CN102731631B - 蛋白a的亲和分离材料及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蛋白A的亲和分离材料和亲和纯化方法，包括下列步骤：(1)用活化基础分离材料固定能够结合蛋白A的配体分子，合成仿生亲和分离材料。(2)用制备的仿生亲和分离材料从含蛋白A的原料中纯化蛋白A。本发明能够高效率、低成本的大规模生产高纯度的蛋白A。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物技术领域的纯化方法。特别是一种纯化蛋白A的亲和分离材料和蛋白A的亲和纯化方法。
背景技术
蛋白A是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质,具有与人和多种动物抗体Fc段结合的能力,结合的抗体在高盐或低pH等条件下可以解离,因此，蛋白A被广泛用于抗体分离纯化。在抗体药物的规模化制造中固定化蛋白A是纯化工艺的核心分离材料，每年存在巨大的需求。可用荧光素、酶、生物素、胶体金、放射性核素、铁蛋白等进行标记,代替抗体IgG作为广谱第二抗，作为多种检测技术的指示系统。目前蛋白A在医学、微生物学、免疫学、细胞学及生物学等领域中已得到了广泛应用。
由于金黄色葡萄球菌中天然蛋白A表达量低，且不易大规模培养。目前蛋白A主要通过转基因大肠杆菌来大量表达。经对现有技术文献的检索发现，美国专利US5075423报道了一种利固定化IgG亲和层析纯化蛋白A，但该方法一步纯化得到的蛋白A纯度并不高，且纯化的蛋白A产品中存在微量IgG污染，需结合其它方法如离子交换层析精制；此外，固定化IgG本身需要高度纯化，成本昂贵，不利于大规模工业化生产。欧洲专利EP0289129A2依次采用阳离子交换层析，阴离子交换层析纯化蛋白A和乙醇沉淀；美国专利US6555661依次采用疏水作用层析和离子交换层析来纯化蛋白A。这些方法操作步骤复杂，产品回收率低,难于降低生产成本。
因此，有必要开发效率高、成本低、生产步骤更简便的蛋白A分离材料和和生产工艺。
发明内容
本发明目的在于克服现有蛋白A生产技术的缺点，提供一种蛋白A的亲和分离材料和纯化蛋白A的亲和方法，使其能够快速、简便、低成本、大批量生产制造蛋白A。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明的纯化方法，即仿生亲和纯化技术，以专一性地识别蛋白A作为基础，其步骤如下：
（1）合成制备仿生亲和分离材料；
用活化基础分离材料固定能够结合蛋白A的配体分子，合成仿生亲和分离材料。
（2）用制备的仿生亲和分离材料纯化蛋白A。
用上述合成的亲和层析介质制备成亲和层析柱，将含蛋白A的样品流经该亲和层析柱，蛋白A吸附在亲和层析柱上，未结合的其它蛋白被洗去，改变缓冲液条件将结合的蛋白A洗脱下来，得到蛋白A粗品。
在步骤（1）中，基础分离材料是一种颗粒状或非微颗粒状，可溶性的或不溶性的，多孔状或无孔的化合物或材料。
在一些实施例中，支持介质包括基础层析介质是葡聚糖凝胶珠、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶、羟乙基甲基丙烯酸酯，聚丙烯酰胺，二乙烯基苯交联的聚苯乙烯、hyper D，toyopearl填料，以及玻璃、硅、金属氧化物、全氟化碳、膨胀床介质、磁化介质珠、磁性胶体、滤器、滤纸、滤布，或者是毛细管管壁，及其数种的组合，并可有机聚合物涂层。
在一些实施例中，活化基础分离材料是用包括溴化氰、羰基二咪唑、二乙烯基砜、吖内酯、三氯三氮嗪、2-氟-1-甲基吡啶(盐)对甲苯磺酸酯、对甲苯磺酰氯、三氟乙基磺酰氯、碘乙酸、溴乙酸、马来酰亚胺、吡啶基二硫化物、环氧基、双环氧烷或者5-硫代-2-硝基苯甲酸作为活化试剂活化的基础分离材料。
在步骤（1）中，在另一个实施例中，活化基础分离材料是用包括光活性反应化学利用对重氮苯基乙二醛、重氮苯甲酰肼、磺基琥珀酰-6-（4'-重氮-2'-硝基苯胺）己酸、或N-[4-（对叠氮水杨酰胺基）丁基]-3'-（2'-二硫代吡啶）丙酰胺进行基础分离材料活化。
在步骤（1）中，能够结合蛋白A的配体分子包括正丁胺、正戊胺、环戊胺，正己胺、环己胺，二正己胺、正辛胺、正十一胺，十二胺，金刚胺，2,4-二氨基-6-羟基吡啶，2-氨基-2-噻唑啉，2,5-二甲基苯胺；
在步骤（2）中，亲和介质吸附蛋白A的条件为pH6.5－7.5，离子强度为0.0－0.15M NaCl的缓冲液；洗脱条件为pH3.0－4.0，离子强度为0.0－0.15MNaCl的缓冲液。
所述的蛋白A为天然蛋白A、重组蛋白A和蛋白A突变体。
本发明克服了蛋白A生产技术中的缺点，使蛋白A生产时分离纯化步骤少，生产成本低，生产效率高，利用蛋白A专一的亲和分离材料，可快速、简便、低成本、大批量纯化蛋白A。
具体实施方式
下面结合具体实例做进一步的阐述：
实施例1：
(1)分离材料制备
量取正己胺（100ml）用去离子水（300ml）溶解，与三氯三氮嗪活化的Sepharose琼脂糖珠（300ml）混匀，用饱和NaHCO3调节pH在6.5～8.0之间，置于50℃下搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到正己胺－5－氯－2,4,6-三氮嗪-Sepharose(260ml)，用30%乙醇储存待用。
(2)大肠杆菌中蛋白A的亲和纯化
含蛋白A基因的大肠杆菌培养，诱导，表达后，收集菌体，以1g菌体/10ml的比例加入磷酸盐缓冲液（10mM磷酸钠，pH6.5，电导率4.85ms/cm），破碎细胞后，12000rpm离心10min，得含蛋白A上清样品。以1N HCl调节pH至6.5，以饱和NaCl溶液将其电导率调至4.85ms/cm，上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液（10mM磷酸钠，pH6.0，电导率4.85ms/cm）平衡好的装有按实例1步骤(1)制备的正己胺－5－氯－2,4,6-三氮嗪-Sepharose亲和分离材料的层析柱（1x5cm）中，依次用磷酸钠缓冲液（10mM磷酸钠，pH6.5,电导率4.85ms/cm）洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸－盐酸缓冲液（0.1M Gly，pH3.0）洗脱结合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鉴定蛋白A纯度为85.1%。
实施例2：
(1)分离材料制备
量取二正己胺（50ml）用去离子水-（300ml）溶解，与环氧基-Sepharose琼脂糖珠（250ml）混匀，用1M NaOH调节pH在12之间，置于50℃下搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1M醋酸，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到二正己胺－5－氯－2,4,6-三氮嗪-Sepharose(200ml)，用30%乙醇储存待用。
(2)大肠杆菌中蛋白A的亲和纯化
取实例1步骤(2)制备的含蛋白A上清样品，以1N HCl调节pH至7.0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至4.85ms/cm，上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液（10mM磷酸钠，pH7.0，电导率4.85ms/cm）平衡好的装有制备的二正己胺－5－氯－2,4,6-三氮嗪-Sepharose亲和分离材料的层析柱（1x5cm）中，依次用磷酸钠缓冲液（10mM磷酸钠，pH7.0,电导率4.85ms/cm）洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸－盐酸缓冲液（0.1M Gly，pH3.0）洗脱结合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鉴定蛋白A纯度为90.2%。
实施例3：
(1)分离材料制备
量取环戊胺（20ml）用去离子水-（300ml）溶解，与环氧基-Sepharose琼脂糖珠（250ml）混匀，用1M NaOH调节pH在12之间，置于50℃下搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1M醋酸，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到环戊胺－5－氯－2,4,6-三氮嗪-Sepharose(18ml)，用30%乙醇储存待用。
(2)大肠杆菌中蛋白A的亲和纯化
取实例1步骤(2)制备的含蛋白A上清样品，含蛋白A基因的大肠杆菌培养，诱导，表达后，收集菌体，以1g菌体/10ml的比例加入磷酸盐缓冲液（10mM磷酸钠，pH7.5，电导率4.85ms/cm），混匀后在90℃热处理30分钟，12000rpm离心10min，取上清。以1N HCl调节pH至7.5，以饱和NaCl溶液将其电导率调至4.85ms/cm，上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液（10mM磷酸钠，pH7.5，电导率4.85ms/cm）平衡好的装有制备的环戊胺－5－氯－2,4,6-三氮嗪-Sepharose亲和分离材料的层析柱（1x5cm）中，依次用磷酸盐缓冲液（10mM磷酸钠，pH7.5，电导率4.85ms/cm）洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸－盐酸缓冲液（0.1M Gly，pH3.0）洗脱结合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鉴定蛋白A纯度为86.5%。
实施例4：
(1)分离材料制备
量取环己胺（55ml）用去离子水-（300ml）溶解，与环氧基-Sepharose琼脂糖珠（250ml）混匀，用1M NaOH调节pH在12之间，置于50℃下搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1M醋酸，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到环己胺－5－氯－2,4,6-三氮嗪-Sepharose(230ml)，用30%乙醇储存待用。
(2)大肠杆菌中蛋白A的亲和纯化
取实例1步骤(2)制备的含蛋白A上清样品，以1N HCl调节pH至7.0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至6.85ms/cm,上样至预先用10倍体积磷酸盐缓冲液（50mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率6.85ms/cm）平衡好的装有制备环己胺－5－氯－2,4,6-三氮嗪-Sepharose亲和分离材料的层析柱（1x5cm）中，依次用磷酸盐缓冲液（50mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率6.85ms/cm）洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸－盐酸缓冲液（0.1M，pH3.0）洗脱结合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鉴定蛋白A纯度为94%。
实施例5：
(1)分离材料制备
量取正十一胺（65ml）用去离子水-（300ml）溶解，与环氧基-聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠（200ml）混匀，用1M NaOH调节pH在12之间，置于50℃下搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1M醋酸，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到正十一胺-5-氯-2,4,6-三氮嗪-聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠(230ml)，用30%乙醇储存待用。
(2)大肠杆菌中蛋白A的亲和纯化
取实例1步骤(2)制备的含蛋白A上清样品，以1N HCl调节pH至7.0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9.30ms/cm,上样至预先用10倍体积磷酸盐缓冲液（100mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率9.30ms/cm）平衡好的装有制备的正十一胺-5-氯-2,4,6-三氮嗪-聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠亲和分离材料的层析柱（1x5cm）中，依次用磷酸盐缓冲液（100mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率9.30ms/cm）洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸－盐酸缓冲液（0.1M Gly，pH3.0）洗脱结合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鉴定蛋白A纯度为97%。
实施例6：
(1)分离材料制备
量取正丁胺（100ml）用去离子水（300ml）溶解，与三氯三氮嗪活化的琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物介质（300ml）混匀，用饱和NaHCO3调节pH在6.5～8.0之间，置于50℃下搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到正丁胺－5－氯－2,4,6-三氮嗪-琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物介质(260ml)，用30%乙醇储存待用。
(2)大肠杆菌中蛋白A的亲和纯化
取实例1步骤(2)制备的含蛋白A上清样品，以1N HCl调节pH至7.0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至13.20ms/cm,上样至预先用10倍体积磷酸盐缓冲液（150mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率13.20ms/cm）平衡好的装有制备的正丁胺－5－氯－2,4,6-三氮嗪-琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物亲和分离材料的层析柱（1x5cm）中，依次用磷酸盐缓冲液（150mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率13.20ms/cm）洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸－盐酸缓冲液（0.1M Gly，pH3.0）洗脱结合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鉴定,蛋白A纯度为95.3%。
实施例7：
(1)分离材料制备
量取正戊胺（200ml）用去离子水（800ml）溶解，与三氯三氮嗪活化的烯丙基葡聚糖和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚介质（900ml）混匀，用饱和NaHCO3调节pH在6.5～8.0之间，置于50℃下搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到正戊胺－5－氯－2,4,6-三氮嗪-烯丙基葡聚糖和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚介质(860ml)，用30%乙醇储存待用。
(2)大肠杆菌中蛋白A的亲和纯化
取实例1步骤(2)制备的含蛋白A上清样品，以1N HCl调节pH至7.0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9.30ms/cm,上样至预先用10倍体积磷酸盐缓冲液（100mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率9.30ms/cm）平衡好的装有制备的正戊胺－5－氯－2,4,6-三氮嗪-烯丙基葡聚糖和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚介质亲和分离材料的层析柱（1x5cm）中，依次用磷酸盐缓冲液（100mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率9.30ms/cm）洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸－盐酸缓冲液（0.1M Gly，pH3.5）洗脱结合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鉴定蛋白A纯度为98.5%。
实施例8：
(1)分离材料制备
量取正辛胺（200ml）用去离子水（800ml）溶解，与三氯三氮嗪活化的交联的葡聚糖珠（900ml）混匀，用饱和NaHCO3调节pH在6.5～8.0之间，置于50℃下搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到正辛胺－5－氯－2,4,6-三氮嗪-交联的葡聚糖珠(860ml)，用30%乙醇储存待用。
(2)大肠杆菌中蛋白A的亲和纯化
取实例1步骤(2)制备的含蛋白A上清样品，以1N HCl调节pH至7.0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9.30ms/cm,上样至预先用10倍体积磷酸盐缓冲液（100mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率9.30ms/cm）平衡好的装有制备的正辛胺－5－氯－2,4,6-三氮嗪-交联的葡聚糖珠亲和分离材料的层析柱（1x5cm）中，依次用磷酸盐缓冲液（100mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率9.30ms/cm）洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸－盐酸缓冲液（0.1M Gly，pH4.0）洗脱结合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鉴定蛋白A纯度为98.1%。
实施例9：
(1)分离材料制备
量取十二胺（200ml）用去离子水（800ml）溶解，与三氯三氮嗪活化的葡聚糖凝胶珠（900ml）混匀，用饱和NaHCO3调节pH在6.5～8.0之间，置于50℃下搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到十二胺－5－氯－2,4,6-三氮嗪-葡聚糖凝胶珠(860ml)，用30%乙醇储存待用。
(2)大肠杆菌中蛋白A的亲和纯化
取实例1步骤(2)制备的含蛋白A上清样品，以1N HCl调节pH至7.0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9.30ms/cm,上样至预先用10倍体积磷酸盐缓冲液（100mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率9.30ms/cm）平衡好的装有制备的十二胺－5－氯－2,4,6-三氮嗪-葡聚糖凝胶珠亲和分离材料的层析柱（1x5cm）中，依次用磷酸盐缓冲液（100mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率9.30ms/cm）洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸－盐酸缓冲液（0.05MNaCl,0.1M Gly，pH3.5）洗脱结合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鉴定蛋白A纯度为97.5%。
实施例10：
(1)分离材料制备
量取正金刚胺（5ml）用去离子水-（30ml）溶解，与环氧基-膨胀床Sepharose（20ml）混匀，用1M NaOH调节pH在12之间，置于50℃下搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1M醋酸，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到金刚胺-5-氯-2,4,6-三氮嗪-膨胀床Sepharose(15ml)，用30%乙醇储存待用。
(2)大肠杆菌中蛋白A的亲和纯化
取实例1步骤(2)制备的含蛋白A上清样品，以1N HCl调节pH至7.0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9.30ms/cm,上样至预先用10倍体积磷酸盐缓冲液（100mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率9.30ms/cm）平衡好的装有制备的金刚胺-5-氯-2,4,6-三氮嗪-膨胀床Sepharose亲和分离材料的层析柱（1x5cm）中，依次用磷酸盐缓冲液（100mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率9.30ms/cm）洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸－盐酸缓冲液（0.1M NaCl,0.1MGly，pH3.5）洗脱结合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鉴定蛋白A纯度为96.5%。
实施例11：
量取2,4-二氨基-6-羟基吡啶（4ml）用去离子水-（30ml）溶解，与环氧基-羟乙基甲基丙烯酸酯珠（20ml）混匀，用1M NaOH调节pH在12之间，置于50℃下搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1M醋酸，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到2,4-二氨基-6-羟基吡啶-羟乙基甲基丙烯酸酯珠(16ml)，用30%乙醇储存待用。
(2)大肠杆菌中蛋白A的亲和纯化
取实例1步骤(2)制备的含蛋白A上清样品，以1N HCl调节pH至7.0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9.30ms/cm,上样至预先用10倍体积磷酸盐缓冲液（100mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率9.30ms/cm）平衡好的装有2,4-二氨基-6-羟基吡啶-羟乙基甲基丙烯酸酯珠亲和分离材料的层析柱（1x5cm）中，依次用磷酸盐缓冲液（100mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率9.30ms/cm）洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸－盐酸缓冲液（0.15M NaCl,0.1MGly，pH3.5）洗脱结合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鉴定蛋白A纯度为95.8%。
实施例12：
量取2-氨基-2-噻唑啉（6ml）用去离子水-（30ml）溶解，与环氧基-纤维素珠（25ml）混匀，用1M NaOH调节pH在12之间，置于50℃下搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1M醋酸，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到2-氨基-2-噻唑啉-纤维素珠(22ml)，用30%乙醇储存待用。
(2)大肠杆菌中蛋白A的亲和纯化
取实例1步骤(2)制备的含蛋白A上清样品，以1N HCl调节pH至7.0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9.30ms/cm,上样至预先用10倍体积磷酸盐缓冲液（100mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率9.30ms/cm）平衡好的装有2-氨基-2-噻唑啉-纤维素珠亲和分离材料的层析柱（1x5cm）中，依次用磷酸盐缓冲液（100mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率9.30ms/cm）洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸－盐酸缓冲液（0.1M Gly，pH3.5）洗脱结合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鉴定蛋白A纯度为98.1%。
实施例13：
量取2,5-二甲基苯胺（10ml）用去离子水-（70ml）溶解，与环氧基-toyopearl HW-65（60ml）混匀，用1M NaOH调节pH在12之间，置于50℃下搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1M醋酸，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到2,5-二甲基苯胺-toyopearl HW-65(55ml)，用30%乙醇储存待用。
(2)大肠杆菌中蛋白A的亲和纯化
取实例1步骤(2)制备的含蛋白A上清样品，以1N HCl调节pH至7.0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至9.30ms/cm,上样至预先用10倍体积磷酸盐缓冲液（100mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率9.30ms/cm）平衡好的装有2,5-二甲基苯胺-toyopearl HW-65亲和分离材料的层析柱（1x5cm）中，依次用磷酸盐缓冲液（100mM NaCl,10mM磷酸钠，pH7.0，电导率9.30ms/cm）洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸－盐酸缓冲液（0.1M Gly，pH3.5）洗脱结合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鉴定蛋白A纯度为97.8%。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，如基础可以更换成葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶等，这些等价形式同样落于本发明的范围。
Claims (6)
1.一种蛋白A的亲和分离材料，其特征在于，所述分离材料是用活化基础分离材料固定能够结合蛋白A的配体分子，合成仿生亲和分离材料；
所述能够结合蛋白A的配体分子是正丁胺、正戊胺、环戊胺，正己胺、环己胺，二正己胺、正辛胺、正十一胺，十二胺，金刚胺，2,4-二氨基-6-羟基吡啶，2-氨基-2-噻唑啉，2,5-二甲基苯胺中一种和/或混合。
2.根据权利要求1所述的蛋白A的亲和分离材料，其特征在于，所述活化基础分离材料的基质是葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶中的一种。
3.一种蛋白A的亲和纯化方法，其特征在于，所述的方法包括下列步骤：
（1）用活化基础分离材料固定能够结合蛋白A的配体分子，合成仿生亲和分离材料；和
（2）用制备的仿生亲和分离材料从含蛋白A的原料中纯化蛋白A；
所述能够结合蛋白A的配体分子是正丁胺、正戊胺、环戊胺，正己胺、环己胺，二正己胺、正辛胺、正十一胺，十二胺，金刚胺，2,4-二氨基-6-羟基吡啶，2-氨基-2-噻唑啉，2,5-二甲基苯胺中一种和/或混合。
4.根据权利要求3所述的蛋白A的亲和纯化方法，其特征在于，在步骤（2）中，蛋白A为天然蛋白A、重组蛋白A和蛋白A突变体。
5.根据权利要求3所述的蛋白A的亲和纯化方法，其特征在于，在步骤（2）中，亲和介质吸附蛋白A的条件为pH6.5－7.5，NaCl浓度为0.0－0.15M的缓冲液；洗脱条件为pH2.0—4.0，NaCl浓度为0－0.15M的缓冲液。
6.根据权利要求3所述的蛋白A的亲和的纯化方法，其特征在于，所述的蛋白A是用重组技术把蛋白A基因放在微生物宿主中进行表达。
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| John Sjoquist等.Protein A Isolated from Staphylococcus aureus after Digestion with Lysostaphin.《European Journal of Biochemistry》.1972,第29卷(第3期), |
| Protein A Isolated from Staphylococcus aureus after Digestion with Lysostaphin;John Sjoquist等;《European Journal of Biochemistry》;19721231;第29卷(第3期);第572页右栏第2段至573页右栏第2段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102731631A (zh) | 2012-10-17 |
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