CN109563124A - 多特异性抗体的纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了纯化多特异性抗体的方法。该方法包括进行捕获层析，第一混合模式层析和第二混合模式层析的顺序步骤。在一些方面，本发明提供了多特异性抗体的组合物，所述组合物具有降低水平的一种或多种产物特异性杂质和/或方法特异性杂质。

Description

多特异性抗体的纯化
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年6月17日提交的美国临时申请序列号62/351,908的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
在ASCII文本文件中提交序列表
以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：146392036340SEQLIST.TXT，记录日期：2017年6月9日，大小：32KB)。
发明领域
提供了从包含多特异性抗体和至少一种杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，所述杂质包括至少一种产物特异性杂质。在一些实施方案中，产物特异性杂质是例如多特异性抗体的前体、聚集体和/或变体。还提供了根据所述方法纯化的多特异性抗体，以及包含此类多特异性抗体的组合物和制剂。
背景技术
对于对人类患者给药可接受的重组生物制药蛋白质，重要的是从最终的生物制品中除去由制造和纯化过程产生的残余杂质。这些过程组分包括培养基蛋白、免疫球蛋白亲和配体、病毒、内毒素、DNA和宿主细胞蛋白(HCP)。新的抗体形式(例如多特异性抗体)的开发提出了新的挑战，因为常规的制造和纯化方法不足以充分去除产物特异性杂质，包括未配对抗体臂和错误组装的抗体。
与标准抗体的纯化相比，从生产培养基中纯化多特异性抗体提出了独特的挑战。虽然标准的单特异性二价抗体由相同的重链/轻链亚基的二聚化产生，但多特异性抗体的产生需要至少两种不同的重链/轻链亚基的二聚化，每个亚基包含不同的重链以及不同的轻链。具有最小量的错配、错误组装或不完全分子的最终正确和完整的多特异性抗体的产生和纯化提出了不同的挑战。经常观察到链错配(例如，相同重链肽的同二聚化或不正确的重链/轻链缔合)，因为不同抗体链的宿主细胞表达不平衡导致蛋白组装不完全。通常观察到的产物特异性杂质包括一半(1/2)抗体(包含单个重链/轻链对)，四分之三(3/4)抗体(包含缺少单个轻链的完整抗体)和同二聚体。根据所用的多特异性形式，可以观察到额外的产物特异性杂质。例如，当多特异性抗体的一个可变结构域被构建为单链Fab(scFab)时，可以观察到5/4抗体副产物(包含额外的重链或轻链可变结构域)。在标准抗体生产中不会出现这种相应的产物特异性杂质。
设计用于去除与抗体具有非常不同的特征和性质的过程相关杂质(例如HCP、DNA、内毒素和其他材料)的常规纯化技术在用于去除与多特异性抗体更相似的杂质时可能是不适当的。因此，需要开发有效去除产物特异性杂质并产生足够量的正确和完整的多特异性抗体的制备和纯化方案。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均通过引用整体并入。
发明内容
如本文所述和举例说明的，申请人已发现在初始捕获层析步骤之后使用至少两种混合模式(在本文中也称为多-模式或多模式)层析步骤导致更大程度地去除产物特异性杂质以及纯化多特异性抗体的改进方法。因此，在某些实施方案中，提供了从包含多特异性抗体和杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，该方法包括以下顺序步骤：a)使组合物进行捕获层析以产生捕获层析洗脱液；b)使捕获层析洗脱液进行第一混合模式层析以产生第一混合模式洗脱液；c)使第一混合模式洗脱液进行第二混合模式层析以产生第二混合模式洗脱液；d)收集包含多特异性抗体的级分，其中该方法减少组合物中产物特异性杂质的量。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，在第一混合模式层析之前，将捕获层析洗脱液进行离子交换层析(例如，阴离子交换)或疏水相互作用层析。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，将第二混合模式洗脱液进行离子交换层析(例如，阴离子交换)或疏水相互作用层析。
在某些实施方案中，提供了从包含多特异性抗体和杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，其中多特异性抗体的每个臂是单独产生的，该方法包括以下顺序步骤：a)使多特异性抗体的每个臂进行捕获层析以产生多特异性抗体的每个臂的捕获洗脱液，b)在足以产生包含多特异性抗体的组合物的条件下形成包含多特异性抗体的每个臂的捕获洗脱液的混合物，c)使包含多特异性抗体的组合物进行第一混合模式层析以产生第一混合模式洗脱液，和d)使第一混合模式洗脱液进行第二混合模式层析以产生第二混合模式洗脱液；e)收集包含多特异性抗体的级分，其中该方法减少组合物中产物特异性杂质的量。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，在第一混合模式层析之前，将捕获层析洗脱液进行离子交换层析(例如，阴离子交换)或疏水相互作用层析。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，将第二混合模式洗脱液进行离子交换层析(例如，阴离子交换)或疏水相互作用层析。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，捕获层析是亲和层析。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，亲和层析是蛋白L层析、蛋白A层析、蛋白G层析、蛋白A和蛋白G层析。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，亲和层析是蛋白A层析。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，捕获层析是以结合和洗脱模式进行。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，第一混合模式层析和第二混合模式层析是连续的。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，第一混合模式层析是混合模式阴离子交换层析。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，第二混合模式层析是混合模式阳离子交换层析。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，第一混合模式层析是混合模式阳离子交换层析。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，第二混合模式层析是混合模式阴离子交换层析。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，第一混合模式层析是以结合和洗脱模式或以流穿模式进行。在根据(或应用于)任何实施方案的一些实施方案中，其中第一混合模式层析是以结合和洗脱模式进行，洗脱是梯度洗脱。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，第二混合模式层析是以结合和洗脱模式或以流穿模式进行。在根据(或应用于)任何实施方案的一些实施方案中，其中第二混合模式层析是以结合和洗脱模式进行，洗脱是梯度洗脱。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，该方法还包括使第二混合模式洗脱液进行超滤的步骤。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，超滤顺序地包括第一超滤、渗滤和第二超滤。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，蛋白A层析包含与琼脂糖连接的蛋白A。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，蛋白A层析是MAbSelectTM，MAbSelectTM SuRe和MAbSe lectTM SuRe LX，Prosep-VA，Prosep-VA UltraPlus，蛋白A琼脂糖快速流动(sepharose fast flow)，或Toyopearl蛋白A层析。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，蛋白A层析使用蛋白A平衡缓冲液，蛋白A上样缓冲液或蛋白A洗涤缓冲液中的一种或多种，其中平衡缓冲液、上样缓冲液和/或洗涤缓冲液在约pH7和约pH8之间。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，蛋白A平衡缓冲液为约pH7.7。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，蛋白A平衡缓冲液包含约25mM Tris和约25mM NaCl。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，在上样后用平衡缓冲液洗涤蛋白A层析。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，通过将具有低pH的蛋白A洗脱缓冲液应用于蛋白A层析，从蛋白A洗脱多特异性抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，蛋白A洗脱缓冲液包含约150mM乙酸，约pH 2.9。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，通过pH梯度从蛋白A层析中洗脱多特异性抗体。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，阴离子交换混合模式层析包含季胺和疏水部分。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，阴离子交换混合模式层析包含季胺和与高度交联的琼脂糖连接的疏水部分。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，混合模式层析是CaptoTM Adhere层析或CaptoTMAdhere ImpRes层析。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，阳离子交换混合模式层析包含N-苄基-n-甲基乙醇胺。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，混合模式层析是CaptoTM MMC层析或CaptoTM MMC ImpRes层析。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，第一混合模式层析使用混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液、混合模式上样缓冲液或混合模式洗涤缓冲液中的一种或多种，其中混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液、混合模式上样缓冲液和/或混合模式洗涤缓冲液在约pH6和约pH7之间。在一些实施方案中，阴离子混合模式平衡缓冲液在约pH6.5至约pH8之间。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，第二混合模式层析使用混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液、混合模式上样缓冲液或混合模式洗涤缓冲液中的一种或多种，其中混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液和/或混合模式洗涤缓冲液在约pH5和约pH8之间，任选地在约pH5和约pH7之间，或在约pH5和约pH6，或在约pH6至约pH7之间。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液和/或混合模式洗涤缓冲液为约pH5.5。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，混合模式预平衡缓冲液包含约500mM乙酸盐。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，混合模式平衡缓冲液包含约50mM乙酸盐。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，第一混合模式层析在上样后用洗涤缓冲液洗涤。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，第二混合模式层析在上样后用洗涤缓冲液洗涤。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，通过盐梯度和/或pH梯度或pH梯度洗脱从第一混合模式层析中洗脱多特异性抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，通过将具有低pH的混合模式洗脱缓冲液应用于混合模式交换层析，从第一混合模式层析中洗脱多特异性抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，通过盐梯度和/或pH梯度或pH梯度洗脱从第二混合模式层析中洗脱多特异性抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，通过将具有低pH的混合模式洗脱缓冲液应用于混合模式交换层析，从第二混合模式层析中洗脱多特异性抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，混合模式洗脱缓冲液包含约25mM乙酸盐，约pH 5.5。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，阴离子交换层析包含季胺。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，阴离子交换层析包含与交联琼脂糖连接的季胺。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，阴离子交换层析是QSFF层析。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，阴离子交换层析使用阴离子交换预平衡缓冲液、阴离子交换平衡缓冲液或阴离子交换上样缓冲液中的一种或多种，其中阴离子交换预平衡缓冲液、阴离子交换平衡缓冲液和/或阴离子交换上样缓冲液在约pH8和约pH9之间。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，阴离子交换预平衡缓冲液、阴离子交换平衡缓冲液和/或阴离子交换上样缓冲液为约pH8.5。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，阴离子交换预平衡缓冲液包含约50mM Tris，500mM乙酸钠。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，阴离子交换平衡缓冲液包含约50mM Tris。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，阴离子交换层析在上样后用阴离子交换平衡缓冲液洗涤。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，通过盐梯度从阴离子交换层析中洗脱多特异性抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，通过将具有增加的盐浓度的阴离子交换洗脱缓冲液应用于阴离子交换层析，从阴离子交换层析中洗脱多特异性抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，阴离子交换洗脱缓冲液包含约pH8.5的约50mMTris，100mM乙酸钠。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，多特异性抗体的臂在细胞中产生。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，细胞是原核细胞。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，原核细胞是大肠杆菌细胞。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，将细胞工程化以表达一种或多种分子伴侣。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，所述分子伴侣是FkpA、DsbA或DsbC中的一种或多种。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，分子伴侣是大肠杆菌分子伴侣。在根据(或应用于)上述实施方案的一些实施方案中，细胞是真核细胞。在根据(或应用于)上述实施方案的一些实施方案中，真核细胞是酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在根据(或应用于)上述实施方案的一些实施方案中，真核细胞是CHO细胞。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，在捕获层析之前裂解细胞以产生包含多特异性抗体或多特异性抗体的臂的细胞裂解物。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，使用微流化器裂解细胞。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，在层析之前将聚乙烯亚胺(PEI)加入细胞裂解物中。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，将PEI加入裂解物中至终浓度为约0.4％。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，通过离心使细胞裂解物澄清。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，来自哺乳动物细胞(例如CHO细胞)的细胞裂解物进行一种或多种以下处理：热灭活、低pH灭活、通过添加洗涤剂的病毒灭活。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，该方法减少方法特异性杂质的量，例如组合物中的宿主细胞蛋白(HCP)、浸出蛋白A、核酸、细胞培养基组分或病毒杂质的任一种。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，双特异性抗体是旋钮入孔(KiH)抗体，例如KiH双特异性抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，双特异性抗体是CrossMab双特异性抗体。
在根据(或应用于)上述任何方法的一些实施方案中，在最后的层析步骤之后收集级分，其包含至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或约100％的多特异性抗体。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，在最后的层析步骤之后收集级分，其包含减少量的产物特异性杂质，其中产物特异性杂质是以下一种或多种：未配对抗体臂，抗体同二聚体，高分子量种类(HMWS)，低分子量种类(LMWS)或3/4抗体。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，该级分含有小于约5％，小于约4％，小于约3％，小于约2％，或小于约1％的未配对抗体臂。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，该级分含有小于约5％，小于约4％，小于约3％，小于约2％，或小于约1％的抗体同二聚体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，该级分含有不超过约1％或不超过约2％的HMWS。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，该级分含有不超过约2％或不超过约1％的LMWS。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，该部分含有不超过约5％，不超过约4％，不超过约3％，不超过约2％，或者不含超过约1％的3/4抗体。
在根据(或应用于)以上任何实施方案的一些实施方案中，所述级分包含
a)至少约95％-100％的多特异性抗体；
b)小于约1％-5％的未配对抗体臂；
c)小于约1％-5％的抗体同二聚体；
d)不超过约1％或2％的HMWS；
e)不超过约1％或2％的LMWS；和/或
f)不超过约5％的3/4抗体。
在某些实施方案中，提供了包含通过上述任一方法的方法纯化的多特异性抗体的组合物。
在根据(或应用于)任何上述方法的一些实施方案中，提供了包含多特异性抗体的组合物，其中所述组合物包含至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或约100％的多特异性抗体。在根据(或应用于)上述任一实施方案的一些实施方案中，提供了包含多特异性抗体的组合物，其中所述组合物包含减少量的产物特异性杂质，其中所述产物特异性杂质是以下一种或多种：未配对抗体臂，抗体同二聚体，高分子量种类(HMWS)，低分子量种类(LMWS)或3/4抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，组合物小于约5％，小于约4％，小于约3％，小于约2％，或小于约1％未配对抗体臂。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，组合物含有小于约5％，小于约4％，小于约3％，小于约2％，或小于约1％的抗体同二聚体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，组合物含有不超过约1％或不超过约2％的HMWS。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，组合物含有不超过约2％或不超过约1％的LMWS。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，组合物含有不超过约5％，不超过约4％，不超过约3％，不超过约2％，或不超过约1％的3/4抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，组合物中的多特异性抗体是双特异性抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，双特异性抗体是旋钮入孔(KiH)抗体，例如KiH双特异性抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，双特异性抗体是CrossMab双特异性抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，双特异性抗体结合ANG-2和VEGF。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，双特异性抗体结合ANG-2和VEGF，包含a)包含第一抗原结合位点的第一全长抗体的重链和轻链；和b)包含第二抗原结合位点的全长抗体的修饰的重链和修饰的轻链，其中恒定结构域CL和CH1被彼此替换。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，组合物含有：a)至少约95％-100％的多特异性抗体；b)小于约1％-5％的未配对抗体臂；c)小于约1％-5％的抗体同二聚体；d)不超过约1％或2％的HMWS；e)不超过约1％或2％的LMWS；和/或f)不超过约5％的3/4抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，组合物中的多特异性抗体是双特异性抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，双特异性抗体是旋钮入孔(KiH)抗体，例如KiH双特异性抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，双特异性抗体是CrossMab双特异性抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，双特异性抗体结合ANG-2和VEGF。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，双特异性抗体结合ANG-2和VEGF，包含a)包含第一抗原结合位点的第一全长抗体的重链和轻链；b)包含第二抗原结合位点的全长抗体的修饰重链和修饰轻链，其中恒定结构域CL和CH1被彼此替换。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，提供了包含通过以上所述的任何一种方法纯化的多特异性或双特异性抗体(例如结合ANG2和VEGF的双特异性抗体)的组合物，其用于治疗癌症或眼病。
在根据(或应用于)上述任一实施方案的一些实施方案中，提供了通过上述任何一种方法纯化的多特异性或双特异性抗体(例如结合ANG2和VEGF的双特异性抗体)用于制造治疗癌症或眼病的药物的用途。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，本文提供的方法用于纯化含Fc的异二聚体多肽。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，提供了本文提供的任何方法在用于减少组合物中含Fc的异二聚体多肽相关杂质的用途。
在某些实施方案中，提供了用多步层析方法纯化含有Fc-区的异二聚体多肽的方法，其中该方法包括亲和层析步骤，然后是两个不同的多模式离子交换层析步骤，从而纯化含有Fc区域的异二聚体多肽。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，多步层析方法包括(i)亲和层析步骤，然后是多模式阴离子交换层析步骤，然后是多模式阳离子交换层析步骤；或(ii)亲和层析步骤，然后是多模式阳离子交换层析步骤，然后是多模式阴离子交换层析步骤。
在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，多步层析方法包括亲和层析步骤，然后是多模式阴离子交换层析步骤，然后是多模式阳离子交换层析步骤。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，多步层析方法包括正好三个层析步骤。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，多模式阴离子交换层析步骤是以流穿模式进行。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，将含有Fc区的异二聚体多肽的多模式阴离子交换层析步骤应用于电导率值小于7mS/cm的溶液中。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，在多模式阴离子交换层析步骤中，将含有Fc-区的异二聚体多肽应用于电导率值在约6mS/cm至约2mS/cm的溶液中。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，在多模式阴离子交换层析步骤中，将含Fc区的异二聚体多肽应用于电导率值为约4.5mS/cm的溶液中。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，多模式阴离子交换层析步骤在约7的pH下进行。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，在多模式阴离子交换层析步骤中，将含有Fc-区的异二聚体多肽应用于电导率为约4.5mS/cm且pH为约7的溶液中。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，在多模式阴离子交换层析步骤中，含有Fc-区的异二聚体多肽以每升层析材料约100g至约300g的范围应用。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，多模式阴离子交换层析材料是多模式强阴离子交换层析材料。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，多模式阴离子交换层析材料具有高流动琼脂糖基质，多模式强阴离子交换剂作为配体，平均粒径为36-44μm和离子容量为0.08至0.11mmol Cl-/mL介质。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，多模式阳离子交换层析介质是多模式弱阳离子交换层析介质。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，多模式阳离子交换层析介质具有高流速琼脂糖基质，多模式弱阳离子交换剂作为配体，平均粒径为36-44μm和离子容量为25至39μmol/mL。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，多模式阴离子交换层析步骤是以结合和洗脱模式进行。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，捕获层析通过亲和层析进行。在一些实施方案中，亲和层析是蛋白A亲和层析或蛋白G亲和层析或单链Fv配体亲和层析或使用CaptureSelect层析材料的层析步骤或使用CaptureSelect FcXL层析材料的层析步骤。在根据(或应用于)任何上述实施方案的一些实施方案中，亲和层析步骤是蛋白A层析步骤。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，亲和层析步骤是使用CaptureSelectTM层析材料的层析步骤。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，含有Fc-区的异二聚体多肽是抗体、双特异性抗体或Fc-融合蛋白。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，含有Fc区的异二聚体多肽是双特异性抗体。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，含有Fc-区的异二聚体多肽是CrossMab。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，含有Fc-区的异二聚体多肽是双特异性抗体，其包含a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链；和b)特异性结合第二抗原的全长抗体的修饰重链和修饰轻链，其中恒定结构域CL和CH1彼此替换。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，双特异性抗体结合ANG2和VEGF。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，CrossMab结合ANG2和VEGF。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，双特异性抗体是vanucizumab。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，双特异性抗体包含第一抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：1和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：2；和第二抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ IDNO：3，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：4。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，双特异性抗体包含具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的第一重链和具有SEQID NO：10的氨基酸序列的第二重链以及具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的第一轻链和具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的第二轻链。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，双特异性抗体包含第一抗原结合位点和第二抗原结合位点，第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：5，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：6；第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：7，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：8。在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，双特异性抗体包含具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的第一重链和具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的第二重链以及具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的第一轻链和具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的第二轻链。
在根据(或应用于)上述任何实施方案的一些实施方案中，纯化的含有Fc-区的异二聚体多肽含有不超过约5％的3/4抗体。
在某些实施方案中，提供了用多步层析方法纯化与ANG2和VEGF结合的双特异性抗体的方法，其中该方法包括亲和层析步骤，然后是多模式阴离子交换层析步骤，然后是多模式阳离子交换层析步骤，从而纯化与ANG2和VEGF结合的双特异性抗体，其中与ANG2和VEGF结合的双特异性抗体包含第一抗原结合位点和第二抗原结合位点，第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：1，和作为轻链可变区(VL)的SEQ ID NO：2；第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：3，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：4或其包含第一抗原结合位点和第二抗原结合位点，第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：5，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：6；第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：7，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：8。在一些实施方案中，根据(或应用于)任何上述实施方案中，结合ANG2和VEGF的双特异性抗体包含a)包含第一抗原结合位点的第一全长抗体的重链和轻链；和b)包含第二抗原结合位点的全长抗体的修饰重链和修饰轻链，其中恒定结构域CL和CH1彼此替换。
在一些实施方案中，提供了根据(或应用于)上述任何实施方案的任何方法用于减少含Fc的异二聚体多肽相关杂质的用途。
在一些实施方案中，提供了通过根据(或应用于)上述任何实施方案的方法获得的含有Fc的异二聚体多肽用于制造用于治疗癌症或眼病的药物的用途。
在一些实施方案中，提供了从根据(或应用于)上述任何实施方案的方法获得的含Fc的异二聚体多肽，用于治疗癌症或眼病。
在某些实施方案中，提供了用于产生含Fc的异二聚体多肽的方法，其包括以下步骤：(i)培养包含编码含Fc的异二聚体多肽的核酸的细胞；(ii)从细胞或培养基中回收含Fc的异二聚体蛋白质；(iii)使用根据(或应用于)上述任一实施方案的方法纯化含Fc的异二聚体多肽，从而产生含Fc的异二聚体多肽。
在某些实施方案中，提供了产生结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体的方法，包括以下步骤：(i)培养包含编码双特异性抗体的核酸的细胞；(ii)从细胞或培养基中回收双特异性抗体；(iii)使用根据(或应用于)任何上述实施方案的方法纯化双特异性抗体，从而产生结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体。
附图简述
图1A描绘了实施例1中使用的第一纯化方案。
图1B描绘了实施例1中使用的第二纯化方案。
图1C描绘了实施例1中使用的第三纯化方案。
图2描绘了实施例2中使用的纯化方案。
图3A描绘了实施例3中使用的第一纯化方案。
图3B描绘了实施例3中使用的第二纯化方案。
图4描绘了实施例4中使用的纯化方案。
图5A描绘了实施例6中使用的第一纯化方案。
图5B描绘了实施例6中使用的第二纯化方案。
图6A描绘了实施例7中使用的第一纯化方案。
图6B描绘了实施例7中使用的第二纯化方案。
图7A描绘了实施例8中描述的第一纯化方案。
图7B描绘了实施例8中描述的第二纯化方案。
图7C描绘了实施例8中描述的第三纯化方案。
发明详述
本文提供了纯化多特异性抗体(例如双特异性抗体或二价F(ab’)2)的方法，包括以下连续步骤：使包含多特异性抗体的组合物经受a)捕获层析，b)第一混合模式层析，和c)第二混合模式层析。在一些方面，提供了纯化多特异性抗体的方法，其中多特异性抗体的各个臂各自在分开的培养物中产生，并且各自通过捕获层析分开纯化。然后组装纯化的抗体臂以产生多特异性抗体。然后将组装的多特异性抗体进行第一混合模式阴离子交换层析，然后进行第二混合模式层析。如下面进一步详细描述的，任选地在捕获层析、第一混合模式层析和/或第二混合模式层析中的每一个之前和/或之后进行一个或多个额外的层析步骤。术语混合模式层析和多模式层析在本文中可互换使用。
在一些方面，提供了包含多特异性抗体的组合物，该多特异性抗体具有降低水平的一种或多种过程特异性和/或产物特异性杂质，例如未配对抗体臂、同二聚体、聚集体、低分子量种类、酸性和碱性变体。在一些方面，提供了包含多特异性抗体的组合物，该多特异性抗体具有降低水平的一种或多种方法特异性杂质，例如原核宿主细胞蛋白，真核宿主细胞蛋白(例如CHO蛋白或“CHOP”)，核酸，和分子伴侣(例如，原核分子伴侣，例如FkpA、DsbA和DsbC)。在某些实施方案中，使用本文提供的方法获得本文提供的组合物。在某些实施方案中，本文提供的组合物具有比使用本领域已知的方法获得的组合物降低水平的一种或多种过程特异性和/或产物特异性杂质。
在一些方面，提供了本文报道的方法在用于含Fc的异二聚体多肽的纯化和用于含Fc的异二聚体多肽相关杂质的减少中的用途。实现了产物特异性杂质的改进的减少。在CrossMab特异性杂质的情况下，实现了例如3/4抗体的减少。
定义
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。该术语还包括天然或通过干预改性的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成，糖基化，脂化，乙酰化，磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分的缀合。定义中还包括，例如，含有一种或多种氨基酸类似物的多肽(包括例如非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其他修饰。本文使用的术语“多肽”和“蛋白质”特别包括抗体。
“纯化的”多肽(例如，抗体或免疫粘附素)意指多肽的纯度增加，使得其以比其天然环境中和/或在实验室条件下最初合成和/或扩增时更纯的形式存在。纯度是一个相对术语，并且不一定意味着绝对纯度。如本文中可互换使用的术语“纯化”、“分离”或“隔离”是指从包含所需分子和一种或多种杂质的组合物或样品中增加所需分子(例如多特异性抗体，例如双特异性抗体)的纯度。通常，通过从组合物中(完全或部分地)除去至少一种杂质来提高所需分子的纯度。
“结合目标抗原”的多特异性抗体是以足够的亲和力结合抗原(例如蛋白质)的抗体，使得多特异性抗体可用作靶定蛋白质或表达蛋白的细胞或组织的诊断和/或治疗剂，并且不与其他蛋白质显著地交叉反应。在此类实施方案中，如用例如荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)或ELISA等确定的，多特异性抗体与“非靶”蛋白质结合的程度少于多特异性抗体与其特定靶蛋白结合的约10％。关于多特异性抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异地结合”或是“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位表示与非特异性相互作用(例如非特异性相互作用可以是与牛血清白蛋白或酪蛋白的结合)可测量地不同的结合。特异性结合可通过例如确定分子的结合相比对照分子的结合而测量。例如，特异性结合可通过与和靶相似的对照分子，例如过量的未标记靶竞争而确定。在此情况下，如果经标记的靶与探针的结合被过量的未标记靶竞争性抑制，则指示特异性结合。本文所用的术语“特异性结合”或“特异地结合”或是“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位可被这样的分子展示，所述分子对靶具有至少约200nM，或者至少约150nM，或者至少约100nM，或者至少约60nM，或者至少约50nM，或者至少约40nM，或者至少约30nM，或者至少约20nM，或者至少约10nM，或者至少约8nM，或者至少约6nM，或者至少约4nM，或者至少约2nM，或者至少约1nM的Kd，或更大的亲和力。在一个实施方案中，术语“特异性结合”指这样的结合，其中多特异性抗原结合蛋白结合特定多肽或特定多肽上的表位，而基本不结合其他多肽或多肽表位。
“结合亲和力”通常指分子(例如多特异性抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用的“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)代表。例如，Kd可以是约200nM或更小，约150nM或更小，约100nM或更小，约60nM或更小，约50nM或更小，约40nM或更小，约30nM或更小，约20nM或更小，约10nM或更小，约8nM或更小，约6nM或更小，约4nM或更小，约2nM或更小，或约1nM或更小。亲和力可用本领域熟知的常用方法测量，包括本文中说明的那些。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原，并倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原，并倾向于保持结合更久。本领域已知多种测量结合亲和力的方法，其中任何一种可用于本文提供的方法和组合物的目的。
在一个实施方案中，根据本发明的“Kd”或“Kd值”通过用使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)的表面等离振子共振测定法在25℃用固定化的靶标(例如抗原)CM5芯片在-10响应单位(RU)测量。简言之，根据供应商的说明，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠(pH4.8)稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射，以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下以约25μl/min的流速注射将Fab的两倍连续稀释液(例如，0.78nM至500nM)注射到含有0.05％吐温20的PBS(PBST)中。通过同时拟合缔合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(BIAcore评估软件版本3.2)计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为比率koff/kon。参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果上述表面等离振子共振测定的结合速率(on-rate)超过106M-1s-1，那么可以通过使用荧光猝灭技术测定结合速率，该技术在存在如分光计(诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色杯的8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic))测量的浓度增加的抗原的条件下，在25℃测量PBS(pH7.2)中20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
用于本文目的的“活性的”或“活性”是指保留天然或天然存在的多肽的生物学和/或免疫学活性的多肽(例如多特异性抗体)的形式，其中“生物学“活性”是指由天然或天然存在的多肽引起的生物学功能(抑制性或刺激性)，而不是诱导产生针对天然或天然存在的多肽所具有的抗原表位的抗体的能力，并且“免疫学“活性”是指诱导产生针对天然或天然存在的多肽所具有的抗原表位的抗体的能力。
除非另有说明，否则关于本文提供的多特异性抗原结合蛋白(例如抗体，片段或其衍生物)的“生物学活性的”和“生物学活性”和“生物学特征”意指具有结合生物分子的能力。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖单克隆抗体，多克隆抗体，由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)可与本文的抗体互换使用。
抗体是具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子，其全部基于免疫球蛋白折叠。例如，IgG抗体具有两条“重”链和两条“轻”链，它们被二硫键连接形成功能性抗体。每个重链和轻链本身包含“恒定”(C)和“可变”(V)区。V区确定抗体的抗原结合特异性，而C区提供结构支持并在与免疫效应物的非抗原特异性相互作用中起作用。抗体或抗体的抗原结合片段的抗原结合特异性是抗体特异性结合特定抗原的能力。
抗体的抗原结合特异性由V区的结构特征决定。变异性不均匀地分布在可变结构域的110个氨基酸跨度上。相反，V区由称为构架区(FR)的15-30个氨基酸的相对不变的一段序列组成，构架区被称为“高变区”的高度可变的较短区域隔开，每个高变区长9-12个氨基酸。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，主要采用β-折叠构型，由三个高变区连接，其形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密靠近在一起，并且来自另一条链的高变区有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，公共卫生服务，国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991年)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
每个V区通常包含三个互补决定区(“CDR”，每个包含“高变环”)和四个构架区。因此，抗体结合位点，即与特定所需抗原以基本亲和力结合所需的最小结构单元，通常将包括三个CDR，并且在其间散布至少三个，优选四个构架区以在适当的构象下保持和呈递CDR。经典的四链抗体具有抗原结合位点，其由VH和VL结构域配合限定。某些抗体，例如骆驼和鲨鱼抗体，缺乏轻链并且仅依赖于由重链形成的结合位点。可以制备单结构域工程化免疫球蛋白，其中结合位点仅由重链或轻链形成，不存在VH和VL之间的配合。
术语“可变”是指可变结构域的某些部分在抗体之间在序列上广泛不同，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性不是均匀地分布在抗体的可变结构域中。它集中在轻链和重链可变区中称为高变区的三个区段中。可变结构域的更高保守部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，主要采用β-折叠构型，由三个高变区连接，其形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密靠近在一起，并且来自另一条链的高变区有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，公共卫生服务，国立卫生研究院，贝塞斯达，MD。(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
当在本文中使用时，术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区可以包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，在VL中约为残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，以及在VH中约为31-35B(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，公共卫生服务，国立卫生研究院，贝塞斯达，MD。(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如VL中的残基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)，以及VH中的26-32(H1)，52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。
“构架”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
在抗体或半抗体的上下文中的“铰链区”通常定义为从人IgG1的Glu216延伸至Pro230(Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985))。通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置，可以使其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列比对。
Fc区的“下铰链区”通常定义为紧邻铰链区C-末端的残基段，即Fc区的残基233-239。在本申请之前，FcγR结合通常归因于IgG Fc区的下铰链区中的氨基酸残基。
人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从IgG的约残基231延伸至约340。CH2结构域的独特之处在于它不与另一个结构域紧密配对。而是，两个N-连接的支链碳水化合物链插入完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。据推测，碳水化合物可以提供结构域-结构域配对的替代物并有助于稳定CH2结构域。Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985)。
“CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C-末端的残基段(即IgG的约氨基酸残基341至约氨基酸残基447)。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab，Fab'，F(ab’)2和Fv片段；双抗体；串联双抗体(taDb)，线性抗体(例如，美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995))；单臂抗体，单可变结构域抗体，微抗体，单链抗体分子；由抗体片段(例如，包括但不限于Db-Fc，taDb-Fc，taDb-CH3，(scFV)4-Fc，di-scFv，bi-scFv或串联(di，tri)-scFv)形成的多特异性抗体；和双特异性T细胞衔接子(BiTE)。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，和残留的“Fc”片段，该名称反映了容易结晶的能力。Fab片段由整个L链以及H链的可变区结构域(VH)和一个重链(CH1)的第一恒定结构域组成。胃蛋白酶处理抗体产生单个大的F(ab’)2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端具有额外的少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。F(ab’)2抗体片段最初是作为Fab'片段对产生的，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变区的二聚体组成。在该构型中，每个可变结构域的三个高变区相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原特异的高变区的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。
Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有至少一个游离巯基。F(ab’)2抗体片段最初是作为Fab'片段对产生的，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以基于其恒定结构域的氨基酸序列分配为两种明显不同的类型之一，称为κ(κ)和λ(λ)。
根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体分配到不同的类别。存在五种主要类型的完整抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。对应于不同类别抗体的重链恒定结构域分别称为α，δ，ε，γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述参见Plückthunin The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994)。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含与同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，该结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
如本文所用的术语“半抗体”或““hemimer”是指单价抗原结合多肽。在某些实施方案中，半抗体或hemimer包含VH/VL单元和任选的至少一部分免疫球蛋白恒定结构域。在某些实施方案中，半抗体或hemimer包含与一种免疫球蛋白轻链结合的一种免疫球蛋白重链，或其抗原结合片段。在某些实施方案中，半抗体或hemimer是单特异性的，即结合单个抗原或表位。本领域技术人员将容易理解，半抗体可具有由单个可变结构域组成的抗原结合结构域，例如源自骆驼科。
术语“VH/VL单元”是指抗体的抗原结合区，其包含至少一个VH HVR和至少一个VLHVR。在某些实施方案中，VH/VL单元包含至少一个，至少两个或所有三个VH HVR和至少一个，至少两个或所有三个VL HVR。在某些实施方案中，VH/VL单元还包含构架区(FR)的至少一部分。在一些实施方案中，VH/VL单元包含三个VH HVR和三个VL HVR。在一些这样的实施方案中，VH/VL单元包含至少一个，至少两个，至少三个或所有四个VH FR和至少一个，至少两个，至少三个或所有四个VL FR。
术语“多特异性抗体”以最广义使用，并且具体涵盖包含具有多表位特异性的抗原结合结构域的抗体(即，能够特异性结合一种生物分子上的两种或更多种不同表位或能够特异性结合两种或多种不同生物分子上的表位)。在一些实施方案中，多特异性抗体(例如双特异性抗体或二价F(ab’)2)的抗原结合结构域包含两个VH/VL单元，其中第一VH/VL单元特异性结合第一表位和第二VH/VL单元特异性结合第二表位，其中每个VH/VL单元包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。此类多特异性抗体包括但不限于全长抗体，具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体，抗体片段如Fab，Fv，dsFv，scFv，双抗体，双特异性双抗体和三抗体，已共价或非共价连接的抗体片段。进一步包含重链恒定区的至少一部分和/或轻链恒定区的至少一部分的VH/VL单元也可称为“hemimer”或“半抗体”。在一些实施方案中。半抗体包含单个重链可变区的至少一部分和单个轻链可变区的至少一部分。在一些这样的实施方案中，包含两个半抗体并结合两种抗原的双特异性抗体包含结合第一抗原或第一表位但不结合第二抗原或第二表位的第一半抗体和结合第二抗原或第二表位但不结合第一抗原或第一表位的第二半抗体。根据一些实施方案，多特异性抗体是IgG抗体，其以5M至0.001pM，3M至0.001pM，1M至0.001pM，0.5M至0.001pM或0.1M至0.001pM的亲和力结合每种抗原或表位。在一些实施方案中，hemimer包含足够部分的重链可变区以允许与第二hemimer形成分子内二硫键。在一些实施方案中，hemimer包含旋钮突变或孔突变，例如，以允许与包含互补孔突变或旋钮突变的第二hemimer或半抗体的异二聚化。旋钮突变和孔突变将在下面进一步讨论。
“双特异性抗体”是包含抗原结合结构域的多特异性抗体，所述抗原结合结构域能够特异性结合一种生物分子上的两个不同表位或能够特异性结合两种不同生物分子上的表位。双特异性抗体在本文中也可称为具有“双重特异性”或“双特异的”。除非另有说明，否则双特异性抗体结合的抗原在双特异性抗体名称中列出的顺序是任意的。在一些实施方案中，双特异性抗体包含两个半抗体，其中每个半抗体包含单个重链可变区和任选的至少一部分重链恒定区，和单个轻链可变区和任选的至少一部分轻链恒定区。在某些实施方案中，双特异性抗体包含两个半抗体，其中每个半抗体包含单个重链可变区和单个轻链可变区，并且不包含多于一个单个重链可变区并且不包含多于一个单个轻链可变区。在一些实施方案中，双特异性抗体包含两个半抗体，其中每个半抗体包含单个重链可变区和单个轻链可变区，并且其中前半部分抗体结合第一抗原而不结合第二抗原并且第二半抗体结合第二抗原而不结合第一抗原。
如本文所用的术语“旋钮入孔”或“KiH”技术是指通过在两个多肽相互作用的界面处将突起(旋钮)引入一个多肽和将腔体(孔)引入另一多肽中而将它们在体外或体内配对在一起的技术。例如，已经在抗体的Fc：Fc结合界面，CL：CH1界面或VH/VL界面中引入KiH(参见，例如，US2011/0287009，US2007/0178552，WO96/027011，WO98/050431，和Zhu等人，1997，Protein Science 6：781-788)。在一些实施方案中，KiH在多特异性抗体的制备过程中驱动两条不同重链的配对。例如，在其Fc区中具有KiH的多特异性抗体可以进一步包含与每个Fc区连接的单个可变结构域，或者还包含与相似或不同的轻链可变结构域配对的不同重链可变结构域。KiH技术还可用于将两个不同的受体细胞外结构域配对在一起或包含不同靶识别序列的任何其他多肽序列(例如，包括亲和体，肽体和其他Fc融合体)。
如本文所用的术语“旋钮突变”是指在多肽与另一多肽相互作用的界面处将突起(旋钮)引入多肽中的突变。在一些实施方案中，另一种多肽具有孔突变(参见例如US 5,731,168，US 5,807,706，US 5,821,333，US 7,695,936，US 8,216,805，各自通过引用整体并入本文)。
如本文所用的术语“孔突变”是指在多肽与另一多肽相互作用的界面处将腔体(孔)引入多肽中的突变。在一些实施方案中，另一种多肽具有旋钮突变(参见例如US 5,731,168，US 5,807,706，US 5,821,333，US 7,695,936，US 8,216,805，各自通过引用整体并入本文)。
表述“单结构域抗体”(sdAbs)或“单可变结构域(SVD)抗体”通常是指其中单个可变结构域(VH或VL)可赋予抗原结合的抗体。换句话说，单个可变结构域不需要与另一个可变结构域相互作用以识别靶抗原。单结构域抗体的实例包括衍生自骆驼科动物(骆马和骆驼)和软骨鱼(例如铰口鲨)的那些和来自人和小鼠抗体的重组方法的那些(Nature(1989)341：544-546；Dev Comp Immunol(2006)30：43-56；Trend Biochem Sci(2001)26：230-235；Trends Biotechnol(2003)：21：484-490；WO 2005/035572；WO 03/035694；FEBS Lett(1994)339：285-290；WO00/29004；WO 02/051870)。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了在单克隆抗体的生产过程中可能出现的变体之外，包含在群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，这些变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们不被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本文提供的方法使用的单克隆抗体可以通过Kohler等人，Nature 256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。例如，还可以使用Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
本文中的单克隆抗体特异性地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性(美国专利号4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其包含衍生自非人灵长类动物(例如，旧世界猴，例如狒狒、恒河猴或食蟹猴)和人恒定区序列的可变结构域抗原结合序列(美国专利号5,693,780)。
“人源化”形式的非人(例如鼠)抗体是嵌合抗体，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的非人种类(供体抗体)的高变区的残基替换，具有所需特异性、亲和力和能力。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上全部至少一个，并且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且除了如上所述的FR取代之外，所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区，通常是人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节，参见Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
出于本文的目的，“完整抗体”是包含重和轻可变结构域以及Fc区的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每个轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每个重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥。每个重链在一端具有可变结构域(VH)，随后是许多恒定结构域。每个轻链在一端具有可变结构域(VL)，在另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。
“裸抗体”是不与诸如细胞毒性部分或放射性标记的异源分子缀合的抗体(如本文所定义)。
如本文所用，术语“免疫粘附素”表示将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能相结合的分子。在结构上，免疫粘附素包含具有所需结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定结构域序列(例如IgG的CH2和/或CH3序列)的融合体，所述氨基酸序列不是抗体的抗原识别和结合位点(即，与抗体的恒定区相比是“异源的”)。示例性粘附素序列包括连续氨基酸序列，其包含受体的一部分或结合目的蛋白质的配体。粘附素序列也可以是结合目的蛋白质，但不是受体或配体序列(例如，肽体中的粘附素序列)的序列。可通过各种方法选择或鉴定此类多肽序列，包括噬菌体展示技术和高通量分选方法。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可以从任何免疫球蛋白获得，例如IgG-1，IgG-2，IgG-3或IgG-4亚型，IgA(包括IgA-1和IgA-2)，IgE，IgD，或IgM。
在某些实施方案中，含有Fc-区的异二聚体多肽是抗体，双特异性抗体或Fc-融合蛋白。
在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的Fc融合蛋白是靶向免疫细胞因子。在某些实施方案中，靶向免疫细胞因子是CEA-IL2v免疫细胞因子。在某些实施方案中，CEA-IL2v免疫细胞因子是RG7813。在某些实施方案中，靶向免疫细胞因子是FAP-IL2v免疫细胞因子。在某些实施方案中，FAP-IL2v免疫细胞因子是RG7461。
在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的多特异性抗体(例如双特异性抗体)结合CEA和至少一种另外的靶分子。在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的多特异性抗体(例如双特异性抗体)结合肿瘤靶向细胞因子和至少一种另外的靶分子。在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的多特异性抗体与IL2v(即白细胞介素2变体)和至少一种另外的靶分子融合。在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的多特异性抗体是T细胞双特异性抗体(即，双特异性T细胞衔接子或BiTE)。
在一些实施方案中，抗体“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性，并且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指分子在补体存在下裂解靶标的能力。补体激活途径通过补体系统的第一组分(C1q)和与同源抗原复合的分子(例如多肽(例如抗体))的结合而起始。为了评估补体激活，可以执行CDC测定法，例如，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)所述。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别在靶细胞上的结合抗体，随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。在造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)的第464页表3。为了评估目标分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的测定。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外地，感兴趣的分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在动物模型中，例如在Clynes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：652-656(1998)中公开的动物模型。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应功能的白细胞。在一些实施方案中，细胞至少表达FcγRIII并实施ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)，天然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。在一些实施方案中，FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)的FcR，并且包括FcγRI，FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和备选的剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有主要在其细胞质结构域中不同的相似氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；和de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中进行了综述。本文的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，而不考虑传代次数。后代可能与亲本细胞的核酸含量不完全相同，而可能含有突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代。
“杂质”是指与所需多肽产物不同的物质。杂质可以指产物特异性多肽，例如单臂抗体和错误组装的抗体，包括碱性变体和酸性变体的抗体变体，以及聚集体。其他杂质包括方法特异性杂质，包括但不限于：宿主细胞材料，例如宿主细胞蛋白(HCP)；浸出蛋白A；核酸；另一种多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基组分等。在一些实例中，杂质可以是来自例如但不限于细菌细胞的HCP，例如大肠杆菌细胞(ECP)，昆虫细胞，原核细胞，真核细胞，酵母细胞，哺乳动物细胞，禽细胞，真菌细胞。在一些实例中，杂质可以是来自哺乳动物细胞的HCP，例如CHO细胞，即CHO细胞蛋白(CHOP)。杂质可以指用于促进多特异性抗体的表达、折叠或组装的辅助蛋白质；例如，原核分子伴侣如FkpA，DsbA和DsbC。
如本文所用的“复合物”或“复合的”是指通过不是肽键的键和/或力(例如，范德华、疏水、亲水力)彼此相互作用的两个或更多个分子的缔合。在一个实施方案中，复合物是异多聚体的。应当理解，本文所用的术语“蛋白质复合物”或“多肽复合物”包括具有与蛋白质复合物中的蛋白质缀合的非蛋白质实体的复合物(例如，包括但不限于化学分子，例如，毒素或检测剂)。
“分离的”核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。
关于参照多肽序列的"百分比(％)氨基酸序列同一性"定义为在比对序列并在必要时引入空位以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于比对序列的适宜参数，包括在比较序列的全长里获得最大比对需要的任何算法。在某些实施方案中，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，并且源代码已与用户文档一起提交到美国版权局(U.S.CopyrightOffice),WashingtonD.C.,20559，其以美国版权注册号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，SouthSanFrancisco，California公开获得，或可从源代码汇编。ALIGN-2程序应当汇编用于UNIX操作系统，包括数字UNIXV4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且不改变。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定的氨基酸序列A对/与/相对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或其可以用短语表示为对/与/相对给定的氨基酸序列B具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y的100倍
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在所述程序对A和B的比对中评为相同匹配的氨基酸残基数，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。将理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另外明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值如在上一段中描述的那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。)单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
如本文所用，术语“载体”是指能够增殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入其中已导入了宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导它们有效连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
本文关于层析使用的术语“顺序”是指特定序列中的层析步骤；例如，第一层析步骤，然后是第二层析步骤，然后是第三层析步骤等。在顺序层析步骤之间可以包括额外的步骤。
本文关于层析使用的术语“连续”是指具有直接连接的第一层析材料和第二层析材料或允许两种层析材料之间连续流动的一些其他机制。
“负载密度”是指与一定体积(例如，升)的层析材料接触的组合物的量(例如，克)。在一些实例中，负载密度以g/L表示。
“样品”是指较大量材料的一小部分。通常，根据本文描述的方法的测试在样品上进行。样品通常从重组多肽制备物中获得，所述重组多肽制剂例如从培养的表达重组多肽的细胞系(本文也称为“产物细胞系”)或从培养的宿主细胞获得。如本文所用，“宿主细胞”不含有用于表达目的重组多肽或产物的基因。样品可以从例如但不限于收获的细胞培养液，在纯化过程中的某一步骤的过程中池中，或从最终的纯化产物中获得。样品还可包括稀释剂，缓冲剂，洗涤剂以及发现与所需分子(例如多特异性抗体，例如双特异性抗体)混合的污染种类，碎片等。
本文对“约”值或参数的引用包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
应理解，本文描述的本发明的方面和实施方案包括“包含”，“由......组成”和“基本上由......组成”方面和实施方案。
如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“或”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。应理解，本文描述的本发明的方面和变化包括“组成”和/或“基本上由......组成”方面和变化。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均通过引用整体并入本文。
多特异性抗体的纯化方法
本文提供了纯化多特异性抗体的方法。在某些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。在某些实施方案中，多特异性抗体是二价F(ab’)2，其包含结合第一靶标的第一F(ab)和结合第二靶标的第二F(ab)。在某些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，即具有两个氨基酸序列相同的抗原结合臂的抗体，并且其中每个Fab臂能够识别两种抗原(例如双重作用Fab抗体)。
在一些方面，多特异性抗体的纯化包括捕获层析，第一混合模式层析和第二混合模式层析的连续步骤。在一些实施方案中，在捕获层析之前组装多特异性抗体。在一些实施方案中，在捕获层析后组装多特异性抗体。
在一些实施方案中，多特异性抗体(例如双特异性抗体或二价F(ab’)2)包含两个或更多个抗体臂，其中不同的抗体臂结合不同的表位。在某些实施方案中，不同的表位在相同的抗原上。在某些实施方案中，每个表位在不同的抗原上。在某些实施方案中，抗体臂包含VH/VL单元。在某些实施方案中，抗体臂包含hemimers，也称为半抗体。为了便于组装，在某些实施方案中，一个抗体臂的重链被修饰为包含“旋钮”，另一个抗体臂的重链包含“孔”，使得第一个重链的旋钮适合于第二重链的孔。
在某些实施方案中，多特异性抗体的每个臂在单独的细胞培养物中产生。在宿主细胞中表达抗体臂后，收集全细胞培养液并均质化，并提取抗体臂。在某些实施方案中，在层析之前将聚乙烯亚胺(PEI)加入细胞裂解物中。在一些实施方案中，在层析之前将细胞裂解物离心。然后通过捕获层析纯化多特异性抗体的每个臂(使得每个臂在单独的层析柱或膜上纯化)。在某些实施方案中，捕获层析是亲和层析。在某些实施方案中，亲和层析是蛋白A层析。在某些实施方案中，亲和层析是蛋白G层析。在某些实施方案中，亲和层析是蛋白A/G层析。在某些实施方案中，亲和层析是蛋白L层析。在捕获层析之后，可以分析纯化的抗体臂；例如，通过SDS-PAGE，SEC层析，质谱法等。然后将多特异性抗体的纯化臂组合并使其组装，如本文其他地方进一步详细讨论的。
在其他实施方案中，多特异性抗体的每个臂在单独的细胞培养物中产生。在宿主细胞中表达抗体臂后，收集全细胞培养液并均质化。然后将来自每种培养物的细胞匀浆混合，并提取合并的抗体臂。在一些实施方案中，在层析之前将聚乙烯亚胺(PEI)加入细胞裂解物中。在一些实施方案中，在层析之前将细胞裂解物离心。然后通过亲和层析纯化多特异性抗体的组合臂。在一些实施方案中，亲和层析是蛋白A层析。此时，可以分析纯化的抗体臂；例如，通过SDS-PAGE，SEC层析，质谱法等。然后将多特异性抗体的纯化臂组合并通过本文所述的方法组装。
在其他实施方案中，多特异性抗体的每个臂在相同的细胞培养物中产生。在宿主细胞中表达抗体臂后，收集全细胞培养液并均质化，并提取抗体臂。在一些实施方案中，在层析之前将聚乙烯亚胺(PEI)加入细胞裂解物中。在一些实施方案中，在层析之前将细胞裂解物离心。然后通过亲和层析纯化多特异性抗体的臂。在一些实施方案中，亲和层析是蛋白A层析。此时，可以分析纯化的抗体臂；例如，通过SDS-PAGE，SEC层析，质谱等。然后通过本文所述的方法使多特异性抗体的纯化臂组装。
在一些实施方案中，细胞裂解物中PEI的最终浓度为至少约0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1.0％，2.0％，3.0％，4.0％或5.0中的任何一种。在一些实施方案中，细胞裂解物中PEI的最终浓度为约0.1％和5％，0.1％和1％，0.1％和0.5％，0.5％和5％，0.5％和1％或1％和5％中的任何一种。在一些实施方案中，将包含PEI的细胞裂解物保持约1hr，2hr，3hr，4hr，5hr，6hr，7hr，8hr，9hr，10hr，12hr，14hr，16hr，18hr，20hr或24hr中的任何一个以上。在一些实施方案中，将包含PEI的细胞裂解物保持在约1hr至24hr，1hr和6hr，6hr和12hr，12hr和18hr，18hr和24hr中的任何一种之间。在一些实施方案中，将包含PEI的细胞裂解物保持在约10hr至14hr中的任何一种之间。在一些实施方案中，包含PEI的细胞裂解物保持在约4℃至37℃之间。在一些实施方案中，包含PEI的细胞裂解物保持在约环境温度。
在一些实施方案中，在层析之前通过离心澄清细胞裂解物。在一些实施方案中，在层析之前过滤细胞裂解物。在一些实施方案中，在层析之前将细胞裂解物通过0.22μm过滤器过滤。
亲和层析的实例包括但不限于例如蛋白A层析，蛋白G层析，蛋白A/G层析或蛋白L层析。亲和层析材料的实例包括但不限于-vA， UltraPlus，ProteinA FastFlow， AF-rProtein A，MabSelectTM，MabSelectSuReTM，MabSelect SuReTM LX，KappaSelect，CaptureSelectTM和CaptureSelectTM FcXL。在某些实施方案中，亲和层析材料在柱中。在某些实施方案中，亲和层析是以“结合和洗脱模式”(或者称为“结合和洗脱过程”)进行。“结合和洗脱模式”是指产物分离技术，其中样品中的产物(例如多特异性抗体)结合亲和层析材料，随后从亲和层析材料中洗脱。在一些实施方案中，洗脱是梯度洗脱，其中流动相的组成在洗脱过程中一次或多次逐步改变。在某些实施方案中，洗脱是梯度洗脱，其中流动相的组成在洗脱过程中连续变化。在某些实施方案中，亲和层析材料是膜。在某些实施方案中，亲和层析是蛋白A层析。在某些实施方案中，蛋白A层析是MAbSelect SuRe层析。在某些实施方案中，亲和层析是CaptureSelect层析。在某些实施方案中，亲和层析是CaptureSelect FcXL层析。
在某些实施方案中，随后将来自亲和层析步骤的洗脱液应用于第一混合模式层析。在某些实施方案中，第一混合模式材料包含能够具有以下一种或多种功能性的官能团：阴离子交换，阳离子交换，氢键，π-π键相互作用，亲水相互作用，嗜硫相互作用和疏水相互作用。在某些实施方案中，第一混合模式材料包含能够进行阴离子交换和疏水相互作用的官能团。在某些实施方案中，第一混合模式材料包含能够进行阳离子交换和疏水相互作用的官能团。在某些实施方案中，第一混合模式材料包含N-苄基-N-甲基乙醇胺，4-巯基-乙基-吡啶，2-苯甲酰氨基-4-巯基丁酸，己胺或苯丙胺，或交联聚烯丙胺。混合模式材料的实例包括CaptoTM Adhere树脂，CaptoTM MMC树脂，MEP HyperCelTM树脂，HEA HyperCelTM树脂，PPA HyperCelTM树脂， HCX，CaptoTM Adhere ImpRes，CaptoTM MMC Impres，NuviaTM cPrime TM膜。在一些实施方案中，第一混合模式材料是CaptoTM Adhere树脂。在某些实施方案中，第一混合模式材料是CaptoTM Adhere树脂。在某些实施方案中，第一混合模式材料是CaptoTM MMC。在某些实施方案中，第一混合模式层析不包括陶瓷羟基磷灰石层析。在某些实施方案中，第一混合模式层析以“结合和洗脱”模式进行。在一些实施方案中，洗脱是梯度洗脱。在某些实施方案中，洗脱是梯度洗脱。在某些实施方案中，第一混合模式层析以“流穿”模式进行。在上述的某些实施方案中，第一混合模式材料在柱中。在上述的某些实施方案中，第一混合模式材料在膜中。
在某些实施方案中，捕获层析和第一混合模式层析是连续的，例如，其中捕获层析材料和第一混合模式材料直接连接或通过允许捕获层析材料和第一混合模式材料之间的连续流动的一些其他机制而连接。在某些实施方案中，捕获层析和第一混合模式层析是连续的，其中第一混合模式层析在捕获层析之后直接进行。
在某些实施方案中，来自捕获层析的洗脱液在施用于第一混合模式树脂之前经历一个或多个另外的层析步骤。例如，来自捕获层析的洗脱液可以在进行第一混合模式层析之前以任何顺序和/或以任何组合进行以下任何一个或多个层析步骤：疏水相互作用(HIC)层析，阴离子交换层析，阳离子交换层析，尺寸排阻层析，亲和层析，陶瓷羟基磷灰石(CHT)层析，亲水相互作用液相层析(HILIC)等。
疏水相互作用层析是液相层析技术，其根据疏水性分离生物分子。HIC层析材料的实例包括但不限于例如 Hexyl-650， Butyl-650， Phenyl-650， Ether-650， Sepharose，OctylPhenyl 或Butyl 在一些实施方案中，HIC层析材料包含苯基琼脂糖凝胶。在某些实施方案中，HIC层析以“结合和洗脱”模式进行。在一些实施方案中，HIC层析以“流穿”模式进行。在上述的一些实施方案中，HIC层析材料在柱中。在上述的一些实施方案中，HIC层析材料在膜中。
阴离子交换层析材料是带正电荷的固相，并且具有游离阴离子，用于与水溶液(例如包含多特异性抗体和杂质的组合物)中的阴离子交换，所述水溶液通过(over)或穿过(through)固相。在本文所述任何方法的一些实施方案中，阴离子交换材料可以是膜、整料或树脂。在一个实施方案中，阴离子交换材料可以是树脂。在一些实施方案中，阴离子交换材料可包含伯胺、仲胺、叔胺或季铵离子官能团，多胺官能团或二乙氨基乙基官能团。阴离子交换材料的实例是本领域已知的，包括但不限于 HQ 50， PI 50， D， Q，Q Fast Flow(QSFF)，AccellTM PlusQuaternary Methyl Amine(QMA)树脂，Sartobind 和DEAE-在一些实施方案中，阴离子交换层析以“结合和洗脱”模式进行。在一些实施方案中，阴离子交换层析以“流穿”模式进行。在上述的一些实施方案中，阴离子交换层析材料在柱中。在上述的一些实施方案中，阴离子交换层析材料是膜。
阳离子交换层析材料是带负电的固相，并且具有游离阴离子，用于与水溶液(例如包含多特异性抗体和杂质的组合物)中的阳离子交换，所述水溶液通过(over)或穿过(through)固相。在本文所述任何方法的一些实施方案中，阳离子交换材料可以是膜、整料或树脂。在一些实施方案中，阳离子交换材料可以是树脂。阳离子交换材料可包含羧酸官能团或磺酸官能团，例如但不限于磺酸盐，羧酸，羧甲基磺酸，磺基异丁基，磺乙基，羧基，磺基丙基，磺酰基，磺基氧基乙基或正磷酸盐。在上述的一些实施方案中，阳离子交换层析材料是阳离子交换层析柱。在上述的一些实施方案中，阳离子交换层析材料是阳离子交换层析膜。本领域已知的阳离子交换材料的实例包括但不限于 S， S，SO3Monolith(诸如，例如和 SO3)，S Ceramic XS， HS 50， HS 20，sulphopropyl- Fast Flow(SPSFF)，SP- XL(SPXL)，CM FastFlow，CaptoTM S， EMD Se Hicap， EMD SO3 -，或EMD COO-。在一些实施方案中，阳离子交换层析以“结合和洗脱”模式进行。在一些实施方案中，阳离子交换层析以“流穿”模式进行。在上述的一些实施方案中，阳离子交换层析材料在柱中。在上述的一些实施方案中，阳离子交换层析材料在膜中。
羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)层析材料的官能团包括带正电荷的晶体钙离子对(C-位点)和与晶体磷酸三联体相关的六个带负电荷的氧原子簇(P-位点)。C位点，P位点和羟基以固定图案分布在晶体表面上。蛋白质通常以低浓度(例如10-25mM)的磷酸盐缓冲液吸附到羟基磷灰石上，尽管如果上样到水、盐水或非磷酸盐缓冲液中，某些酸性蛋白质可以被吸附。蛋白质通常通过增加磷酸盐梯度洗脱，尽管也可以使用Ca2+、Mg2+或Cl-离子的梯度，例如用于碱性蛋白质的选择性洗脱。在本文所述任何方法的一些实施方案中，羟基磷灰石层析材料可以是树脂。在一些实施方案中，羟基磷灰石层析材料可以是树脂。在上述的一些实施方案中，羟基磷灰石层析材料是柱。本领域已知的羟基磷灰石层析材料的实例包括但不限于CHTTM陶瓷羟基磷灰石，CHT陶瓷羟基磷灰石I型载体，CHT陶瓷羟基磷灰石II型载体。在一些实施方案中，羟基磷灰石层析以“结合和洗脱”模式进行。在一些实施方案中，羟基磷灰石层析以“流穿”模式进行。
在一个实施方案中，此外本文报道的方法可以包括从包含所述双特异性抗体的溶液中分离包含Fc结构域的双特异性抗体的方法，所述方法包括(a)使所述溶液与羟基磷灰石层析介质接触，(b)将所述双特异性抗体吸附到所述羟基磷灰石层析介质上，和(c)在氯离子存在下从所述羟基磷灰石层析介质中洗脱所述双特异性抗体，其中所述溶液还包含一个或多个所述双特异性抗体的片段，其中一个或多个片段包含Fc结构域；和/或其中所述溶液还包含一种或多种具有比所述双特异性抗体分子量更大的分子量的多肽，并且包含所述双特异性抗体的两个重链中的至少一条，所述一种或多种多肽还包含如WO2015024896中所述的Fc结构域。
在某些实施方案中，来自捕获层析的洗脱液进行阴离子交换层析。在某些实施方案中，阴离子交换层析材料是Q Fast Flow(QSFF)。在某些实施方案中，阴离子交换层析以“结合和洗脱”模式进行。
在某些实施方案中，将在第一混合模式层析之后收集的洗脱液随后施用于第二混合模式层析。在某些实施方案中，第二混合模式材料包含能够具有以下功能中的一种或多种的官能团：阴离子交换，阳离子交换，氢键，π-π键相互作用，亲水相互作用，嗜硫相互作用和疏水相互作用。在某些实施方案中，第二混合模式材料包含能够进行阴离子交换和疏水相互作用的官能团。在某些实施方案中，第二混合模式材料包含能够进行阳离子交换和疏水相互作用的官能团。在某些实施方案中，第二混合模式材料包含N-苄基-N-甲基乙醇胺，4-巯基-乙基-吡啶，2-苯甲酰氨基-4-巯基丁酸，己胺或苯基丙胺，或交联聚烯丙胺。混合模式材料的实例包括CaptoTM Adhere树脂，CaptoTM MMC树脂，MEP HyperCelTM树脂，HEAHyperCelTM树脂， HCX，CaptoTM Adhere ImpRes，CaptoTM MMC Impres，NuviaTM cPrime TM膜。在一些实施方案中，第二混合模式材料是CaptoTM Adhere树脂。在某些实施方案中，第二混合模式材料是CaptoTM Adhere树脂。在某些实施方案中，第二混合模式材料是CaptoTM MMC。在某些实施方案中，第二混合模式层析不包括陶瓷羟基磷灰石层析。在某些实施方案中，第二混合模式层析以“结合和洗脱”模式进行。在一些实施方案中，洗脱是梯度洗脱。在某些实施方案中，洗脱是梯度洗脱。在某些实施方案中，第一混合模式层析以“流穿”模式进行。在以上的某些实施方案中，第二混合模式材料在柱中。在上述的某些实施方案中，第二混合模式材料是膜。
在某些实施方案中，第一混合模式层析和第二混合模式层析是连续的，例如，其中捕获层析材料和第一混合模式材料直接连接或通过允许在捕获层析材料和第一混合模式材料之间连续流动的一些其他机制而连接。在某些实施方案中，第一混合模式层析和第二混合模式层析是连续的，其中第二混合模式层析在第一混合模式层析之后直接进行。
在某些实施方案中，来自第一混合模式层析的洗脱液在施用于第二混合模式树脂之前经历一个或多个另外的层析操作。例如，来自第一混合模式层析的洗脱液可以在进行第二混合模式层析之前进行以任何顺序和/或以任何组合的以下任何一个或多个层析步骤：疏水相互作用(HIC)层析，阴离子交换层析，阳离子交换层析，尺寸排阻层析，亲和层析，陶瓷羟基磷灰石(CHT)层析，亲水相互作用液相层析(HILIC)等。
在本文所述任何方法的某些实施方案中，来自第二混合模式层析的洗脱液进行一个或多个另外的层析步骤。例如，来自第二混合模式层析的洗脱液可以进行以任何顺序和/或以任何组合的以下任何一个或多个层析步骤：疏水相互作用(HIC)层析，阴离子交换层析，阳离子交换层析，大小排阻层析，亲和层析，陶瓷羟基磷灰石(CHT)层析，亲水相互作用液相层析(HILIC)，混合模式层析等。
在本文所述任何方法的某些实施方案中，所述方法包括使用缓冲液。在多特异性抗体的纯化过程中可以使用各种缓冲液，这取决于例如缓冲液的所需pH、缓冲液的所需电导率、待纯化的多特异性抗体的特征和纯化方法。缓冲液可以是上样缓冲液、平衡缓冲液或洗涤缓冲液。在某些实施方案中，上样缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种是相同的。在某些实施方案中，上样缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液是不同的。在本文所述任何方法的某些实施方案中，缓冲液包含盐。在某些实施方案中，缓冲液包含氯化钠，乙酸钠，Tris HCl，Tris乙酸盐，磷酸钠，磷酸钾，MES，CHES，MOPS，BisTris，精氨酸，精氨酸HCl或其混合物。在某些实施方案中，缓冲液是氯化钠缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液是乙酸钠缓冲液。在某些实施方案中，缓冲液是Tris，精氨酸，磷酸盐，MES，CHES或MOPS缓冲液。
“负载”是指将组合物上样到层析材料上。上样缓冲液是用于将组合物(例如，包含多特异性抗体和杂质的组合物或包含抗体臂和杂质的组合物)上样到层析材料(例如本文所述的任何一种层析材料)上的缓冲液。在上样待纯化的组合物之前，可以用平衡缓冲液平衡层析材料。在将组合物上样到层析材料上之后使用洗涤缓冲液。洗脱缓冲液用于从固相洗脱目标多肽。
在本文所述的任何层析材料上上样包含多特异性抗体(例如包含多特异性抗体和杂质的组合物)的组合物可以被优化以从分离多特异性抗体与杂质。在一些实施方案中，当以结合和洗脱模式(例如，亲和层析，混合模式层析和离子交换层析，如本文所述)进行层析时，将包含多特异性抗体的组合物(例如包含多特异性抗体和杂质的组合物)上样到层析材料上以优化多特异性抗体与层析材料的结合。
电导率是指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子传输流动。因此，随着水溶液中存在的离子量的增加，溶液将具有更高的电导率。电导率的基本测量单位是西门子(mS/cm)或欧姆(mho)，并且可以使用电导率仪测量，例如各种型号的Orion电导率仪。由于电解电导率是溶液中离子携带电流的能力，因此可以通过改变其中离子的浓度来改变溶液的电导率。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如氯化钠，乙酸钠或氯化钾)的浓度以获得所需的电导率。优选地，改变各种缓冲液的盐浓度以获得所需的电导率。
例如，在某些实施方案中，将包含多特异性抗体的组合物(例如包含多特异性抗体和杂质的组合物)上样到层析材料上，例如，包含本文所述的任何一种层析材料的层析柱上，在上样缓冲液中多种不同的pH值下，而上样缓冲液的电导率是恒定的。或者，包含多特异性抗体的溶液可以在上样缓冲液中以许多不同的电导率上样到层析材料上，同时上样缓冲液的pH恒定。完成将包含多特异性抗体的组合物(例如包含多特异性抗体和杂质的组合物)上样到层析材料上并将多特异性抗体从层析材料洗脱到池级分中时，残留在池级分中的杂质的量对于给定的pH或电导率提供了关于多特异性抗体与杂质分离的信息。同样地，对于多特异性抗体流过层析材料的层析，上样缓冲液针对pH和电导率进行优化，使得多特异性抗体流过层析，而杂质被层析材料保留或以与多特异性抗体不同的速率流过层析材料。
在一些实施方案中，包含多特异性抗体或抗体臂的溶液的上样密度大于约10g/L，20g/L，30g/L，40g/L，50g/L，60g/L，70g/L，80g/L，90g/L，100g/L，110g/L，120g/L，130g/L，140g/L，或150g/L中的任何一种的亲和层析材料(例如，蛋白A层析材料)。在一些实施方案中，包含多特异性抗体或抗体臂的溶液的上样密度为约10g/L和20g/L，20g/L和30g/L，30g/L和40g/L，40g/L和50g/L，50g/L和60g/L，60g/L和70g/L，70g/L和80g/L，80g/L和90g/L，90g/L和100g/L之间的任何一种的捕获层析材料(例如亲和层析材料，例如蛋白A层析材料，蛋白G层析材料，蛋白A/G层析材料或蛋白L层析材料)。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，将捕获层析后获得的洗脱液上样到阴离子交换层析材料(例如，Q Sepharose Fast Flow(QSFF))上。在本文所述任何方法的一些实施方案中，将捕获层析后获得的洗脱液上样到阴离子交换层析材料上，多特异性抗体的上样密度大于约30g/L，40g/L，50g/L，60g/L，70g/L，80g/L，90g/L，100g/L，110g/L，120g/L，130g/L，140g/L，或150g/L中的任何一种的阴离子层析材料(例如，Q FastFlow(QSFF))。在一些实施方案中，将捕获层析后获得的洗脱液上样到阴离子交换层析材料上，多特异性抗体的上样密度为约10g/L至20g/L，20g/L和30g/L，30g/L和40g/L，40g/L和50g/L，50g/L和60g/L，60g/L和70g/L，70g/L和80g/L，80g/L和90g/L，90g/L和100g/L之间的任何一种的阴离子交换层析材料(例如，Q Sepharose Fast Flow(QSFF))。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，将捕获层析之后获得的洗脱液(任选地在捕获层析之后和包含本文所述的任何层析操作的一个或多个另外的层析步骤之后)上样到第一混合模式层析上，多特异性抗体的上样密度大于约30g/L，40g/L，50g/L，60g/L，70g/L，80g/L，90g/L，100g/L，110g/L，120g/L，130g/L，140g/L或150g/L的任何一种的第一混合模式层析材料(例如，CaptoTM Adhere层析材料或CaptoTM MMC层析材料)。在一些实施方案中，将捕获层析后获得的洗脱液上样到第一混合模式层析材料上，多特异性抗体的上样密度为约10g/L和20g/L，20g/L和30g/L，30g/L和40g/L，40g/L和50g/L，50g/L和60g/L，60g/L和70g/L，70g/L和80g/L，80g/L和90g/L，90g/L和100g/L之间的任何一种的第一混合模式层析材料(例如，CaptoTM Adhere层析材料或CaptoTM MMC层析材料)。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，将第一混合模式层析后获得的洗脱液上样到第二混合模式层析材料上，多特异性抗体的上样密度大于约30g/L，40g/L，50g/L，60g/L，70g/L，80g/L，90g/L，100g/L，110g/L，120g/L，130g/L，140g/L，或150g/L中的任何一种的第二混合模式层析材料(例如，CaptoTM Adhere层析材料或CaptoTM MMC层析材料)。在一些实施方案中，将第一混合模式层析之后获得的洗脱液上样到第二混合模式层析材料上，多特异性抗体的上样密度为约10g/L和20g/L，20g/L和30g/L，30g/L和40g/L，40g/L和50g/L，50g/L和60g/L，60g/L和70g/L，70g/L和80g/L，80g/L和90g/L，90g/L和100g/L之间的任何一种的混合模式层析材料(例如，CaptoTM Adhere层析材料或CaptoTM MMC层析材料)。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，将在第二混合模式层析之后获得的洗脱液上样到随后的层析材料(例如疏水相互作用(HIC)层析材料，阴离子交换层析材料，阳离子交换层析材料，尺寸排阻层析材料，亲和层析材料或另外的混合模式层析材料)上，多特异性抗体的上样密度大于约30g/L，40g/L，50g/L，60g/L，70g/L，80g/L，90g/L，100g/L，110g/L，120g/L，130g/L，140g/L，或150g/L中的任何一种的随后的层析材料。在一些实施方案中，将在第二混合模式层析之后获得的洗脱液上样到随后的层析材料(例如疏水相互作用(HIC)层析材料，阴离子交换层析材料，阳离子交换层析材料，尺寸排阻层析材料，亲和层析材料，或额外的混合模式层析材料)上，多特异性抗体的上样密度为10g/L和20g/L，20g/L和30g/L，30g/L和40g/L，40g/L和50g/L，50g/L和60g/L，60g/L和70g/L，70g/L和80g/L，80g/L和90g/L，90g/L和100g/L之间的任何一种的后续层析材料。
如本文所用，洗脱是除去产物，例如，来自层析材料的多特异性抗体或抗体臂。洗脱缓冲液是用于从层析材料中洗脱多特异性抗体或其他目的产物的缓冲液。在许多情况下，洗脱缓冲液具有与上样缓冲液不同的物理特性。例如，洗脱缓冲液可以具有与上样缓冲液不同的电导率或与上样缓冲液不同的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比上样缓冲液低的电导率。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比上样缓冲液高的电导率。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比上样缓冲液低的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比上样缓冲液高的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有与上样缓冲液不同的电导率和不同的pH。洗脱缓冲液可以具有更高或更低电导率和更高或更低pH的任何组合。
在某些实施方案中，多特异性抗体从层析材料中的洗脱针对产物的产率进行了优化，具有最小杂质且在最小洗脱体积或池体积。例如，含有多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或抗体臂的组合物可以在上样缓冲液中上样到层析材料上，例如，层析柱。完成上样后，用多种不同pH值的缓冲液洗脱多特异性抗体或抗体臂，同时洗脱缓冲液的电导率恒定。或者，可以在洗脱缓冲液中以多种不同的电导率从层析材料中洗脱多特异性抗体或抗体臂，同时洗脱缓冲液的pH恒定。完成从层析材料中洗脱多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或抗体臂后，池级分中的杂质量提供关于给定pH或电导率下多特异性抗体或抗体臂与杂质分离的信息。在多个柱体积(例如8个柱体积)中洗脱多特异性抗体或抗体臂表明洗脱曲线的“拖尾”。在一些实施方案中，使洗脱的拖尾最小化。
可以采用各种缓冲液，例如，取决于缓冲液的所需pH，缓冲液的所需电导率，目标蛋白质的特征，层析材料和纯化过程(例如，“结合和洗脱”或“流穿”模式)。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述方法包括使用至少一种缓冲液。缓冲液可以是上样缓冲液，平衡缓冲液，洗脱缓冲液或洗涤缓冲液。在一些实施方案中，上样缓冲液，平衡缓冲液，洗脱缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，另外的混合模式层析等的上样缓冲液，平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液)是相同的。在一些实施方案中，上样缓冲液，平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，另外的混合模式层析等的上样缓冲液，平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液)是不同的。在本文所述任何方法的一些实施方案中，缓冲液包含盐。上样缓冲液(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，另外的混合模式层析等的上样缓冲液，平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液)可包括氯化钠，乙酸钠，Tris，精氨酸，磷酸盐，MOPS，MES，CHES，BisTris，硫酸铵，硫酸钠，柠檬酸盐，琥珀酸盐，或其混合物。在某些实施方案中，缓冲液是氯化钠缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液是乙酸钠缓冲液。在某些实施方案中，缓冲液是Tris，精氨酸，磷酸盐，MES，CHES或MOPS缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液包含Tris。在一些实施方案中，缓冲液包含精氨酸。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，上样缓冲液(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，附加混合模式层析等的上样缓冲液)具有大于约1.0mS/cm，1.5mS/cm，2.0mS/cm，2.5mS/cm，3.0mS/cm，3.5mS/cm，4.0mS/cm，4.5mS/cm，5.0mS/cm，5.5mS/cm，6.0mS/cm，6.5mS/cm，7.0mS/cm，7.5mS/cm，8.0mS/cm，8.5mS/cm，9.0mS/cm，9.5mS/cm，10mS/cm或20mS/cm中的任何一个电导率。电导率可在约1mS/cm和20mS/cm，4mS/cm和10mS/cm，4mS/cm和7mS/cm，5mS/cm和17mS/cm，5mS/cm和10mS/cm，或5mS/cm和7mS/cm之间。在一些实施方案中，电导率为约1.0mS/cm，1.5mS/cm，2.0mS/cm，2.5mS/cm，3.0mS/cm，3.5mS/cm，4mS/cm，4.5mS/cm，5.0mS/cm，5.5mS/cm，6.0mS/cm，6.5mS/cm，7.0mS/cm，7.5mS/cm，8.0mS/cm，8.5mS/cm，9.0mS/cm，9.5mS/cm，10mS/cm或20mS/cm中的任何一种。在一个方面，电导率是上样缓冲液，平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的电导率。在一些实施方案中，上样缓冲液，平衡缓冲液和洗涤缓冲液(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，另外的混合模式层析等的上样缓冲液，平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液)中的一种或多种的电导率是相同的。在一些实施方案中，上样缓冲液的电导率不同于洗涤缓冲液和/或平衡缓冲液的电导率。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，另外的混合模式层析等的洗脱缓冲液)具有小于上样缓冲液的电导率的电导率。在本文所述任何方法的一些实施方案中，洗脱缓冲液(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，附加混合模式层析等的洗脱缓冲液)具有小于约0mS/cm，0.5mS/cm，1.0mS/cm，1.5mS/cm，2.0mS/cm，2.5mS/cm，3.0mS/cm，3.5mS/cm，4.0mS/cm，4.5mS/cm，5.0mS/cm，5.5mS/cm，6.0mS/cm，6.5mS/cm，或7.0mS/cm中的任何一个的电导率。电导率可以在约0mS/cm和7mS/cm，1mS/cm和7mS/cm，2mS/cm和7mS/cm，3mS/cm和7mS/cm，或者4mS/cm和7mS/cm，0mS/cm和5.0mS/cm，1mS/cm和5mS/cm，2mS/cm和5mS/cm，3mS/cm和5mS/cm，或4mS/cm和5mS/cm中的任何一种之间。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的电导率(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，另外的混合模式层析等的洗脱缓冲液)约为0mS/cm，0.5mS/cm，1.0mS/cm，1.5mS/cm，2.0mS/cm，2.5mS/cm，3.0mS/cm，3.5mS/cm，4.0mS/cm，4.5mS/cm，5.0mS/cm，5.5mS/cm，6.0mS/cm，6.5mS/cm，或7.0mS/cm中的任何一种。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有大于上样缓冲液的电导率的电导率。在本文所述任何方法的一些实施方案中，洗脱缓冲液(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，附加混合模式层析等的洗脱缓冲液)具有大于约5.5mS/cm，6.0mS/cm，6.5mS/cm，7.0mS/cm，7.5mS/cm，8.0mS/cm，8.5mS/cm，9.0mS/cm，9.5mS/cm，10mS/cm，11mS/cm，12mS/cm，13mS/cm，14mS/cm，15mS/cm，16mS/cm，17.0mS/cm，18.0mS/cm，19.0mS/cm，20.0mS/cm，21.0mS/cm，22.0mS/cm，23.0mS/cm，24.0mS/cm，25.0mS/cm，26.0mS/cm，27.0mS/cm，28.0mS/cm，29.0mS/cm，或30.0mS/cm中的任何一个的电导率。电导率可以在约5.5mS/cm和30mS/cm，6.0mS/cm和30mS/cm，7mS/cm和30mS/cm，8mS/cm和30mS/cm，9mS/cm和30mS/cm，或10mS/cm和30mS/cm中的任何一种之间。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为约5.5mS/cm，6.0mS/cm，6.5mS/cm，7.0mS/cm，7.5mS/cm，8.0mS/cm，8.5mS/cm，9.0mS/cm，9.5mS/cm，10mS/cm，11mS/cm，12mS/cm，13mS/cm，14mS/cm，15mS/cm，16mS/cm，17.0mS/cm，18.0mS/cm，19.0mS/cm，20.0mS/cm，21.0mS/cm，22.0mS/cm，23.0mS/cm，24.0mS/cm，25.0mS/cm，26.0mS/cm，27.0mS/cm，28.0mS/cm，29.0mS/cm，或30.0mS/cm0中的任何一种。在任何上述实施方案的一些方面，洗脱缓冲液的电导率(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，另外的混合模式层析等的洗脱缓冲液)通过逐步梯度或线性梯度从上样和/或洗涤缓冲液中改变。
在一些实施方案中，将包含多特异性抗体的溶液在电导率为约<6.5mS/cm的上样缓冲液中上样到第一混合模式层析材料上，并且在电导率约为1.5mS/cm的洗脱缓冲液中从第一混合层析材料洗脱多肽。在一些实施方案中，上样缓冲液具有约6.5mS/cm的电导率，并且洗脱缓冲液具有约3mS/cm的电导率。在一些实施方案中，上样缓冲液具有约5.5mS/cm的电导率，并且洗脱缓冲液具有约2mS/cm的电导率。在一些实施方案中，上样缓冲液具有约5.5mS/cm的电导率，并且洗脱缓冲液具有约1mS/cm的电导率。在上述实施方案的其他实施方案中，第一混合模式层析材料是CaptoTM Adhere树脂。在上述实施方案的其他实施方案中，第一混合模式层析材料是CaptoTM MMC树脂。
在任何上述实施方案的一些方面，洗脱缓冲液的电导率通过逐步梯度或线性梯度从上样和/或洗涤缓冲液改变。在一些实施方案中，将包含多特异性抗体的组合物以<6.5mS/cm上样到第一混合模式层析(例如，CaptoTM Adhere层析或CaptoTM MMC层析)上，并且通过至约1.5mS/cm的逐步电导率梯度从第一混合模式层析洗脱多特异性抗体。
在一些实施方案中，将包含多特异性抗体的溶液在电导率为约<6.5mS/cm的上样缓冲液中上样到第二混合模式层析材料上，并且在电导率约为1.5mS/cm的洗脱缓冲液中从第二混合层析材料洗脱多肽。在一些实施方案中，上样缓冲液具有约6.5mS/cm的电导率，并且洗脱缓冲液具有约3mS/cm的电导率。在一些实施方案中，上样缓冲液具有约5.5mS/cm的电导率，并且洗脱缓冲液具有约2mS/cm的电导率。在一些实施方案中，上样缓冲液具有约5.5mS/cm的电导率，并且洗脱缓冲液具有约1mS/cm的电导率。在上述实施方案的其他实施方案中，第二混合模式层析材料是CaptoTM Adhere树脂。在上述实施方案的其他实施方案中，第二混合模式层析材料是CaptoTM MMC树脂。
在任何上述实施方案的一些方面，通过逐步梯度或通过线性梯度，从上样和/或洗涤缓冲液改变洗脱缓冲液的电导率。在一些实施方案中，将包含多特异性抗体的组合物以<6.5mS/cm上样到第二混合模式层析(例如，CaptoTM Adhere层析或CaptoTM MMC层析)上，并且通过至约1.5mS/cm的逐步电导率梯度从第二混合模式层析洗脱多特异性抗体。
在一些实施方案中，将包含多特异性抗体的组合物以<2.5mS/cm上样到阴离子交换层析(例如，QSFF层析)上，并通过至约8.6mS/cm的逐步电导率梯度从阴离子交换层析中洗脱多特异性抗体。
在一些实施方案中，将包含多特异性抗体的组合物以约5.0mS/cm上样到阳离子交换层析(例如，POROS 50HS层析)上，并通过至约27.5mS/cm的逐步电导率梯度从阳离子交换层析中洗脱多特异性抗体。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，上样缓冲液(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，另外的混合模式层析等的上样缓冲液)具有小于约10，9，8，7，6或5中的任何一种的pH，包括这些值之间的任何范围。在本文所述任何方法的一些实施方案中，上样缓冲液(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，另外的混合模式层析等的上样缓冲液)具有大于约4，5，6，7，8或9中的任何一种的pH，包括这些值之间的任何范围。上样缓冲液(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何其他层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，另外的混合模式层析等的上样缓冲液)可以具有在约4和9，4和8，4和7，5和9，5和8，5和7，5和6中的任何一个的pH，包括这些值之间的任何范围。在一些实施方案中，上样缓冲液的pH(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，另外的混合模式层析等的上样缓冲液)具有约为4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5或8的任何一个的pH值，包括这些值之间的任何范围。pH可以是上样缓冲液，平衡缓冲液或洗涤缓冲液(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何其他层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，另外的混合模式层析等的上样缓冲液，平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液)的pH。在一些实施方案中，上样缓冲液，平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种的pH是相同的。在一些实施方案中，上样缓冲液的pH不同于平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的pH。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，另外的混合模式层析等的洗脱缓冲液)具有小于上样缓冲液的pH的pH。在本文所述任何方法的一些实施方案中，洗脱缓冲液具有小于约8，7，6，5，4，3或2中的任何一种的pH，包括这些值之间的任何范围。洗脱缓冲液的pH可以在约4和9，4和8，4和7，4和6，4和5，5和9，5和8，5和7，5和6，6和9，6和8，6和7中的任何一种之间，包括这些值之间的任何范围。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，另外的混合模式层析等的洗脱缓冲液)是约4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5或9.0中的任何一个，包括这些值之间的任何范围。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，另外的混合模式层析等的洗脱缓冲液)具有大于上样缓冲液的pH的pH。在本文所述任何方法的一些实施方案中，洗脱缓冲液(例如用于第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，另外的混合模式层析等的洗脱缓冲液)具有大于约5，6，7，8或9中的任何一种的pH，包括这些值之间的任何范围。在本文所述任何方法的一些实施方案中，洗脱缓冲液(例如用于捕获层析的洗脱缓冲液)具有大于约2，4或4中的任何一种的pH，包括这些值之间的任何范围。洗脱缓冲液的pH值(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何其他层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，大小排阻层析，另外的混合模式层析等的洗脱缓冲液)可以在2和9，3和9，4和9，2和8，3和8，4和8，2和7，3和7，4和7，2和6，3和6以及4和6中的任何一种之间，包括这些值之间的任何范围。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约2.0，2.5，3.0，3.5，4.0中的任何一种，包括这些值之间的任何范围。
在一些实施方案中，将包含多特异性抗体或抗体臂的溶液上样到约pH7的亲和层析(例如，蛋白A层析)上，并通过至约为2.9的pH的逐步梯度从亲和层析中洗脱多特异性抗体或抗体臂。
在任何上述实施方案的一些方面，洗脱缓冲液(例如用于捕获层析，第一混合模式层析，第二混合模式层析和/或任何另外的层析，例如阴离子交换层析，阳离子交换层析，HIC层析，尺寸排阻层析，另外的混合模式层析等的洗脱缓冲液)的pH通过逐步梯度或线性梯度从上样和/或洗涤缓冲液改变。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，流速小于约50CV/hr，40CV/hr或30CV/hr中的任何一种。流速可以在约5CV/hr和50CV/hr，10CV/hr和40CV/hr，或18CV/hr和36CV/hr中的任何一种之间。在一些实施方案中，流速为约9CV/hr，18CV/hr，25CV/hr，30CV/hr，36CV/hr或40CV/hr中的任何一种。在本文所述任何方法的一些实施方案中，流速小于约100cm/hr，75cm/hr或50cm/hr中的任何一种。流速可以在约25cm/hr和150cm/hr，25cm/hr和100cm/hr，50cm/hr和100cm/hr，或65cm/hr和85cm/hr中的任何一种之间。
床高度是所用层析材料的高度。在本文所述任何方法的一些实施方案中，床高度大于约5cm，10cm，15cm，20cm，25cm，30cm，35cm，40cm，45cm或50cm中的任何一个。在一些实施方案中，床高度在约5cm和50cm之间。在一些实施方案中，床高度基于负载中多肽或污染物的量来确定。
在一些实施方案中，层析在柱或容器中，体积大于约1mL，2mL，3mL，4mL，5mL，6mL，7mL，8mL，9mL，10mL，15mL，20mL，25mL，30mL，40mL，50mL，75mL，100mL，200mL，300mL，400mL，500mL，600mL，700mL，800mL，900mL，1L，2L，3L，4L，5L，6L，7L，8L，9L，10L，25L，50L，100L，200L，300L，400L，500L，600L，700L，800L，900L或1000L。
在一些实施方案中，从层析收集级分。在一些实施方案中，收集的级分大于约0.01CV，0.02CV，0.03CV，0.04CV，0.05CV，0.06CV，0.07CV，0.08CV，0.09CV，0.1CV，0.2CV，0.3CV，0.4CV，0.5CV，0.6CV，0.7CV，0.8CV，0.9CV，1.0CV，2.0CV，3.0CV，4.0CV，5.0CV，6.0CV，7.0CV，8.0CV，9.0CV或10.0CV。
在某些实施方案中，合并含有纯化或部分纯化的产物，例如多特异性抗体(例如双特异性抗体或二价F(ab’)2)或抗体臂或Fab的级分。级分中多肽的量可由本领域技术人员确定；例如，可以通过UV光谱法测定级分中多肽的量。在某些实施方案中，当OD280大于0.5，0.6，0.7，0.8，0.9和1.0中的任何一个时，收集级分。在某些实施方案中，当OD280在约0.5和1.0，0.6和1.0，0.7和1.0，0.8和1.0，或0.9和1.0之间时，收集级分。在某些实施方案中，合并含有可检测的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或抗体臂的级分。
在本文所述任何方法的某些实施方案中，杂质是产物特异性杂质。产物特异性杂质的实例包括但不限于未配对的半抗体，未配对的抗体轻链，未配对的重链，抗体片段，同二聚体(例如，包含相同重链和轻链的双特异性抗体的成对半二聚体)，聚集体，高分子量种类(MHWS)(如非常高分子量种类(vHMWS))，具有错配的二硫化物的多特异性抗体，轻链二聚体，重链二聚体，低分子量种类(LMWS)和电荷变体(例如抗体的酸性变体和碱性变体)。
在某些实施方案中，本文提供的方法从包含多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和未配对的半抗体的组合物中去除或降低未配对的半抗体的水平。测量组合物中未配对的半抗体的存在或水平的方法是本领域已知的；例如，通过质谱法(例如液相层析-质谱法)，CE-SDS，反相HPLC，HIC HPLC。在本文所述任何方法的某些实施方案中，从一个或多个纯化步骤中回收的组合物(例如层析级分)中未配对的半抗体的量减少超过约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或99％中的任何一种，包括这些值之间的任何范围。在某些实施方案中，从一个或多个纯化步骤中回收的组合物(例如层析级分)中未配对的半抗体的量减少约10％和95％；10％和99％；20％和95％；20％和99％；30％和95％；30％和99％；40％和95％；40％和99％；50％和95％；50％和99％；60％和95％；60％和99％；70％和95％；70％和99％；80％和95％；80％和99％；90％和95％；或90％和99％中的任何一种之间。在一些实施方案中，组合物(例如层析级分)中未配对的半抗体的量减少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％中的任何一种。在某些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物中未配对的半抗体(例如层析级分)的量与纯化步骤之前组合物中未配对的半抗体的量来确定未配对的半抗体的存在或水平的降低。
在某些实施方案中，本文提供的方法从包含多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和同二聚体的组合物中去除或降低同二聚体的水平。测量组合物中同二聚体的存在或水平的方法是本领域已知的；例如，通过质谱法(例如液相层析-质谱法，反相HPLC和HIC HPLC)。在本文所述任何方法的某些实施方案中，在从一个或多个纯化步骤中回收的组合物中的同二聚体(例如层析级分)的量减少超过约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％中的任何一种，包括这些值之间的任何范围。在某些实施方案中，从一个或多个纯化步骤中回收的组合物中同二聚体(例如层析级分)的量减少约10％和95％；10％和99％；20％和95％；20％和99％；30％和95％；30％和99％；40％和95％；40％和99％；50％和95％；50％和99％；60％和95％；60％和99％；70％和95％；70％和99％；80％和95％；80％和99％；90％和95％；或90％和99％中的任何一种之间。在一些实施方案中，组合物(例如层析级分)中同二聚体的量减少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％中的任何一种。在某些实施方案中，同二聚体的存在或水平的降低通过比较从纯化步骤回收的组合物(例如层析级分)中的同二聚体的量与在纯化步骤之前的组合物中的同二聚体的量来确定。
在某些实施方案中，本文提供的方法从包含多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和HMWS蛋白的组合物中去除或降低高分子量种类(HMWS)蛋白的水平。HMWS蛋白可包含例如聚集的多肽(例如聚集的多特异性抗体，聚集的半抗体，聚集的同二聚体等)。在某些实施方案中，聚集的多肽包含重链多聚体，轻链多聚体和/或多特异性抗体的多聚体。HMWS蛋白质可以是包含2，3，4，5，6，7或8个或更多个重链或轻链的单体，或2，3，4，5，6，7或8个或更多个聚集的多特异性抗体。测量聚集蛋白(例如HMWS蛋白)的方法是本领域已知的，并描述于例如WO2011/150110中。这些方法包括例如尺寸排阻层析，毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS)和液相层析-质谱(LC-MS)。在本文所述任何方法的某些实施方案中，从一个或多个纯化步骤中回收的组合物(例如层析级分)中HMWS蛋白的量减少超过约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或99％中的任何一种，包括这些值之间的任何范围。在某些实施方案中，从一个或多个纯化步骤回收的组合物(例如层析级分)中HMWS蛋白的量减少约10％和95％；10％和99％；20％和95％；20％和99％；30％和95％；30％和99％；40％和95％；40％和99％；50％和95％；50％和99％；60％和95％；60％和99％；70％和95％；70％和99％；80％和95％；80％和99％；90％和95％；或90％和99％中的任何一种之间。在一些实施方案中，组合物(例如层析级分)中HMWS蛋白的量减少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或95％中的任何一种。在某些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物(例如层析级分)中的HMWS蛋白质的量与在纯化步骤之前组合物中HMWS蛋白质的量来确定HMWS蛋白质的存在或水平的降低。
在某些实施方案中，本文提供的方法从包含多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和低分子量种类(LMWS)蛋白的组合物中去除或降低LMWS蛋白的水平。LMWS蛋白可包含片段化多肽。在某些实施方案中，片段化多肽是多特异性抗体的片段，抗体臂的片段，重链片段或轻链片段。LMWS蛋白的实例包括但不限于Fab(即片段抗原结合)，Fc(片段，可结晶)，两者的区域或组合，或多特异性抗体，目的重链或轻链的任何随机片段化部分，或1/2抗体(含有一个抗体轻链/重链对)或3/4抗体(含有异二聚体或抗体重链和单个抗体轻链的同二聚体；本文中也表示为HHL)。测量片段化蛋白质(例如LMWS蛋白质)的方法是本领域已知的，并且描述于例如WO2011/150110中。这些方法包括例如尺寸排阻层析，毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS)和液相层析-质谱(LC-MS)。在本文所述任何方法的某些实施方案中，从一个或多个纯化步骤中回收的组合物(例如层析级分)中LMWS蛋白的量减少超过约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或99％中的任何一种，包括这些值之间的任何范围。在某些实施方案中，从一个或多个纯化步骤中回收的组合物(例如层析级分)中LMWS蛋白的量减少约10％和95％；10％和99％；20％和95％；20％和99％；30％和95％；30％和99％；40％和95％；40％和99％；50％和95％；50％和99％；60％和95％；60％和99％；70％和95％；70％和99％；80％和95％；80％和99％；90％和95％；或90％和99％中的任何一种之间。在一些实施方案中，组合物(例如层析级分)中LMWS蛋白的量减少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或95％中的任何一种。在某些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物(例如层析级分)中的LMWS蛋白质与在纯化步骤之前组合物中LMWS蛋白质的量来确定LMWS蛋白质的存在或水平的降低。
在某些实施方案中，本文提供的方法从包含多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和酸性和/或碱性变体的组合物中去除或降低酸性和/或碱性变体的水平。抗体(例如多特异性抗体，例如双特异性抗体)的酸性变体是其中抗体的pI小于天然完整抗体的pI的变体。抗体(例如多特异性抗体，例如双特异性抗体)的碱性变体是其中抗体的pI大于天然完整抗体的pI的变体。此类电荷变体(例如，酸性和碱性变体)可以是天然过程的结果，例如氧化、脱酰胺、赖氨酸残基的C-末端加工、N-末端焦谷氨酸形成和抗体的糖化。测量电荷变体的方法是本领域已知的；例如，成像毛细管等点聚焦(iCIEF)。在本文所述任何方法的某些实施方案中，从一个或多个纯化步骤中回收的组合物(例如层析级分)中的带电变体的量减少超过约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或99％中的任何一种，包括这些值之间的任何范围。在某些实施方案中，从一个或多个纯化步骤回收的组合物(例如层析级分)中的带电变体的量减少约10％和95％；10％和99％；20％和95％；20％和99％；30％和95％；30％和99％；40％和95％；40％和99％；50％和95％；50％和99％；60％和95％；60％和99％；70％和95％；70％和99％；80％和95％；80％和99％；90％和95％；或90％和99％中的任何一种之间。在一些实施方案中，组合物(例如层析级分)中的带电变体的量减少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或95％中的任何一种。在某些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物(例如层析级分)中的带电变体的量与在纯化步骤之前组合物中带电变体的量来确定带电变体的存在或水平的降低。
在本文所述任何方法的某些实施方案中，杂质是方法特异性杂质。例如，方法特异性杂质可包括以下中的一种或多种：浸出的蛋白A；宿主细胞材料；核酸；其他多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基组分，羧肽酶B，庆大霉素等。在某些实施方案中，方法特异性杂质可以是来自例如原核细胞，细菌细胞(例如大肠杆菌细胞)，昆虫细胞，真核细胞，真菌细胞，酵母细胞，禽细胞或哺乳动物细胞，例如CHO细胞的宿主细胞蛋白(HCP)。
在某些实施方案中，本文提供的方法从包含多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和浸出的蛋白A的组合物中去除或降低浸出的蛋白A的水平。浸出的蛋白A是从它所结合的固相分离或洗涤的蛋白A。例如，浸出的蛋白A可以从蛋白A层析柱中浸出。蛋白质A的量可以例如通过ELISA测量，如WO2011/150110中所述。在某些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物(例如层析级分)中的浸出蛋白A的量与在纯化步骤之前组合物中的浸出蛋白A的量来确定浸出蛋白A的存在或水平的降低。
在某些实施方案中，本文提供的方法从包含多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和HCP的组合物中去除或降低宿主细胞蛋白(HCP)的水平。HCP是来自产生多特异性抗体(例如双特异性抗体)的宿主细胞的蛋白质。在某些实施方案中，HCP蛋白质是来自原核细胞的蛋白质。在某些实施方案中，HCP是来自大肠杆菌细胞的蛋白质(即大肠杆菌蛋白质或ECP)。原核HCP(例如ECP)的实例包括但不限于原核分子伴侣，例如FkpA，DsbA和DsbC。在某些实施方案中，HCP是来自真核宿主细胞的蛋白质，例如本文其他地方描述的那些。在某些实施方案中，HCP是来自哺乳动物细胞的蛋白质，例如CHO细胞蛋白质(即中国仓鼠卵巢蛋白质或CHOP)。在某些实施方案中，通过酶联免疫吸附测定(“ELISA”)测量HCP(例如，ECP，FkpA，DsbA或DsbC，或例如CHOP)的量。例如，可以针对FkpA，DsbA或DsbC的超纯组合物产生抗体。在某些实施方案中，通过质谱法测定FkpA，DsbA和/或DsbC的量。在本文所述任何方法的一些实施方案中，HCP的量(例如，ECP，FkpA，DsbA或DsbC，或例如CHOP)。在本文所述任何方法的某些实施方案中，从一个或多个纯化步骤中回收的组合物(例如层析级分)中的HCP(例如，ECP，FkpA，DsbA或DsbC，或，例如CHOP)的量减少至小于约100ppm，75ppm，50ppm，25ppm，20ppm，10ppm，5ppm，2ppm或1ppm，包括这些值之间的任何范围。在一些实施方案中，组合物(例如层析级分)中HCP(例如，ECP，FkpA，DsbA或DsbC，或例如CHOP)的量减少至小于约100ppm，75ppm，50ppm，25ppm，20ppm，10ppm，5ppm，2ppm或1ppm，包括这些值之间的任何范围。在某些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物(例如层析级分)中的HCP的量与纯化步骤之前组合物中HCP的量来确定HCP(例如，ECP，FkpA，DsbA或DsbC，或例如CHOP)的存在或水平的降低。
在某些实施方案中，本文提供的方法从包含多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和核酸的组合物中去除或降低核酸(例如宿主细胞DNA和/或RNA)的水平。测量核酸(例如宿主细胞DNA和/或RNA)的方法是本领域已知的，并描述于例如WO2011/150110中。这些方法包括例如宿主细胞DNA或RNA的PCR。在本文所述任何方法的某些实施方案中，从一个或多个纯化步骤中回收的组合物(例如层析级分)中的核酸量减少超过约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或99％中的任何一种，包括这些值之间的任何范围。在某些实施方案中，从一个或多个纯化步骤中回收的组合物(例如层析级分)中的核酸量减少约10％和95％；10％和99％；20％和95％；20％和99％；30％和95％；30％和99％；40％和95％；40％和99％；50％和95％；50％和99％；60％和95％；60％和99％；70％和95％；70％和99％；80％和95％；80％和99％；90％和95％；或90％和99％中的任何一种之间。在一些实施方案中，组合物(例如层析级分)中核酸的量减少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或95％中的任何一种。在某些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物(例如层析级分)中的核酸量与在纯化步骤之前组合物中核酸的量来确定核酸的存在或水平的降低。
在某些实施方案中，本文提供的方法从包含多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和细胞培养基组分的组合物中去除或降低细胞培养基组分的水平。“细胞培养基组分”是指细胞培养基中存在的组分。在某些实施方案中，“细胞培养基”是指在表达多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或其臂的宿主细胞被收获时的细胞培养基。在某些实施方案中，细胞培养基组分是胰岛素或四环素。在某些实施方案中，通过ELISA测量胰岛素或四环素的量。在本文所述任何方法的某些实施方案中，从一个或多个纯化步骤中回收的组合物(例如层析级分)中的细胞培养基组分的量减少超过约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％中的任何一种，包括这些值之间的任何范围。
在某些实施方案中，从一个或多个纯化步骤中回收的组合物(例如层析级分)中的细胞培养基组分的量减少约10％和95％；10％和99％；20％和95％；20％和99％；30％和95％；30％和99％；40％和95％；40％和99％；50％和95％；50％和99％；60％和95％；60％和99％；70％和95％；70％和99％；80％和95％；80％和99％；90％和95％；或90％和99％中的任何一种之间。在一些实施方案中，组合物(例如层析级分)中细胞培养基组分的量减少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％中的任何一种。在某些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物(例如层析级分)中的细胞培养基组分的量与在纯化步骤之前组合物中的细胞培养基组分的量来确定细胞培养基组分的存在或水平的降低。
在某些实施方案中，本文提供了纯化包含第一臂和第二臂的双特异性抗体的方法，其中第一臂和第二臂分开产生，该方法包括：使第一臂和第二臂进行以结合和洗脱模式操作的层析捕获(例如，本文其他地方描述的捕获层析步骤中的任何一个或组合)以产生第一和第二捕获洗脱液；在足以产生包含多特异性抗体的组合物的条件下形成包含第一和第二捕获洗脱液的混合物，使包含多特异性抗体的组合物以结合和洗脱模式进行阴离子交换层析(例如，Q Fast Flow(QSFF)层析)以产生阴离子交换洗脱液，其中洗脱是梯度洗脱；将阴离子交换洗脱液以结合和洗脱模式进行阴离子交换混合模式层析(例如，CaptoTM Adhere层析)以产生第一混合模式洗脱液，其中洗脱是梯度洗脱；以及将第一混合模式洗脱液以结合和洗脱模式进行阳离子交换混合模式层析(例如，CaptoTM MMC层析)以产生第二混合模式洗脱液，其中洗脱是梯度洗脱，并收集包含双特异性抗体的级分，其中该方法相对于包含第一和第二臂的混合物减少了级分中的杂质量。
在某些实施方案中，本文提供了纯化包含第一臂和第二臂的双特异性抗体的方法，其中第一臂和第二臂分开产生，该方法包括：使第一臂和第二臂以结合和洗脱模式进行层析捕获(例如，本文其他地方描述的捕获层析步骤中的任何一个或组合)以产生第一和第二捕获洗脱液；在足以产生包含多特异性抗体的组合物的条件下形成包含第一和第二捕获洗脱液的混合物，使包含多特异性抗体的组合物以结合和洗脱模式进行阳离子交换混合模式层析(例如，CaptoTM MMC层析)以产生第一混合模式洗脱液；其中洗脱是pH和盐梯度洗脱，并使第一混合模式洗脱液以流穿模式进行阴离子交换混合模式层析(例如，CaptoTM Adhere层析)以产生第二混合模式洗脱液，并收集包含双特异性抗体的级分，其中该方法相对于包含第一和第二臂的混合物减少了级分中的杂质的量。
在某些实施方案中，本文提供了纯化包含第一臂和第二臂的双特异性抗体的方法，其中第一臂和第二臂分开产生，该方法包括：使第一臂和第二臂以结合和洗脱模式进行层析捕获(例如，本文其他地方描述的捕获层析步骤中的任何一个或组合)，以产生第一和第二捕获洗脱液；在足以产生包含多特异性抗体的组合物的条件下形成包含第一和第二捕获洗脱液的混合物，使包含多特异性抗体的组合物以结合和洗脱模式进行阴离子交换混合模式层析(例如，CaptoTM Adhere层析)，其中洗脱是梯度洗脱，以产生第一混合模式洗脱液；使第一混合模式洗脱液以结合和洗脱模式进行阳离子交换混合模式层析(例如，CaptoTMMMC层析)以产生第二混合模式洗脱液，其中洗脱是梯度洗脱，使第二混合模式洗脱液以流穿模式进行疏水性相互作用层析(例如，Hexyl-650C层析)产生疏水相互作用洗脱液；并且收集包含双特异性抗体的级分，其中该方法相对于包含第一和第二臂的混合物减少级分中的杂质的量。
在某些实施方案中，本文提供了纯化包含第一臂和第二臂的双特异性抗体(例如双特异性F(ab’)2)的方法，其中第一臂和第二臂分开产生，该方法包括：使第一臂以结合和洗脱模式进行捕获层析(例如本文其他地方所述的捕获层析步骤中的任何一个或组合)以产生第一捕获洗脱液；使第一捕获洗脱液以结合和洗脱模式进行阳离子交换混合模式层析(例如，CaptoTM MMC层析)，以产生第一混合模式洗脱液；使第二臂以结合和洗脱模式进行捕获层析(例如本文其他地方描述的捕获层析步骤中的任何一种或组合)以产生第二捕获洗脱液；在足以产生包含多特异性抗体的组合物的条件下形成包含第一混合模式洗脱液和第二捕获洗脱液的混合物，使包含多特异性抗体的组合物进行阴离子交换混合模式层析(例如，CaptoTM Adhere层析)以产生第二混合模式洗脱液；使第二混合模式洗脱液以结合和洗脱模式进行阳离子交换层析(例如50HS层析)，以产生阳离子交换洗脱液；使阳离子交换洗脱液以结合和洗脱模式进行后续的阳离子交换混合模式层析，以产生第三混合模式洗脱液；并且收集包含双特异性抗体的级分，其中该方法相对于包含第一和第二臂的混合物减少级分中的杂质的量。
在某些实施方案中，本文提供纯化双特异性抗体(例如双特异性F(ab’)2)的方法，所述双特异性抗体包含第一臂和第二臂，其中所述第一臂和第二臂分开产生，所述方法包括：使第一臂以结合和洗脱模式进行捕获层析(例如本文其他地方所述的捕获层析步骤中的任何一个或组合)以产生第一捕获洗脱液；使第一捕获洗脱液以结合和洗脱模式进行阳离子交换混合模式层析(例如，CaptoTM MMC层析)，以产生第一混合模式洗脱液；使第二臂以结合和洗脱模式进行捕获层析(例如本文其他地方描述的捕获层析步骤中的任何一种或组合)以产生第二捕获洗脱液；在足以产生包含多特异性抗体的组合物的条件下形成包含第一混合模式洗脱液和第二捕获洗脱液的混合物，使包含多特异性抗体的组合物进行阴离子交换混合模式层析(例如，CaptoTM Adhere层析)以产生第二混合模式洗脱液；然后使第二混合模式洗脱液以结合和洗脱模式进行后续阳离子交换混合模式层析(例如，CaptoTM MMC层析)，，以产生第三混合模式洗脱液；并且收集包含双特异性抗体的级分，其中该方法相对于包含第一和第二臂的混合物减少级分中的杂质的量。
在一些实施方案中，通过病毒过滤进一步纯化多特异性抗体(例如双特异性抗体)。病毒过滤是去除多肽纯化进料流中的病毒污染物。病毒过滤的实例包括例如超滤和微滤。在一些实施方案中，使用细小病毒过滤器纯化多肽。
在一些实施方案中，多特异性抗体在层析后浓缩(例如，在第二混合模式层析之后或在第二混合模式层析后进行的一个或多个层析步骤之后)。浓缩方法的实例是本领域已知的，包括但不限于例如超滤和渗滤(UFDF)。在一些实施方案中，通过第一超滤，渗滤和第二超滤浓缩多特异性抗体。在一些实施方案中，超滤和/或渗滤使用截止值小于约5kDal，10kDal，15kDal，20kDal或25kDal或30kDal中的任何一种的过滤器。在一些实施方案中，将第一超滤的渗余物渗滤到药物制剂中。
在一些实施方案中，浓缩后多特异性抗体的浓度为约10mg/mL，20mg/mL，30mg/mL，40mg/mL，50mg/mL，60mg/mL，70mg/mL，80mg/mL，90mg/mL，100mg/mL，110mg/mL，120mg/mL，130mg/mL，140mg/mL，150mg/mL，160mg/mL，170mg/mL，180mg/mL，190mg/mL，200mg/mL或300mg/mL中的任何一种。在一些实施方案中，多特异性抗体的浓度在约10mg/mL和20mg/mL，20mg/mL和30mg/mL，30mg/mL和40mg/mL，40mg/mL和50mg/mL，50mg/mL和60mg/mL，60mg/mL和70mg/mL，70mg/mL和80mg/mL，80mg/mL和90mg/mL，90mg/mL和100mg/mL，100mg/mL和110mg/mL，110mg/mL和120mg/mL，120mg/mL和130mg/mL，130mg/mL和140mg/mL，140mg/mL和150mg/mL mg/mL，150mg/mL和160mg/mL，160mg/mL和170mg/mL，170mg/mL和180mg/mL，180mg/mL和190mg/mL，190mg/mL和200mg/mL，200mg/mL或300mg/mL中的任何一种之间。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法还包括将纯化方法的纯化多肽与药学上可接受的载体组合。在一些实施方案中，通过超滤/渗滤将多特异性抗体配制成药物制剂。
在某些实施方案中，本文提供的方法产生包含多特异性抗体的组合物，所述多特异性抗体纯度大于约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％中的任何一种。在某些实施方案中，组合物中的多特异性抗体纯度大于约96％，97％，98％或99％中的任何一种。
在某些实施方案中，本文提供的方法产生包含多特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％，5％，5.5％，6％，6.5％，7％，7.5％，8％，8.5％，9％，9.5％或10％中的任何一种未配对的抗体臂。在某些实施方案中，本文提供的方法产生包含多特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％，5％，5.5％，6％，6.5％，7％，7.5％，8％，8.5％，9％，9.5％，或10％中的任何一种同二聚体。在某些实施方案中，本文提供的方法产生包含多特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％或5％中的任何一种聚集的蛋白。在某些实施方案中，本文提供的方法产生包含多特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1％，0.5％，1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％或35％中的任何一种HMWS。在某些实施方案中，本文提供的方法产生包含多特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％，5％，5.5％，6％，6.5％，7％，7.5％，8％，8.5％，9％，9.5％或10％中的任何一种LMWS。在某些实施方案中，本文提供的方法产生包含多特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％，5％，5.5％，6％，6.5％，7％，7.5％，8％，8.5％，9％，9.5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或50％中的任何一种的酸性变体。在某些实施方案中，本文提供的方法产生包含多特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1％，0.5％，1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％或35％中的任何一种碱性变体。在某些实施方案中，本文提供的方法产生包含多特异性抗体的组合物，其含有不超过约0.1ppm，0.2ppm，0.3ppm，0.4ppm，0.5ppm，0.6ppm，0.7ppm，0.8ppm，0.9ppm，1ppm，1.5ppm，2ppm，2.5ppm，3ppm，3.5ppm，4ppm，4.5ppm，5ppm，5.5ppm，6ppm，6.5ppm，7ppm，7.5ppm，8ppm，8.5ppm，9ppm，9.5ppm，或10ppm的任何一种浸出的蛋白A。在某些实施方案中，本文提供的方法产生包含多特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1ppm，0.2ppm，0.3ppm，0.4ppm，0.5ppm，0.6ppm，0.7ppm，0.8ppm，0.9ppm，1ppm，1.5ppm，2ppm，2.5ppm，3ppm，3.5ppm，4ppm，4.5ppm，5ppm，5.5ppm，6ppm，6.5ppm，7ppm，7.5ppm，8ppm，8.5ppm，9ppm，9.5ppm，10ppm，15ppm，20ppm，25ppm，30ppm或35ppm中的任何一种HCP。在某些实施方案中，本文提供的方法产生包含多特异性抗体的组合物，其含有小于约2ppm，2.5ppm，3ppm，3.5ppm，4ppm，4.5ppm，5ppm，5.5ppm，6ppm，6.5ppm，7ppm，7.5ppm，8ppm，8.5ppm，9ppm，9.5ppm或10ppm中的任何一种核酸。在某些实施方案中，包含多特异性抗体的组合物包含不超过0ppm的核酸。在某些实施方案中，包含多特异性抗体的组合物中的核酸低于检测水平。在某些实施方案中，本文提供的方法产生包含多特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1％，0.5％，1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％或35％中的任何一种细胞培养基组分。
在某些实施方案中，提供了包含根据本文所述任一方法纯化的多特异性抗体的组合物。
在某些实施方案中，组合物中的多特异性抗体超过约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％纯度中的任何一种。在某些实施方案中，组合物中的多特异性抗体纯度大于约96％，97％，98％或99％中的任何一种。
在某些实施方案中，包含多特异性抗体的组合物含有不超过约0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％，5％，5.5％，6％，6.5％，7％，7.5％，8％，8.5％，9％，9.5％，或10％的任何一种未配对抗体臂。在某些实施方案中，包含多特异性抗体的组合物含有不超过约0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％，5％，5.5％，6％，6.5％，7％，7.5％，8％，8.5％，9％，9.5％或10％的任何一种同二聚体。在某些实施方案中，包含多特异性抗体的组合物含有不超过约0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％或5％的任何一种聚集的蛋白。在某些实施方案中，包含多特异性抗体的组合物含有不超过约0.1％，0.5％，1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％或35％的任何一种HMWS。在某些实施方案中，包含多特异性抗体的组合物含有不超过约0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％，5％，5.5％，6％，6.5％，7％，7.5％，8％，8.5％，9％，9.5％或10％的任何一种LMWS。在某些实施方案中，包含多特异性抗体的组合物含有不超过约0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％，5％，5.5％，6％，6.5％，7％，7.5％，8％，8.5％，9％，9.5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或50％的任何一种酸性变体。在某些实施方案中，包含多特异性抗体的组合物含有不超过约0.1％，0.5％，1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％或35％的任何一种碱性变体。在某些实施方案中，包含多特异性抗体的组合物含有不超过约0.1ppm，0.2ppm，0.3ppm，0.4ppm，0.5ppm，0.6ppm，0.7ppm，0.8ppm，0.9ppm，1ppm，1.5ppm，2ppm，2.5ppm，3ppm，3.5ppm，4ppm，4.5ppm，5ppm，5.5ppm，6ppm，6.5ppm，7ppm，7.5ppm，8ppm，8.5ppm，9ppm，9.5ppm或10ppm中的任何一种浸出蛋白A。在某些实施方案中，包含多特异性抗体的组合物含有不超过约0.1ppm，0.2ppm，0.3ppm，0.4ppm，0.5ppm，0.6ppm，0.7ppm，0.8ppm，0.9ppm，1ppm，1.5ppm，2ppm，2.5ppm，3ppm，3.5ppm，4ppm，4.5ppm，5ppm，5.5ppm，6ppm，6.5ppm，7ppm，7.5ppm，8ppm，8.5ppm，9ppm，9.5ppm，10ppm，15ppm，20ppm，25ppm，30ppm或35ppm中的任何一种HCP。在某些实施方案中，包含多特异性抗体的组合物含有不超过约0.1ppm，0.2ppm，0.3ppm，0.4ppm，0.5ppm，0.6ppm，0.7ppm，0.8ppm，0.9ppm，1ppm，1.5ppm，2ppm，2.5ppm，3ppm，3.5ppm，4ppm，4.5ppm，5ppm，5.5ppm，6ppm，6.5ppm，7ppm，7.5ppm，8ppm，8.5ppm，9ppm，9.5ppm，10ppm，15ppm，20ppm，25ppm，30ppm或35ppm中的任何一种核酸。在某些实施方案中，包含多特异性抗体的组合物含有不超过约0.1％，0.5％，1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％或35％的任何一种的细胞培养基组分。
在一些实施方案中，提供了包含多特异性抗体的组合物，其中所述组合物包含：a)至少约95％-100％的多特异性抗体；b)小于约1％-5％的未配对抗体臂；c)小于约1％-5％的抗体同二聚体；d)不超过约1％或2％的HMWS；e)不超过约1％或2％的LMWS；和/或f)不超过约5％的3/4抗体。
在某些实施方案中，提供了包含根据本文所述任一方法纯化的双特异性抗体的组合物。在某些实施方案中，双特异性抗体是旋钮入孔(KiH)抗体，例如KiH双特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体是CrossMab双特异性抗体。
在某些实施方案中，提供了包含双特异性抗体的组合物，所述双特异性抗体纯度大于约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％中的任何一种。在某些实施方案中，组合物中的双特异性抗体纯度大于约96％，97％，98％或99％中的任何一种。在某些实施方案中，双特异性抗体是旋钮入孔(KiH)抗体，例如KiH双特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体是CrossMab双特异性抗体。
在某些实施方案中，提供了包含双特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％，5％，5.5％，6％，6.5％，7％，7.5％，8％，8.5％，9％，9.5％或10％中的任何一种未配对的抗体臂。在某些实施方案中，提供了包含双特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％，5％，5.5％，6％，6.5％，7％，7.5％，8％，8.5％，9％，9.5％，或10％的任何一种同二聚体。在某些实施方案中，提供了包含双特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％或5％的任何一种的聚集蛋白。在某些实施方案中，提供了包含双特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1％，0.5％，1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％或35％中的任何一种的HMWS。在某些实施方案中，提供了包含双特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％，5％，5.5％，6％，6.5％，7％，7.5％，8％，8.5％，9％，9.5％，或10％中的任何一种的LMWS。在某些实施方案中，提供了包含双特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％，5％，5.5％，6％，6.5％，7％，7.5％，8％，8.5％，9％，9.5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或50％的任何一种酸性变体。在某些实施方案中，提供了包含双特异性抗体的组合物，其含有不超过约0.1％，0.5％，1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％或35％中的任何一种的碱性变体。在某些实施方案中，提供了包含双特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1ppm，0.2ppm，0.3ppm，0.4ppm，0.5ppm，0.6ppm，0.7ppm，0.8ppm，0.9ppm，1ppm，1.5ppm，2ppm，2.5ppm，3ppm，3.5ppm，4ppm，4.5ppm，5ppm，5.5ppm，6ppm，6.5ppm，7ppm，7.5ppm，8ppm，8.5ppm，9ppm，9.5ppm或10ppm中的任何一种的浸出的蛋白A。在某些实施方案中，提供了包含双特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1ppm，0.2ppm，0.3ppm，0.4ppm，0.5ppm，0.6ppm，0.7ppm，0.8ppm，0.9ppm，1ppm，1.5ppm，2ppm，2.5ppm，3ppm，3.5ppm，4ppm，4.5ppm，5ppm，5.5ppm，6ppm，6.5ppm，7ppm，7.5ppm，8ppm，8.5ppm，9ppm，9.5ppm，10ppm，15ppm，20ppm，25ppm，30ppm或35ppm中的任何一种的HCP。在某些实施方案中，提供了包含双特异性抗体的组合物，所述组合物含有小于约2ppm，2.5ppm，3ppm，3.5ppm，4ppm，4.5ppm，5ppm，5.5ppm，6ppm，6.5ppm，7ppm，7.5ppm，8ppm，8.5ppm，9ppm，9.5ppm或10ppm的任何一种核酸。在某些实施方案中，包含双特异性抗体的组合物包含不超过0ppm的核酸。在某些实施方案中，包含双特异性抗体的组合物中的核酸低于检测水平。在某些实施方案中，提供了包含双特异性抗体的组合物，所述组合物含有不超过约0.1％，0.5％，1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％或35％中的任何一种细胞培养基组分。在某些实施方案中，双特异性抗体是旋钮入孔(KiH)抗体，例如KiH双特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体是CrossMab双特异性抗体。
在一些实施方案中，提供了包含双特异性抗体的组合物，其中所述组合物包含：a)至少约95％-100％的双特异性抗体；b)小于约1％-5％的未配对抗体臂；c)小于约1％-5％的抗体同二聚体；d)不超过约1％或2％的HMWS；e)不超过约1％或2％的LMWS；和/或f)不超过约5％的3/4抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体是旋钮入孔(KiH)抗体，例如KiH双特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体是CrossMab双特异性抗体。
本文报道的一个方面是用多步层析方法纯化含有Fc区的异二聚体蛋白质/多肽的方法，其中该方法包括亲和层析步骤，然后是两个不同的多模式离子交换层析步骤，从而纯化含有Fc区的异二聚体蛋白质/多肽。
在某些实施方案中，该方法包括i.亲和层析步骤，然后是多模式阴离子交换层析步骤，然后是多模式阳离子交换层析步骤或ii.亲和层析步骤，然后是多模式阳离子交换层析步骤，然后是多模式阴离子交换层析步骤。
本文报道的一个方面是用于产生含有Fc区的异二聚体蛋白/多肽的方法，其包括步骤i.培养包含编码含有Fc-区的异二聚体蛋白/多肽的核酸的细胞，ii.从细胞或培养基中回收含有Fc-区的异二聚体蛋白质/多肽，iii.用本文报道的方法纯化含有Fc-区的异二聚体蛋白/多肽，从而产生含有Fc区的异二聚体蛋白。已经发现抗体纯化过程的性能取决于所采用的层析步骤的顺序。通过选择层析步骤的特定顺序/次序，可以获得改进的方法。
本文提供的方法至少部分基于以下发现：通过在(初始)亲和层析步骤之后和多模式阳离子交换层析步骤之前(直接)进行多模式阴离子交换层析步骤，可以省略超滤/渗滤步骤。如果在多模式阴离子交换层析步骤之前进行多模式阳离子交换层析步骤，则该步骤是必需的。
在某些实施方案中，多步层析包括亲和层析步骤，然后是多模式阴离子交换层析步骤，然后是多模式阳离子交换层析步骤。
已经发现，使用本文所述的方法，仅用三个层析步骤就可以获得良好的纯度和产率。
在某些实施方案中，多步层析方法包括正好三个层析步骤。
已经发现，如果多模式阴离子交换层析/步骤以流穿模式进行，则可以改善宿主细胞蛋白质的去除。在某些实施方案中，以流穿模式进行多模式阴离子交换层析方法/步骤。
已经发现，多模式阴离子交换层析步骤的负载的pH影响HCP，副产物和DNA去除。在所有方面的一个优选实施方案中，多模式阴离子交换层析步骤在约7.0的pH下进行。
表1
溶液的电导率可能在纯化过程中对不同参数产生影响。这里已经发现，多模式阴离子交换层析步骤的负载(即，包含待施加到层析材料的含有Fc-区的异二聚体多肽的溶液)中的低电导率值导致改善的HCP和DNA去除。
表2
在多模式阴离子交换层析步骤的某些实施方案中，将含有Fc区的异二聚体多肽应用于电导率值小于7mS/cm的溶液中。在多模式阴离子交换层析步骤的某些实施方案中，将含有Fc-区的异二聚体多肽应用于电导率值小于6mS/cm的溶液中。在多模式阴离子交换层析步骤的某些实施方案中，将含有Fc-区的异二聚体多肽应用于电导率值在约6mS/cm至约2mS/cm范围的溶液中。在多模式阴离子交换层析步骤的某些实施方案中，将含Fc区的异二聚体多肽应用于电导率值在约5mS/cm至约4mS/cm范围的溶液中。在多模式阴离子交换层析步骤的某些实施方案中，将含有Fc-区的异二聚体多肽应用于电导率值为约4.5mS/cm的溶液中。
在多模式阴离子交换层析步骤的某些实施方案中，将含有Fc-区的异二聚体多肽应用于电导率为约4.5mS/cm且pH为约7的溶液中。
本文提供的方法至少部分基于以下发现：多模式阴离子交换层析步骤的蛋白质负载量也影响纯化过程的性能。如果负载在规定的范围内，则整个纯化过程得到改善，例如，去除DNA污染。
表3：DNA的起始量：80pg/mg
在多模式阴离子交换层析步骤的某些实施方案中，含有Fc-区的异二聚体多肽以每升层析材料约100g至约300g的范围施用，即负载在约100g/L至约300g/L的范围内。在多模式阴离子交换层析步骤的某些实施方案中，含有Fc-区的异二聚体多肽以每升层析材料约120g至约240g的范围施用。在多模式阴离子交换层析步骤的某些实施方案中，含有Fc-区的异二聚体多肽以每升层析材料约160g至约200g的范围施用。
已经发现，当应用于本文报道的方法时，某些多模式树脂材料特别有用。
在某些实施方案中，多模式阴离子交换层析材料是多模式强阴离子交换层析材料。在某些实施方案中，多模式阴离子交换层析材料具有高流动琼脂糖基质，多模式强阴离子交换剂作为配体，平均粒径为36-44μm，离子容量为0.08-0.11mmol Cl-/mL培养基。在某些实施方案中，多模式阴离子交换层析材料是“Capto adhere ImpRes”。
在某些实施方案中，多模式阳离子交换层析介质是多模式弱阳离子交换层析介质。在某些实施方案中，多模式阳离子交换层析介质具有高流速琼脂糖基质，多模式弱阳离子交换剂作为配体，平均粒径为36-44μm，离子容量为25-39μmol/mL。在某些实施方案中，多模式阳离子交换层析介质是“Capto MMC ImpRes”。
在某些实施方案中，多模式阳离子交换层析方法/步骤以结合和洗脱模式进行。
在某些实施方案中，亲和层析步骤是蛋白A层析步骤或蛋白G亲和层析或单链Fv配体亲和层析或使用KappaSelect层析材料的层析步骤或使用CaptureSelect层析材料的层析步骤或使用CaptureSelect FcXL层析材料的层析步骤。在某些实施方案中，亲和层析步骤是蛋白A层析步骤。在某些实施方案中，亲和层析步骤是CaptureSelectTM层析步骤。在某些实施方案中，亲和层析步骤是蛋白A层析步骤。
在某些实施方案中，含有Fc-区的异二聚体蛋白/多肽是抗体，双特异性抗体或Fc-融合蛋白。在某些实施方案中，含有Fc区的异二聚体蛋白/多肽是双特异性抗体。在某些实施方案中，含有Fc区的异二聚体蛋白/多肽是CrossMab。在某些实施方案中，含有Fc区的异二聚体蛋白/多肽是Fc-融合蛋白。在某些实施方案中，含有Fc区的异二聚体蛋白/多肽是双特异性抗体，其包含a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链；b)特异性结合第二抗原的全长抗体的修饰的重链和修饰轻链，其中恒定结构域CL和CH1彼此替换。
在某些实施方案中，双特异性抗体是结合ANG2和VEGF的双特异性抗体。在某些实施方案中，含有Fc区的异二聚体蛋白/多肽是结合ANG2和VEGF的CrossMab。在某些实施方案中，双特异性抗体是vanucizumab。
在某些实施方案中，双特异性抗体包含第一抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：1，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：2；和第二抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：3，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQID NO：4。在某些实施方案中，双特异性抗体包含具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的第一重链和具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的第二重链和具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的第一轻链和具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的第二轻链。在某些实施方案中，双特异性抗体包含第一抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：5，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：6；第二抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ IDNO：7，以及作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：8。在某些实施方案中，双特异性抗体包含具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的第一重链和具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的第二重链和具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的第一轻链和具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的第二轻链。SEQ ID NO：1-16的氨基酸序列提供于下表4中：
表4
在某些实施方案中，纯化的含有Fc-区的异二聚体多肽含有不超过约5％的3/4抗体。在某些实施方案中，纯化的含有Fc-区的异二聚体多肽含有不超过约4％的3/4抗体。在某些实施方案中，纯化的含有Fc-区的异二聚体多肽含有不超过约3％的3/4抗体。在某些实施方案中，纯化的含有Fc-区的异二聚体多肽含有不超过约2％的3/4抗体。在某些实施方案中，纯化的含有Fc-区的异二聚体多肽含有不超过约1％的3/4抗体。
本文报道的一个方面是用多步层析方法纯化与ANG2和VEGF结合的双特异性抗体的方法，其中该方法包括亲和层析步骤，然后是多模式阴离子交换层析步骤，然后是多模式阳离子交换层析步骤，从而纯化与ANG2和VEGF结合的双特异性抗体，其中与ANG2和VEGF结合的双特异性抗体包含第一抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：1，和作为轻链可变区(VL)的SEQ ID NO：2；和第二抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：3，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：4或包含第一抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：5，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ IDNO：6；和第二抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：7，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：8。
在一个实施方案中，结合ANG2和VEGF的双特异性抗体包含a)包含第一抗原结合位点的第一全长抗体的重链和轻链；和b)包含第二抗原结合位点的全长抗体的修饰重链和修饰轻链，其中恒定结构域CL和CH1彼此替换。
本文报道的一个方面是本文报道的方法用于纯化含Fc的异二聚体多肽的用途。
本文报道的一个方面是本文报道的方法用于减少含Fc的异二聚体多肽相关杂质的用途。
本文报道的一个方面是用本文报道的方法获得的含Fc的异二聚体多肽，其用于制备用于治疗癌症或眼病的药物。
本文报道的一个方面是使用本文报道的方法获得的含Fc的异二聚体多肽，其用于治疗癌症或眼病。
多肽
单克隆抗体
在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。单克隆抗体获自基本上同质的抗体群，即，除了在单克隆抗体的产生过程中产生的可能的变体外，包含在该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，此类变体通常以少量存在。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征不是离散的混合物或不是多克隆抗体。
例如，单克隆抗体可以使用Kohler等人，Nature 256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(美国专利号4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如本文所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物以引发产生或能够产生特异性结合用于免疫的多肽的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(AcademicPress，1986))。
将如此制备的杂交瘤细胞接种并生长在合适的培养基中，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质防止HGPRT缺陷细胞的生长。
在一些实施方案中，骨髓瘤细胞是有效融合的细胞，通过选择的抗体产生细胞支持稳定的高水平抗体产生，并且对诸如HAT培养基的培养基敏感。其中，在一些实施方案中，骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，例如衍生自可从Salk Institute Cell DistributionCenter，San Diego，California USA获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，和可从美国马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。人类骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基的针对抗原的单克隆抗体的产生。在一些实施方案中，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定法测定，例如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson等人的Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来确定。
在鉴定产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释程序亚克隆并通过标准方法培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice pp.59-103(Academic Press，1986))。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在体内作为动物的腹水肿瘤生长。
通过常规免疫球蛋白纯化方法，例如多肽A-Sepharose，羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析，亲和层析或离子交换层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体适当地与培养基、腹水或血清分离。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规方法(例如，通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)分离并测序。在一些实施方案中，杂交瘤细胞用作此类DNA的来源。分离后，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染入本来不产生免疫球蛋白多肽的宿主细胞，如大肠杆菌细胞，猿猴COS细胞，人胚肾(HEK)293细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等人，Curr.Immunol.5：256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs，130：151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可以使用McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库分离抗体或抗体片段。Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)描述了使用噬菌体文库分别分离鼠和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.21：2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。
还可以修饰DNA，例如，通过人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 81：6851(1984))，或通过非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接免疫球蛋白编码序列。
通常，这种非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域，或者它们取代抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生包含一个对于抗原具有特异性的抗原结合位点和对于另一个不同抗原具有特异性的抗原结合位点的嵌合二价抗体。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，抗体是IgA，IgD，IgE，IgG或IgM。在一些实施方案中，抗体是IgG单克隆抗体。
抗体片段
在一些实施方案中，抗体是抗体片段。已经开发了各种技术用于产生抗体片段。传统上，这些片段是通过蛋白水解消化完整抗体得到的(参见，例如，Morimoto等人，Journalof Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan等人，Science229：81(1985))。然而，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可以从上面讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌中回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab’)2片段。用于产生抗体片段的其他技术对于技术人员来说是显而易见的。在其他实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；和美国专利No.5,587,458。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如，如美国专利5,641,870中所述。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
在一些实施方案中，提供了本文所述抗体的片段。在一些实施方案中，抗体片段是抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段选自Fab片段，Fab'片段，F(ab’)2片段，scFv，Fv和双抗体。
多肽变体和修饰
在某些实施方案中，设想本文蛋白质的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善蛋白质的结合亲和力和/或其他生物学特性。蛋白质的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码蛋白质的核苷酸序列中，或通过肽合成来制备。此类修饰包括，例如，蛋白质氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以达到最终构建体，条件是最终构建体具有所需特征。
“多肽变体”意指多肽，例如，如本文所定义的活性多肽，其与多肽的全长天然序列具有至少约80％的氨基酸序列同一性，缺少信号肽的多肽序列，多肽的细胞外结构域，有或没有信号肽。此类多肽变体包括，例如，在全长天然氨基酸序列的N或C末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。通常，多肽变体将与全长天然序列多肽序列，缺少信号肽的多肽序列，有或没有信号肽的多肽的细胞外结构域具有至少约80％的氨基酸序列同一性，或者至少约85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％氨基酸序列同一性中的任何一种。任选地，与天然多肽序列相比，变体多肽将具有不超过一个保守氨基酸取代，或者与天然多肽序列相比不超过约2，3，4，5，6，7，8，9或10个保守氨基酸取代中的任何一种。
变体多肽可以在N-末端或C-末端截短，或者可以缺少内部残基，例如，当与全长天然多肽比较时。某些变体多肽可能缺少对所需生物活性不是必需的氨基酸残基。具有截短、缺失和插入的这些变体多肽可以通过许多常规技术中的任何一种制备。期望的变体多肽可以化学合成。另一种合适的技术涉及通过聚合酶链式反应(PCR)分离和扩增编码所需变体多肽的核酸片段。在PCR中的5'和3'引物处采用限定核酸片段的所需末端的寡核苷酸。优选地，变体多肽与本文公开的天然多肽共享至少一种生物学和/或免疫学活性。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端融合，长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-或C-末端与酶或多肽的融合，其增加抗体的血清半衰期。
例如，可能需要改善多肽的结合亲和力和/或其他生物学特性。通过将合适的核苷酸变化引入抗体核酸中或通过肽合成来制备多肽的氨基酸序列变体。此类修饰包括，例如，多肽氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。如果最终构建体具有所需特征，则进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终构建体。氨基酸变化也可以改变多肽(例如抗体)的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数量或位置。
可以通过比较多肽的序列与同源已知多肽分子的序列并最小化在同源性高的区域中进行的氨基酸序列变化的数量来确定可以插入、取代或缺失哪些氨基酸残基而不会不利地影响所需活性的指导。
用于鉴定作为诱变优选位置的多肽(例如抗体)的某些残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells，Science 244：1081-1085(1989)所述。在此，鉴定残基或靶残基组(例如带电残基，例如Arg，Asp，His，Lys和Glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)代替，以影响氨基酸与抗原的相互作用。那些证明对取代具有功能敏感性的氨基酸位置然后通过在取代位点或为取代位点引入进一步的或其他的变体来改进。因此，尽管预先确定了引入氨基酸序列变异的位点，但不需要预先确定突变本身的性质。例如，为了分析给定位点处突变的性能，在靶密码子或区域进行ala扫描或随机诱变，并筛选表达的抗体变体的所需活性。
另一类变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗体分子中至少有一个氨基酸残基被不同的残基取代。对于取代诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也考虑了FR改变。如果这样的取代导致生物活性的改变，则可以引入表5中称为“示例性取代”或者如下文参考氨基酸类别进一步描述的的更实质性变化，并筛选产物。
表5
通过选择在维持(a)取代区域中多肽骨架的结构，例如，片状或螺旋构象，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的主体方面的显著不同的取代来实现对多肽的生物学性质的实质性修饰。氨基酸可根据其侧链性质的相似性进行分组(A.L.Lehninger，Biochemistry第二版，pp.73-75，Worth Publishers，New York(1975))：
(1)非极性：Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Pro(P)，Phe(F)，Trp(W)，Met(M)
(2)不带电荷的极性：Gly(G)，Ser(S)，Thr(T)，Cys(C)，Tyr(Y)，Asn(N)，Gln(Q)
(3)酸性：Asp(D)，Glu(E)
(4)碱性：Lys(K)，Arg(R)，His(H)
或者，可以基于共同的侧链性质将天然存在的残基分成组：
(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性：Asp，Glu；
(4)碱性：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代将意味着这些类别之一的一个成员与另一类的交换。
与维持抗体正确构象有关的任何半胱氨酸残基也可被取代，如被丝氨酸取代，以提高该分子的氧化稳定性，并阻止异常交联。相反，可在多肽中添加半胱氨酸键以提高其稳定性(特别当抗体为抗体片段如FV片段时)。
取代变体的一个示例包括取代亲本抗体(例如，人源化抗体)的一或多个高变区残基。通常，所选用于进一步开发的变体相对于产生的其亲本抗体应具有改进的生物学活性。产生这种取代变体的一个方便方法涉及利用了噬菌体展示的亲和力成熟。简单地说，使几个高变区位点(如6-7个位点)突变以便在每一位点产生所有可能的氨基酸取代。这样产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，其为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合体。然后筛选噬菌体展示的变体是否具有本文所公开的生物学活性(如结合亲和力)。为了鉴定备选的高变区修饰位点，可通过丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合作出主要贡献的高变区残基。可选或此外，分析抗原-抗体复合体的晶体结构以鉴定抗体与靶标之间的接触点也较有利。这些接触残基及其邻近残基是根据本文所述技术进行取代的候选位点。一旦产生这样的变体，如本文所述对该组变体进行筛选，选出在一或多个相关测定中具有优势特性的抗体以便进一步开发。
多肽的另一种氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化模式。多肽可包含非氨基酸部分。例如，多肽可以是糖基化的。这种糖基化可以在多肽在宿主细胞或宿主生物体中表达期间天然发生，或者可以是由人为干预引起的故意修饰。改变是指缺失多肽中发现的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加多肽中不存在的一个或多个糖基化位点。
多肽的糖基化通常为N-连接或O-连接。N-连接指将碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链相连。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促相连的识别序列。因此，多肽中存在上述任一种三肽序列都可产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化指将N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附着于羟基氨基酸，主要是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸。
在多肽中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列，使其包含一或多个上述三肽序列(在N-连接糖基化位点的情况下)而常规实现。这种改变也可通过在原始的抗体序列中添加或取代一或多个丝氨酸或苏氨酸残基来实现(在O-连接糖基化位点的情况下)。
除去存在于多肽上的碳水化合物部分可以通过化学或酶促方法或通过编码作为糖基化靶标的氨基酸残基的密码子的突变取代来完成。可以通过使用多种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现多肽上碳水化合物部分的酶促切割。
其他修饰包括谷氨酰基和天冬酰胺酰基残基分别对相应的谷氨酰和天冬氨酰残基脱酰胺，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的γ-氨基的甲基化，N-末端胺的乙酰化和任何C-末端羧基的酰胺化。
嵌合多肽
可以以形成嵌合分子的方式修饰本文所述的多肽，所述嵌合分子包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的多肽。在一些实施方案中，嵌合分子包含多肽与标签多肽的融合体，所述标签多肽提供抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通常位于多肽的氨基或羧基末端。可以使用针对标签多肽的抗体检测这种表位标记形式的多肽的存在。此外，表位标签的提供使得能够使用抗标签抗体或结合表位标签的其他类型的亲和基质通过亲和纯化容易地纯化多肽。
多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，所述结合特异性之一是针对c-met，且另一种是针对任意其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合c-met的两个不同表位。双特异性抗体也可以用于将细胞毒性剂定位至表达c-met的细胞。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein和Cuello，Nature 305：537(1983)，WO93/08829,和Traunecker等人，EMBOJ.10：3655(1991))，和“旋钮-入-孔”工程改造(参见，例如，US专利号5,731,168)。也可以通过以下方式制备多特异性抗体：改造静电转向效应用于制备抗体Fc-异二聚体分子(WO2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980和Brennan等人，Science 229：81(1985)；使用亮氨酸拉链生产双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等人，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术以制备双特异性抗体片段(参见，例如，Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如，Gruber等人，J.Immunol.52:5368(1994))；以及制备三特异性抗体，如在例如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所述。
本文的抗体或片段还包括WO2009/080251，WO2009/080252，WO2009/080253，WO2009/080254，WO2010/112193，WO2010/115589，WO2010/136172，WO2010/145792和WO2010/145793中描述的多特异性抗体。
本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括“双作用Fab”或“双作用Fab”(DAF)，其包含结合第一表位(例如，第一抗原上)以及另一种不同的表位(例如，在第一抗原上或第二个不同的抗原上)的抗原结合位点(参见，例如，US 2008/0069820；Bostrom等人(2009)Science，5921，1610-1614)。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组产生是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello，Nature，305：537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，并且产物产率低。在1993年5月13日公开的WO 93/08829和Traunecker等人，EMBO J.，10：3655(1991)中公开了类似的方法。
根据不同且更优选的方法，将具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合体优选具有免疫球蛋白重链恒定结构域，其包含至少部分铰链，CH2和CH3区。优选具有第一重链恒定区(CH1)，其含有轻链结合所必需的位点，存在于至少一种融合体中。将编码免疫球蛋白重链融合体和免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA插入单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物中。当在构建中使用的三种多肽链的不等比例提供最佳产率时，这在调节实施方案中三种多肽片段的相互比例方面提供了很大的灵活性。然而，当以相等比例表达至少两条多肽链导致高产率或当比率没有特别重要时，可以将一条表达载体中的两条或所有三条多肽链的编码序列插入。
在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由在一个臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和在另一臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这种不对称结构有利于所需双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链组合的分离，因为仅在双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供了容易的分离方式。该方法在WO 94/04690中公开。关于产生双特异性抗体的进一步细节，参见，例如，Suresh等人，Methods in Enzymology，121：210(1986)。
旋钮入孔技术
根据另一种方法，可以改造一对抗体分子之间的界面以最大化从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比。优选的界面包含抗体恒定结构域的至少一部分CH3结构域。在该方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)(旋钮或突起)取代。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“腔”(孔)。这提供了一种用于增加异二聚体相对于其他不需要的终产物如同二聚体的产率的机制。本文进一步描述了旋钮和孔。
使用旋钮入孔作为产生多特异性抗体和/或单臂抗体和/或免疫粘附素的方法是本领域熟知的。参见1998年3月24日授权的转让给Genentech的美国专利号5,731,1680、2009年7月16日公开并转让给Amgen的PCT公开号WO2009089004和2009年7月16日公开并转让给Novo NordiskA/S的美国专利公开号20090182127。还参见Marvin和Zhu,ActaPharmacologica Sincia(2005)26(6):649-658和Kontermann(2005)Acta Pharacol.Sin.,26:1-9。本文提供简要讨论。
"突起"指至少一个氨基酸侧链，所述氨基酸侧链从第一多肽的界面伸出并且因此可布置在毗邻界面(即第二多肽的界面)的补偿性腔中，从而使异多聚体稳定化并且因而例如有利于异多聚体形成胜过同型多聚体形成。突起可以存在于原始界面中或可以合成地引入(例如通过改变编码该界面的核酸)。正常情况下，改变编码第一多肽的界面的核酸以编码突起。为了实现这个目的，将编码第一多肽的界面中至少一个“原始”氨基酸残基的核酸替换为编码具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的至少一个"输入"氨基酸残基的核酸。将可以理解可能存在多于一个原始残基和相应的输入残基。被替换的原始残基的数目上限是第一多肽的界面中残基的总数。下表中显示多种氨基残基的侧链体积：
表6氨基酸的特性
a氨基酸分子量扣减水的分子量。值来自Handbook of Chemistry and Physics,第43版，Cleveland,Chemical Rubber Publishing Co.,1961。
b值来自A.A.Zamyatnin，Prog.Biophys.Mol.Biol.24:107-123,1972。
c值来自C.Chothia，J.Mol.Biol.105:1-14，1975。可及表面区域在该参考文献的图6-20中定义。
用于形成突起的优选输入残基通常是天然存在的氨基酸残基并且优选地选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴和色氨酸(W)。最优选的是色氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，用于形成突起的原始残基具有小侧链体积，如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。用于形成突起的CH3结构域中的示例性氨基酸取代包括但不限于T366W取代。
"腔"指至少一个氨基酸侧链，所述氨基酸侧链从第二多肽的界面凹陷并且因此容纳第一多肽毗邻的界面上相应的突起。腔可以存在于原始界面中或可以合成地引入(例如通过改变编码该界面的核酸)。正常情况下，改变编码第二多肽的界面的核酸以编码腔。为了实现这个目的，将编码第二多肽的界面中至少一个“原始”氨基酸残基的核酸替换为编码具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的至少一个"输入"氨基酸残基的核酸。将可以理解可能存在多于一个原始残基和相应的输入残基。被替换的原始残基的数目上限是第二多肽的界面中残基的总数。上表2中显示多种氨基残基的侧链体积。用于形成腔的优选输入残基通常是天然存在的氨基酸残基并且优选地选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。最优选的是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。在一个实施方案中，用于形成腔的原始残基具有大侧链体积，如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。用于产生腔的CH3结构域中的示例性氨基酸取代包括但不限于T366S，L368A和Y407A取代。
"原始"氨基酸残基是由可以具有比原始残基更小或更大侧链体积的"输入"残基替换的氨基酸残基。输入氨基酸残基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸残基，但优选地是前者。"天然存在"的氨基酸残基是由遗传密码编码并在上表2中列出的那些残基。"非天然存在"的氨基酸残基意指不由遗传密码编码、但能够共价结合多肽链中相邻氨基酸残基的残基。非天然存在的氨基酸残基的例子是正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其他氨基酸残基类似物，例如，在Ellman等人，Meth.Enzym.202:301-336(1991)中描述的那些。为了产生这类非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等人Science 244:182(1989)和上文Ellman等人的方法。简而言之，这涉及用非天然存在的氨基酸残基化学活化激活阻抑tRNA，随后体外转录并翻译RNA。本文提供的方法涉及替换至少一个原始氨基酸残基，但是可以替换多于一个原始残基。正常情况下，不多于第一或第二多肽的界面中的总残基将包含替换的原始氨基酸残基。一般，用于替换的原始残基被"埋入"。"埋入"意指残基实质上是溶剂不可及的。通常，输入残基不是半胱氨酸以防止二硫键的可能氧化或错误配对。
突起"可布置"在腔中，这意指分别在第一多肽和第二多肽的界面上的突起和腔的空间位置和突起和腔的尺寸是这样的，使得突起可以在不明显扰动第一多肽和第二多肽在界面处正常缔合情况下位于腔中。由于突起如Tyr；Phe和Trp一般不从界面的轴垂直延伸并且具有优选的构象，所以突起与相应腔的对齐依赖于根据三维结构(如通过X射线结晶学或核磁共振(NMR)获得的那种)对突起/腔对建模。这可以使用本领域广泛接受的技术实现。
"原始或模板核酸"意指编码目的多肽的核酸，所述核酸可以被"改变"(即基因工程化或突变)以编码突起或腔。原始或起始核酸可以是天然存在的核酸或可以包含已经经受事先改变的核酸(例如人源化抗体片段)。"改变"核酸意指原始核酸因插入、缺失或替换至少一个编码目的氨基酸残基的密码子而突变。正常情况下，编码原始残基的密码子由编码输入残基的密码子替换。按照这种方式遗传修饰DNA的技术已经在Mutagenesis:aPractical Approach，M.J.McPherson编(IRL Press,Oxford,UK.(1991)中综述，并且例如包括位点定向诱变、盒诱变和聚合酶链反应(PCR)诱变。通过突变原始/模板核酸，原始/模板核酸编码的原始/模板多肽因此相应地被改变。
可以通过合成的手段，例如通过重组技术、体外肽合成法、用于引入前述非天然存在氨基酸残基的那些技术、通过肽的酶促或化学偶联或这些技术一些组合，将突起或腔“引入”第一或第二多肽的界面。因此，"引入"的突起或腔是"非天然存在的"或"非天然的"，这意指它在自然界中或在原始多肽中不存在(例如人源化单克隆抗体)。
通常，用于形成突起的输入氨基酸残基具有数目相对少(例如约3-6种)的"旋转异构体"。"旋转异构体"是氨基酸侧链的能量有利构象。各种氨基酸残基的旋转异构体的数目在Ponders和Richards，J.Mol.Biol.193:775-791(1987)中综述。
在一个实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽在界面处相遇/相互作用。在其中第一和第二Fc多肽在界面处相遇的一些实施方案中，第二Fc多肽(序列)的界面包含可定位在第一Fc多肽(序列)的界面中的腔中的突起(也称为“旋钮”)(也称为“孔”)。在一个实施方案中，第一Fc多肽已经从模板/原始多肽改变以编码腔或第二Fc多肽已经从模板/原始多肽改变以编码突起或两者。在一个实施方案中，第一Fc多肽已经从模板/原始多肽改变以编码腔，并且第二Fc多肽已经从模板/原始多肽改变以编码突起。在一个实施方案中，第二Fc多肽的界面包含突起，所述突起可定位在第一Fc多肽的界面中的腔中，其中腔或突起或两者已分别被引入第一和第二Fc多肽的界面中。在其中第一和第二Fc多肽在界面处相遇的一些实施方案中，第一Fc多肽(序列)的界面包含突起，所述突起可定位在第二Fc多肽(序列)的界面中的腔中。在一个实施方案中，第二Fc多肽已经从模板/原始多肽改变以编码腔，或者第一Fc多肽已经从模板/原始多肽改变以编码突起，或两者。在一个实施方案中，第二Fc多肽已经从模板/原始多肽改变以编码腔，并且第一Fc多肽已经从模板/原始多肽改变以编码突起。在一个实施方案中，第一Fc多肽的界面包含突起，所述突起可定位在第二Fc多肽的界面中的腔中，其中突起或腔或两者已分别被引入第一和第二Fc多肽的界面中。
在一个实施方案中，突起和腔各自包含天然存在的氨基酸残基。在一个实施方案中，通过用来自具有比原始残基更大的侧链体积的输入残基替换来自模板/原始多肽的界面的原始残基来产生包含突起的Fc多肽。在一个实施方案中，通过包括以下步骤的方法产生包含突起的Fc多肽：其中编码来自所述多肽界面的原始残基的多核苷酸被编码具有比原始的更大侧链体积的输入残基的多核苷酸替换。在一个实施方案中，原始残基是苏氨酸。在一个实施方案中，原始残基是T366。在一个实施方案中，输入残基是精氨酸(R)。在一个实施方案中，输入残基是苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，输入残基是酪氨酸(Y)。在一个实施方案中，输入残基是色氨酸(W)。在一个实施方案中，输入残基是R，F，Y或W。在一个实施方案中，通过替换模板/原始多肽中的两个或更多个残基产生突起。在一个实施方案中，包含突起的Fc多肽包括用色氨酸替换第366位的苏氨酸，氨基酸编号根据Kabat等的EU编号方案(pp.688-696，在Sequences of proteins of immunological interest，第5版，Vol.1(1991；NIH，Bethesda，MD))。
在一些实施方案中，通过用具有比原始残基更小的侧链体积的输入残基替换模板/原始多肽的界面中的原始残基来产生包含腔的Fc多肽。例如，包含腔的Fc多肽可以通过包括以下步骤的方法产生：其中编码来自所述多肽界面的原始残基的多核苷酸被编码具有比原始侧链体积小的输入残基的多核苷酸替换。在一个实施方案中，原始残基是苏氨酸。在一个实施方案中，原始残基是亮氨酸。在一个实施方案中，原始残基是酪氨酸。在一个实施方案中，输入残基不是半胱氨酸(C)。在一个实施方案中，输入残基是丙氨酸(A)。在一个实施方案中，输入残基是丝氨酸(S)。在一个实施方案中，输入残基是苏氨酸(T)。在一个实施方案中，输入残基是缬氨酸(V)。可以通过替换模板/原始多肽的一个或多个原始残基来产生腔。例如，在一个实施方案中，包含腔的Fc多肽包含两个或更多个选自苏氨酸，亮氨酸和酪氨酸的原始氨基酸的替换。在一个实施方案中，包含腔的Fc多肽包含两个或更多个选自丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和缬氨酸的输入残基。在一些实施方案中，包含腔的Fc多肽包含两个或更多个选自苏氨酸，亮氨酸和酪氨酸的原始氨基酸的替换，并且其中所述原始氨基酸被选自丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和缬氨酸的输入残基替换。在一些实施方案中，被替换的原始氨基酸是T366，L368和/或Y407。在一个实施方案中，包含腔的Fc多肽包括用丝氨酸替换第366位的苏氨酸，氨基酸根据上文Kabat等的EU编号方案编号。在一个实施方案中，包含腔的Fc多肽包括用丙氨酸取代368位的亮氨酸，氨基酸根据上文Kabat等的EU编号方案编号。在一个实施方案中，包含腔的Fc多肽包括用缬氨酸替换407位的酪氨酸，氨基酸根据上文Kabat等的EU编号方案编号。在一个实施方案中，包含腔的Fc多肽包含两个或更多个选自T366S，L368A和Y407V的氨基酸替换，氨基酸根据上文Kabat等的EU编号方案编号。在这些抗体片段的一些实施方案中，包含突起的Fc多肽包括用色氨酸替换第366位的苏氨酸，氨基酸根据上文Kabat等人的EU编号方案编号。
在一个实施方案中，抗体包含构成“旋钮”和“孔”的Fc突变，如WO2005/063816中所述。例如，孔突变可以是Fc多肽中的T366A，L368A和/或Y407V中的一种或多种，并且旋钮突变可以是IgG1或IgG4骨架中的T366W。本领域技术人员可以制备其他免疫球蛋白同种型中的等同突变。此外，技术人员将容易理解，用于双特异性的两种半抗体优选是相同的同种型。
CrossMab技术
Schaefer等人(Roche Diagnostics GmbH)描述了一种不使用人工接头，表达来自两种现有抗体的两个重链和两个轻链作为人二价双特异性IgG抗体的方法(PNAS(2011)108(27)：11187-11192和US 2009/0232811)。该方法涉及在一半双特异性抗体(CrossMab)的抗原结合片段(Fab)内交换一个或多个重链和轻链结构域。通过在一半双特异性抗体的抗原结合片段(Fab)内交换重链和轻链结构域，实现轻链及其同源重链的正确结合。这种“交叉”保留了抗原结合亲和力，但使得两个臂不同以至于不再发生轻链错配。参见WO2009/080251，WO2009/080252，WO2009/080253，WO2009/080254，WO2010/115589，WO2010/136172，WO2010/145792和WO2010/145793，各自通过引用整体并入本文。尽管最近有这些优点，例如由于开发了诸如“旋钮入孔(KiH)”或“CrossMab”技术的方法，多特异性抗体的表达可能仍然导致与其产生特异性相关的不期望的产物特异性杂质的形成。这些产物特异性杂质例如可以包括1/2抗体(包含单个重链/轻链对)，3/4抗体(包含缺少单个轻链的完整抗体)或5/4抗体副产物(包含额外的重链或轻链可变结构域)。
BiTE技术
用于双特异性T细胞衔接子(BiTE)分子的另一种形式(参见，例如，Wolf等人(2005)Drug Discovery Today 10：1237-1244))是基于单链可变片段(scFv)模块。scFv由经由柔性接头融合的抗体轻链和重链可变区组成，其通常可以适当地折叠并且使得所述区域可以结合同源抗原。BiTE在单链上串联连接两种不同特异性的scFv。该构型排除了具有相同重链可变区的两个拷贝的分子的产生。此外，接头构型旨在确保相应轻链和重链的正确配对。
其他双特异性抗体形式
Strop等人(Rinat-Pfizer Inc.)描述了通过分别表达和纯化两种目的抗体，然后在指定的氧化还原条件下将它们混合在一起来产生稳定的双特异性抗体的方法(J.Mol.Biol.(2012)420：204-19)。
可以将相比同二聚体强烈偏好形成异二聚体的其他异二聚化结构域掺入本发明的多特异性抗原结合蛋白中。说明性实例包括但不限于，例如，WO2007147901(等人-Novo Nordisk：描述离子相互作用)；WO2009089004(Kannan等人-Amgen：描述静电转向效应)；WO2010/034605(Christensen等人-Genentech；描述卷曲螺旋)。还参见，例如，Pack，P.&Plueckthun，A.，Biochemistry 31，1579-1584(1992)，其描述亮氨酸拉链或Pack等，Bio/Technology 11，1271-1277(1993)，其描述了螺旋-转角-螺旋基序。短语“异多聚化结构域”和“异二聚化结构域”在本文中可互换使用。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含一个或多个异二聚化结构域。
Zhu等人(Genentech)在双抗体构建体的VL/VH界面中具有工程突变，其由完全缺乏恒定结构域的变体结构域抗体片段组成，并产生异二聚体双抗体(Protein Science(1997)6：781-788)。同样，Igawa等人(Chugai)还在单链双抗体的VL/VH界面中设计突变以促进选择性表达并抑制双抗体的构象异构化(Protein Engineering，Design&Selection(2010)23：667-677)。
美国专利公开号2009/0182127(Novo Nordisk，Inc.)描述了通过修饰Fc-界面处和轻-重链对的CH1：CL界面处的氨基酸残基来生成双特异性抗体，其减少一对轻链与另一对重链相互作用的能力。
双特异性抗体包括交联或“异源缀合物”抗体。例如，异源缀合物中的一个抗体可以与抗生物素蛋白偶联，另一个与生物素偶联。例如，已提出此类抗体将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)，并用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373和EP 03089)。可以使用任何方便的交联方法制备异源缀合物抗体。合适的交联剂是本领域熟知的，并且在美国专利号4,676,980中公开，以及许多交联技术。
用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术也已在文献中描述。例如，可以使用化学连接制备双特异性抗体。Brennan等人，Science 229：81(1985)描述了一种方法，其中通过蛋白水解切割完整抗体以产生F(ab’)2片段。在二硫醇络合剂亚砷酸钠存在下还原这些片段以稳定邻位二硫醇并防止分子间二硫键形成。然后将产生的Fab'片段转化为硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将一种Fab'-TNB衍生物再转化为Fab'-硫醇，并与等摩尔量的其它Fab'-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作选择性固定化酶的试剂。
还描述了直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，使用亮氨酸拉链生产双特异性抗体。Kostelny等人，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后再氧化以形成抗体异二聚体。该方法也可用于生产抗体同二聚体。Hollinger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。片段包含通过接头连接至轻链可变结构域(V L)的重链可变结构域(VH)，所述接头太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对。因此，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(scFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994)。
Klein等人，(2012)mAbs 4：6，653-663中提供了各种双特异性和多特异性抗体形式的综述。Spiess等人(2015)“Alternative molecular formats and therapeuticapplications for bispecific antibodies.”Mol.Immunol.Published online January27,2015；doi:10.1016/j.molimm.2015.01.003；和Kontermann等人，(2015)DrugDiscovery Today 20,838-847。
多核苷酸，载体，宿主细胞和重组方法
可以使用本领域熟知的方法，包括重组方法，获得本文所述纯化方法中使用的多特异性抗体。以下部分提供有关这些方法的指导。
核苷酸
如本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。
编码多肽的多核苷酸可以从任何来源获得，包括但不限于从被认为具有多肽mRNA并以可检测的水平表达的组织制备的cDNA文库。因此，编码多肽的多核苷酸可以方便地从人组织制备的cDNA文库中获得。编码多肽的基因也可以从基因组文库中获得或通过已知的合成方法(例如，自动化核酸合成)获得。
例如，多核苷酸可以编码完整的免疫球蛋白分子链，例如轻链或重链。完整的重链不仅包括重链可变区(VH)，还包括重链恒定区(CH)，其通常包含三个恒定结构域：CH1，CH2和CH3；和“铰链”区域。在某些情况下，需要存在恒定区域。
可以由多核苷酸编码的其他多肽包括抗原结合抗体片段，例如单结构域抗体(“dAb”)，Fv，scFv，Fab'和F(ab’)2和“微抗体”。微抗体是(通常)切除CH1和CK或CL结构域的二价抗体片段。由于微型抗体比常规抗体小，它们应该在临床/诊断用途中实现更好的组织穿透，但是它们是二价的，它们应该保持比单价抗体片段(例如dAb)更高的结合亲和力。因此，除非上下文另有规定，否则本文所用的术语“抗体”不仅包括完整抗体分子，还包括上述类型的抗原结合抗体片段。优选地，编码多肽中存在的每个构架区相对于相应的人受体构架将包含至少一个氨基酸取代。因此，例如，相对于受体构架区，该构架区可总共包含三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸取代。
合适地，可以分离和/或纯化本文描述的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸是分离的多核苷酸。
术语“分离的多核苷酸”旨在表示分子被从其正常或自然环境中除去或分离，或者已经以其在其正常或自然环境中不存在的方式产生。在一些实施方案中，多核苷酸是纯化的多核苷酸。术语纯化的旨在表示至少一些污染分子或物质已被除去。
合适地，基本上纯化多核苷酸，使得相关的多核苷酸构成组合物中存在的优势(即，最丰富的)多核苷酸。
多核苷酸的表达
以下描述主要涉及通过培养用含有编码多肽的多核苷酸的载体转化或转染的细胞来产生多肽。当然，预期可以采用本领域熟知的替代方法来制备多肽。例如，合适的氨基酸序列或其部分可以通过使用固相技术的直接肽合成来产生(参见，例如，Stewart等人，Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco，CA)。(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154(1963))。可以使用手工技术或通过自动化进行体外蛋白质合成。例如，可以使用Applied Biosystems Peptide Synthesizer(FosterCity，CA)使用制造商的说明书完成自动化合成。多肽的各个部分可以分别化学合成，并使用化学或酶促方法组合以产生所需多肽。
将如本文所述的多核苷酸插入表达载体中以产生多肽。术语“控制序列”是指在特定宿主生物中表达有效连接的编码序列所必需的DNA序列。控制序列包括但不限于启动子(例如，天然结合的或异源启动子)，信号序列，增强子元件和转录终止序列。
当多核苷酸与另一多核苷酸序列处于功能关系时，它是“有效连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的核酸表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的核酸有效连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与编码序列有效连接；或者如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则它与编码序列有效连接。通常，“有效连接”意指连接的核酸序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的并且处于阅读阶段。但是，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点连接来完成连接。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
对于抗体，可以将轻链和重链克隆到相同或不同的表达载体中。编码免疫球蛋白链的核酸区段与表达载体中的控制序列有效连接，所述控制序列确保免疫球蛋白多肽的表达。
对于包含四种不同多肽链的CrossMab，使用四种表达盒。这些可以克隆到2-4种不同的表达载体中。编码免疫球蛋白链的每个核酸区段与表达载体中的控制序列有效连接，所述控制序列确保免疫球蛋白多肽的表达。如果两个或更多个表达盒包含在相同的表达载体上，则这些表达盒可以单向或双向组织。
可以通过众所周知的方法将含有多核苷酸序列的载体(例如，可变重链和/或可变轻链编码序列和任选的表达控制序列)转移到宿主细胞中，所述方法根据细胞宿主类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理，电穿孔，脂质转染，生物射弹或基于病毒的转染可用于其他细胞宿主。(通常参见Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，第二版，1989)。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺，原生质体融合，脂质体，电穿孔和显微注射。为了产生转基因动物，可以将转基因显微注射到受精卵母细胞中，或者可以将转基因掺入胚胎干细胞的基因组中，并将这些细胞的细胞核转移到去核卵母细胞中。
载体
术语“载体”包括表达载体和转化载体和穿梭载体。
术语“表达载体”意指能够体内或体外表达的构建体。
术语“转化载体”意指能够从一个实体转移到另一个实体的构建体-其可以是该物种的或可以是不同物种的。如果构建体能够从一个物种转移到另一个物种-例如从大肠杆菌质粒转移到例如芽孢杆菌属细菌，那么转化载体有时被称为“穿梭载体”。它甚至可以是能够从大肠杆菌质粒转移到农杆菌到植物的构建体。
可以如下所述将载体转化到合适的宿主细胞中以提供多肽的表达。各种载体可公开获得。载体可以是，例如，质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过各种方法将合适的核酸序列插入载体中。通常，使用本领域已知的技术将DNA插入合适的限制性内切核酸酶位点。含有一种或多种这些组分的合适载体的构建采用本领域技术人员已知的标准连接技术。
载体可以是例如提供有复制起点的质粒、病毒或噬菌体载体，任选地用于表达所述多核苷酸的启动子和任选的启动子调节子。载体可含有一种或多种本领域众所周知的选择标记基因。
这些表达载体通常可作为附加体或作为宿主染色体DNA的整体部分在宿主生物中复制。
对于多特异性抗体产生，通常分离编码多特异性抗体(或多特异性抗体的臂，即重链/轻链对)的核酸并插入可复制的载体中用于进一步克隆、扩增和/或表达。编码抗体的DNA易于使用常规方法分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。很多载体是可使用的。载体的选择部分取决于要使用的宿主细胞。应当理解，任何同种型的恒定区可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且这种恒定区可以从任何人或动物物种获得。
宿主细胞
例如，宿主细胞可以是细菌、酵母或其他真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
经遗传操作的转基因多细胞宿主生物可用于产生多肽。生物体可以是例如转基因哺乳动物生物体(例如，转基因山羊或小鼠品系)。
合适的原核生物包括但不限于真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科，例如大肠杆菌。各种大肠杆菌菌株是公众可获得的，例如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)和K5772(ATCC 53,635)。其他合适的原核宿主细胞包括肠杆菌科，例如埃希氏菌属，例如大肠杆菌，肠杆菌(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属，例如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(例如地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属例如酿脓假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属。这些实例是说明性的而非限制性的。菌株W3110是一种特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是用于重组多核苷酸产物发酵的常见宿主菌株。优选地，宿主细胞分泌最少量的蛋白水解酶。例如，可以修饰菌株W3110以在编码宿主内源多肽的基因中实现基因突变，这些宿主的实例包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整的基因型tonA；大肠杆菌W3110菌株9E4，其具有完整的基因型tonA ptr3；大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC 55,244)，其具有完整的基因型tonA ptr3phoAE15(argF-lac)169degP ompT kan'；大肠杆菌W3110菌株37D6，其具有完整的基因型tonAptr3phoA E15(argF-lac)169degP ompT rbs7ilvG kan'；大肠杆菌W3110菌株40B4，其是菌株37D6，具有非卡那霉素抗性degP缺失突变；和具有突变周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。或者，体外克隆方法，例如PCR或其他核酸聚合酶反应是合适的。在一些实施方案中，原核宿主细胞(例如，大肠杆菌宿主细胞)表达一种或多种分子伴侣以促进抗体的折叠和组装。在一些实施方案中，分子伴侣是FkpA、DsbA或DsbC中的一种或多种。在一些实施方案中，分子伴侣由内源分子伴侣基因表达。在一些实施方案中，分子伴侣由外源分子伴侣基因表达。在一些实施方案中，分子伴侣基因是大肠杆菌分子伴侣基因(例如，大肠杆菌FkpA基因、大肠杆菌DsbA基因和/或大肠杆菌DsbC基因)。
在这些原核宿主中，可以制备表达载体，其通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。此外，将存在任何数量的各种公知的启动子，例如乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统，β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常将控制表达，任选地利用操纵基因序列，并具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。
真核微生物可用于表达。真核微生物如丝状真菌或酵母是用于编码多肽的载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母(Kluyveromyces)宿主，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis，MW98-8C，CBS683，CBS4574)，脆弱克鲁维酵母(K.fragilis，ATCC 12,424)，保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus,ATCC 16,045)，K.wickeramii(ATCC 24,178)，K.waltii(ATCC 56,500)，K.drosophilarum(ATCC 36,906)，K.thermotolerans和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia,EP402,226)；巴斯德毕赤酵母；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如Schwanniomycesoccidentalis；和丝状真菌，例如，脉孢菌属(Neurospora)，青霉属(Penicillium)，弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，例如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。甲基营养型酵母在本文中是合适的，并且包括但不限于能够在甲醇上生长的酵母，选自由汉逊酵母属(Hansenula)，假丝酵母属(Candida)，克洛克氏酵母属(Kloeckera)，毕赤酵母属，酵母属(Saccharomyces)，球拟酵母属(Torulopsis)和红酵母属(Rhodotorula)组成的属。酵母属是优选的酵母宿主，具有合适的载体，其按需要具有表达控制序列(例如，启动子)，复制起点，终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
除微生物外，哺乳动物组织细胞培养物也可用于表达和产生如本文所述的多肽，并且在一些情况下是优选的(参见Winnacker，From Genes to Clones VCH Publishers，NY，NY(1987)。在一些实施方案中，真核细胞可以是优选的，因为本领域已经开发了许多能够分泌异源多肽的合适的宿主细胞系(例如，完整的免疫球蛋白)，并且包括CHO细胞系，各种Cos细胞系，HeLa细胞，优选，骨髓瘤细胞系或转化的B细胞或杂交瘤。在一些实施方案中，哺乳动物宿主细胞是CHO细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞是脊椎动物宿主细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(亚克隆以在悬浮培养中生长的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO或CHO-DP-12系)；小鼠支持细胞；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。
使用原核宿主细胞生产多特异性抗体
载体构建
编码根据本文提供的方法的待纯化的多特异性抗体的多肽组分的多核苷酸序列可用标准重组技术获得。所需的多核苷酸序列可从生产抗体的细胞例如杂交瘤细胞分离并测序。备选地，多核苷酸可用核苷酸合成仪或PCR技术合成。一旦获得，编码多肽的序列(例如两个或更多个重链和/或两个或更多个轻链)被插入能在宿主细胞(例如大肠杆菌细胞)内复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。许多可获得并为本领域所知悉的载体可用于本文提供的方法和组合物的目的。适当的载体的选择将主要取决于要插入载体中的核酸的大小和要用载体转化的特定宿主细胞。根据其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者皆有)及其与所处的特定宿主细胞的相容性，每个载体包含多个组分。载体组分通常包括但不限于：复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段和转录终止序列。
通常，含有源自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与此类宿主共同使用。载体通常携带复制位点和标记序列，所述标记序列能在转化的细胞中提供性状选择。例如，大肠杆菌通常用源自大肠杆菌物种的质粒PBR322转化。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，并因此提供了鉴定转化的细胞的简便方法。PBR322、其衍生物或其他微生物质粒或噬菌体也可包含或被修饰以包含可被微生物用于表达内源蛋白的启动子。用于表达特定抗体的PBR322衍生物的实例在Carter等人，美国专利号5,648,237中详述。
此外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可用做此类宿主的转化载体。例如，细菌噬菌体诸如GEMTM-11可用于制备可用于转化易感宿主细胞例如大肠杆菌LE392的重组载体。
表达载体可包含两个或更多启动子-顺反子对，编码每个多肽组分。启动子是位于顺反子上游(5’)、调节其表达的非翻译调控序列。原核启动子通常分为两类：诱导型和组成型。诱导型启动子是这样的启动子，其响应培养条件的改变，例如营养物质的存在与否或温度的改变，起始其控制之下的顺反子的增加水平的转录。
众所周知被多种潜在的宿主细胞识别的大量启动子。可通过限制性酶消化从来源DNA移出DNA，并将分离的启动子序列插入载体中，将选择的启动子有效连接于编码轻链或重链的顺反子DNA。天然启动子序列和许多异源启动子均可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常允许表达的靶基因的更多的转录和更高的产量。
适于原核宿主使用的启动子包括PhoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子例如tac或trc启动子。然而，其他在细菌中有功能的启动子(例如其他已知的细菌或噬菌体启动子)也是适合的。它们的核苷酸序列已被公布，从而允许本领域技术人员将其有效连接到编码靶轻链和重链的顺反子(Siebenlist等人，(1980)Cell 20:269)，使用接头或衔接子以提供任何需要的限制酶位点。
翻译起始区(TIR)是蛋白质总翻译水平的主要决定因素。TIR包括编码信号序列的多核苷酸，并且从Shine-Dalgarno序列的紧邻上游延伸至起始密码子下游的约20个核苷酸。通常，载体将包含TIR，TIR和变体TIR是本领域已知的，并且用于产生TIR的方法是本领域已知的。可以产生具有一系列翻译强度的一系列核酸序列变体，从而提供方便的用于调节该因子以最佳分泌许多不同多肽的的方式。使用与这些变体融合的报告基因，例如PhoA，提供了量化不同翻译起始区的相对翻译强度的方法。变体或突变体TIR可以在质粒载体的背景中提供，从而提供一组质粒，向该质粒中可以插入目的基因并测量其表达，从而建立最佳的翻译强度范围以最大地表达成熟多肽。变体TIR在USP8,241,901中公开。
在一方面，重组载体内的每个顺反子包含指导表达的多肽跨膜易位的分泌信号序列组分。通常，信号序列可以是载体的组分，或其可以是插入载体中的靶多肽DNA的部分。选择的信号序列应是被宿主细胞识别和处理(即被信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和处理异源多肽天然信号序列的原核宿主细胞，信号序列被原核信号序列取代。此类序列在本领域中是熟知的。另外，载体可包含选自碱性磷酸酶，青霉素酶，Lpp或热稳定肠毒素II(STII)前导序列，LamB，PhoE，PelB，OmpA和MBP的信号序列。
在一个方面，一种或多种多核苷酸(例如，表达载体)共同编码抗体。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码抗体的轻链，并且单独的多核苷酸编码抗体的重链。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码抗体的轻链和重链。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸(例如，表达载体)共同编码单臂抗体。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码(a)单臂抗体的轻链和重链，和(b)Fc多肽。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码单臂抗体的轻链和重链，并且单独的多核苷酸编码Fc多肽。在一个实施方案中，分开的多核苷酸分别编码单臂抗体的轻链组分，单臂抗体的重链组分和Fc多肽。单臂抗体的产生描述于例如WO2005063816中。
适于表达抗体的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，例如革兰氏阴性和革兰氏阳性生物。有用的细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌)、芽孢杆菌属(Bacilli)(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、肠杆菌属(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门杆菌(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性菌。在一个实施方案中，使用大肠杆菌作为宿主细胞。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology，第2卷(Washington，D·C·:American Society forMicrobiology，1987)，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325)及其衍生物，包括具有基因型ΔfhuA(ΔtonA)ptr3lac Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41kanR的菌株33D3(美国专利号5,639,635)以及菌株63C1和64B4。在一些实施方案中，大肠杆菌菌株是名为62A7的W3110衍生物(ΔfhuA(ΔtonA)ptr3,lacIq,lacL8,ompTΔ(nmpc-fepE)ΔdegP ilvG修复)。其他菌株及其衍生物，例如大肠杆菌294(ATCC31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC31,608)也适用。上述实例是说明性的而非限制。本领域知悉构建具有限定的基因型的上述任何细菌的衍生物的方法，并在例如Bass等人，Proteins 8:309-314(1990)中说明。通常需要考虑复制子在细菌细胞内的可复制性，选择适当的细菌。例如，当使用公知的质粒例如PBR322、pBR325、PACYC177或pKN410提供复制子时，可适当地使用大肠杆菌、沙雷氏菌属或沙门杆菌属物种作为宿主。通常宿主细胞应分泌最小量的蛋白水解酶，并且理想地在细胞培养物中掺入额外的蛋白酶抑制剂。
为了提高细菌培养物中多肽的产率和质量，可以修饰细菌细胞。例如，为了改善分泌的抗体多肽的正确组装和折叠，细菌宿主细胞可以包含表达分子伴侣的其他载体，例如FkpA和Dsb蛋白(DsbB，DsbC，DsbD和/或DsbG)可以用于共转化宿主原核细胞。已经证明分子伴侣蛋白促进细菌宿主细胞中产生的异源蛋白质的正确折叠和溶解。
多特异性抗体生产
用上述表达载体转化宿主细胞，并在适当修饰的常规营养培养基中培养，以诱导启动子，选择转化子或扩增编码所需序列的基因。
转化意指将DNA引入原核宿主中，使得DNA可作为染色体外元件或通过染色体整合体复制。取决于所用的宿主细胞，使用适合于此类细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于含有大量细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的另一种技术是电穿孔。
用于产生根据本文提供的方法纯化的多肽的原核细胞在本领域已知的培养基中生长，并适于培养所选择的宿主细胞。合适的培养基的实例包括Luria肉汤(LB)加必需的营养补充剂。在一些实施方案中，培养基还含有基于表达载体构建选择的选择剂，以选择性地允许含有表达载体的原核细胞生长。例如，将氨苄青霉素添加到培养基中以使表达氨苄青霉素抗性基因的细胞生长。
除了碳、氮和无机磷酸盐源之外的任何必需的补充剂也可以以单独引入的适当浓度或作为与另一种补充剂或培养基(例如复合氮源)的混合物包括在内。任选地，培养基可含有一种或多种选自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、硫乙醇酸盐、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇的还原剂。
原核宿主细胞在合适的温度下培养。例如，对于大肠杆菌生长，优选的温度范围为约20℃至约39℃，更优选约25℃至约37℃，甚至更优选约30℃。主要取决于宿主生物，培养基的pH可以是约5至约9的任何pH。对于大肠杆菌，pH优选为约6.8至约7.4，更优选为约7.0。
如果在表达载体中使用诱导型启动子，则在适于启动子激活的条件下诱导蛋白质表达。在一个方面，PhoA启动子用于控制多肽的转录。因此，转化的宿主细胞在用于诱导的磷酸盐限制性培养基中培养。优选地，磷酸盐限制性培养基是C.R.A.P培养基(参见，例如，Simmons等人，J.Immunol.Methods(2002)，263：133-147)或WO2002/061090中描述的培养基。根据所用的载体构建体，可以采用多种其他诱导物，如本领域已知的。
在一个实施方案中，使用本文提供的方法纯化的表达多肽分泌到宿主细胞的周质中并从宿主细胞的周质中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，通常通过诸如渗透压休克、超声处理或裂解的方式。一旦细胞被破坏，可通过离心或过滤除去细胞碎片或全细胞。蛋白质可以进一步纯化，例如，通过亲和树脂层析。或者，可将蛋白质转运到培养基中并在其中分离。可以从培养物中除去细胞，过滤培养上清液并浓缩，以进一步纯化产生的蛋白质。表达的多肽可以使用通常已知的方法进一步分离和鉴定，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析。
在一个方面，通过发酵方法大量进行抗体产生。各种大规模补料分批发酵程序可用于重组多肽生产。大规模发酵具有至少1000升容量，优选约1,000至100,000升容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧气和养分，尤其是葡萄糖(优选的碳/能源)。小规模发酵通常是指在发酵罐中发酵，其体积容量不超过约100升，并且可以在约1升至约100升的范围内。
在发酵过程中，蛋白质表达的诱导通常在细胞已经在合适的条件下生长至期望的密度(例如OD550为约180-220)之后开始，在该阶段细胞处于早期稳定期。根据所采用的载体构建体，可以使用多种诱导物，如本领域已知的和如上所述。在诱导之前，细胞可以生长更短的时间。细胞通常诱导约12-50小时，但可以使用更长或更短的诱导时间。
为了提高多肽的产率和质量，可以改变各种发酵条件。例如，为了改善分泌的抗体多肽的正确组装和折叠，可以使用表达分子伴侣蛋白，例如FkpA，DsbA和/或DsbC的其他载体来共转化宿主原核细胞。已经证明分子伴侣蛋白促进细菌宿主细胞中产生的异源蛋白质的正确折叠和溶解。在一些实施方案中，FkpA，DsbA和/或DsbC在细菌宿主细胞中表达。
为了使表达的异源蛋白质(特别是蛋白水解敏感的蛋白质)的蛋白水解最小化，可以使用某些缺乏蛋白水解酶的宿主菌株。例如，可以修饰宿主细胞株以在编码已知细菌蛋白酶的基因中实现基因突变，所述蛋白酶为例如蛋白酶III，OmpT，DegP，Tsp，蛋白酶I，蛋白酶Mi，蛋白酶V，蛋白酶VI及其组合。一些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株可获得并描述于例如Joly等人，(1998)，上文；Georgiou等人，美国专利号5,264,365；Georgiou等人，美国专利号5,508,192；Hara等人，Microbial Drug Resistance，2：63-72(1996)。
在一个实施方案中，缺乏蛋白水解酶并用表达一种或多种分子伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株用作表达系统中的宿主细胞。
使用真核宿主细胞产生多特异性抗体
信号序列组件
用于真核宿主细胞的载体可任选地含有信号序列或在目的成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特异性切割位点的其他多肽。选择的异源信号序列优选是被宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切割)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。将这种前体区的DNA以阅读框连接到编码所需异多聚体蛋白(例如抗体)的DNA上。
复制起点
通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组件。例如，通常可以使用SV40起点，但仅仅因为它含有早期启动子。
选择基因组件
表达和克隆载体可含有选择基因，也称为选择标记。典型的选择基因编码的蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性，(b)补充营养缺陷(如果相关)，或(c)提供复杂培养基无法获得的关键营养素。
选择方案的一个实例利用药物来阻止宿主细胞的生长。那些用异源基因成功转化的细胞产生一种赋予药物抗性的蛋白质，从而在选择方案中存活。这种显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
用于哺乳动物细胞的合适选择标记的另一个实例是那些能够鉴定能够摄取抗体核酸例如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II，优选灵长类动物金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等的细胞的选择标记。
例如，首先通过在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转化体来鉴定用DHFR选择基因转化的细胞。当采用野生型DHFR时，合适的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。
或者，用编码抗体，野生型DHFR蛋白和另一种选择标记(例如氨基糖苷类3'磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是含有内源DHFR的野生型宿主)可以通过在含有选择标记的选择剂的培养基中的细胞生长来选择，所述选择标记例如是氨基糖苷类抗生素，例如卡那霉素，新霉素或G418。参见，例如，美国专利号4,965,199。
启动子组件
表达和克隆载体通常含有被宿主生物识别并与所需的含铰链多肽(例如抗体)核酸有效连接的启动子。启动子序列对于真核生物是已知的。事实上，所有真核基因都具有位于转录起始位点上游约25至30个碱基的富含AT的区域。在许多基因的转录起始上游70至80个碱基处发现的另一个序列是CNCAAT区域，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'末端是AATAAA序列，其可以是将poly A尾添加到编码序列的3'末端的信号。所有这些序列都适合插入真核表达载体中。
例如，通过从病毒基因组获得的启动子控制哺乳动物宿主细胞中来自载体的所需重链和/或轻链转录，所述病毒例如为多瘤病毒，禽痘病毒，腺病毒(例如腺病毒2)，牛乳头瘤病毒，禽肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)，来自异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，或来自热休克启动子，只要这些启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地作为SV40限制性片段获得，该片段还含有SV40病毒复制起点。人巨细胞病毒的立即早期启动子可方便地作为Hind III E限制片段获得。在美国专利号4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。在美国专利号4,601,978中描述了该系统的改进。还参见Reyes等人，Nature297：598-601(1982)关于在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下在小鼠细胞中表达人b-干扰素eDNA。或者，劳斯肉瘤病毒长末端重复序列可用作启动子。
增强子元件组件
通过将增强子序列插入载体中，可以增加高等真核生物对编码所需含铰链多肽(例如抗体)的DNA的转录。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(例如珠蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，甲胎蛋白和胰岛素基因)。此外，可以使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点后侧的SV40增强子(bp 100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。还参见Yaniv，Nature 297：17-18(1982)，其中描述了用于增强真核启动子活化的元件。增强子可以在抗体多肽编码序列的5'或3'位置剪接到载体中，条件是实现增强，但通常位于启动子的5'位点。
转录终止组件
用于真核宿主细胞的表达载体通常还含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这些序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶尔3'非翻译区获得。这些区域含有在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录为多腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组件是牛生长激素多腺苷酸化区域。参见WO 94/11026和其中公开的表达载体。
选择并转化宿主细胞
用于在本文载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞包括本文所述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(亚克隆用于在悬浮培养中生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Viral.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Nat/.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MOCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。
用上述表达或克隆载体转化宿主细胞以产生所需的含铰链多肽(例如抗体)，并在适当修饰的常规营养培养基中培养，以诱导启动子，选择转化子或扩增编码所需序列的基因。
培养宿主细胞
用于产生多特异性抗体(例如，双特异性抗体)的宿主细胞可以在多种培养基中培养。可商购的培养基例如Ham's F10(Sigma)，Minimal Essential Medium((MEM)，(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco's Modified Eagle's Medium((DMEM)，Sigma)适合于培养宿主细胞。此外，Ham等人，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes等人，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985中描述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)，盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)，缓冲剂(如HEPES)，核苷酸(如腺苷和胸苷)，抗生素(如GENTAMYCINTM)药物)，微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等同能源。还可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必需的补充剂。培养条件，例如温度、pH等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对于普通技术人员是显而易见的。
多特异性抗体形成/组装
在某些实施方案中，本文提供了用于产生多特异性抗体的方法。在某些实施方案中，通过分别产生半抗体来产生多特异性抗体，每个半抗体包含结合特定表位(例如，单个靶标上的不同表位，或两个或更多个靶标上的不同表位)的VH/VL单元。在一些实施方案中，每种半抗体在宿主细胞中单独产生。在一些实施方案中，每种半抗体在相同的宿主细胞中产生。将半抗体混合并使其组装成多特异性抗体。在一些实施方案中，每种半抗体在相同的宿主细胞中一起产生。在一些实施方案中，宿主细胞(例如原核宿主细胞，例如大肠杆菌细胞)表达分子伴侣，例如FkpA，DsbA和/或DsbC，以促进半抗体的折叠。
在一些实施方案中，通过在细菌宿主细胞(例如大肠杆菌)中表达重链和轻链构建体，在分开的培养物中产生含有旋钮或孔突变的半抗体。可以通过蛋白A亲和层析分别纯化每种半抗体。来自旋钮和孔半抗体的澄清细胞提取物可以通过蛋白A柱纯化。可以在还原剂存在下，在体外氧化还原反应中组装具有不同特异性的蛋白A纯化的半抗体以形成双特异性抗体。
在一些实施方案中，通过在相同的细菌宿主细胞(例如，大肠杆菌宿主细胞或CHO宿主细胞)中表达重链和轻链构建体，在相同的培养物中产生含有旋钮突变或孔突变的半抗体。可以通过蛋白A亲和层析纯化半抗体。来自旋钮和孔半抗体的澄清细胞提取物可以通过蛋白A柱纯化。可以在还原剂存在下，在体外氧化还原反应中组装具有不同特异性的蛋白A纯化的半抗体以形成双特异性抗体。
可以使用任何合适的方法来制备所需的还原条件。例如，可以通过向反应中添加还原剂/还原试剂(例如本文所述的组装混合物)来制备所需的还原条件。合适的还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)，三(2-羧乙基)膦(TCEP)，巯基乙醇酸，抗坏血酸，硫醇乙酸，谷胱甘肽(GSH)，β-巯基乙胺，半胱氨酸/胱氨酸，GSH/谷胱甘肽二硫化物(GSSG)，半胱胺/胱胺，甘氨酰半胱氨酸和β-巯基乙醇，优选GSH。在某些特定实施方案中，还原剂是弱还原剂，包括但不限于GSH，β-巯基乙胺，半胱氨酸/胱氨酸，GSH/GSSG，半胱胺/胱胺，甘氨酰半胱氨酸和β-巯基乙醇，优选GSH。在某些优选的实施方案中，还原剂是GSH。在某些实施方案中，还原剂不是DTT。在合适的浓度和合适的实验条件下选择合适的还原剂，以在反应中获得所需的还原条件是在本领域普通技术人员能力内。例如，在20℃下双特异性抗体蛋白浓度为10g/L的溶液中的10mM L-还原型谷胱甘肽将导致约-400mV的起始氧化还原电位。例如，添加到组装混合物中的谷胱甘肽产生弱还原条件，这对于旋钮入孔双特异性组装是有利的。其他类似类别的还原剂如BMEA(β-巯基乙胺)可能具有类似的效果。参见WO2013/055958，其通过引用整体并入本文。可以使用本领域已知的任何合适的方法估计和测量反应的还原条件。例如，还原条件可以使用刃天青指示剂(在还原条件下从蓝色变色至无色)来测量。为了更精确的测量，可以使用氧化还原电位计(例如由BROADLEY 制造的ORP电极)。
在某些具体实施方案中，还原条件是弱还原条件。本文所用的术语"弱还原剂"或"弱还原条件"指，在25℃具有负氧化电位的还原剂或由该还原剂制备的还原条件。在pH为7至9、温度在15℃和39℃之间时，还原剂的氧化电位优选在-50至-600mV、-100至-600mV、-200至-600mV、-100至-500mV、-150至-300mV之间、更优选约-300至-500mV之间、最优选约-400mV。本领域技术人员将能够选择适宜的还原剂来制备希望的还原条件。本领域技术人员将明了，可以以较低的浓度使用强还原剂，即在相同的浓度、pH和温度下比上述还原剂具有更负的氧化电位的还原剂。在优选实施方案中，在上述条件下温育时，蛋白质将能够在还原剂的存在下形成二硫键。弱还原剂的实例包括但不限于谷胱甘肽、β-巯基乙胺、半胱氨酸/胱氨酸、GSH/GSSG、半胱胺/胱胺、甘氨酰半胱氨酸和β-巯基乙醇。在某些实施方案中，可以用与200X摩尔比的GSH:抗体的氧化电位类似的氧化电位作为弱还原条件的参考点，在该条件下预期可用其他还原剂实现有效组装。
谷胱甘肽浓度可以以摩尔浓度或以相对于组装混合物中存在的半抗体的量的摩尔比或摩尔过量的方式表示。对组装混合物中的蛋白质浓度使用还原剂对照的目标摩尔比；这可以防止由于蛋白质浓度变化导致过度还原或还原不足。在某些其他实施方案中，将还原剂以相对于半抗体的总量为2-600X，2-200X，2-300X，2-400X，2-500X，2-20X，2-8X，20-50X，50-600X，50-200X，或100-300X摩尔过量，优选50-400X或50-150X，更优选100-300X，最优选200X或100X摩尔过量加入到组装混合物中。在某些实施方案中，组装混合物的pH为7至9，优选pH为8.5或8.3。
还提供了免疫缀合物(可互换地称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”)，其包含与例如细胞毒性剂例如化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素(即放射性缀合物)缀合的本文所述的任何抗体。
抗原/靶分子
根据本文所述方法纯化的多特异性抗体可以靶向的分子的实例包括但不限于可溶性血清蛋白质和它们的受体及其他膜结合的蛋白质(例如黏附素)。在某些实施方案中，根据本文所述方法纯化的多特异性抗体能够结合选自以下的一种、两种或多于两种细胞因子、细胞因子相关蛋白质和细胞因子受体：8MPI、8MP2、8MP38(GDFIO)、8MP4、8MP6、8MP8、CSFI(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGFI(αFGF)、FGF2(βFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFN81、IFNG、IFNWI、FEL1、FEL1(EPSELON)、FEL1(ZETA)、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、IL33、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBb3、LTA(TNF-β)、LTB、TNF(TNF-α)、TNFSF4(0X40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(AP03L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、HGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、ILIR1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、ILI0RA、ILI0RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(瘦蛋白)、PTN和ΤΗΡO。
在某些实施方案中，根据本文所述方法纯化的多特异性抗体能够结合选自以下的趋化因子、趋化因子受体或趋化因子相关蛋白质：CCLI(1-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-lα)、CCL4(MIP-lβ)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCL11(eotaxin)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-I)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MDP-3b)、CCL20(MIP-3α)、CCL21(SLC/exodus-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/eotaxin-2)、CCL25(TECK)、CCL26(eotaxin-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCLI(GR01)、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCL11(1-TAC)、CXCL12(SDFI)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYDI)、SCYEI、XCLI(lymphotactin)、XCL2(SCM-lβ)、BLRI(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCR1(CKRI/HM145)、CCR2(mcp-IRB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBII)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Rα)、IL8RB(IL8Rβ)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HDF1、HDF1α、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2和VHL。
在某些实施方案中，根据本文所述方法纯化的多特异性抗体能够结合选自以下的一种或多种靶标：ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；ADORA2A；Aggrecan；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；ANGPTL；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；AZGP1(锌-a-糖蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF(BLys)；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLRI(MDR15)；BMP1；BMP2；BMP3B(GDF10)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B；BMPR2；BPAG1(网蛋白)；BRCA1；C19orf10(IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CA125；CA15-3；CA19-9；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2(D6/JAB61)；CCL1(1-309)；CCL11(eotaxin)；CCL13(MCP-4)；CCL15(MIP1)；CCL16(HCC-4)；CCL17(TARC)；CCL18(PARC)；CCL19(MIP-3)；CCL2(MCP-1)；MCAF；CCL20(MIP-3)；CCL21(MTP-2)；SLC；exodus-2；CCL22(MDC/STC-1)；CCL23(MPIF-1)；CCL24(MPIF-2/eotaxin-2)；CCL25(TECK)；CCL26(eotaxin-3)；CCL27(CTACK/ILC)；CCL28；CCL3(MTP-I)；CCL4(MDP-I)；CCL5(RANTES)；CCL7(MCP-3)；CCL8(mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1(CKRI/HM145)；CCR2(mcp-IR/RA)；CCR3(CKR/CMKBR3)；CCR4；CCR5(CMKBR5/ChemR13)；CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)；CCR7(CKBR7/EBI1)；CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9(GPR-9-6)；CCRL1(VSHK1)；CCRL2(L-CCR)；CD11a；CD13；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD22；CD23；CD24；CD28；CD3；CD30；CD31；CD33；CD34；CD35；CD37；CD38；CD39；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD41；CD44；LCA/CD45；CD45RA；CD45RB；CD45RO；CD5；CD52；CD69；CD7；CD71；CD72；CD74；CD79A；CD79B；CD8；CD80；CD81；CD83；CD86；CD95/Fas；CD99；CD100；CD106；CDH1(E-钙黏着蛋白)；CD9/p24；CDH10；CD11a；CD11c；CD13；CD14；CD19,CD20；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A(p21/WAF1/Cip1)；CDKN1B(p27/Kip1)；CDKN1C；CDKN2A(P16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEA；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；几丁质酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7(claudin-7)；CLN3；CLU(簇蛋白)；C-MET；CMKLR1；CMKOR1(RDC1)；CNR1；COL 18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；CR2；CRP；CSFI(M-CSF)；CSF2(GM-CSF)；CSF3(GCSF)；CTLA4；CTNNB1(b-连环蛋白)；CTSB(组织蛋白酶B)；CTSD(组织蛋白酶D)；CX3CL1(SCYDI)；CX3CR1(V28)；CXCL1(GRO1)；CXCL10(IP-10)；CXCL11(I-TAC/IP-9)；CXCL12(SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2(GRO2)；CXCL3(GRO3)；CXCL5(ENA-78/LIX)；CXCL6(GCP-2)；CXCL9(MIG)；CXCR3(GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；细胞角蛋白；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DNCLI；DPP4；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EPO；ERBB2(Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；雌激素受体；孕酮受体；ESR2；F3(TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FGF；FGF1(FGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2(bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3(int-2)；FGF4(HST)；FGF5；FGF6(HST-2)；FGF7(KGF)；FGF8；FGF9；FGFR1；FGFR3；FIGF(VEGFD)；FEL1(EPSILON)；纤维蛋白；FIL1(ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRTI(纤连蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1(FRA-1)；FY(DARC)；GABRP(GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNASI；GNRHI；GPR2(CCR10)；GPR31；GPR44；GPR81(FKSG80)；GRCCIO(C10)；GRP；GSN(凝溶胶蛋白)；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HOP1；组胺和组胺受体；HLA-A；HLA-DRA；HM74；HMOXI；HPV蛋白；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；1D2；IFN-a；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNgamma；ITGB7；DFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；干扰素例如IL1-IL36或其受体，包括IL-l；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；ILIF10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2,ILIRN；IL2；IL20；IL20RA；IL21R；IL22；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL33；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST(糖蛋白130)；P-糖蛋白；EL7；EL7R；EL8；IL8RA；DL8RB；IL8RB；DL9；DL9R；DLK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAK1；ERAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6(a6整联蛋白)；ITGAV；ITGB3；ITGB4(b4整联蛋白)；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；角蛋白；KITLG；KLF5(GCBox BP)；KLF6；KLKIO；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19(角蛋白19)；KRT2A；KHTHB6(毛发特异性H型角蛋白)；kappa轻链；lambda轻链；LAMAS；LEP(瘦素)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA(TNF-b)；LTB；LTB4R(GPR16)；LTB4R2；LTBR；LEWIS-xMACMARCKS；MAG或Omgp；MAP2K7(c-Jun)；MDK；MIB1；黑素体蛋白；midkine；MEF；MIP-2；MKI67；(Ki-67)；MMP2；MMP9；MS4A1；MSMB；MT3(金属硫蛋白-111)；MTSS1；MUC1(黏蛋白)；MYC；MY088；NCK2；神经蛋白聚糖；NFKB1；NFKB2；NGFB(NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66(Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1(NM23A)；NOX5；NPPB；NR0B1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR112；NR113；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZI；OPRD1；P2RX7；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；POGFA；POGFB；PECAM1；PF4(CXCL4)；PGF；PGR；磷酸聚糖；PIAS2；PIK3CG；PLAU(uPA)；PLG；PLXDC1；PPBP(CXCL7)；PPID；PRI；PRKCQ；PRKDI；PRL；PROC；PROK2；PSA；PSAP；PSCA；PTAFR；PTEN；PTGS2(COX-2)；PTN；p53；RAC2(p21Rac2)；RAS；Rb；RARB；RGSI；RGS13；RGS3；RNF110(ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2(亲脂素B)；SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)；SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)；SCYEI(内皮单核细胞激活细胞因子)；S-100SDF2；SERPINA1；SERPINA3；SERP1NB5(maspin)；SERPINE1(PAI-1)；SERPDMF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPPI；SPRR1B(Sprl)；ST6GAL1；STABI；STAT6；STEAP；STEAP2；TB4R2；TBX21；TCPIO；TOGFI；TEK；TGFA；TGFBI；跨膜或细胞表面肿瘤特异性抗原(TAA)例如USP7,521,541中描述的TAA；TAU；TGFB1II；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBRI；TGFBR2；TGFBR3；THIL；THBSI(血小板反应蛋白-1)；THBS2；THBS4；THPO；TIE(Tie-1)；TMP3；组织因子；TLR1；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TLR10；Tn抗原TNF；TNF-a；TNFAEP2(B94)；TNFAIP3；TNFRSFIIA；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6(Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10(TRAIL)；TNFSF11(TRANCE)；TNFSF12(AP03L)；TNFSF13(April)；TNFSF13B；TNFSF14(HVEM-L)；TNFSF15(VEGI)；TNFSF18；TNFSF4(OX40配体)；TNFSF5(CD40配体)；TNFSF6(FasL)；TNFSF7(CD27配体)；TNFSFS(CD30配体)；TNFSF9(4-1BB配体)；TOLLIP；Toll-样受体；TOP2A(拓扑异构酶Ea)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TRPC6；TSLP；TWEAK；遍在蛋白；VEGF；VEGFB；VEGFC；多能聚糖；VHL C5；波形蛋白；VLA-4；XCL1(淋巴细胞趋化蛋白)；XCL2(SCM-1b)；XCRI(GPR5/CCXCRI)；YY1；和ZFPM2。
在某些实施方案中，根据本文所述方法纯化的多特异性抗体的靶分子包括CD蛋白质，如CD3、CD4、CD8、CD16、CD19、CD20、CD34；CD64、CD200；ErbB受体家族的成员，如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞黏附分子，如LFA-l、Mac1、pl50.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7整联蛋白和αν/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如抗-CD11a、抗-CD18或抗-CD11b抗体)；生长因子，如VEGF(VEGF-A)、FGFR、Ang1、KLB、VEGF-C；组织因子(TF)；α干扰素(αIFN)；TNFα；白细胞介素，如IL-1β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-S、IL-9、IL-13、IL17AF、IL-1S、IL13；IL-13Rα1、IL13Rα2、IL14、IL-4R、IL-5R、IL-9R、IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；RANKL、RANK、RSVF蛋白、蛋白C、BR3等。
在某些实施方案中，根据本文所述方法纯化的多特异性抗体的靶分子包括低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP-1)或LRP-8或转铁蛋白受体、和至少一个选自以下的靶标：1)β-分泌酶(BACE1或BACE2)、2)a-分泌酶、3)γ-分泌酶、4)tau-分泌酶、5)淀粉样蛋白前体蛋白(ΑΡΡ)、6)死亡受体6(DR6)、7)淀粉样蛋白β肽、8)α-突触核蛋白、9)Parkin、10)Huntingtin、11)p75NTR和12)胱天蛋白酶-6。
在某些实施方案中，根据本文所述方法纯化的多特异性抗体的靶分子包括选自以下的至少两种靶分子：IL-1α和IL-1β，IL-12和IL-1S；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-5和IL-4；IL-13和IL-1β；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MEF；IL-13和TGF-β；IL-13和LHR激动剂；IL-12和TWEAK，IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAMS，IL-13和PED2，IL13和IL17；IL13和IL4；IL13和IL33；IL17A和IL17F，CD3和CD19，CD138和CD20；CD138和CD40；CD19和CD20；CD20和CD3；CD3S和CD13S；CD3S和CD20；CD3S和CD40；CD40和CD20；CD-S和IL-6；CD20和BR3，TNFα和TGF-β，TNFα和IL-1β；TNFα和IL-2；TNFα和IL-3；TNFα和IL-4；TNFα和IL-5；TNFα和IL6；TNFα和IL8；TNFα和IL-9，TNFα和IL-10，TNFα和IL-11，TNFα和IL-12，TNFα和IL-13，TNFα和IL-14，TNFα和IL-15，TNFα和IL-16，TNFα和IL-17，TNFα和IL-18，TNFα和IL-19，TNFα和IL-20，TNFα和IL-23，TNFα和IFNα，TNFα和CD4，TNFα和VEGF，TNFα和MIF，TNFα和ICAM-1，TNFα和PGE4，TNFα和PEG2，TNFα和RANK配体，TNFα和Te38，TNFα和BAFF，TNFα和CD22，TNFα和CTLA-4，TNFα和GP130，TNFα和IL-12p40，FGFR1和KLB；VEGF和HER2，VEGF-A和HER2，VEGF-A和PDGF，HER1和HER2，VEGFA和ANG2，VEGF-A和VEGF-C，VEGF-C和VEGF-D，HER2和DR5，VEGF和IL-8，VEGF和MET，VEGFR和MET受体，EGFR和MET，VEGFR和EGFR，HER2和CD64，HER2和CD3，HER2和CD16，HER2和HER3；EGFR(HER1)和HER2，EGFR和HER3，EGFR和HER4，IL-14和IL-13，IL-13和CD40L，IL4和CD40L，TNFR1和IL-1R，TNFR1和IL-6R以及TNFR1和IL-18R，EpCAM和CD3，MAPG和CD28，EGFR和CD64，CSPG和RGM A；CTLA-4和BTN02；IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；MAG和RGM A；NgR和RGM A；NogoA和RGM A；OMGp和RGMA；POL-1和CTLA-4；和RGM A和RGM B。
可以用可选地缀合至其他分子的可溶性抗原或其片段作为免疫原来产生抗体。对于跨膜分子如受体，可以用这些的片段(例如受体的胞外域)作为免疫原。备选地，可以用表达跨膜分子的细胞作为免疫原。这类细胞可以衍生自天然来源(例如癌细胞系)或可以是已通过重组技术转化以表达跨膜分子的细胞。用于制备抗体的其他抗原及其形式对本领域技术人员而言显而易见。
制剂和制剂的制备方法
本文还提供了制备包含通过本文所述方法纯化的多特异性抗体的制剂和制备制剂和方法。例如，纯化的多肽可以与药学上可接受的载体组合。
在一些实施方案中，可以通过将具有所需纯度的多肽与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，以冻干制剂或水溶液的形式来制备多肽制剂用于储存(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编(1980))。
如本文所用的“载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其以所采用剂量和浓度对暴露至它的细胞或哺乳动物无毒。生理学上可接受的载体通常是含水pH缓冲溶液。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂以所采用剂量和浓度对接受者无毒，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐，柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双胺；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚，丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类，如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，多肽制剂中的多肽保持功能活性。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可以通过无菌过滤膜过滤而容易地完成。
本文的制剂还可含有一种以上的活性化合物，这是所治疗的具体适应症所必需的，优选那些具有不会相互产生不利影响的互补活性的活性化合物。例如，除多肽外，可能需要在一种制剂中包括另外的多肽(例如抗体)。或者或另外地，组合物可进一步包含化学治疗剂，细胞毒剂，细胞因子，生长抑制剂，抗激素剂和/或心脏保护剂。这些分子合适地以对预期目的有效的量组合存在。
制品
通过本文所述方法纯化的多特异性抗体和/或包含通过本文所述方法纯化的多肽的制剂可包含在制品中。制品可包含含有多肽和/或多肽制剂的容器。优选地，制品包括：(a)容器，其包含在容器内包含本文所述的多肽和/或多肽制剂的组合物；(b)包装插页，其中包含将制剂给予受试者的说明。
制品包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。容器容纳或包含制剂并且可具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是多肽。标签或包装插页指示组合物在受试者中的用途，其具有关于多肽和所提供的任何其他药物的给药量和时间间隔的特定指导。制品还可包括从商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。在一些实施方案中，容器是注射器。在一些实施方案中，注射器进一步包含在注射装置内。在一些实施方案中，注射装置是自动注射器。
“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症、与包装产品组合的其他治疗产品的信息，和/或有关使用此类治疗产品的警告。
本说明书中公开的所有特征可以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由用于相同，等同或类似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列等同或类似特征的示例。
前述书面描述被认为足以使本领域技术人员能够实施所述方法和/或获得本文所述的组合物。提供以下实施例和详细描述是为了说明而非限制。
本说明书中所有参考文献的公开内容明确地通过引用并入本文。
序列表的描述
SEQ ID NO：1vanucizumab的<VEGF>的可变重链结构域VH
SEQ ID NO：2vanucizumab的<VEGF>的可变轻链结构域VL
SEQ ID NO：3vanucizumab的<ANG-2>的可变重链结构域VH
SEQ ID NO：4vanucizumab的<ANG-2>的可变轻链结构域VL
SEQ ID NO：5RG7716的<VEGF>的可变重链结构域VH
SEQ ID NO：6RG7716的<VEGF>的可变轻链结构域VL
SEQ ID NO：7RG7716的<ANG-2>的可变重链结构域VH
SEQ ID NO：8RG7716的<ANG-2>的可变轻链结构域VL
SEQ ID NO：9vanucizumab的<ANG-2>的重链
SEQ ID NO：10vanucizumab的<VEGF>的重链
SEQ ID NO：11vanucizumab的<ANG-2>的轻链
SEQ ID NO：12vanucizumab'的<VEGF>的轻链
SEQ ID NO：13RG7716的<VEGF>的重链
SEQ ID NO：14RG7716的<ANG-2>的重链
SEQ ID NO：15RG7716的<VEGF>的轻链
SEQ ID NO：16RG7716的<ANG-2>的轻链
实施例
提供实施例仅用于说明目的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。实际上，除了本文所示和所述的那些之外的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述中变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。
实施例1：抗-X1/抗-Y1双特异性抗体的组装和纯化
如下组装针对靶蛋白X1和Y1的双特异性抗体-抗-X1/抗-Y1双特异性抗体或aX1/Y1双特异性。使用蛋白A树脂(MabSelect SuRe，GE Healthcare)对每种半抗体(aX1(旋钮)和aY1(孔))独立地进行亲和层析步骤。使用相似的工艺条件但不同的负载密度靶标，对于每种半抗体独立地完成蛋白A步骤。蛋白A柱在环境温度(15-30℃)下运行并且负载冷却至12-18℃。通过施加三个柱体积的洗脱缓冲液，然后施加三个柱体积的再生缓冲液来制备蛋白A柱。然后将柱平衡，装载，洗涤三次(平衡缓冲液洗涤，磷酸钾洗涤，平衡缓冲液洗涤)，洗脱并再生足够的循环以处理负载材料。如果需要，通过加入洗脱缓冲液调节来自蛋白A柱的合并材料的pH，以达到pH≤3.60并保持最少120分钟。在该步骤之后，将合并的材料的pH调节至pH 5.0±0.3用于进一步处理。
然后将从蛋白A层析步骤获得的半抗体库以1：1的摩尔比组合，将pH调节至pH8.2。向组合池中加入200mM L-谷胱甘肽(91/9％GSH/GSSG)缓冲液，以使每1摩尔形成的双特异性物质达到165摩尔L-谷胱甘肽的比例。将该材料加热至32.0±2.0℃，持续8-24小时。将得到的组装池冷却至15-25℃，然后调节至pH5.5。
然后使用CaptoTM MMC树脂以结合和洗脱模式对pH调节的组装池进行多模式阳离子交换层析。用pH5.5的100mM乙酸钠平衡柱。将调节的组装池装载到柱上至45g/L树脂，然后用平衡缓冲液洗涤，再用50mM HEPES和25mM乙酸钠，pH8.0的第二洗涤相洗涤。通过在梯度洗脱中使用50mM HEPES和245mM乙酸钠，pH8.0增加盐和pH，将双特异性抗体从柱上洗脱下来。基于280nm处的吸光度启动并终止阳离子交换池。
然后使用CaptoTM Adhere树脂以流穿模式对来自多模式阳离子层析步骤的洗脱液进行多模式阴离子交换层析。CaptoTM Adhere柱用50mM Tris，85mM乙酸钠，pH 8.0平衡。用纯化水将前一步骤的产物库调节至9.0mS/cm的电导率并装载到柱上。使双特异性抗体流过柱，然后用平衡缓冲液洗涤。基于280nm处的吸光度启动并终止阴离子交换池。上述纯化方案描述于图1A。
第三层析步骤除去残留杂质如DNA，宿主细胞蛋白和内毒素以及产物变体，包括半抗体、同二聚体和聚集体。当CaptoTM Adhere负载掺入20％aY1同二聚体时，层析过程使aY1同二聚体减少约2倍(通过MS为8％，通过用于检测产物相关杂质的基于细胞的测定为10％)。
图1A)中所示的纯化方案与使用常规阳离子交换(CEX)树脂(POROS XS)的纯化方案(参见图1B)的比较显示多模式树脂的使用改善了双特异性抗体与产物相关变体，特别是同二聚体的分离。因此，当来自亲和层析步骤的合并材料掺入20％孔同二聚体时，多模式阳离子交换层析通过质谱法(MS)将孔同二聚体降低至低于2％，并且通过用于产品相关杂质的基于细胞的测定将其降低至低于0.5％的定量限。
表7：从宿主细胞和产物相关杂质中分离抗X1/抗Y1双特异性抗体(POROS XS树脂，结合/洗脱模式)
表8：从宿主细胞和产物相关杂质中分离双特异性抗体(Capto MMC树脂，结合/洗脱模式)
CHOP＝CHO细胞蛋白；HMWS＝高分子量种类；150kD＝双特异性和同二聚体；75kD＝半抗体；LMWS＝低分子量种类
如表9和10中所示，常规阴离子交换(AEX)树脂(QSFF)(参见图1C)和多模式AEX树脂(CaptoTM Adhere)(参见图1A)之间的比较证明了与常规的AEX QSFF树脂相比，多模式AEX树脂实现了双特异性抗体与产物相关杂质的显著更好的分离。由于去除了半抗体(75kD)和聚集体，即高分子量种类(HMWS)，QSFF富集主峰1％，并且Adhere富集主峰10％。使用相同的Capto MMC池直接比较Capto Adhere和QSFF表明，与QSFF相比，Capto Adhere树脂实现了尺寸变体，产物相关变体(包括半抗体)和宿主细胞蛋白清除率的更好清除(表11)。
表9：从宿主细胞和产物相关杂质中分离双特异性抗体(QSFF树脂，流穿模式)
CHOP＝CHO细胞蛋白；HMWS＝高分子量种类；150kD＝双特异性和同二聚体；75kD＝半抗体；LMWS＝低分子量种类
表10：从宿主细胞和产物相关杂质中分离双特异性抗体
(CaptoTMAdhere树脂，流穿模式)
CHOP＝CHO细胞蛋白；HMWS＝高分子量种类；75kD＝半抗体；LOQ＝定量限
表11：Capto Adhere和QSFF的比较
CHOP＝CHO细胞蛋白；HMWS＝高分子量种类；75kD＝半抗体；LOQ＝定量限
上述实验证明了图1A中描绘的纯化方案与图1B或图1C中的纯化方案相比，实现了aX1/Y1双特异性抗体与产物相关杂质的分离显著更好。首先，当来自亲和层析步骤的合并材料掺入20％孔同二聚体时，Capto MMC(即，多模式阳离子交换树脂)通过质谱(MS)将孔同二聚体降低至低于2％并且通过用于产物相关杂质的基于细胞的测定将其降低至低于0.5％的定量限。(参见表7和8)。使用POROS XS，即常规的阳离子交换树脂，未实现这种分离。此外，CaptoAdhere(即多模式阴离子交换树脂)由于去除了高分子量种类(如半抗体(75kD)和聚集体)而富集主峰10％，而QSFF(即常规阴离子交换树脂)仅富集主峰1％。此外，与多模式阳离子树脂接着是常规的阴离子交换树脂QSFF的组合相比，两种多模式树脂：多模式阳离子树脂(CaptoMMC)接着是多模式阴离子树脂CaptoAdhere的组合实现了大小变体，产品相关变体(包括半抗体)和宿主细胞蛋白清除率的更好清除(参见例如表11)。
当多模式树脂的顺序颠倒时，发现了产物相关变体和大小变体的去除的类似改进：在单独的实验中，还通过以下方式实现了aX1/Y1双特异性抗体与产物相关杂质的更好分离：将来自亲和层析步骤的合并材料首先进行多模式阴离子树脂，然后进行多模式阳离子树脂。
实施例2：F(ab’)2双特异性的组装和纯化
实现90％纯F(ab’)2双特异性的初始尝试导致低产率(小于10％的起始材料)。在不损失纯度的情况下维持可接受产率的问题还有几个挑战，包括工艺中间体的不稳定性和产物相关变体的存在，例如同二聚体，游离轻链和重链，以及未反应的Fab'离去基团。开发了新的单元操作以实现所需双特异性F(ab’)2的有效组装和纯化。如图2中提供的示意图所示，组装和纯化包含两种不同Fab'分子的双特异性F(ab’)2。
首先，如下实施捕获步骤。首先从分开的大肠杆菌提取物上清液中捕获每个Fab'。使用CaptoL Protein L亲和层析树脂对含有两个Fab'半分子之一的上清液进行捕获步骤。使用25mM Tris氯化钠平衡缓冲液(pH7.7)平衡柱。在将负载材料施加到柱上后，用平衡缓冲液(pH7.7)洗涤柱，然后用0.4M磷酸钾(pH7)洗涤，用还原剂洗涤以除去半胱氨酸帽，并用另外的平衡缓冲液，pH7.7洗涤。然后使用0.1M乙酸pH2.9的洗脱缓冲液从CaptoL柱洗脱目的Fab'产物。使用280nm的吸光度收集产物。
将来自Capto L层析步骤的含有第一Fab'半分子(Fab'A)的池调节至pH5.5。将DPDS(二吡啶二硫醚)加入到pH 5.5调节的CaptoL池中。DPDS与Fab'分子中的游离铰链半胱氨酸反应形成吡啶化(pyridylated)的Fab'，其与可用的Fab'游离巯基反应，从而促进F(ab’)2异二聚体的形成。一旦形成，将吡啶化的Fab'A装载到第二层析柱上进行纯化。
为了鉴定可以从杂质(即Fab'同二聚体、高分子量种类(HMWS)，Fab'单体)中分离吡啶化Fab'的层析条件，Capto MMC树脂上的Fab'同二聚体，高分子量种类(HMWS)，Fab'单体和吡啶化Fab'(pyr-Fab')的结合行为在层析树脂结合条件的96点分配系数筛选中表征。将吡啶化的Fab'池装载到CaptoTM MMC树脂上。预测Fab'单体在pyr-Fab'的梯度中更早洗脱，而预测HMWS和Fab'同二聚体在梯度中稍后洗脱。从CaptoL层析树脂中洗脱第二Fab'分子Fab'B，然后氧化。
然后使含有吡啶化Fab'A和氧化Fab'B的两个Fab'池经受适合于F(ab’)2双特异性分子组装的条件。合并吡啶化的Fab'A和氧化的Fab'B CaptoL池。将合并的池保持最小组装时间以允许形成F(ab’)2双特异性。然后调节组装池以装载到下一个层析柱上。
进行低分辨率Kp(即分配系数)筛选以表征F(ab’)2组装混合物在不同层析树脂上的结合行为。组装混合物(通过SEC-HPLC测量的0％聚集体，21.5％Fab'A同二聚体，43.9％F(ab’)2，10.3％Fab'A单体，8.8％吡啶化Fab'A和15.5％Fab'B单体)通过以5g/L树脂负载密度装载到下列树脂上来测试：CaptoTM MMC树脂，CaptoTM Adhere树脂，QSFF树脂或50HS树脂。经由SEC-HPLC分析每个流通板的蛋白质组成和蛋白质浓度。这些数据被解卷积并用于产生对应于F(ab’)2、Fab'A同二聚体、Fab'B同二聚体、Fab'A单体和Fab'B单体在试验条件下在四种树脂中每一种上的行为的等高线图。
基于等高线图，预测CaptoTM Adhere解析Fab'A单体、Fab'A同二聚体和Fab'B同二聚体。具体而言，在CaptoTMAdhere树脂上的结合和pH梯度洗脱中，预测Fab'A单体和Fab'B同二聚体比F(ab’)2主峰更早洗脱，而预测Fab'A同二聚体保持与树脂结合。QSFF的等高线图显示，对于测试的pH范围，没有预测到种类与QSFF树脂结合，表明通过QSFF层析法不能实现F(ab’)2与产物相关杂质的分离。在实验条件下，混合模式树脂提供了F(ab’)2与产物相关杂质的最佳分离。CaptoTM MMC等高线图显示，预测CaptoTM MMC在pH 5.5时有效地将F(ab’)2与其产物特异性杂质分离。
在组装F(ab’)2双特异性后，使用CaptoAdhere树脂对组装池进行多模式AEX层析。将组装池滴定至pH 7.5并稀释至电导率≤5.5mS/cm。用25mM乙酸钠50mM Tris pH 7.5平衡缓冲液平衡柱。将组装池以25g/L树脂的负载密度装载到柱上。然后用平衡缓冲液洗涤柱。使用25mM乙酸钠45mM MES 5mM Tris pH 5.5洗脱缓冲液洗脱柱，并通过A280吸光度合并洗脱池。
在多模式AEX之后，将材料装载到以结合和洗脱模式操作的Poros 50HS树脂上。Poros 50HS柱用52mM乙酸钠pH 4.9平衡。负载调节至pH5以及电导率≤3.3mS/cm。用平衡缓冲液洗涤柱。然后用pH4.9的169mM乙酸钠洗涤柱。使用247mM乙酸钠pH 4.9洗脱缓冲液，使用梯度洗脱来洗脱柱。通过A280收集池。
然后使用CaptoMMC树脂对来自POROS 50HS步骤的池进行多模式CEX层析。多模式CEX步骤在结合和洗脱模式下操作。使用50mM乙酸钠pH 5.5平衡缓冲液平衡柱。将负载调节至pH5.0并且电导率≤5mS/cm，并装载到柱上至负载密度为15g/L。用平衡缓冲液洗涤柱。然后用140mM乙酸钠pH 5.5洗涤缓冲液洗涤柱。使用平衡缓冲液和350mM乙酸钠pH5.5洗脱缓冲液，用梯度洗脱洗脱柱。通过A280收集池。
如表12中所示，与使用 HS树脂时相比，当使用CaptoTM MMC树脂时，实现了从大肠杆菌蛋白质中改善分离目的F(ab’)2双特异性产物(100kD)和71kD错误形成的二硫化物产物相关变体。使用CaptoMMC作为第四柱实现了通过SEC测量的纯度大于95％Fab'2双特异性。使用CaptoMMC作为第四柱，也实现了少于5％的71kD错误形成的二硫化物产物相关变体。
表12：F(ab’)2与宿主细胞和产物相关杂质的分离( HS树脂，结合和洗脱模式对比CaptoTMMMC，结合和洗脱模式)
％F(ab’)2＝通过SEC测量的％双特异性；100kD＝通过CE-SDS测量的F(ab’)2目标双特异性产物；71kD＝通过CE-SDS测量的具有错误形成的二硫化物的产物相关变体；ECP＝大肠杆菌蛋白质
因此，图2中描绘的纯化方案与负载材料相比，纯化的F(ab’)2的产率显著提高，并且纯化的F(ab’)2池中宿主细胞蛋白的量减少超过99％。
实施例3：抗X2/抗Y2双特异性抗体的组装和纯化
在另一个实例中，如下纯化双特异性抗体。分别产生每种半抗体并进行亲和层析，然后如本文所述进行组装。组装后，首先使用CaptoTM Adhere树脂以结合和洗脱模式对组装材料进行多模式阴离子交换层析。将组装材料调节至pH 7.5并装载到用150mM乙酸盐/Tris缓冲液，pH 7.5预平衡的柱上。装载后，用平衡缓冲液洗涤柱并用pH5.0的25mM乙酸盐洗脱结合的蛋白质。基于A280nm信号触发洗脱池的收集。然后使用CaptoTM MMC树脂以结合和洗脱模式对CaptoTM Adhere洗脱池进行多模式阳离子交换层析。将Capto Adhere洗脱池调节至pH 6.5并装载到在25mM乙酸盐，25mM MES pH 6.5缓冲液中预平衡的Capto MMC柱上。装载后，用平衡缓冲液洗涤CaptoTM MMC柱，用150mM乙酸钠，25mM MES pH 6.5CaptoTMMMC洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质。基于A280nm信号进行池收集。该纯化方案如图3A所示。
如下表13和14中所示，当CaptoTM Adhere层析后进行CaptoTM MMC层析(参见图3A)，相比于CaptoTM Adhere层析然后进行QSFF层析(参见图3B)，实现了双特异性抗体与方法特异性杂质(例如大肠杆菌蛋白质和分子伴侣(例如，fkpA、dsbA和dsbC))的更大分离。此外，当CaptoTMAdhere层析然后进行CaptoTM MMC层析(参见图3A)时，相比于CaptoTM Adhere层析然后进行QSFF层析(参见图3B)，实现了双特异性抗体与产物特异性杂质(如高分子量种类(vHMWS)、高分子量种类(HMWS)和低分子量种类(LMWS))的更大分离。参见表13和14。
表13：在抗X2/Y2工艺中用CaptoTMAdhere-QSFF步骤实现的过程和产品特异性杂质的清除
表14：在抗X2/Y2工艺中用CaptoTMAdhere-CaptoTMMMC步骤实现的过程和产品特异性杂质的清除
上述实验证明了图3A中描绘的纯化方案(即，其中多模式阴离子交换层析之后进行多模式阳离子交换层析)与图3B中描绘的纯化方案(即，其中多模式阴离子交换层析之后进行常规的阳离子交换层析)相比，实现了抗X2Y2双特异性抗体与过程和产物相关杂质的改进分离。另外，图3A中描绘的纯化方案与图3B中所描绘的纯化方案相比还实现了抗X2Y2双特异性抗体的提高的产率。
实施例4：抗X3/抗Y3双特异性抗体的组装和纯化
在蛋白A柱上捕获抗X3旋钮半抗体。首先使用25mM Tris 25mM氯化钠pH 7.7平衡缓冲液平衡柱。然后将含有抗X3半抗体的大肠杆菌提取物上清液装载到柱上。装载提取上清液后，用平衡缓冲液洗涤柱，然后用0.4M磷酸钾pH7洗涤缓冲液洗涤，然后用平衡缓冲液洗涤。然后使用0.15M乙酸pH 2.9洗脱缓冲液洗脱抗X3半抗体。通过A280收集洗脱池。将洗脱池滴定至pH5.0，然后储存直至与抗Y3孔半抗体组合。使用针对抗X3半抗体描述的相同蛋白A方法捕获抗Y3孔半抗体。
将两种半抗体以1：1的质量比组合。将精氨酸加入组装池中至终浓度为50mM。将合并的半抗体池用200mM组氨酸，8％PVP pH8以1：1稀释。加入L-还原型谷胱甘肽至摩尔过量200X(每摩尔双特异性抗体200摩尔谷胱甘肽)以组装两个半抗体。将组装池滴定至pH 8.0，然后加热至35摄氏度6小时。然后将池冷却至室温并调节以装载到下一个层析柱上。
将组装池装载到QSFF阴离子交换柱上。首先用25mM Tris 350mM氯化钠pH 9.1预平衡柱，然后用25mM Tris 70mM氯化钠pH 9.1平衡缓冲液平衡。然后将调节的负载施加到pH8.5电导率≤4.9mS/cm的柱上。然后用平衡缓冲液洗涤柱。然后使用平衡缓冲液和25mMTris 350mM氯化钠洗脱缓冲液洗脱该池。通过A280收集洗脱池。
然后调节QSFF池以装载到下一柱上。将CaptoAdhere多模式阴离子交换柱用500mM乙酸钠pH 6.0预平衡缓冲液预平衡，然后用8倍柱体积的50mM乙酸钠pH 6.0平衡缓冲液平衡。将pH 6.0电导率≤12mS/cm的调节负载施加到柱上。然后用平衡缓冲液洗涤柱，接着用0.1M精氨酸pH7.0电导率7.5mS/cm洗涤缓冲液洗涤，然后用平衡缓冲液洗涤。然后用50mM乙酸钠pH 5.0洗脱缓冲液梯度洗脱来洗脱柱。通过A280收集洗脱池。
然后调整CaptoAdhere池以装载到下一柱。将CaptoMMC多模式阳离子交换柱用350mM乙酸钠pH 6.0预平衡缓冲液预平衡，然后用50mM乙酸钠pH 6.0平衡缓冲液平衡。将pH6.0电导率≤6.5mS/cm的调节负载施加到柱上。然后用80mM乙酸钠pH 6.0洗涤缓冲液洗涤柱。然后使用350mM乙酸钠pH 6.0洗脱缓冲液通过梯度洗脱来洗脱柱。通过A280收集洗脱池。该纯化方案如图4所示。
如下表15中所示，仅包含一个多模式柱的三柱过程(即，蛋白A，接着是QSFF，接着是CaptoTM Adhere)未实现足够的ECP去除。使CaptoTMAdhere层析柱的洗脱液进行使用CaptoTMMMC层析的第四次层析柱，相对于CaptoTMAdhere池，将大肠杆菌蛋白质的水平降低了大于三倍，将HMWS降低至小于1％，并将双特异性含量增加至100％。
表15
HMWS＝通过SEC测量的高分子量种类；％双特异性＝通过反相HPLC测量的双特异性抗体的％；ECPs＝大肠杆菌宿主细胞蛋白质
实施例5：用于实施例6和7的材料和方法
抗体
实施例6-7使用多种示例性抗体，包括：结合Ang2和VEGF-A的双特异性抗体(抗Ang2/VEGF-A抗体；vanucizumab；RG7221)，如WO2011/117329或SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4中所述，或抗VEGF-A和Ang2的双特异性抗体(抗-VEGF-A/Ang2抗体；RG7716)，如WO 2014/009465或SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：8所述。本文还包括许多抗体，如下文实施例中所述。
本文描述或引用的技术和方法通常被本领域技术人员使用常规方法很好地理解和使用，例如，如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3d edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,et al.eds.,(2003))；the seriesMethods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Antibodies,A Laboratory Manual,andAnimal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.(1987))；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Matherand P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.)；CurrentProtocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)；Short Protocols inMolecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway andP.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd and C.Dean,编,Oxford University Press,2000)；Using Antibodies:ALaboratory Manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；和The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,编,Harwood AcademicPublishers,1995)中广泛使用的方法。
通过SE(尺寸排阻)HPLC测定纯度
SE HPLC用于通过采用SE HPLC柱分离抗体聚集体、单体和片段，监测天然条件下的大小异质性。通过UV吸光度监测洗脱液。纯度被确定为主峰、HMWS形式的总和和LMWS形式的总和相对于检测到的所有蛋白质峰的总和的百分比(面积)。
通过IE(离子交换)HPLC测定纯度
梯度离子交换层析法用于通过使用阳离子交换柱将样品分离成主峰、酸性区域和碱性区域来定量监测用羧肽酶B处理的样品的电荷异质性。通过UV吸光度进行检测。纯度被确定为主峰、酸性区域和碱性区域相对于检测到的所有蛋白质峰的总数的百分比(面积)。
通过CE-SDS(Caliper)测定纯度
用于蛋白质电泳分离的常规SDS-PAGE方法已经在Caliper GXII/LabChip GX测定系统(Caliper LifeScience，Inc./Perkin Elmer)中转移至芯片形式。蛋白质按各自的大小分离。在分离之前通过用荧光染料标记制备样品，该荧光染料可以根据制造商的说明检测和分析。
在每个纯化步骤后，使用微流体Labchip技术(Caliper Life Science，USA)通过CE-SDS分析纯度和抗体完整性。因此，制备分析物溶液并使用HT蛋白质快速芯片(HPProtein Express Chip)在LabChip GXII系统上进行分析。使用LabChip GX软件分析数据。
通过UV测定蛋白质含量
通过UV测定样品的蛋白质浓度。通过从280nm处的吸光度减去320nm处的吸光度来校正蛋白质吸光度。该吸光度值与蛋白质浓度成正比。使用1.5mL mg-1cm-1的消光系数计算蛋白质浓度。
宿主细胞蛋白(HCP)和DNA含量的检测方法
a)CHO HCP测定
通过cobas e 411免疫测定分析仪(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)上的电化学发光免疫测定(ECLIA)测定方法样品中的残留CHO HCP含量。
该测定基于使用来自绵羊的多克隆抗CHO HCP抗体的夹心原理。
第一次温育：来自15μL样品(纯和/或稀释的)的中国仓鼠卵巢宿主细胞蛋白(CHOHCP)和生物素缀合的多克隆CHO HCP特异性抗体形成夹心复合物，其经由生物素与链霉抗生物素蛋白的相互作用而变得结合到链霉抗生物素蛋白包被的微粒。
第二次温育：在添加用钌络合物(三(2,2'-联吡啶)钌(II)-络合物)标记的多克隆CHO HCP特异性抗体后，在微粒上形成三元夹心复合物。
将反应混合物吸入测量小室中，其中微粒被磁性捕获到电极的表面上。然后在洗涤步骤中除去未结合的种类。向电极施加电压然后诱导化学发光发射，其通过光电倍增管测量。
最终根据已知浓度的CHO HCP标准曲线计算测试样品中CHO HCP的浓度。
b)DNA含量
基于q PCR的测定用于CHO DNA的检测和定量。使用基于硅胶的膜，用商业RNA提取试剂盒提取来自样品的DNA。使用PCR引物和探针用序列检测系统对提取的DNA进行定量实时PCR。扩增子(扩增产物)的量化与DNA扩增期间连续测量的荧光发射的增加成正比。标准曲线用于量化样品中CHO细胞DNA的量。
实施例6：：结合Ang2和VEGF-A的双特异性抗体(如WO2011/117329中所述的抗Ang2/抗VEGF-A抗体)的纯化
通过MabSelect SuRe亲和层析以结合-洗脱模式处理来自CHO表达培养物的收获的细胞培养液(HCCF)。在将HCCF装载到柱上至最大负载密度为38gmAb/l树脂后，用25mM Tris，25mM NaCl，pH7.2洗涤柱5个柱体积。然后，用0.7M Tris/HCl，pH7.2进行5个柱体积的另外洗涤。使用高纯水或10mM Tris/HCl pH 7.5进行第三次洗涤步骤。使用pH 3.4的50mM乙酸盐洗脱柱结合的抗体。基于OD280从500至250mAU(路径长度1cm)在最多三个柱体积上收集洗脱池。
用乙酸将亲和洗脱池调节至pH3.5并保持30min。然后将池用1.5M Tris碱调节至pH5.0并通过深度过滤澄清。使用1.5M Tris碱将深度过滤池调节至pH 7，并作为使用多模式阴离子交换树脂Capto adhere ImpRes的第二层析步骤的原料。
Capto adhere ImpRes柱用50mM Tris Acetate，pH 7.0平衡。将平衡柱装载至180gmAb/l树脂的负载密度，并用20mM Tris乙酸盐，pH 7.0洗涤。基于OD280从1000至4000mAU(路径长度1cm)收集洗脱池。
将第二层析步骤的池用乙酸调节至pH 5.0并用作使用多模式阳离子交换树脂Capto MMC ImpRes的最终第三层析步骤的原料。第三层析步骤以结合-和＝洗脱模式进行。用30mM Tris/乙酸盐pH 5.0(平衡缓冲液)平衡Capto MMC ImpRes柱。将平衡柱装载至45gmAb/l树脂的负载密度，并用平衡缓冲液洗涤5个柱体积。第二次洗涤使用30mM Tris/乙酸盐pH 6.8进行10个柱体积，然后用平衡缓冲液进行5个柱体积。最后的洗涤步骤使用30mMTris/乙酸盐pH 4.9，500mM硫酸钠进行10个柱体积。使用30mM Tris/乙酸盐pH 6.0，500mM硫酸钠洗脱柱结合的抗体。基于OD280从3600至1000mAU(路径长度1cm)收集洗脱池。
将第三层析步骤的池浓缩并缓冲液交换到配制缓冲液中。上述纯化方案描述于图5A中。
表16：各层析步骤后产物和方法特异性杂质的分析数据
表17：使用包括亲和层析、阳离子交换层析、疏水相互作用层析和阴离子交换层析的4个层析柱的方法的比较(4柱(4C)方法)
可以看出，与使用包括捕获层析、常规阳离子交换层析、疏水相互作用层析和常规阴离子交换层析的四柱方法相比，通过使用包括MabSelectSure、Capto adhere和CaptoMMC ImpHes HHL的三柱方法，产物相关杂质，例如3/4抗体，预峰，HMWS，LMWS和方法相关杂质，例如HCP和DNA可以减少。
实施例7：针对VEGF-A和Ang2的双特异性抗体(如WO 2014/009465中所述的抗-VEGF-A/抗-An2抗体)的纯化
通过Capture Select FcXL亲和层析以结合-洗脱模式处理来自CHO表达培养物的收获的细胞培养液(HCCF)。在将HCCF装载到柱上至最大负载密度为25gmAb/l树脂后，用25mMTris/HCl，25mM NaCl，pH7.2洗涤柱2个柱体积。然后，用纯化水PWII进行另外的五个柱体积的洗涤。使用pH3.2的30mM乙酸洗脱柱结合的抗体。基于OD280从2500至1000mAU(路径长度1cm)收集洗脱池。
用乙酸将亲和洗脱池调节至pH 3.4并保持60min。然后将池用1.5M Tris Base调节至pH5.0并通过深度过滤澄清。使用1.5M Tris Base将深度过滤池调节至pH7，并作为使用多模式阴离子交换树脂Capto adhere的第二层析步骤的原料。由于负载的电导率<5mS/cm，因此不需要调节电导率。
Capto adhere柱用50mM Tris/乙酸盐，pH 7.0平衡。将平衡柱装载至170gmAb/l树脂的负载密度，并用50mM Tris/乙酸盐，pH 7.0(＝平衡缓冲液)洗涤。基于OD280从1000至2500mAU(路径长度1cm)在最大3CV洗涤下收集洗脱池。
将第二层析步骤的池用乙酸调节至pH 5.0并用作使用多模式阳离子交换树脂Capto MMC ImpRes的最终第三层析步骤的原料。第三层析步骤以结合-洗脱模式进行。用30mM Tris/乙酸盐，30mM Tris/柠檬酸盐pH 5.0平衡CaptoMMC ImpRes柱。将平衡柱装载至30gmAb/l树脂的负载密度，并用平衡缓冲液洗涤5个柱体积。第二次洗涤使用30mM Tris/乙酸盐，30mM Tris/柠檬酸盐，150mM NaCl pH 5.0进行10个柱体积，然后用平衡缓冲液进行5个柱体积。使用30mM Tris/乙酸盐，30mM Tris/柠檬酸盐，500mM NaCl pH 4.5进行最终洗涤步骤10个柱体积。使用40个柱体积中0-50％B的pH/盐梯度洗脱柱结合抗体。缓冲液A是平衡缓冲液30mM Tris/乙酸盐，30mM Tris/柠檬酸盐pH5.0，缓冲液B是30mM Tris/乙酸盐，30mMTris/柠檬酸盐，1.5M NaCl，pH8.5。基于OD280从250至4500mAU(路径长度1cm)收集洗脱池。
表18：在各个层析步骤之后的产物和方法特异性杂质的分析数据
表19：使用包括亲和层析、阳离子交换层析、疏水相互作用层析和阴离子交换层析的4个层析柱的方法的比较(4柱(4C)方法)
可以看出，通过使用Capto Adhere和Capto MMC ImpRes，可以减少HHL，产物相关杂质如3/4抗体，预峰，HMWS，LMWS和方法相关杂质如HCP和DNA。
实施例8：抗-X1/抗-Y1双特异性抗体的组装和纯化
如下组装针对靶蛋白X1和Y1的双特异性抗体-抗-X1/抗-Y1双特异性抗体或aX1/Y1双特异性。如实施例1中所述，使用蛋白A树脂(MabSelect SuRe，GE Healthcare)独立地对每种半抗体(aX1(旋钮)和aY1(孔))进行亲和层析步骤。
然后将从蛋白A层析步骤获得的半抗体池以1：1的摩尔比组合，并如实施例1中所述进行组装。然后使用CaptoTM Adhere树脂以流穿模式对pH调节的组装池进行多模式阴离子交换层析。如实施例1中所述平衡CaptoTM Adhere柱。将来自双特异性组装步骤的产物池用纯化水调节至9.0mS/cm的电导率并装载到柱上。使双特异性抗体流穿柱，然后用平衡缓冲液洗涤。基于280nm处的吸光度启动和终止阴离子交换合并。
然后使用CaptoTM MMC树脂以结合和洗脱模式对多模式阴离子层析产物池进行多模式阳离子交换层析。如实施例1中所述平衡柱。如实施例1中所述装载和洗涤多模式阴离子层析产物池。如实施例1中所述，通过在梯度洗脱中增加盐和pH将双特异性抗体从柱上洗脱下来。基于280nm处的吸光度启动和终止阳离子交换合并。上述纯化方案描述于图7A中。
使用图7A中所示的纯化方案实现的双特异性抗体与产物相关和方法相关杂质的分离程度与使用图7B和7C中所示的纯化方案实现的分离程度进行比较。
重复上述实验，并将来自亲和层析步骤的合并材料掺入20％孔同二聚体。使用图7A所示的纯化方案实现的双特异性抗体与产物相关和方法相关杂质的分离程度再次与使用图7B和7C中所示的纯化方案所获得的分离程度进行比较。
实施方案列表
1.一种从包含多特异性抗体和杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，所述方法包括以下的顺序步骤：
a)使组合物进行捕获层析以产生捕获层析洗脱液；
b)使捕获层析洗脱液进行第一混合模式层析以产生第一混合模式洗脱液；和
c)使第一混合模式洗脱液进行第二混合模式层析以产生第二混合模式洗脱液；和
d)收集包含多特异性抗体的级分，
其中该方法减少了来自所述组合物的产物特异性杂质的量。
2.实施方案1的方法，其中在第一混合模式层析之前使捕获层析洗脱液进行离子交换或HIC层析。
3.一种从包含多特异性抗体和杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，其中所述多特异性抗体的每个臂单独产生，所述方法包括顺序步骤：
a)使多特异性抗体的每个臂进行捕获层析以产生多特异性抗体的每个臂的捕获洗脱液，
b)在足以产生包含所述多特异性抗体的组合物的条件下，形成包含所述多特异性抗体的每个臂的捕获洗脱液的混合物，
c)使所述包含多特异性抗体的组合物进行第一混合模式层析以产生第一混合模式洗脱液，和
d)使第一混合模式洗脱液进行第二混合模式层析以产生第二混合模式洗脱液；和
e)收集包含所述多特异性抗体的级分，
其中该方法减少了来自所述组合物的产物特异性杂质的量。
4.实施方案3的方法，其中在第一混合模式层析之前，使所述包含多特异性抗体的组合物进行离子交换或HIC层析。
5.实施方案1-4中任一项的方法，其中所述捕获层析是亲和层析。
6.实施方案5的方法，其中所述亲和层析是蛋白L层析，蛋白A层析，蛋白G层析，蛋白A和蛋白G层析。
7.实施方案5或实施方案6的方法，其中所述亲和层析是蛋白A层析。
8.实施方案1-7中任一项的方法，其中所述捕获层析是以结合和洗脱模式进行。
9.实施方案1-8中任一项的方法，其中第一混合模式层析和第二混合模式层析是连续的。
10.实施方案1-9中任一项的方法，其中第一混合模式层析是混合模式阴离子交换层析。
11.实施方案1-10中任一项的方法，其中第二混合模式层析是混合模式阳离子交换层析。
12.实施方案1-9中任一项的方法，其中第一混合模式层析是混合模式阳离子交换层析。
13.实施方案1-10和12中任一项的方法，其中第二混合模式层析是混合模式阴离子交换层析。
14.实施方案1-13中任一项的方法，其中第一混合模式层析以结合和洗脱模式进行。
15.实施方案14的方法，其中所述洗脱是梯度洗脱。
16.实施方案1-13中任一项的方法，其中第一混合模式层析以流穿模式进行。
17.实施方案1-16中任一项的方法，其中第二混合模式层析以结合和洗脱模式进行。
18.实施方案17的方法，其中所述洗脱是梯度洗脱。
19.实施方案1-16中任一项的方法，其中第二混合模式层析以流穿模式进行。
20.实施方案1-19中任一项的方法，还包括使第二混合模式洗脱液进行超滤的步骤。
21.实施方案20的方法，其中超滤包括顺序的第一超滤、渗滤和第二超滤。
22.实施方案7-21中任一项的方法，其中蛋白A层析包含与琼脂糖连接的蛋白A。
23.实施方案7-21中任一项的方法，其中蛋白A层析是MAbSelectTM，MAbSelectTMSuRe和MAbSelectTMSuRe LX，Prosep-VA，Prosep-VA Ultra Plus，蛋白A琼脂糖凝胶fast flow或Toyopearl蛋白A层析。
24.实施方案7-23中任一项的方法，其中蛋白A层析使用蛋白A平衡缓冲液，蛋白A上样缓冲液或蛋白A洗涤缓冲液中的一种或多种，其中所述平衡缓冲液、上样缓冲液和/或洗涤缓冲液在约pH 7和约pH 8之间。
25.实施方案24的方法，其中蛋白A平衡缓冲液约为pH 7.7。
26.实施方案24或实施方案25的方法，其中蛋白A平衡缓冲液包含约25mM Tris和约25mM NaCl。
27.实施方案24-26中任一项的方法，其中在上样后用平衡缓冲液洗涤蛋白A层析。
28.实施方案7-27中任一项的方法，其中通过pH梯度洗脱从蛋白A层析中洗脱多特异性抗体。
29.实施方案7-28中任一项的方法，其中通过将具有低pH的蛋白A洗脱缓冲液应用于蛋白A层析，从蛋白A洗脱多特异性抗体。
30.实施方案29的方法，其中蛋白A洗脱缓冲液包含约150mM乙酸，约pH 2.9。
31.实施方案7-30中任一项的方法，其中合并蛋白A洗脱液，其中洗脱液的OD280大于约0.5。
32.实施方案10-31中任一项的方法，其中阴离子交换混合模式层析包含季胺和疏水部分。
33.实施方案32的方法，其中阴离子交换混合模式层析包括季胺和与高度交联的琼脂糖连接的疏水部分。
34.实施方案33的方法，其中混合模式层析是CaptoTM Adhere层析或CaptoTMAdhere ImpRes层析。
35.实施方案11-34中任一项的方法，其中阳离子交换混合模式层析包含N-苄基-n-甲基乙醇胺。
36.实施方案35的方法，其中所述混合模式层析是CaptoTM MMC层析或CaptoTM MMCImpRes层析。
37.实施方案1-36中任一项的方法，其中第一混合模式层析使用混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液、混合模式上样缓冲液或混合模式洗涤缓冲液中的一种或多种，其中混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液、混合模式上样缓冲液和/或混合模式洗涤缓冲液在约pH6和约pH7之间。
38.实施方案1-37中任一项的方法，其中第二混合模式层析使用混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液、混合模式上样缓冲液或混合模式洗涤缓冲液中的一种或多种，其中混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液和/或混合模式洗涤缓冲液在约pH5和约pH8之间。
39.实施方案37或38的方法，其中混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液和/或混合模式洗涤缓冲液为约pH6.5。
40.实施方案37-39中任一项的方法，其中混合模式预平衡缓冲液包含约500mM乙酸盐。
41.实施方案37-40中任一项的方法，其中混合模式平衡缓冲液包含约50mM乙酸盐。
42.实施方案37-41中任一项的方法，其中第一混合模式层析在上样后用洗涤缓冲液洗涤。
43.实施方案37-42中任一项的方法，其中第二混合模式层析在上样后用洗涤缓冲液洗涤。
44.实施方案15和18-43中任一项的方法，其中通过pH梯度从第一混合模式层析中洗脱所述多特异性抗体。
45.实施方案15和18-44中任一项的方法，其中通过将具有低pH的混合模式洗脱缓冲液应用于混合模式离子交换层析，从第一混合模式层析中洗脱所述多特异性抗体。
46.实施方案15和18-45中任一项的方法，其中通过pH梯度从第二混合模式层析中洗脱所述多特异性抗体。
47.实施方案15和18-46中任一项的方法，其中通过将具有低pH的混合模式洗脱缓冲液应用于混合模式交换层析，从第二混合模式层析中洗脱所述多特异性抗体。
48.实施方案2和4-47中任一项的方法，其中所述离子交换层析包含季胺。
49.实施方案48的方法，其中所述离子交换层析是阴离子交换层析，并且其中所述阴离子交换层析包含与交联琼脂糖连接的季胺。
50.实施方案49的方法，其中所述混合模式阴离子交换层析是CaptoAdhere层析。
51.实施方案48-50中任一项的方法，其中所述阴离子交换层析使用阴离子交换预平衡缓冲液、阴离子交换平衡缓冲液或阴离子交换上样缓冲液中的一种或多种，其中阴离子交换预平衡缓冲液、阴离子交换平衡缓冲液和/或阴离子交换上样缓冲液在约pH6和约pH8之间。
52.实施方案51的方法，其中所述阴离子交换预平衡缓冲液、阴离子交换平衡缓冲液和/或阴离子交换上样约为pH6.5。
53.实施方案51或实施方案52的方法，其中所述阴离子交换预平衡缓冲液包含约50mM Tris，500mM乙酸钠。
54.实施方案51-53中任一项的方法，其中所述阴离子交换平衡缓冲液包含约50mMTris。
55.实施方案51-54中任一项的方法，其中所述阴离子交换层析在上样后用阴离子交换平衡缓冲液洗涤。
56.实施方案51-55中任一项的方法，其中通过盐梯度从阴离子交换层析中洗脱所述多特异性抗体。
57.实施方案51-56中任一项的方法，其中通过将具有增加的盐浓度的阴离子交换洗脱缓冲液应用于阴离子交换层析，从阴离子交换层析中洗脱多特异性抗体。
58.实施方案57的方法，其中阴离子交换洗脱缓冲液包含约pH8.5的约50mM Tris，100mM乙酸钠。
59.实施方案51-58中任一项的方法，其中合并阴离子交换洗脱液，其中洗脱液的OD280大于约0.5至约2.0。
60.实施方案1-59中任一项的方法，其中所述多特异性抗体的臂在细胞中产生。
61.实施方案60的方法，其中所述细胞是原核细胞。
62.实施方案61的方法，其中所述原核细胞是大肠杆菌细胞。
63.实施方案61或实施方案62的方法，其中所述细胞经工程改造以表达一种或多种分子伴侣。
64.实施方案63的方法，其中所述分子伴侣是FkpA、DsbA或DsbC中的一种或多种。
65.实施方案63或实施方案64的方法，其中所述分子伴侣是大肠杆菌分子伴侣。
66.实施方案1-60中任一项的方法，其中所述细胞是真核细胞。
67.实施方案66的方法，其中所述真核细胞是酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
68.实施方案66或实施方案67的方法，其中所述真核细胞是CHO细胞。
69.实施方案60-68中任一项的方法，其中在捕获层析之前裂解所述细胞以产生包含多特异性抗体或多特异性抗体的臂的细胞裂解物。
70.实施方案69的方法，其中使用微流化器裂解细胞。
71.实施方案69或实施方案70的方法，其中在层析之前将聚乙烯亚胺(PEI)加入细胞裂解物中。
72.实施方案1-71中任一项的方法，其中所述方法减少组合物中宿主细胞蛋白(HCP)、浸出蛋白A、核酸、细胞培养基组分或病毒杂质中的任何一种的量。
73.实施方案1-72中任一项的方法，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体。
74.实施方案73的方法，其中所述双特异性抗体是旋钮入孔(KiH)双特异性抗体。
75.实施方案73或实施方案74的方法，其中所述双特异性抗体是CrossMab双特异性抗体。
76.实施方案1-75中任一项的方法，其中所述级分含有至少约95％的多特异性抗体。
77.实施方案1-76中任一项的方法，其中所述产物特异性杂质是未配对抗体臂、抗体同二聚体、聚集体、高分子量种类(HMWS)、低分子量种类(LMWS)、酸性变体或碱性变体中的一种或多种。
78.实施方案77的方法，其中所述级分含有不超过约5％的未配对抗体臂。
79.实施方案77或实施方案78的方法，其中所述级分含有不超过约5％的抗体同二聚体。
80.实施方案77-79中任一项的方法，其中所述级分含有不超过约2％的聚集体或高分子量种类(HMWS)。
81.实施方案77-80中任一项的方法，其中所述级分含有不超过约2％的LMWS。
82.实施方案77-81中任一项的方法，其中所述级分含有不超过约50％的酸性变体。
83.实施方案77-82中任一项的方法，其中所述级分含有不超过约35％的碱性变体。
84.实施方案77-83中任一项的方法，其中所述级分含有不超过约5％的3/4抗体。
85.实施方案77的方法，其中所述级分含有
a)至少约95％-100％的多特异性抗体；
b)不超过约1％-5％的未配对抗体臂；
c)不超过约1％-5％的抗体同二聚体；
d)不超过约1％或2％的HMWS；
e)不超过约1％或2％的LMWS；和
f)不超过约5％的3/4抗体。
86.一种组合物，包含通过实施方案1-85中任一项的方法纯化的多特异性抗体。
87.一种组合物，包含通过实施方案1-85中任一项的方法纯化的多特异性抗体，用于治疗癌症或眼病。
88.一种用多步层析法纯化含有Fc区的异二聚体多肽的方法，其中该方法包括亲和层析步骤，然后是两个不同的多模式离子交换层析步骤，
从而纯化含有Fc区的异二聚体多肽。
89.根据实施方案88的方法，其中所述多步层析方法包括
i.亲和层析步骤，然后是多模式阴离子交换层析步骤，然后是多模式阳离子交换层析步骤
或
ii.亲和层析步骤，然后是多模式阳离子交换层析步骤，然后是多模式阴离子交换层析步骤。
90.根据实施方案88-89中任一项的方法，其中所述多步层析方法包括亲和层析步骤，然后是多模式阴离子交换层析步骤，然后是多模式阳离子交换层析步骤。
91.根据实施方案88-90中任一项的方法，其中所述多步层析方法包括正好三个层析步骤。
92.根据实施方案89-91中任一项的方法，其中所述多模式阴离子交换层析步骤以流穿模式进行。
93.根据实施方案89-92中任一项的方法，其中在多模式阴离子交换层析步骤中，将含有Fc区的异二聚体多肽应用于电导率值小于7mS/cm的溶液中。
94.根据实施方案89-93中任一项的方法，其中在多模式阴离子交换层析步骤中，将含有Fc-区的异二聚体多肽应用于电导率值在约6mS/cm至约2mS/cm的范围内的溶液中。
95.根据实施方案89-94中任一项的方法，其中在多模式阴离子交换层析步骤中，将含有Fc区的异二聚体多肽应用于电导率值为约4.5mS/cm的溶液中。
96.根据实施方案89-95中任一项的方法，其中多模式阴离子交换层析步骤在约7的pH下进行。
97.根据实施方案89-96中任一项的方法，其中在多模式阴离子交换层析步骤中，将含Fc区的异二聚体多肽应用于电导率为约4.5mS/cm且pH为约7的溶液中。
98.根据实施方案89-97中任一项的方法，其中在多模式阴离子交换层析步骤中，将含有Fc-区的异二聚体多肽以每升层析材料约100g至约300g的范围施用。
99.根据实施方案89-98中任一项的方法，其中所述多模式阴离子交换层析材料是多模式强阴离子交换层析材料。
100.根据实施方案89-99中任一项的方法，其中所述多模式阴离子交换层析材料具有高流动琼脂糖基质，作为配体的多模式强阴离子交换剂，36-44μm的平均粒径和0.08至0.11mmol Cl-/mL培养基的离子容量。
101.根据实施方案89-100中任一项的方法，其中所述多模式阳离子交换层析介质是多模式弱阳离子交换层析介质。
102.根据实施方案89-101中任一项的方法，其中所述多模式阳离子交换层析介质具有高流速琼脂糖基质，作为配体的多模式弱阳离子交换剂，36-44μm的平均粒径和25至39μmol/mL的离子容量。
103.根据实施方案89-102中任一项的方法，其中所述多模式阴离子交换层析步骤以结合和洗脱模式进行。
104.根据实施方案88-103中任一项的方法，其中所述亲和层析是蛋白A亲和层析或蛋白G亲和层析或单链Fv配体亲和层析或用CaptureSelect层析材料的层析步骤或用CaptureSelect FcXL层析材料的层析步骤。
105.根据实施方案88-104中任一项的方法，其中所述亲和层析步骤是蛋白A层析步骤。
106.根据实施方案88-105中任一项的方法，其中所述亲和层析步骤是使用CaptureSelectTM层析材料的层析步骤。
107.根据实施方案88-106中任一项的方法，其中含有Fc-区的异二聚体多肽是抗体、双特异性抗体或Fc-融合蛋白。
108.根据实施方案88-107中任一项的方法，其中含有Fc区的异二聚体多肽是双特异性抗体。
109.根据实施方案90-108中任一项的方法，其中含有Fc-区的异二聚体多肽是CrossMab。
110.根据实施方案90-109中任一项的方法，其中含有Fc-区的异二聚体多肽是双特异性抗体，该双特异性抗体包含
a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链；和
b)特异性结合第二抗原的全长抗体的修饰重链和修饰轻链，其中恒定结构域CL和CH1彼此替换。
111.根据实施方案108-110中任一项的方法，其中所述双特异性抗体结合ANG2和VEGF。
112.根据实施方案108-110中任一项的方法，其中所述CrossMab结合ANG2和VEGF。
113.根据实施方案108-112中任一项的方法，其中所述双特异性抗体是vanucizumab。
114.根据实施方案108-112中任一项的方法，其中所述双特异性抗体包含第一抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：1，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：2；和第二抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：3，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：4。
115.根据实施方案108-112中任一项的方法，其中所述双特异性抗体包含具有SEQID NO：9的氨基酸序列的第一重链和具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的第二重链以及具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的第一轻链和具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的第二轻链。
116.根据实施方案108-112中任一项的方法，其中所述双特异性抗体包含第一抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：5，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：6；以及第二抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：7，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：8。
117.根据实施方案108-112中任一项的方法，其中所述双特异性抗体包含具有SEQID NO：13的氨基酸序列的第一重链和具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的第二重链以及具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的第一轻链和具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的第二轻链。
118.实施方案108-117中任一项的方法，其中所述纯化的含有Fc-区的异二聚体多肽含有不超过约5％的3/4抗体。
119.一种用多步层析方法纯化结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体的方法，其中该方法包括亲和层析步骤，然后是多模式阴离子交换层析步骤，然后是多模式阳离子交换层析步骤，
从而纯化结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体，
其中所述双特异性抗体包含第一抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：1，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：2；和第二抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：3，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：4，
或者包含第一抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：5，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：6；和第二抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：7，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：8。
120.根据实施方案119的方法，其中所述双特异性抗体结合ANG-2和VEGF，包含
a)包含第一抗原结合位点的第一全长抗体的重链和轻链；和
b)包含第二抗原结合位点的全长抗体的修饰重链和修饰轻链，其中恒定结构域CL和CH1彼此替换。
121.一种包含双特异性抗体的组合物，其中所述组合物含有至少约95％的双特异性抗体。
122.实施方案121的组合物，其中所述组合物含有不超过约5％的未配对抗体臂。
123.实施方案121或122的组合物，其中所述组合物含有不超过约5％的抗体同二聚体。
124.一种包含CrossMab抗体的组合物，其中所述组合物含有至少95％的CrossMab抗体。
125.实施方案121-124中任一项的组合物，其中所述组合物包含不超过约2％的聚集体或高分子量种类(HMWS)。
126.实施方案121-125中任一项的组合物，其中所述组合物包含不超过约2％的低分子量种类(LMWS)。
127.实施方案121-126中任一项的组合物，其中所述组合物含有不超过约50％的酸性变体。
128.实施方案121-127中任一项的组合物，其中所述组合物含有不超过约35％的碱性变体。
129.实施方案121-128中任一项的组合物，其中所述组合物含有不超过约5％的3/4抗体。
130.实施方案121或122的组合物，其中所述组合物含有
a)至少约95％-100％的多特异性抗体；
b)不超过约1％-5％的未配对抗体臂；
c)不超过约1％-5％的抗体同二聚体；
d)不超过约1％或2％的HMWS；
e)不超过约1％或2％的LMWS；和
f)不超过约5％的3/4抗体。
131.实施方案121-130中任一项的组合物，其中所述双特异性抗体结合ANG-2和VEGF。
132.实施方案131的组合物，其中所述双特异性抗体与ANG-2和VEGF结合，包含
a)包含第一抗原结合位点的第一全长抗体的重链和轻链；和
b)包含第二抗原结合位点的全长抗体的修饰重链和修饰轻链，其中恒定结构域CL和CH1彼此替换。
133.一种组合物，其包含结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体，其中所述组合物含有不超过约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的3/4抗体。
134.实施方案133的组合物，其中结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体包含
a)包含第一抗原结合位点的第一全长抗体的重链和轻链；和
b)包含第二抗原结合位点的全长抗体的修饰重链和修饰轻链，其中恒定结构域CL和CH1彼此替换。
135.实施方案133或134的组合物，其中使用实施方案119的方法获得所述组合物。
136.根据实施方案88-118中任一项的方法用于纯化含Fc的异二聚体多肽的用途。
137.根据实施方案88-118中任一项的方法用于减少含Fc的异二聚体多肽相关杂质的用途。
138.用根据实施方案88-118中任一项的方法获得的含Fc的异二聚体多肽或使用实施方案119-120中任一项的方法获得的结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体，用于制备治疗癌症或眼病的药物。
139.从根据实施方案88-118中任一项的方法获得的含Fc的异二聚体多肽或使用实施方案119-120中任一项的方法获得的结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体，用于治疗癌症或眼病。
140.一种产生含Fc的异二聚体多肽的方法，包括以下步骤：
i.培养包含编码含Fc的异二聚体多肽的核酸的细胞，
ii.从细胞或培养基中回收含Fc的异二聚体蛋白质，
iii.用根据实施方案88-118中任一项的方法纯化含Fc的异二聚体多肽，
从而产生含Fc的异二聚体多肽。
141.一种产生使用实施方案119-120中任一项的方法获得的结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体的方法，包括以下步骤：
i.培养包含编码所述双特异性抗体的核酸的细胞，
ii.从细胞或培养基中回收所述双特异性抗体，
iii.根据实施方案119-120中任一项的方法纯化所述双特异性抗体，
从而产生结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体。

Claims (141)

1.一种从包含多特异性抗体和杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，所述方法包括以下的顺序步骤：
a)使组合物进行捕获层析以产生捕获层析洗脱液；
b)使捕获层析洗脱液进行第一混合模式层析以产生第一混合模式洗脱液；和
c)使第一混合模式洗脱液进行第二混合模式层析以产生第二混合模式洗脱液；和
d)收集包含多特异性抗体的级分，
其中该方法减少了来自所述组合物的产物特异性杂质的量。
2.权利要求1的方法，其中在第一混合模式层析之前使捕获层析洗脱液进行离子交换或HIC层析。
3.一种从包含多特异性抗体和杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，其中所述多特异性抗体的每个臂单独产生，所述方法包括顺序步骤：
a)使多特异性抗体的每个臂进行捕获层析以产生多特异性抗体的每个臂的捕获洗脱液，
b)在足以产生包含所述多特异性抗体的组合物的条件下，形成包含所述多特异性抗体的每个臂的捕获洗脱液的混合物，
c)使所述包含多特异性抗体的组合物进行第一混合模式层析以产生第一混合模式洗脱液，和
d)使第一混合模式洗脱液进行第二混合模式层析以产生第二混合模式洗脱液；和
e)收集包含所述多特异性抗体的级分，
其中该方法减少了来自所述组合物的产物特异性杂质的量。
4.权利要求3的方法，其中在第一混合模式层析之前，使所述包含多特异性抗体的组合物进行离子交换或HIC层析。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述捕获层析是亲和层析。
6.权利要求5的方法，其中所述亲和层析是蛋白L层析，蛋白A层析，蛋白G层析，蛋白A和蛋白G层析。
7.权利要求5或权利要求6的方法，其中所述亲和层析是蛋白A层析。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述捕获层析是以结合和洗脱模式进行。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中第一混合模式层析和第二混合模式层析是连续的。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中第一混合模式层析是混合模式阴离子交换层析。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中第二混合模式层析是混合模式阳离子交换层析。
12.权利要求1-9中任一项的方法，其中第一混合模式层析是混合模式阳离子交换层析。
13.权利要求1-10和12中任一项的方法，其中第二混合模式层析是混合模式阴离子交换层析。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中第一混合模式层析以结合和洗脱模式进行。
15.权利要求14的方法，其中所述洗脱是梯度洗脱。
16.权利要求1-13中任一项的方法，其中第一混合模式层析以流穿模式进行。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中第二混合模式层析以结合和洗脱模式进行。
18.权利要求17的方法，其中所述洗脱是梯度洗脱。
19.权利要求1-16中任一项的方法，其中第二混合模式层析以流穿模式进行。
20.权利要求1-19中任一项的方法，还包括使第二混合模式洗脱液进行超滤的步骤。
21.权利要求20的方法，其中超滤包括顺序的第一超滤、渗滤和第二超滤。
22.权利要求7-21中任一项的方法，其中蛋白A层析包含与琼脂糖连接的蛋白A。
23.权利要求7-21中任一项的方法，其中蛋白A层析是MAbSelectTM，MAbSelectTMSuRe和MAbSelectTMSuRe LX，Prosep-VA，Prosep-VA Ultra Plus，蛋白A琼脂糖凝胶fast flow或Toyopearl蛋白A层析。
24.权利要求7-23中任一项的方法，其中蛋白A层析使用蛋白A平衡缓冲液，蛋白A上样缓冲液或蛋白A洗涤缓冲液中的一种或多种，其中所述平衡缓冲液、上样缓冲液和/或洗涤缓冲液在约pH 7和约pH 8之间。
25.权利要求24的方法，其中蛋白A平衡缓冲液约为pH 7.7。
26.权利要求24或权利要求25的方法，其中蛋白A平衡缓冲液包含约25mM Tris和约25mM NaCl。
27.权利要求24-26中任一项的方法，其中在上样后用平衡缓冲液洗涤蛋白A层析。
28.权利要求7-27中任一项的方法，其中通过pH梯度洗脱从蛋白A层析中洗脱多特异性抗体。
29.权利要求7-28中任一项的方法，其中通过将具有低pH的蛋白A洗脱缓冲液应用于蛋白A层析，从蛋白A洗脱多特异性抗体。
30.权利要求29的方法，其中蛋白A洗脱缓冲液包含约150mM乙酸，约pH 2.9。
31.权利要求7-30中任一项的方法，其中合并蛋白A洗脱液，其中洗脱液的OD280大于约0.5。
32.权利要求10-31中任一项的方法，其中阴离子交换混合模式层析包含季胺和疏水部分。
33.权利要求32的方法，其中阴离子交换混合模式层析包括季胺和与高度交联的琼脂糖连接的疏水部分。
34.权利要求33的方法，其中混合模式层析是CaptoTM Adhere层析或CaptoTM AdhereImpRes层析。
35.权利要求11-34中任一项的方法，其中阳离子交换混合模式层析包含N-苄基-n-甲基乙醇胺。
36.权利要求35的方法，其中所述混合模式层析是CaptoTM MMC层析或CaptoTM MMCImpRes层析。
37.权利要求1-36中任一项的方法，其中第一混合模式层析使用混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液、混合模式上样缓冲液或混合模式洗涤缓冲液中的一种或多种，其中混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液、混合模式上样缓冲液和/或混合模式洗涤缓冲液在约pH6和约pH7之间。
38.权利要求1-37中任一项的方法，其中第二混合模式层析使用混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液、混合模式上样缓冲液或混合模式洗涤缓冲液中的一种或多种，其中混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液和/或混合模式洗涤缓冲液在约pH5和约pH8之间。
39.权利要求37或38的方法，其中混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液和/或混合模式洗涤缓冲液为约pH6.5。
40.权利要求37-39中任一项的方法，其中混合模式预平衡缓冲液包含约500mM乙酸盐。
41.权利要求37-40中任一项的方法，其中混合模式平衡缓冲液包含约50mM乙酸盐。
42.权利要求37-41中任一项的方法，其中第一混合模式层析在上样后用洗涤缓冲液洗涤。
43.权利要求37-42中任一项的方法，其中第二混合模式层析在上样后用洗涤缓冲液洗涤。
44.权利要求15和18-43中任一项的方法，其中通过pH梯度从第一混合模式层析中洗脱所述多特异性抗体。
45.权利要求15和18-44中任一项的方法，其中通过将具有低pH的混合模式洗脱缓冲液应用于混合模式离子交换层析，从第一混合模式层析中洗脱所述多特异性抗体。
46.权利要求15和18-45中任一项的方法，其中通过pH梯度从第二混合模式层析中洗脱所述多特异性抗体。
47.权利要求15和18-46中任一项的方法，其中通过将具有低pH的混合模式洗脱缓冲液应用于混合模式交换层析，从第二混合模式层析中洗脱所述多特异性抗体。
48.权利要求2和4-47中任一项的方法，其中所述离子交换层析包含季胺。
49.权利要求48的方法，其中所述离子交换层析是阴离子交换层析，并且其中所述阴离子交换层析包含与交联琼脂糖连接的季胺。
50.权利要求49的方法，其中所述混合模式阴离子交换层析是CaptoAdhere层析。
51.权利要求48-50中任一项的方法，其中所述阴离子交换层析使用阴离子交换预平衡缓冲液、阴离子交换平衡缓冲液或阴离子交换上样缓冲液中的一种或多种，其中阴离子交换预平衡缓冲液、阴离子交换平衡缓冲液和/或阴离子交换上样缓冲液在约pH6和约pH8之间。
52.权利要求51的方法，其中所述阴离子交换预平衡缓冲液、阴离子交换平衡缓冲液和/或阴离子交换上样约为pH6.5。
53.权利要求51或权利要求52的方法，其中所述阴离子交换预平衡缓冲液包含约50mMTris，500mM乙酸钠。
54.权利要求51-53中任一项的方法，其中所述阴离子交换平衡缓冲液包含约50mMTris。
55.权利要求51-54中任一项的方法，其中所述阴离子交换层析在上样后用阴离子交换平衡缓冲液洗涤。
56.权利要求51-55中任一项的方法，其中通过盐梯度从阴离子交换层析中洗脱所述多特异性抗体。
57.权利要求51-56中任一项的方法，其中通过将具有增加的盐浓度的阴离子交换洗脱缓冲液应用于阴离子交换层析，从阴离子交换层析中洗脱多特异性抗体。
58.权利要求57的方法，其中阴离子交换洗脱缓冲液包含约pH8.5的约50mM Tris，100mM乙酸钠。
59.权利要求51-58中任一项的方法，其中合并阴离子交换洗脱液，其中洗脱液的OD280大于约0.5至约2.0。
60.权利要求1-59中任一项的方法，其中所述多特异性抗体的臂在细胞中产生。
61.权利要求60的方法，其中所述细胞是原核细胞。
62.权利要求61的方法，其中所述原核细胞是大肠杆菌细胞。
63.权利要求61或权利要求62的方法，其中所述细胞经工程改造以表达一种或多种分子伴侣。
64.权利要求63的方法，其中所述分子伴侣是FkpA、DsbA或DsbC中的一种或多种。
65.权利要求63或权利要求64的方法，其中所述分子伴侣是大肠杆菌分子伴侣。
66.权利要求1-60中任一项的方法，其中所述细胞是真核细胞。
67.权利要求66的方法，其中所述真核细胞是酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
68.权利要求66或权利要求67的方法，其中所述真核细胞是CHO细胞。
69.权利要求60-68中任一项的方法，其中在捕获层析之前裂解所述细胞以产生包含多特异性抗体或多特异性抗体的臂的细胞裂解物。
70.权利要求69的方法，其中使用微流化器裂解细胞。
71.权利要求69或权利要求70的方法，其中在层析之前将聚乙烯亚胺(PEI)加入细胞裂解物中。
72.权利要求1-71中任一项的方法，其中所述方法减少组合物中宿主细胞蛋白(HCP)、浸出蛋白A、核酸、细胞培养基组分或病毒杂质中的任何一种的量。
73.权利要求1-72中任一项的方法，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体。
74.权利要求73的方法，其中所述双特异性抗体是旋钮入孔(KiH)双特异性抗体。
75.权利要求73或权利要求74的方法，其中所述双特异性抗体是CrossMab双特异性抗体。
76.权利要求1-75中任一项的方法，其中所述级分含有至少约95％的多特异性抗体。
77.权利要求1-76中任一项的方法，其中所述产物特异性杂质是未配对抗体臂、抗体同二聚体、聚集体、高分子量种类(HMWS)、低分子量种类(LMWS)、酸性变体或碱性变体中的一种或多种。
78.权利要求77的方法，其中所述级分含有不超过约5％的未配对抗体臂。
79.权利要求77或权利要求78的方法，其中所述级分含有不超过约5％的抗体同二聚体。
80.权利要求77-79中任一项的方法，其中所述级分含有不超过约2％的聚集体或高分子量种类(HMWS)。
81.权利要求77-80中任一项的方法，其中所述级分含有不超过约2％的LMWS。
82.权利要求77-81中任一项的方法，其中所述级分含有不超过约50％的酸性变体。
83.权利要求77-82中任一项的方法，其中所述级分含有不超过约35％的碱性变体。
84.权利要求77-83中任一项的方法，其中所述级分含有不超过约5％的3/4抗体。
85.权利要求77的方法，其中所述级分含有
a)至少约95％-100％的多特异性抗体；
b)不超过约1％-5％的未配对抗体臂；
c)不超过约1％-5％的抗体同二聚体；
d)不超过约1％或2％的HMWS；
e)不超过约1％或2％的LMWS；和
f)不超过约5％的3/4抗体。
86.一种组合物，包含通过权利要求1-85中任一项的方法纯化的多特异性抗体。
87.一种组合物，包含通过权利要求1-85中任一项的方法纯化的多特异性抗体，用于治疗癌症或眼病。
88.一种用多步层析法纯化含有Fc区的异二聚体多肽的方法，其中该方法包括亲和层析步骤，然后是两个不同的多模式离子交换层析步骤，
从而纯化含有Fc区的异二聚体多肽。
89.根据权利要求88的方法，其中所述多步层析方法包括
i.亲和层析步骤，然后是多模式阴离子交换层析步骤，然后是多模式阳离子交换层析步骤
或
ii.亲和层析步骤，然后是多模式阳离子交换层析步骤，然后是多模式阴离子交换层析步骤。
90.根据权利要求88-89中任一项的方法，其中所述多步层析方法包括亲和层析步骤，然后是多模式阴离子交换层析步骤，然后是多模式阳离子交换层析步骤。
91.根据权利要求88-90中任一项的方法，其中所述多步层析方法包括正好三个层析步骤。
92.根据权利要求89-91中任一项的方法，其中所述多模式阴离子交换层析步骤以流穿模式进行。
93.根据权利要求89-92中任一项的方法，其中在多模式阴离子交换层析步骤中，将含有Fc区的异二聚体多肽应用于电导率值小于7mS/cm的溶液中。
94.根据权利要求89-93中任一项的方法，其中在多模式阴离子交换层析步骤中，将含有Fc-区的异二聚体多肽应用于电导率值在约6mS/cm至约2mS/cm的范围内的溶液中。
95.根据权利要求89-94中任一项的方法，其中在多模式阴离子交换层析步骤中，将含有Fc区的异二聚体多肽应用于电导率值为约4.5mS/cm的溶液中。
96.根据权利要求89-95中任一项的方法，其中多模式阴离子交换层析步骤在约7的pH下进行。
97.根据权利要求89-96中任一项的方法，其中在多模式阴离子交换层析步骤中，将含Fc区的异二聚体多肽应用于电导率为约4.5mS/cm且pH为约7的溶液中。
98.根据权利要求89-97中任一项的方法，其中在多模式阴离子交换层析步骤中，将含有Fc-区的异二聚体多肽以每升层析材料约100g至约300g的范围施用。
99.根据权利要求89-98中任一项的方法，其中所述多模式阴离子交换层析材料是多模式强阴离子交换层析材料。
100.根据权利要求89-99中任一项的方法，其中所述多模式阴离子交换层析材料具有高流动琼脂糖基质，作为配体的多模式强阴离子交换剂，36-44μm的平均粒径和0.08至0.11mmol Cl-/mL培养基的离子容量。
101.根据权利要求89-100中任一项的方法，其中所述多模式阳离子交换层析介质是多模式弱阳离子交换层析介质。
102.根据权利要求89-101中任一项的方法，其中所述多模式阳离子交换层析介质具有高流速琼脂糖基质，作为配体的多模式弱阳离子交换剂，36-44μm的平均粒径和25至39μmol/mL的离子容量。
103.根据权利要求89-102中任一项的方法，其中所述多模式阴离子交换层析步骤以结合和洗脱模式进行。
104.根据权利要求88-103中任一项的方法，其中所述亲和层析是蛋白A亲和层析或蛋白G亲和层析或单链Fv配体亲和层析或用CaptureSelect层析材料的层析步骤或用CaptureSelect FcXL层析材料的层析步骤。
105.根据权利要求88-104中任一项的方法，其中所述亲和层析步骤是蛋白A层析步骤。
106.根据权利要求88-105中任一项的方法，其中所述亲和层析步骤是使用CaptureSelectTM层析材料的层析步骤。
107.根据权利要求88-106中任一项的方法，其中含有Fc-区的异二聚体多肽是抗体、双特异性抗体或Fc-融合蛋白。
108.根据权利要求88-107中任一项的方法，其中含有Fc区的异二聚体多肽是双特异性抗体。
109.根据权利要求90-108中任一项的方法，其中含有Fc-区的异二聚体多肽是CrossMab。
110.根据权利要求90-109中任一项的方法，其中含有Fc-区的异二聚体多肽是双特异性抗体，该双特异性抗体包含
a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链；和
b)特异性结合第二抗原的全长抗体的修饰重链和修饰轻链，其中恒定结构域CL和CH1彼此替换。
111.根据权利要求108-110中任一项的方法，其中所述双特异性抗体结合ANG2和VEGF。
112.根据权利要求108-110中任一项的方法，其中所述CrossMab结合ANG2和VEGF。
113.根据权利要求108-112中任一项的方法，其中所述双特异性抗体是vanucizumab。
114.根据权利要求108-112中任一项的方法，其中所述双特异性抗体包含第一抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：1，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：2；和第二抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：3，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：4。
115.根据权利要求108-112中任一项的方法，其中所述双特异性抗体包含具有SEQ IDNO：9的氨基酸序列的第一重链和具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的第二重链以及具有SEQID NO：11的氨基酸序列的第一轻链和具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的第二轻链。
116.根据权利要求108-112中任一项的方法，其中所述双特异性抗体包含第一抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：5，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：6；以及第二抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：7，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：8。
117.根据权利要求108-112中任一项的方法，其中所述双特异性抗体包含具有SEQ IDNO：13的氨基酸序列的第一重链和具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的第二重链以及具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的第一轻链和具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的第二轻链。
118.权利要求108-117中任一项的方法，其中所述纯化的含有Fc-区的异二聚体多肽含有不超过约5％的3/4抗体。
119.一种用多步层析方法纯化结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体的方法，其中该方法包括亲和层析步骤，然后是多模式阴离子交换层析步骤，然后是多模式阳离子交换层析步骤，
从而纯化结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体，
其中所述双特异性抗体包含第一抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：1，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：2；和第二抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：3，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：4，
或者包含第一抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：5，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：6；和第二抗原结合位点，其包含作为重链可变结构域(VH)的SEQ ID NO：7，和作为轻链可变结构域(VL)的SEQ ID NO：8。
120.根据权利要求119的方法，其中所述双特异性抗体结合ANG-2和VEGF，包含
a)包含第一抗原结合位点的第一全长抗体的重链和轻链；和
b)包含第二抗原结合位点的全长抗体的修饰重链和修饰轻链，其中恒定结构域CL和CH1彼此替换。
121.一种包含双特异性抗体的组合物，其中所述组合物含有至少约95％的双特异性抗体。
122.权利要求121的组合物，其中所述组合物含有不超过约5％的未配对抗体臂。
123.权利要求121或122的组合物，其中所述组合物含有不超过约5％的抗体同二聚体。
124.一种包含CrossMab抗体的组合物，其中所述组合物含有至少95％的CrossMab抗体。
125.权利要求121-124中任一项的组合物，其中所述组合物包含不超过约2％的聚集体或高分子量种类(HMWS)。
126.权利要求121-125中任一项的组合物，其中所述组合物包含不超过约2％的低分子量种类(LMWS)。
127.权利要求121-126中任一项的组合物，其中所述组合物含有不超过约50％的酸性变体。
128.权利要求121-127中任一项的组合物，其中所述组合物含有不超过约35％的碱性变体。
129.权利要求121-128中任一项的组合物，其中所述组合物含有不超过约5％的3/4抗体。
130.权利要求121或122的组合物，其中所述组合物含有
a)至少约95％-100％的多特异性抗体；
b)不超过约1％-5％的未配对抗体臂；
c)不超过约1％-5％的抗体同二聚体；
d)不超过约1％或2％的HMWS；
e)不超过约1％或2％的LMWS；和
f)不超过约5％的3/4抗体。
131.权利要求121-130中任一项的组合物，其中所述双特异性抗体结合ANG-2和VEGF。
132.权利要求131的组合物，其中所述双特异性抗体与ANG-2和VEGF结合，包含
a)包含第一抗原结合位点的第一全长抗体的重链和轻链；和
b)包含第二抗原结合位点的全长抗体的修饰重链和修饰轻链，其中恒定结构域CL和CH1彼此替换。
133.一种组合物，其包含结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体，其中所述组合物含有不超过约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的3/4抗体。
134.权利要求133的组合物，其中结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体包含
a)包含第一抗原结合位点的第一全长抗体的重链和轻链；和
b)包含第二抗原结合位点的全长抗体的修饰重链和修饰轻链，其中恒定结构域CL和CH1彼此替换。
135.权利要求133或134的组合物，其中使用权利要求119的方法获得所述组合物。
136.根据权利要求88-118中任一项的方法用于纯化含Fc的异二聚体多肽的用途。
137.根据权利要求88-118中任一项的方法用于减少含Fc的异二聚体多肽相关杂质的用途。
138.用根据权利要求88-118中任一项的方法获得的含Fc的异二聚体多肽或使用权利要求119-120中任一项的方法获得的结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体，用于制备治疗癌症或眼病的药物。
139.从根据权利要求88-118中任一项的方法获得的含Fc的异二聚体多肽或使用权利要求119-120中任一项的方法获得的结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体，用于治疗癌症或眼病。
140.一种产生含Fc的异二聚体多肽的方法，包括以下步骤：
i.培养包含编码含Fc的异二聚体多肽的核酸的细胞，
ii.从细胞或培养基中回收含Fc的异二聚体蛋白质，
iii.用根据权利要求88-118中任一项的方法纯化含Fc的异二聚体多肽，
从而产生含Fc的异二聚体多肽。
141.一种产生使用权利要求119-120中任一项的方法获得的结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体的方法，包括以下步骤：
i.培养包含编码所述双特异性抗体的核酸的细胞，
ii.从细胞或培养基中回收所述双特异性抗体，
iii.根据权利要求119-120中任一项的方法纯化所述双特异性抗体，
从而产生结合ANG-2和VEGF的双特异性抗体。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113563469A (zh) * 2020-04-28 2021-10-29 江苏中新医药有限公司 高回收率纯化阿达木单抗的方法
CN114026108A (zh) * 2019-06-28 2022-02-08 信达生物制药(苏州)有限公司 无缝连续流层析方法
CN114981286A (zh) * 2019-05-03 2022-08-30 豪夫迈·罗氏有限公司 降低从纯化平台获得的组合物中酶水解活性速率的方法

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
RU2744860C2 (ru) 2015-12-30 2021-03-16 Кодиак Сайенсиз Инк. Антитела и их конъюгаты
EP3676280A1 (en) * 2017-08-30 2020-07-08 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for purifying anti-il-6 receptor antibodies
CN111491951B (zh) * 2017-12-22 2024-05-24 豪夫迈·罗氏有限公司 通过疏水相互作用色谱法耗尽轻链错配的抗体变体
WO2019149693A1 (en) * 2018-01-30 2019-08-08 Univercells S.A. Protein purification process and platform
US20210040146A1 (en) * 2018-01-30 2021-02-11 Exothera S.A. Protein purification process
CN111423512B (zh) * 2019-01-10 2024-01-05 北京比洋生物技术有限公司 阻断血管内皮细胞生长且活化t细胞的多靶向融合蛋白和包含其的药物组合物
WO2020160118A1 (en) 2019-01-29 2020-08-06 Shire-Nps Pharmaceuticals, Inc. Parathyroid hormone variants
EP4041312A4 (en) 2019-10-10 2023-12-20 Kodiak Sciences Inc. METHOD FOR TREATING AN EYE DISORDER
KR20220092958A (ko) * 2019-11-07 2022-07-04 암젠 인크 산물-관련 불순물을 제거하기 위한 양이온 교환 크로마토그래피 동안의 고염 세척
JP2023510382A (ja) * 2020-01-15 2023-03-13 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 組換えタンパク質製造プロセスから不純物を減少させる方法
KR102154952B1 (ko) * 2020-02-21 2020-09-10 프레스티지바이오로직스 주식회사 아달리무맙의 Non-Protein A 정제방법
CN115066258A (zh) * 2020-02-28 2022-09-16 上海药明生物技术有限公司 双特异性抗体的纯化
CN115734969A (zh) * 2020-04-13 2023-03-03 上海药明生物技术有限公司 双特异性抗体的纯化
CN114014906B (zh) * 2020-06-24 2024-01-12 夏尔巴生物技术(苏州)有限公司 一种利用阳离子交换层析纯化疏水性蛋白的方法
CN114539416A (zh) * 2020-11-26 2022-05-27 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种双特异性抗体的层析纯化工艺
KR20230154043A (ko) * 2021-03-09 2023-11-07 제이씨알 파마 가부시키가이샤 항체-리소좀 효소 융합 단백질의 제조 방법
US20240191179A1 (en) * 2021-04-23 2024-06-13 Kyowa Kirin Co., Ltd. Method for suppressing production of degradation products
WO2022222949A1 (zh) * 2021-04-23 2022-10-27 和铂医药(上海)有限责任公司 一种双特异性抗体的纯化方法
WO2022272119A2 (en) * 2021-06-25 2022-12-29 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Synthetic toolkit for plant transformation
KR20230057280A (ko) * 2021-10-19 2023-04-28 (주)알테오젠 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 정제방법
WO2024076990A1 (en) * 2022-10-03 2024-04-11 Therini Bio, Inc. Multi-specific antigen binding proteins which bind human fibrin or fibrinogen ?c domain and vascular endothelial growth factor and methods of use

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011117329A1 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific, bivalent anti-vegf/anti-ang-2 antibodies
CN103201288A (zh) * 2010-11-05 2013-07-10 霍夫曼-拉罗奇有限公司 通过混合模式层析捕捉抗体的优化方法
WO2014009465A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Roche Glycart Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
WO2015070068A1 (en) * 2013-11-07 2015-05-14 Abbvie Inc. Isolation and purification of antibodies
WO2016018740A2 (en) * 2014-07-26 2016-02-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Purification platform for bispecific antibodies
CN105473612A (zh) * 2013-08-19 2016-04-06 豪夫迈·罗氏有限公司 用羟基磷灰石层析分离双特异性抗体和双特异性抗体生产副产物

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
EP0479909B1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
DE69308573T2 (de) 1992-08-17 1997-08-07 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
JP3095175B2 (ja) 1992-11-13 2000-10-03 アイデック ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのヒトｂリンパ球限定分化抗原に対するキメラ抗体と放射能標識抗体の療法利用
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
ATE299938T1 (de) 1997-05-02 2005-08-15 Genentech Inc Ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
AU2002245142B2 (en) 2000-12-14 2007-07-05 Genentech, Inc. Prokaryotically produced antibodies and uses thereof
EP1345967B1 (en) 2000-12-22 2011-08-10 Grad, Carole, Legal representative of Kaplan, Howard Phage display libraries of human v h fragments
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
CN1845938B (zh) 2003-06-30 2010-05-26 杜门蒂斯有限公司 多肽
AU2004309347B2 (en) 2003-12-19 2010-03-04 Genentech, Inc. Monovalent antibody fragments useful as therapeutics
AU2005216847B2 (en) * 2004-02-27 2010-04-01 Cytiva Bioprocess R&D Ab A process for the purification of antibodies
DK1791565T3 (en) 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
CN100475965C (zh) 2005-07-22 2009-04-08 上海高科联合生物技术研发有限公司 一种大肠杆菌高效外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法
EP2035456A1 (en) 2006-06-22 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
PL2059533T3 (pl) 2006-08-30 2013-04-30 Genentech Inc Przeciwciała wieloswoiste
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
DE102008048942B4 (de) 2008-09-25 2011-01-13 Siemens Aktiengesellschaft Anordnung mit einer Wellendichtung
PE20120591A1 (es) 2009-04-02 2012-05-23 Roche Glycart Ag Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla
PL2417156T3 (pl) 2009-04-07 2015-07-31 Roche Glycart Ag Trójwartościowe, bispecyficzne przeciwciała
JP5719354B2 (ja) 2009-05-27 2015-05-20 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 三重又は四重特異性抗体
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
DK2560683T4 (da) 2010-04-23 2022-08-29 Hoffmann La Roche Fremstilling af heteromultimeriske proteiner
BR112012029904A2 (pt) 2010-05-25 2017-08-08 Genentech Inc métodos de purificação de polipeptídeos
ES2682081T3 (es) 2011-10-11 2018-09-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Ensamblaje mejorado de anticuerpos biespecíficos
ES2657377T3 (es) * 2012-09-11 2018-03-05 Coherus Biosciences, Inc. Etanercept plegado correctamente con alta pureza y excelente rendimiento
WO2015135884A1 (en) * 2014-03-10 2015-09-17 Richter Gedeon Nyrt. Immunoglobulin purification using pre-cleaning steps

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011117329A1 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific, bivalent anti-vegf/anti-ang-2 antibodies
CN103201288A (zh) * 2010-11-05 2013-07-10 霍夫曼-拉罗奇有限公司 通过混合模式层析捕捉抗体的优化方法
WO2014009465A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Roche Glycart Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
CN105473612A (zh) * 2013-08-19 2016-04-06 豪夫迈·罗氏有限公司 用羟基磷灰石层析分离双特异性抗体和双特异性抗体生产副产物
WO2015070068A1 (en) * 2013-11-07 2015-05-14 Abbvie Inc. Isolation and purification of antibodies
WO2016018740A2 (en) * 2014-07-26 2016-02-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Purification platform for bispecific antibodies

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELLEN O’CONNOR ET AL.: ""Monoclonal antibody fragment removal mediated by mixed mode resins"", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 *
SOPHIE MARIA ET AL.: ""Purification process of recombinant monoclonal antibodies with mixed mode chromatography"", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 *
XIAOYU YANG ET AL.: ""Analysis and purification of IgG4 bispecific antibodies by a mixed-mode chromatography"", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 *
王文英 等: ""快速蛋白液相色谱系统阴离子交换层析纯化人抗地高辛单链抗体"", 《军医进修学院学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114981286A (zh) * 2019-05-03 2022-08-30 豪夫迈·罗氏有限公司 降低从纯化平台获得的组合物中酶水解活性速率的方法
CN114026108A (zh) * 2019-06-28 2022-02-08 信达生物制药(苏州)有限公司 无缝连续流层析方法
CN113563469A (zh) * 2020-04-28 2021-10-29 江苏中新医药有限公司 高回收率纯化阿达木单抗的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA3026518A1 (en) 2017-12-21
KR20230113662A (ko) 2023-07-31
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JP2019521986A (ja) 2019-08-08
IL263690B2 (en) 2023-05-01
BR112018075516A2 (pt) 2019-10-01

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