KR20150013435A - 친화 크로마토그래피 ＩＶ에 의한 항체 및 Ｆｃ-융합 단백질 정제용 리간드 - Google Patents

친화 크로마토그래피 ＩＶ에 의한 항체 및 Ｆｃ-융합 단백질 정제용 리간드 Download PDF

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토마스 노이만
잉게 오트
크리스티나 슈미츠
레나테 세컬
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그라피니티 파머수티컬스 게엠베하
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Abstract

본 발명은 항체 또는 항체 단편의 친화성 정제를 위한, 지지 물질 및 지지 물질에 공유 결합된 하나 이상의 리간드를 포함하는 리간드 치환된 매트릭스의 용도로서, 리간드가 화학식 I로 나타내어지는 용도에 관한 것이다.
화학식 I
L-(Sp)v-Ar1-Am-Ar2
위의 화학식 I에서,
L은 리간드가 결합된 지지 물질 상의 결합점이고,
Sp는 스페이서 그룹이고,
v는 0 또는 1이고,
Am은 아미드 그룹 -NR1-C(O)-[여기서, NR1은 Ar1에 결합되고 -C(O)-는 Ar2에 결합되거나, -C(O)-는 Ar1에 결합되고 NR1은 Ar2에 결합된다]이고,
R1은 수소 또는 C1 내지 C4 알킬, 보다 바람직하게는 수소 또는 메틸, 가장 바람직하게는 수소이고,
Ar1은 화학 결합을 통하여 Sp 또는 L에 연결된 5원, 6원 또는 7원 단핵 방향족 환 또는 부분 포화된 방향족 환이고, 이는 임의로 추가로
(a) 화학 결합을 통하여 추가의 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 결합되거나,
(b) 다핵 환 시스템의 일부로서 단핵 또는 이핵 방향족 환에 융합되고(여기서, Ar1은 Ar1을 구성하는 상기 5원, 6원 또는 7원 방향족 환에 존재하는 화학 결합을 통하여 Am에 직접 연결되거나, Ar1에 결합된 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 존재하거나 Ar1에 융합된 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 존재하는 화학 결합을 통하여 간접적으로 연결되고; Ar1은 추가로 치환되지 않거나 C1 내지 C4 알킬; C3 및 C4 사이클로알킬; C2 내지 C4 알케닐; C2 내지 C4 알키닐; 할로겐; C1 내지 C4 할로알킬; 하이드록실 치환된 C1 내지 C4 알킬; C1 내지 C4 알콕시; 하이드록실 치환된 C1 내지 C4 알콕시; 할로겐 치환된 C1 내지 C4 알콕시; C1 내지 C4 알킬아미노; C1 내지 C4 알킬티오; -NO2; =O; =S; =NH; -OH; 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된다),
Ar2는 치환되지 않거나, 화학 결합을 통하여 C1 내지 C6 알킬; C3 내지 C6 사이클로알킬; C2 내지 C6 알케닐; C5 및 C6 사이클로알케닐; C2 내지 C6 알키닐; 할로겐; C1 내지 C6 할로알킬; 하이드록실 치환된 C1 내지 C6 알킬; C1 내지 C6 알콕시; 하이드록실 치환된 C1 내지 C6 알콕시; 할로겐 치환된 C1 내지 C6 알콕시; C1 내지 C6 알킬아미노; C1 내지 C6 알킬티오; 카바모일; 메틸렌디옥시; 에틸렌디옥시; -OH; -SH; 5원 또는 6원 단핵 방향족 환; 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된 5원 또는 6원 단핵 방향족 환(여기서, Ar2는 임의로, 위에서 인용된 화학 결합을 통하여 결합될 수 있는 치환체 이외에, 다핵 환 시스템의 일부로서 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 융합된다)이다.

Description

친화 크로마토그래피 ＩＶ에 의한 항체 및 Ｆｃ-융합 단백질 정제용 리간드{LIGANDS FOR ANTIBODY AND Fc-FUSION PROTEIN PURIFICATION BY AFFINITY CHROMATOGRAPHY IV}
본 발명은 단백질 분리 분야, 바람직하게는 친화 분리 기술에 의한, 특히 소분자(small molecule) 리간드를 사용한 크로마토그래피에 의한, 면역글로불린 Fc 분절을 함유하는 융합단백질 및 단일클론 및 다중클론 항체의 정제에 관한 것이다.
면역글로불린은 사람 및 기타 척추동물의 체액에서 발견되는 가용성 단백질의 한 부류이다. 이는 또한 "항체"라고 하고, 세포의 인식, 결합 및 부착의 공정에서 중요한 역할을 한다. 항체는 항원, 일반적으로 박테리아 및 바이러스의 인식 및 제거에 의한 면역 체계에서 가장 중요한 역할을 하는 올리고머성(oligomeric) 당단백질이다.
항체의 중합체 쇄는 이른바 중쇄 및 경쇄를 포함하도록 제작된다. 기본적인 면역글로불린 단위는 이황화 가교에 의하여 연결되는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 이루어진다. 5가지 유형의 중쇄(α, γ, δ, ε, μ)가 있으며, 이들은 면역글로불린 부류(IgA, IgG, IgD, IgE, IgM)를 결정한다. 경쇄 그룹은 두 가지 아형(subtype) λ 및 κ를 포함한다.
IgG는 혈액 및 기타 체액에서 발견될 수 있는, 가용성 항체이다. 이는 박테리아 또는 기타 병원체에 대한 반응으로서 및 이를 중화시키기 위하여 B-세포 유도된 혈장 세포에 의하여 구축된다. IgG는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진, 분자량이 약 150kDa인 Y-형 당단백질이다. 각각의 쇄는 일정 영역 및 변동 영역에서 구별된다. 중쇄의 두 개의 카복시 말단 도메인은 Fc 단편("constant fragment")을 형성하고, 중쇄 및 경쇄의 아미노 말단 도메인은 항원을 인식하고, Fab 단편("antigen-binding fragment")으로 명명한다.
Fc 융합 단백질은 항체 Fc 단편과 주어진 약제 표적에 대한 특이성을 제공하는 단백질 또는 단백질 도메인의 조합을 통하여 생성한다. 예로는 도메인 항체-Fc 융합 단백질이 있으며, 여기서 Fc 단편의 2개의 중쇄는 특정 항체의 중쇄(VH) 또는 경쇄(VL)의 변동 도메인에 결합된다. 다른 Fc 융합 단백질은 Fc 단편과 치료적 단백질 또는 단백질 도메인의 임의 유형과의 조합이다. Fc 부분은 안정성 및 전달 가능성을 단백질 약제에 추가하는 것으로 여겨진다.
치료적 항체 및 Fc 융합 단백질은 다양한 질환을 치료하는 데 사용되고, 중요 예로는 류머티스성 관절염, 건선, 다발성 경화증 및 다수의 암 형태가 포함된다. 치료적 항체는 단일클론 또는 다중클론 항체일 수 있다. 단일클론 항체는 세포주를 생성하는 단일 항체로부터 유도되어, 단일 항체에 대한 동일한 특이성을 나타낸다. 가능한 암 치료에는 종양 세포 특이 항원을 중화시키는 항체가 수반된다. 베박시주마브(Bevacizumab)(Avastin, Genentech)는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 중화시켜, 신규한 혈관이 종양 조직으로 성장하는 것을 방지하는 단일클론 항체이다.
에타너셉트(Etanercept)(Enbrel, Amgen, Fc 단편에 결합된 TNF-수용체 도메인) 또는 알레파셉트(Alefacept)(Amevive, Biogen Idec, 사람 IgG1의 Fc 부분에 결합된 LFA-3)와 같은 치료적 융합 단백질이 자가면역 질환에 대한 약제로서 사용되거나 개발되어 있다.
다양한 생물학적 피드 스트림(feed streams)으로부터의 단백질 제품의 회수 및 정제를 나타내는 단백질 생물분리(bioseperation)는 식품, 약제 및 생명공학 산업에서의 중요한 단위 조작이다. 점점 더 많은 치료적 단일클론 항체(Monoclonal Antibody, Mabs) 및 융합 단백질이 시장에 진출하거나, 현재 임상 개발중이다. 이러한 단백질은 정교한 다단계 정제 프로토콜에 의하여 달성된 예외적으로 높은 순도를 필요로 한다. 다운스트림(downstream) 가공 및 정제가 제조 비용의 약 50 내지 80%를 차지하므로, 신규한 정제 계획을 개발하거나 기존의 정제 계획을 개선하기 위하여 상당한 노력이 진행중이다(1).
친화 크로마토그래피는 단백질 정제를 위한 가장 효과적인 크로마토그래피 방법들 중의 하나이다. 이는 고도로 특이한 단백질-리간드 상호 작용을 기반으로 한다. 리간드는 공급 원료 용액으로부터 표적 단백질을 포획하는 데 사용되는 고정 상에 공유 결합으로 고정화시킨다. 친화성 리간드는 이의 표적을 높은 특이성 및 선택도로 결합시켜, 착체 혼합물로부터도 천배까지 고농축을 고수율로 가능하게 한다.
통상적으로, 단백질 A에 대한 친화 크로마토그래피는 대부분의 Mab와 Fc 융합 단백질 정제 도식에서 제1 단계이다. 단백질 A는 박테리아인 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 표면에 노출된 세포벽 결합 단백질이다. 이는 나노몰 친화도로 다양한 종으로부터의 면역글로불린의 일정 부분(Fc 도메인)에, 특히 사람 아형 IgG1, IgG2 및 IgG4에 결합한다(2). 그러나, 단백질 A의 사용은 위생화 및 현장 정화 절차를 위하여 적용된 혹독한 조건하에 생성물로의 침출 및 불량한 안정성에 의하여 제한된다. 단백질 A의 화학적 안정성은 Mab 정제를 위하여 유전자 조작된 단백질 A 변종을 사용하여 개선시킬 수 있다. 그러나, 단백질 A 수지의 고 비용으로 특히 소분자로부터 선택된, 적합한 대체물을 찾고 있었다.
마브소번트(Mabsorbent) A2P(Prometic Biosciences)는 면역글로불린의 정제를 위한 소분자 리간드이다. 그러나, 당해 리간드는 적합한 선택도를 나타내지 않고(3), 공정 크로마토그래피에 적용되지 않는다.
또 다른 접근에서는 항체 정제에서 제1 포획 단계로서 혼합 방식 크로마토그래피가 사용된다. 가장 일반적인 물질은 고정화된 2-머캅토에틸피리딘(MEP HyperCel, Pall Corporation)을 기본으로 하며, 이는 발효 브로스(fermentation broth)로부터의 IgG를 효과적으로 포획하지만 단백질 A와 비교하여 숙주 세포 단백질(Host Cell Protein, HCP)의 보다 낮은 제거율을 나타낸다(4).
합성 소분자 친화성 리간드는 이의 일반적으로 보다 높은 화학적 안정성 및 이의 보다 낮은 제조 비용으로 인하여 치료 단백질의 정제에 대하여 특히 중요하다. 보다 용이하게 입수 가능하고, 바람직하게는 단백질계 리간드보다 저렴하고, 엄격한 조건하에 보다 강하고, 단백질 A와 유사하거나 보다 높은 선택도를 갖는 합성 친화성 리간드는 항체와 Fc 융합 단백질 정제에 적합한 해결책을 제공할 것이다. 표적 단백질에 따라, 이러한 친화성 리간드는 바람직하게는 단백질 A와 동일한 넓은 적용성을 제공하여, IgG형 면역글로불린 및 Fc 융합 단백질의 일정한 Fc 영역을 인식하여야 한다.
본 발명의 근간을 이루는 문제는 항체 및 Fc 융합 단백질의 Fc 영역에 결합하는 작은 친화성 리간드(화합물)의 제공이다. 바람직하게는, 작은 친화성 리간드는 매트릭스에 결합하기 위하여 그 자체를 빌려준다. 따라서, 본 발명의 근간을 이루는 추가의 문제는, 항체 및 Fc 융합 단백질의 Fc 영역에 결합하는 작은 친화성 리간드를 포함하는 매트릭스의 제공이다.
당해 문제는 이하에 제시된 바와 같은 본 발명의 양태에 의하여 해결된다.
본 발명은 단백질, 바람직하게는 항체 또는 항체 단편의 친화성 정제를 위한, 지지 물질 및 지지 물질에 공유 결합된 하나 이상의 리간드를 포함하는 리간드 치환된 매트릭스의 용도로서, 본 발명에 따르는 리간드 치환된 매트릭스, 또는 각각 본 발명에 따르는 리간드가 화학식 I로 나타내어진다.
[화학식 I]
L-(Sp)v-Ar1-Am-Ar2
상기 화학식 I에서,
L은 리간드가 결합된 지지 물질 상의 결합부분이고,
Sp는 스페이서 그룹이고,
v는 0 또는 1이고,
Am은 아미드 그룹 -NR1-C(O)-[여기서, NR1은 Ar1에 결합되고 -C(O)-는 Ar2에 결합되거나, -C(O)-는 Ar1에 결합되고 NR1은 Ar2에 결합된다]이고,
R1은 수소 또는 C1 내지 C4 알킬, 보다 바람직하게는 수소 또는 메틸, 가장 바람직하게는 수소이고,
Ar1은 화학 결합을 통하여 Sp 또는 L에 연결된 5원, 6원 또는 7원 단핵 방향족 환 또는 부분 포화된 방향족 환이고, 이는 임의로 추가로
(a) 화학 결합을 통하여 추가의 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 결합되거나,
(b) 다핵 환 시스템의 일부로서 단핵 또는 이핵 방향족 환에 융합되고,
(상기 Ar1은 Ar1을 구성하는 상기 5원, 6원 또는 7원 방향족 환에 존재하는 화학 결합을 통하여 Am에 직접 연결되거나, Ar1에 결합된 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 존재하거나 Ar1에 융합된 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 존재하는 화학 결합을 통하여 간접적으로 연결되고;
상기 Ar1은 추가로 치환되지 않거나, C1 내지 C4 알킬; C3 및 C4 사이클로알킬; C2 내지 C4 알케닐; C2 내지 C4 알키닐; 할로겐; C1 내지 C4 할로알킬; 하이드록실 치환된 C1 내지 C4 알킬; C1 내지 C4 알콕시; 하이드록실 치환된 C1 내지 C4 알콕시; 할로겐 치환된 C1 내지 C4 알콕시; C1 내지 C4 알킬아미노; C1 내지 C4 알킬티오; -NO2; =O; =S; =NH; -OH; 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된다)
Ar2는 치환되지 않거나, 화학 결합을 통하여 C1 내지 C6 알킬; C3 내지 C6 사이클로알킬; C2 내지 C6 알케닐; C5 및 C6 사이클로알케닐; C2 내지 C6 알키닐; 할로겐; C1 내지 C6 할로알킬; 하이드록실 치환된 C1 내지 C6 알킬; C1 내지 C6 알콕시; 하이드록실 치환된 C1 내지 C6 알콕시; 할로겐 치환된 C1 내지 C6 알콕시; C1 내지 C6 알킬아미노; C1 내지 C6 알킬티오; 카바모일; C1 내지 C4 알킬렌디옥시, 바람직하게는 메틸렌디옥시 및 에틸렌디옥시; -OH; -SH; 5원 또는 6원 단핵 방향족 환; 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된 5원 또는 6원 단핵 방향족 환(상기 Ar2는 임의로, 위에서 인용된 화학 결합을 통하여 결합될 수 있는 치환체 이외에, 다핵 환 시스템의 일부로서 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 융합된다)이다.
화학식 I은 본 발명에 따르는 리간드 또는 본 발명에 따르는 리간드 치환된 매트릭스를 나타낼 수 있다. L이 본 발명의 지지 물질/매트릭스의 일부인 것으로 간주되는 경우, 화학식 I은 리간드 치환된 매트릭스를 나타낸다. L이 지지 물질/매트릭스의 일부인 것으로 간주되지 않는 경우, 화학식 I은 매트릭스에 결합된 이후의 리간드를 나타낸다. 본 발명과 관련하여, 화학식 I은 바람직하게는 매트릭스에 결합 후의 리간드를 나타낸다. 이러한 해석 내에서, 지지 물질/매트릭스에 결합되기 전의 본 발명에 따르는 리간드는 바람직하게는 화학식 II로 나타내며, 아래를 참조한다.
본 발명에 따르는 리간드(지지 물질/매트릭스에 결합 후) 또는 각각, 화학식 I에 따르는, 본 발명의 리간드 치환된 지지 물질/매트릭스는 본 발명의 한 양태에서 화학식 Ia에 따르는 구조를 갖는다. 본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따르는 리간드(지지 물질/매트릭스에 결합 후) 또는, 각각, 화학식 I에 따르는, 본 발명의 리간드 치환된 매트릭스는 화학식 Ib에 따르는 구조를 갖는다.
[화학식 Ia]
L-(Sp)v-Ar1-N(R1)-C(O)-Ar2
[화학식 Ib]
L-(Sp)v-Ar1-C(O)-N(R1)-Ar2
위의 화학식 Ia 및 Ib에서,
L, Sp, N, R1, Ar1 및 Ar2, 및 정수 v는 화학식 I과 관련하여 위에서 정의한 의미를 갖는다.
본 발명에 따르는 리간드는 사람 기원의 다중클론 및 단일클론 IgG, 특히 사람 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 래빗 및 마우스 면역글로불린과 같은 상이한 동물 종으로부터의 다중클론 및 단일클론 IgG에 결합한다.
L은 지지 물질/매트릭스 상의 적합한 독립체(entity)이므로, 리간드 치환된 매트릭스는 또한 화학식 Ic로 나타낼 수도 있다.
[화학식 Ic]
M-L-(Sp)v-Ar1-Am-Ar2
위의 화학식 Ic에서,
M은 매트릭스/지지 물질이고,
기타 변수는 화학식 I과 관련하여 제시한 의미를 갖는다.
본 발명은 또한 임의로 스페이서 그룹 Sp를 통하여 결합부분 L에서 매트릭스에 결합하기 전 및 결합한 후의 리간드(이는 "화합물"이라고도 한다) 및 리간드 치환된 매트릭스에 관한 것이다. 매트릭스는 지지 물질을 포함하며, 즉 매트릭스는 지지 물질로 전체적으로 구성되거나, 지지 물질은 매트릭스의 일부를 형성하며, 이는 지지 물질 이외의 성분들을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명과 관련하여 명시된 바와 같은 리간드 치환된 매트릭스를 포함하며, 여기서 매트릭스는 추가로 하나 이상의 단백질, 바람직하게는 리간드에 결합된, 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 항체 또는 항체 단편은, 바람직하게는, IgG형 항체, 또는 Fc 융합 단백질이다. 추가의 바람직한 양태에서, 리간드는 항체 또는 융합 단백질의 Fc 단편 또는 도메인에 결합한다. 추가의 바람직한 양태에서, Fc 단편 또는 도메인 또는 항체는 IgG 항체 부류, 보다 바람직하게는 사람, IgG 또는 사람 기원의 다중클론 또는 단클론 IgG, 특히 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에 속한다.
본 발명은 따라서 리간드 또는 화합물(여기서 화합물은 단백질, 바람직하게는 항체 또는 항체 단편에 결합하고, 지지 물질/매트릭스에 결합 전의 리간드 또는 화합물은 화학식 II로 나타낸다)을 포함한다.
[화학식 II]
(SpP)v-Ar1-Am-Ar2
위의 화학식 II에서,
L, v, Ar1, Am 및 Ar2는 화학식 I과 관련하여 위에서 정의한 의미를 갖고,
SpP는 아래에 명시된 바와 같은, 스페이서 전구체이다.
본 발명은 추가로 바람직하게는 본원에 명시된 바와 같은 적합한 매트릭스에 리간드를 결합시킨 후의, 항체 또는 항체 단편의 친화성 정제를 위한 리간드의 용도에 관한 것이다.
화학식 I에서 v가 0인 경우, 리간드는 L에 직접 결합하거나 결합할 것이다. 다른 양태에서, 리간드는 스페이서 그룹 Sp를 통하여 지지 물질에 결합하거나 결합할 것이다. 이는 화학식 I에서 v가 0이 아닌 경우에 적용된다.
위의 화학식 I에서 L은 "결합 지점(point of attachment)"이라고도 하는, 결합점(linking point)이다. 당업자는 적합한 결합점/결합 지점을 인지하고 있다.
결합점 L이 리간드/화합물과 직접 또는 스페이서를 통하여 연결되는 것을 이해한다. L은 그 자체를 본 발명의 리간드를 지지 물질에 결합시키기 위하여 빌려주는 지지 물질 상의 적합한 독립체이다. 적합한 독립체는 당업자에게 공지되어 있다. 통상적으로 L은 매트릭스 결합 리간드를 형성하는 지지 물질상 적합한 관능 그룹과 리간드의 전구체 화합물 상의 상응하는 관능 그룹과의 반응으로부터 생성된 독립체의 일부이거나 일부일 수 있다. 리간드의 전구체 화합물(이는 지지 매트릭스와 반응하여 리간드 치환된 매트릭스를 형성함)은 본 발명의 한 양태에서, 스페이서 전구체를 포함한다. "스페이서 전구체"는 리간드 치환된 매트릭스의 형성 후 잔존하는 스페이서의 일부를 형성하고 지지 물질상 적합한 그룹(전구체 그룹)과의 반응에 의하여 결합점 L의 형성을 위한 적합한 관능 그룹(전구체 그룹)을 함유하는 화학적 독립체로, 아래를 참조한다. 리간드의 전구체 화합물이 스페이서 전구체를 함유하지 않는(그리고 결합을 통하여 지지 물질에 직접 연결되는) 경우, 적합한 관능 그룹(전구체 그룹)이 리간드 자체에 결합된다.
하나의 바람직한 양태에서, L은 결합, 바람직하게는 단일 결합을 통하여 화학식 I에 따르는 리간드에 직접 연결된다. L은 지지 물질 상의 독립체이므로, 결합된 리간드는 따라서 L을 통하여 지지 물질에 연결된다. 이와 관련하여, 용어 "지지 물질"은 본 발명의 목적을 위하여 그 자체를 빌려주는, 당업자에게 공지되고 시장에서 입수 가능한 중합체를 말한다.
본 발명에 따르는 리간드는 화학식 III의 구조 단위를 함유한다.
[화학식 III]
-Ar1-Am-Ar2
위의 화학식 III에서,
Ar1, Am 및 Ar2는 이하에서 및 화학식 I 및 II와 관련하여 명세서 및 실시예의 다른 부분에서 정의한 의미 및 바람직한 의미를 갖는다.
화학식 III에 나타낸 구조 단위는 지지 물질/매트릭스에 결합되기 전 및 지지 물질/매트릭스에 결합된 후의 리간드에 존재한다.
화학식 I에 나타낸 바와 같고/같거나, 화학식 II에 나타낸 바와 같거나, 화학식 III에 나타낸 바와 같은 구조 단위를 함유하는 리간드는 단백질, 바람직하게는 항체, 바람직하게는 IgG형 항체 및 Fc 융합 단백질, 보다 특히 항체 또는 융합 단백질의 Fc 단편 또는 도메인에 결합되며, 여기서, 가장 바람직하게는 Fc 단편 또는 도메인 또는 항체는 IgG 항체 부류에 속하고, 보다 바람직하게는 사람, IgG 또는 사람 기원의 다중클론 또는 단일클론 IgG, 특히 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에 속한다.
바람직한 양태에서, 위에서 정의한 바와 같은 리간드는 매트릭스/지지 물질에 결합되기 전 및 지지 물질/매트릭스에 결합된 후의 위에서 정의한 바와 같은 단백질에 결합한다.
추가의 바람직한 양태에서, 본원은 단백질, 바람직하게는 항체 또는 항체 단편의 친화성 정제를 위한, 화학식 Ia, Ib 및 Ic, 및/또는 화학식 II를 포함하고/하거나, 화학식 III에 나타낸 바와 같은 구조 단위를 함유하는, 화학식 I에 나타낸 바와 같은 본 발명에 따르는 리간드의 용도(여기서, L, Sp, SpP, Am, Ar1 Ar2, R1 및/또는 v는 화학식 I, Ia, Ib, Ic, II 및/또는 III과 관련하여 정의한 바와 같고/같거나, 특히 바람직한 양태에 관하여, 본원 명세서 및 실시예에 정의한 바와 같은 의미를 갖는다)에 관한 것이다. 당해 양태에서, 단백질, 항체 또는 항체 단편은 바람직하게는 화학식 I, II 및 III과 관련하여 위에서 제시한 특성을 갖는다. 당해 양태에서, 리간드는 매트릭스에 결합되거나 매트릭스에 결합되지 않을 수 있고; 바람직하게는 당해 양태에서, 리간드는 매트릭스에 결합된다.
본 발명과 관련하여 "결합"은 바람직하게는 공유 화학 결합, 예를 들면, 단일, 이중 또는 삼중 결합, 바람직하게는 단일 결합이다.
바람직한 양태에서, L은 지지 물질에 그 자체로 그리고 지지 물질/매트릭스에 본 발명의 리간드를 결합시키기 전에 존재하거나, 화학 반응 동안 지지 물질/매트릭스에 본 발명의 리간드를 결합시키는 동안 형성되는, 관능 그룹 또는 화학적 독립체("신규한 관능 그룹")이다.
일반적으로, 지지 물질은 분자의 결합용 관능 그룹, 바람직하게는 본 발명의 리간드를 포함한다. 본 발명과 관련하여, 관능 그룹은 지지 물질의 일부로 간주되고; 이는 또한 본 발명의 리간드가 결합을 통하여 지지 물질에 연결되는 경우(즉, L은 스페이서 그룹 Sp가 존재하지 않은 상태에서, 결합을 통하여 직접 리간드에 연결됨, 하기 참조)에 적용되며, 여기서, 결합은 본 발명에 따르는 각각의 리간드와 지지 물질상 분자의 결합용 상기 관능 그룹 사이에, 또는 상기 관능 그룹의 결합, 바람직하게는 단일 결합으로의 변환 하에 지지 물질 자체에 직접 형성된다.
결합이 본 발명에 따르는 각각의 리간드와 지지 물질 상의 분자의 결합을 위한 관능 그룹 사이에서 직접 형성되는 경우, 당해 관능 그룹은 지지 물질에 후속적으로 결합되는 신규한 관능 그룹으로 상호 전환될 수 있다. 본 발명과 관련하여, 신규한 관능 그룹은 지지 물질/매트릭스의 일부로 간주되고, 결합, 바람직하게는 단일 결합을 통하여 리간드를 매트릭스와 결합시키는 L을 형성한다.
지지 물질 상의 적합한 관능 그룹(또는 "전구체 그룹", 즉 본 발명에 따르는 리간드가 결합되기 전에 존재함) 및 서로 독립적으로, 리간드를 지지 물질에 직접 연결하도록 하는 본 발명의 리간드 상의 적합한 관능 그룹은 이들로 제한되지는 않지만, -OH, -SH, -NH2, >NH, 메탄설포네이트, 트리플루오로메틸 설포네이트, 아릴설포네이트, 카복실산, 설폰산, 인산, 포스포르아미다이트, 에폭사이드, N-하이드록시석시니미딜 카복실레이트, 1-하이드록시벤조트리아졸릴 카복실레이트, 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸릴 카복실레이트, 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 말레이미드, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 알데히드, 케톤, 하이드라진, 하이드라지드, O-알킬 하이드록실아민, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 시아네이트, 티오시아네이트, 비닐설폰을 포함한다.
리간드의 결합시 지지 물질에 존재하는 관능 그룹과 상호 전환될 수 있는 관능 그룹("신규한 관능 그룹")은, 이들로 제한되지는 않지만, 탄소-탄소 단일 결합, 탄소-질소 단일 결합, 아릴 알킬 에테르, 아릴 알킬 티오에테르, 디아릴 에테르, 디아릴 티오에테르, 아릴 알킬 아민, 아릴 디알킬 아민, 아미드, 하이드라지드, 설폰아미드, 설폰산 하이드라지드, N-아릴옥시 아미드, N-아릴옥시 설폰아미드, 포스페이트, 인산 아미드, 인산 하이드라지드, N-아릴옥시 인산 아미드, 하이드라존, 옥심, 우레아, 티오우레아, 이소우레아, 이미도카보네이트, 이소티오우레아, 이미도티오카보네이트를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태에서, L은 스페이서 그룹 -Sp-에 연결된다. 당해 양태에서, L은 지지 물질 상의 적합한 관능 그룹과 스페이서 그룹 Sp 상의 적합한 관능 그룹(또는 "전구체 그룹")과의 반응으로부터 생성된 결합 또는 화학 단위이다. 따라서, 지지 물질 상의 관능 그룹과 스페이스 그룹 Sp 상의 관능 그룹("상보적 그룹") 사이의 화학 반응은 결합점 L을 통하여 본 발명에 따르는 리간드를 지지 물질과 연결시킨다.
스페이서 그룹 Sp는 바람직하게는 C 및 H 원자 이외에 추가의 원자를 함유할 수 있는 탄화수소 그룹이다. 적합한 추가의 원자는 당업자에게 공지되어 있다. 바람직한 원자는 O, S, N, P 및 Si를 포함한다. 탄화수소 그룹은 선형, 분지형 또는 환형일 수 있다. 스페이서 그룹 Sp의 보다 상세한 설명을 아래에 제공한다. Sp는 단일 결합, 이중 결합 또는 삼중 결합, 바람직하게는 단일 결합을 통하여 본 발명에 따르는 리간드의 Ar1에 결합된다. 추가로, Sp는 본 발명의 리간드가 신규한 관능 그룹("최종 관능 그룹", 최종 화학적 독립체 또는 연결 단위라고도 함)의 형성하의 화학 반응에서 매트릭스에 존재하는 관능 그룹(전구체 그룹)과 공유 결합될 수 있도록 하는 관능 그룹(전구체 그룹)에 결합된다. 서로 독립적으로, 지지 물질 및 Sp에 존재할 수 있는 이러한 관능 그룹(전구체 그룹)의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, -OH, -SH, -NH2, >NH, 메탄설포네이트, 트리플루오로메틸 설포네이트, 아릴설포네이트, 카복실산, 설폰산, 인산, 포스포르아미다이트, 에폭사이드, N-하이드록시석시니미딜 카복실레이트, 1-하이드록시벤조트리아졸릴 카복실레이트, 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸릴 카복실레이트, 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 말레이미드, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 알데히드, 케톤, 하이드라진, 하이드라지드, O-알킬 하이드록실아민, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 시아네이트, 티오시아네이트, 비닐설폰을 포함한다. 지지 물질 상의 관능 그룹과 스페이서 Sp에 존재하는 관능 그룹과의 반응으로부터 유도된 적합한 연결 단위의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 탄소-탄소 단일 결합, 에테르, 아릴 알킬 에테르, 아릴 알킬 티오에테르, 디아릴 에테르, 티오에테르, 디아릴 티오에테르, 디알킬아민, 트리알킬아민, 아릴 알킬 아민, 아릴 디알킬 아민, 아미드, 에스테르, 하이드라지드, 설폰아미드, 설폰산 하이드라지드, N-아릴옥시 아미드, N-아릴옥시 설폰아미드, 포스페이트, 인산 아미드, 인산 하이드라지드, N-아릴옥시 인산 아미드, 하이드라존, 옥심, 우레아, 티오우레아, 이소우레아, 이미도카보네이트, 이소티오우레아, 이미도티오카보네이트를 포함한다.
스페이서 그룹 Sp는 일반적으로, 화학식 I에 따르는 리간드의 Ar1과 지지 물질에 존재하는 관능 그룹(전구체 그룹)과 화학 반응을 할 수 있는 관능 그룹(전구체 그룹)을 연결하여, 위에서 기재한 바와 같은 최종 관능 그룹(연결 단위)를 형성한다. 일반적으로, Sp는 사이클릭 아단위(subunit)를 함유할 수도 있는 선형 또는 분지형 탄화수소이다. 탄화수소는 포화 또는 불포화일 수 있으며, 즉 이중 결합 또는 삼중 결합을 함유할 수 있다. Sp가 선형 탄화수소인 경우, 이는 하나의 리간드 잔기가 지지 물질에 존재하는 하나의 전구체 그룹에 연결되도록 하고; 반대로, Sp가 분지형 탄화수소인 경우, 이는 하나 초과의 리간드 잔기가 지지 물질에 존재하는 하나의 전구체 그룹에 연결되도록 할 수 있다. C 및 H 이외에, 탄화수소는 N, O, P 및 S와 같은 기타 원자를 함유할 수 있다. 탄소 쇄는 기타 원자 또는 원자 그룹들에 의하여 차단될 수 있다. Sp는 탄화수소 쇄를 차단하는 상이한 원자 또는 원자 그룹의 조합을 함유할 수 있다. 탄화수소의 탄소 쇄를 차단할 수 있는 원자 또는 원자 그룹의 예는 -O-, >N-, -C(=O)N(H)-, -C(=O)N<, -O-P(=O)(-O-)2이다. 탄화수소가 -N<(3급 아미노), -C(=O)-N<(3급 아미드) 또는 -O-(P=O)(-O-)2(인산 에스테르)와 같은 3가 원자 또는 원자 그룹에 의하여 차단되는 경우, 당해 원자 그룹은 Sp의 하나 초과의 리간드 연결된 아단위를 지지 물질에 존재하는 관능 그룹과 화학 반응을 하는 관능 그룹을 포함하는 Sp의 아단위와 연결시키는 분지화점(branch pioint)으로서 작용하여, 최종적으로 위에서 기재한 바와 같은 연결 단위를 형성시킬 수 있다. 분지화점을 Sp에 도입시킬 수 있는 추가의 적합한 원자 그룹의 예는 천연 또는 인공 3관능성 아미노산(trifunctional amino acid), 예를 들면, 글루탐산, 아스파르트산, 아미노말론산, 리신, 오르니틴 및 디아미노프로피온산을 포함한다. 이 경우, 상기 3가 잔기의 관능 그룹들 중의 하나는 지지 물질에 존재하는 관능 그룹과 화학 반응시키려는 관능 그룹으로서 작용할 수 있다. 통상적으로, Sp의 총 길이는 100 원자 미만, 바람직하게는 50 원자 미만, 보다 바람직하게는 30 원자 미만이다. Sp가 분지된 경우, Sp를 지지 물질 상의 관능 그룹과 화학 반응시키려는 관능 그룹과 연결시키는 원자로부터 Ar1 잔기에 직접 연결된 가장 먼 원자까지의 거리로 정의된 길이는 100 원자 미만, 바람직하게는 50 원자 미만, 보다 바람직하게는 40 원자 미만이다.
지지 물질에 존재하는 화학 그룹과 화학 반응시키려는 탄소계 관능 그룹(functinal group, FG)에 연결된 (예를 들면, 카복실산, 알데히드, 에폭사이드, 카복실산 활성 에스테르와 같은)선형 Sp의 적합한 독립체의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 다음을 포함한다:
FG-(CH2)n-(알킬렌)(여기서, 1 ≤ n ≤ 100, 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 50, 보다 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 30이다);
FG-(CH2)n-O-(알킬렌옥시)(여기서, 1 ≤ n ≤ 99, 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 49, 보다 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 29이다);
FG-(CH2)n-N(H)-(알킬렌아미노)(여기서, 1 ≤ n ≤ 99, 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 49, 보다 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 29이다);
FG-CH2(-O-CH2-CH2)n-(올리고에틸렌글리콜)(여기서, 1 ≤ n ≤ 30, 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 15, 보다 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 9이다);
FG-CH2(-O-CH2-CH2)n-O-(올리고에틸렌글리콜릴옥시)(여기서, 1 ≤ n ≤ 30, 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 15, 보다 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 9이다);
FG-CH2(-O-CH2-CH2)n-N(H)-(올리고에틸렌글리콜릴아미노)(여기서, 1 ≤ n ≤ 30, 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 15, 보다 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 9이다);
FG-CH2(-O-CH2-CH2)2-N(H)-C(=O)-CH2(-O-CH2-CH2)2-(아미드에 의하여 차단된 올리고에틸렌글리콜);
FG-CH2(-O-CH2-CH2)2-N(H)-C(=O)-CH2(-O-CH2-CH2)2-O-(아미드에 의하여 차단된 올리고에틸렌글리콜릴옥시);
FG-CH2(-O-CH2-CH2)2-N(H)-C(=O)-CH2(-O-CH2-CH2)2-N(H)-(아미드에 의하여 차단된 올리고에틸렌글리콜릴아미노).
지지 물질에 존재하는 화학 그룹과 화학 반응시키려는 (예를 들면, NH2, OH, SH, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트와 같은)비-탄소계 관능 그룹(FG)에 결합된 선형 Sp의 적합한 독립체의 예는 이들로 제한되지는 않지만, 다음을 포함한다:
FG-(CH2)n-(알킬렌)(여기서, 1 ≤ n ≤ 100, 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 50, 보다 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 30이다);
FG-(CH2)n-O-(알킬렌옥시)(여기서, 1 ≤ n ≤ 99, 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 49, 보다 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 29이다);
FG-(CH2)n-N(H)-(알킬렌아미노)(여기서, 1 ≤ n ≤ 99, 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 49, 보다 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 29이다);
FG-CH2CH2(-O-CH2-CH2)n-(올리고에틸렌글리콜)(여기서, 1 ≤ n ≤ 30, 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 15, 보다 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 9이다);
FG-CH2CH2(-O-CH2-CH2)n-O-(올리고에틸렌글리콜릴옥시)(여기서, 1 ≤ n ≤ 30, 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 15, 보다 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 9이다);
FG-CH2CH2(-O-CH2-CH2)n-N(H)-(올리고에틸렌글리콜릴아미노)(여기서, 1 ≤ n ≤ 30, 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 15, 보다 바람직하게는 1 ≤ n ≤ 9이다);
FG-CH2CH2(-O-CH2-CH2)2-N(H)-C(=O)-CH2(-O-CH2-CH2)2-(아미드에 의하여 차단된 올리고에틸렌글리콜);
FG-CH2CH2(-O-CH2-CH2)2-N(H)-C(=O)-CH2(-O-CH2-CH2)2-O-(아미드에 의하여 차단된 올리고에틸렌글리콜릴옥시);
FG-CH2CH2(-O-CH2-CH2)2-N(H)-C(=O)-CH2(-O-CH2-CH2)2-N(H)-(아미드에 의하여 차단된 올리고에틸렌글리콜릴아미노).
하나의 관능 그룹이 지지 물질에 존재하는 관능 그룹과 반응시키는 관능기로서 작용하는 3관능성 원자 그룹을 포함하는 분지화 Sp의 적합한 독립체의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 다음을 포함한다:
H2N-C(H)(-C(=O)-N(H)-CH2CH2(-O-CH2CH2)2-)(-CH2-C(=O)-N(H)-CH2CH2(-O-CH2CH2)2-) (글루탐산 비스(3,5-디옥사-1-옥틸) 아미드; NH2 그룹은 지지 물질에 존재하는 관능 그룹과 반응시킨다);
H2N-C(H)(-C(=O)-N(H)-CH2CH2CH2-)(-CH2-C(=O)-N(H)-CH2CH2CH2-) (글루탐산 비스(n-프로필) 아미드; NH2 그룹은 지지 물질에 존재하는 관능 그룹과 반응시킨다);
HO-C(=O)-C(H)(-N(H)-C(=O)-CH2(-O-CH2CH2)2-)(-CH2-N(H)-C(=O)-CH2(-O-CH2CH2)2-)(N,N'-비스(3,5-디옥사옥타노일)디아미노프로피온산; 카복실산 그룹은 지지 물질에 존재하는 관능 그룹과 반응시킨다).
본 발명의 한 양태에서, R1은 수소 및 C1 내지 C4 알킬, 통상적으로, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, 2급 부틸, 3급 부틸, 사이클로프로필, 메틸사이클로프로필과 같은 사이클로알킬 단위를 포함할 수 있는 선형 및 분지형 C1 내지 C4 알킬로부터 선택된다.
바람직하게는, R1은 수소, 에틸 및 메틸로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, R1은 수소 또는 메틸이다. 가장 바람직하게는, R1은 수소이다.
Ar1은 5원, 6원 또는 7원일 수 있는 지환족(alicyclic) 또는 헤테로사이클릭 단핵 방향족 환 또는 부분 포화 방향족 환이다. Ar1은 화학 결합을 통하여 Sp 또는 L에 연결된다. Ar1의 Sp 또는 L에 대한 결합은 단일 결합, 이중 결합 또는 삼중 결합일 수 있다. 바람직하게는, 결합은 단일 결합이다. Ar1은 Sp 또는 L에 대한 화학 결합 이외의 치환체에 대한 결합을 가질 수 있다.
Ar1이 헤테로사이클릭 방향족 환 또는 부분 포화 헤테로사이클릭 방향족 환인 경우, 이는 N, S 및 O 그룹으로부터, 바람직하게는 N 및 S 그룹으로부터, 보다더 바람직하게는 하나 이상의 N-원자의 하나 이상의 헤테로원자를 함유한다. 이들 모든 양태에서, Ar1은 바람직하게는 5원 또는 6원 환이다.
Ar1이 화학 결합을 통하여 추가의 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 결합되지 않거나, 추가의 단핵 또는 이핵 방향족 환 시스템에 융합되지 않는 경우, Ar1은 바람직하게는 6원 지환족 방향족 환(예: 벤젠) 또는 N-원자를 갖는 6원 헤테로사이클릭 환(예: 피리딘, 피리미딘, 피리다진)이다. 당해 양태에서, Ar1은 바람직하게는 벤젠 또는 피리딘이며, 피리딘이 보다 바람직하다.
한 양태에서, Ar1은 화학 결합을 통하여 추가의 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 결합한다. 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 대한 Ar1의 결합은 단일 결합 또는 이중 결합일 수 있다. 바람직하게는, 당해 결합은 단일 결합이다. 추가의 5원 또는 6원 단핵 방향족 환은 지환족 또는 헤테로사이클릭일 수 있으며, 즉 이는 N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유할 수 있다.
Ar1이 화학 결합을 통하여 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 결합되는 경우, Ar1은 바람직하게는 티아졸, 옥사졸, 이소티아졸, 이소옥사졸 또는 트리아졸이며, 트리아졸 및 티아졸이 보다 바람직하다. Ar1에 결합된 5원 또는 6원 환은 바람직하게는 벤젠 또는 피리딘이다. 피리딘 또는 벤젠 환은 치환되지 않거나 -OH, 메틸, 에틸, 에톡시, 모노플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 메톡시, 모노플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 트리플루오로메톡시 그룹으로부터의 하나 이상의 독립체에 의하여 치환될 수 있다. 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 결합된 Ar1에 대한 바람직한 단위는 4-트리아졸릴벤젠, 5-트리아졸릴벤젠, 2-티아졸릴벤젠, 4-티아졸릴벤젠, 5-티아졸릴벤젠, 2-옥사졸릴벤젠, 4-옥사졸릴벤젠, 5-옥사졸릴벤젠, 3-이소티아졸릴벤젠, 4-이소티아졸릴벤젠, 5-이소티아졸릴벤젠, 3-이소옥사졸릴벤젠, 4-이소옥사졸릴벤젠, 5-이소옥사졸릴벤젠, 3-이소티아졸릴벤젠, 4-이소티아졸릴벤젠, 5-이소티아졸릴벤젠이다. 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 결합된 Ar1에 대한 추가의 바람직한 단위는 트리아졸릴피리딘, 티아졸릴피리딘, 옥사졸릴피리딘, 이소옥사졸릴피리딘, 이소티아졸릴피리딘이며, 여기서, 피리딘 단위는 Ar1의 상이한 위치에 결합될 수 있고, 피리딘 질소원자는 상이한 위치에 위치할 수 있다. 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 결합된 Ar1에 대한 보다 바람직한 단위는 4-트리아졸릴벤젠, 4-티아졸릴벤젠, 2-(4-티아졸릴)피리딘 및 3-(4-티아졸릴)피리딘이며, 4-트리아졸릴벤젠이 가장 바람직하다.
본원에서, 용어 "부분 포화 방향족 환"은 하나 이상의 이중 결합이 단일 결합에 의하여 대체된 5원, 6원 또는 7원 방향족 환을 나타낸다. 환이 전체적으로 포화되지 않음, 즉 2개 이상의 sp2 원자가 잔존함을 이해한다. 부분 포화 환 시스템의 하나 이상의 원자는 =O에 의하여 치환될 수 있다.
또 다른 양태에서, Ar1은 다핵 방향족 환 시스템 또는 부분 포화 다핵 환 시스템의 일부로서 단핵 또는 이핵 방향족 환 시스템에 융합된다. 다핵 환 시스템은 이핵 또는 삼핵 환 시스템, 바람직하게는 이핵 환 시스템이다.
본원에서, 용어 "부분 포화 다핵 환 시스템"은 또 다른 단핵 또는 이핵 방향족 환으로 융합되고 이의 하나 이상의 이중 결합이 단일 결합에 의하여 대체되는 5원, 6원 또는 7원 방향족 환을 나타낸다. 환이 전체적으로 포화되지 않음, 즉, 2개 이상의 sp2 원자가 잔존함을 이해한다. 상기 환이 융합되는 방향족 환 시스템이 불포화됨에 따라, 추가의 환 시스템의 일부이기도 한 Ar1의 부분 포화 환의 원자는 적어도 sp2 원자이다. 부분 포화 환 시스템의 하나 이상의 원자는 =O에 의하여 치환될 수 있다.
Ar1이 추가의 단핵 또는 이핵 방향족 환 시스템에 융합되는 경우, Ar1은 바람직하게는 이미다졸, 트리아졸, 옥사졸, 티아졸, 이소옥사졸, 이소티아졸, 피라졸, 피롤, 이미다졸린, 옥사졸린, 테트라하이드로피라진 또는 테트라하이드로[1H]-1,4-옥사제핀이며, 이미다졸, 이미다졸린 및 피라졸이 보다 바람직하고, 이미다졸 및 이미다졸린이 가장 바람직하다. 추가의 방향족 환 시스템은, 바람직하게는 단핵이다. 추가의 방향족 환 시스템은 바람직하게는 벤젠, 티오펜, 피리딘, 피리미딘, 피리다진, 푸란, 티아졸 또는 옥사졸이며, 벤젠, 티오펜 및 피리딘이 보다 바람직하고, 벤젠이 가장 바람직하다. 바람직한, 보다 바람직한, 그리고 가장 바람직한 추가의 방향족 환 시스템은 치환되지 않거나 -OH, 메틸, 에틸, 에톡시, 모노플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 메톡시, 모노플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 트리플루오로메톡시 그룹으로부터의 하나 이상의 독립체에 의하여 치환될 수 있다. 추가의 방향족 환 시스템에 융합된 Ar1로부터 형성된 단위는 이핵 또는 삼핵 환 시스템, 바람직하게는 이핵 환 시스템이다.
바람직한 단위는 벤즈이미다졸, 2-메틸벤즈이미다졸, 2-에틸벤즈이미다졸, 2-메톡시벤즈이미다졸, 벤조트리아졸, 2,3-디하이드로[1H]벤즈이미다졸-2-온, 인다졸, 1,2,3,4-테트라하이드로퀴녹살린-2-3-온, 2,3,4,5-테트라하이드로벤조[f][1,4]옥사제핀-5-온, 벤조티아졸 및 벤즈옥사졸이며, 벤즈이미다졸, 2-메틸벤즈이미다졸, 2-에틸벤즈이미다졸, 2-메톡시벤즈이미다졸 및 2,3-디하이드로[1H]벤즈이미다졸-2-온이 보다 바람직하고, 벤즈이미다졸 및 2-메틸벤즈이미다졸이 가장 바람직하다.
Ar1은 Ar1을 구성하는 상기 5원, 6원 또는 7원 방향족 환 또는 부분 포화 방향족 환에 존재하는 화학 결합을 통하여 Am에 직접, 또는 Ar1에 결합된 추가의 5원 또는 6원 방향족 환, 또는 Ar1에 융합된 추가의 방향족 환에 존재하는 화학 결합을 통하여 간접적으로 연결된다. Am에 대한 Ar1의 직접 연결은 위에서 기재한 모든 3개의 대안에서, 즉, Ar1이 추가의 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 결합되는 경우, 또는 Ar1이 다핵 환 시스템의 일부로서 추가의 5원 또는 6원 환에 융합되는 경우, 또는 이들 2개의 대안 중의 어느 것도 적용되지 않은 경우로 일어날 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, Ar1은 추가로 치환되지 않는다. 용어 "추가로 치환되지 않음"은 Sp 또는 L에 대한 화학 결합 및 Ar1에 임의로 존재하는 하나 이상의 화학 결합(들)(이들은 Am에 대한 임의 결합, 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 대한 결합 및 Ar1을 방향족 환에 융합시키는 결합으로부터 선택된다) 외에, 수소원자만이 위에서 명시된 결합 화학종 이외에 Ar1에 존재한다.
또 다른 양태에서, Ar1은 아래에 명시된 바와 같은 하나 이상의 치환체에 결합된다. 하나 이상의 치환체는 위에서 기재한 모든 대안에서, 즉 Ar1이 Am에 직접 연결되는 경우, 또는 Ar1이 추가의 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 결합되는 경우, 또는 Ar1이 다핵 환 시스템의 일부로서 추가의 5원 또는 6원 환에 융합되는 경우, 또는 이들 대안 중의 어느 것도 적용되지 않는 경우(각각의 경우, Ar1은 Am에 직접 연결되어야 한다)가 존재할 수 있다.
하나 이상의 치환체는 C1 내지 C4 알킬; C3 및 C4 사이클로알킬; C2 내지 C4 알케닐; C2 내지 C4 알키닐; 할로겐; C1 내지 C4 할로알킬; 하이드록실 치환된 C1 내지 C4 알킬; C1 내지 C4 알콕시; 하이드록실 치환된 C1 내지 C4 알콕시; 할로겐 치환된 C1 내지 C4 알콕시; C1 내지 C4 알킬아미노; C1 내지 C4 알킬티오; -NO2; =O; =S; =NH; -OH; 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
C1 내지 C4 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, 2급 부틸, t-부틸을 포함한다. C1 내지 C4 알콕시는 메톡시, 에톡시, n-프로필옥시, i-프로필옥시, n-부틸옥시, i-부틸옥시, 2급 부틸옥시, t-부틸옥시를 포함한다. C3 및 C4 사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸 및 메틸사이클로프로필이다. C1 내지 C4 할로알킬은 플루오로-, 디플루오로- 및 트리플루오로메틸, 및 하나 이상의 플루오로에 의하여 치환된 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, 2급 부틸, t-부틸; 클로로-, 디클로로- 및 트리클로로메틸; 및 하나 이상의 클로로에 의하여 치환된 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, 2급 부틸, t-부틸을 포함한다. 할로겐 치환된 C1 내지 C4 알콕시는 플루오로-, 디플루오로- 및 트리플루오로메톡시, 및 하나 이상의 플루오로에 의하여 치환된 에톡시, n-프로필옥시, i-프로필옥시, n-부틸옥시, i-부틸옥시, 2급 부틸옥시, t-부틸옥시; 클로로-, 디클로로- 및 트리클로로메틸; 및 하나 이상의 클로로에 의하여 치환된 에톡시, n-프로필옥시, i-프로필옥시, n-부틸옥시, i-부틸옥시, 2급 부틸옥시, t-부틸옥시를 포함한다.
바람직한 치환체들은 메틸, 에틸, 프로필, 메톡시, 에톡시, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시; 사이클로프로필, 하이드록시메틸, -NO2, =O이고, 메틸, 에틸, 메톡시 및 =O가 가장 바람직하다.
하나 이상의 치환체에 대한 Ar1의 결합은 단일 결합 또는 이중 결합일 수 있다.
Ar1 또는 Ar1에 추가의 5원 또는 6원 방향족 환이 결합하여 생성된 단위 또는 Ar1에 추가의 5원 또는 6원 방향족 환이 융합되어 생성된 단위는 Sp 또는 L, 및 Am에 결합된다.
Am의 배향에 따라, Ar1 또는 Ar1에 추가의 5원 또는 6원 방향족 환이 결합 또는 융합되어 생성된 단위에 대한 결합은 Am의 C=O 그룹 또는 Am의 NR1 그룹을 통하여 달성될 수 있다. 추가의 5원 또는 6원 방향족 환이 결합되거나 융합되지 않은 Ar1에 대한 적합한 독립체의 예는 이들로 제한되지는 않지만, 벤젠, 티오펜, 피리딘, 피리미딘, 피라진 또는 피리다진을 포함한다.
바람직한 양태에서, Ar1은 벤젠이다. 당해 양태에서, Am의 NR1 그룹 또는 C=O 그룹 및 Sp 또는 L은 서로에 대하여 오르토, 메타 또는 파라로 배향될 수 있으며, 메타 또는 파라가 바람직하고, 파라가 보다 바람직하다. 또 다른 바람직한 양태에서, Ar1은 피리딘이다. 당해 양태에서, Am의 NR1 그룹 또는 C=O 그룹 및 Sp 또는 L은 서로에 대하여 오르토, 메타 또는 파라로 배향될 수 있으며, 메타 또는 파라가 바람직하고, 파라가 보다 바람직하며, 한편, 피리딘 N 원자는 상이한 위치에 위치할 수 있다.
Ar1이 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 결합되어 생성된 적합한 독립체의 예는 이들로 제한되지는 않지만, 4-트리아졸릴벤젠, 5-트리아졸릴벤젠, 2-티아졸릴벤젠, 4-티아졸릴벤젠, 5-티아졸릴벤젠, 2-옥사졸릴벤젠, 4-옥사졸릴벤젠, 5-옥사졸릴벤젠, 3-이소티아졸릴벤젠, 4-이소티아졸릴벤젠, 5-이소티아졸릴벤젠, 3-이소옥사졸릴벤젠, 4-이소옥사졸릴벤젠, 5-이소옥사졸릴벤젠, 3-이소티아졸릴벤젠, 4-이소티아졸릴벤젠, 5-이소티아졸릴벤젠을 포함한다. 당해 양태에서, Am의 NR1 그룹 또는 C=O 그룹은 통상적으로 벤젠 잔기에 결합되고, Ar1의 5원 방향족 환에 대하여 오르토, 메타 또는 파라, 바람직하게는 메타 또는 파라로 위치할 수 있으며, 한편 Sp 또는 L은 통상적으로 벤젠 잔기가 결합된 환 원자에 인접하지 않은 Ar1의 환 원자를 통하여 Ar1의 5원 방향족 환에 결합된다.
Ar1이 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 결합되어 생성된 적합한 독립체의 추가의 예는 이들로 제한되지는 않지만, 트리아졸릴피리딘, 티아졸릴피리딘, 옥사졸릴피리딘, 이소옥사졸릴피리딘, 이소티아졸릴피리딘을 포함하며, 여기서 피리딘 단위는 Ar1의 상이한 위치에 결합될 수 있고, 피리딘 질소원자는 상이한 위치에 위치할 수 있다. 이러한 경우, Am의 NR1 그룹 또는 C=O 그룹은 통상적으로 피리딘 잔기에 결합되고, Ar1의 5원 방향족 환에 대하여 오르토, 메타 또는 파라, 바람직하게는 메타 또는 파라로 위치할 수 있고, 한편 Sp 또는 L은 통상적으로 피리딘 잔기가 결합된 환 원자에 인접하지 않은 Ar1의 환 원자를 통하여 Ar1의 5원 방향족 환에 결합된다.
Ar1이 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 융합되어 생성된 적합한 단위의 예는 이들로 제한되지는 않지만, 벤즈이미다졸, 벤조트리아졸, 2,3-디하이드로[1H]벤즈이미다졸, 인다졸, 1,2,3,4-테트라하이드로퀴녹살린, 2,3,4,5-테트라하이드로벤조[f][1,4]옥사제핀, 벤조티아졸, 벤즈옥사졸을 포함하며, 벤즈이미다졸 및 2,3-디하이드로[1H]벤즈이미다졸이 보다 바람직하고, 벤즈이미다졸이 가장 바람직하다.
Ar1이 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 융합되어 생성된 단위가 벤즈이미다졸인 경우, L 또는 Sp는 통상적으로 1- 또는 2-위치에서 결합되는 한편, Am의 NR1 그룹 또는 C=O 그룹은 통상적으로 5- 또는 6-위치, 바람직하게는 5-위치에서 결합된다. Ar1이 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 융합되어 생성된 단위가 벤조트리아졸인 경우, L 또는 Sp는 통상적으로 1-위치에서 결합되는 한편, Am의 NR1 그룹 또는 C=O 그룹은 통상적으로 5-위치에서 결합된다. Ar1이 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 융합되어 생성된 단위가 2,3-디하이드로[1H]벤즈이미다졸인 경우, L 또는 Sp는 통상적으로 1-위치에서 결합되는 한편, Am의 NR1 그룹 또는 C=O 그룹은 통상적으로 5-위치에서 결합된다. Ar1이 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 융합되어 생성된 단위가 인다졸인 경우, L 또는 Sp는 통상적으로 1-위치에서 결합되는 한편, Am의 NR1 그룹 또는 C=O 그룹은 통상적으로 3- 또는 5-위치에서 결합된다. Ar1이 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 융합되어 생성된 단위가 테트라하이드로퀴녹살린인 경우, L 또는 Sp는 통상적으로 1-위치에서 결합되는 한편, Am의 NR1 그룹 또는 C=O 그룹은 통상적으로 6- 또는 7-위치, 바람직하게는 6-위치에서 결합된다. Ar1이 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 융합되어 생성된 단위가 2,3,4,5-테트라하이드로벤조[f][1,4]옥사제핀인 경우, L 또는 Sp는 통상적으로 4-위치에서 결합되는 한편, Am의 NR1 그룹 또는 C=O 그룹은 통상적으로 7-위치에서 결합된다. Ar1이 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 융합되어 생성된 단위가 벤조티아졸인 경우, L 또는 Sp는 통상적으로 2-위치에서 결합되는 한편, Am의 NR1 그룹 또는 C=O 그룹은 통상적으로 5- 또는 6-위치에서 결합된다. Ar1이 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 융합되어 생성된 단위가 벤즈옥사졸인 경우, L 또는 Sp는 통상적으로 2-위치에서 결합되는 한편, Am의 NR1 그룹 또는 C=O 그룹은 통상적으로 5- 또는 6-위치에서 결합된다.
Ar2는 5원 또는 6원일 수 있는 지환족 또는 헤테로사이클릭 단핵 방향족 환이다. Ar2는 화학 결합을 통하여 Am에 연결된다. 한 양태에서, Ar2는 Am의 N 원자에 연결되고; 또 다른 양태에서, Ar2는 Am의 C 원자에 연결된다. 바람직하게는, Ar2는 Am의 N 원자에 연결된다. Am에 대한 화학 결합 이외에, Ar2는 하나 이상의 추가의 화학적 독립체, 즉 하나 이상의 치환체에 결합되거나, 다핵 환 시스템의 일부로서 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 융합될 수 있다.
Ar2가 헤테로사이클릭 방향족 환인 경우, 이는 N, S 및 O 그룹, 바람직하게는 N 및 S 그룹, 보다더 바람직하게는 하나 이상의 N-원자 및 하나 이상의 S-원자, 가장 바람직하게는 2개의 N-원자 및 하나의 S-원자로부터의 하나 이상의 헤테로원자를 함유한다. Ar2는 바람직하게는 5원 또는 6원 환, 보다더 바람직하게는 5원 환이다.
Ar2가 추가의 단핵 또는 이핵 방향족 환 시스템에 융합되지 않는 경우, 한 양태에서, Ar2는 6원 지환족 방향족 환(예: 벤젠) 또는 하나 이상의 N-원자를 갖는 6원 헤테로사이클릭 환(예: 피리딘, 피리미딘, 피리다진, 피라진 또는 트리아진)이다. 당해 양태에서, Ar2는 바람직하게는 벤젠, 피리딘, 피라진, 피리다진 또는 피리미딘이며, 벤젠 및 피리다진이 보다 바람직하다. 또 다른 양태에서, Ar2는 N, S 및 O 그룹으로부터의 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 5원 헤테로사이클릭 방향족 환이며, N 및 S가 바람직하다. Ar2에 대한 적합한 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 옥사졸, 이소옥사졸, 티아졸, 이소티아졸, 1,2,4-옥사디아졸, 1,2,4-티아디아졸, 1,3,4-옥사디아졸, 1,3,4-티아디아졸, 피롤, 피라졸, 이미다졸, 티오펜, 푸란을 포함한다. Ar2에 대한 바람직한 예는 티아졸, 1,2,4-티아디아졸 및 1,3,4-티아디아졸이며, 1,2,4-티아디아졸 및 1,3,4-티아디아졸이 가장 바람직하다.
또 다른 양태에서, Ar2는 다핵 환 시스템의 일부로서 단핵 또는 이핵 방향족 환 시스템에 융합된다. 다핵 환 시스템은 이핵 또는 삼핵 환 시스템, 바람직하게는 이핵 환 시스템이다.
Ar2가 추가의 단핵 또는 이핵 방향족 환 시스템에 융합된 경우, Ar2는 바람직하게는 1H-피라졸, 티아졸, 옥사졸 또는 이미다졸이다. Ar2가 1H-피라졸인 경우, 제2 방향족 환 시스템은 4- 및 5-위치를 통하여 Ar2에 융합되는 한편, Am은 3-위치에서 결합된다. Ar2가 티아졸인 경우, 제2 방향족 환은 4- 및 5-위치를 통하여 Ar2에 융합되는 한편, Am은 2-위치에서 결합된다. Ar2가 옥사졸인 경우, 제2 방향족 환은 4- 및 5-위치를 통하여 Ar2에 융합되는 한편, Am은 2-위치에서 결합된다. Ar2가 이미다졸인 경우, 제2 방향족 환 시스템은 1- 및 2-위치를 통하여 Ar2에 결합되는 한편, Am은 4-위치에서 결합된다. 대안적으로, 제2 방향족 환 시스템이 4- 및 5-위치를 통하여 Ar2에 결합되는 한편, Am은 2-위치에서 결합된다. 추가의 방향족 환 시스템은, 바람직하게는 단핵이다. 추가의 방향족 환 시스템은 바람직하게는 벤젠, 티오펜, 피리딘, 푸란, 티아졸, 옥사졸 또는 이미다졸이다. 보다 바람직하게는, 추가의 방향족 환 시스템은 벤젠 또는 티아졸이다. 추가의 방향족 환 시스템이 티아졸인 경우, 이는 2- 및 3-위치를 통하여 Ar2에 융합된다. 추가의 방향족 환 시스템에 융합된 Ar2로부터 형성된 단위는 바람직하게는 벤즈옥사졸(2-위치에 결합된 Am), 벤조티아졸(2-위치에 결합된 Am), 인다졸(3-위치에 결합된 Am) 또는 이미다조-[2,1-b]티아졸(6-위치에 결합된 Am)이다.
제2 방향족 환 시스템에 융합되는 대신, Ar2이 옥사졸 또는 티아졸인 경우, 이는 4- 및 5-위치를 통하여 사이클로펜텐에 융합될 수 있다. 바람직한 단위이기도 한, 수득한 단위는 5,6-디하이드로-4H-사이클로펜타옥사졸(2-위치에 결합된 Am) 및 5,6-디하이드로-4H-사이클로펜타티아졸(2-위치에 결합된 Am)이며, 5,6-디하이드로-4H-사이클로펜타티아졸이 보다 바람직하다.
본 발명의 추가의 양태에서, Ar2는 추가로 치환되지 않는다. 용어 "추가로 치환되지 않음"은 Am에 대한 화학 결합 및 Ar2를 방향족 환에 융합시키는 임의로 존재하는 결합 이외에, 수소원자만이 위에서 명시된 결합된 화학종 이외에 Ar2에 존재함을 나타낸다.
또 다른 양태에서, Ar2는 아래에 명시된 바와 같은 하나 이상의 치환체에 결합된다. 하나 이상의 치환체는 위에서 기재한 모든 2개의 대안에서, 즉, Ar2가 다핵 환 시스템의 일부로서 추가의 5원 또는 6원 환에 융합되는 경우, 또는 Ar2가 추가의 환에 융합되지 않은 경우 존재할 수 있다. 하나 이상의 치환체에 대한 Ar2의 결합은 단일 결합 또는 이중 결합일 수 있다. 바람직하게는, 결합은 단일 결합이다.
Ar2는 화학 결합을 통하여, C1 내지 C6 알킬; C3 내지 C6 사이클로알킬; C2 내지 C6 알케닐; C5 및 C6 사이클로알케닐; C2 내지 C6 알키닐; 할로겐; C1 내지 C6 할로알킬; 하이드록실 치환된 C1 내지 C6 알킬; C1 내지 C6 알콕시; 하이드록실 치환된 C1 내지 C6 알콕시; 할로겐 치환된 C1 내지 C6 알콕시; C1 내지 C6 알킬아미노; C1 내지 C6 알킬티오; -OH; SH; 카바모일; C1 내지 C4 알킬렌디옥시; 5원 또는 6원 단핵 방향족 환; 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합될 수 있고; 여기서, Ar2는 임의로, 위에서 인용된 바와 같은 화학 결합을 통하여 결합될 수 있는 치환체 이외에, 다핵 환 시스템의 일부로서 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 융합된다.
C1 내지 C6 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, 2급 부틸, t-부틸, 펜틸 및 헥실을 포함한다. C1 내지 C6 알콕시는 메톡시, 에톡시, n-프로필옥시, i-프로필옥시, n-부틸옥시, i-부틸옥시, 2급 부틸옥시, t-부틸옥시, 펜틸옥시 및 헥실옥시를 포함한다. C3 내지 C6 사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 메틸사이클로프로필, 디메틸사이클로프로필, 트리메틸사이클로프로필, 에틸사이클로프로필, 프로필사이클로프로필, 메틸에틸사이클로프로필, 메틸사이클로부틸, 디메틸사이클로부틸, 에틸사이클로부틸 및 메틸사이클로펜틸을 포함한다. C1 내지 C6 할로알킬은 플루오로-, 디플루오로- 및 트리플루오로메틸, 및 하나 이상의 플루오로에 의하여 치환된 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, 2급 부틸, t-부틸, 프로필 및 헥실; 클로로-, 디클로로- 및 트리클로로메틸; 및 하나 이상의 클로로에 의하여 치환된 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, 2급 부틸, t-부틸, 프로필 및 헥실을 포함한다. 할로겐 치환된 C1 내지 C4 알콕시는 플루오로-, 디플루오로- 및 트리플루오로메톡시, 및 하나 이상의 플루오로에 의하여 치환된 에톡시, n-프로필옥시, i-프로필옥시, n-부틸옥시, i-부틸옥시, 2급 부틸옥시, t-부틸옥시; 클로로-, 디클로로- 및 트리클로로메틸; 및 하나 이상의 클로로에 의하여 치환된 에톡시, n-프로필옥시, i-프로필옥시, n-부틸옥시, i-부틸옥시, 2급 부틸옥시, t-부틸옥시를 포함하고; C1 내지 C4 알킬렌디옥시는 메틸렌디옥시; 에틸렌디옥시, 프로필렌디옥시, 부틸렌디옥시, 바람직하게는 메틸렌디옥시, 에틸렌디옥시을 포함한다.
바람직한 치환체는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 사이클로프로필, 하이드록시메틸, t-부틸, i-부틸, 2급 부틸, 플루오로, 클로로, 카바모일, 에틸티오, 메틸티오이며, 메틸, 에틸, 카바모일, 메톡시, 에틸티오 및 사이클로프로필이 가장 바람직하다.
한 양태에서, Ar2가 화학 결합을 통하여 결합된 치환체는 5원 또는 6원 단핵 방향족 환이다. 5원 또는 6원 방향족 환에 대한 Ar2의 결합은 단일 결합 또는 이중 결합일 수 있다. 바람직하게는, 당해 결합은 단일 결합니다. 추가의 5원 또는 6원 단핵 방향족 환은 지환족 또는 헤테로사이클릭일 수 있으며, 즉 이는 N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유할 수 있다.
Ar2가 화학 결합을 통하여 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 결합되는 경우, Ar2는 바람직하게는 옥사졸, 이소옥사졸, 이미다졸, 피라졸, 피롤, 티아졸, 이소티아졸, 1,2,4-티아디아졸, 1,3,4-티아디아졸, 피리딘, 피리다진 또는 피리미딘이다. 보다 바람직하게는, Ar2는 피라졸, 티아졸, 이소티아졸, 1,2,4-티아디아졸, 1,3,4-티아디아졸 또는 피리다진이다. 가장 바람직하게는, Ar2는 피라졸, 티아졸, 1,2,4-티아디아졸 또는 1,3,4-티아디아졸이다. Ar2가 옥사졸인 경우, Am은 2-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 4- 또는 5-위치에 결합된다. 대안적으로, Am은 4- 또는 5-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 2-위치에 결합된다. Ar2가 이소옥사졸인 경우, Am은 3-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 5-위치에 결합된다. 대안적으로, Am은 5-위치에 결합되고, 추가의 방향족 환은 3-위치에 결합된다. Ar2가 이미다졸인 경우, Am은 2-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 4-위치에 결합된다. 대안적으로, Am은 4-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 2-위치에 결합된다. Ar2가 피라졸인 경우, Am은 3-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 5-위치에 결합된다. 대안적으로, Am은 3- 또는 4-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 1-위치에 결합된다. Ar2가 피롤인 경우, Am은 2-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 4-위치에 결합된다. 대안적으로, Am은 4-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 2-위치에 결합된다. 보다 대안적으로, Am은 3-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 1-위치에 결합된다. Ar2가 티아졸인 경우, Am은 2-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 4- 또는 5-위치에 결합된다. 대안적으로, Am은 4- 또는 5-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 2-위치에 결합된다. Ar2가 이소티아졸인 경우, Am은 3-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 5-위치에 결합된다. 대안적으로, Am은 5-위치에 결합되고, 추가의 방향족 환은 3-위치에 결합된다. Ar2가 1,2,4-티아디아졸인 경우, Am은 3-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 5-위치에 결합된다. 대안적으로, Am은 5-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 3-위치에 결합된다. Ar2가 1,3,4-티아디아졸인 경우, Am은 2-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 5-위치에 결합된다. Ar2가 피리딘인 경우, Am 및 추가의 단핵 방향족 환은 서로에 대하여 메타 또는 파라, 바람직하게는 파라로 위치하는 한편, 피리딘 코어의 질소원자는 상이한 위치에서 위치할 수 있다. Ar2가 피리다진인 경우, Am은 3-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 6-위치에 결합된다. 대안적으로, Am은 5-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 3-위치에 결합된다. 보다 대안적으로, Am은 3-위치에 결합되고, 추가의 단핵 방향족 환은 5-위치에 결합된다. Ar2가 피리미딘인 경우, Am 및 추가의 단핵 방향족 환은 서로에 대하여 메타 또는 파라, 바람직하게는 파라로 위치하는 한편, 피리미딘 코어의 질소원자는 상이한 위치를 가질 수 있다.
Ar2에 결합된 추가의 단핵 5원 또는 6원 방향족 환은 바람직하게는 벤젠, 푸란, 티오펜, 옥사졸, 이소옥사졸, 티아졸, 이소티아졸 또는 피리딘이다. 보다 바람직하게는, Ar2에 결합된 추가의 단핵 5원 또는 6원 방향족 환은 푸란, 옥사졸, 이소옥사졸 또는 피리딘이며, 푸란이 가장 바람직하다. 추가의 단핵 방향족 환이 푸란인 경우, 이는 2- 또는 3-위치를 통하여 Ar2에 결합된다. 추가의 단핵 방향족 환이 티오펜인 경우, 이는 2- 또는 3-위치를 통하여 Ar2에 결합된다. 추가의 단핵 방향족 환이 옥사졸인 경우, 이는 2-, 4- 또는 5-위치를 통하여 Ar2에 결합된다. 추가의 단핵 방향족 환이 이소옥사졸인 경우, 이는 3-, 4- 또는 5-위치를 통하여 Ar2에 결합된다. 추가의 단핵 방향족 환이 티아졸인 경우, 이는 2-, 4- 또는 5-위치를 통하여 Ar2에 결합된다. 추가의 단핵 방향족 환이 이소티아졸인 경우, 이는 3-, 4- 또는 5-위치를 통하여 Ar2에 결합된다. 추가의 단핵 방향족 환이 피리딘인 경우, 이는 2-, 3- 또는 4-위치를 통하여 Ar2에 결합된다.
5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 결합된 Ar2에 대한 바람직한 단위는 1-페닐피라졸(3-위치를 통하여 Am에 결합), 2-(2-푸릴)피라졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 4-페닐티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합), 5-페닐티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합), 2-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 2-(3-푸릴)-1,3,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 2-(2-피리딜)-1,3,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 2-(3-피리딜)-1,3,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 2-(4-피리딜)-1,3,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 3-(2-푸릴)-1,2,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 4-(2-푸릴)티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합), 5-(2-푸릴)티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합), 2-페닐-1,3,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 3-페닐-1,2,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 4-(2-피리딜)티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합), 4-(3-피리딜)티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합), 4-(4-피리딜)티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합), 5-(2-피리딜)티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합), 5-(3-피리딜)티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합), 5-(4-피리딜)티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합), 3-(2-푸릴)피리다진 (6-위치를 통하여 Am에 결합), 2-(5-이소옥사졸릴)-1,3,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 2-(5-옥사졸릴)-1,3,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 2-(2-옥사졸릴)-1,3,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합)이다.
5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 결합된 Ar2에 대한 보다 바람직한 단위는 2-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 2-(3-푸릴)-1,3,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 3-(2-푸릴)-1,2,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 4-(2-푸릴)티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합), 5-(2-푸릴)티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합), 4-(2-피리딜)티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합), 4-(3-피리딜)티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합), 4-(4-피리딜)티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합), 3-(2-푸릴)피리다진(6-위치를 통하여 Am에 결합), 2-(5-이소옥사졸릴)-1,3,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 2-(5-옥사졸릴)-1,3,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 2-(2-옥사졸릴)-1,3,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합)이다. 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 결합된 Ar2에 대한 가장 바람직한 단위는 2-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 3-(2-푸릴)-1,2,4-티아디아졸(5-위치를 통하여 Am에 결합), 4-(2-피리딜)티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합), 4-(3-피리딜)티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합), 4-(4-피리딜)티아졸(2-위치를 통하여 Am에 결합)이다.
Ar2가 추가의 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 결합하여 생성된 단위는, Am에 대한 결합 이외에, 메틸, 에틸, 메톡시, 메틸렌디옥시(이 경우, 치환체는 Ar2가 추가의 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 결합하여 생성된 단위의 2개의 원자에 결합된다), 에톡시, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메톡시, 트리플루오로메톡시, -F, -Cl, -Br로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합될 수 있다. 바람직한 치환체는 메틸 및 메틸렌디옥시이다.
Ar2는 C=O 그룹(화학식 Ia 참조) 또는 NR1 그룹(화학식 Ib 참조)에 결합된다.
화학식 I에 나타낸 변수인 L, Sp, Ar1, Am, R1 및 Ar2의 다양한 의미에 대하여 위에서 인용된 모든 정의는 본 발명의 양태를 나타내고, 고려중인 것 이외의 다른 변수 중의 어느 하나 또는 전체가 이의 일반적인, 바람직한, 보다 바람직한 또는 보다더 바람직한 양태를 나타내는 경우 사실과 독립적으로, 각각의 변수의 일반적인 양태, 바람직한 양태, 보다 바람직한 양태 및 보다더 바람직한 양태를 포함한다. 결과적으로, 한 변수의 일반적인 양태는 기타 변수 중의 어느 하나의 바람직한, 보다 바람직한, 그리고 보다 바람직한 양태와 조합될 수 있다.
이제 화학식 I에 대한 바람직한 정의의 정의가 후속될 것이다.
아래에 정의된 바와 같은 모든 양태에서(즉, 바람직한, 보다 바람직한, 보다더 바람직한), R1은 수소 또는 메틸, 가장 바람직하게는 수소이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 화학식 I의 변수는 다음 의미를 갖는다:
Ar1은 5원 또는 6원 단핵 방향족 환 또는 1, 2 또는 3개의 N 원자 또는 벤젠을 함유하는 부분 포화 방향족 환이고; 여기서 상기 단핵 환 또는 벤젠은 화학 결합을 통하여 Sp 또는 L에 연결되고, 임의로 추가로
(a) 화학 결합을 통하여 벤젠 또는 티오펜에 결합되거나,
(b) 다핵 환 시스템의 일부로서 벤젠 또는 티오펜에 융합(여기서, Ar1은 Ar1을 구성하는 벤젠 또는 상기 방향족 환에 존재하는 화학 결합을 통하여 Am에 직접 연결되거나, Ar1에 결합된 벤젠 환 또는 티오펜 환에 존재하거나 Ar1에 융합된 벤젠 환 또는 티오펜 환에 존재하는 화학 결합을 통하여 간접적으로 연결되고; 추가로 치환되지 않거나, 메틸, 에틸, 프로필, 메톡시, 에톡시, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시; 사이클로프로필, 하이드록시메틸, -NO2, =O, =S; 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된다)되거나/되고;
Ar2는 치환되지 않거나 화학 결합을 통하여 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 사이클로프로필, 하이드록시메틸, t-부틸, i-부틸, 2급 부틸, 플루오로, 클로로, 카바모일, 에틸티오, 메틸티오, 5원 또는 6원 단핵 방향족 환; 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된 5원 단핵 방향족 환(여기서, Ar2는 임의로 위에서 인용된 화학 결합을 통하여 결합될 수 있는 치환체 이외에, 다핵 환 시스템의 일부로서 벤젠 또는 티아졸에 융합된다)이다.
본 발명의 보다더 바람직한 양태에서, 화학식 I의 변수는 다음 의미를 갖는다:
Ar1은 화학 결합을 통하여 Sp 또는 L에 연결된, 이미다졸, 벤젠, 피리딘, 2,3-디하이드로-1H-이미다졸 및 트리아졸로부터 선택된 부분 포화 방향족 환 또는 5원 또는 6원 단핵 방향족 환이고, 이는 임의로 추가로
(a) 화학 결합을 통하여 벤젠에 결합되거나,
(b) 다핵 환 시스템의 일부로서 벤젠에 융합되고/되거나(여기서, Ar1은 Ar1을 구성하는 5원 또는 6원 방향족 환 또는 부분 포화 방향족 환에 존재하는 화학 결합을 통하여 Am에 직접, 또는 Ar1에 결합된 벤젠 환 또는 Ar1에 융합된 벤젠 환에 존재하는 화학 결합을 통하여 간접적으로 연결되고; 추가로 치환되지 않거나 메틸, 에틸, 프로필, 메톡시, 에톡시, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시; 사이클로프로필, 하이드록시메틸, -NO2, =O, =S; 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된다),
Ar2는 치환되지 않거나, 화학 결합을 통하여 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 사이클로프로필, 하이드록시메틸, t-부틸, i-부틸, 2급 부틸, 플루오로, 클로로, 카바모일, 에틸티오, 메틸티오, 바람직하게는 메틸, 에틸, 메톡시, 에틸티오 및 사이클로프로필; 5원 또는 6원 단핵 방향족 환; 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된, N, S, O, 바람직하게는 N, S로부터 선택된 하나 이상의 원자를 함유하는 5원 단핵 방향족 환(여기서, Ar2는 임의로, 위에서 인용된 화학 결합을 통하여 결합될 수 있는 치환체 이외에, 다핵 환 시스템의 일부로서 벤젠 또는 티아졸에 융합된다)이다.
본 발명의 보다더 바람직한 양태에서, 화학식 I의 변수는 다음 의미를 갖는다: Ar1은 벤즈이미다졸, 2,3-디하이드로벤즈이미다졸, 피리딘 및 4-트리아졸릴벤젠(여기서, Ar1은 화학 결합을 통하여 벤즈이미다졸의 1- 또는 2-위치, 2,3-디하이드로벤즈이미다졸의 1-위치, 피리딘의 2-위치 또는 4-트리아졸릴벤젠의 트리아졸 부분의 1-위치에 결합된 Sp 또는 L에 연결되고; 화학 결합을 통하여 벤즈이미다졸의 5- 또는 6-위치, 2,3-디하이드로벤즈이미다졸의 5- 또는 6-위치, 피리딘의 5-위치 또는 4-트리아졸릴벤젠의 벤젠 부분의 4-위치에 결합된 Am에 연결되고; Ar1은 추가로 치환되지 않거나 메틸, 에틸, 메톡시 =S 및 =O; 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된다)으로부터 선택되고/되거나,
Ar2는 치환되지 않거나, 화학 결합을 통하여 메틸, 에틸, 메톡시, 에틸티오 및 사이클로프로필로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된, 1,2,4-티아디아졸, 1,3,4-티아디아졸 및 티아졸로부터 선택된 5원 단핵 방향족 환; 피리딘, 푸란, 이소옥사졸, 옥사졸, 이소티아졸, 티아졸로부터 선택된 5원 또는 6원 단핵 방향족 환; 및 이들의 조합이다.
본 발명은 또한 (지지 물질에 결합된 후) 지지 물질과 함께 본 발명의 방법에 사용된 리간드 치환된 매트릭스를 형성하는 본 발명의 리간드를 포함한다. 매트릭스/지지 물질에 결합하기 전의 리간드는 화학식 II, IIa 및 IIb에 따른다.
화학식 II
(SpP)v-Ar1-Am-Ar2
[화학식 IIa]
(SpP)v-Ar1-N(R1)-C(O)--Ar2
[화학식 IIb]
(SpP)v-Ar1-C(O)-N(R1)-Ar2
위의 화학식 II, IIa 및 IIb에서,
Sp, Ar1, Ar2 및 Am은 바람직한 의미를 포함하여, 위에서 정의한 의미를 갖는다.
본 발명에 따르는 리간드는 화학식 III의 구조 단위를 함유한다:
[화학식 III]
-Ar1-Am-Ar2
위의 화학식 III에서,
Ar1, Am 및 Ar2는 화학식 I과 관련하여 본 명세서 및 실시예를 통하여 정의된 의미를 갖는다.
화학식 III에 나타낸 구조 단위는 지지 물질/매트릭스에 결합된 후 및 지지 물질/매트릭스에 결합되기 전의 리간드에 존재한다.
화학식 I에 나타낸 바와 같고/같거나, 화학식 II에 나타낸 바와 같고/같거나, 화학식 III에 나타낸 바와 같은 구조 단위를 함유하는 리간드는 단백질, 바람직하게는 항체, 바람직하게는 IgG 항체에, 그리고 Fc 융합 단백질, 보다 특히 항체 또는 융합 단백질의 Fc 단편 또는 도메인에 결합되며, 여기서 가장 바람직하게는 Fc 항체 또는 도메인 또는 항체는 IgG 항체 부류에 속하고, 보다 바람직하게는 사람, IgG 또는 사람 기원의 다중클론 또는 단일클론 IgG에, 특히 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에 속한다.
바람직한 양태에서, 위에서 정의한 바와 같은 리간드는 매트릭스/지지 물질에 결합되기 전 및 매트릭스/지지 물질에 결합된 후 위에서 정의한 바와 같은 단백질에 결합한다.
화학식 II, IIa 및 IIb에 따르는 리간드는 리간드에 결합된 SpP 스페이서 전구체 그룹을 포함한다.
화학식 II, IIa 및 IIb에 따르는 리간드는 스페이서 그룹이 결합되지 않은 추가의 화합물의 합성용 전구체로서 작용할 수 있다. 명명된 화합물은 스페이서 그룹의 분열(cleavage) 및, 경우에 따라, SpP에 연결된 리간드에 존재하는 관능성의 당업자에게 공지된 어떠한 기타 적합한 관능성으로의 전환 후 생성된다. 이러한 목적에 적합한 반응은 당업자에게 공지되어 있다. 수득한 화합물 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명에 따르는 매트릭스의 바람직한 리간드를 아래에 나타내며, 여기서, 각각의 화학식에서 맨 좌측의 N 원자는 나타내지 않은 결합점 L에 연결된다. 아래의 모든 화학식은 리간드에 결합된 스페이서 전구체 그룹(SpP)을 나타낸다:
Figure pct00001
1-(3-아미노-1-프로필)-5-[(1-메틸인다졸-3-일)카복스아미도]벤즈이미다졸(L01)
Figure pct00002
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(1-메틸-3-인다졸릴) 아미드(L02)
Figure pct00003
4-(3-아미노-1-프로필)-7-[(1-메틸인다졸-3-일)카복스아미도]-2,3,4,5-테트라하이드로벤조[f][1,4]옥사제핀-5-온(L03)
Figure pct00004
1-(3-아미노-1-프로필)인다졸-3-카복실산 N-(3-카바모일-4-메톡시페닐) 아미드(L04)
Figure pct00005
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L05)
Figure pct00006
1-(3-아미노-1-프로필)벤조트리아졸-5-카복실산 N-(1-메틸인다졸-3-일) 아미드(L06)
Figure pct00007
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(2-에틸-1,3,4-티아디아졸-5-일) 아미드(L07)
Figure pct00008
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(벤즈옥사졸-2-일) 아미드(L08)
Figure pct00009
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[2-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-1,3,4-티아디아졸-5-일] 아미드(L09)
Figure pct00010
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(벤조티아졸-2-일) 아미드(L10)
Figure pct00011
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(5-메틸-1-페닐피라졸-3-일) 아미드(L11)
Figure pct00012
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(2-에틸티오-1,3,4-티아디아졸-5-일) 아미드(L12)
Figure pct00013
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(1,3,4-티아디아졸-2-일) 아미드(L13)
Figure pct00014
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(2-메틸-1,3,4-티아디아졸-5-일) 아미드(L14)
Figure pct00015
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(4-메틸티아졸-2-일) 아미드(L15)
Figure pct00016
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(티아졸-2-일) 아미드(L16)
Figure pct00017
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(5-메틸티아졸-2-일) 아미드(L17)
Figure pct00018
4-[(3-아미노-1-프로필)아미노]-3-니트로벤조산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일]아미드(L18)
Figure pct00019
6-[(3-아미노-1-프로필)아미노]니코틴산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일]아미드(L19)
Figure pct00020
4-[(1-아미노-3-프로필)옥시]벤조산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L20)
Figure pct00021
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(4-피리딜)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L21)
Figure pct00022
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(3-페닐-1,2,4-티아디아졸-5-일) 아미드(L22)
Figure pct00023
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(2-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L23)
Figure pct00024
1-(3-아미노-1-프로필)-2-옥소-2,3-디하이드로벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L24)
Figure pct00025
1-(8-아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L25)
Figure pct00026
1-(8-아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 아미드(L26)
Figure pct00027
1-(8-아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(1,3,4-티아디아졸-2-일) 아미드(L27)
Figure pct00028
1-(3-아미노-1-프로필)-2,3-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로퀴녹살린-6-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일]아미드(L28)
Figure pct00029
1-(8-아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(4-메틸티아졸-2-일) 아미드(L29)
Figure pct00030
1-(3-아미노-1-프로필)-5-[(이미다조-[2,1-b]티아졸-6-일)카복스아미도]벤즈이미다졸(L30)
Figure pct00031
2-(5-아미노-1-펜틸)-1-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일]아미드(L31)
Figure pct00032
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(5,6-디하이드로-(4H)-사이클로펜타티아졸-2-일) 아미드(L32)
Figure pct00033
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(2-페닐-1,3,4-티아디아졸-5-일) 아미드(L33)
Figure pct00034
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(6-메틸피리다진-3-일) 아미드(L34)
Figure pct00035
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(2-사이클로프로필-1,3,4-티아디아졸-5-일) 아미드(L35)
Figure pct00036
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(3-메틸-1,2,4-티아디아졸-5-일) 아미드(L36)
Figure pct00037
4-(5-아미노-3-옥사-1-펜틸옥시)벤조산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L37)
Figure pct00038
4-[(1-아미노-3-프로필)옥시]벤조산 N-[4-(2-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L38)
Figure pct00039
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L39)
Figure pct00040
6-[(3-아미노-1-프로필)아미노]니코틴산 N-[4-(2-피리딜)티아졸-2-일]아미드(L40)
Figure pct00041
1-(8-아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(2-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L41)
Figure pct00042
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(2-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L42)
Figure pct00043
1-(3-아미노-1-프로필)-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(2-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L43)
Figure pct00044
1-(3-아미노-1-프로필)-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L44)
Figure pct00045
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메톡시벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L45)
Figure pct00046
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(3-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L46)
Figure pct00047
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(4-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L47)
Figure pct00048
6-[1-(3-아미노-1-프로필)트리아졸-4-일]벤조산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일]아미드(L48)
Figure pct00049
1-(8-아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L49)
Figure pct00050
1-(8-아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)-2-옥소-2,3-디하이드로벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L50)
Figure pct00051
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(4-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L51)
Figure pct00052
1-(8-아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(4-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L52)
Figure pct00053
(S)-글루탐산 N,N'-비스{8-{5-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일카바모일]벤즈이미다졸-1-일}-3,5-디옥사-1-옥틸} 아미드(L53)
Figure pct00054
(S)-글루탐산 N,N'-비스{8-{5-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일카바모일]-2-메틸벤즈이미다졸-1-일}-3,5-디옥사-1-옥틸} 아미드(L54)
Figure pct00055
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[3-(2-푸릴)-1,2,4-티아디아졸-5-일] 아미드(L55)
Figure pct00056
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(3-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L56)
Figure pct00057
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(2-푸릴)티아졸-2-일] 아미드(L57)
Figure pct00058
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)티아졸-2-일] 아미드(L58)
Figure pct00059
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[6-(2-푸릴)피리다진-3-일] 아미드(L59)
Figure pct00060
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[3-(2-푸릴)-1,2,4-티아디아졸-5-일] 아미드(L60)
Figure pct00061
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(3-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L61)
Figure pct00062
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(2-푸릴)티아졸-2-일] 아미드(L62)
Figure pct00063
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)티아졸-2-일] 아미드(L63)
Figure pct00064
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[6-(2-푸릴)피리다진-3-일] 아미드(L64)
Figure pct00065
1-(3-아미노-1-프로필)-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[3-(2-푸릴)-1,2,4-티아디아졸-5-일] 아미드(L65)
Figure pct00066
1-(3-아미노-1-프로필)-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(3-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L66)
Figure pct00067
1-(3-아미노-1-프로필)-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(2-푸릴)티아졸-2-일] 아미드(L67)
Figure pct00068
1-(3-아미노-1-프로필)-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)티아졸-2-일] 아미드(L68)
Figure pct00069
1-(3-아미노-1-프로필)-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[6-(2-푸릴)피리다진-3-일] 아미드(L69)
Figure pct00070
4-[2-(3-아미노-1-프로필아미노)티아졸-4-일]벤조산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L70)
Figure pct00071
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(5-이소옥사졸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L71)
Figure pct00072
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(5-옥사졸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L72)
Figure pct00073
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-옥사졸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L73)
화학식 II의 리간드의 합성은 예를 들면, 카복실산 성분 및 아민 성분의 어셈블리에 의한 용액 상에서 수행하여, 최종적으로 아미드 Am을 형성할 수 있다. 커플링은 필요한 경우, 반응 혼합물의 통상적인 가열 또는 극초단파 조사에 의하여 도달할 수 있는 승온에서, 당업자에게 공지된 활성화제를 사용한 카복실산 성분의 활성화 및 후속적인 활성화 카복실산과 아민 성분과의 반응에 의하여 달성될 수 있다. 당해 반응 동안, 이후에 지지 물질에 리간드를 결합시키는 전구체 그룹으로서 작용하는 아미노 그룹은, 3급 부톡시카보닐과 같은 적합한 보호 그룹에 의하여 보호될 필요가 있다. 두 성분의 성공적인 커플링 후, 보호 그룹은 적합한 조건하에 제거할 필요가 있다. 개별적인 성분들의 어셈블리를 위하여, 당업자에게 공지된 추가의 용액상 합성 단계가 적용될 수 있다. 스페이서 그룹을 포함하는 탈보호 리간드는 역시 당업자에게 공지된 크로마토그래피 방법에 의하여 정제한다.
적합한 용액-상 합성 프로토콜을 특정 리간드에 적용하지 않아야 하는 경우, 합성은 대안적으로 또한 바람직하게는 추가의 분자가 당업자에게 공지된 반응에 의하여 결합될 수 있는, 반응성 그룹(관능 그룹), 예를 들면, 하이드록실 그룹을 갖는 적합한 스페이서로 예비 가중된(pre-loaded), 수지, 예를 들면, 폴리스티렌 수지로도 공지된, 불용성 지지물 상에서 수행될 수 있다. 최종적으로, 스페이서 그룹을 포함하는 리간드는 당업자에게 공지된 적합한 분열 프로토콜에 의하여 상기 불용성 지지물/수지로부터 방출되고, 당업자에게 또한 공지된 크로마토그래피 방법에 의하여 정제한다.
용어 "항체"는 천연 및 전체적으로 또는 부분적으로 합성 제조되고 추가로 특이적 결합 능력을 유지시키는 이의 모든 단편 및 유도체를 포함하는, 면역글로불린을 의미한다. 통상적인 단편은 Fc, Fab, 중쇄 및 경쇄이다. 당해 용어는 또한 아미노산 서열과 비교하여 면역글로불린 결합 도메인과 95% 이상 동일한 것과 같은, 동종이거나 대체로 동종인 결합 도메인을 갖는 어떠한 폴리펩티드라도 포함한다. 당해 폴리펩티드는 천연 공급원으로부터 유도하거나, 부분적으로 또는 전체적으로 합성적으로 제조할 수 있다. 항체는 단일클론 또는 다중클론일 수 있고, 사람 또는 비-사람 기원이거나 사람 Fc 부분이 뮤린(murine) Fab 단편 또는 사람 서열과 뮤린 서열을 포함하는 Fab 단편(...zumab로 끝나는 치료적 항체, 예를 들면, 베박시주마브)에 융합되거나 상이한 Fab 단편("이특이성(bispecific) 항체")에 연결된 키메라 단백질(...ximab로 끝나는 치료적 항체, 예를 들면, 리툭시마브(Rituximab))일 수 있다. 당해 항체는 모든 면역글로불린 부류, 바람직하게는 IgG, 사람 항체의 경우, 보다 바람직하게는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에 속하는 것일 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 양태에서, 항체는 본 발명에 따르는 리간드가 항체의 Fc 부분에 결합된다고 추정됨에 따라, Fc 단편 또는 도메인을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체는 가장 바람직하게는 면역글로불린 부류, 바람직하게는 IgG, 보다 바람직하게는 사람 IgG 또는 사람 기원의 다중클론 또는 단일클론 IgG, 특히 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 Fc 단편 또는 도메인을 함유하는 항체이다.
용어 "Fc 융합 단백질"은 Fc 단편과 하나 이상의 단백질 또는 단백질 도메인의 모든 조합을 말한다. Fc 융합 단백질의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 사람 IgG1 Fc 도메인과 가용성 수용체 도메인과의 키메라(...cept로 끝나는 치료적 단백질), 예를 들면, 에타너셉트(Etanercept, 2개의 종양 괴사 인자 수용체 도메인과 결합된 사람 IgG1 Fc) 또는 릴로나셉트(Rilonacept, 인터류킨-1-수용체 도메인과 융합된 사람 IgG1)를 포함한다. Fc 융합 단백질은 어떠한 수단으로도 생성할 수 있다. 예를 들면, Fc 융합 단백질은 Fc 단편을 적합한 단백질 또는 단백질 도메인과 커플링하여 효소적으로 또는 화학적으로 생성할 수 있거나, Fc 및 단백질/단백질 도메인 서열을 암호화시키는 유전자로부터 재조합적으로 생성할 수 있다. 대안적으로, Fc 융합 단백질은 전체적으로 또는 부분적으로 합성적으로 생성할 수 있다. Fc 융합 단백질은 또한 임의로 다분자 착체(multimolecular complex)일 수도 있다. 관능성 Fc 융합 단백질은 통상적으로 약 50개 이상의 아미노산을 포함하고, 보다 통상적으로 약 200개 이상의 아미노산을 포함한다.
본 발명은 명세서의 다른 부분에 개시한 바와 같이, 화학식 I의 친화성 리간드를 이용하는, 바람직하게는 착체 혼합물, 예를 들면, 사람 또는 동물 기원의 발효 상청액 또는 혈장으로부터의 항체 또는 Fc 융합 단백질의, 친화 크로마토그래피에 의한, 친화성 정제, 및 이의 바람직한 양태에 관한 것이다.
따라서, 바람직한 양태에서, 본 발명은 친화성 정제, 바람직하게는 친화 크로마토그래피에 의한, 단백질, 바람직하게는 면역글로불린 또는 Fc 융합 단백질의 정제방법을 포함한다. 본 발명에 따르는 친화성 리간드는 항체의 Fc 영역에 결합한다.
베박시주마브(Avastin®, Genentech/Roche)는 인간화된 단일클론 항체(humanized monoclonal antibody)이다. 이는 새로운 혈관 형성(혈관신생)을 자극시키는 단백질 혈관 내피 성장 인자-A(VEGF-A)의 기능을 표적화하고 억제시켜 새로운 혈관의 형성을 방지함으로써 종양 성장을 중단시킨다.
토실리주마브(Tocilizumab)(RoActemra®, Genentech/Roche)는 인간화 단일클론 항체이다. 이는 인터류킨-6 수용체를 향한 것이고, 염증전 시토카인 인터류킨-6의 작용을 차단시킨다. 이는 류머티스성 관절염 치료용으로 승인받았다.
팔리비주마브(Palivizumab)(Synagis®, Abbott)는 호흡기 합포체 바이러스(RSV) F-단백질의 A-에피토프를 향한 인간화 단일클론 항체이다. 이는 RSV 감염의 방지에 사용된다.
세툭시마브(Cetuximab)(Erbitux®, Merck Serono)는 표피 성장 인자 수용체를 향한 키메라 단일클론 항체이다. 이는 두부 및 경부의 대장암 및 편평 상피세포 암종 세포의 치료에 지시된다.
다중클론 사람 IgG는 Fc 부분을 통하여 면역글로불린의 친화성 정제를 위한 기재된 리간드의 보편적인 적용성을 나타내는 것으로 연구되어 있다.
본 발명을 실시하는 경우, 화학식 I에 따르는 리간드는 적합한 지지 물질에 결합되어, 단백질 분리를 위한 리간드 치환된 매트릭스, 통상적으로 친화성 정제, 바람직하게는 친화 크로마토그래피용 매트릭스(본 발명과 관련하여 친화성 매트릭스라고도 함)가 된다. 당해 화학식의 리간드는 임의로 스페이서 -Sp-를 포함하는, L을 통하여 지지 물질에 결합된다.
따라서, 본 발명은 위의 명세서에 명시된 바와 같은 지지 물질 및 하나 이상의 리간드를 포함하는, 단백질 분리용 리간드 치환된 매트릭스(친화성 매트릭스)를 포함하며, 여기서, 리간드는 L을 통하여 결합된다.
매트릭스(M으로 나타낼 수 있음)는 당업자에게 공지된 어떠한 적합한 지지 물질이라도 포함하거나 이루어질 수 있다. 당해 물질은 가용성 또는 불용성, 입상 또는 비입상이거나, 섬유 및 막을 포함하는 일체식 구조를 갖거나, 다공성 또는 비다공성일 수 있다. 이는 접촉 용액 중의 용질로부터 본 발명의 리간드를 분리하는 편리한 수단을 제공한다. 지지 물질의 예는 탄수화물 및 가교결합된 탄수화물 매트릭스, 예를 들면, 아가로스, 세파로스, 세파덱스, 셀룰로스, 덱스트란, 전분, 알기네이트 또는 카라기난; 합성 중합체 매트릭스, 예를 들면, 폴리스티렌, 스티렌-디비닐벤젠 공중합체, 폴리아크릴레이트, PEG 폴리아크릴레이트 공중합체, 폴리메타크릴레이트(예: 폴리(하이드록시에틸메타크릴레이트)), 폴리비닐 알콜, 폴리아미드 또는 퍼플루오로카본; 무기 매트릭스, 예를 들면, 유리, 실리카 또는 금속 옥사이드; 및 복합 물질을 포함한다.
친화성 매트릭스는 적합한 지지 물질의 매트릭스를 제공하고, 화학식 I(화학식 Ia, Ib 및 Ic 및/또는 화학식 II를 포함하고/하거나 여기에 화학식 III의 구조 성분을 가짐)의 리간드를 이에 결합시켜 제조한다. 화학식 I의 리간드를 지지 물질에 결합시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본원은 따라서 화학식 I(화학식 Ia, Ib 및 Ic 및/또는 화학식 II를 포함하고/하거나 여기에 화학식 III의 구조 성분을 가짐)의 리간드의 용도를 포함하며; 여기서, L, Sp, SpP, Am, Ar1 Ar2, R1 및/또는 v는 화학식 I, Ia, Ib, Ic, II 및/또는 III과 관련하여 정의하고/하거나, 바람직하게는 화학식 I, Ia, Ib, Ic, II, 보다 바람직하게는 화학식 II에 정의된 바와 같은 리간드 치환된 매트릭스의 제조/합성에 대하여, 특히 바람직한 양태와 관련하여 본 명세서에 정의한 바와 같은 의미를 갖는다.
본 발명은 또한 단백질의 친화성 정제, 바람직하게는 친화 크로마토그래피 방법에 관한 것이며; 여기서 정제되는 단백질은 위에서 기재한 바와 같은 리간드 치환된 매트릭스와 접촉된다.
용어 "친화성 정제"(이는 용어 "친화성 분리"와 상호 교환적으로 사용됨)는 화학식 I의 리간드에 의한 단백질의 분자 인식을 수반하는 모든 분리 기술을 말한다. 리간드는 이후의 리간드-항체 착체의 분리를 용이하게 하는 고체 지지 물질 상에 고정화시킬 수 있다. 분리 기술은 이들로 제한되지는 않지만, 팩킹 컬럼, 일체식 구조 또는 막 상의 친화 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 당해 용어는 배치-방식의 흡착 또는 친화성 침전을 추가로 포함한다.
플레버(flavor)와는 독립적으로, 정제 기술은 리간드가 조 항체와 접촉하는 초기 인식 상에 의하여 구성된다. 제2 상에서는, 불순물이 리간드-항체 착체로부터 분리되거나(예: 컬럼 크로마토그래피) 리간드-항체 착체가 불순물로부터 분리된다(예: 친화성 침전). 제3 단계에서, 항체는 pH 변화와 같은 화학적 및/또는 물리적 조건의 변경, 이온 강도 및/또는 유기 용매, 세제 또는 카오트로프와 같은 개질제의 첨가에 의하여 리간드-항체 착체로부터 방출된다.
이제, 본 발명을 다음 실시예에 의하여 예시하며, 당해 실시예는 본 발명을 제한하는 것으로 해석하지 않는다.
명세서에 인용된 문헌:
1. A.Cecilia, A.Roque, C.R. Lowe, M.A. Taipa: Antibodies and Genetically Engineered Related Molecules: Production and Purification, Biotechnol. Prog. 2004, 20, 639-654
2. K.L.Carson: Flexibility-the guiding principle for antibody manufacturing, Nature Biotechnology, 2005, 23, 1054-1058; S.Hober, K.Nord, M. Linhult: Protein A chromatography for antibody purification, J. Chromatogr. B. 2007, 848, 40-47
3. T.Arakawa, Y.Kita, H.Sato, D. Ejima, Protein Expression and Purification. 2009, 63, 158-163
4. S. Ghose, B. Hubbard, S.M. Cramer, Journal of Chromatography A, 2006, 1122, 144-152
실시예
물질 및 방법
달리 명시되지 않는 한, 모든 화학 약품 및 용매는 실시예 1을 제외하고는, 분석 등급을 가졌다. 실시예 1에 사용된 시약은 입상 요건 및 유용성에 따라, 제조 등급 내지 분석 등급을 가졌다.
평균 기공 크기가 0.45㎛인 친수성 막 필터를 갖는 96 및 384-웰 필터 플레이트를 팔 게엠베하(Pall GmbH, Dreieich/Germany)로부터 구매하였다. 평균 기공 크기가 10㎛인 폴리에틸렌으로 제조한 상부 프리트(frits)를 포렉스(Porex, Bautzen/Germany)에서 제공받았다. 분별 수집 및 분석 검정을 위한 일반적인 목적의 마이크로티터플레이트를 그라이너 바이오 원 게엠베하(Greiner Bio One GmbH, Frickenhausen/Germany)로부터 주문하였다. 분석 검정을 베엠게 라브테크 게엠베하(BMG Labtech GmbH, Offenburg/Germany)로부터의 플루오스타 갤럭시 플레이트 판독기(Fluostar Galaxy plate reader)를 사용하여 판독하였다.
항체 단편의 정제 및 항체를 사용한 컬럼 크로마토그래피를 워터스 HPLC 시스템(Waters HPLC system, Waters GmbH, Eschborn/Germany)에서 수행하였다. 옴니피트 컬럼 하우징스(Omnifit column housings, Diba Industries Ltd, Cambridge/United Kingdom)를 컬럼의 팩킹을 위하여 사용하였다. NHS-활성화 세파로즈(Sepharose) 4 FF, r단백질 A 세파로즈 FF 및 수퍼덱스(Superdex) 70 크로마토그래피 매질을 GE 헬스케어(GE Healthcare, Uppsala/Sweden)로부터 구입하였다. 마브소번트(Mabsorbent) A2P HF를 프로메틱 라이프 사이언스(Prometic Life Sciences, Cambridge/United Kingdom)로부터, MEP 하이퍼셀(MEP Hypercel)을 팔 코포레이션(Pall Corporation, Port Washington NY, USA)으로부터 구입하였다.
리간드의 분석 크로마토그래피를 다이오드 어레이 검출기 및 단일-쿼드 질량 분광계를 포함하는 시마즈 HPLC 시스템(Shimadzu HPLC system, Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg/Germany)에서 수행하였다. 일체식 C18 역상 컬럼을 메르크 카게아아(Merck KGaA, Darmstadt/Germany)로부터 구입하였다. 분석에 사용된 용매는 질량 분광계 등급을 가졌다.
본 발명에 사용된 항체는 베박시주마브(Avastin, F. Hoffmann-La Roche, Switzerland), 토실리주마브(RoActemra, F. Hoffmann-La Roche, Switzerland), 팔리비주마브(Synagis, Abbott, USA), 세툭시마브(Erbitux, Merck Serono GmbH, Germany) 및 사람 혈청으로부터의 폴리-IgG(Sigma-Aldrich, USA)였다.
단백질 A 크로마토그래피로부터의 통과액(Flowthrough)(숙주 세포 단백질이라고 함)을 무혈청 배지 중의 항체 생성 CHO 세포 배양물의 상청액으로부터 유도하였다.
브래드포드(Bradford) 검정을 위한 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue) 염료 시약을 써모 사이언티픽(Thermo Scientific, Bonn/Germany)으로부터 구입하였다.
실시예 1: 리간드의 합성
일반 과정 A: 극초단파( microwave irradiation 조사하에 카복실산을 방향족 아민에 커플링시킴 ; 탈보호 . (3급 부톡시카보닐아미노)알킬 또는 (3급 부톡시카보닐아미노)알콕시-알콕시-알킬 치환된 방향족 카복실산(0.1 내지 0.5mmol, 통상적으로 0.1mmol) 및 HATU(카복실산에 대하여 1당량)를 아세토니트릴(1 내지 5㎖, 통상적으로 1㎖) 및 DIPEA(카복실산에 대하여 2당량)에 용해시켰다. 5 내지 10분(통상적으로 10분) 동안 교반(agitating) 후, 용액을 극초단파 바이얼 중의 방향족 아민(카복실산에 대하여 1당량)에 가하였다. 아르곤으로 플러슁한 후, 바이얼을 밀봉하고, 혼합물을 극초단파 조사하에 100 내지 120℃(통상적으로 120℃)로 60 내지 90분(통상적으로 90분) 동안 가열하였다. 작은 샘플을 꺼내어 HPLC-MS 분석시켰다. 반응이 완료되면(즉, 활성 에스테르가 HPLC-MS 중에서 가시적임), 혼합물을 후처리하였다. 활성 에스테르와 방향족 아민이 둘 다 검출 가능한 경우, 가열을 12시간 이하 동안 지속하였다. 미반응 활성 에스테르가 검출되고 잔여 방향족 아민이 검출되지 않은 경우, 미세량의 아세토니트릴(통상적으로 0.5㎖) 중의 과량의 방향족 아민(통상적으로 카복실산에 대하여 0.5당량)을 가하고, 활성 에스테르의 완전한 소비까지 가열을 지속하였다.
대부분의 경우, 생성물이 반응 혼합물의 냉각시 실온으로 거의 정량적으로 침전되었다. 이러한 경우, 고체를 분리하고, 에틸 아세테이트(1회 내지 2회, 통상적으로 1회) 또는 메탄올(1회)로 세척한 후, TBME(1회)로 세척하고, 질소 스트림으로 조심스럽게 건조시켰다.
생성물이 침전되지 않거나, 부분적으로만 침전되는 경우, 용매를 질소 스트림으로 제거하였다. 잔사를 수성 시트르산(5%)으로 처리한 후, 에틸 아세테이트로 다중 추출하였다. 결합된 유기 층을 물로 세척하고, 건조 상태로 증발시켰다.
모든 경우, 3급 부톡시카보닐 보호 그룹의 탈보호를 잔사를 통상적으로 1시간 동안 디클로로메탄(통상적으로 2㎖) 및 트리플루오로아세트산(통상적으로 1㎖)으로 처리한 후, 용매를 완전히 증발시켜 달성하였다. 조 생성물을 제조 역상 HPLC-MS(아세토니트릴/물 구배 용출) 또는 플래쉬 컬럼(flash column) 크로마토그래피(아미노 관능화 고정 상, 메탄올/디클로로메탄 구배 용출)에 의하여 정제하였다.
Figure pct00074
3-아미노-4-[(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)아미노]벤조산의 합성: 디옥산(5㎖) 중의 N-3급 부톡시카보닐-1,3-디아미노프로판(5mmol)과 DIPEA(10mmol)를 디옥산(5㎖) 중의 4-플루오로-3-니트로벤조산(5mmol)에 가하였다. 혼합물을 90분 동안 가열하여 환류시키고, 후속적으로, 용매를 진공하에 제거하고, 잔사를 수성 시트르산(5%)으로 처리하고, 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 물로 세척하고, 건조 상태로 증발시키고, 에틸 아세테이트로 동시증발시키고, 잔사를 고진공하에 건조시켰다.
잔사에 활성탄 상의 팔라듐(5%, 50% 물로 습윤화; Degussa Type E 101 NO/W; 50㎎) 및 메탄올(20㎖)을 아르곤하에 가하였다. 트리에틸실란(4㎖)을 10분에 걸쳐 적가(dropwise)하였다. 후속적으로, 혼합물을 셀라이트를 통하여 여과하고, 여액을 건조 상태로 증발시키고, 잔사를 고진공하에 건조시키고, 추가로 정제하지 않고 사용하였다. 반응을 성공적으로 수 회 반복하였다.
Figure pct00075
1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산의 합성: 트리메틸오르토포르메이트(10㎖)를 위에서 기재한 과정에 의하여 수득한 완전한 양의 3-아미노-4-[(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)아미노]벤조산에 가하였다. 혼합물을 35분 동안 가열하여 환류시키고, 이 때 용매를 제거하고, 잔사를 고진공하에 건조시키고, 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(SiO2 고정 상, 메탄올/디클로로메탄 구배 용출)로 정제하여, 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산을 연한 갈색 고체로서 제공하였다.
Figure pct00076
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(3-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L46)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-4-(3-피리딜)티아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 379 (M+1).
Figure pct00077
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(4-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L47)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-4-(4-피리딜)티아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 379 (M+1).
Figure pct00078
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(2-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L23)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-4-(2-피리딜)티아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 379 (M+1).
Figure pct00079
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L05)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸 로부터 제조하였다. ESI-MS: 369 (M+1).
Figure pct00080
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(6-메틸피리다진-3-일) 아미드(L34)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 3-아미노-6-메틸피리다진으로부터 제조하였다. ESI-MS: 311 (M+1).
Figure pct00081
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(3-메틸-1,2,4-티아디아졸-5-일) 아미드(L36)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 5-아미노-3-메틸-1,2,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 317 (M+1).
Figure pct00082
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(1,3,4-티아디아졸-2-일) 아미드(L13)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-1,3,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 303 (M+1).
Figure pct00083
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(4-피리딜)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L21)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-5-(4-피리딜)-1,3,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 380 (M+1).
Figure pct00084
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(2-메틸-1,3,4-티아디아졸-5-일) 아미드(L14)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-5-메틸-1,3,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 317 (M+1).
Figure pct00085
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(3-페닐-1,2,4-티아디아졸-5-일) 아미드(L22)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 5-아미노-3-페닐-1,2,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 379 (M+1).
Figure pct00086
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(2-사이클로프로필-1,3,4-티아디아졸-5-일) 아미드(L35)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-5-사이클로프로필-1,3,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 343 (M+1).
Figure pct00087
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(1-메틸-3-인다졸릴) 아미드(L02)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 3-아미노-1-메틸인다졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 349 (M+1).
Figure pct00088
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[2-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-1,3,4-티아디아졸-5-일] 아미드(L09)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-5-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-1,3,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 423 (M+1).
Figure pct00089
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(벤조티아졸-2-일) 아미드(L10)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노벤조티아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 352 (M+1).
Figure pct00090
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(2-에틸티오-1,3,4-티아디아졸-5-일) 아미드(L12)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-5-에틸티오-1,3,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 363 (M+1).
Figure pct00091
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(4-메틸티아졸-2-일) 아미드(L15)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-4-메틸티아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 316 (M+1).
Figure pct00092
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(2-페닐-1,3,4-티아디아졸-5-일) 아미드(L33)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-5-페닐-1,3,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 379 (M+1).
Figure pct00093
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(5-메틸-1-페닐피라졸-3-일) 아미드(L11)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 3-아미노-5-메틸-1-페닐피라졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 375 (M+1).
Figure pct00094
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(티아졸-2-일) 아미드(L16)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노티아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 302 (M+1).
Figure pct00095
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(5-메틸티아졸-2-일) 아미드(L17)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-5-메틸티아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 316 (M+1).
Figure pct00096
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(2-에틸-1,3,4-티아디아졸-5-일) 아미드(L07)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-5-에틸-1,3,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 331 (M+1).
Figure pct00097
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(벤즈옥사졸-2-일) 아미드(L08)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노벤즈옥사졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 336 (M+1).
Figure pct00098
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(5,6-디하이드로-(4H)-사이클로펜타티아졸-2-일) 아미드(L32)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-5,6-디하이드로-(4H)-사이클로펜타티아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 342 (M+1).
Figure pct00099
1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산의 합성: 디옥산(2㎖) 중의 3-아미노-4-[(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)아미노]벤조산(합성, 상기 참조; 0.5mmol)에 트리메틸오르토아세테이트(2mmol)를 유리 바이얼(vial) 속에서 가하였다. 바이얼을 밀폐하고, 혼합물을 100℃로 1시간 동안 가열하고, 이 때 용매를 증발시켰다. 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(SiO2 고정 상, 메탄올/디클로로메탄 구배 용출)로 정제하여, 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산을 연한 갈색 고체로서 제공하였다.
Figure pct00100
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(2-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L42)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-4-(2-피리딜)티아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 393 (M+1).
Figure pct00101
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L39)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 383 (M+1).
Figure pct00102
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(4-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L51)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-4-(4-피리딜)티아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 393 (M+1).
Figure pct00103
1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)-2-메톡시벤즈이미다졸-5-카복실산의 합성: 디옥산(2㎖) 중의 3-아미노-4-[(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)아미노]벤조산(합성, 상기 참조; 0.5mmol)에 테트라메틸오르토카보네이트(2mmol)를 유리 바이얼 속에서 가하였다. 바이얼을 밀폐하고, 혼합물을 100℃로 1시간 동안 가열하고, 이 때 용매를 증발시켰다. 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(SiO2 고정 상, 메탄올/디클로로메탄 구배 용출)로 정제하여, 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)-2-메톡시벤즈이미다졸-5-카복실산을 연한 갈색 고체로서 제공하였다.
Figure pct00104
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메톡시벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티 아 디아졸-2-일] 아미드( L45 )의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)-2-메톡시벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸로부터 제조하였다(보호 그룹 분열을 저농도의 트리플루오로아세트산 및 최소의 반응 시간으로 수행하여 산성 분열/메톡시 그룹의 가수분해를 피하였다). ESI-MS: 399 (M+1).
Figure pct00105
1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노 -1-프로필)-2- 에틸벤즈이미다졸 -5- 카복실산의 합성: 디옥산(2㎖) 중의 3-아미노-4-[(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)아미노]벤조산(합성, 상기 참조; 0.5mmol)에 트리에틸오르토프로피오네이트(2mmol)를 유리 바이얼 속에서 가하였다. 바이얼을 밀폐하고, 혼합물을 100℃로 1시간 동안 가열하고, 이 때 용매를 증발시켰다. 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(SiO2 고정 상, 메탄올/디클로로메탄 구배 용출)로 정제하여, 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산을 연한 갈색 고체로서 제공하였다.
Figure pct00106
1-(3-아미노-1-프로필)-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(2-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L43)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-4-(2-피리딜)티아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 407 (M+1).
Figure pct00107
1-(3-아미노-1-프로필)-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L44)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 397 (M+1).
Figure pct00108
1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)-2-옥소-2,3-디하이드로벤즈이미다졸-5-카복실산의 합성: 디클로로메탄(2㎖) 중의 3-아미노-4-[(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)아미노]벤조산(합성, 상기 참조; 0.2mmol)에 DIPEA(1mmol) 및 클로로트리메틸실란(0.6mmol)을 가하였다. 5분 동안 교반 후, 디클로로메탄(1㎖) 중의 비스(트리클로로메틸)카보네이트(0.1mmol)의 용액을 적가하고, 5분 동안 교반을 지속하였다. 포화 수성 중탄산나트륨(200㎕)을 가하고, 혼합물을 2분 동안 진탕시킨 다음, 수성 시트르산(5%)을 가하고, 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 디클로로메탄으로 다시 한번 추출하고, 합한 유기 층을 수성 시트르산(5%)과 물로 세척한 후, 형성된 현탁액을 건조 상태로 증발시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트(1㎖) 및 TBME(0.5㎖)로 추출한 후, TBME로 추가로 추출하였다. 합한 유기 층을 건조 상태로 증발시키고, 고진공하에 건조시켰다. 조 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)-2-옥소-2,3-디하이드로벤즈이미다졸-5-카복실산을 추가로 정제하지 않고 사용하였다.
Figure pct00109
1-(3-아미노-1-프로필)-2-옥소-2,3-디하이드로벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L24)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)-2-옥소-2,3-디하이드로벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 385 (M+1).
Figure pct00110
1-(3-3급 부톡시카보닐아미노-1-프로필)-2,3-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로퀴녹살린-6-카복실산의 합성: 디클로로메탄(2㎖) 중의 3-아미노-4-[(3-3급 부틸옥시카보닐아미노-1-프로필)아미노]벤조산(합성, 상기 참조; 0.2mmol)에 DIPEA(1mmol) 및 클로로트리메틸실란(0.6mmol)을 가하였다. 5분 동안 교반 후, 디클로로메탄(1㎖) 중의 옥살릴 클로라이드(0.3mmol)의 용액을 적가하고, 5분 동안 교반을 지속하였다. 포화 수성 중탄산나트륨(200㎕)을 가하고, 혼합물을 2분 동안 진탕시킨 다음, 수성 시트르산(5%)을 가하고, 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 디클로로메탄으로 다시 한번 추출하고, 합한 유기 층을 수성 시트르산(5%) 및 물로 세척한 후, 형성된 현탁액을 건조 상태로 증발시켰다. 잔사를 고진공하에 건조시켰다. 조 1-(3-3급 부톡시카보닐아미노-1-프로필)-2,3-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로퀴녹살린-6-카복실산을 추가로 정제하지 않고 사용하였다.
Figure pct00111
1-(3-아미노-1-프로필)-2,3-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로퀴녹살린-6-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일]아미드(L28)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-(3-3급 부톡시카보닐아미노-1-프로필)-2,3-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로퀴녹살린-6-카복실산 및 2-아미노-5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 413 (M+1).
Figure pct00112
1-아미노-8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사옥탄의 합성: 1,8-디아미노-3,5-디옥사옥탄(135mmol)을 디클로로메탄(100㎖)에 용해시켰다. 디클로로메탄(50㎖) 중의 디-3급 부틸디카보네이트(45mmol)의 용액을 교반하면서 서서히 가하였다. 1시간 후 용매를 제거하고, 잔사를 에틸 아세테이트(200㎖)로 희석하고, 수성 탄산나트륨(10%)으로 3회 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 건조 상태로 증발시켰다. 고진공하에 무색 오일을 건조시킨 후, 조 생성물을 추가로 정제하지 않고 사용하였다.
Figure pct00113
4-아미노-3-[8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사-1-옥틸]아미노벤조산의 합성: 1-아미노-8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사옥탄(6mmol) 및 DIPEA(10mmol)를 디옥산(5㎖)에 용해시켰다. 디옥산(5㎖) 중의 4-플루오로-3-니트로벤조산(5mmol)의 용액을 가하고, 혼합물을 가열하여 2시간 동안 환류시키고, 이 때 디옥산(2㎖) 중의 1-아미노-8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사옥탄(2mmol)의 또 다른 부분을 가하고, 가열을 1시간 동안 지속하였다. 용매를 증발시키고, 잔사를 에틸 아세테이트(50㎖)에 용해시키고, 수성 시트르산(5%) 및 물로 세척하였다. 용매를 제거하고, 잔사를 고진공하에 건조시켰다.
잔사에 아르곤하에 활성탄 상의 팔라듐(5%, 50% 물로 습윤화시킴; Degussa Type E 101 NO/W; 50㎎) 및 메탄올(20㎖)을 가하였다. 트리에틸실란(4㎖)을 10분에 걸쳐 적가하였다. 20분 동안 교반 후, 추가의 트리에틸실란(1㎖)을 2분에 걸쳐 가한 다음, 교반을 10분 동안 지속하였다. 후속적으로, 혼합물을 셀라이트를 통하여 여과하고, 여액을 건조 상태로 증발시키고, 잔사를 고진공하에 건조시키고, 추가로 정제하지 않고 사용하였다. 합성을 성공적으로 수 회 반복하였다.
Figure pct00114
1-[8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사-1-옥틸]벤즈이미다졸-5-카복실산의 합성: 4-아미노-3-[8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사-1-옥틸]아미노벤조산(합성, 상기 참조; 하나의 완전한 배치(batch)의 물질을 사용하였음)을 트리메틸오르토포르메이트(5㎖)에 용해시키고, 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(SiO2 고정 상, 메탄올/디클로로메탄 구배 용출)로 정제하여, 1-[8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사-1-옥틸]벤즈이미다졸-5-카복실산을 연한 갈색 고체로서 제공하였다.
Figure pct00115
1-(8-아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L25)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-[8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사-1-옥틸]벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 443 (M+1).
Figure pct00116
1-(8-아미노-3,5- 디옥사 -1- 옥틸 ) 벤즈이미다졸 -5- 카복실산 N-[4-(2- 피리딜 )티아졸-2-일] 아미드( L41 )의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-[8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사-1-옥틸]벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-4-(2-피리딜)티아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 453 (M+1).
Figure pct00117
1-(8-아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(4-메틸티아졸-2-일) 아미드(L29)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-[8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사-1-옥틸]벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-4-메틸티아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 390 (M+1).
Figure pct00118
1-(8-아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(1,3,4-티아디아졸-2-일) 아미드(L27)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-[8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사-1-옥틸]벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-1,3,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 377 (M+1).
Figure pct00119
1-(8-아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 아미드(L26)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-[8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사-1-옥틸]벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-5-메틸-1,3,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 391 (M+1).
Figure pct00120
1-[8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사-1-옥틸]-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산의 합성: 4-아미노-3-[8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사-1-옥틸]아미노벤조산(합성, 상기 참조; 하나의 완전한 배치의 물질을 사용함)을 디옥산(20㎖)에 용해시키고, 트리메틸오르토아세테이트(20mmol)로 처리하고, 1시간 동안 가열하여 환류시켰다. 용매를 증발시키고, 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(SiO2 고정 상, 메탄올/디클로로메탄 구배 용출)로 정제하여, 1-[8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사-1-옥틸]-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산을 연한 갈색 고체로서 제공하였다.
Figure pct00121
1-(8-아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L49)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-[8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사-1-옥틸]-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 457 (M+1).
Figure pct00122
1-(8-아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(4-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L52)의 합성: 일반 과정 A에 따라 1-[8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사-1-옥틸]-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 및 2-아미노-4-(4-피리딜)티아졸로부터 제조하였다. ESI-MS: 467 (M+1).
Figure pct00123
(S)-글루탐산 N,N'-비스{8-{5-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일 카바모 일] 벤즈이미다졸 -1-일}-3,5- 디옥사 -1- 옥틸 } 아미드( L53 )의 합성: 1-(8-아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L25)를 500μmol 규모로 제조하였다(합성, 상기 참조; 크로마토그래피 정제를 적용하지 않음). 조 아민 트리플루오로아세테이트 염을 DMF(1㎖) 및 DIPEA(3mmol)로 처리하였다. N-3급 부톡시카보닐글루탐산(0.2mmol), HATU(0.4mmol) 및 DIPEA(1mmol)를 DMF(1㎖)에 용해시켰다. 5분 후 혼합물을 위에서 제조한 용액에 가하였다. 20분 후, TBME(2㎖)를 가하고, 혼합물을 약 1시간 동안 방치하고, 이 때 두꺼운 침전물이 형성되어 이를 원심분리로 분리하고, 에틸 아세테이트 및 TBME로 세척하고, 질소 스트림으로 조심스럽게 건조시켰다. 수득한 고체를 디클로로메탄(2㎖) 및 트리플루오로아세트산(1㎖)으로 30분 동안 처리한 다음, 용매를 제거하고, 잔사를 제조 역상 HPLC-MS로 정제하였다. ESI-MS: 499 ((M+2)/2).
Figure pct00124
(S)-글루탐산 N,N'-비스{8-{5-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일카바모일]-2-메틸벤즈이미다졸-1-일}-3,5-디옥사-1-옥틸} 아미드(L54)의 합성: 1-(8-아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L49)를 500μmol 규모에서 제조하였다(합성, 상기 참조; 크로마토그래피 정제를 적용하지 않음). 조 아민 트리플루오로아세테이트 염을 DMF(1㎖) 및 DIPEA(3mmol)로 처리하였다. N-3급 부톡시카보닐글루탐산(0.2mmol), HATU(0.4mmol) 및 DIPEA(1mmol)를 DMF(1㎖)에 용해시켰다. 5분 후 혼합물을 위에서 제조한 용액에 가하였다. 20분 후, TBME(2㎖)를 가하고, 혼합물을 약 1시간 동안 방치하고, 이 때 두꺼운 침전물이 형성되어 이를 원심분리로 분리하고, 에틸 아세테이트 및 TBME로 세척하고, 질소 스트림으로 조심스럽게 건조시켰다. 수득한 고체를 디클로로메탄(2㎖) 및 트리플루오로아세트산(1㎖)으로 30분 동안 처리한 다음, 용매를 제거하고, 잔사를 제조 역상 HPLC-MS로 정제하였다. ESI-MS: 513 ((M+2)/2).
Figure pct00125
1-(8-아미노-3,5- 디옥사 -1- 옥틸 )-2-옥소-2,3- 디하이드로벤즈이미다졸 -5- 카복실산 N-[5-(2- 푸릴 )-1,3,4- 티아디아졸 -2-일] 아미드( L50 )의 합성: 4-아미노-3-[8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사-1-옥틸]아미노벤조산(1mmol; 합성, 상기 참조)을 디옥산(4㎖)에 용해시키고, 테트라메틸오르토카보네이트(4mmol)로 처리하고, 100℃로 1시간 동안 가열하였다. 용매를 증발시키고, 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(SiO2 고정 상, 메탄올/디클로로메탄 구배 용출)로 정제하여, 1-[8-(3급 부톡시카보닐)아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)-2-메톡시벤즈이미다졸-5-카복실산을 제공하였다.
카복실산(0.1mmol), HATU(0.1mmol) 및 DIPEA(0.2mmol)를 아세토니트릴(1㎖)에 용해시켰다. 10분 후, 용액을 2-아미노-5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸(0.1mmol)에 가하고, 혼합물을 극초단파 조사하에 120℃로 90분 동안 가열하였다. 실온으로 냉각 후, 침전물을 분리하고, TBME로 세척하고, 질소 스트림 중에서 조심스럽게 건조시키고, 트리플루오로아세트산(1㎖)으로 처리하였다. 용액을 극초단파 조사하에 100℃로 1시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각 후, 용매를 제거하고, 잔사를 제조 역상 HPLC-MS로 정제하여, 1-(8-아미노-3,5-디옥사-1-옥틸)-2-옥소-2,3-디하이드로벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드를 제공하였다. ESI-MS: 459 (M+1).
Figure pct00126
6-[(3-아미노-1-프로필)아미노]니코틴산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일]아미드(L19)의 합성: 6-클로로니코틴산(0.2mmol), HATU(0.2mmol) 및 DIPEA(0.4mmol)를 아세토니트릴(1㎖)에 용해시켰다. 1분 후 암적색 용액을 2-아미노-5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸(0.2mmol)에 가하고, 혼합물을 50℃로 5분 동안 가열하였다. 실온으로 냉각 후, 형성된 침전물을 분리하고, 에틸 아세테이트 및 TBME로 세척하고, 공기 중에서 건조시켰다. 후속적으로, 1,3-디아미노프로판(1㎖)을 가하고, 혼합물을 극초단파 조사하에 150℃로 1시간 동안 가열하였다. 질소 스트림으로 용매를 제거 후, 잔사를 제조 역상 HPLC-MS로 정제하였다. ESI-MS: 345 (M+1).
Figure pct00127
6-[(3-아미노-1-프로필)아미노]니코틴산 N-[4-(2-피리딜)티아졸-2-일]아미드(L40)의 합성: 6-클로로니코틴산(0.2mmol), HATU(0.2mmol) 및 DIPEA(0.4mmol)를 아세토니트릴(1㎖)에 용해시켰다. 1분 후 암적색 용액을 2-아미노-4-(2-피리딜)티아졸(0.2mmol)에 가하고, 혼합물을 50℃로 20분 동안 가열하였다. 실온으로 냉각 후, 용매를 증발시키고, 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키고, 수성 시트르산(5%), 포화 수성 탄산나트륨 및 물로 세척하였다. 용매의 증발 후, 1,3-디아미노프로판(1㎖)을 가하고, 혼합물을 극초단파 조사하에 100℃로 2시간 동안 가열하였다. 질소 스트림으로 용매를 제거 후, 잔사를 제조 역상 HPLC-MS로 정제하였다. ESI-MS: 355 (M+1).
Figure pct00128
2-클로로트리틸 폴리스티렌 수지에 결합된 3-아지도-1-프로필아민의 합성: 2-클로로트리틸 클로라이드(150μmol)로 예비가중된 폴리스티렌 수지를 3-아미노-1-프로판올(0.5㎖)에 이어서, 디클로로메탄(2㎖)으로 처리하였다. 슬러리를 30분 동안 교반한 다음, 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄(각각 3회)으로 완전히 세척하고, 공기 스트림 중에서 건조시켰다. 건조 수지에 디클로로메탄(2㎖), DIPEA(1mmol) 및 메탄설포닐 클로라이드(0.5mmol)를 가하였다. 실온에서 1시간 동안 진탕시킨 후, 수지를 디클로로메탄으로 3회 세척하고, 공기 스트림 중에서 건조시켰다. 건조 수지를 나트륨 아지드(1mmol)를 함유하는 유리 바이얼에 옮겼다. DMF(2㎖)를 가한 후, 바이얼을 밀폐하고, 혼합물을 60℃로 밤새 가열하였다. 수지를 물/메탄올 및 DMSO(각각 2회)로 세척하였다.
Figure pct00129
4-에티닐벤조산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일]아미드의 합성: 4-브로모벤조산(0.2mmol), HATU(0.2mmol) 및 DIPEA(0.4mmol)를 아세토니트릴(1㎖)에 용해시켰다. 5분 후 용액을 2-아미노-5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸(0.2mmol)에 가하였다. 혼합물을 극초단파 조사하에 100℃로 60분 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 침전물을 분리하고, 에틸 아세테이트 및 TBME로 세척하고, 질소 스트림으로 조심스럽게 건조시켰다.
고체를 테트라하이드로푸란(1㎖)에 현탁시키고, 극초단파 관 속에서 비스(트리페닐포스피닐)팔라듐-(II) 디클로라이드(5μmol), 트리페닐포스핀(15μmol) 및 요오드화구리(I)(15μmol)에 가하였다. 관을 아르곤으로 플러슁하면서, 초음파를 적용한 다음, 이를 밀봉시켰다. 트리에틸아민(0.5㎖) 및 에티닐트리이소프로필실란(0.5mmol)을 가한 후, 바이얼을 아르곤으로 다시 플러슁하고, 극초단파 조사하에 100℃로 3시간 동안 가열하였다. 후속적으로, 모든 휘발성 성분들을 질소 스트림으로 증발시켰다. 잔사를 테트라하이드로푸란(1㎖), 물(10㎕) 및 테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드 용액(THF 중의 1M, 0.5㎖)으로 처리하였다. 혼합물을 15분 동안 교반한 다음, 용매를 증발시키고, 짧은 SiO2 컬럼에 흡착시키고 이로부터 용출시켜(에틸 아세테이트/메탄올로 용출, 약 4:1) 잔사를 주요 부산물로부터 분리하였다. 용매를 증발시킨 후, 생성물을 진공하에 건조시키고, 추가로 정제하지 않고 사용하였다.
Figure pct00130
6-[1-(3-아미노-1-프로필) 트리아졸 -4-일]벤조산 N-[5-(2- 푸 릴)-1,3,4- 티아디아졸 -2-일]아미드( L48 )의 합성: 2-클로로트리틸 폴리스티렌 수지에 결합된 3-아지도-1-프로필아민(150μmol; 합성, 상기 참조)에 요오드화구리(I)(3㎎)를 가하였다. 위에서 수득한 완전한 양의 4-에티닐벤조산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일]아미드를 DMSO(2㎖)에 용해시키고, 수지에 가하였다. 아르곤으로 플러슁한 후, 혼합물을 밤새 60℃에서 교반하였다. 후속적으로, 수지를 DMF, 물, 메탄올 및 디클로로메탄(각각 3회)으로 세척하고, 건조시켰다. 생성물을 트리플루오로아세트산, 디클로로메탄 및 트리에틸실란(45:45:10)으로 2배 처리하여 지지체로부터 분열시킨 후, 디클로로메탄으로 세척하였다. 용매를 증발시킨 후, 조 생성물을 제조 역상 HPLC-MS로 정제하였다. ESI-MS: 396 (M+1).
Figure pct00131
2-(5-아미노-1- 펜틸 )-1- 메틸벤즈이미다졸 -5- 카복실산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4- 티아디아졸 -2-일]아미드( L31 )의 합성: 4-메틸아미노-3-니트로벤조산(0.2mmol), HATU(0.2mmol) 및 DIPEA(0.4mmol)를 아세토니트릴(1㎖)에 현탁시키고, 5분 동안 교반한 다음, 현탁액을 2-아미노-5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸(0.2mmol)에 가하였다. 혼합물을 100℃로 20분 동안 가열한 다음, DMSO(0.1㎖) 및 아세토니트릴(1㎖)을 가하고, 가열을 1시간 동안 지속하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 침전물을 회수하고, 에틸 아세테이트로 2회 세척하고, 질소 스트림으로 조심스럽게 건조시켰다.
활성탄 상의 팔라듐 및 트리에틸실란을 사용한 니트로 그룹의 환원에 대한 시도가 실패함 따라, 잔사를 피리딘(1㎖) 중의 염화주석(II)(1mmol) 및 물(50㎕)로 100℃에서 30분 동안 처리하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 고체를 여과하고, 메탄올로 완전히 씻어내었다. 용매를 증발시키고, 잔사를 에틸 아세테이트에 현탁시켰다. 현탁액을 물로 3회 세척하고, 건조 상태로 증발시켰다.
6-(3급 부톡시카보닐아미노)헥산산(0.2mmol), HATU(0.2mmol) 및 DIPEA(0.4mmol)를 아세토니트릴(1㎖)에 용해시켰다. 2분 후, 용액을 위에서 수득한 잔사에 가하고, 혼합물을 실온에서 75분 동안 교반하고, 이 때 형성된 두꺼운 침전물을 분리하고, 에틸 아세테이트로 2회 세척하고, 질소 스트림으로 조심스럽게 건조시켰다. 트리플루오로아세트산(1㎖)을 가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 혼합물을 건조 상태로 증발시키고, 잔사를 제조 역상 HPLC-MS로 정제하였다. ESI-MS: 411 (M+1).
Figure pct00132
5-아미노-1-(3-3급 부톡시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸의 합성: 3-(3급 부톡시카보닐아미노)-1-프로필아민(0.3mmol)과 DIPEA(0.5mmol)에 디옥산(1㎖) 중의 2,4-디니트로플루오로벤젠(0.25mmol)의 용액을 가하였다. 혼합물을 100℃로 25분 동안 가열한 다음, 용매를 증발시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키고, 수성 시트르산(5%) 및 물로 2회 세척하였다. 용매를 증발시키고, 잔사를 활성탄 상의 팔라듐(5%, 50% 물로 습윤화됨; Degussa Type E 101 NO/W; 10㎎) 및 메탄올(1㎖)로 처리하였다. 혼합물을 아르곤으로 플러슁하고, 트리에틸실란(0.6㎖)을 가하였다. 혼합물을 상청액이 탈색될 때까지 진탕시킨 다음, 트리메틸오르토포르메이트(1㎖)를 가하고, 혼합물을 아르곤 대기하에 80℃로 1시간 동안 가열하였다. 후속적으로, 현탁액을 메탄올로 씻겨진 셀라이트를 통하여 여과시켰다. 용매를 증발시키고, 잔사를 진공하에 건조시켰다.
Figure pct00133
1-(3-아미노-1-프로필)-5-[(이미다조-[2,1-b]티아졸-6-일)카복스아미도]벤즈이미다졸(L30)의 합성: 이미다조[2,1-b]티아졸-6-카복실산(0.25mmol), HATU(0.25mmol) 및 DIPEA(0.5mmol)를 아세토니트릴(1㎖)에 용해시키고, 10분 후 5-아미노-1-(3-3급 부톡시카보닐아미노-1-프로필)벤즈이미다졸(합성, 상기 참조; 하나의 전체 배치를 사용하였다)에 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 진탕시킨 다음, 용매를 증발시키고, 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키고, 수성 시트르산(5%), 수성 탄산나트륨 및 물로 세척하고, 건조 상태로 증발시켰다. 잔사에 디클로로메탄(2㎖)에 이어서 트리플루오로아세트산을 가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 이 때 용매를 증발시키고, 잔사를 제조 역상 HPLC-MS로 정제하였다. ESI-MS: 341 (M+1).
Figure pct00134
1-(3-아미노-1-프로필)-5-[(1-메틸인다졸-3-일)카복스아미도]벤즈이미다졸(L01)의 합성: 이미다조[2,1-b]티아졸-6-카복실산 대신 1-메틸인다졸-3-카복실산을 사용하여 1-(3-아미노-1-프로필)-5-[(이미다조-[2,1-b]티아졸-6-일)카바모일]벤즈이미다졸(L30)에 대하여 기재한 바와 같이 화합물을 제조하였다. ESI-MS: 349 (M+1).
Figure pct00135
4-[(3-아미노-1-프로필)아미노]-3- 니트로벤조산 N-[5-(2- 푸릴 )-1,3,4- 티아디아졸 -2-일]아미드( L18 )의 합성: 디옥산(2㎖) 중의 3-(3급 부톡시카보닐아미노)-1-프로필아민(0.3mmol), 4-플루오로-3-니트로벤조산(0.3mmol) 및 DIPEA(0.6mmol)를 100℃로 40분 동안 가열한 후, 용매를 증발시켰다. 잔사에 아세토니트릴(1㎖) 중 HATU(0.3mmol) 및 DIPEA(0.6mmol)를 가하고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 아세토니트릴(1㎖) 중의 2-아미노-5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸(0.3mmol)을 가한 후, 혼합물을 100℃로 20분 동안 가열하였다. 실온에서 냉각시, 고체가 침전하여 이를 회수하고, 에틸 아세테이트로 3회 세척하고, 질소 스트림으로 건조시켰다. 후속적으로, 디클로로메탄(2㎖) 및 트리플루오로아세트산(1㎖)을 가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하고, 이 때 용매를 증발시켰다. 잔사를 메탄올/디클로로메탄(트리에틸아민 1%를 함유) 구배를 사용한 NH2-개질된 고정 상에서의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. ESI-MS: 389 (M+1).
Figure pct00136
4-[(1-아미노-3-프로필)옥시]벤조산 N-[4-(2-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L38)의 합성: 2-클로로트리틸 클로라이드(150μmol)로 예비가중된 폴리스티렌 수지를 3-아미노-1-프로판올(0.5㎖)에 이어서 디클로로메탄(2㎖)으로 처리하였다. 슬러리를 30분 동안 교반한 다음, 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄(각각 3회)으로 완전히 세척하고, 질소 스트림 중에서 건조시켰다. 건조 수지에 트리페닐포스핀(1mmol) 및 메틸 4-하이드록시벤조에이트(1mmol)를 가하였다. 건조 테트라하이드로푸란(2㎖)을 가한 후, 혼합물을 수지가 충분히 팽윤할 때까지 교반하였다. 이어서, N,N'-아조디카복실산 디이소프로필 에스테르(1mmol)를 적가하고, 혼합물을 2시간 동안 진탕시켰다. 그 후, 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄(각각 3회)으로 세척하였다. 건조 수지를 유리 바이얼에 옮기고, 테트라하이드로푸란(2㎖), 메탄올(1㎖) 및 수성 수산화나트륨(2N, 1㎖)으로 처리하였다. 바이얼을 밀폐하고, 혼합물을 80℃로 3시간 동안 가열한 다음, 수지를 DMF, DMF 중의 아세트산(약 5%), DMF, 메탄올 및 디클로로메탄(각각 3회)으로 세척하였다.
수지를 NMP 중에서 팽윤시켰다. NMP(1㎖), HATU(0.2mmol) 및 DIPEA(0.4mmol)를 가한 후, 혼합물을 10분 동안 교반하고, 이 때 NMP(1㎖) 중의 2-아미노-4-(2-피리딜)티아졸(0.2mmol)을 가하였다. 바이얼을 아르곤으로 플러슁하고, 혼합물을 극초단파 조사하에 120℃로 90분 동안 가열하였다. 그 다음, 수지를 세척하고(DMF, 메탄올, 디클로로메탄, 각각 3회), 표적 화합물을 트리플루오로아세트산, 디클로로메탄 및 트리에틸실란(45:45:10)으로 2배 처리하여 지지체로부터 분열시킨 후, 디클로로메탄으로 씻어내었다. 용매를 증발시킨 후, 잔사를 제조 역상 HPLC-MS로 정제하였다. ESI-MS: 355 (M+1).
Figure pct00137
4-[(1-아미노-3-프로필)옥시]벤조산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L20)의 합성: 2-아미노-4-(2-피리딜)티아졸 대신 2-아미노-5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸을 사용하여, 4-(1-아미노-3-프로필옥시)벤조산 N-[4-(2-피리딜)티아졸-2-일] 아미드(L38)에 대하여 기재한 바와 같이 화합물을 제조하였다. ESI-MS: 345 (M+1).
Figure pct00138
4-(5-아미노-3-옥사-1-펜틸옥시)벤조산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드( L37 )의 합성: 2-클로로트리틸 클로라이드(150μmol)로 예비 가중된 폴리스티렌 수지를 아미노에톡시에탄올(0.5㎖)에 이어서 디클로로메탄(2㎖)으로 처리하였다. 슬러리를 30분 동안 교반한 다음, 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄(각각 3회)으로 완전히 세척하고, 고진공하에 건조하였다. 건조 수지에 트리페닐포스핀(1mmol) 및 메틸 4-하이드록시벤조에이트(1mmol)를 가하였다. 건조 테트라하이드로푸란(2㎖)을 가한 후, 혼합물을 수지가 충분히 팽윤될 때까지 교반하였다. 그 다음, N,N'-아조디카복실산 디이소프로필 에스테르(1mmol)를 적가하고, 혼합물을 2시간 동안 진탕시켰다. 그 후, 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄(각각 3회)으로 세척하였다. 건조 수지를 유리 바이얼로 옮기고, 테트라하이드로푸란(2㎖), 메탄올(1㎖) 및 수산화나트륨(2N, 1㎖)으로 처리하였다. 바이얼을 밀폐시키고, 혼합물을 60℃로 2시간 동안, 그리고 80℃로 30분 동안 가열한 다음, 수지를 DMF, DMF 중의 아세트산(약 5%), 메탄올 및 디클로로메탄(각각 3회)으로 세척하였다.
수지를 NMP에 팽윤시켰다. NMP(1㎖), HATU(0.2mmol) 및 DIPEA(0.4mmol)를 가한 후, 혼합물을 10분 동안 교반하고, 이 때 NMP(1㎖) 중의 2-아미노-5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸(0.2mmol)을 가하였다. 바이얼을 아르곤으로 플러슁하고, 혼합물을 극초단파 조사하에 120℃로 90분 동안 가열하였다. 그 다음, 수지를 세척하고(DMF, 메탄올, 디클로로메탄, 각각 3회), 표적 화합물을 트리플루오로아세트산, 디클로로메탄 및 트리에틸실란(45:45:10)으로 2배 처리하여 지지체로부터 분열시킨 후, 디클로로메탄으로 린싱하였다. 용매를 증발시킨 후, 잔사를 제조 역상 HPLC-MS로 정제하였다. ESI-MS: 375 (M+1).
Figure pct00139
4-(3-아미노-1-프로필)-7-[(1-메틸인다졸-3-일)카복스아미도]-2,3,4,5-테트라하이드로벤조[f][1,4]옥사제핀-5-온(L03)의 합성: 2-클로로트리틸 클로라이드 폴리스티렌 수지(150μmol)에 3-아미노프로판-1-올(1㎖) 및 디클로로메탄(1㎖)을 가하고, 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄(각각 3회)으로 세척하기 전에 혼합물을 20분 동안 교반하였다. 수지를 건조시키고, 디클로로메탄(1㎖) 중의 DIPEA(1mmol)로 처리한 후, 디클로로메탄(1㎖) 중의 메탄설포닐 클로라이드(0.5mmol)를 적가하였다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 진탕시킨 다음, 수지를 디클로로메탄으로 3회 세척하고, 건조시키고, 유리 바이얼로 옮기고, 100℃에서 2시간 동안 에탄올아민(1㎖) 및 NMP(1㎖)로 처리하였다. 후속적으로, 이를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄(각각 3회)으로 세척하였다.
NMP(1.5㎖) 중의 2-플루오로-5-니트로벤조산(200μmol) 및 TBTU(200μmol)를 DIPEA(400μmol)로 2분 동안 처리하였다. 후속적으로, 혼합물을 NMP-팽유된 수지에 가하고, 위에서 기재한 바와 같이 수지를 세척하기 전에 혼합물을 25분 동안 교반하였다. THF(2㎖), 메탄올(1㎖) 및 수성 NaOH(2M, 1㎖)를 가한 후, 수지를 3일 동안 교반한 후, 메탄올 및 디클로로메탄으로 완전히 세척하였다.
수지를 NMP(1.5㎖) 중의 피리딘(0.5㎖) 및 무수 염화주석(II)(1mmol)로 처리하고, 실온에서 5.5시간 동안 진탕시키고, 이 때 NMP(0.5㎖) 중의 염화주석(II)(0.5mmol)의 또 다른 부분을 가하였다. 혼합물은 밤새 진탕시킨 후, 메탄올로 세척하였다. 불용성 반응 부산물을 메탄올로 반복하여 조심스럽게 부유시켜 수지로부터 분리하였다. 디클로로메탄으로 세척 후, 수지를 NMP 중에서 팽윤시켰다. NMP(1.5㎖) 중의 1-메틸-3-인다졸카복실산(0.2mmol) 및 HATU(0.2mmol)를 DIPEA(0.4mmol)로 처리하고, 2분 후, 혼합물을 수지에 가하고, 5시간 동안 교반하였다. 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄(각각 3회)으로 완전히 세척하였다. 표적 화합물을 디클로로메탄 중의 트리플루오로아세트산(45%) 및 트리에틸실란(10%)으로 2배 처리하여 지지체로부터 분열시킨 후, 수지를 디클로로메탄으로 세척하였다. 용매를 증발시킨 후, 조 생성물을 제조 역상 HPLC-MS로 정제하였다. ESI-MS: 394 (M+1).
Figure pct00140
1-(3-아미노-1-프로필)인다졸-3-카복실산 N-(3-카바모일-4-메톡시페닐) 아미드(L04)의 합성: 9-플루오레닐메톡시카보닐 보호된 시버(Sieber) 아미드 링커로 예비 가중된 폴리스티렌 수지를 디클로로메탄에 이어서 DMF 중에서 팽윤시켰다. 수지를 피페리딘(DMF 중의 25%, 약 3㎖)으로 10분 동안 처리한 후, DMF, 메탄올 및 디클로로메탄(각각 3회)으로 세척하였다. 5-(9-플루오레닐메톡시카보닐)아미노-2-메톡시벤조산(0.2mmol) 및 HATU(0.2mmol)를 NMP(1.5㎖)에 용해시키고, DIPEA(0.4mmol)로 처리하였다. 2분 후, 용액을 수지에 가하고, 혼합물을 30분 동안 교반한 다음, 수지를 DMF로 3회 세척하였다. 피페리딘(DMF 중의 25%, 약 3㎖)을 가한 후, 혼합물을 15분 동안 교반하고, 후속적으로 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄(각각 3회)으로 세척하였다.
인다졸-3-카복실산(0.5mmol) 및 1-하이드록시벤조트리아졸(0.5mmol)을 NMP(1.5㎖)에 용해시키고, N,N'-디이소프로필 카보디이미드(0.5mmol)로 2분 동안 처리하고, 이 때 용액을 수지에 가하고, 혼합물을 세척 전 1시간 동안 진탕시켰다(DMF, 메탄올, 디클로로메탄, 각각 3회). 건조 후, 수지를 유리 바이얼로 옮기고, NMP 중의 1,3-디브로모프로판(1mmol) 및 DIPEA(1mmol)로 60℃에서 밤새 처리하였다. 반응을 100℃에서 4.5시간 동안 1회 반복하고, 이 때 수지를 세척하고(DMF, 메탄올, 디클로로메탄, 각각 3회), 유리 바이얼로 다시 옮겼다. 테트라하이드로푸란(2㎖) 및 농축 수성 암모니아(1㎖)를 가한 후, 바이얼을 밀폐하고, 혼합물을 50℃로 90분 동안 가열하였다. 추가의 수성 암모니아(1㎖)를 가한 후, 가열을 밤새 지속하였다. 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄(각각 3회)으로 세척 후, 생성물을 디클로로메탄, 트리플루오로아세트산 및 트리에틸실란(85:10:5)으로 3배 처리하여 수지로부터 분열시킨 후, 디클로로메탄으로 린싱하였다. 용매를 증발시킨 후, 잔사를 제조 역상 HPLC-MS로 정제하였다. ESI-MS: 368 (M+1).
Figure pct00141
1-(3-아미노-1-프로필) 벤조트리아졸 -5- 카복실산 N-(1- 메틸인다졸 -3-일) 아미드( L06 )의 합성: 디옥산(2㎖) 중의 3-(3급 부톡시카보닐아미노)-1-프로필아민(0.3mmol), 4-플루오로-3-니트로벤조산(0.3mmol) 및 DIPEA(0.6mmol)를 100℃로 1시간 동안 가열하고, 후속적으로 용매를 증발시켰다. 잔사에 수성 시트르산(5%)을 가하고, 혼합물을 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 포화 염화나트륨 수용액으로 2회 세척하고, 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 건조 상태로 증발시켰다. 이어서, 활성탄 상의 팔라듐(5%, 50% 물로 습윤됨; Degussa Type E 101 NO/W; 15㎎) 및 메탄올(2㎖)을 가한 후, 트리에틸실란(500㎕; 3분에 걸쳐 적가함)을 가하였다. 혼합물을 추가로 5분 동안 진탕시킨 후, 이를 셀라이트를 통하여 여과하고, 건조 상태로 증발시키고, 잔사를 밀폐된 유리 바이얼 속에서 60℃에서 밤새 DMF(2㎖) 및 이소펜틸 니트라이트(0.9mmol)로 처리하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 수성 시트르산(5%, 2㎖)을 가하고, 혼합물을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 포화 염화나트륨 수용액으로 3회 세척하고, 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 증발시키고, 진공하에 건조시켰다.
잔사를 디옥산(1㎖) 및 DIPEA(0.6mmol)에 용해시키고, 디옥산(1㎖) 중의 비스(트리클로로메틸) 카보네이트(0.1mmol)의 용액으로 실온에서 30분 동안 처리하였다. 후속적으로, 디클로로메탄(1㎖) 중의 3-아미노-1-메틸인다졸(0.3mmol)을 가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하고, 이 때 용매를 증발시키고, 잔사를 포화 탄산나트륨 수용액(2㎖)으로 처리하고, 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 수성 시트르산(5%) 및 포화 수성 탄산나트륨으로 2회 세척하고, 황산마그네슘으로 건조시키고, 셀라이트를 통하여 여과하고, 건조 상태로 증발시켰다.
잔사를 디클로로메탄(2㎖), 트리에틸실란(0.1㎖) 및 트리플루오로아세트산(1㎖)으로 실온에서 15분 동안 처리하였다. 이어서, 용매를 증발시키고, 잔사를 제조 역상 HPLC-MS로 정제하였다. ESI-MS: 350 (M+1).
Figure pct00142
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[3-(2-푸릴)-1,2,4-티아디아졸-5-일] 아미드(L55)의 합성: 일반 과정 A을 사용하여 합성을 수행한다. 카복실산 성분으로서 1-[3-(3급 부톡시카보닐)아미노-1-프로필]벤즈이미다졸-5-카복실산(합성, 상기 참조)을 사용한다. 방향족 아민으로서, 5-아미노-3-(2-푸릴)-1,2,4-티아디아졸을 사용한다.
Figure pct00143
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(3-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L56)의 합성: 일반 과정 A을 사용하여 합성을 수행한다. 카복실산 성분으로서 1-[3-(3급 부톡시카보닐)아미노-1-프로필]벤즈이미다졸-5-카복실산(합성, 상기 참조)을 사용한다. 방향족 아민으로서, 2-아미노-5-(3-푸릴)-1,3,4-티아디아졸을 사용한다.
Figure pct00144
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(2-푸릴)티아졸-2-일] 아미드(L57)의 합성: 일반 과정 A을 사용하여 합성을 수행한다. 카복실산 성분으로서 1-[3-(3급 부톡시카보닐)아미노-1-프로필]벤즈이미다졸-5-카복실산(합성, 상기 참조)을 사용한다. 방향족 아민으로서, 2-아미노-4-(2-푸릴)티아졸을 사용한다.
Figure pct00145
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)티아졸-2-일] 아미드(L58)의 합성: 일반 과정 A을 사용하여 합성을 수행한다. 카복실산 성분으로서 1-[3-(3급 부톡시카보닐)아미노-1-프로필]벤즈이미다졸-5-카복실산(합성, 상기 참조)을 사용한다. 방향족 아민으로서, 2-아미노-5-(2-푸릴)티아졸을 사용한다.
Figure pct00146
1-(3-아미노-1-프로필)벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[6-(2-푸릴)피리다진-3-일] 아미드(L59)의 합성: 일반 과정 A을 사용하여 합성을 수행한다. 카복실산 성분으로서 1-[3-(3급 부톡시카보닐)아미노-1-프로필]벤즈이미다졸-5-카복실산(합성, 상기 참조)을 사용한다. 방향족 아민으로서, 3-아미노-6-(2-푸릴)피리다진을 사용한다. 커플링 시간은 극초단파 조사하에 120℃에서 6-18시간으로 연장시킬 필요가 있다.
Figure pct00147
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[3-(2-푸릴)-1,2,4-티아디아졸-5-일] 아미드(L60)의 합성: 일반 과정 A을 사용하여 합성을 수행한다. 카복실산 성분으로서 1-[3-(3급 부톡시카보닐)아미노-1-프로필]-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산(합성, 상기 참조)을 사용한다. 방향족 아민으로서, 5-아미노-3-(2-푸릴)-1,2,4-티아디아졸을 사용한다.
Figure pct00148
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(3-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L61)의 합성: 일반 과정 A을 사용하여 합성을 수행한다. 카복실산 성분으로서 1-[3-(3급 부톡시카보닐)아미노-1-프로필]-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산(합성, 상기 참조)을 사용한다. 방향족 아민으로서, 2-아미노-5-(3-푸릴)-1,3,4-티아디아졸을 사용한다.
Figure pct00149
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(2-푸릴)티아졸-2-일] 아미드(L62)의 합성: 일반 과정 A을 사용하여 합성을 수행한다. 카복실산 성분으로서 1-[3-(3급 부톡시카보닐)아미노-1-프로필]-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산(합성, 상기 참조)을 사용한다. 방향족 아민으로서, 2-아미노-4-(2-푸릴)티아졸을 사용한다.
Figure pct00150
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)티아졸-2-일] 아미드(L63)의 합성: 일반 과정 A을 사용하여 합성을 수행한다. 카복실산 성분으로서 1-[3-(3급 부톡시카보닐)아미노-1-프로필]-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산(합성, 상기 참조)을 사용한다. 방향족 아민으로서, 2-아미노-5-(2-푸릴)티아졸을 사용한다.
Figure pct00151
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[6-(2-푸릴)피리다진-3-일] 아미드(L64)의 합성: 일반 과정 A을 사용하여 합성을 수행한다. 카복실산 성분으로서 1-[3-(3급 부톡시카보닐)아미노-1-프로필]-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산(합성, 상기 참조)을 사용한다. 방향족 아민으로서, 3-아미노-6-(2-푸릴)피리다진을 사용한다. 커플링 시간은 극초단파 조사하에 120℃에서 6-18시간으로 연장될 필요가 있다.
Figure pct00152
1-(3-아미노-1-프로필)-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[3-(2-푸릴)-1,2,4-티아디아졸-5-일] 아미드(L65)의 합성: 일반 과정 A을 사용하여 합성을 수행한다. 카복실산 성분으로서 1-[3-(3급 부톡시카보닐)아미노-1-프로필]-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산(합성, 상기 참조)을 사용한다. 방향족 아민으로서, 5-아미노-3-(2-푸릴)-1,2,4-티아디아졸을 사용한다.
Figure pct00153
1-(3-아미노-1-프로필)-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(3-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L66)의 합성: 일반 과정 A을 사용하여 합성을 수행한다. 카복실산 성분으로서 1-[3-(3급 부톡시카보닐)아미노-1-프로필]-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산(합성, 상기 참조)을 사용한다. 방향족 아민으로서, 2-아미노-5-(3-푸릴)-1,3,4-티아디아졸을 사용한다.
Figure pct00154
1-(3-아미노-1-프로필)-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[4-(2-푸릴)티아졸-2-일] 아미드(L67)의 합성: 일반 과정 A을 사용하여 합성을 수행한다. 카복실산 성분으로서 1-[3-(3급 부톡시카보닐)아미노-1-프로필]-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산(합성, 상기 참조)을 사용한다. 방향족 아민으로서, 2-아미노-4-(2-푸릴)티아졸을 사용한다.
Figure pct00155
1-(3-아미노-1-프로필)-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-푸릴)티아졸-2-일] 아미드(L68)의 합성: 일반 과정 A을 사용하여 합성을 수행한다. 카복실산 성분으로서 1-[3-(3급 부톡시카보닐)아미노-1-프로필]-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산(합성, 상기 참조)을 사용한다. 방향족 아민으로서, 2-아미노-5-(2-푸릴)티아졸을 사용한다.
Figure pct00156
1-(3-아미노-1-프로필)-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[6-(2-푸릴)피리다진-3-일] 아미드(L69)의 합성: 일반 과정 A을 사용하여 합성을 수행한다. 카복실산 성분으로서 1-[3-(3급 부톡시카보닐)아미노-1-프로필]-2-에틸벤즈이미다졸-5-카복실산(합성, 상기 참조)을 사용한다. 방향족 아민으로서, 3-아미노-6-(2-푸릴)피리다진을 사용한다. 커플링 시간은 극초단파 조사하에 120℃에서 6-18시간으로 연장될 필요가 있다.
Figure pct00157
4-[2-(3-아미노-1-프로필아미노)티아졸-4-일]벤조산 N-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L70)의 합성: 불용성 지지체 상에서 합성을 수행한다. 따라서, 1,3-디아미노프로판(150μmol)으로 예비 가중된 트리틸 폴리스티렌 수지를 1-메틸피롤리딘-2-온 또는 디클로로메탄(1-5㎖) 중의 N-(9-플루오레닐메톡시카보닐)이소시아네이트(150-500μmol)와 30분 내지 밤 새 반응시킨다. 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척한 후, 수지를 DMF(25%, 2-5㎖) 중의 피페리딘으로 10 내지 30분 동안 처리하고, 이 때 수지를 위에서 기재한 바와 같이 세척한다. 그 다음, 등몰량의 적합한 염기를 가한(DIPEA, N-메틸모르폴린, 트리에틸아민 또는 N,N-디메틸아닐린,) 1-메틸피롤리딘-2-온, 디메틸설폭사이드 또는 디클로로메탄(1-5㎖) 중의 4-브로모아세틸벤조산 메틸 에스테르(150-500μmol)을 가하고, 혼합물을 실온에서 30분 내지 밤새 교반하고, 이 때 수지를 위에서 기재한 바와 같이 세척한다. 그 다음, 수지를 수성 수산화나트륨(2-5M, 0.5-2㎖), 메탄올(0.5-2㎖) 및 테트라하이드로푸란(1-4㎖)의 혼합물로 처리하고, 40-70℃에서 1시간 내지 밤새 교반한 후, DMF, DMF 중의 아세트산(1-5%), 메탄올 및 디클로로메탄으로 반복하여 세척한다. 그 다음, NMP(1-3㎖)와 DIPEA(HATU의 양에 대하여 2당량) 중의 HATU(수지의 하중에 대하여 1-2당량)의 용액을 가하고, 혼합물을 2-10분 동안 교반하고, 이 때 2-아미노-5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸(HATU의 양에 대하여 1-2당량)을 가하고, 혼합물을 통상적인 가열에 의하여 또는 극초단파 조사에 의하여 100-120℃에서 30-180분 동안 가열한다. 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척한 후, 최종 생성물을 디클로로메탄 중의 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 처리하여 지지체로부터 분열시킨다. 용매를 증발시킨 후, 최종 생성물을 플래쉬플래쉬 크로마토그래피(아미노 개질된 고정 상, 메탄올/디클로로메탄 구배 용출) 또는 제조 역상 HPLC-MS으로 정제한다.
Figure pct00158
1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(5-이소옥사졸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L71), 1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(5-옥사졸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L72) 및 1-(3-아미노-1-프로필)-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산 N-[5-(2-옥사졸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일] 아미드(L73)의 합성: 화합물들을 일반 과정 A를 사용하여 합성한다. 각각의 아닐린의 합성을 위하여, 다음 과정을 적용한다: 카복실산, 즉 이소옥사졸-5-카복실산(L71에 대하여), 옥사졸-5-카복실산(L72에 대하여) 및 옥사졸-2-카복실산(L73에 대하여)(10mmol)과 티오세미카바존(15mmol)을 포스포릴 클로라이드(5㎖)에 용해시키고, 60-80℃로 10분 내지 5시간 동안 가열한다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 빙수에 투입하고, 수성 수산화나트륨으로 pH 8-10으로 조절한다. 생성물을 여과하거나 적합한 용매(에틸 아세테이트, 클로로포름 또는 디클로로메탄)로 추출한 다음, 증발시켜 수득한 혼합물로부터 회수한다. 조 생성물을 재결정화(예를 들면, 에탄올, 이소프로판올, 에탄올/물 혼합물로부터) 또는 컬럼 크로마토그래피(통상의 상 또는 아미노 개질된 고정 상, 메탄올/디클로로메탄 또는 클로로포름/메탄올 구배 용출)로 정제한다. 표적 화합물을 일반 과정 A를 사용하여 수득한 아닐린 및 카복실산 성분으로서 1-[3-(3급 부톡시카보닐)아미노-1-프로필]-2-메틸벤즈이미다졸-5-카복실산(합성, 상기 참조)으로부터 후속적으로 합성한다.
실시예 1에서 사용된 약어:
DIPEA = N-에틸-N,N-디이소프로필아민(N-ethyl-N,N-diisopropylamine)
TBME = 3급 부틸 메틸 에테르(tert-butyl methyl ether)
HATU = O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N' , N'tetramethyluronium hexafluorophosphate)
HPLC-MS = 질량 분광계에 연결된 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry)
ESI-MS = 전기분무 이온화 질량 분광계(electrospray ionization mass spectrometry)
DMF = N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide)
DMSO = 디메틸설폭사이드(dimethylsulphoxide)
실시예 2: 리간드의 고정화
실시예 1로부터의 리간드를 후속적인 크로마토그래피 및 배치 흡착 실험을 위하여 NHS-활성화 세파로즈 4 FF에 고정시켰다. 리간드상 스페이서-전구체 그룹의 아미노 그룹과 예비 활성화 수지의 NHS-활성화 카복실산 그룹 사이의 아미드 결합의 형성으로 커플링을 달성하였다.
건조된 리간드를 50mM의 대략적인 농도로 DMSO에 재용해시켰다. 커플링 반응에서, 90% DMSO 중의 20 내지 30mM의 대략적인 농도로 용해된 리간드 1용적 및 1M N,N-디이소프로필에틸아민을 함유하는 10% N-메틸 2-피롤리돈을 준비된 NHS-활성화 세파로즈 4 FF(GE Healthcare) 1용적에 가하였다. 반응을 25℃에서 3시간 이상 수행하는 한편, 격렬하게 진탕시켰다. 반응의 상청액을 회수하고, 수지를 적합한 용매로 2회 세척하였다. 수지 상의 잔여 활성 그룹은 1M 에탄올아민으로 25℃에서 1-2시간 동안 블럭킹되었다. 최종적인 수지를 세척하고, 후속적인 실험에 사용할 때까지 4℃에서 30% 에탄올에 저장하였다.
실시예 3: 리간드의 크로마토그래피 평가(실시예 1로부터)
실험
수지를 마이크로타이터 플레이트 크로마토그래피(microtiter plate chromatography)에 의하여 팩킹된 방식으로 검정하였다. 각각의 컬럼에 대하여 수지 약 30㎕를 384-웰 필터 플레이트로 옮기고, 적합한 상부 프리트로 밀봉하였다. r단백질 A 세파로즈 4 FF 및 마브소번트(Mabsorbent) A2P HF를 포함한 컬럼을 대조군으로서 포함시켰다.
컬럼을 주입 전에 포스페이트 완충 염수(0.15M NaCl, 20mM 인산나트륨, pH 7.3; PBS) 6.7 컬럼 용적(column volumn, cv)으로 평형화시켰다. PBS에 0.5mg ㎖-1로 용해시킨 전체 IgG 3.3cv 또는 희석하지 않은 숙주 세포 단백질(HCP)을 컬럼으로 주입하였다.
비결합 단백질을 글리신 완충액 5cv로 pH 2.5에서 용출 전에 PBS 5cv로 컬럼으로부터 세척하였다. 옮긴 용적을 50g으로 컬럼을 통하여 1-2분 동안 회전시켰다. 샘플 주입 동안, 속도를 10g로 감소시키고, 원심분리 시간을 5-10분으로 증가시켰다. 유출 분획을 384-웰 플레이트에서 수집하고, 단백질 농도를 브래드포드 검정으로 분석하였다. 단백질 질량 m i , m ft 및 m e (하기 참조)를 분획 용적의 생성물 및 측정된 단백질 농도로서 계산하였다.
요약 및 결과
몇 가지 항체의 결합 및 용출이 나타났다. 이들 중에는 3개의 인간화 치료적 항체인 베박시주마브, 토실리주마브 및 팔리비주마브, 키메라 항체인 세툭시마브 및 사람 혈청으로부터 분리한 사람 폴리-IgG(h-폴리-IgG) 혼합물이 있다. 항체에 대한 리간드의 선택도는 숙주 세포 단백질의 결합 거동의 연구로 측정하였다. 상업적 수지 r단백질 A 세파로즈 4 FF(r단백질 A) 및 마브소번트 A2P(A2P)에 대한 결과를 비교를 위하여 포함시켰다.
결합 단백질의 분율을 주입된 단백질의 총 질량(m i )와 통과액에서 검출된 단백질의 질량(m ft ) 사이의 차를 주입된 단백질의 총 질량으로 나누어 계산하였다
Figure pct00159
단백질의 수율을 용출된 단백질의 질량(m e )을 주입된 단백질의 질량(m i )로 나누어 계산하였다.
Figure pct00160
수지의 선택도를 결합 베박시주마브 항체의 분율(B Ab )을 결합 숙주 세포 단백질의 분율(B HCP )로 나누어 계산하였다.
Figure pct00161
결합 단백질의 분율 및 단백질의 수율은 전체 IgG-항체에 대한 데이터를 기준으로 한 각각의 수지에 대하여 계산하였다. 숙주 세포 단백질의 경우, 결합 단백질의 분율만을 제시한다. 수지의 선택도를 베박시주마브 전체 IgG 및 숙주 세포 단백질에 대한 데이터로부터 계산하였다. 제한된 실험 정밀도로 인하여, 선택도는 10을 초과한 값에 대해서 버렸다.
실시예 2로부터의 수지 및 참조 수지에 대한 크로마토그래피 결과를 아래 표에 제시한다. L55-73에 대하여 나타낸 결과는 L01-L54로부터 수득한 정보를 기반으로 한 추정치이다.
Figure pct00162
Figure pct00163
Figure pct00164
대조군은 거의 100%로 모든 항체를 결합하였다. 단백질 A가 숙주 세포 단백질(HCP)을 전혀 결합시키지 않는 반면, A2P는 이에 대한 높은 결합 특성을 나타내었다. 수득한 선택도 지수는 단백질 A에 대해서는 10.0, A2P에 대해서는 1.0이었다.
실시예 2로부터의 수지를 이의 항체 결합 특성 및 선택도를 따라 3개의 상이한 그룹으로 분류할 수 있다. 1 그룹의 리간드는 90% 이상의 항체 결합률 및 7 이상의 결합도 지수(예: L24, L25, L39, L53 및 L54)를 특징으로 한다. 제2 그룹의 리간드는 4 내지 6.9의 시험된 항체 및/또는 선택도 중의 하나 이상에 대한 감소된 항체 결합률(80 내지 89%)(예: L5, L30, L31 및 L52)을 나타내었다. 제3 그룹의 리간드는 시험된 항체들 중의 하나 이상을 80% 미만으로 결합하고/하거나, 선택도 지수가 4 미만(예: L1, L18, L32 및 L50)이었다
실시예 4: 결합의 등온선 및 시간 척도
실험
항체로서 베박시주마브를 사용하여 실험을 수행하였다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 배치 흡착 실험에 의하여 정제 항체에 대한 랭뮤어(Langmuir) 등온선의 파라미터를 측정하였다. 각각의 웰에, 흡수성 슬러리 10㎕(50% v/v)를 단백질 용액 100㎕와 혼합하였다. 초기 농도는 포스페이트 완충 염수(0.15M NaCl, 20mM 포스페이트 완충액, pH 7.3; PBS) 중에서 0.05 - 5㎎/ml로 변화하였다. 반응을 25℃에서 3시간 이상 동안 격렬하게 교반하였다. 그 후, 상청액 중의 항체 농도를 브래드포드 검정에 의하여 측정하였다. 데이터는 값들을 랭뮤어 등온선 방정식과 직접 피팅하여 평가하였다(1).
흡수 동역학은 96-웰 필터 플레이트에서 배치 흡착에 의하여 유사하게 연구하였다. 다시, 흡수성 슬러리 (50% v/v) 10㎕를 단백질 용액 100㎕와 혼합하였다. 그러나, PBS 중의 베박시주마브 0.75㎎/ml의 고정 초기 농도를 사용하였다. 반응물을 25℃에서 80분 이하 동안 격렬하게 교반하였다. 상청액을 2.5, 5, 10, 20, 40 및 80분 후 필터를 통하여 회전시켜 신속하게 분리하고, 분석을 위하여 샘플링하였다. 항체의 농도를 브래드포드 검정에 의하여 분석하였다.
요약 및 결과
실시예 1로부터의 고정화 리간드의 부분집합을 베박시주마브에 대한 이의 친화도 및 최대 수용량에 대하여 특징화하였다. 추가로, 결합에 필요한 시간 척도를 일부 리간드에 대하여 측정하였다. 상업적 수지 r단백질 A 세파로즈 4 FF(r단백질 A) 및 마브소번트 A2P(A2P)를 비교를 위하여 포함시켰다.
랭뮤어 등온선의 파라미터, 즉 해리 상수 Kd 및 최대 수용량 qm을 상청액 중의 측정 농도로부터 측정하였다. 파라미터를 체이스(Chase)에 의하여 유도된 모델 방정식의 수치적 핏팅으로 평가하였다(1).
흡수 동역학은 항체로 수지의 평형 포화도 80%가 발생하기까지 걸리는 시간으로서 정의되는, 결합의 시간 척도 t0.8을 특징으로 하였다. t0.8의 측정을 위하여, 상청액 중의 농도를 이중 지수의 핏팅으로 보간하고, t0.8의 값을 그래프로부터 판독하였다(2). 실시예 2로부터의 수지, 및 참조 수지에 대한 결합의 랭뮤어 등온선의 파라미터 및 시간 척도를 아래 표에 보고한다.
Figure pct00165
최고 친화도가 r단백질 A에 대하여 관찰되었으며, 이의 Kd는 0.005㎎/ml였다. A2P, 수지 L01, L05, L07, L13, L14, L23, L25, L31, L39, L40, L41, L46, L47, L51 및 L54의 해리 상수는 한 자릿수만큼 낮았고, 0.038 내지 0.098㎎/ml의 범위였다. 잔여 수지의 해리 상수는 두 자릿수만큼 낮았고, 0.105 내지 0.282㎎/ml의 범위였다. 최대 수용량에 대하여, 최고 용량을 A2P에 대하여 측정하였다(수지 68mg/㎖). r단백질 A의 최대 수용량은 수지 41mg/㎖였다. 실시예 2로부터의 수지의 최대 수용량은 수지의 34 내지 53mg/㎖로 변화하였다. 결합의 시간 척도는 r단백질 A에 대하여 8.9분, A2P에 대하여 9.2분, 실시예 2로부터의 수지에 대하여 5.3 내지 11.8분이었다.
실시예 5: 동적 결합능
실험
정제 베박시주마브를 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의하여 동적 결합능을 측정하였다. 수지를 길이 25mm 및 내주 직경 3mm의 분석 컬럼으로 팩킹시켰다. 컬럼에 포스페이트 완충 염수(150mM NaCl, 20mM 포스페이트 완충액, pH 7.3) 중의 항체 1mg/㎖를 50cm/h의 유량으로 공급하는 한편(컬럼 체류 시간 3분), 유출물 중의 항체 농도를 280nm의 흡광도를 통하여 온라인으로 모니터링하였다. 항체를 완전한 공급물의 돌파까지 가중시켰다. 동적 결합능을 10% 돌파율에서 측정하였다. 평형 수용능을 돌파 곡선 위의 면적의 적분으로 측정하였다. 결합 항체를 pH 3.0에서 글리신으로 용출시켜 컬럼으로부터 스트립핑(stripping)시켰다.
요약 및 결과
유량의 함수로서의 베박시주마브에 대한 동적 (결합) 수용능을 L05(실시예 2로부터) 및 r단백질 A 세파로즈 4 FF(r단백질 A)에 대하여 측정하였다. 이는 10% 돌파가 발생한 후의 시간(t 0 .1 )에 유량(F) 및 공급 농도(c f )를 곱하여 계산하였다.
Figure pct00166
평형 수용능을 제시된 공급 스트림 농도에 대한 컬럼에 결합한 항체의 최대량으로서 정의한다. 이는 공급 농도(c f ), 시간 경과에 따른 유출물 농도(c(t)) 및 유량(F)를 함유하는, 다음 적분을 구하여 계산하였다.
Figure pct00167
적분을 수치로 구하였다. 적분을 완전한 돌파가 발생한 후의 시간으로 제한하였다. 동적 수용능(dynamic capacity) 및 평형 수용능(equilibrium capacity)의 계산을 컬럼의 홀드-업(hold-up) 및 크로마토그래피 시스템에 대하여 둘 다 보정하였다. 수용능을 컬럼 내의 수지의 용적으로 표준화시켰다.
유량의 함수로서의 L05 및 r단백질 A 세파로즈 4 FF에 대한 동적 결합능 및 베박시주마브 1mg/㎖의 공급 농도에 대한 평형 결합능을 아래 표에 제시한다.
r단백질 A에 대하여 수지 28mg/㎖의 동적 결합능을 측정하였다. L05의 동적 결합능은 수지 25mg/㎖였다. 계산된 평형 수용능은 r단백질 A에 대하여 수지 40mg/㎖, L05에 대하여 수지 39mg/㎖였다.
Figure pct00168

실시예 6: 알칼리 안정도
이의 알칼리 안정도에 대하여 실시예 1로부터의 리간드의 부분집합을 시험하였다. 리간드를 25℃에서 8일 동안 0.5M 수산화나트륨으로 처리하였다. 가수분해를 LC-MS 분석에 의하여 모니터링하였다.
Figure pct00169
대부분의 리간드는 0.5M NaOH의 존재하에 999시간 넘는 반감기를 나타내었다. 나머지 리간드는 719 내지 903시간의 반감기를 나타내었다.
실시예 7: 세포 배양 상청액으로부터의 항체의 정제
실험
세포 배양 상청액으로부터의 항체의 정제에 대한 수지의 안정도를 컬럼 크로마토그래피로 검정하였다. 0.12㎎/㎖의 농도로 숙주 세포 단백질로 스파이크된(spiked) 베박시주마브를 공급물(순도 20%)로서 사용하였다. 또한, 숙주 세포 단백질 및 순수 항체 단독을 사용한 크로마토그래피 런(chromatography runs)을 수행하였다. 상응하는 샘플의 25개의 컬럼 용적을 런당 주입하였다. 컬럼을 평형화시키고, 주입 전 후에 PBS로 세척하였다. 결합 단백질을 pH 3.0에서 50mM 글리신으로 용출시켰다. 순도를 3개의 단일 런의 용출 피크의 면적을 적분하고 균형을 맞추어 측정하였다. 수율을 100%로 동시에 작동시킨 단백질 A 컬럼으로부터 용출된 항체의 양을 취하여 상대적 회수율로서 나타내었다.
요약 및 결과
항체를 실시예 2로부터의 수지의 부분집합에 대한 크로마토그래피에 의하여 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 상업용 수지 r단백질 A 세파로즈 FF(r단백질 A)에 대한 크로마토그래피를 비교를 위하여 포함시켰다. 동일한 조건하의 3개의 크로마토그래피 런을 항체, 숙주 세포 단백질 또는 후자의 혼합물을 주입한, 각각의 수지에 대하여 수행하였다.
크로마토그래피 후의 작업 "수율"을 순수한 항체를 이용한 런으로부터 계산하였다. 이는 비례적으로 단백질 A에 대한 런으로부터의 용출 피크의 면적(A E , 단백질 A )에 대한 리간드를 이용한 런으로부터의 용출 피크의 면적(A E , 리간드 )으로서 나타내었다.
Figure pct00170
혼합물의 크로마토그래피 후의 항체의 '순도'를 스파이크된 항체를 이용한 런의 용출 피크의 면적(A E , Mix )을 순수한 항체를 이용한 런의 용출 피크의 면적(A E , Ab ), 또는 HCP를 이용한 런의 용출 피크의 면적(A E , HCP )에 의하여 교정된 스파이크된 항체의 런의 용출 피크의 면적과 균형을 맞추어 계산하였다.
Figure pct00171
실시예 2로부터의 몇 개의 수지 및 참조 수지에 대한 크로마토그래피 후에 수득한 순도 및 수율을 아래의 표에 제시한다.
실험 정밀도 내에서, 모든 시험된 수지에 대하여 수율은 100%였다. 순도는 r단백질 A(98%)에 대한 크로마토그래피 후에 최고였고, 수지 L25(93%) 및 수지 L24 및 L39(둘 다 91%)에 대한 크로마토그래피가 뒤를 이었다. 잔여 수지에 대한 크로마토그래피 후의 순도는 80 내지 89%의 범위였다.
Figure pct00172

실시예에 인용된 문헌:
1. Chase HA. Prediction of the performance of preparative affinity chromatography. J Chromatogr 1984; 297:179-202.
2. Coffman JL, Kramarczyk JF, Kelley BD. High-throughput screening of chromatographic separations: I. Method development and column modeling. Biotechnology and Bioengineering 2008; 100(4):605-618.

Claims (17)

  1. 항체 또는 항체 단편의 친화성 정제를 위한, 지지 물질 및 지지 물질에 공유 결합된 하나 이상의 리간드를 포함하는 리간드 치환된 매트릭스의 용도로서, 상기 리간드가 화학식 I로 나타내어지는 용도.
    화학식 I
    L-(Sp)v-Ar1-Am-Ar2
    위의 화학식 I에서,
    L은 리간드가 결합된 지지 물질 상의 결합점이고,
    Sp는 스페이서 그룹이고,
    v는 0 또는 1이고,
    Am은 아미드 그룹 -NR1-C(O)-[여기서, NR1은 Ar1에 결합되고 -C(O)-는 Ar2에 결합되거나, -C(O)-는 Ar1에 결합되고 NR1은 Ar2에 결합되고; R1은 수소 또는 C1 내지 C4 알킬, 보다 바람직하게는 수소 또는 메틸, 가장 바람직하게는 수소이다]이고,
    Ar1은 화학 결합을 통하여 Sp 또는 L에 연결된 5원, 6원 또는 7원 단핵 방향족 환 또는 부분 포화 방향족 환이고, 이는 임의로 추가로
    (a) 화학 결합을 통하여 추가의 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 결합되거나,
    (b) 다핵 환 시스템의 일부로서 단핵 또는 이핵 방향족 환에 융합되고(여기서, 상기 Ar1은 Ar1을 구성하는 상기 5원, 6원 또는 7원 방향족 환에 존재하는 화학 결합을 통하여 Am에 직접 연결되거나, Ar1에 결합된 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 존재하거나 Ar1에 융합된 추가의 5원 또는 6원 방향족 환에 존재하는 화학 결합을 통하여 간접적으로 연결되고; 상기 Ar1은 추가로 치환되지 않거나, C1 내지 C4 알킬; C3 및 C4 사이클로알킬; C2 내지 C4 알케닐; C2 내지 C4 알키닐; 할로겐; C1 내지 C4 할로알킬; 하이드록실 치환된 C1 내지 C4 알킬; C1 내지 C4 알콕시; 하이드록실 치환된 C1 내지 C4 알콕시; 할로겐 치환된 C1 내지 C4 알콕시; C1 내지 C4 알킬아미노; C1 내지 C4 알킬티오; -NO2; =O; =S; =NH; -OH; 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된다),
    Ar2는 치환되지 않거나, 화학 결합을 통하여 C1 내지 C6 알킬; C3 내지 C6 사이클로알킬; C2 내지 C6 알케닐; C5 및 C6 사이클로알케닐; C2 내지 C6 알키닐; 할로겐; C1 내지 C6 할로알킬; 하이드록실 치환된 C1 내지 C6 알킬; C1 내지 C6 알콕시; 하이드록실 치환된 C1 내지 C6 알콕시; 할로겐 치환된 C1 내지 C6 알콕시; C1 내지 C6 알킬아미노; C1 내지 C6 알킬티오; 카바모일; C1 내지 C4 알킬렌디옥시, 바람직하게는 메틸렌디옥시 및 에틸렌디옥시; -OH; -SH; 5원 또는 6원 단핵 방향족 환; 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된 5원 또는 6원 단핵 방향족 환(여기서, Ar2는 임의로, 위에서 인용된 화학 결합을 통하여 결합될 수 있는 치환체 이외에, 다핵 환 시스템의 일부로서 5원 또는 6원 단핵 방향족 환에 융합된다)이다.
  2. 제1항에 있어서,
    Ar1이 5원 또는 6원 단핵 방향족 환 또는 1, 2 또는 3개의 N 원자 또는 벤젠을 함유하는 부분 포화 방향족 환(여기서, 상기 단핵 환 또는 벤젠은 화학 결합을 통하여 Sp 또는 L에 연결된다)이고, 임의로 추가로
    (a) 화학 결합을 통하여 벤젠 또는 티오펜에 결합되거나,
    (b) 다핵 환 시스템의 일부로서 벤젠 또는 티오펜에 융합되고(여기서, Ar1은 Ar1을 구성하는 상기 방향족 환 또는 벤젠에 존재하는 화학 결합을 통하여 Am에 직접 연결되거나, Ar1에 결합된 벤젠 환 또는 티오펜 환에 존재하거나 Ar1에 융합된 벤젠 환 또는 티오펜 환에 존재하는 화학 결합을 통하여 간접적으로 연결되고; 상기 Ar1은 추가로 치환되지 않거나, 메틸, 에틸, 프로필, 메톡시, 에톡시, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시; 사이클로프로필, 하이드록시메틸, -NO2, =O, =S; 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된다),
    Ar2가 치환되지 않거나, 화학 결합을 통하여 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 사이클로프로필, 하이드록시메틸, t-부틸, i-부틸, 2급 부틸, 플루오로, 클로로, 카바모일, 에틸티오, 메틸티오, 5원 또는 6원 단핵 방향족 환; 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된 5원 단핵 방향족 환(여기서, Ar2는 임의로 위에서 인용된 화학 결합을 통하여 결합될 수 있는 치환체 이외에, 다핵 환 시스템의 일부로서 벤젠 또는 티아졸에 융합된다)인 용도.
  3. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
    R1이 수소 또는 메틸; 가장 바람직하게는 수소이고,
    Ar1이 이미다졸, 벤젠, 피리딘, 2,3-디하이드로-1H-이미다졸 및 트리아졸로부터 선택된 부분 포화 방향족 환 또는 5원 또는 6원 단핵 방향족 환이고, 이는 화학 결합을 통하여 Sp 또는 L에 연결되고, 임의로 추가로
    (a) 화학 결합을 통하여 벤젠에 결합되거나,
    (b) 다핵 환 시스템의 일부로서 벤젠에 융합되고(여기서, Ar1은 Ar1을 구성하는 5원 또는 6원 방향족 환 또는 부분 포화 방향족 환에 존재하는 화학 결합을 통하여 Am에 직접, 또는 Ar1에 결합된 벤젠 환 또는 Ar1에 융합된 벤젠 환에 존재하는 화학 결합을 통하여 간접적으로 연결되고; 추가로 치환되지 않거나, 메틸, 에틸, 프로필, 메톡시, 에톡시, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시; 사이클로프로필, 하이드록시메틸, -NO2, =O, =S; 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된다),
    Ar2가 치환되지 않거나, 화학 결합을 통하여 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 사이클로프로필, 하이드록시메틸, t-부틸, i-부틸, 2급 부틸, 플루오로, 클로로, 카바모일, 에틸티오, 메틸티오, 바람직하게는 메틸, 에틸, 메톡시, 에틸티오 및 사이클로프로필; 5원 또는 6원 단핵 방향족 환; 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된, N, S 및 O, 바람직하게는 N 및 S로부터 선택된 하나 이상의 원자를 함유하는 5원 단핵 방향족 환(여기서, Ar2는 임의로, 위에서 인용된 화학 결합을 통하여 결합될 수 있는 치환체 이외에, 다핵 환 시스템의 일부로서 벤젠 또는 티아졸에 융합된다)인 용도.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
    Ar1이 벤즈이미다졸, 2,3-디하이드로벤즈이미다졸, 피리딘 및 4-트리아졸릴벤젠으로부터 선택되고(여기서, Ar1은 화학 결합을 통하여 벤즈이미다졸의 1- 또는 2-위치, 2,3-디하이드로벤즈이미다졸의 1-위치, 피리딘의 2-위치 또는 4-트리아졸릴벤젠의 트리아졸 부분의 1-위치에서 Sp 또는 L에 연결되고; 화학 결합을 통하여 벤즈이미다졸의 5- 또는 6-위치, 2,3-디하이드로벤즈이미다졸의 5- 또는 6-위치, 피리딘의 5-위치 또는 4-트리아졸릴벤젠의 벤젠 부분의 4-위치에서 Am에 연결되고; 상기 Ar1은 추가로 치환되지 않거나, 메틸, 에틸, 메톡시 =S 및 =O; 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된다)되고,
    Ar2가 치환되지 않거나, 화학 결합을 통하여 메틸, 에틸, 메톡시, 에틸티오 및 사이클로프로필로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 결합된, 1,2,4-티아디아졸, 1,3,4-티아디아졸 및 티아졸로부터 선택된 5원 단핵 방향족 환; 피리딘, 푸란, 이소옥사졸, 옥사졸, 이소티아졸 및 티아졸로부터 선택된 5원 또는 6원 단핵 방향족 환; 및 이들의 조합인 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 지지 물질이 탄수화물 및 가교결합된 탄수화물, 바람직하게는 아가로스, 셀룰로스, 덱스트란, 전분, 알기네이트 및 카라기난, 세파로스, 세파덱스; 합성 중합체, 바람직하게는 폴리스티렌, 스티렌-디비닐벤젠 공중합체, 폴리아크릴레이트, PEG-폴리아크릴레이트 공중합체, 폴리메타크릴레이트, 폴리비닐 알콜, 폴리아미드 또는 퍼플루오로카본; 무기 물질, 바람직하게는 유리, 실리카 및 금속 옥사이드; 및 복합 물질로부터 선택된 물질을 포함하는 용도.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 항체, 바람직하게는 IgG형 항체 또는 Fc 융합 단백질인 용도.
  7. 제6항에 있어서, 상기 정제가 상기 리간드 치환된 매트릭스의 리간드를 상기 항체 또는 상기 융합 단백질의 Fc 단편 또는 도메인에 결합시켜 달성되는 용도.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 Fc 단편 또는 도메인 또는 항체가 IgG 항체 부류, 보다 바람직하게는 사람, IgG 또는 사람 기원의 다중클론 또는 단일클론 IgG, 특히 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에 속하는 용도.
  9. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 리간드 치환된 매트릭스.
  10. 제9항에 따르는 리간드 치환된 매트릭스의 합성 방법으로서, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 명시된 바와 같은 화학식 I에 따르는 리간드가 상기 지지 물질에 결합되는 방법.
  11. 단백질의 친화성 정제, 바람직하게는 친화 크로마토그래피 방법으로서, 정제되는 단백질이 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 리간드 치환된 매트릭스와 접촉하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단백질이 항체 또는 Fc 융합 단백질이고, 상기 리간드가 항체 또는 Fc 융합 단백질의 Fc 영역에 결합되는 방법.
  13. 화학식 II의 리간드.
    [화학식 II]
    (SpP)v-Ar1-Am-Ar2
    위의 화학식 II에서,
    Ar1, Ar2 및 Am은 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 정의한 바와 같은 의미를 갖고,
    SpP는 스페이서 전구체이다.
  14. 화학식 III의 구조 단위를 갖는 리간드.
    화학식 III
    -Ar1-Am-Ar2
    위의 화학식 III에서,
    Ar1, Ar2 및 Am은 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 정의한 바와 같은 의미를 갖는다.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 단백질, 바람직하게는 항체에 결합하는 리간드.
  16. 항체 또는 항체 단편의 친화성 정제를 위한, 제13항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 리간드로서 바람직하게는 상기 리간드를 적합한 매트릭스에 결한한 후의 리간드 용도.
  17. 제 9항에 있어서, 상기 매트릭스는 리간드 결합된 하나 이상의 단백질을 추가로 포함하고, 바람직하게는 리간드 결합된 항체 또는 항체 단편을 추가로 포함하는 리간드 치환된 매트릭스.
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