DE19639346A1 - Verfahren zur Herstellung von rekombinanter Staphylokinase für therapeutische Zwecke - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanter Staphylokinase mit gentechnisch veränderten E. coli Stämmen als Wirkstofflösung für die therapeutische Anwendung am Menschen.

Die rekombinanten Staphylokinasen SAK42D und SAKSTAR exprimiert in gentechnisch veränderten Eschorichia coli wurden in präklinischen Studien als neue Fibrinolytika in der Humantherapie eingesetzt (Collen, D., Van de Werf, F.; Coronary Thrombolysis With Recombinant Staphylokinase in Patients With Evolving Myocardial Infarction, Circulation, L7 (1993), 1850-1853; Collen, D., Lÿnen, H.R.; Staphylokinase, a Fibrin-Specific Plasminogen Activator With Therapeutical Potential?, Blood, 54 (1994), 680-686; Vanderschueren, et.al; A Randomized Trial of Recombinant Staphylokinase versus Alteplase for Coronary Artery Patency in Acute Myocardial Infarction, Circulation 92 (1995); Vanderschueren, S. et. al.; Thrombolytic Therapy of Peripheral Arterial Occlusion With Recombinant Staphylokinase, Circulation, 92 (1995)). Ein behördlich zugelassenes Präparat mit dem Wirkstoff "rekombinante Staphylokinase" liegt gegenwärtig nicht vor.

In Schlott, B., Hartmann, M., Gührs, K.-H., Birch-Hirschfeld, E., Pohl, H.-D., Vanderschueren, S., Van de Werf, F., Michoel, A., Collen, D. and Behnke, D.; High Yield Production and Purification of Recombinant Staphylokinase for Thrombolytic Therapy, BioTechnology 12 (1994), 185-189 wird ein Verfahren zur Herstellung von SAK42D und SAKSTAR für den Labormaßstab (Fermentationsmaßstab max. 15 l) beschrieben. Die mit diesem Verfahren hergestellten Wirkstoffe dienten Forschungs- und Entwicklungszwecken. Die ausgewiesenen Endotoxingehalte in der Größenordnung von 10 EU/mg SAK deuten darauf hin, daß mit dem beschriebenen Verfahren kein Wirkstoff hergestellt werden kann, der die Qualitätskriterien eines gentechnisch hergestellten Arzneimittels erfüllt. Für gentechnisch hergestellte Arzneimittel wird z. B. ein Endotoxingehalt von < 1 EU/mg gefordert. Nachteilig ist weiterhin, daß die publizierten Daten keine quantitativen Angaben zu kritischen Kontaminationen (E. coli Proteine, Total-DNA, SAK-Degradationsprodukte) enthalten.

Auch das in EP 0 621 899 beschriebene Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Staphylokinase-Polypeptiden mit Plasminogen-Aktivator- Wirkung ist, wie das Ausführungsbeispiel 2 zeigt, nicht zur Herstellung eines Wirkstoffes für die Formulierung zum gentechnisch hergestellten Arzneimittel geeignet.

Anzustreben ist ein Verfahren, welches in der Lage ist, im Produktionsmaßstab (Fermentations-Netto-Volumen < 100 l) stabil und mit hoher Ausbeute hochreine rekombinante Staphylokinase für ein gentechnisch hergestelltes Arzneimittel bereitzustellen.

In Yoshimasa, S., et.al.; Production and Characterization of a Novel Tissue- Type Plasminogen Activator Derivate in Escherichia coli., Biotechnol. Prog., 10 (1994), 472-479 wird ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Gewebe- Plasminogenaktivator Derivates in E. coli beschrieben, gekennzeichnet dadurch, daß im 100-l-Fermentations-Maßstab mit einem Voll-Medium gearbeitet wird und eine Reinigungsprozedur zur Isolierung der inclusion bodies und deren Renaturierung erfolgreich ist.

Ähnlich, allerdings in kleinerem Fermentationsmaßstab (Schüttelkultur) und mit einem Sulfonierungsschritt, erfolgt im Labormaßstab die Herstellung von rekombinantem Rinder-Prothrombin-2 (DiBella, E.E., et.al., Expression and folding of recombinant bovine prethrombin-2 and ist activation to thrombin; J. Biol. Chem., 270 (1995), 163-169).

Weitere Verfahren für den Labormaßstab sind dargestellt in Schoner, B.E., et.al.; Isolation and purification of protein granules from Escherichia coli cells overproducing bovine growth hormone, Bio/Technology, 3 (1985), 151-155 für Rinder-Wachstumshormon; Kronheim, S.R., et.al; Purification and characterisation of human interleukin-1 expressed in Escherichia coli., Bio/Technology, 4 (1986) 1078-1082 für rekombinantes Interleukin-1; Kato, K., et.al.; Purification and characterization of recombinant human interleukin-2 produced in Escherichia coli., Biochem. Biophys. Res. Commun., 130 (1985), 692-699; Weber, D.V. and Bailon, P.; Application of receptor affinity chromatography to bioaffinity purification, J. Chromatogr., 510 (1990), 59-69 für rekombinantes Interleukin-2 und Estrada et.al.; High level expression of Streptokinase in Escherichia coli; Biotechnology, 10 (1992), 1138-1142 für rekombinante Streptokinase.

Nachteilig für diese Verfahren ist, daß sie aus Gründen der Verwendung von Vollmedien in der Fermentation und dem Einsatz von Zellaufschlußenzymen und/oder Detergentien problematisch hinsichtlich der Einsetzbarkeit des Produktes in der Humantherapie sind.

Im folgenden werden weitere Patentschriften diskutiert, die die gentechnische Herstellung von Plasminogenaktivatoren betreffen.

Die Patentanmeldung EP 242 836 beschreibt die gentechnische Konstruktion zur Herstellung von t-PA, enthält aber keine Angaben zum biotechnologischen Produktionsverfahren.

Gleiches gilt für US 5,219,569, in dem die gentechnische Konstruktion der Protease-resistenten Urokinase beschrieben wird.

In WO 94/00483 wird zur Reinigung von Kringel-enthaltenden Proteinen ein aus Kostengründen und chemischen Stabilitätsgründen gegenwärtig nicht in den Produktionsmaßstab übertragbares Reinigungskonzept auf der Basis der Affinitätschromatographie vorgestellt. Dieses Patent tangiert die nachfolgend beschriebene erfinderische Lösung nicht.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein biotechnologisches Herstellungsverfahren zur Gewinnung einer hoch reinen Staphylokinase- Wirkstoff-Lösung, die als Ausgangsstoff für ein Arzneimittel den Anforderungen an ein gentechnisch hergestelltes Arzneimittel gerecht wird, bereitzustellen. Insbesondere soll ein biotechnologisches Produktionsverfahren bereitgestellt werden, mit dem der durch das Patent EP 0 621 899 geschützte Wirkstoff Staphylokinase SAK42D für ein gentechnisch hergestelltes Arzneimittel gewonnen werden kann.

Das biotechnologische Herstellungsverfahren unter Nutzung des zellulär rekombinanten Wirts E. coli TG1 mit dem Vektor pMEX602sak42D reicht von der Konservierung, der Stammhaltung und der Fermentation, welche als Hochzelldichtefermentation ausgelegt werden kann (EP 0 511 226), bis zur Formulierung der Staphylokinase-Wirkstoff-Lösung.

Die erfindungsgemäße Lösung der gestellten Aufgabe liegt in einem Verfahren zur Herstellung einer Wirkstofflösung, enthaltend hoch reine, klinisch anwendbare reife rekombinante signalpeptidfreie Staphylokinase aus einem E. coli, der mit einem ein Staphylokinasegen tragenden Plasmid transformiert ist, wobei die Master Cell Bank (MCB), die Master Working Cell Bank (MWCB) und die Working Cell Bank (WCB) unter Verwendung qualitativ gleicher synthetischer Nährmedien und des Cryoprotectans Glycerin hergestellt werden, die Produktfermentation unter Verwendung des qualitativ gleichen synthetischen Nährmediums erfolgt, wobei die Produktbildung induziert wird und die Gewinnung des Produktes durch Verfahrensstufen erfolgt, welche ohne den Zusatz von Proteaseinhibitoren, Detergentien und Reduktionsmitteln durchlaufen werden.

Das beschriebene Verfahren besteht aus folgenden Teilschritten:

• - Herstellung einer Master Cell Bank (MCB),
• - Herstellung einer Master Working Cell Bank (MWCB),
• - Herstellung einer Working Cell Bank (WCB),
• - Produktfermentation,
• - Zentrifugation oder dynamische Druckfiltration der Kulturbrühe,
• - Resuspension der Biomasse,
• - Desintegration durch Hochdruckhomogenisation oder Zellpermeabilisierung,
• - anschließende Ultradiafiltration oder Mikrofiltration,
• - Reinigung durch Kationen-Austauschchromatographie
• - Reinigung durch Anionen-Austauschchromatographie
• - weitere Reinigung durch Hydrophobe Interaktionschromatographie,
• - Umpufferung in eine pharmazeutische Formulierungslösung, und
• - Sterilfiltration.

Das erfindungsgemäß verwendete synthetische Glukose-Mineralsalz-Medium (GMM), welches in allen mikrobiologischen Verfahrensschritten in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt wird, hat folgende qualitative Zusammensetzung: Glukose, Diammoniumhydrogenphosphat, Kaliumdi­ hydrogenphosphat, Citronensäure, Magnesiumsulfat, Eisencitrat, Cobaltchlorid, Mangansulfat, Kupfersulfat, Borsäure, Natriummolybdat, Zinkacetat, Titriplex III, Thiamin.

Durch die Verwendung qualitativ gleichartiger Nährmedien und der damit verbundenen vorteilhaften Kontrolle und Steuerung des Wachstums, ferner wegen der noch dargestellten spezifischen Verfahrensbedingungen werden reproduzierbare Übergangsbedingungen zwischen den mikrobiologischen Verfahrensstufen ermöglicht und die Anzahl und Dauer der einzelnen Verfahrensstufen begrenzt.

Hierdurch weisen die mikrobiologischen Verfahrensstufen folgende Vorteile auf: Substratlimitationen und Inhibition durch toxische Stoffwechselprodukte werden ausgeschlossen, hohe Lebendkeimzahlen des Mikroorganismus bei gleichzeitiger Fixierung des physiologischen Zustandes "exponentielles Wachstum" werden erreicht, die genetische Stabilität des Wirt-Vektor-Systems wird gewährleistet, Produktveränderungen durch proteolytische Aktivitäten werden während der Kultivierung vermieden.

Die Master Cell Bank (MCB) als erste erfindungsgemäße Verfahrensstufe dient als Stammreserve und als Impfmaterial für die Herstellung der Master Working Cell Bank.

Zur Konservierung der Master Cell Bank werden Glycerinkonserven von Zellmaterial eines E. coli Stammes, der Expressionsplasmide mit dem Staphylokinasegen enthält, insbesondere von E. coli TG1 pMEX602sak42D, angelegt. Das Staphylokinasegen ist innerhalb des Plasmides Bestandteil einer Expressionskassette enthaltend einen induzierbaren Promoter, insbesondere den tac-Promoter. Die Herstellung der MCB-Konserven erfolgt auf der Basis von 3 Vorkulturen und einer Fermentation in einem Laborfermenter mit Glukose-Mineralsalz-Medium (GMM) bei ca. 37°C.

Das sterilisierte GMM wird im Fermenter mit der 3. Vorkultur beimpft. Man erreicht zum Startzeitpunkt eine Trockenbiomasse-Konzentration (TBM- Konzentration) von 0,04 bis 0,08 g/l und am Fermentationsende von 15 bis 20 g/l. Die gekühlte Kulturlösung wird nach Zusatz von 10-20% v/v des Cryoprotectans Glycerin unter sterilen Bedingungen portioniert und gemäß einer vorgegebenen Kennlinie mit einem programmgesteuerten Gerät eingefroren.

Durch diese Vorgehensweise bleiben Lebendtiter, Vektorstabilität sowie die physiologischen Eigenschaften des rekombinanten E. coli Stammes über lange Zeiträume konstant.

Die Herstellung und Lagerung der Master Working Cell Bank (MWCB) erfolgt prinzipiell in der gleichen Weise wie die oben beschriebene Herstellung der MCB. Sie beinhaltet jedoch nur eine Vorkulturstufe (entsprechend der 3. Vorkulturstufe der MCB), die mit 0,1-0,2 ml der Zellsuspension einer MCB- Konserve beimpft wird.

Die MWCB liefert erfindungsgemäß das Impfmaterial für die Herstellung der Working Cell Bank (WCB). Die Herstellung der WCB erfolgt im Laborfermenter in der gleichen Weise wie die Herstellung der MWCB. Die Vorkultur wird hierbei jedoch mit 0,1-0,2 ml der Zellsuspension einer MWCB-Konserve beimpft.

Da die WCB als direktes Impfmaterial für die Produktfermentation verwendet wird, erfolgt die Abfüllung der gekühlten und mit Glycerin vermischten Kulturlösung in Portionen, die dem Volumen des zu beimpfenden Produktionsfermenters angepaßt sind. Durch die hohe Zellkonzentration der Konserven und die reproduzierbar hergestellten Konserven werden identische Startbedingungen für eine große Zahl von Produktfermentationen ermöglicht.

Die Produktfermentation erfolgt mit Glukose-Mineralsalz-Medium unter aerob submersen Bedingungen bei 37°C. Die im Fermenter sterilisierte Nährlösung wird mit einer Glycerinkonserve (WCB) oder einer geeigneten Vorkultur beimpft.

In der exponentiellen Wachstumsphase erfolgt bei einer ausgewählten TBM- Konzentration die Induktion der Staphylokinaseexpression, bei Verwendung des tac-Promoters, z. B. im Plasmid pMEX602sak42D, mit 0,2 mM IPTG (Isopropyl-thiogalactopyranosid). Die Kultivierung wird nach einer Induktionsdauer von 1,5 bis 3 h beendet (entspricht 1 bis 3 Verdopplungen der Biomasse nach Induktion). Die Glukosekonzentration liegt zum Zeitpunkt des Abbruchs der Fermentation bei 2-6 g/l.

Bei der Fermentation zu hohen Zelldichten (<60 g/l) wird nach der Beimpfung das Wachstum der E. coli-Zellen zunächst mit maximaler spezifischer Wachstumsrate realisiert, bis die im Medium vorgelegte C-Quelle vollständig verbraucht ist. Anschließend wird die spezifische Wachstumsrate über geregelte oder gesteuerte Zugabe der C-Quelle abgesenkt, um die Anhäufung inhibitorisch wirkender Stoffwechselprodukte bzw. eine O₂-Limitation zu vermeiden. Die Induktion der Produktbildung erfolgt bei einer Biomassekonzentration von 20-40 g/l durch Zugabe von IPTG. Nach weiteren 1-2,5 Verdopplungen der Biomasse wird die Fermentation beendet.

Nach dem Herunterkühlen werden die Wirtszellen mittels Zentrifugation in einer Röhrenzentrifuge oder dynamischer Druckfiltration mit einem Rotations­ scherspaltfilter aus der Kulturbrühe abgetrennt und in einem Kaliumphosphat- Puffer mit pH 9,2-9,8 resuspendiert.

Die resuspendierte Biomasse wird anschließend einer zweistufigen Hochdruckhomogenisation unterzogen, wobei der pH ständig bei 9,2-9,8 gehalten wird. Dieses pH-monitoring hat entscheidende Bedeutung für die hohe Stabilität der aus den Wirtszellen freigesetzten Staphylokinase gegenüber proteolytischem Abbau.

Damit wird eine Verwendung von pharmakologisch bedenklichen Substanzen, wie Proteaseinhibitoren, Detergentien oder Reduktionsmitteln im Verfahren vermieden.

Die Abtrennung der unlöslichen Bestandteile erfolgt erfindungsgemäß besonders effizient durch eine vierstufige Ultradiafiltration über Membranen mit einer Ausschlußgrenze von 100 kD nach dem cross-flow Prinzip. Ein ständiges Nachstellen des pH auf 9,2-9,8 ermöglicht eine hohe Ausbeute des rekombinanten Zielproteins im Permeat bei gleichzeitiger Abreicherung von Wirtszellproteinen.

Eine weitere Methode zur Produktfreisetzung ist erfindungsgemäß eine physikalisch/chemische Permeabilisierung der E. coli-Zellen kombiniert mit einer Abtrennung der Zellreste durch eine dynamische Druckfiltration. Dazu wird die Biomasse bei -70°C eingefroren und in einem Tris/EDTA-Puffer mit pH 9,2-9,6 resuspendiert. Diese Suspension wird anschließend mittels zweistufiger Rotationsscherspaltfiltration über eine 0,65 µm Membran von den Zellresten befreit, wobei eine Abreicherung von Wirtszellproteinen und chromosomaler DNA durch Verbleib in den permeabilisierten Zellen erfolgt.

Nach der Justierung des pH im Permeat der Ultradiafiltration bzw. Mikrofiltration auf 6,5 wird dieses direkt einer Kationen- Austauschchromatographie unterzogen, indem es auf eine Chromatographiesäule gepumpt wird, welche mit einem Kationenaustauscher, bevorzugt SP Sepharose High Performance, gepackt ist. Durch eine Elution dieser Säule mit einem kombinierten pH- und Leitfähigkeitsgradienten bei verringerter linearer Flußrate wird Staphylokinase mit einer Reinheit von < 99% gewonnen, wobei Wirtszellproteine und proteolytische Abbauprodukte der Staphylokinase mittels Fraktionierung aus dem Eluat der Kationen- Austauschchromatographie besonders vorteilhaft entfernt werden.

Zur Abreicherung von Nucleinsäuren und Endotoxinen auf ein pharmakologisch unbedenkliches Niveau pumpt man den Pool zweckmäßigerweise nach Verdünnung mit einem Puffer gleicher Leitfähigkeit und gleichem pH durch eine Chromatographiesäule, welche mit einem Anionenaustauscher, bevorzugt Q Sepharose Fast Flow, gepackt ist. Dabei werden Nucleinsäuren und Endotoxine auf dem Anionen-Austauscher zurückgehalten, während Staphylokinase nahezu quantitativ im Durchlauf gefunden wird.

Dieser kann nach dem Hochsalzen auf 3,5 M NaCl durch Zugabe von 5 M NaCl ohne weitere Prozeßschritte auf eine mit einem hydrophoben Medium, bevorzugt Phenyl Sepharose High Performance, gepackte Chromatographiesäule gepumpt werden. Die Elution des gebundenen Zielproteins erfolgt mit einem absteigendem Leitfähigkeitsgradienten, wobei Restbestandteile an Wirtszellproteinen abgetrennt werden.

Das Eluat der Hydrophoben Interaktionschromatographie wird anschließend durch Ultradiafiltration in einem 10 kD Spiralmodul retentatseitig aufkonzentriert und in eine pharmazeutische Formulierungslösung umpuffert, welche nachfolgend einer Sterilfiltration unterzogen wird.

Das beschriebene Reinigungsverfahren ermöglicht die einfache und effiziente Herstellung von hoch reiner rekombinanter Staphylokinase für die Therapie akuter thrombolytischer Erkrankungen.

Besonders hervorzuheben ist hierbei die für ein rekombinantes Produkt essentielle Abreicherung von kritischen Kontaminanten (Nucleinsäuren, Endotoxine und Wirtszellproteine) auf ein für die Humantherapie zulässiges Maß in nur 3 Chromatographieschritten.

Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung; sie sollen diese jedoch in keiner Weise limitieren.

Ausführungsbeispiel 1

Die einzelnen mikrobiologischen Verfahrensabschnitte umfassen die Herstellung der Master Cell Bank (MCB), die Herstellung der Master Working Cell Bank (MWCB), die Herstellung der Working Cell Bank (WCB) und die Produktfermentation.

Ausgangspunkt für die Herstellung der MCB ist eine Zellsuspension des Stammes E. coli TG1 pMEX602sak42D (beschrieben in EP 0 621 899), von welcher 0,1 ml auf Bacto-Nähragarplatten unter Zusatz von 100 mg/l Ampicillin ausgespatelt werden. Die beimpften Agarplatten werden 30-40 Stunden bei 37 °C inkubiert, bis sich Einzelkolonien von 2-3 mm entwickelt haben (1. Vorkultur).

Eine ausgesuchte Einzelkolonie der 1. Vorkultur wird auf Petrischalen mit Glukose-Mineralsalz-Agarmedium überimpft und bei 37°C bis zur Ausbildung eines dicht gewachsenen Impfstriches 28-32 Stunden inkubiert (2. Vorkultur).

Anschließend wird eine Petrischale der 2. Vorkultur mit 5 ml Glukose- Mineralsalz-Medium (GMM) abgeschwemmt. Ein 5-l-Erlenmeyerkolben mit 1 l GMM wird mit 1-2 ml dieser Zellsuspension beimpft und bei 37°C auf einem Rotationsschüttler (200 rpm) inkubiert. Die Kultivierung erfolgt bei exponentiellem Wachstum im pH-Bereich von 5,5 bis 7,0 bis zu einer Trockenbiomassekonzentration von 0,4 bis 0,8 g/l (3. Vorkultur).

Das synthetische Glukose-Mineralsalz-Medium hat für alle Vorkulturstufen folgende Zusammensetzung: Glukose × H₂O (10 g/l), (NH₄)₂ HPO₄ (2 g/l), KH₂PO₄ (2,66 g/l), Citronensäure (0,34 g/l), MgSO₄ × 7 H₂O (0,93 g/l), Eisen(Ill)-citrat × H₂O (29 mg/l), CoCl₂ × 6 H₂O (0,8 mg/l), MnSO₄ × H₂O (6,8 mg/l), CuSO₄ × 5 H₂O (1,3 mg/l), H₃BO₃ (1,14 mg/l), Na₂MoO₄ × 2 H₂O (0,5 mg/l), Zn(CH₃COO)₂ × 2 H₂O (4,2 mg/l), Titriplex III (1,7 mg/l), Thiamin­ hydrochlorid (4 mg/l), Ampicillin Na-Salz (100 mg/l), für die 2. Vorkultur Bacto- Agar (30 g/l), pH: 6,8 bis 7,0.

Nach Abschluß der Vorkultivierung erfolgt die Beimpfung von 10 l GMM im 15 l Laborfermenter (B. Braun Melsungen AG) mit 1 l der 3. Vorkultur.

Das synthetische Glukose-Mineralsalz-Medium für die Laborfermentation hat folgende Zusammensetzung: Glukose × H₂O (38,5 g/l), (NH₄)₂ HPO₄ (1 g/l), KH₂PO₄ (6,65 g/l) Citronensäure (1,7 g/l), MgSO₄ × 7 H₂O (1,2 g/l), Eisen(III)- citrat × H₂O (72 mg/l), CoCl₂ × 6 H₂O (2 mg/l), MnSO₄ × H₂O (17 mg/l), CuSO₄ × 5 H₂O (2,25 mg/l), H₃BO₃ (2,85 mg/l), Na₂MoO₄ × 2 H₂O (1,25 mg/l), Zn(CH₃COO)₂ × 2 H₂O (10,5 mg/l), Titriplex III (4,25 mg/l), Thiamin-hydrochlorid (4 mg/l), Ampicillin Na-Salz (100 mg/l), Ucolub N115 (0,03 ml/l), pH: 6,8 bis 7,0. Man erreicht zum Startzeitpunkt eine Trockenbiomassekonzentration (TBM) von 0,04 bis 0,08 g/l. Die Kultivierung von E. coli TG1 pMEX602sak42D wird bei einer Temperatur von 37°C, einem pH-Wert von 6,8, einem Druck von 100 kPa und einer Begasungsrate von 10 l min^-1 vorgenommen. Im Fermentationsverlauf wird der pO₂-Wert über die Rührerdrehzahl bei 35% und der pH-Wert durch geregelte Dosierung von 25%iger wäßriger Ammoniaklösung bei 6,8 konstant gehalten. Die Fermentation wird bei einer TBM-Konzentration von 15 bis 20 g/l nach ca. 8 bis 9 Verdopplungen der TBM, was einer Fermentationsdauer von 8 bis 10 Stunden entspricht, in der exponentiellen Wachstumsphase beendet. Um diese Biomassekonzentration zu erreichen, ist eine zusätzliche Glukosedosage von 200 g bei einer TBM- Konzentration von 6 bis 8 g/l erforderlich.

Für die Freigabe der Kulturlösung zur Konservierung sind das Erreichen der geforderten Biomassekonzentration, Kontaminationsfreiheit und die Einhaltung der vorgegebenen Fermentationsbedingungen entscheidend. Nach Abschluß der Fermentation wird die Kulturlösung im Fermenter auf 5-8°C gekühlt. Anschließend werden unter sterilen Bedingungen 600 g der Kulturlösung mit 600 g eisgekühlter 20%iger Glycerinlösung gemischt (Endkonzentration 10% v/v), in Portionen zu je 1 ml in 1,5 ml-Cryoröhrchen abgefüllt und gemäß einer vorgegebenen Kennlinie eingefroren (3°C/min bis 0°C, 1°C/min bis -70°C). Die Glycerinkonserven werden im Tiefkühlschrank bei -70°C gelagert.

Die Herstellung und Lagerung der MWCB erfolgt prinzipiell in der gleichen Weise wie die oben beschriebene Herstellung der MCB. Sie beinhaltet jedoch nur eine Vorkulturstufe (entsprechend der 3. Vorkultur der MCB), die mit 0,1-0,2 ml der Zellsuspension einer MCB-Konserve beimpft wird, welche bei 20-25°C aufgetaut wurde.

Die Herstellung der WCB erfolgt in der gleichen Weise wie die oben beschriebene Herstellung der MWCB. Die Vorkultur wird hierbei jedoch mit 0,1-0,2 ml der Zellsuspension einer MWCB-Konserve beimpft. Da die WCB als direktes Impfmaterial für die Produktfermentation im 100-l-Maßstab verwendet wird, erfolgt unter sterilen Bedingungen die Abfüllung der gekühlten Kulturlösung in Portionen zu je 450 g in 1-l-Schottflaschen, welche mit 300 g eines Glycerin/Wasser-Gemisches (50%) befüllt wurden (Glycerin- Endkonzentration: 20% v/v). Die fertigen Konserven enthalten ca. 750 g des Impfmaterials für die Produktfermentation und werden bei -70°C eingefroren.

Die qualitative und quantitative Zusammensetzung des für die Produktfermentation eingesetzten Glukose-Mineralsalzmediums entspricht dem oben beschriebenen Medium, welches für die Herstellung der MCB, MWCB und WCB bei der Laborfermentation verwendet wurde. Die im Fermenter sterilisierte Nährlösung wird mit 750 ml einer Glycerinkonserve (WCB) beimpft, die 0,5-1 Stunde vor Fermentationsbeginn bei 20-25°C aufgetaut wird.

Die TBM-Konzentration nach Beimpfung beträgt 0,05-0,1 g/l.

Die Kultivierung des rekombinanten E. coli.-Stammes erfolgt unter aerob submersen Bedingungen bei einer Temperatur von 37°C, einem pH-Wert von 6,8 einem Druck von 50 kPa und einer Begasungsrate von 100 l min^-1. Im Fermentationsverlauf wird der pO₂-Wert über die Rührerdrehzahl bei 35% und der pH-Wert durch geregelte Dosierung von 25%iger wäßriger Ammoniaklösung bei 6,8 konstant gehalten.

Bei exponentiellem Wachstum mit maximaler spezifischer Wachstumsrate (µ_max = 0,7-0,75 h^-1) erfolgt nach ca. 5-6 Verdopplungen der Anfangsbiomasse bei einer TBM-Konzentration von 4-4,5 g/l die Induktion der Staphylokinasebildung mit 0,2 mM IPTG. Die Fermentationsdauer bis zu diesem Zeitpunkt beträgt ca. 6 Stunden. Der weitere Fermentationsverlauf ist durch eine Abnahme der spezifischen Wachstumsrate und eine Anreicherung des Zielproduktes Staphylokinase im Cytoplasma der E. coli-Zellen gekennzeichnet. Die Kultivierung wird bei einer TBM-Konzentration von 12-14 g/l beendet, was einer Induktionsdauer von 2 bis 2,5 h entspricht, bei ca. 1,5 Verdopplungen der Biomasse nach IPTG-Induktion. Die Glukosekonzentration liegt zum Zeitpunkt des Abbruchs der Fermentation bei 2 bis 5 g/l. Zu diesem Zeitpunkt erfolgt die Vorbereitung für die Primäraufarbeitung durch Absenkung des Temperatursollwertes auf 5°C bis 8°C, wodurch die Abkühlung der Kulturlösung in einem Zeitraum von ca. 30 Minuten erreicht wird.

Die produkttragenden Zellen werden mittels einer Röhrenzentrifuge aus der Kulturbrühe separiert. Die so gewonnene Feuchtbiomasse wird unter Verwendung einer Leitstrahlmischturbine in 50 l Puffer (10 mM K₂HPO₄, 5 mM EDTA, pH 9,5) resuspendiert.

Vor der anschließenden Desintegration wird der pH-Wert der Resuspension mit 20 Ma% KOH auf 9,5 justiert. Die Desintegration erfolgt zweistufig in einem Hochdruckhomogenisator bei einem Druck von 600 bar. Nach jedem Desintegrationsschritt wird der pH im Desintegrat auf 9,5 hochgestellt.

Unlösliche Bestandteile werden durch Ultradiafiltration mit einer Cross Flow- Filtrationsanlage unter Verwendung von Membrankassetten (OMEGA Screen Channel, 100 kD, Pall) mit einer Gesamtfilterfläche von 1,84 m² abgetrennt. Die Ultradiafiltration wird in vier Stufen durchgeführt. Vor jeder Stufe erfolgt ein Auffüllen des Desintegrats bzw. Retentats mit gereinigtem Wasser auf 170-180 kg und die Justierung des pH-Wertes auf 9,2-9,8. Vor der zweiten Stufe wird 1 M K₂HPO₄, pH 9,5 (1,5 l) zugesetzt. Das aufgefüllte Desintegrat und die aufgefüllten Retentate werden bei jedem Ultradiafiltrationsschritt auf 20-25 kg konzentriert.

Das gewonnene Gesamtpermeat (580-620 l) wird nach pH-Einstellung (6,5 mit 20 Ma% H₃PO₄) mit einer Flußrate von 60 l/h auf eine mit 10 mM KH₂PO₄, pH 6,5 equilibrierte Chromatographiesäule gepumpt, welche mit 10 l SP Sepharose High Performance (Pharmacia) gepackt ist (d = 30 cm, h = 11 cm). Nach der Beladung wird die Säule mit 100 l Equilibrierungspuffer gewaschen und anschließend bei einer Flußrate von 9 l/h mit 100 mM K₂HPO₄, pH 9,3 (linearer Gradient 0-100%, 100 l Gradientenvolumen) eluiert. Aus dem Hauptelutionspeak, welcher SAK42D in hochangereicherter Form enthält, werden Fraktionen gewonnen.

Die Fraktionen mit einem SAK42D-Gehalt von < 99% (SDS-PAGE/HPLC) werden vereinigt, mit dem gleichen Volumen 25 mM KH₂PO₄, pH 7,4 verdünnt und mit einer Flußrate von 6 l/h auf eine mit 25 mM KH₂PO₄, pH 7,4 equilibrierte Chromatographiesäule gepumpt, welche mit 1 l Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia) gepackt ist (d = 10 cm, h = 11 cm). Dabei werden Nucleinsäuren und Endotoxine auf dem Säulenmaterial adsorbiert, während Staphylokinase die Säule ungebunden passiert. Dementsprechend wird der Durchlauf gesammelt und nachfolgend mittels Zugabe von 5 M NaCl auf eine Leitfähigkeit eingestellt, welche dem Startpuffer der nächsten Chromatografiestufe (10 mM KH₂PO₄, 3,5 M NaCl, pH 6,5) entspricht.

Die so vorbereitete Lösung wird mit einer Flußrate von 60 l/h auf eine mit 10 mM KH₂PO₄, 3,5 M NaCl, pH 6,5 equilibrierte Chromatographiesäule gepumpt, welche mit 10 l Phenyl Sepharose High Performance (Pharmacia) gepackt ist (d = 30 cm, h = 12 cm). Nach einer Wäsche mit 50 l Equilibrierungspuffer erfolgt die Elution der gebundenen Staphylokinase mit einem linearen, absteigenden Leitfähigkeitsgradienten bei einer Flußrate von 60 l/h (Gradientenvolumen: 25 l, Elutionspuffer: 10 mM KH₂PO₄, pH 6,5).

Der gewonnene Pool der Hydrophoben Interaktionschromatografie wird durch Diafiltration mit einem Spialmodul S10Y10 (amicon) auf eine SAK42D- Konzentration von 3-5 g/l eingestellt und anschließend in einen Formulierungspuffer folgender Zusammensetzung umgepuffert:

NaH₂PO₄ × 2 H₂O 0,99 g/l
Na₂HPO₄ × 2 H₂O 1,24 g/l pH 6,80 ± 0,05
NaCl 8,20 g/l

Dabei erfolgt die Diafiltration mit dem 5-6fachen Volumen Formulierungspuffer. Die formulierte SAK42D-Lösung wird abschließend durch einen Filter (0,22 µm, SuporCap 50, Gelman) sterilfiltriert. Tabelle 1 weist die Gehalte an kritischen Kontaminationen in der nach dem oben beschriebenen Verfahren gewonnenen SAK42D-Wirkstofflösung exemplarisch aus.

Tabelle 1

Ausführungsbeispiel 2

Die Fermentation des E. coli-Produzentenstammes und die Primäraufarbeitung der Feuchtbiomasse bis zum Permeat der Ultradiafiltration erfolgt analog Ausführungsbeispiel 1. Anschließend wird, wie in EP 0 621 899 beschrieben, die chromatographische Reinigung durchgeführt.

60 l des gewonnenen Gesamtpermeats werden nach pH-Einstellung (6,5 mit 20 Ma% H₃PO₄) mit einer Flußrate von 6 l/h auf eine mit 10 mM KH₂PO₄, pH 6,5 equilibrierte Chromatographiesäule gepumpt, welche mit 1 l SP Sepharose High Performance (Pharmacia) gepackt ist (d = 10 cm, h = 11,1 cm). Nach der Beladung wird die Säule mit 10 l Equilibrierungspuffer gewaschen und anschließend bei einer Flußrate von 6 l/h mit 10 mM K₂HPO₄, 0,5 M NaCl, pH 6,5 (linearer Gradient 0-100%, 10 l Gradientenvolumen) eluiert. Aus dem Hauptelutionspeak, welcher SAK42D in angereicherter Form enthält, werden Fraktionen gewonnen.

Die Fraktionen mit einem SAK42D-Gehalt von < 85% (SDS-PAGE) werden vereinigt, und nachfolgend durch Zugabe von festem NaCl auf eine Leitfähigkeit eingestellt, welche dem Startpuffer der nächsten Chromatografiestufe (10 mM KH₂PO₄, 3,5 M NaCl, pH 6,5) entspricht. Die so vorbereitete Aufgabe wird mit einer Flußrate von 2,4 l/h auf eine mit 10 mM KH₂PO₄, 3,5 M NaCl, pH 6,5 equilibrierte Chromatographiesäule gepumpt, welche mit 300 ml Phenyl Sepharose High Performance (Pharmacia) gepackt ist (BioPilot Column 60/100, d = 6 cm, h = 10 cm). Nach einer Wäsche mit 0,6 l Equilibrierungspuffer erfolgt die Elution der gebundenen Staphylokinase mit einem linearen, absteigenden Leitfähigkeitsgradienten bei einer Flußrate von 2,4 l/h (Gradientenvolumen: 3 l, Elutionspuffer: 10 mM KH₂PO₄, pH 6,5). Der gewonnene Pool der Hydrophoben Interaktionschromatografie wird durch Diafiltration mit einem Spialmodul S1Y10 (amicon) auf eine SAK42D- Konzentration von 3-5 g/l eingestellt und umgepuffert (15 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4).

Die umgepufferte SAK42D-Lösung wird abschließend durch einen Filter (0,22 µm, Vacucap, Gelman) sterilfiltriert. Die erreichten Produktreinheiten sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2

Claims (27)

1. Verfahren zur Herstellung einer Wirkstofflösung, enthaltend hochreine klinisch anwendbare, reife rekombinante signalpeptidfreie Staphylokinase durch Fermentation eines E. coli-Stammes, der mit einem ein Staphylokinasegen tragenden Plasmid transformiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Master Cell Bank (MCB), die Master Working Cell Bank (MWCB) und die Working Cell Bank (WCB) unter Verwendung qualitativ gleicher synthetischer Nährmedien und des Cryoprotectans Glycerin hergestellt werden, die Produktfermentation unter Verwendung des qualitativ gleichen synthetischen Nährmediums erfolgt, wobei die Produktbildung induziert wird und die Gewinnung des Produktes durch Verfahrensstufen erfolgt, die nach der Produktfermentation ohne Zusatz von Proteaseinhibitoren, Detergentien und Reduktionsmitteln durchlaufen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirt/Vektorsystem E. coli mit einem Expressionsplasmid verwendet wird, dessen für Staphylokinase kodierende DNA-Sequenz mit einer induzierbaren Expressions-Kontrollsequenz verknüpft ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirt/Vektorsystem E. coli TG1 pMEX602sak42D verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante Staphylokinase SAK42D hergestellt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ausgehend von einer Standkultur 3 Vorstufen passagiert werden, und der Kulturlösung der folgenden Laborfermentorstufe nach Ernte in der exponentiellen Wachtumsphase am Ende das Cryoprotectans Glycerin zugesetzt wird, die gewonnene Kulturlösung portioniert wird und die Portionen kontrolliert eingefroren und konserviert werden (MCB).

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit einer Portion, gewonnen gemäß Anspruch 5, eine Vorkultur beimpft wird und nachfolgend wie in Anspruch 5 die Laborfermention folgt und anschließend das Gemisch aus Glycerin und Kulturlösung portioniert und kontrolliert eingefroren wird (MWCB).

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit einer Portion, gewonnen gemäß Anspruch 6, eine Vorkultur beimpft wird und nachfolgend wie in Anspruch 6 eine Laborfermentation folgt, die Kulturlösung geerntet wird, Glycerin zugesetzt und in geeigneter Weise portioniert und eingefroren wird (WCB).

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung im Hauptfermentor durch Beimpfen eines Glukose-Mineralsalzmediums mit einer Konserve, gewonnen nach Anspruch 7, erfolgt, wobei die Produktbildung induziert wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bis zu hohen Zelldichten durch gesteuerte bzw. geregelte Zugabe der C-Quelle erfolgt, und anschließend die Produktbildung induziert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Produktbildung durch IPTG induziert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß 1 bis 3 Verdopplungen der Biomasse ab dem Induktionszeitpunkt erfolgen.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen mittels Zentrifugation oder dynamischer Druckfiltration aus der Kulturbrühe gewonnen werden.

13. Verfahren nach Anspruch 1 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Biomasse in einem Kaliumphosphat-Puffer mit pH 9,2-9,8 resuspendiert wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Staphylokinase durch Desintegration mit einem Hochdruckhomogenisator bei pH 9,2-9,8 aus den Wirtszellen freisetzt.

15. Verfahren nach Anspruch 1 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Biomasse eingefroren und anschließend zur Zellpermeabilisierung in einem Tris/EDTA- Puffer mit pH 9,2-9,6 resuspendiert wird.

16. Verfahren nach Anspruch 1, 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß zum Zellaufschluß keine Detergentien, Reduktionsmittel oder Proteaseinhibitoren zugesetzt werden.

17. Verfahren nach Anspruch 1, 14 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß unlösliche Bestandteile und Wirtszellproteine mittels Ultradiafiltration bei pH 9,2-9,8 abgetrennt werden.

18. Verfahren nach Anspruch 1, 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellreste nach der Permeabilisierung durch Diafiltration bei pH 9,2-9,6 in einem dynamischen Druckfilter abtrennt.

19. Verfahren nach Anspruch 1, 13, 14, 15, 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, daß in den Primäraufarbeitungsschritten ein proteolytischer Abbau der Staphylokinase durch Einstellung des pH auf 9,2-9,8 weitgehend verhindert wird.

20. Verfahren nach Anspruch 1, 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, daß man das Permeat der Ultradiafiltration oder Mikrofiltration mit einem pH von 6,5 einer Kationen-Austauschchromatographie unterzieht.

21. Verfahren nach Anspruch 1 und 20, dadurch gekennzeichnet, daß Staphylokinase durch einen kombinierten pH- und Leitfähigkeitsgradienten bei reduzierter linearer Flußrate selektiv von dem Kationen-Austauscher eluiert wird.

22. Verfahren nach Anspruch 1 und 21, dadurch gekennzeichnet, daß Wirtszellproteine und proteolytische Abbauprodukte der Staphylokinase mittels Fraktionierung aus dem Eluat der Kationen-Austauschchromatographie entfernt werden.

23. Verfahren nach Anspruch 1 und 22, dadurch gekennzeichnet, daß man das Eluat der Kationen-Austauschchromatographie zur Abreicherung von Nucleinsäuren und Endotoxinen einer Anionen-Austauschchromatographie unterzieht.

24. Verfahren nach Anspruch 1 und 23, dadurch gekennzeichnet, daß man den Durchlauf der Anionen-Austauschchromatographie nach dem Hochsalzen auf 3,5 M NaCl zur Abreicherung von Wirtszellproteinen einer Hydrophoben Interaktionschromatographie unterzieht.

25. Verfahren nach Anspruch 1 und 24, dadurch gekennzeichnet, daß Staphylokinase selektiv mit einem absteigenden Leitfähigkeitsgradienten von dem hydrophoben Chromatographiemedium eluiert wird.

26. Verfahren nach Anspruch 1 und 25, dadurch gekennzeichnet, daß man das Eluat der Hydrophoben Interaktionschromatographie durch Ultradiafiltration aufkonzentriert und in eine pharmazeutische Formulierungslösung umpuffert.

27. Verfahren nach Anspruch 1 und 26, dadurch gekennzeichnet, daß die umgepufferte Staphylokinase-haltige Wirkstofflösung nachfolgend einer Sterilfiltration unterzogen wird.