CN113563469A - 高回收率纯化阿达木单抗的方法 - Google Patents
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Abstract
一种纯化阿达木单抗的方法，其特征是：使用复合阴离子层析方法去除阿达木单抗中的聚集体和酸性成分，具体步骤是将待层析的阿达木单抗粗品原料先经过一次或多次柱层析纯化后的产物，然后进行复合阴离子层析流穿模式纯化。实验证实，用本方法得到的阿达木单抗产物纯度高于99.5％，酸性成分少于12.5％，HCP小于5ppm，且回收率大于90％。本方法操作简单，纯化效率高，便于产业化生产。
Description
技术领域：
本发明涉及一种单克隆抗体的纯化方法，具体涉及采用复合阴离子层析高回收率纯化阿达木单抗的方法。
背景技术：
阿达木单抗为全人源抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)单克隆抗体，主要用于治疗类风湿性关节炎，强直性脊柱炎，银屑病关节炎等。
阿达木单抗由基因工程的中国仓鼠卵巢细胞培养获得。CHO培养上清中除了包含阿达木单抗，还含有大量的污染物杂质，需纯化去除。
主要影响阿达木单抗纯化的污染物杂质为聚集体、酸性成分及HCP(宿主细胞蛋白)，其中，聚集体、酸性成分是最难去除的杂质，因为通常聚集体及酸性成分由于理化性质与正常阿达木单抗分析相似，使用传统层析方法去除对目标产物阿达木单抗损失较大，回收率低。
目前，对阿达木单抗纯化的报道有：专利CN101454025A为阿达木单抗原研公司专利，采用阳离子交换进行捕获，以降低样品HCP，进而使用疏水、阴离子层析进行进一步纯化；专利CN104098697A、CN108101987A采用阳离子交换层析纯化阿达木单抗，以清除酸性成分；专利CN105837687A采用复合层析MEP代替protein A进行捕获阿达木单抗，能够去除一部分多聚体及大部分宿主蛋白；专利CN105777904A采用阳离交换纯化阿达木单抗，特点是洗脱过程添加添加剂，以清除多聚体；专利CN105777896B使用MEP填料及弱阳离子填料纯化阿达木单抗，能够有效去除酸性成分，可将酸性成分控制在11-14％。
以上方法都是主要采用常规的阳离子交换层析清除杂质，采用的操作为增加中间清洗步骤，清洗去除杂质成分。这些操作往往仅对HCP清除有较好的作用，但由于酸性成分及聚集体与目标成分性质相近，通过该方式清除常常造成比较大的回收率损失。
因此，去除阿达木单抗中的聚集体和酸性成分，又保证有较高回收率，尽量少损失有效成分，是阿达木单抗纯化中的难点。
发明内容
本发明的目的是提供一种阿达木单抗纯化方法，不仅可以有效去除阿达木单抗中的聚集体、酸性成分及HCP，还能保证有较高回收率，且操作方便，便于工业化生产。
本发明人首次将复合阴离子填料用于纯化阿达木单抗，达到了上述发明目的。使用简单的流穿模式就能够同时有效去除聚集体、酸性成分及HCP，且回收率大于90％。
本发明发现，在使用复合阴离子填料进行纯化阿达木单抗时，pH、盐浓度、载量均会影响最终产品纯度及回收率。
本发明用阳离子填料进行了纯化阿达木单抗的两个对比实验：用POROS XS中间清洗方式(见对比实验1)，和POROS XS过载上样方式(见对比实验2)，清除聚集体及酸性成分。
用阳离子填料纯化的对比实验发现，只有高pH情况下清除酸性成分效果优于其它pH；但即使在该条件下，回收率仍不高，仅75％-80％，损失较大。
本发明通过DOE实验设计的方式进行了复合阴离子填料上样条件响应面优化(见实施例1)，并进行了复合阴离子填料上样条件响应面结果验证(见实施例2)，得到了最佳的纯化结果，能够同时有效去除去除聚集体、酸性成分及HCP，而且回收率高。
方法如下：
一种去除阿达木单抗中的聚集体和酸性成分的方法,其特征是进行复合阴离子层析,具体步骤如下：
1)对复合阴离子填料进行平衡,即将平衡缓冲液流过所述材料；
2)将阿达木单抗粗品加载于复合阴离子填料上，使其流过填料,开始收集流穿；
3)加载结束后，进行顶洗，根据收集原则结束收集流穿；
4)使用再生缓冲液再生复合阴离子填料。
步骤1)在样品加载于复合阴离子填料前，采用平衡缓冲液对填料进行平衡。具体来说，所用平衡缓冲液是缓冲盐和NaCl的水溶液，平衡缓冲液应同时满足以下条件：
A缓冲盐种类为Tris或磷酸盐，浓度为20-50mM；
B NaCl浓度为200-500mM；
C pH范围为7.1-8.0；
步骤2)中，所述“阿达木单抗粗品”是本发明方法的待纯化物质，由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞重组宿主细胞培养物表达的重组生产的阿达木单抗经过至少一次柱层析(protein A亲和层析或者protein A亲和层析与其它层析的组合)纯化的产物，含有阿达木单抗产品相关杂质(如聚集体、酸性成分等)以及其它污染物。阿达木单抗粗品应满足以下条件：
A所含缓冲盐种类为Tris或磷酸盐，浓度为20-50mM；
B所含NaCl浓度为200-500mM；
C pH范围为7.1-8.0；
步骤2)将阿达木单抗粗品加载于复合阴离子填料上，使其流过填料，加载量范围为50-90mg/ml，停留时间范围4-8min；
步骤3)所述“顶洗”指在粗品加载结束后，使用步骤2)中所述平衡缓冲液将所纯化后的阿达木单抗从复合阴离子层析柱洗出，该过程继续收集流穿样品，直至280nm吸收为280nm吸收最高点的1/10时结束收集。
步骤4)所述再生缓冲液为pH3的柠檬酸缓冲液。
所述复合阴离子填料优选Capto adhere或Capto adhere ImpRes。
本发明采用复合阴离子填料对阿达木单抗进行纯化，使用简单的流穿模式，能够有效去除聚集体、酸性成分及HCP。
实验证实，用本方法得到的产物纯度高于99.5％，酸性成分少于12.5％，HCP小于5ppm，且回收率大于90％。且采用流穿模式，操作简单，回收率高，纯化效率高，具有较高的工业应用价值。
附图说明
图1是复合阴离子层析纯化阿达木单抗过程，包括平衡、加载、顶洗及再生。
图2加载上样前样品、流穿样品及再生清洗样品SEC-HPLC分析
提供了复合阴离子层析过程样品的SEC-HPLC分析结果，结果显示聚集体大部分结合在柱上，经过该层析步骤，样品中的大部分聚集体得到清除。
图3加载上样前样品、流穿样品及再生清洗样品WCX-HPLC分析
提供了复合阴离子层析过程样品的WCX-HPLC分析结果，结果显示酸性成分更容易结合在柱上，使样品中的酸性成分得到部分清除。
具体实施方式
以下实施例仅用于举例说明本发明的方法和装置，并不限定本发明的范围。
以下提到的术语，其意义如下：
“阿达木单抗”为全人源抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)单克隆抗体，由基因工程的中国仓鼠卵巢细胞培养获得。
“污染物”指基因工程表达的在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)生产的阿达木单抗中含有的多种杂质，包括宿主细胞蛋白、聚集体及酸性成分等。
“聚集体”指阿达木单抗在生产或储存过程中，由于其本身特性，外界温度或其它物理因素的刺激，以及异物混入等等原因而造成分子以非共价或共价形式形成的大的分子形式。聚集体的产生不仅会影响药物的疗效，还会产生免疫原性影响安全性。
“酸性成分”指阿达木单抗在生产或储存过程中由于氨基酸修饰造成的等电点较低的成分。通常，造成阿达木单抗等电点变低的修饰主要为脱酰胺及唾液酸等。
“复合阴离子层析”指固定相载体上偶联的配基既有疏水性质又有阴离子交换性质，利用该性质对目标分子进行分离。商品化的复合阴离子层析材料主要为Capto adhere及Capto adhere ImpRes。
“载荷”指加载到复合阴离子层析材料上的粗品。
“缓冲液”指通过其酸-碱成对成分作用来抵抗pH变化的溶液。
“平衡缓冲液”指用在将所述粗品加载到复合阴离子层析材料上之前平衡复合阴离子层析材料的缓冲液。
“再生缓冲液”可用于再生复合阴离子层析填料，使它能够再次使用。再生缓冲液具有自复合阴离子层析填料清除基本上所有污染物及阿达木单抗的电导率和pH。
“电导率”指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。溶液电导率可以通过改变溶液的离子浓度来改变。
“加载”指将所述粗品流过复合阴离子层析材料，阿达木单抗流过复合阴离子层析材料而污染物结合至复合阴离子层析材料。
“再生”指再生缓冲液流过复合阴离子层析材料的过程。
Tris为三羟甲基氨基甲烷，PB指磷酸盐缓冲液。SEC-HPLC是分子排阻高效液相色谱，WCX-HPLC为弱阳离子交换高效液相色谱。
依照本发明，复合阴离子层析纯化方案通常包括以下按序步骤：(1)平衡复合阴离子层析材料；(2)将粗品加载到复合阴离子层析材料，收集流穿样品；(3)使用平衡缓冲液进行顶洗，收集样品；(4)使用再生缓冲液洗脱污染物。
本发明采用复合阴离子层析，使用流穿模式进行操作。平衡缓冲液及样品条件为优化的重点，一般而言，pH与盐浓度是决定阿达木单抗回收率及纯度的关键要素。本发明的实施方案中，缓冲液所用缓冲盐包括Tris、磷酸盐，优选地，选用Tris作为缓冲盐。缓冲液所用洗脱盐包括但不限于氯化钠、乙酸钠、氯化钾及硫酸铵，优选地，选用氯化钠作为洗脱盐。
通常，在将包含阿达木单抗和污染物的粗品加载到复合阴离子层析材料上之前，使平衡缓冲液流过所述材料。在本发明的优选实施方案中，平衡缓冲液具有约7.5至约8.0的pH，例如约pH7.7。平衡缓冲液盐浓度控制在约0.1M至0.5M NaCl范围内，例如约0.3MNaCl。一种示例性的平衡缓冲液包含20mM Tris-HCl，0.3M NaCl，pH7.7或20mM PB，0.35MNaCl，pH7.5。
平衡后，将包含阿达木单抗和污染物的粗品加载到复合阴离子层析材料上，所述粗品的pH在pH7.5至pH8范围中，例如pH7.7或pH8.0，盐浓度控制在约0.1M至0.5M NaCl范围内，例如约0.3M NaCl。在一个实施方案中，将来自protein A亲和洗脱的粗品加载到复合阴离子层析，停留时间6min，粗品蛋白浓度5-10mg/ml，加载密度约50-100g/L树脂，污染物结合至复合阴离子层析填料，阿达木单抗样品自柱上流穿下来。
加载后，使用平衡缓冲液进行顶洗，顶洗条件与平衡步骤相同，由于该模式为弱分配流穿模式，一般进行顶洗需大于15个柱体积，继续收集样品，直至洗到收集结束点，收集结束原则为280nm吸收最高点的1/10。
顶洗结束后，使用再生缓冲液洗脱再生复合阴离子层析材料。在再生缓冲液组成一般选择低pH值缓冲液，以产生电荷排斥作用达到再生的目的。在一个实施方案中，再生缓冲液为0.1M柠檬酸，pH3.0。
虽然涵盖别的其它步骤，但优选的是，本文中的复合阴离子层析纯化方法只由下列步骤组成：平衡，加载包含阿达木单抗及污染物的粗品，顶洗，和自层析柱上清除污染物的再生步骤。
实施例1阿达木单抗的复合阴离子层析纯化条件探索
1.1简介
本实验以复合阴离子填料Capto adhere作为阿达木单抗清除聚集体的关键步骤，采用流穿模式，优化Capto adhere上样条件的工艺参数。通过DoE实验设计的方法，首先通过单因素试验筛选影响Capto adhere的主要影响因素，根据三因素pH、盐浓度、载样量设计响应面，对流穿及上样前样品进行分析，检测指标为回收率、纯度，根据优化确定范围进行结果验证，最终确定Capto adhere上样条件。
1.2实验设计
DOE试验设计采用3因素响应面设计，3因素分别为pH、盐浓度、载量，pH范围为6.5-7.5、盐浓度为0.3M-0.6M，载量范围为50-150mg/ml。试验共需进行17组试验。
1.3实验过程
将Mabselect SuRe LX洗脱样品先经透析袋透析到20mM PB+0.3M NaCl pH6.5中，再根据DOE试验条件加NaCl及调pH后，0.22PES滤膜过滤，待上样。
试验采用1ml Capto adhere预装柱，停留时间3min，样品浓度10mg/ml，上样缓冲液20mM PB，NaCl及pH与DOE条件相对应，洗脱液为50mM柠檬酸盐，pH3。收集起止原则为50mAu A280-7％MaxA254，按照实验设计进行试验。
测定的响应值：1、纯度：使用SEC-HPLC测定；2、回收率：使用SEC-HPLC测定；
1.4SEC-HPLC分析
采用SEC-HPLC方法分析阿达木单抗纯度及回收率。色谱柱为TSK gel G3000SWXLcolumn,7.8x 300mm。流动相为20mM磷酸缓冲盐，300mM NaCl，pH6.8。分析时上样体积20μL，流速0.5mL/min，柱温30度，检测波长280/214nm，分析时间35min。比例计算采用面积归一化方法。
1.5回收率计算及数据统计分析
收率计算采用SEC-HPLC方法计算。产品回收率＝(洗脱产物单位进样量主峰峰面积*洗脱体积)/(上样前粗品单位进样量主峰峰面积*装载上样体积)*100％。
将纯度及回收率数据输入到Design Expert 8软件进行统计分析，设定条件回收率大于85％，纯度大于95％，预测结果如下表所示：结果如表1所示。从响应面结果分析可以看出，pH、盐浓度、载量均可影响最终产品纯度及回收率。
表1 Capto adhere响应面优化预测结果
1.6预测结果验证
根据表1预测结果，选取7.1/0.5M，7.7/0.35M及7.9/0.3M三个条件进行结果验证，其中7.9/0.3M条件增加Capto ImpRes选项，以比较两款填料差异。具体而言，层析柱采用Capto adhere 4.7ml及Capto adhere ImpRes 4.7ml，上样量及样品条件参照预测条件，流速0.78ml/min。上样前样品及流穿样品进行SEC-HPLC分析，分析方法同1.4。分析结果如表2所示。结果显示，实际验证结果能够得到比预测效果更好，即更高的纯度更好的回收率。Capto adhere与Capto adhere ImpRes相比，Capto adhere纯度略低，回收率略高，效果相差不大。
表2 响应面预测条件验证结果
实施例2阿达木单抗的复合阴离子层析
1.1总过程
以弱分配流穿模式操作层析柱，在环境温度中进行。所述层析柱使用复合阴离子层析树脂(Capto adhere)。该树脂由偶联N-苄基-N-甲基乙醇胺官能团的高交联琼脂糖基质组成。将复合阴离子层析树脂装填入柱至20cm的床高度。在加载亲和层析洗脱产物前，使用平衡缓冲液将复合阴离子层析柱中的贮存液清洗出，并且进行柱平衡。将protein A层析洗脱产物加载到经过平衡的层析柱上，阿达木单抗开始流穿，污染物结合在树脂上，收集流穿样品。加载后，使用平衡缓冲液进行顶洗，将未结合载荷洗出，收集顶洗洗出样品。顶洗后，使用再生缓冲液及清洁液(0.5N NaOH)清洁柱子，之后在贮存液中贮存，直至下次使用(见图1)。
表3 阿达木单抗复合阴离子层析的具体工艺条件。
1.2聚集体分析
采用SEC-HPLC方法分析阿达木单抗聚集体。色谱柱为TSK gel G3000SWXLcolumn,7.8x 300mm。流动相为20mM磷酸缓冲盐，300mM NaCl，pH6.8。分析时上样体积20μL，流速0.5mL/min，柱温30度，检测波长280/214nm，分析时间35min。比例计算采用面积归一化方法。
1.3酸性成分分析
采用WCX-HPLC方法分析阿达木单抗酸性成分。色谱柱为Thermo ProPacTM WCX-10色谱柱，4.6x 250mm。流动相A为20mM磷酸缓冲盐，pH7.1，流动相B为20mM磷酸缓冲盐，300mMNaCl，pH7.1。流速1ml/min，柱温30度，检测波长280nm/214nm，梯度洗脱6％B-25％B 38min。
比例计算采用面积归一化法。
1.4HCP分析
采用Cisbio CHO HCP Kit(货号6FHCPPEG)进行分析。详细操作参照试剂盒说明书进行。具体而言，首先制备一系列浓度标曲，浓度分别为0、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100ng/ml，亲和洗脱样品稀释1024、2048、4096倍，Capto adhere流穿样品稀释1、2倍。反应体系16μl样品加2μl anti-CHO HCP-d2 conjugate，加2μl Anti-CHO HCP-Eu3+-Cryptateconjugate，室温孵育20h，检测荧光665nm和620nm。以Delta F％为纵坐标，浓度为横坐标作图。
1.5回收率计算及数据统计
回收率计算采用SEC-HPLC方法计算。产品回收率＝(洗脱产物单位进样量主峰峰面积*洗脱体积)/(上样前粗品单位进样量主峰峰面积*装载上样体积)*100％。统计回收率结果、聚集体分析结果、酸性成分分析结果、HCP结果如表4所示。结果显示阿达木单抗粗品经过复合阴离子层析纯化，纯度能够达到99.78％，酸性成分12.08％，HCP2.5ppm，回收率达到90.36％。
表4 复合阴离子层析的纯化效果
对比实验——阳离子交换清除阿达木单抗聚集体和酸性成分
对比实验1 Poros XS中间清洗方式清除聚集体及酸性成分
1.1简介
目前单抗产品(包括阿达木单抗)主要通过阳离子交换清除聚集体及酸性成分，常用的模式为上样/洗脱模式，通过增加中间清洗步骤，达到清除杂质的效果。本实验分别用50mM TrispH8.0/7.7进行中间清洗，考察对聚合物及酸性峰的清除情况。
1.2实验过程
取亲和层析洗脱样品，加入水稀释至约5mg/ml，同时调电导至8.72ms/cm(与平衡液一致)。平衡液：20mM柠檬酸盐50mM NaCl pH5.5；中间清洗：50mM Tris pH7.7/8.0，洗脱液：20mM PB 0.5M NaCl pH7.0；层析柱为自装Poros XS(5*200mm)，流速1ml/min，上样80mg/ml填料。先用平衡液平衡2～3cv，上样，再平衡3cv，中间清洗5cv，然后洗脱液洗脱，按峰收集。结束后用0.5M NaOH清洗2～5cv，静置10min，用水冲洗至电导稳定，保存在20％乙醇中。
1.3聚集体分析
采用SEC-HPLC方法分析阿达木单抗纯度及回收率。色谱柱为TSK gel G3000SWXLcolumn,7.8x 300mm。流动相为20mM磷酸缓冲盐，300mM NaCl，pH6.8。分析时上样体积20μL，流速0.5mL/min，柱温30度，检测波长280/214nm，分析时间35min。比例计算采用面积归一化方法。
1.4酸性成分分析
采用WCX-HPLC方法分析阿达木单抗酸性成分。色谱柱为Thermo ProPacTM WCX-10色谱柱，4.6x 250mm。流动相A为20mM磷酸缓冲盐，pH7.1，流动相B为20mM磷酸缓冲盐，300mMNaCl，pH7.1。流速1ml/min，柱温30度，检测波长280nm/214nm，梯度洗脱6％B-25％B 38min。比例计算采用面积归一化法。1.5 1.5回收率计算及数据分析
回收率计算采用SEC-HPLC方法计算。产品回收率＝(洗脱产物单位进样量主峰峰面积*洗脱体积)/(上样前粗品单位进样量主峰峰面积*装载上样体积)*100％。统计回收率结果、聚集体分析结果、酸性成分分析结果、HCP结果如下表所示。其中表5为50mM Tris，pH8.0清洗条件，表6为50mM Tris，pH7.7清洗条件。
表5 对比实验pH8.0中间清洗条件纯化结果
表6 对比实验pH7.7中间清洗条件纯化结果
对比实验1的结果和结论
由表5、表6结果可以看出，pH7.7清洗条件回收率较高，但聚集体、酸性成分清除效果不大；
pH8.0清洗条件能够清除部分酸性成分，但回收率只有80％。
由此可见，采用阳离子交换中间清洗方式清除酸性成分及聚集体会造成较大的回收率损失。
对比实验2Poros XS过载上样清除聚集体及酸性成分研究
1.1简介
目前单抗产品(包括阿达木单抗)主要通过阳离子交换清除聚集体及酸性成分，常用的模式为上样/洗脱模式，本实验采用一种新型的非常规操作模式进行阿达木单抗酸性成分及聚集体。该操作模式为过载上样模式，原理上属于置换色谱，具体而言，在特定上样条件下，持续上样直至出现流穿，此时继续上样，正常的阿达木单抗成分会置换结合弱的酸性成分及聚集体。本实验在不同pH、不同载样量条件下对Poros XS进行过载上样实验，以探索清除聚集体和酸性成分效果。
1.2实验过程
取亲和层析洗脱样品，加入水稀释至约5mg/ml，同时调电导至7.68ms/cm(与平衡液一致)，然后分别调节pH至6.5、7.0。层析柱为自装Poros XS(5*200mm)，流速1ml/min，平衡液：20mM PB 50mM NaCl pH6.5；20mM PB 50mM NaCl pH7.0；洗脱液：20mM PB 0.3M NaClpH6.5；上样量pH6.5条件为120mg/ml、105mg/ml填料，pH7.0条件为105mg/ml、90mg/ml填料。先用平衡液平衡2～3cv，过载上样，当280nm吸收峰开始上升时，进行分段收集，上样结束后先平衡2cv，然后100％洗脱液洗脱。结束后用0.5M NaOH清洗2～5cv，静置10min，用水冲洗至电导稳定，保存在20％乙醇中。
1.3聚集体分析
采用SEC-HPLC方法分析阿达木单抗纯度及回收率。色谱柱为TSK gel G3000SWXLcolumn,7.8x 300mm。流动相为20mM磷酸缓冲盐，300mM NaCl，pH6.8。分析时上样体积20μL，流速0.5mL/min，柱温30度，检测波长280/214nm，分析时间35min。比例计算采用面积归一化方法。
1.4酸性成分分析
采用WCX-HPLC方法分析阿达木单抗酸性成分。色谱柱为Thermo ProPacTM WCX-10色谱柱，4.6x 250mm。流动相A为20mM磷酸缓冲盐，pH7.1，流动相B为20mM磷酸缓冲盐，300mMNaCl，pH7.1。流速1ml/min，柱温30度，检测波长280nm/214nm，梯度洗脱6％B-25％B 38min。
比例计算采用面积归一化法。
1.5回收率计算及数据分析
回收率计算采用SEC-HPLC方法计算。产品回收率＝(洗脱产物单位进样量主峰峰面积*洗脱体积)/(上样前粗品单位进样量主峰峰面积*装载上样体积)*100％。统计回收率结果、聚集体分析结果、酸性成分分析结果如下表所示。
表7 对比实验Poros XS过载上样条件纯化结果
对比实验2的结果和结论
在高回收率(大于80％)情况下，该操作模式对酸性成分及聚集体无清除效果，在损失较多样品的情况下，酸性成分能得到部分清除(21％-15％)，但聚集体清除效果不大。
两个对比实验都表明，目前阿达木单抗产品主要通过阳离子交换清除聚集体及酸性成分的方式，纯化效果不理想，如果希望终产物纯度高，则回收率很低。
Claims (10)
1.复合阴离子层析方法在去除阿达木单抗中的聚集体和酸性成分中的应用。
2.一种去除阿达木单抗中的聚集体和酸性成分的方法,其特征是进行复合阴离子层析,具体步骤如下：
1)对复合阴离子填料进行平衡；所述平衡是将平衡缓冲液流过复合阴离子填料；
2)将阿达木单抗粗品加载于复合阴离子填料上，使其流过填料,开始收集流穿；
3)加载结束后，进行顶洗，收集流穿；所述顶洗,是使用步骤1)的平衡缓冲液将纯化后的阿达木单抗从复合阴离子层析柱洗出。
3.权利要求2所述的方法，步骤1)中，所用平衡缓冲液是缓冲盐和NaCl的水溶液。
4.权利要求2所述的方法，步骤2)中，所述阿达木单抗粗品，是将CHO细胞培养物先经过一次或多次柱层析纯化后的产物。
5.权利要求4所述的方法，所述柱层析的方式为protein A亲和层析或者protein A亲和层析与其它层析的组合。
6.权利要求2所述的方法，步骤2)中，所述阿达木单抗粗品应满足以下条件：
A所含缓冲盐为Tris或磷酸盐，浓度为20-50mM；
B所含NaCl浓度为200-500mM；
C pH范围为7.1-8.0。
7.权利要求2所述的方法，步骤2)中，所述加载的量为50-90mg/ml，停留时间为4-8min。
8.权利要求2所述的方法，步骤3)的顶洗过程继续收集流穿样品，直至280nm吸收为280nm吸收最高点的1/10时结束收集。
9.权利要求1或2所述的方法，所述复合阴离子填料为Capto adhere或Capto adhereImpRes。
10.权利要求2所述的方法，步骤3)结束后再生复合阴离子填料；所述再生是用再生缓冲液流过复合阴离子填料，再生缓冲液的成分是0.1M柠檬酸，pH3。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20211029 |