CN112313248A - 纯化单体单克隆抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

在某些实施方案中，本发明提供一种从包含单体单克隆抗体和一种或多种污染物的混合物中纯化该单体单克隆抗体的方法，其包括：a)使所述混合物经历阳离子交换色谱(CEX)基质，其中所述单体单克隆抗体与所述CEX基质结合；b)使所述CEX基质与pH在约7至约7.8之间的洗涤溶液接触；c)将所述单体单克隆抗体从所述CEX基质洗脱到洗脱溶液中，从而纯化所述单体单克隆抗体。

Description

纯化单体单克隆抗体的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求保护2018年3月29日提交的美国临时申请号62/649,976的权益，其全部内容通过引用而并入本文。
发明背景
蛋白质的大规模、经济纯化对于生物制药工业而言是日益重要的问题。通常，使用原核或真核细胞系生产治疗性蛋白，所述原核或真核细胞系经工程化以从包含编码该蛋白质的基因的重组质粒表达该感兴趣的蛋白质。从补给给细胞的组分混合物、细胞副产物和该蛋白质的聚集形式中分离出所期望的蛋白质，使其具有足够的纯度，例如足以用作人治疗剂的纯度，这对生物制剂制造商提出了巨大的挑战。
因此，在本领域中需要可用于加速基于蛋白质的治疗剂(诸如抗体)的大规模处理的替代性蛋白质纯化方法。
发明概述
在某些实施方案中，本发明提供了一种从包含感兴趣的蛋白和一种或多种污染物的混合物中纯化感兴趣的单体蛋白质的方法。
在某些特定的实施方案中，本发明提供了一种从包含单体单克隆抗体和一种或多种污染物的混合物中纯化单体单克隆抗体(例如，抗IP10单克隆抗体)的方法，该方法包括：a)使混合物经历阳离子交换色谱(CEX)基质，其中所述单体单克隆抗体与所述CEX基质结合；b)使所述CEX基质与pH在约7至约7.8之间的洗涤溶液接触；c)将所述单体单克隆抗体从所述CEX基质洗脱到洗脱溶液中，从而纯化所述单体单克隆抗体。为了说明，污染物选自单克隆抗体的聚集体、宿主细胞蛋白、宿主细胞代谢产物、宿主细胞组成性蛋白、核酸、内毒素、病毒、产物相关污染物、脂质、培养基添加剂和培养基衍生物。例如，抗IP10单克隆抗体的聚集体包括二聚体、多聚体和中间体聚集体种类。任选地，所述中间体聚集体种类在步骤(b)中被去除。
在某些方面，混合物选自收获的细胞培养液、细胞培养物上清液和条件细胞培养物上清液、细胞裂解物和澄清的原液。例如，细胞培养物是哺乳动物细胞培养物，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物。
在某些方面，本方法的混合物已经通过亲和色谱(例如，蛋白A亲和色谱)获得。任选地，来自CEX步骤的洗脱溶液不经历第二色谱步骤。任选地，来自CEX步骤的洗脱溶液进一步经历第二色谱步骤，如离子交换色谱、疏水相互作用色谱和混合模式色谱。
在某些方面，洗涤溶液的pH在约7.2与约7.6之间(例如，7.2、7.3、7.4、7.5、7.6)。任选地，洗涤缓冲液的盐浓度在约20与40mM之间，如在约24与30mM之间。
在某些方面，抗IP10单克隆抗体包含分别为SEQ ID NO:1、2和3的重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。在某些方面，抗IP10单克隆抗体包含分别为SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。为了例示性说明，抗IP10单克隆抗体包含SEQ ID NO:1、2和3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。为了说明，抗IP10单克隆抗体包含分别为SEQ ID NO:4和9的重链可变区序列和轻链可变区序列。为了例示性说明，抗IP10单克隆抗体包含分别为SEQ ID NO:5和10的全长重链氨基酸序列和全长轻链氨基酸序列。
在某些具体的实施方案中，单体抗IP10单克隆抗体被纯化至至少90％的单体纯度，任选地至少95％的单体纯度，或任选地至少99％的单体纯度。
附图简述
图1显示了抗IP10 mAb CEX盐梯度(在50mM乙酸中0mM至300mM NaCl，pH 5.5)。
图2显示了抗IP10 mAb CEX：加载条件(50mM乙酸，pH 5.5)，洗脱条件(50mM乙酸，100mM NaCl，pH 5.5)。高阶聚集体和二聚体已成功被去除。但是，中间体聚集体以相同的水平保持在洗脱池中，这表明中间体聚集体和单体之间的共洗脱。
图3显示了MEP Hypercel色谱后的抗IP10 mAb SEC曲线。
图4显示了使用制备型SEC柱分级的中间种类(虚线)和起始材料(实线)。
图5显示了在非还原条件(A)和还原条件(B)下，中间种类和单体的毛细管电泳图的叠加图。
图6显示了WCX-10HPLC柱和HIC丁基柱上的中间体种类、单体和二聚体。A–WCX-10柱，在pH 6.0的运行缓冲液条件下，从左至右的峰为：单体、中间体、二聚体；B–WCX-10柱，在pH 7.0的运行缓冲液条件下，从左至右的峰为：中间体、单体、二聚体；C–HIC丁基柱，从左到右的峰为：中间体、单体、二聚体。
图7显示了中间体种类与单体的iCE曲线(黑线–单体；红线–中间体种类)。
图8显示了ESI/MS色谱图。
图9显示了ESI/MS色谱图。
图10显示了使用缓冲液A(40mM磷酸盐，pH 5.5)和缓冲液B(35mM磷酸盐，pH 8.5)的CEX pH梯度。
图11显示了使用pH梯度洗脱的种类百分比相对于级分。
图12分别显示了分别使用pH梯度和盐梯度的累积种类相对于总累积质量。
图13显示了多种盐浓度(20、25、30和35mM磷酸盐)下的pH梯度(pH5.5→8.5)。
图14显示了在多种盐浓度(20、25、30和35mM磷酸盐)下，在pH梯度(pH5.5→8.5)下，累积的中间体种类％相对于累积质量。
图15显示了在优化的CEX柱条件下加载、洗涤、洗脱和分离(strip)的样品的尺寸排阻色谱图。
图16显示了通过评估柱加载量、洗涤pH、洗涤盐和洗涤体积得出的CEX DOE结果。
图17显示了等温线和分配系数。
发明详述
本发明提供了一种从包含感兴趣的蛋白和一种或多种污染物的混合物中纯化感兴趣的单体蛋白的方法。
在某些特定的实施方案中，本发明提供了一种从包含单体抗IP10单克隆抗体和一种或多种污染物的混合物中纯化单体抗IP10单克隆抗体的方法，该方法包括：a)使所述混合物经历阳离子交换色谱(CEX)基质，其中所述单体抗IP10单克隆抗体与CEX基质结合；b)使所述CEX基质与pH在约7至约7.8之间的洗涤溶液接触；c)将所述单体抗IP10单克隆抗体从所述CEX基质洗脱到洗脱溶液中，从而纯化所述单体抗IP10单克隆抗体。为了例示性说明，所述污染物选自抗IP10单克隆抗体的聚集体、宿主细胞蛋白、宿主细胞代谢产物、宿主细胞组成性蛋白、核酸、内毒素、病毒、产物相关的污染物、脂质、培养基添加剂和培养基衍生物。例如，抗IP10单克隆抗体的聚集体包括二聚体、多聚体和中间体聚集体种类。任选地，中间体聚集体种类在步骤(b)中被去除。
在某些方面，混合物选自收获的细胞培养液、细胞培养物上清液和条件细胞培养物上清液、细胞裂解物和澄清的原液。例如，细胞培养物是哺乳动物细胞培养物，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物。
在某些方面，本方法的混合物已经通过亲和色谱(例如，蛋白A亲和色谱)获得。任选地，来自CEX步骤的洗脱溶液不经历第二色谱步骤。任选地，来自CEX步骤的洗脱溶液进一步经历第二色谱步骤，诸如离子交换色谱、疏水相互作用色谱和混合模式色谱。
在某些方面，洗涤溶液的pH在约7.2与约7.6之间(例如，7.2、7.3、7.4、7.5和7.6)。任选地，洗涤缓冲液的盐浓度在约20与40mM之间，如在约24与30mM之间。
在某些方面，抗IP10单克隆抗体包含分别为SEQ ID NO:1、2和3的重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。在某些方面，抗IP10单克隆抗体包含分别为SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。为了例示性说明，抗IP10单克隆抗体包含SEQ ID NO:1、2和3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。为了例示性说明，抗IP10单克隆抗体包含分别为SEQ ID NO:4和9的重链可变区序列和轻链可变区序列。为了例示性说明，抗IP10单克隆抗体包含分别为SEQ ID NO:5和10的全长重链氨基酸序列和全长轻链氨基酸序列。
在某些方面，单体抗IP10单克隆抗体被纯化至至少90％单体纯度，任选地至少95％单体纯度，或任选地至少99％单体纯度。
I.定义
为了可以更容易地理解本公开，首先定义了某些术语。如在本申请中使用的，除非本文另有明确规定，否则以下每个术语应具有以下阐述的含义。在整个申请中阐述了附加的定义。
如本文中使用的，在其最广泛的意义上使用术语“感兴趣的蛋白质”，以包括存在于需要纯化的混合物中的任何蛋白质(天然的或重组的)。此类感兴趣的蛋白质包括但不限于激素、生长因子、细胞因子、免疫球蛋白(例如抗体)和含免疫球蛋白样结构域的分子(例如含锚蛋白或纤连蛋白结构域的分子)。
如本文中使用的，“细胞培养物”是指液体培养基中的细胞。任选地，细胞培养物包含在生物反应器中。细胞培养物中的细胞可以来自任何生物体，包括例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物。在一个特定的实施方案中，细胞培养物中的细胞包括用表达构建体转染的细胞，所述表达构建体含有编码感兴趣的蛋白质(例如抗体)的核酸。适合的液体培养基包括例如营养培养基和非营养培养基。在一个特定的实施方案中，细胞培养物包含未经历例如通过过滤或离心纯化的在营养培养基中的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
如本文中使用的，术语“澄清的原液”是指已经从其中基本上去除颗粒物质的混合物。澄清的原液包括通过例如过滤或离心已基本上从其中去除了细胞或细胞碎片的细胞培养物或细胞裂解物。
如本文中使用的，“生物反应器”具有其本领域公认的含义，并且是指经设计用于细胞培养物的受控生长的室。生物反应器可以具有任何尺寸，只要它对细胞例如哺乳动物细胞的培养有用。通常，生物反应器将为至少30ml，并且可以为至少1、10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,0000升或更多，或任何中间体积。通常在培养期间控制生物反应器的内部条件，包括但不限于pH和温度。合适的生物反应器可以由任何材料组成(即，由任何材料构造)，该材料适合于在培养条件下使细胞培养物保持悬浮在培养基中并且对细胞的生长和活力具有传导性，该材料包括玻璃、塑料或金属；该一种或多种材料不应干扰感兴趣的蛋白质的表达或稳定性。本领域普通技术人员将意识到并且将能够选择用于实践本发明的合适的生物反应器。
如本文中使用的，“混合物”包含感兴趣的蛋白质(需要纯化的)和一种或多种污染物(即杂质)。在一个实施方案中，混合物从表达感兴趣的蛋白质的宿主细胞或生物体产生(天然或重组)。此类混合物包括，例如，细胞培养物、细胞裂解物和澄清的原液(例如，澄清的细胞培养物上清液)。
如本文中使用的，术语“分离”和“纯化”可互换使用，并且是指从含有感兴趣的蛋白质(例如抗体)的混合物中选择性去除污染物。
如本文中使用的，在其最广泛的意义上使用术语“污染物”，以覆盖混合物内任何不期望的组分或化合物。在细胞培养物、细胞裂解物或澄清的原液(例如，澄清的细胞培养物上清液)中，污染物包括例如存在于细胞培养基中的宿主细胞核酸(例如DNA)和宿主细胞蛋白质。宿主细胞污染蛋白质包括但不限于由宿主细胞天然或重组产生的蛋白质，以及与感兴趣的蛋白质相关或从其衍生的蛋白质(例如，蛋白水解片段)以及其他的过程相关污染物。在某些实施方案中，使用本领域公认的手段，如离心、无菌过滤、深层过滤和切向流过滤，从细胞培养物中分离出污染物沉淀。
如本文中使用的，“离心”是涉及在工业和实验室环境中使用离心力通过离心机沉降非均质混合物的过程。该过程用于分离两种互不相溶的液体。例如，在本发明的方法中，可以使用离心来从混合物中去除污染物沉淀，所述混合物包括但不限于细胞培养物或澄清的细胞培养物上清液或捕获柱捕获的洗脱池。
如本文中使用的，“无菌过滤”是使用膜过滤器的过滤方法，该膜过滤器通常是孔径为0.2μm的过滤器以有效地去除微生物或小颗粒。例如，在本发明的方法中，可以使用无菌过滤从混合物中除去污染物沉淀，所述混合物包括但不限于细胞培养物或澄清的细胞培养物上清液或捕获柱捕获的洗脱池。
如本文中使用的，“深层过滤”是使用深层过滤器的过滤方法，该深层过滤器通常的特征在于其经设计以由于过滤器基质内的孔径范围而保留颗粒。深层过滤器的容量通常由基质的深度(例如10英寸或20英寸)以及由此而得的对固体的容纳量来定义。例如，在本发明的方法中，可以使用深层过滤从混合物中去除污染物沉淀，所述混合物包括但不限于细胞培养物或澄清的细胞培养物上清液或捕获柱捕获的洗脱池。
如本文中使用的，术语“切向流过滤”是指这样的过滤过程，其中样品混合物在膜的顶部循环，同时施加的压力使某些溶质和小分子通过膜。例如，在本发明的方法中，可以使用切向流过滤从混合物中去除污染物沉淀，所述混合物包括但不限于细胞培养物或澄清的细胞培养物上清液或捕获柱捕获的洗脱池。
如本文中使用的，术语“色谱法”是指通过混合物渗滤通过吸附剂而将混合物中感兴趣的溶质(例如感兴趣的蛋白质)与混合物中的其他溶质分离的过程，所述吸附剂在该过程的特定缓冲条件下或多或少强烈取决于溶质的性质(诸如pI、疏水性、大小和结构)而吸附或保留溶质。在本发明的方法中，在从混合物中去除沉淀物之后，可以使用色谱法去除污染物，所述混合物包括但不限于细胞培养物或澄清的细胞培养物上清液或捕获柱捕获的洗脱池。
术语“离子交换”和“离子交换色谱”是指其中感兴趣的可电离溶质(例如，混合物中的感兴趣的蛋白质)在适当的pH和导电性条件下与连接(例如，通过共价连接)至固相离子交换材料的带相反电荷的配体相互作用的色谱过程，使得感兴趣的溶质与带电荷的化合物非特异性地相互作用，所述相互作用比与混合物中的溶质杂质或污染物的相互作用更多或更少。混合物中的污染性溶质可以比感兴趣的溶质更快或更慢地从离子交换材料柱中洗涤，或与树脂结合或从其排除。“离子交换色谱”具体包括阳离子交换(CEX)、阴离子交换和混合模式色谱法。
短语“离子交换材料”是指带负电荷(即，阳离子交换树脂或膜)或带正电荷(即，阴离子交换树脂或膜)的固相。在一个实施方案中，可以通过例如通过共价连接将一种或多种带电荷的配体(或吸附剂)附接到固相来提供电荷。可替代地或另外地，电荷可以是固相的固有性质(例如，对于二氧化硅而言整体上带有负电荷就是这种情况)。
“阳离子交换树脂”是指带负电荷的固相，并且它具有与穿过或通过该固相的水溶液中的阳离子交换的游离阳离子。可以使用与适于形成阳离子交换树脂的固相附接的任何带负电荷的配体，例如羧酸盐、磺酸盐和以下所述的其它配体。可商购的阳离子交换树脂包括但不限于例如具有下列基团的那些树脂：基于磺酸盐的基团(例如，来自GE Healthcare的MonoS、MiniS、Source15S和30S、SP Sepharose Fast FlowTM、SP Sepharose HighPerformance，来自Tosoh的Toyopearl SP-650S和SP-650M,来自BioRad的Macro-Prep HighS，来自Pall Technologies的Ceramic HyperD S、Trisacryl M和LS SP以及Spherodex LSSP)；基于磺乙基的基团(例如，来自EMD的Fractogel SE，来自Applied Biosystems的PorosS-10和S-20)；基于磺丙基的基团(例如，来自Tosoh的TSK Gel SP 5PW和SP-5PW-HR，来自Applied Biosystems的Poros HS-20和HS 50)；基于磺基异丁基的基团(例如，来自EMD的Fractogel EMD SO3 -)；基于硫氧基乙基的基团(例如，来自Whatman的SE52、SE53和Express-Ion S)；基于羧甲基的基团(例如，来自GE Healthcare的CM Sepharose Fast Flow，来自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell CM，来自BioRad的Macro-Prep CM，来自PallTechnologies的Ceramic HyperD CM、Trisacryl M CM、Trisacryl LS CM，来自Millipore的Matrx Cellufine C500和C200，来自Whatman的CM52、CM32、CM23和Express–Ion C，来自Tosoh的Toyopearl CM-650S、CM-650M和CM-650C)；基于磺酸和羧酸的基团(例如来自J.T.Baker的BAKERBOND Carboxy-Sulfon)；基于羧酸的基团(例如，来自J.T Baker的WPCBX，来自Dow Liquid Separations的DOWEX MAC-3，来自Sigma-Aldrich的Amberlite WeakCation Exchangers、DOWEX Weak Cation Exchanger和Diaion Weak Cation Exchangers以及来自EMD的Fractogel EMD COO-)；基于磺酸的基团(例如，来自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell SP，来自Dow Liquid Separations的DOWEX Fine Mesh Strong Acid CationResin，来自J.T.Baker的UNOsphere S、WP Sulfonic，来自Sartorius的Sartobind S膜，来自Sigma-Aldrich的Amberlite Strong Cation Exchangers、DOWEX Strong Cation和Diaion Strong Cation Exchanger)；和基于正磷酸盐的基团(例如，来自Whatman的P11)。
“阴离子交换树脂”是指带正电的固相，因此具有与其附接的一个或多个带正电荷的配体。可以使用与适于形成阴离子交换树脂的固相附接的任何带负电荷的配体，诸如季氨基。可商购的阴离子交换树脂包括来自Applied Biosystems的DEAE纤维素、Poros PI20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D50，来自Sartorius的Sartobind Q，MonoQ、MiniQ、Source15Q和30Q、Q、DEAE和ANX Sepharose Fast Flow、Q Sepharose high Performance、QAESEPHADEXTM和FAST Q SEPHAROSETM(GE Healthcare)，来自J.T.Baker的WP PEI、WP DEAM、WPQUAT，来自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell DEAE和Hydrocell QA，来自Biorad的UNOsphere Q、Macro-Prep DEAE和Macro-Prep High Q，来自Pall Technologies的CeramicHyperD Q、陶瓷HyperD DEAE、Trisacryl M和LS DEAE、Spherodex LS DEAE、QMA SpherosilLS、QMA Spherosil M和Mustang Q，来自Dow Liquid Separations的I型和II型DOWEX FineMesh Strong Base、Anion Resins和DOWEX MONOSPHER E 77、弱碱阴离子，来自Millipore的Intercept Q membrane、Matrex Cellufine A200、A500、Q500和Q800，来自EMD的Fractogel EMD TMAE、Fractogel EMD DEAE和Fractogel EMD DMAE，来自的Sigma-Aldrich的I型和II型Amberlite弱强阴离子交换剂、I型和II型DOWEX弱和强阴离子交换剂，I型和II型Diaion弱和强阴离子交换剂、Duolite，来自的TSK凝胶Q和DEAE 5PW和5PW-HR、ToyopearlSuperQ-650S、650M和650C、QAE-550C和650S、DEAE-650M和650C，来自Whatman的QA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、Express-Ion D和Express-Ion Q，以及Sartobind Q(Sartoriuscorporation,New York,USA)。
“混合模式离子交换树脂”或“混合模式”是指用阳离子、阴离子和/或疏水部分共价修饰的固相。混合模式离子交换树脂的实例包括BAKERBOND ABXTM(J.T.Baker；Phillipsburg,NJ)、I型和II型陶瓷羟基磷灰石和氟羟基磷灰石(BioRad；Hercules,CA)以及MEP和MBI HyperCel(Pall Corporation；East Hills,NY)。
“疏水性相互作用色谱树脂”是指用苯基、辛基或丁基化学品共价修饰的固相。疏水相互作用色谱法是一种利用疏水性性质将蛋白质彼此分离的分离技术。在这种类型的色谱法中，疏水基团(诸如苯基、辛基或丁基)被附接到固定柱上。穿过色谱柱且表面上具有疏水性氨基酸侧链的蛋白质能够与色谱柱上的疏水基团相互作用并结合。疏水性相互作用色谱树脂的实例包括：(1)丁基FF、丁基HP、辛基FF、苯基FF、苯基HP、苯基FF(高sub)、苯基FF(低sub)、Capto苯基ImpRes、Capto苯基(高sub)、Capto辛基、Capto ButylImpRes、Capto丁基(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)；(2)Toyopearl Super Butyl-550C、Toyopearl己基-650C、丁基-650C、苯基-650C、丁基600M、苯基-600M、PPG-600M、丁基-650M、苯基-650M、Ether-650M、丁基-650S、苯基-650S、Ether-650S、TSKgel苯基-5PW、TSKgel Ether-5PW(Tosoh Bioscience,Tokyo,Japan)；(3)Macro-Prep–butyl,Macro-Prep-methyl(Bio-Rad)；和(4)Sartobind苯基(Sartorius corporation,New York,USA)。
II.感兴趣的蛋白质
在某些方面，本发明的方法可用于纯化任何感兴趣的蛋白质，包括但不限于具有可用于商业、实验或其他应用中的药学、诊断学、农业性质和/或任何多种其他性质的蛋白质。另外，感兴趣的蛋白质可以是蛋白质治疗剂。在某些实施方案中，可以对使用本发明的方法纯化的蛋白质进行加工或修饰。例如，根据本发明的感兴趣的蛋白质可以被糖基化。
因此，本发明可用于培养细胞以产生任何治疗性蛋白质，诸如药学上或商业上相关的酶、受体、受体融合蛋白、抗体(例如，单克隆或多克隆抗体)、抗体的抗原结合片段、Fc融合蛋白、细胞因子、激素、调节因子、生长因子、凝血/凝血(coagulation/clotting)因子或抗原结合剂。上面列出的蛋白质本质上仅是示例性的，并不旨在作为限制性叙述。本领域普通技术人员将知道可以根据本发明产生其他蛋白质，并且将能够使用本文公开的方法来产生此类蛋白质。
在本发明的一个特定实施方案中，使用本发明的方法纯化的蛋白质是抗体。在最广泛的意义上使用术语“抗体”，以涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、免疫粘附素、抗体-免疫粘附素嵌合体。
“抗体片段”包括全长抗体的至少一部分，并且通常包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；单链抗体分子；双抗体；线性抗体；和由工程化抗体片段形成的多特异性抗体。
在传统意义上使用术语“单克隆抗体”，其是指从基本上同源的抗体的群体获得的抗体，使得除了可能以少量存在的可能的天然存在的突变之外，构成该群体的单独的抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原位点是高度特异性的。这与通常包括针对抗原的不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，而单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇。当描述抗体时，术语“单克隆的”表示从基本上同源的抗体群获得的抗体的特性，并且不被解释为需要通过任何特定的方法产生抗体。例如，在本发明中使用的单克隆抗体可以首先通过由Kohler等人在Nature 256:495(1975)中描述的常规杂交瘤技术来产生，或者可以使用重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)来制造它们。也可以从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体，例如，使用Clackson等人Nature 352:624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)；和美国专利号5,223,409；5,403,484；5,571,698；5,427,908；5,580,717；5,969,108；6,172,197；5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；和6,593,081中描述的技术。
本文所述的单克隆抗体包括这样的“嵌合”和“人源化”抗体：其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一种抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；还包括此类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性即可(美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)。非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区残基被来自具有期望的特异性、亲和力和能力的诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物等非人种类(供体抗体)的高变区残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个(通常两个)可变结构域中的基本上所有的，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(一般是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。关于更多详情，参见Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
基于如上文所述制备的鼠单克隆抗体的序列，可以制备嵌合抗体或人源化抗体。可以从感兴趣的鼠杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并使用标准分子生物学技术将其工程改造为含有非鼠(例如，人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠可变区与人恒定区连接(例如，参见Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)。为了产生人源化抗体，可使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人框架中(例如，参见授予Winter的美国专利号5,225,539以及授予Queen等人的美国专利No.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
本文所述的单克隆抗体还包括“人”抗体，其可以从各种来源分离，包括例如来自人类患者的血液，或使用转基因动物重组制备。此类转基因动物的实例包括
Figure BDA0002705059200000111
(Medarex,Inc.,Princeton,NJ)，其具有人重链转基因和人轻链转染色体(参见WO 02/43478)、
Figure BDA0002705059200000112
(Abgenix,Inc.,Fremont CA；描述于例如Kucherlapati等人的美国专利No.5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963)和
Figure BDA0002705059200000113
(Medarex,Inc.；描述于例如Taylor,L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等人(1993)International Immunology 5:647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等人(1993)EMBO J.12:821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等人(1994)International Immunology 6:579-591；和Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851，美国专利No.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；5,545,807；以及PCT公开号WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884和WO 99/45962，Korman等人的WO 01/14424)。还可使用SCID小鼠来制备本发明的人单克隆抗体，所述小鼠中已经重建了人免疫细胞，使其在免疫后能产生人抗体应答。此类小鼠描述于例如Wilson等人的美国专利号5,476,996和5,698,767中。
在某些特定的实施方案中，本发明提供了纯化抗IP10单克隆抗体的方法。优选地，这些方法用于从抗体的聚集形式(例如，二聚体、多聚体、中间体聚集体种类)中纯化单体抗体。
在某些方面，抗IP10单克隆抗体包含分别为SEQ ID NO:1、2和3的重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。在某些方面，抗IP10单克隆抗体包含分别为SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。为了例示性说明，抗IP10单克隆抗体包含SEQ ID NO:1、2和3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。为了例示性说明，抗IP10单克隆抗体包含分别为SEQ ID NO:4和9的重链可变区序列和轻链可变区序列。为了例示性说明，抗IP10单克隆抗体包含分别为SEQ ID NO:5和10的全长重链氨基酸序列和全长轻链氨基酸序列。
下表列出了示例性抗IP10 mAb的氨基酸序列。
Figure BDA0002705059200000121
Figure BDA0002705059200000131
III.含有感兴趣的蛋白质的混合物
本发明的方法可应用于含有感兴趣的蛋白质的任何混合物。在一个实施方案中，混合物从表达待纯化蛋白质的活细胞获得或由其产生(例如天然地或通过基因工程改造)。任选地，细胞培养物中的细胞包括用表达构建体转染的细胞，所述表达构建体含有编码感兴趣的蛋白质的核酸。基因工程改造细胞以产生蛋白质的方法是本领域熟知的。参见，例如，Ausabel等人编辑，(1990),Current Protocols in Molecular Biology(Wiley,NewYork)以及美国专利号5,534,615和4,816,567，将各自通过引用明确并入本文。此类方法包括将编码蛋白质并允许该蛋白质表达的核酸引入活的宿主细胞中。这些宿主细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞或优选培养物中生长的动物细胞。细菌宿主细胞包括但不限于大肠杆菌细胞。适合的大肠杆菌菌株的实例包括：HB101、DH5α、GM2929、JM109、KW251、NM538、NM539，和任何不能切割外来DNA的大肠杆菌菌株。可以使用的真菌宿主细胞包括但不限于酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和曲霉菌属细胞。可以使用的昆虫细胞包括但不限于家蚕(Bombyx mori)、Mamestra drassicae、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、黑腹果蝇(Drosophilia melanogaster)。
许多哺乳动物细胞系是用于表达感兴趣的蛋白质的合适宿主细胞。哺乳动物宿主细胞系包括，例如，COS、PER.C6、TM4、VERO076、DXB11、MDCK、BRL-3A、W138、Hep G2、MMT、MRC5、FS4、CHO、293T、A431、3T3、CV-1、C3H10T1/2、Colo205、293、HeLa,L细胞、BHK、HL-60、FRhL-2、U937、HaK、Jurkat细胞、Rat2、BaF3、32D、FDCP-1、PC12、M1x、鼠骨髓瘤(例如SP2/0和NS0)和C2C12细胞，以及转化的灵长类动物细胞系、杂交瘤、正常二倍体细胞以及源自原代组织和原代外植体的体外培养的细胞株。可以使用本领域技术人员众所周知的方法(例如，通过转化、病毒感染和/或选择)来建立新的动物细胞系。能够表达感兴趣的蛋白质的任何真核细胞都可以用于所公开的细胞培养方法中。许多细胞系可从商业来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)。在本发明的一个实施方案中，细胞培养物，例如大规模细胞培养物，采用杂交瘤细胞。产生抗体的杂交瘤细胞的构建是本领域众所周知的。在本发明的一个实施方案中，细胞培养物，例如大规模细胞培养物，采用CHO细胞产生感兴趣的蛋白质，诸如抗体(参见，例如，WO 94/11026)。各种类型的CHO细胞是本领域已知的，例如CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DXB11、CHO/dhfr-和CHO-S。
在某些实施方案中，本发明预期在从细胞培养物中纯化感兴趣的蛋白质之前，监测使细胞培养物生长的特定条件。监测细胞培养条件允许确定细胞培养是否正在产生足够水平的感兴趣的蛋白质。例如，定期取出培养物的小等分试样进行分析，以监测某些细胞培养条件。待监测的细胞培养条件包括但不限于温度、pH、细胞密度、细胞活力、综合活细胞密度、乳酸水平、铵水平、渗透性和表达蛋白的滴度。用于测量此类条件/标准的许多技术是本领域技术人员众所周知的。例如，可以使用血细胞计数器、自动细胞计数设备(例如，Coulter计数器,Beckman Coulter Inc.,Fullerton,Calif.)或细胞密度检查(例如，CEDEX.RTM.,Innovatis,Malvern,Pa.)来测量细胞密度。活细胞密度可以通过用锥虫蓝染色培养物样品来确定。乳酸和铵水平可以通过例如BioProfile 400化学分析仪(NovaBiomedical,Waltham,Mass.)进行测量，该分析仪可以实时、在线测量细胞培养基中的关键营养素、代谢产物和气体。细胞培养物的渗透性可通过例如冰点渗压计测量。HPLC可用于确定例如乳酸、铵或表达的蛋白质的水平。在本发明的一个实施方案中，表达的蛋白质的水平可以通过使用例如蛋白A HPLC来确定。可替换地，可以通过标准技术，如SDS-PAGE凝胶的考马斯染色、Western印迹、Bradford分析、Lowry分析、双缩脲测定和UV吸光度来确定表达的蛋白的水平。任选地，本发明可以包括监测表达的蛋白质的翻译后修饰，包括磷酸化和糖基化。
在一个特定的实施方案中，本发明的方法包括从含有高浓度的感兴趣的蛋白(例如抗体)的混合物(例如细胞培养物、细胞裂解物或澄清的原液)中有效去除污染物。例如，感兴趣的蛋白质的浓度可以在约0.5至约50mg/ml的范围(例如，0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/ml)。
混合物的制备最初取决于蛋白质的表达方式。一些细胞系统将蛋白质(例如抗体)从细胞直接分泌到周围的生长培养基中，而其他系统将抗体保留在细胞内。对于细胞内产生的蛋白质，可以使用多种方法中的任何一种破坏细胞，比如机械剪切、渗透压冲击和酶处理。所述破坏使细胞的全部内容物释放到匀浆中，并且另外产生可以通过离心或过滤去除的亚细胞片段。由于在蛋白质生产运行过程中细胞的自然死亡和细胞内宿主细胞蛋白的释放，产生了与直接分泌的蛋白质类似的蛋白质，虽然程度较小。
在一个实施方案中，从混合物中去除细胞或细胞碎片，例如以制备澄清的原液。本发明的方法可以采用任何合适的方法来去除细胞或细胞碎片。如果蛋白质是在细胞内产生的，则在第一步，可以去除宿主细胞或裂解片段的颗碎片，例如通过离心或过滤步骤，以制备混合物，然后按照本文描述的方法对混合物进行纯化(即从该混合物纯化感兴趣的蛋白质)。如果蛋白质被分泌到培养基中，则可以通过例如离心、切向流过滤或深层过滤将重组宿主细胞从细胞培养基中分离，以制备混合物，从该混合物中纯化出感兴趣的蛋白质。
在另一个实施方案中，无需首先去除宿主细胞就直接使用细胞培养物或细胞裂解物。实际上，本发明的方法特别适合于使用包含分泌的蛋白质和宿主细胞悬浮液的混合物。
通过以下实施例进一步说明本公开，其不应解释为进一步限制。在本申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用以其整体明确地并入本文。
实施例1
含有四条轻链的单克隆抗体聚集体的表征和去除引言
蛋白质聚集是一种重要的质量属性，因为它对功效和药代动力学有影响[1-4]。尽管为最小化对分子的负面影响并在蛋白质开发过程中实施有效的控制策略做出了巨大的努力，但仍无法完全避免形成非期望的高分子量种类和聚集体[5,6]。因此，需要在整个上游细胞培养和下游纯化过程密切监测聚集水平。
包括蛋白A(ProA)作为捕获步骤以及离子(阴离子或阳离子)交换色谱图(IEX)作为精制步骤的平台方法已广泛用于mAb纯化[7-9]。最初的ProA是为了去除澄清的收获物中存在的大多数杂质。IEX是为了去除产物杂质，如聚集体和过程杂质，包括宿主细胞蛋白(HCP)和残留的宿主细胞DNA。在大多数情况下，使用盐阶梯梯度的阳离子交换色谱(CEX)结合和洗脱模式可用于去除产物聚集体，因为与单体相比，它们的表面电荷有所增加[10-12]。除IEX外，疏水相互作用色谱和混合模式色谱也通常用于精制色谱步骤中，以去除聚集体[20,29-33]。但是，并非所有聚集体种类都表现相同。通常，较大的聚集体可能显示出相对较高的疏水性和更多的表面电荷，因此更易于通过IEX或HIC去除。近年来，对中间体种类的研究越来越多，据报道，二聚体和单体种类之间存在一种聚集体种类[13-15]。Gomez[13,14]发现了三轻链(3LC)种类，并研究了影响3LC种类形成的上游因素。此外，发现使用常规平台方法去除中间体种类更具挑战性。Wollacott[15]对中间体种类进行了表征，并开发了疏水相互作用色谱(HIC)工艺以有效去除该种类。但是，在洗脱缓冲液中需要12％乙醇，以克服大洗脱体积的缺点。Chen[17]评估了不同的混合模式树脂，并设计了一个使用蛋白A-MEP-CHT的新平台来有效去除高水平的聚集体。Gao[18]发现，疏水相互作用和静电相互作用的结合对于用混合模式树脂有效去除聚集体很重要。但是，对这些树脂的工艺和制造的了解是有限的。
在此，申请人报道了使用SE-HPLC的中间体种类。进一步的表征表明，200kDa的中间体种类含有四条轻链，两条来自完整的mAb，两个来自LC二聚体。与大多数聚集体不同，发现4LC中间体种类的疏水性和静电性均低于单体种类，这对使用CEX和HIC结合/洗脱模式来去除聚集体构成了巨大挑战。在我们最初的工艺开发中，通过CEX结合和洗脱模式并未去中间体种类。已经进行了多种尝试来使用多种类型的树脂，但是没有取得很大的成功。但是，近年来，在96孔滤板中使用分批结合的色谱条件的高通量筛选(HTS)大大提高了蛋白质纯化开发的效率。Kelley[19]使用高通量筛选(HTS)系统通过评估蛋白质分配系数来估计树脂-蛋白质相互作用的特征电荷来加速工艺开发。因此，申请人应用了HTS系统，并测量了Poros XS树脂上总共56种不同的pH和盐组合的吸附等温线。通过计算不同种类的分配系数，确定了有效去除中间体种类的最佳条件。然后，申请人将最佳条件应用于Poros XS CEX柱，并进一步开发了精制工艺。
此外，发现中间体种类的等电点(pI)比单体低约0.4个pH单位。由于pH梯度在分析规模中已广泛用于分离电荷变体[21-28]，因此可以将使用pH梯度的相同原理应用于基于中间体与单体的不同pI值将中间体与单体分离。因此，在这项工作中，我们调节缓冲液pH以改变蛋白质的表面电荷，由此影响这些种类与单体之间的选择性。在结合洗脱模式下，对运行条件进行了优化，以使用高pH洗涤缓冲液去除中间体种类，并使用高盐缓冲液清除其他聚集体种类。由于中间体种类是研究的主要重点，因此设计了DOE实验以进一步确认洗涤缓冲液条件，包括洗涤缓冲液pH、洗涤缓冲液盐浓度和洗涤缓冲液体积。加载量也被纳入研究，因为它在其他情况下也显示了对聚集体清除的影响。结果，申请人开发了一种稳健且有效的纯化方法，以去除具有挑战性的中间体种类，其中单体纯度大于99％，步骤产率超过80％。
材料和方法
材料
1.抗IP10单克隆抗体由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系表达。通过使用两级ZetaPlusTM深层过滤器(10SP05A/90ZB05A,3M,USA)和随后的0.2μM无菌过滤器胶囊(Sartorius,USA)来收获细胞培养物材料。
2.树脂
捕获步骤蛋白A树脂是来自GE Healthcare(Piscataway,NJ,USA)的Mabselect蛋白A亲和树脂。CEX树脂是来自Life Technologies(Carlsbad,CA,USA)的Poros XS。此研究中使用的其他树脂是Capto苯基、Tosoh丁基、苯基Sepherose、Capto MMC、Capto AdhereImPres、MEP HyperCel、FractoGel MED SO3 -(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)。
3.色谱纯化过程
所有化学试剂均来自Sigma(St.Louis,MO,USA)和J.T.Baker(MallinkrodtBaker,Phillipsburg,NJ,USA)，除非另有说明。色谱分离是在Unicorn 7.0软件控制的来自GE Healthcare(Piscataway,NJ,USA)的
Figure BDA0002705059200000181
Avant系统上进行的。
所有色谱研究均使用4分钟的恒定停留时间。按照制造商的建议，将色谱柱填充至床高10-20cm，并基于HETP和峰不对称因子进行评估。结果部分或图例中说明了详细的操作条件。通过分析性SEC-HPLC评估产物纯度。
制备型SEC
为了分离中间体高分子量种类，将来自抗IP10 mAb的蛋白A洗脱液注入到TosohBioscience(King of Prussia,PA,USA)的制备型SEC柱(21.5mm x 30cm)上。注射体积为0.5mL，每次运行总加载7-8mg蛋白质。运行缓冲液为0.1M磷酸钾和0.15M氯化钠，pH 6.8。收集级分，并根据洗脱曲线进行合并。
高通量筛选系统
使用Tecan Genesis 150(Tecan US,Research Triangle Park,NC)进行液体和树脂处理。使用具有0.45mm PVDF膜的96孔滤板(Innovative Microplate,Billerica,MA,p/nF20022)温育树脂、蛋白质和溶液混合物。将滤板以1200g离心以将上清液溶液与树脂分离。将滤液捕获在堆叠在滤板下方的收集板中。然后，用UV–vis分光光度计以96孔格式分析收集板中的样品。还用SE-HPLC分析样品的聚集。所有实验均在室温下进行。
分析性测定
1.尺寸排阻HPLC(SEC)
尺寸排阻HPLC(SEC)用于定量分析每种尺寸变异级分的单体、高分子量(HMW)和低分子量(LMW)种类。使用Tosoh Bioscience G3000 SWXL色谱柱(部件号：08541,King ofPrussia,PA)分析样品，使用0.1M磷酸钾和0.15M氯化钠，pH 6.8用作流动相，流速为1.0mL/分钟。通过280nm处的UV吸收来检测峰。结果报告为单体、HMW和LMW种类的面积百分比。
2.基于芯片的CE(Caliper)
在非还原和还原条件下，使用Caliper
Figure BDA0002705059200000191
GXII仪器(Perkin Elmer,Waltham,MA)分析mAb HMW种类。已在其他地方详细且略有修改地描述了常规的基于微芯片的电泳。简而言之，将2μL的2mg/mL抗体与14μL样品缓冲液混合。通过将700μL的PerkinElmer HT Protein Express样品缓冲液与24.5μL的BME(用于还原测定)或35μL的0.5M碘乙酰胺(IAM，用于非还原测定)混合来制备样品缓冲液。将样品在90℃下温育5min。冷却至室温后，在加载到仪器上之前，向每个样品中添加70μL水。芯片是根据制造商的说明书准备的。使用由PerkinElmer提供的内置脚本分析了样品。
3.疏水性相互作用HPLC(HIC)
基于HPLC的HIC方法(TSKgel Butyl-NPR,4.6mm x 10cm,Tosh Bioscience)用于确定每种聚集体种类的相对疏水性。使用线性梯度方法，其中流速为0.5mL/min，流动相A(0.1M磷酸钾，0.15M氯化钠，pH 6.8，含2M硫酸铵)和流动相B(0.1M磷酸钾，0.15M氯化钠，pH6.8)。将分级的聚集体种类注入HIC色谱柱中，总加载量为约30μg。
4.阳离子交换HPLC
使用弱阳离子交换柱(WCX-10,2.5mm x 30cm,Dionex)确定每个分级的聚集体的总体相对净电荷。将线性梯度与流动相A(20mM乙酸盐，pH 5.5)和流动相B(20mM乙酸盐，1.0M氯化钠，pH 5.5)一起使用，流速为0.25mL/min。使用UV检测器在280nm处检测到峰。
5.成像毛细管电泳(iCE)
将所有mAb样品稀释至2.5g/L。将稀释的蛋白质样品(20μL)与制备的两性电解质溶液(180μL)混合，所述两性电解质溶液含有1.0％甲基纤维素(MC)溶液(70μL)、Pharmalyte 3-10(8μL)、8M尿素(50μL)，pI标记4.22和9.46(各1μL)和水(50μL)。将样品充分混合，然后注射到iCIEF仪器中。
将样品预先聚焦在1500V，然后聚焦在3000V。使用CCD相机记录分离毛细管内的IEF过程，以每30秒获取紫外线吸收图像。使用iCE CFR软件4.1(ProteinSimple,San Jose,CA USA)使用那些pI标记进行两点校准，计算峰的pI值。在Empower 3(Waters,Milford,MA)中对每个峰的峰百分比进行定量分析。
6.SEC-MALS
使用TSKgel G 3000SWxl(TOSOH Bioscience)的串联色谱柱在Waters HPLC2695Alliance上通过SEC分析抗体种类及其与蛋白A的复合物。流动相为100mM磷酸钾、150mM NaCl，pH 6.8缓冲液，流速为0.5ml/min。UV信号、光散射和折射率分别由2489UV/Visdetector(Wyatt)、miniDAWN TREOS(Wyatt)和Optilab T-rEX(Wyatt)监测。数据通过ASTRA6.1(Wyatt)处理。
6.天然纳米ESI/MS(NativeNano ESI/MS)
7.用于HCP的ELISA
使用对杂交瘤细胞系NS/0特异的商业微量滴定板ELISA方法(CygnusTechnologies,NC,USA)检测宿主细胞蛋白。样品用与试剂盒一起使用的样品稀释缓冲液(其由磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.0中2mg/ml IgG组成)稀释，并根据制造商的标准测定方案进行分析。将板分光光度计(Tecan Safire II,系列号501000005,Tecan AG,M¨annedorf,Switzerland)设置为450nm/630nm的双波长(测试/参比)，以读取标准品和样品的比色反应。
结果
1.初始CEX运行
使用包括蛋白A色谱作为捕获步骤和阳离子交换色谱(CEX)作为精制步骤的平台工艺进行了初始开发工作。将mAb蛋白A洗脱池在3.5-3.7范围内的低pH下进行病毒灭活，然后中和至pH5.5。中和的蛋白A洗脱池的典型SEC色谱图如图2所示(实线)，总体聚集种类为5％。这两个聚集种类分别称为HMW1和HMW2。将蛋白A池以25g蛋白/L(树脂)的加载量加载到CEX柱(1cm x 20cm)上。
我们首先在pH 5.5下使用15CV的最高300mM的盐浓度进行了盐梯度研究。收集紫外线在100mAU上升和100mAU下降之间的级分，用于SEC分析。虽然HMW1随着洗脱缓冲液的盐浓度的增加而增加，但HMW2却出人意料地降低了，在早期级分中HMW2最高(图1)。看起来与HMW1和单体种类相比，HMW2在CEX色谱柱上的结合较弱。这种非典型的生物物理特性对实现高单体纯度的CEX优化提出了巨大挑战。通过应用阶梯梯度进行洗脱，发现洗脱池中的HMW2种类几乎没有变化，而HMW1种类已被完全去除(图2)。这些观察结果表明，与HMW1种类相比，就表面电荷而言，HMW2种类可能具有与众不同的生物物理学特性。因此，表征这些聚集体，尤其是HMW2种类，对于理解其行为(包括表面电荷和疏水性)变得至关重要，这可以有助于开发更有效地去除聚集体的工艺。同时，还尝试了使用替代树脂的探索。
2.使用其他树脂的研究
似乎仅通过优化CEX操作条件无法获得高单体纯度。通过使用不同类型的树脂寻求替代方法，诸如疏水相互作用色谱(HIC)树脂和阴离子和阳离子混合模式色谱(MMC)树脂。然而，使用HIC的产量很差，这可能是由于蛋白质的极度疏水性质所致。即使在低盐或无盐条件下，蛋白质也可以牢固地结合在HIC柱上，除非引入有机溶剂(如乙醇)(数据未显示)，这对于蛋白质稳定性和产品质量而言并不是理想的选择。Capto MMC通过去除一定水平的中间体种类而不是二聚体种类提供了一些有希望的结果[图3]。表1总结了使用不同树脂去除HMW的性能。
表1.使用不同树脂去除HMW的性能的总结
Figure BDA0002705059200000211
Figure BDA0002705059200000221
3.聚集体的分级和表征
为了开发一种有效去除所有聚集体的工艺，需要对这些聚集体种类有深入的了解。为此目的，使用来自Tosoh的制备型SEC柱收集了具有高纯度的二聚体、中间体和单体的聚集体级分。然后使用SEC-MLAS、毛细管电泳、成像毛细管电泳(iCE)和LC/MS对聚集体进行表征，以确定主要组分及它们的生物物理特性。我们还使用了包括CEX HPLC和HIC HPLC在内的分析工具来测量相对表面电荷和疏水性。表2总结了所有表征结果。
分级
收集级分，并重新注射到SEC上，以评估纯度。纯化的中间体种类(>95％纯度)的SEC色谱图与起始材料重叠，如图4所示。
组成分析
通过使用基于芯片的毛细管电泳和SEC-MALS分析中间体种类的组成。LC/MS与Fabricator消化法相结合也可用于确定该组成。
中间体种类和单体的电泳图(R和NR)显示在图xx-xxy中。基于还原条件，LC与HC的比率经计算为约1.6，表明整体LC的水平高于HC。另一方面，在非还原条件下，在中间体种类中显示了分子量分别为30和54kDa的两个峰。因此，将30kDa峰和54kDa峰分别指定为单个LC和共价结合的LC-LC。中间体种类由两个主要复合体组成：1)与轻链非共价缔合的单体的复合体；2)与轻链二聚体非共价缔合的单体的复合体。基于CE-NR结果，单体/LL是主要的中间体种类。此类组成分配与通过SEC-MLAS测得的约200kDa的分子量很好地匹配。
使用Fabricator消化的LC/MS分析进一步确定了该组成。如图8所示。
生物物理特性
我们使用针对总电荷的成像毛细管电泳、针对总表面电荷的分析性CEX以及针对总表面疏水性的分析性HIC进一步研究了中间体种类的生物物理特性。有趣的是，发现中间体种类不仅比单体疏水性低，而且含有更少的表面电荷。这种非典型的生物物理行为可能与其独特的组成相关。
Figure BDA0002705059200000222
Figure BDA0002705059200000231
归一化的LC与HC的比率＝(样品中的LC％/单体中的LC％)/(样品中的HC％/单体中的HC％)
等式：计算中间体种类的LC/HC
表2.抗IP10 mAb的聚集体的特征
Figure BDA0002705059200000232
分析性CEX和HIC HPLC
分别将抗IP10 mAb的聚集体(二聚体和中间体)和单体注射到分析性CEX HPLC和分析性HIC HPLC上。对于CEX，应用两个运行条件(pH 5.5和pH 7)以评估二聚体、中间体和单体之间的分辨率。在pH 5.5时，二聚体非常好地与单体分离，但中间体种类与单体共洗脱，这正是使用CEX纯化的准确情况。然而，当将运行条件调节至pH7时，中间体种类较早地被洗脱，从而与单体分离。因此，包括采用高pH洗涤以去除中间体种类，并使用B/E以洗脱单体并将更牢固结合的二聚体保留在色谱柱上的策略变得可行。
对中间体种类的进一步了解
通过iCE和LC/MS进一步表征了中间体种类。如图7所示，中间体种类的主pI值为8.7，比单体低约0.4个单位。
iCE曲线
中间体种类与单体(黑线–单体；红线–中间体)的iCE曲线如图7所示。
ESI/质谱
为了进一步确认中间体种类的组成，进行了与天然纳米ESI/MS结合的Fabricator消化的LC/MS分析，如图8和9所示。天然ESI/MS与Fabricator消化相结合不会妨碍非共价相互作用。检测到非共价连接的LC-Fab和LL-Fab，表明LC和LL二聚体结合至Fab区。
工艺优化
1.pH梯度
由于中间体种类显示出比单体低的pI值，因此可以通过操纵工作缓冲液pH来去除中间体种类。因此，将使用pH 5.5至pH 8.5的30mM磷酸盐缓冲液的pH梯度应用到同一CEX柱上的mAb蛋白A池中，如图10所示。收集级分并进行SEC分析。来自线性pH梯度洗脱的SEC的种类分布如图11所示。最初，在相对较低的pH条件下，较早洗脱出更多的LMW和中间体种类，然后是单体种类。随着洗脱pH的增加，更多的二聚体和高阶种类开始从色谱柱上洗脱下来。结果证实了来自分析型CEX HPLC的发现，即pH可用于将中间体种类与单体分离开。此外，图12中的图表明可以优化操作窗口以产生高纯度单体池。因此，将进行DOE研究以评估加载量、洗涤pH、洗涤盐浓度和洗涤体积。
为了进一步比较在盐梯度和pH梯度之间针对分离HMW的选择性，将每个级分的聚集体百分比的总累积含量(C/C0)与蛋白质产率百分比作图。我们知道，中间体种类的洗脱早于单体，并且二聚体种类的洗脱较晚，因此，最理想的情况是中间体种类的斜率较高而二聚体种类的斜率较低，在这种情况下，中间体种类将被有效洗掉，二聚体种类将保留在色谱柱上。
绘制了盐梯度和pH梯度之间的比较，如图12所示。与盐梯度相比，pH梯度明显提供了优异的中间体、二聚体和单体之间的分离。蛋白质产率为10％时，pH梯度提供>60％的中间体种类清除率，而在盐梯度情况下，则仅超过20％。同时，对于pH梯度，>70％LMW被去除，而对于盐梯度，去除20％LMW。二聚体和高阶聚集体种类牢固地结合在色谱柱上，直到pH或盐浓度达到一定水平。然而，类似于中间体种类和单体之间的分离，对于pH梯度，二聚体和单体之间有较好的分离。总之，优化CEX pH条件似乎是使总聚集体和LMW去除最大化以及产物产率损失最小化的更好策略。
2.洗涤缓冲液的pH和盐的组合
尽管中间体种类和单体之间的分离受到操作pH值的影响，但运行条件下的电导率仍可能在分辨率和产物产率方面发挥重要作用。因此，进行了使用多种电导率的pH梯度的系列研究，并针对每种条件绘制了中间体种类分布与总质量的曲线，如图13和14所示。
3.以阶梯梯度使用高pH洗涤液的Poros XS
通过使用pH梯度，中间体和单体之间实现优异的分辨率。然而，从制造的角度来看，阶梯梯度是优选的。通过评估工艺参数并考虑聚集体去除和产物产率，选择了最佳条件(25mM磷酸盐，pH 7.4)来评估pH阶梯梯度。CEX色谱图和相应的SEC曲线(A-加载，B-CEX高pH洗涤，C-CEX洗脱和D-CEX去除)如图15所示。
4.CEX DOE研究
我们对在洗涤缓冲液中使用不同pH和盐浓度的色谱柱的初步研究为我们提供了最佳条件的范围。我们确定洗涤pH的最佳范围是7.2–7.6，洗涤盐[NaCl]的范围在3-7个CV内为24–30mM。加载量(20-30mg蛋白质/mL树脂)也包括在内作为研究因素。
使用DOE实验设计来表征CEX过程。这项研究对于定义设计空间和操作范围对于获得良好的产物质量和稳定的过程非常重要。我们在聚集体清除率和产物产率方面将研究重点集中在洗涤步骤上。加载材料是来自未经优化的蛋白A条件的典型蛋白A池。蛋白A中同时存在二聚体和中间体，各自均超过2.5％。在本研究中，使用了含有5mL Poros XS树脂的Omnifit色谱柱。对于此实验，使用JMP10.0生成了由18个运行组成的定制设计。实验中包括具有3个水平的四个因素，即加载量(20、25和30mg/mL树脂)、洗涤pH(7.2、7.4和7.6)、洗涤盐[NaCl](24mM、27mM和30mM)以及洗涤体积(3CV、5CV和7CV)。通过SEC检测洗脱样品的中间体种类和单体，通过A280分光光度计检测回收，通过ELISA检测HCP，并通过qPCR检测DNA。SEC和单体回收率数据的等高线图如图16所示。
单体％、中间体％和回收率数据在JMP10中建模。由于针对从Poros XS回收的mAb，在所有过程条件下的残留HCP和DNA接近或低于测定的检测极限，因此在所有情况下均可接受，因此这些结果未包括在模型中。对所有三个响应进行建模可得出一个良好的、具有统计学显著性的模型(p<0.05)。来自过程模型的结果表明，洗涤pH对中间体％、单体％和回收％的影响最大。
产率主要受洗涤pH和洗涤盐浓度的影响。发现加载和洗涤CV对产率没有重大影响。
观察到中间体种类与洗涤pH之间的强相关性。
讨论
我们发现中间体种类比单体的酸性更高，这促使我们探索通过pH调节而不是添加盐来修饰表面电荷。开发了使用高pH洗涤以有效去除中间体种类的CEX精制步骤。我们成功实施了包括蛋白A(ProA)→CEX→AEX在内的平台纯化，以控制工艺杂质(HCP、DNA、残留的漂洗蛋白A)和聚集体，以获得单体纯度>99％以及产率>80％的CEX洗脱池。
我们鉴定了中间体种类是由两种主要复合体组成的：与轻链或轻链二聚体非共价缔合的单体。尽管已经报道并表征了含有第三条轻链的mAb，但尚未报道过包含具有如此高百分比的轻链二聚体的mAb。有趣的是，即使两种复合体在SEC上显示为一个单一的中间体峰，但由于我们的高pH洗涤缓冲液在去除含有轻链二聚体的复合体方面更有效，它们似乎具有略微不同的表面电荷。现在的问题是如何解释1)中间体种类所含的表面电荷比单体少；2)单体与轻链二聚体的复合体的电荷比单体与单一轻链的复合体少。为了回答这个问题，我们试图了解不同pH环境下中间体种类的静电。我们使用APBS(自适应Poisson-Boltzmann求解器)测定两种中间体种类和单体在pH 5.5和7.4下的总表面电荷。
中间体种类的独特生物物理特性还反映在其相对于单体的非同寻常的疏水性上。我们在结合洗脱模式下使用HPLC疏水性相互作用色谱法评估每个种类的疏水性。有趣的是，中间体种类的洗脱早于单体，这表明中间体种类的疏水性低于单体。中间体种类的疏水性降低可能是由于以下事实：由于mAb单体与LC或LL之间的缔合，某些疏水性小片可能埋在内部。同样不寻常地，在我们的ProA色谱步骤开发期间，我们发现与单体种类相比，中间体种类在亲和性ProA色谱柱上的洗脱更早(数据未显示)。这种现象可以解释为：1)ProA相互作用主要由疏水相互作用以及一些氢键和两个盐桥组成；2)尽管发现mAb与LC/LL之间的结合位点是单体的Fab区，但一些研究工作已证实Fab臂与Fc之间存在显著的结构偶联，并且Fab的含量可以影响Fc与多种受体结合；3)尽管额外的一个或多个LC与mAb Fab缔合，但可能的空间位阻可能会导致中间体种类与蛋白A树脂之间的较弱结合。
结论
人单克隆抗体(mAb)的尺寸排阻高效液相色谱分析表明，在二聚体和单体之间存在新的聚集体种类。然而，对该种类(称为“中间体种类”)的广泛表征表明，就大小和生物物理属性而言，中间体种类是另一个种类。经确定，该中间体主要是一种复合体，该复合体含有与两条额外的轻链缔合的mAb，分子量为200kDa。发现共价结合的轻链二聚体与单体的Fab部分非共价缔合。
在大多数情况下，发现聚集体与其单体种类相比更具疏水性且带更多正电荷。可以容易地实施在CEX上的简单结合和洗脱，以实现洗脱池中HMW清除率<1％。但是，发现该抗IP10 mAb中的中间体聚集体不仅比单体疏水性更低，而且表面电荷也比单体略少，这对下游的纯化过程提出了巨大挑战。由于以下挑战，HIC在mAb纯化中不是可取的精制步骤：a)极高的疏水性使HIC结合/洗脱或流通模式难以实施；b)由于中间体聚集体的疏水性较低，因此与色谱柱的结合较弱，使得不适合流通HIC。因此，需要合适的精制策略以更有效地去除聚集体。
似乎HIC色谱法和CEX色谱法均不适用于该mAb的中间体聚集体去除。但是，通过操作CEX洗涤缓冲液pH，发现分子量约为200kDa的中间体种类的电荷比单体少，这使它在CEX色谱柱上的结合弱于单体，因此可以分离两种种类。在着重于洗涤策略的情况下，我们开发了使用Poros XS树脂的精制过程，该过程能够用有效洗涤去除中间体种类，并通过优化洗涤缓冲液去除所有其他聚集体种类。对于此mAb，包括蛋白质A和CEX在内的两柱过程足以去除杂质和去除HMW。我们认为，如此高pH的洗涤策略可适用于聚集体的pI值低于单体的pI值的情况。
此外，发现该mAb中的中间体种类与蛋白A色谱柱的结合更弱(数据未显示)，这可能使我们能够通过实施有效的洗涤或削峰策略，使用捕获步骤去除一定水平的中间体种类。此外，我们评估了使用巯基乙基吡啶(MEP)疏水电荷诱导树脂来去除聚集体，尤其是中间体聚集体。此类工作将在单独的文件中呈现。
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等同方案
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Val Ile Gly Phe Ala Gly Leu Ile Lys Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
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<212> PRT
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<400> 3
Glu Gly Ala Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 4
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Gly Phe Ala Gly Leu Ile Lys Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ala Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 454
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Gly Phe Ala Gly Leu Ile Lys Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ala Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 8
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Ile Phe Thr
1 5 10
<210> 9
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Ile Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 10
<211> 216
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Ile Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (21)

1.一种从包含单体单克隆抗体和一种或多种污染物的混合物中纯化所述单体单克隆抗体的方法，其包括：
a)使所述混合物经历阳离子交换色谱(CEX)基质，其中所述单体单克隆抗体与所述CEX基质结合；
b)使所述CEX基质与pH在约7至约7.8之间的洗涤溶液接触；
c)将所述单体单克隆抗体从所述CEX基质洗脱到洗脱溶液中，从而纯化所述单体单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述污染物选自单克隆抗体的聚集体、宿主细胞蛋白质、宿主细胞代谢产物、宿主细胞组成性蛋白、核酸、内毒素、病毒、产物相关的污染物、脂质、培养基添加剂和培养基衍生物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体的聚集体包括二聚体、多聚体和中间体聚集体种类。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合物已经通过亲和色谱获得。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述洗脱溶液不经历第二色谱步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述洗脱溶液进一步经历第二色谱步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二色谱选自离子交换色谱、疏水相互作用色谱和混合模式色谱。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述洗涤溶液的pH在约7.2至约7.6之间。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述洗涤缓冲液的盐浓度在约20至40mM之间。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述洗涤缓冲液的盐浓度在约24至30mM之间。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述中间体聚集体种类在步骤(b)中被去除。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合物选自收获的细胞培养液、细胞培养物上清液和条件细胞培养物上清液、细胞裂解物和澄清的原液。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞培养物是哺乳动物细胞培养物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞培养物是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体是抗IP10抗体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗IP10单克隆抗体包含分别为SEQ ID NO:1、2和3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗IP10单克隆抗体包含分别为SEQ ID NO:4和9的重链可变区序列和轻链可变区序列。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗IP10单克隆抗体包含分别为SEQ ID NO:5和10的全长重链氨基酸序列和全长轻链氨基酸序列。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述单体单克隆抗体被纯化至至少90％单体纯度。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述单体单克隆抗体被纯化至至少95％单体纯度。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述单体单克隆抗体被纯化至至少99％单体纯度。
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