JP2022546901A - アニオン交換－疎水性混合モードクロマトグラフィー樹脂 - Google Patents
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Abstract
アニオン交換－疎水性混合モードリガンドを有するクロマトグラフィー樹脂及びかかる樹脂を使用する方法が提供される。
Description
関連出願を相互参照
本出願は、２０１９年９月５日出願の米国仮出願第６２／８９６，１９６号の優先権を主張するものであり、内容を参照することにより組み込まれる。
本出願は、２０１９年９月５日出願の米国仮出願第６２／８９６，１９６号の優先権を主張するものであり、内容を参照することにより組み込まれる。
主として、哺乳動物体液又は細胞培養ハーベストである原料液からの免疫グロブリンの抽出は、診断、治療用途、及び一般的な実験室研究のために十分に濃縮又は精製された形態で免疫グロブリンを得る際に重要である。同様に、生物学的サンプルからの他の型のタンパク質及び他の分子の精製も重要である。
アニオン交換－疎水性の混合モードリガンドに連結されたクロマトグラフィーマトリックスを含むクロマトグラフィー樹脂が提供される。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー樹脂は、クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ（Ｒ１）－（Ｒ２－Ｌ）ｎ－Ａｒ又はそのアニオン塩である。
式中、
Ｘは、スペーサーであり、
Ｒ1は、水素、又は、任意で、－ＯＨで置換されたＣ１～Ｃ6アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ2～Ｃ6アルキル、又はＣ4～Ｃ6シクロアルキルであり、
Ｌは、ＮＲ4、Ｏ、又はＳであり、
ｎ＝１又は２であり、Ａｒは、６～１０員環であり、
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大５個の、Ｃ１～Ｃ３非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ6分岐アルキル、非置換アリール、又はフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大４個の非置換アルキル基で置換されており、
ただし、Ｒ１が水素である場合は、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ＬはＮＲ４又はＯであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない。
式中、
Ｘは、スペーサーであり、
Ｒ1は、水素、又は、任意で、－ＯＨで置換されたＣ１～Ｃ6アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ2～Ｃ6アルキル、又はＣ4～Ｃ6シクロアルキルであり、
Ｌは、ＮＲ4、Ｏ、又はＳであり、
ｎ＝１又は２であり、Ａｒは、６～１０員環であり、
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大５個の、Ｃ１～Ｃ３非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ6分岐アルキル、非置換アリール、又はフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大４個の非置換アルキル基で置換されており、
ただし、Ｒ１が水素である場合は、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ＬはＮＲ４又はＯであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない。
クロマトグラフィー樹脂のいくつかの実施形態において、
Ｘは、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－及び－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（ＣＨ３）２－ＣＯ－からなる群から選択され、
Ｒ１は、水素又はＣ１～Ｃ３アルキルであり、
Ｒ２はＣ２～Ｃ４アルキルであり、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、
Ａｒは６員環であり、
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大４個の、Ｃ１～Ｃ２非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ４分岐アルキル、又はフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大３個の、非置換アルキル基で置換されており、
ただし、Ｒ１が水素である場合は、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない。
Ｘは、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－及び－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（ＣＨ３）２－ＣＯ－からなる群から選択され、
Ｒ１は、水素又はＣ１～Ｃ３アルキルであり、
Ｒ２はＣ２～Ｃ４アルキルであり、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、
Ａｒは６員環であり、
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大４個の、Ｃ１～Ｃ２非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ４分岐アルキル、又はフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大３個の、非置換アルキル基で置換されており、
ただし、Ｒ１が水素である場合は、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない。
アニオン交換及び疎水性の混合モードクロマトグラフィーを用いて標的生体分子を精製するのに有用なクロマトグラフィー樹脂が提供される。このクロマトグラフィー樹脂によって、サンプルからの標的生体分子（例えば、組換えタンパク質）の効率的な精製が可能になる。一実施形態において、クロマトグラフィー樹脂は、サンプル中の１つ以上の成分（例えば、汚染物質）から標的タンパク質を分離するのに有用である。
定義
特に断りのない限り、本明細書及び特許請求の範囲を含む、本出願において使用される用語を以下の通りに定義する。本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形は、特に明確な指示のない限り、複数の指示対象を含む。標準化学用語の定義は、Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ（２００７）「Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５ｔｈ Ｅｄ．」Ｖｏｌｓ．Ａ ａｎｄ Ｂ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ ＬＬＣ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋをはじめとする参考文献にある。本発明の実施は、特に断わりのない限り、合成有機化学、質量分析、クロマトグラフィーの準備及び分析方法、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法を使用する。
特に断りのない限り、本明細書及び特許請求の範囲を含む、本出願において使用される用語を以下の通りに定義する。本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形は、特に明確な指示のない限り、複数の指示対象を含む。標準化学用語の定義は、Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ（２００７）「Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５ｔｈ Ｅｄ．」Ｖｏｌｓ．Ａ ａｎｄ Ｂ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ ＬＬＣ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋをはじめとする参考文献にある。本発明の実施は、特に断わりのない限り、合成有機化学、質量分析、クロマトグラフィーの準備及び分析方法、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法を使用する。
本明細書で使用される「アルキル」という用語は、１～１０個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖の飽和脂肪族ラジカルを指す。例えば、Ｃ1～Ｃ6アルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、及び／又はヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。アルキルは、１－２、１－３、１－４、１－５、１－６、１－７、１－８、１－９、１－１０、２－３、２－４、２－５、２－６、３－４、３－５、３－６、４－５、４－６及び５－６などの任意の数の炭素を含むことができる。アルキル基は、典型的には、一価であるが、アルキル基が２つの化学基を一緒に連結する場合のように、二価であってもよい。
本明細書中で使用される「シクロアルキル」という用語は、示される炭素原子の数を有する単環式アルキルを指す。単環としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルが挙げられる。
本明細書中で使用される「アリール」という用語は、単環式又は縮合二環式芳香族環アセンブリを指す。例えば、アリールは、フェニル又はナフチルである。アリール基は、任意で、１、２、３、４、又は５個の非置換アルキル基、非置換アリール基、又はフッ素基で置換されていてもよい。
「ヘテロ原子」という用語は、Ｎ、Ｏ及びＳを指す。
本明細書中で使用される「ヘテロアリール基」という用語は、員環として１つのヘテロ原子を含む芳香族基を指す。例としては、ピロール、フラン、チオフェン、及びピリジンが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリール基は、任意で、１、２、３、又は４個のアルキル基で置換されていてもよい。
「アニオン塩」は、リガンド中の塩基（例えば、アミノ又はアルキルアミノ）基で形成される。アニオン塩としては、ハロゲン化物、スルホン酸塩、硫酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩及び硝酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。酸付加塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素塩、硫酸塩、酢酸塩、クエン酸塩及び硝酸塩が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される「スペーサー」という用語は、Ｈ、Ｃ、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１～３０個の原子を有する分子を指す。スペーサーは、中性電荷を有し、環状基を含む。スペーサーは、クロマトグラフィーリガンドをクロマトグラフィーマトリックスと連結する。スペーサーをクロマトグラフィーマトリックスに連結するために使用される結合の種類には、アミド、アミン、エーテル、エステル、カルバメート、尿素、チオエーテル、チオカルバメート、チオカーボネート及びチオ尿素が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、スペーサーをクロマトグラフィーマトリックスに連結するために使用される結合は、アミン、エーテル又はアミドである。
「生物学的サンプル」は、精製されることが望ましい生物学的起源の標的分子（「生体分子」）を含有する任意の組成物を指す。いくつかの実施形態において、精製される標的分子は、抗体又は非抗体タンパク質である。
「抗体」は、免疫グロブリン、複合体（例えば、融合体）、又はそのフラグメント形態を指す。この用語には、ヒト化、ヒト、一本鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、突然変異、移植、及びインビトロで生成された抗体などの天然又は遺伝的に改変された形態を含む、ヒト又は他の哺乳動物細胞株に由来する、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの部類のポリクローナル又はモノクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されない。「抗体」にはまた、免疫グロブリン部分を含む融合タンパク質を含む複合形態も含まれるが、これに限定されない。「抗体」には、抗原結合機能を保持しているか否かにかかわらず、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、Ｆｃなどの抗体フラグメントも含まれる。
「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマー（例えば、組換えタンパク質）に適用される。
「結合溶出モード」は、サンプルがリガンドに適用される場合に、標的分子、及び、場合により望ましくない汚染物質が、リガンドに結合するように、緩衝条件が確立される、クロマトグラフィーへの操作的接近をいう。対象の分画は、その後、対象が支持体から溶出するように条件を変化させることによって達成される。いくつかの実施形態において、汚染物質は、対象溶出後に結合したままである。いくつかの実施形態において、汚染物質は、対象の溶出前に、フロースルー又は結合され、溶出される。
「フロースルーモード」は、精製されるべき標的分子がリガンドを含むクロマトグラフィー支持体を通って流れる一方で、少なくともいくつかのサンプル汚染物質が選択的に保持されることによって、サンプルからのそれらの除去が達成されるように、緩衝条件が確立される、クロマトグラフィーへの操作的アプローチをいう。
クロマトグラフィーリガンド
一実施形態において、混合モードクロマトグラフィー支持体及びリガンドは、
クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ（Ｒ１）－（Ｒ２－Ｌ）ｎ－Ａｒ又はそのアニオン塩である。
式中、
Ｘは、スペーサーであり、
Ｒ1は、水素、又は、任意で、－ＯＨで置換されたＣ１～Ｃ6アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ2～Ｃ6アルキル、又はＣ4～Ｃ6シクロアルキルであり、
Ｌは、ＮＲ4、Ｏ、又はＳであり、
ｎ＝１又は２であり、
Ａｒは、６～１０員環であり、
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大５個の、Ｃ１～Ｃ３非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ6分岐アルキル、非置換アリール、又はフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大４個の非置換アルキル基で置換されており、
ただし、Ｒ１が水素である場合は、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ＬはＮＲ４又はＯであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない。
一実施形態において、混合モードクロマトグラフィー支持体及びリガンドは、
クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ（Ｒ１）－（Ｒ２－Ｌ）ｎ－Ａｒ又はそのアニオン塩である。
式中、
Ｘは、スペーサーであり、
Ｒ1は、水素、又は、任意で、－ＯＨで置換されたＣ１～Ｃ6アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ2～Ｃ6アルキル、又はＣ4～Ｃ6シクロアルキルであり、
Ｌは、ＮＲ4、Ｏ、又はＳであり、
ｎ＝１又は２であり、
Ａｒは、６～１０員環であり、
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大５個の、Ｃ１～Ｃ３非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ6分岐アルキル、非置換アリール、又はフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大４個の非置換アルキル基で置換されており、
ただし、Ｒ１が水素である場合は、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ＬはＮＲ４又はＯであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない。
スペーサーに隣接する窒素の電荷はｐＨに依存する。従って、これらの樹脂は弱イオン交換を行う。
第１の実施形態の第１の態様において、Ｒ1は、水素又はＣ１～Ｃ３アルキルである。あるいは、Ｒ1は、水素又はＣ１～Ｃ２アルキルである。
第１の実施形態の第２の態様において、Ｒ2は、Ｃ2～Ｃ4アルキルである。あるいは、Ｒ2は、Ｃ2又はＣ3アルキルである。
第１実施形態の第３の態様において、ＬはＮＲ4又はＯ、又はＮＲ4又はＳである。あるいは、ＬはＯである。
第１の実施形態の第４の態様において、ｎは１である。
第１の実施形態の第５の態様において、Ａｒは６員環であり、Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大４個の、Ｃ1～Ｃ2非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ4分岐アルキル、又はフッ素基で置換されており、又はＡｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大３個のアルキル基で置換されており、ただし、Ｒ1 が水素である場合、Ｒ2は、Ｃ2アルキルであり、ＬはＮＲ4又はＯであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない。あるいは、Ａｒは、任意で、最大３個の、Ｃ1～Ｃ2非置換アルキル又はフッ素基で置換されており、ただし、Ｒ1が水素である場合、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ＬはＮＲ4又はＯであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない。あるいは、Ａｒは、任意で、１個又は２個のＣ1～Ｃ2非置換アルキルで置換されており、ただし、Ｒ1が水素である場合は、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ＬはＮＲ4又はＯであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない。あるいは、Ａｒは、クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ（Ｒ1）－（Ｒ2－Ｌ）n－に対して、パラ又はメタ位で、１つのＣ1～Ｃ３非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ6分岐アルキル、非置換アリール、又はフッ素基で置換されたフェニルである。あるいは、Ａｒはヘテロアリールであり、ヘテロアリール中のヘテロ原子はＮである。あるいは、Ａｒは非置換ヘテロアリールである。さらに別の選択肢では、Ａｒはピリジルである。
第１の実施形態の第６の態様において、Ｘは、アミド、アミン、エーテル、エステル、カルバメート、尿素、チオエーテル、チオカルバメート、チオカーボネート及びチオ尿素から選択される結合を介してクロマトグラフィーマトリックスに付加する。あるいは、結合はアミン、エーテル又はアミドである。
第１の実施形態の第７の態様において、Ｘは、
－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－及び－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（ＣＨ３）２－ＣＯ－からなる群から選択される。あるいは、Ｘは、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－及び－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－からなる群から選択される。
－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－及び－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（ＣＨ３）２－ＣＯ－からなる群から選択される。あるいは、Ｘは、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－及び－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－からなる群から選択される。
第２の実施形態において、クロマトグラフィー樹脂は、クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ（Ｒ１）－（Ｒ２－Ｌ）ｎ－Ａｒ又はそのアニオン塩である。
式中、
Ｘは、－Ｏ－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＣＨ2－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2）2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ（ＣＨ2－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2）2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－及び－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（ＣＨ3）2－ＣＯ－からなる群から選択され、
Ｒ1は、水素又はＣ１～Ｃ３アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ2～Ｃ４アルキル、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは、６員環であり、そして
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大４個の、Ｃ１～Ｃ２非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ6分岐アルキル、若しくはフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大３個の、非置換アルキル基で置換されており、
ただし、Ｒ１が水素である場合は、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ｎは１であり、Ａｒは非置換フェニルでない）である。
式中、
Ｘは、－Ｏ－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＣＨ2－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2）2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ（ＣＨ2－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2）2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－及び－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（ＣＨ3）2－ＣＯ－からなる群から選択され、
Ｒ1は、水素又はＣ１～Ｃ３アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ2～Ｃ４アルキル、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは、６員環であり、そして
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大４個の、Ｃ１～Ｃ２非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ6分岐アルキル、若しくはフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大３個の、非置換アルキル基で置換されており、
ただし、Ｒ１が水素である場合は、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ｎは１であり、Ａｒは非置換フェニルでない）である。
第２の実施形態の第１の態様において、Ｒ1は水素又はＣ１～Ｃ２アルキルである。
第２の実施形態の第２の態様において、Ｒ2はＣ2又はＣ3アルキルである。
第２の実施形態の第３の態様において、Ａｒは、任意で、最大３個のＣ1～Ｃ２非置換アルキル又はフッ素基で置換された、フェニル、ナフチル、又はピリジルであり、ただし、Ｒ1が水素である場合、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ＬはＮＲ4又はＯであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない。あるいは、Ａｒは、任意で、１個又は２個のＣ1～Ｃ２非置換アルキルで置換されたフェニルであり、ただし、Ｒ1が水素である場合、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ＬはＮＲ4又はＯであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない。あるいは、Ａｒは、クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ（Ｒ1）－（Ｒ2－Ｌ）n－に対してパラ又はメタ位で、１個のＣ1～Ｃ２非置換アルキルで置換されたフェニルである。あるいは、Ａｒはヘテロアリールであり、ヘテロアリール中のヘテロ原子はＮである。あるいは、Ａｒは非置換ヘテロアリールである。さらに別の選択肢では、Ａｒはピリジルである。
第３の実施形態において、クロマトグラフィー樹脂は、クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ（Ｒ１）－（Ｒ２－Ｌ）ｎ－Ａｒ又はそのアニオン塩である。
式中、
Ｘは、－Ｏ－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－及び－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－からなる群から選択され、
Ｒ1は、水素又はＣ１～Ｃ２アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ2～Ｃ３アルキル、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは、任意で、最大３個のＣ１～Ｃ２非置換アルキルで置換された、フェニル、ナフチル、又はピリジルであり、
ただし、Ｒ１が水素である場合は、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ｎは１であり、Ａｒは非置換フェニルでない。
式中、
Ｘは、－Ｏ－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－及び－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－からなる群から選択され、
Ｒ1は、水素又はＣ１～Ｃ２アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ2～Ｃ３アルキル、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは、任意で、最大３個のＣ１～Ｃ２非置換アルキルで置換された、フェニル、ナフチル、又はピリジルであり、
ただし、Ｒ１が水素である場合は、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ｎは１であり、Ａｒは非置換フェニルでない。
第３の実施形態の第１の態様において、Ａｒは、任意で、１個又は２個のＣ1～Ｃ2非置換アルキルで置換され、ただし、Ｒ1が水素である場合、Ｒ2はＣ2アルキルであり、Ａｒはフェニルでない。あるいは、Ａｒは、クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ（Ｒ1）－（Ｒ2－Ｌ）n－に対するパラ又はメタ位で、メチル基で置換されたフェニルである。あるいは、Ａｒは、非置換フェニルであり、ただし、Ｒ1は水素でなく、Ｒ2はＣ2アルキルでない。
第４の実施形態において、－（Ｘ）－Ｎ（Ｒ1）－（Ｒ2－Ｌ）n－Ａｒは、表１のリガンドのいずか１つである。
第５の実施形態において、クロマトグラフィー樹脂は、クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ－［（Ｒ2－Ｌ）n－Ａｒ］2又はそのアニオン塩である。
式中、
Ｘは、スペーサーであり、
Ｒ２は、Ｃ2～Ｃ6アルキル、又はＣ4～Ｃ6シクロアルキルであり、
Ｌは、ＮＲ4、Ｏ、又はＳであり、
ｎ＝１又は２であり、及び
Ａｒは、６～１０員環であり、そして、
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大５個の、Ｃ１～Ｃ３非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ6分岐アルキル、非置換アリール、若しくはフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大４個の非置換アルキル基で置換されている。
式中、
Ｘは、スペーサーであり、
Ｒ２は、Ｃ2～Ｃ6アルキル、又はＣ4～Ｃ6シクロアルキルであり、
Ｌは、ＮＲ4、Ｏ、又はＳであり、
ｎ＝１又は２であり、及び
Ａｒは、６～１０員環であり、そして、
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大５個の、Ｃ１～Ｃ３非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ6分岐アルキル、非置換アリール、若しくはフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大４個の非置換アルキル基で置換されている。
第５の実施形態の第１の態様において、Ｒ2は、Ｃ2～Ｃ4アルキルである。あるいは、Ｒ2はＣ2又はＣ3アルキルである。
第５の実施形態の第２の態様において、ＬはＮＲ4又はＯであり、又はＮＲ4又はＳである。あるいは、ＬはＯである。
第５の実施形態の第３の態様において、ｎは１である。
第５の実施形態の第４の態様において、Ａｒは６員環であり、Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大４個の、Ｃ1～Ｃ2非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ4分岐アルキル、若しくはフッ素基で置換されており、又はＡｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大３個のアルキル基で置換されている。あるいは、Ａｒは、任意で、最大３個のＣ1～Ｃ2非置換アルキル又はフッ素基で置換された、フェニル、ナフチル、又はピリジルである。あるいは、Ａｒは、１個又は２個のＣ1～Ｃ2非置換アルキルで置換されたフェニルである。あるいは、Ａｒは、－（Ｒ2－Ｌ）n－に対してパラ又はメタ位で、１個の、Ｃ1～Ｃ3非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ６分岐アルキル、非置換アリール、又はフッ素基で置換されたフェニルである。あるいは、Ａｒはヘテロアリールであり、ヘテロアリール中のヘテロ原子はＮである。あるいは、Ａｒは非置換ヘテロアリールである。さらに別の選択肢では、Ａｒはピリジルである。
第５の実施形態の第５の態様において、Ｘは、アミド、アミン、エーテル、エステル、カルバメート、尿素、チオエーテル、チオカルバメート、チオカーボネート及びチオ尿素から選択される結合を介してクロマトグラフィーマトリックスに付加している。あるいは、結合はアミン、エーテル又はアミドである。
第５の実施形態の第６の態様において、Ｘは、－Ｏ－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－、-Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＣＨ2－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2）2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ（ＣＨ2－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2）2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－及び－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（ＣＨ3）2－ＣＯ－からなる群から選択される。あるいは、Ｘは、－Ｏ－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－及び－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－からなる群から選択される。
第６の実施形態において、クロマトグラフィー樹脂は、クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ－［（Ｒ2－Ｌ）n－Ａｒ］］2又はそのアニオン塩である。
式中、
Ｘは、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－及び－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（ＣＨ３）２－ＣＯ－からなる群から選択され、
Ｒ2はＣ2～Ｃ4アルキルであり、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは６員環であり、そして、
Ａｒがアリールの場合、アリールは、任意で、最大４個の、Ｃ3～Ｃ２非置換アルキル、Ｃ3又はＣ4分岐アルキル若しくはフッ素基で置換されており、又は
Ａｒがヘテロアリールの場合、ヘテロアリールは、任意で、最大３個の、非置換アルキル基で置換されている。
式中、
Ｘは、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－及び－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（ＣＨ３）２－ＣＯ－からなる群から選択され、
Ｒ2はＣ2～Ｃ4アルキルであり、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは６員環であり、そして、
Ａｒがアリールの場合、アリールは、任意で、最大４個の、Ｃ3～Ｃ２非置換アルキル、Ｃ3又はＣ4分岐アルキル若しくはフッ素基で置換されており、又は
Ａｒがヘテロアリールの場合、ヘテロアリールは、任意で、最大３個の、非置換アルキル基で置換されている。
第６の実施形態の第１の態様において、Ｒ2は、Ｃ2又はＣ3アルキルである。
第６の実施形態の第２の態様において、Ａｒは、任意で、最大３個の、Ｃ1～Ｃ2非置換アルキル若しくはフッ素基で置換された、フェニル、ナフチル、又はピリジルである。あるいは、Ａｒは、任意で、１個又は２個のＣ1～Ｃ2非置換アルキルで置換されたフェニルである。あるいは、Ａｒは、－（Ｒ2－Ｌ）n－に対してパラ又はメタ位で、１個のＣ1又はＣ2非置換アルキルで置換されたフェニルである。あるいは、Ａｒは、ヘテロアリールであり、ヘテロアリール中のヘテロ原子はＮである。あるいは、Ａｒは非置換ヘテロアリールである。さらに別の選択肢では、Ａｒはピリジルである。
第７の実施形態において、クロマトグラフィー樹脂は、クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ－［（Ｒ2－Ｌ）n－Ａｒ］2又はそのアニオン塩である。
式中、
Ｘは、Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－及び－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－からなる群から選択され、
Ｒ1は、水素、Ｃ1、又はＣ2アルキルであり、
Ｒ2はＣ2又はＣ3アルキルであり、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは、任意で、最大３個のＣ1～Ｃ2非置換アルキルで置換された、フェニル、ナフチル、又はピリジルである。
式中、
Ｘは、Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－及び－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－からなる群から選択され、
Ｒ1は、水素、Ｃ1、又はＣ2アルキルであり、
Ｒ2はＣ2又はＣ3アルキルであり、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは、任意で、最大３個のＣ1～Ｃ2非置換アルキルで置換された、フェニル、ナフチル、又はピリジルである。
第７の実施形態の第１の態様において、Ａｒは、任意で、１個又は２個のＣ1～Ｃ2非置換アルキルで置換されたフェニルである。あるいは、Ａｒは、－（Ｒ2－Ｌ）n－に対してパラ又はメタ位で、メチル基で置換されたフェニルである。あるいは、Ａｒは非置換フェニルである。
第８の実施形態において、－（Ｘ）－Ｎ－［（Ｒ2－Ｌ）n－Ａｒ］2は、表２のリガンドのいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、アニオン塩は、塩酸塩、リン酸塩、又は硫酸塩である。
クロマトグラフィーマトリックスは、スペーサーＸで結合を形成できるように官能化されたポリマーである。ポリマーは、親水性ポリマーであることが好ましい。ポリマーは、水に不溶性である。好適なポリマーは、例えば、アガロース、デキストラン、セルロース、澱粉、プルランなどの多糖類をベースとするポリヒドロキシポリマー；ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ（ヒドロキシアルキルビニルエーテル）、ポリ（ヒドロキシアルキルアクリレート）及びポリメタクリレート（例えば、ポリグリシジルメタクリレート）、ポリビニルアルコール、スチレンやジビニルベンゼンをベースとするポリマーなどの完全合成ポリマー；ならびに上記ポリマーに対応するモノマーの２つ以上が含まれるコポリマーである。好適な合成ポリマーとしては、限定されるものではないが、Ｓｉｇｍａ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－ＥＭＤ－Ｍｅｒｃｋ製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ及びＥｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ベースビーズ、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＴｏｙｏｐａｒｌ ＡＦ－Ｅｐｏｓｙ－６５０Ｍ及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＰＯＲＯＳ培地、Ｂｉｏ－Ｒａｄ製のＢｉｏ－Ｇｅｌ Ｐ及びＭａｃｒｏ Ｐｒｅｐ、ＴＥＳＳＥＫ製のＨＥＭＡ及びＳｅｐａｒｏｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製の活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ、活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ならびにＰａｌｌ製のＨｙｐｅｒ Ｄ及びＴｒｉｓａｃｒｙｌ培地が挙げられる。水に可溶性であるポリマーは、例えば、吸着又は共有結合を介して不溶物体に、架橋することによって、及びカップリングすることによって、不溶物になるように誘導体化される。親水性基は、疎水性ポリマー上（例えば、モノビニル及びジビニルベンゼンの共重合体上）に、ＯＨに変換される基を示すモノマーの重合によって、又は、例えば、親水性ポリマーなどの好適な化合物の吸着によって、最終ポリマーの親水性化によって導入される。有用なマトリックスを得るために重合されるモノマーの例は、場合によっては官能基を有する酢酸ビニル、ビニルプロピルアミン、アクリル酸、メタクリレート、ブチルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、ビニルピロリドン（ビニルピロリジノン）である。架橋剤もまた、多くの実施形態において有用であり、存在する場合、いくつかの実施形態において、全モノマーに対して約０．１～約０．７のモル比を構成する。架橋剤の例としては、ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミド、ジアリルタルタルジアミド、トリアリルクエン酸トリアミド、エチレンジアクリレート、ビスアクリルシスタミン、Ｎ，Ｎ′－メチレンビスアクリルアミド、及びピペラジンジアクリルアミドが挙げられる。いくつかの実施態様において、マトリックスは、水溶性親水性モノマーから製造されるポリマーでＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（登録商標）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）基質である。
クロマトグラフィーマトリックスは、粒子、チップ、膜、又はモノリス、すなわち、材料の単一ブロック、ペレット、又はスラブの形成である。好ましくは、クロマトグラフィーマトリックスは多孔質である。粒子は、マトリックスとして使用される場合、球体又はビーズであり、滑らかな表面であるか、粗いもしくはテクスチャーのある表面を有するかのいずれかである。場合によっては、気孔のいくつかは貫通孔であり、粒子を通って延びて、流体力学的な流れ又は気孔を通る迅速な拡散を可能にするのに十分な大きさのチャネルとして働く。球体又はビーズの形態である場合、メジアン粒径（「粒径」という用語は、粒子の最も長い外部寸法をいう）は約２５ミクロン～約１５０ミクロンである。例示的なマトリックス及びそれらを生成する方法の開示は、特許文献１～４にある。
リガンドは、スペーサーＸを介してクロマトグラフィーマトリックスに連結される。クロマトグラフィーマトリックスへの連結は、使用される特定のクロマトグラフィーマトリックス及びクロマトグラフィーマトリックスに連結される化学基に依る。リガンドは、クロマトグラフィーマトリックス上でリガンドと官能基の間の反応を実行することにより、クロマトグラフィーマトリックスと連結させることができる。好適な官能基を持たないクロマトグラフィーマトリックスについては、クロマトグラフィーマトリックスを好適な活性化試薬と反応させて、リガンドを付加させることができる好適な官能基を生成する。還元アミノ化、エポキシド化、又はアザラクトン化は、それぞれアルデヒド、エポキシド、又はアザラクトン官能基に作用する化学作用の例である。
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーマトリックスは、例えば、ＮａＩＯ4による変換によってアルデヒドに変換されるジオールを含む。リガンドの第一級又は第二級アミンは、以下のスキームによる還元アミノ化反応によってクロマトグラフィーマトリックス上のアルデヒドに結合される。このスキームでは、スペーサーＸは－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－である。本開示におけるこの合成スキーム及び他の合成スキームにおいて、正方形はマトリックスを表し、全てのカップリング化は個別に示される。
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーマトリックスは、エポキシド基を含み、リガンド中の第一級又は第二級アミンは、以下のスキームによってエポキシド化を介してエポキシド基に連結される。このスキームでは、スペーサーＸは、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－である。
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーマトリックスは、アズラクトン環を含み、リガンド中の第一級又は第二級アミンは、以下のスキームによってアズラクトン環に連結される。このスキームでは、スペーサーＸは、－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（ＣＨ3）2－ＣＯ－である。
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーマトリックスは、ジオールを含み、第一級又は第二級アミンは、以下のスキームによって、２つの活性化試薬、アリルグリジシルエーテル（ＡＧＥ）及び臭素で樹脂を活性化することによって、－ＯＨ基に連結される。このスキームでは、スペーサーＸは、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＣＨ2－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2）2－である。
特定の実施形態において、クロマトグラフィーマトリックスは、－ＯＨ基を含み、第１級又は第２級アミンは以下のスキームによって樹脂をエピクロロヒドリンで活性化することによって、－ＯＨ基に連結される。このスキームでは、スペーサーＸは－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－である。
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーマトリックスは、－ＯＨ基を含み、第１級又は第２級アミンは、以下のスキームによって樹脂を１，４ブタンジオールジグリシジルエーテルで活性化することによって、－ＯＨ基に連結される。このスキームでは、スペーサーＸは、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－である。
他の活性化試薬としては、エピブロモヒドリン（クロマトグラフィーマトリックス上の－ＯＨ官能基と反応してエポキシド基を生成する）、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（クロマトグラフィーマトリックス上の－ＯＨ官能基と反応してエポキシド基を生成する）、ジクロロプロパノール等のハロゲン置換脂肪族物質（クロマトグラフィーマトリックス上の－ＯＨ官能基と反応してエポキシド基を生成する）、ジビニルスルホン（クロマトグラフィーマトリックス上のジオール官能基と反応してビニル基を生成する）、及び塩化トシルや塩化トレシル等の塩化スルホニル（クロマトグラフィーマトリックス上の－ＯＨ官能基と反応してスルホネートエステルを生成する）が挙げられるが、これらに限定されない。
他のスペーサーとしては、－Ｏ－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ（ＣＨ2－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2）2－及び－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－ＣＨ2－が挙げられるが、これらに限定されない。
クロマトグラフィーマトリックスは、充填カラム及び流動床又は膨張床カラム、モノリス又は多孔質膜を含む任意の従来の構成で、及びローディング、洗浄、及び溶出のためのバッチモード、ならびに連続又はフロースルーモードを含む任意の従来の方法によって利用することができる。いくつかの実施形態において、カラムの直径は、１ｃｍ～１ｍの範囲であり、高さは、１ｃｍ～３０ｃｍ以上の範囲である。
方法
標的生体分子を精製する方法も提供される。一実施形態において、本方法は、生体分子を含むサンプルをクロマトグラフィー樹脂に接触させ、それによって生体分子を汚染物質から分離することを含む。続いて、得られた精製生体分子を回収する。いくつかの実施形態において、標的生体分子は標的タンパク質であり、方法は、汚染物質から標的タンパク質を精製することを含む。いくつかの実施形態において、標的生体分子はモノマー抗体であり、方法は、サンプル中の凝集抗体からモノマー抗体を精製することを含む。
標的生体分子を精製する方法も提供される。一実施形態において、本方法は、生体分子を含むサンプルをクロマトグラフィー樹脂に接触させ、それによって生体分子を汚染物質から分離することを含む。続いて、得られた精製生体分子を回収する。いくつかの実施形態において、標的生体分子は標的タンパク質であり、方法は、汚染物質から標的タンパク質を精製することを含む。いくつかの実施形態において、標的生体分子はモノマー抗体であり、方法は、サンプル中の凝集抗体からモノマー抗体を精製することを含む。
クロマトグラフィーリガンドは、アニオン交換（すなわち、リガンドが正に荷電している場合）及び疎水性の混合モードクロマトグラフィーを使用して標的分子を精製するのに有用である。条件は、クロマトグラフィーを結合溶出モード又はフロースルーモードで実行するように調整することができる。
本方法が適用されるタンパク質調製物は、天然、合成、又は組換え供給源由来のタンパク質を含む。非精製タンパク質調製物は、例えば、血漿、プラズマ、腹水液、乳、植物抽出物、細菌溶解物、酵母溶解物、又はならし細胞培養培地を含むが、これらに限定されない種々の供給源に由来する。部分的に精製されたタンパク質調製物は、少なくとも１つのクロマトグラフィー、沈殿、他の分画工程、又は上記の任意の組み合わせによって処理された未精製調製物に由来する。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー工程は、サイズ排除、親和性、アニオン交換、カチオン交換、タンパク質Ａ親和性、疎水性相互作用、固定化金属親和性クロマトグラフィー、又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない任意の方法を使用する。析出工程には、塩又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）析出、有機酸、有機塩基又は他の薬剤による析出が含まれる。他の分別工程は、結晶化、液体：液体分配、又は膜濾過を含むが、これらに限定されない。
当技術分野で理解されるように、混合モードクロマトグラフィーで使用されるロード、洗浄及び溶出条件は、使用される特定のクロマトグラフィー培地／リガンドに依存する。
いくつかの結合－溶出モードの実施形態において、ローディング（すなわち、標的タンパク質をマトリックスに結合すること）、及び、任意で、洗浄は、６．５を超えるｐＨ、例えば、６．５～８、７～９などで行われる。いくつかの例示的な結合培地－溶出条件は次の通りである。結合条件：適切な緩衝液（例えば、トリス、ビス－トリス、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、又は酢酸ナトリウム）中の０～１０００ｍＭ ＮａＣｌ又は０～４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５～８．５又は７～９。溶出条件：リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アルギニン、又はグリシンを有する適切な緩衝液を使用した、１０～１０００ｍＭ ＮａＣｌ又は２０～５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３～８．５又は４～６。
任意で、マトリックスは、サンプルのいくつかの成分がクロマトグラフィーマトリックスから除去されるが、標的生体分子がマトリックス上に固定されたままであるような条件下で洗浄することができる。いくつかの実施形態において、標的生体分子は、続いて、塩濃度を低下させる、及び／又はマトリックスと接触する溶液のｐＨを低下させることによって溶出される。
あるいは、サンプルのいくつかの成分がマトリックスに固定化されるが、標的生体分子はクロマトグラフィーマトリックスを通って流れ（すなわち、フローパスされる）フロースルーモードで、サンプルは適用されて収集される。いくつかの例示的なフロースルー条件は、０～１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０～８．５であり、適切な緩衝液としては、例えば、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス－トリス、酢酸ナトリウム又はクエン酸－リン酸塩が挙げられる。
実施例
以下の実施例は、例示であって、限定されるものではない。当業者であれば、本質的に同じ又は類似の結果をもたらすように変更又は修正することができる様々な重要でないパラメータを容易に認識できるはずである。
実施例１－表２のリガンドを有するクロマトグラフィー樹脂の生成
以下の実施例は、例示であって、限定されるものではない。当業者であれば、本質的に同じ又は類似の結果をもたらすように変更又は修正することができる様々な重要でないパラメータを容易に認識できるはずである。
実施例１－表２のリガンドを有するクロマトグラフィー樹脂の生成
表３の一次アミンリガンド５、６、１１、及び１６
表３の第一級アミンリガンド５、６、１１、及び１６のそれぞれについて、Ｎ，Ｎ′－メチレンビスアクリルアミドで架橋され、ジオール密度が２００～３００μｍｏｌ／ｍＬである３－アリルオキシ－１，２－プロパンジオールとビニルピロリジノンとの共重合体であるＵＮＯｓｐｈｅｒｅジオール（２０ｍＬ）を、球状ビーズの形態で使用した。ビーズを、２０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム又は水のいずれかに懸濁させた。過ヨウ素酸ナトリウムを、５０～１００ｍＭの範囲内の濃度で添加し、得られた混合物を室温（約７０°Ｆ（２１℃））で３～２４時間インキュベートした。反応は、１５０～２５０μｍｏｌ／ｍＬのジオール基のアルデヒド基への変換をもたらした。得られたアルデヒド官能化樹脂を２０ｍＬカラムに移し、そこで水１００ｍＬで洗浄した。
表３の第一級アミンリガンド５、６、１１、及び１６のそれぞれについて、Ｎ，Ｎ′－メチレンビスアクリルアミドで架橋され、ジオール密度が２００～３００μｍｏｌ／ｍＬである３－アリルオキシ－１，２－プロパンジオールとビニルピロリジノンとの共重合体であるＵＮＯｓｐｈｅｒｅジオール（２０ｍＬ）を、球状ビーズの形態で使用した。ビーズを、２０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム又は水のいずれかに懸濁させた。過ヨウ素酸ナトリウムを、５０～１００ｍＭの範囲内の濃度で添加し、得られた混合物を室温（約７０°Ｆ（２１℃））で３～２４時間インキュベートした。反応は、１５０～２５０μｍｏｌ／ｍＬのジオール基のアルデヒド基への変換をもたらした。得られたアルデヒド官能化樹脂を２０ｍＬカラムに移し、そこで水１００ｍＬで洗浄した。
次に、各第一アミンリガンドについて、２０ミリリットルのＵＮＯｓｐｈｅｒｅアルデヒド樹脂を、０．６ｇのリガンドを含有する０．２０Ｍリン酸ナトリウム２０ｍｌ中にｐＨ７．０で懸濁させた。これらの混合物を室温で１５分間インキュベート（振とう、２００ｒｐｍ）した後、２００ｍｇのＮａＢＨ３ＣＮを、それぞれの混合物に添加し、３～２０時間反応を継続させた。各反応におけるリガンド濃度は、２５～２００ｍＭの範囲にあった。反応の終わりに、樹脂を各々２０ｍｌのカラムに移し、３ＣＶの水、続いて１～２ＣＶの０．１Ｎ ＨＣｌで洗浄し、次いで５ ＣＶの水で洗浄した。各樹脂のリガンド密度は、２５～１００μｍｏｌ／ｍｌの範囲であった。
ＵＮＯｓｐｈｅｒｅアルデヒド樹脂に付加したリガンド５、６、１１、及び１６の構造及び密度を表３に示す。
表４の二次アミンリガンド３２、３４、３９及び４４
表４の第二級アミンリガンド３２、３４、３９、及び４４の各々について、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅジオール（１００ｍＬ）を球状ビーズの形態で使用した。ビーズを、３０ｍＬの水、３０ｍＬの１０Ｎ ＮａＯＨ及び１６ｇのＮａ２ＳＯ４に５０℃で２５０ｒｐｍのシェイカー中で１０分間懸濁させた。アリルグリジシルエーテル（ＡＧＥ）１００ｍｌを加え、同じシェイカー中５０℃で一晩保持した。得られたＡＧＥ変性樹脂を、３×２カラム容量（ＣＶ）のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）及び３０ＣＶの水で洗浄した。ＡＧＥ変性樹脂を１００ｍＬの水及び３．４ｇのＮａＯＡＣと混合した。オレンジ色が残るまで（二重結合と臭素の反応の完了を示す）、臭素液体をスラリーに滴下した。その後、オレンジ色が消えるまでＮａ２ＳＯ３を追加した（過剰な臭素を臭化物に還元）。得られたＵＮＯｓｐｈｅｒｅジオール臭化物樹脂を３０ＣＶの水で洗浄し、リガンドカップリングの用意ができた。各第二級アミンリガンドについて、１００ｍＬのＵＮＯｓｐｈｅｒｅジオール臭化樹脂を５０ｍＬの水及び５０ｍＬのＩＰＡと混合した。次に、１２．５ｇのリガンドを添加した。各混合物を２５０ｒｐｍのシェイカー中５０℃で一晩インキュベートした。反応終了時に、各樹脂を２ＣＶ ＩＰＡ、２ＣＶ水、２ＣＶ １Ｎ ＨＣｌ、２ＣＶ水、２ＣＶ １Ｎ ＮａＯＨ、次いで３０ＣＶ水で洗浄し、３級アミン樹脂を得た。
表４の第二級アミンリガンド３２、３４、３９、及び４４の各々について、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅジオール（１００ｍＬ）を球状ビーズの形態で使用した。ビーズを、３０ｍＬの水、３０ｍＬの１０Ｎ ＮａＯＨ及び１６ｇのＮａ２ＳＯ４に５０℃で２５０ｒｐｍのシェイカー中で１０分間懸濁させた。アリルグリジシルエーテル（ＡＧＥ）１００ｍｌを加え、同じシェイカー中５０℃で一晩保持した。得られたＡＧＥ変性樹脂を、３×２カラム容量（ＣＶ）のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）及び３０ＣＶの水で洗浄した。ＡＧＥ変性樹脂を１００ｍＬの水及び３．４ｇのＮａＯＡＣと混合した。オレンジ色が残るまで（二重結合と臭素の反応の完了を示す）、臭素液体をスラリーに滴下した。その後、オレンジ色が消えるまでＮａ２ＳＯ３を追加した（過剰な臭素を臭化物に還元）。得られたＵＮＯｓｐｈｅｒｅジオール臭化物樹脂を３０ＣＶの水で洗浄し、リガンドカップリングの用意ができた。各第二級アミンリガンドについて、１００ｍＬのＵＮＯｓｐｈｅｒｅジオール臭化樹脂を５０ｍＬの水及び５０ｍＬのＩＰＡと混合した。次に、１２．５ｇのリガンドを添加した。各混合物を２５０ｒｐｍのシェイカー中５０℃で一晩インキュベートした。反応終了時に、各樹脂を２ＣＶ ＩＰＡ、２ＣＶ水、２ＣＶ １Ｎ ＨＣｌ、２ＣＶ水、２ＣＶ １Ｎ ＮａＯＨ、次いで３０ＣＶ水で洗浄し、３級アミン樹脂を得た。
ＵＮＯｓｐｈｅｒｅジオールブロミド樹脂に付加したリガンド３２、３４、３９、及び４４の数、構造、及び密度を表４に示す。
実施例２－酸性タンパク質及び結合－溶出モードを用いた表３及び４からのアミン樹脂の評価
２つのモデル酸性タンパク質、ＣＤＰ－Ｄ－グルコース４，６－デヒドラターゼ及びヒト血清アルブミンの静的結合能、回収率及び純度を、種々の結合及び溶出条件を用いて、表３及び４からの樹脂について求めた。
２つのモデル酸性タンパク質、ＣＤＰ－Ｄ－グルコース４，６－デヒドラターゼ及びヒト血清アルブミンの静的結合能、回収率及び純度を、種々の結合及び溶出条件を用いて、表３及び４からの樹脂について求めた。
材料：
１．表３及び４からの樹脂
２．使い捨てスピンカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号７３２－６２０７）
３．ＣＤＰ－Ｄ－グルコース４，６－デヒドラターゼ（「Ｅｏｄ」）（ｐＩは約６であり、ｐＨ６未満では安定ではない）を含有する粗大腸菌溶解物
４．ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）（分率Ｖ、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ１６５３、ｐＩは約４．７である）
５．Ｅｏｄの結合／洗浄緩衝液
ａ．ｐＨ６．５、７．５、又は約８．５での２５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液
ｂ．０、２５又は約５０ｍＭ ＮａＣｌ
６．ＨＳＡのための結合／洗浄緩衝液
ａ．ｐＨ４、６又は約８での２５ｍＭ リン酸ナトリウム又は酢酸ナトリウム緩衝液
ｂ．０、２００又は約４００ｍＭ ＮａＣｌ
７．Ｅｏｄ用溶出緩衝液
ａ．ｐＨ６．５、７．５、又は約８．５での２５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液
ｂ．１０、５００又は約１０００ｍＭ ＮａＣｌ
８．ＨＳＡ用溶出緩衝液
ａ．ｐＨ４、６、又は約８での２５ｍＭ リン酸ナトリウム又は酢酸ナトリウム緩衝液
ｂ．２０、５００、又は約１０００ｍＭ ＮａＣｌ
１．表３及び４からの樹脂
２．使い捨てスピンカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号７３２－６２０７）
３．ＣＤＰ－Ｄ－グルコース４，６－デヒドラターゼ（「Ｅｏｄ」）（ｐＩは約６であり、ｐＨ６未満では安定ではない）を含有する粗大腸菌溶解物
４．ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）（分率Ｖ、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ１６５３、ｐＩは約４．７である）
５．Ｅｏｄの結合／洗浄緩衝液
ａ．ｐＨ６．５、７．５、又は約８．５での２５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液
ｂ．０、２５又は約５０ｍＭ ＮａＣｌ
６．ＨＳＡのための結合／洗浄緩衝液
ａ．ｐＨ４、６又は約８での２５ｍＭ リン酸ナトリウム又は酢酸ナトリウム緩衝液
ｂ．０、２００又は約４００ｍＭ ＮａＣｌ
７．Ｅｏｄ用溶出緩衝液
ａ．ｐＨ６．５、７．５、又は約８．５での２５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液
ｂ．１０、５００又は約１０００ｍＭ ＮａＣｌ
８．ＨＳＡ用溶出緩衝液
ａ．ｐＨ４、６、又は約８での２５ｍＭ リン酸ナトリウム又は酢酸ナトリウム緩衝液
ｂ．２０、５００、又は約１０００ｍＭ ＮａＣｌ
方法
静的結合能（ＳＢＣ）測定：試験した各樹脂及び標的タンパク質（すなわち、Ｅｏｄ及び／又はＨＳＡ）について、０．１ｍｌの樹脂を含有するスピンカラムを、適切な結合緩衝液（標的タンパク質に依存する）で予備平衡化し、次いで、Ｅｏｄ含有溶解物又はＨＳＡ溶液で５分間インキュベートした。各樹脂及び標的タンパク質について、３つの異なるｐＨ値（例えば、ＥｏｄについてはｐＨ ６．５、７．５、８．５）での結合／洗浄緩衝液を、３つの異なるＮａＣｌ濃度（例えば、Ｅｏｄについては０、２５、５０ｍＭ ＮａＣｌ）と組み合わせて、３つの溶出緩衝液ｐＨ及びＮａＣｌ濃度の組み合わせのそれぞれで試験した。このように、各樹脂及び標的タンパク質を、９つの結合／洗浄緩衝液の組み合わせで試験し、結合／洗浄緩衝液の組み合わせの各々を、９つの溶出緩衝液の組み合わせで試験した。
カラムを１分間１０００ｘｇで遠心分離し、未結合タンパク質／不純物を除去し、５カラム容量の適切な結合／洗浄バッファで１回洗浄した後、５ＣＶの適切な溶出バッファでインキュベートし（標的タンパク質に応じて）、結合標的タンパク質を回収した。カラムを、再び１分間１０００ｘｇで遠心分離し、２８０ｎｍでのカラム排水吸光度を、スピンカラムに充填した元のタンパク質溶液の２８０ｎｍでの吸光度と共に求めた。静的結合能は、ＳＢＣ＝（充填した合計タンパク質－フロースルー画分中のタンパク質）／樹脂の体積によって求めた。
標的タンパク質回収：各樹脂について、溶出液中に回収されたタンパク質を、２８０ｎｍでの吸光度、Ｅｏｄについて１の吸光係数、及びＨＳＡ（標的タンパク質の１ｍｇ／ｍＬ溶液）について０．５３４の吸光係数によって、回収率（％）＝（溶出液中の総タンパク質／総荷重タンパク質）×１００で定量した。
標的タンパク質純度：各樹脂についての標的タンパク質の純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＢｉｏ－ＲａｄのＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアによって評価した。
最適な結合及び溶出条件：ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して、各標的タンパク質及び樹脂を用いて最適な精製条件を求めた。
静的結合能（ＳＢＣ）測定：試験した各樹脂及び標的タンパク質（すなわち、Ｅｏｄ及び／又はＨＳＡ）について、０．１ｍｌの樹脂を含有するスピンカラムを、適切な結合緩衝液（標的タンパク質に依存する）で予備平衡化し、次いで、Ｅｏｄ含有溶解物又はＨＳＡ溶液で５分間インキュベートした。各樹脂及び標的タンパク質について、３つの異なるｐＨ値（例えば、ＥｏｄについてはｐＨ ６．５、７．５、８．５）での結合／洗浄緩衝液を、３つの異なるＮａＣｌ濃度（例えば、Ｅｏｄについては０、２５、５０ｍＭ ＮａＣｌ）と組み合わせて、３つの溶出緩衝液ｐＨ及びＮａＣｌ濃度の組み合わせのそれぞれで試験した。このように、各樹脂及び標的タンパク質を、９つの結合／洗浄緩衝液の組み合わせで試験し、結合／洗浄緩衝液の組み合わせの各々を、９つの溶出緩衝液の組み合わせで試験した。
カラムを１分間１０００ｘｇで遠心分離し、未結合タンパク質／不純物を除去し、５カラム容量の適切な結合／洗浄バッファで１回洗浄した後、５ＣＶの適切な溶出バッファでインキュベートし（標的タンパク質に応じて）、結合標的タンパク質を回収した。カラムを、再び１分間１０００ｘｇで遠心分離し、２８０ｎｍでのカラム排水吸光度を、スピンカラムに充填した元のタンパク質溶液の２８０ｎｍでの吸光度と共に求めた。静的結合能は、ＳＢＣ＝（充填した合計タンパク質－フロースルー画分中のタンパク質）／樹脂の体積によって求めた。
標的タンパク質回収：各樹脂について、溶出液中に回収されたタンパク質を、２８０ｎｍでの吸光度、Ｅｏｄについて１の吸光係数、及びＨＳＡ（標的タンパク質の１ｍｇ／ｍＬ溶液）について０．５３４の吸光係数によって、回収率（％）＝（溶出液中の総タンパク質／総荷重タンパク質）×１００で定量した。
標的タンパク質純度：各樹脂についての標的タンパク質の純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＢｉｏ－ＲａｄのＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアによって評価した。
最適な結合及び溶出条件：ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して、各標的タンパク質及び樹脂を用いて最適な精製条件を求めた。
結果：ＳＢＣの結果、樹脂の回収率を表５（第二級アミン樹脂５、６、１１、及び１６）及び表６（第三級アミン樹脂３２、３４、３９、及び４４）に示す。表５及び６はまた、各樹脂についての最適な結合及び溶出条件を列挙する。表５において、「－」は「約」を表し、両方の表において、「ＮａＣｌ」はＮａＣｌ濃度を表す。
表５及び６からのデータは、標的タンパク質及び樹脂に応じた最適な結合及び溶出条件の範囲を示す。例えば、標的タンパク質としてのＥｏｄについて、最適な結合条件は、樹脂５で試験した場合、ｐＨ６．５／ＮａＣｌなしであり、一方、樹脂１６について、最適な結合条件は、ｐＨ８．５／５０ｍＭ ＮａＣｌであった。同様に、標的タンパク質としてのＨＳＡについて、最適な結合条件は、樹脂６で、ｐＨ８．０／４００ｍＭ ＮａＣｌであり、一方、樹脂３４について、最適な結合条件は、ｐＨ４．０／ＮａＣｌなしであった。
標的タンパク質としてＥｏｄを用いて試験した樹脂５、１１、及び１６の最適溶出条件は、高ｐＨ（８～８．５）及び高ＮａＣｌ濃度（１０００ｍＭ）であった。しかしながら、ＨＳＡで試験した樹脂４４については、最適溶出条件は、低ｐＨ（４）及び低ＮａＣｌ濃度（２０ｍＭ）であった。
表５及び６からのデータによれば、広範囲のｐＨ値及びＮａＣｌ濃度で樹脂を使用できること、所与の用途のための樹脂の選択は、目的の標的タンパク質に応じることが分かる。
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、及び他の公開された参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
追加の開示及び請求主題事項
追加の開示及び請求主題事項
項目１
リガンドに共有結合したクロマトグラフィーマトリックスであって、
クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ（Ｒ１）－（Ｒ２－Ｌ）ｎ－Ａｒ又はそのアニオン塩
（式中、
Ｘは、スペーサーであり、
Ｒ1は、水素、又は、任意で、－ＯＨで置換されたＣ１～Ｃ6アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ2～Ｃ6アルキル、又はＣ4～Ｃ6シクロアルキルであり、
Ｌは、ＮＲ4、Ｏ、又はＳであり、
ｎ＝１又は２であり、及び
Ａｒは、６～１０員環であり、そして
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大５個の、Ｃ１～Ｃ３非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ6分岐アルキル、非置換アリール、若しくはフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大４個の非置換アルキル基で置換されており、
ただし、Ｒ１が水素である場合は、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ＬはＮＲ４又はＯであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない）
である、クロマトグラフィーマトリックス。
リガンドに共有結合したクロマトグラフィーマトリックスであって、
クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ（Ｒ１）－（Ｒ２－Ｌ）ｎ－Ａｒ又はそのアニオン塩
（式中、
Ｘは、スペーサーであり、
Ｒ1は、水素、又は、任意で、－ＯＨで置換されたＣ１～Ｃ6アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ2～Ｃ6アルキル、又はＣ4～Ｃ6シクロアルキルであり、
Ｌは、ＮＲ4、Ｏ、又はＳであり、
ｎ＝１又は２であり、及び
Ａｒは、６～１０員環であり、そして
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大５個の、Ｃ１～Ｃ３非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ6分岐アルキル、非置換アリール、若しくはフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大４個の非置換アルキル基で置換されており、
ただし、Ｒ１が水素である場合は、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ＬはＮＲ４又はＯであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない）
である、クロマトグラフィーマトリックス。
項目２
Ｘは、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－及び－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（ＣＨ３）２－ＣＯ－からなる群から選択され、
Ｒ１は、水素又はＣ１～Ｃ３アルキルであり、
Ｒ２はＣ２～Ｃ４アルキルであり、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、
Ａｒは６員環であり、及び
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大４個の、Ｃ１～Ｃ２非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ４分岐アルキル、若しくはフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大３個の非置換アルキル基で置換されており、
ただし、Ｒ１が水素である場合は、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない、
項目１に記載のクロマトグラフィーマトリックス。
Ｘは、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－及び－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（ＣＨ３）２－ＣＯ－からなる群から選択され、
Ｒ１は、水素又はＣ１～Ｃ３アルキルであり、
Ｒ２はＣ２～Ｃ４アルキルであり、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、
Ａｒは６員環であり、及び
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大４個の、Ｃ１～Ｃ２非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ４分岐アルキル、若しくはフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大３個の非置換アルキル基で置換されており、
ただし、Ｒ１が水素である場合は、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない、
項目１に記載のクロマトグラフィーマトリックス。
項目３
Ｘは、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－及び－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－からなる群から選択され、
Ｒ１は水素又はＣ１～Ｃ２アルキルであり、
Ｒ２はＣ２～Ｃ３アルキルであり、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは、任意で、最大３個のＣ1～Ｃ２非置換アルキルで置換された、フェニル、ナフチル、又はピリジルであり、
ただし、Ｒ1が水素である場合、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない、
項目２に記載のクロマトグラフィーマトリックス。
Ｘは、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－及び－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－からなる群から選択され、
Ｒ１は水素又はＣ１～Ｃ２アルキルであり、
Ｒ２はＣ２～Ｃ３アルキルであり、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは、任意で、最大３個のＣ1～Ｃ２非置換アルキルで置換された、フェニル、ナフチル、又はピリジルであり、
ただし、Ｒ1が水素である場合、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない、
項目２に記載のクロマトグラフィーマトリックス。
項目４
Ａｒは、クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ（Ｒ1）－（Ｒ2－Ｌ）n－に対して、パラ又はメタ位で、１個又は２個のＣ1～Ｃ２非置換アルキルで置換されたフェニルである、
項目１～３のいずれか１つに記載のクロマトグラフィー樹脂。
Ａｒは、クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ（Ｒ1）－（Ｒ2－Ｌ）n－に対して、パラ又はメタ位で、１個又は２個のＣ1～Ｃ２非置換アルキルで置換されたフェニルである、
項目１～３のいずれか１つに記載のクロマトグラフィー樹脂。
項目５
－（Ｘ）－Ｎ（Ｒ1）－（Ｒ2－Ｌ）n－Ａｒは、表１のリガンドのいずか１つである、
項目１～４のいずれか１つに記載のクロマトグラフィー樹脂。
－（Ｘ）－Ｎ（Ｒ1）－（Ｒ2－Ｌ）n－Ａｒは、表１のリガンドのいずか１つである、
項目１～４のいずれか１つに記載のクロマトグラフィー樹脂。
項目６
クロマトグラフィー樹脂であって、
クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ－［（Ｒ2－Ｌ）n－Ａｒ］2又はそのアニオン塩
（式中、
Ｘは、スペーサーであり、
Ｒ２は、Ｃ2～Ｃ6アルキル、又はＣ4～Ｃ6シクロアルキルであり、
Ｌは、ＮＲ4、Ｏ、又はＳであり、
ｎ＝１又は２であり、及び
Ａｒは、６～１０員環であり、
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大５個の、Ｃ１～Ｃ３非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ6分岐アルキル、非置換アリール、若しくはフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大４個の非置換アルキル基で置換されている）、
である、クロマトグラフィー樹脂。
クロマトグラフィー樹脂であって、
クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ－［（Ｒ2－Ｌ）n－Ａｒ］2又はそのアニオン塩
（式中、
Ｘは、スペーサーであり、
Ｒ２は、Ｃ2～Ｃ6アルキル、又はＣ4～Ｃ6シクロアルキルであり、
Ｌは、ＮＲ4、Ｏ、又はＳであり、
ｎ＝１又は２であり、及び
Ａｒは、６～１０員環であり、
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大５個の、Ｃ１～Ｃ３非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ6分岐アルキル、非置換アリール、若しくはフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大４個の非置換アルキル基で置換されている）、
である、クロマトグラフィー樹脂。
項目７
Ｘは、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－及び－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（ＣＨ３）２－ＣＯ－からなる群から選択され、
Ｒ2はＣ2～Ｃ4アルキルであり、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは６員環であり、
Ａｒがアリールの場合、アリールは、任意で、最大４個までのＣ3～Ｃ２非置換アルキル、Ｃ3又はＣ4分岐アルキル又はフッ素基で置換されており、又は
Ａｒがヘテロアリールの場合、ヘテロアリールは、任意で、３個までの非置換アルキル基で置換されている、項目６に記載のクロマトグラフィーマトリックス。
Ｘは、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－及び－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（ＣＨ３）２－ＣＯ－からなる群から選択され、
Ｒ2はＣ2～Ｃ4アルキルであり、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは６員環であり、
Ａｒがアリールの場合、アリールは、任意で、最大４個までのＣ3～Ｃ２非置換アルキル、Ｃ3又はＣ4分岐アルキル又はフッ素基で置換されており、又は
Ａｒがヘテロアリールの場合、ヘテロアリールは、任意で、３個までの非置換アルキル基で置換されている、項目６に記載のクロマトグラフィーマトリックス。
項目８
Ｘは、－Ｏ－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－及び－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－からなる群から選択され、
Ｒ1は、水素又はＣ１～Ｃ２アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ2又はＣ３アルキル、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは、任意で、最大３個のＣ1～Ｃ2非置換アルキルで置換された、フェニル、ナフチル、又はピリジルである、
項目７に記載のクロマトグラフィーマトリックス。
Ｘは、－Ｏ－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－及び－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－からなる群から選択され、
Ｒ1は、水素又はＣ１～Ｃ２アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ2又はＣ３アルキル、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは、任意で、最大３個のＣ1～Ｃ2非置換アルキルで置換された、フェニル、ナフチル、又はピリジルである、
項目７に記載のクロマトグラフィーマトリックス。
項目９
Ａｒは、－（Ｒ2－Ｌ）n－に対するパラ又はメタ位で、１個又は２個のＣ1～Ｃ2非置換アルキルで置換されている、項目６～９のいずれか１つに記載のクロマトグラフィー樹脂。
Ａｒは、－（Ｒ2－Ｌ）n－に対するパラ又はメタ位で、１個又は２個のＣ1～Ｃ2非置換アルキルで置換されている、項目６～９のいずれか１つに記載のクロマトグラフィー樹脂。
項目１０
－（Ｘ）－Ｎ－［（Ｒ2－Ｌ）n－Ａｒ］2は、表２のリガンドのいずれか１つである、項目６～９のいずれか１つに記載のクロマトグラフィー樹脂。
－（Ｘ）－Ｎ－［（Ｒ2－Ｌ）n－Ａｒ］2は、表２のリガンドのいずれか１つである、項目６～９のいずれか１つに記載のクロマトグラフィー樹脂。
項目１１
Ａｒはヘテロアリールであり、ヘテロアリール中のヘテロ原子はＮである、項目１又は６に記載のクロマトグラフィー樹脂。
Ａｒはヘテロアリールであり、ヘテロアリール中のヘテロ原子はＮである、項目１又は６に記載のクロマトグラフィー樹脂。
項目１２
前記アニオン塩は、塩酸塩、リン酸塩、又は硫酸塩である、項目１～１１のいずれか１つに記載のクロマトグラフィー樹脂。
前記アニオン塩は、塩酸塩、リン酸塩、又は硫酸塩である、項目１～１１のいずれか１つに記載のクロマトグラフィー樹脂。
項目１３
Ｘは、アミン、エーテル又はアミド結合を介してクロマトグラフィーマトリックスに付加している、項目１～１２のいずれか１つに記載のクロマトグラフィー樹脂。
Ｘは、アミン、エーテル又はアミド結合を介してクロマトグラフィーマトリックスに付加している、項目１～１２のいずれか１つに記載のクロマトグラフィー樹脂。
項目１４
表１のリガンドのいずれか１つを、還元アミノ化、エポキシド化、又はアザラクトン化のいずれか１つによってクロマトグラフィーマトリックスと反応させることによって調製されるクロマトグラフィー樹脂。
表１のリガンドのいずれか１つを、還元アミノ化、エポキシド化、又はアザラクトン化のいずれか１つによってクロマトグラフィーマトリックスと反応させることによって調製されるクロマトグラフィー樹脂。
項目１５
前記クロマトグラフィーマトリックスは、アルデヒド基を含み、表１のリガンドのいずれか１つは、還元アミノ化によって前記クロマトグラフィーマトリックスと反応する、項目１４に記載のクロマトグラフィー樹脂。
前記クロマトグラフィーマトリックスは、アルデヒド基を含み、表１のリガンドのいずれか１つは、還元アミノ化によって前記クロマトグラフィーマトリックスと反応する、項目１４に記載のクロマトグラフィー樹脂。
項目１６
前記クロマトグラフィーマトリックスは、エポキシド基を含み、表１のリガンドのいずれか１つは、エポキシド化によって前記クロマトグラフィーマトリックスと反応する、項目１４に記載のクロマトグラフィー樹脂。
前記クロマトグラフィーマトリックスは、エポキシド基を含み、表１のリガンドのいずれか１つは、エポキシド化によって前記クロマトグラフィーマトリックスと反応する、項目１４に記載のクロマトグラフィー樹脂。
項目１７
前記クロマトグラフィーマトリックスを前記リガンドと反応させる前に、前記クロマトグラフィーマトリックスを、アリルグリジシルエーテル及び臭素、１，４－ブタンジアルジグリシジル又はエピクロロヒドリンと反応させる、項目１４～１６のいずれか１つに記載のクロマトグラフィー樹脂。
前記クロマトグラフィーマトリックスを前記リガンドと反応させる前に、前記クロマトグラフィーマトリックスを、アリルグリジシルエーテル及び臭素、１，４－ブタンジアルジグリシジル又はエピクロロヒドリンと反応させる、項目１４～１６のいずれか１つに記載のクロマトグラフィー樹脂。
項目１８
表２のリガンドのいずれか１つを、エポキシド化によってクロマトグラフィーマトリックスと反応させることによって調製したクロマトグラフィー樹脂。
表２のリガンドのいずれか１つを、エポキシド化によってクロマトグラフィーマトリックスと反応させることによって調製したクロマトグラフィー樹脂。
項目１９
生体分子を精製する方法であって、
前記生体分子を含むサンプルを、項目１～１８のいずれか１つのクロマトグラフィー樹脂に接触させ、それによって前記生体分子を汚染物質から分離し、
精製された生体分子を収集することを含む、方法。
生体分子を精製する方法であって、
前記生体分子を含むサンプルを、項目１～１８のいずれか１つのクロマトグラフィー樹脂に接触させ、それによって前記生体分子を汚染物質から分離し、
精製された生体分子を収集することを含む、方法。
項目２０
前記精製生体分子は、タンパク質である、項目１９に記載の方法。
前記精製生体分子は、タンパク質である、項目１９に記載の方法。
項目２１
前記接触工程は、前記タンパク質を、クロマトグラフィーマトリックスに固定化することを含み、前記収集工程は、前記クロマトグラフィーマトリックスからタンパク質を溶出することを含む、項目２０に記載の方法。
前記接触工程は、前記タンパク質を、クロマトグラフィーマトリックスに固定化することを含み、前記収集工程は、前記クロマトグラフィーマトリックスからタンパク質を溶出することを含む、項目２０に記載の方法。
項目２２
前記タンパク質は、前記リガンドと接触する溶液のｐＨを約７－９～約４－６に低下させることを含む工程によって溶出される、項目２１に記載の方法。
前記タンパク質は、前記リガンドと接触する溶液のｐＨを約７－９～約４－６に低下させることを含む工程によって溶出される、項目２１に記載の方法。
項目２３
前記接触工程は、前記タンパク質を前記クロマトグラフィーマトリックスに流すことを含み、前記収集工程は、前記流れる前記タンパク質を収集することを含む、項目２０に記載の方法。
前記接触工程は、前記タンパク質を前記クロマトグラフィーマトリックスに流すことを含み、前記収集工程は、前記流れる前記タンパク質を収集することを含む、項目２０に記載の方法。
Claims (23)
- リガンドに共有結合したクロマトグラフィーマトリックスであって、
クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ（Ｒ１）－（Ｒ２－Ｌ）ｎ－Ａｒ又はそのアニオン塩
（式中、
Ｘは、スペーサーであり、
Ｒ1は、水素、又は、任意で、－ＯＨで置換されたＣ１～Ｃ6アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ2～Ｃ6アルキル、又はＣ4～Ｃ6シクロアルキルであり、
Ｌは、ＮＲ4、Ｏ、又はＳであり、
ｎ＝１又は２であり、及び
Ａｒは、６～１０員環であり、
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大５個の、Ｃ１～Ｃ３非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ6分岐アルキル、非置換アリール、若しくはフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大４個の非置換アルキル基で置換されており、
ただし、Ｒ１が水素である場合は、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ＬはＮＲ４又はＯであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない）
である、クロマトグラフィーマトリックス。 - Ｘは、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－及び－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（ＣＨ３）２－ＣＯ－からなる群から選択され、
Ｒ１は、水素又はＣ１～Ｃ３アルキルであり、
Ｒ２はＣ２～Ｃ４アルキルであり、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは６員環であり、そして、
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大４個の、Ｃ１～Ｃ２非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ４分岐アルキル、若しくはフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大３個の非置換アルキル基で置換されており、
ただし、Ｒ１が水素である場合は、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない、
請求項１に記載のクロマトグラフィーマトリックス。 - Ｘは、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－及び－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－からなる群から選択され、
Ｒ１は水素又はＣ１～Ｃ２アルキルであり、
Ｒ２はＣ２～Ｃ３アルキルであり、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは、任意で、最大３個のＣ1～Ｃ２非置換アルキルで置換された、フェニル、ナフチル、又はピリジルであり、
ただし、Ｒ1が水素である場合、Ｒ2はＣ2アルキルであり、ｎは１であり、Ａｒはフェニルでない、
請求項２に記載のクロマトグラフィーマトリックス。 - Ａｒは、クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ（Ｒ1）－（Ｒ2－Ｌ）n－に対して、パラ又はメタ位で、１個又は２個のＣ1～Ｃ２非置換アルキルで置換されたフェニルである、
請求項１～３のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー樹脂。 - －（Ｘ）－Ｎ（Ｒ1）－（Ｒ2－Ｌ）n－Ａｒは、表１のリガンドのいずれか１つである、
請求項１～４のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー樹脂。 - クロマトグラフィー樹脂であって、
クロマトグラフィーマトリックス－（Ｘ）－Ｎ－［（Ｒ2－Ｌ）n－Ａｒ］2
又はそのアニオン塩
（式中、
Ｘは、スペーサーであり、
Ｒ２は、Ｃ2～Ｃ6アルキル、又はＣ4～Ｃ6シクロアルキルであり、
Ｌは、ＮＲ4、Ｏ、又はＳであり、
ｎ＝１又は２であり、及び
Ａｒは、６～１０員環であり、そして、
Ａｒがアリールである場合、アリールは、任意で、最大で５個の、Ｃ１～Ｃ３非置換アルキル、Ｃ3～Ｃ6分岐アルキル、非置換アリール、若しくはフッ素基で置換されており、又は、
Ａｒがヘテロアリールである場合、ヘテロアリールは、任意で、最大４個の非置換アルキル基で置換されている）
である、クロマトグラフィー樹脂。 - Ｘは、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２）２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－及び－ＣＯ－ＮＨ－Ｃ（ＣＨ３）２－ＣＯ－からなる群から選択され、
Ｒ2はＣ2～Ｃ4アルキルであり、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは６員環であり、そして、
Ａｒがアリールの場合、アリールは、任意で、最大４個の、Ｃ3～Ｃ２非置換アルキル、Ｃ3若しくはＣ4分岐アルキル、又はフッ素基で置換されており、あるいは
Ａｒがヘテロアリールの場合、ヘテロアリールは、任意で、最大３個の非置換アルキル基で置換されている、
請求項６に記載のクロマトグラフィーマトリックス。 - Ｘは、－Ｏ－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－及び－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－からなる群から選択され、
Ｒ1は、水素又はＣ１～Ｃ２アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ2又はＣ３アルキル、
ＬはＯであり、
ｎ＝１であり、及び
Ａｒは、任意で、最大３個のＣ1～Ｃ2非置換アルキルで置換されたフェニル、ナフチル、又はピリジルである、
請求項７に記載のクロマトグラフィーマトリックス。 - Ａｒは、－（Ｒ2－Ｌ）n－に対するパラ又はメタ位で、１個又は２個のＣ1～Ｃ2非置換アルキルで置換されている、
請求項６～９のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー樹脂。 - －（Ｘ）－Ｎ－［（Ｒ2－Ｌ）n－Ａｒ］2は、表２のリガンドのいずれか１つである、
請求項６～９のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー樹脂。 - Ａｒはヘテロアリールであり、ヘテロアリール中のヘテロ原子はＮである、請求項１又は６に記載のクロマトグラフィー樹脂。
- 前記アニオン塩は、塩酸塩、リン酸塩、又は硫酸塩である、請求項１～１１のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー樹脂。
- Ｘは、アミン、エーテル又はアミド結合を介してクロマトグラフィーマトリックスに付加している、
請求項１～１２のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー樹脂。 - 表１のリガンドのいずれか１つを、還元アミノ化、エポキシド化、又はアザラクトン化のいずれか１つによってクロマトグラフィーマトリックスと反応させることによって調製される、
クロマトグラフィー樹脂。 - 前記クロマトグラフィーマトリックスは、アルデヒド基を含み、表１のリガンドのいずれか１つは、還元アミノ化によって前記クロマトグラフィーマトリックスと反応する、
請求項１４に記載のクロマトグラフィー樹脂。 - 前記クロマトグラフィーマトリックスは、エポキシド基を含み、表１のリガンドのいずれか１つは、エポキシド化によって前記クロマトグラフィーマトリックスと反応する、請求項１４に記載のクロマトグラフィー樹脂。
- 前記クロマトグラフィーマトリックスを前記リガンドと反応させる前に、前記クロマトグラフィーマトリックスを、アリルグリジシルエーテル及び臭素；１，４－ブタンジアルジグリシジル；又はエピクロロヒドリンと反応させる、請求項１４～１６のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー樹脂。
- 表２のリガンドのいずれか１つを、エポキシド化によってクロマトグラフィーマトリックスと反応させることによって調製した、クロマトグラフィー樹脂。
- 生体分子を精製する方法であって、
前記生体分子を含むサンプルを、請求項１～１８のいずれか１項のクロマトグラフィー樹脂に接触させ、それによって前記生体分子を汚染物質から分離し、
精製された生体分子を収集することを含む、方法。 - 前記精製生体分子は、タンパク質である、請求項１９に記載の方法。
- 前記接触工程は、前記タンパク質を、クロマトグラフィーマトリックスに固定化することを含み、前記収集工程は、前記クロマトグラフィーマトリックスからタンパク質を溶出することを含む、請求項２０に記載の方法。
- 前記タンパク質は、前記リガンドと接触する溶液のｐＨを約７－９～約４－６に低下させることを含む工程によって溶出される、請求項２１に記載の方法。
- 前記接触工程は、前記タンパク質を前記クロマトグラフィーマトリックスに流すことを含み、前記収集工程は、前記流れる前記タンパク質を収集することを含む、請求項２０に記載の方法。
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