KR20040106390A - 단백질의 비친화성 정제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 HPTFF와 비친화성 크로마토그래피를 병용하는 것을 포함하는 단백질 정제 방법에 관한 것이다.

Description

단백질의 비친화성 정제{Non-affinity Purification of Proteins}
경제적인 대규모 단백질 정제는 생물공학 산업 분야에서 점점 중요한 문제가 되고 있다. 일반적으로, 단백질은 목적 단백질의 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드를 삽입하여 목적 단백질을 생산하게끔 조작된 포유류 또는 박테리아 세포주 를 사용하여 세포 배양에 의해 생산된다. 사용된 세포주가 생물체이기 때문에, 그들에게는 통상 동물 혈청 제제로부터 공급되는 당류, 아미노산류 및 성장 인자를 함유하는 복합 증식 배지가 공급되어야 한다. 이러한 세포에 공급된 화합물들의 혼합물 및 세포 자체의 부산물로부터 원하는 단백질을 인체 치료제로서 사용하기에 충분한 순도로 분리하는 것은 만만치 않은 일이다.
세포 파편으로부터 단백질을 정제하는 방법은 우선 단백질의 발현 부위에 따라 좌우된다. 어떤 단백질은 세포로부터 주위 증식 배지로 바로 분비되게 하고, 어떤 단백질은 세포내에서 만들어진다. 후자의 단백질의 경우, 정제 방법의 제1단계는 기계적 전단, 삼투압 충격 또는 효소 처리를 비롯한 여러 방법에 의해 수행될 수 있는 세포의 용균 단계를 포함한다. 이러한 세포 파열로, 세포의 전체 내용물이 균질화물(homogenate)로 방출되고, 또한 크기가 작아 제거하기 어려운 세포내 (subcellular) 단편들이 생성된다. 이들은 일반적으로 원심분리 또는 여과에 의해 제거된다. 정도는 덜 하지만, 동일한 문제가 단백질 생산 과정 중 세포내 숙주 세포 단백질의 방출 및 세포의 자연사로 인해 바로 분비된 단백질에 있어서도 일어난다.
목적 단백질을 함유하는 용액이 얻어지면, 세포에 의해 생산된 다른 단백질로부터 목적 단백질을 분리하는 것은 일반적으로 여러 크로마토그래피 기술을 병용함으로써 시도된다. 이 기술은 단백질의 전하, 소수성 정도 또는 크기를 기준으로 단백질 혼합물을 분리한다. 이 기술 각각마다 몇가지 다른 크로마토그래피 수지가 있어서 관련된 특정 단백질에 대한 정제 방법을 정확히 맞출 수 있다. 이러한 각 분리 방법의 핵심은 단백질이 긴 컬럼의 아래 방향으로 다른 속도로 이동하여 그들이 컬럼 아래 방향으로 계속 내려감에 따라 점점 더 크게 물리적으로 분리되거나, 또는 단백질을 분리 매질에 선별적으로 부착시킨 다음, 다른 용매에 의해 차별적으로 용출시킬 수 있다는 것이다. 경우에 따라, 불순물은 컬럼에 특이적으로 부착되고 목적 단백질은 컬럼에 부착되지 않는, 즉 목적 단백질은 "통과액(flow-through)" 중에 존재하게 되는 경우에 목적 단백질이 불순물로부터 분리된다.
교환가능한 반대이온에 대해 명명된 이온 교환 크로마토그래피는 이온화가능한 분자의 정제에 적용할 수 있는 방법이다. 이온화된 분자는 이들의 대전된 기들과 고상 지지체 매트릭스에 부착된 반대로 대전된 분자와의 비특이적 정전기 상호작용에 근거하여 분리함으로써, 고상과 더 강하게 상호작용하는 상기 이온화된 분자를 보류시킨다. 이온화된 분자의 각 타입의 순 전하 및 매트릭스에 대한 친화성은 대전된 기의 수, 각 기의 전하 및 대전된 고상 매트릭스와 상호작용에 있어서 경쟁하는 분자의 성질에 따라서 달라진다. 이러한 차이는 이온 교환 크로마토그래피에 의한 다양한 분자 타입의 분별을 가져온다. 이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 전형적인 단백질 정제에서는, 포유동물 세포 배양물 중의 숙주 세포와 같은 숙주 세포로부터 유래된 많은 단백질의 혼합물을 이온 교환 컬럼에 적용한다. 비결합 분자를 세척해 낸 후, pH, 반대이온 농도 등을 단계식 또는 구배식으로 변화시키는 등에 의하여 상태를 조절함으로써 고상으로부터 비특이적으로 보유된 또는 보류된 목적 이온화 단백질을 방출하고 이를 대전 특성이 다른 단백질과 분리한다. 음이온 교환 크로마토그래피는 특정한 분리 공정의 상태 및 pH에서 고상 매트릭스에 부착된 양으로 대전된 분자와 상호작용함에 있어서 반대 음이온과 음이온 목적 분자의 경쟁을 수반한다. 반대로, 양이온 교환 크로마토그래피는 특정한 분리 공정의 상태 및 pH에서 고상 매트릭스에 부착된 음으로 대전된 분자와 상호작용함에 있어서 반대 양이온과 양이온 목적 분자의 경쟁을 수반한다. 혼합식 이온 교환 크로마토그래피는 같은 단계에서 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 병용한다. 구체적으로 "혼합식"이란, 양이온 교환 부분과 음이온 교환 부분과 소수성 상호작용 부분과의 혼합물이 공유결합에 의하여 부착된 고상 지지체 매트릭스를 가리킨다. 시판하는 혼합식 이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로 대표적인 것은 ABx(등록 상표)이며, 그 사용은 실시예에 기재된다.
단백질 히드록시아파티트 크로마토그래피는, 단백질의 대전된 아미노 또는 카르복실레이트 기와 히드록시아파티트 상의 반대로 대전된 기의 비특이적 상호작용을 수반하며, 여기서 히드록시아파티트와 단백질의 순 전하는 완충액의 pH에 의하여 조절된다. 용출은 Ca2+또는 Mg2+등의 이온으로 비특이적 단백질-히드록시아파티트 쌍을 대체함으로써 수행된다. 음으로 대전된 단백질 군을 포스페이트 등의 음으로 대전된 화합물로 대체하여 순 음전하(net-negatively charged) 단백질을 용출한다.
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 단백질 등의 분자의 표면 소수성을 기초로 이들 분자를 정제 및 분리하는 데에 유용하다. 단백질의 소수성 기는 크로마토그래피 매트릭스에 커플링된 소수성 기와 비특이적으로 상호작용한다. 단백질 표면 소수성 기의 수와 성질의 차이는 HIC 컬럼 상에서 차별적인 단백질 보류 (retardation)를 가져오며 그 결과, 단백질 혼합물에서 단백질이 분리된다.
소수성 전하 유도 (HCI) 크로마토그래피는 이온화가능한 이중방식 리간드의 pH에 따른 거동에 기초하여 단백질 등의 생체 분자를 분리하는 데에 유용하다(Boschetti, E. et al., Genetic Engineering News 20(13) (2000)). 중성 pH에서, 리간드는 대전되지 않으며, 온화한 비특이적 소수성 상호작용을 통하여 목적 단백질에 결합한다. pH가 완충액 구배 동안 감소함에 따라서, 리간드는 양으로 대전되고 소수성 결합은 정전기 전하 반발에 의하여 파괴된다(Boschetti, E.(2000), 위의 문헌). HCI에 사용된 부드러운 조건은 단백질 변성과 항체 응집의 위험을 감소시킨다.
친화성 크로마토그래피는 정제될 단백질과 고정된 포획제 간의 특이적인 구조의존적 (공간적으로 상보적인) 상호작용을 이용하며, 항체와 같은 일부 단백질에대해 선택할 수 있는 표준적인 정제 방법이다. 예를 들어, 단백질 A는 Fc 영역을 포함하는, 항체 등의 단백질의 친화성 크로마토그래피를 위한 유용한 흡착제이다. 단백질 A는 스타필로코쿠스 아우레아스(Staphylococcus aureas)로부터 유래한 41 kD 세포벽 단백질로서, 항체의 Fc 영역에 높은 친화도 (인간 IgG에 약 10-8M)로 결합한다. 친화성 크로마토그래피는 흔히 사용됨에도 불구하고 비용이 많이 들며, 특히 치료용 단백질을 정제하기 위해 필요한 산업적 규모에서 그러하다.
고성능 접선-플로우 여과 (HPTFF)는 단백질 혼합물의 상대적 크기에 대한 제한없이 단백질 혼합물을 분리하는 데에 유용한 막 기술이다(Zydney, A. L. and van Reis, R., High-Performance Tangential-Flow Filtration, ch. 10 in Membrane Separations in Biotechnology, 2d ed., William K. Wang, ed., Marcel Dekker, Inc., NY, NY (2001). pp. 277-298; van Reis, R. et al. Biotechnol. Bioeng. 56: 71-82 (1997); 및 van Reis, R., 미국 특허 제5,256,694호, 미국 특허 제5,490,937호 및 미국 특허 제6,054,051호, 이들 문헌의 내용은 언급됨으로써 그 전체가 여기에 도입됨). HPTFF는 특정한 불순물(단백질, DNA 또는 내독소(endotoxin) 등)을 제거, 바이러스를 제거 및(또는) 단백질 올리고머 또는 분해 산물을 제거하는 다운스트림 정제 공정에서 두루 사용될 수 있다. HPTFF는 여러 상이한 분리 단계를 하나의 규모화할 수 있는 단위 조작으로 결합할 수 있어서 동시적인 정제, 농축 및 완충액 교환을 수행할 수 있다는 점에서 쓸 수 있는 분리 기술 중에서 독보적이다.
이들 진보된 크로마토그래피 및 여과 방법에도 불구하고, 제약 항체 정제에 맞는 순도, 수율 및 산출율(throughput) 요건을 충족하는 포획 단계로서 친화성 크로마토그래피가 종종 사용된다. 그러나 친화성 매질의 높은 가격 및 불안정성으로 인해 항체 요법, 특히 고용량 및(또는) 만성 투여를 필요로 하는 항체 요법의 궁극적 비용이 증가한다. 또한, 여러 정제 단계가 결합되지 않는다면 종종 적절한 순도가 얻어지지 않아, 이 역시 비용을 상승시키고 생성물 수율을 감소시킨다. 항체는 암, 자기면역 질병, 감염증, 심혈관 질병 및 이식 거부 등의 치료에 있어서, 미국내의 개발 및 시장에서 치료제품 중 점차 더 높은 퍼센트를 차지하고 있다(Stratan, F. et al., Monoclonal Antibodies- Coming of Age, 1 (2001) 및 Booth, M. et al., Monoclonal Antibodies: Targeting the Issues, 1 (2001)). 결과적으로 고가의 친화성 단계가 필요없이 더 적은 단계를 써서 단백질 치료제 또는 그외 폴리펩티드 화합물을 정제하는 방법이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은, 비친화성 크로마토그래피 정제 방법을 HPTFF와 병용하면 숙주 세포 단백질 불순물이 최종 정제된 표적 단백질 중에 100 ppm 미만의 양으로 존재하도록, 항체 또는 항체 유사 분자 등의 표적 단백질을 숙주 세포 단백질이 함유된 혼합물로부터 정제할 수 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 친화성 크로마토그래피 단계 없이 2 개의 비친화성 정제 단계 후에 고성능 접선 플로우 여과 (HPTFF)를 포함하는, 숙주 세포 단백질 및 임의로는 추가의 불순물이 함유된 혼합물로부터 표적 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이며, 이 방법에 의하여 100 ppm 미만, 별법으로는 90 ppm 미만, 80 ppm 미만, 70 ppm 미만, 60 ppm 미만, 50 ppm 미만, 40 ppm 미만, 30 ppm 미만, 20 ppm 미만, 10 ppm 미만, 5 ppm 미만 또는 3 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함하는 정제된 표적 단백질이 얻어진다.
특정한 실시양태에서는 제1 및 제2 비친화성 크로마토그래피 정제 단계가 서로 다르며, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피로 이루어진 군에서 선택된다. 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및(또는) 혼합식 이온 교환 크로마토그래피일 수 있다. 바람직한 실시양태에서 제1 및 제2 비친화성 정제 단계는 순서를 불문하고 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피이다. 또다른 바람직한 실시양태에서는 제1 비친화성 정제 단계가 양이온 교환 크로마토그래피이고 상기한 제2 비친화성 정제 단계가 음이온 교환 크로마토그래피이다. 또다른 바람직한 실시양태에서는 본 발명의 방법은 2 개의 비친화성 크로마토그래피 정제 단계 후에 HPTFF 및 그 후 단리 단계로 구성되며, 어떠한 그외의 다른 정제 단계도 배제된다.
정제될 표적 단백질은 임의의 단백질, 특히 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함하나 이것으로 한정되지 않는 임의의 숙주 세포에서 생산된 재조합 단백질일 수 있다. 최적의 표적 단백질은 항체, 면역어드헤신 및 그외의 항체 유사 분자 (예컨대, CH2/CH3 영역을 포함하는 융합 단백질)이다.
다른 측면에서, 본 발명은 친화성 크로마토그래피 단계 없이 1 개의 비친화성 정제 단계 후에 고성능 접선 플로우 여과 (HPTFF)를 포함하는, 숙주 세포 단백질 및 임의로는 추가의 불순물이 함유된 혼합물로부터 표적 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이며, 이 방법에 의하여 100 ppm 미만, 별법으로는 90 ppm 미만, 80 ppm 미만, 70 ppm 미만, 60 ppm 미만, 50 ppm 미만, 40 ppm 미만, 30 ppm 미만, 20 ppm 미만, 10 ppm 미만, 5 ppm 미만 또는 3 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 함유하는 정제된 표적 단백질이 얻어진다.
본 발명의 이들 및 그외 무제한적인 실시양태는 본 명세서에 제공된 설명 및 청구의 범위를 읽으면 당업자에게 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 기재된 특정의 조성물 및 방법에 제한되는 것이 아니며 그러한 화합물 및 방법은 물론 달라질 수 있다는 점이 이해된다. 또한 본 명세서에 사용된 용어는 특정한 실시양태를 설명하기 위한 목적일 뿐 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다.
본 발명은 일반적으로 단백질 정제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 폴리펩티드 및 1 종 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 친화성 크로마토그래피를 사용하지 않고 단백질(예를 들면, 항체 및 항체 유사 분자, 예컨대 면역어드헤신)을 정제하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 HPTFF 실험을 위한 여과 설정의 개략도를 도시한다.
도 2는 항-HER2 rhuMAb의 정제 동안에 상이한 간격으로 채취하여 SDS-PAGE 분석한 샘플을 포함하는 은 염색 (Zaxis 10-20%) 폴리아크릴아미드 겔을 도시한다. 160 kD, 50 kD, 및 25 kD를 지시하는 화살표는 전장 (full-length) 항체, 중쇄 및경쇄를 각각 나타낸다. 나머지 밴드는 항-HER2 rhuMAb 단편이다. 샘플은 분자량 표준 (레인 1), 친화성 정제 방법을 사용하여 얻은 참조 rhuMAb (레인 2 및 7), 정제 전에 rhuMAb 수확된 세포 배양액 (HCCF)의 샘플 (레인 3), S 크로마토그래피 후에 (레인 4), Q 크로마토그래피 후에 (레인 5), 추가의 HPTFF 후에 (레인 6 및 12), CRC100+를 사용하는 HPTFF 실험 1 후에 (레인 9), CRC300+를 사용하는 HPTFF 실험 1후에 (레인 10) 및 HPTFF 실험 2 후에 (레인 11) 회수된 물질의 샘플이 있다.
도 3a 및 3b. 도 3a는 항-HER2 rhuMAb 경쇄의 아미노산 서열이며, 도 3b는 항-HER2 rhuMAb 중쇄의 아미노산 서열이다.
도 4a 및 4b. 도 4a는 항-CD11a rhuMab 경쇄의 아미노산 서열이고, 도 4b는 항-CD11a rhuMAb 중쇄의 아미노산 서열이다.
도 5는 항-CD40 재조합 인간 단일클론 항체 (rhuMAb)의 정제 동안에 상이한 시점에서 채취한 샘플을 포함하는 은 염색된 SDS-PAGE 겔을 보여준다.
가. 정의
용어 "항체"란 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 단일클론 항체 (전장 단일클론 항체를 포함), 다클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 및 리간드-특이적 결합 도메인을 보유하거나 또는 그를 포함하도록 변형된 것인한 항체 단편을 포괄한다. 본 명세서에서 항체란 관심있는 "항원"에 대해 유도된 것이다. 바람직하게는 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이며, 이 항체를 질병이나 장애를 앓고 있는 포유동물에 투여하면 포유동물에게서 치료상의 이점을 가져올 수 있다. 그러나, 비폴리펩티드 항원(종양-수반된 당지질 항원, 미국 특허 제5,091,178호 참조)에 대해 유도된 항체도 고려된다. 항원이 폴리펩티드인 경우 그 항원은 막횡단 (transmembrane) 분자 (예컨대, 수용체) 또는 성장인자 등의 리간드일 수 있다. 예시적인 항원으로는 상술한 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명에 의하여 포괄되는 항체를 위한 바람직한 분자 표적으로는 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 및 CD40 등의 CD 폴리펩티드, EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체 등의 HER 수용체족에 속하는 것들, LFA-a, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 a와 b 서브유닛 중 하나를 포함하는 av/b3 인테그린 등의 세포 부착 분자 (예컨대, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체), VEGF 등의 성장인자, IgE, 혈액 그룹 항원, flk2/flt3 수용체, 비만(OB) 수용체,mpl수용체, CTLA-4, 폴리펩티드 C 등이 있다. 임의로는 다른 분자에 접합된 것일 수 있는 가용성 항원 또는 그의 단편이 항체를 생성하는 면역원으로서 사용될 수 있다. 수용체 등의 막횡단 분자의 경우, 이들의 단편 (예를 들면, 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로서 사용될 수 있다. 별법으로는, 막횡단 분자를 발현하는 세포가 면역원으로서 사용될 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원(예를 들면, 암 세포주)으로부터 유래할 수 있거나 막횡단 분자를 발현하게끔 재조합 기술에 의하여 형질전환된 세포일 수 있다.
"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 전장 항체의 항원 결합 영역 또는 그의 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2및 Fv단편, 단쇄 항체 분자, 디아바디(diabody), 선형 항체 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 있다.
본 명세서에 사용되는 "단일클론 항체"라는 용어는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체를 의미하며, 즉, 집단을 이루는 개별적인 항체들이 소량 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다는 것이다. 단일클론 항체는 큰 특이성을 가지며, 단일 항원 부위에 대해 유도된다. 또한, 상이한 항원 결정군 (determinant)(에피토프)에 대해 유도되는 상이한 항체들을 전형적으로 포함하는 통상의 (다클론) 항체 제제와 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 항원 결정군에 대해 유도된다. 수식어 "단일클론"은 항체가 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 얻어진다는 항체의 특징을 나타내며, 어떠한 특정 방법으로 항체를 생산할 것을 요구하는 것으로 파악되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조할 수 있다. "단일클론 항체"는 또한, (Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)) 및 (Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991))에 기재된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.
본 명세서에서 단일클론 항체는 구체적으로는 "키메라" 항체 (면역글로불린) 및 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면 이러한 항체의 단편을 포함하는데, 키메라 항체에서는 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정항체류 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이 서열과 상동성이 있는 반면, 이 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체류 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있다(미국 특허 제4,816,567호 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
본 명세서에 사용된 "초가변 영역"이라는 용어는 항원과 결합하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 이 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 유래의 아미노산 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24 내지 34 (L1), 50 내지 56 (L2) 및 89 내지 97 (L3), 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 31 내지 35 (H1), 50 내지 65 (H2) 및 95 내지 102 (H3); (Kabat et al., Sequences of polypeptides of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및(또는) "초가변 루프" 유래의 아미노산 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26 내지 32 (L1), 50 내지 52 (L2) 및 91 내지 96 (L3), 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 26 내지 32 (H1), 53 내지 55 (H2) 및 96 내지 101 (H3); (Chotia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987))를 포함한다. "프레임워크(framework)" 또는 "FR" 잔기는 본 명세서에 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
비인간 (예를 들어 뮤린) 항체의 "인간화" 형은 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 인간 면역글로불린 (수여자 항체)인데, 수여자 항체의 초가변 영역의 잔기는 원하는 특이성, 친화성 및 용량을 지닌, 인간외 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 인간외 영장류 항체의 초가변 영역 유래의 잔기에 의해 대체된다. 경우에 따라, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR)의 잔기는 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더 개량하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 1개 이상, 통상적으로 2개 이상의 가변 도메인을 모두 포함하는데, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 초가변 루프에 상응하며 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 FR 영역에 해당한다. 또한, 경우에 따라 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 통상적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 더 자세한 사항은 (Jones et al, Nature 321:522-525 (1986), Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988), 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992))을 참조한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역어드헤신"이란 이종 "어드헤신" 단백질(예를 들면, 수용체, 리간드 또는 효소)의 "결합 도메인"을 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 결합한 항체-유사 분자를 지칭한다. 면역어드헤신은 구조상 항체의 항원 인식 및 결합 부위 (항원 결합 부위)가 아닌 (즉, 이종 (heterogeneous)인) 원하는 결합 특이성을 갖는 어드헤신 아미노산 서열과 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 면역어드헤신에서 면역글로불린 불변 도메인 서열은 바람직하게는 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄로부터 유래되는데, 이들 영역을 포함하는 면역어드헤신은 단백질 A 크로마토그래피에 의하여 정제될 수 있기 때문이다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)).
본 명세서에서 사용된 용어 "리간드 결합 도메인"이란, 임의의 천연 세포-표면 수용체를 가리키거나, 또는 상응하는 천연 수용체의 적어도 정량적인 리간드 결합을 보유하는 임의의 수용체 영역 또는 유도체를 가리킨다. 특정한 실시양태에서는 수용체가, 면역글로불린 거대 유전자족에 속하는 것과 상동성 있는, 세포외 도메인이 있는 세포 표면 폴리펩티드에서 유래한다. 면역글로불린 거대 유전자족에 속하지 않으나 그럼에도 불구하고 이런 정의에 의해 구체적으로 포함되는 다른 수용체는 사이토킨 수용체이고, 특히 티로신 키나제 활성이 있는 수용체 (수용체 티로신 키나제), 헤마토포이에틴 및 신경 성장인자 수용체 거대족에 속하는 것들, 및 세포 부착 분자 (예를 들면 E-, L- 및 P- 셀렉틴)이다.
용어 "수용체 결합 도메인"은 세포 부착 분자를 비롯한 수용체의 임의의 천연 리간드를 지칭하거나 또는 상응하는 천연 리간드의 적어도 정량적인 수용체 결합능을 보유하는 그러한 천연 리간드의 임의의 영역 또는 유도체를 지칭하는 데에 사용된다. 이런 정의는 무엇보다도 특히 상기한 수용체에 대한 리간드 유래의 결합 서열을 포함한다.
"항체-면역어드헤신 키메라"는 면역어드헤신 (본 출원에서 정의됨) 하나 이상과 항체의 결합 도메인 하나 이상 (본 명세서에서 정의됨)을 결합한 분자를 포함한다. 예시적인 항체-면역어드헤신 키메라는 문헌 [Berg et al., PNAS (USA) 88: 4723-4727 (1991) 및 Chamow et al., J. Immunol. 153: 4268 (1994)]에 기재된 이중특이적 CD4-IgG 키메라이다.
달리 언급이 없다면, 본 명세서에 사용될 때 용어 "HER2"는 인간 HER2 단백질을 의미하며, "HER2"는 인간 HER2 유전자를 의미한다. 인간 HER2 유전자 및 HER2 단백질은 예를 들면 문헌 [Semba et al., PNAS (USA) 82: 6497-6501 (1985) 및 Yamamoto et al., Nature 319:230-234 (1986) (젠뱅크 수탁번호 X03363)]에 기재되어 있다.
"트라스투주맙(Trastuzumab)", "허셉틴(HERCEPTIN)(등록 상표)", "항-HER2 rhuMAb", 및 "HER2"는 서열 1의 경쇄 아미노산 서열 및 서열 2의 중쇄 아미노산 서열, 또는 HER2에 결합할 수 있는 능력을 보유하여 HER2를 과발현하는 종양 세포의 증식을 억제하는 이들의 아미노산 서열 변이체를 포함하는 인간화 항-HER2 항체를 가리키는 것으로 본 명세서에서 서로 바꾸어 사용된다(도 3a 및 3b, 본 명세서에 언급함으로써 명백히 도입된 미국 특허 제5,677,171호를 참조함).
"항-CD11a rhuMAb" 또는 "CD11a"는 서열 3의 경쇄 아미노산 서열 및 서열 4의 중쇄 아미노산 서열, 또는 LFA-1에 결합하는 능력을 보유하여 특정한 T-세포 의존적 면역 기능을 억제하는 이들의 아미노산 서열 변이체를 포함하는 인간화 항-CD11a 항체를 가리키는 것으로 본 명세서에서 서로 바꾸어 사용된다(도 4a 및 4b, 또한 미국 특허 제5,622,700호, 국제특허공개 제WO 98/23761호, Steppe et al., Transparent Intl. 4:3-7 (1991), Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)를 참조. 이들 참고문헌은 언급에 의하여 본 명세서에 도입됨). 항-CD11a 항체는 추가로, 예를 들면 MHM24 (Hildreth et al, Eur. J. Immunol., 13:202-208(1983)), R3.1 (IgG1) (R. Rothlein, Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. 미국 코넥티커트주 리지필드에 소재), 25-3 (또는 25.3), 프랑스 이뮤노테크에서 시판하는 IgG1 (Olive et al., in Feldmann, ed., Human T cell Clones. A new Approach to Immune Regulation, Clifton, NJ, Humana, 1986 p. 173), KBA (IgG2a) (Nishimuar et al., Cell Immunol., 107:32 (1987), Nishimura et al., 같은 책, 94:122 (1985)), M7/15 (IgG2b) (Springer et al., Immunol. Rev., 68:171 (1982)), IOT16 (Vermot Desroches et al., Scand. J. Immunol., 33: 277-286 (1991)), SPVL7 (Vermot Desroches et al., 앞의 책) 및 ATCC에서 입수가능한 M17 (IgG2a) (이들은 래트 항-뮤린 CD11a 항체임)을 포함한다. 바람직한 항-CD11a 항체는 미국 특허 제6,037,454호에 기재된 인간화 항체이다. 또한 항-CD11a 항체는 T-세포 고갈 항체가 아닌, 즉 항-CD11a 항체를 투여해도 순환하는 T-세포의 양을 감소시키지 않는 것이 일반적으로 바람직하다.
본 명세서에서 정제될 "조성물"이라는 용어는 목적 폴리펩티드 및 1 종 이상의 불순물을 포함한다. 이 조성물은 "부분적으로 정제"하거나(즉, 1 단계 이상의 정제 단계, 예를 들어 본 명세서에 기재된 비친화성 크로마토그래피로 처리함) 또는 목적 폴리펩티드를 생산하는 숙주 세포 또는 유기체로부터 직접 얻을 수 있다(예를 들어, 이 조성물은 수확된 세포 배양액을 포함할 수 있음).
본 명세서에 사용된 바와 같이, "폴리펩티드"란 일반적으로 약 10개 이상의 아미노산을 갖는 펩티드 및 단백질을 의미한다. 바람직하게는, 이 폴리펩티드는 포유류 단백질이고, 그 예로는 레닌, 인간 성장 호르몬 및 소의 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 인자, 부갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 지단백질, 알파-1-안티트립신, 인슐린 A-쇄, 인슐린 B-쇄, 프로인슐린, 여포 자극 호르몬, 칼시토닌, 황체형성 호르몬, 글루카곤, 응고 인자(예를 들어 인자 VⅢC, 인자 IX, 조직 인자 및 빌레브란츠(Willebrands) 인자), 항-응고 인자(예를 들어 단백질 C), 심방 나트륨이뇨 인자, 폐 표면활성 물질, 플라스미노겐 활성 물질(예를 들어 유로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성 물질(t-PA)), 봄베신, 트롬빈, 조혈 성장 인자, 종양 괴사 인자-알파 및 종양 괴사 인자-베타, 엔케팔리나제, RANTES (활성화되면 정상적으로 T-세포가 발현 및 분비되도록 조절), 인간 마크로파지 염증 단백질(MIP-1-알파), 혈청 알부민 (예를 들어 인간 혈청 알부민), 뮬러리안(Muellerian)-억제 물질, 릴랙신 A-쇄, 릴랙신 B-쇄, 프로릴랙신, 마우스 성선자극 호르몬-관련 펩티드, 미생물 단백질(예를 들어 베타-락타마제), DNase, IgE, 세포독성 T-림프구 관련 항원(CTLA) (예를 들어 CTLA-4), 인히빈, 액티빈, 혈관 내피 성장인자(VEGF), 호르몬 또는 성장 인자의 수용체, 단백질 A 또는 D, 류마토이드 인자, 향신경 인자(예를 들어 골-유래 향신경 인자(BDNF), 뉴트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6) 또는 신경 성장 인자(예를 들어 NGF-β)), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 섬유아세포 성장 인자(예를 들어 aFGF 및 bFGF), 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자(TGF) (예를 들어 TGF-알파, 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 포함하는 TGF-β), 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II), 데스(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP), CD 단백질(예를 들어 CD3,CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 및 CD40), 에리트로포이에틴, 골유도 인자, 면역 독소, 뼈 형성 단백질(BMP), 인터페론 (예를 들어 인터페론-알파, -베타 및 -감마), 콜로니 자극 인자(CSF) (예를 들어 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF), 인터루킨 (IL)(예를 들어 IL-1 내지 IL-10), 수퍼옥시드 디스뮤타제, T-세포 수용체, 표면 막 단백질, 붕괴 촉진 인자, 바이러스 항원(예를 들어 AIDS 엔벨로프의 일부), 운반 단백질, 호밍 수용체, 어드레신, 조절 단백질, 인테그린 (예를 들어 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM), 종양 관련 항원(예를 들어 HER2, HER3 또는 HER4 수용체), 및 상기 기재된 임의 폴리펩티드의 단편 및(또는) 변이체가 포함된다. 또한, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 상기 열거한 폴리펩티드 중 어느 것에나 특이적으로 결합하는, 항체, 단편 또는 변이체이다.
"불순물"은 원하는 폴리펩티드 생성물 또는 목적 단백질이 아닌 물질이다. 불순물은 숙주 세포 단백질(HCP, 예컨대 CHOP), 표적 폴리펩티드 외의 폴리펩티드, 핵산, 내독소 등이 있으나 이것으로 한정되지는 않는다.
"산성 변이체"는 (예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 결정된 바로는) 목적 폴리펩티드보다 산성인 목적 폴리펩티드의 변이체이다. 산성 변이체의 예로는 탈아미노화 변이체가 있다.
"목적 단백질" 및 "표적 단백질"이란 용어는 서로 바꾸어 사용되며, 단백질과 임의로는 세포 파쇄물 등의 다른 물질과의 혼합물로부터 본 발명의 방법에 의해 정제되어야 할 항체 (본 명세서에 정의됨) 등의 단백질 또는 폴리펩티드를 가리킨다.
용어 "차이니스 햄스터 난소 세포 단백질" 및 "CHOP"는 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포 배양물로부터 유래된 숙주 세포 단백질(HCP) 혼합물을 가리키며, 서로 바꾸어 사용된다. HCP 또는 CHOP는 일반적으로, CHO 세포에서 발현되는 항체 또는 면역어드헤신 등의 목적 단백질을 포함하는 세포 배양 배지 또는 용균물(lysate) (예를 들면, 수확된 세포 배양액 ("HCCF")) 중에서 불순물로서 존재한다. 목적 단백질을 포함하는 혼합물 중에 존재하는 CHOP의 양은 목적 단백질에 대한 순도의 척도를 제공한다. HCP 또는 CHOP는 CHO 숙주 세포 등의 숙주 세포에 의하여 발현된 목적 단백질을 포함하나 이것으로 한정되지는 않는다. 전형적으로, 단백질 혼합물 중의 CHOP의 양은 혼합물 중의 목적 단백질의 양과 대비하여 ppm (part per million)으로 표현한다. 숙주 세포가 또다른 포유동물 세포 유형, 대장균 (E. coli), 효모, 곤충 세포 또는 식물 세포인 경우 HCP는 숙주 세포의 용균물 중에서 발견되는 표적 단백질 이외의 단백질을 가리킨다.
용어 "밀리온 당 부" 또는 "ppm"은 본 발명의 방법에 의하여 정제된 목적 단백질의 순도의 척도를 가리키기 위하여 서로 바꾸어 본 명세서에서 사용된다. ppm 단위는 목적 단백질(mg/ml) 당 HCP 또는 CHOP (ng/ml)의 양을 가리킨다(즉, 단백질이 용액으로 존재하는 경우 CHOP ppm = (CHOP ng/ml)/(목적 단백질 mg/ml)). 단백질이 (동결건조 등에 의하여) 건조된 경우 ppm은 (CHOP ng)/(목적 단백질 mg)을 가리킨다.
폴리펩티드 및 1 종 이상의 불순물이 함유된 조성물로부터 폴리펩티드를 "정제함"이란 조성물로부터 1 종 이상의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 조성물 중의 폴리펩티드의 순도를 증가시킨다는 것을 의미한다. 본 발명에 따르면, 정제는 친화성 크로마토그래피 단계를 사용하지 않고 수행된다. "정제 단계"는 "균일한 조성물"을 생성하는 전체 정제 공정의 부분일 수 있으며, 균일한 조성물이란 본 명세서에서 목적 단백질을 포함하는 조성물 내에 100 ppm 미만, 90 ppm 미만, 80 ppm 미만, 70 ppm 미만, 60 ppm 미만, 50 ppm 미만, 40 ppm 미만, 30 ppm 미만, 20 ppm 미만, 10 ppm 미만, 5 ppm 미만 또는 3 미만의 HCP를 포함하는 조성물을 가리키는 데에 사용된다.
용어 "단백질 A" 및 "ProA"는 본 명세서에서 서로 바꾸어 사용되며, 그 천연 공급원으로부터 회수된 단백질 A, 합성에 의해 제조된 단백질 A (예를 들면, 펩티드 합성 또는 재조합 기술에 의하여), 및 Fc 영역 등 CH2/CH3 영역을 갖는 단백질과 결합하는 능력을 보유한 이들의 변이체를 포괄한다. 단백질 A는 레플리젠 (Repligen), 파마시아 (Pharmacia) 및 퍼마테크 (Fermatech)로부터 상업적으로 구매할 수 있다. 단백질 A는 고상 지지체 물질 상에 고정되는 것이 일반적이다. 용어 "ProA"는 또한 단백질 A가 공유결합에 의하여 부착된 친화성 크로마토그래피 수지 또는 크로마토그래피용 고체 지지체 매트릭스를 포함하는 컬럼을 가리킨다.
용어 "크로마토그래피"란 혼합물의 각 용질이 이동상의 영향하에 정지 매질을 통과해 이동하는 속도 차이 또는 결합 및 용출 과정에서의 차이의 결과, 혼합물 중의 목적 용질을 혼합물 중의 나머지 용질과 분리하는 방법을 의미한다.
"친화성 크로마토그래피" 및 "단백질 친화성 크로마토그래피"란 용어는 본명세서에서 서로 바꾸어 사용되며, 목적 단백질 또는 목적 항체가 생물특이적 리간드에 가역적, 특이적으로 결합하는 단백질 분리 기술을 가리킨다. 바람직하게는 생물특이적 리간드는 크로마토그래피 고상 물질에 공유결합으로 부착되며, 크로마토그래피 고상 물질과 용액이 접촉할 때 용액 중의 목적 단백질에 접근할 수 있다. 목적 단백질(예를 들면, 항체, 효소 또는 수용체 단백질)은 크로마토그래피 단계 동안에 생물특이적 리간드 (예를 들면, 항원, 기질, 보조인자 또는 호르몬)에 대한 특이적 결합 친화성을 보유하는 반면, 혼합물 중의 나머지 용질 및(또는) 단백질은 리간드에 상당하거나 특이적으로 결합하지 않는다. 목적 단백질이 고정된 리간드로 결합하면 목적 단백질은 고상 물질 상의 고정된 리간드에 특이적으로 결합한 채로 남아있는 반면 오염 단백질 또는 단백질 불순물은 크로마토그래피 매질을 통과하게 된다. 특이적으로 결합된 목적 단백질은 그 후 낮은 pH, 높은 pH, 높은 염, 경쟁적 리간드 등을 써서 고정된 리간드로부터 활성 형태로 제거되어, 일찍이 컬럼을 통과한 오염 단백질 또는 단백질 불순물이 없이 용출 완충액과 함께 크로마토그래피 컬럼을 통과한다. 임의의 구성성분이 그의 각기 특이적 결합 단백질(예컨대 항체)의 정제용 리간드로서 사용될 수 있다.
용어 "비친화성 크로마토그래피" 및 "비친화성 정제"란 친화성 크로마토그래피가 사용되지 않는 정제 방법을 의미한다. 비친화성 크로마토그래피는 목적 분자 (예를 들면, 항체 등의 단백질)와 고상 매트릭스 사이의 비특이적 상호작용에 의존하는 크로마토그래피 기술을 포함한다.
고상 매트릭스에 결합된 리간드와 목적 분자 간의 상호작용을 설명하는 것과같이 본 명세서에 사용될 때 용어 "특이적 결합"이란, 결합 부위에서의 정전기력, 수소결합, 소수성 힘 및(또는) 반데르발스힘과 함께, 결합 부위에서의 단백질과 리간드 구조의 공간적 상보성의 복합적 영향을 통해 리간드에 목적 단백질이 일반적으로 가역적으로 결합하는 것을 의미한다. 공간적 상보성이 클수록, 결합 부위에서 다른 힘들이 클수록 각각의 리간드에 대한 단백질의 결합 특이성이 커질 것이다. 특이적 결합의 무제한적 예는 항원-항체 결합, 효소-기질 결합, 효소-보조인자 결합, 금속 이온 킬레이트화, DNA 결합 단백질-DNA 결합, 조절 단백질-단백질 상호작용 등이 있다. 이상적으로는, 친화성 크로마토그래피에서 유리 용액 중 약 10-4내지 10-8의 친화성으로 특이적 결합이 일어난다.
고상 매트릭스에 결합된 리간드 또는 그외 화합물과 목적 단백질 간의 상호작용을 설명할 때와 같이 본 명세서에서 사용될 때 용어 "비특이적 결합"이란, 상호작용 부위에서 정전기력, 수소결합, 소수성 힘 및(또는) 반데르발스힘을 통해 고상 매트릭스 상의 리간드 또는 화합물에 목적 단백질이 결합하되 그러한 비구조적 힘의 영향을 향상시키는 구조적 상보성은 없이 결합하는 것을 지칭한다. 비특이적 상호작용의 예로는 정전기력, 소수성 힘 및 반데르발스힘은 물론 수소결합이 있으나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
"염"은 산과 염기의 상호작용에 의하여 형성된 화합물이다. 본 발명에 유용한 염은 아세테이트 (예를 들면, 아세트산나트륨), 시트레이트 (예를 들면, 시트르산나트륨), 클로라이드 (예를 들면, 염화나트륨), 술페이트 (예를 들면, 황산나트륨) 또는 칼륨염이 있으나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용될 때 "용매"란 하나 이상의 다른 물질을 용해 또는 분산시켜서 용액을 제공할 수 있는 액체 물질을 지칭한다. 용매는 수성 및 유기용매가 있으며, 여기서 유용한 유기 용매로는 비극성 용매, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 아세토니트릴, 헥실렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 2,2-티오디글리콜이 있다.
용어 "세정제 (detergent)"란 폴리소르베이트 (예를 들면, 폴리소르베이트 20 또는 80), 폴록사머 (예를 들면, 폴록사머 188), 트리톤, 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 나트륨 라우렐 술페이트, 나트륨 옥틸 글리코시드, 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-술포베타인, 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사코신, 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인, 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예를 들면, 라우로아미도프로필), 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민, 나트륨 메틸 코코일- 또는 이나트륨 메틸 올레일-타우레이트, 및 모나쿠아트(MONAQUAT)(등록 상표) 시리즈 (미국 뉴저지주 패터슨에 소재한 Mona Industries, Inc. 제품) 등의 이온성 및 비이온성 계면활성제를 가리킨다. 유용한 세정제는 폴리소르베이트 20 (TWEEN 20(등록 상표)) 또는 폴리소르베이트 80 (TWEEN 80(등록 상표)) 등의 폴리소르베이트이다.
본 명세서에서 "중합체"란 아미노산 잔기가 아닌 단량체가 둘 이상 공유결합하여 형성된 분자이다. 중합체의 예로는, 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜,및 공중합체 (예를 들면, 플루로닉, PF68 등)이 있다. 유용한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 예컨대 PEG 400 및 PEG 8000이다.
용어 "이온 교환" 및 "이온 교환 크로마토그래피"란 혼합물 중의 목적 용질(단백질 등)이 고상 이온 교환 물질에 (공유결합 등에 의해) 연결된 대전된 화합물과 상호작용하여 목적 용질이 혼합물 중의 용질 불순물 또는 오염물보다 더 많이 또는 더 적게 대전된 물질과 비특이적으로 상호작용하는 크로마토그래피 방법을 가리킨다. 혼합물 중의 오염 용질은 목적 용질보다 더 빨리 또는 더 느리게 이온 교환 물질 컬럼으로부터 용출되거나 또는 목적 용질에 비하여 수지에 결합하거나 수지로부터 배출된다. "이온 교환 크로마토그래피"는 양이온 교환, 음이온 교환 및 혼합식 크로마토그래피가 있다.
"이온 교환 물질"이라는 어구는 음으로 대전된 고상 (즉, 양이온 교환 수지) 또는 양으로 대전된 고상 (즉, 음이온 교환 수지)을 의미한다. 1 종 이상의 대전된 리간드를 고상에 공유결합 등에 의하여 부착함으로써 전하를 제공할 수 있다. 이와 다르게 또는 추가로, 전하는 고상의 고유한 성질일 수 있다(예를 들어, 실리카의 경우, 고상은 전체적으로 음전하를 띤다).
"고상"이라는 용어는 1 종 이상의 대전된 리간드가 부착할 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 고상은 정제 컬럼, 불균일 상의 이산된 입자, 막 또는 필터 등일 수 있다. 고상을 형성하는 물질의 예에는 폴리사카라이드 (예를 들어, 아가로스 및 셀룰로오스), 및 기계적으로 안정한 그 밖의 매트릭스, 예를 들어 실리카 (예를 들어, 조절형 공극 글래스), 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리아크릴아미드, 세라믹 입자 및 상기 임의의 물질의 유도체가 포함된다.
"양이온 교환 수지"라는 용어는 음으로 대전된 고상을 의미하며, 고상 위로 통과하거나 관통하는 수용액 중의 양이온과 교환되는 유리 양이온을 갖는다. 양이온 교환 수지를 형성하는 고상에 부착된 음으로 대전된 리간드는 예를 들어 카르복실레이트 또는 술포네이트일 수 있다. 시판되는 양이온 교환 수지에는 카르복시-메틸-셀룰로오스, 아가로오스에 고정된 술포프로필(SP) (예를 들어, 파마시아(Pharmacia)사의 SP-SEPHAROSE FAST FLOW(등록 상표) 또는 SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE(등록 상표)) 및 아가로오스에 고정된 술포닐 (예를 들어, 파마시아사의 S-SEPHAROSE FAST FLOW(등록 상표))이 있다. "혼합식 이온 교환 수지"란 양이온, 음이온 및 소수성 부분으로 공유결합에 의하여 변형된 고상을 가리킨다. 시판되는 혼합식 이온 교환 수지는 실리카겔 고상 지지체 매트릭스에 부착된, 약한 양이온 교환기, 낮은 농도의 음이온 교환기, 및 소수성 리간드를 포함하는 백커본드 ABX(BAKERBOND ABX)(등록 상표)(미국 뉴저지주 필스버그에 소재한 J.T. Baker 제품)가 있다.
본 명세서에 사용된 "음이온 교환 수지"라는 용어는 양으로 대전된 고상, 예를 들어 4급 아미노기 등의 양으로 대전된 리간드가 하나 이상 부착된 고상을 가리키는 것으로 사용된다. 시판되는 음이온 교환 수지에는 DEAE 셀룰로스, OAE 세파덱스(SEPHADEX)(등록 상표) 및 패스트 Q 세파로오스(FAST Q SEPHAROSE)(등록 상표)(파마시아사)가 있다.
"완충액"은 산-염기 콘쥬게이트 성분의 작용에 의해 pH의 변화를 저지하는용액이다. 예를 들어 완충액의 원하는 pH에 따라 사용할 수 있는 여러 가지 완충액이 문헌 [Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological System, Gueffroy, D., Ed. Calbiochem Corporation (1975)]에 기재되어 있다. 한 실시양태에서는, 완충액의 pH 범위가 약 2 내지 약 9, 별법으로는 약 3 내지 약 8, 별법으로는 약 4 내지 약 7, 별법으로는 약 5 내지 약 7이다. pH를 이 범위로 조절하는 완충액의 무제한적인 예에는 MES, MOPS, MOPSO, 트리스, HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트 및 암모늄 완충액, 및 이 완충액의 조합이 있다.
"로딩 완충액"이란 목적 폴리펩티드 분자 및 1 종 이상의 불순물을 포함하는 조성물을 이온 교환 수지에 로딩하는 데에 사용되는 완충액이다. 로딩 완충액은 목적 폴리펩티드 분자 (및 일반적으로 1 종 이상의 불순물)가 이온 교환 수지에 결합하도록 하는 또는 목적 단백질은 컬럼을 통과해 흐르게 하면서 불순물이 수지에 결합하게 하는 전도도 및(또는) pH를 갖는다.
"중간 완충액"은 목적 폴리펩티드 분자를 용출하기에 앞서 이온 교환 수지로부터 1 종 이상의 불순물을 용출하는 데에 사용된다. 중간 완충액의 전도도 및(또는) pH는, 1 종 이상의 불순물은 이온 교환 수지로부터 용출되나 상당한 양의 목적 폴리펩티드가 용출되지 않게 하는 전도도 및(또는) pH이다.
본 명세서에 사용된 "세정 완충액"이라는 용어는 목적 폴리펩티드 분자를 용출하기에 앞서 이온 교환 수지를 세척 또는 재평형화하는 데에 사용되는 완충액을 의미한다. 편의상 세정 완충액 및 로딩 완충액은 동일할 수도 있으나 그럴 필요가있는 것은 아니다.
"용출 완충액"은 고상으로부터 목적 폴리펩티드를 용출하는 데에 사용된다. 용출 완충액의 전도도 및(또는) pH는 목적 폴리펩티드가 이온 교환 수지로부터 용출되는 전도도 및(또는) pH이다.
"재생 완충액"은 이온 교환 수지를 재생함으로써 이 수지를 재사용할 수 있게 하는 데에 사용될 수 있다. 재생 완충액은 이온 교환 수지로부터 실질적으로 모든 불순물 및 목적 폴리펩티드를 제거하는 데 필요한 전도도 및(또는) pH를 갖는다.
"전도도"라는 용어는 두 전극 사이의 전류를 통하게 하는 수용액의 능력을 의미한다. 용액 내에서는 이온 운반에 의해 전류가 흐른다. 따라서, 수용액 중 존재하는 이온량을 증가시키면, 용액은 더 높은 전도도를 갖게 될 것이다. 전도도의 측정 단위는 mS/cm (milliSeimens per centimeter)이며, 오리온 (Orion) 등이 시판하는 전도도 측정기를 사용하여 측정할 수 있다. 용액의 이온 농도를 변화시킴으로써 용액의 전도도를 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 원하는 전도도를 얻기 위해 용액 중 완충제의 농도 및(또는) 염(예를 들어, NaCl 또는 KCl)의 농도를 변화시킬 수 있다. 바람직하게는, 하기 실시예와 같이 각종 완충액의 염 농도를 변경하여 원하는 전도도를 얻을 수 있다.
폴리펩티드의 "pI" 또는 "등전점"은 폴리펩티드의 양전하가 그의 음전하와 균형을 이루는 pH를 의미한다. pI는 폴리펩티드의 아미노산 잔기 또는 폴리펩티드에 부착된 탄수화물의 시알산 잔기의 순 전하로부터 계산하거나 또는 등전 초점화(isoelectric focusing)에 의하여 결정할 수 있다.
이온 교환 물질에 분자를 "결합시킴"은 적절한 조건 (pH/전도도)하에 이온 교환 물질에 분자를 노출시킴으로써 분자와 이온 교환 물질의 대전된 기 또는 기들 사이의 이온 상호작용에 의해 분자가 이온 교환 물질 내 또는 이온 교환 물질 상에 가역적으로 고정되는 것을 의미한다.
이온 교환 물질을 "세척하는 것"은 적절한 완충액이 이온 교환 물질을 관통하거나 위로 통과하게 하는 것을 의미한다.
이온 교환 물질로부터 분자 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 불순물)를 "용출시킴"은 이온 교환 물질을 둘러싸는 완충액의 이온 농도를 변화시켜 이온 교환 물질의 대전된 부위에 대해 완충액이 분자와 경합함으로써 이온 교환 물질로부터 분자를 제거하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용될 때 "여액 (filtrate)"이란 여과막을 통과하는 샘플의 일부를 가리킨다.
본 명세서에 사용될 때, "보유액 (retentate)"이란 여과막에 의해 실질적으로 보유되는 샘플의 일부를 가리킨다.
"접선 플로우 여과" 또는 "TFF" 또는 "직교류 (crossflow) 여과"란 샘플 혼합물이 막의 상부를 가로질러 순환하는 동안 가해진 압력이 특정 용질 및 작은 분자로 하여금 막을 관통하게 하는 여과 방법을 가리킨다. 전형적으로는 용액이 필터막과 평행하게 흐른다. 막을 가로지르는 압력차로 인해 유체 및 여과가능한 용질은 필터를 관통해 흐른다. 이는 연속 흐름 공정으로서 수행되는데, 필터를 관통하는 유체가 별개의 회로 내로 계속적으로 유인되면서 용액이 막 위로 반복적으로 통과하기 때문이다.
"고성능 접선 플로우 여과" 또는 "HPTFF"는 플럭스 대 막횡단 압력 곡선에서 막횡단 압력의 5 % 내지 10 % 사이의 플럭스로 수행되는 TFF를 가리킨다(예를 들어 Reis, R.의 미국 특허 제5,256,694호, 미국 특허 제4,490,937호 및 미국 특허 제6,054,051호 참조).
본 명세서에 사용될 때 "용균물 불순물"이란 원하는 DNA 플라스미드가 포함된 혼합물 중의 모든 원치않는 구성성분을 가리키며 그러한 성분으로는 염색체 DNA, 숙주 단백질, 세포 파쇄물, 분비된 숙주 세포 단백질, 예컨대, 세포막 파쇄물, 탄수화물, 작은 분해된 뉴클레오티드, 숙주 RNA, 리포폴리사카라이드 등이 있다.
"셀룰로오스 막"이란 셀룰로오스 중합체를 가리키는데, 여기서 셀룰로오스란 D-글루코오스의 반복 단위이다. 글루코오스 단량체의 1차 알코올기는 그 대전된 화합물이 공유결합하는 막 상에 반응성 물질을 제공한다.
"CRC 막"은 셀룰로오스를 미세구멍 기판 상에서 캐스팅하여 평균 구멍 크기를 조절하고 셀룰로오스 시트 중의 결함의 수를 제한함으로써 제조된 합성품 재생 셀룰로오스 막을 가리킨다.
"대전된 화합물"이란 단백질의 혼합물로부터 단백질을 분리하는 데 사용되는 조건하에서 양전하 또는 음전하를 갖는 부분을 포함하는, 여과막에 연결되는 화합물을 가리킨다. 본 발명에 따르면, 대전된 화합물은 막과 대전된 부분 사이의 링커 암 (arm)을 추가로 포함하여, 대전된 화합물이 막의 표면으로부터 돌출되게 할 수 있다. 대전된 화합물이 구멍의 표면으로부터 구멍의 내강 (lumen) 내로 돌출된 경우, 대전된 화합물은 구멍의 효과적인 크기를 변경하고 막의 구멍 크기 분포를 변경한다.
"반응성의 대전된 화합물"은 막에 연결되기 전의 대전된 화합물이어서, 반응성의 대전된 화합물이 막-반응성의 대전된 화합물 반응을 촉진하는 반응성 부분을 여전히 보유하는 것을 가리킨다. 예를 들면, 대전된 화합물이 셀룰로오스 막에 공유결합에 의해 결합된 프로필 트리메틸 암모늄 이온인 경우, 반응성의 대전된 화합물은 브로모프로필 트리메틸 암모늄 브로마이드일 수 있다. 공유결합은 셀룰로오스 매트릭스의 1차 알코올에 의하여 알킬 브로민의 친핵성 대체를 수반한다.
"링커 암"은 여과막 표면 상의 반응성기와 반응하거나 반응한 부분과 대전된 부분 사이의 대전된 화합물 분자의 부분을 지칭한다. 바람직하게는 링커 암이 원자 또는 분자 서브유닛의 쇄이며, 이 쇄는 대전된 화합물을 막에 공유결합으로 연결하는 데에 사용되는 반응 조건에 대해 불활성이며, 추가로 단백질 분리 동안 사용된 수성 조건에 대해서도 불활성이다. 링커는 탄소 원자 1 내지 20 개의 알킬쇄, 사카라이드 부분 (예를 들면 리보오스 및 데옥시리보오스 등) 1 내지 15 개의 탄수화물 쇄, 사카라이스 부분 1 내지 15 개의 덱스트란 쇄, 아미노산 1 내지 25 개의 아미노산 쇄 및 그외 반복단위 1 내지 25 개의 중합체 (예컨대, 막 자체를 제조할 때 사용되는 것들)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 대전된 화합물이 링커 암으로서 아미노산 쇄를 포함하고 대전된 부분이 쇄의 말단 아미노산인 경우, 말단 아미노산의 측쇄는 대전된 측쇄인 것이 바람직하다.
"시빙 (Sieving)"이란 여액 (막의 다운스트림) 중의 특정 용질의 농도의 공급 용액 (막의 업스트림)에서 동일 용질의 농도에 대한 비율을 가리킨다(Zeman and Zydney, 앞의 책, p. 308 참조). 일반적으로 높은 시빙 값은 용질이 막을 쉽게 통과함을 암시하며, 낮은 시빙 값은 용질이 막에 의해 대량 보유됨을 의미한다. 막의 업스트림에서 용질을 보유할 필요가 있는 경우, 감소된 시빙 계수가 바람직하다.
"투과도"는 여과 속도를 막을 가로지르는 총 압력 하락으로 나눈 것이다. 따라서 투과도는 막 저항성과 반대이다. 막 투과도는 구멍 크기 분포, 다공성 (구멍 밀도), 막 두께, 및 용매 점성에 의해 우선적으로 결정된다. 일반적으로 투과도가 증가함에 따라서 시빙도 증가한다. 시빙이 막에 대전된 화합물을 첨가함으로 인해 개선된 경우, 이 시빙 개선은 대전된 막과 투과도가 실질적으로 동일하지만 대전된 화합물은 없는 막과 비교한 개선이다. 따라서, 단백질 등의 대전된 용질이 유사-대전된 막에 의하여 보유되기 때문에 시빙의 감소가 그 개선인 경우, 시빙은 필적할만한 또는 실질적으로 동일한 투과도에서의 감소이다. 결과적으로 여과의 속도가 유지되면서도 막의 선택도는 개선된다.
"구멍 크기 분포"는 기본적으로 이론 반지름 r에 가까운 실제 반지름 R을 갖는 구멍의 수를 가리키며, 가능성 밀도 함수로 표현된다(Zeman, L.J. and Zydney, A.L., 앞의 책, p299-301 참조). 실제 구멍 반지름의 표준 편차가 증가할수록 구멍 크기 분포는 증가한다. 구멍 크기 분포가 좁으면 이론치로부터의 구멍의 표준편차가 감소된다. 이는 예를 들면 대전된 화합물을 대전된 막의 큰 구멍 내로 첨가함으로써 큰 구멍 일부의 크기가 감소되는 때에 얻어진다. 액체-액체 구멍 침입의 원리는 구멍 크기 분포를 측정하는 데에 유용하다(R. van Reis and A.L. Zydney, 앞의 책, p. 2201 참조). 이 원리에 따르면, 황산염 및 폴리(에틸렌 글리콜)의 용액 등 고도의 혼화성 액체 둘을 혼합을 통해 접촉시키면 평형 분할에 도달한다. 시험할 막을 그 액체들 중 하나로 적셔서 모든 구멍을 채운다. 공급 채널을 배수한 후, 제2 유체를 그 계내로 도입한다. 제2 유체에 의하여 제1 유체를 그 후 구멍 밖으로 대체해 내고, 유속은 막횡단 압력의 함수로서 측정한다. 얻은 데이타는 구멍 크기 분포에 대한 정보를 제공하며 명목상 분자량 컷오프와 상관관계가 있을 수 있다(R. van Reis and A.L. Zydney, 앞의 책, p. 2201 참조).
막 또는 단백질 전하를 가리킬 때 "순 전하"란, 두드러지게 양전하 또는 음전하인 것을 의미하지만 달리 언급이 없다면 막 또는 단백질 상의 양전하의 수 대 음전하 수에 대한 특정한 값을 지칭하는 것은 아니다. 이와 유사하게, "유사 전하" 및 "동일 전하"는 소정의 양전하 또는 음전하를 갖는 단백질을 소정의 양전하 또는 음전하를 갖는 다른 단백질 또는 막과 비교하는 상황을 가리킨다.
"치료"는 치료 및 예방 또는 방어 조치를 모두 의미한다. 치료해야 하는 대상에는 이미 장애가 있는 대상 뿐만 아니라 질환을 예방해야 하는 대상이 포함된다.
"장애"란 본 명세서에 기재된 바와 같이 정제된 폴리펩티드로 처리하면 이로울 수 있는 어떤 상태를 의미한다. 이러한 장애에는 포유류가 해당 장애에 걸리기쉽게 하는 병적 상태를 비롯한 만성 및 급성 장애 또는 질병이 포함된다.
본 명세서에 사용된 "표지 (label)"라는 용어는 폴리펩티드에 직접 또는 간접적으로 접합되는 검출용 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체로 검출할 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지) 또는 효소 표지의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
나. 본 발명을 수행하는 방식
1. 단백질 정제
단백질 기제 의약품의 제조자는 지극히 엄격한 순도 요건을 비롯하여 엄격한 규제 표준을 준수해야 한다. 안정성을 보장하기 위하여 식품의약국 (FDA) 등의 규제기관은 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 것을 포함하여 단백질 기제 의약품이 숙주 세포 단백질, 바이러스, DNA, 내독소, 응집물, 단편, 및 재조합 단백질의 변이체 등의 불순물이 실질적으로 없어야 함을 요구한다. 여러 가지 단백질 정제 프로토콜을 사용할 수 있고 제약 산업에서 널리 사용되고 있으나, 이들은 요구된 순도를 달성하기 위하여 통상적으로, 항체 정제의 경우 단백질 A 정제 등 친화성 정제를 포함한다. 본 명세서에서 상술한 바와 같이, 단백질 A 친화성 정체는 99.5 % 이상의 불순물을 제거하나, 이러한 이점은 비싼 값의 대가이다. 단백질 A는 비친화성 매질의 가격보다 상당히 비싸고 단백질 A-기초 정제 방법은 종종 수지 안정성, 세정능 및 수명, 리간드 누출, 및 정제된 생성물을 오염시키는 단백질 A 잔기의 잠재적 면역원성에 수반되는 문제를 유발한다.
본 발명은 친화성 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는 프로토콜을 통해 단백질, 특히 재조합 단백질을 정제하는 것에 관련된다. 더 구체적으로는, 본 발명은 친화성 크로마토그래피를 포함하지 않는 단계를 통해 정제된 단백질을 사람 치료에 직접 사용하는 것이 가능한 정도로, 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는 (재조합) 단백질을 정제하는 방법을 제공함으로써, 고가의 친화성 크로마토그래피 단계 뿐만 아니라 치료 단백질의 제제화 및 농축에 자주 요구되는 최종 한외여과 투석여과(diafiltration)를 제거한다.
본 발명은 친화성 크로마토그래피를 사용하지 않는 정제 체계에 의하여, 친화성 크로마토그래피 단계를 포함하는 방법과 동일한 정도로, 숙주 세포 단백질을 함유하는 혼합물로부터 재조합 단백질이 정제될 수 있다는 것을 보여주는 실험적 발견을 기초로 한다. 특히 비친화성 크로마토그래피 2 단계에 이어서 마지막 단계로서 고성능 접선 플로우 여과(HPTFF)를 포함하는 3 단계 비친화성 정제 방법으로, 숙주 세포 단백질 불순물을 100 ppm 미만의 양으로 포함하는 고순도 생성물을 얻을 수 있다는 점이 발견되었다.
본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 정제될 단백질은 일반적으로 재조합 기술을 사용하여 제조된다. 재조합 단백질을 제조하는 방법은 예를 들면, 언급함으로써 본 명세서에 구체적으로 도입되는 미국 특허 제5,534,615호 및 제4,816,567호에 기재되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 목적 단백질은 CHO 세포에서 생산된다(국제특허공개 제WO 94/11026호 참조). 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 정제될 수 있는 단백질의 예는 상술하였다.
재조합 기술을 사용할 때, 단백질은 세포내에, 원형질막 주위 공간에서 생성될 수 있거나 직접 배지 내로 분비될 수 있다. 단백질이 세포내로 생성되면, 제1 단계로서 숙주 세포든 용균된 단편이든 입자형 파쇄물을 원심분리 또는 여과 등에 의해 제거한다. 단백질이 배지 내로 분비되는 경우, 재조합 숙주 세포는 접선 플로우 여과 등에 의해 세포 배양 배지로부터 분리될 수 있다.
목적 단백질을 포함하는 혼합물이 일단 얻어지면, 세포에 의해 생성된 다른 단백질과 목적 단백질의 분리는 통상적으로 상이한 크로마토그래피 기술을 병용하여 수행한다. 이들 기술은 단백질 혼합물을 이들의 전하, 소수성 정도 또는 크기에 기초하여 분리한다. 이들 기술에 적용할 수 있는 여러 상이한 크로마토그래피 수지가 있기 때문에, 정제 체계를 관련된 특정 단백질에 정확히 맞출 수 있다. 이들 각 분리 방법의 본질은, 단백질들을 상이한 속도로 긴 컬럼 아래쪽으로 이동하게 해서 단백질들이 컬럼의 더 아래쪽으로 통과할수록 물리적 간격이 증가하게 하거나, 단백질들이 분리 매질에 선택적으로 접착되게 한 후 상이한 완충액에 의해 차별적으로 용출하는 것이다. 일정한 경우, 원하는 단백질은 불순물이 컬럼에 특이적으로 접착하고 목적 단백질은 접착하지 않을 때, 즉 목적 단백질은 통과액 중에 존재할 때 분리된다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 단백질은 하나 또는 둘의 비친화성 정제 단계 이후에 HPTFF에 의하여 100 ppm 미만의 숙주 세포 단백질 불순물이 존재함을 특징으로 하는 정도로 정제될 수 있다. 비친화성 정제 단계는 비친화성 크로마토그래피에 기초할 수 있거나 또는 크로마토그래피외 정제 기술을 포함할 수 있다.
예시적인 비친화성 크로마토그래피 정제 단계로는 히드록시아파티트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 및 겔 여과, 양이온 교환 (예를 들면, SP-세파로오스) 크로마토그래피, 음이온 교환 (예를 들면, Q-세파오로스) 크로마토그래피, 혼합식 크로마토그래피(예를 들면, ABx) 및 소수성 전하 유도 크로마토그래피가 있다.
예시적인 비친화성 크로마토그래피외 정제 단계는 투석, 황산암모늄 침전 및 에탄올 침전이 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 두 개의 크로마토그래피 비친화성 분리 단계에 이어서 HPTFF, 임의로는 대전된 막 HPTFF를 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태에서 크로마토그래피 비친화성 분리 단계는 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 혼합식 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 및 소수성 전하 유도 크로마토그래피(HCI) 중에서 선택된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 정제 프로토콜은 (1) 양이온 교환 크로마토그래피, (2) 음이온 교환 크로마토그래피, 및 (3) HPTFF 단계를 이 순서로 포함하며, 어떠한 친화성 정제 단계도 없고, 바람직하게는 어떤 종류의 추가적 정제 단계도 없다.
이온 교환 크로마토그래피는 단백질 정제를 위해 일반적으로 사용되는 크로마토그래피 기술이다. 이온 교환 크로마토그래피에서 용질 표면 상의 대전된 패치는 만일 주변 완충액의 이온 세기가 낮다면, 크로마토그래피 매트릭스에 부착된 반대 전하에 의해 이끌린다. 용출은 일반적으로 완충액의 이온 세기 (즉, 전도도)를 증가시켜서 이온 교환 매트릭스의 대전된 부위에 대해 용질과 경쟁하게 함으로써이루어진다. 용질을 용출하는 또다른 방법은 pH를 변화시켜서 용질의 전하를 변경하는 것이다. 전도도 또는 pH의 변화는 점진적 (구배 용출) 또는 단계적 (단계 용출)일 수 있다. 과거에는 이들 변화는 진행성 (progressive)이었는데, 즉, pH 또는 전도도는 한 방향으로 증가 또는 감소한다.
재조합 숙주 세포에서 유래한 불순한 제제는 평형 완충액과 동일한 것일 수 있는 로딩 완충액을 사용하여 평형화된 크로마토그래피 고상 매트릭스 상에 로딩한다. 이 불순한 제제가 고상을 통하여 흐를 때, 단백질 및 그외 불순물(예컨대, 그 단백질이 CHO 세포에서 생성된 경우 차이니스 햄스터 난소 단백질 CHOP)은 고상에 차별적으로 결합함으로써 단백질이 크로마토그래피 컬럼을 통과할 때 분리가 일어난다.
완충액 조성물 중의 완충액, 염 및(또는) 다른 화합물의 양 및 종류는 합해진 양이 단백질 불순물(들)을 목적 단백질로부터 차별적으로 용출하여, 목적 단백질이 불순물에 비해 보유될 수 있거나, 불순물이 목적 단백질에 비해 보유되게 하는 것이다. 본 발명을 실행하는 데에 유용한 완충염 및 그외 첨가물로는 아세테이트, 시트레이트, 히스티딘, 포스페이트, 아세트산암모늄, MES, CHAPS, MOPSO, 트리스 등의 완충염, 염화나트륨 및 염화칼륨 등 완충액 이온 세기를 조절하기 위한 여, 및 아미노산 (글리신 및 히스티딘 등), 차오트롭 (우레아 등), 알코올 (에탄올, 만니톨, 글리세롤 및 벤질 알코올 등), 세정제 (트윈 (등록 상표) 및 C12E8 등) 및 당류 (수크로오스, 만니톨, 말토오스, 트레할로오스, 글루코오스 및 프럭토오스 등) 등의 그외 첨가제가 있으나, 이것으로 한정되지는 않는다. 이들 완충액및 첨가제 중 임의의 것과 사용되는 농도는 실행되는 크로마토그래피의 유형에 따라 달라질 수 있으며, 완충액 및 첨가제 조성 및 농도는 표준적 방법에 의하여 쉽게 결정한다.
용출을 위한 pH 또는 pH 범위는 목적 단백질 및 실행되는 크로마토그래피 및 HPTFF의 유형에 따라서 결정될 것이나, 용출 완충액의 pH는 약 2 내지 약 9, 별법으로는 약 3 내지 약 8, 약 4 내지 약 8, 또는 약 5 내지 약 8일 수 있다. 로딩, 세척, 용출 완충액에 적절한 pH 범위는 목적 단백질이 활성 형태로 회수되도록 표준적 방법에 의하여 쉽게 결정된다. 이런 목적을 위한 용출 완충액의 예는 시트레이트 또는 아세테이트 완충액이 있다.
로딩, 세척 또는 용출 완충액을 위한 이온 세기 또는 이온 세기 범위는 실행되는 HPTFF 방법을 위한 투석여과 완충액 및 실행되는 크로마토그래피의 유형 및 목적 단백질에 따라 결정될 것이지만, 완충액의 이온 세기 (예를 들면 전도도로서 측정됨)는 약 0.2 내지 20 mS/cm, 별법으로는 약 0.2 내지 8 mS/cm, 약 0.2 내지 6 mS/cm, 약 0.2 내지 4 mS/cm, 약 0.2 내지 2 mS/cm, 또는 약 1 내지 2 mS/cm일 수 있다. 완충액을 위한 적절한 이온 세기 범위는 목적 단백질이 활성 형태로 회수되도록 표준적 방법에 의해 쉽게 결정된다.
양이온 교환 크로마토그래피 단계는 통상적으로, 숙주 세포 단백질(예를 들어 단백질이 CHO 세포에서 생성된다면 CHOP) 및 변이체, 분해 생성물, 및 정제될 단백질의 응집물의 적어도 일부를 제거한다. 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 남아있는 숙주 세포 단백질(예를 들면, CHOP), 변이체, 분해 생성물 및 단백질의응집물, 및 또한 내독소 및 DNA 불순물로부터 단백질을 추가로 정제한다.
비친화성 크로마토그래피 또는 그외 비친화성 정제에 이어서, 용출된 목적 단백질을 HPTFF 처리한다. HPTFF는 크기 및 전하 둘 모두를 기준으로 용질을 선택적으로 분리하는 2차원 유닛 작용이다. HPTFF는 여러 가지 최근 개발을 이용하여 효과적인 단백질 정제에 필요한 고선택도를 제공할 수 있다. 우선, 전통적인 막 방법과는 달리, HPTFF는 오염을 최소화하며 농도 분극화를 이용하고 분리 모듈 전체에 걸쳐 거의 균일한 막횡단 압력 및 플럭스를 유지함으로써 분리를 최적화하는 조건하에서 압력 의존적 체제로 작동한다(van Reis, R., 미국 특허 제5,256,694호, 제5,490,937호 및 제6,054,051호, 앞의 문헌). 분리 선택도는 여액 완충액 pH 및 이온 세기를 조절하여 혼합물 중의 상이한 종류의 효과적 부피의 차이를 최대화함으로써 개선시킬 수 있다(van Reis et al. (2001), 앞의 문헌; van Reis et al. (1997), 앞의 문헌, 및 Saksena, S. and Zydney, A. L., Biotechnol. Bioeng. 43: 960-968 (1994)). 또한, 막의 전기 전하는 유사한 전하를 갖는 모든 종류의 정전기적 배척을 증가시키도록 변형될 수 있다. 따라서, 양으로 대전된 막은 유사한 구멍 크기의 음으로 대전된 막보다 더 큰 정도로 양으로 대전된 단백질을 거부할 것이다(van Reis et al. (2001), 앞의 문헌, Nakao, S. et al., Desalination 70: 191-205 (1988), 및 van Reis et al., J. Membr. Sci. 159: 133-142 (1999)). 또한, HPTFF에서 단백질 분리는, 여액이 막을 통하여 제거될 때 공급물 용기로 새로운 완충액을 동시에 첨가함으로써 보유액 밖으로 불순물(또는 생성물)이 세척되어 나오는 투석여과식을 사용하여 수행된다. 이 완충액 첨가는 분리 동안 내내 보유액 중의 적절한 단백질 농도를 유지한다. 투석여과는 또한 여액 중의 불순물의 연속적인 제거로 인하여, 막 선택도보다 큰, 보유액 중에 수집된 생성물에 대한 정제율을 얻는 것이 가능하다(van Reis et al. (2001), 앞의 문헌; van Reis, R. and Saksena, S., J. Membr. Sci. 129:19-29 (1997)).
단백질 분리에 유용한 HPTFF 여과막은 산업규모 또는 실험실 규모의 한외여과 (UF)용 합성 (흔히 중합성) 선택적 장벽 (selective barrier)이다(Leos J. Zeman and Andrew L. Zydney, "Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications," 1996, Marcel Dekker, Inc., p.3 참조). 이 방법에서는 단백질 등의 특정한 공급물 스트림 구성성분이 막의 구멍을 통과해 여액 내로 들어가는 반면, 나머지인 통상 더 큰 단백질 또는 구성성분들은 막에 의해 보유액 중에 보유된다(Zeman and Zydney, 앞의 문헌, p.3 참조).
단백질 한외여과는 단백질 용액의 농축 및 정제에 사용되는 압력-구동 막 공정이다(Robert van Reis and Andrew L. Zydney, "Protein Ultrafiltration" in Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation, M.C. Flickinger and S.W. Drew, eds., John Wiley & Sons, Inc. (1999), p. 2197). UF 막은 전형적으로 평균 구멍 크기가 10 내지 500 Å인데, 이는 역삼투압막과 미세여과막의 평균 구멍 크기 사이이다. 한외여과는 소정의 압력 구동력에 대응하여 막을 가로지르는 상이한 구성성분의 여과 속도의 차이에 기초하여 용질을 분리한다(R. van Reis and A.L. Zydney, 앞의 문헌, p. 2197). 용질 여과 속도 및 이에 따른 막 선택도는 열동력학적 및 수동력학적 상호작용 양자에 의하여 결정된다(R. van Reis and A.L. Zydney, 앞의 문헌, p. 2197). 한외여과는 자주, 단백질 농축, 완충액 교환 및 탈염, 단백질 정제, 바이러스 제거 및 청정을 위한 다운스트림 가공에 사용된다(R. van Reis and A.L. Zydney, 앞의 문헌, p. 2197).
HPTFF를 사용하면 원하는 단백질을 상대적 여과 속도에 따라서 보유액 또는 여역 중에 수집한다(R. van Reis and A.L. Zydney, 앞의 문헌, p. 2197). HPTFF는 상기한 반투과성 막을 사용하여 유사한 크기의 단백질을 분리하는 데에 유용하다(예를 들면, R. van Reis, et al., Biotech. Bioeng. 56: 71-82 (1997) 및 R. van Reis et al., J. Memb. Sci. 159: 133-142 (1999) 참조). HPTFF는 오염을 최소화하고 농도 분극화의 효과를 이용하기 위하여 여액 플럭스 및 디바이스 유체 역학을 조절함으로써 고선택도를 달성한다(R. van Reis et al., J. Memb. Sci. 159:133-142 (1999)).
HPTFF의 성능은 선택도와 산출율이라는 두 개의 파라미터로 평가할 수 있으며, 이 파라미터는 공정 수율과 정제율을 최적화하는 데 사용된다(van Reis and Saksena, 앞의 문헌, 1997, van Reis et al., 앞의 문헌, 1999). 선택도는 투과성 용질 및 보유된 용질의 관찰된 시빙 계수의 비율로서 정의된다. 현재의 HPTFF 응용은 목적 단백질의 보유 및 HCP 또는 불순물의 시빙에 기초하고 있으므로, 선택도는 수학식 1로 설명된다.
상기 식에서 시빙 계수는 수학식 2의 무차원(dimensionless) 비율로서 정의된다.
식 중 C여액및 C공급물은 여액 및 공급라인 중의 용질 농도이다.
산출율은 투과성 용질과 보유된 용질 사이의 시빙 차이와 여액 플럭스의 곱으로 정의된다.
다른 계산된 방법 파라미터는 일정한 부피 투석여과 동안의 보유액 수율이다. 이 수율은 수학식 4와 같이 표현된다.
N은 투석부피(diavolume)의 수와 같고, S는 고려된 용질의 시빙과 같다.
HPTFF 여과 단계에 대한 더 자세한 사항은 아래 실시예에서 제공될 것이다.
본 발명의 방법에 의한 단백질 정제의 바람직한 측정은 숙주 세포 단백질 불순물, 예를 들면 재조합 단백질이 CHO 세포에서 생산되는 경우 CHOP 불순물의 측정이다. 정제된 단백질은 숙주 세포 단백질, 예를 들면, CHOP를 100 pm 미만, 더 바람직하게는 90 pm 미만, 80 pm 미만, 70 pm 미만, 60 pm 미만, 50 pm 미만, 40 pm 미만, 30 pm 미만, 20 pm 미만, 10 pm 미만, 5 pm 미만 또는 3 pm 미만을 포함해야 한다(여기서 ppm 값은 상기 정의된 바와 같이 계산됨).
이렇게 회수된 단백질은 제약상 허용되는 담체 중에 제제화되어 그러한 분자에 공지된 여러 진단, 치료 또는 그외의 용도로 사용된다.
2.항체
본 발명에 따라 정제될 바람직한 단백질은 항체이다. 특히, 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 재조합 인간화 단일클론 항체 (RhuMAb)의 정제를 위하여, RhuMAb를 발현하는 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포로부터 유래한, 상태조절된 (conditioned) 수거한 세포 배양액 (HCCF)을 처음의 양이온 교환 컬럼 (SP-세파로오스 패스트 플로우 수지, Amersham Biosciences 제품; (S))으로 로딩하였다. S 컬럼으로부터 수집한 물질인 S 푸울(pool)을 SP-세파로오스 컬럼으로부터 수집하여 상태조절한 후, 음이온 교환 (Q-세파로오스 패스트 플로우 수지, Amersham Biosciences; (Q))으로 로딩하였다. (각기 Q 푸울로서, Q 컬럼과 같은) 음이온 교환 컬럼으로부터 수집되는 물질을 HPTFF로 추가 정제하였다.
본 발명의 범위 내에서 항체는 트라스투쯔맙 (Trastuzumab, HERCEPTIN(등록 상표))을 포함하는 항-HER2 항체 (Carter etal., Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), 미국 특허 제5,725,856호), 미국 특허 제5,736,137호에서와 같은 키메라 항-CD20 "C2B8" (RITUXAN(등록 상표)), 미국 특허 제5,721,108,Bl호에서와 같은 2H7 항체의 키메라 또는 인간화 변이체 또는 토시투맘맙 (Tositumomab, BEXXAR(등록 상표)) 등의 항-CD20 항체; 항-IL-8 (St John et aL, Chest, 103: 932 (1993), 및 국제특허공개 제WO95/23865호); 인간화 항-VEGF 항체 huA4.6.1 아바스틴(AVASTIN(등록 상표)) (Kim et al, Growth Factors, 7: 53-64 (1992), 국제특허공개 제WO 96/30046호, 및 제WO 98/45331호 (1998년 10월 15일 공개))와 같은 인간화 및(또는) 친화성 성숙된 항-VEGF 항체를 비롯한 항-VEGF 항체; 항-PSCA 항체 (WO 01/40309); S2C6 및 이의 인간화 변이체 (WO 00/75348)를 비롯한 항-CD40 항체; 항-CD11a (미국 특허 제5,622,700호, 국제특허공개 제WO 98/23761호, Steppe et al., Transplant Intl. 4: 3-7 (1991), 및 Hourmant et al., Transplantation 58: 377-380 (1994)); 항-IgE (Presta et al., J Immunol 151: 2623-2632 (1993), 및 국제특허공개 제WO 95/19181호); 항-CD18 (미국 특허 제5,622,700호 (1997년 4월 22일 발행), 또는 국제특허공개 제WO97/26912호 (1997년 7월 31일 공개)); 항-IgE (E25, E26 및 E27 포함, 미국 특허 제5,714,338호 (1998년 2월 3일 발행) 또는 미국 특허 제5,091,313호 (1992년 2월 25일 발행), 국제특허공개 제WO 93/04173호 (1993년 3월 4일 공개) 또는 국제특허출원 제PCT/US98/13410호 (1998년 6월 30일 출원), 미국 특허 제5,714,338호); 항-Apo-2 수용체 항체 (WO 98/51793, 1998년 11월 19일 공개); cA2 (REMICADE(등록 상표)), CDP571 및 MAK-195를 비롯한 항-TNF-α 항체 (미국 특허 제5,672,347호 (1997년 9월 30일 발행), Lorenz et al. JImmunol. 156 (4): 1646-1653 (1996), 및 Dhainaut et al. Crit. Care Med. 23 (9): 1461-1469 (1995)); 항-조직 인자(TF) (유럽특허 제0 420 937 Bl호, 1994년 11월 9일 허여); 항-인간 α4β7 인테그린 (WO 98/06248, 1998년 2월 19일 공개), 항-EGFR (1996년 12월 19일 공개된 WO 96/40210에서와 같은 키메라 또는 인간화 225 항체), OKT3 등의 항-CD3 항체 (미국 특허 제4,515,893호, 1985년 5월 7일 발행), CHI-621 (SIMULECT(등록 상표)) 및 (ZENAPAX(등록 상표)) 등의 항-tac 항체또는 항-CD25 (미국 특허 제5,693,762호, 1997년 12월 2일 발행), cM-7412항체 등의 항-CD4 항체 (Choy et al. Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996)), CAMPATH-1H 등의 항-CD52 항체 (Riechmann et al.. Nature 332:323-337 (1988)), 문헌 [Graziano et al., J. Immunol. 155 (10):4996-5002 (1995)]에서와 같은 FcγRI에 대해 유도된 M22 항체 등의 항-Fc 수용체 항체, hMN-14 등의 항-발암배 항원(CEA) 항체 (Sharkey et al., Cancer Res. 55 (23Suppl): 5935s-5945s (1995); huBrE-3, hu-Mc 3 및 CHL6을 비롯한 유방 표피세포에 대해 유도된 항체 (Ceriani et al. Cancer Res. 55(23):5852s-5856s (1995) 및 Richman et al., Cancer Res. 55(23 Supp):5916s-5920s (1995)); C242 등의 결장 암종 세포에 결합하는 항체 (Litton et al., Eur J. Immunol. 26(1):1-9 (1996)); 항-CD38 항체, 예를 들면 AT 13/5 (Ellis et al. J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)); 항-CD33 항체, 예컨대 Hu M195 (Jurcic et al., Cancer Res. 55 (23 Suppl):5908s-5910s (1995) 및 CMA-676 또는 CDP771; LL2 또는 림포사이드 (LymphoCide) 등의 항-CD22 항체 (Juweid et al., Cancer Res 55 (23 Suppl):5899s-5907s (1995)), 17-1A (PANOREX(등록 상표))등의 항-EpCAM 항체; abciximab 또는 c7E3 Fab (REOPRO(등록 상표)) 등의 항-GpIIb/IIIa 항체; MEDI-493 (SYNAGIS(등록 상표)) 등의 항-RSV 항체; 프로토비어 (PROTOVIR(등록 상표)) 등의 항-CMV 항체; PRO542 등의 항-HIV 항체; 항-Hep B 항체 오스타비어(OSTAVIR(등록 상표)) 등의 항-간염 항체; 항-CA 125 항체 OvaRex; 항-이디오타입 GD3 에피토프 항체 BEC2; 항-αvβ3 항체 비탁신(VITAXIN(등록 상표)); ch-G250 등의 항-인간 신장 세포 암종 항체; ING-1; 항-인간 17-1A 항체 (3622W94); 항-인간 결장직장 종양 항체 (A33); GD3 강글리오사이드에 대해 유도된 항-인간 흑색종 항체 R24; 항-인간 편평세포 암종 (SF-25); 및 스마트 (Smart) ID10 및 항-HLA DR 항체 온콜림 (Oncolym, Lym-1) 등의 항-인간 백혈구 항원(HLA) 항체가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 여기의 항원에 대한 바람직한 표적 항원은 HER2 수용체, VEGF, IgE, CD20, CD11a, 및 CD40이다.
구체적으로 위에 밝힌 항체외에도, 숙련자라면 목적 항원에 대해 유도된 항체를 예를 들면 후술한 기술을 사용하여 생성할 수 있을 것이다.
(a) 항원 선택 및 제조
본 명세서에서 항체는 목적 항원에 대해 유도된다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고, 질병 또는 장애에 걸린 포유동물에 항체를 투여하면 그 포유동물에게서 치료상 이점을 가져올 것이다. 그러나, 비폴리펩티드 항원(종양 관련 당지질 항원, 미국 특허 제5,091,178호 참조)에 대해 유도된 항체도 고려된다. 항원이 폴리펩티드인 경우, 항원은 막횡단 분자 (예를 들면, 수용체) 또는 성장 인자 등의 리간드일 수 있다. 예시적인 항원으로는 하기 (3)절에기재한 단백질이 있다. 본 발명에 의해 포괄되는 항체에 대한 예시적인 분자 표적으로는 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD34, CD40 등의 CD 단백질; EGF 수용체, HER2, HER3, HER4 수용체 등의 ErbB 수용체족에 속하는 것들; LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 α 또는 β 서브유닛 중 하나를 포함하는 αv/β3 인테그린 등의 세포 부착 분자 (예를 들면, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); VEGF 등의 성장 인자; IgE; 혈액 그룹 항원; flk2/flt3 수용체; 비만(OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C, 또는 본 명세서에 언급된 다른 항원 중 임의의 것이 있다. 위에 열거한 항체가 결합하는 항원은 본 명세서의 범위내에 특히 포함된다.
임의로는 다른 분자에 접합될 수 있는 가용성 항원 또는 그의 단편을 항체를 생성하는 면역원으로 사용할 수 있다. 수용체 등의 막횡단 분자의 경우, 이들의 단편 (예를 들면, 수용체의 세포외 도메인)을 면역원으로 사용할 수 있다. 별법으로는 막횡단 분자를 발현하는 세포가 면역원으로 사용될 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원(예를 들면, 암 세포주)으로부터 유래하거나 막횡단 분자를 발현하께끔 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다.
항체를 제조하는 데에 유용한 다른 항원 및 이의 형태는 당업자에게 명백할 것이다.
(b) 다클론 항체
다클론 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 보조제를 피하(sc) 또는 복강내(ip)로 여러번 주사하여 동물 내에서 유발시킨다. 그 관련 항원을, 면역시키고자 하는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면, 키홀 삿갓조개(keyhole limpet) 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제인자에, 이관능성 작용제 또는 유도화제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통해 접합), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기에서, R 및 R1은 상이한 알킬기임)를 사용하여 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
동물을 예를 들면, 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 접합물(각각 토끼와 마우스에 대해)을 3 부피의 프로인드(Freund's) 완전 보조제와 합하고, 이 용액을 여러 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 접합물 또는 유도체에 대해 면역시킨다. 1개월 후에, 동물을 원래의 양의 1/5 내지 1/10의 프로인드 완전 보조제 중의 펩티드 또는 접합물로 여러 부위에 피하 주사함으로써 재면역시켰다. 7 내지 14 일 후, 동물에게서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 분석하였다. 역가가 정체 (plateau)될 때까지 동물을 재면역시킨다. 바람직하게는, 동일한 항원을 상이한 단백질에, 및(또는) 상이한 가교결합제를 통해 접합시킨 접합물로 동물을 재면역한다. 접합물은 또한 단백질 융합체로서 재조합 세포 배양을 통해 제조할 수 있다. 또한, 명반(alum)과 같은 응집제를 사용하여 면역 반응을 증진시킨다.
(c) 단일클론 항체
단일클론 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]에서 처음 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (미국특허 제4,816,567호)을 이용하여 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적당한 숙주 동물(예를 들면, 햄스터 또는 짧은 꼬리 원숭이)을 상기와 같이 면역시켜, 면역에 사용된 단백질과 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로는, 림프구를 시험관내에서 면역시킬 수 있다. 그 후, 적합한 융합제 (예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜)를 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 만든다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103, (Academic Press, 1986)).
이렇게 제조한 하이브리도마 세포를 바람직하게는 비융합 골수종 모세포의 성장 또는 생존을 억제시키는 1 종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 중에 접종하고 배양한다. 예를 들면, 골수종 모세포가 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하며, 선택된 항체-생산 세포에 의한 높은 수준의 안정한 항체 생산을 유지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 이들 중, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대, 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양로부터 유래된 것, 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type CultureCollection, 미국 매릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 세포주 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 단일클론 항체의 생산용으로 기재되어 있다(Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); 및 Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대해 유도된 단일클론 항체의 생산에 대해 분석하였다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성을 면역침강법에 의해, 또는 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석에 의해 측정하였다.
원하는 특이성, 친화성 및(또는) 활성을 가진 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 동정한 후에, 상기 세포를 제한 희석 방법으로 서브클론화시키고, 표준 방법으로 배양할 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1986). 이러한 목적에 적합한 배양 배지에는, 예를 들면 DMEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 상기 하이브리도마 세포는 동물 내에서 복수 (ascites) 종양으로서 생체내에서 배양할 수 있다.
상기 서브클론에 의해 분비된 단일클론 항체는 단백질 A-세파로스, 히드록시아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 방법에 의해 배양 배지, 복수 액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다. 바람직하게는 본 명세서에 기재한 단백질 A 크로마토그래피방법이 사용된다.
단일클론 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 방법을 이용하여 (예를 들면, 상기 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여) 쉽게 단리되고 서열 분석된다. 상기 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원이다. 일단 단리되면, 이 DNA를 발현 벡터 내로 위치시킨 후, 벡터를 숙주 세포 (예를 들면, 대장균 (E. coli) 세포, 원숭이 (simian) COS 세포, 차이니스 햄스터 난소 (CHO)세포, 또는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체를 합성할 수 있다.
또한 상기 DNA는, 예를 들면 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 서열로 치환함으로써 (미국 특허 제4,816,567호, Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851 (1984)), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드를 코딩하는 서열 전부 또는 일부를 상기 면역글로불린 코딩 서열과 공유결합으로 연결시킴으로써 변형시킬 수 있다.
전형적으로, 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명 항체의 불변 도메인을 대신하거나, 또는 항체에서 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인을 대신하여, 항원에 대해 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체가 생성된다.
다른 실시양태에서는, 단일클론 항체를 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348: 551-554 (1990)]에 기술된 기술을 이용하여 생성된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)]에서는 파아지 라이브러리를 사용하는 뮤린 및 인간 항체의 단리를 각각 기술하였다. 이후의 문헌에서는 체인 서플링(chain shuffling)에 의한 고친화도(nM 범위)의 인간 항체의 생산 (Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)) 뿐만 아니라, 매우 큰 파아지 라이브러리의 제조 전략으로서의 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993))을 기술하였다. 따라서, 이들 기법은 단일클론 항체의 단리를 위한 전통적인 하이브리도마 기술에 대한 가능한 대안이다.
(d) 인간화 항체 및 인간 항체
인간화 항체는 인간 이외의 공급원으로부터 인간화 항체 내로 도입된 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비인간 아미노산 잔기들은 종종 '수입' 잔기로 불리며, 이것은 전형적으로 '수입' 가변 도메인으로부터 얻어진 것이다. 인간화 과정은 본질적으로 윈터 (Winter)와 공동연구자들의 방법에 따라서 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 이에 상응하는 인간 항체 서열로 치환함으로써 수행될 수 있다(Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986), Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988), Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)). 따라서, 이러한 '인간화' 항체는 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이며, 여기서 실질적으로, 완전한 인간 가변 도메인보다 적은 부분이 인간 이외의 종으로부터의 상응하는 서열로 치환되어 있다. 실제로는, 인간화 항체는 전형적으로 몇몇 CDR 잔기들 및 아마도 몇몇 FR 잔기들이 설치류 항체의 유사 부위에서 유래한 잔기들로 치환되어 있는 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하는 데에 사용할 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 도메인 모두)의 선택은 항원성을 감소시키기는 데 있어서 매우 중요하다. 소위 "베스트핏 (best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열을 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크(FR)로서 수용한다(Sims et al., J. Immunol, 151: 2296 (1993)). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 몇종의 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151: 2623 (1993)).
항원에 대한 높은 친화도와 그외의 다른 양호한 생물학적 특성을 보유하도록 항체를 인간화시키는 것이 또한 중요하다. 이러한 목적을 이루기 위해서는, 바람직한 방법에 따르면, 인간화 항체를 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 다양한 구상되는 인간화 생성물 및 모서열의 분석 과정에 의해 제조한다. 3차원 면역글로불린 모델이 일반적으로 이용가능하고, 당업계의 숙련자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 배위 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이들 디스플레이를 검사하면 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기들의 유망한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 끼치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성과 같은 원하는 항체 특성을 성취하도록, 수여자 및 수입 서열로부터 FR 잔기를 선택하고 결합시킬 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 끼치는 데 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.
별법으로는, 내인성 면역글로불린 생산이 없는 상태에서 면역시 인간 항체의 완전한 레퍼터리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들면, 마우스)을 제조하는 것이 현재 가능하다. 예를 들면, 키메라 및 생식세포주 돌연변이 마우스에서 항체의 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동종접합 (homozygous) 결실시키면 내인성 항체 생산이 완전히 억제되는 것으로 설명된 바 있다. 인간 생식세포주 면역글로불린 유전자 배열을 그러한 생식세포주 돌연변이 마우스에 전이시키면 항원 공격시에 인간 항체를 생산할 것이다. 예를 들면, 문헌 [Jakobovits et al., Proc, Natl. Acad, Sci. USA, 90: 2551 (1993), Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993), Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993) 및 Duchosal et al., Nature 355:258 (1992)]를 참조한다. 인간 항체는 또한 파아지-디스플레이 라이브러리로부터 유래될 수도 있다(Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Bio., 222: 581-597 (1991), Vaughan et al., Nature Biotech 14:309 (1996)).
(e) 항체 단편
항체 단편을 생산하기 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전형적으로는, 이들단편은 완전한 항체의 단백질분해성 소화를 통해 유래되었다(예를 들면, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]을 참조). 그러나, 이들 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접 제조될 수도 있다. 예를 들면, 항체 단편은 상술한 항체 파아지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 별법으로는, Fab'-SH 단편은 대장균으로부터 직접 회수하고 화학적으로 커플링시켜 F(ab')2단편을 형성할 수 있다(Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). 다른 방법에 따라, F(ab')2단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리시킬 수 있다. 항체 단편을 생산하기 위한 다른 기법은 숙련된 당업자에게 명백할 것이다. 다른 실시양태에서는, 선택된 항체가 단쇄 Fv 단편 (scFv)이다. 국제출원공개 제WO 93/16185호 참조한다.
(v) 다중특이적 항체
다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는다. 이런 분자는 정상적으로는 두 개의 항원에 결합할 뿐이지만(즉, 이중특이적 항체, BsAb), 본 명세서에서 사용될 때 이 표현은 삼중특이적 항체 등 추가의 특이성을 갖는 항체도 포함한다.
이중특이적 항체를 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기초하며, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖고 있다(Millstein et al., Nature305: 537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 상기 하이브리도마 (쿼드로마 (quadroma))는 10개의 상이한 항체 분자 중 단지 1개만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는 그 항체 분자들의 잠재적 혼합물을 생산한다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에서 수행되는 정확한 분자의 정제는 불편하며 생산 수율이 낮다. 유사한 방법이 국제출원공개 제WO 93/08829호 및 (Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659 (1991))에 개시되어 있다.
WO 96/27011에 기재된 다른 방법에 따르면, 재조합 세포 배양물로부터 회수된 이종이량체의 백분율을 최대화하기 위해 항체 분자의 쌍 사이의 경계면을 조작할 수 있다. 바람직한 경계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서는 제1 항체 분자의 경계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄 (예를 들면, 티로신 또는 트립토판)으로 대체한다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 항체 분자의 경계면 상에 큰 측쇄(들)와 크기가 동일하거나 유사한 보정적 공동 (compensatory cavity)이 만들어진다. 이는 동종이량체 등 다른 원치않는 최종 생성물에 비하여 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교결합된 또는 "이종접합" 항체를 포함한다. 예를 들면, 이종접합물 내의 항체 중 하나는 아비딘과 결합되고, 다른 하나는 비오틴과 커플링될 수 있다. 그러한 항체는 예를 들면, 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화하기 위해 (미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (국제 출원공개 제WO 91/00360호, 동 제WO 92/200373호, 및 유럽특허 제EP03089호) 제안되었다. 이종접합 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 공지되어 있고, 많은 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 기술되어 있다.
항체 단편으로 이중특이적 항체를 제조하는 기술도 문헌에 기술되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 이용하여 제조할 수 있다. 문헌[Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에서는 완전한 항체를 단백질 분해에 의해 절단하여 F(ab')2단편을 제조하는 방법을 기술하였다. 이들 단편은 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원되어 인근(vicinal) 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 이어서, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민으로 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정을 위한 제제로서 사용할 수 있다.
최근의 진보로 대장균으로부터 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수가 용이해졌고, 이들 단편은 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]에서는 완전한 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2분자의 생산을 기술하였다. 각각의 Fab' 단편은 대장균으로부터 개별적으로 분비되고, 시험관 내에서 화학 커플링되게 하여 이중특이적 항체를형성한다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대해 인간 세포독성 림프구의 용균 활성을 촉발시킨다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하는 다양한 기술도 설명되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 루이신 지퍼(zippers)를 사용하여 생산되었다(Kostelny et al., J. Immunol., 148(5); 1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터의 루이신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성한 다음, 재산화시켜 항체 이종이량체를 형성하였다. 이 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 기술되어 있는 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적인 메카니즘을 제공하였다. 단편은 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이를 짝지우기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH및 VL도메인은 다른 단편의 상보적인 VL및 VH도메인과 짝을 이루게 되어, 2개의 항원 결합 부위를 형성하게 된다. 단쇄 Fv (sFv)를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 다른 방법도 보고되었다(문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)] 참조). 별법으로는, 항체를 문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일수 있다. 간략하게는, 이들 항체는 한쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한쌍의 탠덤 Fd 세그먼트 (VH-CH1-VH-CH1)를 포함한다. 선형 항체는 이중특이적이거나 단일특이적일 수 있다.
2 이상의 역가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들면, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다(Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)).
3.면역어드헤신
가장 단순하고 가장 똑바른 면역어드헤신 설계는 면역글로불린 중쇄의 힌지 및 Fc 영역과 어드헤신 (예를 들면, 수용체의 세포외 도메인 (ECD))의 결합 도메인을 결합한다. 보통, 본 발명의 면역어드헤신을 제조할 때, 어드헤신의 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 면역글로불린 불변 도메인 서열의 N 말단을 코딩하는 핵산으로 C-말단에 융합시키지만, N-말단 융합체도 가능하다.
전형적으로 이런 융합체에서는 코딩된 키메라 폴리펩티드가 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 적어도 기능상 활성의 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 보유할 것이다. 융합은 불변 도메인의 Fc 부분의 C 말단, 또는 중쇄 CH1의 바로 N-말단 또는 경쇄의 상응하는 영역에서도 이루어진다. 융합이 일어나는 정확한 부위는 중요하지 않다. 특정한 부위가 잘 알려져 있으며, 면역어드헤신의 생물학적 활성, 분비 또는 결합 특성을 최적화하기 위해 선택될 수 있다.
바람직한 실시양태에서는, 어드헤신 서열을 면역글로불린 G1(IgG1)의 Fc 도메인의 N-말단에 융합된다. 전체 중쇄 불변 영역을 어드헤신 서열에 융합할 수 있다. 그러나, 더 바람직하게는 IgG Fc를 화학적으로 정의하는 파파인 절단 부위 (즉, 잔기 216, 중쇄 불변 영역의 제1 잔기를 114번이 되게 함)의 바로 업스트림의 힌지 영역에서 시작하는 서열 또는 다른 면역글로불린의 유사 부위가 융합에 사용된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 어드헤신 아미노산 서열은 IgG 중쇄의 (a) 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 또는 (b) CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인에 융합된다.
이중특이적 면역어드헤신의 경우, 면역어드헤신은 다량체로서, 특히 이종이량체 또는 이종삼량체로서 조립된다. 일반적으로 이런 조립된 면역글로불린은 유닛 구조를 알았을 것이다. 기본적인 4개의 쇄 구조 유닛은 IgG, IgD 및 IgE가 존재하는 형태이다. 4 쇄 유닛은 더 큰 고분자량 면역글로불린에서 반복되며, IgM은 일반적으로 디술피드 결합에 의해 함께 묶여진 4개 기본 유닛의 오량체로서 존재한다. IgA 글로불린 및 때때로 IgG 글로불린도 혈청 내에서 다량체 형태로 존재할 수 있다. 다량체의 경우, 4 개 유닛 각각은 동일하거나 상이할 수 있다.
본 명세서의 범위내에서 여러 예시적인 조립된 면역어드헤신은 다음과 같이 개략적으로 도시된다.
(a) ACL-ACL;
(b) ACH-(ACH,ACL-ACH,ACL-VHCH, 또는 VLCL-ACH);
(c) ACL-ACH-(ACL-ACH.ACL-VHCH, VLCL-ACH또는 VLCL-VHCH);
(d) ACL-VHCH-(ACH, 또는 ACL-VHCH, 또는 VLCL-ACH);
(e) VLCL-AHCH-(ACL-VHCH, 또는 VLCL-ACH); 및
(f) (A-Y)n-(VLCL-VHCH)2
여기에서, 각 A는 동일하거나 상이한 어드헤신 아미노산 서열을 나타내며,
VL은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고,
VH는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고,
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고,
CH은 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이고,
n은 1보다 큰 정수이고,
Y는 공유결합 가교결합제의 잔기를 나타낸다.
간결하게 나타내기 위해 상기 구조는 주요한 특징만을 보여주며, 연결 (J) 도메인 또는 면역글로불린의 다른 도메인은 나타내지 않으며, 디술피드 결합도 나타내지 않는다. 그러나, 이러한 도메인이 결합 활성을 위해 필요한 경우, 이들이 면역글로불린 분자에서 차지하는 통상적인 위치에 이들이 존재하도록 제작될 것이다.
별법으로는, 어드헤신 서열이 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열 사이에 삽입되어 키메라 중쇄를 포함하는 면역글로불린을 얻을 수 있다. 이런 실시양태에서는 어드헤신 서열이 면역글로불린의 각 암 (arm)에서 힌지와 CH2 도메인 사이에, 또는 CH2와 CH3 도메인 사이에서 면역글로불린 중쇄의 3' 말단에 융합된다. 유사한 제작물이 문헌 [Hoogenboom, et al., Mol. Immunol. 28:1027-1037 (1991)]에 보고된 바 있다.
면역글로불린 경쇄가 본 발명의 면역어드헤신에 필요하지 않을지라도, 면역글로불린 경쇄가 어드헤신-면역글로불린 중쇄 융합 폴리펩티드에 공유결합되거나 또는 직접 어드헤신에 융합되어 존재할 수 있다. 전자의 경우에는 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA가 어드헤신-면역글로불린 중쇄 융합 단백질을 코딩하는 DNA와 공동발현되는 것이 통상적이다. 분비시에, 혼성 중쇄 및 경쇄가 공유결합되어, 2 디술피드-연결된 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍을 포함하는 면역글로불린 유사 구조를 제공할 것이다. 이러한 구조를 제조하는 데에 적합한 방법은 예를 들어 미국 특허 제4,816,567호 (1989년 3월 28일 발행)에 기재되어 있다.
면역어드헤신은 어드헤신 부분을 코딩하는 cDNA를 면역글로불린 cDNA 서열로 프레임내 (in-frame)로 융합함으로써 가장 편리하게 제작된다. 그러나, 게놈 면역글로불린 단편으로의 융합도 사용될 수 있다(예를 들어 문헌 [Aruffo et al., Cell 61:1303-1313 (1990) 및 Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144 (1991)]를 참조). 후자 유형의 융합은 발현을 위한 Ig 조절 서열이 존재할 필요가 있다. IgG 중쇄 불변 영역을 코딩하는 cDNA는 지라 또는 말초혈관 림프구로부터 유래된 cDNA 라이브러리로부터의 공개된 서열에 기초하여 혼성화 또는 중합효소연쇄반응 (PCR) 기술을 써서 단리할 수 있다. 면역어드헤신의 "어드헤신" 및 면역글로불린 부분 을 코딩하는 cDNA는, 선택된 숙수세포에서 효율적인 발현을 지시하는 플라스미드 벡터내로 탠덤하게 삽입한다.
4.다른 C H 2/C H 3 영역 포함 단백질
다른 실시양태에서는 정제될 단백질이 CH2/CH3 영역에 융합된 것이거나 CH2/CH3 영역과 접합된 것이다. 이러한 융합 단백질은 단백질의 혈청 반감기가 증가되도록 제조될 수 있다. 이런 식으로 접합될 수 있는 생물학적으로 중요한 단백질의 예로는 레닌, 인간 성장 호르몬 및 소의 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 인자, 부갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 지단백질, 알파-1-안티트립신, 인슐린 A-쇄, 인슐린 B-쇄, 프로인슐린, 여포 자극 호르몬, 칼시토닌, 황체형성 호르몬, 글루카곤, 응고 인자(예를 들어 인자 VⅢC, 인자 IX, 조직 인자 및 빌레브란츠 (Willebrands) 인자), 항-응고 인자(예를 들어 단백질 C), 심방 나트륨이뇨 인자, 폐 표면활성 물질, 플라스미노겐 활성 물질(예를 들어 유로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성 물질(t-PA)), 봄베신, 트롬빈, 조혈 성장 인자, 종양 괴사 인자-알파 및 종양 괴사 인자-베타, 엔케팔리나제, RANTES (활성화되면 정상적으로 T-세포가 발현 및 분비되도록 조절), 인간 마크로파지 염증 단백질(MIP-1-알파), 혈청 알부민 (예를 들어 인간 혈청 알부민), 뮬러리안(Muellerian)-억제 물질, 릴랙신 A-쇄, 릴랙신 B-쇄, 프로릴랙신, 마우스 성선자극 호르몬-관련 펩티드, 미생물 단백질(예를 들어 베타-락타마제), DNase, IgE, 세포독성 T-림프구 관련 항원(CTLA) (예를 들어 CTLA-4), 인히빈, 액티빈, 혈관 내피 성장인자(VEGF), 호르몬 또는 성장 인자의 수용체, 단백질 A 또는 D, 류마토이드 인자, 향신경 인자(예를 들어 골-유래 향신경 인자(BDNF), 뉴트로핀-3, -4, -5또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6) 또는 신경 성장 인자(예를 들어 NGF-β)), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 섬유아세포 성장 인자(예를 들어 aFGF 및 bFGF), 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자(TGF) (예를 들어 TGF-알파, 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 포함하는 TGF-β), 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II), 데스(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP), CD 단백질(예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 및 CD40), 에리트로포이에틴, 골유도 인자, 면역 독소, 뼈 형성 단백질(BMP), 인터페론 (예를 들어 인터페론-알파, -베타 및 -감마), 콜로니 자극 인자(CSF) (예를 들어 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF), 인터루킨 (IL)(예를 들어 IL-1 내지 IL-10), 수퍼옥시드 디스뮤타제, T-세포 수용체, 표면 막 단백질, 붕괴 촉진 인자, 바이러스 항원(예를 들어 AIDS 엔벨로프의 일부), 운반 단백질, 호밍 수용체, 어드레신, 조절 단백질, 인테그린 (예를 들어 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM), 종양 관련 항원(예를 들어 HER2, HER3 또는 HER4 수용체), 및 상기 기재된 임의 폴리펩티드의 단편이 포함된다.
다음 실시에는 예시를 위해 제공되는 것이며 제한하는 것이 아니다. 본 명세서에 모든 인용된 문헌의 개시 내용은 언급에 의하여 본 명세서에 명백히 도입된다.
실시예는 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법을 어떻게 제조 및 사용하는가에 대한 완벽한 공개 및 설명을 당분야의 숙련자에게 제공하기 위해 제공되며, 발명자들이 자신의 발명으로 생각하는 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 사용된 수와 관련하여 (예를 들면, 양, 온도 등) 정확성을 보장하기 위해 노력을 기울였으마, 실험적 오류가 일부 있으며, 편차가 고려되어야 한다. 본 명세서에 모든 인용된 문헌의 개시 내용은 언급에 의하여 본 명세서에 명백히 도입된다.
읽기 편하도록 실시예에서 자주 사용되는 약어 목록을 아래에 제시한다.
Cf여액 중의 농도 (g/l)
Cb벌크 농도 (또는 공급물 농도) (g/l)
CHO 차이니스 햄스터 난소
CHOP 차이니스 햄스터 난소 세포 단백질(들)
CV 컬럼 부피
DF 투석여과
HCCF 수확된 세포 배양액
HCI 소수성 전하 유도 크로마토그래피
HCP 숙주 세포 단백질
HIC 소수성 상호작용 크로마토그래피
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
HPTFF 고성능 접선 플로우 여과
J 여액 플럭스 (lm-2h-1)
Lp막 투과도
N 투석부피의 수
PHCPHCP 제거를 기준으로 한 정제율
PCHOPCHOP 제거를 기준으로 한 정제율
pI 등전점
rhuMAb 재조합 인간화 단일클론 항체
Si용질 "i"의 시빙
Y 수율
ψ 선택도
<실시예 1>
2 단계의 비친화성 정제
이 실시예에서는 비친화성 정제 매트릭스를 달리 조합하여 사용하여, 비친화성 정제의 2 단계 또는 3 단계로 이루어진 방법으로 항-CD11a rhuMAb HCCF를 정제하였다.
양이온 교환 (예를 들면, S 컬럼을 사용), 음이온 교환 (예를 들면, Q 컬럼을 사용), 혼합식 이온 교환 (예를 들면, ABx를 사용), 히드록시아파티트 (HA), 소수성 상호작용 (HIC) 및 소수성 전하 유도 (HCI) 수지의 정제 성능을 항-CD11a rhuMAb 단백질에 대한 크로마토그래피 정제 방법의 각 단계에서 시험하였다. 전체 숙주 세포 단백질(CHOP) 불순물 제거 및 단백질 수율을 실시예 2에서 상술한 바와 같이 측정하고, 단백질 A 크로마토그래피를 포함하고 2 단계 또는 3 단계로 이루어진 통상의 방법 (즉, 2 단계 방법의 경우 ProA 이후에 음이온 교환 (예를 들면, ProA-Q), 3 단계 방법의 경우, ProA 이후에 양이온 교환, 그 후 음이온 교환 (예를 들면, ProA-S-Q))과 비교하였다.
SP-세파로오스 패스트 플로우(등록 상표) 수지 (S, 양이온 교환 수지, 미국 뉴저지주 피스카타웨이에 소재한 Amersham Bioscience 제품), Q-세파로오스 패스트 플로우(등록 상표) 수지 (Q, 음이온 교환 수지, 위의 Amersham Bioscience 제품), 백커본드 ABX(등록 상표) 수지 (ABx, 혼합식 이온 교환 수지, 미국 뉴저지주 필립스버그에 소재한 J.T. Baker, Inc. 제품), 페닐-세파로오스 패스트 플로우(등록 상표) 수지 (HIC, 소수성 상호작용 수지, 위의 Amersham Bioscience 제품), 마크로프렙 세라믹 히드록시아파티트 (Macroprep Ceramic Hydroxyapatite) 수지 (HA, 히드록시아파티트 수지, 미국 캘리포니아주 허큘레스에 소재한 BioRad Laboratories 제품) 및 MEP 하이퍼셀(HYPERCEL)(등록 상표) 수지 (HCI, 소수성 전하 유도 수지, 인비트로젠 라이프 테크놀로지즈(등록 상표), 미국 메릴랜드주 록빌에 소재한 LifeTechnologies, Inc.제품)를 0.66 cm e.d. x 20 cm 옴니 (Omni) 유리 컬럼 내로 각기 채웠다. 크로마토그래피를 위한 작동 조건을 표 1에 제시한다.
수지 수지 유형 작동 방식 완충액 로딩 조건
SP-세파로오스 패스트 플로우(등록 상표) (S, 미국 뉴저지주 피스카타웨이에 소재한 Amersham Bioscience 제품) 양이온 교환 (S) 비특이적 결합 및 용출식 20 mM MES, 50 mM NaCl, pH 5.5 500 mM NaCl까지 10 CV 구배 < 5 mS/cm pH 5.5
백커본드 ABX(등록 상표) (미국 뉴저지주 필립스버그에 소재한 J.T. Baker, Inc. 제품) 혼합식 이온 교환 (ABx) 비특이적 결합 및 용출식 S와 동일 S와 동일
Q-세파로오스 패스트 플로우(등록 상표) (미국 뉴저지주에 소재한 Amersham Bioscience 제품) 음이온 교환 (Q) 통과식 25 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8 < 7 mS/cm pH 8
페닐-세파로오스 패스트 플로우(등록 상표) (미국 뉴저지주에 소재한 Amersham Bioscience 제품) 소수성 상호작용 (HIC) 비특이적 결합 및 용출식 50 mM MES, 0.8 M Na2SO4, pH 6 50 mM MES까지 15 CV 구배, pH 6 0.8 M Na2SO4pH 6
마크로프렙 세라믹 히드록시아파티트 (미국 캘리포니아주 허큘레스에 소재한 BioRad Laboratories 제품) 히드록시아파티트 (HA) 비특이적 결합 및 용출식 10 mM 인산나트륨, pH 6.8 400 mM 포스페이트까지 10 CV 구배, pH 6.8 < 3 mS/cm pH 6.8
MEP 하이퍼셀(등록 상표) (미국 메릴랜드주 록빌에 소재한 LifeTechnologies, Inc.제품) 소수성 전하 유도 (HCI) 비특이적 결합 및 용출식 25 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.1, 50 mM 아세테이트로 단계 용출, pH 4 pH >7
모든 컬럼에 100 cm/h (시간 당 5 컬럼 부피)의 유속으로 수지 ml 당 항체 10 mg을 로딩했다.
S, HIC 및 HCI 수지를 그 사용 사이에 0.5 N NaOH ≥ 3 컬럼 부피로 살균하였다. ABx, Q 및 HA 수지가 든 컬럼을 각 사용 전에 새로운 수지로 채웠다.
항-CD11a rhuMAb를 발현하는 CHO 세포를 배양하여, 항체를 포함하는 수확된 세포 배양 제제를 수집하였다. 세포 배양 혼합물 원액에는 대략 220,000 ppm CHOP (220,000 ng CHOP/mg 항-CD11a rhuMAb와 동등함)가 함유되었다. 혼합물 원액의 분취량을 표 2의 단계 1을 위한 수지 각각에 적용하였다. 단계 1로부터의 용출물의 분취량을 그 후 표 2의 단계 2에서 각각의 다른 수지에 적용하고, 항체 및 불순물을 추가 분리하였다. 각 단계를 위한 완충액 조건은 표 1에 요약했다. 혼합물 원액 및 제1 단계로부터의 각 용출 푸울을, 다음 정제 단계에서 혼합물 원액 또는 용출 푸울을 적용할 수지의 완충액 조건의 이온 세기 및 pH로 조절하였다. 비친화성 정제의 각 2 단계 이후에 CHOP 농도에 의해 측정된 정제 결과의 요약을 표 2에 나타낸다.
비친화성 정제의 2 단계에 걸친 CHOP 제거
단계 1에 사용된 수지 CHOP (ppm, ng/mg 항체) 단계 2에 사용된 다른 수지 CHOP (ppm, ng/mg 항체)
시험 방법
Q 23,000 Q 14,000
HIC 3,000
ABx 1,000
S 900
HCl 11,000
HIC 26,000 Q 9,900
HIC 2,400
ABx 400
S 900
ABx 6,600 Q 3,100
HIC 2,400
ABx 1,700
S 1,000
HCI 2,800
S 14,000 Q 80
HIC 600
ABx 140
S 2,100
비교 방법
ProA 300 S 30
시험된 비친화성 단계 중, ABx 컬럼은 HCCF에서 대부분의 CHOP 불순물을 제거하여, CHOP 농도가 6600 ppm이 되었다. 비친화성 정제의 2 단계로부터 생성된 푸울의 순도는 80 ppm 내지 14,000 CHOP 범위이었다. 제1 단계로서 S 정제와 제2 단계로서 Q 정제로 정제하면, 80 ppm의 낮은 CHOP 농도가 얻어졌다. 그러나, Q 정제를 제1 단계로, S 정제를 제2 단계로 그 단계를 뒤집으면, 정제 수율은 900 ppm의 CHOP 농도였다. 비친화성 방법의 단계 순서는 순도 결과에 영향을 주었다.
3 단계의 비친화성 정제를 사용하는 추가의 정제를 평가하여, 표 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 단백질 A 크로마토그래피의 친화성 단계 하나를 포함하는 3 단계 정제 방법 즉, ProA-S-Q와 비교하였다. 2 단계 정제 방법에 대해 상기 설명한 연구의 경우, 220,000 ppm CHOP를 포함하는 세포 배양 혼합물 원액의 분취량를 표 3의 단계 1에서 그 분취량을 적용할 수지에 대한 표 1에 따른 pH 및 이온 세기로 조절하였고, 표 3의 단계 2 및 3에 대해서도 마찬가지로 했다. 3 단계의 비친화성 정제를 포함하는 방법을 사용하여 CHOP를 제거한 결과를 표 3에 나타냈다. 3 단계 비친화성 정제 방법 중 일부로부터의 항-CD11a rhuMAb의 수율을 표 4에 나타냈다.
3 단계의 비친화성 정제를 거친 CHOP 제거
단계 1에 사용된 수지 단계 1 이후 [CHOP] ppm 단계 2에 사용된 수지 단계 2 이후 [CHOP] ppm 단계 3에 사용된 다른 수지 단계 3 이후 [CHOP] ppm
시험 방법
HIC 26,000 ABx 400 ABx 13
S 14
HIC 20
Q 22
S 14,000 Q 80 ABx <2
S 10
HIC <2
Q 30
S 14,000 ABx 140 ABx 28
S 50
HIC 6
Q <2
비교 방법
ProA 730 S 160 Q <2
3 단계의 비친화성 정제를 거친 항-CD11a rhuMAb의 수율
방법 단계 전체 수율
단계 1 단계 2 단계 3
시험 방법
S 96 % Q 100 % ABx 79 % 76 %
S 96 % Q 100 % HIC 89 % 85 %
S 96 % ABx 92 % Q 100 % 88 %
비교 방법
ProA 97 % S 89 % Q 98 % 85 %
2 또는 3 단계의 비친화성 정제를 조합하면, CHOP 불순물의 제거에 의해 측정되는 순도가 대략, 예를 들어 방법 (S-Q-ABx 또는 HIC)의 제1 비친화성 단계 후에는 CHOP 14,000 ppm, 제2 비친화성 단계 후에는 CHOP 약 80 ppm, 제3 단계 후에는 CHOP 약 2 ppm이 얻어졌고, 표 4에 나타낸 바와 같은 항-CD11a 항체의 생성물 순도가 얻어졌다.
<실시예 2>
비친화성 크로마토그래피 및 HPTFF 정제의 조합
이 실시예는 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포로부터 얻은 재조합 인간 단일클론 항체인 항-HER2 rhuMAb (분자량 160 kD, pI 약 9.0)의 정제에 관한 것이다. 항-HER2 rhuMAb는 제넨테크사 (미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코에 소재)의 산업규모 CHO 세포 배양 공정으로부터 얻었다. CHO 세포 배양 후에 항-HER2 rhuMAb 분자를 원심분리 및 정상적인 세포 여과에 의해 부분적으로 청정하여 세포 및 세포 파쇄물을 제거하였다. 생성된 푸울은 항-HER2 rhuMAb 생성물 0.52 mg/ml 및 CHOP 0.78 mg/ml로 이루어졌다.
항-HER2 rhuMAb의 정제를 위하여, 항-HER2 rhuMAb를 발현하는 CHO 세포에서 유래한 항-HER2 rhuMAb 생성물 및 차이니스 햄스터 난소 숙주 세포 단백질(CHOP)을 포함하는, 상태조절된 수확된 세포 배양액 (HCCF)를 처음의 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 (S) (SP-세파로오스 패스트 플로우(등록 상표) 수지, Amersham Biosciences)에 로딩하여 숙주 세포 단백질 또는 CHO 단백질(CHOP), 변이체 및 응집물을 제거하였다. S 컬럼에서 얻은 용출물 모아서 (S 푸울) 제2 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 (Q) (Q-세파로오스 패스트 플로우(등록 상표) 수지, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재한 Amersham Biosciences 제품)에 처리하여, CHOP 및 표적 단백질 응집물을 제거하였다. Q 컬럼으로부터 얻은 통과액 (Q 푸울)을 나누어, 각 푸울을 CHOP, 변이체 및 소분자의 추가 제거를 위하여 제3 방법 HPTFF에 처리했다. Q 푸울 2 개를 아래 상세히 설명한 바와 같이 HPTFF 실험 1 및 HPTFF 실험 2로 처리했다.
A. 비친화성 크로마토그래피
크로마토그래피 컬럼을 수지 1 리터 당 대략 10 g의 rhuMAb를 로딩하여, 100 cm/h (시간당 5 컬럼 부피(CV))의 유속으로 총 약 40 g의 rhuMAb를 로딩하였다.
1. 방법
비친화성 크로마토그래피 컬럼의 준비를 위하여, 결합-및-용출식 SP-세파로오스 및 통과식 Q-세파로오스를 각기 예비 규모 컬럼 내로 각각 채웠다. 각 크로마토그래피 컬럼을 위한 작동 조건은 표 5에 나타냈다.
비친화성 크로마토그래피 작동 조건
수지 수지 유형 작동 방식 완충액 로딩 조건
SP-세파로오스 패스트 플로우(등록 상표) (S, 미국 뉴저지주 피스카타웨이에 소재한 Amersham Bioscience 제품) 양이온 교환 (S) 비특이적 결합 및 용출식 25 mM MES, 20 mM NaCl, pH 5.5 500 mM NaCl까지 10 CV 구배 < 6 mS/cm pH 5.5
Q-세파로오스 패스트 플로우(등록 상표) (미국 뉴저지주에 소재한 Amersham Bioscience 제품) 음이온 교환 (Q) 통과식 25 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8 < 8 mS/cm pH 8
HCCF를 전도도 6 mS/cm 미만이 되게 물로 희석하고 HCCF를 HCl로 pH 5.5로 조절함으로써 HCCF의 상태를 조절하고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 상태조절된 HCCF 66 리터 부피를 비친화성 크로마토그래피 처리하였다.
SP-세파로오스 컬럼을 5 컬럼 부피(CV)의 컬럼 완충액으로 평형화하였다(표 5). 상태조절된 HCCF (< 10 g/l) 66 리터를 평형화된 SP-세파로오스 컬럼으로 로딩하였다. 상태조절된 HCCF를 SP-세파로오스 컬럼으로 로딩한 후, 컬럼을 컬럼 완충액 5 CV로 세척하였다. 용출은 용출 완충액 (25 mM MES, 500 mM NaCl, pH 5.5)을 써서 이루어졌고, 용출물은 280 nm에서 0.1 내지 0.2 AU의 흡광도에서 수집하였다. 크로마토그래피 수지를 0.5 M NaOH 용액에서 재생하고 0.1 M NaOH 중에서 더 보관하였다.
SP-세파로오스 컬럼으로부터의 수집물을 모아서 (SP 푸울) S 푸울을 전도도가 대략 7.5 내지 8 mS/cm이 되게 물로 희석하고 NaOH로 pH 8로 조절함으로써 상태조절하였다. 그 다음, 상태조절된 S 푸울을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 여과된 SP 푸울 (약 9 리터)을 컬럼 완충액 (표 5 참조) 5 CV로 평형화해 둔 Q-세파로오스 컬럼에 로딩하였다. 통과액을 0.2-0.2 AU (280 nm)에서 수집하여 통과액을 모았다(Q 푸울). Q 푸울 총 20.6 리터를 수집하였다.
Q-세파로오스 크로마토그래피 수지를 0.5 M NaOH 용액에서 재생하고 0.1 M NaOH에 더 보관하였다. Q 컬럼에서 회수한 20.6 리터를 HPTFF 정제 전에 3 개의 동일한 푸울로 나누었으며, 각 푸울은 부피가 6.9 리터이고 농도가 항-HER2 rhuMAb 약 1.4 g/L이었다.
2. 분석
이 벙법의 정제 단계 후에 각 푸울, 즉 HCCF 및 정제 단계로부터 얻은 푸울 중의 항-HER2 rhuMAb의 양은 단백질 A 면역친화성에 기초한 HPLC 분석에 의하여 측정하였다. HPLC 컬럼은 포로스 (Poros) 단백질 A 4.6 mm i.d. x 100 mm 베드 높이 (PerSptive Biosystems)이었다. 샘플 및 표준물을 로딩 완충액 중에서 컬럼에 적용하였고, rhuMAb 분석물이 컬럼에 결합한 후, 산성 조건에서 용출하였다. 용출된 물질의 피크 면적을 표준 곡선의 피크 면적과 비교하여 rhuMAb의 양을 계산하였다. 분석 범위는 0.05 mg/ml 내지 1.0 mg/ml가 통상적이었다.
S 및 Q 크로마토그래피를 완료했을 때, 푸울의 샘플을 SDS-PAGE 분석 (도 2, 각각 레인 4 및 5)하였다. 단백질을 크기 (상대적 수동력학적 반지름)에 따라 분리하는 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)으로 샘플을 분석하였다. 샘플 및 분자량 표준 (10 내지 200 kDa 범위)을 비환원성 조건에서 준비하여 대략 2.5 ㎍/레인으로 겔에 로딩하였다. 10 % 내지 20 % 아크릴아미드 구배 겔 (8 cm x 8 cm 크기)를 여기에 사용하였으며 (미국 오하이오주 휴드슨에 소재한 Zaxis International, Inc.) 170 mV의 일정한 전압에서 전기영동하였다. 이 전기영동 후에, 단백질을 염색하여 가시화하였다. 그 후, 전기영동 겔을 문헌 [Morrisey, J. Analytical Biochemistry, 1981, 117: 307-310]에 기재된 방법에 따라서 은 염색으로 처리하였다. 결과를 도 2에 나타냈다.
완전한 단량체로서 각 푸울에 존재하는 항-HER2 rhuMAb의 양을 결정하기 위하여, 혼합물을 다음 절차에 따라서 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 처리하였다. 간략하게 설명하면, 슈퍼덱스 (Superdex) 200 HR 10/30 컬럼 (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재한 Amersham Biosciences 제품)을 인산염 완충 염수 중에서 평형화하였다. 샘플 당 대략 100 ㎍의 rhuMAb를 컬럼에 적용하였다. 샘플 중에 포함된 단백질 분자의 크기를 기준으로 컬럼으로부터 샘플이 용출되었다(최적 분리 범위: 10 내지 600 kDa). 컬럼 용출물의 흡광도를 280 nm에서 측정하였고, 단백질 용출 피크를 적분하여 단량체 rhuMAb의 퍼센트 면적을 결정하였다. HCCF, S 푸울, Q 푸울 및 HPTFF 푸울 중의 완전한 단량체 항-HER2 rhuMAb의 백분율을 표 8에 나타냈다.
CHOP 농도는 염소 항-(숙주 세포 단백질) 항체를 사용하여 효소결합면역흡착 (ELISA) 분석법에 의해 결정하여 CHOP를 정량하였다. 친화성 정제된 염소 전체 (whole) 항-CHOP 항체를 마이크로타이터 플레이트 웰에 고정시켰다. 그 웰 내에서 CHOP를 포함하는 푸울 샘플의 희석물을 인큐베이션한 후, 접합된 퍼옥시다제 전체 항-CHOP와 인큐베이션하였다. 그 후, o-페닐렌디아민을 써서 492 nm에서 흡광도를 판독하여 양고추냉이 퍼옥시다제를 정량하였다. 샌드위치 ELISA의 원리에 근거할 때, 퍼옥시다제 농도는 CHOP 농도에 상응했다. ELISA의 분석 범위는 전형적으로 5 ng/mL 내지 320 ng/mL이었다. 샘플의 농도에 따라서 샘플 당 2 내지 4 희석물을 분석하여 희석-보정 결과를 평균하였다.
B. HPTFF
고성능 접선 플로우 여과 (HPTFF)는 크기 및 전하 양자를 기준으로 크기차가 10 배 미만인 용질의 분리를 포함하는 2 차원 여과 작업이다. 상기한 바와 같이, HPTFF에 의해 추가 분석하기 전에 Q 푸울을 3 개의 동등한 Q 푸울로 나누었는데, 각 푸울은 부피가 6.9 L이고 농도는 항-HER2 rhuMAb 약 1.4 g/L이었다. Q 푸울 2 개를 HPTFF 실험 1로 처리하고, 각각을 다른 조건을 포함하게 하였다. HPTFF 실험 1로부터 HPTFF를 위한 최적 조건의 결정시, HPTFF 실험 1 및 2로부터의 합한 푸울을 아래 자세히 설명한 바와 같이 추가의 HPTFF 처리하였다.
1. 막
이들 실시예에서 HPTFF에 사용된 여과막은 합성품 재생 셀룰로오스 (CRC)-밀리포어 울트라셀(등록 상표)(ULTRACEL)(Millipore) (명목상 분자량 컷오프 300 kD (PLCMK))이었다. CRC300 미니-펠리콘2(PELLICON2(등록 상표)) 막 (Millipore)은 본 명세서에 기재된 바와 같이 전하를 변형하여 이 실시예의 HPTFF 연구에 사용되는 대전된 셀룰로오스 막 CRC300+를 얻었다. 간략하게 설명하면, 300 kD 펠리콘2 (등록 상표) 카세트 (막 면적 0.1 ㎡)를 규모 축소 실험 (최소 1 리터 용액)에 사용하였다. 막을 처음 사용하기 전에 카트리지 준비 프로토콜에 따라서 세척하여 임의의 잔류하는 보관 및 선적용 용액을 제거하고 막을 적절한 완충액 조건으로 평형화하였다. 브로모-프로필-트리메틸-암모늄 브로마이드 (Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스에 소재)를 사용하여 알칼리 조건에서 막을 그 위치에서 (in situ) 화학적으로 변형하였다(PCT/US00/19964, 그 전체 내용이 언급에 의해 이 명세서에 도입됨). 구체적으로는, 막을 병류(cocurrent) 여액 플로우 없이, 100 lm-2h-1의 일정한 여액 플럭스에서 대전시키고, 보유액 압력은 10 psig에 고정하고, 0.1 N NaOH 중에 용해되고 0.2 ㎛ 여과된 1 L 리간드로 여액 개방식으로 전체 재순환하였다. 대전하기 전의 Lp는 0.1 N NaOH 중에서 약 53 lm-2h-1/psi이었고, 대전 후의 Lp는 0.1 N NaOH 중에서 약 37 lm-2h-1/psi이었다. 대전 후, 생성된 양으로 대전된 막을 0.1 N 수산화나트륨을 사용하에 세정하고, 민케어(MINNCARE)(등록 상표) 용액 300 ppm으로 소독하고, 0.1 N 수산화나트륨 중에 보관하였다. 각 HPTFF 실험전에, 막을 이 실험의 제1 투석여과 완충액으로 흠뻑 적셔서 보관용 용액을 제거하고 견뢰도를 시험하였다. 막 투과도는 3 가지 여액 플럭스의 최소치에서 병류 여액 플로우로 HPTFF계를 사용하여 측정하였다.
2. HPTFF 여과계
HPTFF 실험을 도 1에 도시한 기본 배열을 갖춘 전자동 접선 플로우 여과계를 사용하여 수행하였다. HPTFF계는 40 리터 스테인레스 스틸 재순환 탱크, 공급 및 여액 플로우 계량기 (Admag Model 102 및 105, Johnson Yokogawa Corp., GA 뉴먼 소재) 및 압력 변환기 (모델 MSP220-A2, 0-100 psig = 0-7 바, 미국 뉴욕주 풀톤빌에 소재한 Anderson Instruments 제품)을 포함했다. 공급 펌프 및 병류 여액 플로우 펌프는 정변위 펌프 (Universal 6, 미국 위스콘신주 델라반 소재한 Waukesha-Cherry Burrell 제품)이었고, 투석여과 펌프 및 여액 펌프는 연동 펌프 (모델 L-7518-62, 미국 일리노이주 닐레스 소재한 Cole Parmer 제품)이었다. 재순환 탱크에는 온도 프로브 (모델 RIX, -29 ℃ 내지 82 ℃, 미국 캘리포니아주 세풀베다에 소재한 Moore Industries 제품)가 포함되었다. 모든 도관은 316L 스테인레스 스틸로 제작되었다. 보유액 압력 조절 밸브는 강철 격막 (모델 1/2 Mikroseal 팩크리스 (packless) 조절 밸브, 미국 뉴햄프셔주 포츠마우쓰에 소재한 H.D. Baumann 제품)을 사용하여 작동된 반면, 다른 밸브는 모두 에틸렌 프로필렌 디엔 단량체 격막으로 실용적으로 작동되었다(Biotek 모델 8836-18-BH, 미국 캘리포니아주 시미 밸리 소재한 ITT Sherotec 제품). 연속 탱크 액체 수준은 마그네토 제한 프로브 (모델 Tempsonics II, 미국 노쓰 캘리포니아주 리서치 트라이앵클 파크에 소재한 MTS)로 측정했다. 데이타 획득 및 조절은 마이크로어드밴티지 (MycroAdvantage) 소프트웨어 쉘 (미국 펜실바니아 스프링하우스에 소재한 Moore Products 제품)을 사용하는 내부소유 소프트웨어 (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재한 Genentech, Inc.)를 사용하여 수행했다.
HPTFF는 고정된 공급물 유속 323 l.m-2.h-1(부피 공급물 유속을 막 면적으로 나눈 값) 및 보유액 압력 10 psi에서 수행하였다. 병류 여액 유속을, 막 카세트의 입구 (공급물) 및 출구 (보유액)에서 동일한 막횡단 압력에 도달하도록 조절하였다. 여액 플럭스는 여액 펌프 속도를 조절함으로써 50 l.m-2.h-1로 설정하였다. HPTFF 실험의 개시는 상기 카세트의 입구와 출구에서의 막횡단 압력 간의 차이를 최소화하기 위하여 모든 유속의 경사 상승(ramp-up)을 수반했다. 보유액을 공급물 탱크로 재순환시키고 여액은 수집 용기로 향하게 했다. 공급물 및 여액 샘플을 생성물 및 HCP 분석용으로 두 경우 모두에 수집하였다.
a. HPTFF 실험 1
상기한 바와 같은 Q 푸울을 동등한 6.9L Q 푸울로 나눈 후에, Q 푸울 중 하나를 다음 조건하에서 CRC300+ 막을 사용하는 HPTFF 실험 1로 처리하였다.
대전된 막을 이 실험을 위한 제1 투석여과 완충액 중에서 평형화하였다(표 7 참조). Q 푸울을 희석하여, rhuMAb 푸울의 이온 세기 및 전도도를 2.7 mS/cm으로 낮추고, pH를 4.5로 조절한 후 공급물 탱크에 첨가하였다(도 1). 공급물 탱크 중의 물질을 용액 일부를 제거하여 농축시켰다. 벌크 부피가 10 g/L의 벌크 농도(Cb)에 도달했을 때, 공급물 탱크 중의 용액을 순차적인 투석여과 단계로 처리하였다. 1.5 mS/cm의 일정한 전도도로, 투석여과를 pH 4.5에서 10 투석부피로, pH 5.0, pH 5.5, pH 6.0 및 pH 6.5에서 5 투석부피로 수행하였다(표 7). 수율은 다음 식을 사용하여 투석여과 동안 정량가능한 생성물 시빙에 기초하여 계산하였다.
식 중, S는 표적 단백질의 시빙이며, N은 투석부피의 수이다.
실험 조건 및 HPTFF 정제 단계로부터의 결과
농도 Cb(g/L) 투석여과 pH-N 수율 (%) [CHOP]최종ppm
Q 푸울 410
HPTFF 실험 1 10 4.5-10 99% 21
5.0-5
5.5-5
6.0-5
6.5-5
HPTFF 실험 2 10 4.5-10 99 % 17
5.5-10
6.5-10
추가의 HPTFF (HPTFF 1 & 2로부터의 합한 푸울) 10 6.5-40 99% 2.2
6.0-5
상기한 바와 같이, SDS-PAGE 겔 전기영동 (도 2, 레인 10), rhuMAb % 완전한 단량체 분석 및 CHOP 농도 분석 (표 8)을 비롯한 분석을 HPTFF 실험 1에서 회수된 푸울의 생성물 품질에 대해 수행했다.
CHOP의 상당한 시빙은 항-HER2 rhuMAb의 별다른 손실 없이도 CRC300+를 사용하여 관찰되었다. CRC300+를 사용하여 수행된 HPTFF로부터 회수된 푸울에서 CHOP의 최종 농도는 21 ppm이었다.
b. HPTFF 실험 2
상기한 바와 같은 Q 푸울의 다른 것 (rhuMAb 1.4 mg/ml, CHOP 410 ppm, pH 5.6 및 전도도 약 8 mS/cm)을 HPTFF 실험 2로 처리하였다.
상기한 바와 같이, CRC300+ 막을 이 HPTFF 실험 2를 위한 제1 투석여과 완충액 (표 7 참조) 중에서 평형화하였다. Q 푸울을 물로 희석하여 전도도를 2.4 mS/cm로 낮추었다. HCl을 사용하여 pH를 4.5로 조절하였다. 생성된 상태조절된 푸울을 공급물 탱크로 로딩하였다. 단일 작동에서, 상태조절된 푸울을 pH 4.5에서 10 g/L로 농축한 후, 특정한 순서의 투석여과 완충액 (표 7)을 포함하는 일정한 보유액 부피 투석여과를 수행하였다. 투석여과 완충액의 3 개 순서는 1.5 mS/cm의 일정한 전도도에서, 각기 pH 4.5, 5.5 및 6.5의 10 투석부피로 선정하였다. 모든 HPTFF 실험은 50 l.m-2.h-1의 여액 플럭스에서, 투과도가 36 l.m-2.h-1/psi인 양으로 대전된 펠리콘-2(Pellicon-2(등록 상표)) 미니 카세트를 써서 수행하였다.
CRC300+를 사용하여 수행된 HPTFF 공정이 완결된 때, 회수된 푸울의 샘플을 SDS-PAGE 분석 (도 2, 레인 11)하였다. HPTFF 실험 2로부터 회수된 푸울의 생성물 품질에 대해서는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 CHOP 농도 분석을 비롯한 추가의 분석을 하였다(표 8).
HPTFF 단계의 경우 정제율은 24 보다 컸고(즉, CHOP의 24 배 제거), CHOP 제거가 농축 및 투석여과 둘 다에서 일어났다. CHOP 농도는 410 ppm (Q 크로마토그래피 컬럼에서 회수된 물질 중의 농도)에서부터 17 ppm (HPTFF 실험 2로부터 회수된 물질 중의 농도)까지 감소되었다(표 8 참조). 상당한 여액 손실은 전혀 관찰되지 않았다.
정제 방법에서 항-HER2 rhuMAb 공급물 스트림의 CHO 숙주 세포 단백질 정량 및 순도 분석
정제 단계 [CHOP] (ppm) 완전한 rhuMAb 단량체 % (SEC로 측정)
HCCF 1,469,000 --
S 푸울 144,780 95.9 %
Q 푸울 410 97.4 %
HPTFF 실험 1,2 21, 17 99.8 %
비교 방법 (ProA-S-Q-UFDF 단계 사용) <1 100 %
c. 추가의 HPTFF
HPTFF 실험 1 및 2 이후에 회수된 물질을 합하고 다음과 같이 추가의 HPTFF로 더 처리하였다.
상기한 바와 같이, CRC300+ 막을 제1 투석여과 완충액 중에서 평형화하고, 합한 물질을 공급물 탱크에 로딩하였다. 공급물 탱크 중의 물질을 다음과 같은 최적의 순차적 투석여과 단계로 처리하였다: pH 6.5 및 1.5 mS/cm에서 40 투석부피 후, pH 6.0 및 0.3 mS/cm에서 5 투석부피.
추가의 HPTFF 방법은 최종 보유액 중의 CHOP의 농도를 2.2 ppm으로 감소시켰다. 추가의 HPTFF 이후에 회수된 물질의 샘플을 SDS-PAGE 분석하였다. SDS-PAGE 분석에 의해 결정된 추가의 HPTFF 후에 회수된 물질의 품질(도 2, 레인 6 및 12)을ProA, SP, Q 및 UFDF를 포함하는 전통적인 정제 방법을 통해 얻은 물질의 생성물 품질(도 2, 레인 7)과 비교하였다.
2 단계의 비친화성 정제 및 제3 단계인 HPTFF를 포함하는 정제 방법은 CHOP 불순물의 제거에 의하여 결정된 순도가, S 정제 후 약 144,780 ppm의 CHOP, Q 정제후 약 410 ppm의 CHOP가 얻어졌고, 최종 순도는 약 17-21 ppm의 CHOP가 얻어졌다. 약 2.2 ppm의 CHOP라는 추가의 순도는 추가의 HPTFF에 의하여 얻어졌으며, 추가의 정제가 대안적으로 제3 단계에 도입됨으로써 비싼 친화성 크로마토그래피를 사용하는 전통적인 방법에 필적하는 3 단계 비친화성 방법을 제공한다.
<실시예 3>
비친화성 크로마토그래피 및 HPTFF 정제의 조합
이 실시예는 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포로부터 얻은 재조합 인간 단일클론 항체인 항-CD40 rhuMAb (분자량 160 kD, pI 약 9.0)의 정제에 관한 것이다. 항-CD40 rhuMAb는 제넨테크사 (미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코에 소재)의 산업규모 CHO 세포 배양 공정으로부터 얻었다. CHO 세포 배양 후에 항-CD40 rhuMAb 분자를 원심분리 및 정상적인 세포 여과에 의해 부분적으로 청정하여 세포 및 세포 파쇄물을 제거하였다. 생성된 푸울은 항-CD40 rhuMAb 생성물 1.7 mg/ml 및 CHOP 대략 0.4 mg/ml로 이루어졌다.
항-CD40 rhuMAb의 정제를 위하여, 항-CD40 rhuMAb를 발현하는 CHO 세포에서 유래한 항-CD40 rhuMAb 생성물 및 차이니스 햄스터 난소 숙주 세포 단백질(CHOP)을 포함하는, 상태조절된 수확된 세포 배양액 (HCCF)를 처음의 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 (S) (SP-세파로오스 패스트 플로우(등록 상표) 수지, Amersham Biosciences)에 로딩하여 숙주 세포 단백질 또는 CHO 단백질(CHOP), DNA 불순물 변이체 및 응집물을 제거하였다. S 컬럼에서 얻은 용출물 모아서 (S 푸울) 제2 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 (Q) (Q-세파로오스 패스트 플로우(등록 상표) 수지, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재한 Amersham Biosciences 제품)에 처리하여, CHOP, DNA 불순물 및 표적 단백질 응집물을 제거하였다. Q 컬럼으로부터 얻은 통과액 (Q 푸울)을 추가로, CHOP, 변이체 및 소분자의 추가 제거를 위하여 제3 방법 HPTFF로 처리했다.
A. 비친화성 크로마토그래피
1. 방법
비친화성 크로마토그래피 컬럼의 준비를 위하여, 결합-및-용출식 SP-세파로오스 및 통과식 Q-세파로오스를 각기 예비 규모 컬럼 내로 각가 채웠다. 각 크로마토그래피 컬럼을 위한 작동 조건은 표 9에 나타냈다.
비친화성 크로마토그래피 작동 조건
수지 수지 유형 작동 방식 완충액 로딩 조건
SP-세파로오스 패스트 플로우(등록 상표) (S, 미국 뉴저지주 피스카타웨이에 소재한 Amersham Bioscience 제품) 양이온 교환 (S) 비특이적 결합 및 용출식 20 mM MES, 50 mM 아세트산나트륨, pH 6.5 < 7.0 mS/cm pH 6.5
Q-세파로오스 패스트 플로우(등록 상표) (미국 뉴저지주에 소재한 Amersham Bioscience 제품) 음이온 교환 (Q) 통과식 25 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8 < 8 mS/cm pH 8
HCCF를 전도도 7 mS/cm 미만이 되게 물로 희석하고 HCCF를 아세트산으로 pH 6.5로 조절함으로써 HCCF의 상태를 조절하고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. SP-세파로오스 컬럼을 4 컬럼 부피(CV)의 컬럼 완충액으로 평형화하고 (표 9), 수지 1 리터당 대략 30 mg의 rhuMAb를 유속 150 cm/h로 로딩하여 총 약 13 g의 rhuMAb를 로딩하였다. 상태조절된 HCCF를 SP-세파로오스 컬럼으로 로딩한 후, 컬럼을 세척 완충액 (20 mM HEPES, 35 mM 아세트산나트륨, pH 8.0) 5 CV로 세척한 후, 컬럼 완충액 (표 9) 3 CV로 세척하였다. 용출은 컬럼 완충액으로부터 용출 완충액 (20 mM MES, 140 mM 아세트산나트륨, pH 6.5)으로의 10 CV 구배 용출에 의해 이루어졌고, 용출물은 280 nm에서 0.1 내지 0.5 AU의 흡광도에서 수집하였다. 크로마토그래피 수지를 0.5 M NaOH 용액에서 재생하고 0.1 M NaOH 중에서 더 보관하였다.
SP-세파로오스 푸울 (SP 푸울)은, 전도도가 대략 7.5 mS/cm이 되게 물로 S 푸울을 희석하고 NaOH로 pH 8로 조절함으로써 상태조절하였다. 그 다음, 상태조절된 S 푸울 (총 질량 약 9 g)을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 여과된 상태조절된 SP 푸울 (약 9 리터)을 컬럼 완충액 (표 9 참조) 5 CV로 평형화해 둔 Q-세파로오스 컬럼에 로딩하였다. 통과액을 0.2-0.2 AU (280 nm)에서 수집하여 통과액을 모았다(Q 푸울). Q-세파로오스 크로마토그래피 수지는 0.5 M NaOH 용액 중에서 재생하고 0.1 M NaOH에 더 보관하였다.
2. 분석
이 방법의 정제 단계 후에 각 푸울, 즉 HCCF 및 정제 단계로부터 얻은 푸울 중의 항-CD40 rhuMAb의 양은 본 명세서의 실시예 2에 기재된 단백질 A 면역친화성에 기초한 HPLC 분석에 의하여 측정하였다. CHOP 농도는 본 명세서의 실시예 2에 기재된 효소결합면역흡착 (ELISA) 분석법을 써서 측정하였다. S 및 Q 크로마토그래피를 완료했을 때, 푸울의 샘플을 SDS-PAGE 분석 (도 5, 각각 레인 3 및 4)하였다. Q 푸울을 희석하여 rhuMAb 푸울의 이온 세기 및 전도도를 1.8 mS/cm으로 낮추고, pH 4.5로 조절한 후, 재순환 탱크로 첨가한다(도 1). 양으로 대전된 CRC300+ 막을 사용하는 HPTFF 실험 정제 단계 (HPTFF 실험)는 벌크 부피가 10 g/L의 벌크 농도 (Cb)에 도달할 때까지 Q 푸울로부터 물질을 우선 농축함으로써 시작했다. 재순환 탱크 중의 생성된 용액을 그 다음 순차적인 투석여과 단계로 처리하였다. 1.5 mS/cm의 일정한 전도도로, 투석여과를 pH 4.5 및 pH 5.5에서 5 투석부피로, pH 6.5에서 20 투석부피로, pH 7.0에서 10 투석부피로 수행하였다(표 10). 수율은 다음 식을 사용하여 투석여과 동안 정량가능한 생성물 시빙에 기초하여 계산하였다.
식 중, S는 표적 단백질의 시빙이며, N은 투석부피의 수이다.
실험 조건 및 HPTFF 정제 단계로부터의 결과
농도 Cb(g/L) 투석여과 pH-N 수율 (%) [CHOP] (ppm) [DNA] (ppm)
Q 푸울 96 % 15 15
HPTFF 푸울 10 4.5-5 99 % <0.6 <0.6
5.5-5
6.5-20
7.0-10
이 HPTFF 실험으로부터 회수된 푸울의 생성물 품질을 본 명세서의 실시예 2에 기재된 바와 같이, SDS-PAGE 겔 전기영동 (도 5, 레인 5), rhuMAb % 완전한 단량체 분석, 및 CHOP 농도 분석 (표 11)을 비롯한 분석을 하였다. DNA 농도는 트레즈홀드(THRESHOLD(등록 상표)) 전체 DNA 분석 (미국 캘리포니아주 선니베일에 소재한 Molecular Devices Corp. 제품)에 따라서 평가했다(표 11). 트레즈홀드(등록 상표) 전체 DNA 분석은 단일가닥 DNA에 대해 특이적이며, 단일가닥 DNA는 열에 의해 변성되어 샘플로부터 얻어진다. 단일가닥 DNA는 우레아제 및 스트렙타비딘에 공유결합하여 DNA 복합체를 형성하는 결합 단백질로 표지한다. 이 DNA 복합체를 "스틱" (stick)으로 알려진 비오틴 코팅 니트로셀룰로오스 막을 통해 여과한다. 막 상의 비오틴은 DNA 복합체의 스트렙타비딘과 반응하여, 복합체를 포획한다. 이 스틱을 기질인 우레아가 들어있는 트레즈홀드 판독기에 놓는다. 우레아와 (DNA 복합체 내의) 우레아제간의 효소 반응은 기질 용액의 국소적 pH를 변화시킨다. 실리콘 센서는 pH 변화에 비례하는 표면 전압의 변화를 기록한다. 샘플의 정량은 DNA 표준물과 비교하여 결정한다. 샘플을 희석하여, DNA 함량이 표준 곡선의 보고 범위 (10-400 pg/mL) 내에 들어가게 하였다.
양으로 대전된 CRC300+ HPTFF 막을 사용하였을 때 CHOP의 상당한 시빙이 관찰되었으나, 양으로 대전된 항-CD40 rhuMAb의 상당한 손실은 전혀 없었다. CHOP 제거는 농축 및 투석여과 동안에 발생했다. CHOP 농도는 15 ppm (Q 크로마토그래피 컬럼에서 회수된 물질 중의 농도)에서부터 0.6 ppm 미만(재순환 탱크 중의 단백질 푸울 중의 농도)까지 처음 20 투석부피 내에서 감소되었다. CHOP 불순물 제거는 HPTFF 실험으로부터 회수된 물질 중의 농도를 측정함으로써 확인하였다(표 11 참조). 상당한 여액 손실은 전혀 관찰되지 않았다.
정제 방법에서 항-CD40 rhuMAb 공급물 스트림의 CHO 숙주 세포 단백질 정량 및 순도 분석
정제 단계 [CHOP] (ppm) 완전한 rhuMAb 단량체 % (SEC로 측정) [DNA] (ppm)
HCCF 240,000 -- >5441
S 푸울 530 -- 0.1
Q 푸울 15 -- <0.01
HPTFF 푸울 <0.6 99.5 % <0.006
비교 방법 (ProA-S-Q-UFDF 단계 사용) 3 99.5 % <0.003
2 단계의 비친화성 정제 및 제3 단계인 HPTFF를 포함하는 정제 방법은 (1) CHOP 불순물의 제거에 의하여 결정된 순도가, S 정제 후 약 530 ppm의 CHOP, Q 정제후 약 15 ppm의 CHOP가 얻어졌고, 최종 순도는 약 0.6 ppm 미만의 CHOP가 얻어졌으며, (2) DNA 불순물 제거에 의하여 결정된 순도는 S 정제 후에 약 0.1 ppm의 DNA, Q 정제 후에 약 0.01 ppm 미만의 DNA가 얻어졌고, 최종 순도는 약 0.006 ppm 미만의 DNA가 얻어졌다. 또한 전기영동 분석에 의하여, 비친화성 최종 푸울의 순도 (도 5, 레인 5)가 친화성 단계를 사용하여 얻어진 통상의 푸울의 순도 (도 5,레인 10)에 필적함이 드러났다.
도 5는 실시예 3에 따른 항-CD40 재조합 인간 단일클론 항체 (rhuMAb)의 정제 동안에 상이한 시점에서 채취한 샘플을 포함하는 은 염색된 SDS-PAGE 겔을 보여주며 (레인 2-5), 이는 친화성 정제 단계를 포함하는 통상의 정제 방법 (레인 8-10)과 비교된다. 160 kD, 50 kD, 및 25 kD를 지시하는 화살표는 전장 항체, 중쇄 및 경쇄를 각각 나타낸다. 나머지 밴드는 항-CD40 rhuMAb 단편이다. 레인 1은 단백질 표준물의 혼합물이다. 레인 2-6은 숙주 세포 배양액 (HCCF)이 양이온 교환 크로마토그래피(S 푸울, 레인 3)에 의해 정제되고, 그 다음 음이온 교환 크로마토그래피(Q 푸울, 레인 4)에 의해 정제된 후, 대전된 막을 사용하는 HPTFF (HPTFF 푸울, 레인 5)에 의해 정제되는 본 명세서의 실시예 3에 기재된 비친화성 방법의 수행 후에 취해진 샘플이며, 이는 HPTFF 막을 세정한 후 및 HPTFF 장치의 공급쪽에서 회수된 물질(HPTFF 완충액 플러쉬 푸울, 레인 6)과 비교된다. 레인 7은 블랭크이다. 레인 8-10은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계, 다음에 양이온 교환 크로마토그래피 단계 (레인 8), 그 다음 음이온 교환 크로마토그래피(레인 9), 그 다음 한외여과 단계 (레인 10)을 포함하는 통상적인 회수 방법으로 정제한 HCCF 혼합물 중의 항-CD40에 대응한다.
이 여과 체계는 비싼 친화성 크로마토그래피를 사용하는 전통적인 방법에 필적하는 3 단계 비친화성 방법을 제공한다.
위에 기재된 명세서는 당분야의 숙련자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분한 것으로 생각된다. 예시된 실시양태는 본 발명의 특정한 측면을 예시하기 위한것일뿐이며, 본 발명의 범위내에는 모든 기능상 동등한 실시양태가 포함될 수 있으므로본 발명은 본 명세서에 제공된 실시예에 의해 제한되는 것이 아니다. 본 명세서에 제공된 실시예는 특정한 예로 청구의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 사실상 본 발명의 다양한 변형이 본 명세서에서 밝히고 설명한 것외에도 첨부된 청구의 범위 내에 포함되며, 당분야의 숙련자에게 상기한 설명으로부터 명백하게 될 수 있을 것이다.
Sequence Listing <110> GENENTECH, INC. FAHRNER, ROBERT FOLLMAN, DEBORAH LEBRETON, BENEDICTE VAN REIS, ROBERT <120> NON-AFFINITY PURIFICATION OF PROTEINS <130> 39766-0121 PCT <150> US 60/375,953 <151> 2002-04-26 <160> 4 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn 20 25 30 Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 110 115 120 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 125 130 135 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 140 145 150 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 155 160 165 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 170 175 180 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 185 190 195 Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 200 205 210 Arg Gly Glu Cys <210> 2 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 20 25 30 Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr 95 100 105 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 125 130 135 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 140 145 150 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 155 160 165 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 170 175 180 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 185 190 195 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 200 205 210 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 215 220 225 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 320 325 330 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 335 340 345 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 350 355 360 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 365 370 375 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 380 385 390 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 395 400 405 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 410 415 420 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 425 430 435 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 445 <210> 3 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Thr Ile Ser 20 25 30 Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 His Asn Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 110 115 120 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 125 130 135 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 140 145 150 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 155 160 165 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 170 175 180 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 185 190 195 Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 200 205 210 Arg Gly Glu Cys <210> 4 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 20 25 30 Gly His Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Tyr 50 55 60 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ile Tyr Phe Tyr Gly Thr 95 100 105 Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 125 130 135 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 140 145 150 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 155 160 165 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 170 175 180 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 185 190 195 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 200 205 210 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 215 220 225 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 320 325 330 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 335 340 345 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 350 355 360 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 365 370 375 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 380 385 390 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 395 400 405 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 410 415 420 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 425 430 435 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 445 450 Lys

Claims (28)

  1. 숙주 세포 단백질을 함유하는 혼합물을
    (a) 비친화성 정제 단계에 뒤이어
    (b) 고성능 접선-플로우 여과 (HPTFF)하고,
    (c) 표적 단백질을 100 ppm 미만의 상기 숙주 세포 단백질을 함유하는 순도로 단리시키는 것을 포함하며,
    친화성 정제 단계는 포함하지 않는,
    숙주 세포 단백질을 함유하는 혼합물로부터의 표적 단백질 정제 방법.
  2. 숙주 세포 단백질을 함유하는 혼합물을
    (a) 제1 비친화성 정제 단계, 및
    (b) 제2 비친화성 정제 단계에 뒤이어
    (c) 고성능 접선-플로우 여과 (HPTFF)하고
    (d) 표적 단백질을 100 ppm 미만의 상기 숙주 세포 단백질을 함유하는 순도로 단리시키는 것을 포함하며,
    친화성 정제 단계는 포함하지 않는,
    숙주 세포 단백질을 함유하는 혼합물로부터의 표적 단백질 정제 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제1 비친화성 정제 단계와 제2 비친화성 정제 단계가서로 상이하며, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피가 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 혼합식 이온 교환 크로마토그래피로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1 비친화성 정제 단계와 제2 비친화성 정제 단계가 순서를 불문하고 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 제1 비친화성 정제 단계가 양이온 교환 크로마토그래피이고, 상기 제2 비친화성 정제 단계가 음이온 교환 크로마토그래피인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 정제 단계 (a) - (c)에 뒤이어 단리 단계 (d)로 이루어진 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 단계가 카르복시메틸, 백커본드 ABX(BAKERBOND ABX)(등록 상표), 술포프로필(SP) 및 술포닐로 이루어진 군에서 선택된 양이온 교환 리간드 상에서 수행되는 것인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 단계가 카르복시메틸-셀룰로오스, 백커본드 ABX(등록 상표), 아가로오스 상에 고정된 술포프로필 및 아가로오스 상에 고정된 술포닐로 이루어진 군에서 선택된 양이온 교환 수지 상에서 수행되는 것인 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 음이온 교환 리간드가 DEAE 및 4급 암모늄 이온으로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 음이온 교환 수지가 DEAE 셀룰로오스, QAE 세파덱스(QAE SEPHADEX)(등록 상표) 및 패스트 세파로오스(FAST SEPHAROSE)(등록 상표)로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 HPTFF가 대전된 막을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 숙주 세포 단백질이 차이니스 햄스터 난소 단백질(CHOP)인 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표적 단백질이 항체인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 항체가 단일클론 항체인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 항체가 다클론 항체인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 항체가 인간화 항체인 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 항체가 인간 항체인 방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 항체가 항체 단편인 방법.
  20. 제14항에 있어서, 상기 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2및 Fv 단편, 단쇄 항체 분자, 디아바디(diabody), 선형 항체, 항체 단편으로 제조된 이중특이적 항체 및 다중특이적 항체로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
  21. 제14항에 있어서, 상기 항체가 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34, CD40, EGF 수용체, HER2, HER3, HER4 수용체, LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, av/b3 인테그린, CD11a, CD18, CD11b, VEGF, IgE, flk2/flt3 수용체, 비만(OB) 수용체,mpl수용체, CTLA-4 및 폴리펩티드 C로 이루어진 군에서 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  22. 제14항에 있어서, 상기 항체가 항-HER2, 항-CD20, 항-IL-8, 항-VEGF, 항-PSCA, 항-CD11a, 항-IgE, 항-Apo-2 수용체, 항-TNF-α, 항-조직 인자(TF), 항-CD3, 항-CD25, 항-CD34, 항-CD40, 항-tac, 항-CD4, 항-CD52, 항-Fc 수용체, 항-발암배 항원(CEA) 항체, 유방 표피세포에 대해 유도된 항체, 결장 암종 세포에 결합하는 항체, 항-CD33, 항-CD22, 항-EpCAM, 항-GpIIb/IIIa, 항-RSV, 항-CMV, 항-HIV, 항-간염, 항-avβ3, 항-인간 신장세포 암종, 항-인간 17-1A, 항-인간 직장결장 종양, 항-인간 흑색종, 항-인간 편평세포 암종 및 항-인간 백혈구 항원(HLA) 항체로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
  23. 제14항에 있어서, 상기 항체가 항-HER2 수용체, 항-VEGF, 항-IgE, 항-CD20, 항-CD11a 및 항-CD40 항체로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표적 단백질이 면역어드헤신인 방법.
  25. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표적 단백질이 항체-유사 분자인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 항체-유사 분자가 CH2/CH3 영역과 융합되거나 또는접합된 단백질인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 단백질이 레닌, 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 인자, 부갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 지단백질, 알파-1-안티트립신, 인슐린 A-쇄, 인슐린 B-쇄, 프로인슐린, 여포 자극 호르몬, 칼시토닌, 황체형성 호르몬, 글루카곤, 인자 VⅢC, 인자 IX, 조직 인자, 폰 빌레브란츠(Von Willebrands) 인자, 단백질 C, 심방 나트륨이뇨 인자, 폐 표면활성 물질, 유로키나제, 인간 뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성 물질(t-PA), 봄베신, 트롬빈, 조혈 성장 인자, 종양 괴사 인자-알파 및 종양 괴사 인자-베타, 엔케팔리나제, RANTES, 인간 마크로파지 염증 단백질(MIP-1-알파), 혈청 알부민, 뮬러리안(Muellerian)-억제 물질, 릴랙신 A-쇄, 릴랙신 B-쇄, 프로릴랙신, 마우스 성선자극 호르몬-관련 펩티드, 베타-락타마제, DNase, IgE, 세포독성 T-림프구 관련 항원(CTLA), 인히빈, 액티빈, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 호르몬 또는 성장 인자의 수용체, 단백질 A 또는 D, 류마토이드 인자, 골-유래 향신경 인자(BDNF), 뉴트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 신경 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 섬유아세포 성장 인자, 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자(TGF), 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II), 데스(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP), CD 단백질, 에리트로포이에틴, 골유도 인자, 면역 독소, 뼈 형성 단백질(BMP), 인터페론-알파, -베타 및 -감마, 콜로니 자극 인자(CSF), 인터루킨 IL-1 내지 IL-10, 수퍼옥시드 디스뮤타제, T-세포 수용체, 표면 막 단백질, 붕괴촉진 인자, 바이러스 항원, 운반 단백질, 호밍(homing) 수용체, 어드레신, 조절 단백질, 인테그린, 종양 관련 항원, 및 이들의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
  28. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단리된 단백질을 제약 제제로 혼입하는 단계를 더 포함하는 방법.
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