JP4319979B2 - タンパク質の非アフィニティ精製 - Google Patents
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Description
本発明は、HPTFFを併用した非アフィニティクロマトグラフィー精製プロセスによってタンパク質(例えば、抗体または抗体様分子)を、宿主細胞タンパク質を含む混合物から精製し得、その結果、宿主細胞タンパク質不純物が、最終的に精製した標的タンパク質中に100ppm未満の量で存在するという驚くべき研究成果に関する。
A.定義
「抗体(antibody)」という用語は、最も広範な意味で使用され、具体的にはモノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多特異的抗体(例えば、二重特異性抗体)かまたは、リガンド特異的な結合領域を含むように改変される限り抗体フラグメントリガンド特異的な結合領域を保持する限りを網羅する。ここでの抗体は、目的の「抗原」に対して方向づけられている。抗原は、好ましくは、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または傷害に羅患した哺乳動物への抗体の投与が、その哺乳動物において治療的利益をもたらし得る。しかし、非ポリペプチド抗原(例えば、腫瘍関連の糖脂質抗原;米国特許第5,091,178号参照)に対する抗体もまた熟慮される。抗原がポリペプチドである場合、抗原は膜貫通分子(例えば、レセプター)または、リガンド(例えば、成長因子)であり得る。模範的な抗原は上で議論したポリペプチドを含む。本発明により含まれる抗体への好ましい分子標的としては、CDポリペプチド(例えば、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34、およびCD40);HERレセプターファミリー(例えば、EGFレセプター、HER2,HER3またはHER4レセプター);細胞接着分子(例えば、LFA−1,Mac1,p150,95,VLA−4,ICAM−1,VCAMおよびaまたはbのサブユニットを含むav/b3インテグリン(例えば、抗−CD11a,抗CD18,または、抗CD11b抗体)のメンバー;成長因子(例えば、VEGF);IgE,血液型抗原;flk2/flt3レセプター;肥満(OB)レセプター;mplレセプター;CTLA−4;ポリペプチドCなどが挙げられる。可溶性抗原またはフラグメントは、必要に応じて他の分子に結合されて、抗体産生のための免疫原として使用され得る。膜貫通分子(例えばレセプター)のために、これらのフラグメント(例えば、レセプターの細胞外領域)は免疫原として使用されえる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として使用され得る。このような細胞は、天然の供給源に由来し得る(例えば、癌細胞株)。またはこのような細胞は、組換え技術によって膜貫通分子を発現するように形質転換された細胞であり得る。
(1、タンパク質精製)
タンパク質ベースの薬学的産物の製造者は、厳密な監督標準(regulatory standard)(非常にストリンジェントな純度の要求を含む)と適合しなければならない。安全を保証するために、監督官庁(例えば、Food and Drug Administration:FDA)は、タンパク質ベースの医薬(組換えDNA技術よって生成される医薬を含む)が、不純物(宿主細胞タンパク質、ウイルス、DNA、外毒素、凝集体、フラグメントおよび組換えタンパク質の改変体など)を実質的に含まないことを必要とする。種々のタンパク質精製プロトコルが利用可能であり、医薬産業に広範に使用されるが、精製の必要とされる程度に達するために、代表的に、アフィニティ精製(例えば、抗体の場合、プロテインA精製)を含む。本明細書中の上記に示されるように、プロテインAアフィニティは、99.5%以上の不純物を除去するが、この利点は費用がかかる。プロテインAは、非アフィニティ媒体の価格よりも有意に高く、そしてプロテインAベースの精製方法は、しばしば、樹脂の安定性、洗浄可能性(cleanability)および寿命、リガンド漏出ならびに精製された産物に混入するプロテインA残渣の潜在的な免疫原性に関連する問題が生じる。
本発明に従って精製されるのに、好ましいタンパク質は、抗体である。特に、以下の実施例において記述されているように、組換えヒト化モノクローナル抗体(RhuMAb)精製のために、RhuMAbを発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞からの、調整されたHarvested Cell Culture Fluid(HCCF)が、最初のカチオン交換カラム(SP−Sepharose Fast Flow Resin,Amersham Biiosciences;(S))上に装填された。Sカラムから収集された物質(S プール(pool))は、SP−セファロースカラムから回収され、調製され、それから、アニオン交換カラム上に装填された(Q−Sepharose Fast Flow樹脂,Amersham Biosciences;(Q))。アニオン交換カラム(例えばQカラム、それぞれのQプール(pool))から収集された物質は、HPTFFによりさらに精製された。
Trastuzumabを含む抗HER2抗体(HERCEPTIN(登録商標))(Carterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285〜4289(1992)、米国特許第5,725,856号);抗CD20抗体(例えば、米国特許第5,736,137号中のキメラ抗CD20「C2B8」(RITUXAN(登録商標))、米国特許第5,721,108、B1号中の2H7抗体のキメラまたはヒト化改変体、すなわちTositumomab(BEXXAR(登録商標)));抗IL−8(St Johnら, Chest,103:932(1993),および国際公報第WO95/23865号);抗VEGF抗体(例えば、ヒト化抗VEGF抗体であるhuA4.6.1 AVASTIN(登録商標)のようなヒト化および/または親和性成熟化抗VEGF抗体)(Kimら,Growth Factors,7:53〜64(1992),国際公報第WO 96/30046号および1998年10月15日に公開された同第WO 98/45331号、);抗PSCA抗体(WO01/40309);抗CD40抗体(抗CD40抗体のS2C6およびヒト化改変体(WO00/75348)を含む;抗CD11a(米国特許第5,622,700号,WO98/23761、Steppeら,Transplant Intl.4:3〜7(1991)、およびHourmantら,Transplantation 58:377〜380(1994));抗IgE(Prestaら、J.Immunol.151:2623〜2632(1993)および国際公報第WO95/19181号);抗CD18(米国特許第5,622,700号(1997年、4月22日発行)、またはWO97/26912(1997年7月31日公開)中、);抗IgE(E25,E26およびE27を含む;米国特許第5,714,338号(1998年2月3日発行)、または米国特許第5,091,313号(1992年2月25日発行)、WO93/04173(1993年3月4日発行)または、国際出願番号PCT/US98/13410,(1998年6月30日に出願)、米国特許第5,714,338号);抗Apo−2レセプター抗体(WO98/51793(1998年11月19日公開));抗TNF−α抗体(cA2,REMICADE(登録商標)CDP571およびMAK−195を含む(米国特許第5,672,347号(1997年9月30日発行)Lorenzら,J.Immunol.156(4):1646〜1653(1996)、およびDhainautら、Crit.Care Med.23(9):1461〜1469(1995)を参照);抗組織因子(TF)(欧州特許第0 420 937 B1号、(1994年11月9日認可));抗ヒトα4β7インテグリン(WO98/06348(1998年2月19日公開));抗EGFR(WO96/40210(1996年12月19日公開)中のようなキメラ化225抗体またはヒト化225抗体);抗CD3抗体(例えば、OKT3(米国特許第4,514,893号(1985年5月7日発行));抗CD25または、抗tac抗体(例えば、CHI−621(SIMULECT(登録商標))および(ZENAPAX(登録商標))(米国特許第5,693,762号(1997年12月2日発行));抗CD4抗体(例えば、cM−7412抗体(Choyら、Arthritis Rheum 39(1):52〜56(1996));抗CD52抗体(例えば、CAPATH−1H(Riechmanら,Nature 332:323〜337(1988));抗Fcレセプター抗体(例えば、Grazianoら、J.Immunol.155(10):4996〜5002(1995)中のようなFcγRIに対するM22抗体);抗癌胎児性抗原(CEA)抗体(例えば、hMN−14(Sharkeyら,Cancer Res.55(23Suppl):5935s〜5945s(1995));胸部上皮細胞に対する抗体(huBrE−3,hu−Mc3およびCHL6を含む(Cerianiら,Canacer Res.55(23):5852s〜5856s(1995);ならびにRichmanら,Cancer Res.55(23 Supp):5916s〜5920s(1995));大腸癌細胞に結合する抗体(例えば、C242(Littonら Eur J.Immunol. 26(1):1〜9(1996));抗CD38抗体(例えば、AT13/5(Eliisら,J.Immunol.155(2):925〜937(1995));抗CD33抗体(例えば、HuM195(Jurcicら、Cancer Res 55(23 Suppl):5908s〜5910s(1995)およびCMA−676またはCDP771);抗CD22抗体(例えば、LL2またはLymphoCide(Juweidら,Cancer Res 55(23 Suppl):5899s〜5907s(1995));抗EpCAM抗体(例えば、17−1A(PANOREX(登録商標));抗GpIIb/IIIa抗体(例えば、アブシキシマブ(abciximab)またはc7E3Fab(REOPRO(登録商標));抗RSV抗体(例えば、MEDI−493(SYNAGIS(登録商標));抗CMV抗体(例えばPROTOVIR(登録商標));抗HIV抗体(例えば、PRO542);抗肝炎抗体(例えば、抗Hep B抗体(OSTAVIR(登録商標));抗CA125抗体(OvaRex);抗イディオタイプGD3抗原決定基抗体(BEC2);抗αvβ3抗体(VITAXIN(登録商標));抗ヒト腎臓細胞癌抗体(例えば、ch−G250);ING−1;抗ヒト17−1A抗体(3622W94);抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体(A33);GD3ガングリオシドに対して方向付けられた抗ヒト黒色腫抗体(R24);抗ヒト扁平上皮細胞癌(SF−25);ならびに抗ヒト白血球抗原(HLA)抗体(例えば、SmartID10および抗HLA DR抗体(Oncolym(Lym−1))。本明細書中での抗体に対する好ましい標的抗原は:HER2レセプター、VEGF、IgE、CD20、CD11a,およびCD40である。
本明細書中の抗体は、目的の抗原に対するものである。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または傷害を羅患する哺乳動物への抗体投与が、その哺乳動物に治療的利益をもたらし得る。しかし、非ポリペプチド抗原(例えば、腫瘍関連の糖脂質抗原;米国特許第5,091,178号を参照)に対する抗体もまた、意図される。抗原がポリペプチドの場合、そのポリペプチドは、膜貫通分子(例えば、レセプター)または成長因子のようなリガンドであり得る。例示的な抗体は以下の(3)区分で記述されているタンパク質が挙げられる。本発明により包含され抗体の例示的な分子標的としては、CDタンパク質(例えば、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD40);ErBレセプターファミリーのメンバー(例えば、EGFレセプター、HER2レセプター、HER3レセプターまたはHER4レセプター);細胞接着分子(例えば、LFA−1、Mac1、p150、95、VLA−4、ICAM−1、VCAMおよびそのαサブユニットまたはβサブユニットいずれかを含む、αv/β3インテグリン(たとえば、抗CD11a抗体、抗CD18抗体または抗CD11b抗体);成長因子(例えば、VEGF);IgE;血液型抗原;flk2/flt3レセプター;肥満性(OB)レセプター;mplレセプター;CTLA−4;プロテインCまたは本明細書中で述べられた任意の他の抗原が上げられる。上で列挙した抗体への結合が特異的である抗原は本発明の範囲中に含まれる。
ポリクローナル抗体は、好ましくは、当該関連する抗原およびアジュバントを複数回、皮下(sc)または腹腔内(ip)へ注射することによって、動物において産生される。二官能性または誘導化剤(例えば、マレイミドベンゾイル スルホスクシミドエステル(システイン残基を介して結合)、N−ヒドロキシスクシニミド(リシン残基を介して)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2またはR1N=C=NR(RおよびR1は異なるアルキル基))を使用して、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質(例えば、鍵穴吸着ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシンインヒビター)に、抗原を結合させることは、有益であり得る。
モノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature,256:495(1975)によって最初に記述されたハイブリドーマ方法を使用して作製され得るか、または、モノクローナル抗体は、組換えDNA方法によって作製され得る(米国特許第4,816,567号)。
ヒト化抗体は、非ヒトの供給源由来の抗体に導入された1つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトのアミノ酸残基は、しばしば「インポート(import)」残基と言われ、代表的には「インポート」可変ドメインからとられる。ヒト化は、本質的にはWinterおよび共同研究者(Jonesら、Nature,321:522−525(1986);Riechmannら、Nature,332:323−327(1988);Verhoeyenら、Science,239:1534−1536(1988))の方法に従って、げっ歯類のCDRまたはCDR配列をヒト抗体の対応する配列と置換することによって行われ得る。従って、そのような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体(米国特許第4,816,567号)であり、実質的に、少ないインタクトなヒトの可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際上、ヒト化抗体は、代表的に、いくらかのCDR残基および恐らくはいくらかのFR残基が、げっ歯類抗体における類似の部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。
種々の技術が、抗体フラグメントの産生のために開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク分解性の消化によって得られた(例えばMorimotoら、Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107−117(1992)およびBrennanら、Science,229:81(1985))を参照のこと)。しかし、これらのフラグメントは現在、組換え宿主細胞によって直接産出され得る。例えば、抗体フラグメントは、上記の抗体ファージライブラリから単離され得る。あるいは、Fab’−SHフラグメントは、E.coliから直接回収され、そして、化学的に結合されてF(ab’)2フラグメントを形成し得る(Carterら、Bio/Technology 10:163−167(1992))。別のアプローチによれば、F(ab’)2フラグメントは、組換え宿主細胞の培養物から直接単離され得る。抗体フラグメントの産生のための他の技術は、当業者に明らかである。他の実施形態において、選択の抗体は、単鎖Fvフラグメント(scFv)である。WO 93/16185を参照のこと。
多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。そのような分子は、通常2つの抗原に結合するのみである(すなわち、二重特異性抗体(BsAbs))が、追加の特異性を有する抗体(例えば、三重特異性抗体)は、本明細書中で使用される場合、この表現によって包含される。
最も単純で、最も簡単な免疫付着因子設計は、付着因子の結合ドメイン(例えば、レセプターの細胞外ドメイン(ECD))と、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域とFc領域を組み合わせる。通常、本発明の免疫付着因子を調製する場合、付着因子の結合ドメインをコードする核酸を免疫グロブリン定常ドメイン配列のN末端をコードする核酸にC末端で融合するが、N末端融合もまた可能である。
(a) ACL−ACL;
(b) ACH−(ACH、ACL−ACH、ACL−VHCHまたはVLCL−ACH);
(c) ACL−ACH−(ACL−ACH、ACL−VHCH、VLCL−ACHまたはVLCL−VHCH)
(d) ACL−VHCH−(ACHまたはACL−VHCHまたはVLCL−ACH);
(e) VLCL−ACH−(ACL−VHCHまたはVLCL−ACH);および
(f) (A−Y)n−(VLCL−VHCH)2、
ここで、各Aは同一または異なる付着因子アミノ酸配列を表し;
VLは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである;
VHは免疫グロブリン重鎖可変ドメインである;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインである;
CHは免疫グロブリン重鎖定常ドメインである;
nは1を超える整数である;
Yは、共有結合架橋剤の残基を示す。
他の実施形態において、精製されるべきタンパク質は、CH2/CH3領域に融合しているか、または、CH2/CH3領域と結合体化しているタンパク質である。このような融合タンパク質は、タンパク質の血清半減期を増加させるように生成され得る。このように結合体化され得る生物学的に重要なタンパク質の例としては、以下が挙げられる:レニン;成長ホルモン(ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む);成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク質;α−1−抗トリプシン;インスリンA鎖;インスリンB鎖;プロインスリン;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体形成ホルモン;グルカゴン;凝固因子(例えば、第VIIIC因子、第IX因子、組織因子、およびvon Willebrands因子);抗凝固因子(例えば、プロテインC);心房ナトリウム利尿因子;肺表面活性剤;プラスミノーゲンアクチベーター(例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿素または組織型プラスミノーゲンアクチベーター(t−PA));ボンベシン;トロンビン;造血増殖因子、腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β;エンケファリナーゼ;RANTES(正常に発現および分泌された活性化時にT細胞に対して調節された);ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(MIP−1−α);血清アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン);Muellerian阻害物質;リラキシンA鎖;リラキシンB鎖;プロリラキシン;マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド;微生物タンパク質(例えば、β−ラクタマーゼ);DNase;IgE;細胞傷害性Tリンパ球関連抗原(CTLA)(例えば、CTLA−4);インヒビン;アクチビン;血管内皮細胞増殖因子(VEGF);ホルモンまたは成長因子に対するレセプター;プロテインAまたはプロテインD;リウマチ因子;神経栄養因子(例えば、ウシ由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、ニューロトロフィン−5、またはニューロトロフィン−6(NT−3、NT−4、NT−5、またはNT−6)、または神経成長因子(例えば、NGF−β));血小板由来増殖因子(PDGF);線維芽細胞増殖因子(例えば、aFGFおよびbFGF);上皮増殖因子(EGF);形質転換増殖因子(TGF)(例えば、TGF−αおよびTGF−β(TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、TGF−β4、またはTGF−β5を含む));インスリン様増殖因子IおよびII(IGF−IおよびIGF−II);des(1−3)−IGF−I(脳IGF−I)(インスリン様増殖因子結合タンパク質);CDタンパク質(例えば、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34、およびCD40);エリスロポエチン;骨誘導性因子;免疫毒素;骨形態生成タンパク質(BMP);インターフェロン(例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γ);コロニー刺激因子(CSF)(例えば、M−CSF、GM−CSFおよびG−CSF);インターロイキン(IL)(例えば、IL−1〜IL−10);スーパーオキシドジスムターゼ;T細胞レセプター;表面膜タンパク質;崩壊促進因子;ウイルス抗原(例えば、AIDSエンベロープの一部);輸送タンパク質;ホーミングレセプター;アドレシン(addressin);調節タンパク質;インテグリン(例えば、CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA−4およびVCAM);腫瘍関連抗原(例えば、HER2、HER3またはHER4レセプター);ならびに任意の上に列挙したポリペプチドのフラグメント。
本実施例は、本発明の化合物、組成物の製造方法および使用方法、ならびに本発明の方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提供され、そして、本発明者らが発明であるとみなすものの範囲を限定することを意図しない。使用される数字(例えば、量、温度など)に対する正確性を保証するための努力ははらったが、いくらかの実験的誤差を有しており、偏差が考慮されるべきである。本明細書における全ての引用の開示は、本明細書で参考として明示的に援用される。
Cf 濾液中の濃度(g/l)
Cb バルク濃度(または供給物濃度)(g/l)
CHO チャイニーズハムスター卵巣
CHOP チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質
CV カラム容量
DF ダイアフィルトレーション
HCCF 回収された細胞培養物流体
HCI 疎水性電荷誘導クロマトグラフィー
HCP 宿主細胞タンパク質
HIC 疎水性相互作用クロマトグラフィー
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
HPTFF 高速接線流濾過
J 濾液流動(lm−2h−1)
Lp 膜透過性
N 完全容量(diavolume)の数
PHCP HCP除去に基づく精製ファクター
PCHOP CHOP除去に基づく精製ファクター
pI 等電点
rhuMAb 組換えヒト化モノクローナル抗体
Si 溶質「i」のふるい分け
Y 収率
Ψ 選択性
(実施例1)
(2工程の非アフィニティ精製)
本実施例において、非アフィニティ精製マトリクスの異なる組み合わせを使用する、2工程の非アフィニティ精製または3工程の非アフィニティ精製のいずれかからなるプロセスを用い、抗CD11a rhuMAb HCCFの精製を実施した。
(非アフィニティクロマトグラフィーおよびHPTFF精製の組み合わせ)
本実施例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞からの組換えヒトモノクローナル抗体である抗HER2 rhuMAb(160kDaの分子量および約9.0のpIを有する)の精製に関する。抗HER2 rhuMAbをGenentech(South San Francisco,CA,USA)における工業スケールのCHO細胞培養プロセスから入手した。CHO細胞培養後、抗HER2 rhuMAb分子を、遠心分離および通常の細胞濾過によって部分的に浄化し、細胞および細胞デブリを除去した。得られたプールは、0.52mg/mlの抗HER2 rhuMAb生成物および0.78mg/mlのCHOPからなっていた。
クロマトグラフィーカラムに、合計約40gのrhuMAbに対して、約10gのrhuMAb/L樹脂を100cm/hの流速(1時間あたり5カラム容量(CV))でロードした。
非アフィニティクロマトグラフィーカラムの調製のために、結合−溶出SPセファロースおよびフロースルーQ−セファロースの各々を、調製用スケールカラム中に充填した。各クロマトグラフィーカラムの操作条件を、表5に示す。
プロセスの精製工程後の、各プール中の抗−HER2 rhuMAbの量(すなわち、HCCF中および、精製プロセスからのプール中)を、プロテインA免疫アフィニティに基づくHPLC分析によって決定した。HPLCカラムは、PorosのプロテインA、内径4.6mm×100mmベッド高(PerSeptive Biosystems)であった。サンプルおよび標準を、ローディング緩衝液中でカラムに添加し、rhuMAb分析物をカラムに結合させ、次に、酸性条件化で溶出した。溶出した物質のピーク面積を、標準曲線のピーク面積と比較し、rhuMAbの量を計算した。アッセイした範囲は、典型的には、0.05mg/mL〜1.0mg/mLであった。
高速接線流濾過(HPTFF)は、サイズおよび荷電の両方に基づく、10倍以内のサイズの差異を有する溶質の分離を含む、二次元濾過操作である。上記のように、Qプールを、3つの等価なQプールに分け、その各々は6.9Lの容量であり、そして濃度は、HPTFFによるさらなる精製の前に、約1.4g/Lの抗−HER2 rhuMAbであった。Qプールの2つを、HPTFF実験1に供し、各々のQプールは、異なる条件を含んだ。HPTFF実験1の研究から、HPTFFの最適条件を決定する際に、HPTFF実験1および2からのプールの組み合わせを、以下に詳細に記載するさらなるHPTFFに供した。
これらの実験において、HPTFFのために使用した濾過膜は、名目上の分子量カットオフ300kD(PLCMK)を有する、複合再生セルロース(Composite Regenerated Cellulose)(CRC)−Millipore ULTRACELTM(Millipore)である。CRC300mini−PELLICON2(登録商標)膜(Millipore)を、本明細書に記載されるように荷電について改変し、本実施例のHPTFF研究において使用する荷電したセルロース膜CRC300+を得た。手短には、300kD PELLICON−2(登録商標)カセット(0.1m2の膜面積)を、スケールダウン実験のために使用した(最少で1Lの溶液)。膜を、最初の使用の前に、カートリッジ調製プロトコルに従って洗浄して、残存する保存溶液および輸送溶液を取り除き、膜を適切な緩衝液条件に平衡化した。膜を、アルカリ条件下で、ブロモ−プロピル−トリメチル−アンモニウムブロミド(Sigma−Aldrich, St Louis,MO)を用いて、インサイチュで化学的に改変した(PCT/US00/19964、本明細書においてその全体が参考として援用される)。具体的には、並流濾液流を用いることなく、100lm−2h−1の一定の濾液流で、保持液圧力を10psigに固定し、0.1N NaOH中に溶解して0.2μmで濾過した1Lのリガンドを用いて濾液オープンモードで総リサイクルして、膜を荷電した。荷電前のLpは、0.1N NaOH中で約53lm−2h−1であり、荷電後のLpは、0.1N NaOH中で約37lm−2h−1であった。荷電後、生じた陽性荷電の膜を、0.1N水酸化ナトリウムで清浄し、300ppmのMINNCARETM溶液で衛生化し、そして0.1N 水酸化ナトリウム中に保存した。各HPTFF実験の前に、膜を、実験の第1のダイアフィルトレーション緩衝液を用いてフラッシュして、保存溶液を除去し、そして完全性について試験した。膜透過性を、3つの濾液流を最少にして、並流濾液流を用いるHPTFFシステムを用いて、測定した。
HPTFF実験を、図1に示される基本的な構成を有する完全に自動化された平行流濾過システムを用いて行なった。HPTFFシステムは、40リットルのステンレス鋼リサイクルタンク、供給および濾過フローメーター(Admag Model 102 and 105,Johnson Yokogawa Corp.,Newman,GA)、ならびに圧力トランスデューサ(Model MSP220−A2、0−100psig=0−7bar,Anderson Instruments,Fultonville,NY)を備えた。供給および並流濾液フローポンプは、正の容積型ポンプ(positive displacement pumps)(Universal 6,Waukesha−Cherry Burrell,Delavan,WI)であり、その一方で、ダイアフィルトレーションポンプおよび濾液ポンプは、ペリスタル型ポンプ(Model L−7518−62,Cole Parmer,Niles,IL)であった。リサイクルタンクは、温度プローブ(Model RIX,−29℃〜82℃,Moore Industries,Sepulveda,CA)を備えた。全てのパイピングを、316Lのステンレス鋼で構築した。保持液圧力制御バルブを、鋼ダイアフラム(Model 1/2 Mikroseal packless control valve,H.D.Baumann,Portsmouth,NH)を用いて作動させ、全ての他のバルブを、エチレンプロピレンジエンモノマーダイアフラム(Biotek Model 8836−18−BH,ITT Sherotec,Simi Valley,CA)を用いて空気によって作動させた。連続するタンク液体レベルを、磁気制御プローブ(magneto restrictive probe)(Model Tempsonics II,MTS,Research Triangle Park,NC)を用いて測定した。データの獲得および制御を、Mycro Advantageソフトウェアシェル(Moore Products,Springhouse,PA)を使用する、専用のソフトウェア(Genentech,Inc.,South San Francisco,CA)を用いて行なった。
上記のように、等量の6.9L QプールへのQプールの分割の後、Qプールの一つを、以下の条件下でCRC300+膜を用いるHPTFF実験1に供した。
上記のように、1.4mg/mlのrhuMAb、410ppmのCHOP、pH5.6であり、約8mS/cmの伝導度を有する別のQプールを、HPTFF実験2に供した。
本実施例は、組換えヒトモノクローナル抗体である抗−CD40 rhuMAb(チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)細胞由来の分子量160kD、およびpI約9.3)の精製を含む。抗−CD40 rhuMAbを、Genentech(South San Francisco,CA,USA)での工業スケールのCHO細胞培養プロセスから得た。CHO細胞培養の後、抗−CD40 rhuMAb分子を、遠心および通常の細胞濾過によって部分的に清澄化し、細胞と細胞片を取り除いた。生じたプールは、1.7mg/mlの抗−CD40 rhuMAb産物および約0.4mg/mlのCHOPから構成された。
(1.方法)
非アフィニティクロマトグラフィーカラムの調製のために、結合−溶出SPセファロースおよびフロースルーQ−セファロースの各々を、調製用スケールカラム中に充填した。各クロマトグラフィーカラムの操作条件を、表9に示す。
プロセスの精製工程後の、各プール中(すなわち、精製プロセスからのプール中のHCCF中)の抗−CD40 rhuMAbの量を、本明細書の実施例2に記載されるように、プロテイン−A免疫アフィニティに基づくHPLC分析によって、決定した。CHOP濃度を、本明細書の実施例2に記載されるように、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を用いて決定した。SクロマトグラフィーおよびQクロマトグラフィーの完了の際に、プールからのサンプルを、SDS−PAGE分析に供した(図5、それぞれ、レーン3および4)。rhuMAbプールのイオン強度を低下させ、伝導度を1.8mS/cmにまで低下させるために、Qプールを希釈し、pHを4.5に調整し、次に、リサイクルタンクに添加した(図1)。正に荷電したCRC300+膜を用いるHPTFF実験の精製工程(HPTFF実験)を、バルク容量が10g/Lのバルク濃度(Cb)に達するまで、Qプールからの物質を最初に濃縮することによって、開始した。次に、リサイクルタンク中に、結果として生じた溶液を、連続するダイアフィルトレーション工程に供した。1.5mS/cmの一定の伝導度を用いて、各々pH4.5およびpH5.5の5完全容量を用い、次に、pH6.5の20完全容量を用い、次に、pH7.0の10完全容量を用いて、ダイアフィルトレーションを行った(表10)。収量を、以下の式:
Claims (21)
- 宿主細胞タンパク質を含む混合物から標的タンパク質を精製するための方法であって、該混合物を以下に供する工程:
(a)第一の非アフィニティ精製工程、および
(b)第二の非アフィニティ精製工程、続いて
(c)高速接線流濾過(HPTFF)、
を包含し、
前記第一の非アフィニティ精製工程が、カチオン交換クロマトグラフィーであり、前記第二の非アフィニティ精製工程がアニオン交換クロマトグラフィーである、方法。 - 前記カチオン交換クロマトグラフィー工程が、カルボキシメチル、スルホプロピル(sulphopropyl)(SP)、およびスルホニルからなる群より選択されるカチオン交換配位子上で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記カチオン交換クロマトグラフィー工程が、カルボキシメチル−セルロース、アガロース上に固定されたスルホプロピル、アガロース上に固定されたスルホニルから選択されるカチオン交換樹脂上で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記アニオン交換クロマトグラフィー工程が、DEAEおよび第四級アンモニウムイオンからなる群より選択されるアニオン交換配位子において行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記アニオン交換クロマトグラフィー工程が、DEAEセルロース、QAE SEPHADEXTM、およびFAST SEPHAROSETMからなる群より選択されるアニオン交換樹脂において行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記HPTFFが、荷電した膜を用いて実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主細胞タンパク質が、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質(CHOP)である、請求項1に記載の方法。
- 前記標的タンパク質が、抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項8に記載の方法。
- 前記抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項8に記載の方法。
- 前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項8に記載の方法。
- 前記抗体が、ヒト抗体である、請求項8に記載の方法。
- 前記抗体が、抗体フラグメントである、請求項8に記載の方法。
- 前記抗体フラグメントが、抗体フラグメントから形成される、Fab、Fab’、F(ab’)2およびFvフラグメント、単鎖抗体分子、ダイアボディー(diabody)、線状抗体、二重特異性抗体および多重特異性抗体からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記抗体が、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34、CD40、EGFレセプター、HER2レセプター、HER3レセプター、HER4レセプター、LFA−1、Macl、pl50,95、VLA−4、ICAM−1、VCAM、av/b3インテグリン、CD11a、CD18、CD11b、VEGF、IgE、flk2/flt3レセプター、肥満(OB)レセプター、mplレセプター、CTLA−4、およびポリペプチドCからなる群より選択される抗原に特異的に結合する、請求項8に記載の方法。
- 前記抗体が、以下:
抗HER2;抗CD20;抗IL−8;抗VEGF;抗PSCA;抗CD11a;抗IgE;抗Apo−2レセプター;抗TNF−α;抗組織因子(Tissue Factor)(TF);抗CD3;抗CD25;抗CD34;抗CD40;抗tac;抗CD4;抗CD52;抗Fcレセプター;抗癌胎児性抗原(CEA)抗体;胸部上皮細胞に特異的な抗体;結腸癌種細胞に結合する抗体;抗CD33;抗CD22;抗EpCAM;抗GpIIb/IIIa;抗RSV;抗CMV;抗HIV;抗肝炎;抗αvβ3;抗ヒト腎細胞癌腫;抗ヒト17−1A;抗ヒト結腸直腸腫瘍;抗ヒト黒色腫;抗ヒト扁平上皮癌腫;および抗ヒト白血病抗原(HLA)抗体
からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。 - 前記抗体が、抗HER2レセプター抗体、抗VEGF抗体、抗IgE抗体、抗CD20抗体、抗CD11a抗体、および抗CD40抗体からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記標的タンパク質が、免疫付着因子(immunoadhesin)である、請求項1に記載の方法。
- 前記標的タンパク質が、C H 2/C H 3領域に融合したタンパク質、またはC H 2/C H 3領域と結合体化したタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質が、以下:
レニン;成長ホルモン;成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク質;α−1−抗トリプシン;インスリンA鎖;インスリンB鎖;プロインスリン;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体形成ホルモン;グルカゴン;第VIIIC因子;第IX因子;組織因子;フォンヴィレブランド因子;プロテインC;心房性ナトリウム利尿因子;肺表面活性剤;ウロキナーゼ;ヒト尿および組織型プラスミノーゲンアクチベーター(t−PA);ボンベシン;トロンビン;造血増殖因子;腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β;エンケファリナーゼ;RANTES;ヒトマクロファージ炎症タンパク質(MIP−1−α);血清アルブミン;Muellerian−阻害物質;リラキシンA鎖;リラキシンB鎖;プロリラキシン;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;β−ラクタマーゼ;DNase;IgE;細胞傷害性Tリンパ球関連抗原(CTLA);インヒビン;アクチビン;血管内皮増殖因子(VEGF);ホルモンまたは増殖因子に対するレセプター;プロテインAまたはプロテインD;リウマチ因子;骨由来神経栄養因子(BDNF);ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、ニューロトロフィン−5、およびニューロトロフィン−6(NT−3、NT−4、NT−5、およびNT−6)、神経成長因子;血小板由来増殖因子(PDGF);線維芽細胞増殖因子;上皮増殖因子(EGF);トランスホーミング増殖因子(TGF);インスリン様増殖因子−Iおよびインスリン様増殖因子−II(IGF−IおよびIGF−II);des(1−3)−IGF−I(脳IGF−I)、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP);CDタンパク質;エリスロポイエチン;骨誘導因子;免疫毒素;骨形態形成タンパク質(BMP);インターフェロン−α、インターフェロン−βおよびインターフェロン−γ;コロニー刺激因子(CSF);インターロイキンIL−1〜IL−10;スーパーオキシドジスムターゼ;T細胞レセプター;表面膜タンパク質;破壊促進因子;ウイルス抗原;輸送タンパク質;ホーミングレセプター;アドレシン(addressin);調節タンパク質;インテグリン;腫瘍関連抗原;ならびにそれらのフラグメント
からなる群より選択される、請求項19に記載の方法。 - 薬学的処方物中に単離されたタンパク質を組み込む工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
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