JP2019530646A

JP2019530646A - タンパク質精製法

Info

Publication number: JP2019530646A
Application number: JP2019507288A
Authority: JP
Inventors: ジェンジアン・リ; シュアンクオ・シュー; チャオ・フアン; ジーチャン・チェン
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2016-08-12
Filing date: 2017-08-10
Publication date: 2019-10-24
Also published as: EP3497112A1; US11840554B2; US20240051989A1; US10947268B2; US20190218248A1; KR20190039978A; CN109790201A; US20210246161A1; WO2018031726A1

Abstract

本発明は、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーにおいて凝集体形成を減少させて目的のタンパク質を精製する方法であって、（ａ）目的のタンパク質と１以上の汚染物質とを含む混合物を提供し；（ｂ）アルギニンと結合させたＣＥＸ樹脂上に該混合物を負荷し；そして、（ｃ）目的のタンパク質を樹脂から溶出させることを含み、それにより、ＣＥＸクロマトグラフィーにおいて凝集体形成を減少させて目的のタンパク質を精製する方法を提供する。

Description

関連発明の相互参照
本出願は、２０１６年８月１２日出願の米国仮特許出願第６２／３７４，３３７号に基づく優先権の利益を主張し、引用により本明細書中にその内容全体を具体的に包含させる。

発明の背景
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびそれらの誘導体生成物（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）は、これらのタイプの生物製剤の安全性、有効性および高品質のために、最も困難なヒト疾患のいくつかの治療において重要な役割を果たす［１］。モノクローナル抗体の市場は急成長しており、モノクローナル抗体生成物の世界全体での売上高は、２０２０年までに約１２５０億ドルに達すると推定されている［２］。従って、ロバストな市販のクロマトグラフィー精製プロセスの開発は、患者にとって極めて重要である［３］。精製プロセスは、一般的に、プロテインＡクロマトグラフィーを捕捉に用い、次いで１回または２回のポリッシング（最終精製）工程を行う［４］。塩基性の等電点（ｐＩ）を有するそれらのｍＡｂおよびＦｃ融合タンパク質について、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）は、主に、比較的単純なカラム挙動、生成物関連不純物（例えば、高分子量種（ＨＭＷ））の効率的な除去、および一般的にタンパク質構造に対する静電相互作用の影響が小さいために、ポリッシング工程の好ましい選択肢であると伝統的に考えられている［５、６］。比較すると、タンパク質は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体の表面に吸着する際には部分的にアンフォールディングする（折り畳み構造がほどける）ことが多い［７−９］。

近年、ＣＥＸにおいて、従来とは異なるタンパク質結合および溶出挙動を報告する例が増えている。例えば、Voitlら［１０、１１］は、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤＳＥＨｉｃａｐでのヒト血清アルブミンの線形塩勾配中の２つのピークの溶出プロファイルを報告した。２つの溶出ピークにおいてＨＭＷの増加は観察されなかったため、このタンパク質は、完全に溶出させるのに異なる塩濃度を必要とする２つの異なる立体構造で樹脂に結合したと仮定された。Gillespieら［１２］は、線形塩勾配を用いた幾つかのＣＥＸ樹脂における不安定なグリコシル化されていないＩｇＧ１の２つピークの溶出プロファイルを報告し、遅い溶出ピークは早い溶出ピークよりも多くの凝集物を含んでいたことを報告した。水素−重水素交換およびフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）の結果は、第二ピークが樹脂誘導性抗体変性によって生じ、これはアルギニンのような優先的に除かれる溶質を用いることによって軽減することができることを示した［１３−１５］。この試験は、ＣＥＸ操作に関連した多くの要因を評価したが、凝集メカニズムは、詳しく議論されなかった。GuoおよびCarta［１６−１８］は、グリコシル化ＩｇＧ２の２つのピークのＣＥＸ溶出挙動を報告した。この作用は、ポリマー官能化樹脂ＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤＳＯ_３ ⁻では顕著であったが、グラフトポリマーを含まないマクロポーラス型樹脂（例えば、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＲａｐｉｄＳ）では事実上存在せず、テンタクル（tentacle）ポリマーを通るタンパク質拡散は、タンパク質構造を不安定化し、凝集形成を引き起こしたという仮説を導いた。２つのピークの溶出挙動は、結合タンパク質が長時間保持された場合にのみ見られることが示された。Luoら［１９］は、塩溶出の際のＩｇＧ２の２つのピークの溶出挙動を報告した。この試験は、ＩｇＧ２が高塩濃度および高タンパク質濃度で可逆性の自己会合体（ＲＳＡ）を形成することができ、そしてＲＳＡ種は単量体よりも樹脂に強く結合することができ、このことがピーク分裂を引き起こすことを示唆した。別の試験では、Luoら［２０］は、ＩｇＧ４のピーク分裂現象を報告し、それをヒスチジン−プロトン化に基づくチャージバリアント（charge variant）の分離に結び付けた。

生物学的製剤の多様なカラム挙動は、最終的にはその複雑な分子特性に起因し得る。例えば、ｍＡｂおよびＦｃ融合タンパク質は、類似の結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）領域を共有するが、それらの溶液特性は、高度に可変性の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびＦｃ領域におけるグリコシル化のために顕著に異なり得る［２１］。あるｍＡｂは、低ｐＨ（ｐＨ２〜４）および高塩濃度で変性および凝集する傾向があることが報告されている［２２］。Buchnerら［２３］は、免疫グロブリンは、低ｐＨ（＜３）下で“Ａ状態”を形成することができると報告しており、このことは疎水性が増加した二次構造の割合が高くなり、高塩濃度では凝集が遅い傾向があることを特徴とする。Latypovら［２４、２５］は、主にＦｃ領域に位置するＣＨ_２ドメインの安定性によって決定される酸誘導性アンフォールディングおよび凝集について、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２に対する広範な研究を行った。溶液条件に応じて、ｍＡｂなどのタンパク質は、それらの天然構造を維持しながら、部分的にアンフォールドされ、互いに不可逆的な凝集体または可逆的なクラスターを形成し得る［２６、２７］。可逆性または不可逆性のｍＡｂ会合は、とりわけ高タンパク質濃度でｍＡｂ表面上の不均一電荷分布に主に起因するタンパク質−タンパク質結合によってもたらされることが多い［２８−３０］のに対して、電解質の存在による二量体ＩｇＧ１ｍＡｂ微細構造の形成に関する最近の報告はまた、疎水性相互作用などの重要な非静電的寄与も示唆している［２６］。Ｆｃ融合タンパク質は、分子間および分子内ドメイン安定性の欠如のために、完全なｍＡｂと比較して立体構造変化を受ける可能性がさらに高い。Fastら［３１］は、４０℃にてｐＨが７．５から６．０に低下するとき、Ｆｃ融合タンパク質であるアバタセプト（Orencia）が急速に凝集することを報告した。立体構造変化および凝集体形成は、凝集しやすいモルテン・グロビュール（molten globule）様構造を形成するために折り畳まれない、ＣＤＲ（ＣＴＬＡ−４）およびＣＨ_２ドメインの不安定性に起因した。

さらに、ＣＥＸカラムでタンパク質が曝される溶液条件は、移動相と固定相の間の複雑なイオン平衡のために決定が困難な場合がある。その結果、複雑なカラム現象を理解する上で、タンパク質溶液の特性の影響がクロマトグラフプロセスの影響と絡み合うという状況が発生し得る。例えば、緩衝液塩イオンとＨ^＋／ＯＨ⁻イオンとの間の競合的平衡のために、塩溶出中にＣＥＸにおいて予期しないｐＨ低下が起こり得ることが報告されている［３２−３４］。高塩濃度の緩衝液を溶出工程で注入するとき、移動相の陽イオンが固定相のＨ^＋イオンを置換する。これらの放出されたＨ^＋イオンは移動相に移り、溶出液のｐＨを一時的に低下させる。溶出時の高い細孔内タンパク質濃度に加えて、高塩濃度および低ｐＨの局所環境がタンパク質の変性および凝集を引き起こし得るような一時的な条件下では、不安定なタンパク質に対して十分に注意を払う必要がある。

従って、タンパク質精製プロセス中の凝集体形成を減少させるために用いることができる改良されたタンパク質精製法が当技術分野において必要とされている。

発明の概要
ある態様において、本発明は、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーにおいて凝集体形成を減少させて目的のタンパク質を精製する方法であって、（ａ）目的のタンパク質と１以上の汚染物質とを含む混合物を提供し；（ｂ）アルギニンと結合させたＣＥＸ樹脂上に該混合物を負荷し；そして、（ｃ）目的のタンパク質を樹脂から溶出させることを含み、それにより、ＣＥＸクロマトグラフィーにおいて凝集体形成を減少させて目的のタンパク質を精製する方法を提供する。例えば、混合物は、清澄化バルクまたは細胞培養上清（例えば、哺乳動物細胞培養、細菌細胞培養または真菌細胞培養由来の上清）を含む。具体的な例において、混合物は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養由来の上清である。例示すると、汚染物質は、宿主細胞タンパク質、宿主細胞代謝産物、宿主細胞構成タンパク質、核酸、内毒素、ウイルス、生成物関連汚染物質、脂質、培地添加物および培地誘導体から選択される。例示すると、目的のタンパク質は、抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体から選択されるモノクローナル抗体）、抗体フラグメントおよびＦｃ融合体から選択される。

ある側面において、本発明のＣＥＸ樹脂のベースマトリックス材料は、アガロース、セルロース、デキストラン、キトサン、ポリ（メタクリレート）、アクリルポリマーおよびポリ（スチレン−ジビニル−ベンゼン）から選択される。ＣＥＸ樹脂は、スルホネート、カルボン酸、カルボキシメチルスルホン酸、スルホイソブチル、スルホエチル、カルボキシル、スルホプロピル、スルホニル、スルホキシエチルおよびオルトリン酸から選択される陽イオン交換リガンド官能基を用いて製造される。特定の態様において、アルギニンと結合させたＣＥＸ樹脂は、アルギニン−スルホプロピル（Ａｒｇ−ＳＰ）樹脂（例えば、アルギニン−スルホプロピル（Ａｒｇ−ＳＰ）アガロース樹脂）である。

ある側面において、ＣＥＸクロマトグラフィー工程の前に、混合物は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよびプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーから選択されるアフィニティークロマトグラフィーにより調製される。場合により、アフィニティークロマトグラフィーは、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーである。ある側面において、本発明の方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および／または混合モードクロマトグラフィーなどの１つまたは複数の追加のクロマトグラフィーマトリックスをさらに含む。

他の態様において、本発明は、アルギニンと結合した陽イオン交換（ＣＥＸ）樹脂を提供する。例えば、ＣＥＸ樹脂のベースマトリックス材料は、アガロース、セルロース、デキストラン、キトサン、ポリ（メタクリレート）、アクリルポリマーおよびポリ（スチレン−ジビニル−ベンゼン）から選択される。例えば、ＣＥＸ樹脂は、スルホネート、カルボン酸、カルボキシメチルスルホン酸、スルホイソブチル、スルホエチル、カルボキシル、スルホプロピル、スルホニル、スルホキシエチルおよびオルトリン酸から選択される陽イオン交換リガンド官能基を用いて調製される。特定の態様において、アルギニンと結合させたＣＥＸ樹脂は、アルギニン−スルホプロピル（Ａｒｇ−ＳＰ）アガロース樹脂などのアルギニン−スルホプロピル（Ａｒｇ−ＳＰ）樹脂である。

図１Ａは、塩溶出工程を用いたＳＰＳＦＦのクロマトグラムを示す。ＣＥＸカラムにｐＨ４．５で３０ｇ／Ｌの樹脂を充填し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で洗浄して、（ａ）５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ６．３）または（ｂ）５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ８．３）それぞれで溶出した。図１Ｂは、ｐＨ溶出工程を用いたＳＰＳＦＦのクロマトグラムを示す。ＣＥＸカラムにｐＨ４．５で３０ｇ／Ｌの樹脂を充填し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で洗浄して、（ａ）５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ６．３）または（ｂ）５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ８．３）それぞれで溶出した。図２は、塩溶出工程およびｐＨ溶出工程の溶出液（ＳＰＳＦＦ上）、ロード物質（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５緩衝液中）および５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ４．５）緩衝液中の対照溶液サンプルの、ＳＥＣプロファイルを示す。図３は、凝集および解離過程の提案された機序を示す。図４は、ＳＰＳＦＦの溶出液凝集物レベルに対するカラム負荷の影響を示す。ＳＥＣ試験を、ｐＨ溶出工程の直後（ｔ＝０日）および４℃で５日間インキュベーション後（ｔ＝５日目）に実施した。図５は、天然一本鎖および遊離一本鎖のＳＡＰスコアを示す。赤色と青色は、それぞれ疎水性表面積および親水性表面積を表す。図６Ａは、ｐＨ溶出工程の溶出液の凝集物レベルの経時変化を示す。全てのカラムにｐＨ４．５で３０ｇ／Ｌの樹脂を充填した。図６Ｂは、種々の樹脂についての凝集可逆性の経時変化を示す。全てのカラムにｐＨ４．５で３０ｇ／Ｌの樹脂を充填した。図７は、Ａｒｇ−ＳＰ混合モードアガロースビーズの概略図を示す。図８は、種々の樹脂を用いたｐＨ溶出工程の溶出液の凝集物レベルを示す。ＣＥＸカラムにｐＨ４．５で１０ｇ／Ｌの樹脂を充填し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ８．３）緩衝液で溶出した。図９は、種々の時点におけるＳＰＳＦＦ溶出プール（ｐＨ４．５で３０ｇ／Ｌの樹脂充填量）のＳＥＣを示す。ｐＨ溶出工程の溶出液を、溶出後４℃にて０、２、４、６、８、２４および１２０時間インキュベーション後にアッセイした。負荷物質の凝集物レベルは１．５％であった。図１０は、表面上の静電電位を計算することによって行われた種々のｐＨにおける電荷モデリングを示す；表面上のネガティブパッチは、ｐＨが上昇するにつれて増加する。図１１は、各残基におけるｐＨ４での値と比較した計算されたタンパク質帯電電位変化を示す。図１２は、種々のｐＨ条件におけるＳＰＳＦＦ、ＣＭＳＦＦ、および結合タンパク質のＤＳＦ結果を示す。図１３は、ＳＰＳＦＦに結合したときの、ＣＥＸ負荷ｐＨ、溶出液凝集物レベル、タンパク質正味電荷およびタンパク質融解温度（Ｔｍ）の間の相関関係を示す。図１４は、樹脂疎水性を示す染色色素（Sypro Orange dye）の実験を示す。樹脂を２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中でＳｙｐｒｏオレンジ色素と共にインキュベートした。全てのサンプルを、ローラーミキサーで、１８０ｒｐｍで５分間、上下させ、次いで写真を撮る前に重力沈降させた。実験条件は表４を参照のこと。

発明の詳細な説明
ある態様において、本発明は、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーにおいて凝集体形成を減少させて目的のタンパク質を精製する方法であって、（ａ）目的のタンパク質と１以上の汚染物質とを含む混合物を提供し；（ｂ）アルギニンと結合させたＣＥＸ樹脂上に前記混合物を負荷し；そして、（ｃ）目的のタンパク質を樹脂から溶出させることを含み、それにより、ＣＥＸクロマトグラフィーにおいて凝集体形成を減少させて目的のタンパク質を精製する方法を提供する。

特定の態様において、アルギニンと結合させたＣＥＸ樹脂は、アルギニン−スルホプロピル（Ａｒｇ−ＳＰ）アガロース樹脂などのアルギニン−スルホプロピル（Ａｒｇ−ＳＰ）樹脂である。例えば、混合物は、清澄化バルクまたは細胞培養上清を含む。例示すると、目的のタンパク質は、抗体、抗体フラグメントおよびＦｃ融合体から選択される。場合により、ＣＥＸクロマトグラフィー工程の前に、混合物を、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよびプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー）によって調製する。場合により、本発明の方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および／または混合モードクロマトグラフィーなどの１つまたは複数の追加のクロマトグラフィーマトリックスをさらに含む。

他の態様において、本発明は、アルギニンと結合した陽イオン交換（ＣＥＸ）樹脂を提供する。特定の態様において、アルギニンと結合させたＣＥＸ樹脂は、アルギニン−スルホプロピル（Ａｒｇ−ＳＰ）アガロース樹脂などのアルギニン−スルホプロピル（Ａｒｇ−ＳＰ）樹脂である。

定義
本明細書で用いる用語“精製する”および“分離する”は、互換的に用いられ、目的のタンパク質（例えば、抗体）を含む混合物からの汚染物質の除去を意味する。

本明細書で用いる用語“目的のタンパク質”は、その最も広い意味において、精製が望まれる、混合物中に存在する任意のタンパク質（天然または組換えのいずれか）を含むように用いられる。そのような目的のタンパク質には、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、免疫グロブリン（例えば、抗体）、免疫グロブリン様ドメイン含有分子（例えば、アンキリンまたはフィブロネクチンドメイン含有分子）およびＦｃ融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で用いる用語“Ｆｃ融合タンパク質”は、免疫グロブリン由来部分（すなわち、Ｆｃ部分）および第二の非免疫グロブリンタンパク質由来の部分を含む治療用タンパク質を包含することを意味する。

本明細書で用いるとき、“混合物”は、（精製が望まれる）目的のタンパク質および１つまたは複数の汚染物質、すなわち不純物を含む。一態様において、混合物は、目的のタンパク質を発現する宿主細胞または生物から（天然にまたは組換え的にのいずれかで）産生される。そのような混合物には、例えば、細胞培養物、細胞溶解物および清澄化バルク（例えば清澄化細胞培養上清）が含まれる。

本明細書で用いる用語“汚染物質”は、その最も広い意味において、混合物内のあらゆる望ましくない成分または化合物を含意するように用いられる。細胞培養物、細胞溶解物または清澄化バルク（例えば、細胞培養上清）において、混入物としては、例えば、細胞培養培地中に存在する、宿主細胞核酸（例えば、ＤＮＡ）および宿主細胞タンパク質、目的のタンパク質に関連するまたは由来するタンパク質（例えば、タンパク質分解フラグメント）および他の生成物関連汚染物質（例えば、目的のタンパク質の短縮体および凝集体）が挙げられる。宿主細胞の汚染タンパク質としては、宿主細胞によって天然にまたは組換え的に産生されたものが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で用いるとき、“洗浄する”とは、陽イオン交換樹脂を通してまたは陽イオン交換樹脂上に適当な緩衝液を通すことを意味する。

本明細書で用いるとき、“溶出させる”は、緩衝液がイオン交換物質上の荷電部位に対し分子と競合するように、陽イオン交換樹脂を取り囲む緩衝液のｐＨおよび／またはイオン強度を変えることによって陽イオン交換樹脂から目的のタンパク質（例えば、抗体）を取り出すことを意味する。

本明細書で用いるとき、“細胞培養物”とは、目的のタンパク質を産生する液体培地中の細胞を意味する。細胞は、例えば、細菌、真菌、哺乳動物または植物を含む生物に由来し得る。好適な液体媒体としては、例えば、栄養培地および非栄養培地が挙げられる。

本明細書で用いる用語“清澄化されたバルク”は、そこから粒子状物質（例えば、細胞）が実質的に除去されている混合物を意味する。清澄化されたバルクとしては、細胞培養上清、またはそれから細胞または細胞破片が、例えば濾過または遠心分離によって実質的に除去されている細胞溶解物が挙げられる。

用語“抗体”は、その最も広い意味において、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、イムノアドヘシン、抗体−イムノアドヘシンキメラ、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、グラフト抗体、またはインビトロ生成抗体を含むが、これらに限定されない、あらゆる既知の抗体を網羅するように用いられる。抗体は、全長抗体または抗体フラグメントであり得る。抗体は、既知の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭのいずれかから選択され得る。抗体は、単量体、二量体、または多量体（例えば、三量体または五量体）であり得る。

“抗体フラグメント”としては、全長抗体の少なくとも一部、および一般的にはその抗原結合領域または可変領域が挙げられる。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖフラグメント；一本鎖抗体分子；二重特異性抗体；線形抗体；ならびに、操作された抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれる。

用語“モノクローナル抗体”は、通常の意味において、集団を構成する個々の抗体が、少量存在し得る天然の変異体を除いて同一であるように、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味するのに用いられる。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられている。これは、一般的には抗原の異なる決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的であり、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。抗体を記載する際の用語“モノクローナル”は、実質的に均質な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本明細書で用いるモノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature 256:495 (1975) によって最初に記載された従来のハイブリドーマ技術を用いて産生することができるか、または、それらは組換えＤＮＡ法を使用して作製することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。モノクローナル抗体は、例えば、Clacksonら、Nature 352:624−628 (1991)；Marksら、J. Mol. Biol. 222:581−597 (1991)；ならびに、米国特許第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５８０，７１７号；同第５，９６９，１０８号；同第６，１７２，１９７号；同第５，８８５，７９３号；同第６，５２１，４０４号；同第６，５４４，７３１号；同第６，５５５，３１３号；同第６，５８２，９１５号；および、同第６，５９３，０８１号に記載の技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。

本明細書に記載のモノクローナル抗体には、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体中、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りの部分が、それらが所望の生物学的活性を示す限り、他の種に由来する抗体中、または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列、ならびにそのような抗体のフラグメントと同一または相同である、“キメラ”抗体および“ヒト化”抗体が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；および、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851−6855 (1984)）。非ヒト（例えば、マウス）抗体の“ヒト化”形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長動物などの非ヒト種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに高めるために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含んでいてよく、ここで、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そしてＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。場合により、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、一般的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み得る。さらに詳細には、Jonesらの、Nature 321:522−525 (1986)；Riechmannらの、Nature 332:323−329 (1988)；および、Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593−596 (1992)を参照のこと。

キメラ抗体またはヒト化抗体は、上記のように調製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的のマウスハイブリドーマから得られ、そして標準的な分子生物学的技術を用いて非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含むように操作され得る。例えば、キメラ抗体を作製するために、当技術分野で公知の方法を用いてマウス可変領域をヒト定常領域に連結することができる（例えば、Cabillyらの、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。ヒト化抗体を作製するために、当該分野で公知の方法を用いてマウスＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入することができる（例えば、Winterの、米国特許第５，２２５，５３９号、およびQueenらの、米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号および同第６，１８０，３７０号を参照のこと）。

本明細書に記載のモノクローナル抗体にはまた、例えば、ヒト患者の血液由来のものまたはトランスジェニック動物を用いて組換え的に調製されたものを含む、種々の供給源から単離され得る“ヒト”抗体も含まれる。そのようなトランスジェニック動物の例には、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を有するＫＭ−Ｍｏｕｓｅ^{（登録商標）}（Medarex, Inc., Princeton, NJ）（ＷＯ０２／４３４７８参照）、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ^{（登録商標）}（Abgenix, Inc., Fremont CA；例えば、Kucherlapatiらの、米国特許第５，９３９，５９８号；同第６，０７５，１８１号；同第６，１１４，５９８号；同第６、１５０，５８４号および同第６，１６２，９６３に記載）、ならびにＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ^{（登録商標）}（Medarex, Inc.；例えば、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287−6295；Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647−656；Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720−3724；Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117−123；Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821−830；Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912−2920；Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579−591；および、Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845−851, 米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；および、同第５，７７０，４２９号；同第５，５４５，８０７；および、Kormanらの、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２、ＷＯ０１／１４４２４に記載）。本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化時にヒト抗体応答が生じ得るようにヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを用いて調製することもできる。かかるマウスは、例えば、Wilsonらの、米国特許第５，４７６，９９６号および同第５，６９８，７６７に記載されている。

本明細書に記載の用語“クロマトグラフィー”は、混合物中の目的の溶質、例えば目的のタンパク質が、プロセスの特定の緩衝条件下で、例えば、ｐＩ、疎水性、サイズおよび構造など溶質の性質のために、多かれ少なかれ強く溶質を吸着するまたは保持する吸着剤を通して、混合物のパーコレーション（percolation）によって該混合物中の他の溶質から分離されるプロセスを意味する。

用語“イオン交換”および“イオン交換クロマトグラフィー”は、目的のイオン化可能溶質（例えば、混合物中の目的のタンパク質）が、該目的の溶質が混合物中の溶質不純物または汚染物質よりも多かれ少なかれ荷電した化合物と非特異的に相互作用するように、ｐＨおよび導電性の好適な条件下で固相イオン交換材に（例えば、共有結合によって）結合した反対に荷電したリガンドと相互作用するクロマトグラフィープロセスを意味する。混合物中の汚染溶質は、イオン交換材のカラムから洗い流すことができるか、または目的の溶質よりも早くまたは遅く、樹脂に結合させるかまたは樹脂から除くことができる。“イオン交換クロマトグラフィー”は、具体的には、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび混合型モードクロマトグラフィーを含む。

“陽イオン交換樹脂”または“ＣＥＸ樹脂”は、負に帯電しており、固相上または固相を通過した水溶液中の陽イオンと交換するための遊離陽イオンを有する固相を意味する。陽イオン交換樹脂を形成するのに適した固相に結合した負に帯電したリガンド、例えばカルボン酸塩、スルホン酸塩を用いることができる。市販の陽イオン交換樹脂としては、例えば、スルホン酸をベースにした基を有するもの（例えば、ＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｓおよび３０Ｓ、ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ^（商標）、GE Healthcare社製のＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Tosoh社製のＴｏｙｏｐｅａｒｌＳＰ−６５０ＳおよびＳＰ−６５０Ｍ、BioRad社製のＭａｃｒｏ−ＰｒｅｐＨｉｇｈＳ、Pall Technologies社製のＣｅｒａｍｉｃＨｙｐｅｒＤＳ、ＴｒｉｓａｃｒｙｌＭおよびＬＳＳＰおよびＳｐｈｅｒｏｄｅｘＬＳＳＰ）；スルホエチルをベースにした基を有するもの（例えば、EMD社製のＦｒａｃｔｏｇｅｌＳＥ、Thermo Scientific社製のＰｏｒｏｓＳ−１０およびＳ−２０）；スルホプロピルをベースにした基を有するもの（例えば、Tosoh社製のＴＳＫＧｅｌＳＰ５ＰＷおよびＳＰ−５ＰＷ−ＨＲ、Thermo Scientific社製のＰｏｒｏｓＨＳ−２０およびＨＳ５０）；スルホイソブチルをベースにした基を有するもの（例えば、EMD社製のＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤＳＯ_３ ⁻）；スルホキシエチルをベースにした基を有するもの（例えば、Whatman社製のＳＥ５２、ＳＥ５３およびＥｘｐｒｅｓｓ−ＩｏｎＳ)、カルボキシメチルをベースにした基を有するもの（例えば、GE Healthcare社製のＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ、Biochrom Labs社製のＨｙｄｒｏｃｅｌｌＣＭ、BioRad社製のＭａｃｒｏ−ＰｒｅｐＣＭ、Pall Technologies社製のＣｅｒａｍｉｃＨｙｐｅｒＤＣＭ、ＴｒｉｓａｃｒｙｌＭＣＭ、ＴｒｉｓａｃｒｙｌＬＳＣＭ、EMD−Millipore社製のＭａｔｒｘＣｅｌｌｕｆｉｎｅＣ５００およびＣ２００、Whatman社製のＣＭ５２、ＣＭ３２、ＣＭ２３およびＥｘｐｒｅｓｓ−ＩｏｎＣ、Tosoh社製のＴｏｙｏｐｅａｒｌＣＭ−６５０Ｓ、ＣＭ−６５０ＭおよびＣＭ−６５０Ｃ）；スルホン酸およびカルボン酸をベースにした基を有するもの（例えば、J.T. Baker社製のＢＡＫＥＲＢＯＮＤカルボキシ−スルホン）；カルボン酸をベースにした基を有するもの（例えば、J.T Baker社製のＷＰＣＢＸ、Dow Liquid Separations社製のＤＯＷＥＸＭＡＣ−３、Sigma−Aldrich者社製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ弱酸性陽イオン交換体、ＤＯＷＥＸ弱酸性陽イオン交換体、およびＤｉａｉｏｎ弱酸性陽イオン交換体ならびにEMD社製のＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤＣＯＯ−）；スルホン酸をベースにした基を有するもの（例えば、Biochrom Labs Inc.社製のＨｙｄｒｏｃｅｌｌＳＰ、Dow Liquid Separations社製のＤＯＷＥＸＦｉｎｅＭｅｓｈＳｔｒｏｎｇＡｃｉｄＣａｔｉｏｎＲｅｓｉｎ、J.T.Baker社製のＵＮＯｓｐｈｅｒｅＳ、ＷＰＳｕｌｆｏｎｉｃ、Sartorius社製のＳａｒｔｏｂｉｎｄＳ膜、Sigma−Aldrich社製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅＳｔｒｏｎｇＣａｔｉｏｎＥｘｃｈａｎｇｅｒ、ＤＯＷＥＸＳｔｒｏｎｇＣａｔｉｏｎおよびＤｉａｉｏｎＳｔｒｏｎｇＣａｔｉｏｎＥｘｃｈａｎｇｅｒ）；ならびに、オルトリン酸をベースにした基を有するもの（例えば、Whatman社製のＰ１１）が挙げられるが、これらに限定されない。

目的のタンパク質を含む混合物
本発明の方法は、タンパク質（複数可）を含む混合物から目的の１以上のタンパク質を精製するために用いられ得る。一態様において、混合物は、精製されるタンパク質を発現する生細胞から得られるか、またはそれにより産生される（例えば、天然にまたは遺伝子工学的方法により）。タンパク質を産生するために細胞を遺伝子操作する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Ausabel et al., eds. (1990)、Current Protocols in Molecular Biology (Wiley、New York) および米国特許第５，５３４，６１５号および同第４，８１６，５６７号を参照のこと（これらの各々を、引用により本明細書中に包含させる）。そのような方法は、タンパク質をコードし、タンパク質の発現を可能にする核酸を生きた宿主細胞に導入することを含む。これらの宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、または好ましくは、培養で増殖させた動物細胞であり得る。細菌宿主細胞としては、大腸菌細胞が挙げられるが、これに限定されない。好適な大腸菌株の例には、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＧＭ２９２９、ＪＭ１０９、ＫＷ２５１、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９ならびに外来ＤＮＡを切断することができない全ての大腸菌株が含まれる。用いることができる真菌宿主細胞には、出芽酵母細胞、メタノール資化酵母細胞およびアスペルギルス属細胞が含まれるが、これらに限定されない。用いることができる動物細胞株のいくつかの例は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＤＸＢ１１、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＮＳ０およびＷＩ１３８である。当業者に周知の方法を用いて新しい動物細胞株を樹立することができる（例えば、形質転換、ウイルス感染および／または選択により）。他の態様において、目的のタンパク質（例えば、抗体）は、ＣＨＯ細胞中で産生される（例えば、ＷＯ９４／１１０２６参照）。種々の種類のＣＨＯ細胞、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ⁻およびＣＨＯ−Ｓが当技術分野で公知である。

混合物の調製は、最初は、タンパク質の発現様式によって変わる。いくつかの細胞系は、細胞から周囲の増殖培地にタンパク質（例えば、抗体）を直接分泌する一方、他の系は、抗体を細胞内に保持する。細胞内で産生されたタンパク質の場合、細胞は、機械的剪断、浸透圧ショックおよび酵素処理などの様々な方法のいずれかを使用して破壊し得る。細胞破壊により、細胞の全内容物がホモジネート中に放出され、加えて、遠心分離または濾過により除かれ得る細胞内フラグメントを生じる。タンパク質産生過程の間の細胞の自然死および細胞内宿主細胞タンパク質の放出のために直接分泌されるタンパク質に関しても、より程度は低いが同様の問題が生じる。

一態様において、例えば、清澄化バルクを調製するために、細胞または細胞片が混合物から除去される。本発明の方法は、遠心分離、接線流濾過またはデプス濾過を含む、細胞または細胞片を除去するための全ての好適な方法を用いることができる。

タンパク質精製
本発明の方法は、混合物からの目的のタンパク質（例えば、抗体またはＦｃ融合タンパク質）のＣＥＸ精製のための改良された技術を提供する。これらの方法は、一般に、以下の工程を含む：（ａ）目的のタンパク質および１つまたは複数の汚染物質を含む混合物を提供すること；（ｂ）アルギニンと結合させたＣＥＸ樹脂上に混合物を負荷すること；および、（ｃ）目的のタンパク質を樹脂から溶出させて、それにより、ＣＥＸクロマトグラフィーにおいて凝集体形成を減少させて目的のタンパク質を精製すること。特定の態様において、アルギニンと結合させたＣＥＸ樹脂は、アルギニン−スルホプロピル（Ａｒｇ−ＳＰ）アガロース樹脂である。しかしながら、当業者は、上記の方法の工程の前、後または工程間にさらなる精製工程を行い得ることを理解する。アルギニンと結合させたＣＥＸ樹脂の使用により、アルギニンと結合していないＣＥＸ樹脂を用いるのと比較して、目的のタンパク質の凝集体形成が減少する。

目的のタンパク質（例えば、抗体）の陽イオン交換樹脂への結合は、精製されるタンパク質の最も酸性のアイソフォームのｐＩより低い任意のｐＨで行われ得る。特定の態様では、目的のタンパク質は、約ｐＨ４〜約ｐＨ８（例えば、約ｐＨ４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５および８）で樹脂に結合する。１つの例示的態様において、目的のタンパク質は、約ｐＨ６．２で樹脂に結合する。別の例示的態様において、目的のタンパク質は、約ｐＨ４．５で樹脂に結合する。

目的のタンパク質が陽イオン交換樹脂に結合したら、緩衝液で樹脂を洗浄することによって汚染物質（例えば、ＨＣＰ）を除去する。樹脂を洗浄するための最適ｐＨは、精製されたタンパク質の純度および収率をモニターすることによって目的の各タンパク質について経験的に決定することができる。洗浄緩衝液は、汚染物質、例えば、ＤＮＡおよび内毒素汚染物質をさらに除去するために、洗剤または界面活性剤（例えばポリソルベート）を用いて増量することができる。

陽イオン交換樹脂を洗浄後、目的のタンパク質を緩衝剤を用いて溶出させる。一般的に、溶出は、溶出緩衝液のｐＨを上げること、または、例えば溶出緩衝液への塩（例えば、塩化ナトリウム）の添加によって、結合緩衝液に対して溶出緩衝液のイオン強度を高めることによって促進される。さらに、ポリエーテル（例えば、ポリエチレングリコール）を溶出緩衝液に添加して、タンパク質の凝集および高分子量種の形成を減少させることができる。

アルギニンと結合させたＣＥＸ樹脂の調製
ある態様において、本発明は、アルギニンと結合させたＣＥＸ樹脂を提供する。ＣＥＸ樹脂とアルギニンとのカップリングは、アミン反応性化学基、例えば、ＮＨＳエステル、イミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ヒドロキシメチルホスフィンなどであるが、これらに限定されない基を用いて様々な方法で実施することができる。

以下の実施例に示されるように、ＳＰアガロース樹脂は、３−アミノ−１−プロパンスルホン酸の第一級アミン基をＮＨＳ活性化アガロースビーズとカップリングさせることによって調製することができる。Ａｒｇ−ＳＰアガロース樹脂は、Ｌ−アルギニンおよび３−アミノ−１−プロパンスルホン酸をＮＨＳ活性化アガロースビーズに順次カップリングすることにより調製することができる。ＮＨＳ活性化アガローススラリーを、初めに、ＤＩ（脱イオン）水で徹底的に洗浄してアセトン貯蔵溶液を除去し、次いで、０．２μｍ濾紙を備えた濾フラスコを用いて、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．２）のカップリング緩衝液で洗浄する。その後、ＳＰアガロース樹脂を調製するために、アガロースビーズを、３００ｍＭの３−アミノ−１−プロパンスルホン酸と１：２の体積比で、室温にて２時間、混合することができる。Ａｒｇ−ＳＰアガロース樹脂を調製するために、アガロースビーズを、初めに、３００ｍＭのＬ−アルギニンと５分間混合し、カップリング緩衝液で洗浄し、次いで３００ｍＭの３−アミノ−１−プロパンスルホン酸と、室温にてさらに２時間、混合する。カップリング反応の約８０％が、最初の０．５時間に起こる。リガンド固定化アガロースビーズをカップリング緩衝液で十分に洗浄した後、１Ｍのエタノールアミン溶液（ｐＨ７．４）を添加して、未反応ＮＨＳ官能基をキャップする。最後に、官能化アガロースビーズを、カラムパッキング用のカップリング緩衝液で再度洗浄する。

本開示を以下の実施例によってさらに説明するが、それらはさらなる限定として解釈されるべきではない。本出願を通して引用された全ての図および全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、その内容全体が引用により本明細書に明確に包含される。

実施例１
構造的に不安定なＦｃ融合タンパク質のための陽イオン交換クロマトグラフィーにおける凝集体形成および解離の理解における考察

材料および方法
１．化学物質、樹脂およびタンパク質
全ての化学物質は、特に断らない限り、Ｊ.Ｔ．Ｂａｋｅｒ社（Phillipsburg、NJ、USA）から入手した。３−アミノ−１−プロパンスルホン酸（３ＡＰＳ）およびエタノールアミンは、Sigma−Aldrich社（St．Louis、MO、USA）から購入した。ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（SP SFF）樹脂およびＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（CM SFF）樹脂は、GE Healthcare Sciences社（Uppsala、Sweden）から入手した。ＰｏｒｏｓＸＳ樹脂およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化アガローススラリーは、Life Technologies社（Waltham、MA、USA）から購入した。ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＲａｐｉｄＳおよびゲル濾過標準は、Bio−Rad社（Philadelphia、PA）から購入した。この研究に用いたＦｃ融合タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現され、Bristol−Myers Squibb社により製造された。このＦｃ融合タンパク質の全体分子量は７８ｋＤａである。試験のｐＩ（等電点）は、ゼータ電位測定により７．２と決定された。前述のように、このＦｃ融合タンパク質については、ヒンジ領域内および他の２本の一本鎖の間のどこにもジスルフィド結合は存在しない。この試験で用いたタンパク質負荷材は、プロテインＡ精製プールを標的溶液条件に緩衝液交換することによって得られた。

２．クロマトグラフィー装置および方法
全てのクロマトグラフィー実験は、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアバージョン６．３（Piscataway、NY、USA）をインストールしたGE HealthcareのＡＥＫＴＡＡＶＡＮＴシステムを用いて行った。ＳＰＳＦＦ、ＣＭＳＦＦおよびＰｏｒｏｓＸＳ樹脂を、GE Healthcare（Piscataway、NY、USA）から購入したＣ１０／１０カラム（１．０ｃｍＩ.Ｄ × １０ｃｍベッド高）に充填した。充填および調整されたカラムを、５カラム容量（ＣＶ）の５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０−５．５）で平衡化し、次いで、（特に断らない限り）６分間の滞留時間を用いて対応するｐＨにて、タンパク質を負荷した。その後、カラムを３ＣＶの５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で洗浄した。結合したＦｃ融合タンパク質を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ６．３）または５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ８．３）のいずれかで溶出させ、溶出液をピークの両側で０．１５ＯＤの吸光度の間の画分に集めて最大の産物回収を達成した。溶出ｐＨ条件（ｐＨ６．３、８．３）は通常の酢酸緩衝能の範囲外であることが特記されるべきである。それらは、主に、緩衝液マトリックス（例えば、ＭＥＳまたはリン酸塩）を変更することなく、または追加のイオン種を導入することなく、溶液組成を単純化するためにここで選択された。この研究の主眼は、ＣＥＸ工程に関連する凝集現象の機序を理解することであり、それ故、モノマーの精製を達成するために、モノマー精製を達成するために高度なピークカット戦略は利用されなかった。カラムを３ＣＶの２ＭＮａＣｌで再生し、３ＣＶの１ＭＮａＯＨで清浄化し、最後に各実験後に０．１ＭＮａＯＨで貯蔵した。タンパク質濃度は、Thermo Fisher Scientific（Wilmington、DE、USA）から購入したＮａｎｏＤｒｏｐ２０００を用いて測定した。全ての実験を室温で行った。

３．凝集体分析のためのＳＥＣ法
分析ＳＥＣを、Waters Corporation（Milford、MA、USA）のＷａｔｅｒｓＨＰＬＣシステムにインストールされたTosoh Bioscience（King of Prussia、PA、USA）のＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬカラムを用いて行った。この方法では、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ硫酸ナトリウム（ｐＨ６．８）を１ｍＬ／分の流速で用いて、定総注入タンパク質量は１００μｇであった。溶出したタンパク質をＵＶ２８０ｎｍでモニターした。

４．Ｓｙｐｒｏオレンジ色素による試験
ＳＰＳＦＦ、ＣＭＳＦＦおよびＰｏｒｏｓＸＳ樹脂を、２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）緩衝液に緩衝液交換し、５０％（ｖ／ｖ）重力沈降スラリーのために調整した。色素含有サンプルについては、４００μＬの樹脂スラリーを、９８．５μＬの２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）緩衝液およびInvitrogen（Paisley、Scotland、U.K.）から購入した１．５μＬのＳｙｐｒｏオレンジ色素（５０００Ｘ）と混合した。非標識対照サンプルについては、４００μＬの樹脂スラリーを、１００μＬの２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）緩衝液と混合した。全てのサンプルをローラーミキサーで、１８０ｒｐｍで５分間反転撹拌し、その後、写真を撮る前に重力沈降させた。

５．示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）研究
樹脂、ＳＰＳＦＦおよびＣＭＳＦＦを、対応する緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０−５．５）に緩衝液交換し、５０％（ｖ／ｖ）重力沈降スラリーに調整した。実験を、Applied Biosystems（Warrington、Cheshire、U.K.）の７５００リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）システム（software version 1.4.1）を用いて行った。まとめると、樹脂（終濃度１０％ｖ／ｖ）、タンパク質（終濃度１ｇ／Ｌ）、Ｓｙｐｒｏオレンジ色素（終濃度１５Ｘ）および対応するｐＨの緩衝液を予め計算した比率で混合し、高速光学９６ウェル反応プレート（Applied Biosystems）に加えて、最終容量２０μＬ／ウェルにし、各条件をデュプリケートで調製した。Applied Biosystemsから購入した光学接着フィルムで密封した後、プレートをＲＴ−ＰＣＲで直接分析した。加熱サイクルは、２分間の４℃の予備冷却工程と、その後の３０秒間で０．５℃ずつの上昇で４℃から５３℃までの勾配温度での９９段階を含んだ。Ｓｙｐｒｏオレンジ色素を検出するための較正設定（λ_ｅｘ４９０ｎｍ；λ_ｅｍ５８０ｎｍ）を用いてデータを集め、蛍光データを修正ＣｌａｒｋｅおよびＦｅｒｓｈｔ式に当てはめて分析した［３５］。

式中、Ｉ（Ｔ）は、蛍光強度である；Ｔは、各蛍光データ点の実際の温度である；Ｔ_ｍは、融解温度である；α_Ｆおよびβ_Ｆは、それぞれ折り畳み状態のベースラインの切片と傾きである；α_Ａおよびβ_Ａは、それぞれ、高温での蛍光消光工程についての切片および傾きである；ｍは、見かけの融解温度における遷移の勾配に関連する指数因子である。α_Ｆ、β_Ｆ、α_Ａ、β_Ａ、ｍおよびＴ_ｍの値は、ＤＳＦデータに適合するように最小二乗法を用いることによって得られた。

６．実験室内の（In−house）樹脂調製
ＳＰアガロース樹脂を、３−アミノ−１−プロパンスルホン酸の第一級アミン基をＮＨＳ活性化アガロースビーズとカップリングすることにより調製した。Ａｒｇ−ＳＰアガロース樹脂を、Ｌ−アルギニンおよび３−アミノ−１−プロパンスルホン酸をＮＨＳ活性化アガロースビーズに順次カップリングさせることにより調製した。ＮＨＳ活性化アガローススラリーを、初めに、ＤＩ水で徹底的に洗浄してアセトン貯蔵溶液を除去し、次いで、０．２μｍ濾紙を備えた濾フラスコを用いて、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．２）のカップリング緩衝液で洗浄した。その後、ＳＰアガロース樹脂を調製するために、アガロースビーズを、３００ｍＭの３−アミノ−１−プロパンスルホン酸と１：２の体積比で、室温にて２時間、混合した。Ａｒｇ−ＳＰアガロース樹脂を調製するために、アガロースビーズを、初めに、３００ｍＭのＬ−アルギニンと５分間混合し、カップリング緩衝液で洗浄し、次いで３００ｍＭの３−アミノ−１−プロパンスルホン酸と、室温にてさらに２時間混合した。カップリング反応の約８０％が、製造業者提供のプロトコールに従って最初の０．５時間に起こる。リガンド固定化アガロースビーズをカップリング緩衝液で十分に洗浄した後、１Ｍのエタノールアミン溶液（ｐＨ７．４）を添加して、未反応ＮＨＳ官能基をキャップした。最後に、官能化アガロースビーズを、カラムパッキング用のカップリング緩衝液で再度洗浄した。この作業で調製したＡｒｇ−ＳＰアガロース樹脂を、内径５ｍｍのＡＰＭｉｎｉＧｌａｓｓカラム（Waters Corporation、Milford、MA、USA）に、約５ｃｍのベッド高で充填した。

７．モデリング法
タンパク質３Ｄ構造を、ＢＩＯＶＩＡＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｔｕｄｉｏソフトウェア内の相同性モデリングを用いて得た［３６］。タンパク質構造に基づいて、空間的凝集傾向（ＳＡＰ）モデルを用いて、ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｔｕｄｉｏ内の相同性モデル化構造を用いて凝集しやすい疎水性領域を決定した。タンパク質の各原子のＳＡＰ値は次のように定義されている［３７］。
ここで、１０Åの半径（Ｒ）内の側鎖原子のＳＡＡ（溶媒接触面積）はコンピュータ計算され、ここで、完全に露出した残基の側鎖のＳＡＡは、トリペプチドの完全に伸びた立体構造における中央残基の側鎖のＳＡＡを計算することによって得られる。残基疎水性は、グリシンが疎水性０を有するように正規化された疎水性スケール［３８］から得られる。従って、グリシンよりも疎水性が高いアミノ酸は陽性であり、グリシンよりも疎水性が低いアミノ酸は疎水性スケールでは陰性である。残基に対するＳＡＰは、その全ての構成原子のＳＡＰを平均することによって得られる。タンパク質表面の全体的な疎水性を示すタンパク質ＳＡＰスコアは、全ての残基についてのＳＡＰ値をプラスのＳＡＰスコアで合計することによって得られる。

種々のｐＨ条件でのタンパク質電荷は、ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｔｕｄｉｏソフトウェアのタンパク質イオン化プロトコールに基づいて計算される。電荷は、タンパク質構造内の滴定可能なアミノ酸残基のそれぞれについてのｐＫ_１／２および滴定曲線を予測することに基づいている。静電場の電位（electrostatic potential）は、ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｔｕｄｉｏ内のＤｅｌｐｈｉプログラムを用いて計算される。Ｄｅｌｐｈｉプログラムは、差分法を用いて立方格子上のポアソン−ボルツマン方程式を解く。ＣＨＡＲＭＭ完全原子論的力場［３９］は、これらの電荷とポテンシャルの計算に用いられる。静電ポテンシャルは、計算されたポテンシャルで分子表面を着色することによって視覚化される。平均残基電位は、その構成原子における静電電位の値を平均することによって計算される。

結果および考察
１．ＣＥＸにおけるＦｃ融合タンパク質の凝集挙動
５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ６．３）を用いる塩溶出工程中、ＳＰＳＦＦカラムにてマルチピーク溶出プロファイル（図１Ａ）が観察された。ＳＥＣ分析に基づく溶出凝集物レベル（８．６％）は、充填材のそれ（１．５％）よりもはるかに高く、ＣＥＸ工程中の顕著な凝集物形成を示した。図１Ａのトレーサーは、塩遷移中に一時的なｐＨ低下を示し（＜ｐＨ４．５まで）、これは溶出フロントと同時に起こり、一時的な低ｐＨおよび高塩環境をもたらした。５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ５．６）の溶出緩衝液は、ｐＨ６．３の酢酸塩と同様のｐＨ遷移現象を示した。ｐＨ６．３の酢酸塩を、形成された凝集体の良好な定量化のためのタンパク質回収率を最大化させるために、塩溶出工程に用いた。塩溶出工程中の同様のｐＨ遷移現象が他の研究において報告されている［３２−３４］。低ｐＨおよび高塩は、溶液内タンパク質安定性試験に基づいて凝集および沈殿を引き起こすことが見出された。溶出画分を用いた別の試験（記載なし）もまた、以前の報告［１２］と同様に、遅い溶出ピークがより高い凝集物レベルを含むことを確認した。これとは対照的に、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ８．３）を用いたｐＨ溶出工程では、結果として、単一ピーク溶出およびスムーズなｐＨ遷移が得られた（図１Ｂ）。それにもかかわらず、主要な凝集形成も溶出液中に観察された（６．１％）。単一ピーク溶出プロファイルは、ｐＨ溶出工程中に形成されたモノマーおよび凝集体が同様の溶出特性を有していたことを示す。別の研究で評価されたタンパク質の溶液中の安定性（室温にて２４時間）（データ示さず）に基づいて、タンパク質は、低塩濃度でｐＨ４．０−８．０の間で溶液中で安定であり、調べた条件では、凝集体形成は観察されなかった。この研究は、ｐＨ溶出工程研究で観察された凝集現象の根本原因としてのタンパク質溶液特性を除外するのに十分な証拠を提供した。

２つの異なる溶出条件の間に形成される凝集体の種類をよりよく理解するために、塩溶出工程プールおよびｐＨ溶出工程プールのＳＥＣプロファイルを、充填材（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中）および５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ４．５）を用いて調製したタンパク質溶液のそれと比較した。タンパク質溶液サンプルの緩衝液条件は、溶出時にカラム内の緩衝液遷移領域にあることを模倣するように選択された（図１ａ）。ピーク最大値でのタンパク質濃度および溶液条件はカラム内での溶出が進むにつれて変化し、緩衝液遷移領域内のタンパク質量は全溶出タンパク質のほんの一部にすぎないことを考慮すると、溶液サンプルが溶出サンプルと真に匹敵するような条件を特定することは実際上不可能である。従って、タンパク質溶液サンプルは、実際のＣＥＸ溶出中に経験した条件の半定量的比較しか提供できない。図２に示すように、ＳＥＣプロファイルでは２つの異なるピークが観察された。これらの２つのピークの保持時間をBio−Rad社のゲル濾過標準のクロマトグラムと比較すると、ＨＭＷ_１およびＨＭＷ_２はそれぞれ、二量体およびオリゴマー種にほぼ対応することが示唆される。オリゴマー種は、溶液サンプル中で最も多く存在し、これはＳＥＣ分析前のＣＥＸ工程の持続時間（図２）に等しい時間（≦４時間）保持された。同様のＳＥＣプロファイルが塩溶出工程においても観察され、溶出時の一時的な低ｐＨおよび高塩環境もまたタンパク質凝集を引き起こし、同様のＨＭＷ種を生成する可能性があることを示唆する。塩溶出工程における低い凝集レベルは、図１ａに示されるように、緩衝液遷移領域中の溶出液の塩濃度がわずかに低いためである可能性が高い。ｐＨ溶出工程で形成された凝集体の大部分は二量体であり、これは、塩溶出工程中に低ｐＨおよび高塩条件で形成された凝集体とは異なる。ｐＨ溶出は、タンパク質にとって好ましくない溶液環境を作り出さなかったので、凝集体レベルの増加はおそらくＣＥＸにおけるタンパク質−樹脂の相互作用の結果であった。

ｐＨ溶出工程を用いて、ＣＥＸ工程中に形成された凝集体の性質に対するタンパク質−樹脂の相互作用の影響を評価した。なぜなら、この溶出モードは、タンパク質が不安定である溶液条件（例えば、低ｐＨおよび高塩）を効果的に回避することができるからである。このアプローチを用いて、４℃に保持されたサンプルについての断続的なＳＥＣ分析を通して、ＣＥＸ溶出液中の凝集体の安定性を調べた。図９に示すように、凝集ピークの大きさは保持時間の増加とともに減少し、ＳＰＳＦＦについてのＣＥＸ工程中に形成されたいくつかの凝集体種の可逆的性質が示唆される。溶出液の凝集レベルは、溶出後最初の８時間で６．１％から４．１％に減少し、５日後に２．１％まで減少し続けた。この結果は、凝集体解離反応速度が、実質的にサンプル保持時間に依存して溶出液凝集体含有量のレベルに影響を及ぼし得ることを示唆している。従って、ＣＥＸにおける凝集体形成および凝集可逆性に寄与する要因の機序の理解は、ロバストかつ高収率のＣＥＸ精製プロセスの開発にとって特に重要であった。

２．提案された仮説
他の報告されている研究［１６−１８］とは異なり、凝集体形成は、結合タンパク質のための過度の保持時間を必要とせず、溶出液凝集レベルは、時間依存的自己解離過程に関連する可能性がある。ここで観察された現象は、複雑な凝集機序を示唆し、ＣＥＸ中に形成された凝集体が、可逆的な立体構造変化を有するそれらの分子間の一時的に好ましいタンパク質−タンパク質相互作用による可能性が高いという仮説が立つ。とりわけ、凝集体解離は、数日までの時間スケール内で天然立体構造が徐々に回復する間の動力学的駆動プロセスであるように思われた。

提案した仮説の概略図を図３に示す。この仮説は、ＣＥＸの吸着および脱着の際の単純な２工程の凝集プロセス、ならびにＣＥＸ溶出液中の凝集体解離プロセスを記載する。提案された凝集メカニズムによれば、ＣＥＸ溶出液中の凝集体レベル（Ａ_ｉｒ+Ａ_ｒ）は、２つの寄与要因：結合タンパク質の立体構造変化および脱着の際のこれらの部分的に折り畳まれていない分子
の濃度によってもたらされる。２つの要因が一体となって、ＣＥＸ溶出液中で検出される凝集体の特性（Ａ_ｉｒまたはＡ_ｒ）および凝集体の量を決定する。一般的に、
における高度の立体構造変化および
の高濃度は、これらの折り畳まれていない分子が互いに遭遇し、その結果凝集体を形成する可能性が高くなり、結果として、溶出液凝集体レベルが高くなる。タンパク質の静電的相補性および多様な疎水性が非天然凝集を促進し得る構造摂動を有する分子に対するペア毎で高次分子間相互作用が、凝集体形成の主な原因である［４０］。従って、部分的に折りたたまれていない分子がすべて、とりわけ低濃度の
で凝集を引き起こす分子衝突に関与するわけではない。構造変化に応じて、いくつかの凝集体は、熱力学的平衡に達するのに十分な時間が与えられたとき、可逆的（Ａ_ｒ）になる可能性があり、最終的には天然タンパク質（Ｎ）に戻る可能性がある。

３．メカニズム研究
１）カラム負荷の効果
ＳＰＳＦＦ溶出液中の凝集体レベルに対するカラム負荷の影響を試験した。全ての溶出液サンプルを、溶出直後および５日後に再度（４℃保存）、ＳＥＣについてアッセイした。ｔ＝０ｄでの溶出液凝集レベルは、比較的広い範囲のカラム負荷（１−５０ｇ／Ｌ樹脂）内で大幅に変化した。ＳＰＳＦＦの動的結合能は、５０ｇ／Ｌ樹脂よりも大きい。全ての実験で顕著に高い全体的な生成物回収率（≧９８％）が得られたため、ＳＥＣの結果は、ここでは異なる負荷条件で直接的に比較される。図４に示すように、溶出液凝集レベルは、最初に増加し、次いでわずかに減少し、最大凝集物レベルは約３０ｇ／Ｌ樹脂で達成された。最終的に、全ての溶出液サンプルは、５日後（ｔ＝５ｄ）に実質的に同じ凝集物レベルを示した。ＳＰＳＦＦ溶出液中の不可逆的な凝集体の量が、試験した特定の条件における負荷条件とは本質的に無関係であるのに対して、この結果は、最初の凝集物レベルに対するカラム負荷の影響を示唆する。カラム負荷と溶出液凝集物レベル（ｔ＝０ｄでの）との間の非線形相関は、吸着の際のタンパク質立体構造変化
と脱着の際の
の濃度とを結び付けることによって提案されたメカニズムの枠組みを用いて定性的に理解することができる。カラム負荷は、脱着の際の
の濃度およびこれらの凝集しやすいタンパク質分子が凝集体を形成するために遭遇する可能性に影響を与える。低負荷での溶出液に見られる比較的低い凝集物レベルは、凝集物形成の可能性に対する負荷の影響を考慮すると、主に溶出の際の
の低濃度のためであった。加えて、図４の下に凹状の傾向は、立体障害および反発的なタンパク質−タンパク質相互作用のために、より高い負荷がタンパク質の立体構造変化の減少を引き起こし得る場合の、
の立体構造変化の程度に対するカラム負荷の影響を示唆するように思われる。
の立体構造の変化は通常、タンパク質の疎水性表面部分の露出［４１］およびタンパク質凝集にとってエネルギー的に好ましい条件をもたらす［４２］。最大の溶出プールＨＭＷが中間負荷レベルで達成された図４で観察される非線形パターンの、減少したレベルの
の立体構造変化および増加レベルの
の濃度がもたらされた。

２）負荷ｐＨの影響
溶出液凝集物レベルに対する負荷ｐＨ（４．０から５．５）の影響を評価するために、ＳＰＳＦＦにて一連の実験を行った。異なるｐＨ条件における負荷伝導率は極小さい範囲（２．０〜２．５ｍ^Ｓ／ｃｍ）内でのみ変化した。表１は、負荷ｐＨの増加と共に溶出液凝集物レベルが有意に減少したことを示しており、これは全体的に誘引的なタンパク質−樹脂相互作用と一致している。タンパク質の静電ポテンシャルは、方法セクションに記載されている相同性モデリングツールを使用して計算され、異なるｐＨ条件下での電荷分布を示した。電荷モデリング（図１０）は、タンパク質表面、とりわけＣＤＲ領域およびＦｃ領域において、ｐＨが高くなるにつれてより負に帯電したパッチを示すことを示している。タンパク質上のこれらの負の表面積は、樹脂上のアニオン性リガンドと相互作用するときに反発的な環境を作り出す可能性があり、全体的な結合強度およびタンパク質の立体構造変化を減少させる。さらに、図１１の帯電電位変化は、小さなｐＨ変化でアミノ酸残基の帯電電位が劇的に変化する場所を明確に示している。ChangおよびLenhoffら［４３］は、タンパク質−樹脂相互作用が、タンパク質構造中の少数のアミノ酸残基によって大部分決定され、これは結合タンパク質の立体構造の完全性の維持およびそれによる溶出液の凝集物レベルの冷夏に対する負荷ｐＨ条件の影響の説明に役立つかもしれない。Chaudhriら［４４］は、粗粒度（coarse−grained）計算モデルを用いて、ｍＡｂ−ｍＡｂの関連性の傾向が、数個のアミノ酸のみが異なる変異体では顕著に異なり得ることを確認した。ＣＥＸにおけるタンパク質構造の安定性に特に重要な特定のアミノ酸残基を同定することは、タンパク質の一次配列に生物学的に重要でない変更を加えることによって凝集を阻害する分子（aggregation−resistant molecule）［４５］を操作することに役立ち得る［４６］。明らかに、製造にやさしい生物学的分子の合理的設計は、タンパク質−タンパク質の相互作用およびタンパク質−樹脂の相互作用が潜在的なタンパク質立体構造変化に与える影響を説明するための、本研究の範囲外であるさらなるモデリングの取り組みを必要とする。

直交実験ツール（orthogonal experimental tool）として、ＤＳＦを用いてタンパク質の立体構造変化の存在および深刻度をさらに試験し、そしてＣＥＸ条件を溶出液の凝集体レベルに相関させた。ＤＳＦ試験は、試験対象の疎水性表面（例えば、タンパク質）に結合したときに蛍光を活性化し得るメロシアミン色素の一員であるＳｙｐｒｏオレンジ色素を用いて実施された［４７−４９］。異なるｐＨにてＣＭおよびＳＰセファロースと結合したタンパク質についてのＤＳＦの結果を図１２に示した。温度を徐々に上げながら調製したサンプルの蛍光を記録する安定性曲線を式１に当てはめて、融解温度（Ｔ_ｍ）を推定した。Ｔ_ｍはタンパク質立体構造の完全性の熱安定性を表すので、ここでは、調べた溶液条件におけるタンパク質の立体構造の安定性の代替指標として使用されている。

表２に示されるように、結合および遊離タンパク質の両方の適合Ｔ_ｍ値は、ｐＨが低下するにつれて減少し、これは、タンパク質がより低いｐＨで立体構造的に不安定になったことを示唆する。遊離溶液では、タンパク質のＴ_ｍ値は、ｐＨ５．５からｐＨ４．５までごく僅かに低下を示しただけだが、ｐＨ４では、タンパク質の構造的剛性が低下したり、および／または大きな立体構造変化を起こしたりし得るなど、顕著に低下した。結合タンパク質については、両方の樹脂についてのＴ_ｍの有意な低下は、ｐＨ４．５−５．０付近のより高いｐＨで生じた。結果は、対応する条件で、結合タンパク質がより疎水性の領域を露出し、遊離溶液中よりも立体構造的に安定でなくなったことを明確に示している。さらに、ＳＰＳＦＦ上の結合タンパク質のＴ_ｍ値は、ＣＭＳＦ上のそれよりも一貫して低いように見え、ＳＰＳＦＦに結合したときの該タンパク質のより低い構造的安定性を示唆している。この観察されたパターンは、両樹脂が同じアガロースベースのマトリックスおよび類似の細孔形態を有するので、全体的なリガンド特性（例えば、タイプ、密度、リンカーの柔軟性など）と関連している可能性が高い［５０］。異なる樹脂のＣＥＸ挙動は、以下により詳細に議論される。電荷モデリングをＤＳＦの結果と組み合わせると、より低ロードｐＨでの結合強度の増加は、より高度のタンパク質立体構造変化、より疎水性の表面露出、およびより低いタンパク質構造安定性をもたらし、さらにＣＥＸにおけるより多くの凝集体形成をもたらしたことが分かる。図１３に示すように、ロードｐＨは、計算され測定された生物物理学的性質、ならびにＣＥＸ溶出液凝集体レベルと合理的によく相関している。

試験したタンパク質について、ＣＥＸ工程において示される立体構造不安定性は、２本の一本鎖間にジスルフィド結合がないことに起因し得る。タンパク質の二次構造および三次構造が依然としてＣＥＸ樹脂表面上に大部分保存されている間に、局所的な立体構造変化が起こり得ることが報告されている［１６］。ＳＡＰモデリングを用いて、タンパク質の疎水性に対する小さな立体構造変化の潜在的な影響を調べた。このモデルは、溶媒に曝されたタンパク質表面の疎水性領域の程度を推定する［３７］。仮定された単純なシナリオは、樹脂表面へのタンパク質吸着の際に、２つの一本鎖が数オングストローム（Å）のギャップで互いに分離し得るということであった。ギャップが溶媒接近性を可能にするとき、タンパク質表面の疎水性は変化すると予想される。一本鎖の表面疎水性は、２本の一本鎖が実際に１０Å以上のギャップで隔てられている極端な場合を模倣するために、天然タンパク質構造ならびに他の一本鎖の存在なしの条件において計算された。ＳＡＰモデル化の両方の場合において、一本鎖の二次構造および三次構造は同じに保たれた。図５において、２つのシナリオは、露出した疎水性領域の分布に明らかな違いがあることを示す。２本の一本鎖が完全に溶媒接近性を可能にするほんのわずかなギャップで開くと、ＳＡＰスコアは７５から９３に増加し、これはタンパク質疎水性が２４％増加することを表す。吸着によりタンパク質構造がどのように変化するかについては多くの可能性があるが、図５の簡単なシナリオは、ＣＥＸにおける凝集メカニズムの提案された仮説（図３）と、および結合タンパク質が遊離溶液中のタンパク質よりも疎水性が高いことが明らかなＤＳＦ実験と、定性的によく一致している。ＳＡＰ計算は、タンパク質の二次構造および三次構造に影響を及ぼす他の立体構造変化を考慮することさえもせずに、タンパク質疎水性に対する２つの一本鎖間のギャップの影響を示すのみであることに留意すべきである。

３）負荷中の滞留時間（residence time （ＲＴ））の影響
溶出液凝集体レベルに対する負荷ＲＴの影響を調べて、結合タンパク質の立体構造変化が起こる時間スケールを試験した。合計のタンパク質／樹脂接触時間は、負荷ＲＴ（すなわち、流速）を変えること、および／またはタンパク質をＣＥＸカラムにロードした後に静的保持を加えることによって変えた。この試験では溶出ＲＴを一定に保った。表３に示すように、負荷ＲＴを２分から６分に変更したとき、溶出液凝集体レベルは４．５％から６．１％まで中程度増加し、これは１２分から３６分への結合タンパク質／樹脂接触時間の増加に対応した。より長い負荷ＲＴは、より長い接触時間のためにより多くのタンパク質立体構造変化をもたらし得るだけでなく、ＣＥＸ中の粒子内物質移動の重要性が低い役割のために溶出時のより高いタンパク質濃度にもつながり得て、両方とも、増大した溶出液凝集体レベルに寄与し得る。この現象は、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質の立体構造安定性、およびタンパク質濃度の関数としての凝集率を相関させる溶液研究とよく一致している［２６］。注目すべきことに、溶出液凝集体レベルは、６分間の負荷ＲＴおよび追加の１２時間の静的保持により１７．７％に増加し、Ｆｃ融合タンパク質において激しい立体構造変化を引き起こすことに対するタンパク質／樹脂接触時間の有意な影響を示す。この観察は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２についても報告されている［１２、１８］。吸着時に構造変化を受けるタンパク質の速度論的タイムスケールは、通常のＣＥＸ操作に実際的に関連があることに留意されたい。従って、負荷ＲＴは、ＣＥＸ工程で溶出液凝集体レベルを制御するのに役立つ重要な要素であり、この研究で試験したもののように、構造的に不安定なタンパク質では遅い負荷と不要な折り畳みはできるだけ避けるべきである。また、予期せぬカラム上での結合生成物の保持でも、ロバストなカラム性能を確保するために、ＣＥＸプロセス開発中に広範なタンパク質／樹脂接触時間を試験することの重要性も強調している。興味深いことに、実際的に関連性のある異なる溶出ＲＴ条件において、溶出液凝集体レベルにおける大きな違いは観察されなかった（データ示さず）。これは、溶出中の凝集速度論が、吸着時に立体構造変化を受けるタンパク質の速度論よりもはるかに速いことを示した。

４）ＣＥＸ樹脂の種類による影響
タンパク質構造の変化がタンパク質表面の疎水性の変化を必然的にもたらすことを考慮して、ＳＰＳＦＦ、ＣＭＳＦＦ、およびＰｏｒｏｓＸＳは、樹脂特性、特に固定相疎水性およびイオン化可能なリガンドタイプの影響を評価するために同様の条件で調べられた。ＰｏｒｏｓＸＳおよびＳＰＳＦＦの支持マトリックスは、それぞれ架橋ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）および架橋アガロースである。ＣＭＳＦＦは、ＳＰＳＦＦと同じベースマトリックスを有するが、樹脂は、ＣＯ_３ ⁻リガンドで官能化されている。

図６Ａに示すように、最初の溶出液凝集体レベルは、３つの樹脂間でかなり異なり、多いものから順にＰｏｒｏｓＸＳ（７．２％）、ＳＰＳＦＦ（６．１％）およびＣＭＳＦＦ（３．７％）であった。ＰｏｒｏｓＸＳからのタンパク質回収率はたった８９％であり、ＳＰＳＦＦ（≧９８％）およびＣＭＳＰＰ（≧９８％）よりはるかに低いことに注目すべきである。ロードされた残りのタンパク質は、アルカリ性の（caustic）洗浄工程中にＰｏｒｏｓＸＳカラムからのみ除去でき、このことは、タンパク質−樹脂相互作用が非常に強くなり、実質的に不可逆的な結合が生じたことを示唆した。樹脂特性の違いをよりよく理解するために、表４に記載の条件でＳｙｐｒｏオレンジ色素溶液を新鮮な樹脂粒子と混合した。図１４に示す通り、ＣＭＳＦＦおよびＳＰＳＦＦは、色素を添加する前後の樹脂相中の淡い色の変化に基づいて極少量の色素結合を示し、これは、おそらくアガロースベースマトリックスの既知の親水性のためである。反対に、ＰｏｒｏｓＸＳは、樹脂の色の変化によって示唆されるように、顕著な色素結合を示した。これは明らかに、その親水性コーティングに関わらず、ＰｏｒｏｓＸＳが、疎水性色素を結合するのに十分に疎水性であることを示している。ＣＭＳＰＰおよびＳＰＳＦＦと比較して、ＰｏｒｏｓＸＳは、タンパク質と樹脂との間の二次疎水性相互作用を介して結合タンパク質とより強く相互作用することができ、これはまた、ＰｏｒｏｓＸＳ溶出液における不可逆的結合および凝集体形成のより高い割合を説明する。しかしながら、異なるリガンド密度、リンカー特性、細孔構造およびベースマトリックスの疎水性の影響が、異なる樹脂についての交絡変数であるため、観察された傾向を特定の要因（複数可）に帰することは困難であることに注意すべきである。

図６における別の観察は、研究した３つの樹脂についての凝集可逆性の比較である。図６Ａに示すように、ＣＭＳＦＦおよびＳＰＳＦＦについての溶出液凝集体レベルは２％未満に減少したが、ＰｏｒｏｓＸＳのそれは、１２０分後でも依然として約４％であった。さらに、ＰｏｒｏｓＸＳ溶出中に形成された凝集体は、図６Ｂに示すように、有意に少ない程度（熱力学的側面）およびはるかに遅い速度（速度論的側面）でモノマーに戻った。ＣＭＳＦＦおよびＳＰＳＦＦ溶出液中の凝集体は、同程度の可逆性を示し、おそらく同様の生物学的性質を示唆している。ＰｏｒｏｓＸＳと他の２種の樹脂との間の凝集可逆性の明らかな違いは、ＰｏｒｏｓＸＳ上のはるかに強い全体的なタンパク質−樹脂相互作用（タンパク質／リガンドおよびタンパク質／樹脂表面を含む）を反映し、形成された凝集種の異なる分子特性をもたらした。

４．提案メカニズムの実験的検証
ＣＥＸ工程における凝集体形成を減少または防止するために種々の戦略が試験されてきた。ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＲａｐｉｄのようなグラフトポリマーを含まないマクロポーラス型樹脂の使用は、ＣＥＸ誘導生成物のアンフォールディングおよびｍＡｂの凝集を減少させるのに効果的であることが見いだされた［１７］。しかしながら、この樹脂は、この研究で評価された条件下で凝集体形成を減少させることはできなかった（データは示さず）。負荷／洗浄／溶出溶液に添加物（例えば、アルギニン、グリシンおよびスクロース）を添加することも、効果がないことが証明された。これらの結果は、他の以前の研究とは異なる凝集メカニズムを示唆している。提案された仮説によれば、凝集体形成は、結合タンパク質における立体構造変化の重大度および溶出の際の凝集しやすいタンパク質の濃度の結果である。従って、高負荷ｐＨ、短いタンパク質／樹脂接触時間、親水性樹脂表面、および弱いイオン化可能なリガンドなどの尺度は、凝集体形成を減らすのに役立ち得る。それにも関わらず、これらの努力のいずれも、この研究において凝集体形成を完全に防ぐことができなかった。

上記で評価された容易に適用可能な手段に加えて、提案された凝集仮説を調べ、そして分子レベルで凝集現象の機構的理解を得るために樹脂修飾を行った。カスタムメイドの樹脂（ＳＰおよびＡｒｇ−ＳＰリガンドで官能化された）は、樹脂表面にアルギニンを追加的に固定化して、該樹脂表面に近接して二次タンパク質−アルギニン相互作用を作り出すまたは作り出すことなしに、比較的低いＳＰリガンド密度で実験室内（in-house）で製造された。完全に官能化されたＳＰアガロース樹脂の動的結合容量は３０ｇ／Ｌ樹脂であり、同じ条件で測定したときＳＰＳＦＦのそれ（≧５０ｇ／Ｌ樹脂）より低い。調製したＡｒｇ−ＳＰアガロース樹脂の動的結合容量は、固定化アルギニンの弱化作用のために２０ｇ／Ｌ樹脂である。溶液中のタンパク質安定化剤としてのその広範な使用にもかかわらず、アルギニンは、永久的な二次タンパク質−アルギニン相互作用を用いて一次タンパク質−樹脂結合を調節するために樹脂表面上に固定化されていない。図７は、Ａｒｇ−ＳＰ修飾混合モードアガロースビーズの概略図を示す。

２種のカスタムメイドの樹脂を含む幾つかの異なる樹脂を図８に示す。ＳＰアガロース樹脂からの凝集体形成はＳＰＳＦＦと比較して低かったことが分かる。このことは、カスタムメイドのＳＰアガロース樹脂中の比較的低いリガンド密度によるものであると考えられ、最近の分子規模の研究で示唆されているように、種々のクラスタリング条件における確率的リガンド分布が化学的に同一のリガンドに対しても異なるタンパク質吸着特性をもたらした［５１］。より低いリガンド密度は、結合タンパク質当たりのより少ない相互作用リガンドをもたらし、ある程度まで凝集体形成を減少させるのを助けた。Ａｒｇ−ＳＰアガロース樹脂については、溶出液において顕著な凝集物の増加は観察されなかった。これは、タンパク質−樹脂相互作用に対する固定化アルギニンの弱化作用のためと考えられる。固定化アルギニンは、実際には、結合タンパク質と樹脂表面との間の望ましくない相互作用を妨げ得る混合荷電リガンド（すなわち、負電荷のカルボキシル基および正電荷のグアニジン基）として機能し得る。固定化アルギニン中の正電荷グアニジン基は、より弱い結合強度およびより少ないタンパク質立体構造変化に寄与し得る。タンパク質−樹脂相互作用に対するアルギニンの弱化作用は、アルギニンが遊離溶質の代わりに混合モードリガンドとして機能する樹脂表面上に固定化された場合にのみ有効であるようであったことを特記する。アルギニンの影響の違いは、ＣＥＸの構造的に不安定なタンパク質の凝集の問題を少なくするために、混合モードのリガンドとしてアルギニンを用いることのユニークな利点を示唆し得る。固定化アルギニン上のグアニジン基が、タンパク質溶液にアルギニンを添加したときに観察される効果と同様のさらなるタンパク質安定化効果を有するかどうかは不明である［５２］。この質問に対する答えは、本研究の範囲外であり、好適に選択された官能基を有する異なる分子の固定化を含むさらなる研究を必要とし得る。結合能を改善し、かつＨＭＷ緩和能を保持するために、固定化手順がさらに最適化（別の努力）されているが、本発明で得られた結果は、提案された仮説を支持する証拠を提供する。

結論
本発明では、ＣＥＸ工程における構造的に不安定なＦｃ融合物の凝集挙動を調べた。塩溶出工程を用いたマルチピーク溶出プロファイルは、カラム内緩衝液移行中のタンパク質安定性によって引き起こされる凝集体形成と関連していることが見いだされた。単一ピークの溶出は、ｐＨ溶出工程を用いることによって達成されたが、凝集は、結合タンパク質の立体構造変化から生じる異なるメカニズムを介して生じた。ｐＨ溶出工程データは、分子が安定である溶液条件におけるタンパク質の立体構造安定性および凝集傾向に対するＣＥＸ結合／溶出プロセスの影響を明確に示す。形成された凝集体は、熱力学的に好ましくない可能性があり、試験した条件下で数日以内に部分的に天然立体構造に戻った。比較的遅い凝集体解離速度は、代表的なかつ再現可能な分析結果を確実に得るために、サンプリング、サンプル保存、および分析試験の適切かつ一貫した実行の重要性を強調している。凝集体形成は、結合タンパク質の立体構造の変化の重大度および溶出の際の凝集しやすいタンパク質の濃度に影響を与えるＣＥＸカラム負荷により影響を受けやすいことが見いだされた。これらの２つの要因が一体となって、カラム負荷の関数として溶出液凝集体レベルの非線形パターンに寄与した。

ＣＥＸ溶出液中の凝集体形成および安定性はまた、他の操作条件（例えば、ｐＨ、流速など）ならびに樹脂特性によっても影響を受け得る。一般的に、タンパク質結合強度およびタンパク質−樹脂接触時間を減少させるためのこれらの実用的方法は、ＤＳＦの結果によって確認されるように、結合タンパク質におけるより少ない立体構造変化のためにより低い凝集レベルをもたらし得る。好ましい樹脂特性としては、弱いイオン化可能リガンド（例えば、ＣＭ官能性）、親水性樹脂表面およびより低いリガンド密度が挙げられる。実験室内で調製されたＡｒｇ−ＳＰアガロース樹脂を用いた研究は、ＣＥＸ工程で見られる凝集挙動について提案された仮説の実験的検証を提供する。樹脂表面へのアルギニンの固定化は、タンパク質が、構造的不安定性および評価された他の全てのＣＥＸ樹脂を用いた高溶出液凝集体レベルを示した低ｐＨ条件においてさえも、タンパク質と樹脂との間の望ましくない相互作用を効果的に最小化した。この試験は、ＣＥＸ工程における構造的に不安定なＦｃ融合タンパク質のための凝集体形成の機構的理解を高めることを目的とするだけでなく、ここで試験したもののような特別な用途のための新しい樹脂設計におけるいくつかの興味深い方向性も提供する。最後に、溶液中で観察されるタンパク質安定性とクロマトグラフィープロセスにおけるその凝集傾向との間の不一致は、製造に都合のよい生物学的分子の設計およびロバストなＣＥＸ研磨プロセスの開発における分子の下流の加工可能性情報（すなわち、本発明）の取得の重要性を強調する。

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Claims

陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーにおいて凝集体形成を減少させて目的のタンパク質を精製する方法であって、
（ａ）目的のタンパク質と１以上の汚染物質とを含む混合物を提供し、
（ｂ）アルギニンと結合させたＣＥＸ樹脂上に前記混合物を負荷し、そして
（ｃ）目的のタンパク質を前記樹脂から溶出させる
ことを含み、それにより、ＣＥＸクロマトグラフィーにおいて凝集体形成を減少させて目的のタンパク質を精製する、方法。
該混合物が清澄化バルクを含む、請求項１に記載の方法。
該清澄化バルクが細胞培養上清を含む、請求項２に記載の方法。
該上清が、哺乳動物、細菌または真菌の細胞培養物由来である、請求項３に記載の方法。
該上清が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物由来である、請求項４に記載の方法。
該汚染物質が、宿主細胞タンパク質、宿主細胞代謝産物、宿主細胞構成タンパク質、核酸、内毒素、ウイルス、生成物関連汚染物質、脂質、培地添加物および培地誘導体から選択される、請求項１に記載の方法。
目的のタンパク質が、抗体、抗体フラグメントおよびＦｃ融合タンパク質から選択される、請求項１に記載の方法。
目的のタンパク質がＦｃ融合タンパク質である、請求項７に記載の方法。
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項７に記載の方法。
該モノクローナル抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
該ＣＥＸ樹脂が、アガロース、セルロース、デキストラン、キトサン、ポリ（メタクリレート）、アクリルポリマーおよびポリ（スチレン−ジビニル−ベンゼン）から選択される、請求項１に記載の方法。
該ＣＥＸ樹脂が、スルホネート、カルボン酸、カルボキシメチルスルホン酸、スルホイソブチル、スルホエチル、カルボキシル、スルホプロピル、スルホニル、スルホキシエチルおよびオルトリン酸から選択される陽イオン交換リガンドを用いて調製される、請求項１に記載の方法。
アルギニンとカップリングさせたＣＥＸ樹脂が、アルギニン−スルホプロピル（Ａｒｇ−ＳＰ）官能化樹脂である、請求項１に記載の方法。
該混合物が、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよびプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーから選択されるアフィニティークロマトグラフィーによって調製される、請求項１に記載の方法。
アフィニティークロマトグラフィーが、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーである、請求項１４に記載の方法。
１以上の追加のクロマトグラフィーマトリックスをさらに含む、請求項１に記載の方法。
該１以上の追加のクロマトグラフィーマトリックスが、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーから選択される、請求項１６に記載の方法。
アルギニンと結合させた陽イオン交換（ＣＥＸ）樹脂。
該ＣＥＸ樹脂が、アガロース、セルロース、デキストラン、キトサン、ポリ（メタクリレート）、アクリルポリマーおよびポリ（スチレン−ジビニル−ベンゼン）から選択される、請求項１８に記載のＣＥＸ樹脂。
該ＣＥＸ樹脂が、スルホネート、カルボン酸、カルボキシメチルスルホン酸、スルホイソブチル、スルホエチル、カルボキシル、スルホプロピル、スルホニル、スルホキシエチルおよびオルトリン酸から選択される陽イオン交換リガンドを用いて調製される、請求項１８に記載のＣＥＸ樹脂。
アルギニンと結合させたＣＥＸ樹脂が、アルギニン−スルホプロピル（Ａｒｇ−ＳP）官能化樹脂である、請求項１８に記載のＣＥＸ樹脂。