CN103506079B - 一种用于分离纯化抗体的介质及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型生物分离材料及其制备方法:将亲水性凝胶微球作为基质在均三嗪活化剂中制成活化基质,然后以偶联法对活化基质键合4-(2-羟基乙基)-吡啶等两个小分子配体,具有更好的特异性与亲和选择性。本发明的分离介质配合亲和层析色谱或扩展床吸附用于工业化大规模抗体生产,极具成本优势,仅一步可从血液、血清、血浆、血浆组分、腹水、细胞培养液、细胞均化液、奶液、初乳等生物原料中直接提取生产高纯度的抗体产品,省时省事。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于分离纯化抗体的介质及其制备方法,属于生物分离材料领域。具体地说涉及一种用于以亲和层析色谱或扩展床吸附法从血液、血清、血浆、血浆组分、腹水、细胞培养液、细胞均化液、奶液、初乳等生物原料中分离纯化抗体的新型生物分离材料及其制备方法。
发明背景
生物分离介质是专门用于提纯和精制生物相关产品的一类材料。分离介质广泛用于医药行业、发酵行业、生物制品、血液制品、疫苗和基因工程产品分离。在纯化产品时,分离介质具有分离效果好、产品纯度高、使用范围广,而且还具有可以进行大规模连续自动化生产的特点,使之成为目前对高纯度和高附加值产品进行分离的首选方法。依赖分离介质的产品涵盖基因重组药物、抗体、疫苗、诊断试剂、生化产品、血液净化、基因芯片以及抗生素等。
近年来,针对抗体的分离介质倍受重视。但是,抗体产品纯度往往要求较高,同时还要尽可能地保持其生物活性,传统分离介质难以满足要求。常规离子交换层析分离介质以及疏水作用层析分离介质能够结合抗体,但是特异性和选择性较差,造成分离步骤多,降低抗体的收率与活性;例如,人IgG抗体普遍使用Cohn-Oncley的四步分离法从血库血浆中提取,得到的IgG纯度仅85%,且易形成多聚体或聚集体;又例如使用离子交换层析法从单克隆抗体含3%牛血清的细胞培养液中直接提取IgG,抗体回收率仅为70%,且抗体仅占白蛋白的二分之一,使用硫酸铵沉淀法,纯度更低。
目前,使用昂贵的proteinA或基因重组蛋白质大分子作为亲和配体、专门用于抗体药物分离纯化的亲和分离介质,其选择性非常好,例如美国GE公司已商品化的MabSelect以及IgSelect等专门针对抗体的亲和分离介质产品,但这些蛋白质大分子配体价格昂贵,容易受到从分离前段工序带来的蛋白酶的降解,既降低分离介质的重复使用次数或寿命、稳定性低,又可能产生肽链碎片污染抗体产品、影响其质量与安全。以高效的小分子亲和配体取代这些昂贵的大分子配体,可解决传统大分子配体分离介质的生产成本、保存稳定性、掉肽链(leaking,大分子配体从微球介质上断链或形成碎片)等问题。美国专利(USPatent5,652、348、5,719,269、7,144,743)描述了利用杂环配体与抗体的疏水相互作用进行吸附分离的新型分离介质及其制备方法,中国专利CN101284224描述了一种以巯基乙基吡啶和砜基为配基、以纤维素/无机增重剂复合微球为基质的分离抗体的扩张床吸附介质及制备方法,但存在介质生物相容性不够,且需要在碱性条件下操作、砜基易产生非特异性吸附等缺点。所有这些小分子配体存在一个更致命的问题:选择性比proteinA或基因重组蛋白质大分子亲和配体低得多。因此,本发明除选择生物相容性更好的亲水凝胶微球作为介质的基质,主要是设计、制备选择性更好的小分子作为配体,更有效地实现抗体的分离纯化过程。
发明内容
本发明的目的是,针对目前用于抗体药物分离纯化的亲和分离介质的诸多问题,提出一种用于分离纯化抗体的介质及其制备方法。这一方法具有如下具体特征:
1、本发明所述的一种用于分离纯化抗体的介质及其制备方法,其特征在于将亲水性凝胶微球作为基质悬浮于均三嗪活化剂中制成活化基质,然后以偶联法对活化基质键合两个小分子配体;所述分离介质的组成结构为:
其中Matrix表示基质,R1,R2表示两个相同或不同的小分子配体。
2、本发明所述的所述的介质,其特征在于,构成所述介质的基质Matrix为亲水性凝胶微球,包括亲水性琼脂糖凝胶微球、亲水性葡聚糖凝胶微球、亲水性聚丙烯酰胺凝胶微球;但优选亲水性琼脂糖凝胶微球作为基质材料;基质的粒径为50-160微米,交联度为4-10%范围。
3、本发明所述的介质,其特征在于,构成所述介质的基质Matrix与均三嗪之间可以通过-O-(醚键),-NH-,-S-(硫醚键)相连接。
4、本发明所述的介质,其特征在于,构成所述介质的基质Matrix与均三嗪之间还可以以包括但不限于下列一种加长的连接臂相连接:
-O-CH2-CH2-CH2-X-,其中X=O,N,S
-O-CH2-CH(OH)-CH2-X-,其中X=O,N,S
-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-X,其中X=O,N,S。
5、本发明所述的介质,其特征在于,构成所述介质的小分子配体R1、R2包括但不限于含羟基、伯胺基或巯基的吡啶类衍生化合物,具体包括但不限于2-(2-羟基乙基)-吡啶,3-(2-羟基乙基)-吡啶,4-(2-羟基乙基)-吡啶(又名吡啶乙醇),2-(2-巯基乙基)-吡啶,3-(2-巯基乙基)-吡啶,4-(2-巯基乙基)-吡啶,2-(2-氨基乙基)-吡啶,3-(2-氨基乙基)-吡啶,4-(2-氨基乙基)-吡啶。
6、本发明所述的介质制备方法,其特征在于,所述制备介质所使用的均三嗪活化剂可以是其本身;亦可是通过均三嗪与环氧氯丙烷、二乙烯砜、羰基二咪唑等反应后串联环氧基、砜乙烯基等其它基团的均三嗪衍生物,使得活化基质具备更丰富的表面化学活性有机官能团。
本发明以均三嗪活化介质为基质,同时连接巯基乙基吡啶等两个功能小分子配体;这两个小分子配体协同作用于抗体片段Fc的两条链,提高了分离介质与抗体结合的选择性,实现对抗体的选择性以及pH可调性吸附特点,并以以亲和层析色谱或扩展床吸附法从血液、血清、血浆、血浆组分、腹水、细胞培养液、细胞均化液、奶液、初乳等生物原料中分离纯化抗体。此项双配体技术未见任何报道。
具体实施方式
以下通过实例对本发明作进一步描述:
实施例1:
按上述化学反应简式所示,首先使用均三嗪对琼脂糖凝胶微球进行活化。将10g均三嗪(sym-triazine,无色结晶,熔点86℃,沸点114℃,CAS4719-04-4)溶解于100ml二氯甲烷中,过滤,使用旋转蒸发器蒸去溶剂,将残余固体重新溶解在100ml丙酮中,在冰盐浴中冷至-5℃。取琼脂糖凝胶微球(交联度6%,平均粒径90μm)10g加入50ml的NaOH溶液中,在室温下搅拌15分钟,过滤除去NaOH溶液。将凝胶重新悬于4℃冷的NaOH溶液中,并在冰盐浴中冷至0℃。向此溶液中加入20ml均三嗪/丙酮冷溶液,在冰浴上持续搅拌70分钟、室温下持续搅拌30分钟。过滤,用50ml醋酸水溶液(1∶1体积比)、250ml水依次各洗涤三遍,得到均三嗪活化琼脂糖凝胶微球。
实施例2:
将8.5体积的0.2M的K2HPO4溶液与1.5体积的0.2M的KH2PO4溶液混合,制成偶联缓冲液。取10g实例1中的均三嗪活化琼脂糖凝胶微球,悬于10ml偶联缓冲液中。后按10mg/ml的比例加入4-(2-氨基乙基)-吡啶作为抗体的小分子亲和配体。室温下持续搅拌(或震荡、摇晃)24小时。用偶联缓冲液洗涤至在293nm波长下五吸收峰为止。所得介质配体密度130μmol/ml。将其保存于含0.02%叠氮酸钠(w/v)的醋酸钠溶液(0.2M,pH5.4)中待用。
实施例3:
将8.5体积的0.2M的K2HPO4溶液与1.5体积的0.2M的KH2PO4溶液混合,制成偶联缓冲液。取10g实例1中的均三嗪活化琼脂糖凝胶微球,悬于10ml偶联缓冲液中。后按20mg/ml的比例加入4-(2-羟基乙基)-吡啶作为抗体的小分子亲和配体。室温下持续搅拌(或震荡、摇晃)24小时。用偶联缓冲液洗涤至在293nm波长下五吸收峰为止。所得介质配体密度150μmol/ml。将其保存于含0.02%叠氮酸钠(w/v)的醋酸钠溶液(0.2M,pH5.4)中待用。
实施例4:
将8.5体积的0.2M的K2HPO4溶液与1.5体积的0.2M的KH2PO4溶液混合,制成偶联缓冲液。取10g实例1中的均三嗪活化琼脂糖凝胶微球,悬于10ml偶联缓冲液中。后按20mg/ml的比例加入4-(2-巯基乙基)-吡啶作为抗体的小分子亲和配体。室温下持续搅拌(或震荡、摇晃)24小时。用偶联缓冲液洗涤至在293nm波长下五吸收峰为止。所得介质配体密度150μmol/ml。将其保存于含0.02%叠氮酸钠(w/v)的醋酸钠溶液(0.2M,pH5.4)中待用。
Claims (6)
1.一种分离纯化抗体的介质,其组成结构为:
其中,Matrix表示亲水性凝胶微球基质,R1,R2表示两个相同或不同含羟基、伯胺基或巯基的吡啶类衍生化合物小分子配体,包括2-(2-羟基乙基)-吡啶、3-(2-羟基乙基)-吡啶、4-(2-羟基乙基)-吡啶、2-(2-巯基乙基)-吡啶、3-(2-巯基乙基)-吡啶、4-(2-巯基乙基)-吡啶、2-(2-氨基乙基)-吡啶、3-(2-氨基乙基)-吡啶、4-(2-氨基乙基)-吡啶及这些化合物的衍生物。
2.根据权利要求1所述的介质,其特征在于,构成所述介质的基质包括亲水性琼脂糖凝胶微球、亲水性葡聚糖凝胶微球、亲水性聚丙烯酰胺凝胶微球;基质交联度为4-10%、粒径为50-160微米。
3.根据权利要求1所述的介质,其特征在于,构成所述介质基质与均三嗪之间通过-O-、-NH-、-S-键相连接。
4.根据权利要求1所述的介质,其特征在于,构成所述介质的基质与均三嗪之间通过下列一种加长的连接臂相连接:
-O-CH2-CH2-CH2-X-,其中X=O,N,S
-O-CH2-CH(OH)-CH2-X-,其中X=O,N,S
-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-X,其中X=O,N,S。
5.根据权利要求1所述的介质制备方法,其特征在于,制备介质时使用均三嗪活化剂,包括均三嗪与环氧氯丙烷或二乙烯砜或羰基二咪唑反应后形成的均三嗪衍生物,使得活化基质具备更丰富的表面化学活性有机官能团。
6.一种权利要求1所述介质用于分离纯化抗体的介质在以亲和层析色谱和扩展床吸附法分离纯化抗体中的应用。
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