CN103073616A - 使用混合模式层析技术去除抗体聚集体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种使用混合模式层析技术去除抗体聚集体的方法，包括以下步骤：（1）在层析柱中装填混合模式层析介质，该介质在空白基质表面偶联烯丙基的间隔臂，在间隔臂末端偶联配基分子正丁胺或苄胺；（2）将待精细纯化的抗体样品流过该层析柱，收集流穿液，得到抗体的单体成份，清洗层析柱，得到聚集体及其他杂质，从而实现抗体单体与聚集体的分离。本发明能够高效率、低成本的大规模去除抗体的聚集体成份。

Description

使用混合模式层析技术去除抗体聚集体的方法

技术领域

本发明涉及一种使用混合模式层析技术去除抗体聚集体的方法，属于蛋白质层析分离技术领域。

背景技术

近二十年来，蛋白质药物发展迅速，目前有近百种重组蛋白药物上市，几千种处于研发状态。2009年仅美国市场蛋白质药物销售额已经达到了480亿美元，这其中抗体类药物占了约33%的份额。目前，国际上已经有20多种抗体批准进入临床应用，近200种抗体进入临床研究，抗体药物逐渐成为生物医药产业发展的主要方向。

作为大分子蛋白的抗体药物，由于一些物理的和化学的因素，使其在发酵、纯化以及制剂过程中经常有聚集现象发生（The AAPS Journal, 2006, 8, E572-E579.）。可溶性聚集体不但会使病人产生免疫反应，甚至会使人对药物产生免疫耐受性，从而大大降低了药物的药效（Journal of Immunotoxicology, 2006, 3, 151-156.）。除此之外，聚集体还会影响抗体药物的生物活性、稳定性以及保存期等，这些问题使得单抗药物聚集体的控制及其去除成为单抗药物开发过程中的一大挑战（Wei Wang, International Journal of Pharmaceutics, 2005, 289, 1-30.），引起了各国科学家和产业界的关注和重视。

单抗药物聚集体的去除主要通过层析过程来完成，层析技术比如离子交换层析（US Patent 2008/0058507 A1；US Patent 6,177,548 B1）和疏水层析（US Patent 2010/0069617 A1），离子交换和疏水层析能有效的去除聚集体成份，但如果聚集体含量高于10%时，单步IEC或HIC的去除能力非常有限，往往需要多个层析步骤才能有效降低聚集体（Current Pharmaceutical Biotechnology, 2009, 10, 421-426；Current Pharmaceutical Biotechnology, 2009, 10, 427-433.），这样会使单抗的收率降低，成本增加。Gagnon等人提出采用羟基磷灰石层析技术来去除聚集体（US Patent 2010/0145029 A1；US Patent 2005/0107594 A1），该方法去除聚集体的能力很高，可以将60%的聚集体去除到0.1%以下，但是，羟基磷灰石介质的使用寿命短，大规模装柱困难，且对缓冲液条件要求严格，因此并不适合在大规模生产中使用（Journal of Chromatography A, 2007, 1165, 78-85.）。近年来，GE Healthcare公司推出了一种以苯甲基-甲基乙醇胺为配基的Capto Adhere层析介质，该介质去除聚集体的效果明显（CN 101318991 A），但据报道（BioProcess International, 2009, 7(2): 52-56.），Capto Adhere介质的去除效果在很大程度上受样品上样量的影响，当上样量降低时，回收率则明显下降，其中的影响机理尚不明确。如何有效去除单抗药物的聚集体，并缩短工艺流程，提高产率，降低生产成本，是实现单抗药物高质量低成本的一个关键问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种混合模式层析技术去除抗体聚集体的方法，使其能够快速、简便、低成本、大批量有效的纯化抗体蛋白。

为了实现上述目的，本发明采取如下技术解决方案：

混合模式层析技术去除抗体聚集体的方法，包括以下步骤：

（1）在层析柱中装填结构式（I）所示的混合模式层析介质；

（2）制备粗纯化抗体样品

利用Protein A亲和层析法来获得粗纯化抗体样品，Protein A是天然蛋白质A或其功能性衍生物；

（3）聚集体的去除

将粗纯化抗体样品进行缓冲液交换，缓冲液pH值低于抗体蛋白1-3个pH单位，离子强度为2~10mS/cm，开始上样，样品流穿后开始收集流穿液，即可得到抗体的单体成份，之后用pH值为2.6的缓冲液进行洗脱，洗脱成份即为结合在柱上的聚集体。

所述的空白基质是琼脂糖凝胶、纤维素微球或葡聚糖凝胶。

所述的抗体样品可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，可以是天然蛋白，也可以是重组蛋白，可以由哺乳动物细胞表达，如CHO细胞，也可以由微生物细胞表达，如大肠杆菌或酵母菌。

上述步骤（3）中，上样量为50~90mg/ml介质，上样流速以保证样品的停留时间为5min。

本发明能够有效的去除抗体产品的聚集体等污染性杂质，对于高含量聚集体的去除特别有效，从而提高了终产物质量。本发明能一步有效去除单抗的聚集体，缩短了工艺流程，提高产率，降低生产成本，同时具有稳定性好、过程控制指标明确、适合规模化生产等特点。

附图说明

图1 为重组抗肿瘤坏死因子单克隆抗体的发酵液经过初步分离，样品的SEC-HPLC色谱图，横坐标为蛋白质出峰时间，其中聚集体蛋白于11.8min和15.4min出峰，单体蛋白于17.9min出峰，目的蛋白与聚集体蛋白的峰面积比为79.5% ：20.5%；

图2 为重组抗肿瘤坏死因子单克隆抗体的发酵液经过初步分离及缓冲液交换后上样苄胺型混合模式层析柱的色谱图，其中纵坐标mAu表示A280紫外吸收值，横坐标为样品体积，流穿峰为目的蛋白，洗脱峰为聚集体成分；

图3 为采用苄胺型混合模式层析纯化后的样品的SEC-HPLC色谱图，其中单体蛋白于17.8min出峰，目的蛋白与聚集体蛋白的峰面积比为98.5% ：1.5%；

图4 为苄胺型混合模式层析洗脱峰的SEC-HPLC色谱图，其中吸附于介质的单体蛋白于17.9min出峰；

图5为重组抗肿瘤坏死因子单克隆抗体的发酵液经过初步分离及缓冲液交换后上样丁胺型混合模式层析柱的色谱图，其中纵坐标mAu表示A280紫外吸收值，横坐标为样品体积，流穿峰为目的蛋白，洗脱峰为聚集体成分； 

图6 为采用丁胺型混合模式层析纯化后的样品的SEC-HPLC色谱图，其中单体蛋白于17.8min出峰，目的蛋白与聚集体蛋白的峰面积比为97.6% ：2.4%； 

图7 为丁胺型混合模式层析洗脱峰的SEC-HPLC色谱图，其中吸附于介质的单体蛋白于17.8min出峰。

具体实施方式

本发明参考文献(Journal of Applied Polymer Science, 2008, 107, 674–682)所述方法合成混合模式层析介质，再通过精确控制层析缓冲系统的pH、离子强度、上样量及层析流速，将待纯化样品流过该介质层析柱，收集流穿液，得到抗体的单体成份，清洗层析柱，得到聚集体及其他杂质，从而实现抗体单体与聚集体的分离。

具体地说，本发明混合模式层析技术去除抗体聚集体的方法，包括以下步骤：

1）以空白基质为原料，将空白基质与烯丙基溴反应后，得到含烯丙基的基质，然后再经N-溴代琥珀酰亚胺活化，得到溴代醇化的基质，最后再与苄胺或正丁胺进行反应，分别获得苄胺型混合模式层析介质和丁胺型混合模式层析介质；

2）利用Protein A亲和层析法来获得粗纯化样品，Protein A是天然蛋白质A或其功能性衍生物；

3）将粗纯化样品进行缓冲液交换，缓冲液pH值低于目标蛋白1-3个pH单位，离子强度为2~10mS/cm；

4）开始上样，上样量为50~90mg/ml介质，流速以保证样品的停留时间为5min，样品流穿后开始收集流穿液，即可得到抗体的单体成份，之后通过pH值为2.6的缓冲液进行洗脱，洗脱成份即为结合在柱上的聚集体及其他杂质。

本发明协同利用静电相互作用力和疏水相互作用力，可以高效的去除抗体蛋白的聚集体成份。以下是发明人给出的实施例，需要说明的是，本发明不限于这些实施例。

实施例1

1、制备混合模式层析介质

采用平均粒径为90微米的琼脂糖凝胶介质作为基质，将琼脂糖基质、二甲基亚砜、烯丙基溴和2M的氢氧化钠溶液混合，二甲基亚砜添加的体积量为琼脂糖基质体积的20%，烯丙基溴为10%，氢氧化钠溶液为50%；上述溶液25℃下180rpm摇床中活化20小时，抽滤，用去离子水洗涤得到烯丙基化基质；再将烯丙基化基质、N-溴代琥珀酰亚胺以及适量去离子水混合，N-溴代琥珀酰亚胺加入量为活化基质体积的5倍，25℃下振荡反应1h，水洗；然后再加入2倍体积的苄胺，于25℃下振荡反应30h，水洗即得所需苄胺型混合模式层析介质；

2、粗纯化样品重组抗肿瘤坏死因子单克隆抗体的制备

重组抗肿瘤坏死因子单克隆抗体通过中国仓鼠卵巢细胞（CHO）培养表达，采用离心法进行发酵液的澄清处理。利用AKTA explorer 100层析系统，将80 ml rProtein A Sepharose FF亲和介质装填于XK26/20层析柱中，用5倍柱体积的平衡缓冲液（20mM Tris，150mM NaCl，pH7.4）充分平衡层析柱后，以120cm/h的线速度和25mg/ml的动态载量开始上样，上样结束后，继续用上述平衡缓冲液冲洗，待280nm紫外吸收回到基线后，用5倍体积的高盐缓冲液（20mM Tris，1.0 M NaCl，pH7.4）清洗，然后用3倍体积的平衡缓冲液洗涤，最后用洗脱缓冲液（50mM柠檬酸盐缓冲液，pH3.5）洗脱。洗脱液样品的SEC-HPLC色谱如附图1和2所示，横坐标为蛋白质出峰时间，其中聚集体蛋白于13.8min出峰，目的蛋白于15.9min出峰。

3、用苄胺型混合模式层析介质去除聚集体蛋白

配置磷酸盐缓冲液：10mM PB，20mM NaCl，pH7.5，通过装有G25凝胶过滤介质的层析柱将上述粗纯化样品进行缓冲液交换。利用AKTA purifier-100层析系统，将1ml苄胺型混合模式介质装填于Tricorn5/50层析柱中，用10倍柱体积的上述磷酸盐缓冲液充分平衡层析柱后，开始上样，上样量控制为90mg/ml介质，流速保证让样品的停留时间为5min。当样品上完后，继续用磷酸盐缓冲液冲洗至基线，收集整个流穿峰，经过液相色谱检测（SEC-HPLC色谱图如附图3所示），即为目标单体蛋白。之后用pH2.6缓冲液进行洗脱，洗脱峰经过液相色谱检测（SEC-HPLC色谱图如附图4所示），为聚集体和少量单体的混合物。整个过程的色谱图如附图2所示。

4、用SEC-HPLC测定产物纯度

粗纯化样品的聚集体含量以及纯化后单体的纯度通过液相色谱柱TSKgel G3000SWXL（30×7.8）来分析检测，使用系统为Agilent HPLC系统。流动相为50mM PB，200mM NaCl，pH7.0，检测波长为280nm。充分平衡液相柱至基线稳定后，进样，进样体积为50微升，流速为0.5ml/min。

实施例2

1、制备混合模式层析介质

采用平均粒径为90微米的琼脂糖凝胶介质作为基质，将琼脂糖基质、二甲基亚砜、烯丙基溴和2M的氢氧化钠溶液混合，二甲基亚砜添加的体积量为琼脂糖基质体积的20%，烯丙基溴为10%，氢氧化钠溶液为50%；上述溶液25℃下180rpm摇床中活化20小时，抽滤，用去离子水洗涤得到烯丙基化基质；再将烯丙基化基质、N-溴代琥珀酰亚胺以及适量去离子水混合，N-溴代琥珀酰亚胺加入量为活化基质体积的5倍，25℃下振荡反应1h，水洗；然后再加入5倍体积的丁胺，于25℃下振荡反应30h。水洗即得所需丁胺型混合模式层析介质。

2、粗纯化样品重组抗肿瘤坏死因子单克隆抗体的制备

重组抗肿瘤坏死因子单克隆抗体通过中国仓鼠卵巢细胞（CHO）培养表达，采用离心法进行发酵液的澄清处理。利用AKTA explorer 100层析系统，将80 ml rProtein A Sepharose FF亲和介质装填于XK26/20层析柱中，用5倍柱体积的平衡缓冲液（20mM Tris，150mM NaCl，pH7.4）充分平衡层析柱后，以120cm/h的线速度和25mg/ml的动态载量开始上样，上样结束后，继续用上述平衡缓冲液冲洗，待280nm紫外吸收回到基线后，用5倍体积的高盐缓冲液（20mM Tris，1.0 M NaCl，pH7.4）清洗，然后用3倍体积的平衡缓冲液洗涤，最后用洗脱缓冲液（50mM柠檬酸盐缓冲液，pH3.5）洗脱。洗脱液样品的SEC-HPLC色谱如图1所示，横坐标为蛋白质出峰时间，其中聚集体蛋白于13.8min出峰，目的蛋白于15.9min出峰。

3、用丁胺型混合模式层析介质去除聚集体蛋白

配置磷酸盐缓冲液：10mM PB，100mM NaCl，pH6.5，通过装有G25凝胶过滤介质的层析柱将上述粗纯化样品进行缓冲液交换。利用AKTA purifier-100层析系统，将1ml丁胺型混合模式介质装填于Tricorn5/50层析柱中，用10倍柱体积的上述磷酸盐缓冲液充分平衡层析柱后，开始上样，上样量控制为50mg/ml介质，流速保证让样品的停留时间为5min。当样品上完后，继续用平衡缓冲液冲洗至基线，收集整个流穿峰，经过液相色谱检测（SEC-HPLC色谱图如附图6所示），即为目标单体蛋白。之后用pH2.6缓冲液进行洗脱，洗脱峰经过液相色谱检测（SEC-HPLC色谱图如附图7所示），为聚集体和少量单体的混合物。整个过程的色谱图如附图5所示。

4、用SEC-HPLC测定产物纯度

粗纯化样品的聚集体含量以及纯化后单体的纯度通过液相色谱柱TSKgel G3000SWXL（30×7.8）来分析检测，使用系统为Agilent HPLC系统。流动相为50mM PB，200mM NaCl，pH7.0，检测波长为280nm。充分平衡液相柱至基线稳定后，进样，进样体积为50微升，流速为0.5ml/min。

结果表明，本发明混合模式层析技术均能够有效的去除抗体样品的聚集体，提高终产物的质量，去除率分别达到了92.7%和88.3%。目前抗体经过亲和层析后聚集体含量多为2%-5%，实验证明采用本发明的方法去除聚集体，纯度均可达99%以上。本发明能一步有效去除抗体的聚集体成份，缩短了工艺流程，提高产率，降低生产成本，同时具有稳定性好、过程控制指标明确、适合规模化生产等特点。

Claims (4)

1.混合模式层析技术去除抗体聚集体的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）在层析柱中装填结构式（I）所示的混合模式层析介质；

（2）制备粗纯化抗体样品

利用Protein A亲和层析法来获得粗纯化抗体样品，Protein A是天然蛋白质A或其功能性衍生物；

（3）聚集体的去除

将粗纯化抗体样品进行缓冲液交换，缓冲液pH值低于抗体蛋白1-3个pH单位，离子强度为2~10mS/cm，开始上样，样品流穿后开始收集流穿液，即可得到抗体的单体成份，之后用pH值为2.6缓冲液进行洗脱，洗脱成份即为结合在柱上的聚集体。

2.根据权利要求1所述混合模式层析技术去除抗体聚集体的方法，其特征在于：所述的空白基质是琼脂糖凝胶、纤维素微球或葡聚糖凝胶。

3.根据权利要求1所述混合模式层析技术去除抗体聚集体的方法，其特征在于：所述的抗体样品是多克隆抗体或单克隆抗体，天然蛋白或重组蛋白，由哺乳动物细胞或微生物细胞表达。

4.根据权利要求1所述混合模式层析技术去除抗体聚集体的方法，其特征在于：步骤（3）中，上样量为50~90mg/ml介质，上样流速以保证样品的停留时间为5min。

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