AT400443B - Menschliche mangan-superoxiddismutase cdna, ihre expression in bakterien und verfahren zur gewinnung enzymatisch aktiver, menschlicher mangan-superoxiddismutase - Google Patents

Description

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In der vorliegenden Beschreibung wird auf verschiedene Veröffentlichungen mit in Klammer gesetzten arabischen Ziffern hingewiesen. Eine volle Zitierung dieser Literaturhinweise findet sich am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Patentansprüchen. Es wird auf die gesamte, in diesen Veröffentlichungen enthaltene Offenbarung Zum Zwecke der Erläuterung des Standes der Technik, wie er dem Fachman bis zum Datum der Anmeldung der vorliegenden Erfindung bekannt war, verwiesen.

Superoxiddismutase (SOD) und das Phänomen der freien Sauerstoffradikale (O2-) wurden 1968 von McCord und Fridovich (1) entdeckt. Superoxidradikale und andere hochreaktive Sauerstoffarten werden in jeder atmenden Zelle als Nebenprodukte eines oxidativen Stoffwechsels gebildet, und es hat sich gezeigt, daß sie für eine große Zahl von Makromolekülen und Zellkomponenten (siehe 2,3) äußerst schädlich sind. Eine als Superoxiddismutasen bekannte Gruppe von Metallproteinen katalysiert die Oxidations-Reduktionsreaktion 202- + 2H2O — H2O2 + O2 und schafft somit einen Abwehrmechanismus gegen eine Sauerstofftoxizität.

Es sind mehrere Formen von SOD bekannt, die verschiedene Metalle und verschiedene Proteine enthalten. Metalle, die in SOD enthalten sein können, sind Eisen, Mangan, Kupfer und Zink. Alle bekannten Formen von SOD katalysieren dieselbe Reaktion. Diese Enzyme finden sich in verschiedenen evolutären Gruppen. Superoxiddismutasen, die Eisen enthalten, finden sich hauptsächlich in prokaryotischen Zellen. Kupfer und Zink enthaltende Dismutasen hat man im wesentlichen in allen eukaryotischen Organismen gefunden (4). Superoxiddismutasen, die Mangan enthalten, wurden in Organismen, angefangen von Mikroorganismen bis zum Menschen, gefunden.

Da jedes biologische Makromolekül als Ziel für eine schädigende Wirkung, verursacht durch die vagabundierenden Superoxidradikale, dienen kann, hat man begonnen, sich für das therapeutische Potential von SOD zu interessieren. Die Literatur läßt erkennen, daß SOD auf einen weiten klinischen Anwendungsbereich eingesetzt werden kann, wie beispielsweise gegen Onkogenese und Tumorwachtum und zur Minderung der cytotoxischen und cardiotoxischen Nebenwirkungen von Antikrebsmitteln (10), zum Schutz von ischämischen Geweben (12) und zum Schutz von Spermatozoen (13). Weiters besteht ein Interesse, die Auswirkungen von SOD auf den Alterungsprozeß zu untersuchen.

Die Forschung im Zusammenhang mit menschicher SOD hat sich hauptsächlich auf ihre Verfügbarkeit beschränkt.

Superoxiddismutase ist auch wegen ihrer entzündungshemmenden Eigenschaften von Interesse (11). Es wurde erkannt, daß vom Rind stammende Superoxiddismutase (Orgotein) entzündungshemmende Eigenschaften besitzt. Es wird derzeit in Teilen Europas als Humanpharmazeuticum vertrieben. In den USA wird es als Veterinärpräparat, insbesondere für die Behandlung von entzundenen Sehen bei Pferden, verwendet. Die Zulieferung von Orgotein ist jedoch beschränkt. Frühere Verfahren, welche die Gewinnung aus Rinderzellen oder anderen tierischen Zellen umfaßten, sind starken Einschränkungen unterworfen und das gewonnene Orgotein kann bei Menschen, da es nicht menschlichen Ursprungs ist, zu allergischen Reaktionen führen.

Kupfer-Zink-Superoxiddismutase (CuZn-SOD) ist die am meisten und besten untersuchte Art der verschiedenen Formen der Superoxiddismutase.

Menschliche CuZn-SOD ist ein dimeres Metalleprotein bestehend aus identischen, nicht kovalent gebundenen Untereinheiten, von denen jede ein Molekulargewicht von 16.000 Dalton besitzt und ein Kupfer-und ein Zinkatom enthält (5). Jede Untereinheit besteht aus 153 Aminosäuren, deren Sequenz festgestellt wurde (6, 7).

Die menschliches CuZn-Superoxiddismutase codierende cDNA wurde geklont (8). Die vollständige Sequenz der geklonten DNA wurde ebenfalls bestimmt (9). Außerdem wurden die Expressionsvektoren enthaltend die Superoxiddismutase codierende DNA für die Herstellung und die Gewinnung von Superoxiddismutase in Bakterien beschrieben (24, 25). Die Expression einer Superoxiddismutase-DNA und die Herstellung von SOD in Hefe wurde ebenfalls bereits geoffenbart (26).

Vor kurzem wurde die Genplazierung an menschlichem Chromosom 21 gekennzeichnet (27) und wurden die jüngsten Entwicklungen betreffend CuZn-Superoxiddismutase zusammengefaßt (28).

Weniger ist über Mangan-Superoxiddismutase (MnSOD) bekannt. Die MnSOD von E. Coli k-12 wurde geklont und aufgezeichnet. Barra et al. offenbaren eine 196-Aminosäuresequenz für das aus menschlichen Leberzellen isolierte MnSOD-Polypeptid (19). Die Aussagen des Standes der Technik differieren jedoch hinsichtlich der Struktur des MnSOD-Moleküls, insbesondere darüber, ob es zwei oder vier identische Polypeptiduntereinheiten besitzt (19, 23). Es ist jedoch klar, daS das MnSOD-Polypeptid und das CuZnSOD-Polypeptid nicht homolog sind (19). Die Aminosäuresequenzhomologen von MnSODsen und FeSOD aus verschiedenen Quellen wurden ebenfalls verglichen (18).

Baret et al zeigen in einem Rattenversuch, daß die Halbwertszeit von menschlicher MnSOD wesentlich länger ist als von menschlicher Kupfer-SOD; sie haben weiters gefunden, daß im Rattenversuch men- 2

AT 400 443 B schlche MnSOD und Kupfer-SOD von Ratten als entzündungshemmende Mittel unwirksam sind, wogegen Kupfer-SOD aus Rindern und die aus Menschen volle Witksamkeit besitzt (20).

McCord et al. zeigen in "in vitro"-Tests, daß die natürlich vorkommende menschliche Mangan-Superoxiddismutase menschliche phagocytierende polymorphonucleare (PMN) Leukozyten vor freien Superoxidradikalen besser schützt als CuZn-Superoxiddismutase vom Rind oder Schwein (21).

Vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines cDNA-Moleküls, welches das menschliche Supero-xiddismutasepolypeptid oder Analogen oder Mutanten hievon codiert. Weiters bezieht sich die Erfindung auf die Einführung dieser cDNA in wirksame baktierielle Expressionsvektoren zum Zwecke der Herstellung von menschlichem MnSOD-Polypeptid, von Analogen, Mutanten und Enzymen hievon in Bakterien und der Gewinnung der bakteriell erzeugten menschlichen MnSOD-Polypeptiden,Analogen oder Mutanten hievon, sowie auf deren Verwendung.

Weiters betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung enzymatisch aktiver menschlicher MnSOD in Bakterien sowie auf ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung dieser enzymatisch aktiven menschlichen MnSOD.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung menschlicher Mangan-Superoxiddismutase oder von Analogen oder Mutanten hievon zur Katalysierung der Reduktion von Superoxidradikalen zu Wasserstoffperoxid und molekularem Sauerstoff. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von bakteriell erzeugter MnSOD oder Analogen oder Mutanten hievon zum Zwecke der Reduzierung der Rückperfusionsgefahr nach Ischämie und der Verlängerung der Überlebensdauer von exzisierten isolierten Organen. Weiters betrifft die Erfindung die Verwendung von bakteriell erzeugter MnSOD oder von Analogen hievon zur Behandlung von Entzündungen.

Ein DNA-Molekül, welches cDNA, codiert mit Mangan-Superoxiddismutase, einem Analogen oder einem Mutanten hievon, enthält, wurde aus einer menschlichen T-Zellen-cDNA-bank isoliert. Die Nucleotidsequenz eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, welches menschliches Mangan-Superoxiddismutasepolypeptid codiert, wurde entdeckt. Die Sequenz eines Stranges, der das Polypeptid oder ein Analoges hievon codiert, ist in Fig. 1 vom Nucleotid 115 nach unten bis einschließlich zum Nucleotid 708 gezeigt. Andere Sequenzen, welche das Analoge oder den Mutanten codieren, können im wesentlichen ähnlich dem das Polypeptid codierenden Strang sein. Die Nucleotidsequenz eines Stranges eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, welches ein vierundzwanzig-(24) Aminosäurevorpeptid codiert, ist ebenfalls in Figur 1 von den Nucleotiden 43 bis einschließlich 114 gezeigt.

Das doppelsträngige DNA-Molekül oder ein anderes doppelsträngiges DNA-Molekül, das einen Nucleo-tidstrang enthält, der die das menschliche Mangan-Superoxiddismutasepolypeptid oder eines seiner Analogen oder Mutanten codierende Sequenz aufweist, kann in einen Clonbildungsträger, wie z.B. ein Plasmid oder Virus, incorporiert werden. Jedes DNA-Molekül kann in eine entweder prokaryotische, z.B. bakterielle Zelle, oder in eine eukaryotische Zelle, wie eine Hefe- oder Säugetierzelle, unter Anwendung bekannter Methoden, einschließlich, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, Methoden, die Clonbildungsträger enthaltend irgendein Molekül einsetzen, eingeführt werden.

Vorzugsweise wird die menschliches Mangan-Superoxiddismutasepolypeptid, ein Analoges oder einen Mutanten davon codierende cDNA oder DNA in ein Plasmid, z.B. pMSE-4 oder pMSARB4 incorporiert und sodann in eine geeignete Wirtszelle eingeführt, wo die DNA exprimiert und das menschliche Mangan-Superoxiddismutase(hMnSOD)-Polypeptid oder eines seiner Analogen oder Mutanten gebildet werden. Bevorzugte Wirtszellen sind Escheria coli, insbesondere E. coli A4255 und E. coli A6145. Das Plasmid pMSE-4 im E. coli Stamm A4255 wurde bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer 53250 deponiert. Das Plasmid pMS RB4 kann wie in Figur 4 gezeigt und in der im Zusammenhang mit der Besprechung derselben erläuterten Weise erhalten werden.

Zellen, in die solche DNA-Moleküle eingeführt worden waren, können nach bekannten Methoden unter entsprechenden Bedingungen, die eine Transkription der DNA in mRNA und Expression als mRNA-Produkt ermöglichen, gezüchtet oder gewachsen werden. Das resultierende Mangan-Superoxiddismutaseprotein kann sodann gewonnen werden.

Es können auch Veterinärpräparate und pharmazeutische Präparate, die menschliche MnDOS oder Analogen oder Mutanten hiervon enthalten, hergestellt werden. Diese menschliche Mangan-Superoxiddismutase oder Analogen oder Mutanten hiervon können verwendet werden,um folgende Reaktionen zu katalysieren: 2SO2- + 2H+ -*· H2O2 + O2 und dabei durch Superoxidradikale verursachte Zellschäden zu vermindern. 3

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Insbesondere können diese Enzyme, Analogen oder Mutanten hiervon verwendet werden, um Schäden, verursacht durch Rückperfusion nach Ischämie, zu reduzieren, die Überlebenszeit excisierter isolierter Organe zu erhöhen oder Entzündungen zu behandeln.

Demnach betrifft die vorliegende Erfindung ein Plasmid für die Expression eines menschlichen Mangan-Superoxiddismutaseanalogen in einer geeigneten Wirtszelle, welches die enzymatische Aktivität der natürlich vorkommenden menschlichen Superoxiddismutase besitzt, dadurch gekennzeichnet, daß das Analoge im wesentlichen aus zwei oder vier nicht kovalent verknüpften Polypeptiden besteht, wobei jedes dieser Polypeptide 199 Aminosäuren aufweist und wobei die Sequenz eines jeden dieser Polypeptide Methionin an seinem N-Terminus unmittelbar neben dem Lysin, codiert durch die Nucleotide 115-117 der Fig. 1A, aufweist und sich bis zum Lysin, codiert durch die Nucleotide 706-708 der Fig. 1B, fortsetzt, welches der COOH-Terminus der das Polypeptid aufweisenden, dieses Polypeptid codierenden DNA ist, und daß geeignete regulierende Elemente im Plasmid derart angeordnet sind, daß sie die Expression des Polypeptids und die Bildung des menschlichen Mangan-Superoxiddismutaseanalogen in der Wirtszelle ermöglichen.

Weiters bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines enzymatisch aktiven Analogen oder Mutanten der menschlichen Mangan-Superoxiddismutase mit im wesentlichen derselben Aminosäuresquenz und der biologischen Aktivität wie die der natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxiddismutase durch Expression des vorstehend erläuterte Plasmids. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kultur von Bakterienzellen in einem Zuchtmedium, welches derart mit einer nicht-wachstumshemmenden Menge von Mn++ versetzt ist, daß die Konzentration an Mn++ im Medium während des Wachstums der Bakterien höher als 2 ppm ist, züchtet, wobei die Bakterienzellen ein wie vorstehend definiertes Plasmid enthalten, das die das Analoge der menschlichen Mangan-Superoxiddismutase codierende DNA enthält, und die Zellen zur Expression der das Analoge der menschlichen Mangan-Superoxiddismutase codierenden DNA befähigt sind und wobei die genannte Kultur unter derart geeigneten Bedingungen gezüchtet wird, daß die DNA exprimiert und das Analoge der menschlichen Mangan-Superoxiddismutase in den Bakterienzellen erzeugt wird; und man das enzymatisch aktive Analoge oder den Mutanten der so erzeugten menschlichen Mangan-Superoxiddismutase gewinnt.

Vorzugsweise werden beim erfindungsgemäßen Verfahren als Bakterienzellen Zellen von Escherichia Coli verwendet.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Verfahren zuerst die Isolierung der Bakterienzellen aus dem Produktionsmedium und die Suspendierung derselben in einer Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 bis 8,0.

Die Zeilen werden sodann aufgebrochen und zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit 30 bis 120 min auf eine Temperatur zwischen 55 und 65 *C, vorzugsweise 45-75 min auf 58-62 °C und insbesondere 1 h lang auf 60C erhitzt und sodann auf unter 10 "C, vorzugsweise auf 4°C, abgekühlt. Jede sich bildende Fällung wird entfernt, beispielsweise abzentrifugiert, und die gekühlte überstehende Flüssigkeit gegen einen Puffer, beispielsweise 2 mM Kaliumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von etwa 7,8, dialysiert. Vorzugsweise erfolgt die Dialyse durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Filtrationsmembrane, die kleiner als 30K ist. Gleichzeitig mit oder nach der Dialyse kann die überstehende Flüssigkeit auf ein zweckentsprechendes Volumen, beispielsweise auf 0,03 seines ursprünglichen Volumens, eingeengt werden. Das Retentat wird sodann auf einer Anionenaustauscher -Chromatographierkolonne mit einer gepufferten Lösung, beispielsweise einer Lösung von wenigstens 20 mM Kaliumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von etwa 7,8, eluiert. Die Fraktionen von Elutionsmittel enthaltend Superoxiddismutase werden aufgenommen, vereinigt und gegen etwa 40 mM Kaliumacetat, pH 5,5, dialysiert. Die dialysierten vereinigten Fraktionen werden sodann durch eine Kationenaustauscher-Chromatographierkolonne mit einem linearen Gradienten von 40 bis 200 mM Kaliumacetat und einem pH von 5,5 eluiert. Die Peakfraktionen enthaltend die Superoxiddismutase werden aufgenommen und vereinigt. Gegebenenfalls können sodann die vereinigten Peakfraktionen gegen eine geeignete Lösung, wie z.B. Wasser oder eine Pufferlösung von etwa 10 mM Kaliumphposphatpuffer mit einem pH-Wert von etwa 7,8, dialysiert werden.

Weiters betrifft die Erfindung gereinigte, enzymatisch aktive, menschliche Mangan-Superpoxiddismuta-se oder Analogen hievon, wie z.B. met-hMnSOD oder Mutanten, die nach den erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden.

Die Erfindung wird unter Hinweis auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert.

FIG. 1 Die Sequenz der menschlichen MnSOD cDNA

Die Fig. 1 zeigt die Nucleotidsequenz eines Stranges eines doppelsträngigen Moleküls, welches die menschliche Mangan-Superoxiddismutase kodiert, sowie die 198 Aminosäuresequenz von menschlichem MnSOD entsprechend der DNA-Sequenz. Weiters zeigt die Fig. 1 die Nucleotidsequenz eines Stranges 4

AT 400 443 B eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, welches ein Vorpeptid des ausgereiften menschlichen MnSOD codiert, bestehend aus 24 Aminosäuren, sowie die Aminosäuresequenz entsprechend der DNA-Sequenz. Weiters sind Teile der 5' und 3' nicht entschlüsselten Sequenzen gezeigt. 5 FIQ. 2 Konstruktion von pMSE-4: Menschliches MnSOD-Expressionsplasmid

Plasmid pMS8-4, enthaltend MnSOD an einer EcoRI (Ri) Schnittstelle wurde vollständig mit Ndel- und Narl-Restriktionsenzymen verdaut. Das große Fragment wurde isoliert und, wie in Flg. 2 gezeigt ist, mit einem synthetischen Oiigomer ligiert. Das resultierende Plasmid, pMSB-NN, enthält den Codierungsbereich io für ausgereifte MnSOD, dem ein ATG-Initiationscodon vorangeht. Das vorgenannte Plasmid wurde mit EcoRI verdaut, die Enden wurden mit Klenov-Fragmenten von Polymerase 1 aufgefüllt und weiter mit Ndel gespalten. Das kleine, das MnSOD-Gen enthaltende Fragment wurde in pSODa13 eingeführt, das mit Ndel und Stul behandelt wurde. pSODa13 kann nach der Methode gemäß der US-PS 4,742,004, ausgegeben am 3. Mai 1988, erhalten werden. Dieses Plasmid pMSE-4, welches den MnSOD-Codierungsbereich, dem die 75 cll-Ribosomalbindungsstelle vorgeschaltet ist, enthält, wird unter der Kontrolle eines xPL-Promotors erhalten. Plasmid pMSE-4 wurde bei der American Culture Collection mit der Hinterlegungsnummer 53250 deponiert. FIG. 3 Auswirkung der Mnl + + Konzentration auf die Aktivität von SPD erzeugt in E. Coli 20 Das Diagramm gemäß Fig. 3 zeigt die Koorelation zwischen der spezifischen Aktivität in Einheiten/mg der rekombinanten löslichen MnSOD, erzeugt durch den E. coli Stamm A4255 enthaltend Plasmid pMSE-4 sowohl unter nicht induzierenden (32 *C) als auch unter induzierenden (42 °C) Bedingungen, und der Konzentration von Mn++(ppm) im Zuchtmedium. 25 FIG. 4 Konstruktion von pMS RB4: Menschliches MnSOD Expressionsplasmid

TetR Expressionsvektor, pARB, wurde aus pSOD/Si 11 durch vollständige Verdauung mit EcoRI gefolgt von einer teilweisen Spaltung mit BamHI-Restriktionsenzymen erzeugt. pSODj8iT-11 wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) mit der Hinterlegungsnummer 53468 deponiert. Das vrdaute Plasmid 30 wurde mit synthetischem Oiigomer ligiert 5'- AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3’ 3'- G GG CCCAG AT CT AG ACTAG - 5'

Das EcoRI-Fragment des MnSOD-Expressionsplasmids pMSE-4, enthaltend cll-Ribosomalbindungsstellen und die komplette Codierungsfrequenz für das ausgereifte Enzym, wurde in die einzige EcoRI-Stelle von p 35 RB eingeführt. Das resultierende Plasmid, pMSARB4, enthält MnSOD-Gene unter der Kontolle von XPL und eil RBS und verleiht eine Resistenz gegen Tetracyclin.

Es wurde ein doppelsträngiges DNA-Molekül, welches eine cDNA, die ein menschliches Mangan-Superoxiddismutasepolypeptid oder Analogen oder Mutanten hievon codiert, enthält, aus einer menschlichen T-Zellen-cDNA-Bank isoliert. Die Nucleotidsequenz eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, welches 40 menschliches Mangan-Superoxiddismutasepolypeptid oder Analogen oder Mutanten hievon codiert, wurde entdeckt. Die Sequenz eines Stranges eines DNA-Moleküls, welcher die menschliche Mangan-Superoxid-dismutase oder deren Analogen oder Mutanten codiert, ist in Figur 1 gezeigt und umfaßt die Nucleotidnum-mern 15 bis einschließlich 7o8. Die Sequenz auf einem Strang, der hMnSOD oder Mutanten codiert, ist ähnlich dem Strang, welcher hMnSOD-Polypeptid codiert. Die Nucleotidsequenz des Polypeptids der 45 menschlichen Mangan-Superoxiddismutase ist ebenfalls in Figur 1 gezeigt. Die Nucleotidzahlen 43 bis einschließlich 114 codieren für dieses Peptid.

Die Methoden der Herstellung der cDNA und der Bestimmung der Sequenz der DNA, die das menschliche Mangan-Superoxiddismutasepolypeptid, Analogen oder Mutanten hievon codiert, sind dem Fachmann bekannt und werden später näher beschrieben. Überdies können nun, da die DNA-Sequenz, so welche die menschliche Mangan-Superoxiddismutasecodiert, entdeckt ist, bekannte Synthesemethoden angewendet werden, um DNA-Moleküle herzustellen, die Teile dieser Sequenz enthalten.

Herkömmliche Klonbiidungsträger, wie Plasmide, z.B. pBR322, Viren oder Bakteriophagen, z. B.X, können unter Anwendung bekannter Methoden modifiziert oder entwickelt werden, um auf diese Weise neue Klonbiidungsträger zu erzeugen, die cDNA enthalten welche menschliches Mangan-Superoxiddismuta-55 sepolypeptid oder Analogen und Mutanen hievon codiert. In gleicher Weise können solche Klonbiidungsträger derart modifiziert oder entwickelt werden, daß sie DNA-Moleküle enthalten, von denen ein Strang ein Segment, welches die in Fig. 1 gezeigte Sequenz für menschliches Mangan-Superoxiddismutasepolypeptid hat, oder im wesentlichen diesem ähnliche Segmente enthält. Die inserierten DNA-Moleküle können können 5

AT 400 443 B nach verschiedenen Methoden, einschließlich enzymatische oder chemische Synthesen, hergestellt werden.

Die resultierenden Klonbildungsträger sind chemische Größen, die In der Natur nicht Vorkommen und nur durch die allgemein als rekombinante DNA-Technologie bezeichnete moderne Technologie geschaffen werden können. Vorzugsweise ist der Klonbildungsträger ein Plasmid, z.B. pMSE-4 oder pMSARB4. Diese Klonbildungsträger können entweder in prokaryotische Zellen, wie in Bakterienzellen (Escheria coli, B.subtilis usw.), oder in eukaryotische Zellen, z.B. Hefezellen oder Zellen von Säugetieren, unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Methoden, wie Transformation, Transfektion u.dgl., eingeführt werden. Die Zellen in welche die Klonbildungsträger eingeführt werden, enthalten demnach eine cDNA, die menschliches Mangan-Superoxiddismutasepolypeptid oder deren Analogen und Mutanten codiert, wenn die cDNA im Klonbildungsträger zugegen war, oder enthalten eine DNA, die einen Strang aufweist, der zur Gänze oder von dem ein Teil die Sequenz für menschliches MnSOD-Superoxiddismutasepolypeptid gemäß Fig. 1 oder eine hiezu im wesentlichen gleiche Sequenz, wenn eine solche DNA im Klonbildungsträger zugegen war, enthält.

Escheria coli sind die bevorzugten Wirtszellen für die erfindungsgemäßen Klonbildungsträger. Ein zur Zeit bevorzugter auxotropher Stamm von E. coli ist A1645, enthaltend Plasmid pApoE-Ex2, der bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, U.S.A. unter der Hinterlegungsnummer 39787 deponiert wurde. Alle Hinterlegungen bei der American Type Culture Collection, auf welche im Zusammenhang mit vorliegender Erfindung verwiesen wird, wurden entsprechend dem Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen durchgeführt. A1645 wurde aus A1637 durch Selektion für GAL+(Fähigkeit, Galactose zu fermentieren sowie Verlust an Tetracyclinresistenz gewonnen. Er enthält nach wie vor Elemente des Phagen λ. Sein Phenotyp ist C600 r"m+ gal+ thr" leu- lac“ bl (Xcl857 Hl BamHI N+). A1637 wurde aus C600 durch Einführung von Trampeson enthaltendem, tetracyclinresistentem Gen in das Galactose-Operon sowie Elementen von Phagen X,einschließlich den Elementen, die für die cl-Repressorsynthese verantwortlich sind, erhalten. C600 ist an der American Type Culture Collection, Hinterlegungsnummer 23724, verfügbar.

Prototrophe Stämme von Escheria coli, die eine hohe Polypeptidexpression auch dann ermöglichen, wenn sie in einem Minimalmedium gezüchtet worden waren, sind sogar noch bevorzugter als Wirte für die Expression von Genen, welche Mangan-Superoxiddismutase codieren. Ein derzeit bevorzugter prototropher Stamm ist A2455. Ein Stamm A4255, welcher das Plasmid pMSE-4 enthält, wurde bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer 53250 deponiert.

Die resultierenden Zellen, in welche die das menschliche Mangan-Superoxiddismutasepeptid oder ein Analoges oder einen Mutanten hievon codierende DNA eingeführt wurde, können behandelt werden, indem man sie beispielsweise in geeigneter Weise unter entsprechenden, dem Fachmann bekannten Bedingungen kultiviert züchtet, so daß die DNA die Expression der durch die DNA codierten Information leitet, z.B. die Expression des hMnSOD-Polypeptids oder eines Analogen oder Mutanten hievon, und die Zelle das hMnSOD-Polypeptid oder eines Analogen oder Mutanten hievon, das sodann gewonnen werden kann, exprimiert. im Zusammenhang mit vorliegender Beschreibung betrifft der Ausdruck "Superoxiddismutase" (SOD) ein Enzym oder ein Polypeptid, das auf Superoxid oder freie Sauerstoffradikale wie Rezeptoren reagiert oder folgende Reaktion katalysiert: 202- + 2H+ - O2 H2O2

Der Ausdruck "menschliches Mangan-Superoxiddismutasepolypeptid" (MnSOD) betrifft jedes Superoxiddis-mutasemolekül, welches das Element Mangan in irgendeiner seiner chemischen Formen enthält.

Der Ausdruck "menschliches Mangan-Superoxiddismutasepolypeptid” bezieht sich auf ein Polypeptid mit 198 Aminosäuren, wovon ein Teil der Aminosäuresequenz in Fig. 1 gezeigt ist; der N-Terminus der Sequenz ist das Lysin, welches durch die Nucleotide 115-117 gemäß Fig. 1 codiert ist, der COOH-Terminus ist das durch die Nucleotide 706-708 gemäß Fig. 1 codierte Lysin.

Der Ausdruck "Polypeptidmangankomplex" bezieht sich auf ein Molekül, welches ein menschliches Mangan-Superoxiddismutasepolypeptid in einem Komplex mit Mangan in irgendeiner seiner chemischen Formen enthält und welches die enzymatische Aktivität natürlich vorkommender menschlicher Mangan-Superoxiddismutase besitzt.

Der Ausdruck "menschliche Mangan-Superoxiddismutase" bezieht sich auf ein Molekül, welches wenigstens zwei menschliche Mangan-Superoxiddismutasepolypeptide in einem Komplex mit Mangan in irgendeiner seiner chemischen Formen enthält und weiches die enzymatische Aktivität von natürlich vorkommemder menschlicher Mangan-Superoxiddismutase besitzt. 6

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Der Ausdruck "menschliches Mangan-Superoxiddismutasepolypeptid -Analoges" bezieht sich auf ein Polypeptid, welches ein menschliches Mangan-Superoxiddismutasepolypeptid aufweist, bei dem an eines oder beide Enden eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren gebunden sind.

Der Ausdruck "Polypeptidmangankomplex-Analoges” bezieht sich auf ein Molekül, welches einen Polypeptid-Mangankomplex enthält, dessen Polypeptidteil an eines oder beide seiner Enden gebunden eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren aufweist.

Der Ausdruck "menschliches Mangan-Superoxiddismutase-Analoges" bezieht sich auf ein Molekül, das wenigstens zwei Polypeptide, von denen wenigstens eines ein menschliches Mangan-Superoxiddismutase-polypeptid-Analoges ist, in einem Komplex mit Mangan in irgendeiner seiner chemischen Formen aufweist und welches die enzymatische Aktivität von natürlich vorkommender menschlicher Mangan-Superoxiddis-mutase besitzt.

Der Ausdruck "menschlicher Mangan-Superoxiddismutasepolypeptid -Mutant" bezieht sich auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen identisch zu der des menschlichen Mangan-Superoxiddismutasepeptids ist, sich jedoch von diesem durch eine oder mehrere Aminosäuren unterscheidet.

Der Ausdruck "Polypeptidmangankomplex-Mutant" bezieht sich auf ein Molekül, welches einen menschlichen Mangan-Superoxiddismutasepolypeptid -Mutanten in einem Komplex mit Mangan in irgendeiner seiner chemischen Formen enthält und welches die enzymatische Aktivität von Mangan-Superoxiddis-mutase besitzt.

Der Ausdruck "menschlicher Mangan-Superoxiddismutase-Mutant" bezieht sich auf ein Molekül, das wenigstens zwei Polypeptide enthält, von denen wenigstene eines ein menschlicher Mangan-Superoxiddis-mutasepolypeptid -Mutant in einem Komplex mit Mangan in irgendeiner seiner chemischen Formen ist und welches die enzymatische Aktivität von natürlich vorkommender menschlicher Mangan-Superoxiddismutase besitzt.

Die Mutanten von hMnSOD-Polypeptid und hMnSOD, die einen Teil der Erfindung bilden, können durch mutieren der in Fig. 1 gezeigten DNA-Sequenz hergestellt werden, wobei der N-Terminus dieser Sequenz das durch die Nucleotide 115-117 codierte Lysin ist und der COOH-Terminus derselben durch die Nucleotide 706-708 codiert wird.

Die DNA kann im Zuge von dem Fachmann bekannten Methoden mutiert werden, wie z.B. gemäß Bauer et al., Gene 37: 73-81 (1985). Die mutierte Sequenz kann, wie hier beschrieben wird, in entsprechende Expressionsvektoren inseriert werden, welche in die Zellen eingeführt werden, die sodann in einer Weise behandelt werden, daß die mutierte DNA die Expression der hMnSOD-Polypeptide und der hMnSOD-Mutanten leitet.

Es wird angenommen, daß die enzymatisch aktive Form der menschlichen Mangan-Superoxiddismutase ein Protein mit wenigstens zwei, möglicherweise mit vier Untereinheiten ist, von denen jede annähernd 198 Aminosäuren in der in Fig. 1 gezeigten Sequenz für menschliche Mangan-Superoxiddismutase besitzt, wobei der N-Terminus der Sequenz das Lysin, codiert durch die Nucleotide 115-117 gemäß Fig. 1, und der COOH-Terminus das Lysin, codiert durch die Nucleotide 706-708 gemäß Fig. 1 ist.

Menschliche MnSOD oder Analogen oder Mutanten hievon können aus Zellen erzeugt werden, in die DNA oder cDNA eingeführt wurde, welche menschliche Mangan-Superoxiddismutase oder Analoge oder Mutanten hievon kodiert. Die menschliche MnSOD oder deren Analogen oder Mutanten können verwendet werden, um die Dismutation oder univalente Reduktion von Superoxidanion in Gegenwart von Protonen unter Bildung von Wasserstoffperoxid nach der folgenden Gleichung zu katalysieren: 20z- + 2H+ - HzOz + 02

Es können Veterinärpräparate und pharmazeutische Präparate hergestellt werden, die wirksame Mengen an hMnSOD oder einem oder mehreren hMnSOD-Analogen oder -Mutanten und einen geeigneten Träger enthalten. Solche Träger sind allgemein bekannt. Die MnSOD oder Analogen oder Mutanten hievon können direkt in Form eines Präparates an das Tier oder den Menschen verabreicht werden, beispielsweise um einen an Entzündungen leidenden Patienten zu behandeln oder um eine durch freie Sauerstoffradikale bei Rückperfusion nach einer Ischämie oder Organtransplantation auftretende Gefährdung zu reduzieren. Die MnSOD oder ein Analoges oder Mutant hievon kann auch direkt oder in Form eines Präparates dem Perfusionsmedium eines isolierten Organs zugegeben werden, um eine Schädigung des isolierten Organs durch freie Sauerstoffradikale bei der Perfusion nach der Excision zu reduzieren und so die Überlebensperiode des Organs zu verlängern. Weiters kann die hMnSOD oder ein Analoges oder Mutant hievon dazu verwendet werden, die neurologische Schädigung bei Rückperfusion nach einer Ischämie zu reduzieren und um bronchiale Lungendysplasie zu behandeln. 7

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Ein Verfahren zur Herstellung von aktiver menschlicher Mangan-Superoxiddismutase oder eines Analogen oder Mutanten hievon in einer Bakterienzelle wurde ebenfalls gefunden. Die Bakterienzelle enthält eine die menschliche Mangan-Superoxiddismutase oder ein Analoges oder einen Mutanten hievon codierende DNA-Sequenz und ist zur Expression derselben befähigt. Die Methode umfaßt die Haltung der Bakterienzel-5 le unter geeigneten Bedingungen in einem geeigneten Produktionsmedium. Das Produktionsmedium ist mit einer solchen Menge an Mn++ versetzt, daß die Konzentration an Mn++ im Medium größer ist als 2 ppm.

Die Bakterienzelle kann irgendein Bakterium sein, in welchem eine DNA-Sequenz, die menschliche Mangan-Superoxiddismutase codiert, durch rekombinante DNA-Techniken eingeführt wurde. Das Bakterium muß zur Expression der DNA-Sequenz und zur Erzeugung des Proteinproduktes befähigt sein. Die io entsprechenden Bedingungen und das Produktionsmedium variieren in Abhängigkeit von der Art des Bakterienstammes.

Die Bakterienzelle kann die DNA, welche die Superoxiddismutase codiert, im Körper eines Vektor-DNA-Moleküls, wie eines Plasmids, enthalten. Der Vektor oder das Plasmid wird mittels rekombinaten DNA-Techniken konstruiert, so daß die Sequenz, welche die SOD codiert, an einer geeigneten Stelle im Molekül 75 inkorporiert ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Bakterienzelle eine Escheria coli Zelle. Ein bevorzugter auxotropher Stamm von E. coli ist A1645. Ein bevorzugter prototropher Stamm von E. coli ist A4255. Die E. coli Zelle gemäß vorliegender Erfindung enthält ein Plasmid, welches für eine menschliche Mangan-Superoxiddismutase oder ein Analoges oder einen Mutanten hievon codiert. 20 Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Bakterienzelle das Plasmid pMSE-4. Eine Methode zur Konstruktion dieses Plasmids ist in der Figurenbeschreibung erläutert, das Plasmid selbst ist in Beispiel 2 beschrieben. Dieses Plasmid wurde unter der Hinterlegungsnummer 43250 bei der ATCC deponiert.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungform der Erfindung enthält die Bakterienzelle das 25 Plasmid pMSARB4. Eine Methode der Konstruktion dieses Plasmids ist in der Figurenbeschreibung erläutert, das Plasmid selbst ist in Beispiel 5 beschrieben. Dieses Plasmid kann aus pSOD0iT-11 konstruiert werden, das unter der Hinterlegungsnummer 53468 bei der American Type Culture Collection deponiert.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein enzymatisch aktives menschliches Mangan-30 Superoxiddismutase-Analoges durch E. coli-Stamm-A4255-Zellen, enthaltend das Plasmid pMSE-4 und durch E. coli-Stamm-A4255-Zellen, enthaltend das Plasmid pMS RB4, erzeugt.

Das Produktionsmedium für Bakterienzellen kann jede Art annehmbarer Zuchtmedien, wie Caseinhydro-lysat oder LB (Luria Brühe)-Medium, sein, wobei letzteres bevorzugt ist. Geeignete Wachstumsbedingungen variieren mit dem Stamm E. coli und dem Plasmid, welches er enthält, beispielsweise wird E. coli A4255 35 enthaltend das Plasmid pMSE-4 bei 42 "C induziert und etwa 1 bis 5 Stunden lang auf dieser Temperatur gehalten. Die geeigneten Temperaturbedingungen, die Zeit, die Bewegung und die Belüftung zur Züchtung des Inoculum und der Kultur zu einer gewünschten Dichte vor der Produktionsphase sowie zur Aufrechterhaltung der Kultur in der Produktionsperiode können variieren und sind dem Fachmann bekannt.

Die Konzentration von Mn++ Ion im Medium, die notwendig ist, um enzymatisch aktive MnSOD zu 40 erzeugen, variiert mit der Art des verwendeten Mediums.

Im LB-Wachtumsmedium haben sich Mn++ Konzentationen von 150 ppm bis 750 ppm als wirksam erwiesen. Es ist bevorzugt, daß in allen komplizierten Arten von Wachstumsmedien die Konzentration von Mn++ 50 bis 1500 ppm beträgt.

Die spezifischen Bestandteile eines geeigneten Ansatzes, der Kultur und des Inoculations- und Produk-45 tionsmediums können variiren und sind dem Fachmann bekannt.

Die Erfindung betrifft weiters ein Verfarehn zur Gewinnung von menschlicher Mangan-Superoxiddismutase oder Analogen oder Mutanten hievon aus Bakterienzellen, welche diese enthalten. Die Zellen werden zuerst behandelt, um eine Proteinfraktion enthaltend Proteine zu gewinnen, die in Zellen enthaltend menschliches Mangan-Superoxiddismutase oder Analogen oder Mutanten hievon zugegen sind, wonach die so Proteinfraktion behandelt wird, um menschliche Mangan-Superoxiddismutase oder Analogen oder Mutanten hievon zu erhalten.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Zellen zuerst behandelt, um lösliche Proteine von unlöslichen Proteinen und Zellwandbruchstücken abzutrennen, wonach die löslichen Proteine gewonnen werden. Die so gewonnenen löslichen Proteine werden sodann behandelt, um eine 55 Fraktion der löslichen Proteine, die menschliche Mangan-Superoxiddismutase oder Analoge oder Mutanten hievon enthalten, abzutrennen, beispielsweise zu fällen, wonach die Fraktion gewonnen wird. Die Fraktion wird sodann behandelt, um getrennt die menschliche Mangan-Superoxiddismutase oder deren Analogen oder Mutanten zu gewinnen. 8

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In der Folge wird eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung beschrieben. Zuerst werden die Bakterienzeilen aus dem Produktionsmedium isoliert und in einer geeigneten Lösung mit einem pH von etwa 7,0 oder 8,0 suspendiert. Die Zellen werden sodann aufgebrochen und zentrifugiert. Die resultierende überstehende Flüssigkeit wird während 30 bis 120 min auf eine Temperatur von 55 bis 65 *C, vorzugsweise 45*75 min auf 58 bis 62 °C, und insbesondere 1 h auf 60'C erhitzt und sodann auf unter 10 °C, vorzugsweise auf etwa 4· C, abgekühlt. Ein allfälliger Niederschlag, der sich während der Abkühlung bilden könnte, wird beispielsweise durch Zentrifugieren entfernt, wonach die gekühlte überstehende Flüssigkeit gegen einen geeigneten Puffer dialysiert wird. Vorzugsweise wird die gekühlte überstehende Flüssigkeit durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Filtrationsmembrane, die kleiner als 30K, vorzugsweise 10K, ist, durchgeführt. Ein brauchbarer Puffer ist ein 2 mM Kaliumphosphatpuffer mit einem pH von etwa 7,8. Nach oder zugleich mit dieser Dialyse kann die überstehende Flüssigkeit gegebenenfalls auf ein entsprechendes Volumen eingeengt werden. Ein Volumen von 0,03 des ursprünglichen Volumens der überstehenden Flüssigkeit hat sich als zweckmäßig erwiesen. Das Retentat wird sodann an einer Anionen-austauscher-Chromatographierkolonne mit einer entsprechend gepufferten Lösung, z.B. mit einer Lösung mit wenigstens 20 mM Kaliumphosphatpuffer mit einem pH von etwa 7,8, eluiert. Die Superoxiddismutase enthaltenden Fraktionen des Elutionsmittels werden aufgenommen, vereinigt und gegen etwa 40 mM Kaliumacetat, pH 5,5, dialysiert. Die dialysierten vereinigten Fraktionen werden sodann durch eine Kationen-austauscherChromatographierkolonne mit einem linearen Gradienten von 40 bis 200 mM Kaliumacetat (KOAC) und einem pH von 5,5 eluiert. Die Peak-Fraktionen enthaltend die Superoxiddismutase werden aufgenommen und vereinigt. Gegebenenfalls können die vereinigten Peakfraktionen sodann gegen eine entsprechende Lösung, z.B. Wasser oder eine Pufferlösung von etwa 10 mM Kaliumphosphat mit einem pH von etwa 7,8, dialysiert werden.

Die Erfindung betrifft weiters gereinigte, d.h. im wesentlichen von anderen Substanzen menschlichen Ursprungs freie menschliche Mangan-Superoxiddismutase oder Analoge oder Mutanten hievon, wie sie nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden. Insbesondere betrifft sie ein menschliches Mangan-Superoxiddismutase-Analog mit wenigstens zwei Polypeptiden, von denen wenigstens eines die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz, deren N-Terminus das durch die Nucleotide 115-117 gemäß Fig. 1 codierte Lysin und deren COOH-Terminus das durch die Nucleotide 706-708 gemäß Fig. 1 codierte Lysin hat, plus einen zusätzlichen Methioninrest am N-Terminus (Met-hMnSOD) aufweist. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft gereinigte Met-hMnSOD mit einer spezifischen Aktivität von 3500 Einheiten/mg.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, ohne auf diese beschränkt zu sein, näher erläutert. Die Beispiele enthalten keine detaillierten Beschreibungen der konventionellen Methoden, wie sie für die Konstruktion der Vektoren, der Einführung von Genen, welche Polypeptide codieren, in solche Vektoren, oder der Einführung der resultierenden Plasmide in Wirtszellen. Die Beispiele enthalten auch keine detaillierte VBeschreibung der konventionellen Methoden, die angewendet werden, um die durch solche Wirtsvektorsysteme erzeugten Polypeptide zu prüfen oder um die Identität solcher Polypeptide durch Aktivitäts-Markierung von isoelektrisch fokussierenden Gelen (lEF-Gel) (isoelectric focussing gels). Diese Methoden sind dem Fachmann allgemein bekannt und in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben, von dene als Beispiele die folgenden angegeben sind: T. Maniatis, E.F.Fritsch und J.Sombrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory, New York (1982) J.M. McCord und I. Fridovich, J. Biol. Chem. 244:6049-55 (1969). C. Beauchamp und I. Fridovich, Anal. Biochem. 44:276-87 (1971).

Beispiel 1:

Um MnSOD cDNA-Klone zu identifizieren, wurden gemischte Oligomerproben gemäß der veröffentlichten Aminosäuresequenz (18,19) synthetisiert. 9

AT 400 443 B 5' —Probe - mer Sequenz von AAi» AAs*. (18,19) TTGCATAATTTGTGCCTTAATGTGTGGTTC T G τ 6 g e 3*-Probe - mer Sequenz von AA*·*«? (18) 5' 3'

TCTGTTACGTTTTCCCAGTTTATTACGTTCCA 6 G 6 G

Die aus 30 Nucleotiden bestehende 5'-Probe entspricht den Aminosäuren 15 bis 24 von gereifter MnSOD. Die 3'-Probe bestehend aus 32 Nucleotiden entspricht den Aminosäuren 179 bis 189 von gereifter MnSOD. Die 5'-Probe ist eine Mischprobe bestehend aus 36 verschiedenen Sequenzen, wie oben gezeigt ist. Die 3'-Probe ist eine Mischprobe bestehend, wie oben gezeigt, aus 19 verschiedenen Sequenzen. (Wenn an einer gegebenen Position mehr als ein Nucleotid gezeigt ist, so ist die DNA mit äquivalenten Mengen eines jeden der gezeigten Nucleotiden synthetisiert worden, so daß die Mischprobe entstand).

Die 5'-Probe wurde verwendet, um 300.000 Plaques von einer T-Zellen-cDNA-Bank, in den gt-10-Vektor geklont, auszusieben. Die Hybridisierung zu Phagenplaquereplicas, immobilisiert auf Nitrocellulosefiltern, wurde nach Standardmethoden (Maniatis et al. supra) durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierung bei 50 °C in 8xSSC während 16 h durchgeführt wurde. Die Filter wurden sodann bei 50 °C mit 5xSSC und 0,1 SDS gewaschen. Drei positive Plaques wurden isoliert und mit Phi, MS8, Phi, MS1 und Phi MS1J bezeichnet.

EcoRl-Verdauungsprodukte von DNA aus Phi MS8 und Phi MS1 zeigten, daß beide etwa 800 bp lange cDNA-lnsertionen aufweisen, welche sowohl zur 5'- als auch zur 3'-Oligonucleotidprobe hybridisieren. Phi MS1J hatte nur ein 450 bp cDNA-lnsert, welches nur zur 5'-£ndprobe hybridisierte.

Die EcoRI-lnsertionen der drei Phagenklone wurden in die AcoRI-Stellen von pBR322 subgeklont, um pMS8-4, pMS1-4 bzw. pMS1J zu erhalten. Die Restriktionsanalyse und Hybridisierung der 5' und 3' Oligonucleotidproben zeigte gleichartige Muster sowohl für pMS8-4 und pMS1-4. Die folgende Restriktionskarte, welche die 5'— 3' -Orientierung zeigt, wurde für beide Plasmide abgeleitet. S1

Baml StuI

RI RI PvuII PvuII Seal

I , I.100 200 300 ΖΣΖ400 500 600 n—700 800

Die Sequenz des cDNA-lnserts von pMS8-4 ist in Fig. 1 gezeigt. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz unterscheidet sich von der veröffentlichten Aminosäuresequenz (19) dadurch, daß Glu an Stelle von Gin an drei (3) Stellen (AA 42, 88, 108) aufscheinen und zusätzlich zwei Aminosäuren, Gly und Trp zwischen AAi 23—1 24· zugegen sind. Die Sequenzanalyse von pMS1-4 und pMS1J zeigte, daß die drei MnSOD-Klone unabhängig abgeleitet waren und bestätigte diese Unterschiede von der veröffentlichten Aminosäuresequenz.

Der Sequenz-Upstream des N-endständigen Lysins von gereifter MnSOD sagt eine Sequenz von 24 Aminosäuren voraus. 10

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Beispiel 2:

Konstruktion von pMSE-4: Menschliches MnSOD-Expressionsplasmid

Der Ausgangspunkt für die Konstruktion von pMSE-4 ist das Plasmid pMS8-4, welches wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde. Plasmid pMS8-4, welches menschliche MnSOD-cDNA oder eine EcoRI-Schnittstelle enthält, wurde vollständig mit Ndel- und Narl-Restriktionsenzymen verdaut. Das große Fragment wurde isoliert und mit einem synthetischem Oligomer, wie in Fig. 2 gezeigt, verbunden. Das resultierende Plasmid pMS8-NN enthält den Codierungsbereich für das gereifte MnSOD, dem ein ATG-Initiationscodon vorangeht. Das obgenannte Plasmid wurde mit EcoRI verdaut, Enden wurden mit Klenow-Fragment von Polymerase I aufgefüllt und weiter mit Ndel gespaltet. Das kleine, die MnSOD enthaltende Fragment wurde in pSOD 13 inseriert, die mit Ndel und Stul behandelt wurde. pSOD 13 kann in der in der US-PS 4,742,004, ausgegeben am 3. Mai 1988, die hiermit als Bezugshinweis aufgenommen wird, beschriebenen Weise erhalten werden. Dieses gebildete Plasmid pMSE-4 enthält den MnSOD Codierungsbereich, dem die cll-ribosomale Bindungsstelle vorangeht und der vom XPL -Promotor kontrolliert wird. Plasmid pMSE-4 wurde unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 53250 deponiert. Alle in den oben genannten Verfahren angewendeten Methoden sind im wesentlichen dieselben wie die in Manitatis, supra, beschriebenen.

Beispiel 3:

Expresion der recombinanten menschlichen MnSOD

Plasmid pMSE-4 wurde in Escherichia coli Stamm A4255 unter Anwendung bekannter Methoden eingeführt. Sodann wurden E. coli Stamm 4255, enthaltend pMSE-4, bei 32 °C in Luria-Brühe (LB) als Nährmedium enthaltend 100 ng/ml Ampicillin gezüchtet, bis die optische Dichte (OD) bei 600 nm 0,7 betrug.

Die Induktion wurde bei 42‘C durchgeführt. Zu verschiedenen Zeitintervallen genommene Probmen wurden der Natriumdodecylsulfat Polyacrylamidgel - Elekrophorese (SDS-PAGE) unterworfen. Die Gele zeigten einen Anstieg der Werte an menschlichem MnSOD bis zu 120 min post-lnduktion, in welchem Stadium das rekombinante MnSOD-Protein zu 27% aus Gesamtzellprotein bestand, wie durch Scannen von mit Coomassie-Blau markiertem Gel festgestellt wurde. Das Schallen der Proben während 90 sec in einem W-375-Schallgerät und die Aufteilung der Proteine in lösliche (s) und unlösliche (p) Fraktionen durch Zentrifugieren bei 10.000 g während 5 min zeigte, daß der größte Teil der erzeugten rekombinanten MnSOD unlöslich war. Die induzierte lösliche Proteinfraktion enthielt nur wenig mehr SOD-Aktivität als das nicht induzierte Gegenteil, wie durch Standardmethoden ermittelt wurde. Siehe McCord et al., supra. Anscheinend ist ein Teil der in der löslichen Fraktion gefundenen MnSOD inaktiv. Dies läßt den Schluß zu, daß der Großteil der menschlichen MnSOD, der unter den in diesem Beispiel beschriebenen Bedingungen erzeugt wurde, tatsächlich inaktiv ist.

Bereispiel 4:

Auswirkung von Mn im Zuchtmedium auf die MnSOD-Löslichkeit und -Aktivität.

Der Zusatz von Mn in zunehmenden Konzentrationen bis 450 ppm zum Zuchtmedium von E. coli A4255, enthaltend pMSE-4, vor einer 2 h-lnduktion bei 42 · C und bei OD 600 = 0,7 hatte keine nachteilige Auswirkung auf die Gesamtausbeute an menschlichem MnSOD. Die Analyse von geschallten löslichen (s) und unlöslichen (p) Proteinfraktionen durch Natriumdodecylsulfat-Polyacryiamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) zeigte eine erhöhte Löslichkeit des recombinanten Proteins bei erhöhten Mn Konzentrationen (Tabelle 1). Eine Untersuchung der SOD-Aktivität (siehe McCord et al., supra) läßt auf eine Korrelation zwischen den erhöhten Mn++ Konzentrationen im Zuchtmedium und der erhöhten Löslichkeit von MnSOD bei einem anscheinenden Optimum bei einer Konzentration von 150 ppm Mn++ im Medium schließen (Fig. 3). Weiters wurde durch erhöhte Mn++ Konzentrationen früher inaktives lösliches Enzym aktiviert. Lösliche Proteinfraktionen induzierter Kulturen, die bei diesen Mn++ Werten gezüchtet wurden, zeigen eine bis zu 60-fache Erhöhung an SOD-Aktivität gegenüber Fraktionen nicht induzierter Kulturen, die bei diesen Mn++ Werten gezüchtet worden waren. Die Aktivitätsmarkierung von isoelektrischen Fokussierungsgelen (lEF-Gel) (siehe Beauchamp et al., supra) zeigte, das Multiformen der rekombinanten MnSOD identisch zu denen der nativen menschlichen Leber-MnSOD waren. 11

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Die Ergebnisse für die Herstellung von menschlichem MnSOD durch E. coli A1645 enthaltend pMSE-4 waren ähnlich den oben beschriebenen.

Tabelle 1

Mn++ (ppm) Prozent an löslicher menschlicher MnSOD des geamten induzierten menschlichen MnSOD Prozent an löslicher menschlicher MnSOD der löslichen Baktrienproteine Spezifische Aktivität-Einheiten/mg löslicher Proteine 0 30,6 7,2 30 50 72,7 15,4 241 100 78,0 16,9 356 150 82,9 18,8 606 200 82,0 20,8 338 250 79,2 20,4 380 300 80,8 20,3 381 450 89,2 22,4 323

Beispiel 5:

Konstruktion von pMS RB4: Tet menschlichem MnSOD-Expressionsplasmid

Tet Expressionsvektor, p RB, wurde aus pSODßi durch vollständige Verdauung mit EcoRI gefolgt von einer teilweisen Spaltung mit BamHI-Restriktionsenzymen erzeugt. pSOD/Si T-11 wurde bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 53468 deponiert. Das verdaute Plasmid wurde mit dem synthetischen Oligomer 5’- AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3' 3’- GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5’ verbunden, wobei das den XPL Promotor enthaltende p RB erhalten wurde.

Das EcoRI-Fragment des MnSOD-Expressionspiasmids pMSE-4, das eil Ribosomalbindungsstellen und die komplette Sequenz für das gereifte Enzym enthält, wurde in die einzige EcoRI-Stelle von P RB inseriert. Das resultierende Plasmid pMS RB4 enthält das MnSOD-Gen unter der Konstrolle von \PL und eil RBS und verleiht eine Tetracyclinresistenz (Fig. 4).

Beispiel 6:

Expression von menschlicher MnSOD aus pMS RB4

Plasmid pMS RB4 wurde in Escherichia coli Stamm A4255 unter Anwendung bekannter Methoden introduziert. Die Kulturen wurden bei 32 · C in Luria Brühe (LB) enthaltend verschiedene Konzentrationen an Mn gezüchtet, bis die optische Dichte (OD) bei 600 nm 0,7 erreichte. Die Induktion wurde bei 42 °C durchgeführt. In verschiedenen Zeitintervallen genommene Proben wurden an SDS-PAGE der Elekrophore-se unterworfen. Die hMnSOD-Werte erhöhten sich mit der Induktionszeit bis 120 min, in welchem Stadium sie etwa 15% der Gesamtzellproteine betrugen, wie durch Scannen von mit Coomassie-Blau markiertem Gel festgestellt wurde.

Die induzierte MnSOD war trotz der Gegenwart von Mn im Zuchtmedium löslich. Dies steht im Gegensatz zu Beobachtungen beim Amp Plasmid pMSE-4 (Siehe Beispiel 4). Das Maximum an SOD-Altivität und Expressionswert hingen von der Mn Zugabe ab (Tabelle 2). 12 >43076 31

Tabelle 2

MnSOD—Expression in E. coli A4255 (ptiS RB4?

Mn-"- Prozent lösliche (ppm) hMnSOD der löslichen Bakterien— Proteine

Spezi-fische Aktivität-Einheiten/mg lösliche Proteine 42°C 32eC 42eC □ 10,9 8,0 23 50 19,8 8,0 227 100 16,0 8,0 241 200 17,0 10,0 278 300 16,0 9,3 238 34

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Tabelle 2

MnSOD-Expression in E. coli A4255 (pMS RB4) Mn++ (ppm) Prozent lösliche hMnSOD der löslichen Bakterien-Proteine Spezifische Aktivität-Einheiten/mg lösliche Proteine 42 *C 32» C 42 »C 0 10,9 8,0 23 50 19,8 8,0 227 100 16,0 8,0 241 200 17,0 10,0 278 300 16,0 9,3 238

Beispiel 7:

Reinigung von enzymatisch aktiver recombinanter menschlicher MnSOD E. coli Stamm A4255 beinhaltend Plasmid pMS RB4 wurde in LB, versetzt mit 750 ppm Mn++, bei 32*C bis zu OD600 von 17,7 fermentiert. Die Induktion der Expression von menschlicher MnSOD wurde nach einem Temperaturanstieg auf 42 °C während 2 h durchgeführt, in welchem Stadium die Kultur OD600 von 43,0 erreichte. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet und in 0,2 des ursprünglichen Volumens in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,8, enthaltend 250 mM NaCI, resuspendiert. Die Bakterien wurden durch doppelten Durchgang durch Dynomill aufgebrochen, zentrifugiert und die Zellbruchstücke verworfen. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf 0,03 des Originalvolumens eingeengt und gegen Kaliumphosphatpuffer, pH 7,8, auf einer Pelicon-Ultrafiltrationseinheit, ausgerüstet mit einer 10K-Membrane, dialysiert. Das rohe Emzympräparat wurde auf eine DE52-Kolonne aufgegeben, gut mit 2 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,8, gewaschen und mit 2 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,8, eluiert. Die vereinigten, das Enzym enthaltenden Fraktionen wurden gegen 40 mM Kaliumacetat, pH 5,5, aufgegeben auf eine CM52-Kolonne, dialysiert und mit einem linearen Gradienten von 40 - 200 mM Kaliumacetat, pH 5,5, eluiert. Peakfraktionen enthalend menschliche MnSOD wurden vereinigt, gegen H2O, eingestellt mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer auf pH 7,8 dialysiert und auf -20 ” C eingefroren.

Die erhaltene recombinante menschliche MnSOD hatte eine Reinheit von mehr als 99% bei einer spezifischen Aktivität von etwa 3500 Einheiten/mg. Die Gesamtausbeute aus dem Reinigungsverfahren betrug etwa 30% (Tabelle 3).

Die Sequenzierung des gereinigten Enzyms zeigt die Gegenwart eines zusätzlichen Methionins an der N-endständigen Aminosäure gegenüber der bekannten menschlichen MnSOD (19).

Die Analyse nach Metallgehalt durch Atomabsorption ergab etwa 0,77 Atome Mn pro Enzymuntereinheit Dies stimmt mit veröffentlichten Werten überein (23). 13

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Jj :(3 JJ Ή > JJ 44 «ί Cp 0) ε £ -s t"» r- O CN o Ο —* σ ιΛ ro o in Φ pH m Γ* LO Q ίΊ JJ pH CN ΓΟ O j-i -H CO -j Φ 1 N JC c Φ C Σ α f * CO Cd c 0 Φ •H 42 JJ ü o σ o O CO tÖ Ή * * * 44 r-i o CO ro CO in C C o 10 ΓΟ Φ υ φ DU •pH s in u e 3 φ 0) Φ &, ε Λ 1 in i-2 u 3 m ω < a cn rs) in rsj pH JJ o - . H c w pH CO LH <3· u GS ε pH φ c CP Ό X! in E Φ 3 ri O C o o o σ CM GS 44 •H * - 0) o Φ o ·«· o +4 p-i Jj JJ o CM CM CP »"“f O —« Ή Q) c Sj c 0 Ck -H Π3 > JJ ε Φ ε CP lj θ' 3 Φ c in 44 cp 3 Φ ♦H Cp C5 φ Φ •H 44 Ί3 ε c CP c JJ >1 I -w Φ rö N φ s-4 in Λ Jj C £X φ in Φ c . H =3 JJ Φ =3 <-J in jj JJ U ü( Vj -p Φ jj -U :3 - φ φ cd « <0 >4-1 f-i a> 42 44 1 3 D Ή Ό =3 CP c t-H l“"l Φ -H c -H 0 Cd W JJ Φ ε φ ·· in u 1 1 k 14-1 o x: U in CM CN Φ 3 3 Φ o :3 »-J m LO s JJ >1 JJ O Φ m 2 CO o w 10 &. ft Ω u *

Literatur 1. McCord, J.M. und Fridovich, I., J. Biol. Chem, 244:6049-55 (1969). 2. Fridovich, I. in Advances in Inorganic Biochemistry, Ed. Eichhorn, G.L. und Marzilli, L.G. (Eise-vier/North Holland, New York) S. 67-90 (1979) 3. Freeman, B.A. und Crapo, J.D., Laboratory Investion 47:412-26 (1982). 4. Steinman, H.M. in Superoxide Dismutase, Ed. Oberley, L.W. (CRC Press, Florida), S. 11-68 (1982). 5. Hartz, J.W. und Deutsch, H.F., J, Biol. Chem, 247:7043-50 (1972). 6. Jabusch, J.R., Färb, D.L., Kerschensteiner, D.A. und Deutsch, H.F., Biochemistry 19:2310-16 (1980). 14

Claims (23)

1. AT 400 443 B
2. 7. Barra, D., Martini, F., Bannister, J.V., Schinina, N.W., Rotilio, W.H., Bannister, W.H. und Bossa, F„ FEBS Leiters 120:53-56 (1980).
3. 8. Lieman-Hurwitz, J., Dafni, N., Lavie, V. und Groner, Y., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:2808-11 (1982).
4. 9. Sherman, L., Dafni, N., Lieman-Hurwitz, J. und Groner, Y., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:5465-69 (1983).
5. 10. Oberiey, L.W. und Buettner, G.R., Cancer Research 39:1141-49 (1979).
6. 11. Huber, W. und Menander-Huber, K.B., Clinics in Rheum. Dis. 6:465-98 (1980).
7. 12. McCord, J.M. und Roy, R.S., Can. J. Physiol. Pharma. 60:1346-52 (1982).
8. 13. Alvarez, J.G. und Storey, B.T., Biol. Reprod. 28:1129-36 (1983).
9. 14. Talmasoff, J.M., Ono, T. und Cutier, R.G., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:2777-81 (1980).
10. 15. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. und Randall, R.J., J. Biol, Chem. 193:265-75 (1951).
11. 16. Weser, U. und Hartmann, H.J., FEBS Letters 17:78-80 (1971).
12. 17. Jewett, S.LO., Latrenta, G.S. und Beck, C.M., Are. Biochem. Biophys. 215:116-128 (1982).
13. 18. Harris, J.l. und Steinman, H.M., Superoxide and Superoxide Dismutase, Michelson, A.M., McCord, J.M. und Fridovich, I. Ed., Academic Press, London, S. 225-230 (1977).
14. 19. Barra, D., Schinina, M.E., Simmaco, M„ Bannister, J.V., Bannister, W H., Rotilio, G. und Bossa, F., J. Biol. Chem. 259:12595-601 (October 25, 1984).
15. 20. Baret, A., Jadot, G., und Michelson, A.M., Biochemical Pharmacology 33:2755-60 (September 1, 1984).
16. 21. McCord, J.M. und Salin, M.L., Movement, Metabolism and Bactericidal Mechanisms of Phagocytes, Ross, A., Patriarca, P.L., Romeo, D. (Ed.) S. 257-264 (1977).
17. 22. Touati, D., Journal of Bacteriology 155:1078-87 (1983).
18. 23. McCord, J.M., Boyle, J.A., Day, Jr„ E.D., Rizzolo, L.J. und Salin, M.L., Superoxide and Superoxide Dismutase, Michaelson, A.M., McCord, J.M., und Fridovich, I. (Ed.) Academic Press, London S. 129-138 (1977).
19. 24. Europäische Patentveröffentlichung No. 0131843 AI, vom 23. Jänner 1985, entsprechend der Europ. Patentanmeldung No. 84107717.5 vom 3. Juli 1984, in welcher die Priorität der U.S. Serial No. 514,188 vom 15. Juli 1983 beansprucht wird.
20. 25. Hallewell, et al., Nucleic Acids Res. 5, (1985).
21. 26. Europäische Patentveröffentlichung 0138111 AI, vom 24, April 1985, entsprechend der EP-Anmel-dung No. 84111416.8 vom 25. September 1984, in welcher die Priorität der U.S. Serial No. 538,607 vom 3. Oktober 1983 und U.S. Serial No. 609,412 vom 11. Mai 1984 beansprucht wird.
22. 27. EMBO Journal, Vol. 4, No. 1, S. 77-84 (Jänner 1985).
23. 28. Abstracts der Vierten Internationalen Konferenz über Superoxid und Superoxid-Dismutase, Rom, Italien 1.-6. September 1985. Patentansprüche 1. Plasmid für die Expression eines menschlichen Mangan-Superoxiddismutaseanalogen in einer geeigneten Wirtszelle, welches die enzymatische Aktivität der natürlich vorkommenden menschlichen Supero-xiddismutase besitzt, dadurch gekennzeichnet, daß das Analoge im wesentlichen aus zwei oder vier nicht kovalent verknüpften Polypeptiden besteht, wobei jedes dieser Polypeptide 199 Aminosäuren aufweist und wobei die Sequenz eines jeden dieser Polypeptide Methionin an seinem N-Terminus unmittelbar neben dem Lysin, codiert durch die Nucleotide 115-117 der Fig. 1A, aufweist und sich bis zum Lysin, codiert durch die Nucleotide 706-708 der Fig. 1B, fortsetzt, welches der COOH-Terminus der das Polypeptid aufweisenden, dieses Polypeptid codierenden DNA ist, und daß geeignete regulierende Elemente im Plasmid derart angeordnet sind, daß sie die Expression des Polypeptids und die Bildung des menschlichen Mangan-Superoxiddismutaseanalogen in der Wirtszelle ermöglichen. 2. Plasmid nach Anspruch 1 mit der Bezeichnung pMSE-4, hinterlegt im Escherichia coli Stamm A4225 unter ATCC 53250. 3. Plasmid nach Anspruch 1 mit der Bezeichnung pMSDRB4, hinterlegt in dem im Anspruch 2 definierten Stamm. 4. Verfahren zur Herstellung eines enzymatisch aktiven Analogen oder Mutanten der menschlichen Mangan-Superoxiddismutase mit im wesentlichen derselben Aminosäuresquenz und der biologischen Aktivität wie die der natürlich vorkommenden menschlichen Mangan-Superoxiddismutase durch Expres- 15 AT 400 443 B sion des Plasmids nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kultur von Bakterienzellen in einem Zuchtmedium, welches derart mit einer nicht-wachstumshemmenden Menge von Mn++ versetzt ist, daß die Konzentration an Mn++ im Medium während des Wachstums der Bakterien höher als 2 ppm ist, züchtet, wobei die Bakterienzellen ein Plasmid nach Anspruch 1 enthalten, das die das Analoge der menschlichen Mangan-Superoxiddismutase codierende DNA enthält, und die Zellen zur Expression der das Analoge der menschlichen Mangan-Superoxiddismutase codierenden DNA befähigt sind und wobei die genannte Kultur unter derart geeigneten Bedingungen gezüchtet wird, daß die DNA exprimiert und das Analoge der menschlichen Mangan-Superoxiddismutase in den Bakterienzellen erzeugt wird; und man das enzymatisch aktive Analoge oder den Mutanten der so erzeugten menschlichen Mangan-Superoxiddismutase gewinnt. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Bakterienzellen Zellen von Escherichia coli verwendet werden. 6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid eine ein menschliches Mangan-Superoxiddismutaseanaloges codierende DNA enthält, wobei das Analoge zwei oder vier nichtkovalent verknüpfte identische Polypeptide aufweist, ein jedes dieser Polypeptide 199 Aminosäuren besitzt und die Sequenz eines jeden dieser Polypeptide Methionin an seinem N-Terminus unmittelbar neben dem Lysin, codiert durch die Nucleotide 115-117 der Fig. 1A, aufweist und sich bis zum Lysin, codiert durch die Nucleotide 706-708 der Fig. 1B, fortsetzt, welches der COOH-Terminus des Polypeptids ist. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Plasmid eines mit der Bezeichnung pMSE-4, hinterlegt im Escherichia coli-Stamm A 4255 unter ATCC 53250, eingesetzt wird. 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Plasmid eines mit der Bezeichnung pMSDRB4, hinterlegt in dem in den Ansprüchen 2 und 7 definierten Stamm, eingesetzt wird. 9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Mn++ 50 bis 1500 ppm beträgt. 10. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Escherichia coli-Zellen jene des Stammes A4255, der ein Plasmid mit der Bezeichnung pMSE-4 enthält und hinterlegt ist unter ATCC 53250, eingesetzt werden. 11. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Escherichia coli-Zellen jene des Stammes A4255, der das Plasmid mit der Bezeichnung pMSDRB4 enthält und hinterlegt ist unter ATCC 53250, eingesetzt werden. Hiezu 5 Blatt Zeichnungen 16