CN111818980B - 阴离子交换-疏水混合模式色谱树脂 - Google Patents

阴离子交换-疏水混合模式色谱树脂 Download PDF

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Abstract

具有阴离子交换‑疏水混合模式配体的色谱树脂，其可用于使用阴离子交换(即，其中配体带正电)和疏水混合模式色谱来纯化靶分子。色谱树脂允许从样品高效纯化靶生物分子(例如，重组蛋白质、抗体、抗体药物偶联物、或抗体衍生物，所述抗体衍生物包括但不限于抗体片段和抗体融合体)，并且已发现可用于从聚集体靶生物分子纯化单体靶生物分子。在一个实施方式中，色谱树脂可用于分离样品中的抗体与一种或多种组分(如污染物)。

Description

阴离子交换-疏水混合模式色谱树脂
背景技术
从来源液体(主要是哺乳动物的体液或细胞培养物)中提取免疫球蛋白对于获得充分浓缩或纯化形式的免疫球蛋白是很有价值的，一般用于诊断和治疗用途以及实验室研究。类似地，从生物样品纯化其他类型的蛋白质和其他分子可以是很有价值的。
附图说明
图1是各种混合模式色谱树脂对单克隆抗体S(mAb S)的动态结合能力(DBC)。
图2是原型13上的mAb S的色谱洗脱分布图。
图3显示出原型13上单克隆抗体T(mAb T)的流穿模式(flow-through mode)纯化色谱图。
图4是原型12上的mAb S的结合-洗脱模式(bind-elute mode)纯化色谱图。
图5是原型13上的mAb S的结合-洗脱模式纯化色谱图。
发明内容
提供了色谱树脂，所述色谱树脂包含连接至阴离子交换-疏水混合模式配体的色谱基质。在一些实施方式中，色谱树脂具有下式或其阴离子盐：
色谱基质-(X)-N(R1)(R2)-(R3-L)n-Ar，
其中：
X是间隔基；
R1和R2各自独立地是被-OH任选取代的C1至C6烷基；
R3是C2至C6烷基或C4-C6环烷基；
L是NR4、O、或S，其中，R4是氢、或C1至C4烷基；
n＝1或2；并且
Ar是6元至10元环，并且：
如果Ar是芳基，则芳基被至多5个C1至C3未取代烷基、C3至C6支化烷基、未取代芳基或氟基团任选取代；或者
如果Ar是杂芳基，则杂芳基被至多4个烷基基团任选取代。
在色谱树脂的一些实施方式中：
X选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-、–O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH(OH)-CH2-、和-CO-NH-C(CH3)2-CO-；
R1和R2各自独立地是C1至C3烷基；
R3是C2至C4烷基；
L是O；
n＝1；并且
Ar是6元环，并且：
如果Ar是芳基，则芳基被至多4个C1至C2未取代烷基、C3至C4支化烷基、或氟基团任选取代；或者
如果Ar是杂芳基，则杂芳基被至多3个烷基基团任选取代。
发明详述
提供了色谱树脂，所述色谱树脂可用于使用阴离子交换(即，其中配体带正电)和疏水混合模式色谱来纯化靶生物分子。色谱树脂允许从样品高效纯化靶生物分子(例如，重组蛋白质、抗体、抗体药物偶联物、或抗体衍生物，所述抗体衍生物包括但不限于抗体片段和抗体融合体)，并且已发现可用于从聚集体靶生物分子纯化单体靶生物分子。在一个实施方式中，色谱树脂可用于分离样品中的抗体与一种或多种组分(如污染物)。
定义
除非另有说明，否则如本申请(包括说明书和权利要求)所用的以下术语具有下文所给出的含义。除非上下文另外明确说明，否则本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指示物。标准化学术语的定义可以在参考著作中找到，所述参考著作包括Carey和Sundberg(2007)“高级有机化学第五版”(Advanced OrganicChemistry 5th Ed.)的卷A和B，纽约斯普林格科学商业媒体有限责任公司(SpringerScience+Business Media LLC,New York)。除非另有说明，本发明的实施将采用合成有机化学、质谱、色谱的制备和分析方法、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。
“抗体”是指免疫球蛋白、其复合物(例如，融合体)或片段形式。该术语包括但不限于：源自人或其它哺乳动物细胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类的多克隆或单克隆抗体，包括天然形式或遗传修饰形式，如人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、移接和体外生成的抗体。“抗体”还包括复合物形式，其包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白。“抗体”包括抗体片段，如无论保留抗原结合功能与否的Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc。
如本文所用，术语“烷基”指具有1至10个碳原子的直链或支化的饱和脂族基团。例如，C1-C6烷基包括但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、和/或己基。烷基可包括任意数量的碳，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6。烷基基团通常是一价的，但可以是二价的，例如当烷基基团将两个化学基团连接到一起时。
如本文所用，术语“环烷基”指具有指定数量碳原子的单环烷基。单环包括：例如，环丁基、环戊基和环己基。
如本文所用，术语“芳基”指单环或稠合二环芳族环组成物。例如，芳基可以是苯基、萘基、或吡啶基。芳基基团可以被一个、两个、三个、四个或五个未取代烷基基团、未取代芳基基团、或氟基团任选取代。
术语“杂原子”是指N、O和S。
如本文中所用，术语“杂芳基”是指包含一个杂原子作为环成员的芳族基团。示例包括但不限于：吡咯、呋喃、噻吩和吡啶。杂芳基基团可以被一个、两个、三个或四个烷基基团任选取代。
在配体的碱性(例如烷基氨基)基团上形成“阴离子盐”。阴离子盐包括但不限于卤化物、磺酸盐、硫酸盐、羧酸盐、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、和硝酸盐。酸加成盐的示例包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、和硝酸盐。
如本文所用，术语“间隔基”是指具有1至30个选自下组的原子的分子：H、C、N、O和S。间隔基具有中性电荷，并且可以包括环状基团。间隔基将色谱配体连接至色谱基质。用于将间隔基连接至色谱基质的键的类型包括但不限于：酰胺、胺、醚、酯、氨基甲酸盐/酯、脲、硫醚、硫代氨基甲酸盐/酯、硫代碳酸盐/酯、和硫脲。在一些实施方式中，用于将间隔基连接至色谱基质的键是胺、醚或酰胺。
“生物样品”是指含有希望纯化的生物来源靶分子(“生物分子”)的任何组合物。在一些实施方式中，待纯化的靶分子是抗体蛋白或非抗体蛋白(例如，激素或酶)。
“结合-洗脱模式(Bind-elute mode)”是指色谱的一种操作方法，其中，建立缓冲条件，以使得在将样品应用于配体时，靶分子以及可任选的不希望的污染物会与配体结合。随后可以通过改变条件使得目标物从载体上洗脱来实现目标物的分提(fractionation)。在一些实施方式中，在目标物洗脱后，污染物仍保持结合。在一些实施方式中，在目标物洗脱之前，污染物会流穿(flow-through)或结合并洗脱。
“流穿模式(Flow-through mode)”是指色谱的一种操作方法，其中，建立缓冲条件，以使得待纯化靶分子流动通过包含配体的色谱载体，同时选择性保留至少一些样品污染物，由此实现将其从样品中去除。
色谱树脂
在第一实施方式中，色谱树脂具有下式或其阴离子盐：
色谱基质-(X)-N(R1)(R2)-(R3-L)n-Ar，
其中：
X是间隔基；
R1和R2各自独立地是被-OH任选取代的C1至C6烷基；
R3是C2至C6烷基或C4-C6环烷基；
L是NR4、O、或S，其中，R4是氢、或C1至C4烷基；
n是1或2；并且
Ar是6元至10元环，并且：
如果Ar是芳基，则芳基被至多5个C1至C3未取代烷基、C3至C6支化烷基、未取代芳基或氟基团任选取代；或者
如果Ar是杂芳基，则杂芳基被至多4个烷基基团任选取代。
由于其结构，与间隔基相邻的氮带有正电荷，因此电荷与pH无关。因此，这些树脂提供了强离子交换。
在第一实施方式的第一方面中，R1和R2各自独立地是C1至C3烷基。或者，R1和R2各自独立地是C1或C2烷基。
在第一实施方式的第二方面中，R3是C2至C4烷基。或者，R3是C2或C3烷基。
在第一实施方式的第三方面中，L是NR4或O、或NR4或S。或者，L是O。
在第一实施方式的第四方面中，n是1。
在第一实施方式的第五方面中，Ar是六元环，并且如果Ar是芳基，则芳基被至多4个C1至C2未取代烷基、C3至C4支化烷基、或氟基团任选取代；或者如果Ar是杂芳基，则杂芳基被至多3个烷基基团任选取代。或者，Ar是被至多3个C1至C2未取代烷基或氟基团任选取代的苯基、萘基或吡啶基。或者，Ar是被一个或两个C1至C2未取代烷基任选取代的苯基。或者，Ar是未被取代的苯基。或者，Ar是杂芳基，并且杂芳基中的杂原子是N。或者，Ar是未被取代的杂芳基。在另一替代方式中，Ar是吡啶基。
在第一实施方式的第六方面中，X通过选自如下的键附着至色谱基质：酰胺、胺、醚、酯、氨基甲酸盐/酯、脲、硫醚、硫代氨基甲酸盐/酯、硫代碳酸盐/酯、和硫脲。或者，所述键是胺、醚或酰胺。
在第一实施方式的第七方面中，X选自下组：
–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-、–O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH(OH)-CH2-、和-CO-NH-C(CH3)2-CO-。或者，X选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、和-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-。
在第二实施方式中，色谱树脂具有下式或其阴离子盐：
色谱基质-(X)-N(R1)(R2)-(R3-L)n-Ar，
其中：
X选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-、–O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH(OH)-CH2-、和-CO-NH-C(CH3)2-CO-；
R1和R2各自独立地是C1至C3烷基；
R3是C2至C4烷基；
L是O；
n是1；并且
Ar是6元环，并且：
如果Ar是芳基，则芳基被至多4个C1至C2未取代烷基、C3至C4支化烷基、或氟基团任选取代；或者
如果Ar是杂芳基，则杂芳基被至多3个烷基基团任选取代。
在第二实施方式的第一方面中，R1和R2各自独立地是C1或C2烷基。
在第二实施方式的第二方面中，R3是C2或C3烷基。
在第二实施方式的第三方面中，Ar是被至多3个C1至C2未取代烷基取代的苯基、萘基或吡啶基。或者，Ar是被一个或两个C1至C2未取代烷基任选取代的苯基。或者，Ar是未被取代的苯基。或者，Ar是杂芳基，并且杂芳基中的杂原子是N。或者，Ar是未被取代的杂芳基。
在第三实施方式中，色谱树脂具有下式或其阴离子盐：
色谱基质-(X)-N(R1)(R2)-(R3-L)n-Ar，
其中：
X选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、和-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-；
R1和R2各自独立地是C1或C2烷基；
R3是C2或C3烷基；
L是O；
n是1；并且
Ar是被至多3个C1至C2未取代烷基任选取代的苯基、萘基或吡啶基。
在第三实施方式的第一方面中，Ar是被一个或两个C1至C2未取代烷基取代的苯基。或者，Ar是未被取代的苯基。
在第四实施方式中，-(X)-N(R1)(R2)-(R3-L)n-Ar是表1中的任一配体。
表1
Figure BDA0002669375520000071
Figure BDA0002669375520000081
Figure BDA0002669375520000091
在第五实施方式中，色谱树脂具有下式或其阴离子盐：
色谱基质-(X)-N(R1)-[(R3-L)n-Ar]2，
其中：
X是间隔基；
R1是被-OH任选取代的C1至C6烷基；
R3是C2至C6烷基或C4-C6环烷基；
L是NR4、O、或S，其中，R4是氢、或C1至C4烷基；
n是1或2；并且
Ar是6元至10元环，并且：
如果Ar是芳基，则芳基被至多5个C1至C3未取代烷基、C3至C6支化烷基、未取代芳基或氟基团任选取代；或者
如果Ar是杂芳基，则杂芳基被至多4个烷基基团任选取代。
在第五实施方式的第一方面中，R1是C1至C3烷基。或者，R1是C1或C2烷基。
在第五实施方式的第二方面中，R3是C2至C4烷基。或者，R3是C2或C3烷基。
在第五实施方式的第三方面中，L是NR4或O、或NR4或S。或者，L是O。
在第五实施方式的第四方面中，n是1。
在第五实施方式的第五方面中，Ar是六元环，并且如果Ar是芳基，则芳基被至多4个C1至C2未取代烷基、C3至C4支化烷基、或氟基团任选取代；或者如果Ar是杂芳基，则杂芳基被至多3个烷基基团任选取代。或者，Ar是被至多3个C1至C2未取代烷基或氟基团任选取代的苯基、萘基或吡啶基。或者，Ar是被一个或两个C1至C2未取代烷基任选取代的苯基。或者，Ar是未被取代的苯基。或者，Ar是杂芳基，并且杂芳基中的杂原子是N。或者，Ar是未被取代的杂芳基。
在第六实施方式中，色谱树脂具有下式或其阴离子盐：
色谱基质-(X)-N(R1)-[(R3-L)n-Ar]2，
其中：
X选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-、–O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH(OH)-CH2-、和-CO-NH-C(CH3)2-CO-；
R1是C1至C3烷基；
R3是C2至C4烷基；
L是O；
n＝1；并且
Ar是6元环，并且：
如果Ar是芳基，则芳基被至多4个C1至C2未取代烷基、C3至C4支化烷基、或氟基团任选取代；或者
如果Ar是杂芳基，则杂芳基被至多3个烷基基团任选取代。
在第六实施方式的第一方面中，R1是C1或C2烷基。
在第六实施方式的第二方面中，R3是C2或C3烷基。
在第六实施方式的第三方面中，Ar是被至多3个C1至C2未取代烷基取代的苯基、萘基或吡啶基。或者，Ar是被一个或两个C1至C2未取代烷基任选取代的苯基。或者，Ar是未取代的。或者，Ar是杂芳基，并且杂芳基中的杂原子是N。或者，Ar是未被取代的杂芳基。
在第七实施方式中，色谱树脂具有下式或其阴离子盐：
色谱基质-(X)-N(R1)-[(R3-L)n-Ar]2，
其中：
X选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、和-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-；
R1是C1或C2烷基；
R3是C2或C3烷基；并且
L是O；
n是1；并且
Ar是被至多3个C1至C2未取代烷基任选取代的苯基、萘基或吡啶基。
在第七实施方式的第一方面中，Ar是被一个或两个C1至C2未取代烷基取代的苯基。或者，Ar是未取代的。
在第八实施方式中，-(X)-N(R1)-[(R3-L)n-Ar]2是表2中的任一配体。
表2
Figure BDA0002669375520000111
Figure BDA0002669375520000121
Figure BDA0002669375520000131
Figure BDA0002669375520000141
在一些实施方式中，阴离子盐是盐酸盐或硫酸盐。
色谱基质是官能化的聚合物，以使得可以与间隔基X形成键。优选地，聚合物是亲水性聚合物。聚合物不溶于水。合适的聚合物是多羟基聚合物，例如，基于如下物质的多羟基聚合物：多糖，例如琼脂糖、右旋糖酐、纤维素、淀粉、支链淀粉(pullulan)，和完全合成的聚合物，例如，聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚羟烷基乙烯基醚、聚羟烷基丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯(例如聚甲基丙烯酸缩水甘油酯)，聚乙烯醇，以及基于苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物，以及其中包括两种或更多种对应于上述聚合物的单体的共聚物。合适的合成聚合物包括但不限于如下物质：来自Toso-Haas公司的Fractogel、来自赛默飞世尔科学公司的POROS介质、来自伯乐公司(Bio-Rad)的Bio-Gel P和Macro Prep、来自TESSEK公司的HEMA和Separon、以及来自波乐公司(Pall)的Hyper D和三丙烯酰基介质(Trisacryl media)。可溶于水的聚合物可衍生为不溶的，例如，通过交联并通过经吸附或共价结合偶联至不溶体。可以通过如下方式将亲水基团引入疏水性聚合物上(例如，单乙烯基和二乙烯基苯的共聚物上)：使呈现出可转化为羟基的基团的单体进行聚合，或通过使最终聚合物亲水化，例如，通过合适化合物(例如，亲水性聚合物)的吸附。可以进行聚合以获得可用基质的单体的示例是：乙酸乙烯酯、乙烯基丙胺、丙烯酸、甲基丙烯酸酯、丙烯酸丁酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、乙烯基吡咯烷酮(乙烯基吡咯酮)，在一些情况下具有官能团。交联剂也可用于许多实施方式中，并且在一些实施方式中当存在交联剂时，其可构成相对于总单体约0.1至约0.7的摩尔比。交联剂的示例为：二羟基乙烯双丙烯酰胺、二烯丙基酒石二酰胺、三烯丙基柠檬酸三酰胺、二丙烯酸乙二醇酯(ethylene diacrylate)、双丙烯酰基胱胺、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺和哌嗪二丙烯酰胺。在一些实施方式中，基质是UNOsphereTM载体、由水溶性亲水性单体生产的聚合物(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)。
色谱基质可以是颗粒、碎片、膜或整体件(monolith)的形式，即材料的厚块、单块、或丸粒。优选地，色谱基质是多孔的。当用作基质时，颗粒可以是球形或珠状形式的，并且是表面光滑的或具有粗糙或纹理化表面。在一些情况下，一些孔是延伸穿过颗粒的通孔，以用作足够大的通道，从而允许通过孔发生流体动力学流动或快速扩散。当为球形或珠状形式时，中值粒径为约25微米至约150微米，其中，术语“直径”是指颗粒的最长外部尺寸。示例性基质及其制备方法的公开见述于Lihme等人的美国专利第6498236号、Hjertén等人的美国专利第5,645,717号、Liao等人的美国专利第5,647,979号、Liao等人的美国专利第5,935,429号、和Liao等人的美国专利第6,423,666号。
通过间隔基X使配体连接至色谱基质。与色谱基质的连接将取决于所使用的具体色谱基质和待连接至色谱基质的化学基团。通过色谱基质上的官能团与配体之间进行反应可以使配体连接至色谱基质。对于不具有合适官能团的色谱基质，色谱基质与合适的活化试剂反应，以产生配体可附着的合适官能团。还原胺化、环氧化物化学反应或氮杂内酯化学反应是分别作用于醛、环氧化物或氮杂内酯官能团的化学反应的示例。
在一些实施方式中，色谱基质包含环氧化基团，并且配体中的叔胺通过以下方案由环氧化物化学反应连接至环氧化基团。在该方案中，间隔基X是–O-CH2-CH(OH)-CH2-。在本公开的该合成方案和其它合成方案中，方块表示基质，而所有偶联化学部分单独显示。
Figure BDA0002669375520000151
在一些实施方式中，色谱基质包含吖内酯环，并且配体中的伯胺通过以下方案连接至吖内酯环。在该方案中，间隔基X是-CO-NH-C(CH3)2-CO-。
Figure BDA0002669375520000152
在一些实施方式中，色谱基质包含二醇，并且配体中的叔胺按以下方案，通过用两种活化试剂(烯丙基缩水甘油醚(AGE)和溴)使树脂活化而连接至–OH基团。在该方案中，间隔基X是–O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-。
Figure BDA0002669375520000161
在某些实施方式中，色谱基质包含–OH基团，并且配体中的叔胺按以下方案，通过用表氯醇使树脂活化而连接至–OH基团。在该方案中，间隔基X是–O-CH2-CH(OH)-CH2-。
Figure BDA0002669375520000162
在一些实施方式中，色谱基质包含–OH基团，并且配体中的叔胺按以下方案，通过用1,4-丁二醇二缩水甘油醚使树脂活化而连接至–OH基团。在该方案中，间隔基X是–O-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH(OH)-CH2-。
Figure BDA0002669375520000171
其他活化试剂包括但不限于：表溴醇(与色谱基质上的-OH官能团反应以产生环氧基)、聚乙二醇二缩水甘油醚(与色谱基质上的-OH官能团反应以产生环氧基)和磺酰氯(如甲苯磺酰氯和三氟代乙烷磺酰氯(tresyl chlorides))(与色谱基质上的–OH官能团反应以产生磺酸酯)。
其它间隔基包括但不限于：–O-CH2-,–O-CH2-CH2-CH2-,–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2)2-、和–O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2-。
色谱基质可以以任何常规构造使用，包括填充柱和流化床或膨胀床柱、整体件或多孔膜，并且可以通过任何常规方法使用，所述常规方法包括用于加载、洗涤和洗脱的分批模式，以及连续或流穿模式。在一些实施方式中，柱的直径范围为1cm至约1m，并且高度为1cm至约30cm或更高。
方法
还提供了用于纯化靶生物分子的方法。在一个实施方式中，该方法包括：使含有生物分子的样品与色谱树脂接触，由此分离生物分子与污染物。随后收集所产生的经纯化生物分子。在一些实施方式中，靶生物分子是单体抗体，并且该方法包括从样品的聚集抗体中纯化单体抗体。
色谱树脂可用于使用阴离子交换(即，其中配体带正电)和疏水混合模式色谱来纯化靶生物分子。可以对条件进行调整以使得色谱以结合-洗脱模式或流穿模式运行。
可以应用该方法的蛋白质制剂可以包括未纯化或部分纯化的来自天然、合成或重组来源的抗体(例如IgG)。例如，未纯化的抗体制剂可以来自各种来源，包括但不限于：血浆、血清、腹水、牛奶、植物提取物、细菌溶解产物(bacterial lysates)、酵母溶解产物或条件细胞培养基。部分纯化的蛋白质制剂可以来自未纯化制剂，所述未纯化制剂已经通过至少一种色谱法、沉淀法、其他分提步骤或前述的任意组合进行了处理。在一些实施方式中，一个或多个色谱步骤采用任意方法，所述方法包括但不限于：尺寸排阻色谱、亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、蛋白质A亲和色谱、疏水相互作用色谱、固定化金属亲和色谱或羟基磷灰石色谱。一个或多个沉淀步骤可以包括盐或聚乙二醇(PEG)沉淀，或用有机酸、有机碱或其它试剂沉淀。其他分提步骤可包括但不限于：结晶、液:液分配(liquid:liquid partitioning)或膜过滤。
如本领域中将理解的，用于混合模式色谱的加载、洗涤和洗脱条件将取决于所使用的具体色谱法介质/配体。
在一些结合-洗脱模式的实施方式中，在高于7(例如7-8或7-9等)的pH下进行加载(即，使抗体与色谱树脂结合)、并任选地进行洗涤。一些示例性结合-洗脱条件为：
结合条件：在适当缓冲液(例如，Tris、Bis-Tris或磷酸盐)中，pH为6.5-8.5，0-1000mM NaCl或100-300mM NaCl；
洗脱条件：使用具有醋酸钠、柠檬酸盐、精氨酸、或甘氨酸的适当缓冲液，pH 3-8.5或4.0-6.0，1-1000mM NaCl或0-150mM NaCl。
任选地，可以在一定条件下对色谱树脂进行洗涤，以使得样品的一些组分被从色谱树脂去除、但目标生物分子保持固定在色谱树脂上。在一些实施方式中，随后通过改变(例如，降低或提高)盐浓度和/或降低与基质接触的溶液的pH，使目标生物分子洗脱。
或者，样品可以流穿模式施加，其中，样品的一些组分固定在色谱树脂上，但是目标生物分子会流穿(即，流动通过)色谱树脂，并被收集。一些示例性流穿条件为：0-150mMNaCl、pH 4.0-8.0；合适的缓冲液可以包括：例如，2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、Bis-Tris、醋酸钠、柠檬酸盐-磷酸盐。
实施例
下列实施例仅作为说明而不是限制进行提供。本领域技术人员将容易识别可以进行改变或修改以产生基本上相同或相似结果的各种非关键参数。
实施例1–制备具有表1配体的色谱基质
与AGE(烯丙基缩水甘油醚)反应：对于表2中的所有配体，以球形珠的形式使用UNOsphereTM二醇(100mL)，一种用N,N′-亚甲基双丙烯酰胺交联的3-烯丙氧基-1,2-丙二醇和乙烯基吡咯烷酮的共聚物，并且二醇密度为200-300μmol/mL。使珠在250RPM的振荡器中悬浮于30mL水、30mL 10N NaOH和16g Na2SO4中10分钟。添加100mL AGE，并且混合物在相同振荡器中保持50℃过夜。所得树脂用3×2柱体积(CV)的异丙醇(IPA)和30CV的水进行洗涤。
溴化：使上述AGE改性的树脂与100mL水和3.4g NaOAC混合。将溴液体逐滴添加至浆料中，直到保持橙色为止(表明双键与溴之间的反应完成)。然后加入Na2SO3直至橙色消失(使过量的溴还原为溴化物)。树脂用30CV水洗涤并准备用于配体偶联。
原型配体与UNOsphere二醇溴化物的偶联：对于各原型配体(即16个配体)，使100mL UNOsphere二醇溴化物与50mL水和50mL IPA混合。然后，添加12.5g原型配体。使各混合物在250RPM振荡器中于50℃孵育过夜。反应结束时，树脂用2CV IPA、2CV水、2CV 1N HCl、2CV水、2CV1N NaOH进行洗涤，然后用30CV的水进行洗涤，以获得各原型树脂。
表3列出了附着至UNOsphere二醇溴化物树脂的各配体的数量、结构和密度。
表3
Figure BDA0002669375520000191
Figure BDA0002669375520000201
Figure BDA0002669375520000211
实施例2–制备具有2-苯氧基乙基胺作为对比配体(原型12)的色谱树脂
制备具有原型12配体的色谱树脂用于比较目的。配体2-苯氧基乙基胺具有以下结构：
Figure BDA0002669375520000221
原型12的氮可以基于pH进行质子化并因此带正电，并且因此与本公开的强离子交换配体不同，其是弱离子交换剂。
为了使2-苯氧基乙胺附着至UNOsphereTM二醇(20mL)，使用82摩尔/毫升的球形珠形式的色谱基质。UNOsphereTM二醇是一种用N,N′-亚甲基双丙烯酰胺交联的3-烯丙氧基-1,2-丙二醇和乙烯基吡咯烷酮的共聚物，并且二醇密度为200-300μmol/mL。
使珠悬浮在20mL的0.1M醋酸钠或水中。添加高碘酸钠至浓度为50至100mM，并将所得混合物在室温(约70℉(21℃))下孵育3-24小时。反应导致二醇基团转化为150-250μmol/mL范围内的醛基团。将所得的醛官能化珠转移到20mL的柱中，该柱中用100mL的水进行洗涤。
然后使20毫升的UNOsphere醛树脂悬浮在20ml的含0.6g 2-苯氧乙胺、pH为7.0的0.20M磷酸钠中。该混合物在室温下孵育(振荡，200rpm)15分钟后，然后添加200mgNaBH3CN，并使反应继续进行3-20小时。确定反应中2-苯氧乙胺的浓度在25mM至200mM的范围内。反应结束时，将树脂原型12转移至20ml柱中，依次用3CV的水和1-2CV的0.1N HCl洗涤，然后用5CV的水进行洗涤。2-苯氧乙胺配体密度在25-100μmol/ml的范围内。
实施例3–结合-洗脱模式的树脂评估
测定三种混合模式树脂(包括两种市售树脂和原型树脂13)的动态结合能力(DBC)和酸性mAb、mAb S的回收率(pI～7.2)。
材料
1.色谱介质：I型陶瓷羟磷灰石(CHT)(伯乐公司，40μ珠尺寸)、II型CHT(伯乐公司，40μ珠尺寸)和原型13(伯乐公司，50μ珠尺寸)
2.测试蛋白质单克隆抗体S(mAb S)：使用UNOsphere SUPrATM亲和色谱介质(伯乐公司)从组织培养液中纯化后，约25％的mAb S分子以聚集体形式存在。
3.填充柱：生物级迷你筒(Bio-Scale Mini cartridge)(伯乐公司)，0.56x 4cm，约1ml床体积，带有无压缩的0.63g CHT I和II、或压缩系数为1.2的1mL原型13。
4.用于CHT I和II的结合缓冲液：5mM NaPO4，25mM NaCl，pH 6.5
5.用于原型13的结合缓冲液：20mM NaPO4，pH 7.8
6.用于CHT I和II的洗脱缓冲液：5mM NaPO4，550mM NaCl，pH 6.5
7.用于原型13的洗脱缓冲液：20mM NaOAc，pH6.0
8.剥离缓冲液：20mM NaOAc，pH 4.0
9.BioLogic Duoflow 10系统(伯乐公司)
方法：
在BioLogic Duoflow 10系统(伯乐公司)上测定DBC：将结合缓冲液中含约1.0毫克/毫升mAb S的溶液以0.62毫升/分钟的流速施加至各柱上。对于各柱，测定柱洗脱物在280nm的光密度(OD280)达到原始mAb溶液的OD280的5％或10％的值(即5％或10％的“穿透(breakthrough)”)的时间。当达到5％或10％穿透时，停止样品加载。然后用结合缓冲液进行洗涤。通过将5％或10％穿透的保留时间乘以流速和mAb浓度来确定DBC。
靶mAb回收率：将结合缓冲液中含约1.0毫克/毫升mAb S的溶液注入1毫升树脂柱上。用pH6.0的洗脱缓冲液洗脱mAb S。通过尺寸排阻高效液相色谱法(HPLC-SEC)分析各柱所收集的抗体洗脱级分，以确定洗脱级分中抗体的聚集体百分含量。通过对各个单体、二聚体和四聚体峰面积进行积分来确定样品中单体、二聚体和四聚体的百分含量，并列于表4中。
结果：动态结合能力(DBC)的结果显示在图1中，mAb S从树脂中的色谱洗脱分布显示在图2中，加载、洗脱物和剥离部分的单体含量显示在表4中。
表4–来自原型13树脂的mAB S的单体含量
Figure BDA0002669375520000231
参见图1，对于mAb S，原型13的DBC高于CHT I和CHT II的DBC。
参见表4和图2，在约pH6，mAb S单体从原型13洗脱(图2)。因此，原型13可以用于以结合-洗脱模式从mAb S去除聚集体。
实施例4–评估流穿模式的原型13树脂
材料
1.色谱介质：原型13(伯乐公司，50μm珠尺寸)
2.含有单克隆抗体T(mAb T)的样品：mAb T的pI为约8.45(DrugBank DB00072)。当用UNOsphere SuprA从CHO细胞培养收获物进行纯化时，mAb T起始材料含有98.3～98.9％的单体。使用牛IgG为标准物通过Bradford来确定24-26毫克/毫升mAb T浓度。通过CHO-CMHCP ELISA试剂盒(天鹅技术公司(Cygnus Technologies))测定，起始原料具有1–2ngdsDNA和150–200ng/mg宿主细胞蛋白(HCP)。
3.填充柱：生物级迷你筒(伯乐公司)，0.56x 4cm，压缩系数为1.2的1mL原型13。
4.结合缓冲液：20mM NaPO4，100mM NaCl，pH 6.5
5.剥离缓冲液：20mM NaOAc，pH 4.0
方法：将树脂填装到柱中，并且用结合缓冲液进行平衡。将含24–26毫克/毫升mAbT的溶液以0.62毫升/分钟的流速施加至柱上。mAbT流穿柱。然后将剥离缓冲液施加至柱以去除结合的物质。
结果：树脂的色谱显示于图3中。在将剥离缓冲液施加至柱之前，在色谱中观察到OD280的增加，表示部分mAb T结合至树脂。结果显示原型13可以用于以流穿模式纯化mAbT。
实施例5–原型13用于以流穿模式去除mAb聚集体的测试
材料：在该实验中使用与实施例4中相同的材料。
方法：将树脂填装到柱中，并且用结合缓冲液进行平衡。将含24–26毫克/毫升mAbT的溶液以0.62毫升/分钟的流速施加至柱上。mAbT流穿柱。然后将剥离缓冲液施加至柱以去除结合的物质。洗脱物中回收的单体mAb T通过OD280、1.4的吸收效率和以下等式进行定量：
单体回收率(％)＝(洗脱物中的总单体/总加载单体)x 100。
结果：结果显示于下表5。在pH6.5、原型13的情况下，mAb T的回收率最高。结果显示原型13可以用于以流穿模式纯化mAb T。
表5：mAb T回收率
Figure BDA0002669375520000241
Figure BDA0002669375520000251
实施例6–结合-洗脱模式的原型树脂用于mAb聚集体去除的测试
材料
1.色谱介质：表3中所列各原型树脂。
2.测试蛋白质mAb S：使用UNOsphere SUPrATM亲和色谱介质(伯乐公司)从组织培养液中纯化后，约25％的mAb S分子以聚集体形式存在。
3.填充柱：生物级迷你筒(伯乐公司)，0.56x 4cm，约1ml床体积，带有压缩系数为1.2的1mL原型13或0.63g CHT。
4.结合缓冲液：20mM磷酸钠，pH 7.8
5.洗脱缓冲液：20mM乙酸钠(pH4.0)
方法：
靶mAb回收率：将结合缓冲液中含约1.0毫克/毫升mAb S的溶液注入1毫升表3所列各原型树脂的柱上。流速为150cm/小时。用10柱体积的0–100％洗脱缓冲液梯度来洗脱mAbS。通过尺寸排阻高效液相色谱法(HPLC-SEC)分析各柱所收集的抗体洗脱级分，以确定洗脱级分中抗体的聚集体百分含量。通过从100％减去聚集体百分含量来确定样品中单体百分含量，并列于表6中。洗脱物中回收的单体mAb S通过OD280、1.4的吸收效率和以下等式进行定量：
单体回收率(％)＝(洗脱物中的总蛋白质/总加载蛋白质)x 100。
结果：各原型树脂的mAb S单体回收率和洗脱物单体含量结果列于表6中。数据显示每个树脂都可用于回收(或纯化)单体mAb S。
表6：原型树脂mAb S单体回收率
Figure BDA0002669375520000252
Figure BDA0002669375520000261
实施例7–结合-洗脱模式的原型12和原型13树脂的比较
材料和方法
靶mAb回收率：将结合缓冲液(20mM磷酸钠，pH7.8)中含1.18毫克/毫升mAb S的溶液注入1毫升原型树脂12和13各自的柱上。流速为150cm/小时。用10柱体积的0–100％洗脱缓冲液(20mM乙酸钠，pH4.0)梯度来洗脱mAbS。通过尺寸排阻高效液相色谱法(HPLC-SEC)分析各柱所收集的抗体洗脱级分，以确定洗脱级分中抗体的单体和聚集体百分含量。通过对相应单体、二聚体和四聚体峰面积进行积分来确定采用各树脂的样品中单体、二聚体和四聚体的百分含量，并列于表7和表8中。
结果：采用两种树脂的单体mAb S的单体含量结果列于表7和8。
表7：采用原型12的mAb S单体回收率
样品 时间范围(分钟) 单体含量(％) 二聚体(％) 四聚体(％)
起始材料 ---- 74.1 20.3 5.6
流穿 45–64 96.2 3.87 0
洗脱物1 74–77 77.5 19.3 3.2
洗脱物2 77–80 70.3 23.2 3.5
洗脱物3 80–82 69.9 22.9 7.2
合并的洗脱物1至3 74-82 72.8 22.8 4.4
表8：采用原型13的mAb S单体回收率
Figure BDA0002669375520000271
参见表7和表8，原型13树脂具有更好的聚集体清除效率，这由包含高单体含量的早期洗脱级分证明(即，在早期洗脱级分的洗脱物0和洗脱物1中存在单体富集)。原型12的mAb S的回收率结果表明，洗脱级分中单体含量无显著差异；因此，在早期洗脱级分(洗脱物1和洗脱物2)中未观察到单体富集。
图4和图5分别是原型12树脂和原型13树脂上mAb S的结合-洗脱模式纯化色谱图。在纯化期间，监测吸光度单位(左y轴上的AU)和pH值(pH单位在右y轴上)随时间的变化。参见图4，随着pH从7.8降低至4，mAb S从原型12树脂洗脱，但是在洗脱级分中未观察到单体mAb S富集(如表7中单体含量结果所证明)。因此，对于原型12树脂，7.8至4的pH梯度并未产生纯化的mAb S。参见图5，随着pH从7.8降低至4，mAb S单体从原型13树脂洗脱，并且mAb S单体的洗脱在约pH6(或者在洗脱级分洗脱物3期间)完成。假设通过洗脱级分洗脱物3完成了mAb S单体的洗脱，并且洗脱级分洗脱物0和洗脱物1中发生单体富集(如表8中的单体含量结果证明)，则可以使用pH 6代替pH 4从原型13树脂中洗脱单体mAbS。这一点得到实施例3中显示的用原型13树脂在pH6的mAb S结合-洗脱结果证明。
本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料均通过引用全文纳入本文。
其他公开和可要求保护的主题
项目1.一种具有下式或其阴离子盐的色谱树脂：
色谱基质-(X)-N(R1)(R2)-(R3-L)n-Ar，
其中：
X是间隔基；
R1和R2各自独立地是被-OH任选取代的C1至C6烷基；
R3是C2至C6烷基或C4-C6环烷基；
L是NR4、O、或S，其中，R4是氢、或C1至C4烷基；
n是1或2；并且
Ar是6元至10元环，并且：
如果Ar是芳基，则芳基被至多5个C1至C3未取代烷基、C3至C6支化烷基、未取代芳基或氟基团任选取代；或者
如果Ar是杂芳基，则杂芳基被至多4个烷基基团任选取代。
项目2.如项目1所述的色谱基质，其中：
X选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-、–O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH(OH)-CH2-、和-CO-NH-C(CH3)2-CO-；
R1和R2各自独立地是C1至C3烷基；
R3是C2至C4烷基；
L是O；
n是1；并且
Ar是6元环，并且：
如果Ar是芳基，则芳基被至多4个C1至C2未取代烷基、C3至C4支化烷基、或氟基团任选取代；或者
如果Ar是杂芳基，则杂芳基被至多3个烷基基团任选取代。
项目3.如项目2所述的色谱树脂，其中：
X选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、和-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-；
R1和R2各自独立地是C1或C2烷基；
R3是C2或C3烷基；
L是O；
n是1；并且
Ar是被至多3个C1至C2未取代烷基任选取代的苯基、萘基或吡啶基。
项目4.如项目1至3中任一项所述的色谱树脂，其中，Ar是被一个或两个C1至C2未取代烷基任选取代的苯基。
项目5.如项目1至4中任一项所述的色谱树脂，其中，-(X)-N(R1)(R2)-(R3-L)n-Ar是表1中的任一配体。
项目6.一种具有下式或其阴离子盐的色谱树脂：
色谱基质-(X)-N(R1)-[(R3-L)n-Ar]2，
其中：
X是间隔基；
R1是被-OH任选取代的C1至C6烷基；
R3是C2至C6烷基或C4-C6环烷基；
L是NR4、O、或S，其中，R4是氢、或C1至C4烷基；
n是1或2；并且
Ar是6元至10元环，并且：
如果Ar是芳基，则芳基被至多4个C1至C3未取代烷基、C3至C6支化烷基、未取代芳基或氟基团任选取代；或者
如果Ar是杂芳基，则杂芳基被至多4个烷基基团任选取代。
项目7.如项目6所述的色谱树脂，其中：
X选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-、–O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH(OH)-CH2-、和-CO-NH-C(CH3)2-CO-；
R1是C1至C3烷基；
R3是C2至C4烷基；
L是O；
n是1；并且
Ar是6元环，并且：
如果Ar是芳基，则芳基被至多4个C1至C2未取代烷基、C3至C4支化烷基、或氟基团任选取代；或者
如果Ar是杂芳基，则杂芳基被至多3个烷基基团任选取代。
项目8.如项目7所述的色谱树脂，其中：
X选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、和-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-；
R1是C1或C2烷基；
R3是C2或C3烷基；并且
L是O；
n是1；并且
Ar是被至多3个C1至C2未取代烷基任选取代的苯基、萘基或吡啶基。
项目9.如项目6至8中任一项所述的色谱树脂，其中，Ar是被一个或两个C1至C2未取代烷基任选取代的苯基。
项目10.如项目6至9中任一项所述的色谱树脂，其中，-(X)-N(R1)-[(R3-L)n-Ar]是表2中的任一配体。
项目11.如项目中1至10中任一项所述的色谱树脂，其中，Ar是未取代的。
项目12.如项目1或6所述的色谱树脂，其中，Ar是杂芳基，并且杂芳基中的杂原子是N。
项目13.如项目1至12中任一项所述的色谱树脂，其中，阴离子盐是盐酸盐或硫酸盐。
项目14.如项目1至13中任一项所述的色谱树脂，其中，X通过胺、醚或酰胺键附着至色谱基质。
项目15.一种色谱树脂，其通过使表1的任一配体以还原胺化、环氧化物化学反应或氮杂内酯化学反应中的任一反应方式与色谱基质反应来制备。
项目16.如项目15所述的色谱树脂，其中，色谱基质包含醛基团，并且表1中任一配体通过还原胺化与色谱基质反应。
项目17.如项目15所述的色谱树脂，其中，色谱基质包含环氧基团，并且表1中任一配体通过环氧化物化学反应与色谱基质反应。
项目18.如项目15至17中任一项所述的色谱树脂，其中，在色谱基质与配体反应之前，色谱基质与烯丙基缩水甘油醚和溴；1,4-丁二醇二缩水甘油基；或表氯醇反应。
项目19.如项目18所述的色谱树脂，其中，色谱基质含有-OH基团，并且与烯丙基缩水甘油醚和溴反应。
项目20.一种色谱树脂，其通过使表2的任一配体以环氧化物化学反应方式与色谱基质反应来制备。
项目21.一种对生物分子进行纯化的方法，所述方法包括：
使含有生物分子的样品与如权利要求1至20中任一项所述的色谱树脂接触，由此分离生物分子与污染物；以及
收集纯化的生物分子。
项目22.如项目21所述的方法，其中，纯化的生物分子是蛋白质。
项目23.如项目22所述的方法，其中，蛋白质是抗体。
项目24.如项目21至23中任一项所述的方法，其中，样品包含单体抗体和抗体聚集体，所述方法包括：分离单体抗体与抗体聚集体，并且，纯化的生物分子包含单体抗体。
项目25.如项目24中任一项所述的方法，其中，纯化的生物分子是单体抗体。
项目26.如项目25所述的方法，其中，接触步骤包括：使单体抗体固定至色谱基质，并且收集步骤包括：从色谱基质洗脱单体抗体。
项目27.如项目26所述的方法，其中，单体抗体通过包括如下过程的步骤进行洗脱：使与配体接触的溶液的pH从约7–9降低至约4–6。
项目28.如项目25所述的方法，其中，接触步骤包括：使单体抗体流动通过色谱基质，并且收集步骤包括：收集流穿的单体抗体。

Claims (32)

1.一种具有下式或其阴离子盐的色谱树脂：
色谱基质-(X)-N(R1)(R2)-(R3-L)n-Ar，
其中：
X是间隔基，其中，X选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-、–O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH(OH)-CH2-、和-CO-NH-C(CH3)2-CO-；
R1和R2各自独立地是被-OH任选取代的C1至C6烷基；
R3是C2至C6烷基或C4-C6环烷基；
L是NR4、O、或S，其中，R4是氢、或C1至C4烷基；
n是1或2；并且
Ar是6元至10元环，并且：
如果Ar是芳基，则芳基被至多5个C1至C3未取代烷基、C3至C6支化烷基、未取代芳基或氟基团任选取代；或者
如果Ar是杂芳基，则杂芳基被至多4个烷基基团任选取代。
2.如权利要求1所述的色谱基质，其中，
R1和R2各自独立地是C1至C3烷基；
R3是C2至C4烷基；
L是O；
n是1；并且
Ar是6元环，并且：
如果Ar是芳基，则芳基被至多4个C1至C2未取代烷基、C3至C4支化烷基、或氟基团任选取代；或者
如果Ar是杂芳基，则杂芳基被至多3个烷基基团任选取代。
3.如权利要求2所述的色谱树脂，其中
X选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、和-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-；
R1和R2各自独立地是C1或C2烷基；
R3是C2或C3烷基；
L是O；
n是1；并且
Ar是被至多3个C1至C2未取代烷基任选取代的苯基、萘基或吡啶基。
4.如权利要求1至3中任一项所述的色谱树脂，其中，Ar是被一个或两个C1至C2未取代烷基任选取代的苯基。
5.如权利要求1至3中任一项所述的色谱树脂，其中，-(X)-N(R1)(R2)-(R3-L)n-Ar是选自下组的任一配体：
N,N-二甲基-2-苯氧基乙-1-胺、
N,N-二甲基-3-苯氧基丙-1-胺、
N,N-二甲基-2-(2-苯氧基乙氧基)乙-1-胺、
2-(甲基(2-苯氧基乙基)氨基)乙-1-醇、
2-(3,5-二甲基苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
2-([1,1'-联苯基]-4-基氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
N,N-二甲基-2-(对甲苯氧基)乙-1-胺、
2-(4-乙基苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
2-(4-异丙基苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
2-(4-氟苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
2-(2,5-二氟苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
3-(3,5-二氟苯氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺、
2-(3-氟苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
2-(3,5-二氟苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
2-(3,4-二氟苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
N,N-二甲基-2-(3,4,5-三氟苯氧基)乙-1-胺、
2-(4-(叔丁基)苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
N,N-二甲基-2-(萘-1-基氧基)乙-1-胺、
N,N-二甲基-2-(全氟苯氧基)乙-1-胺、
N,N-二甲基-2-(吡啶-4-基氧基)乙-1-胺、
N,N-二甲基-2-(吡啶-3-基氧基)乙-1-胺、
2-((2,6-二甲基吡啶-4-基)氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
N,N-二甲基-3-(吡啶-4-基氧基)丙-1-胺、
N,N-二甲基-3-苯氧基环丁-1-胺、
N,N-二甲基-3-苯氧基环戊-1-胺、
N,N-二甲基-3-苯氧基环己-1-胺。
6.如权利要求1至3中任一项所述的色谱树脂，其中，Ar是未取代的。
7.如权利要求1所述的色谱树脂，其中，Ar是杂芳基，并且杂芳基中的杂原子是N。
8.如权利要求1至3中任一项所述的色谱树脂，其中，阴离子盐是盐酸盐或硫酸盐。
9.如权利要求1至3中任一项所述的色谱树脂，其中，X通过胺、醚或酰胺键附着至色谱基质。
10.一种具有下式或其阴离子盐的色谱树脂：
色谱基质-(X)-N(R1)-[(R3-L)n-Ar]2
其中：
X是间隔基；
R1是被-OH任选取代的C1至C6烷基；
R3是C2至C6烷基或C4-C6环烷基；
L是NR4、O、或S，其中，R4是氢、或C1至C4烷基；
n是1或2；并且
Ar是6元至10元环，并且：
如果Ar是芳基，则芳基被至多4个C1至C3未取代烷基、C3至C6支化烷基、未取代芳基或氟基团任选取代；或者
如果Ar是杂芳基，则杂芳基被至多4个烷基基团任选取代。
11.如权利要求10所述的色谱树脂，其中
X选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-、–O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH(OH)-CH2-、和-CO-NH-C(CH3)2-CO-；
R1是C1至C3烷基；
R3是C2至C4烷基；
L是O；
n是1；并且
Ar是6元环，并且：
如果Ar是芳基，则芳基被至多4个C1至C2未取代烷基、C3至C4支化烷基、或氟基团任选取代；或者
如果Ar是杂芳基，则杂芳基被至多3个烷基基团任选取代。
12.如权利要求11所述的色谱树脂，其中
X选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、和-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-；
R1是C1或C2烷基；
R3是C2或C3烷基；并且
L是O；
n是1；并且
Ar是被至多3个C1至C2未取代烷基任选取代的苯基、萘基或吡啶基。
13.如权利要求10至12中任一项所述的色谱树脂，其中，Ar是被一个或两个C1至C2未取代烷基任选取代的苯基。
14.如权利要求10至12中任一项所述的色谱树脂，其中，-(X)-N(R1)-[(R3-L)n-Ar]是选自下组的任一配体：
N-甲基-2-苯氧基-N-(2-苯氧基乙基)乙-1-胺、
N-甲基-2-(2-苯氧基乙氧基)-N-(2-苯氧基乙氧基)乙基)乙-1-胺、
2-(二(2-苯氧基乙基)氨基)乙-1-醇、
2-(3,5-二甲基苯氧基)-N-(2-(3,5-二甲基苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
2-([1,1'-联苯基]-4-基氧基)-N-(2-([1,1'-联苯基]-4-基氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
N-甲基-2-(对甲苯氧基)-N-(2-(对甲苯氧基)乙基)乙-1-胺、
2-(4-乙基苯氧基)-N-(2-(4-乙基苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
2-(4-异丙基苯氧基)-N-(2-(4-异丙基苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
2-(4-(叔丁基)苯氧基)-N-(2-(4-(叔丁基)苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
N-甲基-2-(萘-1-基氧基)-N-(2-(萘-1-基氧基)乙基)乙-1-胺、
2-(4-氟苯氧基)-N-(2-(4-氟苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
2-(2,5-二氟苯氧基)-N-(2-(2,5-二氟苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
2-(3-氟苯氧基)-N-(2-(3-氟苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
2-(3,5-二氟苯氧基)-N-(2-(3,5-二氟苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
2-(3,4-二氟苯氧基)-N-(2-(3,4-二氟苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
N-甲基-2-(3,4,5-三氟苯氧基)-N-(2-(3,4,5-三氟苯氧基)乙基)乙-1-胺、
N-甲基-2-(全氟苯氧基)-N-(2-(全氟苯氧基)乙基)乙-1-胺、
2-((2,6-二甲基吡啶-4-基)氧基)-N-(2-((2,6-二甲基吡啶-4-基)氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
N-甲基-2-(吡啶-4-基氧基)-N-(2-(吡啶-4-基氧基)乙基)乙-1-胺、
N-甲基-2-(吡啶-3-基氧基)-N-(2-(吡啶-3-基氧基)乙基)乙-1-胺、
N-甲基-3-苯氧基-N-(3-苯氧基环丁基)环丁-1-胺、
N-甲基-3-苯氧基-N-(3-苯氧基环戊基)环戊-1-胺、
N-甲基-4-苯氧基-N-(4-苯氧基环己基)环己-1-胺。
15.如权利要求10至12中任一项所述的色谱树脂，其中，Ar是未取代的。
16.如权利要求10所述的色谱树脂，其中，Ar是杂芳基，并且杂芳基中的杂原子是N。
17.如权利要求10至12中任一项所述的色谱树脂，其中，阴离子盐是盐酸盐或硫酸盐。
18.如权利要求10至12中任一项所述的色谱树脂，其中，X通过胺、醚或酰胺键附着至色谱基质。
19.一种具有式色谱基质-(X)-配体的色谱树脂，所述色谱树脂通过使任一配体以还原胺化、环氧化物化学反应或氮杂内酯化学反应中的任一反应方式与色谱基质反应来制备，
其中，X选自下组：–O-CH2-、–O-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-、–O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH2-CH(CH2-OH)-(O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2)2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-、–O-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2-、–O-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH(OH)-CH2-、和-CO-NH-C(CH3)2-CO-，并且，
配体选自下组：
N,N-二甲基-2-苯氧基乙-1-胺、
N,N-二甲基-3-苯氧基丙-1-胺、
N,N-二甲基-2-(2-苯氧基乙氧基)乙-1-胺、
2-(甲基(2-苯氧基乙基)氨基)乙-1-醇、
2-(3,5-二甲基苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
2-([1,1'-联苯基]-4-基氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
N,N-二甲基-2-(对甲苯氧基)乙-1-胺、
2-(4-乙基苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
2-(4-异丙基苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
2-(4-氟苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
2-(2,5-二氟苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
3-(3,5-二氟苯氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺、
2-(3-氟苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
2-(3,5-二氟苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
2-(3,4-二氟苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
N,N-二甲基-2-(3,4,5-三氟苯氧基)乙-1-胺、
2-(4-(叔丁基)苯氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
N,N-二甲基-2-(萘-1-基氧基)乙-1-胺、
N,N-二甲基-2-(全氟苯氧基)乙-1-胺、
N,N-二甲基-2-(吡啶-4-基氧基)乙-1-胺、
N,N-二甲基-2-(吡啶-3-基氧基)乙-1-胺、
2-((2,6-二甲基吡啶-4-基)氧基)-N,N-二甲基乙-1-胺、
N,N-二甲基-3-(吡啶-4-基氧基)丙-1-胺、
N,N-二甲基-3-苯氧基环丁-1-胺、
N,N-二甲基-3-苯氧基环戊-1-胺、
N,N-二甲基-3-苯氧基环己-1-胺。
20.如权利要求19所述的色谱树脂，其中，色谱基质包含醛基团，并且任一所述配体通过还原胺化与色谱基质反应。
21.如权利要求19所述的色谱树脂，其中，色谱基质包含醛基团，并且任一所述配体通过环氧化物化学反应与色谱基质反应。
22.如权利要求19至21中任一项所述的色谱树脂，其中，在色谱基质与配体反应之前，色谱基质与以下物质反应：烯丙基缩水甘油醚和溴；1,4-丁二醇二缩水甘油基；或表氯醇。
23.如权利要求22所述的色谱树脂，其中，色谱基质含有-OH基团，并且与烯丙基缩水甘油醚和溴反应。
24.一种色谱树脂，其通过使配体以环氧化物化学反应方式与色谱基质反应来制备，
其中，所述配体选自下组：
N-甲基-2-苯氧基-N-(2-苯氧基乙基)乙-1-胺、
N-甲基-2-(2-苯氧基乙氧基)-N-(2-苯氧基乙氧基)乙基)乙-1-胺、
2-(二(2-苯氧基乙基)氨基)乙-1-醇、
2-(3,5-二甲基苯氧基)-N-(2-(3,5-二甲基苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
2-([1,1'-联苯基]-4-基氧基)-N-(2-([1,1'-联苯基]-4-基氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
N-甲基-2-(对甲苯氧基)-N-(2-(对甲苯氧基)乙基)乙-1-胺、
2-(4-乙基苯氧基)-N-(2-(4-乙基苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
2-(4-异丙基苯氧基)-N-(2-(4-异丙基苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
2-(4-(叔丁基)苯氧基)-N-(2-(4-(叔丁基)苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
N-甲基-2-(萘-1-基氧基)-N-(2-(萘-1-基氧基)乙基)乙-1-胺、
2-(4-氟苯氧基)-N-(2-(4-氟苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
2-(2,5-二氟苯氧基)-N-(2-(2,5-二氟苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
2-(3-氟苯氧基)-N-(2-(3-氟苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
2-(3,5-二氟苯氧基)-N-(2-(3,5-二氟苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
2-(3,4-二氟苯氧基)-N-(2-(3,4-二氟苯氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
N-甲基-2-(3,4,5-三氟苯氧基)-N-(2-(3,4,5-三氟苯氧基)乙基)乙-1-胺、
N-甲基-2-(全氟苯氧基)-N-(2-(全氟苯氧基)乙基)乙-1-胺、
2-((2,6-二甲基吡啶-4-基)氧基)-N-(2-((2,6-二甲基吡啶-4-基)氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺、
N-甲基-2-(吡啶-4-基氧基)-N-(2-(吡啶-4-基氧基)乙基)乙-1-胺、
N-甲基-2-(吡啶-3-基氧基)-N-(2-(吡啶-3-基氧基)乙基)乙-1-胺、
N-甲基-3-苯氧基-N-(3-苯氧基环丁基)环丁-1-胺、
N-甲基-3-苯氧基-N-(3-苯氧基环戊基)环戊-1-胺、
N-甲基-4-苯氧基-N-(4-苯氧基环己基)环己-1-胺。
25.一种对生物分子进行纯化的方法，所述方法包括：
使含有生物分子的样品与如权利要求1至24中任一项所述的色谱树脂接触，由此分离生物分子与污染物；以及
收集纯化的生物分子。
26.如权利要求25所述的方法，其中，纯化的生物分子是蛋白质。
27.如权利要求26所述的方法，其中，蛋白质是抗体。
28.如权利要求25至27中任一项所述的方法，其中，样品包含单体抗体和抗体聚集体，所述方法包括：分离单体抗体与抗体聚集体，并且，纯化的生物分子包含单体抗体。
29.如权利要求28所述的方法，其中，纯化的生物分子是单体抗体。
30.如权利要求29所述的方法，其中，接触步骤包括：使单体抗体固定至色谱基质，并且收集步骤包括：从色谱基质洗脱单体抗体。
31.如权利要求30所述的方法，其中，单体抗体通过包括如下过程的步骤进行洗脱：使与配体接触的溶液的pH从7–9降低至4–6。
32.如权利要求29所述的方法，其中，接触步骤包括：使单体抗体流穿色谱基质，并且收集步骤包括：收集流穿的单体抗体。
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