CN106103465A - 使用预清洗步骤的免疫球蛋白纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫球蛋白的纯化，及提供用于以有效而节约成本的方式和以令人满意的纯度和产率纯化免疫球蛋白的方法的问题。具体而言，本发明涉及成本非常高的层析材料的重复利用方面，尤其是用于下游工艺捕获步骤的层析材料的寿命，及可以如何在降低纯化工艺技术复杂性的同时增加层析材料寿命。

Description

使用预清洗步骤的免疫球蛋白纯化
技术领域
本发明涉及从细胞培养物来源的组合物纯化抗体的方法，其在捕获步骤和/或捕获步骤后的其他精制步骤之前使用预清洗步骤。
背景技术
选择高效和经济的下游顺序来纯化通过重组DNA技术产生的多肽，是每种预期用于治疗用途的新生物药物开发中的重要步骤。最近，由于其在医疗用途中异常高的治疗剂量，随着导致更高细胞密度和更高表达速率的改进的细胞培养方法的使用，对单克隆抗体大规模纯化工艺的需求进一步增强。培养液中不断提高的产物和污染物浓度对捕获层析、对其之前的样品澄清步骤和对随后的精制层析提出了更高的要求。整个下游工艺必须：(i)处理提高的产物量；(ii)有效去除增加的工艺相关和产物相关杂质至低于确定的接受标准；和(iii)保持mab的经济产率和足够质量。通常，下游工艺占据治疗性抗体的总制造成本的大部分。
粗级分中的mab通常与杂质结合，如宿主细胞蛋白质(HCP)、宿主DNA、病毒、聚集体、其他不希望得到的产物变体和多种来自工艺材料的浸出物(leachate)。这些杂质的存在对患者而言是潜在健康风险，因此法规要求最终产品中不含它们。仅可容忍非常低的残留量。
用于纯化细胞培养物来源的多肽的经典流程遵循捕获层析-中间层析-精制层析的顺序，在该下游顺序的多种位置伴随过滤、浓缩或透析步骤。近年来，已在mab纯化领域成功建立平台方法。由于mab是具有共同物理化学特性的明确定义的糖蛋白种类，使用通用平台工艺是合理的(Kelly B 2009)。这种通用工艺(具有或多或少的产品特异性修改)可以应用于许多mab，尤其是用于属于相同种类或亚类(例如IgG1)的那些免疫球蛋白。
用于mab纯化的最常见捕获步骤之一是A蛋白亲和层析。此捕获提供了对含Fc分子的杰出选择性，从而在单个步骤中去除超过99.5％的污染物。但是，除其优势外，还应提到两个劣势。一个劣势是不希望的A蛋白或A蛋白片段浸出，已知其具有毒性(Gagnon P1996)。另一个劣势是这类树脂的高成本，尤其是在纯化治疗性抗体所必需的工业规模上的高成本。A蛋白树脂约比离子交换树脂贵30倍。据计算，对于10m3细胞培养物的下游处理，A蛋白亲和层析的成本约为4-5百万美元(Farid SS 2009)。
已公开了许多解决方案来克服浸出A蛋白的问题(Gagnon P 1996；Fahrner RL2001)。几种方法涉及去除浸出A蛋白的A蛋白后层析步骤，如以结合模式(EP0345549)或流穿模式(WO2004076485)使用的阴离子交换层析，阳离子交换层析(WO2009058812)，疏水作用层析(WO9522389)，或层析组合，例如离子交换层析后进行疏水作用层析(WO2010141039)，阴离子交换层析后进行阳离子交换层析(WO2011090720)，或以任意顺序进行的阳离子交换层析和混合模式层析(WO2011150110)。由于治疗性抗体所需总体纯度极高，典型平台纯化方案包括至少两步A蛋白后层析，其通常选自阳离子交换、流穿模式阴离子交换(anion exchange chromatography in flow-through)和疏水作用层析(FahrnerRL 2001、Kelly B 2009、WO9522389、WO2009138484、WO2010141039、WO2011017514、WO2011090720)。
其他方法通过在洗脱免疫球蛋白之前使用去除浸出A蛋白的特殊洗涤，在A蛋白亲和层析过程中就已减少浸出物。开发了许多中间洗涤缓冲液，其包含盐或其他成分，例如疏水电解质，如氯化四甲铵(Fahrner RL 2001)。
一些方法通过直接降低源自样品的蛋白水解活性，更靠近A蛋白浸出的来源发挥作用。大部分A蛋白浸出由蛋白水解引起。通过低温和/或通过向缓冲液中加入蛋白酶抑制剂(WO2005016968)来达到这种减少的浸出。
用于避免或减少A蛋白浸出的特殊方法包括用表面活性化合物预处理A蛋白树脂，例如离液物质(chaotropic substance)，如尿素或盐酸胍(WO03041859)。
早已知道不同类型的A蛋白树脂显示不同的浸出程度(Füglistaller P 1989)。因此，A蛋白材料的选择是重要因素。除配基本身外，骨架基质也影响浸出、结合载量(bindingcapacity)和流速(Fahrner RL 2001)。这些参数一起确定柱尺寸、工艺时间，从而确定亲和捕获步骤的经济性。此外，在过去十年间，层析供应商开发了通过遗传改造天然金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)A蛋白序列而提供的更耐用的A蛋白配基。这些改进的树脂包含刚性基质与改进的重组配基蛋白质的组合，该改进的重组配基蛋白质特殊改造，以使得能够耐受碱、具有高结合载量和低配基渗漏。一个实例是来自GE Healthcare LifeSciences的MabSelect SuReTM(WO2009138484)。此材料可以在运行后用至多0.5M NaOH快速和有效地清洗。但是，得到这些益处需付出代价。MabSelect SuRe和相当的现代树脂显著贵于前代A蛋白树脂。因此，虽然有这些新的亲和介质，但并没有经济利益，实际情况恰好相反。
鉴于与基于A蛋白的亲和捕获相关的非常高的成本，开发完全避免用任何亲和层析进行免疫球蛋白纯化的备选策略也就不足为奇。一个实例是使用高效切向流过滤与非亲和层析如阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水作用层析或混合模式层析的组合(WO03102132)。
在许多情况下，用粗输入(上样)材料进行捕获步骤，其可导致亲和柱树脂的污染(杂质累积在亲和柱树脂上)。在缺乏适当再生步骤的情况下，这可以阻止捕获树脂的成功重复使用。在A蛋白亲和捕获的情况下，必须强调，配基浸出不是限制A蛋白树脂寿命的主要因素。粗培养液中的污染物(如脂质、氧化剂、聚集体或颗粒、金属离子和其他物质)促进树脂的污染(fouling)。除对A蛋白结合部分的直接作用外，基质也可受到不可逆污染。结果使载量和流速从一次运行至另一次运行降低。此问题不限于A蛋白树脂：层析树脂在其运行寿命中污染是商业生物分离中普遍的显著问题。在用作细胞培养物来源免疫球蛋白的捕获步骤时，用于疏水作用层析和混合模式层析的疏水配基尤其易于截留来自培养液的亲脂污染物。虽然有运行后清洗步骤的复杂流程，但捕获柱的寿命受限，并取决于循环数、运行和清洗的操作条件及样品纯度。
混合模式层析主要描述为用于A蛋白下游精制步骤的选择(Kelly,B.2009,WO03102132)。已知结合模式的Capto MMC在纯化mab中的用途。开发了特殊的洗脱条件(WO2011049798)。同样，已显示，在A蛋白亲和层析后进行的流穿阴离子交换层析之后，优选流穿模式的CaptoAdhere是适宜的精制步骤(WO2013066707)。此外，以过载和洗脱层析模式考察了一些不同的混合模式树脂，CaptoAdhere是最优选的(WO2013067301)。
为了澄清重污染培养液，利用了机械分离步骤，其去除大多数细胞碎片和聚集体。离心和过滤是在将样品上样至捕获树脂之前进行的最常见的预处理步骤。对于大体积，通过细胞分离器进行离心，通过深层过滤器和/或微滤器进行过滤步骤。得到的培养液则称为“澄清的细胞培养上清”(Liu HF 2010)。虽然直接将收获培养液上样至A蛋白树脂上是常见的方法选择(Fahrner RL 2001)，但其他平台技术利用澄清步骤，即离心、深层过滤和/或微滤(Liu HF 2010,WO9522389,WO2001150110)，以保护捕获柱。
在离心/过滤基础上备选地或额外地进行的预清洗层析步骤仅有零星报道。在非常小的规模上在A蛋白之前使用了固定化金属(Zn2+)螯合层析(IMAC)(VanDamme A.-M.1990,Bulens F.1991)。相反，在离心、过滤和浓缩之后使用了DEAE Cellulose上的弱阴离子交换层析，然后将所获得的流穿物上样至A蛋白上(EP0550400)。最后，考察了在A蛋白之前用深层过滤预处理培养液的优势，并与较低效的TMAE Fractogel上的流穿模式阴离子交换层析相比较(Yigsaw Y 2006)。
发明概述
本发明涉及免疫球蛋白的纯化，及提供用于以有效而节约成本的方式和以令人满意的纯度和产率纯化免疫球蛋白的方法的问题。具体而言，本发明涉及成本非常高的层析材料的重复利用方面，尤其是用于下游工艺捕获步骤的层析材料的的寿命，及可以如何在降低纯化工艺技术复杂性的同时增加层析材料寿命。
用于从细胞培养液纯化免疫球蛋白的常规下游层析工艺通常以捕获层析步骤开始，其中必须从包含与杂质在一起的免疫球蛋白的样品捕获免疫球蛋白。免疫球蛋白大致由于免疫球蛋白与捕获层析树脂的选择性结合而从杂质分开，杂质不结合树脂，从而在流穿物中获得，而免疫球蛋白在洗脱物中获得。
此捕获层析步骤通常是免疫球蛋白纯化中最昂贵的步骤，占总体下游工艺成本的40至50％。在使用A蛋白亲和层析时，捕获步骤的成本尤其高。相同的情况适用于混合模式层析柱，其可以备选地用作免疫球蛋白纯化中的捕获层析步骤。
一直存在对从大体积的细胞培养液和发酵液及从源自这类细胞培养液或发酵液的样品节约成本地纯化免疫球蛋白的需要。具体而言，存在对节约成本而仍然有效且在纯度和产率上令人满意的纯化方法的需要。
已发现，通过在捕获层析步骤上游并入附加层析步骤，可以显著降低纯化工艺的总费用。捕获层析步骤上游的附加层析步骤降低了高成本捕获层析材料所暴露的杂质负荷。用与在随后的捕获步骤中使用的层析材料相比更便宜和更耐用且易于再生的层析材料进行这个所谓的“预清洗”步骤。
为了保持纯化工艺尽可能简单，在优选实施方案中，预清洗步骤以流穿模式进行，即待纯化的免疫球蛋白不结合树脂，从而在流穿级分中获得，而杂质很大程度上保留在树脂上，从而从免疫球蛋白分开。
在另一优选实施方案中，预清洗步骤和捕获步骤串联，以便预清洗步骤的流穿物不在收集容器中暂存，而是立即转到捕获层析树脂。
为了达到预期用于治疗用途的免疫球蛋白所需的高纯度，在预清洗步骤和捕获层析步骤之后，进行捕获层析步骤后的一个或多个层析精制步骤。
通过提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法来解决本发明潜在的问题，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；或使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
本发明进一步解决在免疫球蛋白制造工艺中提高病毒安全性的问题。
附图简述
图1：常规免疫球蛋白纯化方法的工艺方案
图1A显示用于从大体积细胞培养物纯化免疫球蛋白的通用工艺方案。从离心和/或过滤所收获的培养液后获得的澄清大体积材料开始，该工艺包括A蛋白捕获步骤和两个后续精制步骤。此方案包括两个典型的病毒安全性步骤。通过保持A蛋白洗脱物处于低pH来进行病毒灭活步骤，并在最后一个精制步骤后进行用于病毒去除的纳米过滤步骤。最后一步通常是设置希望得到的免疫球蛋白浓度和制剂成分浓度的切向流超滤和/或渗滤(UF/DF-TFF)。
图1B显示用于从大体积细胞培养物纯化免疫球蛋白的包括三步层析的经典工艺方案(例如，按照Fahrner R.L.2001或Kelly B.2009)。除公开的精制步骤是阳离子交换层析(精制步骤1)后进行阴离子交换层析(精制步骤2)外，该工艺是与图1A中相同的工艺。必须强调，阳离子交换层析以结合模式进行，而阴离子交换层析以流穿模式进行。应提到，此经典方案的常用等同变通形式是简单地改变精制步骤1和2的顺序。
图2：本发明的使用预清洗步骤的示例性工艺方案
图2A显示在A蛋白捕获步骤之前具有预清洗步骤的大规模工艺方案。通过使用分离器的制备型离心及随后的深层过滤和微滤来澄清所收获的细胞培养物。通过以流穿模式使用阴离子交换柱来进行预清洗层析步骤。在优选配置中，预清洗柱直接连接A蛋白捕获层析柱。两个精制步骤是以结合和洗脱模式利用的阳离子交换层析(精制步骤1)及随后的混合模式层析(精制步骤2)。混合模式树脂具有带正电荷的配基，且可以以结合模式或以流穿模式进行。此第二精制步骤是可选的。病毒安全性步骤和最终UF/DF-TFF在图1A下描述。
图2B显示除在预清洗阴离子交换和A蛋白亲和层析之间插入另一混合模式层析之外，与图2A的工艺相似的备选大规模工艺方案。此混合模式层析用含有带负电荷的配基的树脂(例如Capto MMC)或用含有带正电荷或不带电荷的配基的树脂(例如MEP HyperCel)进行，且以结合模式进行。因此，混合模式层析在此工艺中作为捕获步骤发挥作用，而A蛋白亲和层析在此方案内更好地定义为中间步骤。作为最后一步层析的第二混合模式层析步骤是可选的。所有其他步骤如图2A下所述。
图2C显示除用混合模式捕获层析取代A蛋白捕获层析之外，与图2A的工艺相似的另一备选大规模工艺方案。此混合模式层析用含有带负电荷的配基的树脂(例如CaptoMMC)或用含有带正电荷或不带电荷的配基的树脂(例如MEP HyperCel)进行，且以结合模式进行。与图2B中所示的工艺不同，此工艺缺乏A蛋白亲和层析。所有其他步骤如图2A下所述。
发明详述
本文所用的“样品”或“包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品”包含目的免疫球蛋白和至少一种杂质。样品可以直接从产生免疫球蛋白的宿主细胞或生物获得。样品可以是收获的细胞培养液、细胞培养物上清或预处理的细胞培养物上清。样品可以通过离心和/或过滤(例如微滤、渗滤、超滤和深层过滤)进行了部分澄清或纯化。
本文所用的术语“预处理样品”是例如为用于本发明方法的层析步骤准备的细胞培养物上清，例如，为了调整pH和/或电导率范围和/或缓冲能力，以达到希望得到的层析性能及稳定免疫球蛋白，对样品进行一种或多种调整，包括缓冲液更换，稀释，加入盐、去垢剂、离液物质或有机化合物，pH滴定或过滤。由于从哺乳动物细胞表达的免疫球蛋白通常在培养过程中分泌进入细胞培养液，在培养过程结束时通过从细胞分离细胞培养液来进行产物收集。细胞分离方法应应温和，来最小化细胞破碎，以避免细胞碎片的增加及蛋白酶和可影响免疫球蛋白产物质量的其他分子的释放。通常，对来自哺乳动物细胞培养物的收获液进行离心，然后过滤。膨胀床吸附层析是避免离心/过滤方法的备选方法。通过层析步骤纯化之前的其他样品处理可以是浓缩和/或渗滤细胞培养物上清为特定免疫球蛋白浓度、pH范围、电导率和缓冲液种类浓度。
术语“杂质”和“污染物”在本文中可互换使用，指不同于目的免疫球蛋白的任何物质。实例可以是细胞培养液成分、宿主细胞蛋白质、内毒素、病毒、脂质、DNA、RNA、来自工艺材料的浸出物、及其聚集体或片段。待纯化的目的免疫球蛋白的聚集体、电荷变体、错误折叠分子或片段也视为杂质。
本文所用的术语“层析介质”必须理解为处于小球、平板、晶体、monolith、膜、纤维、纤维网、或任意其他固相的形式的层析材料或介质。“介质”具有结合称为“基质”的骨架的称为“配基”的官能团。一个例外是用于大小排阻层析的凝胶层析树脂，其通常不含任何附着的配基。因此，术语“介质”不将本发明的方法仅限于利用层析树脂的柱层析，而是还包括其他类型的层析，例如利用膜吸附剂的膜层析。具体而言，在阴离子交换层析中，阴离子层析交换树脂或阴离子交换层析膜二者都包含在本发明内。
“树脂”指小球形式的任何层析材料或介质，其包含具有可与蛋白质或至少一种污染物相互作用的结合官能团(配基)的基质。一个例外是用于大小排阻层析的凝胶层析树脂，其通常不含任何附着的配基。树脂可以作为不同大小的小球提供，并填充在柱中。备选地，可以购买预装柱。
术语“结合模式”或“结合和洗脱模式”指层析条件，其中将含有待纯化免疫球蛋白的样品加至层析柱，其中免疫球蛋白结合层析介质。因此，免疫球蛋白保留在层析介质上，而样品的杂质可以存在于非结合级分(也称流穿级分)中。在以结合模式进行层析步骤时，可以在免疫球蛋白结合层析介质之后和从介质洗脱免疫球蛋白之前进行一个或多个洗涤步骤。为了获得免疫球蛋白，然后洗脱并在洗脱物中获得免疫球蛋白，然后可以根据需要在其他层析步骤中对其进行进一步纯化。免疫球蛋白的洗脱可以用允许污染物保持结合介质而免疫球蛋白洗脱的选择性条件进行。
以“结合模式”进行层析步骤并非必然指结合100％的目的免疫球蛋白。在本发明的背景中，“结合层析树脂”或“结合层析介质”指至少50％的免疫球蛋白结合、优选至少75％的免疫球蛋白结合、更优选至少85％的免疫取蛋白结合、最优选超过95％的免疫球蛋白结合树脂或介质。
术语“流穿模式”、“在流穿物中获得不结合层析树脂的免疫球蛋白”和“在流穿物中获得不结合层析介质的免疫球蛋白”指层析条件，其中将含有目的免疫球蛋白的样品加至层析树脂或介质，其中免疫球蛋白不结合层析树脂，而是主要存在于不结合树脂或介质的级分中，因此包含在流穿物中。
以“流穿模式”进行层析步骤并非必然指100％的目的免疫球蛋白不结合，因此包含在流穿物中。在本发明的背景中，“不结合层析树脂”或“不结合层析介质”指至少50％的免疫球蛋白不结合、优选至少75％的免疫球蛋白不结合、更优选至少85％的免疫球蛋白不结合、最优选超过95％的免疫球蛋白不结合树脂或介质。杂质可以以此模式结合树脂或介质。
在本发明的背景中，应理解，本发明的预清洗层析步骤以流穿模式进行，而捕获步骤视为第一层析步骤，其以结合模式进行。
在导致本发明的实验中，观察到无细胞收获材料(澄清的上清)仍包含几种连同待纯化的免疫球蛋白一起强烈结合捕获树脂的物质。这影响树脂的重复使用。根据本发明的发现，对于附加的澄清培养液快速纯化，插入适宜的预清洗柱代表了良好的解决方案。通过结合其他杂质，预清洗柱提高样品纯度，减少关键污染物，并保护高成本亲和柱。预清洗柱应可重复使用，且其再生应可能通过简单手段进行。最适宜的是具有坚固基质的强阴离子交换层析介质，该基质具有选自季铵基乙基、季铵或三甲铵部分的配基，例如，如Nuvia Q所提供。以流穿模式使用预清洗阴离子交换柱具有几个优势：柱可以保持相对小，且它可以直接连接捕获柱。此配置避免了暂时收集和保存阴离子交换洗脱物，减少步骤数，并提高工艺的经济性。阴离子交换柱后可以是A蛋白或混合模式树脂(例如Bakerbond ABx、Capto MMC、CaptoAdhere或MEP HyperCel)或任何其他难以再生的高价树脂。
术语“按以下顺序”理解为指按所列顺序进行所提到的工艺步骤。可以在所列工艺步骤之前、之后和之间并入其他工艺步骤。
本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；或使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析，其中免疫球蛋白结合免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂，通过从免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂洗脱蛋白质，来在洗脱物中获得免疫球蛋白；或使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换介质的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；或使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换介质的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析，其中免疫球蛋白结合免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂，通过从免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂洗脱蛋白质，来在洗脱物中获得免疫球蛋白；或使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
术语“其他处理步骤”指常应用于蛋白质纯化流程内的任意步骤，如过滤、透析、病毒灭活、稀释、浓缩、pH调节、电导率调节、或中间层析步骤。其他处理步骤可以应用于本发明的所有层析步骤之间。除步骤(a)的使样品暴露于阴离子交换层析和步骤(b)的使步骤(a)中获得的流穿物暴露于层析之间外，中间层析步骤可以应用在任意层析步骤之间。具体而言，术语“其他处理步骤”指应用在捕获层析和阳离子交换层析之间的中间层析步骤。中间层析步骤可以用任意层析介质进行。中间层析步骤可以利用任意层析类型，包括柱层析和膜层析。
在一个实施方案中，在步骤(a)的使样品暴露于阴离子交换层析和步骤(b)的使步骤(a)中获得的流穿物暴露于层析之间不应用其他处理步骤。
在另一实施方案中，在步骤(a)的使样品暴露于阴离子交换层析和步骤(b)的使步骤(a)中获得的流穿物暴露于层析之间不应用过滤，例如除菌过滤。
预清洗步骤：阴离子交换层析
本发明的方法涉及在捕获步骤之前作为预清洗步骤的流穿模式阴离子交换层析步骤。此阴离子交换层析介质可以是强或弱阴离子交换层析介质，包括阴离子交换膜。
已发现，此预清洗阴离子交换层析步骤能够有效截留否则可在酸性pH下引起沉淀的杂质，并结合宿主核酸分子，如DNA和RNA。还发现，来自粗样品的促进层析捕获柱污染的物质被预清洗阴离子交换柱预捕获，避免进入随后的捕获柱。
此外，预清洗步骤对A蛋白浸出具有显著作用，通过使用预清洗层析可大幅减少A蛋白浸出。
最后，观察到，在用于病毒灭活的A蛋白洗脱物保持步骤期间观察到沉淀和/或浑浊的情况下，在使用预清洗阴离子交换层析时，此作用可以完全避免。由于预清洗步骤的层析介质暴露于层析工艺中最高的杂质负荷，预清洗步骤的层析介质需要快速、便宜和有效的再生和清洗方法。已发现，阴离子交换层析介质(例如树脂或膜)的再生可以用仅包括几个步骤的快速、便宜和有效的流程有效地进行。对于阴离子交换层析介质的再生，可以利用允许短时间内清洗层析介质而不减损其功能的苛刻条件。离子交换层析依赖于待结合的分子和固定在基质上的电荷之间的电荷-电荷相互作用。在阴离子交换层析中，待结合的分子带负电荷，固定的官能团(配基)带正电荷。常用的阴离子交换层析介质是Q介质(季胺配基)、TMAE树脂(三甲氨乙基配基)和DEAE树脂(二乙氨乙基配基)。但是，一般而言，阴离子交换层析步骤可以用所有常见的市售阴离子交换介质进行。阴离子交换介质可以以预装柱的形式或作为膜使用。备选地，树脂可以作为原材料购买，并由用户装柱。关于柱的容量和尺寸，除常规限制外没有特别的限制。本领域技术人员知道要使用的阴离子交换层析介质的量和柱的尺寸。这取决于工艺的总体规模。
可用于本发明目的的典型强阴离子交换层析介质包含如以下的官能团：季氨乙基(QAE)部分，树脂包括，例如Toyopearl QAE(可从Tosoh Bioscience,德国获得)、Selectacel QAE(纤维素的季氨乙基衍生物，可从Polysciences Inc.,Pennsylvania USA获得)、QAE Sephadex(可从GE Healthcare,德国获得)等；季铵(Q)部分，树脂包括，例如QSepharose XL、Q Sepharose FF、Q Sepharose HP、Q Sepharose CL-4B、Q Sepharose BigBeads、Source Q、Resource Q、Capto Q、Capto Q ImPres(全都可从GE Healthcare,德国获得)，Poros HQ(Applied Biosystems,德国)，Q HyperCel、Biosepra Q Ceramic HyperD(可从Pall,New York,USA获得)，Macro Prep High Q(Bio-Rad,California,USA)，ToyopearlSuper Q(可从Tosoh Bioscience,德国获得)，UNOsphere Q(可从Bio-Rad,California,USA获得)；三甲铵乙基(TMAE)包括例如Fractogel EMD TMAE(Merck KgaA,德国)；三甲铵树脂包括例如Nuvia Q(可从Bio-Rad,California,USA获得)。
具体而言，已发现强阴离子交换层析介质在截留否则将在酸性pH下引起沉淀的杂质和结合宿主核酸分子(如DNA和RNA)上有效。
优选地，使用强阴离子交换层析介质，该强阴离子交换层析介质包含选自季氨乙基(QAE)部分、季铵部分及除结合甲基丙烯酸聚合基质的三甲铵乙基外的三甲铵部分的配基。
更优选地，阴离子交换层析可以是强阴离子交换层析，其用具有N(CH3)3 +(三甲铵；可从Bio-Rad,California,USA获得的Nuvia Q)官能团(配基)的强阴离子交换层析树脂或具有相似特征的介质进行。
因此，本发明的优选实施方案提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于强阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合强阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；或使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
化学稳定性
1.0M NaOH(20℃)： 至多1周
1.0M HCl(20℃)： 至多5周
凝胶床压缩比： 1.10-1.15(沉降床体积/填充床体积)
pH稳定性
在优选实施方案中，预清洗阴离子交换柱的直径大于捕获柱的直径。在另一优选实施方案中，预清洗阴离子交换柱的床高短于捕获柱的床高。在最优选的实施方案中，预清洗柱的直径大于捕获柱的直径，且预清洗阴离子交换柱的床高短于捕获柱的床高。对于杂质的最佳捕获，需要最小约10cm的预清洗阴离子交换柱床高。
一些类型的杂质可以不仅通过离子相互作用还通过疏水相互作用结合介质。也可以发生复合物形成。由于预清洗层析步骤作为不希望得到的污染物的滤器发挥作用，该污染物紧密吸附至介质，有必要开发有效的再生和清洗方法。为了从强阴离子交换层析树脂(例如，具有–N(CH3)3+配基，如Nuvia Q)去除大多数杂质，可在其使用后按以下顺序使用以下再生方法(在位清洗)：(a)溶液A：40mM磷酸钠、2M尿素、1.5M NaCl、10mM EDTA、pH 7-8；(b)溶液B：2M NaCl、100mM柠檬酸；(c)溶液C：水；和(d)溶液D：1M NaOH；(e)溶液E：10mMNaOH。溶液A-E连续通过柱。溶液E可用于保存。推荐以逆流进行再生。
优选地，预清洗柱和捕获步骤柱可以串联。这是指，预清洗步骤的流穿物不在收集容器中暂存，而是立即转到捕获层析柱。在优选方法中，两个柱在运行后断开，并分别再生(在位清洗)。最优选的再生步骤以逆流进行。
捕获步骤
术语“捕获步骤”理解为以结合模式进行的第一层析步骤。用于从培养液纯化出免疫球蛋白的捕获步骤通常作为亲和层析步骤进行。A蛋白或其衍生物主要用作亲和捕获。但是，其他层析原理也可以用作捕获步骤。根据本发明，混合模式层析可以成功用于捕获免疫球蛋白。
在优选实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在优选实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换介质的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析，其中免疫球蛋白结合免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂，通过从免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂洗脱蛋白质，来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一优选实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换介质的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一优选实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换介质的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析，其中免疫球蛋白结合免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂，通过从免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂洗脱蛋白质，来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一优选实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于强阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合强阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)暴露步骤(b)中获得的洗脱物或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一优选实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于强阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合强阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白，其中强阴离子交换层析树脂的配基是–N(CH3)3 +；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
A蛋白亲和层析
通过在阴离子交换预清洗层析步骤后用A蛋白亲和层析步骤作为捕获步骤，本发明的方法提供了节约成本的免疫球蛋白纯化方法，同时利用了A蛋白亲和层析在免疫球蛋白纯化中的显著结合特异性。
本文所用的术语“免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析”指利用微生物来源(例如金黄色葡萄球菌、链球菌属(Streptococcus)、大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus))的重组蛋白或衍生自其的变体或可具有微生物来源的具有结合免疫球蛋白的能力的合成肽作为配基的亲和层析。示例性免疫球蛋白结合蛋白可以是A蛋白、G蛋白、L蛋白或A/G蛋白。优选地，免疫球蛋白结合蛋白或肽是A蛋白。配基可以包含A蛋白的E、D、A、B和C结构域中的一个或多个。更优选地，配基包含A蛋白的结构域B或改造的Z蛋白。利用用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)重组产生的14kD肽作为配基的示例性树脂是IgSelect(GEHealthcare)。没有其他信息可获得的此配基专门针对对所有类型人Fc的高亲和力而设计。
为了制备对苛刻清洗条件具有更高抗性的A蛋白亲和层析材料并针对运行间交叉污染效应提供保护，现在常使用改进型A蛋白亲和树脂，其具有经特殊改造以确保碱耐受性、高结合载量和低配基渗漏的配基。但是，这些改进型树脂的一个主要缺点是它们显著比常规A蛋白树脂更贵。本发明的方法的重要优势是可以使用常规A蛋白树脂以及更近的新一代A蛋白树脂产品二者。由于A蛋白树脂暴露于较低杂质负荷，常规和更便宜的A蛋白树脂变得可接受，尽管它们受限于较温和的再生条件。但是，由于本发明的预清洗步骤，且独立于所选择的A蛋白树脂，常规和新一代树脂二者都可以在更长寿命内使用。此外，由于A蛋白柱的清洗变得更容易的事实，工艺也变得更经济。
可用于本发明目的的常见A蛋白树脂的实例可以包括但不限于Unosphere SUPrA(Bio-Rad)，Protein A Ceramic HyperD F(Pall Corporation)，Poros MabCapture A(Applied Biosystems)，ProSep HC、ProSep Ultra和ProSep Ultra Plus(EMDMillipore)，Protein A Sepharose FF、rProtein A Sepharose FF、rmp Protein ASepharose FF、MAbSelect、MAbSelect SuRe、MAbSelect SuRe LX和MabSelect Xtra(GEHealthcare)，及Toyopearl rProtein A(Tosoh Bioscience)。
在本文中使用时，术语“A蛋白”涵盖从其天然来源回收的A蛋白、合成或生物合成(例如，通过肽合成或通过重组技术)产生的A蛋白、及其保留结合具有CH2/CH3区的蛋白质的能力的变体。优选地，可以使用具有高结合载量和/或碱稳定性的树脂。例如，可以使用A蛋白、A蛋白衍生物、碱稳定A蛋白衍生亲和介质(大肠杆菌(E.coli))。优选地，使用碱稳定A蛋白衍生(大肠杆菌)配基。碱稳定A蛋白衍生配基可以与高度交联的琼脂糖基质偶联，优选用化学稳定的硫醚键固定。一个实例是来自GE Healthcare Life Sciences的MabSelectSuRe，其可以在运行后用至多0.5M NaOH快速和有效地清洗。MabSelect SuRe的碱稳定配基源自A蛋白的B结构域，基本缺乏提供更高洗脱pH的VH3结合结构域。优选的产品是MabSelect SuRe LX，其具有比MabSelect SuRe更高的结合载量。
A蛋白树脂MabSelect SuRe LX的特征如下：
在A蛋白亲和层析和从A蛋白柱洗脱免疫球蛋白之间可以包括一个或几个利用一种或多种特殊洗涤缓冲液的洗涤步骤。洗涤缓冲液是用来从A蛋白树脂去除杂质而不去除显著量的结合A蛋白的目的免疫球蛋白的缓冲液。洗涤缓冲液可以包含盐和去垢剂(例如聚山梨酸酯)；盐和溶剂(例如己二醇)；高浓度盐(例如高体积摩尔浓度Tris缓冲液)；或盐和聚合物(例如聚乙二醇)。此外，洗涤缓冲液可以包含离液剂(例如尿素或精氨酸)和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA)。
对于从A蛋白柱洗脱目的免疫球蛋白，应用洗脱缓冲液。优选地，洗脱缓冲液具有低pH，从而通过改变蛋白质构象来破坏A蛋白和目的免疫球蛋白之间的相互作用。优选地，低pH洗脱缓冲液具有从约2至约5范围内、最优选从约3至约4范围内的pH。将pH控制在此范围内的缓冲液的实例包括磷酸、乙酸、柠檬酸、甘氨酸和铵缓冲液，以及这些的组合。这类优选的缓冲液是柠檬酸和乙酸缓冲液，最优选柠檬酸钠或乙酸钠缓冲液。考虑其他洗脱缓冲液用于洗脱目的免疫球蛋白，包括高pH缓冲液(例如，具有9或更高pH的那些)或包含诸如MgCI2(2mM)的化合物或组合物的缓冲液。
A蛋白亲和层析树脂可以优选在柱内(在位清洗)用0.1至0.5NaOH再生。
在具体实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中A蛋白亲和层析树脂的配基是碱稳定A蛋白衍生物(例如MabSelect SuRe)；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于强阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合强阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白，其中强阴离子交换树脂的配基是–N(CH3)3 +；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中A蛋白亲和层析树脂的配基是碱稳定A蛋白衍生物(例如MabSelect SuRe)；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
混合模式层析作为捕获步骤
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于强阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合强阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
混合模式层析(MMC)利用配基和样品分子之间的一种以上相互作用形式。称为混合模式树脂的树脂是具有包括带电荷的疏水离子交换配基或结晶矿物(如羟基磷灰石)的官能团的层析材料。有时用术语“多模式层析”或“疏水电荷诱导层析”代替“混合模式层析”。混合模式层析通常是至少两种原理的相互作用：疏水相互作用和离子交换或金属亲和相互作用和离子交换。混合模式层析提供了较不可预测的选择性，这种选择性不能分别通过单模式层析方法如离子交换或疏水作用层析重现。带正电荷的疏水配基属于阴离子交换混合模式一组(例如Capto MMC)，而带负电荷的配基属于阳离子交换混合模式(例如CaptoAdhere)。一些混合模式树脂具有两性离子特性(例如Bakerbond ABx)。其他混合模式树脂具有疏水配基，该疏水配基可离子化，并通过降低pH而从不带电荷转变为带正电荷(例如MEP HyperCel)。最后，羟基磷灰石因具有带正电荷的钙离子和带负电荷的磷酸基团而具有更复杂的混合模式功能。
优选地，利用显示离子和疏水功能性的混合模式树脂，例如Bakerbond ABx(J.T.Baker)、Capto MMC、CaptoAdhere(GE Healthcare)、PPA HyperCel或MEP Hypercel(Pall Corporation)。更优选地，利用混合模式层析树脂MEP HyperCel。
混合模式层析树脂MEP HyperCel的特征如下：
包含4-巯基-乙基-吡啶作为配基的混合模式层析树脂(MEP HyperCel)可以用具有约6.5至9.9的pH的缓冲液(例如，PBS、pH 7.4或50mM Tris-HCl、pH 8)平衡。
对于从包含4-巯基-乙基-吡啶作为配基的混合模式层析树脂(MEP HyperCel)洗脱目的免疫球蛋白，应用洗脱缓冲液。优选地，洗脱缓冲液具有破坏目的免疫球蛋白和MEPHyperCel柱之间的相互作用的pH。优选地，洗脱缓冲液具有从约pH 3至约pH 7、优选从约pH3.5至约pH 6、更优选从约pH 4至约pH 5.5范围内的pH。可以向洗脱缓冲液(如MEPHyperCel洗脱缓冲液)中加入精氨酸(0.1至1.0M、0.2至0.8M、0.4至0.6M)，从而减少免疫球蛋白聚集，并防止在酸性pH下丧失溶解性。
混合模式层析的优势是结合树脂的免疫球蛋白无需像例如在使用常规疏水作用层析时那样加入大量盐(如硫酸铵)。
混合模式层析(如利用包含4-巯基-乙基-吡啶作为配基的树脂的混合模式层析)的温和洗脱条件可以减少聚集，并可以保持免疫球蛋白的生物活性。
混合模式层析树脂可以用10至200mM柠檬酸、10mM HCl、0.5至1.0M NaOH、6M盐酸胍、2至8M尿素或40％丙醇再生。优选地，通过应用预清洗步骤，混合模式层析树脂可以简单地用100mM柠檬酸然后用0.5至1.0M NaOH再生。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中配基是4-巯基-乙基-吡啶；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于强阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合强阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中配基是4-巯基-乙基-吡啶；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于强阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合强阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白，其中配基是–N(CH3)3 +；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中配基是4-巯基-乙基-吡啶；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(b2)使步骤(b)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b2)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b2)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
优选地，对于步骤(b)的混合模式层析，可以使用包含带负电荷配基的混合模式层析树脂。更优选地，包含带负电荷配基的树脂是具有以下化学式的多模式弱阳离子交换剂(Capto MMC)：
多模式弱阳离子交换剂Capto MMC的特征如下：
结合载量/ml层析介质>45mg BSA/ml介质，处于30mS/cm2)
对于从多模式弱阳离子交换层析树脂洗脱目的免疫球蛋白，可以提高缓冲液的pH和/或盐浓度。优选地，可以提高pH和盐浓度二者。洗脱缓冲液的盐浓度可以在从0.25M至1.75M、优选从0.5M至1M的范围内。用于洗脱的示例性盐/缓冲液可以是磷酸钠、Tris-HCl、NaCl和/或NH4Cl。离子强度可以在0.02–0.3M范围内。缓冲液的pH可以在pH 6和pH 9之间、优选pH 7和8之间，更优选在洗脱之前应用pH在5.5和7.5之间的附加洗涤步骤。
在备选实施方案中，可以利用另一精制步骤。另一精制步骤可以是适合用于精制步骤的任何层析方法，如阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水作用层析或混合模式层析。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中混合模式层析树脂的配基带负电荷；
(b2)使步骤(b)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b2)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b2)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(b2)使步骤(b)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b2)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b2)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
其中步骤(b)的混合模式层析树脂的配基具有以下化学式：
阳离子交换层析作为精制步骤
阳离子交换层析依赖于样品中的蛋白质和固定在树脂上的电荷之间的电荷-电荷相互作用。在阳离子交换层析中，待结合的分子带正电荷，而固定的官能团(配基)带负电荷。常用的阳离子交换树脂是S树脂(磺酸)、SP树脂(磺丙基)、SE树脂(磺乙基)和CM树脂(羧甲基)。
但是，一般而言，阳离子交换层析步骤可以用所有常见的市售阳离子交换树脂或膜进行。阳离子交换树脂可以以预装柱或在其上固定了官能团(例如磺酸)的膜的形式使用。备选地，树脂可以作为原材料购买，并由用户装柱。关于柱的容量和尺寸，除常规限制外没有特别的限制。本领域技术人员知道要使用的阳离子交换树脂的量和柱的尺寸。这取决于工艺的总体规模。
典型的市售产品包括，例如，Macro-Prep High S、Macro-Prep CM、UnosphereRapid S、Unosphere Rapid S40、Nuvia S和Nuvia HR-S(Bio-Rad,California,USA)，Toyopearl CM、Toyopearl SP和Toyopearl GigaCap S(Tosoh Bioscience,德国)，Millipore ProRes S、Fractogel EMD COO-、Fractogel EMD SO3-(Merck KGaA,德国)，Biosepra CM Ceramic HyperD、Biosepra S Ceramic HyperD、S HyperCel(PallCorperation,New York,USA)，Poros HS、Poros XS(Applied Biosystems,德国)，YMCBioPro30S、YMC BioPro 70S(YMC欧洲)，CM-Sepharose FF、SP-Sepharose FF、S-SepharoseFF、SP-Sepharose HP、SP-Sepharose XL、SP-Sepharose Big Beads、CM-Sephadex、CaptoS、Capto SP ImpRes和Source S(全都来自GE Healthcare,德国)。通常，阳离子交换层析用pH值在4和7之间的缓冲液进行。
本发明优选的阳离子交换树脂是使用磺酸或磺丙基配基的强阳离子交换剂。最优选的是磺酸或磺丙基连接至刚性基质，如高度交联琼脂糖，例如Nuvia HR-S，或聚(苯乙烯二乙烯苯)，例如Poros 50HS。
阳离子交换剂Poros 50HS的特征如下：
Poros 50HS的备选优选材料是Nuvia HR-S，其是基于磺酸基团和高度交联琼脂糖基质的强阳离子交换剂。
阳离子交换层析可以用具有约pH 4至约pH 8的pH的缓冲液平衡。缓冲液浓度可以在10mM至100mM的范围内、优选在20mM至50mM的范围内。
用于阳离子交换层析的缓冲液的实例是柠檬酸、乳酸、甲酸、丁二酸、乙酸、丙二酸、甘氨酸、MES、磷酸、HEPES、或其混合物。
阳离子交换层析步骤可以分开免疫球蛋白的电荷变体，且可以去除残留宿主细胞蛋白质、聚集体和浸出A蛋白。
免疫球蛋白可以在低于免疫球蛋白等电点(pI)的pH值下和在低电导率下结合树脂。
对于洗脱，可以使用通过单级或梯度提供的洗脱缓冲液离子强度的提高。用于阳离子交换层析的洗脱的示例性盐是NaCl、KCl、硫酸盐、磷酸盐、甲酸盐或乙酸盐。优选地，使用NaCl或KCl。离子强度可以提高至至多1M。
备选地，可以使用通过单级或梯度提供的洗脱缓冲液pH的提高。
进行阳离子交换层析的优选实施方案是pH工作范围在4和6之间、更优选pH在4.5和5.5之间。可以用碳酸(最优选柠檬酸)作为缓冲物质。
在另一优选实施方案中，通过改变pH值(即提高pH)来进行结合阳离子交换树脂的免疫球蛋白的洗脱。这可以通过由混合两种不同缓冲溶液提供的从低pH至高pH的梯度来达到。优选柠檬酸缓冲液用于低pH，磷酸缓冲液用于高pH。在最优选的实施方案中，通过将约pH 5至6的柠檬酸缓冲液与约pH 7至9的磷酸缓冲液混合来形成pH梯度。缓冲液可以用酸的钠盐按10至50mM的浓度配制。
备选地，可以用通过单级或梯度提供的洗脱缓冲液pH和离子强度二者的提高来进行洗脱。
阳离子交换层析树脂可以用1M NaCl再生3至5个柱体积。此外，可以应用包括以下步骤的在位清洗方法：(a)用1至5个柱体积的1M NaOH、1M NaCl洗涤；(b)用1至5个柱体积的1M乙酸或TFA洗涤；(c)再平衡。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；或使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中阳离子交换层析树脂的配基是磺丙基。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于强阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合强阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中阳离子交换层析树脂的配基是磺丙基。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于强阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合强阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白，其中强阴离子交换层析树脂的配基是–N(CH3)3 +；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中阳离子交换层析树脂的配基是磺丙基。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于强阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合强阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白，其中强阴离子交换层析树脂的配基是–N(CH3)3 +；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中A蛋白亲和层析树脂的配基是碱稳定A蛋白衍生物(例如MabSelect SuRe)；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中阳离子交换层析树脂的配基是磺丙基。
在另一实施方案中，本发明的预清洗步骤之后是以结合模式进行的混合模式层析，然后是以结合模式进行的蛋白/肽亲和层析。
在另一实施方案中，本发明的预清洗步骤之后是以结合模式进行的混合模式层析，然后是以结合模式进行的A蛋白亲和层析。
关于A蛋白亲和层析的详情在上文中提供，也适用于混合模式层析之后的A蛋白层析。
关于免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析的详情在上文中提供，也适用于混合模式层析之后的A蛋白亲和层析。
混合模式层析作为附加精制步骤
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；或使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析，其中免疫球蛋白结合免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂，通过从免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂洗脱蛋白质，来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换介质的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换介质的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析，其中免疫球蛋白结合免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂，通过从免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂洗脱蛋白质，来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；或使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，在流穿物中获得不结合混合模式层析树脂的免疫球蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中混合模式层析树脂的配基是多模式强阴离子交换剂。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，在流穿物中获得不结合混合模式层析树脂的免疫球蛋白，其中混合模式层析树脂的配基是多模式强阴离子交换剂。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白，其中阴离子交换层析的配基是–N(CH3)3 +；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中A蛋白亲和层析树脂的配基是碱稳定A蛋白衍生物；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中阳离子交换层析的配基是磺丙基；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中混合模式层析树脂的配基是多模式强阴离子交换剂。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白，其中阴离子交换层析的配基是–N(CH3)3 +；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析，其中免疫球蛋白结合免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂，通过从免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中阳离子交换层析的配基是磺丙基；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中混合模式层析树脂的配基是多模式强阴离子交换剂。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换介质的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中A蛋白亲和层析树脂的配基是碱稳定A蛋白衍生物；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中阳离子交换层析的配基是磺丙基；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中混合模式层析树脂的配基是多模式强阴离子交换剂。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换介质的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析，其中免疫球蛋白结合免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂，通过从免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂洗脱蛋白质，来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中阳离子交换层析的配基是磺丙基；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中混合模式层析树脂的配基是多模式强阴离子交换剂。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白，其中阴离子交换层析的配基是–N(CH3)3 +；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中A蛋白亲和层析树脂的配基是碱稳定A蛋白衍生物；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中阳离子交换层析的配基是磺丙基；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，在流穿物中获得不结合混合模式层析树脂的免疫球蛋白，其中混合模式层析树脂的配基是多模式强阴离子交换剂。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白，其中阴离子交换层析的配基是–N(CH3)3 +；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析，其中免疫球蛋白结合免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂，通过从免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂洗脱蛋白质，来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中阳离子交换层析的配基是磺丙基；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，在流穿物中获得不结合混合模式层析树脂的免疫球蛋白，其中混合模式层析树脂的配基是多模式强阴离子交换剂。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换介质的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中A蛋白亲和层析树脂的配基是碱稳定A蛋白衍生物；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中阳离子交换层析的配基是磺丙基；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，在流穿物中获得不结合混合模式层析介质的免疫球蛋白，其中混合模式层析树脂的配基是多模式强阴离子交换剂。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换介质的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析，其中免疫球蛋白结合免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂，通过从免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂洗脱蛋白质，来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中阳离子交换层析的配基是磺丙基；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，在流穿物中获得不结合混合模式层析介质的免疫球蛋白，其中混合模式层析树脂的配基是多模式强阴离子交换剂。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(b2)使步骤(b)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b2)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b2)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(b2)使步骤(b)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b2)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b2)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，在流穿物中获得不结合混合模式层析树脂的免疫球蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中配基是4-巯基-乙基-吡啶；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中配基是4-巯基-乙基-吡啶；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，在流穿物中获得不结合混合模式层析树脂的免疫球蛋白。
称为混合模式介质或树脂的介质是具有包括带电荷的疏水离子交换配基或结晶矿物(如羟基磷灰石)的官能团的层析介质。有时用术语“多模式层析”或“疏水电荷诱导层析”代替“混合模式层析”。混合模式层析通常是至少两种原理的相互作用：疏水相互作用和离子交换或金属亲和相互作用和离子交换。混合模式层析提供了较不可预测的选择性，这种选择性不能分别通过单模式层析方法如离子交换或疏水作用层析重现。带正电荷的疏水配基属于阴离子交换混合模式一组(例如Capto MMC)，而带负电荷的配基属于阳离子交换混合模式(例如CaptoAdhere)。一些混合模式树脂具有两性离子特性(例如BakerbondABx)。其他混合模式介质具有疏水配基，该疏水配基可离子化，并通过降低pH而从不带电荷转变为带正电荷(例如MEP HyperCel)。最后，羟基磷灰石因具有带正电荷的钙离子和带负电荷的磷酸基团而具有更复杂的混合模式功能。
优选地，阳离子交换层析之后的混合模式层析步骤用包含带正电荷配基的介质进行。更优选地，带正电荷配基是具有以下化学式的N-苄基-N-甲基乙醇胺：
(例如，来自GE Healthcare,德国的CaptoAdhere)。
混合模式层析树脂CaptoAdhere的特征如下：
pH稳定性
在以结合和洗脱模式(bind end elute mode)上样混合模式层析树脂时可以应用以下条件：pH 6至pH 9，优选pH 7.0至8.5；电导率0.5至10mS/cm，优选1至4mS/cm。可以使用一个或多个洗涤步骤。条件取决于免疫球蛋白的pI。
用于CaptoAdhere层析的优选上样条件可以如下：用0.5M磷酸钠pH 8.2然后用20mM磷酸钠pH 8.2平衡树脂。将样品(阳离子交换库)调节至pH 8.0-8.5和电导率1-4mS/cm，并上样在柱上。用平衡缓冲液20mM磷酸钠pH 8.2洗涤后，可用例如20mM磷酸钠pH 5至7、优选pH 5.5至6.5从CaptoAdhere树脂洗脱目的免疫球蛋白。
在流穿模式中，必须以这样的方式调节pH和离子强度，使得免疫球蛋白不结合混合模式配基，而待清除的残留污染物(DNA、聚集体、浸出A蛋白、宿主细胞蛋白质)保持结合。条件取决于免疫球蛋白的pI。优选地，在6.5至8.5的pH范围内、更优选在pH 7和8之间使用磷酸或Tris缓冲液。用盐(如NaCl)或通过缓冲液浓度调节电导率。最优选的是补充50至200mM浓度范围内的NaCl的10至50mM浓度范围内的磷酸钠缓冲液。必须考虑，虽然解吸离子相互作用，但高盐浓度促进疏水相互作用。在优选方法中，将来自阳离子交换层析的洗脱物调节至pH 7.5至8，并用NaCl提高电导率至10-12mS/cm。
混合模式树脂的再生(在位清洗)可以用低pH、高盐和高pH，例如用10至200mM柠檬酸、0.5-2M NaCl和10mM至1M NaOH进行。
优选的再生方法通过用溶液A-D连续洗涤来进行：溶液A：100mM柠檬酸、2M NaCl；溶液B：2M NaCl；溶液C：1M NaOH；溶液D：10mM NaOH。树脂的保存可以在溶液D中进行。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白，其中阴离子交换层析的配基是–N(CH3)3 +；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中A蛋白亲和层析树脂的配基是碱稳定A蛋白衍生物；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中阳离子交换层析的配基是磺丙基；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中混合模式层析树脂的配基是N-苄基-N-甲基乙醇胺。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白，其中阴离子交换层析的配基是–N(CH3)3 +；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析，其中免疫球蛋白结合免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂，通过从免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂洗脱蛋白质，来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中阳离子交换层析的配基是磺丙基；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中混合模式层析树脂的配基是N-苄基-N-甲基乙醇胺。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换介质的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中A蛋白亲和层析树脂的配基是碱稳定A蛋白衍生物；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中阳离子交换层析的配基是磺丙基；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中混合模式层析树脂的配基是N-苄基-N-甲基乙醇胺。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换介质的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析，其中免疫球蛋白结合免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂，通过从免疫球蛋白结合蛋白/肽亲和层析树脂洗脱蛋白质，来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中阳离子交换层析的配基是磺丙基；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白，其中混合模式层析树脂的配基是N-苄基-N-甲基乙醇胺。
作为精制步骤，也可以利用其它层析类型。例如，可以利用最优选流穿模式的阴离子交换柱层析和阴离子交换膜层析作为精制步骤。
蛋白质的等电点或pI指蛋白质具有等于零的总净电荷的pH，即蛋白质具有相等数目的正电荷和负电荷的pH。pI的测定可以按照现有技术中已建立的技术实现，如等电聚焦。
在另一实施方案中，纯化可以在第一层析步骤之前包括一个或多个离心步骤。
在另一实施方案中，纯化可以在第一层析步骤之前包括一个或多个过滤步骤。在另一优选实施方案中，纯化可以包括一个离心步骤和一个或多个过滤步骤。在优选实施方案中，第一层析步骤之前是深层过滤和微滤步骤。在更优选的实施方案中，第一层析步骤之前是细胞分离步骤、深层过滤步骤和微滤步骤。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(i)离心样品，其中在上清中获得免疫球蛋白；
(ii)深层过滤步骤(i)中获得的上清，其中在滤液中获得免疫球蛋白；
(iii)微滤步骤(ii)中获得的免疫球蛋白，其中在滤液中获得免疫球蛋白；
(a)使步骤(iii)的滤液暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；或使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(i)离心样品，其中在上清中获得免疫球蛋白；
(ii)深层过滤步骤(i)中获得的上清，其中在滤液中获得免疫球蛋白；
(iii)微滤步骤(ii)中获得的免疫球蛋白，其中在滤液中获得免疫球蛋白；
(a)使步骤(iii)的滤液暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(b2)使步骤(b)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b2)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b2)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(i)离心样品，其中在上清中获得免疫球蛋白；
(ii)深层过滤步骤(i)中获得的上清，其中在滤液中获得免疫球蛋白；
(iii)微滤步骤(ii)中获得的免疫球蛋白，其中在滤液中获得免疫球蛋白；
(a)使步骤(iii)的滤液暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(b2)使步骤(b)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b2)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b2)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，在流穿物中获得不结合混合模式层析树脂的免疫球蛋白。
深层过滤
此外，本发明的方法可以包括一个或多个深层过滤步骤。与通过将颗粒截留在膜表面来分离的膜过滤不同，深层滤器包括纤维或小球的基质，其中通过基质而不是在其表面上发生分离。
深层滤器的实例包括但不限于SXLP700416和SXLPDE2408SP囊式滤器(PallCorporation)，Millistak+XOHC、FOHC、DOHC、AlHC和BlHC Pod滤器(EMD Millipore)，或Zeta 20Plus 30ZA/60ZA、60ZN90ZA、delipid、VR07和VR05滤器(3M)。
优选地，深层滤器包括赋予滤器基质强正电荷的预提取无机助滤剂、纤维素和树脂系统，例如来自英国3M的Zeta Plus。
用于本发明的最优选的深层滤器是来自Pall Corporation的PDE2和P700系列囊式滤器。
超滤、病毒过滤、微滤
此外，本发明的方法可以包括一个或多个微滤、超滤和/或纳滤步骤。超滤是流体静力压迫使流体通过半透膜的膜过滤形式。高分子量的悬浮固体和溶质被截留，而水和低分子量溶质通过膜。超滤是常用于分离、纯化和浓缩大分子溶液尤其是蛋白质溶液的方法。超滤可以与渗滤组合。此模式适合用于缓冲液更换，通过反复和连续的稀释和再浓缩来从溶液去除盐和其他微观种类。超滤可以用膜堆在切向流或横流过滤系统(TFF或TF-UF)中进行，尤其是用于处理大体积样品。备选地，常用中空纤维系统进行超滤。膜截留大小在从约1至300kD范围内。对于免疫球蛋白，超滤膜的典型截留为10-100kD。在本发明的框架内，优选30或50kD的UF膜分子量截留。
微滤是使用具有从约0.1至10μm孔径的膜的颗粒过滤方法。对于对环境提出特殊要求的除菌过滤，使用孔径约0.2μm的无菌微滤器。具有更大孔径(0.45μm、3μm)的附加预过滤器的使用是常见的。这防止因小孔径滤器的快速堵塞而使流速降低。
最后，在生物药物生产中，纳滤主要用于病毒过滤，是哺乳动物细胞培养物中生产的治疗性蛋白质的安全性所需的。纳滤步骤通常在接近灌装纯化的免疫球蛋白原液的下游工艺结束时进行。常用纳滤器的孔径在15至35nm范围内(Planova,Asahi Kasei,日本；或Viresolve,EMD-Millipore,德国)。
在本发明的优选实施方案中，纯化工艺包括一个或多个超滤/渗滤和/或纳滤步骤。这些过滤步骤可以用例如可从Pall Corporation、GE Healthcare、EMD-Millipore或Sartorius获得的市售过滤装置进行。
在另一实施方案中，该方法包括在2.5至4.5、优选pH 3至4的低pH下孵育A蛋白亲和层析的洗脱物确定的时间(优选30至90分钟)的另一步骤。
在另一实施方案中，该方法包括在2.5至4.5、优选pH 3至4的低pH下孵育混合模式层析的洗脱物确定的时间(优选30至90分钟)的另一步骤。
在另一实施方案中，该方法包括使从阳离子交换层析步骤获得的洗脱物或从其衍生并在阳离子交换层析步骤后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于纳滤。优选地，可以用孔径15至35nm、最优选20nm的滤器进行纳滤。
对于病毒，流穿模式阴离子交换层析步骤可以导致至少5、至少5.5、至少6、至少6.5的log10降低因子。
对于有包膜病毒，在低pH下孵育洗脱物(从A蛋白亲和层析步骤或混合模式层析步骤获得)的步骤可以导致至少5、优选至少5.5的log10降低因子。
对于有包膜病毒，阳离子交换层析步骤可以导致至少5的log10降低因子。
纳滤步骤可以导致有包膜病毒的至少4的log10降低因子和/或无包膜病毒的至少5的log10降低因子。
对于有包膜病毒，阳离子交换层析步骤和低pH孵育洗脱物(从A蛋白亲和层析步骤或混合模式层析步骤获得)的步骤可以导致至少10的log10降低因子。
对于有包膜病毒，阴离子交换层析步骤和低pH孵育洗脱物(从A蛋白亲和层析步骤或混合模式层析步骤获得)的步骤可以导致至少10、优选至少11、更优选至少12的累积log10降低因子。
对于有包膜病毒，阴离子交换层析步骤、低pH孵育洗脱物(从A蛋白亲和层析步骤或混合模式层析步骤获得)的步骤和纳滤步骤可以导致至少15、优选至少16的累积log10降低因子。
对于有包膜病毒，阴离子交换层析步骤、低pH孵育洗脱物(从A蛋白亲和层析步骤或混合模式层析步骤获得)的步骤和阳离子交换层析步骤可以导致至少15、优选至少16、更优选至少17的累积log10降低因子。
对于有包膜病毒，阴离子交换层析步骤、低pH孵育洗脱物(从A蛋白亲和层析步骤或混合模式层析步骤获得)的步骤、阳离子交换层析步骤和纳滤步骤可以导致至少20、优选至少21的累积log10降低因子。
对于无包膜病毒，阴离子交换层析步骤、阳离子交换层析步骤和纳滤步骤可以导致至少12、优选至少13的累积log10降低因子。
具体实施方案涉及用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)在2.5至4.5的低pH下孵育步骤(b)中获得的洗脱物确定的时间；
其中对于有包膜病毒，该方法导致步骤(a)和(c)的累积log10降低因子为至少10。
另一实施方案涉及用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)在2.5至4.5的低pH下孵育步骤(b)中获得的洗脱物确定的时间；
(d)使步骤(c)孵育后的洗脱物或从其衍生并在步骤(c)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于纳滤；
其中对于无包膜病毒，该方法导致步骤(a)和(d)的累积log10降低因子为至少10，和/或其中对于无包膜病毒和/或有包膜病毒，该方法导致步骤(a)、(c)和(d)的累积log10降低因子为至少15。
另一实施方案涉及用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)在2.5至4.5的低pH下孵育步骤(b)中获得的洗脱物确定的时间；
(c2)使步骤(c)中获得的洗脱物或从其衍生并在步骤(c)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
其中对于有包膜病毒，该方法导致步骤(a)、(c)和(c2)的累积log10降低因子为至少15。
另一实施方案涉及用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)在2.5至4.5的低pH下孵育步骤(b)中获得的洗脱物确定的时间；
(c2)使步骤(c)中获得的洗脱物或从其衍生并在步骤(c)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(d)使步骤(c2)孵育后的洗脱物或从其衍生并在步骤(c2)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于纳滤；
其中该方法导致，对于有包膜病毒，步骤(a)、(c)和(c2)的累积log10降低因子为至少15，和/或对于有包膜病毒，步骤(a)、(c)、(c2)和(d)的累积log10降低因子为至少20，和/或对于无包膜病毒，步骤(a)、(c2)和(d)的累积log10降低因子为至少12。
另一实施方案涉及用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；或使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于纳滤；
其中对于有包膜病毒和/或无包膜病毒，该方法导致步骤a)和b)的累积log10降低因子为至少10。
另一实施方案涉及用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；或使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c2)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
使步骤(c2)中获得的洗脱物或从其衍生并在步骤(c2)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于纳滤；
其中对于有包膜病毒，该方法导致步骤(a)、(c2)和(d)的累积log10降低因子为至少15，和/或其中对于无包膜病毒，该方法导致步骤(a)、(c2)和(d)的累积log10降低因子为至少13。
上述方法也用于在免疫球蛋白制造工艺中提高病毒安全性。
本文提到的术语孵育“确定的时间”指孵育至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟、至少60分钟，优选指孵育30分钟至90分钟、更优选45分钟至75分钟、最优选60分钟。
“在低pH下孵育”步骤的pH不仅指2.5至4.5的pH，还指3至4、优选3.25至3.75的pH，更优选指3.5的pH。
术语“有包膜病毒”指具有围绕病毒核蛋白核心的脂蛋白包膜的任何病毒，例如疱疹病毒、细胞病毒(Cytovirus)、痘病毒、沙粒病毒、动脉炎病毒、嗜肝DNA病毒、黄病毒、披膜病毒、冠状病毒、正黏病毒、副黏病毒、弹状病毒、布尼亚病毒、线状病毒、杆状病毒、虹彩病毒和逆转录病毒，包括用于本实验的人病原体和模式病毒鼠白血病病毒(MuLV)。
术语“无包膜病毒”指缺乏病毒包膜的任何病毒，例如腺病毒、花椰菜花叶病毒、肌病毒、藻DNA病毒、覆盖层病毒、乳多空病毒、圆环病毒、细小病毒、双RNA病毒、呼肠病毒、星状病毒、杯状病毒、小RNA病毒、马铃薯Y病毒组、Tobamavirus、香石竹潜病毒组、Anellovirus和戊型肝炎病毒，包括用于本实验的人病原体和模式病毒小鼠细小病毒(MVM)。
起始材料中和相关产品级分中病毒滴度的计算比定义病毒降低，称为log10降低因子(LRF)、log10降低值(LRV)或有时简称log10清除。LRF计算方式在病毒清除研究的相关指导(例如(EMA指南CPMP/BWP/268/95(1996)附件II“Note for guidance on virusvalidation studies:the design,contribution and interpretation of studiesvalidating the inactivation and removal of viruses”)中列出。
“洗涤步骤”是在样品上样至层析柱上之后但在从柱洗脱蛋白质之前进行的步骤。洗涤步骤额外地去除较弱或非特异性结合基质、免疫球蛋白和/或配基的污染物，而不从树脂显著洗脱目的免疫球蛋白。在洗涤步骤中，用所希望的洗涤缓冲液洗涤树脂(例如，洗涤缓冲液通过层析柱，直至在柱出口测量的UV吸光度回到基线)。
术语“洗脱”理解为通过改变溶液条件使得缓冲液成分与目的分子竞争层析树脂上的配基部位来从层析树脂解吸目的免疫球蛋白的过程。例如使用A蛋白的亲和层析中发生另一种洗脱方式。在这种情况下，洗脱缓冲液可以改变配基或免疫球蛋白的构象，从而松弛结合。可以通过改变围绕离子交换材料的缓冲液的离子强度使得流动相中的缓冲离子与分子竞争离子交换树脂的带电荷离子部位来从离子交换树脂洗脱目的免疫球蛋白。备选地，pH的变化影响两性蛋白质，因此pH提高至蛋白质的pI以上阻止其与阳离子交换树脂结合，使蛋白质洗脱。在pH降低至蛋白质的pI以下时，相同的效应发生在阴离子交换层析树脂上。
如本文中所理解，术语“洗脱”包括有或无前置洗脱步骤的等度洗脱、单步洗脱和梯度洗脱。可以通过提高流动相中的离子强度或电导率来进行目的免疫球蛋白的洗脱，这通过提高缓冲溶液中的盐浓度来实现。备选地，pH值的提高或降低可以是适宜的。可以利用不连续分级梯度、线性梯度、非线性梯度或这类梯度的适宜组合。
适合用于洗涤及用于洗脱的缓冲液可以选自加入盐(如磷酸盐、硫酸盐或氯化物，如NaCl或KCl)的乙酸、柠檬酸、Tris/HCl、Tris/乙酸、磷酸、琥珀酸、丙二酸、MES、HEPES、Bistris、甘氨酸和其他适宜的缓冲液。借助其来达到洗脱的离子强度和盐浓度取决于缓冲溶液的pH值和蛋白质的pI。洗涤缓冲液可以进一步包含去垢剂(例如聚山梨酸酯)、溶剂(例如己二醇、异丙醇或乙醇)或聚合物(例如聚乙二醇)。此外，洗涤缓冲液可以包含离液剂(例如尿素或精氨酸)和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA)。
本文所用的术语“缓冲液”指通过酸碱共轭成分的作用抵抗pH变化的溶液。
术语“免疫球蛋白”和“抗体”在本文中可互换使用。免疫球蛋白可以是单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及其显示希望得到的抗原结合活性的片段。天然存在的抗体是具有不同结构的分子。例如，天然IgG抗体是由通过二硫键连接的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)(也称可变重链结构域或重链可变结构域)，随后是三个或四个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和可选的CH4)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)(也称可变轻链结构域或轻链可变结构域)，随后是恒定轻链(CL)结构域。根据其恒定结构域的氨基酸序列，可将轻链分配至称为κ和λ的两种类型之一。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；单链抗体分子；双抗体；线性抗体；及从抗体片段形成的多特异性抗体。
优选地，免疫球蛋白是单克隆抗体。本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本同质的抗体的群体获得的抗体，即除可以小量存在的可能的天然存在的突变外，包含该群体的单种抗体是相同的。与通常包含抗不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体抗抗原上的单个决定簇。修饰词“单克隆的”表示抗体获自基本同质的抗体群体的特征，不解释为需要通过任何具体方法产生抗体。
免疫球蛋白可以属于鼠种类IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM、IgA、IgD或IgE，人种类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE，或其组合或片段。
免疫球蛋白可以识别包括但不限于以下抗原的蛋白质中的任意一种或组合：CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD40、CD44、CD52、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD147、CD152、IL-la、IL-1β、IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-12、IL-23、IL-2受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-12受体、IL-13受体、IL-18受体亚基、PDGF-β、及其类似物、PLGF、VEGF、TGF、TGF-β2、TGF-p1、EGF受体、PLGF受体、VEGF受体、血小板受体gpIIb/IIIa、血小板生成素受体、凋亡受体PD-1、肝细胞生长因子、护骨蛋白配体、干扰素γ、B淋巴细胞刺激物BLyS、T细胞活化调节物CTLA-4、C5补体、IgE、肿瘤抗原CA125、肿瘤抗原MUC1、PEM抗原、ErbB2/HER-2、以提高的水平存在于患者血清中的肿瘤相关表位、表达在乳腺、结肠、鳞状细胞、前列腺、胰腺、肺和/或肾癌细胞上和/或黑素瘤、神经胶质瘤或成神经细胞瘤细胞、肿瘤坏死核心上的癌症相关表位或蛋白质、整联蛋白α4β7、整联蛋白VLA-4、B2整联蛋白、α4β1和α4β7整联蛋白、TRAIL受体1、2、3和4、RANK、RANK配体(RANKL)、TNF-α、黏附分子VAP-1、表皮细胞黏附分子(EpCAM)、胞间黏附分子-3(ICAM-3)、白细胞整联蛋白(leukointegrin)黏附素、血小板糖蛋白gp IIb/IIIa、心脏肌球蛋白重链、甲状旁腺素、骨硬化蛋白(sclerostin)、MHC I、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、肿瘤坏死因子(TNF)、Fc-y-1受体、HLA-DR 10β、HLA-DR抗原、L-选择蛋白和IFN-γ。
免疫球蛋白可以是例如阿飞莫单抗(afelimomab)、阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿西莫单抗(arcitumomab)、贝利单抗(belimumab)、canakinumab、西妥昔单抗(cetuximab)、地诺单抗(denosumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、英西单抗(imciromab)、卡罗单抗(capromab)、英夫利昔单抗(infliximab)、伊匹单抗(ipilimumab)、阿昔单抗(abciximab)、利妥昔单抗(rituximab)、巴利昔单抗(basiliximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、nivolumab、诺菲单抗(nofetumomab)、奥马珠单抗(omalizumab)、达利珠单抗(daclizumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、muromonab-CD3、依决可单抗(edrecolomab)、吉姆单抗(gemtuzumab)、戈利木单抗(golimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab)、eculizumab、ustekinumab、ocrelizumab、奥法木单抗(ofatumumab)、obinutuzumab、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、romosozumab、托珠单抗(tocilizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、克立昔单抗(clenoliximab)、凯立昔单抗(keliximab)、galiximab、foravirumab、lexatumumab、贝伐单抗(bevacizumab)和vedolizumab。
本发明的免疫球蛋白优选IgG分子，如IgG1,IgG2,IgG3或IgG4分子。更优选地，该免疫球蛋白是IgG1。甚至更优选地，该免疫球蛋白是IgG1，其中至少Fc部分是人的。免疫球蛋白可以是鼠-人嵌合IgG1，其中IgG1的Fc部分是人的。最优选地，该嵌合免疫球蛋白是利妥昔单抗或英夫利昔单抗。
利妥昔单抗是嵌合抗cd20抗体，其详细描述于例如WO9411026中。
英夫利昔单抗是嵌合抗TNFα抗体，其详细描述于例如WO9216553中。
免疫球蛋白可以是鼠祖抗体的人源化IgG1形式。最优选地，该人源化抗体是曲妥珠单抗或贝伐单抗。
曲妥珠单抗是人源化抗HER2抗体，其详细描述于例如WO9222653中。
贝伐单抗是人源化抗VEGF抗体，其详细描述于例如WO9845331中。
免疫球蛋白可以是全人IgG1抗体。最优选地，该人抗体是阿达木单抗或地诺单抗。
阿达木单抗是人抗TNFα抗体，其详细描述于例如WO9729131中。
地诺单抗是人抗RANKL抗体，其详细描述于例如WO03002713中。
在一个实施方案中，该抗体可以是利妥昔单抗或阿达木单抗。
本文的单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中部分重链和/或轻链与源自特定物种或隶属于特定抗体种类或亚类的抗体中相应的序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与源自另一物种或隶属于另一抗体种类或亚类的抗体中相应的序列相同或同源，以及这类抗体的片段，只要它们显示希望得到的生物活性。
此外，本文的单克隆抗体还包括“人源化”抗体。这类抗体通过“人源化”非人(例如鼠)抗体而获得，仅包含源自动物免疫球蛋白的最少序列。分子的大部分是人序列。用来自具有希望得到的结合特性的非人供体抗体的高变区的残基取代来自人受体抗体的高变区的残基。
最后，本文的单克隆抗体还包括全人抗体，其可以通过筛选人抗体文库而获得。
在优选实施方案中，样品源自从重组CHO细胞培养物获得的细胞培养物上清。优选地，从处于生长期的重组细胞培养物获得样品。
层析介质可以是一次性的或可重复使用的。在一个实施方案中，层析介质是可重复使用的。
在具体实施方案中，步骤(a)的阴离子交换层析树脂是可重复使用的。
与配置为一次性介质的层析介质相比，可重复使用的层析介质节约成本。尤其是对于第一预清洗步骤，使用大量层析介质。因此，使用可重复使用的层析介质(例如，可重复使用的阴离子交换层析树脂用于预清洗步骤)尤其有利。
本文所用的术语“可重复使用的”指介质或树脂配置为重复使用一个以上纯化循环，即至少2、5、10、50、100、200、300、400、500或更多个纯化循环。在每个循环之间，可以洗涤和/或再生和/或保存层析介质或树脂。
在另一具体实施方案中，所有层析步骤的层析介质都是可重复使用的。
术语“基质”或“固相”指配基可以黏附的非水性基质。本文的目的基质通常是包含玻璃、陶瓷、二氧化硅、纤维素、琼脂糖、甲基丙烯酸聚合物或聚苯乙烯的基质。
“配基”指与蛋白质或与至少一种污染物相互作用且共价结合“基质”的任何官能团。
“树脂”指小球形式的任何层析材料，其包含具有可与蛋白质或至少一种杂质相互作用的结合官能团(配基)的基质。一个例外是用于大小排阻层析的凝胶层析树脂，其通常不含任何附着配基。树脂可以作为不同大小的小球提供，并填充在柱中。备选地，可以购买预装柱。
本发明的方法可以用于以小规模和大规模进行免疫球蛋白纯化。优选地，该方法以大规模进行。
“小规模”也表示为“实验室规模”，指包含少于50g免疫球蛋白、少于10g免疫球蛋白或少于1g免疫球蛋白的样品的纯化。“小规模”也指其中从捕获步骤的柱洗脱的蛋白质少于50g免疫球蛋白、少于10g免疫球蛋白或少于1g免疫球蛋白的纯化过程。
“大规模”也称为“生产规模”或“制造规模”，指包含超过50g免疫球蛋白、超过100g免疫球蛋白、超过200g免疫球蛋白、或超过300g免疫球蛋白的样品的纯化。“大规模”也指其中从捕获步骤的柱洗脱的蛋白质超过50g免疫球蛋白、超过100g免疫球蛋白、超过200g免疫球蛋白、或超过300g免疫球蛋白的纯化过程。
实施例
通过参考以下实施例来支持和说明本发明的用于纯化免疫球蛋白的方法。必须强调的是，这些实施例决不应解释为限制本发明的范围。
实施例1：免疫球蛋白和细胞培养物
本发明的方法既不依赖于具体抗体也不依赖于用于表达免疫球蛋白的具体宿主细胞。表达方式及为收获液中的最大产率而优化的所选择的培养条件同样如此。在开发本发明的方法期间使用了不同的单克隆抗体。按照本发明的方法以多种规模成功纯化了它们。表格中所呈现的大部分所选择的实验用小鼠-人嵌合抗CD20IgG1抗体利妥昔单抗进行。此外，一些其他实验用全人抗TNFαIgG1抗体阿达木单抗进行。两种抗体都在CHO细胞中重组表达，该CHO细胞在不同规模的补料分批培养中繁殖。开发阶段的实验主要用来自100L实验室规模的收获培养液进行。用于实施例的生产规模和最大培养体积为1000L。除非另有说明，规模总是指培养体积。
实施例2：细胞培养液的收获和预清洗过滤步骤
以下方法针对100L规模描述。通过以100L/小时流速按9600转/分钟用LAPX404分离器(Alfa Laval)分离来去除细胞和细胞碎片。使分离的培养液连续滤过以下滤器(PallCorporation)：(i)囊式滤器SXLP700416SP；(ii)囊式滤器SXLPDE2408SP；和(iii)再次通过囊式滤器SXLPDE2408SP。深层过滤和微滤原理都通过此滤器配置来达到。在第一步层析之前，还用Sartopore 2/0.2μm膜过滤装置(Sartorius)对经过滤的培养液进行微滤。
实施例3：层析树脂的选择(表1和表2)
针对其在广泛的筛选计划中作为预清洗步骤、捕获步骤和精制步骤的有效性测试了来自不同供应商的相对大的一系列常用和可能有用的工艺层析树脂(参见图2A和2C)。这在本发明的早期开发阶段期间进行。树脂填充在小柱(10-20ml)中，从100L实验室规模取得包含利妥昔单抗的样品，分离和过滤后直接取得(预清洗步骤和捕获步骤)或从A蛋白洗脱物取得(结合模式的精制步骤)。将A蛋白和预清洗层析后获得的阳离子交换层析库用于进行流穿模式的精制步骤。层析运行用Purifier System(GE Healthcare)进行。
预清洗树脂：以流穿模式测试和比较了八种不同的阴离子交换层析树脂。这些树脂是Capto Q、Q-Sepharose FF、Unosphere Q、Nuvia Q、Fractogel TMAE、Poros HQ、QHyperCel和Toyopearl Super Q 650。用10mM Tris-HCl、pH 8.0平衡填充柱。测试标准为：(i)根据污染物穿透前通过的样品体积的最大载量；(ii)再生(包括褪色)；和(iii)在低于pH 5.0酸化所收集的流穿物后的沉淀程度。发现四种树脂最适用于预清洗步骤(表1)，除Nuvia Q外，它们产生相似的结果。但是，Nuvia Q清楚地证明更优，是优选的树脂(表2)。
具有A蛋白的亲和捕获层析树脂：以不应用洗涤步骤的结合和洗脱模式测试和比较了总计九种不同的A蛋白树脂。使用关于柱尺寸、流速和保留时间的相同条件。柱平衡缓冲液是40mM磷酸钠、150mM NaCl、pH 7.4。用100mM柠檬酸钠、pH 3.5进行洗脱。所测试的树脂是MabSelect、MabSelect Xtra、MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX、UnosphereSupra、ProSep Ultra Plus、Protein A Ceramic HyperD F、Poros MabCapture A和Toyopearl rProtein A。标准是：(i)动态和特异性结合载量(穿透测定)；(ii)所需再生方法；(iii)对苛刻清洗(NaOH、尿素、Gu-HCl)的敏感性；(iv)洗脱物的纯度(残留HCP、浸出A蛋白)；和(v)成本计算。概括起来，发现三种树脂更优和最有用(表1)。Poros MabCapture A和来自GE Healthcare的两种MabSelect SuRe树脂是最有前景的用于大规模工艺的候选树脂。MabCapture A与MabSelect SuRe相比具有低15％的HCP去除能力，是第二选择。最优选的树脂是MabSelect SuRe LX，其具有略高于MabSelect SuRe的结合载量(表2)。
非亲和捕获层析树脂：在这个类别中测试了总计五种不同的树脂。这些树脂是Capto MMC(混合模式)、Capto S(阳离子交换剂)、MEP HyperCel(混合模式)、PPA HyperCel(混合模式)和Toyopearl AF Red(基于Procion Red HE-3B的染料配基)。标准是：(i)动态和特异性结合载量(穿透测定)；(ii)所需洗脱标准；(iii)再生方法(0.5M NaOH)；和(iv)洗脱物纯度(HCP)。所有这些树脂(表1)都显示有效的捕获能力但不同的纯化力。洗脱物中的HCP在质量和数量上不同。非亲和捕获步骤可以在随后的A蛋白亲和层析之前应用(参见图2B)，然后基本上作为第二预清洗步骤发挥作用，以进一步为贵重的A蛋白柱减负。但是，两种混合模式树脂结果显示更优，也可以在缺乏任何A蛋白亲和步骤的下游顺序内用作捕获步骤(参见图2C)。这些有前景的树脂是Capto MMC和MEP HyperCel(表2)。
用于结合模式精制层析的树脂：除一种混合模式层析树脂外，此类别仅考虑阳离子交换剂。测试了大量(n＝14)常见阳离子交换剂：Poros HS、Poros XS、SP Sepharose HP、Capto SP Impres、YMC BioPro 30S、YMC BioPro 70S、Unosphere Rapid S、UnosphereRapid S40、Nuvia S、Nuvia HR-S、Toyopearl SP 650S、Toyopearl GigaCap S 650S、Millipore ProRes S和Fractogel EMD SO3。用A蛋白(MabSelect SuRe)洗脱物上样柱，该A蛋白洗脱物包含利妥昔单抗和低量污染物，用平衡缓冲液调节至10mg/ml蛋白质浓度。并非所有树脂都在相同程度上测试。除动态和特异性结合载量(穿透测定)外，还考查了分开残留HCP和产品相关杂质(聚集体、不希望得到的电荷变体)的能力。用递增的盐和/或pH梯度进行洗脱。树脂关于酸性(电荷变体)和碱性(聚集体)级分中的杂质的分离显示显著差异。此标准进行加权，因为它是免疫球蛋白精制步骤的预期目的。发现总计六种树脂适合用于精制步骤(表1)。在Poros 50HS、SP Sepharose HP、Capto SP Impres、Nuvia HR-S、Toyopearl SP 650S和Fractogel EMD SO3中，来自Applied Biosystems的阳离子交换剂Poros HS 50和来自Bio-Rad的一种树脂Nuvia HR-S显示对污染物HCP、聚集体、不希望得到的电荷变体和浸出A蛋白的最佳去除潜能。此外，针对其作为结合模式精制步骤的有用性考查了来自GE Healthcare的带正电荷混合模式树脂CaptoAdhere。以与阳离子交换剂相同的方式应用相同的样品、柱尺寸和标准。平衡缓冲液是20mM磷酸钠、pH 8.2，用NaOH调节样品pH至8.2，并用平衡缓冲液进一步稀释。虽然树脂能够结合更高的量，但利妥昔单抗的有效分离需要20-23mg/ml的负荷。用20mM磷酸钠、pH 6.0进行所结合的蛋白质的洗脱。结合模式的CaptoAdhere树脂显示非常有前景的对污染物的去除力，选择其作为精制步骤的优选树脂(表2)。
用于非结合模式精制层析的树脂：在此类别中，仅考虑阴离子交换剂和一种混合模式树脂。测试了总计七种不同的常见阴离子交换剂：Poros HQ、Capto Q、Unosphere Q、Nuvia Q、Toyopearl GigaCap Q 650、Q HyperCel和Fractogel EMD TMAE。标准是：所获得的流穿物中利妥昔单抗的最大纯度，特别关注残留聚集体、HCDNA和HCP。在A蛋白(MabSelect SuRe)步骤后用阳离子交换剂(Poros HS)库上样柱。发现三种阴离子交换层析树脂Poros HQ、Capto Q和Nuvia Q最适合用于流穿模式的精制步骤(表1)。此外，针对其作为流穿模式精制步骤的有用性考查了来自GE Healthcare的带正电荷混合模式树脂CaptoAdhere。以与阴离子交换剂相同的方式应用相同的样品、柱尺寸和标准。平衡缓冲液是20mM磷酸钠、100mM NaCl、pH 7.8。CaptoAdhere树脂还以流穿模式显示对污染物的显著去除力，且略优于阴离子交换层析树脂。这易于通过补充阴离子交换功能的附加疏水相互作用来解释。因此，选择CaptoAdhere作为用于流穿模式精制步骤的优选树脂(表2)。
表1：适合用作预清洗、捕获和精制层析步骤的工艺树脂[AEX＝阴离子交换层析；CEX＝阳离子交换层析；MMC＝混合模式层析]：
+＝适宜的树脂；++＝优选的树脂
表2：优选的层析树脂[AEX＝阴离子交换层析；CEX＝阳离子交换层析；MMC＝混合模式层析]：
工艺步骤 树脂 类型 配基 供应商
预清洗 Nuvia Q AEX 三甲铵 Bio-Rad
捕获 MabSelect SuRe LX Affinity 碱稳定A蛋白衍生物 GE Healthcare
捕获 MEP HyperCel MMC 4-巯基-乙基-吡啶 Pall Corporation
捕获 Capto MMC MMC 多模式弱阳离子交换剂 GE Healthcare
精制 Poros 50HS CEX 磺丙基 Applied Biosystems
精制 Nuvia HR-S CEX 磺酸 Bio-Rad
精制 CaptoAdhere MMC N-苄基-N-甲基乙醇胺 GE Healthcare
实施例4：预清洗阴离子交换层析步骤
按图2A-C中所示的下游顺序纯化了100L规模(利妥昔单抗或阿达木单抗)和1000L规模(利妥昔单抗)。用于预清洗层析步骤的优选树脂是以流穿模式进行的Nuvia Q。用实施例2中所述预清洗过滤流程后获得的培养液进行此工艺步骤。用Nuvia Q阴离子交换层析树脂以流穿模式进行预清洗层析，以降低随后的捕获步骤的杂质负荷(HCP、HCDNA、聚集体、脂质、色素等)。连续用WFI(2CV)、1M Tris-乙酸pH 6.0(3CV)和20mM Tris-乙酸pH 7.2(4CV)平衡填充了树脂的柱(用于1000L规模的尺寸＝60cm直径x16cm床高，填充体积约45L；用于100L规模的尺寸＝14cm直径x27cm床高，填充体积约4.1L)。以约200cm/小时的流速使产品溶液通过柱(17g/L树脂)，然后使WFI(2CV)通过柱。通过连续用(i)40mM NaH2PO4、10mMEDTA、2M尿素、1.5M NaCl、pH 7.2(4CV)，(ii)100mM柠檬酸、2M NaCl(10CV)，(iii)WFI(4CV)，(iv)1M NaOH(4CV)，和(v)10mM NaOH(2CV)反向洗涤来进行Nuvia Q树脂的再生。然后将柱保存在10mM NaOH溶液中。
实施例5：预清洗阴离子交换层析步骤对用作捕获树脂的MEP HyperCel的重复使用的影响(表3)
MEP HyperCel是用于捕获步骤的优选的非亲和树脂，其可以应用于有(图2B)或无(图2C)随后的A蛋白亲和步骤的大规模工艺。发现MEP HyperCel柱的污染(弄脏)是严重不足的。但是，这可以通过应用预清洗阴离子交换柱(此实施例中是Nuvia Q)来防止或强烈减少。在没有Nuvia Q预清洗柱的情况下，MEP HyperCel的重复使用需要剧烈、持久和昂贵的再生流程，即使这样寿命也有限。表2的实验用分别填充Nuvia Q和MEP HyperCel的小模型柱(20ml)进行。Nuvia Q层析的上样和进行如实施例4中所述。流穿物立即上样至MEPHyperCel上而不进行调整。同时，第二捕获柱用实施例2的培养液直接上样，即分流Nuvia Q步骤。捕获柱上样直至达到最大载量，产品出现在流穿物(穿透)中。通过pH降低(pH 4)来从MEP HyperCel柱洗脱结合的IgG。从穿透前的体积计算结合载量。简单再生混合模式树脂，并重新平衡用于下一次运行。通过使100mM柠檬酸溶液、然后使1M NaOH通过来以逆流进行MEP Hypercel的再生。与NaOH的接触时间为60分钟，然后通过再平衡和彻底去除NaOH(pH对照)来为下一次使用准备柱。Nuvia Q柱按实施例4中所述再生。总计进行了八个循环(七次重复使用)。结果总结在表3中，且支持Nuvia Q步骤的优越性。在应用Nuvia Q预清洗时，结合载量无变化。相反，在没有这种步骤的情况下，结合载量从运行至运行减少，在八个循环后下降至64％。
表3：流穿模式阴离子交换层析(AEX)作为预清洗步骤对用作捕获步骤的混合模式树脂MEP HyperCel的重复使用的影响(每毫升树脂的IgG结合载量)
循环数 MEP HyperCel AEX→MEP HyperCel
1 16.5mg/ml 16.1mg/ml
2 13.2mg/ml 16.0mg/ml
3 12.6mg/ml 15.9mg/ml
4 11.9mg/ml 16.2mg/ml
5 11.5mg/ml 16.1mg/ml
6 11.0mg/ml 15.9mg/ml
7 10.7mg/ml 16.0mg/ml
8 10.5mg/ml 15.9mg/ml
实施例6：Capto MMC捕获层析
Capto MMC树脂是带负电荷的混合模式层析介质(参见表2)，应用于图2B(五柱工艺)和图2C(四柱工艺)的工艺流程方案中所示的下游顺序内。在这些顺序中，Capto MMC基本上作为第二预清洗步骤发挥作用来纯化样品，并去除可损害随后的A蛋白亲和层析树脂的关键污染物，如蛋白酶。此外，此步骤允许显著的样品浓缩，因此减少A蛋白层析的处理时间。Capto MMC层析以结合模式进行，用实施例4中所述的Nuvia Q流穿物上样，该流穿物可用乙酸调节至pH 5。100L和1000L规模的利妥昔单抗都按照此方法纯化。用于1000L规模的柱尺寸为60cm直径x15cm床高(填充体积约42L)，用于100L规模的柱尺寸为20x14cm(填充体积约4.4L)。用20mM乙酸钠、pH 5.0平衡柱，用40mM磷酸钠、pH 6.5洗涤具有结合的利妥昔单抗的柱。针对最大回收优化洗脱，并用40mM磷酸钠、250mM NaCl、pH 7.5进行。流速为150-200cm/小时。洗脱物直接上样至A蛋白柱上。
实施例7：A蛋白捕获层析
A蛋白捕获层析用MabSelect SuRe(100L规模)或MabSelect SuRe LX(1000L)进行。除柱的规模外，工艺参数相同。在实施例4中所应用的方法之后(图2A的工艺，Nuvia Q流穿物)或在实施例6中所应用的方法之后(图2B的工艺，Capto MMC洗脱物)取样。用于1000L规模的柱尺寸为40cm直径x30cm床高(填充体积约38L)，用于100L规模的柱尺寸为20x10.4cm(填充体积约3.2L)。用40mM磷酸钠、150mM NaCl、pH 7.4平衡A蛋白柱。除非另有说明，按20g蛋白质/L树脂(100L规模)或35g蛋白质/L树脂(1000L规模)上样产品溶液。用平衡缓冲液(2CV)、然后用40mM磷酸钠、1.5M NaCl、2M尿素、10mM EDTA、pH 7.4洗涤柱。用100mM柠檬酸钠、pH 3.5进行洗脱。流速为140cm/小时。通过连续用(i)0.2M NaOH(2CV)、(ii)WFI(2CV)、3.5％乙酸、100mM硫酸钠(2CV)和(iii)WFI(2CV)反向洗涤来进行MabselectSuRe或MabSelect SuRe LX树脂的再生。再平衡柱用于下一次运行或保存在20％乙醇中。
实施例8：预清洗阴离子交换层析对浸出A蛋白的影响(表4)
为了考察预清洗层析(Nuvia Q)和温度对A蛋白(MabSelect SuRe LX)浸出的影响，在规模缩小的A蛋白亲和层析中进行了一系列实验。所使用的柱具有12ml的体积。用Purifier System(GE Healthcare)进行层析运行。样品是从1000L批次利妥昔单抗取得的小部分样品。样品取自实施例2中所述流程之后(Nuvia Q预清洗步骤之前)或实施例3中所述流程之后(Nuvia Q预清洗步骤之后)获得的工艺步骤。A蛋白亲和层析方法按照实施例7进行。用25-30mg蛋白质/ml树脂上样柱。样品和A蛋白亲和层析保持室温(20-25℃)或放入冷室(2-8℃)。分别从两份不同整分试样取得两份平行样品，平行纯化和测试。结果显示在表4中。无前置Nuvia Q步骤的两次室温下的平行浸出运行的平均值为23.4ng/mg(每毫克IgG的A蛋白当量)。预清洗步骤的作用明显(表4)。在室温下，当样品在A蛋白步骤之前通过Nuvia Q柱时，仅发生9.1ng/mg(＝39％)的浸出。在本身对浸出具有显著影响的低温下，也观察到此作用。无Nuvia Q的平均浸出为5.0ng/mg，有Nuvia Q的平均浸出为3.4ng/mg(68％)(表4)。Nuvia Q步骤显著减少A蛋白浸出，并允许使用对亲和层析步骤更优选的室温。结合Nuvia Q树脂的蛋白水解活性的捕获最好地解释了Nuvia Q对A蛋白浸出的影响。
表4：预清洗阴离子交换(Nuvia Q)层析步骤对在A蛋白洗脱物中测量的浸出A蛋白(来自MabSelect SuRe LX)的影响。在两个不同温度下进行两次平行层析。
实施例9：串联的预清洗和捕获柱
由于Nuvia Q预清洗阴离子交换步骤以流穿模式进行，随后的A蛋白亲和树脂(MabSelect SuRe LX)能够有效地从此流穿物捕获出免疫球蛋白，可能将Nuvia Q柱与MabSelect SuRe LX柱直接串联。图2A和2B中总结的下游工艺用这种串联预清洗和捕获柱从1000L规模(利妥昔单抗)运行。但是，除非另有说明，100L规模工艺也用串联柱进行。两种柱分别平衡，然后通过阀切换连接。产品溶液以约100L/小时(1000L规模)或约10L/小时(100L规模)上样至实施例4中针对Nuvia Q所述的上行方向的串联柱上。用WFI(2CV)洗涤后，Nuvia Q柱通过层析设备上的阀切换来分流，并以实施例4中所述的逆流再生。A蛋白柱的其他处理(即洗涤、洗脱和再生)以实施例7中所述的断开配置进行。
实施例10：病毒灭活
如图1和2中所示，病毒灭活步骤发生在A蛋白亲和层析之后。利用来自亲和基质的低pH洗脱。在这种水性酸性环境中，许多病毒尤其是有包膜类型的病毒不稳定，并解体。针对本发明开发的A蛋白方法产生具有pH3.5的洗脱物(参见实施例7)。类似地，混合模式捕获柱(MEP HyperCel或Capto MMC)的洗脱物具有低pH4(参见实施例5和6)。后文描述MabSelect SuRe LX洗脱物(1000L规模，利妥昔单抗)的灭活。从A蛋白柱洗脱单克隆抗体在100mM柠檬酸钠pH 3.5中，直接进入病毒灭活罐A。洗脱物直接在罐A中用WFI稀释约2倍。控制溶液的pH，根据需要用100mM柠檬酸再次调节至3.5，然后将溶液转移至病毒灭活罐B，其中溶液在20-24℃下65转/分钟搅拌60分钟。然后用50mM NaOH调节溶液pH至pH 4.5，为随后的阳离子交换层析步骤提供起始条件。
实施例11：Poros 50HS阳离子交换层析(精制1)
通过用阳离子交换层析作为第一精制步骤来进行污染物和产品相关物质(如电荷变体)的分离。此步骤包含在所有纯化顺序中(100L利妥昔单抗和阿达木单抗，1000L利妥昔单抗)。连续用(i)WFI(注射用水，2CV)和(ii)20mM柠檬酸钠pH 5.5(4CV)平衡Poros 50HS树脂填充的柱(用于1000L规模的尺寸＝60cm直径x 32cm床高，填充体积约90L；用于100L规模的尺寸＝25cm直径x15cm床高，填充体积约7.3L)。将实施例10中所述的病毒灭活和样品调节(pH 4.5)后获得的产品溶液按约8g蛋白质/L树脂上样至柱上，由此通过0.45μmKleenpak Nova预过滤器(Pall Corporation)。用WFI(1CV)洗涤柱，然后进行梯度洗脱。通过按以下比例和顺序混合20mM柠檬酸钠pH 5.5(缓冲液A)和40mM磷酸钠pH 7.8(缓冲液B)来形成梯度：(i)100％A(0.2CV)、(ii)线性梯度至40％A+60％B(2CV)、(iii)线性梯度至100％B(6CV)、(iv)100％B(2CV)。流速为150cm/小时。洗脱物在级分中分开，以允许特异性混合。通过连续用(i)2M NaCl(1CV)和(ii)1M NaOH(2CV)洗涤来进行Poros 50HS树脂的再生。然后将柱保存在10mM NaOH中。
实施例12：CaptoAdhere混合模式层析(精制2)
第二精制步骤但是可选的，并应用于100L和1000L规模的利妥昔单抗。选择用于具有两个精制步骤的工艺(图2A和2B)中的最终层析的树脂是CaptoAdhere，其利用配基N-苄基-N-甲基乙醇胺。配基具有带正电荷的基团，因此除疏水相互作用外还提供阴离子交换剂功能。层析能够进一步减少残留的痕量污染物，如HCDNA和HCP。残留浸出A蛋白、产品聚集体和产品片段也可以通过此步骤去除。以流穿模式以及以结合模式进行CaptoAdhere精制步骤。
流穿模式的CaptoAdhere层析：用于此最终层析的样品是实施例11中所述流程之后的Poros 50HS库。填充柱的尺寸对于1000L规模为14cm直径x13cm床高(填充体积约2L)，对于100L规模为5x 13cm(填充体积约0.2L)。用20mM磷酸钠、100mM NaCl、pH 7.8平衡柱。用0.2M NaOH调节混合级分的pH至7.8，用1M NaCl提高电导率至10-12mS/cm。经调节的库按250-275g蛋白质/L树脂的负荷通过CaptoAdhere柱，收集全部流穿物。流速为300cm/小时。通过连续用(i)100mM柠檬酸、2M NaCl(2CV)、(ii)2M NaCl(1CV)、(iii)1M NaOH(2CV)和(iv)10mM NaOH(2CV)洗涤来进行CaptoAdhere树脂的再生。然后将柱保存在10mM NaOH中。
结合模式的CaptoAdhere层析：将实施例11中所述流程之后获得的Poros 50HS库的pH和电导率分别调节至pH 8.2和3.2mS/cm。填充柱的尺寸对于1000L规模为40cm直径x28cm床高(填充体积约35L)，对于100L规模为14x 27cm(填充体积约4.1L)。用20mM磷酸钠pH 8.2平衡树脂。将产品溶液按15-20g蛋白质/L树脂上样至柱上。用20mM磷酸钠pH 6.0进行洗脱。流速为300cm/小时。按针对流穿模式的方法所述再生柱。
实施例13：最终过滤步骤
在最终层析和灌装药物物质的最终原液之间，需要几个过滤步骤，以配制为所选择的保存缓冲液、固定希望得到的浓度和去除病毒。本发明的免疫球蛋白纯化方法不依赖于这些过滤方法。因此，此实施例中的方法、设备和所选择的膜必须理解为只是一种选择，可能进行任意变动。下文简述用于具有两个精制步骤的工艺的用于1000L规模的方法。
切向流超滤/渗滤(UF/DF)缓冲液更换：来自CaptoAdhere柱的洗脱物收集在UF/DF设备的罐中，并用Omega Centrasette膜包(Pall Corporation,30kD截留)浓缩至8g/L。用10体积制剂缓冲液(25mM柠檬酸钠、154mM NaCl、pH 6.5)渗滤截留液。
纳滤病毒去除：纳滤是要求最高和最可靠的病毒去除步骤，在纳米范围内的大小排阻基础上运行。将渗滤的产品溶液转移入可移动罐，然后用Viresolve Pro Modus 1.3滤器(Millipore,20nm孔径)进行纳滤。在过滤产品溶液之前，用25mM柠檬酸钠、154mM NaCl、pH 6.5调节滤器。为了保护纳米过滤器，应用了Sartopore 2MidiCaps预过滤器(Sartorius,0.2μm孔径)。通过最大2bar的超压来进行过滤。
通过切向流超滤/渗滤(UF/DF)进行浓缩和最终配制：经纳滤的产品溶液收集在UF/DF设备的罐中，并用Omega Centrasette膜包(Pall Corporation,30kD截留)浓缩至约10.2g/L。将浓缩的产品溶液转移至可移动罐。将罐放置在层状气流下，加入吐温80至终浓度为0.09％(w/w)。
最终微滤(除菌过滤)：用0.2μm Mini Kleenpak囊式滤器(Pall Corporation)进行最终的微滤。
实施例14：通过不同工艺获得的批次的最终纯度(表5)
关于通过图2A的常规工艺(按照例如Fahrner RL 2001)和图2B的新工艺产生的两个代表性批次的最终纯度的结果总结在表5中。免疫球蛋白为利妥昔单抗，从100L规模纯化。常规纯化方法(工艺1B)的工艺步骤包括三步层析：(i)MabSelect SuRe(捕获)；(ii)Poros 50HS(结合模式)；和(iii)Poros 50HQ(流穿模式)。新工艺(工艺2B)的层析顺序包括：(i)Nuvia Q(预清洗)；(ii)Capto MMC(捕获)；(iii)MabSelect SuRe(中间)；(iv)Poros50HS(结合模式，精制1)；和(v)CaptoAdhere(流穿模式，精制2)。单个步骤按实施例1、2、4、6、7和10-13中所述进行。表5中所选择的纯度参数是：(i)IgG单体的相对量(％)；(ii)残留宿主细胞蛋白质(HCP，ng/mg IgG)；和(iii)残留宿主细胞DNA(HCDNA，pg/g IgG)。分析方法在下文实施例15中描述。如从全部三个参数可见，与按照经典工艺1B纯化的批次相比，按照新工艺2B纯化的批次具有更高的纯度(表5)。
表5：通过两种不同工艺(常规工艺(1B)和本发明的工艺之一(2B))获得的两个纯化批次的质量比较。“工艺1B”指图1B中所示的无预清洗层析步骤的标准工艺。“工艺2B”指图2B中所示的本发明的工艺，其包括预清洗层析步骤(Nuvia Q流穿)和混合模式层析捕获步骤(Capto MMC)及随后的A蛋白(MabSelect SuRe)。测试方法是：大小排阻高效液相层析(SEC-HPLC)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和定量聚合酶链反应(qPCR)。测试参数是单体IgG百分比、每毫克IgG的宿主细胞蛋白质(HCP)和每克IgG的宿主细胞DNA(HCDNA)。
测试方法 参数 工艺1B 工艺2B
SEC-HPLC 单体(％) 99.6 99.7
ELISA HCP(ng/mg) 4.3 1.1
qPCR HCDNA(pg/g) 289 142
实施例15：分析方法
在工艺过程中及在工艺结束时应用几种分析方法来表征纯化免疫球蛋白的质量。这些方法是标准方法，并描述于文献(例如欧洲药典)中。下文简述产生表格中结果的那些方法的原理：
高效大小排阻层析(SEC-HPLC)：SEC-HPLC方法用于测定具有不同于免疫球蛋白分子量的分子量的杂质。大小排阻层析(SEC)是基于以与其大小成比例的流体动力直径为基础分离分子的技术。使用用于SEC的高效液相层析系统(SE-HPLC)，其具有比常规SEC好得多的分辨率。按文献(例如WO2013067301)中所述进行层析来定量免疫球蛋白的单体、二聚体、聚集体和片段。蛋白质的检测基于UV吸光度。相对纯度指积分的单体峰面积占所有峰的总面积的％。从重复测量的平均值计算测试结果。
用于定量宿主细胞蛋白质(HCP)的酶联免疫吸附测定：通过夹心ELISA法进行测量。CHO宿主细胞蛋白质结合固定至标准96孔微量测试板的聚苯乙烯表面上的特异性抗CHO抗体，然后结合辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。然后通过向孔中加入3,3’,5,5’四甲基联苯胺(TMB)底物来进行酶促反应，取决于抗体-过氧化物酶缀合物的存在，其产生可通过可见光吸光度检测的有色产物。微量测试板在450nm(参考波长620nm)读板。
用于定量浸出A蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)：用来自Repligen的市售MabSelect Sure Ligand ELISA试剂盒进行测量。浸出的MabSelect Sure配基结合固定至标准96孔微量测试板的聚苯乙烯表面上的特异性抗A蛋白兔抗体，然后结合生物素标记的二抗。通过用链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶缀合物孵育孔来检测结合生物素的存在。然后通过向孔中加入3,3’,5,5’四甲基联苯胺(TMB)底物来进行酶促反应，取决于抗体-过氧化物酶缀合物的存在，其产生可通过可见光吸光度检测的有色产物。微量测试板在450nm(参考波长620nm)读板。测定灵敏度为0.1ng/ml样品。
用于定量宿主细胞DNA(HCDNA)的定量聚合酶链反应(qPCR)：通过基于TaqMan化学(Applied Biosystems)的实时定量PCR法来进行测量。该方法在检测DNA污染中非常灵敏和特异。该测定基于通过使用序列特异性引物(SSP)和荧光标记杂交探针的聚合酶链反应(PCR)进行的良好确定的DNA片段的序列特异性扩增和实时荧光检测。整个方法(包括仪器、试剂、取样和基于软件的计算)按照供应商的说明书进行。在PCR反应中，从由特异性引物决定的起始DNA区合成大量双链DNA。报道染料和猝灭染料标记的寡核苷酸探针结合待倍增的模板DNA的区域。PCR反应期间，DNA聚合酶分解探针，使得两种染料的物理接近结束，报道染料发射与PCR反应的合成产物成比例的荧光。将CHO特异性探针和引物用于测量，其倍增CHO宿主细胞DNA的适当区域的量。在此步骤期间，荧光信号增加，在某个循环数之后，荧光超过阈值。此循环数与DNA的起始量成比例。可能通过将用样品获得的循环数与校准曲线比较来确定宿主细胞DNA的绝对量。
实施例16：病毒去除和灭活的验证
由于关于来自原料或生产步骤的病毒污染的顾虑，通过细胞培养物生产的重组蛋白质药物(如单克隆抗体)的生产工艺需要病毒去除和/或灭活。因此，对产生源自细胞培养物的生物治疗性蛋白质的每个制造工艺的病毒安全性存在相当的法规要求。下游工艺必须按照来自各监管当局(例如欧洲医药管理局(EMA)和美国食品和药品管理局(FDA))的已有指南验证其去除和/或灭活潜在病毒污染的能力。进行病毒清除研究的目的是证明制造过程中有效地去除和灭活病毒，作为来自细胞培养物来源的重组蛋白质药物的总体安全性的部分证明。
工艺步骤的选择：针对所选择的步骤验证了IgG1抗体利妥昔单抗的下游工艺。所分析的工艺步骤是前一实施例中所述的相应大规模步骤的代表性规模缩小形式。选择了四个工艺步骤：
a)Nuvia Q预清洗阴离子交换层析(参见实施例4)；
b)A蛋白洗脱物的低pH病毒灭活(参见实施例10)；
c)Poros HS阳离子交换层析(参见实施例11)；
d)Viresolve Pro纳滤(参见实施例13)。
病毒的选择：选择了两种常用的模式病毒：
a)小鼠白血病病毒(MuLV)；
b)小鼠细小病毒(MVM)。
MuLV是逆转录病毒科(Retroviridae)的成员，其是具有包膜的单链RNA病毒，大小约80-100nm。MVM是细小病毒科(Parvoviridae)的成员，其是无包膜单链DNA病毒。细小病毒属于已知的最小病毒，大小为20-24nm。两种病毒都获自美国模式培养物保藏所(ATCC)。
实验的表现：将来自一个大规模批次的真实中间工艺样品冷冻保存(≤-15℃)。实验前融化20ml的整分试样，并分别掺入高病毒滴度的MuLV或MVM。工艺步骤b)“A蛋白洗脱物的低pH病毒灭活”(参见实施例10)仅测试MuLV。由于裸病毒壳体的形态学，细小病毒以其对低pH处理的抗性而闻名。因此，未针对低pH孵育测试MVM。用基于病毒特异性细胞的感染性测定和qPCR定量分析掺标的起始材料和经处理的样品，降低因子计算为log10值。所有测试材料都预先针对对测定的干扰进行了考察，平行对照孵育证明病毒在实验期间的稳定性。感染性测定仅检测感染性病毒，而qPCR包含感染性病毒和灭活病毒二者。对于每个工艺步骤和病毒类型，进行一式两份的运行。在经处理的样品不包含可检测到的病毒滴度的情况下，用测定的计算检测限作为最大滴度。降低因子则表示为至少log10“≥”。
病毒清除研究的结果：表6中针对每个运行、步骤和病毒显示单个实验的结果。基于简单的流穿模式阴离子交换层析(树脂Nuvia Q)的预清洗步骤的高降低因子令人惊奇。发现Log10降低因子对于MuLV为至少6.5至6.7，对于MVM为6.6。这个步骤是所测试的四个步骤中最优的一个。尤其是在困难的细小病毒MVM的情况下，这是意料之外的。此外，通过使用预清洗阴离子交换层析和A蛋白洗脱物(pH 3.5)的简单的60分钟保持步骤的组合，对于诸如MuLV的有包膜病毒，可获得至少12.3的累积降低因子。总的累积log10降低因子对于MuLV和四个步骤为21.7，对于MVM和三个步骤为至少13.3。
表6：用于降低两种模式病毒鼠白血病病毒(MuLV)和小鼠细小病毒(MVM)的不同工艺步骤的log10降低因子。每个步骤和病毒进行两次运行。
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Claims (42)

1.用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，所述方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；或使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)的阴离子交换层析是强阴离子交换层析。
3.权利要求2的方法，其中强阴离子交换层析包含配基，所述配基是除结合甲基丙烯酸聚合基质的三甲铵乙基之外的强阴离子交换层析配基。
4.权利要求3的方法，其中强阴离子交换层析树脂的配基选自季氨乙基(QAE)部分、季铵部分和三甲铵部分。
5.权利要求4的方法，其中强阴离子交换层析树脂的配基是三甲铵(-N(CH3)3 +)。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中阳离子交换层析树脂包含磺丙基(-CH2CH2CH2SO3–)作为配基。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中A蛋白亲和层析树脂包含结合高度交联琼脂糖的碱稳定A蛋白衍生物。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(b)的混合模式层析树脂包含4-巯基-乙基-吡啶作为配基。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(a)的流穿物不在收集容器中暂存，而是立即转到步骤(b)的层析树脂。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中进行附加的混合模式层析。
11.权利要求10的方法，其中所述方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(b2)使步骤(b)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)使步骤(b2)中获得的洗脱物，或从其衍生并在步骤(b2)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
12.权利要求11的方法，步骤(b)的混合模式层析树脂包含带负电荷的配基。
13.权利要求12的方法，其中带负电荷的配基是具有以下化学式的多模式弱阳离子交换部分：
14.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(c)之后接着以下步骤：
(d)使步骤(c)中获得的洗脱物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白。
15.权利要求14的方法，其中混合模式层析树脂包含带正电荷的配基。
16.权利要求15的方法，其中带正电荷的配基是具有以下化学式的N-苄基-N-甲基乙醇胺部分：
17.前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤(b)中，可以在免疫球蛋白结合层析树脂之后和从树脂洗脱免疫球蛋白之前包括一个或几个洗涤步骤。
18.前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤(c)中，可以在免疫球蛋白结合层析树脂之后和从树脂洗脱免疫球蛋白之前包括一个或几个洗涤步骤。
19.权利要求11至18的方法，其中在步骤(b2)中，可以在免疫球蛋白结合层析树脂之后和从树脂洗脱免疫球蛋白之前包括一个或几个洗涤步骤。
20.权利要求14至19的方法，其中在步骤(d)中，可以在免疫球蛋白结合层析树脂之后和从树脂洗脱免疫球蛋白之前包括一个或几个洗涤步骤。
21.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(b)中的洗脱通过应用洗脱免疫球蛋白的pH变动或pH梯度来进行。
22.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(c)的洗脱通过应用洗脱免疫球蛋白的pH变动或pH梯度来进行。
23.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(a)之前是以下步骤：
(i)离心样品，其中在上清中获得免疫球蛋白；
(ii)过滤步骤(i)中获得的上清，其中在滤液中获得免疫球蛋白。
24.权利要求23的方法，其中步骤(ii)中的过滤是深层过滤和/或除菌过滤。
25.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(a)的阴离子交换层析树脂可重复使用。
26.前述权利要求中任一项的方法，其中用于步骤(a)的阴离子交换层析树脂包含选自玻璃、陶瓷、二氧化硅、纤维素、琼脂糖、甲基丙烯酸聚合物或聚苯乙烯的基质。
27.前述权利要求中任一项的方法，其中用于步骤(b)的A蛋白亲和层析树脂或混合模式层析树脂包含选自玻璃、陶瓷、二氧化硅、纤维素、琼脂糖、甲基丙烯酸聚合物或聚苯乙烯的基质。
28.前述权利要求中任一项的方法，其中用于步骤(c)的阳离子交换层析树脂包含选自玻璃、陶瓷、二氧化硅、纤维素、琼脂糖、甲基丙烯酸聚合物或聚苯乙烯的基质。
29.权利要求11至28的方法，其中用于步骤(b2)的A蛋白亲和层析树脂包含选自玻璃、陶瓷、二氧化硅、纤维素、琼脂糖、甲基丙烯酸聚合物或聚苯乙烯的基质。
30.权利要求14至29的方法，其中用于步骤(d)的混合模式层析树脂包含选自玻璃、陶瓷、二氧化硅、纤维素、琼脂糖、甲基丙烯酸聚合物或聚苯乙烯的基质。
31.前述权利要求中任一项的方法，其中免疫球蛋白是IgG1。
32.权利要求31的方法，其中IgG1的Fc部分是人的。
33.前述权利要求中任一项的方法，其中样品是从重组CHO细胞培养物获得的细胞培养液。
34.前述权利要求中任一项的方法，其中方法包括在2.5至4.5的低pH下孵育步骤(b)的洗脱物确定的时间的另一步骤，
其中对于有包膜病毒，步骤(a)、在低pH下孵育步骤(b)的洗脱物的步骤和步骤(c)导致累积log10降低因子为至少15。
35.前述权利要求中任一项的方法，其中方法包括使步骤(c)的洗脱物或从其衍生并在步骤(c)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于纳滤的另一步骤，其中对于无包膜病毒，步骤(a)、步骤(c)和纳滤步骤导致累积log10降低因子为至少12，和/或其中对于有包膜病毒，步骤(a)、步骤(c)和纳滤步骤导致累积log10降低因子为至少15。
36.权利要求34的方法，其中方法包括使步骤(c)的洗脱物或从其衍生并在步骤(c)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于纳滤的另一步骤，其中对于有包膜病毒，步骤(a)、在低pH下孵育步骤(b)的洗脱物的步骤、步骤(c)和纳滤步骤导致累积log10降低因子为至少20。
37.用于从包含免疫球蛋白和至少一种杂质的样品纯化免疫球蛋白的方法，所述方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；或使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)在2.5至4.5的低pH下孵育步骤(b)中获得的洗脱物确定的时间；
其中对于有包膜病毒，所述方法导致步骤(a)和(c)的累积log10降低因子为至少10。
38.用于在免疫球蛋白制造工艺中提高病毒安全性的方法，所述方法包括以下顺序的以下步骤：
(a)使样品暴露于阴离子交换层析，在流穿物中获得不结合阴离子交换层析树脂的免疫球蛋白；
(b)使步骤(a)中获得的流穿物暴露于A蛋白亲和层析，其中免疫球蛋白结合A蛋白亲和层析树脂，通过从A蛋白亲和层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；或使步骤(a)中获得的流穿物暴露于混合模式层析，其中免疫球蛋白结合混合模式层析树脂，通过从混合模式层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
(c)在2.5至4.5的低pH下孵育步骤(b)中获得的洗脱物确定的时间；
其中对于有包膜病毒，所述方法导致步骤(a)和(c)的累积log10降低因子为至少10。
39.权利要求37或38的方法，其进一步包括以下步骤：
(d)使步骤(c)孵育后的洗脱物或从其衍生并在步骤(c)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于纳滤；
其中对于无包膜病毒，所述方法导致步骤(a)和(d)的累积log10降低因子为至少10，和/或其中对于有包膜病毒，所述方法导致步骤(a)、(c)和(d)的累积log10降低因子为至少15。
40.权利要求37至39的方法，其进一步包括以下步骤：
(c2)使步骤(c)中获得的洗脱物或从其衍生并在步骤(c)后进行的一个或多个其他处理步骤后获得的组合物暴露于阳离子交换层析，其中免疫球蛋白结合阳离子交换层析树脂，通过从阳离子交换层析树脂洗脱蛋白质来在洗脱物中获得免疫球蛋白；
其中对于有包膜病毒，所述方法导致步骤(a)、(c)和(c2)的累积log10降低因子为至少15。
41.权利要求40的方法，其中对于有包膜病毒，所述方法导致步骤(a)、(c)、(c2)和(d)的累积log10降低因子为至少20，和/或其中对于无包膜病毒，所述方法导致步骤(a)、(c2)和(d)的累积log10降低因子为至少12。
42.权利要求37至41的方法，其中步骤(a)的阴离子交换层析是包含配基的强阴离子层析，所述配基是除结合甲基丙烯酸聚合基质的三甲铵乙基之外的强阴离子交换层析配基，其中配基选自季氨乙基(QAE)部分、季铵部分和三甲铵部分，其中配基优选是三甲铵(-N(CH3)3+)。
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