥＡＤＧＳＲＱＡＲＶＧＰＡＧＬＧ（配列番号１６４）、ＴＧＳＰＡＧＬＥＡＤＧＳＲＱＡＲＶＧＳ（配列番号１６２）、ＴＧＰＡＧＬＧＬＥＡＤＧＳＲＱＡＲＶＧ（配列番号１６６）、ＴＧＲＱＡＲＶＧＬＥＡＤＧＳＰＡＧＬＧ（配列番号１６７）、ＴＧＳＲＱＡＲＶＧＰＡＧＬＥＡＤＧＳ（配列番号１６８）、およびＴＧＰＡＧＬＧＳＲＱＡＲＶＧＬＥＡＤＧＳ（配列番号１６９）、ＧＰＡＧＬＧＬＥＰＤＧＳＲＱＡＲＶＧ（配列番号１７０）、ＧＧＳＧＧＧＧＩＥＰＤＩＧＧＳＧＧＳ（配列番号１７１）、ＧＧＳＧＧＧＧＬＥＡＤＴＧＧＳＧＧＳ（配列番号１７２）、ＧＳＩＥＰＤＩＧＳ（配列番号１７３）、ＧＳＬＥＡＤＴＧＳ（配列番号１７４）、ＧＧＳＧＧＧＧＩＥＰＤＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号１７５）、ＧＧＳＧＧＧＧＩＥＰＤＶＧＧＳＧＧＳ（配列番号１７６）、ＧＧＳＧＧＧＧＩＥＰＤＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１７７）、ＧＧＳＧＧＧＧＩＥＰＤＴＧＧＳＧＧＳ（配列番号１７８）、ＧＧＧＳＬＥＰＤＧＳＧＳ（配列番号１７９）、およびＧＰＡＧＬＧＬＥＡＤＧＳＲＱＡＲＶＧ（配列番号１８０）、ＧＧＥＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１８１）、ＧＳＳＡＧＳＥＡＧＧＳＧＱＡＧＶＧＳ（配列番号１８２）、ＧＧＳＧＧＧＧＬＥＡＥＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１８３）、ＧＧＳＧＧＧＧＩＥＰＤＰＧＧＳＧＧＳ（配列番号１８４）、ＴＧＧＳＧＧＧＧＩＥＰＤＩＧＧＳＧＧＳ（配列番号１８５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

ｅ．抗ＰＤ－１ＶＨＨドメイン
本開示の拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、本明細書に提供されるいずれかの中からの少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ＶＨＨドメインは、配列番号２４５～２８７、２９４～２９９、および３１２～３１５のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含む。

特定の実施形態では、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、記載されるいずれかなど、少なくとも２つのＰＤ－１ＶＨＨドメインを含有する。場合によっては、少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインは、ヘテロ二量体ＦｃのＦｃポリペプチドに対してアミノ末端に位置付けられ、少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインは、ＣＤ３結合領域のＶＨ鎖またはＶＬ鎖に対してカルボキシ末端に位置付けられる。いくつかの態様では、２つのＰＤ－１ＶＨＨドメインの各々は、同一である。

特定の実施形態では、拘束された多重特異性ポリペプチド構築物は、ＰＤ－１ドメインのみを含有する。場合によっては、ＰＤ－１ＶＨＨドメインは、ヘテロ二量体ＦｃのＦｃポリペプチドに対してアミノ末端に位置付けられる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ＶＨＨドメインは、ＣＤ３結合領域のＶＨ鎖またはＶＬ鎖に対してカルボキシ末端に位置付けられる。

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１ＶＨＨドメインは、直接またはリンカーを介して間接的に、Ｆｃ領域および／またはＣＤ３結合領域に連結される。いくつかの実施形態では、連結は、リンカーを介している。いくつかの実施形態では、リンカーは、記載される任意の可動性または剛性リンカーを含み得る、連結ペプチド（ＬＰ）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_２（配列番号２４４）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_３（配列番号２４５）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_４（配列番号２４６）、およびＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_５（配列番号２４７）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは、非限定的な例として、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ（配列番号２４８）、ＧＧＧＧＧ（配列番号２４９）、およびＧＧＧＧＧＧ（配列番号７）などのグリシン残基を含む可動性リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＳリンカーとグリシンリンカーとの組み合わせを含む。

ｆ．共刺激結合ドメイン
本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、共刺激受容体に結合する１つ以上の共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）を含む。いくつかの実施形態では、提供される多重特異性ポリペプチド構築物の１つ以上のＣＲＢＲは、Ｔ細胞上に発現される共刺激受容体に結合する。いくつかの実施形態では、共刺激受容体は、活性化Ｔ細胞の表面上で上方制御、誘発、または発現される。いくつかの態様では、ＣＲＢＲは、共刺激受容体に結合し、共刺激受容体を刺激する。いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチドのＣＲＢＲへの共刺激受容体の作動性結合は、Ｔ細胞における下流シグナル伝達を誘発して、ＣＤ３の関与後にＴ細胞活性化または機能性を増強または強化する。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、ＣＲＢＲ、またはＣＲＢＲの各々は独立して、抗体もしくは抗原結合断片、共刺激受容体の天然同族結合パートナー、アンチカリン（操作されたリポカリン）、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、センチリン（操作されたフィブロネチシンＩＩＩドメイン）、シスチン－ノットドメイン、アフィリン、アフィボディ、または操作されたＣＨ３ドメインである。

いくつかの実施形態では、ＣＲＢＲ、または第１のＣＲＢＲおよび第２のＣＲＢＲなどのＣＲＢＲの各々は独立して、抗体またはその抗原結合断片の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＢＲ、または第１の抗原結合ドメインおよび第２のＣＲＢＲなどのＣＲＢＲの各々は独立して、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、および単一ドメイン軽鎖抗体からなる群から選択される、抗体またはその抗原結合断片の１つ以上のコピーを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＲＢＲ、または第１のＣＲＢＲおよび第２のＣＲＢＲなどのＣＲＢＲの各々は独立して、単鎖抗体である。いくつかの実施例では、単鎖は、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、または単一ドメイン軽鎖抗体である。

いくつかの実施形態では、ＣＲＢＲ、または第１のＣＲＢＲおよび第２のＣＲＢＲなどのＣＲＢＲの各々は独立して、１つ以上の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）断片、例えば、Ｖ_ＨＨ、Ｖ_ＮＡＲ、操作されたＶ_ＨまたはＶ_Ｋドメインを含む。Ｖ_ＨＨは、天然ラクダ科重鎖のみの抗体、重鎖のみの抗体を産生する遺伝子操作されたげっ歯類、またはナイーブ／合成のラクダ科もしくはヒト化ラクダ科の単一ドメイン抗体ライブラリーから生成され得る。Ｖ_ＮＡＲは、軟骨魚重鎖のみの抗体から生成され得る。界面工学および特定の生殖系列ファミリーの選択を含む様々な方法が、従来的にヘテロ二量体のＶ_ＨおよびＶ_Ｋドメインから単量体ｓｄＡｂを生成するために実装されてきた。

いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物のＣＲＢＲ、または第１のＣＲＢＲおよび／または第２のＣＲＢＲなどのＣＲＢＲの各々は独立して、共刺激性受容体に結合する少なくとも１つのｓｄＡｂまたはｓｃＦｖを含有する。いくつかの実施形態では、共刺激受容体に結合する少なくとも１つのｓｃＦｖまたはｓｄＡｂは、多重特異性ポリペプチド構築物のＦｃ領域に対してアミノ末端に、かつ／またはＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられる。いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物は、共刺激受容体に結合する１つのｓｃＦｖまたはｓｄＡｂのみを含有し、これは、Ｆｃ領域に対してアミノ末端、および／またはＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端のいずれかに位置付けられ得る。いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物は、Ｆｃ領域に対してアミノ末端に、かつ／またはＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられる、共刺激受容体に結合する２つのｓｃＦｖまたはｓｄＡｂを含有する。

いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第１のＦｃポリペプチド、リンカー、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片（例えば、Ｆｖ）のＶＨドメイン、および共刺激受容体に結合するｓｃＦｖまたはｓｄＡｂを含む第１のポリペプチドと、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第２のＦｃポリペプチド、リンカー、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片（例えば、Ｆｖ）のＶＬドメイン、および任意選択的に共刺激受容体に結合する別の、同じ、または異なるｓｃＦｖまたはｓｄＡｂを含む第２のポリペプチドと、を含む、２つのポリペプチドから形成されるか、またはそれらを含む。共刺激受容体に結合するｓｃＦｖまたはｓｄＡｂは、ヘテロ二量体ＦｃのＦｃポリペプチドに対してアミノ末端に、かつ／またはＣＤ３結合領域のＶＨ鎖もしくはＶＬ鎖に対してカルボキシ末端に位置付けられ得る。多重特異性ポリペプチド構築物の第１および／または第２のポリペプチドの少なくとも１つは、セクションＩＩ．４に記載されるようにＴＡＡまたはその鎖に結合する抗原結合ドメインも含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＡに結合する抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂであり、多重特異性ポリペプチド構築物の第１および／または第２のポリペプチドの一部として含まれる。いくつかの実施形態では、ＴＡＡに結合する抗原結合ドメインは、Ｆａｂであり、多重特異性ポリペプチド構築物は、第３のポリペプチドからさらに形成され、少なくとも第１および第２のポリペプチドは、ＴＡＡに結合するＦａｂの鎖（例えば、ＦａｂのＶＨ－ＣＨ１またはＶＬ－ＣＬ）を含み、第３のポリペプチドは、ＴＡＡに結合するＦａｂの他方の鎖（例えば、ＦａｂのＶＨ－ＣＨ１またはＶＬ－ＣＬの他方）を含有する。

いくつかの実施形態では、ＣＲＢＲ、または第１のＣＲＢＲおよび／もしくは第２のＣＲＢＲなどのＣＲＢＲの各々は独立して、２つ以上の鎖を含有する。いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物のＣＲＢＲ、または第１のＣＲＢＲおよび／または第２のＣＲＢＲなどのＣＲＢＲの各々は独立して、ＦＡＢとして集合したＶＨおよびＶＬ配列を含有する。

いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物のＣＲＢＲ抗原結合ドメイン、または第１の抗原結合ドメインおよび／もしくは第２の抗原結合ドメインなどのＣＲＢＲ抗原結合ドメインの各々は独立して、共刺激受容体に結合するＦａｂ抗体のＶＨ－ＣＨ１（Ｆｄ）およびＶＬ－ＣＬを含有する。いくつかの実施形態では、ＶＨ－ＣＨ１（Ｆｄ）およびＶＬ－ＣＬを含有するＦａｂ抗体は、多重特異性ポリペプチド構築物のＦｃ領域に対してアミノ末端に、かつ／またはＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられる。いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物は、Ｆｃ領域に対してアミノ末端、および／またはＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端のいずれかに位置付けられ得る、共刺激受容体に結合する、ＶＨ－ＣＨ１（Ｆｄ）またはＶＬ－ＣＬを含有する１つのＦａｂ抗体のみを含有する。いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物は、一方がＦｃ領域に対してアミノ末端に位置付けられ、他方がＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられる、共刺激受容体に結合する、各々がＶＨ－ＣＨ１（Ｆｄ）およびＶＬ－ＣＬを含有する２つのＦａｂ抗体断片を含有する。

いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第１のＦｃポリペプチド、リンカー、および共刺激受容体に結合するＦａｂ抗体断片のＶＨ－ＣＨ１（Ｆｄ）またはＶＬ－ＣＬを含む第１のポリペプチドと、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第２のＦｃポリペプチド、リンカー、および任意選択的に、共刺激受容体に結合するＦａｂ抗体断片の同じＶＨ－ＣＨ１（Ｆｄ）またはＶＬ－ＣＬを含む第２のポリペプチドと、共刺激受容体に結合するＦａｂ抗体断片のＶＨ－ＣＨ１（Ｆｄ）またはＶＬ－ＣＬの他方を含む第３のポリペプチドと、を含む、３つ以上のポリペプチドから形成されるか、またはそれらを含む。多重特異性ポリペプチド構築物の第１、第２、および／または第３のポリペプチドはまた、記載されるいずれかなどのＰＤ－１ＶＨＨドメインを含み得る。

いくつかの実施形態では、ＣＲＢＲ、またはＣＲＢＲの各々は独立して、共刺激受容体（例えば、天然リガンド）の天然（ｎａｔｕｒａｌ）（天然（ｎａｔｉｖｅ））同族結合パートナー、または共刺激受容体への結合活性を示すそのバリアントであるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、提供される多重特異性ポリペプチド構築物の１つ以上のＣＲＢＲは、Ｔ細胞上に発現される共刺激受容体に結合する。いくつかの実施形態では、共刺激受容体に結合する２つ以上のＣＲＢＲがあり、第１のＣＲＢＲおよび第２のＣＲＢＲなどのＣＲＢＲの各々は、同じ共刺激受容体に結合する。いくつかの実施形態では、第１のＣＲＢＲおよびＣＲＢＲなどのＣＲＢＲの各々は、異なる共刺激受容体に結合する。いくつかの実施形態では、第１のＣＲＢＲおよび第２のＣＲＢＲなどのＣＲＢＲの各々は、同じ共刺激受容体上の異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原－ＣＲＢＲおよびＣＲＢＲなどのＣＲＢＲの各々は、同じ共刺激受容体上の同じエピトープに結合する。

いくつかの実施形態では、共刺激受容体に結合するＣＲＢＲ、またはＣＲＢＲの各々は独立して、共刺激受容体への一価、二価、三価、または四価結合をもたらす。

いくつかの実施形態では、共刺激受容体は、対象から得られる初代Ｔ細胞などのＴ細胞上に発現される。いくつかの実施形態では、共刺激受容体は、ヒト対象から得られる初代ヒトＴ細胞などのヒトＴ細胞上に発現される。

いくつかの実施形態では、共刺激受容体は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、共刺激受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーである。いくつかの実施形態では、共刺激受容体は、受容体のＢ７ファミリーのメンバーである。

いくつかの実施形態では、共刺激受容体は、４１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、膜貫通アクチベーターおよびＣＡＭＬインタラクター（ＴＡＣＩ）、ならびにＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、共刺激受容体は、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、またはＣＤ２８から選択される。いくつかの実施形態では、共刺激受容体は、４１ＢＢ、ＯＸ４０、またはＧＩＴＲから選択される。

いくつかの実施形態では、共刺激受容体は、４１ＢＢである。いくつかの実施形態では、共刺激受容体は、ＯＸ４０である。いくつかの実施形態では、共刺激受容体は、ＧＩＴＲである。いくつかの実施形態では、共刺激受容体は、ＩＣＯＳである。いくつかの実施形態では、共刺激受容体は、ＣＤ２８である。

いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチドのＣＲＢＲは、共刺激受容体への作動性結合分子であるか、またはそれを含む。ＣＲＢＲは、共刺激受容体に結合し、受容体の天然リガンドによって開始、誘発、または刺激されるものと同様または同一である反応または活性を開始、誘発、または刺激することができる。いくつかの態様では、共刺激受容体へのＣＲＢＲの結合は、受容体の天然リガンドによって開始、誘発、または刺激されるシグナルの５％超、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、または１００％超である、下流シグナルを誘発または刺激する。

いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＲＢＲは、共刺激受容体４１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＲＢＲは、共刺激受容体４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、またはＣＤ２８に結合する抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＲＢＲは、共刺激受容体４１ＢＢ、ＯＸ４０、またはＧＩＴＲに結合する抗体またはその断片である。４１ＢＢ、ＯＸ４０、およびＧＩＴＲに結合するための例示的なポリペプチドは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１２３６５０号、同第ＷＯ２０１７／１２３６７３号、および同第ＷＯ２０１７／０１５６２３号に記載されている。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＲＢＲは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１２３６５０号、同第ＷＯ２０１７／１２３６７３号、および同第ＷＯ２０１７／０１５６２３号に記載されるものなど、共刺激受容体に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。

いくつかの実施例では、共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）は、４１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、膜貫通アクチベーターおよびＣＡＭＬインタラクター（ＴＡＣＩ）、ＮＫＧ２Ｄの天然同族結合パートナーに結合するか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、天然同族結合パートナーは、４１ＢＢリガンド（４１ＢＢＬ）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＣＤ７０、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＩＣＯＳリガンド（ＩＣＯＳＬ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、Ａ増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）、ＮＫＧ２Ｄ断片、またはそれらの機能的断片から選択される。

ＣＲＢＲの例示的な配列を表４に記載する。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＲＢＲ、または独立して各ＣＲＢＲは、共刺激受容体４１ＢＢに結合する。いくつかの実施例では、ＣＲＢＲは、例えば、ＶＨおよびＶＬを含有するｓｄＡｂまたは断片（例えば、ｓｃＦｖ）など、４１ＢＢに特異的な、またはそれに結合する抗体または抗原結合断片であるか、またはそれを含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＲＢＲ、または独立して各ＣＲＢＲは、４１ＢＢの天然リガンドであるか、またはその機能的結合断片である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＲＢＲ、または独立して各ＣＲＢＲは、アンチカリンである。そのような４１ＢＢ結合ＣＲＢＲの例は、配列番号１８６～２１０のいずれかに記載される。いくつかの実施形態では、４１ＢＢ結合ＣＲＢＲは、配列番号１８７、１８９、および１９１のいずれかに記載されるＶＨと、配列番号１８８、１９０、または１９２のいずれかに記載されるＶＬとを含有する。提供される多重特異性ポリペプチド構築物中のＣＲＢＲ、または独立して各ＣＲＢＲは、上記の配列番号のいずれかと少なくとも８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、４１ＢＢに結合することができる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＲＢＲ、または独立して各ＣＲＢＲは、共刺激受容体ＯＸ４０に結合する。いくつかの実施例では、ＣＲＢＲは、例えば、ＶＨおよびＶＬを含有するｓｄＡｂまたは断片（例えば、ｓｃＦｖ）など、ＯＸ４０に特異的な、またはそれに結合する抗体または抗原結合断片であるか、またはそれを含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＲＢＲ、または独立して各ＣＲＢＲは、ＯＸ４０の天然リガンドであるか、またはその機能的結合断片である。そのようなＯＸ４０結合ＣＲＢＲの例は、配列番号２１１～２２０のいずれかに記載される。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０結合ＣＲＢＲは、配列番号２１６および２１８のいずれかに記載されるＶＨと、配列番号２１７および２１９のいずれかに記載されるＶＬとを含有する。提供される多重特異性ポリペプチド構築物中のＣＲＢＲ、または独立して各ＣＲＢＲは、上記の配列番号のいずれかと少なくとも８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ＯＸ４０に結合することができる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＲＢＲ、または独立して各ＣＲＢＲは、共刺激受容体ＧＩＴＲに結合する。いくつかの実施例では、ＣＲＢＲは、例えば、ＶＨおよびＶＬを含有するｓｄＡｂまたは断片（例えば、ｓｃＦｖ）など、ＧＩＴＲに特異的な、またはそれに結合する抗体または抗原結合断片であるか、またはそれを含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＲＢＲ、または独立して各ＣＲＢＲは、ＧＩＴＲの天然リガンドであるか、またはその機能的結合断片である。そのようなＧＩＴＲ結合ＣＲＢＲの例は、配列番号２２１～２３０のいずれかに記載される。いくつかの実施形態では、ＧＩＴＲ結合ＣＲＢＲは、配列番号２２２、２２４、２２６、および２２８のいずれかに記載されるＶＨと、配列番号２２３、２２５、２２７、および２２９のいずれかに記載されるＶＬとを含有する。提供される多重特異性ポリペプチド構築物中のＣＲＢＲ、または独立して各ＣＲＢＲは、上記の配列番号のいずれかと少なくとも８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ＧＩＴＲに結合することができる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＲＢＲ、または独立して各ＣＲＢＲは、共刺激受容体ＣＤ２７に結合する。いくつかの実施例では、ＣＲＢＲは、例えば、ＶＨおよびＶＬを含有するｓｄＡｂまたは断片（例えば、ｓｃＦｖ）など、ＣＤ２７に特異的な、またはそれに結合する抗体または抗原結合断片であるか、またはそれを含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＲＢＲ、または独立して各ＣＲＢＲは、ＣＤ２７の天然リガンドであるか、またはその機能的結合断片である。そのようなＣＤ２７結合ＣＲＢＲの例は、配列番号２３１のいずれかに記載される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２７結合ＣＲＢＲは、配列番号２３２に記載されるＶＨと、配列番号２３３に記載されるＶＬとを含有する。提供される多重特異性ポリペプチド構築物中のＣＲＢＲ、または独立して各ＣＲＢＲは、上記の配列番号のいずれかと少なくとも８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ＣＤ２７に結合することができる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＲＢＲ、または独立して各ＣＲＢＲは、共刺激受容体ＩＣＯＳに結合する。いくつかの実施例では、ＣＲＢＲは、例えば、ＶＨおよびＶＬを含有するｓｄＡｂまたは断片（例えば、ｓｃＦｖ）など、ＩＣＯＳに特異的な、またはそれに結合する抗体または抗原結合断片であるか、またはそれを含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＲＢＲ、または独立して各ＣＲＢＲは、ＩＣＯＳの天然リガンドであるか、またはその機能的結合断片である。例示的なＩＣＯＳ結合ＣＲＢＲ配列は、配列番号２３４に記載される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＲＢＲ、または独立して各ＣＲＢＲは、共刺激受容体ＣＤ２８に結合する。いくつかの実施例では、ＣＲＢＲは、例えば、ＶＨおよびＶＬを含有するｓｄＡｂまたは断片（例えば、ｓｃＦｖ）など、ＣＤ２８に特異的な、またはそれに結合する抗体または抗原結合断片であるか、またはそれを含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＲＢＲ、または独立して各ＣＲＢＲは、ＣＤ２８の天然リガンドであるか、またはその機能的結合断片である。例示的なＣＤ２８結合ＣＲＢＲ配列は、配列番号２３５に記載される。

いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＲＢＲは、直接またはリンカーを介して間接的に、Ｆｃ領域および／またはＣＤ３結合領域に連結される。いくつかの実施形態では、連結は、リンカーを介している。いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に記載される任意の可動性または剛性リンカーを含み得る連結ペプチド（ＬＰ）であるが、概して、ＣＲＢＲまたは領域を連結するペプチドは、切断可能なリンカーではない。

いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物は、ＣＲＢＲとＦｃ領域との間の連結ペプチド（ＬＰ）を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性ポリペプチド構築物は、ＣＤ３結合領域とＣＲＢＲとの間の連結ペプチド（ＬＰ）を含む。

３．ＮＫ動員
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、本明細書に提供される少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメイン、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に発現されるか、またはＮＫ細胞を動員する表面分子に結合することが可能な少なくとも１つの追加の結合分子であるか、またはこれらを含む、二重特異性構築物である。特定の態様では、多重特異性構築物は、ＰＤ－１およびＮＫ細胞表面分子に対して二重特異性である。いくつかの実施形態では、表面分子は、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）である。具体的には、提供される二重特異性ＰＤ－１結合ポリペプチドは、ヒトＣＤ１６ａなどのヒトＮＫ細胞上に発現されるＮＫ活性化受容体に特異的に結合することが可能である。

ＣＤ１６は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に関与することが既知であるいくつかのＩｇＧのＦｃ部分に対する低親和性受容体であり、ＮＫ細胞による標的細胞溶解を引き起こすことに関与する、最もよく特徴がわかっている膜受容体である（Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍｅｔａｌ．，１９９９，ＰＮＡＳ９６：５６４０－５６４４）。概して、ヒトＮＫ細胞の大多数（約９０％）は、低密度のＣＤ５６（ＣＤ５６ｄｉｍ）および高レベルのＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を発現する（Ｃｏｏｐｅｒｅｔａｌ．，２００１，ＴｒｅｎｄｓＩｍｍｕｎｏｌ．２２：６３３－６４０）。ヒトＦｃγＲＩＩＩは、それらの細胞外免疫グロブリン結合領域において９６％の配列同一性を共有する２つのアイソフォーム、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）およびＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩＢ）として存在する（ｖａｎｄｅＷｉｎｋｅｌａｎｄＣａｐｅｌ，１９９３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１４（５）：２１５－２２１）。特定の実施形態では、追加の結合分子は、ＣＤ１６ａに特異的に結合することが可能である。

ＣＤ１６ａは、マクロファージ、マスト細胞、およびＮＫ細胞上で膜貫通受容体として発現される。ＮＫ細胞上でＣＤ１６ａのアルファ鎖は、シグナル伝達を媒介するために、ＦｃεＲＩ γ鎖および／またはＴ－細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３ ζ鎖を含有する免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）と会合する（Ｗｉｒｔｈｍｕｅｌｌｅｒｅｔａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１３８１－１３９０）。γ鎖およびζ鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体の異なる組み合わせとＣＤ１６ａとの相互作用が、ＮＫ細胞において観察されており、ＮＫ細胞におけるＣＤ１６ａ複合体の変異を介した異なるシグナル伝達経路を介して、シグナル伝達を媒介する能力を示す（Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ．，１９９０，ＰＮＡＳ８７（６）：２２７４－２２７８、Ａｃｋｅｒｌｙｅｔａｌ．，１９９２，Ｉｎｔ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＳｕｐｐｌ．７：１１－１４）。ＦｃγＲ発現エフェクター細胞は、ＡＤＣＣを介した腫瘍細胞の破壊に関与することが示されている。例えば、ＣＤ１６ａに特異的に結合することが可能なアゴニスト結合分子などとのＣＤ１６ａの関与は、ＣＤ１６ａを発現するＮＫ細胞の活性化をもたらし、それによって生物学的応答、特にシグナル伝達応答を引き起こすことができる。場合によっては、結合分子は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）と類似した様式で、そのような細胞への結合によって細胞死滅を引き起こすことが可能である。

特定の実施例では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、ＰＤ－１およびＣＤ１６ａに特異的に結合することができる二重特異性分子を含み、抗原を有する細胞がＮＫ細胞媒介性細胞死滅を介して根絶され得るように、ＮＫ細胞をそのような抗原を有する細胞に標的化し得る。例えば、腫瘍細胞上に発現されるＰＤ－１に特異的に結合する結合分子は、ＮＫ細胞を腫瘍細胞に標的化し得る。場合によっては、ＣＤ１６ａに結合する結合分子によって引き起こされるＮＫ細胞の活性化は、腫瘍細胞の死滅をもたらし得る。

いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ａなどの活性化ＮＫ細胞受容体に特異的な追加の結合ドメインは、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体（ＶＨＨ）、または単一ドメイン軽鎖抗体から選択される抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、追加の結合ドメインは、ＣＤ１６ａなどの活性化ＴＮＫ細胞受容体に結合することに対して一価である。

場合によっては、追加の結合ドメインは、ＣＤ１６ａを認識する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１６ａ結合ドメインは、抗ＣＤ１６ａＦａｂ断片、抗ＣＤ１６ａＦ（ａｂ’）_２断片、抗ＣＤ１６ａＦｖ断片、抗ＣＤ１６ａｓｃＦｖ、抗ＣＤ１６ａｄｓＦｖ、抗ＣＤ１６ａｓｃＡｂ、抗ＣＤ１６ａｄＡｂ、抗ＣＤ１６ａ単一ドメイン重鎖抗体（ＶＨＨ）、および抗ＣＤ１６ａ単一ドメイン軽鎖抗体の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１６ａ結合ドメインは、ＣＤ１６ａに結合することに対して一価である。いくつかの実施形態では、ＢＨ７３結合ポリペプチドは、ＢＨ７３に結合し、ＣＤ１６ａの活性をアゴナイズする二重特異性構築物である。

ＣＤ１６ａに特異的な抗体およびその抗原結合断片は既知であり、例えば、ＮＭ３Ｅ２を含む（ＭｃＣａｌｌｅｔａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６：４３３－０４５）。他の抗ＣＤ１６ａ抗体も、本明細書に提供される構築物で使用され得、公開された米国特許出願第ＵＳ１０１６／０２８０７９５号、米国特許第９，７０１，７５０号、Ｂｅｈａｒｅｔａｌ．（２００８）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ．２１：１－１０、Ａｒｎｄｔｅｔａｌ．，（１９９９）Ｂｌｏｏｄ９４：２５６２－２５６８に記載されるいずれかを含む。特定の実施例では、抗ＣＤ１６ａは、抗ＣＤ１６ａｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１６ａは、ＴａｎｄＡｂ分子に含まれる抗ＣＤ１６ａ抗体である（例えば、Ｒｅｕｓｈｅｔａｌ．（２０１４）Ｍａｂｓ，６：７２７－７３８を参照）。いくつかの態様では、抗ＣＤ１６ａは、米国特許第９，０３５，０２６号に記載される抗ＣＤ１６ａまたはｓｃＦｖなどの抗原結合断片である。

提供される二重特異性構築物は、少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインと、ＣＤ１６ａ結合ドメインなどの活性化ＮＫ細胞受容体に特異的な少なくとも１つの追加のドメインとを含有する、多数のフォーマットのいずれかでフォーマットされ得る。

一実施形態では、二重特異性構築物は、抗ＣＤ１６ａＦａｂなどの、ＮＫ細胞活性化受容体、例えばＣＤ１６ａに特異的なＦａｂ抗原結合断片に直接または間接的に連結された、記載される少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインを含有する、二重特異性単一ドメイン抗体連結Ｆａｂ（Ｓ－Ｆａｂ）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ＶＨＨドメインは、抗Ｃ１６ａＦａｂのＶＨ鎖またはＶＬ鎖のＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、Ｓ－Ｆａｂは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマー、タンパク質（アルブミンなど）、ポリグルタミン酸、またはＰＡＳｙｌａｔｉｏｎとのコンジュゲーションなどによってさらに修飾され得る（Ｐａｎｅｔａｌ．（２０１８）ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１８：３１８９－３２０１）。

別の実施形態では、二重特異性構築物は、その構築物が、ＮＫ細胞活性化受容体、例えば、ＣＤ１６ａに特異的な抗原結合ドメインのＶＨおよびＶＬを含有するｓｃＦｖに直接または間接的に連結された、記載される少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨを含有する、ｓｃＦｖ－単一ドメイン抗体である。ＮＫ細胞活性化受容体に対するｓｃＦｖ、例えば、抗ＣＤ１６ａｓｃＦｖは、記載されるＶＨ配列およびＶＬ配列のいずれかを含有し得る。いくつかの実施形態では、ＶＨＨドメインおよびｓｃＦｖは、ペプチドリンカーなどのリンカーによって接続される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、本明細書に記載されるペプチドリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、ＶＨＨドメインおよびｓｃＦｖは各々、任意選択的にヒンジ領域またはリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して、Ｆｃ領域のＮ末端などのＦｃ領域に接続される。Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域またはそのバリアント、例えば、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域またはそのバリアントなど、本明細書に記載されるいずれかであり得る。特定の実施例では、Ｆｃ領域は、異なるポリペプチドが二量体化されてヘテロ二量体をもたらすことができるヘテロ二量体化を促進するように変異または修飾される、バリアントＦｃドメイン、例えば、バリアントヒトＩｇＧ１ドメインによって形成される。

さらなる実施形態では、ＮＫ細胞活性化受容体、例えば、ＣＤ１６ａに特異的な抗原結合ドメインは、ＣＤ１６ａに特異的に結合するＶＨＨドメインなどの単一ドメイン抗体である。ＣＤ１６ａに結合するＶＨＨドメインを含む単一ドメイン抗体は既知であり、例えば、公開された米国特許出願第ＵＳ２０１６／０２８０７９５号を参照されたい。そのような態様では、本明細書に提供される二重特異性構築物は、少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインと少なくとも１つのＣＤ１６ａＶＨＨドメインとを含み得る。構築物をフォーマットするために、場合によっては、各ＶＨＨドメインは、任意選択的にヒンジ領域またはリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して、Ｆｃ領域のＮ末端などのＦｃ領域に接続される。Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域またはそのバリアント、例えば、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域またはそのバリアントなど、本明細書に記載されるいずれかであり得る。特定の実施例では、Ｆｃ領域は、異なるポリペプチドが二量体化されてヘテロ二量体をもたらすことができるヘテロ二量体化を促進するように変異または修飾される、バリアントＦｃドメイン、例えば、バリアントヒトＩｇＧ１ドメインによって形成される。

上記の実施形態では、ヘテロ二量体化を促進するためのＦｃ領域の例示的な修飾は既知であり、例えば、以下の表１に記載されるいずれかを含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃの一方のＦｃポリペプチドは、配列番号１０３、１０７、１１５、または１１７のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Ｆｃの他方のＦｃポリペプチドは、配列番号１０４、１０８、１１１、１１３、１１９、または１２１のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含有する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃの一方のＦｃポリペプチドは、配列番号１０５、１０９、１１６、または１１８のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Ｆｃの他方のＦｃポリペプチドは、配列番号１０６、１１０、１１２、１１４、１２０、または１２２のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含む。

４．サイトカイン融合体および／またはサイトカイン受容体標的化
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、サイトカイン－抗体融合タンパク質（ＰＤ－１ＶＨＨ－サイトカイン融合体とも呼ばれる）である、多重特異性ポリペプチド構築物である。いくつかの態様では、本明細書に提供される少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインは、インターフェロンなどの少なくとも１つのサイトカインに直接または間接的に連結される。特定の実施形態では、サイトカインは、抗増殖活性、アポトーシス活性、および／または抗ウイルス活性を示すことが可能なインターフェロンである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１ＶＨＨ－サイトカイン融合体の界面は、ＩＦＮＡＲ１および／または２から構成される受容体に結合することが可能である。様々なアッセイのいずれかを使用して、ＩＦＮＡＲ１および／または２への結合、癌細胞の成長速度および／もしくは増殖速度の低減もしくは減少、腫瘍サイズの縮小、腫瘍の排除、または癌細胞の死の誘発（例えば、アポトーシスを介した）に対するそのような融合タンパク質の効果を評価することができる。そのようなアッセイには、ＰＤ－１を発現することが既知の様々な癌細胞株を用いたインビトロアッセイ、または動物腫瘍モデルを採用したインビボアッセイが含まれる。

いくつかの実施形態では、インターフェロンは、ヒトＩ型インターフェロンまたはそのバリアントなどのＩ型インターフェロンである。いくつかの態様では、ヒトＩ型インターフェロンは、切断型ヒトＩ型インターフェロンまたはヒト変異型Ｉ型インターフェロンであるバリアントである。いくつかの実施形態では、Ｉ型インターフェロンまたはそのバリアントは、野生型ヒトＩＦＮ－アルファ（ＩＦＮ－アルファ、アルファ２、およびアルファ１４などの天然高親和性バリアント）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ－ベータ）、ならびにその変異体および／またはその切断型である。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、ヒトＩＩ型インターフェロンまたはそのバリアントなどのＩＩ型インターフェロンである。いくつかの態様では、ヒトＩＩ型インターフェロンは、切断型ヒトＩＩ型インターフェロンまたはヒト変異型ＩＩ型インターフェロンであるバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＩ型インターフェロンまたはそのバリアントは、野生型ヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）、ならびに変異体および／またはその切断型である。いくつかの実施形態では、提供されるサイトカイン－抗体融合タンパク質を使用して、ＰＤ－１を発現または過剰発現する標的細胞（例えば、癌細胞）の成長および／または増殖を阻害することができる。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ＶＨＨ－サイトカイン融合タンパク質は、国際ＰＣＴ公開出願第ＷＯ２０１４／１９４１００号、米国特許第９，８０３，０２１号、Ｖａｌｅｄｋａｒｉｍｉｅｔａｌ．（２０１７）ＢｉｏｍｅｄＰｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，９５：７３１－７４２、またはＹｏｕｎｇｅｔａｌ．（２０１４）ＳｅｍｉｎＯｎｃｏｌ．，４１：６２３－６３６に記載されるいずれかとフォーマットが類似している。

特定の実施形態では、インターフェロン、例えば、ヒトＩ型インターフェロンなどのＩ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ、またはＩＦＮ－ガンマ）は、天然もしくは野生型インターフェロンの内因性結合親和性および／または活性を、好ましくは少なくとも６０％、もしくは少なくとも約８０％、例えば、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、１００％のレベル、または天然野生型インターフェロン（その単離形態の）よりも大きいレベルで有するものである。

インターフェロンおよびインターフェロン変異体は、サイトカインの周知の、特徴がはっきりした群である（例えば、ＷＯ２００２／０９５０６７、ＷＯ２００２／０７９２４９、ＷＯ２００２／１０１０４８、ＷＯ２００２／０９５０６７、ＷＯ２００２／０８３７３３、ＷＯ２００２／０８６１５６、ＷＯ２００２／０８３７３３、ＷＯ２００３／０００８９６、ＷＯ２００２／１０１０４８、ＷＯ００２／０７９２４９、ＷＯ２００３／０００８９６、ＷＯ２００４／０２２５９３、ＷＯ２００４／０２２７４７、ＷＯ２００３／０２３０３２、ＷＯ２００４／０２２５９３、およびＫｉｍｅｔａｌ．（２００３）ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ．１８９（２）：１８３－１８８、Ｈｕｓｓａｉｎｅｔａ／．（２０００）Ｊ．ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓ．２０（９）：７６３－７６８、Ｈｕｓｓａｉｎｅｔａｌ．（１９９８）Ｊ．ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓ．１８（７）：４６９－４７７、Ｎｙｍａｎｅｔａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２９（Ｐｔ２）：２９５－３０２、Ｇｏｌｏｖｌｅｖａｅｔａｌ．（１９９７）Ｊ．ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓ．１７（１０）：６３７－６４５、Ｈｕｓｓａｉｎｅｔａｌ．（１９９７）Ｊ．ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓ．１７（９）：５５９－５６６、Ｇｏｌｏｖｌｅｖａｅｔａｌ．（１９９７）Ｈｕｍ．Ｈｅｒｅｄ．４７（４）：１８５－１８８、Ｋｉｔａｅｔａｌ．（１９９１）Ｊ．ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓ．１７（３）：１３５－１４０、Ｇｏｌｏｖｌｅｖａｅｔａｌ．（１９９６）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５９（３）：５７０－５７８、Ｈｕｓｓａｉｎｅｔａｌ．（１９９６）Ｊ．ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓ．１６（７）：５２３－５２９、Ｌｉｎｇｅｅｔａｌ．（１９９５）ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａを参照）。そのようなもののいずれも、提供されるサイトカイン－抗体融合タンパク質で使用され得る。

いくつかの実施形態では、インターフェロンは、ヒトＩ型インターフェロンである。遺伝子／タンパク質のヒトインターフェロンファミリーの対立遺伝子が既知であり、例えば、Ｐｅｓｔｋａ（１０９８３）ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ．，２２１：１－３７、Ｄｉａｚｅｔａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２２：５４０－５２、Ｐｅｓｔｋａ（１９８６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９９：３－４、およびＫｒａｕｓｅｅｔａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２２９９５－３００４を参照されたい。

いくつかの実施形態では、インターフェロンは、完全長ＩＦＮ－アルファ（例えば、ヒトＩＦＮ－アルファ）、完全長ＩＦＮ－ベータ（例えば、ヒトＩＦＮ－ベータ）、または完全長ＩＦＮ－ガンマ（例えば、ヒトＩＦＮ－ガンマ）である。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、生物学的に活性な切断型ＩＦＮ－アルファ（例えば、ヒトＩＦＮ－アルファ）、生物学的に活性な切断型ＩＦＮ－ベータ（例えば、ヒトＩＦＮ－ベータ）、または生物学的に活性な切断型ＩＦＮ－ガンマ（例えば、ヒトＩＦＮ－ガンマ）である。いくつかの実施形態では、生物学的に活性な切断型インターフェロンは、Ｎ末端および／またはＣ末端で切断された野生型または天然インターフェロンのアミノ酸の連続配列を含有し、天然または野生型インターフェロンの長さの少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、またはそれ以上の長さを含む。インターフェロンの生物学的活性を評価するための様々な標準アッセイのいずれかが使用され得る。例えば、ＩＦＮ－アルファ活性は、特定の試験ウイルスに対する抗ウイルス活性を測定することによって分析され得る。ＩＦＮ－アルファ活性を分析するためのキットは、市販されている（例えば、Ｎｅｕｔｅｋｂｉｏ，ＩｒｅｌａｎｄによるＩＬＩＴＥ（商標）アルファベータキットを参照）。いくつかの態様では、ＩＦＮ－アルファは、ＩＦＮ－ａ２ａ（例えば、アクセッション番号ＣＡＡ２３８０５）、ＩＦＮ－ａ－ｃ（アクセッション番号Ｐ０１５６６）、ＩＦＮ－ａ－ｄ（アクセッション番号ＡＡＢ５９４０３）、ＩＦＮａ－５（アクセッション番号ＣＡＡ２６７０２）、ＩＦＮａ－６（アクセッション番号ＡＡ２６７０４）、ＩＦＮａ－４（アクセッション番号ＮＰ＿０６６５４６）、ＩＦＮａ－４ｂ（アクセッション番号ＣＡＡ２６７０１）、ＩＦＮａ－Ｉ（アクセッション番号ＡＡＡ５２７２５）、ＩＦＮａ－Ｊ（アクセッション番号ＣＡＡ２３７９２）、ＩＦＮａ－Ｈ（アクセッション番号ＣＡＡ２３７９４）、ＩＦＮａ－Ｆ（アクセッション番号ＡＡＡ５２７１８）、ＩＦＮａ－７（アクセッション番号ＣＡＡ２６９０３）、またはその生物学的に活性な断片である。いくつかの態様では、ＩＦＮ－ベータは、アクセッション番号ＡＡＣ４１７０２に記載されるＩＦＮ－ベータ、またはその生物学的に活性な断片である。いくつかの態様では、ＩＦＮ－ガンマは、アクセッション番号Ｐ０１５７９に記載されるＩＦＮ－ガンマ、またはその生物学的に活性な断片である。

いくつかの実施形態では、バリアントまたは変異インターフェロンアルファ２（ＩＦＮａ２）を含有する、提供されるＰＤ－１ＶＨＨ－サイトカイン融合体が企図される。特定の変異体には、５７位のＨｉｓ、および／または５８位のＥ、および／または６１位のＱの変異が含まれる。特定の実施形態では、変異体は、変異Ｈ５７Ｙ、および／またはＥ５８Ｎ、および／またはＱ６１Ｓを含む。特定の実施形態では、変異体は、変異Ｈ５７Ｙ、Ｅ５８Ｎ、およびＱ６１Ｓ（ＹＮＳ）を有する変異ＩＦＮａ２を含む（例えば、Ｋａｌｉｅｅｔａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８２：１１６０２－１１６１１を参照）。他の実施形態では、変異体は、５７位のＨｉｓ、および／または５８位のＥ、および／または６１位のＱからＡ（アラニン）への変異を含む。特定の実施形態では、変異体は、変異Ｈ５７Ａ、Ｅ５８Ａ、およびＱ６１Ａ（ＨＥＱ）を有する変異ＩＦＮａ２を含む（例えば、Ｊａｉｔｉｎｅｔａｌ．（２００６）Ｍｏ／．ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌ，２６（５）：１８８８－１８９７を参照）。特定の実施形態では、変異インターフェロンは、５７位のＨｉｓからＡ、Ｙ、もしくはＭへの変異、および／または５８位のＥからＡ、もしくはＮ、もしくはＤ、もしくはＬへの変異、および／または６１位のＱからＡ、もしくはＳ、もしくはＬ、もしくはＤへの変異を含む。特定の実施形態では、変異体は、Ｒ１４５からＶ、Ｉ、もしくはＬ、および／またはＡ１４６からＮもしくはＳ、および／またはＭ１４９からＹに対応するアミノ酸の置き換えを有するバリアント、例えば、Ｒ１４５Ｖ／Ａ１４６Ｎ／Ｍ１４９Ｙ、Ｒ１４５Ｉ／Ａ１４６Ｓ／Ｍ１４９Ｙ、またはＲ１４５Ｌ／Ａ１４６Ｓ／Ｍ１４９Ｙなど、インターフェロンアルファ８（ＩＦＮ－ａ８）の変異体を含む（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏｅｔ．ａｌ，．（２００９）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ＆ｃｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓ，２９：１６１－１７０を参照）。

いくつかの実施形態では、提供されるＰＤ－１ＶＨＨ－サイトカイン融合体は、アミノ酸１７で天然システインに対して置換されたセリンを含有する変異またはバリアントＩＦＮ－ベータを含有する（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓｅｔａｌ．（１９８５）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４５，５９１４－５９２０を参照）。

いくつかの実施形態では、提供されるＰＤ－１ＶＨＨ－サイトカイン融合体は、切断型インターフェロンを含有する。一実施形態では、切断型インターフェロンは、最大で最初の１５個のアミノ末端のアミノ酸残基、および／または最大で最後の１０～１３個のカルボキシル末端のアミノ酸残基の欠失を有するヒトＩＦＮ－アルファを含み、これは、天然または野生型ヒトＩＦＮ－アルファの活性を保持することが示されている（例えば、Ａｃｋｅｒｍａｎ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８１：１０４５－１０４７を参照）。いくつかの実施形態では、切断型ヒトＩＦＮ－アルファは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、もしくは１３個のカルボキシル末端のアミノ酸残基が欠失しており、かつ／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個のアミノ末端のアミノ酸残基が欠失している。

いくつかの実施形態では、提供されるＰＤ－１ＶＨＨ－サイトカイン融合体は、公開された米国特許出願第ＵＳ２００９／００２５１０６号に記載されるような切断型インターフェロンを含有する。いくつかの実施形態では、提供されるＰＤ－１ＶＨＨ－サイトカイン融合体は、Ｌｕｎｄｅｌｌｅｔａｌ．（１９９１）ＰｒｏｔｅｉｎＮｅｇ．，４：３３５－３４１、Ｐａｎｅｔａｌ．（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６６：１４５－１４９に記載されるような、Ｎおよび／またはＣ末端欠失を含有する切断型ＩＦＮ－ガンマを含有する。

いくつかの実施形態では、インターフェロン、例えば、ヒトインターフェロンは、修飾されていない典型的には野生型のタンパク質と比較して、タンパク質分解に耐性がある変異インターフェロンであり、例えば、米国特許第７，９９８，４６９号、米国特許第８，０５２，９６４号、米国特許第４，８３２，９５９号、米国特許第６，１２０，７６２号、ＷＯ１９９２／００８７３７、およびＥＰ２１９７８１を参照されたい。

提供されるＰＤ－１ＶＨＨ－サイトカイン融合タンパク質の態様では、抗体およびサイトカイン、例えば、インターフェロンは、直接結合されるか、またはペプチドリンカーなどのリンカーを介して間接的に結合される。結合は、結合がＰＤ－１への抗体の結合を干渉しない限り、ＶＨＨドメインのＮ末端またはＣ末端に対するものであり得る。本明細書に記載される任意のリンカー、例えばペプチドリンカーが使用され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_２（配列番号１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_３（配列番号２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_４（配列番号３）、およびＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_５（配列番号４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＧＳリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、非限定的な例として、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ（配列番号５）、ＧＧＧＧＧ（配列番号６）、およびＧＧＧＧＧＧ（配列番号７）などのグリシン残基を含む可動性リンカーである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＧＳリンカーとグリシンリンカーとの組み合わせを含むことができる。

Ｄ．操作された細胞
本明細書に記載される提供されるＰＤ－１結合分子のいずれかを発現する操作された細胞が、本明細書に提供される。特定の実施形態では、提供されるＰＤ－１結合分子は、細胞から分泌される。いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に提供される抗ＰＤ－１ＶＨＨドメインを含有するＰＤ－１結合分子は、シグナルペプチド、例えば、抗体シグナルペプチド、または細胞外にドメインを得るための他の効率的なシグナル配列を含む。ＰＤ－１結合分子がシグナルペプチドを含み、操作された細胞によって発現される場合、シグナルペプチドは、免疫調節タンパク質を操作された細胞によって分泌させる。概して、シグナルペプチド、またはシグナルペプチドの一部分は、分泌を伴う結合分子から切断される。ＰＤ－１結合分子は、核酸（発現ベクターの一部であり得る）によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合分子は、細胞（免疫細胞、例えば、初代免疫細胞など）によって発現および分泌される。

いくつかの実施形態では、提供される操作された細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含有する。ＣＡＲは、典型的には、単一融合分子中の１つ以上のシグナル伝達ドメインと会合し、かつＴ細胞などの細胞の表面上に発現される、細胞外標的化／結合部分を含有する合成受容体である。したがって、ＣＡＲは、単一融合分子中で抗原特異性とＴ細胞活性化特性とを組み合わせる。第１世代ＣＡＲは、典型的には、ＣＤ３ゼータまたはＦｃｌ受容体γ鎖の細胞質領域をそれらのシグナル伝達ドメインとして含んだ。第１世代ＣＡＲは、卵巣癌、腎癌、リンパ腫、および神経芽腫を有する患者において第Ｉ相臨床試験で試験されており、それらはわずかな応答を誘発した（Ｓａｄｅｌａｉｎｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＯｐｉｎＩｍｍｕｎｏｌ，２１（２）：２１５－２２３，２００９で考察されている）。ＣＤ２８およびＣＤ３ゼータなどの共刺激分子のシグナル伝達ドメインを含有する第２世代ＣＡＲは、活性化シグナルと共刺激シグナルとの組み合わせを方向付けるための二重シグナル伝達を提供する。第３世代ＣＡＲは、３つ以上のシグナル伝達ドメインを有してより複雑である（Ｓａｄｅｌａｉｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（３），３８８－３９８，２０１３、およびＤｏｔｔｉｅｔａｌ，Ｉｍｍｕｎｏ．Ｒｅｖ，２５７（１），１－３６，２０１４で考察されている）。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原に特異的な１つ以上の抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインを含有する。いくつかの態様では、ＴＡＡに特異的な腫瘍抗原および／または抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるいずれかであり得る。ＣＡＲ構築物は、１つ以上の細胞外抗原結合ドメインを含有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達領域を含む。場合によっては、細胞外抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）である。概して、ＣＡＲの抗原結合ユニットを形成する細胞外抗原結合ドメインは、ＣＡＲが標的抗原を発現する細胞または組織を標的とする療法において有用であるように、十分な親和性を有する標的抗原に「結合する」、または「結合することが可能である」、すなわち、それを標的とする。

ＣＡＲの膜貫通ドメインは、典型的には細胞膜を横断するか、または細胞膜を横断するもしくは細胞膜に及ぶことが可能であり、細胞外抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含有する内質部分に直接または間接的に（例えば、免疫グロブリンヒンジ配列などのスペーサーを介して）接続される、ドメインである。一実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、膜貫通タンパク質（例えば、Ｉ型膜貫通タンパク質）、人工疎水性配列、またはそれらの組み合わせの膜貫通領域である。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ゼータドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。他の膜貫通ドメインが当業者に明らかになり、本明細書に提供されるＣＡＲの実施形態に関連して使用され得る。

本明細書に提供されるＣＡＲの細胞内シグナル伝達領域は、例えば、結合抗原上のなど、ＣＡＲの抗原結合ドメインの関与時に、Ｔ細胞にシグナルを伝達する１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、細胞内領域は、ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。例示的な細胞内シグナル伝達ドメインとしては、例えば、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖またはその相同体（例えば、η鎖、ＦｃｓＲＩｙおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇａ）鎖、Ｂ２９（Ｉｇ）鎖など）、ヒトＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ３ポリペプチド（Δ、δ、およびε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０など）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎなど）、ならびにＣＤ２、ＣＤ５、ＯＸ４０、およびＣＤ２８などの、Ｔ細胞形質導入に関与する他の分子に由来するシグナル伝達ドメインが挙げられる。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達領域は、ヒトＣＤ３ゼータ鎖に由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。

いくつかの実施形態では、エンドドメインは、ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号２３６に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２３６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、Ｔ細胞シグナル伝達の活性を保持する。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達領域は、共刺激分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含有することができる。そのような実施例では、そのようなシグナル伝達ドメインは、例えば、ＩＴＡＭ含有シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータのみを含有するＣＡＲと比較して、抗原特異的関与後のメモリー細胞の増殖、生存、および／または発生などを介して、ＣＡＲ－Ｔ細胞活性を強化し得る。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、以下から選択されるタンパク質から得られた機能的シグナル伝達ドメインである：ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－ＩＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＤａｐＩＯ、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１ｌａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、またはそれらの組み合わせ。特定の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ヒトタンパク質に由来するか、またはそれから得られる。いくつかの態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２８またはヒトＣＤ１３７（４－ＩＢＢ）に由来するか、またはそれから得られる。

いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８または４－１ＢＢに由来し、配列番号２３７～２４０のいずれかに記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２３７～２４０と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達の活性を保持する。

特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとを接続するヒンジまたはスペーサー領域をさらに含む。このヒンジまたはスペーサー領域は、結果として生じるＣＡＲの異なる長さおよび可動性を達成するために使用され得る。使用され得るヒンジまたはスペーサー領域の例としては、抗体のＦｃ断片、またはその断片もしくは誘導体、抗体のヒンジ領域またはその断片もしくは誘導体、抗体のＣ_Ｈ２領域、抗体のＣ_Ｈ３領域、人工スペーサー配列、例えば、ペプチド配列、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。他のヒンジまたはスペーサー領域は、当業者に明らかになり、使用され得る。一実施形態では、ヒンジは、ｌｇＧ４ヒンジまたはＣＤ８Ａヒンジである。

いくつかの実施形態では、スペーサーおよび膜貫通ドメインは、配列番号２４１～２４３に記載される例示的な配列、または配列番号２４１～２４３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するような、ＣＤ８由来のヒンジおよび膜貫通ドメインである。

本明細書に提供されるＰＤ－１結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む単離核酸構築物も、本明細書に提供される。ＣＡＲをコードし、本明細書に提供されるＰＤ－１結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む単離核酸構築物も、本明細書に提供される。いくつかでは、ＣＡＲをコードする第１の核酸は、ＩＲＥＳまたはリボソームスキップ配列（例えば、Ｔ２ＡまたはＰ２Ａ）などの２シストロン性の要素によってＰＤ－１結合分子をコードする第２の核酸から分離される。いくつかの態様では、構築物は、細胞におけるＰＤ－１結合分子および／またはＣＡＲの発現のための発現ベクターである。発現ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，２０１３）に記載される。哺乳動物細胞への遺伝子導入のために、多数のウイルス系が開発されている。例えば、アデノウイルスベクターなどのレトロウイルスが使用される。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。

さらなる態様では、上記の１つ以上の核酸構築物を含む単離細胞または細胞集団も提供される。また、本明細書に提供されるＰＤ－１結合分子および／またはＣＡＲを発現するように遺伝子組み換えされた単離細胞または細胞集団が提供される。したがって、本明細書に提供されるＣＡＲを安定的に発現するなど、ＣＡＲを含む遺伝子操作された細胞が本明細書に提供される。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、造血幹細胞、および／または多能性胚性／誘導性幹細胞からなる群から選択される。場合によっては、細胞は、ＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞などのＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象に対して自己である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、ＣＡＲ核酸構築物を用いたトランスフェクションまたは形質導入などの操作のために、患者から単離されてもよい（初代Ｔ細胞とも呼ばれる）。

例示的な例では、初代Ｔ細胞は、エクスビボで精製され（ＣＤ４細胞もしくはＣＤ８細胞、または両方）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズなどのＴＣＲ／ＣＤ２８アゴニストで刺激され得る。２～３日間の活性化プロセスの後、ＣＡＲをコードする組み換え発現ベクターは、標準的なレンチウイルスもしくはレトロウイルスの形質導入プロトコル、またはプラスミドエレクトロポレーション法を介して、初代Ｔ細胞に安定的に導入され得る。細胞は、例えば、抗エピトープタグ、または天然親分子と交差反応する抗体を使用したフローサイトメトリーによって、ＰＤ－１結合分子の分泌および／またはＣＡＲ発現について監視され得る。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、抗エピトープタグ抗体を用いたソーティングを介して濃縮され得るか、または用途に応じて高発現もしくは低発現のために濃縮され得る。

ＰＤ－１結合分子および／またはＣＡＲ操作されたＴ細胞は、様々な手段によって適切な機能について分析され得る。場合によっては、インビトロ細胞傷害性、増殖、またはサイトカインアッセイ（例えば、ＩＦＮ－ガンマ発現）を使用して、操作されたＴ細胞の機能を評価することができる。例示的な標準エンドポイントは、腫瘍系統の溶解率、操作されたＴ細胞の増殖、または培養上清におけるＩＦＮ－ガンマタンパク質発現である。場合によっては、例えば抗原を介してＣＡＲの刺激時にＴ細胞の活性化を刺激する能力は、ＣＤ６９、ＣＤ４４、もしくはＣＤ６２Ｌなどの活性化マーカーの発現、増殖、および／またはサイトカイン産生を監視することなどによって評価され得る。

また、本明細書に提供される操作された細胞を対象に投与することを含む、癌などの対象における疾患または状態の予防および／または治療のための方法が本明細書に提供される。概して、対象は、その疾患または状態の治療、薬学的に活性な量の細胞および／または本発明の医薬組成物を必要とする。

ＩＶ．ポリペプチドの発現および産生
提供されるｓｄＡｂおよびＰＤ－１結合ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、提供される核酸配列、特にＤＮＡ配列は、本明細書に提供される融合タンパク質をコードする。上記の実施形態のいずれかにおいて、核酸分子はまた、ＰＤ－１結合ポリペプチドの分泌を誘導するリーダー配列をコードしてもよく、そのリーダー配列は典型的には、分泌ポリペプチド中に存在しないように切断される。リーダー配列は、天然重鎖（またはＶＨＨ）リーダー配列であってもよいか、または別の異種リーダー配列であってもよい。

核酸分子は、当該技術分野で従来的な組み換えＤＮＡ技術を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、選択された宿主細胞における発現に好適な発現ベクターである。

本明細書に記載されるＰＤ－１結合ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターが提供される。そのようなベクターとしては、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣＨＯ細胞もしくはＣＨＯ由来細胞などの所望の細胞型における、またはＮＳＯ細胞におけるポリペプチドの発現に最適化されたものから選択される。例示的なそのようなベクターは、例えば、ＲｕｎｎｉｎｇＤｅｅｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：８８０－８８９（２００４）に記載されている。

特に、融合タンパク質などの所望のＰＤ－１結合ポリペプチドをコードするＤＮＡベクターを使用して、本明細書に記載されるＰＤ－１結合ポリペプチドを調製する方法を容易にし、有意量を得ることができる。ＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入され得る。様々な宿主－ベクター系を利用して、タンパク質コード配列を発現し得る。これらには、ウイルスに感染した哺乳動物細胞系（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）、ウイルスに感染した昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス）、酵母ベクターを含有する酵母などの微生物、またはバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が含まれる。利用される宿主－ベクター系に応じて、多数の好適な転写および翻訳要素のいずれか１つが使用され得る。

本開示はまた、ポリペプチドの発現をもたらす条件下で細胞を培養することによって、ＰＤ－１結合ポリペプチドを産生する方法を提供し、細胞は、本明細書に記載されるＰＤ－１結合ポリペプチドをコードする単離核酸分子、および／またはこれらの単離された核酸配列を含むベクターを含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、細菌細胞などの原核細胞において、または真菌細胞（酵母など）、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞などの真核細胞において発現され得る。そのような発現は、例えば、当該技術分野で既知の手順に従って実施され得る。ポリペプチドを発現するために使用され得る例示的な真核細胞としては、ＣＯＳ７細胞を含むＣＯＳ細胞、２９３－６Ｅ細胞を含む２９３細胞、ＣＨＯ－Ｓ、ＤＧ４４、Ｌｅｃ１３ＣＨＯ細胞、およびＦＵＴ８ＣＨＯ細胞を含むＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、ならびにＮＳＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、酵母において発現され得る。例えば、米国公開第ＵＳ２００６／０２７００４５（Ａ１）号を参照されたい。いくつかの実施形態では、特定の真核宿主細胞は、ポリペプチドに所望の翻訳後修飾を行うその能力に基づいて選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞は、２９３細胞で産生されるのと同じポリペプチドよりも高いレベルのシアル化を有するポリペプチドを産生する。

所望の宿主細胞への１つ以上の核酸（ベクターなど）の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染などを含むが、これらに限定されない任意の方法によって達成され得る。非限定的な例示的な方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３^ｒｄｅｄ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（２００１）に記載されている。核酸は、任意の好適な方法に従って、所望の宿主細胞において一過性にまたは安定的にトランスフェクトされ得る。

本明細書に記載される核酸またはベクターのいずれかを含む宿主細胞も提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＰＤ－１結合ポリペプチドを発現する宿主細胞が提供される。宿主細胞において発現されたＰＤ－１結合ポリペプチドは、任意の好適な方法によって精製され得る。そのような方法としては、親和性マトリックスまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用が挙げられるが、これらに限定されない。好適な親和性リガンドには、ＲＯＲ１ＥＣＤ、およびＦｃ領域に結合する薬剤が含まれる。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、または抗体親和性カラムを使用して、Ｆｃ領域を結合し、Ｆｃ領域を含むＰＤ－１結合ポリペプチドを精製してもよい。疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えば、ブチルまたはフェニルカラムも、抗体などの一部のポリペプチドを精製するのに好適であり得る。イオン交換クロマトグラフィー（例えば、アニオン交換クロマトグラフィーおよび／またはカチオン交換クロマトグラフィー）もまた、抗体などの一部のポリペプチドを精製するのに好適であり得る。混合モードクロマトグラフィー（例えば、逆相／アニオン交換、逆相／カチオン交換、親水性相互作用／アニオン交換、親水性相互作用／カチオン交換など）も、抗体などの一部のポリペプチドを精製するのに好適であり得る。ポリペプチドを精製する多くの方法は、当該技術分野で既知である。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、無細胞系で産生される。非限定的な例示的な無細胞系は、例えば、Ｓｉｔａｒａｍａｎｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９８：２２９－４４（２００９）、Ｓｐｉｒｉｎ，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５３８－４５（２００４）、Ｅｎｄｏｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２１：６９５－７１３（２００３）に記載されている。

いくつかの実施形態では、上記の方法によって調製されるＰＤ－１結合ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、宿主細胞で調製される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、無細胞系で調製される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、精製される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドを含む細胞培養培地が提供される。

いくつかの実施形態では、上記の方法によって調製された抗体を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、宿主細胞で調製されたＰＤ－１結合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、無細胞系で調製されたＰＤ－１結合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、精製されたＰＤ－１結合ポリペプチドを含む。

Ｖ．医薬組成物および製剤
本明細書に提供されるＰＤ－１結合ポリペプチド、またはそれを発現する操作された細胞のいずれかを含有する医薬組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質などのＰＤ－１結合ポリペプチド（本明細書において「活性化合物」とも称される）、およびその誘導体、断片、類似体、および相同体は、投与に好適な医薬組成物に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１結合ポリペプチドを含有する、キメラ抗原受容体などのキメラ受容体を発現する操作された細胞は、投与に好適な医薬組成物に組み込まれ得る。

そのような組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体を含有する。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬剤投与に適合する、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを含むことが意図される。好適な担体は、当該技術分野の標準的な参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。そのような担体または希釈剤の好適な例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソーム、および固定油などの非水性ビヒクルも使用され得る。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合不可能である場合を除き、組成物におけるその使用が企図される。補助的活性化合物も組成物に組み込まれ得る。

本開示の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、腫瘍内、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下への適用に使用される溶液または懸濁液には、以下の構成成分が含まれ得る：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩、ならびに張性の調整のための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどが含まれ得る。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、ガラスもしくはプラスチックで作製されたアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与バイアルに封入され得る。

注射用途に好適な医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性である）または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与については、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は、滅菌されなければならず、容易な注射可能性が存在する程度まで流体でなければならない。これは、製造および保管の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合に必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の長期間の吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど、吸収を遅らせる薬剤を組成物中に含むことによってもたらされ得る。

滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上で列挙した成分の１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒中に活性化合物を必要量で組み込み、その後に濾過滅菌することによって調製され得る。概して、分散液は、塩基性分散媒体と上で列挙したものからの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に、活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、活性成分の粉末、およびその以前に滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥である。

経口組成物は概して、不活性希釈剤または食用担体を含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤に圧縮され得る。経口治療的投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と組み込まれ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され得る。経口組成物はまた、マウスウォッシュとして使用するための流体担体を使用して調製され得、流体担体中の化合物は、経口的に適用され、うがいおよび吐き出しまたは嚥下される。薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分、または類似の性質の化合物のいずれかを含有することができる：結合剤、例えば、微結晶セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはトウモロコシデンプン；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅ；滑剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えば、スクロースもしくはサッカリン；または香味剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香味料。

吸入による投与については、化合物は、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。

全身投与はまた、経粘膜的または経皮的手段によるものであり得る。経粘膜投与または経皮投与については、透過されるバリアに適切な浸透剤が製剤中で使用される。そのような浸透剤は、当該技術分野で一般的に知られており、例えば、経粘膜的投与のために、洗剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐薬の使用によって達成され得る。経皮投与については、活性化合物は、当該技術分野で一般的に既知の軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。

化合物はまた、直腸送達のための坐薬（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を用いた）、または停留浣腸の形態で調製され得る。

一実施形態では、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、身体からの迅速な除去から化合物を保護する担体で調製される。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。そのような製剤の調製方法は、当業者に明らかになるであろう。材料はまた、ＡｌｚａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手され得る。リポソーム懸濁液はまた、薬学的に許容される担体としても使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に既知の方法に従って調製され得る。

投与の容易さおよび投与量の均一性のために、単位剤形で経口組成物または非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される場合、単位剤形は、治療される対象に対する単位投与量として好適な、物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して所望の治療効果をもたらすよう計算された所定量の活性化合物を含有する。本開示の単位剤形の仕様は、活性化合物の特有の特徴、および達成される特定の治療効果、ならびに個体の治療のためのそのような活性化合物を配合する技術分野に固有の限界によって決定され、かつそれらに直接依存する。

医薬組成物は、投与についての説明書と一緒にキット、容器、パック、またはディスペンサーに含まれ得る。これらの医薬組成物は、使用説明書とともに診断キットに含まれ得る。

医薬組成物は、特定の適応症の治療または予防に有効な量で投与される。治療有効量は、典型的には、治療されている対象の体重、その身体状態もしくは健康状態、治療される状態の広範さ、または治療されている対象の年齢に依存する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１用量当たり約５０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１用量当たり約１００μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１用量当たり約１００μｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１用量当たり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与されてもよい。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１用量当たり約１０ｍｇ～約１，０００ｍｇの範囲の量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１用量当たり約２０ｍｇ～約５００ｍｇの範囲の量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１用量当たり約２０ｍｇ～約３００ｍｇの範囲の量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１用量当たり約２０ｍｇ～約２００ｍｇの範囲の量で投与されてもよい。

医薬組成物は、必要に応じて対象に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、有効用量の医薬組成物は、１回以上対象に投与される。様々な実施形態では、有効用量の医薬組成物は、月１回、月１回未満、例えば、２か月毎、３か月毎、または６か月毎など、対象に投与される。他の実施形態では、有効用量の医薬組成物は、月２回以上、例えば、２週間毎、毎週、週２回、週３回、毎日、または１日複数回など、投与される。有効用量の医薬組成物は、少なくとも１回対象に投与される。いくつかの実施形態では、有効用量の医薬組成物は、少なくとも１か月、少なくとも６か月、または少なくとも１年の期間にわたって複数回投与されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、状態のうちの１つ以上の症状を軽減するために、必要に応じて対象に投与される。

ＶＩ．治療および使用方法
本明細書に記載されるＰＤ－１結合ポリペプチドまたはそれを発現する操作された細胞は、様々な治療的、診断的、および予防的適応症において有用である。例えば、ＰＤ－１結合ポリペプチドまたは操作された細胞は、対象における様々な疾患および障害の治療で有用である。そのような方法および使用には、例えば、腫瘍または癌などの疾患、状態、または障害を有する対象に、分子もしくは操作された細胞、またはそれを含有する組成物を投与することを伴う、治療方法および使用が含まれる。いくつかの実施形態では、分子または操作された細胞は、疾患または障害の治療をもたらすのに有効な量で投与される。使用には、そのような方法および治療における、ならびにそのような治療方法を実施するための薬剤の調製における、ＰＤ－１結合ポリペプチドまたは操作された細胞を含有する分子の使用が含まれる。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＤ－１結合ポリペプチドもしくは操作された細胞、またはそれを含む組成物を、疾患または状態を有するか、または有する疑いがある対象に投与することによって実施される。いくつかの実施形態では、方法は、それによって対象における疾患または状態または障害を治療する。

一実施形態では、本開示のＰＤ－１結合ポリペプチドまたは操作された細胞は、治療薬として使用され得る。そのような薬剤は、概して、対象における疾患または病理を診断、予測、監視、治療、軽減、および／または予防するために採用される。治療レジメンは、標準的な方法を使用して、障害に罹患している（または発症するリスクがある）対象、例えば、ヒト患者または他の哺乳動物を同定することによって実施される。場合によっては、ＰＤ－１を発現する腫瘍を有することが既知であるか、疑われているか、または同定されている対象が選択される。ＰＤ－１結合ポリペプチドまたは操作された細胞は、対象に投与される。ＰＤ－１結合ポリペプチドまたは操作された細胞が対象に投与され、概して、標的（複数可）とのその結合による効果を有する。

いくつかの実施形態では、提供されるＰＤ－１ポリペプチド多重特異性ポリペプチド構築物または操作された細胞は、細胞におけるＣＤ３および／もしくはＣＤ３シグナルの関与によって、かつ／またはＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２との相互作用を遮断することなどによって、対象に投与されたときに免疫応答を調節する、例えば、増加させることが可能である。いくつかの実施形態では、治療有効量の提供される多重特異性構築物もしくは操作された細胞、またはその医薬組成物を投与することによって、対象において免疫応答を調節する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、免疫応答を調節する方法は、対象における免疫応答を増加させるか、または強化する。例えば、応答の増加または強化は、細胞媒介性免疫の増加であり得る。いくつかの実施例では、方法は、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性などのＴ細胞活性を増加させる。いくつかの実施形態では、調節された（例えば、増加した）免疫応答は、腫瘍または癌に対するものである。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１－Ｆｃ融合タンパク質またはＦｃ領域を含有する多重特異性構築物などのＰＤ－１結合ポリペプチドの投与は、多重特異性ポリペプチド構築物のＦｃ領域を通したＦｃγＲの関与を介して、自然免疫細胞を活性化し得る。そのような多重特異性ポリペプチド構築物の投与は、ＡＤＣＣ、サイトカイン放出、脱顆粒、および／またはＡＤＣＰを含む、自然免疫細胞エフェクター機能をアゴナイズ、刺激、活性化、および／または増強し得る。拘束された多重特異性ポリペプチド構築物の場合、そのような多重特異性ポリペプチド構築物の投与は、第１および第２の構成成分を結合するリンカー（複数可）がプロテアーゼによって、および／または標的細胞（例えば、腫瘍細胞）上の腫瘍抗原の結合によって切断されると、Ｔ細胞を活性化し、それによって抗ＣＤ３結合部分がＴ細胞上のＣＤ３εに結合することを可能にし得る。場合によっては、多重特異性ポリペプチド構築物の投与は、ＣＤ３媒介性Ｔ細胞の活性化、細胞傷害性、サイトカイン放出、および／または増殖をアゴナイズ、刺激、活性化、および／または増強し得る。

いくつかの実施形態では、提供される方法は、治療有効量の提供されるＰＤ－１結合ポリペプチドもしくは操作された細胞、またはその医薬組成物のいずれかを投与することによって、対象において疾患または状態を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、腫瘍または癌である。概して、疾患または障害の軽減または治療は、疾患または障害に関連する１つ以上の症状または医学的問題の減少を伴う。例えば、癌の場合、治療有効量の薬物は、以下の１つまたは組み合わせを達成することができる：癌細胞の数の低減、腫瘍サイズの縮小、末梢器官への癌細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減少および／もしくは停止）、腫瘍転移の阻害、腫瘍増殖のある程度の阻害、ならびに／または癌に関連する症状の１つ以上のある程度の緩和。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、対象、例えば、ヒトまたは他の哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、コンパニオン動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、家畜、労働動物、もしくは動物園動物における疾患または障害の発症または再発を予防するために使用され得る。対象および患者という用語は、本明細書において互換的に使用される。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドもしくは操作された細胞、またはその医薬組成物を使用して、哺乳動物癌細胞（ヒト癌細胞など）の増殖を阻害することができる。癌を治療する方法は、有効量の本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを、癌を有する対象に投与することを含み得る。有効量の医薬組成物は、癌の進行を阻害、停止、または逆転するために投与され得る。ヒト癌細胞は、インビボまたはエクスビボで処置され得る。ヒト患者のエクスビボ治療では、癌細胞を含有する組織または体液は、体外で処置され、次いで組織または体液は、患者内に再導入されて戻される。いくつかの実施形態では、癌は、治療用組成物を患者に投与することによって、インビボでヒト患者において治療される。

疾患の非限定的な例としては、あらゆる種類の癌（乳癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、黒色腫、頭頸部癌、膵癌など）、関節リウマチ、クローン病、ＳＬＥ、心血管損傷、虚血などが挙げられる。例えば、適応症には、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）を含む白血病、多発性骨髄腫を含むリンパ芽球性疾患、ならびに肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍、および乳房腫瘍（トリプルネガティブ乳癌を含む）を含む固形腫瘍が含まれる。例えば、適応症には、原発腫瘍起源に関係なく、骨疾患または癌の転移；非限定的な例としてＥＲ／ＰＲ＋乳癌、Ｈｅｒ２＋乳癌、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌；結腸直腸癌；子宮内膜癌；胃癌；膠芽腫；食道癌などの頭頸部癌；非限定的な例として非小細胞肺癌などの肺癌；多発性骨髄腫、卵巣癌；膵癌；前立腺癌；骨肉腫などの肉腫；非限定的な例として腎細胞癌などの腎癌；および／または非限定的な例としての扁平上皮癌、基底細胞癌、もしくは黒色腫などの皮膚癌が含まれる。いくつかの実施形態では、癌は、扁平上皮癌である。いくつかの実施形態では、癌は、皮膚扁平上皮癌である。いくつかの実施形態では、癌は、食道扁平上皮癌である。いくつかの実施形態では、癌は、頭頸部扁平上皮癌である。いくつかの実施形態では、癌は、肺扁平上皮癌である。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドもしくは操作された細胞、またはその医薬組成物は、癌または他の新生物状態の治療、その症状の軽減、改善、およびその進行の遅延に有用である。いくつかの実施形態では、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化管癌、膵癌、結腸直腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫、およびウイルス関連癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性癌、難治性癌、または再発癌である。

いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質または多重特異性ポリペプチド構築物などのＰＤ－１結合ポリペプチドの治療有効量は、概して、治療目的を達成するために必要な量に関する。典型的には、投与される本開示の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態の個体差を考慮して、医師によって決定され得る。

いくつかの実施形態では、治療有効用量は、非限定的な例として、約０．０１μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、非限定的な例として、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～約５～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。一般的な投与頻度は、例えば、１日２回から週に１回までの範囲であり得る。

いくつかの実施形態では、治療量の本開示の操作された細胞組成物が投与される。概して、本明細書に記載される操作された細胞、例えば、Ｔ細胞を含む医薬組成物は、１０^４～１０^９細胞／ｋｇ体重、例えば、１０^５～１０^６細胞／ｋｇ体重の投与量で投与されてもよく、これらの範囲内のすべての整数値を含むことが規定され得る。Ｔ細胞組成物などの操作された細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法で一般的に既知の注入技術を使用することによって投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ，ＮｅｗＥｎｇ．Ｊ．ｏｆＭｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照）。特定の患者のための最適な投与量および治療レジメンは、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて治療を調整することによって、当業者によって容易に決定され得る。

治療の有効性は、特定の障害を診断または治療するための任意の既知の方法に関連して決定される。所望の特異性を有するＰＤ－１結合ポリペプチドまたはそれを含有する操作された細胞のスクリーニング方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および当該技術分野内で既知の他の免疫学的媒介技術が挙げられるが、これらに限定されない。提供されるＰＤ－１結合ポリペプチドまたは操作された細胞の投与が、望ましくない免疫反応を媒介するか、もしくは媒介することが可能な免疫細胞の排除、隔離、もしくは不活性化；防御免疫応答を媒介するか、もしくは媒介することが可能である免疫細胞の誘発、生成、もしくは刺激；免疫細胞の物理的もしくは機能的特性の変化；またはこれらの効果の組み合わせによって、免疫学的活性を十分に調節するかを判定するための様々な手段が知られている。免疫学的活性の調節の測定例としては、免疫細胞集団の存在または非存在の検査（フローサイトメトリー、免疫組織化学、組織学、電子顕微鏡法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））；シグナルに応答して増殖または分裂する能力またはそれに対する耐性を含む、免疫細胞の機能的能力の測定（抗ＣＤ３抗体、抗Ｔ細胞受容体抗体、抗ＣＤ２８抗体、カルシウムイオノフォア、ペプチドまたはタンパク質抗原がロードされたＰＭＡ（ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート）抗原提示細胞での刺激後の３Ｈ－チミジン取り込みに基づく、Ｔ細胞増殖アッセイおよびペプスキャン分析、Ｂ細胞増殖アッセイを使用するなど）；他の細胞を死滅させるか、または溶解する能力の測定（細胞傷害性Ｔ細胞アッセイなど）；サイトカイン、ケモカイン、細胞表面分子、抗体、および他の細胞産物の測定（例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ、ウェスタンブロット分析、タンパク質マイクロアレイ分析、免疫沈降分析による）；免疫細胞または免疫細胞内のシグナル伝達経路の活性化の生化学的マーカーの測定（例えば、チロシン、セリン、またはトレオニンリン酸化のウェスタンブロットおよび免疫沈降分析、ポリペプチド切断、ならびにタンパク質複合体の形成または解離；タンパク質アレイ分析；ＤＮＡアレイまたはサブトラクティブハイブリダイザーションを使用したＤＮＡ転写プロファイリング）；アポトーシス、壊死、または他の機構による細胞死の測定（例えば、アネキシンＶ染色、ＴＵＮＥＬアッセイ、ＤＮＡラダーを測定するためのゲル電気泳動、組織学；蛍光発生カスパーゼアッセイ、カスパーゼ基質のウェスタンブロット分析）；免疫細胞によって産生された遺伝子、タンパク質、および他の分子の測定（例えば、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、二次元ゲル電気泳動、ウェスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着アッセイ、フローサイトメトリー）；ならびに例えば、再発率または疾患重症度を測定することによる自己タンパク質または自己ポリペプチドを伴う自己免疫疾患、神経変性疾患、および他の疾患の改善などの臨床症状または転帰の測定（臨床スコア、追加の療法の使用についての必要条件、機能状態、画像研究）が挙げられるが、これらに限定されない。

提供されるＰＤ－１結合ポリペプチドはまた、様々な診断用および予防用製剤でも有用である。一実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドは、前述の障害の１つ以上を発症するリスクがある患者に投与される。障害の１つ以上に対する患者または器官の素因は、遺伝子型マーカー、血清学的マーカー、または生化学的マーカーを使用して決定され得る。

本開示の別の実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドまたは操作された細胞は、前述の障害の１つ以上に関連する臨床的適応症と診断されたヒト個体に投与される。診断時、そのような治療薬は、臨床的適応症の影響を軽減または逆転するために投与される。

併用療法
本開示のＰＤ－１結合ポリペプチドまたは操作された細胞は、単独で、または他の抗癌剤などの他の治療様式と組み合わせて投与され得る。これらは、他の治療様式の前、それと実質的に同時、または後に提供され得る（すなわち、同時または連続的に）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法は、以下を施すことをさらに含むことができる：放射線療法、化学療法、ワクチン接種、標的腫瘍療法、ＣＡＲ－Ｔ療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、癌免疫療法、サイトカイン療法、外科的切除、クロマチン修飾、アブレーション、凍結療法、腫瘍標的に対するアンチセンス剤、腫瘍標的に対するｓｉＲＮＡ剤、腫瘍標的に対するマイクロＲＮＡ剤もしくは抗癌剤／抗腫瘍剤、または抗体、サイトカイン、もしくは受容体細胞外ドメイン－Ｆｃ融合体などの生物製剤。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１結合ポリペプチドは、１つ以上の化学療法薬、ＣＡＲ－Ｔ（キメラ抗原受容体Ｔ細胞）療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、サイトカイン療法、および／またはＶＩＳＴＡ、ｇｐＮＭＢ、Ｂ７Ｈ４、ＨＨＬＡ２、ＣＤ７３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴなどの他のチェックポイント分子を標的とする薬剤と同時に与えられる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＤ－１結合ポリペプチドまたは操作された細胞は、抗ＨＥＲ－２抗体、抗ＣＤ２０抗体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）拮抗薬（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、血小板由来成長因子阻害剤（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（イマチニブメシル酸塩））、ＣＯＸ－２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、ＣＴＬＡ４阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ抗体イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）））、ＰＤ－１阻害剤（例えば、抗ＰＤ１抗体、ＢＭＳ－９３６５５８）、ＰＤＬ１阻害剤（例えば、抗ＰＤＬ１抗体、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、ＰＤＬ２阻害剤（例えば、抗ＰＤＬ２抗体）、サイトカイン、以下の標的：ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＰＤ－１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ４、またはＶＥＧＦ受容体（複数可）の１つ以上に結合する拮抗薬（例えば、中和抗体）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、および他の生物活性および有機化学剤など、他の抗腫瘍剤と組み合わされて使用される。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＰＤ－１結合ポリペプチドまたは操作された細胞は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法と同時に与えられる。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法の例としては、ニボルマブ（ＢＭＳ）、ピジリズマブ（ＣｕｒｅＴｅｃｈ、ＣＴ－０１１）、ペムブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ）、デュルバルマブ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、アテゾリズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、アベルマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＡＭＰ－２２４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）、ＢＭＳ－９３６５５９、ＡＭＰ－５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）、ＭＤＸ－１１０５（Ｍｅｒｃｋ）、ＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ／ＡｎａｐｔｙｓＢｉｏ、ＡＮＢ－０１１）、ＳＴＩ－Ａ１０１０（ＳｏｒｒｅｎｔｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＳＴＩ－Ａ１１１０（ＳｏｒｒｅｎｔｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、およびプログラム死－１（ＰＤ－１）またはプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に向けられる他の薬剤が挙げられる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＤ－１結合ポリペプチドまたは操作された細胞は、化学療法薬として使用され得る。化学療法薬の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；窒素マスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニンヌスチン；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，ＣｈｅｍＩｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３－１８６（１９９４）を参照）；ジネマイシンＡを含むジネマイシン；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベンメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エリプチニウムアセテート；エポチロン；エトグルシド；ガリウムニトレート；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ－ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、パクリタキセルのＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）クレモフォール無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤（ＡｍｅｒｉｃａｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ－ＰｏｕｌｅｎｃＲｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナ類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ－１１）（５－ＦＵおよびロイコボリンを用いたイリノテカンの治療レジメを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン治療レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含むオキサリプラチン；細胞増殖を低減するＰＫＣ－アルファ、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、ＥＧＦＲ（例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）））およびＶＥＧＦ－Ａの阻害剤、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

さらなる非限定的な例示的な化学療法薬としては、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；例えば、４（５）－イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）メゲストロールアセテート、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、フォルメスタニー、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールなどの、副腎におけるエストロゲン産生を調整する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害薬；ならびに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；ならびにトロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に例えば、ＰＫＣ－アルファ、Ｒａｌｆ、およびＨ－Ｒａｓなど、異常な細胞増殖（ａｂｈｅｒａｎｔｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に関与しているシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの；リボザイム、例えば、ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）、およびＨＥＲ２発現阻害剤；ワクチン、例えば、遺伝子療法ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）（アルデスロイキン）ｒＩＬ－２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ＧｎＲＨアゴニスト；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含む、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）など、癌に対するホルモン作用を制御または阻害する抗ホルモン剤が挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドおよび追加の薬剤は、単一の治療用組成物に製剤化され、ＰＤ－１結合ポリペプチドおよび追加の薬剤は、同時に投与される。代替的に、ＰＤ－１結合ポリペプチドもしくは操作された細胞および追加の薬剤は、互いに分離しており、例えば、各々は、別個の治療用組成物に製剤化され、ＰＤ－１結合ポリペプチドもしくは操作された細胞および追加の薬剤は、同時に投与されるか、またはＰＤ－１結合ポリペプチドもしくは操作された細胞および追加の薬剤は、治療レジメン中の異なる時間に投与される。例えば、ＰＤ－１結合ポリペプチドもしくは操作された細胞は、追加の薬剤の投与前に投与されるか、ＰＤ－１結合ポリペプチドもしくは操作された細胞は、追加の薬剤の投与後に投与されるか、またはＰＤ－１結合ポリペプチドもしくは操作された細胞および追加の薬剤は、交互に投与される。ＰＤ－１結合ポリペプチドおよび追加の薬剤は、単回用量または複数回用量で投与されてもよい。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドまたは操作された細胞および追加の薬剤（複数可）は、同時に投与される。例えば、ＰＤ－１結合ポリペプチドおよび追加の薬剤（複数可）は、単一の組成物に製剤化されてもよく、または２つ以上の別個の組成物として投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合ポリペプチドもしくは操作された細胞および追加の薬剤（複数可）は、連続的に投与されるか、またはＰＤ－１結合ポリペプチドもしくは操作された細胞および追加の薬剤は、治療レジメン中の異なる時間に投与される。

ＶＩＩ．例示的な実施形態
特に以下の実施形態が提供される。

１．ＰＤ－１に特異的に結合する少なくとも１つの重鎖のみの可変ドメイン（ＰＤ－１ＶＨＨドメイン）と、ＰＤ－１以外の標的に結合する１つ以上の追加の結合ドメインと、を含む、ＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２．少なくとも１つのＶＨＨドメインが、配列番号２６８、２７２、２７３、および３１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号２７８または３１４に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号２８３または３１５に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、実施形態１に記載のＰＤ－１結合構築物。

３．配列番号２６８、２７２、２７３、および３１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号２７８または３１４に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号２８３に記載される選択されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、少なくとも１つの重鎖のみの可変ドメイン（ＰＤ－１ＶＨＨドメイン）を含む、ＰＤ－１結合構築物。

４．ＰＤ－１が、ヒトＰＤ－１である、実施形態１～３のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

５．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、ヒト化である、実施形態１～４のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

６．１つ以上の追加の結合ドメインが、免疫細胞上の活性化受容体に結合する、実施形態１、２、４、および５のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

７．免疫細胞が、Ｔ細胞である、実施形態６に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

８．活性化受容体が、ＣＤ３（ＣＤ３ε）である、実施形態６または実施形態７に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

９．ＰＤ－１およびＣＤ３に対して二重特異性である、実施形態８に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

１０．免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態９に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

１１．活性化受容体が、ＣＤ１６（ＣＤ１６ａ）である、実施形態６または実施形態１０に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

１２．ＰＤ－１およびＣＤ１６ａに対して二重特異性である、実施形態１１に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

１３．１つ以上の追加のドメインが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する、実施形態１、２、４、および５のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

１４．１つ以上の追加の結合ドメインが、サイトカイン受容体に結合する、実施形態１、２、４、および５のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

１５．１つ以上の追加の結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片を含む、実施形態１、２、および４～１４のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

１６．１つ以上の追加の結合ドメインが、一価である、実施形態１、２、および４～１５のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

１７．抗体またはその抗原結合断片が、Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＮＡＲ、またはＶＨＨである、実施形態１６に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

１８．１つ以上の追加の結合ドメインが、サイトカインであるか、またはサイトカイン受容体に結合することが可能なその切断断片もしくはバリアントである、実施形態１４に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

１９．サイトカインが、Ｉ型インターフェロンもしくはＩＩ型インターフェロンであるインターフェロンであるか、Ｉ型インターフェロンの切断断片もしくはバリアントであるか、またはＩＩ型インターフェロンの切断断片もしくはバリアントである、実施形態１８に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２０．Ｉ型インターフェロンが、ＩＦＮ－アルファもしくはＩＦＮ－ベータであるか、またはその切断断片もしくはバリアントであるか、または
ＩＩ型インターフェロンが、ＩＦＮ－ガンマであるか、またはその切断断片もしくはバリアントである、実施形態１９に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２１．ポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃ領域を含む、実施形態１～２０のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２２．ポリペプチドが、少なくとも１つの単一ドメイン抗体および１つ以上の追加の結合ドメインを連結する免疫グロブリンＦｃ領域を含む、実施形態１、２、および４～２１のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２３．二量体である、実施形態１～２２のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２４．Ｆｃ領域が、ホモ二量体Ｆｃ領域である、実施形態２１～２３のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２５．Ｆｃ領域が、配列番号８、１０、１１、１２、もしくは１３のいずれかに記載されるアミノ酸の配列、または配列番号８、１０、１１、１２、もしくは１３のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、実施形態２１～２４のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２６．Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１である、実施形態２１～２４のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２７．Ｆｃ領域が、配列番号８に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、実施形態２６に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２８．Ｆｃ領域が、ヘテロ二量体Ｆｃ領域である、実施形態２１～２３のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２９．Ｆｃ領域が、エフェクター機能を示す、実施形態２１～２８のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

３０．Ｆｃ領域が、エフェクター機能を低減し、かつ／またはＦｃガンマ受容体もしくはＣ１ｑから選択されるエフェクター分子への結合を低減する、１つ以上のアミノ酸修飾を含むポリペプチドを含む、実施形態２１～２９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

３１．１つ以上のアミノ酸修飾が、Ｇｌｕ２３３、Ｌｅｕ２３４、またはＬｅｕ２３５のうちの１つ以上の欠失である、実施形態３０に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

３２．Ｆｃ領域が、配列番号９に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、実施形態３０または実施形態３１に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

３３．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５１～２６７もしくは２８４のいずれかに記載される配列、または配列番号２５１～２６７もしくは２８４のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３２のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

３４．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、（ｉ）配列番号２８４に記載される配列、（ｉｉ）配列番号２８４のヒト化バリアント、または（ｉｉｉ）配列番号２８４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３３のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

３５．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２８４に記載される配列を含む、実施形態１～３４のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

３６．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６８、２７２、および２７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号２７８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号２８３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む、実施形態１～３４のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド。

３７．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、それぞれ配列番号２６８、２７８、および２８３、それぞれ配列番号２７２、２７８、および２８３、またはそれぞれ配列番号２７３、２７８、および２８３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、実施形態１～３４および３６のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

３８．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５１～２６７のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５１～２６７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４、３６、および３７のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

３９．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５１～２６７のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列を含む、実施形態１～３４および３６～３８に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

４０．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５７に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

４１．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５７に記載されるアミノ酸の配列を含む、実施形態１～３４および３６～４０のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

４２．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５１に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

４３．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５２に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

４４．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５３に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

４５．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５４に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

４６．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５５に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

４７．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５６に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

４８．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５８に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

４９．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５９に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

５０．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６０に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６０と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

５１．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６１に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

５２．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６２に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

５３．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６３に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

５４．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６４に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

５５．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６５に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

５６．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６６に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

５７．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６７に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

５８．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、または２８４と少なくとも９５％の配列同一性を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

５９．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、または２８４に記載される、実施形態１～３４および３６～３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

６０．（ａ）第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む第１の構成成分と、（ｂ）可変重鎖領域（ＶＨ）および可変軽鎖領域（ＶＬ）を含む抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片を含む第２の構成成分と、を含む、多重特異性ポリペプチド構築物であって、
抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片を含むＶＨおよびＶＬが、ヘテロ二量体Ｆｃの反対側のポリペプチドに連結され、
第１および第２の構成成分が、リンカーによって連結され、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、抗ＣＤ３抗体のＮ末端に位置付けられ、
第１および第２の構成成分のうちの一方または両方が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含み、
第１および第２の構成成分のうちの一方または両方が、少なくとも１つの重鎖のみの可変ドメイン（ＰＤ－１ＶＨＨドメイン）を含む、多重特異性ポリペプチド構築物。

６１．多重特異性ポリペプチド構築物が、少なくとも（ｉ）ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第１のＦｃポリペプチド、リンカー、および抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片のＶＨまたはＶＬドメインを含む第１のポリペプチドと、（ｉｉ）ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第２のＦｃポリペプチド、リンカー、任意選択的に第１のポリペプチド中に存在するのと同じリンカー、および抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片のＶＨまたはＶＬドメインのうちの他方を含む第２のポリペプチドと、を含み、
第１および第２のポリペプチドのうちの一方または両方が独立して、ＴＡＡに結合する少なくとも１つの抗原結合ドメイン、および少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインを含む、実施形態６０に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

６２．ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第１および第２のＦｃポリペプチドのうちの一方または両方が、ホモ二量体Ｆｃ領域のポリペプチドと比較して、任意選択的に配列番号２４５に記載されるＦｃポリペプチドまたはその免疫学的に活性な断片と比較して、ヘテロ二量体化を誘発する少なくとも１つの修飾を含む、実施形態６０または実施形態６１に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

６３．ヘテロ二量体Ｆｃの第１および第２のＦｃポリペプチドの各々が独立して、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、実施形態６２に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

６４．ヘテロ二量体Ｆｃの第１および第２のＦｃポリペプチドの各々が、ノブイントゥホール修飾を含むか、またはポリペプチドの静電的相補性を増加させるための電荷変異を含む、実施形態６３に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

６５．アミノ酸修飾が、ノブイントゥホール修飾である、実施形態６４に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

６６．ヘテロ二量体Ｆｃの第１のＦｃポリペプチドが、Ｔｈｒ３６６Ｓｅｒ、Ｌｅｕ３６８Ａｌａ、Ｔｙｒ４０７Ｖａｌ、およびそれらの組み合わせの中から選択される修飾を含み、ヘテロ二量体Ｆｃの第２のＦｃポリペプチドが、修飾Ｔｈｒ３６６Ｔｒｐを含む、実施形態６０～６５のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

６７．第１および第２のＦｃポリペプチドが、システイン残基への非システイン残基の修飾をさらに含み、第１のポリペプチドの修飾が、位置Ｓｅｒ３５４およびＴｙｒ３４９のうちの一方であり、第２のＦｃポリペプチドの修飾が、位置Ｓｅｒ３５４およびＴｙｒ３４９のうちの他方である、実施形態６６に記載の多重特異性ポリペプチド。

６８．アミノ酸修飾が、ポリペプチドの静電的相補性を増加させるための電荷変異である、実施形態６０～６４のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

６９．第１および／もしくは第２のＦｃポリペプチド、または第１および第２のＦｃポリペプチドの各々が、相補的な位置の修飾を含み、修飾が、他方のポリペプチドの相補的アミノ酸と反対の電荷を有するアミノ酸での置き換えである、実施形態６０～６４および６８のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

７０．ヘテロ二量体Ｆｃの第１または第２のＦｃポリペプチドのうちの１つが、残基Ｉｌｅ２５３での修飾をさらに含む、実施形態６０～６９のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

７１．修飾が、Ｉｌｅ２５３Ａｒｇである、実施形態７０に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

７２．ヘテロ二量体Ｆｃの第１または第２のＦｃポリペプチドのうちの１つが、残基Ｈｉｓ４３５での修飾をさらに含む、実施形態６０～７１のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

７３．修飾が、Ｈｉｓ４３５Ａｒｇである、実施形態７２に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

７４．Ｆｃ領域が、Ｌｙｓ４４７を欠くポリペプチドを含む、実施形態６０～７３のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

７５．Ｆｃ領域が、ＦｃＲｎ結合を強化するための少なくとも１つの修飾を含むポリペプチドを含む、実施形態６０～７４のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

７６．修飾が、Ｍｅｔ２５２、Ｓｅｒ２５４、Ｔｈｒ２５６、Ｍｅｔ４２８、Ａｓｎ４３４、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される位置である、実施形態７５に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

７７．修飾が、Ｍｅｔ２５２Ｙ、Ｓｅｒ２５４Ｔ、Ｔｈｒ２５６Ｅ、Ｍｅｔ４２８Ｌ、Ｍｅｔ４２８Ｖ、Ａｓｎ４３４Ｓ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される位置である、実施形態７６に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

７８．修飾が、位置Ｍｅｔ２５２および位置Ｍｅｔ４２８である、実施形態７６に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

７９．修飾が、Ｍｅｔ２５２ＹおよびＭｅｔ４２８Ｌである、実施形態７８に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

８０．修飾が、Ｍｅｔ２５２ＹおよびＭｅｔ４２８Ｖである、実施形態７６に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

８１．ヘテロ二量体Ｆｃの第１のポリペプチドが、配列番号１０３、１０７、１１５、または１１７のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Ｆｃの第２のポリペプチドが、配列番号１０４、１０８、１１１、１１３、１１９、または１２１のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含む、実施形態６０～８０のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

８２．Ｆｃ領域が、エフェクター機能を低減し、かつ／またはＦｃガンマ受容体もしくはＣ１ｑから選択されるエフェクター分子への結合を低減する、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むポリペプチドを含む、実施形態１～８１のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

８３．１つ以上のアミノ酸修飾が、Ｇｌｕ２３３、Ｌｅｕ２３４、またはＬｅｕ２３５のうちの１つ以上の欠失である、実施形態８２に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

８４．ヘテロ二量体Ｆｃの第１のポリペプチドが、配列番号１０５、１０９、１１６、または１１８のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Ｆｃの第２のポリペプチドが、配列番号１０６、１１０、１１２、１１４、１２０、または１２２のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を含む、実施形態６０～８３のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

８５．抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片が、一価である、実施形態６０～８４のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

８６．抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片が、単鎖抗体ではなく、任意選択的に単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ではない、実施形態６０～８５のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

８７．抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片が、Ｆｖ抗体断片である、実施形態６０～８６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

８８．Ｆｖ抗体断片が、ジスルフィド安定化抗ＣＤ３結合Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）を含む、実施形態８７に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

８９．抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片が、アミノ酸配列ＴＹＡＭＮ（配列番号２９）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号３０）を含むＶＨＣＤ２、アミノ酸配列ＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号３１）を含むＶＨＣＤＲ３、アミノ酸配列ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号３２）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号３３）を含むＶＬＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号３４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む、６０～８８の多重特異性ポリペプチド構築物。

９０．抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片が、
配列番号３５～６５のいずれかのアミノ酸配列、または配列番号３５～６５のいずれかと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示す配列を有するＶＨと、
配列番号６６～８５および２９３のいずれかのアミノ酸配列、または配列番号６６～８５および２９３のいずれかと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示す配列を有するＶＬと、を有する、実施形態６０～８９のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

９１．抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片が、配列番号４７のアミノ酸配列および配列番号７５のアミノ酸配列を含む、実施形態６０～９０のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

９２．抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片が、配列番号４７のアミノ酸配列および配列番号２８５のアミノ酸配列を含む、実施形態６０～９０のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

９３．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、Ｆｃ領域に対してアミノ末端に、かつ／または多重特異性ポリペプチド構築物のＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられる、実施形態６０～９２のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

９４．第１のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端への順序で、ＴＡＡに結合する第１の抗原結合ドメイン、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド、リンカー、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片のＶＨまたはＶＬドメイン、およびＴＡＡに結合する第２の抗原結合ドメインを含み、
第２のポリペプチドが、少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインを含み、Ｎ末端からＣ末端への順序で、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第２のＦｃポリペプチド、リンカー、任意選択的に、第１のポリペプチド中に存在するのと同じリンカー、および抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片のＶＨまたはＶＬドメインのうちの他方を含み、少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、Ｆｃ領域に対してアミノ末端に、かつ／またはＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられる、実施形態６０～９３のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

９５．多重特異性ポリペプチド構築物が、ＰＤ－１に特異的に結合する１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインのみを含む、実施形態６０～９４のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

９６．ＰＤ－１ＶＨＨドメインが、多重特異性構築物のＦｃ領域に対してアミノ末端に位置付けられる、実施形態６０～９５のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

９７．第１のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端への順序で、ＴＡＡに結合する第１の抗原結合ドメイン、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド、リンカー、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片のＶＨまたはＶＬドメイン、およびＴＡＡに結合する第２の抗原結合ドメインを含み、
第２のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端への順序で、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第２のＦｃポリペプチド、リンカー、任意選択的に、第１のポリペプチド中に存在するのと同じリンカー、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片のＶＨまたはＶＬドメインのうちの他方、およびＰＤ－１ＶＨＨドメインを含む、実施形態６０～９６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

９８．ＰＤ－１ＶＨＨドメインが、多重特異性構築物のＦｃ領域に対してアミノ末端に位置付けられる、実施形態６０～９５のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

９９．第１のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端への順序で、ＴＡＡに結合する第１の抗原結合ドメイン、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド、リンカー、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片のＶＨまたはＶＬドメイン、およびＴＡＡに結合する第２の抗原結合ドメインを含み、
第２のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端への順序で、ＰＤ－１ＶＨＨドメイン、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第２のＦｃポリペプチド、リンカー、任意選択的に、第１のポリペプチド中に存在するのと同じリンカー、および抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片のＶＨまたはＶＬドメインのうちの他方を含む、実施形態６０～９５および９８のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１００．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５１～２６７もしくは２８４のいずれかに記載される配列、または配列番号２５１～２６７もしくは２８４のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～９９のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１０１．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、（ｉ）配列番号２８４に記載される配列、（ｉｉ）配列番号２８４のヒト化バリアント、または（ｉｉｉ）配列番号２８４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
１０２．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２８４に記載される配列を含む、実施形態６０～１０１のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１０３．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６８、２７２、および２７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号２７８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号２８３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む、実施形態６０～１０１のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１０４．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、それぞれ配列番号２６８、２７８、および２８３、それぞれ配列番号２７２、２７８、および２８３、またはそれぞれ配列番号２７３、２７８、および２８３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、実施形態６０～１００および１０３のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１０５．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５１～２６７のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５１～２６７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００、１０３、および１０４のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１０６．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５１～２６７のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列を含む、実施形態６０～１００および１０３～１０５に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１０７．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５７に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１０８．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５７に記載されるアミノ酸の配列を含む、実施形態６０～１００および１０３～１０７に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１０９．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５１に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

１１０．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５２に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１１１．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５３に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１１２．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５４に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１１３．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５５に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１１４．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５６に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１１５．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５８に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１１６．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５９に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１１７．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６０に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６０と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１１８．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６１に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１１９．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６２に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１２０．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６３に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１２１．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６４に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１２２．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６５に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１２３．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６６に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１２４．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２６７に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１２５．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、または２８４と少なくとも９５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１２６．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、または２８４に記載される、実施形態６０～１００および１０３～１０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１２７．第１および第２の構成成分のうちの一方または両方が、共刺激受容体に結合する少なくとも１つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）を含む、実施形態６０～１２６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１２８．少なくとも１つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）が、Ｆｃ領域に対してアミノ末端に、かつ／または多重特異性ポリペプチド構築物のＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられる、実施形態１２７に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１２９．多重特異性ポリペプチド構築物が、１つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）のみを含む、実施形態１２７または実施形態１２８に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１３０．多重特異性ポリペプチド構築物が、任意選択的に同じであるかまたは異なる２つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）を含む、実施形態１２７～１２９のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１３１．少なくとも１つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）が、共刺激受容体の天然同族結合パートナーの細胞外ドメインもしくはその結合断片、または共刺激受容体への結合活性を示すそのバリアントであるか、またはそれを含む、実施形態１２７～１２９のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１３２．少なくとも１つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、および単一ドメイン軽鎖抗体からなる群から選択される抗体またはその抗原結合断片である、実施形態１２７～１３０のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１３３．抗体またはその抗原結合断片が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＮＡＲ、またはＶＨＨである、実施形態１３２に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１３４．抗体または抗原結合断片が、ｓｄＡｂである、実施形態１１３２または実施形態１３３に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１３５．ｓｄＡｂが、ヒトまたはヒト化ｓｄＡｂである、実施形態１３４に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１３６．少なくとも１つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）が、４１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、膜貫通アクチベーターならびにＣＡＭＬインタラクター（ＴＡＣＩ）、およびＮＫＧ２Ｄの中から選択される共刺激受容体に結合する、実施形態１２７～１３５のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１３７．少なくとも１つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）が、４１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、およびグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）の中から選択される共刺激受容体に結合する、実施形態１２７～１３６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１３８．少なくとも１つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）が、配列番号２１０に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２１０に記載される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有し、４－１ＢＢに結合する配列を含む、実施形態１２７～１３７のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１３９．多重特異性ポリペプチド構築物が、ＴＡＡに結合する第１および第２の抗原結合ドメインを含む、実施形態６０～１３８のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１４０．抗原結合ドメインが、同じ腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する、実施形態１３９に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１４１．第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、同じＴＡＡの異なるエピトープまたは非重複エピトープに結合し、かつ／または同じＴＡＡへの結合を競合する、実施形態１３９または実施形態１４９に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１４２．第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、異なるＴＡＡに結合する、実施形態１３９に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１４３．１つの抗原結合ドメインが、Ｆｃ領域に対してアミノ末端に位置付けられ、１つの抗原結合ドメインが、ＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられる、実施形態１３９～１４２のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１４４．ＴＡＡに結合する抗原結合ドメイン、またはＴＡＡに結合する抗原結合ドメインの各々が独立して、ＴＡＡの天然同族結合パートナーの細胞外ドメインもしくはその結合断片、またはＴＡＡへの結合活性を示すそのバリアントを含む、実施形態６０～１４３のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１４５．ＴＡＡに結合する抗原結合ドメイン、またはＴＡＡに結合する抗原結合ドメインの各々が独立して、抗体またはその抗原結合断片である、実施形態６０～１４３のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１４６．抗体またはその抗原結合断片が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＮＡＲ、またはＶＨＨである、実施形態１４５に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１４７．抗体または抗原結合断片が、ｓｄＡｂである、実施形態１４５または実施形態１４６に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１４８．ｓｄＡｂが、ヒトまたはヒト化ｓｄＡｂである、実施形態１４７に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１４９．抗原結合ドメイン、または抗原結合ドメインの各々が独立して、１－９２－ＬＦＡ－３、５Ｔ４、アルファ－４インテグリン、アルファ－Ｖインテグリン、アルファ４ベータ１インテグリン、アルファ４ベータ７インテグリン、ＡＧＲ２、抗Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、アペリンＪ受容体、ＡＰＲＩＬ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＡＦＦ、ＢＴＬＡ、Ｃ５補体、Ｃ－２４２、ＣＡ９、ＣＡ１９－９、（Ｌｅｗｉｓａ）、炭酸脱水酵素９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３２、（ＩＬ－２ＲＧ）、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１７２Ａ、ＣＤ２４８、ＣＤＨ６、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ－９０）、ＣＬＡＵＤＩＮ－３、ＣＬＡＵＤＩＮ－４、ｃＭｅｔ、コラーゲン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＳＦＲ、ＣＳＦＲ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＹＲ６１、ＤＬ４４、ＤＬＫ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、ＤＰＰ－４、ＤＳＧ１、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ３、ＲＳＶのＦタンパク質、ＦＡＰ、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ８、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ－３、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）、ＧＡＬ３ＳＴ１、Ｇ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦＲ、ＧＤ２、ＧＩＴＲ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、Ｇｐ１３０、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＧＰＮＭＢ、ＧＲＰ７８、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＧＦ、ｈＧＨ、ＨＶＥＭ、ヒアルロニダーゼ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒベータ１、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２３、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７／ＩＬ２７Ｒ（ｗｓｘ１）、ＩＬ２９、ＩＬ－３１Ｒ、ＩＬ３１／ＩＬ３１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、インスリン受容体、Ｊａｇｇｅｄリガンド、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、ＫＩＳＳ１－Ｒ、ＬＡＧ－３、ＬＩＦ－Ｒ、ＬｅｗｉｓＸ、ＬＩＧＨＴ、ＬＲＰ４、ＬＲＲＣ２６、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ、ＬｙＰＤ１、ＭＣＳＰ、メソテリン、ＭＲＰ４、ＭＵＣ１、ムチン－１６（ＭＵＣ１６、ＣＡ－１２５）、Ｎａ／ＫＡＴＰａｓｅ、ＮＧＦ、ニカストリン、Ｎｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、ＮＯＶ、ＯＳＭ－Ｒ、ＯＸ－４０、ＰＡＲ２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦＲアルファ、ＰＤＧＦＲベータ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ホスファチジル－セリン、Ｐ１ＧＦ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ、ＲＡＡＧ１２、ＲＡＧＥ、ＳＬＣ４４Ａ４、スフィンゴシン１リン酸、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＡＰＡ１、ＴＥＭ－８、ＴＧＦベータ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＭＥＭ３１、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＲ、ＴＮＦＲＳ１２Ａ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、ＴＲＫ－Ａ、ＴＲＫ－Ｂ、ｕＰＡＲ、ＶＡＰ１、ＶＣＡＭ－１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＷＩＳＰ－１、ＷＩＳＰ－２、およびＷＩＳＰ－３の中から選択される腫瘍抗原に結合する、実施形態６０～１４８のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１５０．第１のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端への順序で、ＴＡＡに結合する第１の抗原結合ドメイン、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド、リンカー、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片のＶＨまたはＶＬドメイン、およびＴＡＡに結合する第２の抗原結合ドメインを含み、
第２のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端への順序で、ＰＤ－１ＶＨＨドメインまたはＣＲＢＲのうちの１つ、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第２のＦｃポリペプチド、リンカー、任意選択的に、第１のポリペプチド中に存在するのと同じリンカー、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片のＶＨまたはＶＬドメインのうちの他方、およびＰＤ－１ＶＨＨドメインまたはＣＲＢＲのうちの他方を含む、実施形態１３９～１４９のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１５１．リンカーが、ペプチドまたはポリペプチドリンカーであり、任意選択的にリンカーが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長である、実施形態６０～１５０のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１５２．リンカーが、切断不可能なリンカーである、実施形態６０～１５１のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１５３．切断不可能なリンカーが、ＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２５）、ＧＧＧＧＧＳ（配列番号１２６）、およびそれらの組み合わせを含む、実施形態１５２に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１５４．リンカーが、配列ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号１２７）であるか、またはそれを含む、実施形態６０～１５３のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１５５．リンカーが、切断可能なリンカーである、実施形態６０～１５１のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１５６．切断可能なリンカーが、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、実施形態１５５に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１５７．プロテアーゼが、免疫エフェクター細胞、腫瘍、または腫瘍微小環境中に存在する細胞によって産生される、実施形態１５６に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１５８．プロテアーゼが、免疫エフェクター細胞によって産生され、免疫エフェクター細胞が、活性化Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはＮＫＴ細胞である、実施形態１５６または実施形態１５７に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１５９．プロテアーゼが、マトリプターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、グランザイムＢ、およびそれらの組み合わせから選択される、実施形態１５６～１５８のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１６０．プロテアーゼが、グランザイムＢである、実施形態１５９に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１６１．切断可能なリンカーが、アミノ酸配列

（配列番号１７１）を含む、実施形態１５６～１６０のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

１６２．配列番号２６８、２７２、および２７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号２７８に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号２８３に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、ＰＤ－１に結合する単離された単一ドメイン抗体。

１６３．配列番号２５１～２６７もしくは２８４のいずれかに記載されるアミノ酸配列、または配列番号２５１～２６７もしくは２８４のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２に記載の単離された単一ドメイン抗体。

１６４．単一ドメイン抗体が、（ｉ）配列番号２８４に記載される配列、（ｉｉ）配列番号２８４のヒト化バリアント、または（ｉｉｉ）配列番号２８４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２または実施形態１６３に記載の単離された単一ドメイン抗体。

１６５．ｓｄＡｂが、配列番号２８４に記載される配列を含む、実施形態１６２～１６４のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１６６．ｓｄＡｂが、配列番号２６８、２７２、および２７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号２７８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号２８３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む、実施形態１６２～１６４のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１６７．ｓｄＡｂが、それぞれ配列番号２６８、２７８、および２８３、それぞれ配列番号２７２、２７８、および２８３、またはそれぞれ配列番号２７３、２７８、および２８３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、実施形態１６２～１６４のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１６８．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２５１～２６７のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５１～２６７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４、１６６、および１６７のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１６９．ｓｄＡｂが、配列番号２５１～２６７のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列を含む、実施形態１６２～１６４および１６６～１６８のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１７０．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２５７に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１７１．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２５７に記載されるアミノ酸の配列を含む、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１７２．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２５１に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１７３．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２５２に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１７４．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２５３に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１７５．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２５４に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１７６．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２５５に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１７７．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２５６に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１７８．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２５８に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１７９．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２５９に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２５９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１８０．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２６０に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６０と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１８１．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２６１に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１８２．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２６２に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１８３．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２６３に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１８４．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２６４に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１８５．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２６５に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１８６．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２６６に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかの実施形態に記載の単離された単一ドメイン抗体。

１８７．少なくとも１つのＰＤ－１ｓｄＡｂが、配列番号２６７に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２６７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１８８．ｓｄＡｂが、配列番号２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、または２８４に記載されるアミノ酸の配列を含む、実施形態１６２～１６４および１６６～１６９のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

１８９．実施形態１～５９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド（複数可）。

１９０．実施形態６０～１６１のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物をコードする、ポリヌクレオチド（複数可）。

１９１．実施形態６０～１６１のいずれかに記載の多重特異性構築物の第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、多重特異性構築物の第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列と、を含む、ポリヌクレオチドであって、第１および第２の核酸配列が、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸によって分離される、ポリヌクレオチド。

１９２．第１の核酸配列および第２の核酸配列が、同じプロモータに作動可能に連結される、実施形態１９１に記載のポリヌクレオチド。

１９３．自己切断ペプチドまたはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸が、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａから選択される、実施形態１９２に記載のポリヌクレオチド。

１９４．実施形態１６２～１８８のいずれかに記載の単一ドメイン抗体をコードする、ポリヌクレオチド。

１９５．実施形態１８９～１９４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

１９６．発現ベクターである、実施形態１９５に記載のベクター。

１９７．ウイルスベクターまたは真核ベクターであり、任意選択的に、真核ベクターが哺乳動物ベクターである、実施形態１９５または実施形態１９６に記載のベクター。

１９８．実施形態１８９～１９４のいずれかに記載のポリヌクレオチド（複数可）、または実施形態１９５～１９７のいずれかに記載のベクター（複数可）を含む、細胞。

１９９．細胞が、組み換えまたは単離である、実施形態１９８に記載の細胞。

２００．細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態１９９に記載の細胞。

２０１．ポリペプチドを産生する方法であって、細胞に、実施形態１８９～１９４のいずれかに記載のポリヌクレオチド（複数可）、または実施形態１９５～１９７に記載のベクター（複数可）を導入することと、多重特異性ポリペプチド構築物を産生するための条件下で細胞を培養することと、を含む、方法。

２０２．細胞からポリペプチドを単離または精製することをさらに含む、実施形態２０１に記載の方法。

２０３．実施形態２０１または実施形態２０２に記載の方法によって産生される、ポリペプチド。

２０４．実施形態１～５９のいずれかに記載の結合分子または実施形態１６２～１８８のいずれかに記載の単一ドメイン抗体を含む結合分子を含む、操作された免疫細胞であって、任意選択的に、結合分子が、細胞から分泌可能である、操作された免疫細胞。

２０５．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む、実施形態２０４に記載の操作された細胞。

２０６．細胞が、リンパ球である、実施形態２０４または実施形態２０５に記載の操作された免疫細胞。

２０７．細胞が、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態２０５または２０６に記載の操作された免疫細胞。

２０８．ＣＡＲが、ＴＡＡに結合する抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態２０５～２０７のいずれかに記載の操作された免疫細胞。

２０９．細胞内シグナル伝達ドメインが、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）シグナル伝達ドメインを含み、任意選択的に、細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、任意選択的にヒトＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む、実施形態２０８に記載の操作された免疫細胞。

２１０．細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激分子のシグナル伝達ドメインをさらに含む、実施形態２０９に記載の操作された免疫細胞。

２１１．実施形態１～５９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド、実施形態６０～１６１のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物、実施形態１６２～１８８のいずれかに記載の単一ドメイン抗体、または実施形態２０４～２１０のいずれかに記載の操作された免疫細胞を含む、医薬組成物。

２１２．薬学的に許容される担体を含む、実施形態２１１に記載の医薬組成物。

２１３．滅菌されている、実施形態２１１または実施形態２１２に記載の医薬組成物。

２１４．対象における免疫応答を刺激または誘発する方法であって、それを必要とする対象に、実施形態１～５９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド、実施形態６０～１６１のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物、実施形態１６２～１８８のいずれかに記載の単一ドメイン抗体、または実施形態２０４～２１０のいずれかに記載の操作された免疫細胞、または実施形態２１１～２１３に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

２１５．免疫応答が、腫瘍または癌、任意選択的にＰＤ－１を発現する腫瘍または癌に対して増加する、実施形態２１４に記載の方法。

２１６．方法が、対象における疾患または状態を治療する、実施形態２１４または実施形態２１５に記載の方法。

２１７．対象における疾患または状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の実施形態１～５９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド、実施形態６０～１６１のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物、実施形態１６２～１８８のいずれかに記載の単一ドメイン抗体、または実施形態２０４～２１０のいずれかに記載の操作された免疫細胞、または実施形態２１１～２１３に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

２１８．疾患または状態が、腫瘍または癌である、実施形態２１６または実施形態２１７に記載の方法。

２１９．当該対象が、ヒトである、実施形態２１４～２１８のいずれかに記載の方法。

２２０．少なくとも１つのＶＨＨドメインが、配列番号３００に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号３０１に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号３０２に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、実施形態１に記載のＰＤ－１結合構築物。

２２１．少なくとも１つのＶＨＨドメインが、配列番号３０３に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号３０４に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号３０５に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、実施形態１に記載のＰＤ－１結合構築物。

２２２．少なくとも１つのＶＨＨドメインが、配列番号３０６に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号３０７に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号３０８に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、実施形態１に記載のＰＤ－１結合構築物。

２２３．少なくとも１つのＶＨＨドメインが、配列番号３０９に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号３１０に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号３１１に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、実施形態１に記載のＰＤ－１結合構築物。

２２４．配列番号３００に記載される選択されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号３０１に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号３０２に記載される選択されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、少なくとも１つの重鎖のみの可変ドメイン（ＰＤ－１ＶＨＨドメイン）を含む、ＰＤ－１結合構築物。

２２５．配列番号３０３に記載される選択されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号３０４に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号３０５に記載される選択されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、少なくとも１つの重鎖のみの可変ドメイン（ＰＤ－１ＶＨＨドメイン）を含む、ＰＤ－１結合構築物。

２２６．配列番号３０６に記載される選択されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号３０７に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号３０８に記載される選択されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、少なくとも１つの重鎖のみの可変ドメイン（ＰＤ－１ＶＨＨドメイン）を含む、ＰＤ－１結合構築物。

２２７．配列番号３０９に記載される選択されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号３１０に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号３１１に記載される選択されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、少なくとも１つの重鎖のみの可変ドメイン（ＰＤ－１ＶＨＨドメイン）を含む、ＰＤ－１結合構築物。

２２８．ＰＤ－１が、ヒトＰＤ－１である、実施形態２２０～２２７のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２２９．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、ヒト化である、実施形態２２０～２２８のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２３０．１つ以上の追加の結合ドメインが、免疫細胞上の活性化受容体に結合する、実施形態２２０～２２４および２２８～２２９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２３１．免疫細胞が、Ｔ細胞である、実施形態２３０に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２３２．活性化受容体が、ＣＤ３（ＣＤ３ε）である、実施形態２３０または実施形態２３１に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２３３．ＰＤ－１およびＣＤ３に対して二重特異性である、実施形態２３２に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２３４．免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態２３３に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２３５．活性化受容体が、ＣＤ１６（ＣＤ１６ａ）である、実施形態２３０または実施形態２３４に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２３６．ＰＤ－１およびＣＤ１６ａに対して二重特異性である、実施形態２３５に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２３７．１つ以上の追加のドメインが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する、実施形態２２０～２２４および２２８～２２９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２３８．１つ以上の追加の結合ドメインが、サイトカイン受容体に結合する、実施形態２２０～２２４および２２８～２２９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２３９．１つ以上の追加の結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片を含む、実施形態２２０～２２４および２２８～２３８のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２４０．１つ以上の追加の結合ドメインが、一価である、実施形態２２０～２２４および２２８～２３９のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２４１．抗体またはその抗原結合断片が、Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＮＡＲ、またはＶＨＨである、実施形態２４０に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２４２．１つ以上の追加の結合ドメインが、サイトカインであるか、またはサイトカイン受容体に結合することが可能なその切断断片もしくはバリアントである、実施形態２３８に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２４３．サイトカインが、Ｉ型インターフェロンもしくはＩＩ型インターフェロンであるインターフェロンであるか、Ｉ型インターフェロンの切断断片もしくはバリアントであるか、またはＩＩ型インターフェロンの切断断片もしくはバリアントである、実施形態２４２に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２４４．Ｉ型インターフェロンが、ＩＦＮ－アルファもしくはＩＦＮ－ベータであるか、またはその切断断片もしくはバリアントであるか、または
ＩＩ型インターフェロンが、ＩＦＮ－ガンマであるか、またはその切断断片もしくはバリアントである、実施形態２４３に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２４５．ポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃ領域を含む、実施形態２２０～２４４のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２４６．ポリペプチドが、少なくとも１つの単一ドメイン抗体および１つ以上の追加の結合ドメインを連結する免疫グロブリンＦｃ領域を含む、実施形態２２０～２２４および２２８～２４５のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２４７．二量体である、実施形態２２０～２４６のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２４８．Ｆｃ領域が、ホモ二量体Ｆｃ領域である、実施形態２４５～２４７のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２４９．Ｆｃ領域が、配列番号８、１０、１１、１２、もしくは１３のいずれかに記載されるアミノ酸の配列、または配列番号８、１０、１１、１２、もしくは１３のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、実施形態２４５～２４８のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２５０．Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１である、実施形態２４５～２４８のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２５１．Ｆｃ領域が、配列番号８に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、実施形態２５０に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２５２．Ｆｃ領域が、ヘテロ二量体Ｆｃ領域である、実施形態２４５～２４７のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２５３．Ｆｃ領域が、エフェクター機能を示す、実施形態２４５～２５２のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２５４．Ｆｃ領域が、エフェクター機能を低減し、かつ／またはＦｃガンマ受容体もしくはＣ１ｑから選択されるエフェクター分子への結合を低減する、１つ以上のアミノ酸修飾を含むポリペプチドを含む、実施形態２４５～２５３のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２５５．１つ以上のアミノ酸修飾が、Ｇｌｕ２３３、Ｌｅｕ２３４、またはＬｅｕ２３５のうちの１つ以上の欠失である、実施形態２５４に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２５６．Ｆｃ領域が、配列番号９に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、実施形態２５４または実施形態２５５に記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２５７．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２９６～２９９のいずれかに記載される配列、または配列番号２９６～２９９のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態２２０～２５６のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２５８．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、（ｉ）配列番号２９６に記載される配列、（ｉｉ）配列番号２９６のヒト化バリアント、または（ｉｉｉ）配列番号２９６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態２２０～２５７のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２５９．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２９６に記載される配列を含む、実施形態２２０～２５８のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２６０．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号３００に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３０１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３０２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む、実施形態２２０～２５８のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド。

２６１．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、それぞれ配列番号３００、３０１、および３０２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、実施形態２２０～２５８および２６０３６のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２６２．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、（ｉ）配列番号２９７に記載される配列、（ｉｉ）配列番号２９７のヒト化バリアント、または（ｉｉｉ）配列番号２９７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態２２０～２５７のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２６３．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２９７に記載される配列を含む、実施形態２２０～２５７および２６２のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２６４．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号３０３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３０４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３０５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む、実施形態２２０～２５７および２６２のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド。

２６５．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、それぞれ配列番号３０３、３０４、および３０５に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、実施形態２２０～２５７、２６２、および２６４のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２６６．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、（ｉ）配列番号２９８に記載される配列、（ｉｉ）配列番号２９８のヒト化バリアント、または（ｉｉｉ）配列番号２９８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態２２０～２５７のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２６７．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２９７に記載される配列を含む、実施形態２２０～２５７および２６６のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２６８．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号３０６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３０７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３０８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む、実施形態２２０～２５７および２６６のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド。

２６９．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、それぞれ配列番号３０６、３０７、および３０８に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、実施形態２２０～２５７、２６６、および２６８のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２７０．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、（ｉ）配列番号２９９に記載される配列、（ｉｉ）配列番号２９９のヒト化バリアント、または（ｉｉｉ）配列番号２９９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態２２０～２５７のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２７１．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２９９に記載される配列を含む、実施形態２２０～２５７および２７０のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２７２．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号３０９に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３１０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３１１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む、実施形態２２０～２５７および２７０のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド。

２７３．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、それぞれ配列番号３０９、３１０、および３１１に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、実施形態２２０～２５７、２７０、および２７２のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２７４．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２９６～２９９と少なくとも９５％の配列同一性を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態２２０～２５８、２６０～２６２、２６４～２６６、２６８～２７０、および２７２～２７３のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２７５．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２９６～２９９に記載される、実施形態２２０～２５８、２６０～２６２、２６４～２６６、２６８～２７０、および２７２～２７４のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド構築物。

２７６．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２９６～２９９のいずれかに記載される配列、または配列番号２９６～２９９のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～９９のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２７７．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、（ｉ）配列番号２９６に記載される配列、（ｉｉ）配列番号２９６のヒト化バリアント、または（ｉｉｉ）配列番号２９６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～９９または２７６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２７８．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２９６に記載される配列を含む、実施形態６０～９９、２７６、または２７７のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２７９．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号３００に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３０１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３０２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む、実施形態６０～９９、２７６、または２７７のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２８０．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、それぞれ配列番号３００、３０１、および３０２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、実施形態６０～９９、２７６、２７７、または２７９のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２８１．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、（ｉ）配列番号２９７に記載される配列、（ｉｉ）配列番号２９７のヒト化バリアント、または（ｉｉｉ）配列番号２９７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～９９または２７６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２８２．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２９７に記載される配列を含む、実施形態６０～９９、２７６、または２８１のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２８３．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号３０３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３０４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３０５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む、実施形態６０～９９、２７６、または２８１のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２８４．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、それぞれ配列番号３０３、３０４、および３０５に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、実施形態６０～９９、２７６、２８１、または２８３のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２８５．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、（ｉ）配列番号２９８に記載される配列、（ｉｉ）配列番号２９８のヒト化バリアント、または（ｉｉｉ）配列番号２９８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～９９または２７６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２８６．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２９７に記載される配列を含む、実施形態６０～９９、２７６、または２８５のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２８７．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号３０６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３０７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３０８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む、実施形態６０～９９、２７６、または２８５のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２８８．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、それぞれ配列番号３０６、３０７、および３０８に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、実施形態６０～９９、２７６、２８５、または２８７のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２８９．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、（ｉ）配列番号２９９に記載される配列、（ｉｉ）配列番号２９９のヒト化バリアント、または（ｉｉｉ）配列番号２９９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～９９または２７６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２９０．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２９９に記載される配列を含む、実施形態６０～９９、２７６、または２８９のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２９１．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号３０９に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３１０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３１１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む、実施形態６０～９９、２７６、または２８９のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２９２．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、それぞれ配列番号３００、３０１、および３０２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、実施形態６０～９９、２７６、２８９、または２９１のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２９３．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２９６、２９７、２９８、または２９９と少なくとも９５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態６０～９９または２７６～２９２のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２９４．少なくとも１つのＰＤ－１ＶＨＨドメインが、配列番号２９６、２９７、２９８、または２９９に記載される、実施形態６０～９９または２７６～２９２のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２９５．第１および第２の構成成分のうちの一方または両方が、共刺激受容体に結合する少なくとも１つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）を含む、実施形態２７６～２９４のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２９６．少なくとも１つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）が、Ｆｃ領域に対してアミノ末端に、かつ／または多重特異性ポリペプチド構築物のＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられる、実施形態２９５に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２９７．多重特異性ポリペプチド構築物が、１つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）のみを含む、実施形態２９５または実施形態２９６に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２９８．多重特異性ポリペプチド構築物が、任意選択的に同じであるかまたは異なる２つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）を含む、実施形態２９５～２９７のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

２９９．少なくとも１つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）が、共刺激受容体の天然同族結合パートナーの細胞外ドメインもしくはその結合断片、または共刺激受容体への結合活性を示すそのバリアントであるか、またはそれを含む、実施形態２９５～２９７のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３００．少なくとも１つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、および単一ドメイン軽鎖抗体からなる群から選択される抗体またはその抗原結合断片である、実施形態２９５～２９８のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３０１．抗体またはその抗原結合断片が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＮＡＲ、またはＶＨＨである、実施形態３００に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３０２．抗体または抗原結合断片が、ｓｄＡｂである、実施形態３００または実施形態３０１に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３０３．ｓｄＡｂが、ヒトまたはヒト化ｓｄＡｂである、実施形態３０２に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３０４．少なくとも１つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）が、４１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、膜貫通アクチベーターならびにＣＡＭＬインタラクター（ＴＡＣＩ）、およびＮＫＧ２Ｄの中から選択される共刺激受容体に結合する、実施形態２９５～３０３のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３０５．少なくとも１つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）が、４１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、およびグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）の中から選択される共刺激受容体に結合する、実施形態２９５～３０４のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３０６．少なくとも１つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）が、配列番号２１０に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号２１０に記載される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有し、４－１ＢＢに結合する配列を含む、実施形態２９５～３０５のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３０７．多重特異性ポリペプチド構築物が、ＴＡＡに結合する第１および第２の抗原結合ドメインを含む、実施形態２７６～３０６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３０８．抗原結合ドメインが、同じ腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する、実施形態３０７に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３０９．第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、同じＴＡＡの異なるエピトープまたは非重複エピトープに結合し、かつ／または同じＴＡＡへの結合を競合する、実施形態３０７または実施形態３０８に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３１０．第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、異なるＴＡＡに結合する、実施形態３０７に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３１１．１つの抗原結合ドメインが、Ｆｃ領域に対してアミノ末端に位置付けられ、１つの抗原結合ドメインが、ＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられる、実施形態３０７～３１０のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３１２．ＴＡＡに結合する抗原結合ドメイン、またはＴＡＡに結合する抗原結合ドメインの各々が独立して、ＴＡＡの天然同族結合パートナーの細胞外ドメインもしくはその結合断片、またはＴＡＡへの結合活性を示すそのバリアントを含む、実施形態２７６～３１１のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３１３．ＴＡＡに結合する抗原結合ドメイン、またはＴＡＡに結合する抗原結合ドメインの各々が独立して、抗体またはその抗原結合断片である、実施形態２７６～３１１のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３１４．抗体またはその抗原結合断片が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＮＡＲ、またはＶＨＨである、実施形態３１３に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３１５．抗体または抗原結合断片が、ｓｄＡｂである、実施形態３１３または実施形態３１４に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３１６．ｓｄＡｂが、ヒトまたはヒト化ｓｄＡｂである、実施形態３１５に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３１７．抗原結合ドメイン、または抗原結合ドメインの各々が独立して、１－９２－ＬＦＡ－３、５Ｔ４、アルファ－４インテグリン、アルファ－Ｖインテグリン、アルファ４ベータ１インテグリン、アルファ４ベータ７インテグリン、ＡＧＲ２、抗Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、アペリンＪ受容体、ＡＰＲＩＬ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＡＦＦ、ＢＴＬＡ、Ｃ５補体、Ｃ－２４２、ＣＡ９、ＣＡ１９－９、（Ｌｅｗｉｓａ）、炭酸脱水酵素９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３２、（ＩＬ－２ＲＧ）、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１７２Ａ、ＣＤ２４８、ＣＤＨ６、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ－９０）、ＣＬＡＵＤＩＮ－３、ＣＬＡＵＤＩＮ－４、ｃＭｅｔ、コラーゲン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＳＦＲ、ＣＳＦＲ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＹＲ６１、ＤＬ４４、ＤＬＫ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、ＤＰＰ－４、ＤＳＧ１、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ３、ＲＳＶのＦタンパク質、ＦＡＰ、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ８、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ－３、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）、ＧＡＬ３ＳＴ１、Ｇ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦＲ、ＧＤ２、ＧＩＴＲ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、Ｇｐ１３０、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＧＰＮＭＢ、ＧＲＰ７８、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＧＦ、ｈＧＨ、ＨＶＥＭ、ヒアルロニダーゼ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒベータ１、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２３、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７／ＩＬ２７Ｒ（ｗｓｘ１）、ＩＬ２９、ＩＬ－３１Ｒ、ＩＬ３１／ＩＬ３１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、インスリン受容体、Ｊａｇｇｅｄリガンド、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、ＫＩＳＳ１－Ｒ、ＬＡＧ－３、ＬＩＦ－Ｒ、ＬｅｗｉｓＸ、ＬＩＧＨＴ、ＬＲＰ４、ＬＲＲＣ２６、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ、ＬｙＰＤ１、ＭＣＳＰ、メソテリン、ＭＲＰ４、ＭＵＣ１、ムチン－１６（ＭＵＣ１６、ＣＡ－１２５）、Ｎａ／ＫＡＴＰａｓｅ、ＮＧＦ、ニカストリン、Ｎｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、ＮＯＶ、ＯＳＭ－Ｒ、ＯＸ－４０、ＰＡＲ２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦＲアルファ、ＰＤＧＦＲベータ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ホスファチジル－セリン、Ｐ１ＧＦ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ、ＲＡＡＧ１２、ＲＡＧＥ、ＳＬＣ４４Ａ４、スフィンゴシン－１－リン酸、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＡＰＡ１、ＴＥＭ－８、ＴＧＦベータ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＭＥＭ３１、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＲ、ＴＮＦＲＳ１２Ａ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、ＴＲＫ－Ａ、ＴＲＫ－Ｂ、ｕＰＡＲ、ＶＡＰ１、ＶＣＡＭ－１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＷＩＳＰ－１、ＷＩＳＰ－２、およびＷＩＳＰ－３の中から選択される腫瘍抗原に結合する、実施形態２７６～３１６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３１８．第１のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端への順序で、ＴＡＡに結合する第１の抗原結合ドメイン、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド、リンカー、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片のＶＨまたはＶＬドメイン、およびＴＡＡに結合する第２の抗原結合ドメインを含み、
第２のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端への順序で、ＰＤ－１ＶＨＨドメインまたはＣＲＢＲのうちの１つ、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の第２のＦｃポリペプチド、リンカー、任意選択的に、第１のポリペプチド中に存在するのと同じリンカー、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片のＶＨまたはＶＬドメインのうちの他方、およびＰＤ－１ＶＨＨドメインまたはＣＲＢＲのうちの他方を含む、実施形態３１０～３１７のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３１９．リンカーが、ペプチドまたはポリペプチドリンカーであり、任意選択的にリンカーが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長である、実施形態２７６～３１８のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３２０．リンカーが、切断不可能なリンカーである、実施形態２７６～３１９のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３２１．切断不可能なリンカーが、ＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２５）、ＧＧＧＧＧＳ（配列番号１２６）、およびそれらの組み合わせを含む、実施形態３２０に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３２２．リンカーが、配列ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号１２７）であるか、またはそれを含む、実施形態２７６～３２１のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３２３．リンカーが、切断可能なリンカーである、実施形態２７６～３１９のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３２４．切断可能なリンカーが、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、実施形態３２３に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３２５．プロテアーゼが、免疫エフェクター細胞、腫瘍、または腫瘍微小環境中に存在する細胞によって産生される、実施形態３２４に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３２６．プロテアーゼが、免疫エフェクター細胞によって産生され、免疫エフェクター細胞が、活性化Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはＮＫＴ細胞である、実施形態３２４または実施形態３２５に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３２７．プロテアーゼが、マトリプターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、グランザイムＢ、およびそれらの組み合わせから選択される、実施形態３２４～３２６のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３２８．プロテアーゼが、グランザイムＢである、実施形態３２７に記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３２９．切断可能なリンカーが、アミノ酸配列

（配列番号１７１）を含む、実施形態３２４～３２８のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物。

３３０．配列番号３００に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号３０１に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号３０２に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、ＰＤ－１に結合する単離された単一ドメイン抗体。

３３１．配列番号２９６に記載されるアミノ酸配列、または配列番号２９６のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態３３０に記載の単離された単一ドメイン抗体。

３３２．単一ドメイン抗体が、（ｉ）配列番号２９６に記載される配列、（ｉｉ）配列番号２９６のヒト化バリアント、または（ｉｉｉ）配列番号２９６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態３３０または実施形態３３１に記載の単離された単一ドメイン抗体。

３３３．ｓｄＡｂが、配列番号２９６に記載される配列を含む、実施形態３３０～３３２のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

３３４．ｓｄＡｂが、配列番号３００に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３０１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３０２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む、実施形態３３０～３３２のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

３３５．ｓｄＡｂが、それぞれ配列番号３００、３０１、および３０２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、実施形態３３０～３３２および３３４のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

３３６．配列番号３０３に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号３０４に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号３０５に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、ＰＤ－１に結合する単離された単一ドメイン抗体。

３３７．配列番号２９７に記載されるアミノ酸配列、または配列番号２９７のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態３３６に記載の単離された単一ドメイン抗体。

３３８．単一ドメイン抗体が、（ｉ）配列番号２９７に記載される配列、（ｉｉ）配列番号２９７のヒト化バリアント、または（ｉｉｉ）配列番号２９７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態３３６または実施形態３３７に記載の単離された単一ドメイン抗体。

３３９．ｓｄＡｂが、配列番号２９７に記載される配列を含む、実施形態３３６～３３８のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

３４０．ｓｄＡｂが、配列番号３０３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３０４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３０５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む、実施形態３３６～３３８のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

３４１．ｓｄＡｂが、それぞれ配列番号３０３、３０４、および３０５に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、実施形態３３６～３３８および３４０のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

３４２．配列番号３０６に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号３０７に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号３０８に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、ＰＤ－１に結合する単離された単一ドメイン抗体。

３４３．配列番号２９８に記載されるアミノ酸配列、または配列番号２９８のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態３４２に記載の単離された単一ドメイン抗体。

３４４．単一ドメイン抗体が、（ｉ）配列番号２９８に記載される配列、（ｉｉ）配列番号２９８のヒト化バリアント、または（ｉｉｉ）配列番号２９８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態３４２または実施形態３４３に記載の単離された単一ドメイン抗体。

３４５．ｓｄＡｂが、配列番号２９８に記載される配列を含む、実施形態３４２～３４４のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

３４６．ｓｄＡｂが、配列番号３０６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３０７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３０８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む、実施形態３４２～３４４のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

３４７．ｓｄＡｂが、それぞれ配列番号３０６、３０７、および３０８に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、実施形態３４２～３４４および３４６のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

３４８．配列番号３０９に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号３１０に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号３１１に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、を含む、ＰＤ－１に結合する単離された単一ドメイン抗体。

３４９．配列番号２９９に記載されるアミノ酸配列、または配列番号２９９のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態３４８に記載の単離された単一ドメイン抗体。

３５０．単一ドメイン抗体が、（ｉ）配列番号２９９に記載される配列、（ｉｉ）配列番号２９９のヒト化バリアント、または（ｉｉｉ）配列番号２９９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、ＰＤ－１に結合する、実施形態３４８または実施形態３４９に記載の単離された単一ドメイン抗体。

３５１．ｓｄＡｂが、配列番号２９９に記載される配列を含む、実施形態３４８～３５０のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

３５２．ｓｄＡｂが、配列番号３０９に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３１０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３１１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む、実施形態３４８～３５０のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

３５３．ｓｄＡｂが、それぞれ配列番号３０９、３１０、および３１１に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、実施形態３４８～３５０および３５２のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

３５４．ｓｄＡｂが、配列番号２９６～２９９のいずれか１つに記載されるアミノ酸の配列を含む、実施形態３３０～３３２、３３４～３３８、３４０～３４４、３４６～３５０、および３５２～３５３のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

３５５．ｓｄＡｂが、配列番号２９６、２９７、２９８、または２９９に記載されるアミノ酸の配列を含む、実施形態３３０～３３２、３３４～３３８、３４０～３４４、３４６～３５０、および３５２～３５４のいずれかに記載の単離された単一ドメイン抗体。

３５６．実施形態２２０～２７５のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド（複数可）。

３５７．実施形態２７６～３２９のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物をコードする、ポリヌクレオチド（複数可）。

３５８．実施形態２７６～３２９のいずれかに記載の多重特異性構築物の第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、多重特異性構築物の第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列と、を含む、ポリヌクレオチドであって、第１および第２の核酸配列が、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸によって分離される、ポリヌクレオチド。

３５９．第１の核酸配列および第２の核酸配列が、同じプロモータに作動可能に連結される、実施形態３５８に記載のポリヌクレオチド。

３６０．自己切断ペプチドまたはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸が、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａから選択される、実施形態３５９に記載のポリヌクレオチド。

３６１．実施形態３３０～３５５のいずれかに記載の単一ドメイン抗体をコードする、ポリヌクレオチド。

３６２．実施形態３５６～３６１のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

３６３．発現ベクターである、実施形態３６２に記載のベクター。

３６４．ウイルスベクターまたは真核ベクターであり、任意選択的に、真核ベクターが哺乳動物ベクターである、実施形態３６２または実施形態３６３に記載のベクター。

３６５．実施形態３５６～３６１のいずれかに記載のポリヌクレオチド（複数可）、または実施形態３６２～３６４のいずれかに記載のベクター（複数可）を含む、細胞。

３６６．細胞が、組み換えまたは単離である、実施形態３６５に記載の細胞。

３６７．細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態３６６に記載の細胞。

３６８．ポリペプチドを産生する方法であって、細胞に、実施形態３５６～３６１のいずれかに記載のポリヌクレオチド（複数可）、または実施形態３６２～３６４に記載のベクター（複数可）を導入することと、多重特異性ポリペプチド構築物を産生するための条件下で細胞を培養することと、を含む、方法。

３６９．細胞からポリペプチドを単離または精製することをさらに含む、実施形態３６８に記載の方法。

３７０．実施形態３６８または実施形態３６９に記載の方法によって産生される、ポリペプチド。

３７１．実施形態２２０～２７５のいずれかに記載の結合分子または実施形態３３０～３５５のいずれかに記載の単一ドメイン抗体を含む結合分子を含む、操作された免疫細胞であって、任意選択的に、結合分子が、細胞から分泌可能である、操作された免疫細胞。

３７２．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む、実施形態３７１に記載の操作された細胞。

３７３．細胞が、リンパ球である、実施形態３７１または実施形態３７２に記載の操作された免疫細胞。

３７４．細胞が、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態３７２または３７３に記載の操作された免疫細胞。

３７５．ＣＡＲが、ＴＡＡに結合する抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態３７２～３７４のいずれかに記載の操作された免疫細胞。

３７６．細胞内シグナル伝達ドメインが、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）シグナル伝達ドメインを含み、任意選択的に、細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、任意選択的にヒトＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む、実施形態３７５に記載の操作された免疫細胞。

３７７．細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激分子のシグナル伝達ドメインをさらに含む、実施形態３７６に記載の操作された免疫細胞。

３７８．実施形態２２０～２７５のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド、実施形態２７６～３２９のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物、実施形態３３０～３５５のいずれかに記載の単一ドメイン抗体、または実施形態３７１～３７７のいずれかに記載の操作された免疫細胞を含む、医薬組成物。

３７９．薬学的に許容される担体を含む、実施形態３７８に記載の医薬組成物。

３８０．滅菌されている、実施形態３７８または実施形態３７９に記載の医薬組成物。

３８１．対象における免疫応答を刺激または誘発する方法であって、それを必要とする対象に、実施形態２２０～２７５のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド、実施形態２７６～３２９のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物、実施形態３３０～３５５のいずれかに記載の単一ドメイン抗体、または実施形態３７１～３７７のいずれかに記載の操作された免疫細胞、または実施形態３７８～３８０に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

３８２．免疫応答が、腫瘍または癌、任意選択的にＰＤ－１を発現する腫瘍または癌に対して増加する、実施形態３８１に記載の方法。

３８３．方法が、対象における疾患または状態を治療する、実施形態３８１または実施形態３８２に記載の方法。

３８４．対象における疾患または状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の実施形態２２０～２７５のいずれかに記載のＰＤ－１結合ポリペプチド、実施形態２７６～３２９のいずれかに記載の多重特異性ポリペプチド構築物、実施形態３３０～３５５のいずれかに記載の単一ドメイン抗体、または実施形態３７１～３７７のいずれかに記載の操作された免疫細胞、または実施形態３７８～３８０に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

３８５．疾患または状態が、腫瘍または癌である、実施形態３８４または実施形態３８５に記載の方法。

３８６．当該対象が、ヒトである、実施形態３８１～３８５のいずれかに記載の方法。

ＶＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、例示の目的にのみ含まれ、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

Ｅｘａｍｐｌｅ１：ＰＤ－１ｓｄＡｂの生成
ヒトＰＤ－１を標的とする単一ドメイン抗体を、ラマおよびアルパカの免疫化を介して生成した。ラマおよびアルパカを、以下のように記載されるヒトＰＤ－１細胞外ドメインの組み換えバージョン（ＥＣＤ、配列番号２８６に記載されるヒトＰＤ－１のアミノ酸２５～１６７、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ１５１１６）で免疫化した。
ＬＤＳＰＤＲＰＷＮＰＰＴＦＳＰＡＬＬＶＶＴＥＧＤＮＡＴＦＴＣＳＦＳＮＴＳＥＳＦＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＣＲＦＲＶＴＱＬＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡＥＬＲＶＴＥＲＲＡＥＶＰＴＡＨＰＳＰＳＰＲＳＡＧＱＦＱ

特異的な抗ＰＤ１抗体力価の発現に続いて、ラマ／アルパカ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、免疫化した動物由来の５００ｍＬの血液から単離し、ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙＭａｘｉＫｉｔを使用して総ｍＲＮＡを単離し、その後、ＴｈｅｒｍｏＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅおよびオリゴ－ｄＴプライミングを使用して第１の鎖ｃＤＮＡに変換した。単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ＶＨＨとも呼ばれる）配列を、鋳型としてｃＤＮＡを使用してＰＣＲを介して特異的に増幅し、ｓｄＡｂ－Ｆｃ－ＡＧＡ２融合タンパク質として酵母表面提示ベクターにクローニングした。Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号８に記載される）であった。

これらのｓｄＡｂを提示する酵母ライブラリーを、磁気ビーズ分離、続いて、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を介して、ＰＤ－１ＥＣＤの組み換え型を使用して濃縮した。ソーティングされた酵母を播種し、単離したコロニーを９６ウェルブロックに採取し、発現を表面提示ｓｄＡｂ－Ｆｃから培地への分泌に切り替えた培地中で増殖させた。例示的な同定されたｓｄＡｂを、表Ｅ１に記載する。

Ｅｘａｍｐｌｅ２：ラクダ科由来ＰＤ－１ｓｄＡｂのヒト化
例示的なラクダ科由来ＰＤ－１ｓｄＡｂ、１８Ｈ１０を、ヒトＶＨ３－２３生殖系列を足場として使用してヒト化した。溶解性、特異性、安定性、および／または親和性に寄与するラクダ科残基は、未修飾のままであった。加えて、すべてのヒト化バリアントは、Ｌｅｕ１１Ｇｌｕ（Ｌ１１Ｅ）の修飾、ならびにＳｅｒ１１２Ｌｙｓ（Ｓ１１２Ｋ）およびＳｅｒ１１３Ｐｒｏ（Ｓ１１３Ｐ）のカルボキシ末端修飾を含有し、それは、これらが、ｓｄＡｂに向けられた既存のＡＤＡの認識を阻害または低減することが知られているためである（ＵＳ２０１６／０２０７９８１に記載されるように）。

表Ｅ２は、例示的なＰＤ－１ｓｄＡｂヒト化バリアントを記載する。

Ｅｘａｍｐｌｅ３：フローサイトメトリーによるＰＤ－１発現細胞へのｓｄＡｂの結合
ＰＤ－１発現細胞上の精製したｓｄＡｂ－Ｆｃについて、特異性および相対親和性を評価した。２９３個の細胞の一過性トランスフェクションについては、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞を、新鮮なＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地中で１×１０^６細胞／ｍＬにおいて再懸濁した。細胞を、トランスフェクション当たり５０ｍＬに播種し、３７℃において振盪器上でインキュベートしながら、トランスフェクション試薬を調製した。５０μｇの各トランスフェクションプラスミドを、５００μＬのＯｐｔｉＭＥＭに希釈した。各トランスフェクション用の別個の管において、１５０μｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ、７５μＬの２ｍｇ／ｍＬ溶液）を、５００μＬのＯｐｔｉＭＥＭに添加し、次いでＤＮＡ：ＯｐｔｉＭＥＭ溶液と１：１で混合した。ＤＮＡおよびＰＥＩを室温で１５分間複合体化した。次いで、ＤＮＡ：ＰＥＩ複合体を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞の調製したフラスコに滴下し、旋回によって混合した。トランスフェクトした細胞を３７℃の振盪器で一晩インキュベートし、タンパク質発現のための時間を取った。使用したトランスフェクションプラスミドは、ヒト、カニクイザル、およびマウス起源のシトリンタグ付き完全長ＰＤ１タンパク質をコードした。

実施例１および実施例２に記載される例示的なＰＤ－１－ｓｄＡｂ－Ｆｃ融合タンパク質の結合を、一過性にトランスフェクトしたＰＤ－１発現細胞を使用してフローサイトメトリーによって評価した。トランスフェクトされていないＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞または一過性にトランスフェクトしたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（１ｘＴＢＳ、０．０１％ＦＢＳ、０．００２％アジ化ナトリウム）中で０．５×１０×１０^６細胞／ｍＬに希釈し、９６ウェル丸底アッセイプレート中で１００μＬ／ウェルで播種した。アッセイプレートを約７５０ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いで上清を除去し、一次抗体希釈物を以下のように添加した。滴定希釈抗体を、２９３個の細胞を含むアッセイプレートに添加した。細胞を抗体希釈物中で４℃において３０分間インキュベートした。３０分間のインキュベーション後、アッセイプレートを約７５０ｒｐｍで５分間遠心分離し、１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、約７５０ｒｐｍで５分間再び遠心分離した。洗浄液を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液中で１：１０００に希釈した５０μＬ／ウェルのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７コンジュゲートロバ－抗ヒトＩｇＧを添加し、４℃で２０分間インキュベートした。次いで、アッセイプレートを７５０ｒｐｍで５分間遠心分離し、１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、７５０ｒｐｍで５分間再び遠心分離した。洗浄液を除去し、フローサイトメトリー（ｉＱｕｅＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ）による分析のために、細胞を３０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。

例示的な結果を、ヒトＰＤ－１発現細胞（ｈｕＰＤ１－ＦＬ２９３）、カニクイザルＰＤ－１発現細胞（ｃｙｎｏＰＤ１－ＦＬ２９３）、マウスＰＤ－１発現細胞（ｍｕＰＤ１－ＦＬ２９３）、または非発現（ＵＴ２９３）細胞に結合するための１８Ｈ１０（ラマ由来の親、配列番号２８４）、１８Ｈ１０のヒト化バリアント（配列番号２５１～２５７、２５９～２６０、および２６２～２６６）、または１－１４（配列番号３１２）について図１Ａ～図１Ｇに記載する。

Ｅｘａｍｐｌｅ４：フローサイトメトリーによる活性化ヒトＴ細胞へのＰＤ－１ｓｄＡｂの結合の評価
フローサイトメトリーによって、活性化ヒトＴ細胞へのＰＤ－１－ｓｄＡｂ－Ｆｃ融合タンパク質の結合を評価した。

ヒトＴ細胞の濃縮および活性化のために、密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒトドナー血液から単離した。血液試料をＰＢＳ／２％ＦＢＳ（１：２）で希釈し、３０ｍＬの希釈血液を１５ｍＬのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配培地上に層状にした。遠心分離後、血漿とＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐとの相間におけるＰＢＭＣ層を除去し、残りの赤血球を、赤血球溶解緩衝液を使用して室温で５分間溶解した。非Ｔ細胞集団を、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＴＣＲ γ／δに対するビオチン化抗系統マーカー抗体で標識し（２０分間、室温）、磁気ストレプトアビジン粒子を使用して枯渇させた。Ｔ細胞画分を含有する非結合細胞上清を保持した。濃縮したヒトＴ細胞を、１μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＣＤ３（ＯＫＴ３）でコーティングした組織培養プレート中で、１ｍＬの培地当たり約２×１０^６細胞の密度で播種することによって、それらを３日間活性化した。活性化Ｔ細胞を、結合アッセイでさらに使用する前にＰＢＳ中で１回洗浄した。

活性化ヒトＴ細胞への結合について、１６７ｎＭ～０．００８４７ｎＭに及ぶ４倍１０点連続希釈の１８Ｈ１０（配列番号２８４）、ヒト化１８Ｈ１０（ｈｚｖ７、配列番号２５７）、または１－１４（配列番号３１２）をインキュベーションのために使用したことを除いて、実質的に実施例３のようにフローサイトメトリーによって、結合を評価および定量化した。図２に示すように、試験した例示的なＰＤ－１標的構築物およびヒト化バリアントは、濃縮および活性化したヒトＴ細胞に結合することが分かった。

Ｅｘａｍｐｌｅ５：レポーターアッセイを使用したＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断の評価
ＴＣＲ関与がルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写をもたらすＰＤ－１発現Ｊｕｒｋａｔエフェクターレポーター細胞株を使用して、ＰＤ－１を標的とする例示的なｓｄＡｂがＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を遮断する能力を評価した。アッセイでは、ＰＤ－Ｌ１発現ａＡＰＣ／ＣＨＯＫ１細胞をＪｕｒｋａｔレポーター細胞と共培養して、ＴＣＲ特異的活性化シグナルを提供すると同時に、エフェクター細胞上のＰＤ－１の関与を通してこのシグナルを抑制した。ＰＤ－１ｓｄＡｂが抑制されたシグナルを遮断し、ＴＣＲ関与を強化する能力をモニタリングした。

ＰＤ－Ｌ１発現ａＡＰＣ／ＣＨＯＫ１細胞を、アッセイの１日前に、１０％ＦＢＳで補充した１００μＬのＨａｍ’ｓＦ１２に播種した。アッセイの当日、すべての培地を廃棄し、１８Ｈ１０（配列番号４１）またはヒト化１８Ｈ１０（ｈｚｖ７、配列番号１４）（開始濃度：５０ｎＭ、滴定１：４）を含有する試験タンパク質の滴定を含有する、４０μＬのアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、１％ＦＢＳで補充）で置き換えた。次いで、ＪｕｒｋａｔＰＤ－１レポーター細胞をプレート（４０μＬ）に添加し、プレートを６時間インキュベートした（３７℃、加湿雰囲気中５％ＣＯ２）。インキュベーション後、等体積のＢｉｏＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｕｂｓｔｒａｔｅをウェルに添加し、室温で１０分間インキュベートし、発光を評価および分析した。

図３Ａおよび図３Ｂに示すように、例示的な試験したタンパク質１８Ｈ１０（配列番号２８４）、ヒト化１８Ｈ１０（ｈｚｖ７、配列番号２５７）、または１－１４（配列番号３１２）によるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の遮断が、ＴＣＲ関与およびルシフェラーゼ転写の存在によって示されるように観察された。

Ｅｘａｍｐｌｅ６：抗ＰＤ１ｓｄＡｂを用いて、ＴＡＡ標的された拘束されたＣＤ３結合タンパク質を産生する方法
拘束されたＣＤ３結合を示すジスルフィド安定化抗ＣＤ３Ｆｖ結合領域、ヘテロ二量体Ｆｃドメイン、Ｆｃ領域に対してアミノ末端に、かつ／またはＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられた１つ以上のＴＡＡ抗原結合ドメイン、およびＦｃ領域に対してアミノ末端に、かつ／またはＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられた、ＰＤ－１に対する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含有する阻害受容体結合領域（ＩＲＢＲ）を含有する、多重特異性ポリペプチド構築物を生成した。場合によっては、Ｆｃ領域に対してアミノ末端に、かつ／またはＣＤ３結合領域に対してカルボキシ末端に位置付けられた、例えば４１ＢＢに対する少なくとも１つの共刺激受容体結合領域（ＣＲＢＲ）を含有するように、多重特異性ポリペプチド構築物を生成した。

例示的な構築物では、ヘテロ二量体多重特異性ポリペプチド構築物の少なくとも第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを生成し、発現のためにプラスミドにクローニングした。第１のポリペプチド鎖は、概して、Ｎ末端からＣ末端への順序で、Ｆｃホールポリペプチド（例えば、配列番号１１２または場合によっては配列番号１１４に記載される）、プロテアーゼの１つ以上の基質認識部位を含有するような切断可能または切断不可能なリンカー、およびｄｓＦｖ抗ＣＤ３抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン（例えば、配列番号２８５に記載される）を含んだ。第２のポリペプチド鎖は、概して、Ｎ末端からＣ末端への順序で、Ｆｃノブポリペプチド（例えば、配列番号１０５または場合によっては配列番号１０９に記載される）、第１のポリペプチド鎖と同じ切断可能なリンカーまたは同じ切断不可能なリンカー、およびｄｓＦｖ抗ＣＤ３抗体の可変重鎖ドメイン（例えば、配列番号４７に記載される）を含んだ。グランザイムＢの基質認識部位を含有する、例示的な切断不可能なリンカー、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号１２７）、または例示的な切断可能なリンカー、

（配列番号１７１）を有する構築物を生成した。ポリペプチド鎖の一方または両方はさらに、様々な配置で、Ｆｃドメインのアミノ末端および／もしくはＣＤ３結合領域のカルボキシ末端のＰＤ－１ｓｄＡｂ（例えば、配列番号２８４もしくは配列番号２５７）、ならびに／またはＦｃドメインのアミノ末端および／もしくはＣＤ３結合領域の４－１ＢＢｓｄＡｂ（例えば、配列番号２１０）共刺激受容体結合ドメインをコードした。

ヘテロ二量体の拘束されたＣＤ３結合タンパク質の各鎖をコードする別個のプラスミドを、ポリエチレンイミンを使用して等モル比で哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３またはＣＨＯのいずれか）に一過性にトランスフェクトした。上清中に分泌した組換えタンパク質を３～７日後に採取し、分泌した組み換えタンパク質をプロテインＡクロマトグラフィー、続いて、分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）またはフロースルー疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のいずれかによって精製した。位置Ｉ２５３ＲまたはＨ４３５Ｒのヘテロ二量体Ｆｃ（通常はホール－Ｆｃ）の１つの鎖へと設計された変異（それがプロテインＡに結合しないような）によって、ヘテロ二量体タンパク質を選択的に精製した。ＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ－２００樹脂を用いたＡＫＴＡ）またはＦＴ－ＨＩＣ（ブチル／フェニルセファロースを用いたＡＫＴＡ）上の第２のクロマトグラフィーステップを使用して、より疎水性であり、予測した分子量の２倍であった２つのヘテロ二量体Ｆｃを含有するクロスペア種を除去した。

方法は、ヘテロ二量体Ｆｃの適切に対になった種、ならびに記載されるようなジスルフィド安定化抗ＣＤ３Ｆｖ（例えば、配列番号４７に記載される変異Ｇ４４Ｃを有する抗ＣＤ３ＶＨ、および配列番号２８５に記載される変異Ｇ１００Ｃを有するＶＬ）を含有する、ヘテロ二量体多重特異性ポリペプチド構築物の産生に有利に働く。精製したヘテロ二量体の拘束されたＣＤ３結合タンパク質は安定しており、４℃での長時間のインキュベーションまたはタンパク質濃度の増加時にクロスペア種を蓄積しなかった。

本発明は、例えば、本発明の様々な態様を説明するために提供される、特定の開示された実施形態の範囲に限定されることを意図していない。記載される組成物および方法に対する様々な修正は、本明細書の記載および教示から明らかになるであろう。そのような変化は、本開示の真の範囲および趣旨から逸脱することなく実施され得、本開示の範囲内に入ることが意図される。

Claims

明細書に記載の発明。