KR100956913B1 - 치료제로서 유용한 일가 항체 단편 - Google Patents

치료제로서 유용한 일가 항체 단편 Download PDF

Info

Publication number
KR100956913B1
KR100956913B1 KR1020067014346A KR20067014346A KR100956913B1 KR 100956913 B1 KR100956913 B1 KR 100956913B1 KR 1020067014346 A KR1020067014346 A KR 1020067014346A KR 20067014346 A KR20067014346 A KR 20067014346A KR 100956913 B1 KR100956913 B1 KR 100956913B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
polypeptide
antibody fragment
antibody
nucleic acid
antibodies
Prior art date
Application number
KR1020067014346A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20060130610A (ko
Inventor
아더 지-옌 후앙
랄프 에이치. 슈왈
다니엘 지. 얀수라
Original Assignee
제넨테크, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제넨테크, 인크. filed Critical 제넨테크, 인크.
Publication of KR20060130610A publication Critical patent/KR20060130610A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100956913B1 publication Critical patent/KR100956913B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 단일 항원 결합 암 및 이량체화를 유도하지 않으면서 안정성을 증가시키는 Fc 영역 (이는 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩타이드의 컴플렉스를 포함하며, 상기 Fc 폴리펩타이드 중 하나만이 N-말단이 절단된 중쇄이다)으로 이루어진 안정화된 일가 항체 단편을 제조하는 방법 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일가 항체 단편, 단일 항원 결합 암, Fc 영역

Description

치료제로서 유용한 일가 항체 단편{Monovalent antibody fragments useful as therapeutics}
연관 출원
본원은, 2003년 12월 19일자로 출원된 가출원 제60/531,409호를 우선권으로 주장하는, 제37 CFR 1.53(b)(1)호 하에 출원된 정규 출원이며, 상기 가출원은 이의 내용이 전부 본원에 참조로 삽입된다.
일반적으로, 본 발명은 분자 생물학 및 항체 치료학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 치료제로서 유용한 독특한 특성을 갖는 일가 항체 단편에 대한 신규 형태, 및 이러한 항체 단편의 이용에 관한 것이다.
최근 수년간 다양한 장애 및 질환에 대한 진단제 및 치료제로서 항체를 사용하는 가능성이 증가하였다. 일반적으로 진단, 연구 및 치료 목적을 위한 항체의 중요성은, 목적하는 특성을 얻기 위해 천연 항체의 서열 및 구조를 연구하고 이를 변형시키는데 들인 상당량의 노력에 반영되어 있다.
주된 고찰은, 이상적인 치료 항체가 환자에게 투여한 후 표적물 특이성, 생물학적 안정성 및 생물학적 이용성, 및 치료 효과를 최대화하기에 충분한 표적물 결합 친화성을 포함한 특정한 최소한의 특성을 갖는가에 대한 것이다. 불행히도, 이러한 최소한의 특성을 모두 또는 대부분이라도 보유하는 항체 치료제를 생성하려는 노력이 제한된 성공을 거두었다. 예를 들어, IgG와 같은 전체 길이의 항체는 단일 항체 분자에 2개의 항원 결합 암 (arm)의 존재로부터 유도되는 친화 효과 때문에 바람직한 약력학 (예: 생체 내에서 실질적인 반감기) 및 우수한 표적물 결합 친화성은 나타낸다. 그러나, 이러한 전체 길이의 항체는 이의 큰 분자 크기 때문에 생물학적 이용성에 문제점을 갖는다. 또한, 전체 길이의 항체는 일부의 경우에서는 Fab 단편과 같이 길항적 항체임에도 불구하고 표적 항원에 결합 시 (바람직하지 못한) 효능적 (agonistic) 효과를 나타낼 수 있다 [U.S. 특허 제6,468,529호]. 이러한 현상은, 길항 효과가 바람직한 치료 작용인 경우, 부적절한 것이다. 일부 경우에서, 이러한 현상은 세포 표면 수용체에 결합되었을 때 수용체 활성화를 이끄는 수용체 이량체화를 촉진하는 이가 항체의 "가교결합" 효과 때문일 수 있다.
일가 항체는 "가교결합" 효과를 갖는 것으로는 예측되지 않지만, 오늘날까지 일가 항체는 구조/구성에 있어 고유한 특정한 한계점 때문에 치료제로서 바람직하지 않았다. 예를 들어, Fab 형태의 일가 항체는 치료제로서의 사용에 대해 저조한 약력학 (예: 투여 후 생체 내 불안정 및 빠른 제거)을 갖는다. 또한, 일가의 항체는, 이들의 다가 상대물과 비교하여, 친화적 결합 효과의 부재에 의해 일반적으로 낮은 겉보기 결합 친화성을 갖는다.
일반적으로, 치료제로서 사용하기 위한 항체 형태의 선택은 바람직하지 않은 제한점을 갖는 실체를 수용하는 것에 의해 제어되었다. 그럼에도 불구하고, 아마도 부분적으로는 생체 내에서의 생물학적 안정성에 기인하여, 최근에는 뚜렷하게 전체 길이의 항체 형태를 선택하고 있다. 일가 항체는 모든 것을 고려하여 볼 때 생물학적 안정성이 생물학적 이용성보다 치료적 효능에 대해 중요한 요인이 아닌 경우에 허용될 수 있다. 예를 들어, 일가 Fab 항체는, 부분적으로는 전체 길이의 항체와 비교하여 우수한 조직 침투 때문에, 이종 분자가 치료 작용을 발휘하는 표적 세포 또는 조직에 독소와 같은 이종 분자를 전달하는데 보다 우수한 비히클일 수 있다 [U.S. 특허 제5,169,939호]. 일가 항체를 치료제로서 개발하기 위한 시도에 대한 다른 예는, 일가 항체가 치료 효과를 얻는데 중요한 세팅, 예를 들어 이가의 항체가 결과적으로는 표적 세포가 세포독성제, 이펙터 및 보체를 피하는 수단을 제공할 수 있는 항원적 조절을 받도록 표적 세포를 유도할 수 있는 우려가 있는 경우를 포함한다. 이러한 항체에 대한 예가 문헌 [Cobbold & Waldmann, Nature (1984), 308:460-462; EP 0 131 424; Glennie & Stevenson, Nature (1982), 295:712-714; Nielsen & Routledge, Blood (2002), 100:4067-4073; Stevenson et al., Anticancer Drug Des. (1989), 3(4):219-230; Routledge et al., Transplantation (1995), 60:847-853; Clark et al., Eur. J. Immunol. (1989), 19:381-388; Bolt et al., Eur. J. Immunol. (1993), 23:403-411; Routledge et al., Eur. J. Immunol. (1991), 21:2717-2725; Staerz et al., Nature (1985), 314:628-631; 및 U.S. 특허 제5,968,509호]에 기술되어 있다. 특히, 이들 일가 항 체 단편은 기능적 Fc 서열을 포함하며, 이 서열은 이들의 이펙터 기능 (예: T 세포의 보체-매개된 용해)이 치료 작용에 필요하기 때문에 포함된다. 상술된 시나리오 이외는, 당해 기술에서는 치료제로서 사용 및/또는 개발되는 일가 항체에 Fc 영역을 포함시키는 것에 대한 필요 또는 유용성을 인식하는 것으로 보이지 않는다. Fc 영역이 치료 작용에 불필요한 일가 항체에 Fc 영역을 포함시키는 것에 대한 꺼림은 이러한 항체를 얻기가 실제로 어렵다는 것 때문에 강조된다. 기존의 항체 생산 기술은 단일 항원 결합 성분 (즉 일가) 및 Fc 영역을 포함하는 헤테로이량체를 다량으로 충분히 정제된 형태로 수득하기 위한 효과적인 방법을 제공하지 않는다.
명백히, 항체 단편의 생체 내 안정성을 증가시키려는 일부 노력이 있었으며, 성공 정도는 다양하였다. 예를 들어, Fab 항체는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 안정화 잔기 또는 이종성 펩티드와 같은 다른 안정화 잔기에 부착될 수 있다 [Dennis et al., J. Biol. Chem. (2002), 277:35035-35043; PCT 공개 제WO01/45746호].
상기한 바에 비추어 볼 때, 개선된 항체 형태, 및 이러한 항체를 제조하는 방법 및 예를 들어 치료제 또는 예방제로서 이용 방법이 상당히 필요하다. 본원에 기술된 발명은 이러한 필요에 초점을 맞추었으며 기타 이점을 제공한다.
특허 출원 및 공개물을 포함한 본원에 인용된 모든 참조문은 모두 참조로 본원에 삽입된다.
발명의 설명
본 발명은 치료적 유용성, 기능성 및 이의 제조 방법에 있어 다양한 이점을 제공하는 항체의 형태를 제공한다. 하나의 양상으로, 본 발명의 항체는 특정한 비-면역 반응에 기초한 치료 계획에 필수적인 일가 특성을 제공한다. 예를 들어, 길항적 작용을 필요로 하는 병적 상태에서 이가의 항체가 바람직하지 못한 효능적 효과를 갖는 경우에, 본 발명의 항체의 일가 특성은 표적 분자에 항체가 결합 시 길항적 작용을 갖고/갖거나 이를 확실하게 한다. 또한, 본 발명의 항체는 유사/실질적으로 동일한 항원 결합 특성을 갖는 Fab 형태와 비교하여 뛰어난 약물 동태학 특성 (예: 생체 내에서 향상된 반감기 및/또는 감소된 제거)으로 특징지워지며, 이로써 통상의 일가 Fab 항체의 사용 시의 주요한 결점을 극복한다. 하나의 양상으로, 본 발명의 항체는 면역 이펙터 반응이 유해한 병적 상태를 치료하는데 특히 유용한 특성인 면역 이펙터 기능이 적거나 없다. 또 다른 양상으로, 본 발명의 항체는 생산 수율을 크게 개선하는 대체물로서 특징지워진다. 또한, 일가 항체 단편을 생성하기 위한 특정한 통상의 방법 (예: 효소적 분해에 이어서 일부의 경우 화학적 커플링)과 대비되게, 본 발명의 생산 방법의 재조합 특징은 치료제로서 개발 및/또는 상업화에 유용한 충분히 높은 균질도 및/또는 순도를 갖는 항체군을 수득할 수 있게 한다.
따라서, 하나의 양상으로, 본 발명은 단일 표적 분자 결합 암 및 Fc 영역 (즉, Fc 폴리펩티드의 컴플렉스)를 포함하고, 생체 내에서 Fc 영역이 결여된 상대 항체 단편 보다 생체 내에서 보다 안정한, 일가 항체 단편을 제공한다. 하나의 양상으로, 본 발명은 단일 항원 결합 암 및 상기 항원 결합 암을 포함하는 Fab 분자와 비교하여 항체 단편의 안정성을 증가시키는 (즉, 보다 안정하여, 예를 들어 생 체 내 반감기가 보다 길다) Fc 영역을 포함하고, 상기 Fc 영역은 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드의 컴플렉스를 포함하며, Fc 폴리펩티드 중 단지 하나만이 N-말단이 절단된 중쇄인, 항체 단편을 제공한다. 하나의 양태에서, N-말단이 절단된 중쇄는 제 1 Fc 폴리펩티드와 컴플렉스를 형성하기에 충분한 중쇄 CH2 및/또는 CH3 도메인의 적어도 일부에 인접하게 연결된 힌지 서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어지고, 증가된 안정성을 부여한다. 하나의 양태에서, N-말단이 절단된 중쇄는 제 1 Fc 폴리펩티드와 컴플렉스를 형성하고 증가된 안정성을 부여할 수 있는 중쇄 CH2 및/또는 CH3 도메인에 인접하게 연결된 힌지 서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어진다. 하나의 양태에서, N-말단이 절단된 중쇄의 N-말단 서열은 힌지 서열의 일부 또는 전체이다 (즉, 절단된 중쇄는 힌지 서열을 포함하거나 이의 일부 또는 전체인 N 말단을 포함한다). 하나의 양태에서, N-말단이 절단된 중쇄는 IgG 중쇄의 것이다. 하나의 양태에서, Fc 영역은 FcRn에 결합할 수 있다. 하나의 양태에서, Fc 영역은 FcRn에 결합하는 것 이외에 면역 이펙터 기능을 갖지 않는다. 일반적으로 바람직하게는, N-말단이 절단된 중쇄는 특이적으로 항원을 결합하지 않는다.
본원에 기술되는 바와 같이, 본 발명의 항체 단편은 Fab 단편 상대물과 비교하여 상당히 향상된 안정성을 갖는 것이 특징적이다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체 단편은 Fab 단편 상대물의 생체 내 반감비의 적어도 약 2배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 25배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 350배, 적어도 약 400배, 적어도 약 450배, 적어도 약 500배를 나타낸다. 생체 내 반감기는 당 기술 분야에서 공지된 다양한 방 법으로 측정될 수 있으며, 이중 일부가 본원에 기술된다. 하나의 양태에서, 생체 내 반감기는 적합한 포유동물 (예: 마우스)에 일정량의 항체를 투여하고 포유동물에서 투여된 항체의 양의 감소율을 측정하여 측정된다.
면역 이펙터 기능은 특정 임상적 세팅에서 필요하지 않거나 심지어는 유해하다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 비글리코실화된다. 이러한 항체는 Fc 영역의 글리코실화에 의존적인 실질적인 면역 이펙터 기능을 나타내지 않는다. 일반적으로 바람직하게는, 본 발명의 비글리코실화된 항체는 FcRn에 결합하는 것 이외는 실질적인 면역 이펙터 기능을 나타내지 않는다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체 단편은 FcRn 결합 이외는 실질적인 이펙터 기능을 갖지 않거나 완전히 이펙터 기능이 결여된다. 하나의 양태에서, 상기 이펙터 기능은 보체 용해이다. 하나의 양태에서, 상기 이펙터 기능은 항체 의존적 세포독성 (ADCC)이다. 하나의 양태에서, 항체 단편은 FcRn을 결합한다. 비글리코실화된 항체는 당해 기술 분야에서 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 편리한 방법은 항체를 이. 콜라이와 같은 원핵생물 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 항체 단편은 글리코실화된다. 글리코실화는 당 기술 분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 항체를 포유동물 숙주 세포, 예로 CHO 세포에서 생성하여 달성될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 항체 단편은 면역 반응의 성분을 표적하지 않으며, 따라서 치료 작용의 메카니즘은 면역 반응의 조절 및/또는 개입을 포함하지 않는다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 본 발명의 항체 단편은 면역억제 특성이 약하 거나 이러한 특성이 없다. 예를 들어, 상기 면역억제 특성은 간접적으로나 직접적으로 T 세포 고갈을 일으킬 능력을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 항체 단편은 T 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하지 않으며, 일부 양태에서 T 세포 표면 항원은 CD3 또는 CD4이다. 하나의 양태에서, 상기 T 세포 표면 항원은 CD3이다. 또 따른 양태에서, 항체 단편은 면역글로불린 폴리펩티드를 특이적으로 결합하지 않으며, 예를 들어 표면 면역글로불린의 람다 쇄에 있는 불변 결정자 또는 표면 면역글로불린에 있는 이디오타입 결정자를 특이적으로 결합하지 않는다.
본 발명의 항체 단편은 목적하는 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 항체 단편은 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 항체 단편은 수용체 다량체화 (예: 이량체화) 시에 활성화되는 세포 표면 수용체를 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체의 표적 분자에의 결합은 상기 표적 분자에 대한 다른 분자 (예를 들어, 표적 분자가 수용체인 경우 리간드)의 결합을 방해한다. 따라서, 하나의 예로서, 본 발명의 항체 단편은 표적 분자에 결합 시 코그네이트 (cognate) 결합 파트너의 항체 분자에 대한 결합을 방해한다. 코그네이트 결합 파트너는 리간드, 또는 헤테로이량체화 분자 또는 호모이량체화 분자일 수 있다. 하나의 예로서, 본 발명의 항체 단편은 표적 분자에 결합 시 표적 분자의 다량체화를 억제한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 단편이 길항제인 일부 양태에서, 세포 표면 수용체에 대한 항체 단편의 결합은 수용체가 이의 또 다른 유니트와 이량체화하는 것을 억제하여 (적어도 부분적으로 수용체 이량체화의 결여 때문에) 수용체의 활성화가 억제된다. 수용체 분자가 정상적 기능을 수행하기 위해 이량체화 (호모이량체화 또는 헤테로이량체화)할 수 있거나 이를 필요로 하는 많은 다양한 수용체 분자가 당 기술 분야에 공지되어 있다. 이러한 수용체는 수용체 티로신 키나제, 예로 섬유아세포 성장 인자 수용체 및 HGF 수용체, c-met를 포함한다. 다른 단백질-단백질 상호작용은 수용체-리간드 상호작용, 예로 flt, flk 등에 VEGF (vascular endothelial growth factor) 결합, 및 c-met에 HGF (hepatocyte growth factor) 결합을 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체 단편은 c-met에 결합하기 위해 HGF와 경쟁할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 VEGF 수용체에 대한 결합에 대해 VEGF와 경쟁할 수 있다.
하나의 양상으로, 본 발명은 (본원에 기술된 바와 같이) 하나의 암을 갖는 형태의 길항제이나, 2개의 암을 갖는 형태의 (즉, 2개의 암이 동일한 항원 결합능을 가짐) 효능제이거나 효능제 활성을 갖는 항체 단편을 제공한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 (i) 경쇄 가변 도메인 (및 일부의 양태에서는 추가로 경쇄 불변 도메인)을 포함하는 제 1 폴리펩티드, (ii) 중쇄 가변 도메인, 제 1 Fc 폴리펩티드 서열 (및 일부의 경우에서는 비-Fc 중쇄 불변 도메인 서열)을 포함하는 제 2 폴리펩티드, 및 (iii) 제 2 Fc 폴리펩티드 서열을 포함하는 제 3 폴리펩티드를 포함하는 항체 단편을 제공한다. 일반적으로, 제 2 폴리펩티드는 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 도메인 (예: CH1의 전부 또는 일부) 및 제 1 Fc 폴리펩티드를 포함하는 단일 폴리펩티드이다. 예를 들어, 제 1 Fc 폴리펩티드 서열은 일반적으로 펩티드 결합 [즉, 비-펩티드 결합이 아님]에 의해 중쇄 불변 도메인에 연결된다. 하나의 양태에서, 제 1 폴리펩티드는 사람 경쇄 불변 도메인에 융합된 비-사람 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 하나의 양태에서, 제 2 폴리펩티드는 사람 중쇄 불변 도메인에 융합된 비-사람 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 하나의 양태에서, 제 3 폴리펩티드는 이의 N 말단에 힌지 서열의 적어도 일부를 포함하는 N-말단이 절단된 중쇄를 포함한다. 하나의 양태에서, 제 2 폴리펩티드는 이의 N 말단에 기능적 또는 야생형 힌지 서열을 포함하지 않는 N-말단이 절단된 중쇄를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체 단편의 2개의 Fc 폴리펩티드는 공유결합적으로 연결된다. 예를 들어, 2개의 Fc 폴리펩티드는 분자간 디술파이드 결합, 예를 들어 힌지 영역의 시스테인 잔기 사이에 분자간 디술파이드 결합을 통해 연결될 수 있다.
하나의 양상으로, 본 발명은 면역글로불린의 적어도 (또는 적어도 약) 50 %, 75 %, 85 %, 90 %, 95 %가 본 발명의 항체 단편인 면역글로불린군을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 면역글로불린군을 포함하는 조성물은, 이로 제한됨이 없이, 숙주 세포 용해물, 세포 배양 배지, 숙주 세포 페이스트 또는 이의 반-정제되거나 정제된 형태를 포함한 다양한 형태일 수 있다. 정제 방법은 당 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 이의 일부가 본원에 기술된다.
하나의 양상으로, 본 발명은 항체 분자 내의 Fc 서열의 헤테로이량체화를 촉진하는 (호모이량체화는 최소화하면서) 하나 이상의 특성을 포함하는 항체 단편을 제공한다. 이러한 특징(들)은 본원에 기술된 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 면역글로불린군의 수율 및/또는 순도 및/또는 균질성을 개선한다. 하나의 양태에서, 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드는 경계면에서 만나고/상호작용한다. 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드가 경계면에서 만나는 일부 양태에서, 제 2 Fc 폴리펩티드 (서열)의 경계면은 제 1 Fc 폴리펩티드 (서열)의 경계면에 있는 공동 (cavity)에 위치가능한 돌출부 (protuberance)를 포함한다. 하나의 양태에서, 제 1 Fc 폴리펩티드는 공동을 암호화하도록 원형/최초 폴리펩티드로부터 변형되거나 제 2 Fc 폴리펩티드는 돌출부를 암호화하도록 원형/최초 폴리펩티드로부터 변형되거나, 이 둘 모두이다. 하나의 양태에서, 제 1 Fc 폴리펩티드는 공동을 암호화하도록 원형/최초 폴리펩티드로부터 변형되고 제 2 Fc 폴리펩티드는 돌출부를 암호화하도록 원형/최초 폴리펩티드로부터 변형된다. 하나의 양태에서, 제 2 Fc 폴리펩티드의 경계면은 제 1 Fc 폴리펩티드의 경계면에 있는 공동에 위치가능한 돌출부를 포함하고, 여기서 공동 또는 돌출부, 또는 이둘 모두는 각각 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드의 경계면으로 도입된다. 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드가 경계면에서 만나는 일부 양태에서, 제 1 Fc 폴리펩티드 (서열)의 경계면은 제 2 Fc 폴리펩티드 (서열)의 경계면에 있는 공동에 위치가능한 돌출부를 포함한다. 하나의 양태에서, 제 2 Fc 폴리펩티드는 공동을 암호화하도록 원형/최초 폴리펩티드로부터 변형되거나 제 1 Fc 폴리펩티드는 돌출부를 암호화하도록 원형/최초 폴리펩티드로부터 변형되거나, 이둘 모두이다. 하나의 양태에서, 제 2 Fc 폴리펩티드는 공동을 암호화하도록 원형/최초 폴리펩티드로부터 변형되고 제 1 Fc 폴리펩티드는 돌출부를 암호화하도록 원형/최초 폴리펩티드로부터 변형된다. 하나의 양태에서, 제 1 Fc 폴리펩티드의 경계면은 제 2 Fc 폴리펩티드의 경계면에 있는 공동에 위치가능한 돌출부를 포함하고, 여기에서 돌출부 또는 공동, 또는 이둘 모두는 각각 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드의 경계면으로 도입된다.
하나의 양태에서, 돌출부 및 공동은 천연 발생의 아미노산 잔기를 포함한다. 하나의 양태에서, 돌출부를 포함하는 Fc 폴리펩티드는 원형/최초 폴리펩티드의 경계면으로부터의 최초 잔기를 최초 잔기 보다 큰 측쇄 용적을 갖는 도입 (import) 잔기로 대체시켜 생성된다. 하나의 양태에서, 돌출부를 포함하는 Fc 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 경계면으로부터의 최초 잔기를 암호화하는 핵산을 최초 잔기 보다 큰 측쇄 용적으로 갖는 도입 잔기를 암호화하는 핵산으로 대체시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되다. 하나의 양태에서, 최초 잔기는 트레오닌이다. 하나의 양태에서, 최초 잔기는 T366이다. 하나의 양태에서 도입 잔기는 아르기닌 (R)이다. 하나의 양태에서, 도입 잔기는 페닐알라닌 (F)이다. 하나의 양태에서, 도입 잔기는 티로신 (Y)이다. 하나의 양태에서, 도입 잔기는 트립토판 (W)이다. 하나의 양태에서, 도입 잔기는 R, F, Y 또는 W이다. 하나의 양태에서, 돌출부는 원형/최초 폴리펩티드에 있는 2개 이상의 잔기를 대체시킴으로써 생성된다. 하나의 양태에서, 돌출부를 포함하는 Fc 폴리펩티드는 위치 366에 있는 트레오닌의 트립토판으로의 대체를 포함하며, 아미노산 번호 매김은 카바트 (Kabat) 등 [pp. 688-696 in Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)]의 EU 번호매김 체계를 따른다.
일부 양태에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 원형/최초 폴리펩티드의 경계면에 있는 최초 잔기를 최초 잔기 보다 작은 측쇄 용적을 갖는 도입 잔기로 대체시킴으로써 생성된다. 예를 들어, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 경계면에 있는 최초 잔기를 암호화하는 핵산을 최초 잔기 보다 작은 측쇄 용적을 갖는 도입 잔기를 암호화하는 핵산으로 대체시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있다. 하나의 양태에서, 최초 잔기는 트레오닌이다. 하나의 양태에서, 최초 잔기는 루이신이다. 하나의 양태에서, 최초 잔기는 티로신이다. 하나의 양태에서, 도입 잔기는 시스테인 (C)이 아니다. 하나의 양태에서, 도입 잔기는 알라닌 (A)이다. 하나의 양태에서, 도입 잔기는 세린 (S)이다. 하나의 양태에서, 도입 잔기는 트레오닌 (T)이다. 하나의 양태에서, 도입 잔기는 발린 (V)이다. 공동은 원형/최초 폴리펩티드의 하나 이상의 최초 잔기를 대체시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 트레오닌, 루이신 및 티로신으로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 최초 아미노산의 대체를 포함한다. 하나의 양태에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 알라닌, 세린, 트레오닌 및 발린으로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 도입 잔기를 포함한다. 일부 양태에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 트레오닌, 루이신 및 티로신으로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 최초 아미노산의 대체를 포함하며, 상기 최초 아미노산은 알라닌, 세린, 트레오닌 및 발린으로 이루어진 군 중에서 선택되는 도입 잔기로 대체된다. 일부 양태에서, 대체되는 최초 아미노산은 T366, L368 및/또는 Y407이다. 하나의 양태에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 위치 366에 있는 트레오닌의 세린으로의 대체를 포함하며, 아미노산 번호 매김은 카바트 (Kabat) 등 (상기 참조)의 EU 번호매김 체계를 따른다. 하나의 양태에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 위치 368에 있는 루이신의 알라닌으로의 대체를 포함하며, 아미노산 번호 매김은 카바트 (Kabat) 등 (상기 참조)의 EU 번호매 김 체계를 따른다. 하나의 양태에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 위치 407에 있는 티로신의 발린으로의 대체를 포함하며, 아미노산 번호 매김은 카바트 (Kabat) 등 (상기 참조)의 EU 번호매김 체계를 따른다. 하나의 양태에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 T366S, L368A 및 Y407V로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 아미노산 대체를 포함하며, 아미노산 번호 매김은 카바트 (Kabat) 등 (상기 참조)의 EU 번호매김 체계를 따른다. 이들 항체 단편에 대한 일부 양태에서, 돌출부를 포함하는 Fc 폴리펩티드는 위치 366에 있는 트레오닌의 트립토판으로의 대체를 포함하며, 아미노산 번호 매김은 카바트 (Kabat) 등 (상기 참조)의 EU 번호매김 체계를 따른다.
하나의 양상으로, 본 발명의 항체 단편은 Fc 영역을 포함하며, 이의 존재는 동일한 결합 암 (서열)을 포함하는 Fab 단편과 비교하여 항체 단편의 안정성을 증가시키는데 필요하다. 상기 Fc 영역은 분리된 Fc 폴리펩티드 서열의 컴플렉스화 (다량체화)를 통해 형성된다. 상기 분리된 Fc 폴리펩티드 서열은, (본원에서 정의되는 바와 같이) 이들이 Fc 영역을 형성하기 위해 이량체화할 수 있는 한, 동일한 서열 및/또는 도메인을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 제 1 Fc 폴리펩티드는, 예를 들어 힌지, 불변 및/또는 가변 도메인 서열과 함께, 일반적으로 단일 폴리펩티드에 있는 면역글로불린 중쇄의 하나 이상의 도메인에 인접하게 연결된다. 하나의 양태에서, 제 1 Fc 폴리펩티드는 적어도 일부의 힌지 서열, 적어도 일부의 CH2 도메인 및/또는 적어도 일부의 CH3 도메인을 포함한다. 하나의 양태에서, 제 1 Fc 폴리펩티드는 면역글로불린의 힌지 서열 및 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 하나의 양태에서, 제 2 Fc 폴리펩티드 (즉, N-말단이 절단된 중쇄의 일부인 Fc 폴리펩티드)는 적어도 일부의 힌지 서열, 적어도 일부의 CH2 도메인 및/또는 적어도 일부의 CH3 도메인을 포함한다. 하나의 양태에서, 제 2 Fc 폴리펩티드는 면역글로불린의 힌지 서열 및 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체 단편은 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드를 포함하며, 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드 각각은 적어도 일부의 하나 이상의 항체 불변 도메인을 포함한다. 하나의 양태에서, 항체 불변 도메인은 CH2 및/또는 CH3 도메인이다. 불변 도메인을 포함하는 본 발명의 항체 단편에 대한 양태에서, 항체 불변 도메인은 모든 면역글로불린 부류, 예를 들어 IgG로부터의 것 일 수 있다. 면역글로불린 공급원은 최초의 형태 (예: IgG는 사람 IgG1일 수 있다) 또는 합성 형태의 적합한 종의 것 일 수 있다.
본 발명의 항체는 단일 항원 결합 암을 포함한다. 단일 항원에 대한 결합은 하나 이상의 결합 표적물 (예: 결정자/에피토프)에 대한 결합을 수반할 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 단일특이적이다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 하나의 양태에서 단일특이적인 면역어드헤신 (immunoadhesin)이다.
본 발명의 항체 단편은 이종 잔기와 접합될 수 있다. 이종 잔기는, 항체에 대한 접합이 항체의 목적하는 작용 및/또는 특성을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 적합할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 면역접합체는 세포독성제인 이종 잔기를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 세포독성제는 방사성 동위원소, 화학치료제 및 독소로 이루어진 군 중에서 선택된다. 일부 양태에서, 상기 독소는 칼시체 미신, 마이탄신 및 트리초텐으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 일부 양태에서, 면역접합체는 검출가능한 마커인 이종 잔기를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 검출가능한 마커는 방사성 동위원소, 리간드-수용체쌍의 일원, 효소-기질쌍의 일원 및 형광 공명 에너지 전달쌍의 일원으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
다양한 세팅에서, 본 발명의 항체 단편의 고도로 균질한 군을 포함하는 조성물을 수득하는 것이 매우 바람직하다. 이는 당 기술 분야에 공지된 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 단편으로 구성된 폴리펩티드는 일반적으로 재조합적으로 발현된다 (이와는 대조적인 것은, 예를 들어 전체 길이의 면역글로불린의 효소적 분해된다). 일부 양태에서, 본 발명의 조성물은 결합 암의 N-말단 및/또는 Fc 영역의 C 말단에 대해 실질적으로 균질한 항체 단편을 포함한다. 조성물은, 이에 포함된 본 발명의 항체 단편의 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %가 결합 암의 N-말단 및/또는 Fc 영역의 C 말단에 동일한 아미노산 잔기를 갖는 경우, "실질적으로 균질"하다. 상기 조성물은 항체 단편이 최초에 생성된 공급원 조성물의 비정제되거나 반-정제되거나 정제된 형태일 수 있다.
하나의 양상으로, 본 발명은 본 발명의 항체 단편 및 하나의 양태에서 제약학적으로 허용되는 담체인 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 양태에서, 항체 단편은 이종 잔기에 접합된다.
또 다른 양상으로, 본 발명은 용기 및 이에 담기는 본 발명의 항체 단편을 포함하는 조성물을 포함하는 제조 물품을 제공한다. 일부 양태에서, 이러한 제조 물품은 추가로 상기 조성물을 사용하기 위한 설명서를 포함한다. 하나의 양태에서, 항체 단편은 치료학적 유효량으로 제공된다.
또 다른 양상으로, 본 발명은 본 발명의 항체 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 항체 단편의 성분은 단일 폴리뉴클레오티드 또는 분리된 (다수의) 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 하나의 양태에서, 단일 폴리뉴클레오티드는 (a) 항원 결합 암의 경쇄 및 중쇄 성분, 및 (b) N-말단이 절단된 중쇄 폴리펩티드를 암호화한다. 하나의 양태에서, 단일 폴리뉴클레오티드는 항원 결합 암의 경쇄 및 중쇄 성분을 암호화하고, 분리된 폴리뉴클레오티드는 N-말단이 절단된 중쇄 폴리펩티드를 암호화한다. 하나의 양태에서, 분리된 폴리뉴클레오티드는 각각 항원 결합 암의 경쇄 성분, 항원 결합 암의 중쇄 성분 및 N-말단이 절단된 중쇄 폴리펩티드를 암호화한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 본 발명의 항체를 발현하기 위한 재조합 벡터를 제공한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 하나의 양태에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포, 이. 콜라이 (E. coli)이다. 하나의 양태에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예로 CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포이다.
하나의 양상으로, 본 발명은 적합한 숙주 세포 (예: 이. 콜라이 또는 CHO)에서 항체 단편를 형성하는 헤테로다량체화를 가능하게 하는 조건 하에 항체 단편을 암호화하는 핵산을 발현시킴을 포함하여, 본 발명의 항체 단편을 생성하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 숙주 세포 배양물에 생성되는 면역글로불린 폴리펩티드의 적어도 50 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %는 본 발명의 항체 단편이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성되는 항체 단편은 본원에 기술된 바와 같이 하나의 Fc 폴리펩티드에 돌출부 및 또 다른 Fc 폴리펩티드에 공동을 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 숙주 세포에서 3개의 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 제 1 폴리뉴클레오티드는 항원 결합 암의 제 1 성분 (예: 중쇄 CDR 서열(들) 또는 가변 도메인 (및 일부의 예에서는 추가로 비-Fc 중쇄 불변 도메인 서열을 포함)) 및 제 1 Fc 폴리펩티드를 암호화하고, 제 2 폴리뉴클레오티드는 항원 결합 암의 제 2 성분 (예: 경쇄 CDR 서열(들) 또는 가변 도메인 (및 일부의 예에서는 추가로 경쇄 불변 도메인 서열을 포함))을 암호화하며, 제 3 폴리뉴클레오티드는 제 2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 N-말단이 절단된 중쇄를 암호화하고, 여기서 본 발명의 항체 단편은 이들 폴리펩티드의 헤테로다량체화에 의해 형성된다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 상기 폴리뉴클레오티드를 적합한 숙주 세포로 도입하는 것을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 본 발명의 항체 단편을 세포 배양물, 예를 들어 세포 용해물 또는 배양 배지로부터 회수하는 것을 포함한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 적합한 숙주 세포에서 본 발명의 항체 단편의 성분을 암호화하는 핵산을 발현시키는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 성분을 암호화하는 각각의 시스트론은 상기 성분을 암호화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 해독 개시 영역 (TIR)을 포함하고, 각각의 TIR의 세기는 목적량의 항체 단편이 생성되도록 성분들의 발현 수준에 대한 비율이 적합하게 조절된다. 하나의 양태에서, TIR은 대략 동일한 세기이다. 하나의 양태에서, 상대적 TIR은, 예를 들어 문헌[Simmons & Yansura, Nature Biotechnol. (1996), 14:629-634 및 Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147]에 따른 1이다. 일부 양태에서, TIR은 원핵세포성 분비 시그널 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 양태에서, 원핵세포 분비 시그널 서열은 STII, OmpA, PhoE, LamB, MBP 및 PhoA 분비 시그널 서열로 이루어진 군 중에서 선택된다.
본 발명의 항체는 다양한 세팅에서 다양한 용도를 발견한다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 일반적으로 치료 항체이다. 본 발명의 항체는 다양한 메카니즘에 의해 치료 효과를 발휘할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 효능제 항체일 수 있다. 또 다른 예로서, 본 발명의 항체는 길항제 항체일 수 있다. 또 다른 예로서, 본 발명의 항체는 중화 항체이다.
하나의 양상으로, 본 발명은 질병을 앓는 환자에게 질병을 치료하거나 진행을 지연시키기에 효과적인 유효량의 본 발명의 항체 단편을 투여함을 포함하여, 질병을 치료하거나 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 질환은 종양 또는 암이다. 하나의 양태에서, 질환은 면역학적 장애, 예를 들어 자가면역 질환, 예를 들어 류마티스 관절염, 면역 혈소판감소성자반병, 전신성홍반성루푸스, 건선, 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 인슐린 의존성 진성 당뇨병 등이다. 또 다른 양태에서, 질환은 이상 혈관화 (예: 혈관신생)와 관련된다. 또 다른 양태에서, 질환은 성장 인자-수용체 시그널화의 이상 조절과 관련된다. 하나의 예로 서, 성장 인자-수용체 시그널화는 티로신 키나제와 관련된다. 하나의 예로서, 상기 성장 인자-수용된 시그널화는 HGF-c-met 축과 관련된다.
본 발명의 항체는 많은 세포성, 유전성 및/또는 생화학적 이상으로부터 발생하는 많은 병적 상태를 치료 또는 예방하는데 적합하다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 HGF/c-met 시그널화 경로에서의 이상과 관련된 병적 상태를 치료 및/또는 예방하는데 특히 적합하다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 c-met 길항제이다. 하나의 양태에서, 상기 항체는 키메릭 항체, 예를 들어 이종의 비-사람, 사람 또는 사람화 서열 (예: 골격 및/또는 불변 도메인 서열)에 이식된 비-사람 공여체로부터의 항원 결합 서열을 포함하는 항체이다. 하나의 양태에서, 비-사람 공여체는 마우스이다. 하나의 양태에서, 항원 결합 서열은 합성, 예를 들어 돌연변이유발 (예: 파이지 디스플레이 스크리닝 등)에 의해 수득된 것이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 키메릭 항체는 뮤린 V 영역 및 사람 C 영역을 갖는다. 하나의 양태에서, 뮤린 경쇄 V 영역은 사람 카파 경쇄에 융합된다. 하나의 양태에서, 뮤린 중쇄 V 영역은 사람 IgG1 C 영역에 융합된다. 하나의 양태에서, 항원 결합 서열은 경쇄 및/또는 중쇄의 적어도 하나, 적어도 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함한다. 하나의 양태에서, 항원 결합 서열은 중쇄 CDR3를 포함한다. 하나의 양태에서, 항원 결합 서열은 ATCC 수탁 번호 제HB-11894호 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 제HB-11895호 (하이브리도마 5D5.11.6)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 단일클론 항체의 CDR 및/또는 가변 도메인 서열의 일부 또는 전체를 포함한다. 하나의 양태에서, 항원 결합 서열은 하이브리도마 세포주 1A3.3.13 또는 5D5.11.6에 의해 생성되는 단일클론 항체의 중쇄의 적어도 CDR3를 포함한다. 본 발명의 사람화 항체는 FR에서의 아미노산 치환 및 이식된 CDR에서 변화를 갖는 친화성 성숙 변이체를 갖는 것들을 포함한다. CDR 또는 FR에서 치환된 아미노산은 공여체 또는 수용체 항체에 존재하는 것으로만 한정되지는 않는다. 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 추가로 향상된 CDC 및/또는 ADCC 작용 및 B-세포 사멸을 포함한 개선된 이펙터 기능을 이끄는 Fc 영역에서의 아미노산 잔기의 변화를 포함한다. 본 발명의 기타 항체는 안정성을 개선시키는 특이적 변화를 갖는 것들을 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 생체 내에서 개선된 ADCC 작용을 갖는 퓨코즈 결핍 변이체를 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 항체 단편은 SYWLH (서열: 1), MIDPSNSDTRFNPNFKD (서열: 2) 및 YGSYVSPLDY (서열: 3)로 이루어진 군 중에서 선택되는 CDR 서열 중 적어도 하나, 적어도 2개 또는 3개 모두를 포함하는 중쇄를 포함하는 항원 결합 암을 포함한다. 하나의 양태에서, 항원 결합 암은 아미노산 서열 SYWLH을 갖는 중쇄 CDR-H1을 포함한다. 하나의 양태에서, 항원 결합 암은 아미노산 서열 MIDPSNSDTRFNPNFKD을 갖는 중쇄 CDR-H2를 포함한다. 하나의 양태에서, 항원 결합 암은 아미노산 서열 YGSYVSPLDY을 갖는 중쇄 CDR-H3를 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체 단편은 KSSQSLLYTSSQKNYLA (서열: 4), WASTRES (서열: 5) 및 QQYYAYPWT (서열: 6)로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 하나, 적어도 2개 또는 3개 모두를 포함하는 경쇄를 포함하는 항원 결합 암을 포함한다. 하나의 양태에서, 항원 결합 암은 아미노산 서열 KSSQSLLYTSSQKNYLA을 갖는 중쇄 CDR-L1을포함한다. 하나의 양태에서, 항원 결합 암은 아미노산 서열 WASTRES을 갖는 중쇄 CDR-L2를 포함한다. 하나의 양태에서, 항원 결합 암은 아미노산 서열 QQYYAYPWT을 갖는 중쇄 CDR-L3를 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체 단편은 SYWLH (서열: 1), MIDPSNSDTRFNPNFKD (서열: 2) 및 YGSYVSPLDY (서열: 3)로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 하나, 적어도 2개 또는 3개 모두를 포함하는 중쇄 및 KSSQSLLYTSSQKNYLA (서열: 4), WASTRES (서열: 5) 및 QQYYAYPWT (서열: 6)로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 하나, 적어도 2개 또는 3개 모두를 포함하는 경쇄 를 포함하는 항원 결합 암을 포함한다.
본 발명은 H 쇄 가변 영역 (VH)에 ATCC 수탁 번호 제HB-11894호 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 제HB-11895호 (하이브리도마 5D5.11.6)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 단일클론 항체의 적어도 CDR3 서열 및 실질적으로 사람 컨센서스 서열 (예를 들어, 실질적으로 사람 중쇄 서브군 III (VHIII)의 사람 컨센서스 골격 (FR) 잔기)을 포함하고, 생체 내애서 HGF/c-met 활성을 억제하는데 효과적인, 사람 c-met를 결합하는 사람화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 항체는 추가로 ATCC 수탁 번호 제HB-11894호 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 제HB-11895호 (하이브리도마 5D5.11.6)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 단일클론 항체의 H 쇄 CDR1 서열 및/또는 CDR2 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 항체는, 실질적으로 사람 경쇄 K 서브군 I (VκI)로부터의 사람 컨센서스 골격 (FR) 잔기와 함께, ATCC 수탁 번호 제HB-11894호 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 제HB-11895호 (하이브리도마 5D5.11.6)로 기탁된 하이 브리도 세포주에 의해 생산되는 단일클론 항체의 L 쇄 CDR1 서열, CDR2 서열 및/또는 CDR3 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 항체 단편은 서열: 7의 중 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 암을 포함한다:
(서열: 7) QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLE WIGMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVY YCATYGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS
하나의 양태에서, 본 발명의 항체 단편은 서열: 8의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 암을 포함한다:
(서열: 8) DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQ SPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQY YAYPWTFGGGTKLEIK
하나의 양상으로, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식 장애, 면역 (예: 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애와 같은 질환의 치료 및/또는 예방 처리를 위한 약제의 제조에 있어 본 발명의 항체 단편 (예: 본 발명의 c-met 길항제 항체 단편)의 용도를 제공한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식 장애, 면역 (예: 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애와 같은 질환의 치료 및/또는 예방 처리를 위한 약제의 제조에 있어 본 발명의 핵산 (예: 본 발명의 c-met 길항제 항체 단편을 암호화하는 핵산)의 용도를 제공한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식 장애, 면역 (예: 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애와 같은 질환의 치료 및/또는 예방 처리를 위 한 약제의 제조에 있어 본 발명의 발현 벡터 (예: 본 발명의 c-met 길항제 항체 단편을 암호화하는 벡터)의 용도를 제공한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식 장애, 면역 (예: 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애와 같은 질환의 치료 및/또는 예방 처리를 위한 약제의 제조에 있어 본 발명의 숙주 (예: 본 발명의 c-met 길항제 항체 단편을 암호화하는 벡터를 포함하는 숙주 세포)의 용도를 제공한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식 장애, 면역 (예: 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애와 같은 질환의 치료 및/또는 예방 처리를 위한 약제의 제조에 있어 본 발명의 제조 물품 (예: 본 발명의 c-met 길항제 항체 단편 및/또는 본 발명의 c-met 길항제 항체 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 제조 물품)의 용도를 제공한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식 장애, 면역 (예: 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애와 같은 질환의 치료 및/또는 예방 처리를 위한 약제의 제조에 있어 본 발명의 키트 (예: 본 발명의 c-met 길항제 항체 단편 및/또는 본 발명의 c-met 길항제 항체 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 키트)의 용도를 제공한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 세포 또는 조직을 유효량의 본 발명의 c-met 길항제 항체 단편과 접촉시켜 c-met 활성화와 관련된 세포 증식을 억제함을 포함하여, c-met 활성화된 세포 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 c-met 활성화와 관련된 병적 상태의 환자에게 유효량의 본 발명의 c-met 길항제 항체 단편을 투여하여 상기 상태를 치료함을 포함하여, 상기 환자에서 상기 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 이둘 모두를 발현하는 세포를 유효량의 본 발명의 c-met 길항제 항체 단편과 접촉시켜 상기 세포의 성장을 억제함을 포함하여, 상기 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 세포는 상이한 세포에 의해 (예를 들어 주변분비 효과를 통해) 발현되는 HGF에 의해 접촉된다.
하나의 양상으로, 본 발명은 c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 이둘 모두를 발현하는 세포를 포함하는 암성 종양을 갖는 포유동물에 유효량의 본 발명의 c-met 길항제 항체 단편을 투여하여 상기 포유동물을 효과적으로 치료함을 포함하여, 상기 포유동물을 치료학적으로 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 세포는 상이한 세포에 의해 (예를 들어 주변분비 효과를 통해) 발현되는 HGF에 의해 접촉된다.
하나의 양상으로, 본 발명은 세포의 성장이 적어도 부분적으로 c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 이둘 모두의 증가된 발현된 관련된 세포 증식 장애의 처리가 필요한 환자에 유효량의 본 발명의 c-met 길항제 항체 단편를 투여하여 상기 세포 증식 장애를 효과적으로 치료 또는 예방함을 포함하여, 상기 세포 증식 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 증식 장애는 암이다.
하나의 양상으로, 본 발명은 세포의 성장이 적어도 부분적으로 c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 이둘 모두의 성장 강화 효과에 의존적인 종양의 세포를 유효량의 본 발명의 c-met 길항제 항체 단편과 접촉시켜 상기 세포의 성장을 억제함을 포함하여, 상기 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 세포는 상이한 세포에 의해 (예를 들어 주변분비 효과를 통해) 발현되는 HGF에 의해 접촉된다.
하나의 양상으로, 본 발명은 종양의 성장이 적어도 부분적으로 c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 이둘 모두의 성장 강화 효과에 의존적인 종양의 세포를 유효량의 본 발명의 c-met 길항제 항체 단편과 접촉시켜 상기 종양을 효과적으로 치료함을 포함하여, 포유동물에서 상기 종양을 치료학적으로 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 세포는 상이한 세포에 의해 (예를 들어 주변분비 효과를 통해) 발현되는 HGF에 의해 접촉된다.
본 발명의 방법은, 예를 들어 HGF/c-met 시그널화 경로의 이상조절과 관련된 세포 및/또는 조직에서 모든 적합한 병적 상태에 영향을 미치는데 이용될 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법에서 표적되는 세포는 암세포이다. 예를 들어, 암세포는 유방암 세포, 대장암 세포, 폐암 세포, 유두암 세포 (예: 갑상선의 유두암 세포), 결장암 세포, 췌장암 세포, 전립선암 세포, 난소암 세포, 경부암 세포, 중추신경계암 세포, 골육종 세포, 신장암 세포, 간세포암 세포, 방광암 세포, 위암 세포, 두경부 편평세포암 세포, 흑색종 세포, 림프종 세포, 골수종 세포 (예: 다발성 골수종), 신경교종/신경교아세포종 세포 (예: 악성 성상세포종, 다형성 교모세포종, 악성 핍지교종 및 악성 올리고덴드로성상세포종 (oligodendroastrocytoma)) 및 백혈병 세포로 이루어진 군 중에서 선택되는 것 일 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법에서 표적되는 세포는 과다증식 및/또는 증식성 세포이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법에서 표적되는 세포는 이형성 세포이다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 방법에서 표적되는 세포는 전이 세포이다.
또한, 본 발명의 방법은 추가의 처리 단계를 포함한다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 표적화된 세포 및/또는 조직 (예: 암 세포)가 방사선 처리 또는 화학요법제에 노출되는 단계를 추가로 포함한다.
c-met의 활성화는 이상 조절이 다수의 병적 상태를 이끄는 중요한 생물학적 과정이다. 따라서, 본 발명의 방법의 하나의 양태에서, 표적되는 세포 (예: 암 세포)는 c-met의 활성화가 동일 조직 기원의 정상 세포와 비교하여 향상되는 세포이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 표적화된 세포의 죽음을 일으킨다. 예를 들어, 본 발명의 길항제 항체 단편과의 접촉으로 세포가 c-met 경로를 통해 시그널을 보낼 수 없으며, 이 결과 세포가 죽는다.
c-met 활성화 (및 따라서 시그널화)의 이상조절은 예를 들어 HGF (c-met의 코그네이트 리간드) 및/또는 c-met 자체의 과발현을 포함한 많은 세포성 변화로부터 발생할 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본 발명의 방법은 c-met 또는 간세포 성장 인자, 또는 이둘 모두가 동일한 조직 기원의 정상 세포와 비교하여 보다 풍부하게 발현되는 세포를 표적하는 단계를 포함한다. c-met-발현 세포는 다양한 공급원으로부터, 즉 자가분비 또는 주변분비 (paracrine) 방식으로 HGF에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법의 하나의 양태에서, 표적화된 세포는 상이한 세포에서 (예를 들어 주변분비 효과를 통해) 발현되는 간세포 성장 인자에 의해 접촉/결합된다. 상기한 상이한 세포는 동일 또는 상이한 조직 기원일 수 있다. 하나의 양태에서, 표적화된 세포는 표적화된 세포 자체에 의해 (예를 들어 자가분비 효과/루프)에 의해 발현되는 HGF에 의해 접촉/결합된다. 하나의 양태에서, 표적화된 세포에서 c-met 활성 (또는 활성화)는 리간드 의존적이다. 하나의 양태에서, c-met 활성 (또는 활성화)는 리간드 독립적이다.
도 1은 항-c-met Fab/c 항체 (하나의 암을 갖는 항체) 발현을 위한 항-Fab 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 2는 항-c-met Fab/c 항체 (하나의 암을 갖는 항체) 발현을 위한 항-Fc 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 3은 Fc 영역에 돌출부 및 공동을 포함하는 항-c-met Fab/c 항체 (하나의 암을 갖는 항체)의 발현을 위한 항-Fab 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 4는 Fc 영역에 돌출부 및 공동을 포함하는 항-c-met Fab/c 항체 (하나의 암을 갖는 항체)의 발현을 위한 항-Fc 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 5는 하나의 암을 갖는 항-c-met 항체가 c-met에 대한 HGF 결합을 차단하는 경쟁적 결합 검정의 결과를 나타낸다.
도 6은 HGF 및/또는 항-c-met 5D5 1-암 항체를 사용하거나 사용하지 않고 처리된 U87 세포에서 KIRA 검정의 결과를 나타낸다.
도 7은 다양한 양의 항-c-met 5D5 항체의 존재 하에 BaF3-hMet 세포의 세포 증식을 나타낸다.
도 8은 하나의 암을 갖는 항-c-met 항체가 HGF 작용을 차단하는 세포 이동 검정을 나타낸다.
도 9A 및 도 9B는 하나의 암을 갖는 항-c-met 항체의 약물 동태학적 분석을 나타낸다.
도 10A 및 도 10B는 하나의 암을 갖는 항-c-met 항체를 사용한 암의 치료를 나타낸다. 또 10B에서, "OA"는 하나의 암을 나타낸다.
본 발명은 특정 병적 상태를 치료하는데 사용하기에 특히 유용하게 하는 독특한 특징을 갖는 일가 항체 단편을 사용하기 위한 방법, 조성물, 키트 및 제조 제품을 제공한다. 또한, 상기한 항체 단편은 실제적인 수율 및 바람직한 순도로 쉽게 제조될 수 있다. 본 발명의 항체 단편은 기존의 일가 항체와 비교하여 뛰어나 물리화학적 및/또는 치료적 능력에 의해 특징지워진다. 일반적으로, 본 발명의 일가 항체 단편은 단일 항원 결합 암 및 Fc 영역을 포함하며, 상기 단일 항원 결합 암은 포함하나 Fc 영역은 포함하지 않는 Fab 분자와 비교하여 생체 내에서 향상된 안정성을 나타낸다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체 단편은 Fc 영역을 구성하는 Fc 폴리펩티드 사이에 다량체화 경계면을 형성하는 각각의 Fc 서열의 하나 이상의 잔기에 대체물을 포함한다. 본 발명은 본 발명의 항체 단편을 제조하는 방법 및 이용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 신규한 항체 단편의 효과적이고 상업적으로 실행가능한 생산을 가능하게 한다. 항체 단편은 사실상 일가이고 고도로 안정한 치료 항체의 사용이 매우 바람직하고/하거나 필요한 병적 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법, 조성물, 키트 및 제품에 대한 상세 내역이 본원에 제공된다.
일반적 기술
본 발명의 실시는, 달리 지시가 없는 한, 당 기술 분야에 속하는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학에 대한 통상의 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명된다 [Such techniques are explained fully in the literature, such as, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988)].
정의
본원에 사용된 용어 "벡터"는 핵산 분자가 또 다른 핵산 분자에 연결되어 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 언급하고자 한다. 하나의 유형의 벡터가 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 절편이 연결될 수 있는 환형 이중쇄 DNA 루프를 언급한다. 또 다른 유형의 벡터는 파아지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기에서 추가의 DNA 단편은 바이러스 게놈으로 연결될 수 있다. 특정 벡터 (예: 세균성 복제 기원을 갖는 세균성 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터)는 이들이 도입된 숙주 세포에서 독자적으로 복제할 수 있다. 다른 벡터 (예: 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포로의 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히 "재조합 벡터")로 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용성을 갖는 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는, 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터의 형태인 한, 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 모든 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 언급하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 동족체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체로 삽입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 메틸화된 뉴클레오티드 및 이들의 동족체를 포함할 수 있다. 변형되는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 차단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후, 예를 들어 라벨과 접합시켜 더욱 변형시킬 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어 "캡", 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드를 동족체로 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어 비하전된 연결 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등)을 갖는 것 및 하전된 연결 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것, 펜던트 잔기, 예를 들어 단백질 (예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩티드, ply-L-리신 등)을 갖는 것, 삽입물 (예: 아크리딘, 프로랄렌 등)을 갖는 것, 킬레이터 (예: 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)을 갖는 것, 알킬화제를 포함하는 것, 변형된 연결 (예: 알파 아노머릭 (anomeric) 핵산 등)을 갖는 것, 및 비현형된 형태의 폴리뉴클레오티드(들)을 포함한다. 또한, 슈가에 통상 존재하는 어떠한 히드록실기라도, 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 대체되거나 표준 보호기로 보호되거나, 추가의 뉴클레오티드에 추가의 연결을 만들기 위해 활성화되거나, 고형 또는 반고형 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH가 포스포릴화되거나 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑기 또는 아민으로 치환될 수 있다. 또한, 다른 히드록실도 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보즈, 카보사이클릭 슈가 동족체, α-아노머릭 슈가, 에피머릭 슈가, 예를 들어 아라비노즈, 자일로즈 또는 릭소즈 (lyxose), 피라노즈 슈가, 푸라노즈 슈가, 세도헵툴로즈, 비사이클릭 동족체 및 비염기성 뉴클레오시드 동족체, 예를 들어 메틸 리보사이드를 포함한, 당 분야에 일반적으로 공지된 리보즈 또는 데옥시리보즈 슈가의 동족체 형태를 포함할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결은 선택적 연결기로 대체될 수 있다. 이들 선택적 연결기는, 이로 제한됨이 없이, 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), "(O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기에서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 치환되거나 비치환된 알킬 (1-20 C) (임으로 에테르 (-O-) 연결을 포함), 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알딜이다)로 대체되는 양태를 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 있는 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 상기 기술을 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용한다.
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 짧은, 일반적으로 단일쇄인, 일반적으로 합성인 폴리뉴클레오티드를 언급하며, 일반적으로 길이가 약 200개 미만의 뉴클레오티드이며, 반드시 이러한 길이인 것은 아니다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 서로 배타적인 것이 아니다. 폴리뉴클레오티드에 대해 상기한 기술이 올리고뉴클레오티드에도 동일하게 완전히 적용가능하다.
본원에 사용된 용어 "간세포 성장 인자" 또는 "HGF"는, 달리 특정하게 또는 문맥상으로 지시되지 않는 한, HGF/c-met 시그널화 경로의 활성화가 일어나게 하는 조건 하에 상기 경로를 활성화시킬 수 있는 모든 자연형 또는 변이형 (자연/천연 발생적 또는 합성적) HGF 폴리펩티드를 언급한다. 용어 "야생형 HGF"는 일반적으로 천연 발생 HGF 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 언급한다. 용어 "야생형 HGF 서열"은 일반적으로 천연 발생 HGF에서 발견되는 아미노산 서열을 언급한다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 가장 광범위한 의미로 상호교환적으로 사용되며, 단일클론 항체 (예: 완전한 길이 또는 온전한 단일클론 항체), 폴리클론 항체, 일가 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예: 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이특이적 항체) 및 항체 단편을 포함한다. 항체는 사람, 사람화 및/또는 성숙된 친화성을 갖는 항체일 수 있다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 단지 일부를 포함하며, 여기서 일부는 온전한 항체로 존재할 때 이 부분과 통상적으로 관련되는 작용 중 적어도 하나, 바람직하게는 대부분 또는 모든 작용을 보유하는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 암"은 목적하는 표적 분자를 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 본 발명의 항체 단편의 구성 부분을 언급한다. 일반적으로 바람직하게는, 항원 결합 암은 면역글로불린 폴리펩티드 서열의 컴플렉스, 예를 들어 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 CDR 및/또는 가변 도메인 서열이다.
본원에서 사용된 용어 "N-말단이 절단된 중쇄"는, 빠진 부분이 통상적으로 중쇄의 N 말단 영역에 위치되는 것인, 전체 길이의 면역글로불린의 일부 (전체는 아님)를 포함하는 폴리펩티드를 언급한다. 빠진 부분은, 이로 제한됨이 없이, 가변 도메인, CH1 및 힌지 서열의 일부 또는 전체를 포함한다. 일반적으로, 야생형 힌지 서열이 존재하지 않는 경우, N-말단이 절단된 중쇄의 잔류 불변 영역(들)은 또 다른 Fc 서열 (즉, 본원에 기술된 바와 같은 "제 1" Fc 폴리펩티드)에 연결될 수 있는 성분을 포함한다. 예를 들어, 상기 성분은 디술파이드 결합을 형성할 수 있는 변형된 잔기 또는 추가된 시스테인 잔기일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 군으로부터 수득되는 항체, 즉 상기 군의 개개의 항체가 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일한 항체를 언급한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원에 대해 지시된다. 또한, 통상적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
본원에서 단일클론 항체는 구체적으로 "키메릭" 항체 (여기에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유도되거나 특정 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체에 있는 상응 서열과 동일하거나 상동이고, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유도되거나 또 다른 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체에 있는 상응 서열과 동일하거나 상동이다), 및, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이러한 항체의 단편을 포함한다 [U.S. 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)].
비-사람 (예: 뮤린) 항체의 "사람화" 형태는 비-사람 면역글로불린으로부터 유도되는 최소 서열을 포함하는 키메릭 항체이다. 대체로, 사람화 항체는 수용체의 과가변 영역으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 수용력을 갖는 비-사람종 (공여체 항체) (예: 마우스, 래트, 래비트 또는 비사람 영장류)의 과가변 영역으로부터의 잔기로 대체되는 사람 면역글로불린 (수용체 항체)이다. 일부 예에서, 사람 면역글로불린의 골격 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-사람 잔기로 대체된다. 또한, 사람화 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 사람화 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나, 통상적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기에서 모든 또는 실질적으로 모든 과가변 루프는 바사람 면역글로불린의 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 사람 면역글로불린 서열의 FR이다. 또한, 사람화 항체는 임의로 통상적으로 사람 면역글로불린 불변 영역 (Fc)인 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 자세한 설명은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 하기 검토 논문 및 이에 인용된 참조문을 참조한다 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)].
"사람 항체"는 사람에 의해 생성되는 항체의 아미노산 서열에 상응하고/하거나 본원에 기술된 바와 같이 사람 항체를 만들기 위한 모든 기술을 이용하여 만들었던 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 사람 항체에 대한 이러한 정의는 구체적으로 비-사람 항원-결합 잔기를 포함하는 사람화 항체를 배제시킨다.
"성숙된 친화성을 갖는 (affinity matured)" 항체는 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 변화를 가져 이러한 변화(들)을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화성이 개선된 항체이다. 바람직한 성숙된 친화성을 갖는 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어는 피코몰 친화성을 가질 것이다. 성숙된 친화성을 갖는 항체는 당 기술 분야에서 공지된 절차에 따라 생성된다. 마르크스 등 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]은 VH 및 VL 도메인 셔플링 (shuffling)에 의한 친화성 성숙을 기술한다. CDR 및/또는 골격 잔기의 무작위 돌연변이유발이 문헌 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schieret al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기술되어 있다.
본원에 사용된 용어 "면역어드헤신"은 이종 단백질("어드헤신", 예를 들어 수용체, 리간드 또는 효소)의 "결합 도메인"을 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 성분과 조합한 항체 유사 분자를 나타낸다. 구조적으로, 면역어드헤신은 항체의 항원 인지 및 결합 부위(항원 조합 부위)와 다른 (즉 "이종"인) 바람직한 결합 특이성을 갖는 어드헤신 아미노산 서열과 면역글로블린 불변 도메인 서열의 융합물을 포함한다. 면역어드헤신 중의 면역글로블린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로블린, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입, IgA, IgE, IgD 또는 IgM로부터 수득할 수 있다.
"헤테로다량체", "헤테로다량체 컴플렉스" 또는 "헤테로다량체 폴리펩티드"는, 적어도 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 분자이고, 여기서 제 2 폴리펩티드는 제 1 폴리펩티드와는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 차이난다. 헤테로다량체는 제 1 및 제 2 폴리펩티드에 의해 형성된 "헤테로이량체"를 포함하거나 제 1 및 제 2 폴리펩티드 이외의 폴리펩티드가 존재하는 경우 보다 고차원적 3차 구조를 형성할 수 있다.
본원에 사용된 "폴리펩티드"는 일반적으로 악 10개 이상의 아미노산을 갖는 펩티드 및 단백질을 언급한다.
본원에 사용된 용어 "면역억제 특성" 또는 이의 변형은, 이로 제한됨이 없이, 체액성 및 세포-매개된 면역을 포함한 면역계를 수반하는 하나 이상의 정상적 활성 및/또는 작용을 직접적으로나 간접적으로 억제하는 항체의 특성을 언급한다.
본원에 사용된 용어 "Fc 영역"은 일반적으로 면역글로불린 중쇄의 C-말단 폴리펩티드 서열 (이는 온전한 항체의 파파인 분해에 의해 수득될 수 있다)을 포함하는 이량체 컴플렉스를 언급한다. Fc 영역은 천연 또는 변이 Rc 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 서열의 경계가 다양할 수 있지만, 사람 IgG 중쇄 Fc 서열은 통상적으로 약 위치 Cys226의 아미노산 잔기 또는 약 위치 Pro230로부터 Fc의 카복실 말단으로 뻗는 것으로 정의된다. 면역글로불린의 Fc 서열은 일반적으로 2개의 불변 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 임의로 CH4 도메인을 포함한다. 본원에서 "Fc 폴리펩티드"는 Fc 영역을 구성하는 폴리펩티드 중 하나를 의미한다. Fc 폴리펩티드는 적합한 면역글로불린, 예로 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입, IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다. 일부 양태에서, Fc 폴리펩티드는 (일반적으로 이의 N 말단에서) 야생형 힌지 서열의 일부 또는 전체를 포함한다. 일부 양태에서, Fc 폴리펩티드는 기능성 또는 야생형 힌지 서열을 포함하지 않는다.
"항체-의존적 세포-매개된 세포독성" 또는 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예: 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식구)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인지하여 표적 세포를 용해시키는 세포-매개된 반응을 언급한다.
용어 "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하기 위해 사용된다. 예를 들어, FcR은 천연 서열 사람 FcR일 수 있다. 일반적으로, FcR은 IgG 항체를 결합하고 (감마 수용체), the FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브부류의 수용체 (이들 수용체의 대립형질 변이체 및 달리는 스플라이싱된 형태를 포함)를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 주로 세포질 도메인이 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함한다. 또한, 다른 이소타입의 면역글로불린도 특정한 FcR에 의해 결합될 수 있다 [Janeway et al., Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4th ed., 1999)]. 활성화 수용체 FcγRIIA은 이의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기초된 활성화 모티프 (ITAM)을 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기초된 억제 모티프 (ITIM)을 포함한다 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)]. FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 앞으로 확인될 것을 포함하여 기타 FcR이 본원에서 용어 "FcR"에 포함된다. 또한, 이 용어는 모 IgG의 태아로의 전달에 책임이 있는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976); 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)].
본원에 사용된 "힌지 영역", "힌지 서열" 및 이의 변이체는, 예를 들어 문헌 [Janeway et al., Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4th ed., 1999); Bloom et al., Protein Science (1997), 6:407-415; Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202]에 기술된, 당해 기술 분야에서 공지된 의미의 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "시스트론"은 광범위하게는 폴리펩티드 쇄 및 인접한 조절 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 해독 단위에 상응하는 유전적 요소를 언급한다. "인접한 조절 서열"은, 예를 들어 해독 개시 영역 (TIR, 이하에서 정의됨) 및 종결 영역을 포함한다.
본원에 사용된 "해독 개시 영역" 또는 TIR은 목적 유전자의 해독 개시의 능력을 제공하는 핵산 영역을 언급한다. 일반적으로, 특정 시스트론 내의 TIR은 리보좀 결합 부위 (RBS) 및 이에 대한 서열 5' 및 3'를 포함한다. RGA는 최소한으로 샤인-달가노 영역 및 개시 코돈 (AUG)를 포함하는 것으로 정의된다. 따라서, TIR은 또한 해독될 핵산 서열의 적어도 일부를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 TIR은 시스트론 내의 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 서열에 선행하는 시그널 펩티드를 암호화하는 분비 시그널 서열을 포함한다. TIR 변이체는 TIR의 특성, 예로 하기에서 정의되는 바와 같은 해독 세기를 변화시키는 TIR 영역 내의 서열 변이체 (특히 치환물)를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 TIR 변이체는 시스트론 내의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 서열에 선행하는 분비 시그널 서열의 처음 2 내지 약 14개, 바람직하게는 약 4 내지 12개, 보다 바람직하게는 약 6개의 코돈에 서열 치환체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "해독 세기"는 TIR의 하나 이상의 변이체가 폴리펩티드의 분비를 지시하는데 사용되는 조절 시스템에서 분비되는 폴리펩티드의 측정치 및 야생형 TIR 또는 동일한 배양 및 검정 조건 하의 일부 다른 조절과 비교되는 결과를 언급한다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 본원에 사용된 "해독 세기"는, 예를 들어 mRNA 안정성, 리보좀 결합 부위에 결합하는 리보좀의 효능 및 막을 가로지른 전위의 방식의 측정치를 포함할 수 있다.
"분비 시그널 서열" 또는 "시그널 서열"은 세포막, 예를 들어 원핵생물의 내막 또는 내막과 외막 모두를 통해 새로이 합성된 목적 단백질을 통과시키는데 사용될 수 있는 짧은 시그널 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 언급한다. 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 폴리펩티드와 같은 목적 단백질은 그 자체로서 원핵생물 숙주 세포의 페리플라즘 또는 배양 배지로 분비될 수 있다. 분비 시그널 서열에 의해 암호화되는 시그널 펩티드는, 발현될 폴리펩티드에 고유한 시그널 펩티드를 포함하여, 숙주 세포에 대해 내생적이거나 외생적일 수 있다. 분비 시그널 서열은 통상적으로 발현될 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하며, 통상적으로 생합성과 세포질로부터 폴리펩티드의 분비 사이에 효소적으로 제거된다. 따라서, 시그널 펩티드는 통상 성숙한 단백질 산물에는 존재하지 않는다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 이러한 향체가 결합하는 항원 (예: c-met 및 VEGF 수용체)의 생물학적 활성을 억제 또는 감소시키는 것이다.
본원에 사용된 "효능제 항체"는 목적 폴리펩티드 (예: HGF 및 VEGF)의 기능적 활성 중 하나 이상을 모방하는 항체이다.
본원에 사용된 "종양 항원"은 당해 기술 분야에 공지된 의미를 포함하며, 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 상이하게 발현되는 임의의 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 분자는 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 검출가능하거나 상당히 높거나 낮은 수준으로 발현된다. 일부 양태에서, 상기 분자는 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 검출가능하거나 상당히 높거나 낮은 수준의 생물학적 활성을 나타낸다. 일부 양태에서, 상기 분자는 종양 세포의 종양원성 특징에 기여하는 것으로 공지되거나 생각된다. 많은 종양 항원이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 또한, 분자가 종양 항원인지의 여부는 당업자에게 널리 공지된 기술 및 검정, 예를 들어 클론형성 검정, 형질전환 검정, 시험관 내 또는 생체 내 종양 형성 검정, 겔 이동 검정, 유전자 넉아웃 분석 등에 따라 측정될 수 있다.
"장애"는 본 발명의 항체 또는 방법을 이용한 처리로부터 이익을 얻는 모든 상태이다. 이는 포유동물을 문제의 장애에 걸리게 하는 병적 상태를 포함한 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본원에서 처리되는 장애의 비제한적 예는 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프성 악성종양; 뉴런, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 기타 선, 대식구, 상피, 간질 및 블라스토코엘릭 (blastocoelic) 장애; 및 염증, 면역 및 기타 혈관형성-관련 장애를 포함한다.
용어 "암" 및 "암성"은 통상적으로 비조절된 세포 성장/증식으로 특징지워지는 생리학적 상태를 기술하기 위해 언급된다. 암의 예는, 이로 제한됨이 없이, 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함한다. 이러한 암에 대한 보다 특정한 예는 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 골수종 (예: 다발성 골수종), 간세포암 (hepatocellular cancer), 위장암, 췌장암, 신경교종/신경교아세포종 세포 (예: 악성 성상세포종, 다형성 교모세포종, 악성 핍지교종 및 악성 올리고덴드로성상세포종), 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양 (hepatoma), 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
본원에서 "자가면역 질환"은 개체의 자신의 조직으로부터 발생하고 이에 대해 지시되는 비-악성 질환 또는 장애이다. 본원에서 자가면역 질환은 구체적으로 악성 또는 암성 질환 또는 상태, 특히 B 세포 림프종, 급성 림프성 백혈병 (ALL), 만성 림프성 백혈병 (CLL), 모양 세포성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 배제시킨다. 자가면역 질환 또는 상태의 예는, 이로 제한됨이 없이, 염증 반응, 예를 들어 건선 및 피부염 (예: 아토피성 피부염)을 포함한 염증성 피부 질환; 전신성 경피증 및 경화증; 염증성 장 질환 (예: 크론 질환 및 궤양성 대장염)과 관련된 반응; 호흡 장애 증후군 (성인 호흡 장애 증후군 (ARDS)을 포함); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 대장염; 사구체신염; 알레르기 상태, 예를 들어 습진 및 천식 및 T세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 기타 상태; 아테롬성 동맥경화증; 백혈구 부착 결핍증; 류마티스성 관절염; 전신 홍반성 루프스 (SLE); 진성 당뇨병 (예: 제 I형 진성 당뇨병 또는 인슐린 의존적 진성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노이드 증후군 (Reynaud's syndrome); 자가면역 갑상선염; 알레르기성 뇌척수염; 조르겐 증후군 (Sjorgen's syndrome); 연소자형 당뇨병; 및 결핵, 유육종증, 다발성근염, 육아종증 및 혈관염에서 통상적으로 발견되는 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연 과민증과 관련된 면역 반응; 악성빈혈 (애디슨병); 백혈구 누출을 수반하는 질환; 중추신경계 (CNS) 염증 장애; 다발성 기관 손상 증후근; 용혈성 빈혈 (이로 제한됨이 없이, 크라이오글로빈 혈증 (cryoglobinemia) 또는 쿰브스 양성 빈혈 (Coombs positive anemia); 중증 근무력증; 항원-항체 컴플렉스 매개된 질환; 항-사구체 기저막 질환; 항인지질 증후근; 알러지성 신경염; 그레이브스 질환 (Graves' disease); 람버트-이튼 근무력증 증후군 (Lambert-Eaton myasthenic syndrome); 수포성유천포창 (pemphigoid bullous); 천포창 (pemphigus); 자가면역 다중내분비병증 (autoimmune polyendocrinopathies); 라이터 질환 (Reiter's disease); 강직인간 증후군(Stiff-man syndrome); 베체트 질환 (Behcet disease); 거세포동맥염 (giant cell arteritis); 면역 복합체 신장염; IgA 신장병; IgM 다발신경병증; 면역 혈소판 감소성 자반증 (immune thrombocytopenic purpura: ITP) 또는 자가면역 혈소판감소증 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 처리되는 개체 또는 세포의 천연 과정을 변화시키기 위한 시도의 임상적 중재를 언급하며 임상적 병리의 예방을 위해 또는 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발을 예방, 증후근의 경감, 질환에 대한 직접적 또는 간접적 병적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 소강 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 질환 또는 장애의 지연 전개에 사용된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체 및 방법은 종양을 퇴화시킨다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체 및 방법은 종양/암 성장을 억제시킨다.
"유효량"은 목적하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해, 필요한 기간 동안 투약량에서, 유효한 양을 언급한다. 본 발명의 항체의 "치료학적 유효량"은 개체의 질환 상태, 나이, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유도할 항체의 능력과 같은 요인에 따라 다양할 수 있다. 또한, 치료학적 유효량은 항체의 독성 또는 유해 효과보다 치료학적으로 유리한 효과가 큰 양이다. "예방학적 유효량"은 목적하는 예방적 결과를 달성하기 위해, 필요한 기간 동안 투약량에서, 유효한 양을 언급한다. 통상적으로 (반드시는 아님), 예방적 용량은 질환의 발병 전 또는 초기 상태에서 피검물에 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
본원에서 사용된, 본 발명의 항체 단편에 대한 용어 "실질적인 이펙터 기능을 갖지 않는다"는 본 발명의 항체 단편의 검출가능한 이펙터 기능 활성의 양과 항체의 야생형 글리코실화된 상대물에 의해 표현되는 활성의 양 사이의 차이가 당업자에게 명백한 바와 같이 통계학적으로 유의하다는 것을 의미하며, 여기서 본 발명의 항체 단편의 활성의 양은 야생형 상대물에 의해 표현되는 활성의 양보다 낮다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체 단편은 통계학적으로 유의한 배경 수준 이상인 (FcRn 결합 이외의) 이펙터 기능 활성 수준은 나타내지 않는다. 본원에서 사용된, 본 발명의 항체 단편에 대한 용어 "면역억제 특성이 약하거나 없는"은 항체가 환자에게 투여 시 생물학적으로 의미있는 양의 면역억제를 나타내지 않는다는 것을 의미한다. 당해 기술 분야에서 이해되는 바와 같이, 활성의 양은, 본 발명의 항체와 참조 상대물 사이의 비교가 수행될 수 있는 한, 정량적으로 또는 정성적으로 측정될 수 있다. 활성은 본원에 기술된 것을 포함하여 당해 기술 분야에서 공지된 검정 또는 기술에 따라 측정되거나 검출될 수 있다. 본 발명의 항체 및 이의 참조 상대물에 대한 활성의 양은 동시에 또는 별도의 수행을 측정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 유사한", "실질적으로 동등한", "실질적으로 같은" 및 이의 변형들은, 당업자가 2개의 값 사이의 차이를 수치적 값으로 측정되는 생물학적, 물리적 또는 정량적 특성과 관련하여 생물학적 의미가 약하거나 없다고 고려하도록, 2개의 수치적 값 (일반적으로 하나는 본 발명의 항체와 관련되고 다른 하나는 이의 참조 상대물과 관련됨) 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 2개의 값 사이의 차이는 참조 상대물에 대한 값의 함수로서 바람직하게는 약 50 % 미만, 바람직하게는 약 40 % 미만, 바람직하게는 약 30 % 미만, 바람직하게는 약 20 % 미만, 바람직하게는 약 10 % 미만이다.
본 발명의 항체 단편은 또 다른 항체 형태 (예: Fab 단편 상대물)과 비교하여 "보다 안정" 하거나 "증가된 안정성"을 가지며, 본원에서 사용된 바와 같이 이의 변형물은 본 발명의 항체 단편이 참조 항체 (예: Fab 단편 상대물)과 비교하여 생체 내애서 검출가능/측정가능한 증가를 나타낸다는 것을 의미한다. 안정성은 본 발명의 항체 단편을 환자에게 투여 후 특정 시점에서 환자에 남아있는 항체 단편의 양의 표시로서 당해 기술에서 검토되는 반감기, 제거율 및/또는 임의의 다른 변수에 기초할 수 있다. 반감기 및/또는 제거율과 같은 안정성 변수를 측정하기 위한 방법이 당 기술 분야에 공지되어 있으며, 일부가 본원에서 기술된다.
"보체 의존적 세포독성" 및 "CDC"는 보체의 존재하에서의 표적물의 용해를 언급한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템 (C1q)의 제 1 성분이 코그네이트 항원과 컴플렉스를 형성한 분자 (예: 항체)에 결합함으로써 개시된다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자 (예: 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너 (예: 항원 또는 FcRn 수용체) 사이의 비공유결합적 상호작용의 총합의 세기를 언급한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화는 일반적으로 해리 상수 (Kd)에 의해 표시될 수 있다. 친화성은 본원에 기술된 방법을 포함하여 당해 기술 분양에 공지된 일반적 방법으로 측정될 수 있다. 낮은 친화성 항체는 항원 (또는 FcRn 수용체)을 약하게 결합하고 쉽게 해리하며, 고친화성 항체는 항원 (또는 FcRn 수용체)를 보다 세게 결합하여 오랫동안 결합한 상태를 유지한다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 작용을 제지 또는 억제하고/하거나 세포를 파괴시키는 물질을 언급한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예: At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학치료제, 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적으로 활성인 독소 (이의 단편 및/또는 변이체 포함)를 포함한다.
"화학치료제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 예는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 CYTOXAN® 사이클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카보퀴온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민 (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함); 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파촌; 락파촐; 콜치신; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 동족체 토포테칸 (HYCAMTIN®), CPT-11 (이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신, 스코폴레틴 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 동족체를 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스틴; 두오카르미신 (합성 동족체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 무스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 무스타드; 니트로우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님무스틴; 항생제, 예를 들어 에네디인 항생제 (예: 칼리체아미신, 특히 칼리체아미신 감마 1I 및 칼리케아미신 오메가 I1 (Agnew, Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994)); 디네미신 (디네미신 A를 포함); 에스페라미신; 네오카지노스타틴 크로모포 및 관련 크로모단백질 에네디인 항생제 크로모포), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (ADRLAMYCIN®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀 주사 (DOXIL®) 및 데옥시독소루비신을 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예를 들어 메토트렉세이트, 겜시타빈 (GEMZAR®), 테가푸르 (UFTORAL®), 카페시타빈 (XELODA®), 에포티올론 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 동족체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 동족체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 동족체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-아드레날, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미놀레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK® 다당류 컴플렉스 (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리초테세네스 (특히 T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE®, FILDESIN®); 데카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 톡소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (TAXOL®), 파클리탁셀의 크레모포가 없는 알부민-가공된 나노입자 제형 (ABRAXANETM), 및 독세탁셀 (TAXOTERE®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 동족체, 예를 들어 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴 (VELBAN®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (ONCOVIN®); 옥살리플라틴; 유코보린; 비노렐빈 (NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레틴산; 상기한 것들의 제약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 상기한 것들의 2개 이상의 배합물, 예로 CHOP (사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 배합 치료에 대한 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보빈과 배합된 옥살리플라틴 (ELOXATINTM)으로의 처리에 대한 약어)를 포함한다.
또한, 이러한 정의에는 종양의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하도록 작용하는 항-호르몬제가 포함되며, 종종 전신적 또는 신체 전부의 치료를 위한 형태이다. 이러한 예는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (NOLVADEX® 타목시펜을 포함), 랄록시펜 (EVISTA®), 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (FARESTON®); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절자 (ERD); 에스트로겐 수용체 길항제, 예로 풀베스트란트 (FASLODEX®); 난소를 막거나 닫히도록 작용하는 제제, 예로 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효능제, 예로 류프롤라이드 아세테이트 (LUPRON® 및 ELIGARD®), 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립테렐린; 기타 항-안드로겐, 예로 플루트아미드, 닐루트아미드 및 비칼루트아미드; 및 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예로 4(5)-이미다졸, 아미노글루테트이미드, 메게스트롤 아세테이트 (MEGASE®), 엑세메스탄 (AROMASIN®), 포르메스타니, 파드로졸, 보로졸 (RIVISOR®), 레트로졸 (FEMARA®), 및 아나스트로졸 (ARIMIDEX®)을 포함한다. 또한, 화학요법제의 이러한 정의는 비스포스포네이트, 예로 클로드로네이트 (예: BONEFOS® 또는 OSTAC®), 에티드로네이트 (DIDROCAL®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (ZOMETA®), 알렌드로네이트 (FOSAMAX®), 파미드로네이트 (AREDIA®), 틸루드로네이트 (SKELID®), 또는 리세드로네이트 (ACTONEL®); 및 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드 시토신 동족체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적 세포 증식에 관련된 시그널화 경로, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R)에서 유전자의 발현을 억제하는 것; 백신, 예로 THERATOPE® 백신 및 유전자 치료 백신, 예로 ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신 및 VAXID® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예: LURTOTECAN®); rmRH (예: ABARELIX®); 라파티닙 디토실레이트 (ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제: 또한 GW572016로 공지됨); COX-2 억제제, 예로 셀레콕시브 (CELEBREX®; 4-(5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)벤젠술폰아미드; 및 상기한 것들의 제약학적으로 허요되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, 용어 "제 1" 폴리펩티드 및 "제 2" 폴리펩티드, 및 이의 변형은 단순한 일반적 확인자이며, 본 발명의 항체의 특이적 폴리펩티드 또는 성분을 확인하기 위해 취해진 것이 아니다.
"돌출부 (protuberance)"는, 제 1 폴리펩티드의 경계면으로부터 돌출하여 헤테로다량체를 안정화하도록 인접한 경계면 (즉, 제 2 폴리펩티드의 경계면)에 있는 상보적 공동에 위치가능하고 따라서 호모다량체 형성에 비해 헤테로다량체 형성이 유리한, 하나 이상의 아미노산 측쇄를 언급한다. 돌출부는 최초 경계면에 존재하거나, 합성적으로 (즉, 경계면을 암호화하는 핵산을 변형시켜) 도입될 수 있다. 보통은, 제 1 폴리펩티드의 경계면을 암호화하는 핵산을 돌출부를 암호화하도록 변형시킨다. 이를 달성하기 위해, 제 1 폴리펩티드의 경계면에 있는 하나 이상의 "최초" 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산을 최초 아미노산 잔기 보다 큰 측쇄 용적을 갖는 하나 이상의 "도입 (import)" 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산으로 대체시킨다. 하나 이상의 최초 및 상응 도입 잔기가 있을 수 있다. 대체될 수 있는 최초 잔기의 수에 대한 상한은 제 1 폴리펩티드의 경계면에 있는 총 잔기의 수이다. 다양한 아미노산 잔기의 측쇄 용적이 하기 표에 나타나 있다.
아미노산 잔기의 특성
아미노산 1문자 약어 매쓰a (달톤:daltons) 용적b (옹스트럼3) 접근가능한 표면적c (옹스트럼2)
알라닌 (Ala) A 71.08 88.6 115
아르기닌 (Arg) R 156.20 173.4 225
아스파라긴 (Asn) N 114.11 117.7 160
아스파트산 (Asp) D 115.09 111.1 150
시스테인 (Cys) C 103.14 108.5 135
글루타민 (Gln) Q 128.14 143.9 180
글루탐산 (Glu) E 129.12 138.4 190
글리신 (Gly) G 57.06 60.1 75
히스티딘 (His) H 137.15 153.2 195
이소루이신 (Ile) I 113.17 166.7 175
루이신 (Leu) L 113.17 166.7 170
루이신 (Lys) K 128.18 168.6 200
메티오닌 (Met) M 131.21 162.9 185
페닐알라닌 (Phe) F 147.18 189.9 210
프롤린 (Pro) P 97.12 122.7 145
세린 (Ser) S 87.08 89.0 115
트레오닌 (Thr) T 101.11 116.1 140
트립토판 (Trp) W 186.21 227.8 255
티로신 (Tyr) Y 163.18 193.6 230
발린 (Val) V 99.14 140.0 155
a 아미노산 분자량 - 물 분자량. 문헌 [Handbook of Chemistry and Physics, 43rd ed. Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961]로부터의 값.
b 문헌[A. A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24:107-123, 1972]으로부터의 값.
c 문헌 [C. Chothia, J. Mol. Biol. 105:1-14, 1975]으로부터의 값. 접근가능한 표면적은 이 참조문의 도 6 내지 20에서 정의된다.
돌출부를 형성하기 위한 바람직한 도입 잔기는 일반적으로 천연 발생 아미노산 잔기이며, 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y) 및 트립토판 (W) 중에서 선택된다. 가장 바람직한 잔기는 트립토판 및 티로신이다. 하나의 양태에서, 돌출부를 형성하기 위한 최초 잔기는 작은 측쇄 용적을 갖는다 (예: 알라닌, 아스파라긴, 아스파트산, 글리신, 세린, 트레오닌 또는 발린).
"공동 (cavity)"은 제 2 폴리펩티드의 경계면으로부터 들어가 제 1 폴리펩티드의 인접한 경계면에 있는 상응하는 돌출부를 수용하는 하나 이상의 아미노산 측쇄를 언급한다. 공동은 최초 경계면에 존재하거나 (예를 들어 경계면을 암호화하는 핵산을 변형시켜) 합성적으로 도입될 수 있다. 보통은, 제 2 폴리펩티드의 경계면을 암호화하는 핵산은 공동을 암호화하도록 변형된다. 이를 달성하기 위해, 제 2 폴리펩티드의 경계면에 있는 적어도 하나의 "최초" 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산은, 최초 아미노산 잔기 보다 작은 측쇄 용적을 갖는 하나 이상의 "도입" 아미노산 잔기를 암호화하는 DNA로 대체된다. 하나 이상의 최초 및 상응하는 도입 잔기가 있을 수 있다. 대체되는 최초 잔기의 수에 대한 상한은 제 2 폴리펩티드의 경계면에 이는 잔기의 총수이다. 다양한 아미노산의 측쇄 용적이 상기 표 1에 나타나 있다. 공동을 형성하기 위한 바람직한 도입 잔기는 통상 천연 발생 아미노산 잔기이며, 바람직하게는 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T) 및 발린 (V) 중에서 선택된다. 가장 바람직한 잔기는 세린, 알라닌 또는 트레오닌이다. 하나의 양태에서, 공동을 형성하기 위한 최초 잔기는 큰 측쇄 용적을 갖는다 (예: 티로신, 아르기닌, 페닐알라닌 또는 트립토판).
"최초" 아미노산 잔기는 최초 잔기 보다 작거나 큰 측쇄 용적을 가질 수 있는 "도입" 잔기에 의해 대체되는 것이다. 도입 아미노산 잔기는 천연 발생인거나 비-천연 발생의 아미노산 잔기일 수 있으나, 바람직하게는 천연 발생 아미노산 잔기이다. "천연 발생" 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 암호화되고 상기 표 1에 열거된 잔기이다. "비-천연 발생" 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 암호화되지 않으나 폴리펩티드 쇄 내에서 인접한 아미노산 잔기(들)을 공유적으로 결합할 수 있는 잔기를 의미한다. 비-천연 발생 아미노산 잔기의 예는, 예를 들어 노르루이신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 문헌 [Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)]에 기술된 것과 같은 기타 아미노산 잔기 동족체이다. 이러한 비-천연 발생 아미노산 잔기를 생성하기 위해서, 문헌 [Noren et al. Science 244: 182 (1989) 및 Ellman et al., 상기 참조]의 절차가 이용될 수 있다. 간단히 설명하면, 이는 억제제 tRNA를 비-천연 발생 아미노산 잔기로 화학적으로 활성화시킨 후 시험관 내 전사하고 RNA를 해독하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 하나 이상의 최초 아미노산 잔기를 대체하는 것을 포함하나, 하나 이상의 최초 잔기가 대체될 수도 있다. 보통은, 제 1 또는 제 2 폴리펩티드의 경계면에 있는 총 잔기에 지나지 않는 잔기가 대체되는 최초 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 통상적으로, 대체를 위한 최초 잔기는 "묻힌다". "묻힌 (buried)"은 잔기가 본질적으로 용매에 접근가능하지 않다는 것을 의미한다. 일반적으로, 도입 잔기는 가능한 산화를 방지하거나 디술파이드 결합의 잘못 짝지음을 방지하기 위해 시스테인이 아니다.
돌출부는 공동에 "위치가능"하며, 이는, 각각 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드의 경계면에 있는 돌출부 및 공동의 공간적 배치 및 돌출부 및 공동의 크기가, 돌출부가 경계면에서 제 1 및 제 2 폴리펩티드의 정상적 화합을 유의하게 방해하지 않으면서 공동에 위치될 수 있도록 한다는 것을 의미한다. 돌출부, 예로 Tyr, Phe 및 Trp는 통상적으로 경계면의 축으로부터의 수직으로 연장되지 않고 바람직한 배치를 갖기 때문에, 돌출부의 상응하는 공동과의 정렬은 X-선 결정학 또는 핵자기공명 (NMR)에 의해 수득되는 구조와 같은 3차원 구조에 기초된 돌출부/공동 쌍을 모델링하는 것에 의존한다. 이는 당해 기술 분야에서 널리 수용되는 기술을 이용하여 달성될 수 있다.
"최초 (original) 또는 원형 (template) 핵산"은 돌출부 또는 공동을 암호화 하기 위해 "변형" (즉, 유전자 조작된 또는 돌연변이) 될 수 있는 목적 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 의미한다. 최초 또는 출발 핵산은 천연 발생 핵산일 수 있거나, 앞서 변형된 (예: 사람화 항체 단편) 핵산을 포함할 수 있다. 핵산의 "변형"은 최초 핵산이 목적 아미노산 잔기를 암호화하는 하나 이상의 코돈을 삽입, 결실 또는 대체에 의해 돌연변이시키는 것을 의미한다. 일반적으로, 최초 잔기를 암호화하는 코돈은 도입 잔기를 암호화하는 코돈으로 대체된다. DNA를 이러한 방식으로 유전자 조작하기 위한 기술이 문헌 [Mutagenesis: a Practical Approach, M. J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, UK. (1991)]에서 검토되었으며, 예를 들어 부위-지시된 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발 및 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 돌연변이유발을 포함한다. 최초/원형 핵산을 변형시킴으로써, 최초/원형 핵산에 의해 암호화되는 최초/원형 폴리펩티드가 상응하게 변형된다.
돌출부 또는 공동은 합성적 수단, 예를 들어 재조합 기술, 시험관 내 펩티드 합성, 전술된 비-천연 발생 아미노산 잔기의 도입을 위한 기술, 펩티드의 효소적 또는 화학적 커플링 또는 이들 기술의 일부 조합에 의해 제 1 또는 제 2 폴리펩티드의 경계면으로 도입될 수 있다. 따라서, "도입되는" 돌출부 또는 공동은 "비-천연 발생" 또는 "비-자연적"인 것이며, 이는 자연에 또는 최초 폴리펩티드에 존재하지 않는다는 것을 의미한다 (예: 사람화 단일클론 항체).
일반적으로, 돌출부를 형성하기 위한 도입 아미노산 잔기는 상대적으로 적은 수의 "로타머 (rotamer)" (예: 약 3 내지 6)를 갖는다. "로타머"는 아미노산 측쇄의 에너지적으로 유리한 구조이다. 다양한 아미노산 잔기의 수가 문헌 [Ponders and Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987)]에 검토되어 있다.
"분리된" 헤테로다량체는 자연 세포 배양 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 헤테로다량체를 의미한다. 자연 환경의 오염 성분은 헤테로다량체에 대한 진단 또는 치료적 이용을 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 헤테로다량체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법으로 측정 시 95 중량% 초과, 보다 바람직하게는 99 중량% 초과의 단백질, (2) 스피닝 컵 서열분석기로 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도, 또는 (3) 코마시 블루 또는 실버 염색을 이용한 환원 또는 비환원 조건 하의 SDS-PAGE에 의해 균일할 정도로 정제될 것이다.
본 발명의 헤테로다량체는 일반적으로 실질적인 균질 상태로 정제된다. 용어 "실질적으로 균질한", "실질적으로 균질한 형태" 및 "실질적인 균질성"은 생성물이 바람직하지 않은 폴리펩티드 배합물 (예: 호모다량체)로부터 기원하는 부산물이 실질적으로 없다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 순도로 표현되는 실질적 균질성은 부산물의 양이 10 %를 초과하지 않거나, 5 % 이하이거나 1 % 이하이거나 0.5 % 이하라는 것을 의미하며, 여기서 비율 (%)는 중량에 의한 것이다.
표현 "조절 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 언급한다. 예를 들어 원핵세포에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위 및 가능하게는 아직 잘 이해되지 않은 다른 것을 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그널, 및 인핸서를 사용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있는 경우 "작동적으로 연결"된다. 예를 들어, 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현되는 경우, 프리서열 또는 분비 리더를 위한 DNA가 폴리펩티드를 위한 DNA에 작동적으로 연결되며; 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우, 코딩 서열에 작동적으로 연결되고; 또는 이동을 용이하게 하기 위해 리보좀 결합 부위가 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"은 연결되는 DNA 서열은 인접하며, 분비 리더의 경우 인접하고 판독 상인 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적일 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결합에 의해 수행된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상의 실시예 따라 사용된다.
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명의 항체의 재조합 생산을 위해, 이를 암호화하는 핵산을 분리하고 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터에 삽입한다. 항체를 암호화하는 DNA는 쉽게 분리되고 통상의 절차를 이용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 서열분석된다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터의 선택은 사용되는 숙주 세포에 부분적으로 의존한다. 일반적으로, 바람직한 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 (일반적으로 포유동물) 기원의 것이다.
원핵생물 숙주 세포를 사용한 항체 생성
벡터 제작
본 발명의 항체의 폴리펩티드 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 재조합 기술을 이용해 수득될 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오티드 서열은 하이브리도마와 같은 항체 생성 세포로부터 분리되고 서열분석될 수 있다. 달리, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 이 서열은 원핵생물 숙주에서 이종 폴리뉴클레오티드를 복제하고 발현할 수 있는 재조합 벡터로 삽입된다. 당 기술 분야에서 이용가능하고 공지된 많은 벡터가 본 발명의 목적에 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 선별은 주로 벡터에 삽입될 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환될 특정 숙주 세포에 의존할 것이다. 각각의 벡터는, 작용 (이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 이둘 모두) 및 벡터가 거주하는 특정 숙주 세포와의 적합성에 따라, 다양한 성분을 포함한다. 벡터 성분은 일반적으로, 이로 제한됨이 없이, 복제 기원, 선별 마커 유전자, 프로모터, 리보좀 결합 부위 (RBS), 시그널 서열, 이종 핵산 삽입물 및 전사 종결 서열을 포함한다.
일반적으로, 숙주 세포와 양립할 수 있는 종으로부터 유도되는 레플리콘 및 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터가 이들 숙주와 연관지어 사용된다. 벡터는 통상적으로 복제 부위 및 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 표시 서열을 갖는다. 예를 들어, 이. 콜라이는 통상적으로 이. 콜라이 종으로부터 유도되는 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환된다. pBR322는 암피실린 (Amp) 및 테트라사이클린 (Tet) 내성물을 암호화하는 유전자를 포함하여 형질전환된 세포를 확인하는 손쉬운 수단을 제공한다. 또한, pBR322, 이의 유도체 또는 기타 미생물성 플라스미드 또는 박테리오파아지는 내생적 (endogeneous) 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 포함하거나 이를 포함하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현을 위해 사용되는 pBR322 유도체의 예가 문헌 [Carter 등의 U.S. 특허 제5,648,237호]에 기술되어 있다.
또한, 숙주 미생물과 양립할 수 있는 레플리콘 및 조절 서열을 포함하는 파아지 벡터가 이들 숙주와 연관지어 형질전환 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, λGEMTM-11와 같은 박테이오파아지가 이. 콜라이 LE392와 같은 민감한 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있는 재조합 벡터를 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 폴리펩티드 성분 각각을 암호화하는 2개 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 시스트론에 대해 상부 (5')에 위치되는 발현을 조절하는 비해독 조절 서열이다. 원핵생물 프로모터는 통상적으로 유도성 및 구성적인 프로모터의 2개 부류로 나뉜다. 유도성 프로모터는 배양 조건, 예로 영양물의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화에 반응하여 조절 하에 있는 시스트론의 증가된 전사 수준을 개시하는 프로모터이다.
다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인지되는 많은 프로모터가 널리 공지되어 있다. 선택된 프로모터는 제한 효소 분해를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 본 발명의 벡터로 분리된 프로모터 서열을 삽입함으로써 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 시스트론에 작동적으로 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 많은 이종 프로모터 모두 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시하기 위해 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 이종 프로모터는 일반적으로 천연의 표적 폴리펩티드 프로모터와 비교하여 발현되는 표적 유전자의 우수한 전사 및 높은 수율을 가능하게 하기 때문에 사용된다.
원핵생물 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, β-갈락타마제 및 락토즈 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 그러나, 세균에서 작용하는 다른 프로모터 (예: 다른 공지된 세균 또는 파아지 프로모터)도 또한 적합하다. 이들의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있으며, 따라서 기술자라면 모든 필요한 제한 부위를 공급하기 위한 어댑터 또는 링커를 사용하여 표적 경쇄 및 중쇄 [Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269]를 암호화하는 시스트론에 이들을 작동적으로 연결할 수 있다.
하나의 양태에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 막을 통해 발현되는 폴리펩티드의 전위를 지시하는 분비 시그널 서열을 포함한다. 일반적으로, 시그널 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 벡터로 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택되는 시그널 서열은 숙주 세포에 의해 인지되고 프로세싱되는 (즉, 시그널 펩티다제에 의해 절단되는) 것이어야 한다. 이종 폴리펩티드에 고유한 시그널 서열을 인지 및 프로세싱하지 않는 원핵생물 숙주 세포에 대해서, 시그널 서열은, 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, Ipp 또는 열-안정 엔테로톡신 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 군 중에서 선택되는 원핵생물의 시그널 서열로 치환된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 발현 시스템의 시스트론 모두에 사용되는 시그널 서열은 STII 시그널 서열 또는 이의 변이체이다.
또 다른 양상에서, 본 발명에 따른 면역글로불린의 생성은 숙주 세포의 세포질에서 일어나므로 각각의 시스트론 내에 분비 시그널 서열의 존재를 필요로 하지 않는다. 이와 관련하여, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄는 발현, 접힘 및 조립되어 (assembled) 세포질 내에서 기능적 면역글로불린을 형성한다. 특정 숙주 균주 (예: 이. 콜라이 trxB - 균주)는 디술파이드 결합 형성이 유리한 세포질 조건을 제공하여, 발현된 단백질 서브유니트의 적합한 접힘 및 조립을 가능하게 한다 [Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995)].
본 발명은 본 발명의 분비되고 적합하게 조립된 항체의 수율을 최대화하기 위해 발현되는 폴리펩티드 성분의 정량적 비율이 조절될 수 있는 발현 시스템을 재공한다. 이러한 조절은 적어도 부분적으로는 폴리펩티드 성분의 해독 세기를 동시에 조절함으로써 달성된다.
해독 세기를 조절하기 위한 하나의 기술이 문헌 [Simmons 등의 U.S. 특허 제5,840,523호]에 기술되어 있다. 이는 시스트론 내에 해독 개시 영역 (TIR)의 변이체를 사용한다. 지정된 TIR에 대해서, 일련의 아미노산 또는 핵산 서열 변이체를 다양한 해독 세기를 갖도록 제조하여 특정 쇄의 목적하는 발현 수준을 위해 이러한 인자를 조절하는 편리한 수단을 제공할 수 있다. TIR 변이체는, 비록 뉴클레오티드 서열의 침묵 변화가 바람직하더라도, 아미노산 서열을 변형시킬 수 있는 코돈 변화를 초래하는 통상의 돌연변이 기술로 생성될 수 있다. TIR의 변형은, 예를 들어 시그널 서열의 변형과 함께 샤인-달가노 서열의 수 또는 공간 간격의 변화를 포함할 수 있다. 돌연변이체 시그널 서열을 생성하기 위한 하나의 방법은 시그널 서열의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 (즉, 침묵 변화) 코딩 서열의 개시부에서의 "코돈 뱅크"의 생성이다. 이는 각각의 코돈의 제 3 뉴클레오티드 위치를 변화시킴으로써 달성될 수 있다; 추가로, 일부 아미노산, 예로 루이신, 세린 및 아르기닌은 뱅크 제조 시 복합성을 줄 수 있는 다수의 제 1 및 제 2 위치를 갖는다. 돌연변이유발에 대한 이러한 방법이 문헌 [Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158]에 기술되어 있다.
바람직하게는, 각각의 시스트로을 위한 여러가지의 TIR 세기를 갖는 한 세트의 벡터가 생성된다. 이러한 제한 세트는 각각의 쇄의 발현 수준 및 다양한 TIR 세기 조합 하에서의 목적하는 항체 산물의 수율 비교를 제공한다. TIR 세기는 문헌 [Simmons등의 U.S. 특허 제5,840,523호]에 상세히 기술된 바와 같이 리포터 유전자의 발현 수준을 정량함으로써 측정될 수 있다. 해독 세기 비교에 기초하여, 바람직한 개개의 TIR이 선택되어 본 발명의 발현 벡터 제작 시 조합된다.
폴리펩티드를 발현하는데 적합한 원핵생물 숙주세포는 아르캐박테리아 (Archaebacteria) 및 유박테리아 (Eubacteria), 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 유기체를 포함한다. 유용한 세균의 예는 에쉐리키아 (Escherichia) (예: 이. 콜라이), 바실루스 (Bacillus) (예: 비. 서브틸리스 (B. subtilis)), 엔테로박테리아 (Enterobacteria), 슈도모나즈 종 (Pseudomonas species) (예: 피. 아에루기노 사 (P. aeruginosa)), 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세칸스 (Serratia marcescans), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 쉬겔라 (Shigella), 리조비아 (Rhizobia), 비트레오실라 (Vitreoscilla), 또는 파라코쿠스 (Paracoccus)를 포함한다. 하나의 양태에서, 그람-음성 세포가 사용된다. 하나의 양태에서, 이. 콜라이 세포는 본 발명의 숙주로서 사용된다. 이. 콜라이 균주의 예는 균주 W3110 [Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC 제27,325호] 및 유전형 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR을 갖는 균주 33D3을 포함한 이의 유도체 [U.S. 특허 제5,639,635호]를 포함한다. 다른 균주 및 이의 유도체, 예로 이. 콜라이 294 (ATCC 제31,446호), 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 λ1776 (ATCC 제31,537호) 및 이. 콜라이 RV308(ATCC 제31,608호)가 또한 적합하다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 설명을 위한 것이다. 정의된 유전형을 갖는 상술된 세균 중 임의의 세균의 유도체를 제작하는 방법이 당 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기술되어 있다. 일반적으로 세균의 세포에 있는 레플리콘의 복제성을 고려하여 적합한 세균을 선별하는 것이 필요하다. 예를 들어, 널리 공지된 플라스미드, 예로 pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410이 레플리콘을 공급하는데 사용되는 경우, 이. 콜라이 또는 살모넬라 종이 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 통상적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비해야 하며, 추가의 프로테아제 억제제가 세포 배양물에 첨가되는 것이 바람직할 수 있다.
항체 생산
숙주 세포는 상술된 발현 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선별하거나 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키는데 적합하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양된다.
형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 구성물에 의해서 복제되도록 원핵생물 숙주로 도입되는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이러한 세포에 대해 적합한 표준 기술을 이용해 수행된다. 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리가 실질적인 세포-벽 장애물을 포함하는 세균 세포에 대해 일반적으로 사용된다. 형질전환을 위한 또 다른 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 이용되는 또 다른 기술은 전기천공이다.
원핵생물 숙주 세포는 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 당 기술 분야에서 공지된 어떠한 배지에서도 성장될 수 있다. 적합한 배지의 예는 루리아 브로스 (luria broth: LB) + 필수 영양 보충물을 포함한다. 일부 양태에서, 배지는 발현 벡터를 포함하는 원핵생물 세포의 선택적인 성장을 가능하게 하도록 발현 벡터의 제작물에 기초하여 선택된 선별제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 암피실린이 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위해 배지에 가해진다.
또한, 탄소, 질소 및 무기 포스페이트 공급원을 제외한, 모든 필요한 보충물이 적합한 농도로 포함될 수 있으며, 단독으로 도입되거나 복합 질소 공급원과 같이 또 다른 보충물 또는 배지와 함께 혼합물로서 도입된다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 환원제를 포함할 수 있다.
원핵생물 숙주 세포는 적합한 온도에서 배양된다. 이. 콜라이에 대해서, 예를 들어 바람직한 온도는 약 20 ℃ 내지 약 39 ℃, 바람직하게는 약 25 ℃ 내지 약 37 ℃, 보다 더 바람직하게는 약 30 ℃이다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5 내지 약 9의 범위일 수 있다. 이. 콜라이에 대해, pH는 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4, 보다 바람직하게는 약 7.0이다.
유도성 프로모터가 발현 벡터에 사용되는 경우, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에서 유도된다. 본 발명의 하나의 양상에서, PhoA 프로모터가 폴리펩티드의 전사를 조절하는데 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도를 위해 포스페이트-제한 배지에서 배양될 수 있다. 바람직하게는, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 이다 [Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147]. 당 기술 분야에 기술된 바와 같이, 사용되는 벡터 제작물에 따라, 다양한 다른 유도제가 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포의 페리플라즘으로 분비되고 이로부터 회수된다. 단백질 회수는 통상적으로, 삼투 쇽, 초음파 분해 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 파괴시키는 것을 수반한다. 세포를 파괴시킨 후, 세포 파편 또는 전체 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질은, 예를 들어 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 더욱 정제될 수 있다. 달리, 단백질은 배양 배지로 이동되어 이로부터 분리될 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거시키고, 배양 상등액을 여과시키며, 생산된 단백질의 추가 정제를 위해 농축시킬 수 있다. 발현된 폴리펩티드는 SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) 및 웨스턴 블롯 검정과 같은 일반적으로 공지된 방법을 이용하여 더욱 분리 및 확인될 수 있다.
본 발명의 하나의 양상으로, 항체 생산은 발효 공정에 의해 다량으로 수행된다. 다양한 대규모 유가식 (fed-batch) 발효 절차가 재조합 단백질의 생산에 이용가능하다. 대규모 발효는 적어도 1000 L의 용량, 바람직하게는 1000 내지 100,000 L 용량을 갖는다. 이들 발효기는 산소 및 영양물, 특히 글루코즈 (바람직한 탄소/에너지 공급원)을 분배시키기 위한 교반기 임펠러를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로 용적 용량이 약 100 L 이하인 발효조에서의 발효를 언급하며, 약 1 L 내지 약 100 L일 수 있다.
발효 공정에서, 단백질 발현의 유도는 통상적으로 세포가 적합한 조건 하에서 예를 들어 약 180 내지 220의 OD550를 갖는 목적하는 밀도로 성장한 후 개시되며, 상기 단계에서 세포는 초기 정상기에 존재한다. 당해 기술 분야에 공지되어 있고 상술된 바와 같이, 사용되는 벡터 제작물에 따라 다양한 유도제가 사용될 수 있다. 세포는 유도 전 보다 짧은 기간 동안 성장될 수 있다. 세포는, 보다 길거나 짧은 유도 시간이 이용될 수 있지만, 통상적으로 약 12 내지 50시간 동안 유도된다.
본 발명의 폴리펩티드의 생산 수율 및 양을 개선하기 위해서, 다양한 발효 조건이 변형될 수 있다. 예를 들어, 분비되는 항체 폴리펩티드의 적절한 조립 및 접힘을 개선하기 위해, 샤페론 단백질, 예로 Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (샤페론 활성을 갖는 펩티딜프롤릴 시스, 트랜스-이소머라제)을 과다발현하는 추가의 벡터가 숙주 원핵생물 세포를 공동-형질전환하기 위해 사용될 수 있다. 샤페논 단백질은 세균 숙주 세포에서 생성되는 이종 단백질의 적합한 접힘 및 가용성을 촉진하는 것으로 입증되었다 [Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., U.S. Pat. No. 6,083,715; Georgiou et al., U.S. Pat. No. 6,027,888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210].
발현되는 이종 단백질 (특히 단배질 분해적으로 민감한 단백질)의 단백질 분해를 최소화하기 위해서, 단백질 분해 효소가 결여된 특정 숙주 균주가 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주는 공지된 세균 프로테아제, 예로 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이의 배합물을 암호화하는 유전자에 유전적 돌연변이(들)를 갖도록 변형될 수 있다. 일부의 이. 콜라이 프로테아제-결여 균주가 사용가능하며, 예를 들어 문헌 [Joly et al. (1998), 상기 참조; Georgiou 등의 U.S. 특허 제5,264,365호; Georgiou 등의 U.S. 특허 제5,508,192호; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기술되어 있다.
하나의 양태에서, 단백질 분해 효소가 결여되고 하나 이상의 샤페론 단백질을 과다발현하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 균주가 본 발명의 발현 시스템에서 숙주 세포로서 사용된다.
항체 정제
하나의 양태에서, 본원에서 생산되는 항체 단백질은 추가의 검정 및 사용에 대해 실질적으로 균질한 제제를 수득하기 위해 정제될 수 있다. 당 기술 분야에서 공지된 표준 단백질 정제 방법이 이용될 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 절차에 대한 예이다: 면역친화 또는 이온-교환 컬럼에서 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 및 DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 Sephadex G-75를 사용한 겔 여과.
하나의 양상에서, 고체상에 고정화되는 단백질 A는 본 발명의 전체 길이 항체 생성물의 면역친화적 정제를 위해 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 대해 고친화도로 결합하는 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureas)로부터의 41 kD 세포벽 단백질이다 [Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13]. 단백질 A가 고정화되는 고체상은 바람직하게는 유리 또는 실리카 표면, 보다 바람직하게는 조절된 세공 유리 컬럼 또는 규산 컬럼을 포함하는 컬럼이다. 일부 적용에서, 컬럼은 오염물의 비특이적 부착을 방지하기 위한 시도에서 시약, 예로 글리세롤로 코팅되었다.
정제의 제 1 단계로서, 상술된 세포 배양물로부터 유도되는 제제는 단백질 A에 목적 항체의 특이적 결합을 가능하게 하는 단백질 A 고정화된 고체상에 적용된다. 이어서, 고체상은 이에 비특이적으로 결합된 오염물을 제거하기 위해 세척된다. 마지막으로, 목적 항체는 용출에 의해 고체상으로부터 회수된다.
진핵생물 숙주 세포를 사용한 항체 생성
벡터 성분은, 이로 제한됨이 없이, 하기 중 하나 이상을 포함한다: 시그널 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
(i) 시그널 서열 성분
진핵생물 숙주 세포에서 사용하기 위한 벡터는 또한 목적하는 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 시그널 서열 또는 다른 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 선택되는 이종 시그널 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인지 및 프로세싱 (즉 시그널 펩티다제에 의해 절단)되는 서열이다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 시그널 서열 및 바이러스 분비 리더, 예를 들어 헤르페스 심플렉스 gD 시그널이 이용가능하다.
이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 항체를 암호화하는 DNA에 판독 프레임으로 결합된다.
( ii ) 복제 기원
일반적으로 복제 성분의 기원은 포유동물 발현 벡터에 대해 필요하지 않다. 예를 들어, SV40 기원은 단지 초기 프로모터를 포함하기 때문에 전형적으로 사용될 수 있다.
( iii ) 선별 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선별 마커라고도 부르는 선별 유전자를 포함할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들면 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 관련되는 경우, 영양요구성을 보완하거나, (c) 복합 배지로부터는 얻을 수 없는 중요한 영양분을 공급하는 단백질을 암호화한다.
선별 방식에 대한 하나의 예시에서는, 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 사용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 이러한 세포들은, 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하기 때문에 선별 요법에서 살아남는다. 이러한 우성 선택에 대한 예에서는 약물인 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.
포유동물 세포에 대해 적합한 선별 마커의 다른 예는 항체 핵산을 흡수할 수 있는 세포를 동정할 수 있는 것들, 예를 들면 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 디아미나제, 오르니틴 디카르복실라제 등이다.
예를 들어, DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 모든 형질전환체를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지 내에서 배양함으로써 동정된다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예: ATCC CRL-9096)이다.
달리, 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또 다른 선별가능 마커, 예로 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 암호화하는 DNA 서열로 형질전환되거나 공동-형질전환된 숙주 세포 (특히 내생의 DHFR을 포함하는 야생형 숙주)는 선별가능 마커, 예로 아미노글리코사이드 항생제, 예로 카나마이신, 네오마이신 또는 G418를 위한 선별제를 포함하는 배지에서 세포 배양에 의해 선별될 수 있다 [U.S. 특허 제4,965,199호].
( iv ) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체 폴리펩티드 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함한다. 프로모터 서열은 진핵생물에 대해서 알려져 있다. 사실상, 모든 진핵생물 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 약 25 내지 30 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 다수 유전자의 전사 시작 부위로부터 70 내지 80 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역이다 (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다). 대부분 진핵생물 유전자의 3' 말단에는, 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일을 첨가하기 위한 시그널일 수 있는 AATAAA 서열이 존재한다. 이러한 서열들은 모두 진핵생물 발현 벡터 내로 적절하게 삽입된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 항체 폴리펩티드 전사는, 숙주 세포 시스템과 적합하다면, 예를 들어 바이러스, 예로 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예: 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 수득되는 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예로 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 열-쇽 프로모터에 의해 조절된다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는, SV40 바이러스 복제원점도 포함하는 SV40 제한효소 단편으로서 편리하게 수득된다. 사람 사이토메갈로바이러스의 즉시형 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 사용하는 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이러한 시스템에 대한 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한, 단순포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 조절 하에 마우스 세포에서 사람 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해 문헌 [Reyes et al., Nature 297:598-601(1982)]을 참조한다. 달리, 로우즈 육종 바이러스)의 긴 말단 반복물이 프로모터로서 사용될 수 있다.
(v) 인핸서 요소 성분
고등 진핵생물에 의한 본 발명의 항체를 암호화하는 DNA의 전사는 흔히 인핸서 서열을 벡터 내에 삽입함으로써 증가된다. 다수의 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자들로부터 공지되어 있다 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린). 그러나 통상적으로는, 예로는 진핵생물 세포 바이러스로부터의 인핸서가 사용될 것이다. 예를 들어, 복제 기원의 후반부 (bp 100-270) 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후반부 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소에 대한 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18(1982)]을 참조한다. 도 참조. 인핸서는 항체-암호화 서열에 대해 5' 또는 3' 부위에서 벡터로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치된다.
( vi ) 전사 종결 성분
진핵생물 숙주 세에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결 및 mRNA 안정화에 에 필요한 서열을 포함할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5', 때로는 3' 비해독 영역으로부터 얻을 수 있다. 이러한 영역들은 항체를 암호화하는 mRNA의 비해독 부분 내에 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 포함한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. PCT 공개 제W094/11026호 및 이에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
( vii ) 숙주 세포의 선별 및 형질전환
본원에서 벡터의 DNA를 클로닝 또는 발현하는데 적합한 숙주 세포는, 척추동물 숙주 세포를 포함하여 본원에 기술된 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 배양물 (조직 배양물) 중 척추동물 세포의 증식은 통상의 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40으로 형질전환된 멍키 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 사람 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁 배양으로 성장시키기 위해 서브클로닝된 293, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); CHO 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 (sertoli) 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 멍키 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 멍키 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 사람 경부암 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 케이나인 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 사람 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방암 (MMT 060562, ATCC CCL5 1); TRI 세포 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 사람 간암주 (Hep G2)를 포함한다.
숙주 세포는 항체 생산을 위한 상술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선별하거나 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭하기에 적합하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양된다.
( viii ) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지 내에서 배양될 수 있다. 시판되는 배지, 예를 들면 햄스 F10 (Ham's F10, Sigma), 최소 필수 배지 (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's medium: DMEM, Sigma)가 숙주 세포 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44(1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255(1980), 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; PCT 공개 제WO 90/03430호; 제WO 87/00195호; 또는 미국 특허 Re. 30,985]에 기술된 것들 중 임의의 배지가 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이러한 배지들 중 어느 것도 필요하다면 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예: 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예: 염화나트륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 및 인산나트륨, 인산칼슘, 인산마그네슘), 완충제 (예: HEPES), 뉴클레오티드 (예: 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예: GENTAMYCIN™ 약물), 미량 요소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 이와 동등한 에너지원을 보충할 수 있다. 당업자가 알 수 있는 기타 필요한 임의의 보충물도 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들면 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 대해 과거에 사용되던 것이며, 당업자에게 명백할 것이다.
( ix ) 항체의 정제
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는 세포 내에 생산되거나 배지로 직접적으로 분비될 수 있다. 만일 항체가 세포 내에서 생산된다면, 첫 번째 단계로서 숙주 세포 또는 용해된 단편, 예를 들어 원심분리 또는 초여과로 제거한다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 일반적으로 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 초여과 유니트로 상기 발현 시스템으로부터의 상청액을 먼저 농축한다. 단백질 분해를 억제하기 위해 상기 중 임의의 단계는 프로테아제 억제제, 예를 들면 PMSF를 포함할 수 있고, 우연한 오염물질의 발생을 예방하기 위해 항생제를 포함할 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들면, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피로 정제될 수 있는데, 여기서 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은, 종 및 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 영역의 이소타입에 좌우된다. 단백질 A는 사람 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄에 기초한 항체 정제에 사용될 수 있다 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13(1983)]. 모든 마우스 이소타입 및 사람 γ3에 대해 단백질 G가 권장된다 [Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575(1986)]. 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 기타 매트릭스들도 사용될 수 있다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들면 조절된 포어 글래스 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 신속한 유속 및 짧은 처리 시간을 가능케 해준다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 [J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 회수하려는 항체에 따라서는 기타 단백질의 정제를 위한 기술, 예를 들면 이온교환 컬럼 상에서의 분획법, 에탄올 침전법, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예: 폴리아스파트산 컬럼) 상에서의 헤파린 SEPHAROSE™ 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전법도 이용할 수 있다.
임의의 예비적 정제 단계(들)을 수행한 후, 목적 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물을, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예: 약 0 내지 약 0.25 M 염)에서 수행되는, 약 pH 2.5 내지 4.5의 용출 완충액을 사용하는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마코그래피할 수 있다.
활성 검정
본 발명의 항체는 당해 기술 분야에서 공지된 다양한 검정에 의해 이들의 물리적/화학적 특성 및 생물학적 기능을 특징지울 수 있다.
정제된 면역글로불린은, 이로 제한됨이 없이, N-말단 서열분석, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 매쓰 분광법, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 분해를 포함한 일련의 검정에 의해 특징지울 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 본원에서 생성되는 면역글로불린은 이들의 생물학적 활성에 대해 분석된다. 일부 양태에서, 본 발명의 면역글로불린은 이들의 항원 결합 활성에 대해 시험된다. 당해 기술 분야에서 공지되고 본원에서 사용될 수 있는 항원 결합 검정은, 제한 없이, 웨스턴 블롯, 방사성면역검정, ELISA, "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 형광 면역검정 및 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 이용하는 임의의 직접적 또는 경쟁적 결합 검정을 포함한다. 예시적인 항원 결합 검정이 하기 실시예에 제공된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 일부 (단 전부는 아님) 이펙터 기능을 갖는 변형된 항체를 고려하며, 이펙터 기능은, 특정 이펙터 기능 (예: 보체 및 ADCC)는 불필요하거나 유해하지만, 항체가 생체 내에서 항체의 반감기가 중요한 많은 적용에 대한 바람직한 후보물이도록 한다. 특정 양태에서, 생성된 면역글로불린의 Fc 활성을 측정하여 단지 바람직한 특성만이 유지되게 한다. 시험관 내 및/또는 생체 내 세포독성 검정을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/결핍을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행하여 항체가 FcγR 결합능은 결여되나 (따라서 ADCC 활성이 결여) FcRn 결합능은 보유하는 것을 확실하게 할 수 있다. 단구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현하는 반면, ADCC를 매개하기 위한 주요 세포인 NK 세포는 단지 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포에서 FcR의 발현이 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464쪽의 표 3에 요약되어 있다. 목적 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관 내 검정의 예가 문헌 [U.S. 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호]에 기술되어 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵구 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 달리 또는 추가로, 목적 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 기술된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여 항체가 C1q를 결합할 수 없어 CDC 활성이 결여되는 것을 확인할 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기술된 바와 같이, CDC 검정을 수행할 수 있다. 또한, 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예를 들어 실시예에 기술된 방법을 이용하여 FcRn 결합 및 생체 내 제거/반감기 측정을 수행할 수 있다.
사람화 항체
본 발명은 사람화 항체를 포함한다. 비-사람 항체를 사람화하기 위한 다양한 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 사람화 항체는 비-사람인 공급원으로부터 항체로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비-사람 아미노산 잔기는 종종 "도입" 잔기로 언급되며, 이는 통상적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 사람화는 본질적으로 사람 항체의 상응하는 서열을 과가변 영역 서열로 대체함으로써 문헌 [Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536]의 방법에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "사람화" 항체는 온전한 사람 가변 도메인보다 실질적으로 적은 도메인이 비-사람 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메릭 항체 [U.S. 특허 제4,816,567호]이다. 실제로, 사람화 항체는 통상적으로 일부 과가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 사람 항체이다.
사람화 항체를 제조하는데 사용될 경쇄 및 중쇄 모두의 사람 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "최적-조화 (best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열이 공지된 사람 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 가까운 사람 서열이 사람화 항체를 위한 사람 골격으로 허용된다 [Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901]. 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브군의 모든 사람 항체에 대한 컨센서스 서열로부터 유도되는 특정 골격을 사용한다. 동일한 골격이 수개의 상이한 사람화 항체에 대해 사용될 수 있다 [Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623].
또한, 항체가 항원에 대한 고친화성 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하면서 사람화되는 것이 중요하다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 하나의 방법에 따라, 모 서열 및 사람화 서열의 3차원적 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적인 사람화 생성물의 분석 과정에 의해 사람화 항체를 제조한다. 3차원적 면역글로불린 모델은 시판되며 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원적 입체 구조를 설명하고 나타내는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이의 조사는 후보 면역글로불린 서열의 기능화에 있어 잔기의 가능한 역할 분석 (즉, 항원을 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기의 분석)을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성이 달성되도록 FR 잔기를 선택하고 수용체 및 도입 서열로부터 조합될 수 있다. 일반적으로, 과가변 영역 잔기가 항원 결합에 영향을 끼치는데 직접적으로 가장 실질적으로 수반된다.
항체 변이체
하나의 양상으로, 본 발명은 Fc 영역을 포함하는 Fc 폴리펩티드의 경계면에 헤테로이량체화를 촉진 및/또는 증진시키는 변형을 포함하는 항체 단편을 제공하다. 이러한 변형은 제 1 Fc 폴리펩티드로 돌출부의 도입 및 제 2 Fc 폴리펩티드로 공동의 도입을 포함하며, 돌출부는 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드의 컴플렉스화를 촉진하도록 공동에 위치가능하다. 이들 변형을 갖는 항체를 생성하는 방법이, 예를 들어 문헌 [U.S. 특허 제5,731,168호]에 기술된 바와 같이 당해 기술 분야에서 공지되어 있다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 항체의 아미노산 서열의 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체 핵산으로 적합한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 잔기로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 어떠한 조합도, 최종 제작물이 목적하는 특성을 갖는 한, 최종 제작물에 가해질 수 있다. 아미노산 대체물은 서열이 제조되는 시점에서 주제 항체의 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
돌연변이유발에 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기술된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기의 군이 확인되고 (예: arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기) 아미노산의 항원과의 상호작용에 영향을 끼칠 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체된다. 이어서, 치환에 대한 기능적 민감성을 입증하는 이들 아미노산 위치 선정은 치환의 부위에서 또는 부위를 위해 추가 또는 다른 변이체를 도입함으로써 다듬어진다. 따라서, 아미노산 서열 변화를 도입하기 위한 부위는 미리결정되는 반면, 돌연변이 자체의 특성은 미리결정될 필요가 없다. 예를 들어, 지정된 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위하여, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발이 표적 코돈 또는 영역에서 수행되며, 발현된 면역글로불린은 목적하는 활성에 대해 스크리닝된다.
아미노산 서열 삽입물은 하나의 잔기로부터 수백 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드까지의 길이 범위에 걸친 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합믈, 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열 내 삽입물을 포함한다. 말단 삽입물의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT에 대한 것) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단의 융합물을 포함한다.
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 상이한 잔기에 의해 대체된 항체 분자에 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이유발을 위한 가장 중요한 부위는 과가변 영역을 포함하나, FR 대체물도 또한 고려된다. 보존적 치환이 하기 표 2에서 "바람직한 치환물"의 항목 아래에 나타나 있다. 이러한 치환물"이 생물학적 활성에 변화를 일으키는 경우, 표 2에서 "예시적 치환물로 표시되거나 아미노산 부류를 참조하여 하기에 더욱 기술되는 바와 같이 보다 실질적인 변화가 도입되거나 생성물이 스크리닝될 수 있다.
최초 잔기 예시적 치환물 바람직한 치환물
Ala (A) val; leu; ile val
Arg (R) lys; gln; asn lys
Asn (N) gln; his; asp, lys; arg gln
Asp (D) glu; asn glu
Cys (C) ser; ala ser
Gln (Q) asn; glu asn
Glu (E) asp; gln asp
Gly (G) ala ala
His (H) asn; gln; lys; arg arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe; 노르루이신 leu
Leu (L) 노르루이신; ile; val; met; ala; phe ile
Lys (K) arg; gln; asn arg
Met (M) leu; phe; ile leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr tyr
Pro (P) ala ala
Ser (S) thr; cys cys
Thr (T) ser ser
Trp (W) tyr; phe tyr
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; 노르루이신 leu
항체의 생물학적 특성에 있어 실질적인 변형은 (a) 치환 장소에서 폴리펩티드 빼대 (backbone)의 구조, 예를 들어 시트 또는 나선형 배치, (b) 표적 부위에서 분자의 하전 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하는데 있어 효과가 상당히 상이한 치환물을 선택함으로써 달성된다. 천연 발생 잔기는 일반적인 측쇄 특성에 기초된 군으로 나뉜다.
(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성의 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gin, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 끼치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환물은 이들 부류 중 하나의 부류의 일원을 또 다른 부류로 교체하는 것을 수반할 것이다.
치환적 변이체의 일 유형은 모 항체 (예: 사람화 또는 사람 항체)의 하나 이상의 과가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 변이체가 생성되는 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하기 위한 편리한 방법은 파아지 디스플레이를 사용하는 친화성 성숙을 수반한다. 간단히 설명하면, 수개의 과가변 영역 부위 (예: 6 내지 7개 부위)가 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성하기 위해 돌연변이될 수 있다. 이렇게 생성된 항체는 필라멘트성 파아지 입자로부터 각각의 입자 내에 패킹되는 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합물로서 나타난다. 이어서, 파이지-디스플레이된 변이체는 전술된 바와 같이 이들의 생물학적 활성 (예: 결합 친화성)에 대해 스크리닝된다. 변형을 위한 후보 과가변 영역을 확인하기 위해서, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 알라닌 결합에 상당히 기여하는 과가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 달리 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 컴플렉스의 결정 구조를 분석하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기가 정밀하게 작업된 기술에 따른 치환을 위한 후보물이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널이 기술된 바와 같이 스크리닝되고, 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 특성을 갖는 항체가 추가의 개발을 위해 선별될 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당해 기술 분야에서 공지된 다양한 방법으로 제조된다. 이들 방법은, 이로 제한됨이 없이, 천연 공급원으로부터 분리 (천연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 올리고뉴클레오티드-매개된 (또는 부위-지시된) 돌연변이유발에 의한 제조, PCR 돌연변이유발 및 보다 초기에 제조된 변이체 또는 항체의 비-변이체 버젼의 카세트 돌연변이유발을 포함한다.
본 발명의 면역글로불린 폴리펩티드의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하여 Fc 영역 변이체를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 위치를 포함한 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예: 치환)을 포함하는 사람 Fc 영역 서열 (예: 사람 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
이러한 설명 및 당해 기술의 교시에 따라, 일부 양태에서는 본 발명의 방법에 사용되는 항체가, 예를 들어 Fc 영역에서 야생형 상대물 항체와 비교되는 하나 이상의 대체물을 포함할 수 있다는 것이 고려된다. 그럼에도 불구하고 이들 항체는 이들의 야생형 상대물과 비교되는 치료적 사용에 요구되는 실질적으로 동일한 특성을 보유한다. 예를 들어, 문헌 [PCT 공개 제WO99/51642호]에 기술된 바와 같이, 특정 대체물이 Fc 영역에 만들어져 변형된 (즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)이 생길 수 있다. Fc 영역 변이체의 다른 예에 대해 문헌 [Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); U.S. 특허 제5,648,260호; U.S. 특허 제5,624,821호; 및 PCT 공개 제WO94/29351호]을 참조한다.
면역접합체
또한, 본 발명은 화학치료제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예: 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편) 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사접합체)에 접합된 항체를 포함하는, 면역접합체 또는 항체-약물 접합체 (ADC)에 관한 것이다.
세포독성제 또는 세포증식억제제 (즉, 암의 치료에서 종양 세포를 죽이거나 억제할 약물)의 국부적 전달을 위한 항체-약물 접합체의 사용은 [Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; U.S. 특허 제4,975,278호], 이론적으로는 약물 잔기를 종양에 표적 전달하여 전달 위치에서 세포내 축적시키고, 비접합된 약물 제제의 전신 투여는 정상 세포 및 제거시키고자 하는 종양 세포에 대해 허용될 수 없는 수준의 독성을 줄 수 있다 [Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506]. 이로써, 최소의 독성으로 최대 효능이 고려된다. 다중클론 항체 및 단일클론 항체 모두 이러한 전략에 유용한 것으로 보고되었다 [Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87l]. 이러한 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트 및 빈데신 [Rowland et al., (1986) 상기 참조]을 포함한다. 항체-독소 접합체에 사용되는 독소는 디프테리아 독소, 식물 독소, 예로 리신, 소분자 독소, 예로 겔다나마이신 [Mandler et al (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791], 마이탄시노이드 [EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623], 및 칼리케아미신 [Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342]을 포함한다. 상기 독소는 투불린 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제 억제을 포함한 메카니즘으로 세포독성 및 세포증식억제 효과를 발휘할 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합되는 경우 불활성이거나 덜 활성적이기 쉽다.
ZEVALIN® (이브리투모맙 티욱세탄: ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec)은 정상 및 악성 B 림프구에서 발견되는 CD20 항원에 대해 지시되는 뮤린 IgG1 카파 단일클론 항체 및 티오우레아 링커-킬레이터에 의해 결합된 111In 또는 90Y 방사성동위원소로 구성된 항체-방사성동위원소 접합체이다 [Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69]. 비록 ZEVALIN®이 B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL)에 대해 활성을 갖지만, 투여 시 대부분의 환자에서 심각하고 지속적인 혈구감소를 나타낸다. 칼리체아미신에 연결된 hu CD33 항체로 구성된 항체 약물 접합체인 MYLOTARGTM (겜투주맙 오조감미신: gemtuzumab ozogamicin, Wyeth Pharmaceuticals)은 주사를 통한 급성 골수성 백혈병의 치료를 위해 2000년에 승인되었다 [Drugs of the Future (2000) 25(7):686; U.S. 특허 제4,970,198호; 제5,079,233호; 제5,585,089호; 제5,606,040호; 제5,693,762호; 제5,739,116호; 제5,767,285호 제5,773,001호]. 마이탄시노이드 약물 잔기, DM1에 디술파이드 링커 SPP를 통해 연결된 huC242 항체로 구성된 항체 약물 접합체인 칸투주맙 메르탄신 (Cantuzumab mertansine, Immunogen, Inc.)은 CanAg를 발현하는 암, 예로 결장암, 췌장암, 위암 등의 치료를 위해 제 II상의 임상 시도 중에 있다. 마이탄시노이드 약물 잔기, DM1에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 단일클론 항체로 구성된 항체 약물 접합체인 MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)은 전립선 종양의 잠재적인 치료를 위해 개발 중이다. 아우리스타틴 펩티드, 아우리스타틴 E (AE) 및 모노메틸아우리스타틴 (MMAE), 돌라스타틴의 합성 동족체는 키메릭 단일클론 항체 cBR96 (암종의 루이스 Y에 특이적) 및 cAC10 (혈액 악성 종양의 CD30에 특이적)에 접합되었으며 [Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21 (7):778-784], 치료제로 개발중이다.
이러한 면역접합체의 생성에 유용한 화학치료제는 상기 기술하였다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, (슈도모나즈 아에루기노사로부터) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테세네스를 포함한다 [PCT 공개 제WO93/21232 (공개일: 1993.10.28)]. 다양한 방사성 핵종이 방사결합된 항체의 생성에 이용가능하다. 예로는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re를 포함한다. 항체 및 세포독성제의 접합은 다양한 이작용성 단백질-커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체 (예: 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예: 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루카르알데히드), 비스-이지도 화합물 (예: 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예: 토일렌 2,6-디이소시아네이트) 및 이-활성 불소 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 리신 면역독소가 문헌 [Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)는 방사성 뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다 [PCT 공개 제WO 94/11026호].
또한, 항체와 하나 이상의 소분자 독소, 예로 칼리체아미신, 마이탄시노이드, 트리초테센 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 접합체가 본원에서 고려된다.
마이탄신 및 마이탄시노이드
하나의 양태에서, 본 발명의 항체 (전체 길이 또는 단편)는 하나 이상의 마이탄시노이드 분자에 접합된다.
마이탄시노이드는 투불린 중합화를 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 마이탄신은 동아프리카의 관목 메이테누스 세라타 (Maytenus serrata)로부터 처음 분리되었다 [미국 특허 제3,896,111호]. 이어서, 특정 미생물이 마이탄시노이드, 예로 마이탄시놀 및 C-3 마이탄시놀 에스테르를 생산한다고 밝혀졌다 [미국 특허 제4,151,042호]. 합성 마이탄시놀 및 이의 유도체 및 동족체가 예를 들어 문헌 [U.S. 특허 제4,137,230호; 제4,248,870호; 제,256,746호; 제4,260,608호; 제4,265,814호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,308,268호; 제4,308,269호; 제4,309,428호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,317,821호; 제4,322,348호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,364,866호; 제4,424,219호; 제4,450,254호; 제4,362,663호; 및 제4,371,533호, 이의 기술이 본원에 참조로 삽입됨]에 기술되어 있다.
마이탄시노이드 -항체 접합체
이들의 치료학적 지수를 개선하려는 시도에서, 마이탄신 및 마이탄시노이드를 종양 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항체에 접합시켰다. 마이탄신을 포함하는 면역접합체 및 이들의 치료적 용도가, 예를 들어 문헌 [U.S. 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽 특허 제EP 0 425 235 B1호, 이의 기술이 본원에 참조로 삽입됨]에 기술되어 있다. 리우 (Liu) 등은 문헌 [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에서 사람 대장암에 대해 지시되는 단일클론 항체 C242에 연결된 DM1으로 표시되는 마이탄시노이드를 포함하는 면역접합체를 기술하였다. 상기 접합체는 배양된 결장암 세포에 대해 고도로 세포독성인 것으로 밝혀졌으며, 생체 내 종양 성장 검정에서 항종양 활성을 나타내었다. 차리 (Chari) 등은 문헌 [Cancer Research 52:127-131 (1992)]에서 마이탄시노이드가 디술파이드 링커를 통해 사람 결장암 세포주의 항원에 결합하는 뮤린 항체 A7 또는 HER-2/neu 온코진을 결합하는 또 다른 뮤린 단일클론 항체 TA.1에 접합된 면역접합체를 기술한다. TA.1-마이탄시노이드 접합체의 세포독성은 3X105 HER-2 표면 항원/세포를 발현하는 사람 유방암 세포주 SK-BR-3에서 시험관 내에서 시험되었다. 약물 접합체는 유리 마이탄시노이드 약물과 유사한 세포독성도를 달성하였으며, 이는 항체 분자 당 마이탄시노이드 분자의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있었다. A7-마이탄시노이드 접합체는 마우스에서 낮은 전신계성 세포독성을 나타내었다.
항체- 마이탄시노이드 접합체 (면역접합체)
항체-마이탄시노이드 접합체는 항체 또는 마이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 감소시키지 않으면서 항체를 마이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결시킴으로써 제조된다. 항체 분자 당 하나의 독소도 있는 그대로의 항체에 비해 세포독성을 향상시킬 것으로 예상되지만, 항체 분자 당 접합된 평균 3 내지 4개의 마이탄시노이드 분자가 항체의 기능 또는 용해도에 부정적으로 영향을 끼치지 않으면서 표적 세포에 대한 세포독성을 향상시키는데 효능을 보였다. 마이탄시노이드는 당 기술 분야에서 널리 공지되어 있으며, 공지된 기술로 합성되거나 천연 공급원으로부터 분리될 수 있다. 적합한 마이탄시노이드가, 예를 들어 미국 특허 제5,208,020호 및 상기 언급된 다른 특허 및 비특허 공개문에 기술되어 있다. 바람직한 마이탄시노이드는 마이탄시놀 및 마이탄시놀 분자의 방향족 환 또는 다른 위치에서 변형된 마이탄시놀 동족체, 예로 다양한 마이탄시놀 에스테르이다.
예를 들어 문헌 [U.S. 특허 제5,208,020호 또는 EP 특허 제0 425 235 B1호, 및 Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에 기술된 것을 포함하여, 항체-마이탄시노이드 접합체를 제조하기 위한 당 기술 분야에서 공지된 많은 연결기가 있다. 연결기는, 상기 확인된 특허에 기술되어 있는 바와 같은, 디술파이드기, 티오에테르기, 산-불안정기, 광-불안정기, 펩티다제-불안정기 또는 에스테라제-불안정기를 포함하며, 디술파이드 및 티오에테르기가 바람직하다.
항체와 마이탄시노이드의 접합체는 이작용성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미노에스테르의 이작용성 유도체 (예: 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예: 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예: bis (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예: 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 이-활성 불소 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 특히 바람직한 커플링제는 디술파이드 연결을 제공하기 위한 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) [Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)] 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)-펜타노에이트 (SPP)를 포함한다.
링커는 연결 유형에 따라 다양한 위치에서 마이탄시노이드 분자에 결합될 수 있다. 예를 들어 에스테르 연결은 통상의 커플링 기술을 이용하여 히드록시기와 반응시켜 형성될 수 있다. 이 반응은 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실기로 변형된 C-15 위치; 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치에서 발생할 수 있다. 바람직한 양태에서, 연결은 마이탄시놀 또는 마이탄시놀 동족체의 C-3 위치에서 형성된다.
칼시체아미신
또 다른 목적 면역접합체는 하나 이상의 칼리체아미신 분자에 접합된 항체를 포함한다. 항생제의 칼리체아미신 부류는 서브-피코몰 농도에서 이중쇄 DNA를 파괴할 수 있다. 칼리체아미신 부유의 접합체의 제조를 위해 문헌 [U.S. 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호, 제5,877,296호 (모두 아메리칸 시아나미드 캄파니)]을 참조한다. 사용될 수 있는 칼리체아미신의 구조적 동족체는, 이로 제한됨이 없이, γ1 1, α2 1, α3 1, N-아세틸-γ1 1, PSAG 및 θ1 1 [Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) 및 전술한 U.S. 특허 (아메리칸 시아나미드 캄파니)를 포함한다. 항체가 접합될 수 있는 또 다른 항-종양 약물은 안티폴레이트인 QFA이다. 칼리체아미신 및 QFA 모두 세포내 작용 부위를 가지며 혈장막을 쉽게 통과하지 못한다. 따라서, 항체 매개된 내화를 통한 이들 제제의 세포 흡수가 이들의 세포독성 효과를 크게 향상시킨다.
기타 세포독성제
본 발명의 항체에 접합될 수 있는 기타 항종양제는 BCNU, 스트렙토조이신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 문헌 [U.S. 특허 제5,053,394호, 제5,770,710호]에 기술된 집합적으로 LL-E33288 컴플렉스로 공지된 제제의 부류, 및 에스페라미신 [U.S. 특허 제5,877,296호]을 포함한다.
사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나즈 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터의 것), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨 라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테세네스를 포함한다 [PCT 공개 제WO 93/21232호 (공개일: 1993년 10월 28일)].
또한, 본 발명은 항체와 핵산분해 활성을 갖는 화합물 (예: 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예로 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 면역접합체를 고려한다.
종양의 선택적 파괴를 위해서, 항체는 고도의 방사성 원자를 포함할 수 있다. 많은 방사성 동위원소가 방사접합된 항체의 생성에 이용가능하다. 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 접합체가 검출에 이용되는 경우, 이는 신티그래픽 조사를 위한 방사성 원소, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 NMR 영상화 (또는 자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)를 위한 스핀 라벨, 예로 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성- 또는 기타 라벨은 공지된 방법으로 접합체에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생물학적 합성하거나, 예를 들어 수소 대신에 불소-19를 수반하는 적합한 아미노산 전구체를 사용하여 화학적 아미노산 합성에 의해 합성할 수 있다. 라벨, 예를 들어 tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111은 펩티드의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. 요도겐 (IODOGEN) 방법 [Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57]을 사용하여 요오드-123을 삽입할 수 있다. 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", Chatal, CRC Press 1989]은 기타 방법들을 상세히 기술한다.
항체와 세포독성제의 접합체는 다양한 이작용성 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미노에스테르의 이작용성 유도체 (예: 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예: 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예: bis(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예: 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 이-활성 불소 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성핵종을 접합시키기 위한 예시적 킬레이트제이다 [PCA 출원 공보 제WO94/11026호]. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광-불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디술파이드-포함 링커 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); U.S. 특허 제5,208,020호]가 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 분명히, 이로 제한됨이 없이, 가교 시약: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) (예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지사 (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill., U.S.A)에서 시판됨)로 제조되는 ADC를 고려한다 [pages 467498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog].
항체 약물 접합체의 제조
본 발명의 항체 약물 접합체 (ADC)에서, 항체 (Ab)는 하나 이상의 잔기 (D)에 링커 (L)를 통해, 예를 들어 약 내지 약 20개 약물 잔기/항체로 접합된다. 화학식 I의 ADC는 (1) 항체의 친핵성기를 이가 링커 시약과 반응시켜 공유결합을 통해 Ab-L을 형성한 후 약물 잔기 D와 반응시킴 및 (2) 약물 잔기의 친핵성기와 이가 링커 시약과 반응시켜 공유결합을 통해 D-L을 형성한 후 항체의 친핵성기와 반응시킴을 포함하여, 당해 기술 분야에 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하여 수개의 경로에 의해 제조될 수 있다.
Ab-(L-D)p
항체의 친핵성기는, 이로 제한됨이 없이, (i) N-말단 아민기, (ii) 측쇄 아민기, 예로 리신, (iii) 측쇄 티올기, 예로 시스테인, 및 (iv) 슈가 히드록실 또는 아미노기 (여기서, 항체는 글리코실화된다)를 포함한다. 아민, 티올 및 히드록실기는 친핵성이며, (i) 활성 에스테르, 예로 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예로 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카복실 및 말레이미드기를 포함한 링커 잔기 및 링커 시약의 친전자성기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원가능한 쇄간 디술파이드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체는 환원제, 예로 DTT (디티오트레이톨)로 처리하여 링커 시약과 접합하기에 반응적이도록 할 수 있다. 따라서, 이론적으로 각각의 시스테인 브릿지는 2개이 반응적 티올 친핵체를 형성할 것이다. 추가의 친핵성기는 리신을 2-이미노티올란 (트라우트 시약: Traut's reagent)과 반응시켜 아민을 티올로 전환시킴으로써 항체로 도입될 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 약물 접합체는 링커 시약 또는 약물의 친핵성 치환체와 반응할 수 있는 친전자성 잔기를 도입하기 위해 항체를 변형시켜 생성될 수 있다. 글리코실화된 항체의 당은, 예를 들어 링커 시약 또는 약물 잔기의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤기를 형성하기 위해 페리오데이트 산화 시약을 사용하여 산화될 수 있다. 생성된 이민 쉬프 (Schiff) 염기는 안정한 연결을 형성하거나, 안정한 아민 연결을 형성하기 위해, 예를 들어 보로히드라이드 시약에 의해 환원될 수 있다. 하나의 양태에서, 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분과 글락토즈 옥시다제 또는 나트륨 메타-페리오데이트와의 반은은 약물의 적합한 기와 반응할 수 있는 단백질 내 카보닐 (알데히드 및 케톤) 기를 생산할 수 있다 [Hermanson, Bioconjugate Techniques]. 또 다른 양태에서, N-말단 세린 또는 트 레오닌 잔기를 포함하는 단백질은 나트륨 메타-페리오데이트와 반응하여 제 1 아미노산 대신에 알데히드를 생성할 수 있다 [Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; U.S. 특허 제5,362,852호]. 이러한 알데히드는 약물 잔기 또는 링커 친핵체와 반응될 수 있다.
마찬가지로, 약물 잔기의 친핵성기는, 이로 제한됨이 없이, (i) 활성 에스테르, 예로 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예로 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카복실 및 말레이미드기를 포함하여 링커 잔기 및 링커 시약의 친전자성기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있는, 아민, 티올, 히드록실, 옥심, 히드라진, 티오세미카바존, 히드라진 카복실레이트 및 아릴히드라진기를 포함한다.
달리, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은, 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 긴 DNA는 서로 인접하거나 접합체의 목적하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 암호화하는 영역에 의해 분리되는 2개 부분의 접합체를 암호화하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여 후, 제거제를 사용하여 순환물로부터 비결합된 접합체를 제거시키고, 세포독성제 (예: 방사성핵종)에 접합된 "리간드" (예: 아비딘)을 투여하는, 종양 예비-표적화에 사용하기 위해 항체는 "수용체" (예: 스트렙트아비딘)에 접합될 수 있다.
항체 유도체
본 발명의 항체는 당해 기술 분야에서 공지되고 쉽게 이용가능한 추가의 비단백질성 잔기를 포함하도록 더욱 변형될 수 있다. 바람직하게는, 항체의 유도체화에 적합한 잔기는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체에 대한 비-제한적 예는, 이로 제한됨이 없이, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로즈, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예: 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 이의 물에서의 안정성 때문에 제조시 유리할 수 있다. 상기 중합체는 어떠한 분자량의 거소도 가능하며, 측쇄되거나 비측쇄화될 수 있다. 항체에 부착되는 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 하나 이상의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은, 이로 제한됨이 없이, 개선될 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 한정된 조건 하에서 치료에 사용될 것인지의 여부 등을 포함한 고려사항들에 기초하여 결정될 수 있다.
항원 특이성
본 발명은 어떠한 적합한 항원 결합 특이성을 갖는 항체에도 적용가능하다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 항체는 생물학적으로 중요한 폴리펩티드인 항원에 특이적이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는 포유동물의 질환 또는 장애의 치료 또는 진단에 유용하다. 본 발명의 항체는, 이로 제한됨이 없이, 차단 항체, 효능제 항체, 중화 항체 또는 항체 접합체를 포함한다. 치료 항체의 비-제한적 예는 항-c-met, 항-VEGF, 항-IgE, 항-CD11, 항-CD18, 항-CD40, 항-조직 인자 (TF), 항-HER2, 및 항-TrkC 항체를 포함한다. 또한, 비-폴리펩티드 항원 (예: 종양-관련된 당지질 항원)에 대해 지시되는 항체가 고려된다.
항원이 폴리펩티드인 경우, 이는 트랜스막 분자 (예: 수용체) 또는 리간드, 예로 성장 인자일 수 있다. 예시적 항원은 분자, 예로 레닌; 성장 호르몬 (사람 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬 포함); 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 당단백질; 알파-1-안티트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예로 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 (TF) 및 폰 빌레브란트 인자; 항-응고 인자, 예로 단백질 C; 심방성 나트륨 이뇨인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성자, 예로 우로키나제 또는 사람 뇨 또는 조직-타입 플라스미노겐 활성자 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (regulated on activation normally T-cell expressed and secreted); 사람 대식구 염증 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예로 사람 혈청 알부민; 뮬레리안 (Muellerian)-억제 물질; 렐락신 A-쇄; 렐락신 B-쇄; 프로렐락신; 마우스 고나도트로핀-관련된 펩티드; 미생물 단백질, 예로 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA), 예로 CTLA-4; 인히빈; 악티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 신경영양성인자, 예로 골-유도된 신경영양성 인자 (BNDF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예로 NGF-β; 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예로 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예로 TGF-알파 및 TGF-베타 (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5 포함); 인슐린-유사 성장 인자-I 및-II (IGF-I 및 IGF-II); 데스(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예로 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예로 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터루킨 (IL), 예로 IL-1 내지 IL-10; 수퍼옥사이드 디스무타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 부패 가속화 인자; 바이러스 항원, 예로 HIV 엔벨로프의 부분; 수송 단백질; 귀환 수용체 (homing receptor); 아드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예로 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련된 항원, 예로 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 열거된 폴리펩티드의 단편을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에 의해 포함되는 항체에 대한 항원은 CD 단백질, 예로 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 및 CD46; ErbB 수용체 부류의 일원, 예로 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 어드헤신 분자, 예로 LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, α4/β7 인테그린 및 αv/β3 인테그린 (이의 α 또는 β 서브유니트 포함) (예: 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인 자, 예로 VEGF; 조직 인자 (TF); TGF-β; 알파 인터페론 (α-IFN); 인터루킨, 예로 IL-8; IgE; 혈액 그룹 항원 Apo2, 죽음 수용체; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C 등을 포함한다. 일부 양태에서, 표적물은 VEGF, TF, CD19, CD20, CD40, TGF-β, CD11a, CD18, Apo2 및 C24이다.
일부 양태에서, 본 발명의 항체는 종양 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 종양 항원이 클러스터 분화 인자 (즉, CD 단백질)가 아닌 종양 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 CD 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 CD3 또는 CD4 이외의 CD 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 CD19 또는 CD20 이외의 CD 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 CD40 이외의 CD 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 CD19 또는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 CD40에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 CD11에 특이적으로 결합할 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 면역 세포에서 발현되지 않는 항원을 결합한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 T 세포에서 발현되지 않는 항원을 결합한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 B 세포에서 발현되지 않는 항원을 결합한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 세포 생존 조절 인자에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 세포 증식 조절 인자에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 세포 주기 조절에 수반되는 분 자에 특이적으로 결합할 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 조직 발달 또는 세포 분화에 수반되는 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 세포 표면 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 세포 표면 수용체 폴리펩티드가 아닌 종양 항원에 결합할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 림포카인에 특이적으로 결합할 수 있다. 또 다른 양태에서, 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 사이토킨에 특이적으로 결합할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 혈관형성 (vasculogenesis)에 수반되는 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 혈관신생 (angiogenesis)에 수반되는 분자에 특이적으로 결합할 수 있다.
임의로 다른 분자에 접합되는, 가용성 항원 또는 이의 단편이 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 트랜스막 분자, 예로 수용체에 대해, 이들 분자의 단편 (예: 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로 사용될 수 있다. 달리, 트랜스막 분자를 발현하는 세포가 면역원으로 사용될 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원 (예: 암세포주)로부터 유도되거나 트랜스막 분자를 발현하기 위해 재조합 기술로 형질전화된 세포일 수 있다. 항체 제조에 유용한 기타 항원 및 이의 형태가 당업자에게는 자명할 것이다.
제약학적 제형물
본 발명의 항체를 포함하는 치료 제형물은 저장을 위해 목적하는 정도의 순 도를 갖는 항체를 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]와 혼합함으로써 수용액, 동결건조된 제형 또는 다른 건조 제형물의 형태로 제조된다. 적합한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수령자에게 무독성이며, 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예: 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예로 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 슈가 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 카운터이온, 예를 들어 나트륨; 금속 컴플렉스 (예: Zn-단백질 컴플렉스); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함한다.
또한, 본원에서 제형물은 특정 증상이 치료되는데 필요한 경우 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 보완적 활성을 갖는것들을 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도한 목적에 효과적인 양으로 배합 상태 로 적합하게 존재한다.
또한, 활성 성분은 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예로 각각 히드록시메틸셀룰로즈 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예: 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마아크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼에 인트랩핑 (entrapping) 될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기술되어 있다.
생체 내 투여를 위해 사용될 제형은 멸균성이어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통해 여과시킴으로써 쉽게 달성된다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 본 발명의 면역글로불린을 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스 (매트릭스는 성형된 제품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다)를 포함한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예: 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴에이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드 (U.S. 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예로 LUPRON DEPOTTM (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주입가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체가 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하는 한편, 특정한 히드로겔은 단백 질을 보다 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 면역글로불린이 오랫동안 체 내에 남아있는 경우, 이들은 37 ℃에서 습기에 노출된 결과로 변성 또는 응집하여 생물학적 활성이 상실되고 면역원성에 가능한 변화가 생길 수 있다. 합리적인 계획은 수반되는 메카니즘에 따라 안정화를 궁리할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술파이드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지는 경우, 안정화는 술프히드릴 잔기를 변형시키거나, 산성 용액으로부터 동결건조시키거나, 습기 함량을 조절하거나, 적합한 첨가제를 사용하거나, 특정한 중합체 매트릭스 조성을 전개시켜 달성될 수 있다.
용도
본 발명의 면역글로불린은, 예를 들어 시험관 내, 생체 외 및 생체 내 치료 방법에 사용될 수 있다. 본 발명은 통상의 일가 항체와 비교하여 우수한 특성을 갖는 일가 항체 단편을 사용하는 것에 기초하여 다양한 방법을 제공한다. 특정한 병적 상태에서 일가 항체를 사용하는 것이 필요하고/하거나 바람직할 수 있다. 또한, 일부의 경우, 치료 항체는 면역계-매개된 활성, 예를 들어 이펙터 기능 ADCC, 식작용 및 CDC를 수반하지 않으면서 치료 작용을 발휘할 수 있다. 이러한 상황에서, 이러한 활성이 실질적으로 감소되거나 제거되지 않는 항체의 형태를 생성하는 것이 바람직하다. 또한, 항체가 효과적으로 고수율로 제조될 수 있는 형태인 경우가 유리하다. 본 발명은 다양한 목적에 사용될 수 있는 이들 항체를 예를 들어 치료제, 예방제 및 진단제로서 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 치료가 필요한 환 자에게 단일 항원 결합 암을 포함하는 고도로 안정한 항체 단편을 투여하여 질환을 치료하는 단계를 포함하여, 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본원에 기술된 본 발명의 어떠한 항체 단편이라도 본원에 기술된 치료 (또는 예방 또는 진단) 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 시험관 내, 생체 외 및/또는 생체 내에서 특이적 항원 활성을 부분적으로나 완전히 차단하기 위해 길항제로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 중 적어도 일부는 다른 종으로부터의 항원 활성을 중화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는, 예를 들어 항원을 포함하는 세포 배양에서, 사람 환자에서 또는 본 발명의 항체가 교차-반응하는 항원을 갖는 다른 포유동물 대상 (예: 침팬지, 비비 (baboon), 마머제트 (marmoset), 시노몰거스 및 레소스 (rhesus), 돼지 또는 마우스)에서 특이적 항원 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 항원 활성이 억제되도록 항체를 항원과 접촉시킴으로써 항원 활성 억제에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항원은 사람 단백질 분자이다.
하나의 양태에서, 본 발명의 항체는, 환자에서 항원 활성이 억제되도록 환자에 본 발명의 항체를 투여하는 단계를 포함하여, 항원 활성이 치명적인 장애를 앓는 환자에서 항원을 억제시키기 위한 방법에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항원은 사람 단백질 분자이고, 환자는 사람 환자이다. 달리, 환자는 본 발명의 항체가 결합하는 항원을 발현하는 포유동물일 수 있다. 또한, 환자는 면역글로불린이 수의학 목적을 위해서 또는 사람 질환의 동물 모델로서 교차-반응하는 항원을 발현하는 비-사람 포유동물 (예: 영장류, 돼지 또는 마우스)에게 투여될 수 있다. 후 자의 경우, 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가 (예를 들어 용량 및 투여 시간 경과의 시험)하는데 유용할 수 있다. 치료학적으로 유용할 수 있는 본 발명의 차단 항체는, 이로 제한됨이 없이, 예를 들어 항-c-met, 항-VEGF, 항-IgE, 항-CD11, 항-인터페론 및 항-조직 인자 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는, 이로 제한됨이 없이, 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프성 종양; 뉴런, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 기타 선, 대식구, 상피, 기질 및 블라스토코엘릭 장애; 및 염증, 혈관신생 및 면역학적 장애를 포함하여, 하나 이상의 항원 분자의 비정상적 발현 및/또는 활성과 관련된 질환, 장애 또는 상태를 치료, 억제, 진행 지연, 재발 예방/재발 지연, 완화 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
하나의 양상으로, 본 발명의 차단 항체는 리간드 항원에 대해 특이적이며, 리간드 항원을 수반하는 리간드-수용체 상호작용을 차단 또는 방해하여 상응하는 시그널 경로 및 다른 분자 또는 세포성 사건을 억제시킴으로써 항원 활성을 억제시킨다. 또한, 본 발명은 반드시 리간드 결합을 억제하지는 않으나 수용체 활성을 방해하여 통상 리간드 결합에 의해 개시되는 반응을 억제시키는 수용체-특이적 항체의 특징을 나타낸다. 또한, 본 발명은 바람직하게 또는 배타적으로 리간드-수용체 컴플렉스에 결합하는 항체를 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 특정 항원 수용체에 대해 효능제로 작용하여 리간드-매개된 수용체 활성화의 모든 활성 또는 부분적 활성을 강화, 향상 또는 활성화시킬 수 있다.
특정 양태에서, 세포독성제와 접합된 항체를 포함하는 면역접합체가 환자에게 투여된다. 일부 양태에서, 결합되는 면역접합체 및/또는 항원은 세포에 의해 내화되어 항체가 결합하는 표적 세포를 죽이는 면역접합체의 치료 효과를 증가시킨다. 하나의 양태에서, 세포독성제는 표적 세포에 있는 핵산을 표적하거나 방해한다. 이러한 세포독성제의 예는 본원에서 주목되는 임의의 화학요법제 (예: 마이탄시노이드 또는 칼리체아미신), 방사성 동위원소, 또는 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다.
본 발명의 항체는 치료시 단독으로 사용되거나 다른 조성물과 배합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 또 다른 항체, 화학요법제(들) (화학요법제의 칵테일 포함), 다른 세포독성제(들), 항-혈관신생제(들), 사이토킨 및/또는 성장 억제제(들)과 공동-투여될 수 있다. 본 발명의 항체가 종양 성장을 억제하는 경우, 또한 종양 성장을 억제하는 하나 이상의 다른 치료제(들)과 함께 배합하는 것이 특히 바람직할 수 있다. 예를 들어, VEGF 활성을 차단하는 항-VEGF 항체는 전이성 유방암의 치료시 항-ErbB 항체 (예: HERCEPTIN® 항-HER2 항체)와 배합될 수 있다. 달리 또는 추가로, 환자는 병행 방사 치료 (예: 외부 빔 조사 또는 항체와 같은 방사성 표지제를 사용한 치료)를 받을 수 있다. 상기 주목되는 이러한 병행 치료는 (2개 이상의 제제가 동일하거나 상이한 제형물에 포함되는 경우) 배합 투여, 및 본 발명의 항체의 투여가 아주방트 치료(들)의 투여 전 및/또는 후에 발생할 수 있는 경우 분리된 투여를 포함한다.
본 발명의 항체 (및 아주방트 치료제)는 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내를 포함한 임의의 적합한 수단으로, 필요한 경우 국소 치료, 병소 내 투여를 위해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또 는 피하 투여를 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 적합하게는 펄스 주입, 특히 감소량의 항체로 투여된다. 투여는, 부분적으로 투여가 단시간에 걸친 것인지 또는 장기간에 걸친 것인지에 따라. 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예를 들어 정맥 내 또는 피하주사일 수 있다.
본 발명의 항체 조성물은 우수한 의료 실시와 모순되지 않는 양상으로 제형화되고 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려할 인자는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개개 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴 및 의사에게 공지된 기타 인자를 포함한다. 항체는 필수적이지는 않으나 임의로 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해 통상 사용되는 하나 이상의 제제와 함께 제형화된다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제형물 중에 존재하는 본 발명의 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형 및 상술된 기타 인자에 따른다. 일반적으로 앞서 사용된 바와 동일한 동일한 투여량 및 투여 경로 또는 앞서 사용된 용량의 약 1 내지 99 %가 사용된다.
질환을 예방 또는 치료하기 위해, 본 발명의 항체의 적합한 용량은 (단독으로나 화학요법제와 같은 다른 제제와 배합하여 사용되는 경우) 치료되는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중중도 및 경과, 항체가 예방적 목적인지 치료적 목적인지의 여부, 이전 치료, 항체에 대한 환자의 임상적 병력 및 반응, 및 주치의 판단에 따를 것이다. 항체는 적합하게는 환자에게 1회 또는 일련의 처리로 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예: 0.1 mg/kg-10 mg/kg)의 항체가 예를 들어 한번 이상의 분리된 투여 또는 연속 주입에 의해 환자 에게 투여하기 위한 초기 후보 용량이다. 하나의 전형적 1일 용량은 상술된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 또는 그 이상으로 반복된 투여을 위해, 상태에 따라, 질환 증후군의 목적하는 억제가 나타날 때까지 치료를 계속한다. 하나의 예시적인 항체 용량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위일 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg의 하나 이상의 용량 (또는 이의 임의의 배합)이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은(예를 들어 환자가 약 2 내지 약 20회 (예: 약 6회) 용량의 항체를 수령하도록) 간헐적으로, 예로 매주 또는 3일 마다 투여될 수 있다. 초기에 고용량을 투여한 후 하나 이상의 낮은 용량을 투여할 수 있다. 예시적 투여 요법은 약 4 mg/kg의 초기 용량에 이어 약 2 mg/kg의 주 단위의 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 치료의 진행은 통상의 기술 및 검정으로 쉽게 모니터링된다.
제조 물품
본 발명의 또 다른 양상으로, 상술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질들을 포함하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품을 용기 및 이러한 용기 상의 또는 용기와 관련된 라벨 및 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 상기 용기는 그 자체의 조성물 또는 다른 조성물과 배합되는 경우 상태를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 조성물을 보유 하며 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥 내 용액 백이거나 피하 주사 바늘로 꿰뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 적어도 하나의 활성제가 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 암과 같은 선택적 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조 물품은 (a) 본 발명의 항체를 포함하는 조성물이 담기는 제 1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제를 포함하는 조성물이 담기는 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 양태에서 제조 물품은, 제 1 및 제 2 항체 조성물이 특정 상태, 예로 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 달리 또는 추가로, 제조 물품은 제약학적으로 허용되는 완충제, 예로 제균작용 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거 용액 및 덱스트로즈 용액을 포함하는 제 2 (또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 또한 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 시판 및 사용자 견지에서 바람직한 다른 물질들을 포함할 수 있다.
하기는 본 발명의 방법 및 조성물에 대한 실시예이다. 상기한 일반적 기술을 고려할 때, 다양한 다른 양태가 실시될 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 1: 본 발명의 항체 단편의 생성 및 특징 분석 (이하 "하나의 암을 갖는 항체" 또는 " Fab /c 항체"로도 언급)
발현 벡터의 제작
전체 길이 또는 Fab/c 항-c-met 항체의 발현을 위한 모든 플라스미드는, 중쇄 및 경쇄 및 Fc 단편의 전사를 위한 phoA 프로모터 (AP) [Kikuchi et al., Nucleic Acids Res., 9: 5671-5678 (1981)], 이어서 해독 개시를 위한 샤인-달가노 서열 [Yanofsky et al., Nucleic Acids Res., 9: 6647-6668 (1981) 및 Chang et al., Gene, 55: 189-196 (1987)]에 의존하는, 분리된 시스트론 시스템 [Simmons et al., J. Immunol. Methods, 263: 133-147 (2002)]에 기초하였다. 추가로, 열-안정한 엔테로톡신 II 시그널 서열 (STII) [Picken et al., Infect. Immun., 42: 269-275 (1983) 및 Lee et al., Infect. Immun., 42: 264-268 (1983)]은 중쇄 및 경쇄 및 Fc 단편의 페리플라즘 분비에 사용되었다. 두개의 쇄 및 Fc 단편에 대한 미세 해독 조절은, 해독 개시 영역 (TIR)에서 침묵 코돈 변화를 포함하는, 측정된 상대적 해독 세기를 갖는 전술된 STII 시그널 서열 변이체로 달성되었다 [ich contain silent codon changes in the translation initiation region (TIR) (Simmons and Yansura, Nature Biotechnol., 14: 629-634 (1996) 및 Simmons et al., J. Immunol. Methods, 263: 133-147 (2002)]. 마지막으로, λt0 전사 종결자 [Schlosstissek and Grosse, Nucleic Acids Res., 15: 3185 (1987)]를 2개의 쇄 및 Fc 단편을 위한 코딩 서열의 하류에 위치시켰다. 모든 플라스미드는 pBR322-기초된 벡터 시스템의 골격을 이용한다 [Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43: 77-90 (1978)]. 공급원 항-c-met 항체는 문헌 [U.S. 특허 제5,686,292호; 제5,646,036호; 제6,207,152호; 제6,214,344호 & 제6,468,529호]에 기술된 5D5 항체였다. 5D5 공급원 항체를 위한 하이브리도마 세포주는 이미 ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md., USA)에 수탁 번호 제HB-11895호 (하이브리도마 5D5.11.6) (기탁일: May 23, 1995)로 기탁되었다.
플라스미드 pxcM11C
키메릭 5D5 항-c-met 항체를 암호화하는 목적하는 pxcM11C 플라스미드를 생성하는데 2개의 중간 플라스미드가 필요하였다. 5D5 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 먼저 각각의 쇄의 발현을 위해 pBR322-기초된 플라스미드에 분리되게 전달하였다. 하기에 이들 중간 플라스미드 pxcMLC 및 pxcMHC의 제조 및 pxcM11C의 제작이 기술된다.
pxcMLC
본 플라스미드는 완전한 길이의 항체를 생성하는데 적합한 사람 경쇄 골격에 5D5 항체의 뮤린 경쇄 가변 도메인을 전달하기 위해 제작하였다. 이러한 플라스미드는 3개의 DNA 단편의 결합을 수반한다. 제 1의 단편은 작은 MIul-BamHI 단편이 제거된 pPho51 벡터 [Simmons and Yansura, Nature Biotechnol, 14: 629-634 (1996)] (변이체 1)이었다. 결합의 제 2 파트는 경쇄의 마지막 15개 아미노산, λt0 터미네이터 및 tet 유전자의 개시부을 암호화하는 pST7LC로부터의 약 516개 염기쌍 AlwNI-BamHI 단편이었다. 플라스미드 pST7LC는 STII 시그널 서열의 하류로 사 람 카파 경쇄를 갖는 변이체 6의 유도체 (상기 문헌 참조) 이다. 결합의 제 3 파트는, 하기 프라이머를 사용하여, (하기 실시예 2에서 "5D5 Fab의 클로닝 및 재조합 발현"이란 표제하에 기술된) 5D5 Fab 서열 포함 플라스미드로부터 생성되는 약 623개 염기쌍 MluI-AlwNI PCR 단편이었다:
(서열: 9) 5' - TAAATTTAACGCGTACGCTGACATTATGATGTCCCAGTCTCCATCC
(서열: 10) 5'- GGGCGAGCTCAGGCCCTGATGGGTGACTTCGCAGGC
pxcMHC
본 플라스미드는 전체 길이의 항체를 생성하기에 적합한 사람 중쇄 골격으로 5D5 항체의 뮤린 중쇄 가변 도메인을 도입하기 위해 제작되었다. pxcMHC의 제작은 2개의 DNA 단편의 결합을 수반하였다. 제 1의 단편은 작은 MluI-BstEII 단편이 제거된 pST2HC 벡터였다. 플라스미드 pST2HC 벡터는 사람 IgG1 중쇄가 STII 시그널 서열의 하류에 융합된 변이체 3의 유도체 (상기 문헌 참조)이다. 결합의 제 2 파트는, 하기 프라이머를 사용하여, (하기 실시예 2에서 "5D5 Fab의 클로닝 및 재조합 발현"이란 표제하에 기술된) 5D5 Fab 서열 포함 플라스미드로부터 생성된 약 346개 염기쌍 MluI-BstEII PCR 단편이었다:
(서열: 11) 5' - GCTACAAACGCGTACGCTCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGG
(서열: 12) 5' - AAGAGACGGTGACCGAGGTTCCTTGACC
pxcM11C
본 플라스미드는 전체 길이의 5D5 키메릭 항체를 발현하기 위해 제작되었다. 이 플라스미드의 제작은 4개의 DNA 단편의 결합을 수반하였다. 제 1의 단편은, 작은 MluI-BstEII 단편이 제거된, 1-경쇄 및 1-중쇄의 TIR을 갖는 폴리시스트론 벡터였다. 결합의 제 2 파트는 pxcMLC로부터의 약 623개 염기쌍 MluI-AlwNI 단편이었다. 제 3 파트는 paTF50 (상기 문헌 참조; paTF50은 1-경쇄 및 1-중쇄의 TIR을 갖는 분리된 시스트론 벡터이다)로부터의 약 547개 염기쌍 AlwNI-BsiWI 단편이었다.
플라스미드 pxcM11C - Fc
pxcM11C-Fc의 제작을 위해, AP 프로모터, STII 시그널 서열 및 λt0 전사 종결자를 포함한 상기 기술된 조절 요소 모두를 갖는 Fc 단편의 발현물을 암호화하는 카세트를 pxcM11C 플라스미드에 가하였다. pxcM11c-Fc의 제작을 이끄는 2개의 플라스미드 pBR322.VNERK.HC 및 pBR322.Fc가 먼저 기술될 필요가 있다.
pBR322 . VNERK . HC
pBR322.VNERK.HC 플라스미드는 STII 시그널 서열의 하류로 사람 중쇄를 갖는 변이체 1의 유도체 [Simmons and Yansura, Nature Biotechnol, 14: 629-634 (1996)]이다. 이 플라스미드는 2개의 DNA 단편을 함께 결합시켜 제작되었다. 제 1의 단편은 작은 EcoRI-ClaI 단편이 제거된 벡터 pBR32였다. 결합물 중의 제 2 파트는, 하기 프라이머를 사용하여, AP 프로모터, STII 시그널 서열, 중쇄, λt0 종결 자 및 tet 유전자의 개시부를 pVG11.VNERK로부터 생성된 약 1885개 염기쌍 EcoRI-ClaI PCR 단편이었다:
(서열: 13) 5' - TTTCCCTTTGAATTCTTGGTTGTTAACGTTGCCGACGCGCATC
(서열: 14) 5' - TTTCCCTTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGTAAACAATAAAAAACGCCC
플라스미드 pVG11.VNERK는, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 항-VEGF 항체 (VNERK)로 변화된, 1-경쇄 및 1-중쇄의 TIR을 갖는 분리된 시스트론 벡터의 유도체 [Simmons et al., J. Immunol. Methods, 263: 133-147 (2002)]였다.
pBR322 . Fc
pBR322.Fc 플라스미드는 상술된 바와 같은 모든 조절 서열을 갖는 Fc 단편의 발현물을 암호화하는 pBR322.VNERK.HC 플라스미드의 유도체이다.
pBR322.Fc 플라스미드는 2개의 DNA 단편을 함께 결합시켜 제작하였다. 제 1 단편은 작은 MluI-NsiI 단편이 제거된 벡터 pBR322.VNERK.HC였다. 결합물 중의 제 2 파트는 아미노산 SGTT 및 이어서 사람 IgG1의 아밈노산 221 내지 429를 암호화하는 pJAL226으로부터듸 약 1319개 염기쌍 MluI-NsiI 단편이었다. pJAL226은 STII 시그널 서열의 하류에 사람 Fc 단편을 갖는 변이체 3의 유도체 [Simmons and Yansura, Nature Biotechnol, 14: 629-634 (1996)]이다.
pxcM11C - Fc
pxcM11C-Fc는 2개의 DNA 단편을 함께 결합시켜 제작하였다. 제 1 단편은 작 은 HpaI-ClaI 단편이 제거된 벡터 pxcM11C였다. 결합물 중의 제 2 파트는 pBR322.Fc로부터의 약 1198개 염기쌍 HpaI-ClaI 단편이었다. 이러한 결합으로 목적하는 플라스미드 pxcM11C-Fc를 생성하였다.
플라스미드 pxcM11C .H- Fc .K
플라스미드 pxcM11C.H-Fc.K는, pxcM11C 중쇄의 CH3 도메인이 "홀 (hole)" (본원에서 "공동 (cavity)"로도 언급됨) 돌연변이 (T366S, L368A, Y407V) [Merchant et al., Nature Biotechnology, 16:677-681 (1998)]를 갖는 CH3 도메인으로 대체된, pxcM11C-Fc의 유도체이다. 또한, Fc 단편의 CH3 도메인은 "놉 (knob)" (본원에서 "돌출부 (protuberance)"로도 언급됨) 돌연변이 (T366W) (상기 문헌 참조)를 갖는 CH3 도메인으로 대체되었다.
pxcM11C .H
본 플라스미드는 2 단계로 제작되었다. 제 1 단계에서, "홀" 돌연변이는 2개의 DNA 단편을 함께 결합시킴으로써 도입되었다. 제 1 단편은 작은 SacII-NsiI 단편이 제거된 벡터 pxcM11C였다. 결합물 중의 제 2 파트는 pBR322.VNERK.HC.H로부터의 약 411개 염기쌍 SacII-NsiI 단편이었다. pBR322.VNERK.HC.H은 "홀" 돌연변이 (T366S, L368A, Y407V)가 도입된 [Merchant et al., Nature Biotechnology, 16:677-681 (1998)] pBR322.VNERK.HC 플라스미드의 유도체 (상기 참조)이다. 이러한 중간 플라스미드를 pxcM11C.H라 명명한다.
pxcM11C .H- Fc .K
제 2 단계는 Fc 단편으로 "놉" 돌연변이를 도입하며, 2개의 DNA 단편의 결합을 수반하였다. 제 1 단편은 작은 ClaI-HpaI 단편이 제거된 벡터 pxcM11C.H이었다. 결합물 중의 제 2 파트는 "놉" 돌연변이를 갖는 Fc 단편에 대한 발현 카세트를 암호화하는 pBR322.Fc.K로부터의 약 1198개 염기쌍 ClaI-HpaI 단편이었다. pBR322.Fc.K는 "놉" 돌연변이 (T366W) [Merchant et al., Nature Biotechnology, 16:677-681 (1998)] 및 상술된 모든 조절 서열을 갖는 Fc 단편의 발현물을 암호화하는 pBR322.Fc 플라스미드의 유도체 (상기 참조)이다. 이러한 결합으로 플라스미드 pxcM11C.H-Fc.K가 제작되었다.
항-c- Met 1-암 Fab /c 항체의 발현 및 특징 분석
항체의 소규모 유도는 모 (parent) 제작물 (항-c-Met에 대해서 pxcM11C 5D5) 및 하나의 암을 갖는 Fab/c 항체 제작물 (pxcM11C-Fc)을 사용하여 수행하였다. 각각의 제작물의 소규모 발현을 위해 이. 콜라이 33D3 (W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompT A(nmpc-fepE) degP41 kanR)을 숙주 세포로 사용하였다. 형질전환 후, 선별된 형질전환체 선택물을 카베니실린 (50 μg/mL)으로 보충된 5 mL 루리아-베르타니 (Luria-Bertani) 배지로 접종하고, 밤새 배양 휠에서 30 ℃로 성장시켰다. 이어서, 각각의 배양물을 C.R.A.P. 포스페이트--제한 배지 [Simmons et al., J. Immunol. Methods 263:133-147 (2002)]로 희석시켰다 (1:100). 이어서, 카베니실린을 50 μg/mL의 농도로 유도 배양물에 가하고, 배양물을 배양 휠에서 30 ℃에서 약 24시간 동안 성장시켰다. 달리 언급이 없는 한, 모든 진동 플라스크 유도는 5 mL 용적으로 수행하였다.
유도된 배양물로부터의 비-환원된 전체 세포 용해물은 하기와 같이 제조하였다: (1) 1 OD600-mL 유도 샘플을 마이크로퓨지 튜브에서 원심분리하였다; (2) 각각의 펠렛을 TE (10 mM 트리스 pH 7.6, 1 mM EDTA) 90 μL에 재현탁시켰다; (3) 100 mM 요오도아세트산 (Sigma I-2512) 10 μL를 각각의 샘플에 가해 어떠한 유리 시스테인이라도 차단하고 디술파이드 셔플링을 방지하였다; (4) 10 % SDS 20 μL를 각각의 샘플에 가하였다. 샘플을 볼텍싱하고, 3분 동안 약 90 ℃로 가열한 후, 다시 볼텍싱하였다. 샘플을 실온으로 냉각시킨 후, 아세톤 750 μL를 가해 단백질을 침전시켰다. 샘플을 볼텍싱하고, 약 15분 동안 실온에 놔두었다. 마이크로원심분리기에서 5분 동안 원심분리한 후, 각각의 샘플의 상등액을 흡출시키고, 각각의 단백질 펠렛을 dH20+50 μL 2X NOVEX SDS 샘플 완충액 50 μL에 재현탁시켰다. 이어서, 샘플을 약 90 ℃에서 4분 동안 가열하고, 잘 볼텍싱한 후, 실온으로 냉각시켰다. 이어서, 최종 5분간 원심분리를 한 후, 상등액을 깨끗한 튜브에 옮겼다.
유도된 배양물로부터의 환원된 전체 세포 용해물을 하기와 같이 제조하였다: (1) 1 OD600-mL 유도 샘플을 마이크로퓨지 튜브에서 원심분리하였다; (2) 각각의 펠렛을 TE (10 mM 트리스 pH 7.6, 1 mM EDTA) 90 μL 중에 재현탁시켰다; (3) 1 M 디 티오트레이톨 (Sigma D-5545) 10 μL을 각각의 샘플에 가해 디술파이드 결합을 환원시켰다; (4) 10 % SDS 20 μL를 각각의 샘플에 가하였다. 샘플을 볼텍싱하고, 3분 동안 약 90 ℃에서 가열한 후, 다시 볼텍싱하였다. 샘플을 실온으로 냉각시킨 후, 아세톤 750 μL를 가해 단백질을 침전시켰다. 샘플을 볼텍싱하고, 약 15분 동안 실온에 놔두었다. 마이크로원심분리기에서 5분 동안 원심분리한 후, 각각의 샘플의 상등액을 흡출시키고, 각각의 단백질 펠렛을 1M 디티오트레이톨 10 μL + dH20 40 μL + 2X NOVEX SDS 샘플 완충액 50 μL에 재현탁시켰다. 이어서, 샘플을 약 90 ℃에서 4분 동안 가열하고, 잘 볼텍싱한 후, 실온으로 냉각시켰다. 이어서, 최종 5분간 원심분리를 한 후, 상등액을 깨끗한 튜브에 옮겼다.
제조 후, 각각의 샘플 5 내지 8 μL를 10 웰, 1.0 mm NOVEX 제조된 12 % 트리스-글리신 SDS-PAGE에 로딩하고, 1.5 내지 2시간 동안 약 120 V에서 전기영동하였다. 이어서, 생성된 겔을 코마시 블루 (Coomassie Blue)로 염색하거나 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다.
웨스턴 블롯 분석을 위해, SDS-PAGE 겔을 10 mM CAPS 완충액, pH 11 + 3 % 메탄올 중의 니트로셀룰로즈 막 (NOVEX)에서 전기블롯팅하였다. 이어서, 막을 실온에서 흔들면서 약 30분 내지 1시간 동안 1X NET (150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM 트리스 pH 7.4, 0.05 % 트리톤 X-100) + 0.5 % 젤라틴의 용액을 사용하여 차단시켰다. 차단 단계 후, 막을 항-Fab 웨스턴 블롯 분석을 위해 1X NET + 0.5 % 젤라틴 + 항-Fab 항체 (사람 IgG Fab에 대한 퍼옥시다제-접합된 염소 IgG 분획물; CAPPEL #55223)의 용액에 배치하였다. 항-Fab 항체를 항체의 로트에 따라 1:50,000 내지 1:1,000,000로 희석시켰다. 달리, 막을 항-Fc 웨스턴 블롯 분석을 위해 1X NET + 0.5 % 젤라틴 + 항-Fc 항체 (사람 Fc 단편에 대한 퍼옥시다제-접합된 염소 IgG 분획물; BETHYL #A80-104P41)의 용액에 배치하였다. 항-Fc 항체를 항체의 로트에 따라 1:50,000 내지 1:250,000로 희석시켰다. 각각의 경우의 막을 흔들면서 실온에서 밤새 항체 용액에 뇌두었다. 다음날 아침, 막을 1X NET + 0.5 % 젤라틴으로 최소 3X10분으로 세척한 후, TBS (20 mM 트리스 pH 7.5, 500 mM NaCl)로 1X15분 세척하였다. 항-Fab 항체 및 항-Fc 항체에 의해 결합된 단백질 밴드를 아머샴 파마시아 바이오텍 ECL (Amersham Pharmacia Biotech ECL) 검출을 이용하고 막을 X-선 필름에 노출시켜 가시화하였다.
항-c-Met Fab/c 항체 발현에 대한 항-Fab 웨스턴 블롯 결과가 도 1에 나타나 있다. 이들은 완전히 접히고 조립된 전체 길이의 항체 (레인 1) 및 하나의 암을 갖는 Fab/c 항체 (레인 2)의 발현을 보였다. 항-Fab 항체는 Fc 단편을 결합할 수 없으므로, 검출되지 않았다. 비-환원된 샘플에서는, Fc 단편과 전체 길이의 항-c-met 항체의 공동 발현으로 완전히 접히고 조립된 전체 길이의 항체로부터 완전히 접히고 조립된 하나의 암을 갖는 Fab/c 항체로의 실질적인 이동을 나타내었다. 환원된 샘플에서는, 전체 길이의 항-c-met 항체 및 하나의 암을 갖는 항-c-Met Fab/c 항체에 대해 검출된 유사한 양의 중쇄 및 경쇄가 있었다. 아마도 분비 경로에서의 약간의 백업 때문에, 하나의 암을 갖는 항-c-Met Fab/c 제작물을 갖는 경쇄 전구체의 양에 약간의 증가가 있었다.
유사하게, 항-Fc 웨스턴 블롯 결과가 도 2에 나타나 있으며, 이들도 완전히 접히고 조립된 하나의 암을 갖는 Fab/c 항체의 발현 (레인 2)을 나타내었다. 항-Fc 항체는 경쇄를 결합할 수 없어, 검출되지 않았다. 비-환원 샘플에서는, Fc 영역과 완전한 길이의 항-c-met 항체의 공동 발현으로 완전히 접히고 조립된 전체 길이의 항체로부터 완전히 접히고 조립된 하나의 암을 갖는 Fab/c 항체로의 이동을 나타내었다. 또한, Fc 폴리펩티드 단량체 및 이량체를 항-Fc 웨스턴 블롯에서 검출하였다. 환원 샘플에서는, 전체 길이의 항-c-met 항체 및 하나의 암을 갖는 항-c-Met Fab/c 항체 발현에 대해 검출된 유사한 양의 중쇄가 있었다. 아마도 하나의 암을 갖는 Fab/c 항체 제작물의 사용으로 분비 경로에서의 약간의 백업 때문에, 소량의 전구체 Fc 단편이 있었다.
상술된 자료로부터 명백한 바와 같이, 주요 항체종이 목적하는 하나의 암을 갖는 Fab/c 항체인 면역글로불린군을 생성할 수 있다. 그러나, 온전한 형태의 항체 (즉 완전히 접히고 조립된 항-c-Met 전체 길이 항체)는 항-Fab 및 항-Fc 웨스턴 블롯 분석 모두에 이해 검출가능하였다. 온전한 형태의 항c-met 5D5 항체는 길항제 효과를 필요로 하는 치료 체계에서 바람직하지 않은 c-met 수용체의 효능제이므로, 일반적으로 생성되는 온전한 형태의 항체의 양을 최소화시키는 것이 바람직하다.
돌출부 및 공동을 갖는 하나의 암을 갖는 Fab/c 항-c-met 항체의 발현 및 특징 분석 (이하 "홀 안의 놉 (Knobs into Holes)"으로도 언급됨)
항-c-Met Fab/c 항체의 제조에 있어 전체 길이의 항-c-met 항체의 형성을 최소화시키기 위해, "홀 안의 놉" 돌연변이를 본질적으로 문헌 [Merchant et al., Nature Biotechnology, 16:677-681 (1998)]에 기술된 바와 같이 Fc의 CH3 도메인에 만들었다. "홀" 돌연변이 (T366S, L368A, Y407V)를 전체 길이의 중쇄에 도입하고 "놉" 돌연변이 (T366W)를 Fc 단편에 도입함으로써 하나의 암을 갖는 Fab/c 항-c-met 항체에 대한 제작물을 제조하였다.
이어서, 전체 길이의 항-c-met 항체 (pxcM11C), 하나의 암을 갖는 Fab/c 항-c-met 항체 (pxcM11C-Fc) 및 하나의 암을 갖는 "홀 안의 놉" 항-c-met 항체 (pxcM11C.H.Fc.K) 제작물을 상술된 바와 동일한 방식으로 발현하였다. 전체 세포 용해물을 제조하고, SDS-PAGE로 분리시킨 후, 니트로셀룰로즈로 전달하고, 전술된 염소 항-사람 Fab 접합된 항체 및 염소 항-사람 Fc 접합된 항체로 검출하였다.
항-Fab 웨스턴 블롯 결과가 도 3에 나타나 있다. 도 3은 하나의 암을 갖는 Fab/c "홀 안의 놉" 항-c-met 항체의 접힘 및 조립에 있어 상당한 개선을 보였다. 또한, 항-Fab 웨스턴 블롯 결과는 전체 길이의 항-c-met 항체의 검출가능하지 않은 수준으로의 감소를 보였다. 다시, 항-Fab 항체는 Fc 단편에 결합할 수 없다는 것에 주목하는 것이 중요하다. 비-환원된 샘플에서는, 하나의 암을 갖는 "홀 안의 놉" 항-c-met 항체의 발현으로 완전히 접히고 조립된 전체 길이의 항체의 완전히 접히고 조립된 하나의 암을 갖는 Fab/c 항체로의 실질적인 이동이 생겼다. 또한, 야생형 Fc로부터 "홀 안의 놉" Fc로 이동하는 하나의 암을 갖는 Fab/c 항체의 접힘 및 조립에 상당한 개선이 있었다. 환원된 샘플에서는, 완전한 길이의 하나의 암을 갖는 Fab/c 및 하나의 암을 갖는 Fab/c "홀 안의 놉" 항-c-Met 항체에 대한 검출되는 유사한 양의 중쇄가 있었다. 또한, 하나의 암을 갖는 Fab/c "홀 안의 놉" 항-c-Met 제작물을 사용으로 프로세싱된 경쇄의 양의 증가 및 경쇄 전구에의 감소가 나타났다.
유사하게, 도 4의 항-Fc 웨스턴 블롯 결과는 야생형의 하나의 암을 갖는 Fab/c 항-c-met 항체에 비해 하나의 암을 갖는 Fab/c "홀 안의 놉"의 접힘 및 조립에 상당한 개선을 보였다. 다시, 항-Fab 웨스턴 블롯 결과는 전체 길이의 항-c-met 항체의 검출할 수 없는 수준으로의 감소를 나타냈다. 항-Fc 항체는 경쇄를 결합할 수 없으므로, 검출되지 않았다. 환원된 샘플에서는, 전체 길이의 야생형의 하나의 암을 갖는 Fab/c 및 하나의 암을 갖는 Fab/c "홀 안의 놉" 항-c-Met 항체에 대해 검출된 유사한 양의 중쇄가 있었다.
실시예 2: 본 발명의 항체의 약물 동태학 및 치료 효능
물질 및 방법
물질- HGF 및 c-Met-IgG은 전술한 바와 같이 (8; 14) 제넨텍 (Genentech)에서 생산하였다. 맥시소브 (Maxisorb) 미세역가 평판은 NUNC (Rosklide, Denmark)에서 구입하고, 항-hFc는 잭슨 이뮤노케미칼 (Jackson Immunochemical, West Grove, Pa.)에서 구입하였다. HRP-스트렙트아비딘은 지메드 (Zymed, South San Francisco, Calif.)로부터 구입하였다. 3H-티미딘은 아머샴 (Amersham, Inc., Arlington Heights, Ill.)에서 구입하였다. MDA-MB-435 세포는 ATCC (Rockville, Md.)로부터 구입하였다. 피로글루타메이트 아미노펩티다제는 타카라 바이오케미칼 (Takara Biochemicals, Berkeley, Calif.)로부터 구입하였다. NHS-X-바이오틴 (NHS-X-Biotin)은 리서치 오가닉스 (Research Organics, Cleveland, Ohio)로부터 구입하였다. 이뮤노빌론-PSQ PVDF (Immobilon-PSQ PVDF)는 밀리포어 (Millipore, Marlborough, Mass.)로부터 구입하였다. 슈퍼스크립트 II RNase H-리버스 트랜스크립타제 (Superscript II RNase H-Reverse Transcriptase)는 깁코-BRL (Gibco-BRL, Gaithersburg, Md.)로부터 구입하였다. Taq 폴리머라제는 퍼킨 엘머-세투스 (Perkin Elmer-Cetus, Foster City, Calif.)로부터 구입하였다. 베이커본드 (Bakerbond) ABX, 40 μ 입자 크기는 제이. 티. 베이커 (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)로부터 구입하고, SP-세파로즈 고성능 수지 (SP-Sepharose High Performance resin)는 파마시아 바이오텍 (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, N.J.)으로부터 구입하였다. 바이오틴-항-P-Tyr는 업스테이트 바이오텍 (Upstate Biotech, Lake Placid, N.Y.)으로부터 구입하고, TMB 퍼옥시다제 기질은 KPL (Gaithersburg, Md.)로부터 구입하였다.
항체 및 Fab 단편의 생성
항-c- Met 단일클론 항체의 생성
5D5 항체를 포함한 항-c-met 단일클론 항체의 생산이 기술되었다 [U.S. 특허 제5,686,292호; 제5,646,036호; 제6,207,152호; 제6,214,344호 & 제6,468,529호]. BALB/c 마우스를 MPL/TDM 아주방트에 현탁된 가용성 c-Met-IgG [Mark et al., J. Biol. Chem. (1992), 267:26166-26171] 2.5 μg으로 0, 7, 14, 21, 28, 266, 273, 및 279일에 각각의 뒷발바닥에서 면역처리하였다. 마지막 면역처리한지 4일 후, 림프절을 수거하고, 문헌 [Laskov et al.,Cell.Immunol. (1980), 55:251]에 기술된 바와 같이 35 % 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 P3/X63-Ag8U1 골수종 세포 [Yelton et al., Curr.Top.Microbio.Immunol. (1978), 81:1]와 융합시켰다. 먼저, c-Met에 대해 특이적인 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 포획 ELISA로 선별한 후, c-Met를 발현하는 BAF3 트랜스펙션된 세포를 사용하여 유동 세포 분석법으로 스크리닝하였다. 선별된 하이브리도마에 대해 후술되는 바와 같이 c-Met-IgG에 대한 바이오틴-HGF 결합을 억제하는 능력을 시험하였다. 하이브리도마를 제한 희석으로 2회 클로닝한 후, 이들의 길항적 및 효능적 능력에 대해 더욱 특징분석하였다. 복수를 balb/c 마우스에서 생성하고, 단백질 G 친화성 컬럼을 사용하여 단일클론 항체를 정제하였다. 단백질 농도는 1.4의 흡광 계수를 사용한 289 nm에서의 흡광도로 측정하였다.
자연적 Fab 의 생성 및 정제
항체 5D5를 밤새 20 mM 포스페이트, 10 mM EDTA 완충액에서 투석하고, 센트리콘 (Centricon) 30에서 7 mg/ml로 농축하였다. 고정화된 파파인 (Pierce, Rockford, Ill.) 0.5 ml를 분해 완충액으로 세척한 후, 5D5 10 mg을 가하고, 200 rpm으로 흔들면서 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 결합 완충액 1.5 ml를 혼합 물에 가한 후, 상등액을 비드로부터 분리시키고, 결합 완충액으로 미리 평형화시킨 단백질 A 컬럼을 통과시켰다. 추가의 결합 완충액을 컬럼에 통과시키고, 용출물을 1 ml 분획으로 수집하였다. 각각의 분획물의 흡광도를 280 nm에서 판독하고, Fab 단편을 포함하는 용출물을 푸울링하였다. 단백질을 PBS에서 밤새 투석하고, 단백질 농도를 1.53의 흡광 계수를 이용해 280 nm에서의 흡광도로 측정하였다. Fab 단편을 겔 투과로 더욱 정제하여 잔류 F(ab')2를 제거하였다.
5 D5 Fab 의 N-말단 서열분석
분취량의 5D5 Fab를 4 내지 20 % 구배 SDS 겔에서 재용해시키고, 바이로라드 트랜스-블롯 전달 세포 (BioRad Trans-Blot transfer cell)에서 250 mA 정전류로 1시간 동안 PVDF (Immobilon-PSQ) 막에 전기블롯팅하였다 [Matsudaira, J.Biol.Chem. (1987), 262:10035-10038]. 막을 0.5분 동안 50 % 메탄올 중의 0.1 % 코마시 블루 R-250로 염색하고, 2 내지 3분 동안 50 % 메탄올 중의 10 % 아세트산으로 탈염색하였다. 막을 물로 철저히 세척하고, 건조시킨 후, Blott® 카트리지 (Applied Biosystem)를 사용하면서 모델 473A 자동화된 단백질 서열분석기로 서열 분석하였다. 피크물을 넬슨 분석용 760 인터페이스 (Nelson Analytical 760 interface)를 사용해 저스티스 이노베이션 소프트웨어 (ustice Innovation software)로 통합하였다. 서열 해석은 DEC 알파 [Henzel et al., J.Chromatog. (1996), 404:41-52]에서 수행하였다.
하기와 같이 수행되는 5D5 중쇄의 서열 수득은 탈차단이 필요하였다. Fab 단편을 1시간 동안 45 ℃에서 7 mM DTT로 환원시키고, 20분 동안 25 ℃에서 180 mM 이소프로필아세트아미드로 알킬화시켰다 [Krutzsch & Inman, Anal.Biochem. (1993), 209:109-116]. 이어서, 알킬화된 Fab 단편을 10 mM DTT (분해 완충액)를 포함하는 0.1 M 인산나트륨을 사용하여 마이크로콘-10 (Microcon-10)에서 3회 교환하고, 분해 완충액 20 μl 중에서 3시간 동안 45 ℃에서 피로글루타메이트 아미노펩티다제 1 mU로 분해하였다. 이어서, 탈차단된 Fab를 PVDF에 옮기고, 상술된 바와 같이 서열분석하였다.
5 D5 Fab 의 클로닝 및 재조합체 발현
N-말단 서열 자료를 사용하여 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 5' 말단에 특이적인 PCR 프라이머를 고안하고, 각각의 쇄의 컨센서스 골격 4에 어닐링하도록 3' 프라이머를 고안하였다 [Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest (1991), Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.]. 또한, 클로닝을 위한 제한 효소 부위를 추가하기 위한 프라이머를 고안하였다. 스트라타젠 (Stratagene) RNA 분리 키트로 108 세포의 하이브리도마 5D5로부터 분리된 총 RNA를 RT-PCR을 위한 기질로서 사용하였다. 역전사는 표준 조건 [Kawasaki, Amplification of RNA. In PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, pp. 21-27 (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White, editors) (Academic Press, Inc., San Diego; 1990)] 하에서 골격 4 특이적 프라이머 및 슈퍼스크립트 II RNase H-역전사효소를 사용하여 수행하였다. PCR 증폭은, 단 2 % DMSO를 반응 혼합물에 포함시키는 것을 제외하고는, 문헌 [Kawasaki, Amplification of RNA. In PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, pp. 21-27 (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White, editors) (Academic Press, Inc., San Diego; 1990)]에 기술된 바와 같이 Taq 폴리머라제를 사용하였다. 증폭된 DNA 단편을 제한 효소 Sfi I 및 Rsr II (경쇄) 또는 Mlu I 및 Apa I (중쇄)를 사용하여 분해시키고, 겔 정제하며, 발현 플라스미드 pAK19의 유도체 [Carter et al., Bio/Technol. (1992), 10:163-167]에 클로닝하였다. 이러한 벡터 pXCA730,를 부위-지시된 돌연변이유발로 변형시켜 [Kunkel, Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1985), 82:488] ST II 시그널 서열과 가변 도메인 사이 및 각각의 새의 가변 및 불변 도메인의 접합점에 독특한 제한 부위를 포함시켰다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 cDNA를 사람 Cκ 및 CH1 도메인의 하류에 인프레임으로 삽입하였다. F(ab')2 분자를 수득하도록 디술파이드 브릿지를 형성할 수 있는 pAK19 내의 중쇄의 C-말단 시스테인을 제거하여 항체의 단지 Fab 형태만을 발현시켰다.
재조합 5D5 Fab를 문헌 [Carter et al., Bio/Technol. (1992), 10:163-167]에 기술된 바와 같이 이. 콜라이 K12 균주 33B6 (W3110 tonA phoA E15 deoC KanR ilvGR degPD)argF-lac) 169) [Rodriques et al., Cancer Res. (1995), 55:63-70]에 서 발현시켰다. 10 L 발효로부터의 세포 펠렛을 연속 공급 원심분리에 의해 수거하고, 동결시킨 후, -70 ℃에서 저장하였다. 펠렛의 일부를 120 mM MES, pH 6, 및 5 mM EDTA (5 ml/페이스트 g)로 이루어진 추출 완충액에 현탁시켰다. 현탁물을 4 ℃에서 약 15분 동안 울트라투락스 (ultraturrax, Janke and Kunkel)를 사용하여 철저히 혼합하였다. 이어서, 온전한 세포를 냉각 코일이 장착된 세포 분쇄기 (Microfluidizer, Microfluidics Corporation, Newton, Mass.)를 통해 2회 통과시켜 파괴하였다. 이어서, 현탁물을 pH 6으로 조절된 5 % (v/v) 스톡을 사용하여 0.1 % (v/v) 폴리에틸렌이민으로 조절하였다. 온전한 세포 및 PEI-응집된 파편을 30분 동안 25,400 Xg에서 원심분리시켜 가용성 분획으로부터 분리하였다. 상등액을 정제수를 첨가하여 전도도가 4 mS 미만이도록 조절하고, 베이커본드 ABX, 40 μ 입자 크기의 컬럼 (1X10 cm)에 로딩하였다. 컬럼을 50 mM MES, 5 mM EDTA, pH 6으로 평형화시켰다. 모든 단계는 100 cm/h의 선형 유속으로 수행하였다. 조건조절된 상등액을 로딩한 후, 컬럼 유출물의 흡광도가 기저선과 동등할 때까지 평형 완충액으로 세척하였다. 평형 완충액 중의 0 내지 100 mM 황산암모늄의 선형 구배 16-컬럼 용적을 사용하여 용출을 수행하였다. 컬럼 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 겔로 분석하고, Fab를 포함한 분획을 푸울링하였다. ABX 컬럼으로부터의 푸울의 전도도를 4 mS 미만으로 낮추고, 25 mM MOPS 완충액, pH 6.9으로 평형화시킨 SP-세파로즈 고성능 수지의 컬럼 (1X10 cm)에 로딩하였다. 모든 단계는 100 cm/h의 선형 유속으로 수행하였다. 로딩 후, 컬럼을 평형 완충액 1 컬럼 용적으로 세척하였다. 이어서, 5D5 Fab를 평형 완충액 중의 0 내지 200 mM 아세트산나트륨의 선형 구배 16-컬럼 용적을 사용하여 컬럼으로부터 용출시켰다. 컬럼 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하고, Fab를 포함한 분획을 푸울링하였다.
하나의 암을 갖는 5 D5 단백질의 소규모 생산
(상기 기술된 바와 같은) 발현 플라스미드 pxcM11C.H-Fc.K를 사용하여 이. 콜라이 균주 33D3 (W3110 kanR ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 laclq lacL8 ompTΔ (nmpc-fepE) degp)를 형질전환시킨 후, 형질전환체를 카베니실린 (50 ug/mL)이 첨가된 LB 배지에서 30 ℃로 밤새 성장시켰다. LB 배지를 카베니실린 (50 ug/mL)을 포함하는 C.R.A.P. 배지 (1)중으로 100배 희석하고, 30 ℃에서 흔들면서 약 24시간 동안 성장시켰다. 소분취량을 떼어내어 SDS-PAGE 및 항-Fab 항체 (사람 IgG Fab에 대한 퍼옥시다제-접합된 염소 IgG 분획; CAPPEL #55223) 또는 항-Fc 항체 (사람 Fc 단편에 대한 퍼옥시다제-접합된 염소 IgG 분획; Bethyl #A08-104P41)을 사용한 웨스턴 분석을 수행하였다. 이어서, 나머지 배양물은 원심분리하고, 세포 페이스트를 항체 정제 단계를 개시할 때까지 -70 ℃에서 동결시켰다.
하나의 암을 갖는 5 D5 의 정제
동결된 세포 페이스트를 해동시키고, 10 용적 (w/v) 용해 완충액 (25 mM 트리스-HCl, 5 mM EDTA, pH 7.5) 중에 현탁시킨 후, 원심분리시켰다. 불용성 펠렛을 폴리트론 (Polytron) 분쇄기 (Kinematica A. G, Switzerland)를 사용하여 용해 완충액 중에 재현탁시키고, 세포를 마이크로플루이다이저 (Microfluidics, Newton, Mass)를 통과시켜 파괴하였다. 폴리에틸렌이민 (Sigma) 0.1 % (v/v)를 용해물에 가하고, 1시간 동안 4 ℃에서 교반시킨 후, 15,000 Xg에서 원심분리하였다. 생성된 상등액을 단백질 A 친화성 수지와 혼합하고, 4 ℃에서 밤새 교반하였다. 수지를 침강시키고, 상등액을 따른 후, 수지를 액체 크로마토그래피 시스템 (Varian Inc, Palo Alto, Calif.)에 부착된 컬럼에 부었다. 컬럼을 10 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA 완충액, pH 7.5, 이어서 동일한 완충액 중의 0.5M NaCl로 세척하고, 50 mM 시트르산나트륨, 0.1 M NaCl 완충액 중의 pH 6 내지 pH 2의 구배로 용출시켰다. 용출된 분획을 즉시 2 M 우레아 및 pH 5.4의 최종 농도로 조절하고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)로 분석하였다. 하나의 암을 갖는 항-c-Met를 포함하는 분획을 푸울링하고, 25 mM MES, 2M 우레아 pH 5.4로 평형화시킨 SP 세파로즈 컬럼 (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.) 상에서 양이온 교환 크로마토그래피하였다. 컬럼을 25 mM MES, pH 5.4 중의 0 내지 1 M NaCl의 구배로 용출시켰다. SDS-PAGE 분석한 후, 푸울링된 용출물을 0.4 M 황산나트륨, pH 6으로 조절하고, 0.4 M 황산나트륨, 25 mM MES pH 6으로 평형화시킨 하이-프로필 (Hi-Propyl) (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)에 로딩시켰다. 컬럼을 25 mM MES, pH 6 중의 0.4 M 내지 0 M의 황산나트륨의 구배로 용출시켰다. SDS-PAGE 분석 후, 생성된 용출물을 센트리프렙 10 (CentriPrep 10, Millipore Corp, Bedford, Mass.)을 사용하여 농축시키고, 10 mM 나트륨 숙시네이트, 0.15 M NaCl, pH 5로 평형화시킨 수퍼덱스 200 컬럼 (Superdex 200 column, Amersham Biosciences)에서 크기 배제 크로마토그래피를 하였다.
단백질 농도를 정량적 아미노산 분석으로 측정하였다. 엔도톡신 수준을 LAL 검정으로 측정하였다. 이들 항체 제제를 다음 분석에 사용하였다.
검정
세포 배양
A549 폐암 세포를 10 % FBS로 보충된 MEM에서 배양하였다. 전술된 바와 같이 [Schwall et al., J. Cell Biol. (1996), 133:709-718] 사람 cMet로 트랜스펙션시킨 BaF3-cMet 세포 및 상기 벡터로 트랜스펙션시킨 BaF3-neo 세포를 10 % FCS, 5 % WEHI-231 세포 배양 조건조절된 배지 (IL-3 포함), 2 mM 글루타민. β-머캅토에탄올 (4 μ/L), 0.5 mg/ml G418로 보충된 RPMI 1640에서 배양하였다. U87 & U118 신경교아종 세포, 786-0 신장암 세포를 10 % FCS를 포함하는 RPMI 1640에서 배양하였다.
HGF - cMet 결합
c-Met-IgG가 IgG 도메인을 통해 미세역가 평판에 포획된 고체상 시스템에서 바이오틴-HGF를 사용하여 HGF 결합 조사를 수행하였다. HGF를 0.1 M NaHCO3, pH 8.5 중에서 20배 몰 과량의 NHS-X-바이오틴과 함께 인큐베이션하여 바이오틴 처리하였다. NHS-X-바이오틴을 실온에서 교반하면서 15분 간격으로 가해지는 4개의 증가물로 나누었다. 비접합된 바이오틴을 투석시켜 제거하고, 표지된 물질을 4 ℃에 서 저장하였다. 미세역가 평판을 4 ℃에서 밤새 코팅 완충액 (0.05 M 카보네이트/비카보네이트, pH 9.6) 중에서 2 μg/ml 어피니퓨어 (AffiniPure) 래비트 항-사람 IgG, Fc (Jackson ImmunoResearch)로 코팅하였다. 평판을 1시간 동안 실온 (RT)에서 0.5 % BSA, pH 7.4를 포함하는 PBS로 차단하고, 2 μg/ml cMet-IgG와 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 냉각된 HGF의 0.01 내지 1,000 nM 경쟁자의 존재 또는 부재 하의 53 ng/ml 바이오틴 표지된 HGF, 항-cMet 5D5 mAb, Fab 또는 하나의 암을 갖는 항체를 1시간 동안 RT에서 가하였다. 평판을 RT에서 1시간 동안 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-스트렙트아비딘 (1:10,000 희석물, Amersham)를 가한 후, 포스파타제 기질 CP-니트로페닐 포스페이트 (Kirkegaard & Perry Laboratories)를 가하고, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과가 도 5에 나타나 있다. 하나의 암을 갖는 항-c-met 5D5 항체는 경쟁적 결합 검정에서 항-c-met Fab와 유사하게 작용하였다.
KIRA 에 의한 c- Met 의 티로신- 포스포릴화
c-Met의 티로신 포스포릴화제를 문헌 [Sadick et al., Anal.Biochem. (1996), 235:207-214]의 방법에 기초하여 (이때 가용화된 수용체는 항-수용체 항체로 코팅되는 평판에 포획되고 항-P-Tyr로 검출된다) 샌드위치 ELISA로 측정하였다. U87 세포를 밤새 37 ℃에서 96-웰 평판에서 106/ml로 도말하였다. 이어서, 배지를 10분 동안 HGF 및/또는 항체와 함께 MEM, 0.1 % FBS로 교체하였다. 이어서, 세포 를 평판 쉐이커 상에서 RT에서 30분 동안 세포 용해 완충액 (20 mM 트리스, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 nM EGTA, 1 % 트리톤, 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (Sigma), 1X 포스파타제 억제제 칵테일 II (Sigma)) 100 μl 중에서 추출하고, 얼음 또는 -70 ℃에서 저장하였다. 용해물을 밤새 항-cMet mAb 1949 (Genentech)로 코팅된 평판에 가하였다. 포스포-티로신 cMet를 1:4000 희석된 바이오틴화 항-포스포티로신 (4G10, Upstate), 이어서 HRP-스트렙트아비딘 및 TMB로의 색상 전개로 검출하였다. 총 cMet를 1:10,000 항-cMet 항체를 사용해 유사하게 측정하였다.
그 결과가 도 6에 나타나 있다.
세포 증식, 이동 검정
BaF3은 정상적으로는 cMet를 발현하지 않고 HGF에 반응하지 않는 뮤린 IL-3 의존적 림프성 세포이다. 그러나, 사람 c-Met에 대한 정상적인 완전한 길이의 cDNA로의 트랜스펙션에 의해 유도된 BaF3-hMet에서 [Schwall et al., J.Cell Biol. (1996), 133:709-718], HGF는 IL-3의 부재 하에 증식 및 생존을 자극한다. BaF3-hMet 및 BaF3-neo 세포를 RPMI 1640, 5 % 우태혈청, 4 μ/L β-ME, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 술페이트, 2 mM L-글루타민 및 5 % WEHI-조건조절된 배지 (IL-3의 공급원)에 통상적으로 계대한다. HGF-의존적 증식을 측정하기 위해서, 알라르마 블루 (Alarma Blue, Trek Diagnostic Systems) 25 μl를 가하고, 4 시간 후 형광 강도를 측정하여 처리한 지 3일 후 세포의 수를 정량하였다. 특이 성에 대한 대조군으로서, 하나의 암을 갖는 S5b를 IL-3로 자극된 BaF3-hMet 세포에서 시험하였다.
그 결과가 도 7에 나타나 있다.
변형된 보이덴 (Boyden) 챔버 검정을 이용하여 MDAMB435-PGL 세포 및 U87 세포의 이동을 평가하였다. 세포를 10 μg/ml 피브로넥틴으로 코팅된 5 μm 포어 폴리카보네이트 필터를 갖는 상부 챔버에 도말 (2X104/웰) 하였다. 5D5 Fab 또는 하나의 암을 갖는 항체를 지시된 양으로 포함하거나 포함하지 않는 HGF 100 ng/ml를 하부 챔버의 배지에 가하였다. 세포를 밤새 배양하였다. 세포를 특별한 스폰지 솜막대를 사용하여 여과 막의 위쪽을 닦아내고, 필터의 표면 아래로 이동된 세포를 고정시킨 후, YO-PRO-3 요오다이드 (Molecular Probes)로 염색하고, 형광 현미경으로 계수하였다.
그 결과가 도 8에 나타나 있다.
약물 동태학
OA-5D5 또는 5D5 Fab (5 mg/kg)을 누드 마우스에 정맥 내로 주사하였다. 지시된 시점에서, 4마리 마우스로부터 혈청 샘플을 수집하여, 샌드위치 ELISA로 검정하였다. 샌드위치 ELISA에서 혈청 샘플은 cMet-IgG로 코팅된 평판에 포획된 후, 경쇄 특이적 2차 항체로 검출된다.
그 결과가 도 9A에 나타나 있다. 하나의 암을 갖는 5D5 항체의 반감기는 이 의 Fab 상대물과 비교하여 상당히 증가하였다.
OA-5D5가 생체 내에서 분해하는지를 측정하기 위해서, 7일 PK 샘플로부터 ELISA에 의한 OA-5D5 40 ng에 상응하는 혈청 용적을 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE 겔에서 전기영동하였다. 겔을 니트로셀룰로즈로 옮기고, HRP 접합된 항-사람 Fc (1:5,000, 사람 특이적, Jackson Labs)로 블롯팅하였다. 나이브 (naive) 마우스로부터의 동일 용적의 혈청을 대조군으로서 동시에 진행하였다.
그 결과가 도 9B에 나타나 있다. 투여한 지 7일에 혈청 중의 하나의 암을 갖는 5D5 항체는 온전하였다.
생체 내 종양 효능 조사
2.5x106 A549 (사람 폐암) 또는 U87 MG 세포 (자가분비 HGF를 분비하고 cMet를 발현하는 사람 신경교아종)로 피하 접종된 4 내지 6주령의 암컷인 흉선이 없는 누드 마우스를 사용하여 효능 조사를 수행하였다. 하나의 암을 갖는 5D5 항체, 5D5 Fab 항체 또는 대조군 항체 (항-gp120)로의 처리를 종양 세포 접종 시 (즉, 아주 처리) 또는 종양이 약 150 mm3로 성장한 후에 개시하였다. 모든 항체는 4주 동안 1회/1주로 복강 내로 투여하였다. 단지 하나의 암을 갖는 5D5 항체만을 아주방트 처리 요법 (항-gp120 대조군을 가짐)으로 시험하였다.
도 10은 U87 MG 세포로 접종시켜 생성된 종양에 대한 결과를 나타낸다. 도 10A (아주방트 처리) 및 도 10B (종양이 확립된 후 처리)에 나타난 바와 같이, 하 나의 암을 갖는 5D5 항체는 종양을 억제시키거나 퇴화시킬 수 있었다. 도 10B에 나타난 바와 같이, 하나의 암을 갖는 5D5 항체는 이의 Fab 상대물과 비교하여 뛰어난 치료 효능을 가졌다. (흥미롭게도, 100 mM의 하나의 암을 갖는 5D5 항체는 시험관 내에서 U87 세포수에 최소한의 효과를 나타내었다)
A549 세포의 접종으로부터 생성된 종양의 처리 결과는 부정적이었으며, 이는 U87 종양에 대해 하나의 암을 갖는 5D5 항-c-met 항체의 효과가 비특이적 독성 때문이 아니라는 것을 확인하는 특이성 조절을 제공한다.
또한, 하나의 암을 갖는 5D5 항-c-met 항체를 다른 기술로 확립된 생체 내 종양 모델, 예를 들어 문헌 [U.S. 특허 제6,271,342호]에 기술된 온코테스트 (Oncotest) 모델을 사용하여 종양 진행을 조절하는 능력에 대해 시험할 수 있다. MRC-5 섬유아세포 (ATCC CCL-171)와 동시 접종된 BxPC-3 (췌장) (ATCC CRL-1687) 세포의 종양 성장은, 하나의 암을 갖는 5D5 항체를 30 mg/kg, 2X/주로 투여하는 경우, 50 % 억제를 나타내었다. 기타 설명적 자료가 하기에 열거된다:
ㆍ하나의 암을 갖는 5D5 항체 10 mg/kg, q7d (즉, 7일 마다)을 사용한 온코테스트 RXF1220 (신장)에서 약 30 %의 종양 억제가 관측되었다;
ㆍ(i) 10 mg/kg, q7d을 사용한 온코테스트 PAXF736 (췌장); (ii) 10 mg/kg, q7d를 사용한 온코테스트 GXF97 (위); (iii) 30 mg/kg, q7d를 사용한 온코테스트 LXFA526 (폐); (iv) 30 mg/kg, q7d을 사용한 온코테스트 LSFA297 (폐)에서 20 % 미만의 종양 성장이 관측되었다;
ㆍ하나의 암을 갖는 5D5 항체 10 mg/kg, q7d을 사용한 A549 이종이식에서 어 떠한 활성도 관측되지 않았다;
ㆍ30 mg/kg, q7d를 사용한 온코테스트 LXFA650 (폐)에서 어떠한 활성도 관측되지 않았다.
Sequence Listing <110> GENENTECH, INC., et al. <120> MONOVALENT ANTIBODY FRAGMENTS USEFUL AS THERAPEUTICS <130> P2081R1PCT <140> PCT/US04/042619 <141> 2004-12-17 <150> US 60/531,409 <151> 2003-12-19 <160> 14 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Ser Tyr Trp Leu His 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe 1 5 10 15 Lys Asp <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Tyr Gly Ser Tyr Val Ser Pro Leu Asp Tyr 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr Ser Ser Gln Lys Asn Tyr 1 5 10 15 Leu Ala <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Gln Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr 5 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Trp Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe 50 55 60 Asn Pro Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Asn Val Asp Arg Ser 65 70 75 Ser Asn Thr Ala Tyr Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ala Asp 80 85 90 Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly Ser Tyr Val Ser Pro 95 100 105 Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 8 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Asp Ile Met Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Val 1 5 10 15 Gly Glu Lys Val Thr Val Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu 20 25 30 Tyr Thr Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 35 40 45 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 50 55 60 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr 65 70 75 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Val Lys Ala Asp Asp Leu Ala 80 85 90 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly 95 100 105 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 110 <210> 9 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence was synthesized <400> 9 taaatttaac gcgtacgctg acattatgat gtcccagtct ccatcc 46 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence was synthesized <400> 10 gggcgagctc aggccctgat gggtgacttc gcaggc 36 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence was synthesized <400> 11 gctacaaacg cgtacgctca ggttcagctg cagcagtctg gg 42 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence was synthesized <400> 12 aagagacggt gaccgaggtt ccttgacc 28 <210> 13 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence was synthesized <400> 13 tttccctttg aattcttggt tgttaacgtt gccgacgcgc atc 43 <210> 14 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence was synthesized <400> 14 tttcccttta tcgatgataa gctgtcaaac atgagtaaac aataaaaaac 50 gccc 54

Claims (97)

  1. 단일 항원 결합 암, 및 상기 단일 항원 결합 암을 포함하는 Fab 분자와 비교하여 항체 단편의 안정성을 증가시키는 Fc 영역을 포함하고, 상기 Fc 영역은 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드의 컴플렉스를 포함하며, 약한 면역억제 특성을 갖거나 면역억제 특성이 없고 T 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하지 않는 항체 단편으로서, 상기 단편은 (a) 경쇄 가변 도메인을 포함하는 제 1 폴리펩티드, (b) 중쇄 가변 도메인 및 제 1 Fc 폴리펩티드를 포함하는 제 2 폴리펩티드, 및 (c) 제 2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 제 3 폴리펩티드를 포함하는 것인 항체 단편.
  2. 제 1항에 있어서, 비글리코실화된 항체 단편.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 면역억제 특성이 T 세포를 고갈시키는 능력을 포함하는 것인 항체 단편.
  5. 제 1항에 있어서, FcRn 결합 이외의 다른 실질적인 이펙터 (effector) 기능을 갖지 않는 항체 단편.
  6. 제 5항에 있어서, 이펙터 기능이 보체 용해인 항체 단편.
  7. 제 1항에 있어서, FcRn에 결합하는 항체 단편.
  8. 삭제
  9. 제 1항에 있어서, T 세포 표면 항원이 CD3 또는 CD4인 항체 단편.
  10. 삭제
  11. 제 1항에 있어서, 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체 단편.
  12. 제 1항에 있어서, 수용체 이량체화 시에 활성화되는 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 단편.
  13. 삭제
  14. 제 1항에 있어서, 제 1 폴리펩티드가 사람 경쇄 불변 도메인에 융합된 비-사람 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 단편.
  15. 제 1항에 있어서, 제 1 폴리펩티드가 사람화 또는 사람 골격 서열에 융합된 비-사람종으로부터의 CDR을 포함하는 항체 단편.
  16. 제 1항에 있어서, 제 2 폴리펩티드가 사람 중쇄 불변 도메인에 융합된 비-사람 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 단편.
  17. 제 1항에 있어서, 제 2 폴리펩티드가 사람화 또는 사람 골격 서열에 융합된 비-사람종으로부터의 CDR을 포함하는 항체 단편.
  18. 제 1항에 있어서, 제 3 폴리펩티드가 N 말단에 적어도 일부의 힌지 서열을 포함하는 N-말단이 절단된 중쇄를 포함하는 항체 단편.
  19. 제 1항에 있어서, 2개의 Fc 폴리펩티드가 공유적으로 연결된 항체 단편.
  20. 제 1항에 있어서, 2개의 Fc 폴리펩티드가 힌지 영역에서 분자간 디술파이드 결합을 통해 연결된 항체 단편.
  21. 제 1항에 있어서, 표적 분자에 결합 시 표적 분자의 다량체화를 억제시키는 항체 단편.
  22. 제 1항에 있어서, 표적 분자에 결합 시 표적 분자에 대한 코그네이트 (cognate) 결합 파트너의 결합을 억제시키는 항체 단편.
  23. 제 1항에 있어서, 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드가 경계면에서 만나고, 제 2 Fc 폴리펩티드의 경계면이 제 1 Fc 폴리펩티드의 경계면에 있는 공동 (cavity)에 위치가능한 돌출부 (protuberance)를 포함하는 항체 단편.
  24. 제 1항에 있어서, 제 2 Fc 폴리펩티드가 돌출부를 암호화하도록 원형/최초 폴리펩티드로부터 변형되거나, 제 1 Fc 폴리펩티드가 공동을 암호화하도록 원형/최초 폴리펩티드로부터 변형되거나, 또는 이들 모두 변형된 항체 단편.
  25. 제 1항에 있어서, 제 2 Fc 폴리펩티드가 돌출부를 암호화하도록 원형/최초 폴리펩티드로부터 변형되고, 제 1 Fc 폴리펩티드가 공동을 암호화하도록 원형/최초 폴리펩티드로부터 변형된 항체 단편.
  26. 제 1항에 있어서, 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드가 경계면에서 만나고, 제 2 Fc 폴리펩티드의 경계면이 제 1 Fc 폴리펩티드의 경계면에 있는 공동에 위치가능한 돌출부를 포함하며, 공동 또는 돌출부 또는 이들 모두가 각각 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드 경계면으로 도입되는 항체 단편.
  27. 삭제
  28. 제 24항에 있어서, 돌출부 및 공동 각각이 천연 발생 아미노산 잔기를 포함하는 항체 단편.
  29. 제 24항에 있어서, 돌출부를 포함하는 Fc 폴리펩티드가, 원형/최초 폴리펩티드의 경계면으로부터의 최초 잔기를 최초 잔기 보다 큰 측쇄 용적을 갖는 도입 잔기로 대체시켜 생성되는 항체 단편.
  30. 제 24항에 있어서, 돌출부를 포함하는 Fc 폴리펩티드가, 상기 폴리펩티드의 경계면으로부터의 최초 잔기를 암호화하는 핵산을 최초 잔기 보다 큰 측쇄 용적을 갖는 도입 잔기를 암호화하는 핵산으로 대체시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되는 항체 단편.
  31. 제 29항에 있어서, 최초 잔기가 트레오닌인 항체 단편.
  32. 제 29항에 있어서, 도입 잔기가 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 또는 트립토판 (W)인 항체 단편.
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 제 23항에 있어서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드가, 원형/최초 폴리펩티드의 경계면으로부터의 최초 잔기를 최초 잔기 보다 작은 측쇄 용적을 갖는 도입 잔기로 대체시켜 생성되는 항체 단편.
  37. 제 23항에 있어서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드가, 상기 폴리펩티드의 경계면으로부터의 최초 잔기를 암호화하는 핵산을 최초 잔기 보다 작은 측쇄 용적을 갖는 도입 잔기를 암호화하는 핵산으로 대체시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되는 항체 단편.
  38. 제 36항에 있어서, 최초 잔기가 트레오닌, 루이신, 또는 티로신인 항체 단편.
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 제 36항에 있어서, 도입 잔기가 시스테인 (C)이 아니거나, 또는 도입 잔기가 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T) 또는 발린 (V)인 항체 단편.
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 제 36항에 있어서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드가 트레오닌, 루이신 및 티로신으로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 최초 아미노산의 대체를 포함하는 항체 단편.
  47. 제 36항에 있어서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드가 알라닌, 세린, 트레오닌 및 발린으로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 도입 잔기를 포함하는 항체 단편.
  48. 제 36항에 있어서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드가 트레오닌, 루이신 및 티로신으로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 최초 아미노산의 대체를 포함하고, 최초 아미노산이 알라닌, 세린, 트레오닌 및 발린으로 이루어진 군 중에서 선택되는 도입 잔기로 대체되는 항체 단편.
  49. 제 23항에 있어서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드가 위치 366에 있는 트레오닌의 세린으로의 대체를 포함하거나, 위치 368에 있는 루이신의 알라닌으로의 대체를 포함하거나, 또는 티로신의 발린으로의 대체를 포함하고, 아미노산 번호매김이 Kabat의 EU 번호매김 체계에 따르는 항체 단편.
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 제 23항에 있어서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드가 T366S, L368A 및 Y407V로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 아미노산 대체를 포함하는 항체 단편.
  53. 제 23항에 있어서, 돌출부를 포함하는 Fc 폴리펩티드가 위치 366에 있는 트레오닌의 트립토판으로의 대체를 포함하고, 아미노산 번호매김이 Kabat의 EU 번호매김 체계에 따르는 항체 단편.
  54. 제 1항에 있어서, 제 1 및 제 2 Fc 폴리펩티드 각각이 항체 불변 도메인을 포함하는 항체 단편.
  55. 제 54항에 있어서, 항체 불변 도메인이 CH2 및/또는 CH3 도메인인 항체 단편.
  56. 제 54항에 있어서, 항체 불변 도메인이 IgG로부터 유래한 항체 단편.
  57. 제 56항에 있어서, IgG가 사람 IgG1인 항체 단편.
  58. 제 1항에 있어서, 단일특이적인 항체 단편.
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 면역글로불린의 75 % 이상이 제 1항, 제 2항, 제 4항 내지 제 7항, 제 9항, 제 11항, 제 12항, 제 14항 내지 제 26항, 제 28항 내지 제 32항, 제 36항 내지 제 38항, 제 41항, 제 46항 내지 제 49항, 및 제 52항 내지 제 58항 중 어느 한 항의 항체 단편인 면역글로불린군을 포함하는, 악성 종양, 양성 종양, 비-백혈병, 림프성 악성종양, 뉴런 장애, 신경교 장애, 성상세포 장애, 시상하부 장애, 선(glandular) 장애, 대식구 장애, 상피 장애, 간질 장애, 블라스토코엘릭 (blastocoelic) 장애, 또는 혈관형성-관련 장애 치료 또는 예방용 조성물.
  62. (a) 제 1항, 제 2항, 제 4항 내지 제 7항, 제 9항, 제 11항, 제 12항, 제 14항 내지 제 26항, 제 28항 내지 제 32항, 제 36항 내지 제 38항, 제 41항, 제 46항 내지 제 49항, 및 제 52항 내지 제 58항 중 어느 한 항의 항체 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 숙주 세포 배양물로부터 항체 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 제 1항, 제 2항, 제 4항 내지 제 7항, 제 9항, 제 11항, 제 12항, 제 14항 내지 제 26항, 제 28항 내지 제 32항, 제 36항 내지 제 38항, 제 41항, 제 46항 내지 제 49항, 및 제 52항 내지 제 58항 중 어느 한 항의 항체 단편을 제조하는 방법.
  63. (a) 제 1항, 제 2항, 제 4항 내지 제 7항, 제 9항, 제 11항, 제 12항, 제 14항 내지 제 26항, 제 28항 내지 제 32항, 제 36항 내지 제 38항, 제 41항, 제 46항 내지 제 49항, 및 제 52항 내지 제 58항 중 어느 한 항의 항체 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 숙주 세포 배양물로부터 항체 단편을 회수하는 단계를 포함하고;
    상기 항체 단편을 포함하는 폴리펩티드를, 면역글로불린군의 50 % 이상이 제 1항, 제 2항, 제 4항 내지 제 7항, 제 9항, 제 11항, 제 12항, 제 14항 내지 제 26항, 제 28항 내지 제 32항, 제 36항 내지 제 38항, 제 41항, 제 46항 내지 제 49항, 및 제 52항 내지 제 58항 중 어느 한 항의 항체 단편이 되는 비율로 발현시키는,
    제 1항, 제 2항, 제 4항 내지 제 7항, 제 9항, 제 11항, 제 12항, 제 14항 내지 제 26항, 제 28항 내지 제 32항, 제 36항 내지 제 38항, 제 41항, 제 46항 내지 제 49항, 및 제 52항 내지 제 58항 중 어느 한 항의 항체 단편을 제조하는 방법.
  64. 제 63항에 있어서, 약 등몰량의 폴리펩티드를 발현시키는, 항체 단편을 제조하는 방법.
  65. 제 64항에 있어서, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 대체로 동일한 세기의 해독 개시 영역 (TIR)에 작동 가능하게 연결시키는, 항체 단편을 제조하는 방법.
  66. 제 62항에 있어서, 숙주 세포가 원핵생물인, 항체 단편을 제조하는 방법.
  67. 제 66항에 있어서, 숙주 세포가 이. 콜라이 (E. coli)인, 항체 단편을 제조하는 방법.
  68. 제 67항에 있어서, 이. 콜라이가 내인성 프로테아제 활성이 결핍된 균주인, 항체 단편을 제조하는 방법.
  69. 제 62항에 있어서, 숙주 세포가 진핵생물인, 항체 단편을 제조하는 방법.
  70. 제 69항에 있어서, 숙주 세포가 CHO인, 항체 단편을 제조하는 방법.
  71. 제 62항에 있어서, 항체 단편을 배양 배지로부터 회수하는, 항체 단편을 제조하는 방법.
  72. 제 62항에 있어서, 항체 단편을 세포 용해물로부터 회수하는, 항체 단편을 제조하는 방법.
  73. (a) 제 23항의 항체 단편의 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 숙주 세포에 도입하는 단계;
    (b) 상기 항체 단편을 암호화하는 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) 숙주 세포 배양물로부터 항체 단편을 회수하는 단계를 포함하고,
    여기서, 제 2 Fc 폴리펩티드의 경계면을 암호화하는 핵산은 돌출부를 암호화하도록 제 2 Fc 폴리펩티드의 최초 경계면을 암호화하는 핵산으로부터 변형시키고, 제 1 Fc 폴리펩티드의 경계면을 암호화하는 핵산은 공동을 암호화하도록 제 1 Fc 폴리펩티드의 최초 경계면을 암호화하는 핵산으로부터 변형시킨 것인, 제 23항의 항체 단편을 제조하는 방법.
  74. 제 73항에 있어서, 제 2 Fc 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 돌출부를 암호화하도록 최초 핵산으로부터 변형시키고, 제 1 Fc 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 공동을 암호화하도록 최초 핵산으로부터 변형시키는, 항체 단편을 제조하는 방법.
  75. 제 73항에 있어서, 단계 (a)에 앞서, 제 2 Fc 폴리펩티드의 경계면으로부터의 최초 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산을 최초 아미노산 잔기 보다 큰 측쇄 용적을 갖는 도입 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산으로 대체하는 단계를 수행하며, 여기서 보다 큰 측쇄 용적을 갖는 도입 잔기는 돌출부를 포함하는 것인, 항체 단편을 제조하는 방법.
  76. 제 73항에 있어서, 단계 (a)에 앞서, 제 1 Fc 폴리펩티드의 경계면에 있는 최초 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산을 최초 아미노산 잔기 보다 작은 측쇄 용적을 갖는 도입 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산으로 대체하여 공동을 형성하는 단계를 수행하는, 항체 단편을 제조하는 방법.
  77. 삭제
  78. (a) 제 1항, 제 2항, 제 4항 내지 제 7항, 제 9항, 제 11항, 제 12항, 제 14항 내지 제 26항, 제 28항 내지 제 32항, 제 36항 내지 제 38항, 제 41항, 제 46항 내지 제 49항, 및 제 52항 내지 제 58항 중의 어느 한 항의 항체 단편을 형성하는 폴리펩티드를 제조하는 단계; 및
    (b) 헤테로다량체화시키는 단계를 포함하는,
    제 1항, 제 2항, 제 4항 내지 제 7항, 제 9항, 제 11항, 제 12항, 제 14항 내지 제 26항, 제 28항 내지 제 32항, 제 36항 내지 제 38항, 제 41항, 제 46항 내지 제 49항, 및 제 52항 내지 제 58항 중 어느 한 항의 항체 단편을 제조하는 방법.
  79. 삭제
  80. 제 78항에 있어서, 형성되는 면역글로불린 폴리펩티드 컴플렉스의 50 % 이상이 헤테로삼량체인, 항체 단편을 제조하는 방법.
  81. 제 78항에 있어서, 단계 (b)가 제 1 Fc 폴리펩티드 및 제 2 Fc 폴리펩티드를 시험관 내에서 커플링하는 것을 포함하는, 항체 단편을 제조하는 방법.
  82. 제 78항에 있어서, 최초 경계면의 아미노산 서열을 변형시켜 조작된 경계면에 돌출부 및 공동을 생성하는, 항체 단편을 제조하는 방법.
  83. 제 1항, 제 2항, 제 4항 내지 제 7항, 제 9항, 제 11항, 제 12항, 제 14항 내지 제 26항, 제 28항 내지 제 32항, 제 36항 내지 제 38항, 제 41항, 제 46항 내지 제 49항, 및 제 52항 내지 제 58항 중 어느 한 항의 항체 단편을 암호화하는 분리된 핵산.
  84. 제 1항, 제 2항, 제 4항 내지 제 7항, 제 9항, 제 11항, 제 12항, 제 14항 내지 제 26항, 제 28항 내지 제 32항, 제 36항 내지 제 38항, 제 41항, 제 46항 내지 제 49항, 및 제 52항 내지 제 58항 중 어느 한 항의 항체 단편을 집단으로 암호화하는 2개 이상의 재조합 핵산을 포함하는 조성물.
  85. 제 83항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  86. 제 85항에 있어서, 항원 결합 암을 암호화하는 핵산이 단일 벡터에 존재하는 숙주 세포.
  87. 제 85항에 있어서, 항원 결합 암을 암호화하는 핵산이 분리된 벡터에 존재하는 숙주 세포.
  88. 제 85항에 있어서, 항원 결합 암 및 N-말단이 절단된 중쇄를 암호화하는 핵산이 단일 벡터에 존재하는 숙주 세포.
  89. 제 1항, 제 2항, 제 4항 내지 제 7항, 제 9항, 제 11항, 제 12항, 제 14항 내지 제 26항, 제 28항 내지 제 32항, 제 36항 내지 제 38항, 제 41항, 제 46항 내지 제 49항, 및 제 52항 내지 제 58항 중 어느 한 항의 항체 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하여 폴리펩티드를 발현시키는 단계, 및
    세포 배양물로부터 제 1항, 제 2항, 제 4항 내지 제 7항, 제 9항, 제 11항, 제 12항, 제 14항 내지 제 26항, 제 28항 내지 제 32항, 제 36항 내지 제 38항, 제 41항, 제 46항 내지 제 49항, 및 제 52항 내지 제 58항 중 어느 한 항의 항체 단편을 회수하는 단계를 포함하는,
    제 1항, 제 2항, 제 4항 내지 제 7항, 제 9항, 제 11항, 제 12항, 제 14항 내지 제 26항, 제 28항 내지 제 32항, 제 36항 내지 제 38항, 제 41항, 제 46항 내지 제 49항, 및 제 52항 내지 제 58항 중 어느 한 항의 항체 단편을 제조하는 방법.
  90. 제 89항에 있어서, 항체 단편을 세포 용해물로부터 회수하는, 항체 단편을 제조하는 방법.
  91. 제 89항에 있어서, 항체 단편을 세포 배양 배지로부터 회수하는, 항체 단편을 제조하는 방법.
  92. 제 89항에 있어서, 숙주 세포가 원핵생물 세포인, 항체 단편을 제조하는 방법.
  93. 제 92항에 있어서, 숙주 세포가 이. 콜라이인, 항체 단편을 제조하는 방법.
  94. 제 89항에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포인, 항체 단편을 제조하는 방법.
  95. 제 1항, 제 2항, 제 4항 내지 제 7항, 제 9항, 제 11항, 제 12항, 제 14항 내지 제 26항, 제 28항 내지 제 32항, 제 36항 내지 제 38항, 제 41항, 제 46항 내지 제 49항, 및 제 52항 내지 제 58항 중 어느 한 항의 항체 단편 및 담체를 포함하는, 악성 종양, 양성 종양, 비-백혈병, 림프성 악성종양, 뉴런 장애, 신경교 장애, 성상세포 장애, 시상하부 장애, 선(glandular) 장애, 대식구 장애, 상피 장애, 간질 장애, 블라스토코엘릭 (blastocoelic) 장애, 또는 혈관형성-관련 장애 치료 또는 예방용 조성물.
  96. 삭제
  97. 삭제
KR1020067014346A 2003-12-19 2004-12-17 치료제로서 유용한 일가 항체 단편 KR100956913B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US53140903P 2003-12-19 2003-12-19
US60/531,409 2003-12-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060130610A KR20060130610A (ko) 2006-12-19
KR100956913B1 true KR100956913B1 (ko) 2010-05-11

Family

ID=34738648

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067014346A KR100956913B1 (ko) 2003-12-19 2004-12-17 치료제로서 유용한 일가 항체 단편

Country Status (22)

Country Link
US (5) US20050227324A1 (ko)
EP (2) EP2275448A3 (ko)
JP (2) JP2008504007A (ko)
KR (1) KR100956913B1 (ko)
CN (1) CN1922210A (ko)
AT (1) ATE554107T1 (ko)
AU (1) AU2004309347B2 (ko)
BR (1) BRPI0417107A (ko)
CA (1) CA2548757A1 (ko)
CY (1) CY1112862T1 (ko)
DK (1) DK1718677T3 (ko)
ES (1) ES2384569T3 (ko)
HK (1) HK1099027A1 (ko)
IL (2) IL175885A (ko)
MX (1) MXPA06006985A (ko)
NZ (1) NZ547438A (ko)
PL (1) PL1718677T3 (ko)
PT (1) PT1718677E (ko)
RU (1) RU2006126097A (ko)
SI (1) SI1718677T1 (ko)
WO (1) WO2005063816A2 (ko)
ZA (1) ZA200604864B (ko)

Families Citing this family (192)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
ATE446317T1 (de) 2001-05-11 2009-11-15 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Spezifische bindungsproteine und ihre verwendung
KR100956913B1 (ko) * 2003-12-19 2010-05-11 제넨테크, 인크. 치료제로서 유용한 일가 항체 단편
PT1773885E (pt) 2004-08-05 2010-07-21 Genentech Inc Antagonistas anti-cmet humanizados
WO2006031994A2 (en) * 2004-09-14 2006-03-23 Xencor, Inc. Monomeric immunoglobulin fc domains
JP2008535821A (ja) * 2005-03-25 2008-09-04 ジェネンテック・インコーポレーテッド 過剰に安定化したｃ−ｍｅｔを調節するための方法及び組成物
NI200800032A (es) 2005-07-25 2009-03-23 Reducción de célula b utilizando moléculas de unión específicas cd37 y cd20
AR056142A1 (es) * 2005-10-21 2007-09-19 Amgen Inc Metodos para generar el anticuerpo igg monovalente
KR101866623B1 (ko) 2005-11-28 2018-07-04 젠맵 에이/에스 재조합 １가 항체 및 그의 제조 방법
US9181344B2 (en) * 2005-12-15 2015-11-10 Genmab A/S Use of effector-function-deficient antibodies for treatment of auto-immune diseases
KR20080080651A (ko) 2005-12-20 2008-09-04 아라나 테라퓨틱스 리미티드 항염증성 ｄａｂ
US7846439B2 (en) 2006-02-01 2010-12-07 Cephalon Australia Pty Ltd Domain antibody construct
TW200812615A (en) 2006-03-22 2008-03-16 Hoffmann La Roche Tumor therapy with an antibody for vascular endothelial growth factor and an antibody for human epithelial growth factor receptor type 2
MX2008015524A (es) 2006-06-12 2009-01-13 Trubion Pharmaceuticals Inc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
GB0614780D0 (en) * 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
SG174090A1 (en) 2006-08-21 2011-09-29 Hoffmann La Roche Tumor therapy with an anti-vegf antibody
US8680252B2 (en) * 2006-12-10 2014-03-25 Dyadic International (Usa), Inc. Expression and high-throughput screening of complex expressed DNA libraries in filamentous fungi
US9862956B2 (en) 2006-12-10 2018-01-09 Danisco Us Inc. Expression and high-throughput screening of complex expressed DNA libraries in filamentous fungi
JP5276017B2 (ja) 2007-01-25 2013-08-28 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド Ｅｇｆｒ変異体仲介性疾患の治療における抗ｅｇｆｒ抗体の使用
PE20081760A1 (es) 2007-02-09 2009-01-01 Genentech Inc Anticuerpos anti-robo4 y sus usos
CN101688229B (zh) 2007-03-15 2013-06-12 路德维格癌症研究所 包含egfr抗体和src抑制剂的组合物及其在制备用于治疗哺乳动物癌症的药物中的用途
BRPI0811857A2 (pt) * 2007-05-14 2014-10-21 Biogen Idec Inc Regiões fc (scfc) de cadeia simples, polipeptídeos de aglutinação que as compreendem e métodos relacionados.
US7867491B2 (en) * 2007-05-30 2011-01-11 Genexine Co., Ltd. Immunoglobulin fusion proteins
AU2008255350B2 (en) 2007-05-31 2014-07-10 Genmab A/S Transgenic animals producing monovalent human antibodies and antibodies obtainable from these animals
CA2688275A1 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Stable igg4 antibodies
WO2008145138A1 (en) * 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Recombinant fucose modified monovalent half-antibodies obtained by molecular engineering
US20100291023A1 (en) * 2007-05-31 2010-11-18 Genmab A/S Method for extending the half-life of exogenous or endogenous soluble molecules
EP2170951A2 (en) * 2007-05-31 2010-04-07 Genmab A/S Recombinant non glycosylated monovalent half-antibodies obtained by molecular engineering
EP2152751A1 (en) * 2007-05-31 2010-02-17 Genmab A/S Fusion or linked proteins with extended half life
CN101896503B (zh) 2007-08-14 2018-05-22 路德维格癌症研究所有限公司 靶向egf受体的单克隆抗体175及其衍生物和用途
US7982016B2 (en) 2007-09-10 2011-07-19 Amgen Inc. Antigen binding proteins capable of binding thymic stromal lymphopoietin
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
BRPI0906049A8 (pt) 2008-03-14 2018-06-26 Genentech Inc método para determinar se um câncer em um paciente é resistente ao tratamento com um agente antimitótico, método para tratar um paciente com câncer que é resistente ao agente antimitótico e método de tratamento
SI2132228T1 (sl) 2008-04-11 2011-10-28 Emergent Product Dev Seatle CD37 imunoterapevtik in kombinacija z njegovim bifunkcionalnim kemoterapevtikom
PA8849001A1 (es) 2008-11-21 2010-06-28 Lilly Co Eli Anticuerpos de c-met
AU2009324092A1 (en) 2008-12-03 2011-06-23 Genmab A/S Antibody variants having modifications in the constant region
EP2210902A1 (en) * 2009-01-14 2010-07-28 TcL Pharma Recombinant monovalent antibodies
CN101830986A (zh) * 2009-03-13 2010-09-15 北京表源生物技术有限公司 一种融合蛋白多聚体
CA2756244A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
KR20110126748A (ko) 2009-04-07 2011-11-23 로슈 글리카트 아게 이중특이적 항-ｅｒｂｂ-1/항-ｃ-ｍｅｔ 항체
MX2011010166A (es) 2009-04-07 2011-10-11 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-3/anti-c-met.
EP2417156B1 (en) 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
EA023179B1 (ru) 2009-08-13 2016-05-31 Круселл Холланд Б.В. Антитела против респираторного синцитиального вируса (pcb) и способы их применения
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
CN104945509A (zh) 2009-09-16 2015-09-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含卷曲螺旋和/或系链的蛋白质复合体及其用途
WO2011035205A2 (en) 2009-09-18 2011-03-24 Calmune Corporation Antibodies against candida, collections thereof and methods of use
WO2011056997A1 (en) 2009-11-04 2011-05-12 Fabrus Llc Methods for affinity maturation-based antibody optimization
TW201120210A (en) 2009-11-05 2011-06-16 Hoffmann La Roche Glycosylated repeat-motif-molecule conjugates
AU2010314981B2 (en) 2009-11-05 2015-07-02 Genentech, Inc. Methods and composition for secretion of heterologous polypeptides
EP3511342B1 (en) 2010-03-10 2024-01-17 Genmab A/S Monoclonal antibodies against c-met
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
US20110287003A1 (en) * 2010-05-14 2011-11-24 Genentech, Inc. Treatment methods
EP2576621B1 (en) 2010-05-27 2019-04-10 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
EP2575880B1 (en) 2010-05-27 2019-01-16 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2 epitope
MX343298B (es) 2010-07-09 2016-11-01 Crucell Holland Bv Anticuerpos contra el virus sincitial respiratorio (rsv) humano y metodos de uso.
WO2012016227A2 (en) 2010-07-29 2012-02-02 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
JP5758004B2 (ja) 2010-08-24 2015-08-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ジスルフィドによって安定化されたＦｖ断片を含む二重特異性抗体
MX2013002084A (es) 2010-08-31 2013-05-09 Genentech Inc Biomarcadores y metodos de tratamiento.
JP6167040B2 (ja) 2010-11-05 2017-07-19 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計
AU2011336470B8 (en) 2010-12-01 2017-09-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
EP2655413B1 (en) 2010-12-23 2019-01-16 F.Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
WO2012106587A1 (en) 2011-02-04 2012-08-09 Genentech, Inc. Fc VARIANTS AND METHODS FOR THEIR PRODUCTION
US10689447B2 (en) 2011-02-04 2020-06-23 Genentech, Inc. Fc variants and methods for their production
BR112013019975A2 (pt) 2011-02-28 2017-08-01 Hoffmann La Roche proteínas de ligação de antígeno, composição farmacêutica, uso de uma proteína de ligação de antígeno, método para o tratamento de um paciente e método para a preparação de uma proteína de ligação de antígeno, ácido nucleico, vetor e célula hospedeira"
MX342034B (es) 2011-02-28 2016-09-12 Hoffmann La Roche Proteinas monovalentes que se unen a antigenos.
SG193554A1 (en) 2011-03-29 2013-11-29 Roche Glycart Ag Antibody fc variants
KR20140045440A (ko) 2011-06-30 2014-04-16 제넨테크, 인크. 항-c-met 항체 제제
JP2015527869A (ja) 2011-08-26 2015-09-24 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド タンデムＦｃ二重特異性抗体
JP2014534949A (ja) 2011-09-19 2014-12-25 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｃ−ｍｅｔアンタゴニストおよびｂ−ｒａｆアンタゴニストを含む組合せ処置
JP2014530201A (ja) 2011-09-20 2014-11-17 イーライ リリー アンド カンパニー 抗ｃ−Ｍｅｔ抗体
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
EA030440B1 (ru) 2011-10-24 2018-08-31 Галозим, Инк. Сопровождающая диагностика для терапии антигиалуронановым агентом и способы ее применения
PL2773671T3 (pl) 2011-11-04 2022-01-24 Zymeworks Inc. Projekt stabilnego przeciwciała heterodimerycznego z mutacjami w domenie fc
JP2014533700A (ja) 2011-11-21 2014-12-15 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃ−ＭＥＴ抗体の精製
WO2013119966A2 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Genentech, Inc. Single-chain antibodies and other heteromultimers
US20150125449A1 (en) * 2012-05-10 2015-05-07 Zymeworks Inc. Single-Arm Monovalent Antibody Constructs and Uses Thereof
US9499634B2 (en) 2012-06-25 2016-11-22 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
JP6203838B2 (ja) 2012-06-27 2017-09-27 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 少なくとも２つの異なる結合実体を含む、テーラーメイドの高度に選択的かつ多重特異的なターゲティング実体を選択および作製するための方法、ならびにその使用
WO2014001325A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
CN104428315B (zh) 2012-07-13 2017-09-29 罗氏格黎卡特股份公司 双特异性抗‑vegf/抗‑ang‑2抗体及其在治疗眼血管疾病中的应用
US9714291B2 (en) 2012-10-05 2017-07-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Heterodimer protein composition
WO2014062856A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
EP2727941A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
EP2914629A1 (en) 2012-11-05 2015-09-09 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
US9856319B2 (en) 2012-12-28 2018-01-02 Abbvie Inc. Monovalent binding proteins
ITTO20130012A1 (it) 2013-01-09 2014-07-10 Metheresis Translational Res S A Nuovi frammenti anticorpali, relative composizioni ed usi
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
EP3620473A1 (en) 2013-01-14 2020-03-11 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
AU2014207549B2 (en) 2013-01-15 2018-12-06 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
EA201591652A1 (ru) 2013-03-06 2016-02-29 Мерримак Фармасьютикалз, Инк. ТАНДЕМНЫЕ БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ Fc-АНТИТЕЛА ПРОТИВ c-MET
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
CA2906927C (en) 2013-03-15 2021-07-13 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US20160114057A1 (en) * 2013-05-24 2016-04-28 Zyeworks Inc. Modular protein drug conjugate therapeutic
RU2655439C2 (ru) 2013-05-31 2018-05-28 Займворкс Инк. Гетеромультимеры с уменьшенной или подавленной эффекторной функцией
EP3055329B1 (en) 2013-10-11 2018-06-13 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
PL3116999T3 (pl) 2014-03-14 2021-12-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Sposoby i kompozycje do wydzielania polipeptydów heterologicznych
MX2016012285A (es) 2014-03-24 2017-01-23 Genentech Inc Tratamiento de cáncer con antagonista de c-met y correlación de estos con la expresión de hgf.
ME03666B (me) 2014-03-28 2020-10-20 Xencor Inc Bispecifična antitela koja se vezuju za cd38 i cd3
CA3203273A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Halozyme, Inc. Compositions of adenosine deaminase-2 (ada2), variants thereof and methods of using same
EP3223845B1 (en) 2014-11-26 2021-05-19 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd20
KR20170084327A (ko) 2014-11-26 2017-07-19 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 cd38에 결합하는 이형이량체 항체
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
PL3227332T3 (pl) 2014-12-03 2020-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Wielospecyficzne przeciwciała
US10047157B2 (en) 2014-12-19 2018-08-14 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Humanized anti-ACTH antibodies and use thereof
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
EP3816179A3 (en) 2015-02-05 2021-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant comprising a modified fcrn-binding domain
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
JP6865689B2 (ja) 2015-03-06 2021-04-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド 超精製ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ、ならびにそれらの作製及び使用方法
WO2016196679A1 (en) 2015-06-02 2016-12-08 Genentech, Inc. Compositions and methods for using anti-il-34 antibodies to treat neurological diseases
CN113372443A (zh) 2015-09-18 2021-09-10 中外制药株式会社 Il-8-结合抗体及其应用
WO2017053469A2 (en) 2015-09-21 2017-03-30 Aptevo Research And Development Llc Cd3 binding polypeptides
JP7058219B2 (ja) 2015-12-07 2022-04-21 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｐｓｍａに結合するヘテロ二量体抗体
CN109715657A (zh) 2016-04-15 2019-05-03 高山免疫科学股份有限公司 Cd80变体免疫调节蛋白及其用途
US10882914B2 (en) 2016-04-15 2021-01-05 Alpine Immune Sciences, Inc. ICOS ligand variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN109312408B (zh) 2016-05-17 2022-12-23 豪夫迈·罗氏有限公司 用于诊断和供免疫疗法中使用的基质基因签名
RU2022104399A (ru) 2016-06-14 2022-05-05 Ксенкор, Инк. Биспецифические антитела-ингибиторы контрольных точек
CN109563124A (zh) 2016-06-17 2019-04-02 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性抗体的纯化
US10316088B2 (en) 2016-06-28 2019-06-11 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CA3032120A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
KR102562519B1 (ko) 2016-10-14 2023-08-02 젠코어 인코포레이티드 IL-15/IL-15Rα FC-융합 단백질 및 PD-1 항체 단편을 포함하는 이중특이성 이종이량체 융합 단백질
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
CN110494565A (zh) 2016-12-02 2019-11-22 朱诺治疗学股份有限公司 工程化b细胞及相关组合物和方法
US20180230218A1 (en) 2017-01-04 2018-08-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
NZ756395A (en) 2017-03-16 2024-01-26 Alpine Immune Sciences Inc Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3596116B1 (en) 2017-03-16 2023-09-06 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-l1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN110809581A (zh) 2017-03-16 2020-02-18 高山免疫科学股份有限公司 Pd-l2变体免疫调节蛋白及其用途
AU2018250641A1 (en) 2017-04-11 2019-10-31 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs having constrained CD3 binding and methods of using the same
US10781435B2 (en) 2017-06-22 2020-09-22 Catalyst Biosciences, Inc. Modified membrane type serine protease 1 (MTSP-1) polypeptides and methods of use
MA49517A (fr) 2017-06-30 2020-05-06 Xencor Inc Protéines de fusion fc hétérodimères ciblées contenant il-15/il-15ra et domaines de liaison à l'antigène
CA3070297A1 (en) 2017-08-11 2019-02-14 Genentech, Inc. Anti-cd8 antibodies and uses thereof
MA50360A (fr) 2017-10-10 2020-08-19 Alpine Immune Sciences Inc Protéines immunomodulatrices de variants de ctla-4 et leurs utilisations
SG11202003078VA (en) 2017-10-18 2020-05-28 Alpine Immune Sciences Inc Variant icos ligand immunomodulatory proteins and related compositions and methods
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
KR20200085828A (ko) 2017-11-08 2020-07-15 젠코어 인코포레이티드 신규의 항-pd-1 서열을 사용한 이중특이적 및 단일특이적 항체
MX2020006322A (es) 2017-12-19 2020-09-18 Xencor Inc Proteinas de fusion il-2 fc modificadas.
SG11202006148UA (en) 2018-01-03 2020-07-29 Alpine Immune Sciences Inc Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
AU2019247415A1 (en) 2018-04-04 2020-10-22 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
BR112020020604A2 (pt) 2018-04-11 2021-01-12 Inhibrx, Inc. Construções de polipeptídeo multiespecífico tendo ligação restrita de cd3 e métodos e usos relacionados
WO2019204665A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
CN112437777A (zh) 2018-04-18 2021-03-02 Xencor股份有限公司 包含IL-15/IL-15RA Fc融合蛋白和TIM-3抗原结合结构域的靶向TIM-3的异源二聚体融合蛋白
WO2019241758A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2020014306A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
JP2021531785A (ja) 2018-07-24 2021-11-25 インヒブルクス インコーポレイテッド 制約されたｃｄ３結合ドメインおよび受容体結合領域を含有する多重特異性ポリペプチド構築物ならびにそれを使用する方法
TW202021618A (zh) 2018-08-17 2020-06-16 美商２３與我有限公司 抗ｉｌ１ｒａｐ抗體及其使用方法
JP2022501361A (ja) 2018-09-19 2022-01-06 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド バリアントｃｄ８０融合タンパク質および関連構築物の方法および使用
WO2020061441A1 (en) * 2018-09-21 2020-03-26 University Of Cincinnati SUPPRESSING IgE-MEDIATED ALLERGY BY DESENSITIZATION WITH MONOVALENT ANTI-FC MONOCLONAL ANTIBODY
CA3115096A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
IT201800009282A1 (it) * 2018-10-09 2020-04-09 Metis Prec Medicine Sb Srl Nuovo agente terapeutico per il trattamento di un tumore e/o metastasi
EP3864049A1 (en) 2018-10-11 2021-08-18 Inhibrx, Inc. Pd-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
WO2020076992A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. 5t4 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
JP2022504822A (ja) 2018-10-11 2022-01-13 インヒブルクス インコーポレイテッド Ｄｌｌ３シングルドメイン抗体およびその治療用組成物
TW202028246A (zh) 2018-10-11 2020-08-01 美商英伊布里克斯公司 B7h3單域抗體及其治療性組合物
EP3887394A2 (en) 2018-11-30 2021-10-06 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd86 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
AR117327A1 (es) 2018-12-20 2021-07-28 23Andme Inc Anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
PE20211295A1 (es) 2018-12-21 2021-07-20 23Andme Inc Anticuerpos anti il-36 y procedimientos de uso de estos
US11613744B2 (en) 2018-12-28 2023-03-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
BR112021012601A2 (pt) 2018-12-28 2021-11-30 Catalyst Biosciences Inc Polipeptídeos ativadores de plasminogênio do tipo uroquinase modificados e métodos de uso
US11472890B2 (en) 2019-03-01 2022-10-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind ENPP3 and CD3
EP3955953A1 (en) 2019-04-17 2022-02-23 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of variant icos ligand (icosl) fusion proteins
CN110174456B (zh) * 2019-06-11 2021-09-21 华润双鹤药业股份有限公司 一种测定肺表面活性物质蛋白的方法及其应用
KR20220063185A (ko) 2019-09-16 2022-05-17 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 면역-pet 영상화를 위한 방사성 표지된 met 결합 단백질
EP4097129A1 (en) 2020-01-29 2022-12-07 Inhibrx, Inc. Cd28 single domain antibodies and multivalent and multispecific constructs thereof
AU2021267276A1 (en) 2020-05-08 2022-12-15 Alpine Immune Sciences, Inc. April and BAFF inhibitory immunomodulatory proteins and methods of use thereof
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
AU2021281417A1 (en) 2020-05-29 2022-12-08 23Andme, Inc. Anti-CD200R1 antibodies and methods of use thereof
WO2021259880A1 (en) 2020-06-22 2021-12-30 Almirall, S.A. Anti-il-36 antibodies and methods of use thereof
IL300528A (en) 2020-08-07 2023-04-01 Fortis Therapeutics Inc Immune conjugates targeting cd46 and methods of using them
EP4200332A1 (en) 2020-08-19 2023-06-28 Xencor, Inc. Anti-cd28 and/or anti-b7h3 compositions
JP2023541627A (ja) 2020-09-14 2023-10-03 イシュノス サイエンシズ ソシエテ アノニム Ｉｌ１ｒａｐに結合する抗体及びその使用
CA3212665A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
WO2022192586A1 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
PE20240641A1 (es) 2021-05-07 2024-04-04 Alpine Immune Sciences Inc Metodos de dosificacion y tratamiento con una proteina inmunomoduladora de fusion taci-fc
WO2023168426A1 (en) 2022-03-03 2023-09-07 Enosi Therapeutics Corporation Compositions and cells containing mixtures of oligo-trap fusion proteins (ofps) and uses thereof
WO2023172883A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins of variant cd80 polypeptides, cell therapies thereof and related methods and uses
WO2024077018A2 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of taci-fc fusion immunomodulatory protein
WO2024102948A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 Celgene Corporation Fc receptor-homolog 5 (fcrh5) specific binding molecules and bispecific t-cell engaging antibodies including same and related methods

Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US526365A (en) * 1894-09-18 Jacquard mechanism for looms
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
US4342566A (en) * 1980-02-22 1982-08-03 Scripps Clinic & Research Foundation Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8318575D0 (en) 1983-07-08 1983-08-10 Cobbold S P Antibody preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US5169939A (en) * 1985-05-21 1992-12-08 Massachusetts Institute Of Technology & Pres. & Fellows Of Harvard College Chimeric antibodies
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5362716A (en) * 1989-12-27 1994-11-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods for stimulating hematopoietic progenitors using hepatocyte growth factor and lymphokines
US5871959A (en) * 1989-12-27 1999-02-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing hepatocycte growth factor/scatter factor and related cell lines
GB9009106D0 (en) * 1990-04-23 1990-06-20 3I Res Expl Ltd Processes and intermediates for synthetic antibody derivatives
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5968509A (en) * 1990-10-05 1999-10-19 Btp International Limited Antibodies with binding affinity for the CD3 antigen
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
US5227158A (en) * 1991-06-10 1993-07-13 Genentech, Inc. Method of stimulating hepatocyte proliferation by administration of hepatocyte growth factor and gamma-interferon
CA2103059C (en) * 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
WO1993006217A1 (en) * 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US5207152A (en) * 1991-10-28 1993-05-04 Wettlaufer Dale E Compact juice machine
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
EP0640094A1 (en) * 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5328837A (en) * 1992-05-18 1994-07-12 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor protease domain variants
US5316921A (en) * 1992-05-18 1994-05-31 Genentech, Inc. Single-chain hepatocyte growth factor variants
WO1993023541A1 (en) * 1992-05-18 1993-11-25 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor variants
PL174721B1 (pl) 1992-11-13 1998-09-30 Idec Pharma Corp Przeciwciało monoklonalne anty-CD20
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) * 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
DE19512484A1 (de) 1995-04-04 1996-10-17 Bayer Ag Kohlenhydratmodifizierte Cytostatika
US6121022A (en) * 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5686292A (en) * 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
US6214344B1 (en) 1995-06-02 2001-04-10 Genetech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonists and uses thereof
US5646036A (en) * 1995-06-02 1997-07-08 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
AU2660397A (en) 1996-04-05 1997-10-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
PT1068241E (pt) 1998-04-02 2007-11-19 Genentech Inc Variantes de anticorpos e respectivos fragmentos
DE19858253A1 (de) * 1998-12-17 2000-06-21 Aventis Pharma Gmbh Verwendung von Inhibitoren des KQt1-Kanals zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, die durch Helminthen und Ektoparasiten hervorgerufen werden
WO2001045746A2 (en) 1999-12-24 2001-06-28 Genentech, Inc. Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds
US6548237B2 (en) * 2000-07-04 2003-04-15 Fuji Photo Film Co., Ltd. Silver halide color photographic lightsensitive material and method of forming color image using the same
US6979556B2 (en) * 2000-12-14 2005-12-27 Genentech, Inc. Separate-cistron contructs for secretion of aglycosylated antibodies from prokaryotes
US20040002587A1 (en) * 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
GB0230203D0 (en) * 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
KR100956913B1 (ko) * 2003-12-19 2010-05-11 제넨테크, 인크. 치료제로서 유용한 일가 항체 단편

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
European Journal of Immunology, Vol. 21(11), pp. 2717-2725.*
Journal of Molecular Biology, Vol. 270(1), pp. 26-35.*

Also Published As

Publication number Publication date
IL211367A (en) 2014-06-30
EP1718677A2 (en) 2006-11-08
CN1922210A (zh) 2007-02-28
US20080063641A1 (en) 2008-03-13
BRPI0417107A (pt) 2007-02-06
CA2548757A1 (en) 2005-07-14
NZ547438A (en) 2010-01-29
US20140205593A1 (en) 2014-07-24
JP2008504007A (ja) 2008-02-14
EP1718677B1 (en) 2012-04-18
US20160222115A1 (en) 2016-08-04
AU2004309347B2 (en) 2010-03-04
DK1718677T3 (da) 2012-07-09
CY1112862T1 (el) 2016-04-13
HK1099027A1 (en) 2007-08-03
ATE554107T1 (de) 2012-05-15
IL175885A (en) 2011-02-28
JP2011172585A (ja) 2011-09-08
IL175885A0 (en) 2006-10-05
SI1718677T1 (sl) 2012-08-31
WO2005063816A2 (en) 2005-07-14
EP2275448A3 (en) 2013-02-06
PT1718677E (pt) 2012-07-18
PL1718677T3 (pl) 2012-09-28
US20050227324A1 (en) 2005-10-13
IL211367A0 (en) 2011-04-28
KR20060130610A (ko) 2006-12-19
ZA200604864B (en) 2007-10-31
EP2275448A2 (en) 2011-01-19
RU2006126097A (ru) 2008-02-20
US20110200596A1 (en) 2011-08-18
WO2005063816A3 (en) 2005-08-25
MXPA06006985A (es) 2006-08-31
ES2384569T3 (es) 2012-07-09
AU2004309347A1 (en) 2005-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100956913B1 (ko) 치료제로서 유용한 일가 항체 단편
US11472881B2 (en) Single-domain antibodies and variants thereof against CTLA-4
JP6173690B2 (ja) 異種ポリペプチドの分泌のための方法及び組成物
WO2019129221A1 (en) Single-domain antibodies and variants thereof against tigit
US20050152894A1 (en) Antibodies with altered effector functions
KR101252306B1 (ko) 간세포 성장 인자 활성화제의 조정제
WO2019096121A1 (en) Single-domain antibodies and variants thereof against pd-l1
AU2006262289A1 (en) Methods and compositions for targeting IFNAR2
AU2013203389A1 (en) Methods and composition for secretion of heterologous polypeptides

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130329

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160330

Year of fee payment: 7

LAPS Lapse due to unpaid annual fee