JPS62289187A - ヒトマンガンス−パ−オキシドジスムタ−ゼ↓ｃＤＮＡ、その細菌中での発現及び酵素活性ヒトマンガンス−パ−オキシドジスムタ−ゼの回収方法 - Google Patents
ヒトマンガンス−パ−オキシドジスムタ−ゼ↓ｃＤＮＡ、その細菌中での発現及び酵素活性ヒトマンガンス−パ−オキシドジスムタ−ゼの回収方法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
３、発明の詳細な説明
λに１１
本明細書では種々の刊行物を参考文献として括弧内の数
字で紹介し、これら参考文献の完全目録を明細書の発明
の詳細な説明の末尾に添付した。
字で紹介し、これら参考文献の完全目録を明細書の発明
の詳細な説明の末尾に添付した。
本発明の出願された時点で当業者に公知の技術状態を完
全に理解するために、これら参考文献の開示内容全部が
本明細書に含まれるものとする。
全に理解するために、これら参考文献の開示内容全部が
本明細書に含まれるものとする。
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）と酸素遊離ラ
ジカル（０，・−）の現象とは１９６８年にＭｃＣｏｒ
ｄ及びＦｒ１ｄｏｖｉｃｈ（１）によって発見された。
ジカル（０，・−）の現象とは１９６８年にＭｃＣｏｒ
ｄ及びＦｒ１ｄｏｖｉｃｈ（１）によって発見された。
スーパーオキシドラジカル及びその他の高度に反応性の
酸素種は全ての呼吸細胞中で種々の高分子及び細胞成分
に対する酸化性損傷の副生物として産生される（参考文
献２．３）。スーパーオキシドジスムターゼとして公知
の金属タンパク質のグループは酸化還元反応２０．・−
＋ ２Ｈ” −ＨｔＯｚ ＋ Ｏｘを触媒し酸素毒性に
対する防御メカニズムを与える。
酸素種は全ての呼吸細胞中で種々の高分子及び細胞成分
に対する酸化性損傷の副生物として産生される（参考文
献２．３）。スーパーオキシドジスムターゼとして公知
の金属タンパク質のグループは酸化還元反応２０．・−
＋ ２Ｈ” −ＨｔＯｚ ＋ Ｏｘを触媒し酸素毒性に
対する防御メカニズムを与える。
異なる金属及び異なるタンパク質を含む複数の形態のＳ
ＯＤが公知である。ＳＯＤ中に存在する金属としては鉄
、マンガン、銅及び亜鉛がある。公知形態のＳＯＤは全
て同じ反応を触媒する。これら酵素は幾つがの進化的グ
ループで検出される。鉄を含有するスーパーオキシドジ
スムターゼは主として原核細胞中で検出される。銅及び
亜鉛を含有するスーパーオキシドジスムターゼは実質的
に全ての真核生物中で検出される（４）。マンガンを含
有するスーパーオキシドジスムターゼは微生物からヒト
までの生物中に検出された。
ＯＤが公知である。ＳＯＤ中に存在する金属としては鉄
、マンガン、銅及び亜鉛がある。公知形態のＳＯＤは全
て同じ反応を触媒する。これら酵素は幾つがの進化的グ
ループで検出される。鉄を含有するスーパーオキシドジ
スムターゼは主として原核細胞中で検出される。銅及び
亜鉛を含有するスーパーオキシドジスムターゼは実質的
に全ての真核生物中で検出される（４）。マンガンを含
有するスーパーオキシドジスムターゼは微生物からヒト
までの生物中に検出された。
全ての生体高分子は過剰のスーパーオキシドラジカルの
損傷作用の標的となり得るので、ＳＯＤの潜在的治療能
力の研究が盛んになって来ている。
損傷作用の標的となり得るので、ＳＯＤの潜在的治療能
力の研究が盛んになって来ている。
科学文献はＳＯＤの臨床用途が広いことを示唆している
。これらは、発癌及び腫瘍増殖の阻止、抗癌剤の細胞薬
害及び心臓薬害の低減（１０）、虚血組織の保護（１２
）及び精子の保護（１３）を含む。更に、老化過程での
ＳＯＤの効果の研究も重要である（１４）。
。これらは、発癌及び腫瘍増殖の阻止、抗癌剤の細胞薬
害及び心臓薬害の低減（１０）、虚血組織の保護（１２
）及び精子の保護（１３）を含む。更に、老化過程での
ＳＯＤの効果の研究も重要である（１４）。
しかし乍らヒトＳＯＤが少量しか入手できないことがヒ
トＳＯＤの治療能力に関する研究の主な障害になってい
る。
トＳＯＤの治療能力に関する研究の主な障害になってい
る。
スーパーオキシドジスムターゼはまたその抗炎症特性の
ために重要である（１１）。ウシ由来のスーパーオキシ
ドジスムターゼ（オルゴテイン）は抗炎症特性をもっこ
とが認められておりヨーロッパの一部でヒト用の薬剤と
して市販されている。また、米国では、特に炎症を起こ
したウマの鍵を治療する獣医薬として販売されている。
ために重要である（１１）。ウシ由来のスーパーオキシ
ドジスムターゼ（オルゴテイン）は抗炎症特性をもっこ
とが認められておりヨーロッパの一部でヒト用の薬剤と
して市販されている。また、米国では、特に炎症を起こ
したウマの鍵を治療する獣医薬として販売されている。
しかし乍らオルゴテインの供給量も限られている。ラン
又はその他の動物細胞からの回収を含めて従来技術には
重大な制約があり、このような細胞から得られたオルゴ
テインはヒト由来でないためヒトではアレルギー反応を
起こす可能性もある。
又はその他の動物細胞からの回収を含めて従来技術には
重大な制約があり、このような細胞から得られたオルゴ
テインはヒト由来でないためヒトではアレルギー反応を
起こす可能性もある。
銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ｃｕＺｎＳＯＤ
）は種々の形態のスーパーオキシドジスムターゼのうち
で最も研究か進み、その特性も最も解明されている。
）は種々の形態のスーパーオキシドジスムターゼのうち
で最も研究か進み、その特性も最も解明されている。
ヒトＣｕＺｎ ＳＯＤは、非共有的に結合した同一のサ
ブユニットから成り、各サブユニットが分子量１６．０
００ダルトンで銅１原子と亜鉛１原子とを含む二量体金
属タンパク質である（５）。各サブユニットは１５３個
のアミノ酸から成りその配列は解明されている（６．７
）。
ブユニットから成り、各サブユニットが分子量１６．０
００ダルトンで銅１原子と亜鉛１原子とを含む二量体金
属タンパク質である（５）。各サブユニットは１５３個
のアミノ酸から成りその配列は解明されている（６．７
）。
ヒトＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼをコードす
るｃＤＮＡがクローニングされた（８）。クローン化Ｄ
ＮＡの全配列も決定された（９）。更に、細菌中でスー
パーオキシドジスムターゼを産生及び回収するためのス
ーパーオキシドジスムターゼをコードするＤ Ｎ Ａを
含む発現ベクターも記載されている（２４゜２５）。ス
ーパーオキシドジスムターゼＤＮＡの発現及びその酵母
中でのＳＯＤの産生も開示された（２６）。
るｃＤＮＡがクローニングされた（８）。クローン化Ｄ
ＮＡの全配列も決定された（９）。更に、細菌中でスー
パーオキシドジスムターゼを産生及び回収するためのス
ーパーオキシドジスムターゼをコードするＤ Ｎ Ａを
含む発現ベクターも記載されている（２４゜２５）。ス
ーパーオキシドジスムターゼＤＮＡの発現及びその酵母
中でのＳＯＤの産生も開示された（２６）。
最近、ヒト染色体２１上のＣｕＺｎ ＳＯＤ遺伝子座が
決定され（２７）、ＣｕＺｎスーパーオキシドジスムタ
ーゼに関する最近の研究成果がまとめられた（２８）。
決定され（２７）、ＣｕＺｎスーパーオキシドジスムタ
ーゼに関する最近の研究成果がまとめられた（２８）。
マンガンスーパーンスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）について
はまだ未知の部分が多い。大腸菌（、Ｅ、 ｃｏｌ １
）Ｋ−１２のＭｎ５ＯＤが最近クローニングされその地
図が作成された（２２）。Ｂａｒｒａ等はヒト肝臓細胞
から単離されたＭｎ５ＯＤポリペプチドの１９６個のア
ミノ酸配列を開示している（１９）。しかし乍ら従来技
術の開示では、Ｍｎ５ＯＤ分子の構造について、特に該
構造の同一のサブユニットが２つであるか４つであるか
について意見が分かれている。しかし乍ら、Ｍｎ５ＯＤ
ポリペプチドとＣｕＺｎ５ＯＤポリペプチドとが相同で
ないことについては一致している（１９）、種々のソー
スからのＭｎ５ＯＤとＦｅ５ＯＤとのアミノ酸配列の相
同性も比較されている（１８）。
はまだ未知の部分が多い。大腸菌（、Ｅ、 ｃｏｌ １
）Ｋ−１２のＭｎ５ＯＤが最近クローニングされその地
図が作成された（２２）。Ｂａｒｒａ等はヒト肝臓細胞
から単離されたＭｎ５ＯＤポリペプチドの１９６個のア
ミノ酸配列を開示している（１９）。しかし乍ら従来技
術の開示では、Ｍｎ５ＯＤ分子の構造について、特に該
構造の同一のサブユニットが２つであるか４つであるか
について意見が分かれている。しかし乍ら、Ｍｎ５ＯＤ
ポリペプチドとＣｕＺｎ５ＯＤポリペプチドとが相同で
ないことについては一致している（１９）、種々のソー
スからのＭｎ５ＯＤとＦｅ５ＯＤとのアミノ酸配列の相
同性も比較されている（１８）。
Ｂａｒｅｔ等はラットモデルに於いて、ヒトＭｎ５ＯＤ
の半減期がヒト銅ＳＯＤの半減期より実質的に長いこと
を開示している。彼等はまた、ラットモデルに於いて、
ヒトＭｎ５ＯＤとラット銅ＳＯＤとは抗炎症剤として有
効でないが、ウシ銅ＳＯＤとヒト銅ＳＯＤとが完全に有
効であることを開示している（２０）。
の半減期がヒト銅ＳＯＤの半減期より実質的に長いこと
を開示している。彼等はまた、ラットモデルに於いて、
ヒトＭｎ５ＯＤとラット銅ＳＯＤとは抗炎症剤として有
効でないが、ウシ銅ＳＯＤとヒト銅ＳＯＤとが完全に有
効であることを開示している（２０）。
ＭｃＣｏｒｄ等は、ｉｎ ＶｉｔｒＯ試験では天然産生
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼが食作用を
行なうヒト多形核（ＰＭＮ）白血球をウシ又はブタのＣ
ｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼよりら十分にスー
パーオキンド遊離ラジカルから保護することを開示して
いる（２１）。
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼが食作用を
行なうヒト多形核（ＰＭＮ）白血球をウシ又はブタのＣ
ｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼよりら十分にスー
パーオキンド遊離ラジカルから保護することを開示して
いる（２１）。
本発明はヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポ
リペプチドらしくはその類似体又はそれらの突然変異体
をコードするｃＤＮＡ分子の調製に係る。本発明はまた
、該ｃ Ｄ Ｎ Ａを有効な細菌発現ベクターに挿入し
、細菌中にヒトＭｎ５ＯＤポリペプチド、その類似体、
その突然変異体及び酵素を産生じ、細菌産生ヒトＭｎ５
ＯＤポリペプチド、その類似体、その突然変異体又は酵
素を回収することを目的とする。本発明はまた、このよ
うに回収されたヒトＭｎ５ＯＤポリペプチド、その類似
体又はその突然変異体とそれらの使用とに係る。
リペプチドらしくはその類似体又はそれらの突然変異体
をコードするｃＤＮＡ分子の調製に係る。本発明はまた
、該ｃ Ｄ Ｎ Ａを有効な細菌発現ベクターに挿入し
、細菌中にヒトＭｎ５ＯＤポリペプチド、その類似体、
その突然変異体及び酵素を産生じ、細菌産生ヒトＭｎ５
ＯＤポリペプチド、その類似体、その突然変異体又は酵
素を回収することを目的とする。本発明はまた、このよ
うに回収されたヒトＭｎ５ＯＤポリペプチド、その類似
体又はその突然変異体とそれらの使用とに係る。
本発明は更に、細菌中での酵素活性ヒトＭｎ５ＯＤの産
生方法及びこのような酵素活性ヒトＭｎ５ＯＤの回収及
び精製方法に係る。
生方法及びこのような酵素活性ヒトＭｎ５ＯＤの回収及
び精製方法に係る。
本発明はまた、スーパーオキシドラジカルうく過酸化水
素と分子酸素とに還元されるときの触媒の機能を果たす
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼもしくはそ
の類似体又はそれらの突然変異体の使用に係る。特に、
本発明は虚血後の再潴流傷害を低減し、摘出単離器官の
生存期間を延長オるための細菌産生Ｍｎ５ＯＤもしくは
その類似体又はそれらの突然変異体の使用に係る。本発
明はまた、炎症治療のための細菌産生１ＡｎｓＯＤもし
くはその類似体又はそれらの突然変異体の使用に係る。
素と分子酸素とに還元されるときの触媒の機能を果たす
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼもしくはそ
の類似体又はそれらの突然変異体の使用に係る。特に、
本発明は虚血後の再潴流傷害を低減し、摘出単離器官の
生存期間を延長オるための細菌産生Ｍｎ５ＯＤもしくは
その類似体又はそれらの突然変異体の使用に係る。本発
明はまた、炎症治療のための細菌産生１ＡｎｓＯＤもし
くはその類似体又はそれらの突然変異体の使用に係る。
発明の概要
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチ
ドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体をコード
するｃＤＮＡを含むＤＮＡ分子がヒトＴ−細胞ライブラ
リーから単離された。ヒトマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれら
の突然変異体をコードする二重鎖のヌクレオチド配列が
発見された。該ポリペプチドもしくはその類似体をコー
ドする１つの鎖の配列は第１図のヌクレオチド１１５か
ら下流にヌクレオチド７０ｇまでの配列である。類似体
又はそれらの突然変異体をコードする別の配列は該ポリ
ペプチドをコードする鎖と実質的に同様であろう、２４
個のアミノ酸プレペプチドをコードする二重鎖ＤＮＡ分
子の１つの鎖のヌクレオチド配列は同じく第１図にヌク
レオチド４３からヌクレオチド −１１４で示される
。
ドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体をコード
するｃＤＮＡを含むＤＮＡ分子がヒトＴ−細胞ライブラ
リーから単離された。ヒトマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれら
の突然変異体をコードする二重鎖のヌクレオチド配列が
発見された。該ポリペプチドもしくはその類似体をコー
ドする１つの鎖の配列は第１図のヌクレオチド１１５か
ら下流にヌクレオチド７０ｇまでの配列である。類似体
又はそれらの突然変異体をコードする別の配列は該ポリ
ペプチドをコードする鎖と実質的に同様であろう、２４
個のアミノ酸プレペプチドをコードする二重鎖ＤＮＡ分
子の１つの鎖のヌクレオチド配列は同じく第１図にヌク
レオチド４３からヌクレオチド −１１４で示される
。
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチ
ドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体をコード
する配列をもつヌクレオチド鎖を含む二重鎖ＤｌｆＡ分
子又はその他の任意の二重鎖ＤＮＡをプラスミド又はウ
ィルスの如きクローニングベヒクルに組み込んでもよい
。いずれのＤＮＡ分子も、原核細胞例えば細菌又は真核
細胞例えば酵母もしくは咄乳動物に公知方法で導入され
得る。この公知方法はいずれかの分子を含むクローニン
グベヒクルを使用する方法でもよいがこの方法に限定は
されない。
ドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体をコード
する配列をもつヌクレオチド鎖を含む二重鎖ＤｌｆＡ分
子又はその他の任意の二重鎖ＤＮＡをプラスミド又はウ
ィルスの如きクローニングベヒクルに組み込んでもよい
。いずれのＤＮＡ分子も、原核細胞例えば細菌又は真核
細胞例えば酵母もしくは咄乳動物に公知方法で導入され
得る。この公知方法はいずれかの分子を含むクローニン
グベヒクルを使用する方法でもよいがこの方法に限定は
されない。
好ましくはヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ
ポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変異
体をコードするｃＤＮＡ又はＤＮＡをプラスミド例えば
ｐＭＳＥ−４又はｐＭＳΔＲＢ４に組み込んで、次にＤ
ＮＡが発現できる適当な宿主細胞に導入し、ヒトマンガ
ンスーパーオキンドジスムターゼ（ｈＭｎＳＯＤ）ポリ
ペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体を
産生ずる。好ましい宿主細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、特に大腸菌Ａ４２５５株及び大
腸菌Ａ１６４５株である。大腸菌Ａ４２５５株中のプラ
スミ ドｐＭＳＥ−４はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎにＡ Ｔ Ｃ
Ｃ受託番号Ｎｏ、５３２５０で寄託された。プラスミド
ｐＭＳΔＲＢ４は第４図に示し図面に関する説明に記載
のごとく調製され得ろ。
ポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変異
体をコードするｃＤＮＡ又はＤＮＡをプラスミド例えば
ｐＭＳＥ−４又はｐＭＳΔＲＢ４に組み込んで、次にＤ
ＮＡが発現できる適当な宿主細胞に導入し、ヒトマンガ
ンスーパーオキンドジスムターゼ（ｈＭｎＳＯＤ）ポリ
ペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体を
産生ずる。好ましい宿主細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、特に大腸菌Ａ４２５５株及び大
腸菌Ａ１６４５株である。大腸菌Ａ４２５５株中のプラ
スミ ドｐＭＳＥ−４はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎにＡ Ｔ Ｃ
Ｃ受託番号Ｎｏ、５３２５０で寄託された。プラスミド
ｐＭＳΔＲＢ４は第４図に示し図面に関する説明に記載
のごとく調製され得ろ。
かかるＤＮＡ分子が導入された細胞を、ＤＮＡをｍＲＮ
Ａに転写しｍＲＮＡをタンパク質として発現させ得る適
当な条件下で当業者に公知の方法で培養又は増殖すｕ゛
る。得られたマンガンスーパーオキンドジスムターゼタ
ンパク質を回収する。
Ａに転写しｍＲＮＡをタンパク質として発現させ得る適
当な条件下で当業者に公知の方法で培養又は増殖すｕ゛
る。得られたマンガンスーパーオキンドジスムターゼタ
ンパク質を回収する。
ヒトＭｎ５ＯＤもしくはその類似体又はそれらの突体変
異体と適当な担体とを含む獣医薬又は医薬組成物を調製
することら可能である。このヒトマンガンスーパーオキ
シドンスムターゼもしく：まその類似体又はそれらの突
然変異体は以下の反応を触媒するために使用され得ろ。
異体と適当な担体とを含む獣医薬又は医薬組成物を調製
することら可能である。このヒトマンガンスーパーオキ
シドンスムターゼもしく：まその類似体又はそれらの突
然変異体は以下の反応を触媒するために使用され得ろ。
２０、；÷２８＋ → ＨｔＯｔ＋Ｏｔこれによりスー
パーオキシドラノカルによって生じる細胞傷害が低減す
る。
パーオキシドラノカルによって生じる細胞傷害が低減す
る。
より特定的には、これら酵素らしくはその類似体又はそ
れらの突然変異体は、虚血後の古酒流によって生じる傷
害を低減するため、摘出単離器官の生存時間を延長する
ため又は炎症治療に使用され得る。
れらの突然変異体は、虚血後の古酒流によって生じる傷
害を低減するため、摘出単離器官の生存時間を延長する
ため又は炎症治療に使用され得る。
本発明の目的は、酵素活性ヒトマンガンスーパーオキン
ドジスムターゼらしくはその類似体又はそれらの突然変
異体を細菌細胞中で産生ずる方法を提供することである
。細菌細胞は、マンガンスーパーオキンドノスムターゼ
らしく：よその類似体又はそれらの突然変異体をコード
ずろＤＮＡ配列を含み該配列を発現し得る。本発明方法
では、細菌細胞を適当な産生培地中で適当な条件下に維
持する。培地中で細胞が利用できるＭｎ２＋の濃度が約
２ｐｐｍを上回るように産生培地にＭｎ”ゝを補給する
。
ドジスムターゼらしくはその類似体又はそれらの突然変
異体を細菌細胞中で産生ずる方法を提供することである
。細菌細胞は、マンガンスーパーオキンドノスムターゼ
らしく：よその類似体又はそれらの突然変異体をコード
ずろＤＮＡ配列を含み該配列を発現し得る。本発明方法
では、細菌細胞を適当な産生培地中で適当な条件下に維
持する。培地中で細胞が利用できるＭｎ２＋の濃度が約
２ｐｐｍを上回るように産生培地にＭｎ”ゝを補給する
。
本発明の好適具体例に於いて、細菌細胞はヒトマンガン
スーパーオキシドジスムターゼポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列を含むプラスミド、例えばｐＭＳＥ−４又
はｐＭＳ ＲＢ４を含む大腸菌細胞、例えば大腸菌Ａ４
２５５株である。産生培地中のＭｎ”の濃度範囲は約５
０ｐｐｍ〜約１５００１）Ｉ）ｍであり、好ましくはＬ
５０ｐｐｍ及び７ｓｏｐｐｍである。
スーパーオキシドジスムターゼポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列を含むプラスミド、例えばｐＭＳＥ−４又
はｐＭＳ ＲＢ４を含む大腸菌細胞、例えば大腸菌Ａ４
２５５株である。産生培地中のＭｎ”の濃度範囲は約５
０ｐｐｍ〜約１５００１）Ｉ）ｍであり、好ましくはＬ
５０ｐｐｍ及び７ｓｏｐｐｍである。
本発明は更に、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ
もしくはその類似体又はそれらの突然変異体を含有細菌
細胞から回収する方法に係る。ヒトマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの突
然変異体を含む細胞中に存在するタンパク質を含むタン
パク質画分を回収すべく細胞を先ず処理し、次にタンパ
ク質画分を処理してヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異体を
回収する。本発明の好適具体例に於いては、細胞を先ず
処理して不溶タンパク質と細胞壁破片とから可溶タンパ
ク質を分離し、次に可溶タンパク質を回収する。次に可
溶タンパク質を処理して、ｈＭｎｓＯＤもしくはその類
似体又はそれらの突然変異体を含む可溶タンパク質の画
分を分離例えば沈澱させ、ｈＭｎｓＯＤもしくはその類
似体又はそれらの突然変異体を含む画分を回収する。回
収した可溶タンパク質画分を次に処理してヒトマンガン
スーパｑし 一オキシトジスムターゼ七−一はその類似体を分離回収
する。
もしくはその類似体又はそれらの突然変異体を含有細菌
細胞から回収する方法に係る。ヒトマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの突
然変異体を含む細胞中に存在するタンパク質を含むタン
パク質画分を回収すべく細胞を先ず処理し、次にタンパ
ク質画分を処理してヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異体を
回収する。本発明の好適具体例に於いては、細胞を先ず
処理して不溶タンパク質と細胞壁破片とから可溶タンパ
ク質を分離し、次に可溶タンパク質を回収する。次に可
溶タンパク質を処理して、ｈＭｎｓＯＤもしくはその類
似体又はそれらの突然変異体を含む可溶タンパク質の画
分を分離例えば沈澱させ、ｈＭｎｓＯＤもしくはその類
似体又はそれらの突然変異体を含む画分を回収する。回
収した可溶タンパク質画分を次に処理してヒトマンガン
スーパｑし 一オキシトジスムターゼ七−一はその類似体を分離回収
する。
より好ましい方法によれば、ヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの突然
変異体を含有する細菌細胞からヒトマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの突
然変異体を回収する。
シドジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの突然
変異体を含有する細菌細胞からヒトマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれらの突
然変異体を回収する。
該方法では先ず産生培地から細菌細胞を単離し、ｐＨ約
７．０〜８．０の適当な溶液に懸濁させる。次に細胞を
破壊し遠心して得られた上清を５５〜６５℃で約３０〜
１２０分間、好ましくは５８〜６２℃で４５〜７５分間
、より好ましくは６０℃で１時間加熱し、１０℃未満好
ましくは約４℃まで冷却する。形成された沈澱物を例え
ば遠心によって完全に除去し、冷却された上清を適当な
バッファ、例えばｐＨ約７．８の２ｍＭ燐酸カリウムバ
ッファに透析する。好ましくは３０により小さいろ過膜
を使用し限外ｐ過によって透析する。透析と同時又は透
析後に、冷却した上清を適当な容量、例えば初期容量の
０．０３まで任意に濃縮してもよい。保持物（ｒｅｔｅ
ｎｔａｔｅ）を適当なバッファ溶液例えばｐｔ＋約７．
８の２０ｍＭ以上の燐酸カリウムバッファ溶液でアニオ
ン交換クロマトグラフィーカラムから溶出する。スーパ
ーオキンドジスムターゼを含む溶出物の画分を収集し、
プールし、ｐＨ＋５．５の約４０１ＴＩＭの酢酸カリウ
ムに透析する。透析したプール画分をｐｏｓ、ｓの約４
０〜約２００ｍＭの酢酸カリウムの直線濃度勾配をちつ
カヂオン交換クロマトグラフィーカラムでｌ溶出する。
７．０〜８．０の適当な溶液に懸濁させる。次に細胞を
破壊し遠心して得られた上清を５５〜６５℃で約３０〜
１２０分間、好ましくは５８〜６２℃で４５〜７５分間
、より好ましくは６０℃で１時間加熱し、１０℃未満好
ましくは約４℃まで冷却する。形成された沈澱物を例え
ば遠心によって完全に除去し、冷却された上清を適当な
バッファ、例えばｐＨ約７．８の２ｍＭ燐酸カリウムバ
ッファに透析する。好ましくは３０により小さいろ過膜
を使用し限外ｐ過によって透析する。透析と同時又は透
析後に、冷却した上清を適当な容量、例えば初期容量の
０．０３まで任意に濃縮してもよい。保持物（ｒｅｔｅ
ｎｔａｔｅ）を適当なバッファ溶液例えばｐｔ＋約７．
８の２０ｍＭ以上の燐酸カリウムバッファ溶液でアニオ
ン交換クロマトグラフィーカラムから溶出する。スーパ
ーオキンドジスムターゼを含む溶出物の画分を収集し、
プールし、ｐＨ＋５．５の約４０１ＴＩＭの酢酸カリウ
ムに透析する。透析したプール画分をｐｏｓ、ｓの約４
０〜約２００ｍＭの酢酸カリウムの直線濃度勾配をちつ
カヂオン交換クロマトグラフィーカラムでｌ溶出する。
スーパーオキンドジスムターゼを含むピーク画分を収集
し、プールする。
し、プールする。
プールしたピーク画分を任意に適当な溶液、例えば水又
はｐＩＩ約７．８の約１０ｍＭ燐酸カリウムバッファの
バッファ溶液に透析する。
はｐＩＩ約７．８の約１０ｍＭ燐酸カリウムバッファの
バッファ溶液に透析する。
本発明はまた、本発明の方法で産生され精製された酵素
活性ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼもしく
はその類似体例えばｍｅｔ −ｈＭｎｓＯＤ又はそれら
の突然変異体に係る。
活性ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼもしく
はその類似体例えばｍｅｔ −ｈＭｎｓＯＤ又はそれら
の突然変異体に係る。
図面の説明
第１図。ヒトＭｎ５ＯＤｃＤＮＡの配列第１図はヒトマ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼをコードする二重
鎖ＤＮＡ分子の１つの鎖のヌクレオチド配列と該ＤＮＡ
配列に対応するヒトＭｎ５ＯＤの１９８個のアミノ酸配
列とを示す。第１図はまた、２４９のアミノ酸から成る
、成熟ヒトＭｎ５ＯＤに対するプレペプチドをコードす
る二重量Ｄｌ＋八分子分子つの鎖のヌクレオチド配列と
該ＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列とを示す。また５
″及び３゛の未翻訳配列を示す。
ンガンスーパーオキシドジスムターゼをコードする二重
鎖ＤＮＡ分子の１つの鎖のヌクレオチド配列と該ＤＮＡ
配列に対応するヒトＭｎ５ＯＤの１９８個のアミノ酸配
列とを示す。第１図はまた、２４９のアミノ酸から成る
、成熟ヒトＭｎ５ＯＤに対するプレペプチドをコードす
る二重量Ｄｌ＋八分子分子つの鎖のヌクレオチド配列と
該ＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列とを示す。また５
″及び３゛の未翻訳配列を示す。
第２図。ｐＭＳＥ−４：ヒトＭｎ５ＯＤ発現プラスミド
の構築ＥｃｏＲＩ （Ｒ１）インサートに！ＡｎＳＯＤ
を含むプラスミドｐＭｓ８−４をＮｄｅ ＩとＱａｒ
Ｉ制限酵素で完全消化した。
の構築ＥｃｏＲＩ （Ｒ１）インサートに！ＡｎＳＯＤ
を含むプラスミドｐＭｓ８−４をＮｄｅ ＩとＱａｒ
Ｉ制限酵素で完全消化した。
大きい断片を単離し第２図に示すように合成オリゴマー
と結合した。得られたプラスミドｐＭＳ８−ＫＮはＡＴ
Ｇ開始コドンの直後に成熟Ｍｎ５ＯＤのコード領域を含
む。このプラスミドをＥｃｏＲＴで消化し、Ｐｏ１ｙ−
ｎｅｒａｓｅ ＩのＫｌｅｎｏｗ断片で末端を充填し、
更にＮｄｅ Ｉで開裂した。Ｍｎ５ＯＤ遺伝子を担持す
る小さい断片を７ｄｅ Ｉと５ｊｕｌとによって処理し
たｐｓＯＤα１３に挿入した。、ｐｓＯＤα１３は、１
９８４年８月２７日出願の米国特許出願第８４４２４５
号に開示された方法で得られる。
と結合した。得られたプラスミドｐＭＳ８−ＫＮはＡＴ
Ｇ開始コドンの直後に成熟Ｍｎ５ＯＤのコード領域を含
む。このプラスミドをＥｃｏＲＴで消化し、Ｐｏ１ｙ−
ｎｅｒａｓｅ ＩのＫｌｅｎｏｗ断片で末端を充填し、
更にＮｄｅ Ｉで開裂した。Ｍｎ５ＯＤ遺伝子を担持す
る小さい断片を７ｄｅ Ｉと５ｊｕｌとによって処理し
たｐｓＯＤα１３に挿入した。、ｐｓＯＤα１３は、１
９８４年８月２７日出願の米国特許出願第８４４２４５
号に開示された方法で得られる。
該特許出願は本明細書に含まれるものとする。この結果
得られたプラスミドＩ）ＭＳＥ−４はえＰＬプロモータ
のコントロール下でａｌｌリポソーム結合部位の直後に
Ｍｎ５ＯＤコード領域を含む。プラスミドｐＭＳＥ−４
はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ、５３２５０
で寄託されている。
得られたプラスミドＩ）ＭＳＥ−４はえＰＬプロモータ
のコントロール下でａｌｌリポソーム結合部位の直後に
Ｍｎ５ＯＤコード領域を含む。プラスミドｐＭＳＥ−４
はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ、５３２５０
で寄託されている。
第３図のヂャート図は、非誘発条件（３２℃）及び誘発
条件（４２℃）下でプラスミドＩ）ＭＳＥ−４を含む大
腸、菌Ａ４２５５株によって産生された組換体可溶性Ｍ
ｎ５ＯＤの比活性（単位／ｍｇ）と増殖培地中のＭｎ
２ ＋濃度（ｐｐｍ）との相関関係を示す。
条件（４２℃）下でプラスミドＩ）ＭＳＥ−４を含む大
腸、菌Ａ４２５５株によって産生された組換体可溶性Ｍ
ｎ５ＯＤの比活性（単位／ｍｇ）と増殖培地中のＭｎ
２ ＋濃度（ｐｐｍ）との相関関係を示す。
第４図。ｐＭＳΔＲＢ４ ：ヒトＭｎ５ＯＤ発現プラス
ミドの構」 ｐＳＯＤβ、Ｔ −１１を５醗−ＲＩで完全消化しり旦
ＩＩＩ制限酵素で部分開裂することによってＴｅｔＲ発
現ベクターｐΔＲＢを調製した。ｐｓＯＤβ、Ｔ−１１
はＡｍｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号Ｎｏ、 ０３４
６８で寄託されている。消化されたプラスミドを合成オ
リゴマー ５°−ＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＣＴ−３’
３’−ＧＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧ−５’
と結合しλＰ、プロモータを含むｐΔＲＢを調製した。
ミドの構」 ｐＳＯＤβ、Ｔ −１１を５醗−ＲＩで完全消化しり旦
ＩＩＩ制限酵素で部分開裂することによってＴｅｔＲ発
現ベクターｐΔＲＢを調製した。ｐｓＯＤβ、Ｔ−１１
はＡｍｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号Ｎｏ、 ０３４
６８で寄託されている。消化されたプラスミドを合成オ
リゴマー ５°−ＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＣＴ−３’
３’−ＧＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧ−５’
と結合しλＰ、プロモータを含むｐΔＲＢを調製した。
ａｌｌリポソーム結合部位と成熟酵素の完全コード配列
とを含むＭｎ５ＯＤ発現プラスミドｐＭＳＥ−４のＥｃ
ｏＲ１断片をｐΔＲＢの単−ＥｃｏＲＩ部位に挿入した
。
とを含むＭｎ５ＯＤ発現プラスミドｐＭＳＥ−４のＥｃ
ｏＲ１断片をｐΔＲＢの単−ＥｃｏＲＩ部位に挿入した
。
得られたプラスミドｐＭＳΔＲＢ４はλＰＬのコントロ
ール下のＭｎ５ＯＤ遺伝子とｃｌｌ ＲＢＳＡを含みテ
トラサイタリン耐性であった。
ール下のＭｎ５ＯＤ遺伝子とｃｌｌ ＲＢＳＡを含みテ
トラサイタリン耐性であった。
詳細な説明
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポリベプチ
ドもしくはその類似体又はそれらの突然変局体をコード
するｃＤＮＡを含む二重鎖ＤＮＡ分子がヒトＴ−細胞Ｄ
ＮＡライブラリーから単離された。ヒトマンガンスーパ
ーオキンドジスムターゼボリベプチドらしくはその類似
体又はそれらの突然変異体をコードする二重鎖ＤＮＡ分
子のヌクレオチド配列が発見された。ヒＩ・マンガンス
ーパーオキシドジスムターゼボリペプチドもしくはその
類似体をコードするＤＮＡ分子の１つの鎖の配列は第１
図に示されておりヌクレオチド１１５から７０８までを
含む。
ドもしくはその類似体又はそれらの突然変局体をコード
するｃＤＮＡを含む二重鎖ＤＮＡ分子がヒトＴ−細胞Ｄ
ＮＡライブラリーから単離された。ヒトマンガンスーパ
ーオキンドジスムターゼボリベプチドらしくはその類似
体又はそれらの突然変異体をコードする二重鎖ＤＮＡ分
子のヌクレオチド配列が発見された。ヒＩ・マンガンス
ーパーオキシドジスムターゼボリペプチドもしくはその
類似体をコードするＤＮＡ分子の１つの鎖の配列は第１
図に示されておりヌクレオチド１１５から７０８までを
含む。
ｈＭｎｓＯＤ類似体又はそれらの突然変異体をコードす
る１つの鎖の配列はｈ Ｍ ｎ ＳＯＤポリペプチドを
コードする鎖に実質的に等しい。ヒトマンガンスーパー
オキシドジスムターゼのプレペプチドのヌクレオチド配
列も第１図に示されている。ヌクレオチド４３から１１
４までがこのプレペプチドをコードする。
る１つの鎖の配列はｈ Ｍ ｎ ＳＯＤポリペプチドを
コードする鎖に実質的に等しい。ヒトマンガンスーパー
オキシドジスムターゼのプレペプチドのヌクレオチド配
列も第１図に示されている。ヌクレオチド４３から１１
４までがこのプレペプチドをコードする。
ヒトマンガンスーパーオキシドノスムターゼポリベプチ
ドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体をコード
するｃＤＮＡを調製しＤＮＡの配列を決定する方法は当
業者に公知であり詳細に後述する。
ドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体をコード
するｃＤＮＡを調製しＤＮＡの配列を決定する方法は当
業者に公知であり詳細に後述する。
更に、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼをコ
ードするＤＮＡ配列が発見されたので、この配列部分を
含むＤＮＡ分子を調製するために公知の合成方法を使用
し得る。
ードするＤＮＡ配列が発見されたので、この配列部分を
含むＤＮＡ分子を調製するために公知の合成方法を使用
し得る。
従来のクローニングベヒクル例えばｐＢＲ３２２の如き
プラスミド、ウィルス又は例えばλの如きバクテリオフ
ァージはヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポ
リペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体
をコードするｃＤＮＡを含む新規なりローニングベヒク
ルを産生ずるように公知方法によって修飾及び操作され
得ろ。同様にかかるクローニングベヒクルは、１つの鎖
が第１図に示すヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼポリペプチドの配列をもつ断片又はこれと実質的に
等しい断片を含むＤＮＡ分子を含むように修飾又は操作
され得る。挿入されるＤＮＡ分子は酵素合成又は化学合
成の如き種々の方法によって調製され得る。
プラスミド、ウィルス又は例えばλの如きバクテリオフ
ァージはヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポ
リペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体
をコードするｃＤＮＡを含む新規なりローニングベヒク
ルを産生ずるように公知方法によって修飾及び操作され
得ろ。同様にかかるクローニングベヒクルは、１つの鎖
が第１図に示すヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼポリペプチドの配列をもつ断片又はこれと実質的に
等しい断片を含むＤＮＡ分子を含むように修飾又は操作
され得る。挿入されるＤＮＡ分子は酵素合成又は化学合
成の如き種々の方法によって調製され得る。
得られたクローニングベヒクルは、天然には産生じない
化学物質であり、一般にＤＮＡ組換技術と指称される最
新の技術でしか調製できない。好ましくはクローニング
ベヒクルはプラスミド、例えばｐＭＳＥ−４又はｐＭＳ
ΔＲＢ４である。これらクローニングベヒクルは形質転
換、トランスフェクション等の当業者に公知の技術を使
用し原核細胞例えば細菌（大、陽画、枯草菌）に導入さ
れてもよく、又は真核細胞例えば酵母もしくは捕乳動物
に導入されてもよい。従って、クローニングベヒクルが
導入される細胞はクローニングベヒクル中にｃＤＮＡが
存在するときはヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然
変異体をコードするｃＤＮＡを含み、クローニングベヒ
クル中にＤＮＡが存在するときはそのＤＮＡの１つの鎖
の全部又は一部が第１図のヒトＭｎ５ＯＤポリペプチド
の配列又はこれと実質的に等しい配列を含む該ＤＮＡを
含む。
化学物質であり、一般にＤＮＡ組換技術と指称される最
新の技術でしか調製できない。好ましくはクローニング
ベヒクルはプラスミド、例えばｐＭＳＥ−４又はｐＭＳ
ΔＲＢ４である。これらクローニングベヒクルは形質転
換、トランスフェクション等の当業者に公知の技術を使
用し原核細胞例えば細菌（大、陽画、枯草菌）に導入さ
れてもよく、又は真核細胞例えば酵母もしくは捕乳動物
に導入されてもよい。従って、クローニングベヒクルが
導入される細胞はクローニングベヒクル中にｃＤＮＡが
存在するときはヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然
変異体をコードするｃＤＮＡを含み、クローニングベヒ
クル中にＤＮＡが存在するときはそのＤＮＡの１つの鎖
の全部又は一部が第１図のヒトＭｎ５ＯＤポリペプチド
の配列又はこれと実質的に等しい配列を含む該ＤＮＡを
含む。
大腸菌は本発明のクローニングベヒクルの好ましい宿主
細胞である。現状で大腸菌の好ましい栄養要求間はプラ
スミドｐＡ＋’）ｏＥ−Ｅｘ２を含む大腸菌Ａ１６４５
である。該大腸菌はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＳＲｏｃｋｖｉｌｌｅ
、 ＭａｒｙｌａｎｄＳＵＳＡにＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ
、３９７８７で寄託されている。本出願に記載の１〜ｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎへの寄託はいずれも微生物の寄託の国際的承
認に関するブダペスト条約に従ってなされたものである
。
細胞である。現状で大腸菌の好ましい栄養要求間はプラ
スミドｐＡ＋’）ｏＥ−Ｅｘ２を含む大腸菌Ａ１６４５
である。該大腸菌はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＳＲｏｃｋｖｉｌｌｅ
、 ＭａｒｙｌａｎｄＳＵＳＡにＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ
、３９７８７で寄託されている。本出願に記載の１〜ｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎへの寄託はいずれも微生物の寄託の国際的承
認に関するブダペスト条約に従ってなされたものである
。
Ａ １６４５はＧａｊ”（ガラクトース発酵能）とテト
ラサイクリン耐性の喪失とに基づく選択によってＡ１６
３７から得られた。Ａ ｌ ６４５はλファージのエレ
メントを維持している。その表現型は、Ｃ６００ｒｆ”
ｇａｌ” ｔｈｒ−１ｅａ−１ａｃＺ−ｂＮ（λｃ １
８５７ΔＨ１ΔＢａｍ１（ＩＮ＋）である。
ラサイクリン耐性の喪失とに基づく選択によってＡ１６
３７から得られた。Ａ ｌ ６４５はλファージのエレ
メントを維持している。その表現型は、Ｃ６００ｒｆ”
ｇａｌ” ｔｈｒ−１ｅａ−１ａｃＺ−ｂＮ（λｃ １
８５７ΔＨ１ΔＢａｍ１（ＩＮ＋）である。
Ａ １６３７はテトラサイクリン耐性遣云子を含むトラ
ンスボゾンをガラクトースオペロンとｃｌリプレッザー
合成を生起させるエレメントを含むλファージのエレメ
ントとに導入することによってＣ６００から得られた。
ンスボゾンをガラクトースオペロンとｃｌリプレッザー
合成を生起させるエレメントを含むλファージのエレメ
ントとに導入することによってＣ６００から得られた。
Ｃ６００はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ Ｃｏｂｌｅｃｔ ｉｏ：＋からＡ Ｔ ＣＣ受託番
号Ｎｏ、２３７２４として得られろ。
ｅ Ｃｏｂｌｅｃｔ ｉｏ：＋からＡ Ｔ ＣＣ受託番
号Ｎｏ、２３７２４として得られろ。
最小培地中で増殖するときでも高いレベルのポリペプチ
ドを発現し得る大腸菌の原栄養株はマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼをコードする遺伝子の発現用宿主と
して更に好ましい。現在の好ましい原栄養株はＡ４２５
５である。プラスミドｐＭＳＥ−４を含むＡ４２５５株
はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ、５３２５０で
寄託されている。
ドを発現し得る大腸菌の原栄養株はマンガンスーパーオ
キシドジスムターゼをコードする遺伝子の発現用宿主と
して更に好ましい。現在の好ましい原栄養株はＡ４２５
５である。プラスミドｐＭＳＥ−４を含むＡ４２５５株
はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ、５３２５０で
寄託されている。
得られた細胞はヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼポリペプチドらしくはその類似体又はそれらの突然
変異体をコードするＤＮＡを取り込んでおり、この細胞
を当業者に公知の適当な条件下で増殖又は培養によって
適宜処理するとＤ Ｎ Ａは、そのＤＮＡによってコー
ドされた遺伝情報の発現を指令する。例えばＤＮＡがｈ
ＭｎｓＯＤポリペプチドもしくはその類似体又はそれら
の突然変異体の発現を指令し、細胞はｈＭｎｓＯＤポリ
ペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体を
発現させ、次にこれを回収する。
ーゼポリペプチドらしくはその類似体又はそれらの突然
変異体をコードするＤＮＡを取り込んでおり、この細胞
を当業者に公知の適当な条件下で増殖又は培養によって
適宜処理するとＤ Ｎ Ａは、そのＤＮＡによってコー
ドされた遺伝情報の発現を指令する。例えばＤＮＡがｈ
ＭｎｓＯＤポリペプチドもしくはその類似体又はそれら
の突然変異体の発現を指令し、細胞はｈＭｎｓＯＤポリ
ペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体を
発現させ、次にこれを回収する。
る用語は、受容体としてスーパーオキシド又は酸素遊離
ラジカルに作用するか又は不均化反応２０、・−＋２Ｈ
” −◆ Ｏｔ＋ｌｌｔ鵠を触媒する酵素又はポリペ
プチドを意味する。
ラジカルに作用するか又は不均化反応２０、・−＋２Ｈ
” −◆ Ｏｔ＋ｌｌｔ鵠を触媒する酵素又はポリペ
プチドを意味する。
本明細書中の「マンガンスーパーオキシドジスムターゼ
（ＭｎＳＯＤｌｌなる用語は、マンガン元素を任意の化
学的形態で含有するスーパーオキンドジスムターゼ分子
を意味する。
（ＭｎＳＯＤｌｌなる用語は、マンガン元素を任意の化
学的形態で含有するスーパーオキンドジスムターゼ分子
を意味する。
本明細書中の「ヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼポリペプチド」なる用語は、１９８周のアミノ酸か
ら成りその一部分が第１図のアミノ酸配列であるポリペ
プチドを意味する。配列のＮ末端は第１図のヌクレオチ
ド１１５〜１１７によってコードされるリジンであり、
配列のＣＯＯＨ末端は第１図のヌクレオチド７０６〜７
０８によってコードされるリジンである。
ーゼポリペプチド」なる用語は、１９８周のアミノ酸か
ら成りその一部分が第１図のアミノ酸配列であるポリペ
プチドを意味する。配列のＮ末端は第１図のヌクレオチ
ド１１５〜１１７によってコードされるリジンであり、
配列のＣＯＯＨ末端は第１図のヌクレオチド７０６〜７
０８によってコードされるリジンである。
本明細書中の「ポリペプチドマンガン複合体」なる用語
は、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペ
プチドを任意の化学的形態のマンガンとの複合体として
含み、天然産生ヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼの酵素活性をもつ分子を意味する。
は、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペ
プチドを任意の化学的形態のマンガンとの複合体として
含み、天然産生ヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼの酵素活性をもつ分子を意味する。
本明細書中の「ヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼ」なる用語は、少なくとも２つのヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼポリペプチドを任意の化学的
形態のマンガンとの複合体として含み、天然産生ヒトマ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼの酵素活性をもつ
分子を意味する。
ーゼ」なる用語は、少なくとも２つのヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼポリペプチドを任意の化学的
形態のマンガンとの複合体として含み、天然産生ヒトマ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼの酵素活性をもつ
分子を意味する。
本明細書中の「ヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼポリペプチド類似体」なる用語は、一端又は両端に
１つ以上の付加アミノ酸が結合したヒトマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼポリペプチドを含むポリペプチ
ドを意味する。
ーゼポリペプチド類似体」なる用語は、一端又は両端に
１つ以上の付加アミノ酸が結合したヒトマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼポリペプチドを含むポリペプチ
ドを意味する。
本明細書中の「ポリペプチドマンガン複合体類似体」な
る用語は、一端又は両端に結合した１つ以−ヒの付加ア
ミノ酸を含むポリペプチド部分をもつポリペプチドマン
ガン複合体を含む分子を意味する。
る用語は、一端又は両端に結合した１つ以−ヒの付加ア
ミノ酸を含むポリペプチド部分をもつポリペプチドマン
ガン複合体を含む分子を意味する。
本明細書中の［ヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼ類似体」なる用語は、２つ以上のポリペプチドを任
きの化学的形態のマンガンとの複合体として含み、ポリ
ペプチドの少なくとも１つがヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼポリペプチド類似体であり、天然産生
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの酵素活性
をらつ分子を意味する。
ーゼ類似体」なる用語は、２つ以上のポリペプチドを任
きの化学的形態のマンガンとの複合体として含み、ポリ
ペプチドの少なくとも１つがヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼポリペプチド類似体であり、天然産生
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの酵素活性
をらつ分子を意味する。
本明細書中の「ヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼポリペプチド突然変異体」なろ用語は、ヒトマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドに実質的
に等しいが１つ以上の異なるアミノ酸を含むアミノ酸配
列をもつポリペプチドを仏法する。
ーゼポリペプチド突然変異体」なろ用語は、ヒトマンガ
ンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドに実質的
に等しいが１つ以上の異なるアミノ酸を含むアミノ酸配
列をもつポリペプチドを仏法する。
本明細書中の「ポリペプチドマンガン複合体突然変異体
」なる用語は、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼポリペプチド突然変異体を任意の化学的形態のマン
ガンとの複合体として含みマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼの酵素活性をもつ分子を意味する。
」なる用語は、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼポリペプチド突然変異体を任意の化学的形態のマン
ガンとの複合体として含みマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼの酵素活性をもつ分子を意味する。
本明細書中の「ヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼ突然変異体」なる用語は、２つ以上のポリペプチド
を任意の化学的形態のマンガンとの複合体として含み、
ポリペプチドの少なくとも１つがヒトマンガンスーパー
オキシドジスムターゼポリペプチド突然変異体であり、
天然産生ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの
酵素活性をらつ分子を意味する。
ーゼ突然変異体」なる用語は、２つ以上のポリペプチド
を任意の化学的形態のマンガンとの複合体として含み、
ポリペプチドの少なくとも１つがヒトマンガンスーパー
オキシドジスムターゼポリペプチド突然変異体であり、
天然産生ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの
酵素活性をらつ分子を意味する。
本発明の一部を構成するｈＭｎｓＯＤポリペプチド及び
ｈＭｎｓＯＤの突然変異体は第１図のＤＮＡ配列の突然
変異によって調製され得る。該配列のＮ末端はヌクレオ
チド１１５〜１１７によってコードされるリジンであり
、該配列のＣｏｏ）ｌ末端はヌクレオチド７０６〜７０
８によってコードされる。
ｈＭｎｓＯＤの突然変異体は第１図のＤＮＡ配列の突然
変異によって調製され得る。該配列のＮ末端はヌクレオ
チド１１５〜１１７によってコードされるリジンであり
、該配列のＣｏｏ）ｌ末端はヌクレオチド７０６〜７０
８によってコードされる。
ＤＮＡは当業者に公知の方法、例えばＢａｕｅｒ等、Ｇ
ｅｎｅ、３７ ＋７３−８１（１９８５）の方法で突然
変異させ得る。突然変異した配列を本文に記載の適当な
発現ベクターに挿入し、これを細胞に導入し処理して突
然変異ＤＮＡがｈＭｎｓＯＤポリペプチド突然変異体と
ｈＭｎｓＯＤ突然変異体との発現を指令する。
ｅｎｅ、３７ ＋７３−８１（１９８５）の方法で突然
変異させ得る。突然変異した配列を本文に記載の適当な
発現ベクターに挿入し、これを細胞に導入し処理して突
然変異ＤＮＡがｈＭｎｓＯＤポリペプチド突然変異体と
ｈＭｎｓＯＤ突然変異体との発現を指令する。
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの酵素活性
形態は、少なくとも２つ、場合によっては４つの等しい
サブユニットをもつタンパク質であり、サブユニットの
各々が第１図のヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼの配列中のほぼ１９８個のアミノ酸をもち、配列の
Ｎ末端が第１図のヌクレオチド１１５〜１１７でコード
されるリジンであり、配列のＣｏｏｌ（末端が第１図の
ヌクレオチド７０６〜７０８でコードされるリジンであ
ると推定される。
形態は、少なくとも２つ、場合によっては４つの等しい
サブユニットをもつタンパク質であり、サブユニットの
各々が第１図のヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼの配列中のほぼ１９８個のアミノ酸をもち、配列の
Ｎ末端が第１図のヌクレオチド１１５〜１１７でコード
されるリジンであり、配列のＣｏｏｌ（末端が第１図の
ヌクレオチド７０６〜７０８でコードされるリジンであ
ると推定される。
ヒトＭｎ５ＯＤもしくはその類似体又はそれらの突然変
異体はヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼもし
くはその類似体又はそれらの突然変異体をコードするＤ
ＮＡ又はｃＤＮＡを導入した細胞から調製されろ。この
ヒトＭｎ５ＯＤもしくはその類似体又はそれらの突然変
異体は陽子の存在下でスーパーオキンドアニオンの不均
化反応又は−価還元によって式 ％式％ で示される過酸化水素を形成する反応を触媒する。
異体はヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼもし
くはその類似体又はそれらの突然変異体をコードするＤ
ＮＡ又はｃＤＮＡを導入した細胞から調製されろ。この
ヒトＭｎ５ＯＤもしくはその類似体又はそれらの突然変
異体は陽子の存在下でスーパーオキンドアニオンの不均
化反応又は−価還元によって式 ％式％ で示される過酸化水素を形成する反応を触媒する。
有効量のｈＭｎｓＯＤ又は１種類以上のｈＭｎｓＯＤ類
似体又はそれらの突然変異体と適当な担体とを含有する
獣医薬及び医薬組成物の調製も可能である。かかる担体
は当業者に公知である。ｈＭｎｓＯＤもしくはその類似
体又はそれらの突然変異体は、炎症にかかった患者を治
療するため又は虚血もしくは臓器移植後の再潅流のとき
の酸素遊離ラジカルによる患者に対する傷害を低減する
ために直接に又は動物又はヒト患者に適した組成物の形
態で投与することができる。ｈＭｎｓＯＤもしくはその
類似体又はそれらの突然変異体はまた、摘出後の潅流の
ときの酸素遊離ラジカルによる単離器官の傷害を低減し
この器官の生存期間を延長するために、単離器官の′ａ
流媒体に直接添加されてもよく又は組成物の形態で添加
されてもよい。更に、ｈＭｎｓＯＤもしくはその類似体
又はそれらの突然変異体は虚血後の再潅流のときの神経
傷害を低減するために使用されてもよく又は気管支肺形
成異常の治療に使用されてもよい。
似体又はそれらの突然変異体と適当な担体とを含有する
獣医薬及び医薬組成物の調製も可能である。かかる担体
は当業者に公知である。ｈＭｎｓＯＤもしくはその類似
体又はそれらの突然変異体は、炎症にかかった患者を治
療するため又は虚血もしくは臓器移植後の再潅流のとき
の酸素遊離ラジカルによる患者に対する傷害を低減する
ために直接に又は動物又はヒト患者に適した組成物の形
態で投与することができる。ｈＭｎｓＯＤもしくはその
類似体又はそれらの突然変異体はまた、摘出後の潅流の
ときの酸素遊離ラジカルによる単離器官の傷害を低減し
この器官の生存期間を延長するために、単離器官の′ａ
流媒体に直接添加されてもよく又は組成物の形態で添加
されてもよい。更に、ｈＭｎｓＯＤもしくはその類似体
又はそれらの突然変異体は虚血後の再潅流のときの神経
傷害を低減するために使用されてもよく又は気管支肺形
成異常の治療に使用されてもよい。
本発明はまた、細菌細胞中で酵素活性ヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれ
らの突然変異体を産生ずる方法を提供する。細菌細胞は
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼらしくはそ
の類似体又はそれらの突然変異体をコードするＤＮＡ配
列を含み該配列を発現し得る。本発明方法では、細菌細
、砲を４当な条件下で適当な産生培地中に維持する。培
地中のＭｎ”″濃度が約２ｐｐｍを上回るような量の１
＋！ｎ ２ ＋を産生培地に補給する。
パーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又はそれ
らの突然変異体を産生ずる方法を提供する。細菌細胞は
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼらしくはそ
の類似体又はそれらの突然変異体をコードするＤＮＡ配
列を含み該配列を発現し得る。本発明方法では、細菌細
、砲を４当な条件下で適当な産生培地中に維持する。培
地中のＭｎ”″濃度が約２ｐｐｍを上回るような量の１
＋！ｎ ２ ＋を産生培地に補給する。
細菌細胞はＤＮＡ組換技術によってヒトマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼをコードするＤＮＡ配列が導入
できるいかなる細菌でしよい。細菌はＤＮＡ配列を発現
しタンパク物質を産生じ得る必要がある。細菌の種及び
株に従って適正条件及び産生培地を任意に調整し得る。
ーオキシドジスムターゼをコードするＤＮＡ配列が導入
できるいかなる細菌でしよい。細菌はＤＮＡ配列を発現
しタンパク物質を産生じ得る必要がある。細菌の種及び
株に従って適正条件及び産生培地を任意に調整し得る。
細菌細胞はプラスミドの如きベクターＤＮＡ分子本体に
スーパーオキンドジスムターゼ又は類似体をコードする
ＤＮＡ配列を含む必要がある。ヘクター即ちプラスミド
は分子の適当な位置に取り込まれたＳＯＤをコードする
配列を６つようにＤＮＡ組換技術によって溝築され得る
。
スーパーオキンドジスムターゼ又は類似体をコードする
ＤＮＡ配列を含む必要がある。ヘクター即ちプラスミド
は分子の適当な位置に取り込まれたＳＯＤをコードする
配列を６つようにＤＮＡ組換技術によって溝築され得る
。
本発明の好Ｒ具体例では細菌細胞か太陽菌細胞である。
大腸菌の好ましい栄養要求株はＡ１６４５である。大腸
菌の好ましい原栄養株はＡ４２５５である。
菌の好ましい原栄養株はＡ４２５５である。
本発明の大、陽画細胞はヒトマンガンスーパー才キンド
ノスムターゼらしくはその類似体又はそれらの突然変異
体をコードするプラスミドを含む。
ノスムターゼらしくはその類似体又はそれらの突然変異
体をコードするプラスミドを含む。
本発明の好適具体例で細菌細胞はプラスミドｐＭｓＥ−
４を含む。こＤプラスミドの構築方法は図面の説明に記
載されておりプラスミド自体は実施例２に記載されてい
る。このプラスミドはＡ Ｔ ＣＣ受託番号Ｎ０．５３
２５０で寄託されている。
４を含む。こＤプラスミドの構築方法は図面の説明に記
載されておりプラスミド自体は実施例２に記載されてい
る。このプラスミドはＡ Ｔ ＣＣ受託番号Ｎ０．５３
２５０で寄託されている。
本発明の別の好適具体例によれば、細菌細胞がプラスミ
ドｐＭＳΔＲＢ４を含む。このプラスミドの構築方法は
図面の説明に記載されておりプラスミド自体は実施例５
に記載されている。このプラスミドはＡＴＣＣ受託番号
Ｎｏ、５３４６８で寄託され１とプラスミドｐｓＯＤβ
、Ｔ−１１から構築される。
ドｐＭＳΔＲＢ４を含む。このプラスミドの構築方法は
図面の説明に記載されておりプラスミド自体は実施例５
に記載されている。このプラスミドはＡＴＣＣ受託番号
Ｎｏ、５３４６８で寄託され１とプラスミドｐｓＯＤβ
、Ｔ−１１から構築される。
本発明の特定具体例に於いて、酵素活性ヒトマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼ類似体は、プラスミドｐＭ
ＳＥ−４を含む大腸菌Ａ４２５５株細胞及びプラスミド
ｐＭＳΔＲＢ４を含む大腸菌Ａ４２５５株によって産生
される。
ーパーオキシドジスムターゼ類似体は、プラスミドｐＭ
ＳＥ−４を含む大腸菌Ａ４２５５株細胞及びプラスミド
ｐＭＳΔＲＢ４を含む大腸菌Ａ４２５５株によって産生
される。
細菌細胞の適当な産生培地はカゼイン氷解物又はＬＢ（
Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）培地の如き許容されるいかな
るタイプの増殖培地でもよい。後者の方が好ましい。大
腸菌の株及び大腸菌か含むプラスミドに従って増殖条件
を適宜調整し得る。例えばプラスミドｐＭＳＥ−４を含
む大腸菌Ａ４２５５は４２℃で誘発され、この′ｆｊＬ
度で約１〜５時間維持される。産生段階以面に接種物を
増殖させ培養物を所望５度まで増殖させ且つ産生期間中
に培養物を維持するための適当な温度、時間、攪拌及び
通気条件は適宜変化し得、当業者に公知である。
Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）培地の如き許容されるいかな
るタイプの増殖培地でもよい。後者の方が好ましい。大
腸菌の株及び大腸菌か含むプラスミドに従って増殖条件
を適宜調整し得る。例えばプラスミドｐＭＳＥ−４を含
む大腸菌Ａ４２５５は４２℃で誘発され、この′ｆｊＬ
度で約１〜５時間維持される。産生段階以面に接種物を
増殖させ培養物を所望５度まで増殖させ且つ産生期間中
に培養物を維持するための適当な温度、時間、攪拌及び
通気条件は適宜変化し得、当業者に公知である。
酵素活性Ｍｎ５ＯＤを産生ずるに必要な培地中のＭｎ”
″濃度は使用培地の種類によって調整される。
″濃度は使用培地の種類によって調整される。
ＬＢ−タイプ増殖培地では１５０ｐｐｍ 〜７５０ｐｐ
ｍの！ｄｒ＋”濃度が宵効である。全ての複合タイプの
増殖培地では、培地中のＩＡ ｎ ” ”濃度は約５０
〜約１５００ｐｐｍであるのが好ましい。
ｍの！ｄｒ＋”濃度が宵効である。全ての複合タイプの
増殖培地では、培地中のＩＡ ｎ ” ”濃度は約５０
〜約１５００ｐｐｍであるのが好ましい。
適当な保存、培養、接種及び産生用培地の個々の成分を
種々に調整し得ることも当業者に公知である。
種々に調整し得ることも当業者に公知である。
本発明はまた、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼもしくはその類似体又はそれるの突然変異体を含有
する細菌細胞からこれらを回収する方法を提供する。細
胞を先ず処理してヒトマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼらしくはその類似体又はそれらの突然変異体を含
む細胞中に存在するタンパク質を含むタンパク質画分を
回収し、このタンパク質画分を処理してヒトマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又はそ
れらの突然変異体を回収する。
ーゼもしくはその類似体又はそれるの突然変異体を含有
する細菌細胞からこれらを回収する方法を提供する。細
胞を先ず処理してヒトマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼらしくはその類似体又はそれらの突然変異体を含
む細胞中に存在するタンパク質を含むタンパク質画分を
回収し、このタンパク質画分を処理してヒトマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼもしくはその類似体又はそ
れらの突然変異体を回収する。
本発明の好適具体例によれば、細胞を先ず処理して可溶
タンパク質を不溶タンパク質及び細胞壁破片から分離し
次に可溶タンパク質を回収する。
タンパク質を不溶タンパク質及び細胞壁破片から分離し
次に可溶タンパク質を回収する。
このように回収された可溶タンパク質を処理しヒトマン
ガンスーパーオキシドジスムターゼらしくはその類具体
又はそれらの突然変異体を含む可溶タンパク質の画分を
分離例えば沈澱させ、この画分を回収する。次にこの画
分を処理してヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼらしくはその類似体又はそれらの突然変異体を分離回
収する。
ガンスーパーオキシドジスムターゼらしくはその類具体
又はそれらの突然変異体を含む可溶タンパク質の画分を
分離例えば沈澱させ、この画分を回収する。次にこの画
分を処理してヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼらしくはその類似体又はそれらの突然変異体を分離回
収する。
本発明の好適具体例を以下により詳細に説明する。先ず
、細菌細胞を産生培地から単離しｐＨ約７０又は８．０
の適当な溶液に＠潤させる。次に細胞を破壊し遠心する
。得られた上清を約５５〜６５℃の範囲の温度で約３０
〜１２０分間、好ましくは５８〜６２℃で１５〜７５分
間、より好ましくは６０℃で１時間加熱し、１０℃未満
好ましくは約４℃に冷却する。冷却中に形成された沈澱
物を例えば遠心によって完全に除去し、次に冷却上清を
適当なバッファに透析する。
、細菌細胞を産生培地から単離しｐＨ約７０又は８．０
の適当な溶液に＠潤させる。次に細胞を破壊し遠心する
。得られた上清を約５５〜６５℃の範囲の温度で約３０
〜１２０分間、好ましくは５８〜６２℃で１５〜７５分
間、より好ましくは６０℃で１時間加熱し、１０℃未満
好ましくは約４℃に冷却する。冷却中に形成された沈澱
物を例えば遠心によって完全に除去し、次に冷却上清を
適当なバッファに透析する。
好ましくは３０により好ましくはＩＯＫより小さいろ過
膜を用いる限外濾過によって冷却上清を透析する。過当
なバッファとしてはｐＨ約７．８の２ ｍ Ｓｔ燐酸カ
リウムバッファがある。この透析と同時又は透１斤後に
、冷却上清を適当な容〕に（モぎにａ縮し得る。
膜を用いる限外濾過によって冷却上清を透析する。過当
なバッファとしてはｐＨ約７．８の２ ｍ Ｓｔ燐酸カ
リウムバッファがある。この透析と同時又は透１斤後に
、冷却上清を適当な容〕に（モぎにａ縮し得る。
例えば上清の初期容量の００３容に濃縮するのが有利で
ある。次に保持物を適当なバッファ溶液例えばｐＨ約７
．８の少なくとも２０ｍＭの燐酸カリウムバッファ溶液
を用い、アニオン交換クロマトグラフィーカラムから溶
出する。スーパーオキシドジスムターゼを含む溶出物の
画分を収集しプールし、ｐＨ５，５の約４０ｍＭ酢酸カ
リウムに透析する。透析したプール画分をｐＨ５．５の
約４０〜約２００ｄ酢酸カリウム（ＫＯＡＣ）直線勾配
をもつカチオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出
する。スーパー・オキシドジスムターゼを含むピーク画
分を収集しプールする。
ある。次に保持物を適当なバッファ溶液例えばｐＨ約７
．８の少なくとも２０ｍＭの燐酸カリウムバッファ溶液
を用い、アニオン交換クロマトグラフィーカラムから溶
出する。スーパーオキシドジスムターゼを含む溶出物の
画分を収集しプールし、ｐＨ５，５の約４０ｍＭ酢酸カ
リウムに透析する。透析したプール画分をｐＨ５．５の
約４０〜約２００ｄ酢酸カリウム（ＫＯＡＣ）直線勾配
をもつカチオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出
する。スーパー・オキシドジスムターゼを含むピーク画
分を収集しプールする。
プールしたピーク画分を適当な溶液例えば水又はｐＨ約
７．８の約１０ｍＭの燐酸カリウムのバッファ溶液で任
意に透析してもよい。
７．８の約１０ｍＭの燐酸カリウムのバッファ溶液で任
意に透析してもよい。
本発明はまた、本発明方法によって産生される精製され
た即ち実質的にヒト由来の別の物質を含まないヒトマン
ガンスーパーオキシドジスムターゼもしくはその類似体
又はそれらの突然変異体に係る。特に本発明は、２つ以
上のポリペプチドを含み、このポリペプチドの少なくと
も１つが第１図のアミノ酸配列をもち、該配列のＮ末端
が第１図のヌクレオチド１１５〜１１７でコードされる
リジンであり、該配列のＣＯＯＮ末端が第１図のヌクレ
オチド７０６〜７０８でコードされるリジンであり、該
配列のＮ末端に付加メチオニン残基が結合している（Ｍ
ｅｔ−ｈＭｎｓＯＤ）ヒトマンガンスーパーオキノドジ
スムターゼ類似体に係る。本発明の好適具体例は比活性
３５００単位／町をもつ精製Ｍｅｔ−ｈＭｎｓＯＤであ
る。
た即ち実質的にヒト由来の別の物質を含まないヒトマン
ガンスーパーオキシドジスムターゼもしくはその類似体
又はそれらの突然変異体に係る。特に本発明は、２つ以
上のポリペプチドを含み、このポリペプチドの少なくと
も１つが第１図のアミノ酸配列をもち、該配列のＮ末端
が第１図のヌクレオチド１１５〜１１７でコードされる
リジンであり、該配列のＣＯＯＮ末端が第１図のヌクレ
オチド７０６〜７０８でコードされるリジンであり、該
配列のＮ末端に付加メチオニン残基が結合している（Ｍ
ｅｔ−ｈＭｎｓＯＤ）ヒトマンガンスーパーオキノドジ
スムターゼ類似体に係る。本発明の好適具体例は比活性
３５００単位／町をもつ精製Ｍｅｔ−ｈＭｎｓＯＤであ
る。
実施例
以下の実施例は本発明の理解を助けるための記載であり
、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない
。実施例はベクター構築、ポリペプチドをコードする遺
伝子の該ベクター内挿入、又は、得られたプラスミドの
宿主内導入の従来方法に関する詳細な記載を含まない。
、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない
。実施例はベクター構築、ポリペプチドをコードする遺
伝子の該ベクター内挿入、又は、得られたプラスミドの
宿主内導入の従来方法に関する詳細な記載を含まない。
実施例はまたかかる宿主ベクター系によって産生される
ポリペプチドの検定に使用される従来方法又は等重点フ
ォーカシング（ＩＥＰ）ゲルの活性染色によるかかるポ
リペプチドの同定に使用される従来方法についても詳細
に説明しない。かかる方法は当業者に公知であり多くの
文献に記載されている。これら文献の例を以下に挙げる
。
ポリペプチドの検定に使用される従来方法又は等重点フ
ォーカシング（ＩＥＰ）ゲルの活性染色によるかかるポ
リペプチドの同定に使用される従来方法についても詳細
に説明しない。かかる方法は当業者に公知であり多くの
文献に記載されている。これら文献の例を以下に挙げる
。
Ｔ、’ｄａｎｉａｔｉｓ、 Ｅ、Ｆ、Ｉコｒｉｔｓｃｈ
＆びＪ、Ｓｏｍｏｂｒｏｏｋ、Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ
Ｃ２Ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌＳＣｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）：Ｊ
、 Ｍ、 ＭｃＣｏｒｄ及び１．Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈＳ
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２４４６０４９−５５（
１９６９）・ Ｃ，Ｂｅａｕｃｈａｍｐ及び１．Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ、
Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、４４：２７６−８７（１
９７１）。
＆びＪ、Ｓｏｍｏｂｒｏｏｋ、Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ
Ｃ２Ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌＳＣｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）：Ｊ
、 Ｍ、 ＭｃＣｏｒｄ及び１．Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈＳ
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２４４６０４９−５５（
１９６９）・ Ｃ，Ｂｅａｕｃｈａｍｐ及び１．Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ、
Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、４４：２７６−８７（１
９７１）。
刃施例ｌ
Ｍｎ５ＯＤ ｃＤＮＡクローンを同定するために、公表
されているアミノ酸配列（１ｇ、 １９）に従って混合
オリゴマープローブを合成した。
されているアミノ酸配列（１ｇ、 １９）に従って混合
オリゴマープローブを合成した。
５°ブローブーＡＡ、５−ＡＡ２．の３０個の配列（１
８，１９）５゛３゛ ＴＴＧＣＡＴＡＡＴＴＴＧＴＧＣＣＴＴＡＡＴＧＴＧＴ
ＧＧＴＴＣＧＴＧ Ｇ Ｇ ３′ブローブーＡＡ、、、−ＡＡ、、、の３２個の配列
（１８）５°
３゛ＴＣＴＧＴＴＡＣＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴ
ＴＴＡＴＴＡＣＧＴＴＣＣＡＧＧ
ＧＧ ３０個のヌクレオチドから成る５°−プローブは成熟Ｍ
ｎ５ＯＤのアミノ酸１５〜２４に対応する。３２ｇのヌ
クレオチドから成る３″−プローブは成熟Ｍｎ５ＯＤの
アミノ酸１７９〜１８９に対応する。５°−プローブは
上記のごとく異なる３６個の配列から成る混合プローブ
である。３゛−プローブは上記のごとく異なる１６個の
配列から成る混合プローブである。（所与の位置に１つ
以上のヌクレオチドが図示されるとき、Ｄ Ｎ Ａ鎖は
図示のヌクレオチドの谷々を等モル量ずつ用いて合成さ
れる混合プローブである）。
８，１９）５゛３゛ ＴＴＧＣＡＴＡＡＴＴＴＧＴＧＣＣＴＴＡＡＴＧＴＧＴ
ＧＧＴＴＣＧＴＧ Ｇ Ｇ ３′ブローブーＡＡ、、、−ＡＡ、、、の３２個の配列
（１８）５°
３゛ＴＣＴＧＴＴＡＣＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴ
ＴＴＡＴＴＡＣＧＴＴＣＣＡＧＧ
ＧＧ ３０個のヌクレオチドから成る５°−プローブは成熟Ｍ
ｎ５ＯＤのアミノ酸１５〜２４に対応する。３２ｇのヌ
クレオチドから成る３″−プローブは成熟Ｍｎ５ＯＤの
アミノ酸１７９〜１８９に対応する。５°−プローブは
上記のごとく異なる３６個の配列から成る混合プローブ
である。３゛−プローブは上記のごとく異なる１６個の
配列から成る混合プローブである。（所与の位置に１つ
以上のヌクレオチドが図示されるとき、Ｄ Ｎ Ａ鎖は
図示のヌクレオチドの谷々を等モル量ずつ用いて合成さ
れる混合プローブである）。
λｇＬ−１０ベクターにクローニングされたＴ−細抱ｃ
ＤＮ人ラビライブラリ−３００，Ｑ（ｔｏのプラークを
５゛−プローブを使用してスクリーニングした。ニトロ
セルロースフィルターに固定したファージプラークレプ
リカに対するハイブリダイゼーションを標準方法（上掲
のＭａｎｉａｔｉｓ等）を準用し５０℃の８ＸＳＳＣ中
で１６時間行なった。次にフィルターを５０℃の５ｘｓ
ｓｃ及び０，１％ＳＤＳで洗浄した。３つの陽性プラー
クを単離しＰｈｉ ＭＳ８、Ｐｈｉ ＭＳＩ及びＰｈｉ
ＭＳＩＪと命名した。
ＤＮ人ラビライブラリ−３００，Ｑ（ｔｏのプラークを
５゛−プローブを使用してスクリーニングした。ニトロ
セルロースフィルターに固定したファージプラークレプ
リカに対するハイブリダイゼーションを標準方法（上掲
のＭａｎｉａｔｉｓ等）を準用し５０℃の８ＸＳＳＣ中
で１６時間行なった。次にフィルターを５０℃の５ｘｓ
ｓｃ及び０，１％ＳＤＳで洗浄した。３つの陽性プラー
クを単離しＰｈｉ ＭＳ８、Ｐｈｉ ＭＳＩ及びＰｈｉ
ＭＳＩＪと命名した。
Ｐｈｉ ＭＳ８及びＰｈｉ ＭＳＩから得たＤＮＡのＥ
ｃｏＲＩ消化物は、双方ともが長さ約８００ｂｐのｃＤ
ＮＡインサートをもち５゛−及び３−末端のオリゴヌク
レオチドプローブにハイブリダイズすることが判明した
。
ｃｏＲＩ消化物は、双方ともが長さ約８００ｂｐのｃＤ
ＮＡインサートをもち５゛−及び３−末端のオリゴヌク
レオチドプローブにハイブリダイズすることが判明した
。
Ｐｈｉ ＭＳＩＪは５′−末端プローブのみにハイブリ
ダイズする僅か４５０ｂｌ）のｃＤＮＡインサートを担
持していた。
ダイズする僅か４５０ｂｌ）のｃＤＮＡインサートを担
持していた。
３つのファージクローンのＥｃｏＲＩインサートを１）
ＢＲ３２２のＥｃｏＲ１部位にサブクローニングすると
夫々ｐｙｓｇ−４、ｐＭｓｌ−４及びｐＭＳｔＪをか得
られた。制限解析及び５°−及び３°−オリゴヌクレオ
チドプローブへのハイブリダイゼーションによって、ｐ
ＭＳ８−４及びｐＭｓｌ４の双方で同様のパターンが判
明した。双方のプラスミドについて５−→３’一方向の
以下の制限地図が推定された。
ＢＲ３２２のＥｃｏＲ１部位にサブクローニングすると
夫々ｐｙｓｇ−４、ｐＭｓｌ−４及びｐＭＳｔＪをか得
られた。制限解析及び５°−及び３°−オリゴヌクレオ
チドプローブへのハイブリダイゼーションによって、ｐ
ＭＳ８−４及びｐＭｓｌ４の双方で同様のパターンが判
明した。双方のプラスミドについて５−→３’一方向の
以下の制限地図が推定された。
ｐＭＳ８−４のｃＤＮＡインサートの配列を第１図に示
す。
す。
予想されるアミノ酸配列は公表されているアミノ酸配列
（Ｉ９）に比較して３つの位置（ＡＡ４２．８８．１０
８）でＧｉｎがＧｌｕで置換されＡＡ１２３ １！４間
に２つの付加アミノ酸Ｇｌｙ及びＴｒｐがある。ｐＭｓ
ｌ−４及びｐＭｓｌＪの配列解析より、３つのＭｎ５Ｏ
Ｄクローンが別々に誘導されることが判明し、公表アミ
ノ酸配列に比較して上記の違いをもつことが確認された
。
（Ｉ９）に比較して３つの位置（ＡＡ４２．８８．１０
８）でＧｉｎがＧｌｕで置換されＡＡ１２３ １！４間
に２つの付加アミノ酸Ｇｌｙ及びＴｒｐがある。ｐＭｓ
ｌ−４及びｐＭｓｌＪの配列解析より、３つのＭｎ５Ｏ
Ｄクローンが別々に誘導されることが判明し、公表アミ
ノ酸配列に比較して上記の違いをもつことが確認された
。
成熟Ｍｎ５ＯＤのＨ末端リジンの上流の配列は２４個の
アミノ酸のプレペプチド配列を予想させる。
アミノ酸のプレペプチド配列を予想させる。
ｐＭＳＥ−４の構築の出発点は実施例１に記載のごとく
得られたプラスミドｐＭｓ８−４である。ＥｃｏＲＩイ
ンサートにヒトＭｎ５ＯＤ ｃＤＮＡを含むプラスミド
９Ｍ５８−４をＮｄｅ Ｉ及びＤ工■制限酵素で完全消
化した。大きい断片を単離し第２図に示すごとく合成オ
リゴマーと結合した。得られたプラスミドｐＭＳ８−Ｎ
ＮはＡＴＧ開始コドンの直後の成熟Ｍｎ５ＯＤのコード
領域を含んでいた。前記プラスミドをＥｃｏＲＩで消化
し末端をＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩのＫｌｅｎｏｖ断片
で充填し更に１ｌｄｅ Ｉで開裂した。Ｍｎ５ＯＤ遺伝
子を含む小さい断片をＮｄｅ Ｉ及びＳｔｕ Ｉで処理
したｐｓＯＤ ｌ ３に挿入した。
得られたプラスミドｐＭｓ８−４である。ＥｃｏＲＩイ
ンサートにヒトＭｎ５ＯＤ ｃＤＮＡを含むプラスミド
９Ｍ５８−４をＮｄｅ Ｉ及びＤ工■制限酵素で完全消
化した。大きい断片を単離し第２図に示すごとく合成オ
リゴマーと結合した。得られたプラスミドｐＭＳ８−Ｎ
ＮはＡＴＧ開始コドンの直後の成熟Ｍｎ５ＯＤのコード
領域を含んでいた。前記プラスミドをＥｃｏＲＩで消化
し末端をＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩのＫｌｅｎｏｖ断片
で充填し更に１ｌｄｅ Ｉで開裂した。Ｍｎ５ＯＤ遺伝
子を含む小さい断片をＮｄｅ Ｉ及びＳｔｕ Ｉで処理
したｐｓＯＤ ｌ ３に挿入した。
ｐｓＯＤ１３は１９８４年８月２７日出願の米国特許出
願第６４４２４５号にｇｉｌ！載の方法で得られる。該
特許出願は本明細書に含まれるものとする。得られたプ
ラスミドｐＭＳε−４はａｌｌリポソーム結合部位の直
後のＭｎ５ＯＤコード領域を含みλＰ１．プロモータの
コントロール下にある。プラスミドｐＭＳＥ−４はＡＴ
ＣＣ受託番号Ｎｏ、 ５３２５０で寄託されている。上
記手順で使用される全ての方法は上掲のＭａｎｉａｔｉ
ｓの方法と実質的に同じである。
願第６４４２４５号にｇｉｌ！載の方法で得られる。該
特許出願は本明細書に含まれるものとする。得られたプ
ラスミドｐＭＳε−４はａｌｌリポソーム結合部位の直
後のＭｎ５ＯＤコード領域を含みλＰ１．プロモータの
コントロール下にある。プラスミドｐＭＳＥ−４はＡＴ
ＣＣ受託番号Ｎｏ、 ５３２５０で寄託されている。上
記手順で使用される全ての方法は上掲のＭａｎｉａｔｉ
ｓの方法と実質的に同じである。
実施例３
組換体ヒトＭｎ５ＯＤの発現
公知方法を用いプラスミドＩ）ＭＳＥ−４を大腸菌Ａ４
２５５株に導入した。Ｉ）ＭＳＥ−４を含む大腸菌Ａ４
２５５株を１００＃／ｄのアンビンリンを含むＬｕｒｉ
ａ Ｂｒｏｔｂ（ＬＢ）培地で３２℃で６０［１ｎｍの
光学密度（ＯＤ）が０．７になるまで増殖させた。誘発
は４２℃で行なった。種々の時点でサンプルを採取しド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ −ＰＡＧＥ）で分離した。該ゲルによると
ヒトＭｎ５ＯＤレベルは誘発後の１２０分間まで増加し
、Ｃｏｏｍａｓｉｅ−ｂｌｕｅ染色ゲルの走査によって
定ｍするとこの時期に組換体Ｍｎ５ＯＤタンパク質は全
細胞タンパク質の２７％を溝成していた。ト３７５超音
波処理装置でサンプルを９０秒問題音波処理し１０．０
００７で５分間遠心してタンパク質を可溶（Ｓ）画分と
不７Ｓ（１））画分とに分画すると、産生された殆んど
の組換体Ｍｎ５ＯＤが不溶であることが判明した。標準
方法で検定すると、誘発された可溶タンパク質画分は誘
発されない同様の画分よりもＳＯＤ活性をすこしだけ多
く含むことが判明した。上掲のＭｃＣｏｒｄ等参照。可
溶画分中に検出されるＭｎ５ＯＤの一部分は明らかに不
活性である。これはこの実施例に記載の条件下で産生さ
れたヒトＭｎ５ＯＤの殆どが事実上不活性であることを
示唆する。
２５５株に導入した。Ｉ）ＭＳＥ−４を含む大腸菌Ａ４
２５５株を１００＃／ｄのアンビンリンを含むＬｕｒｉ
ａ Ｂｒｏｔｂ（ＬＢ）培地で３２℃で６０［１ｎｍの
光学密度（ＯＤ）が０．７になるまで増殖させた。誘発
は４２℃で行なった。種々の時点でサンプルを採取しド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ −ＰＡＧＥ）で分離した。該ゲルによると
ヒトＭｎ５ＯＤレベルは誘発後の１２０分間まで増加し
、Ｃｏｏｍａｓｉｅ−ｂｌｕｅ染色ゲルの走査によって
定ｍするとこの時期に組換体Ｍｎ５ＯＤタンパク質は全
細胞タンパク質の２７％を溝成していた。ト３７５超音
波処理装置でサンプルを９０秒問題音波処理し１０．０
００７で５分間遠心してタンパク質を可溶（Ｓ）画分と
不７Ｓ（１））画分とに分画すると、産生された殆んど
の組換体Ｍｎ５ＯＤが不溶であることが判明した。標準
方法で検定すると、誘発された可溶タンパク質画分は誘
発されない同様の画分よりもＳＯＤ活性をすこしだけ多
く含むことが判明した。上掲のＭｃＣｏｒｄ等参照。可
溶画分中に検出されるＭｎ５ＯＤの一部分は明らかに不
活性である。これはこの実施例に記載の条件下で産生さ
れたヒトＭｎ５ＯＤの殆どが事実上不活性であることを
示唆する。
４２℃での誘発の２時間前にｐＭＳＥ−４を含む大腸菌
Ａ４２５５の増殖培地に４５０ｐｐｍまで濃度を増加さ
せ乍らＭｎ’＋を添加するとヒトＭｎ５ＯＤの縮収率に
不利な影響を与えないことか判明した。超音波処理した
可溶タンパク質（ｓ）画分と不溶タンパク質（ｐ）画分
とをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析すると、Ｍｎ２＋
の濃度増加に伴って組換体タンパク質の溶解度が増加す
ることが判明した（表１）。ＳＯＤ活性の定量アッセイ
（上掲のＭｃＣｏｒｄ等参照）は、増殖培地中のＭｎ”
″濃度の増加とＭｎ５ＯＤの溶解度の増加との相関関係
があり培地中のＭｎ”ｉ度１５０ｐｐｍで見掛は上最適
の溶解度が得られることを示唆する（第３図）。更にＭ
ｎ ” ” ６度を増加するとそれまで不活性の可溶
酵素が活性化された。これらのＭｎ”″レベルで増殖さ
せた誘発培養物の可溶タンパク質画分は、これらのＭｎ
２°レベルで増殖させた非誘発培養物の可溶タンパク質
画分に比較して６０倍までのＳＯＤ活性を示した。等電
点フォーカシング（ＩＥＦ）ゲル（上掲のＢｅａｕ−ｃ
ｈａｍｐ等参照）の活性染色では多数の形態の組換体Ｍ
ｎ５ＯＤか天然のヒト肝臓Ｍｎ５ＯＤの形容に等しいこ
とが判明した。
Ａ４２５５の増殖培地に４５０ｐｐｍまで濃度を増加さ
せ乍らＭｎ’＋を添加するとヒトＭｎ５ＯＤの縮収率に
不利な影響を与えないことか判明した。超音波処理した
可溶タンパク質（ｓ）画分と不溶タンパク質（ｐ）画分
とをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析すると、Ｍｎ２＋
の濃度増加に伴って組換体タンパク質の溶解度が増加す
ることが判明した（表１）。ＳＯＤ活性の定量アッセイ
（上掲のＭｃＣｏｒｄ等参照）は、増殖培地中のＭｎ”
″濃度の増加とＭｎ５ＯＤの溶解度の増加との相関関係
があり培地中のＭｎ”ｉ度１５０ｐｐｍで見掛は上最適
の溶解度が得られることを示唆する（第３図）。更にＭ
ｎ ” ” ６度を増加するとそれまで不活性の可溶
酵素が活性化された。これらのＭｎ”″レベルで増殖さ
せた誘発培養物の可溶タンパク質画分は、これらのＭｎ
２°レベルで増殖させた非誘発培養物の可溶タンパク質
画分に比較して６０倍までのＳＯＤ活性を示した。等電
点フォーカシング（ＩＥＦ）ゲル（上掲のＢｅａｕ−ｃ
ｈａｍｐ等参照）の活性染色では多数の形態の組換体Ｍ
ｎ５ＯＤか天然のヒト肝臓Ｍｎ５ＯＤの形容に等しいこ
とが判明した。
ｐＭＳＥ−４を含む大１１！＠Ａ１６４５によるヒトＭ
ｎ５ＯＤ産生の結果は上記と同様であった。
ｎ５ＯＤ産生の結果は上記と同様であった。
表１
０ ３０．６ ７．２
３０５０ ７２．７ １５．４
２４１１００ ７ｇ、 ０
１６．９ ３５６１５０ ｇ２
．９ １８．８ ６０６２００
８２．０ ２０．８ ３
３８２５０ ７９．２ ２０．４
３８０３００ ｇｏ、８
２０．３ ３８１４５０ ８９
．２ ２２．４ ３２３実施例５ してｐｓＯＤβＩＴ４１からＴｅｔ発現ベクターｐΔＲ
Ｂを生成した。Ｉ）ＳＯＤβ１Ｔ−１ｔはＡＣＴＴ受託
番号Ｎｏ、 ５３４６８で寄託されている。消化された
プラスミドを合成オリゴマー ５’ −ＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＣＴ−３
゜３°−ＧＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧ−５
゜と結合しλＰＬプａモータを含むｐΔＲＢを調製した
。
３０５０ ７２．７ １５．４
２４１１００ ７ｇ、 ０
１６．９ ３５６１５０ ｇ２
．９ １８．８ ６０６２００
８２．０ ２０．８ ３
３８２５０ ７９．２ ２０．４
３８０３００ ｇｏ、８
２０．３ ３８１４５０ ８９
．２ ２２．４ ３２３実施例５ してｐｓＯＤβＩＴ４１からＴｅｔ発現ベクターｐΔＲ
Ｂを生成した。Ｉ）ＳＯＤβ１Ｔ−１ｔはＡＣＴＴ受託
番号Ｎｏ、 ５３４６８で寄託されている。消化された
プラスミドを合成オリゴマー ５’ −ＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＣＴ−３
゜３°−ＧＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧ−５
゜と結合しλＰＬプａモータを含むｐΔＲＢを調製した
。
ａｌｌリポソーム結合部位と成熟酵素の完全コード配列
とを含むＭｎ５ＯＤ発現プラスミドｐＭＳＥ−４の除旦
ＲＩ所片をｐΔＲＢの唯１つの鈷旦Ｒ１部位に挿入した
。得られたプラスミドｐＭＳΔＲＢ４はλＰＬのコント
ロール下のＭｎ５ＯＤ遺伝子及びｃｌｌ ＲＢＳを含み
テトラサイクリン耐性（第４図）である。
とを含むＭｎ５ＯＤ発現プラスミドｐＭＳＥ−４の除旦
ＲＩ所片をｐΔＲＢの唯１つの鈷旦Ｒ１部位に挿入した
。得られたプラスミドｐＭＳΔＲＢ４はλＰＬのコント
ロール下のＭｎ５ＯＤ遺伝子及びｃｌｌ ＲＢＳを含み
テトラサイクリン耐性（第４図）である。
実施例６
公知方法を用い大腸菌Ａ４２５５株にプラスミドｐＭＳ
ΔＲＢ４を導入した。種々のａ度のＭｎ”＋を含むＬｕ
ｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地中で３２℃で６００ｎ
ｍの光学密度（ＯＤ）が６．７になるまで培養物を増殖
させた。４２℃で誘発した。種々の時点でサンプルを採
取し５ＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動にかけた。ｈＭｎｓＯ
Ｄレベルは１２０分間までは誘発時間に伴って増加し、
この時期にＣｏｏｍａｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色ゲルの走査
によって定量すると総細胞タンパク質の約１５％を含ん
でいた。
ΔＲＢ４を導入した。種々のａ度のＭｎ”＋を含むＬｕ
ｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地中で３２℃で６００ｎ
ｍの光学密度（ＯＤ）が６．７になるまで培養物を増殖
させた。４２℃で誘発した。種々の時点でサンプルを採
取し５ＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動にかけた。ｈＭｎｓＯ
Ｄレベルは１２０分間までは誘発時間に伴って増加し、
この時期にＣｏｏｍａｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色ゲルの走査
によって定量すると総細胞タンパク質の約１５％を含ん
でいた。
増殖培地中のＭｎ”ｉｌ１度にかかわりなく誘発Ｍｎ５
ＯＤは可溶であった。これはＡｍｐＲプラスミドｐＭＳ
Ｅ−４での観察と対照的である（実施例４参照）。
ＯＤは可溶であった。これはＡｍｐＲプラスミドｐＭＳ
Ｅ−４での観察と対照的である（実施例４参照）。
しかし乍ら最大ＳＯＤ活性及び発現レベルはＭｎ”の補
給虫に依存した（表２）。
給虫に依存した（表２）。
表２
大腸菌Ａ４２５５（ｐＭＳΔＲＢ４）中のＭｎ５ＯＤ発
現Ｍｎ２＋ 可溶細菌タンパク 可溶タンパク質０
１０．９ ８．０ ２３５０
１９．８ ＬＯ２２７１００１６，
０ｇ、０ ２４１ ２００ １７．０ １０．０ ２７
８３００ １６．０ ９．３ ２３
８実施例７ 酵素活性組換体ヒ） Ｍｎ５ＯＤの精製プラスミドｐＭ
ＳΔＲＢ４を含む大腸菌Ａ４２５５株を７５０ｐｐｍの
Ｍｎ’＋を補給したＬＢ中で３２℃でＡ６００が１７．
０になるまで発酵させた。温度を４２℃にし２時間維持
してヒトＭｎ５ＯＤの発現を誘発した。この時期に培養
物のＡ６００は４３．０に達していた。細胞を遠心によ
って回収し、２５０ｍＭのＮａＣｊ！を含むＩ）８７．
８の５０ｍＭの燐酸カリウムバッファの出発容俄の０．
２容で再懸濁させた。Ｄｙｎｏｍｉｌｌに２回通して細
菌を破壊し、遠心ｊ２２）細胞破片を廃棄した。上清を
６０℃で１時間加熱し、４℃に冷却し、透明な上清を初
期界１の０．０３容に濃縮し、ＩＯＫ膜を備えたＰｅｌ
１ｃｏｎ限外ｐ過装置てｐＨ＋７．８の２ｍＭの燐酸
バッファに透析した。粗酵素調製物をＤＥ５２カラムに
充填しｐＨ！７．８の２ｍＭ燐酸カリウムバッファで完
全に洗い、ｐＨ！７．８の２０ｍＭの燐酸カリウムバッ
ファで溶出した。酵素を含有するプール画分をＩ）１１
５．５の４０ｍＭの酢酸カリウムに透析し、Ｃ！１１５
２カラムに充填しｐＨ５．５の４０〜２００ｍＭ酢酸カ
リウムの直線勾配で溶出した。ヒトＭｎ５ＯＤを含むピ
ーク画分をプールし、ｐＩ１７．８の１０ｍＭ燐酸カリ
ウムバッファに調整した＋１ 、Ｏに透析し一２０℃で
凍結した。
現Ｍｎ２＋ 可溶細菌タンパク 可溶タンパク質０
１０．９ ８．０ ２３５０
１９．８ ＬＯ２２７１００１６，
０ｇ、０ ２４１ ２００ １７．０ １０．０ ２７
８３００ １６．０ ９．３ ２３
８実施例７ 酵素活性組換体ヒ） Ｍｎ５ＯＤの精製プラスミドｐＭ
ＳΔＲＢ４を含む大腸菌Ａ４２５５株を７５０ｐｐｍの
Ｍｎ’＋を補給したＬＢ中で３２℃でＡ６００が１７．
０になるまで発酵させた。温度を４２℃にし２時間維持
してヒトＭｎ５ＯＤの発現を誘発した。この時期に培養
物のＡ６００は４３．０に達していた。細胞を遠心によ
って回収し、２５０ｍＭのＮａＣｊ！を含むＩ）８７．
８の５０ｍＭの燐酸カリウムバッファの出発容俄の０．
２容で再懸濁させた。Ｄｙｎｏｍｉｌｌに２回通して細
菌を破壊し、遠心ｊ２２）細胞破片を廃棄した。上清を
６０℃で１時間加熱し、４℃に冷却し、透明な上清を初
期界１の０．０３容に濃縮し、ＩＯＫ膜を備えたＰｅｌ
１ｃｏｎ限外ｐ過装置てｐＨ＋７．８の２ｍＭの燐酸
バッファに透析した。粗酵素調製物をＤＥ５２カラムに
充填しｐＨ！７．８の２ｍＭ燐酸カリウムバッファで完
全に洗い、ｐＨ！７．８の２０ｍＭの燐酸カリウムバッ
ファで溶出した。酵素を含有するプール画分をＩ）１１
５．５の４０ｍＭの酢酸カリウムに透析し、Ｃ！１１５
２カラムに充填しｐＨ５．５の４０〜２００ｍＭ酢酸カ
リウムの直線勾配で溶出した。ヒトＭｎ５ＯＤを含むピ
ーク画分をプールし、ｐＩ１７．８の１０ｍＭ燐酸カリ
ウムバッファに調整した＋１ 、Ｏに透析し一２０℃で
凍結した。
得られた組換体ヒトＭｎ５ＯＤは純度９９％以上であり
比活性約３５００単位／ｍｇであった。精製手順の総収
量は約３０％であった（表３）。
比活性約３５００単位／ｍｇであった。精製手順の総収
量は約３０％であった（表３）。
精製酵素の配列決定によって公知のヒト＼１ｎｓＯＤ（
１９）に比較してＮ末端アミノ酸に付加メチオニンが存
在することが判明した。
１９）に比較してＮ末端アミノ酸に付加メチオニンが存
在することが判明した。
原子吸収によって金属含量を分析すると、酵素サブユニ
ット当たり約０．７７原子Ｍｎが存在していた。
ット当たり約０．７７原子Ｍｎが存在していた。
これは公表データと一致する（２３）。
」
ステップ 総タンパク質 収率 比活
性ｇｍ ｇｍｓＯＤ ％ 単位／ｍｇＤ
ｙｎｏｍｉｌｌ上清 １００．０ １１．９
１００．０ ４１７６０℃上清 ２４，
０ ８．２ ６８．９ １１９７Ｐｅｌｉｃ
ｏｎ保持物 ２０．０ ７．５ ６３．０
１３５０ＤＥ５２溶出物 ７．３ ５
．７ ４−８．０ ２７３２ＣＭ５２溶出物
４．２ ４，２ ３５．３ ３５００
注＊１５Ｌ発酵から精製された酵素における値。
性ｇｍ ｇｍｓＯＤ ％ 単位／ｍｇＤ
ｙｎｏｍｉｌｌ上清 １００．０ １１．９
１００．０ ４１７６０℃上清 ２４，
０ ８．２ ６８．９ １１９７Ｐｅｌｉｃ
ｏｎ保持物 ２０．０ ７．５ ６３．０
１３５０ＤＥ５２溶出物 ７．３ ５
．７ ４−８．０ ２７３２ＣＭ５２溶出物
４．２ ４，２ ３５．３ ３５００
注＊１５Ｌ発酵から精製された酵素における値。
２Ｘ：６０１４９−５５ （１９６９１゜２． Ｆ
ｒ１ｄｏｖｉｃｈ、 工、ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｇｉ
ｎ Ｉｎｏｒ ａｎｉｃ Ｂｉｏｃｈｅｍ−「二］、
ｅｄｓ、 Ｅｉｃｈｈｏｒｎ、 Ｇ、Ｌ、 ａｎｄ Ｍ
ａｒｚｉｌｌｉ、 Ｌ、Ｇ。
ｒ１ｄｏｖｉｃｈ、 工、ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｇｉ
ｎ Ｉｎｏｒ ａｎｉｃ Ｂｉｏｃｈｅｍ−「二］、
ｅｄｓ、 Ｅｉｃｈｈｏｒｎ、 Ｇ、Ｌ、 ａｎｄ Ｍ
ａｒｚｉｌｌｉ、 Ｌ、Ｇ。
（Ｅｌｓｅｖｉｓｒ／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏ１ｌａｎｄ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、 ｐｐ、 ６７−９０（１９７９
）。
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、 ｐｐ、 ６７−９０（１９７９
）。
ＩＬ Ｓｔｅｉｎｍａｎ、 Ｈ，Ｍ、 ｉｎ Ｓｕ
ｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ、 ｅｄ、○ｂ
ｅｒ−１ｅｙ、 Ｌ、Ｗ、 （ｃＲＣＰｒｅｓｓ、
Ｆ２Ｏｒｉｄａ）、 ｐｐ、 １１−６８ （１９８
２）。
ｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ、 ｅｄ、○ｂ
ｅｒ−１ｅｙ、 Ｌ、Ｗ、 （ｃＲＣＰｒｅｓｓ、
Ｆ２Ｏｒｉｄａ）、 ｐｐ、 １１−６８ （１９８
２）。
５、 ）ＩａｒｔＺ、Ｊ、Ｗ、ａｎｄ Ｄｅｕｔｓ
ｃｈ、Ｈ，Ｆ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。
ｃｈ、Ｈ，Ｆ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。
２４７：７０４３−５０ （１９７２）。
６、 Ｊａｂｕｓｃｈ、 Ｊ、Ｒ，、Ｆａｒｂ、
Ｄ、Ｌ、、 Ｋｅｒｓｃｈｅｎｓｔｅｉｎｅｒ、 Ｄ、
Ａ。
Ｄ、Ｌ、、 Ｋｅｒｓｃｈｅｎｓｔｅｉｎｅｒ、 Ｄ、
Ａ。
ａｎｄ Ｄｅｕｔｓｃｈ、 Ｈ，Ｆ、、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒ １９：２３１０−１６ （１９８０）。
ｍｉｓｔｒ １９：２３１０−１６ （１９８０）。
７、 Ｂａｒｒａ、 Ｄ、、 Ｍａｒｔｉｎｉ、
Ｆ、、 Ｂａｎｎ１ｓｔｅｒ、 Ｊ、Ｖ、、 ５ｃｈｉ
ｎｉｎａ。
Ｆ、、 Ｂａｎｎ１ｓｔｅｒ、 Ｊ、Ｖ、、 ５ｃｈｉ
ｎｉｎａ。
Ｍ、Ｗ、、 Ｒｏｔｉｌｉｏ、 Ｗ、Ｈ，、Ｂａｎｒｉ
ｓｔｉ制ｒ、 Ｗ、Ｈ，ａｎｄ Ｂｏｓｓａ。
ｓｔｉ制ｒ、 Ｗ、Ｈ，ａｎｄ Ｂｏｓｓａ。
Ｐ、、 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２０：５３−５
６ （１９８０）。
６ （１９８０）。
８、 Ｌｉｅｍａｎ−Ｈｕｒｗｉｔｚ、 Ｊ、、
Ｄａｆ’ｎ１ｊＮ、、 Ｌａｖｉｅ、 Ｖ、 ａｎｄＧ
ｒｏｎｅｒ、 Ｙ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ｄａｆ’ｎ１ｊＮ、、 Ｌａｖｉｅ、 Ｖ、 ａｎｄＧ
ｒｏｎｅｒ、 Ｙ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７９：２８０８−
１１ （１９８２）。
１１ （１９８２）。
９、 Ｓｈｅｒｍａｎ、Ｌ、、Ｄａｆｎｉ、Ｎ、、
Ｌｉｅｍａｎ−Ｈｕｒｗｉｔｚ、Ｊ、ａｎｄＧｒｏｎｅ
ｒ、Ｙ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ ８０：５１１６５−６９ （１９８３）。
Ｌｉｅｍａｎ−Ｈｕｒｗｉｔｚ、Ｊ、ａｎｄＧｒｏｎｅ
ｒ、Ｙ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ ８０：５１１６５−６９ （１９８３）。
１０、 ０ｂｅｒｌｅｙ、 Ｌ、Ｍ、 ａｎｄ Ｂｕｅ
ｔｔｎｅｒ、 Ｇ、Ｒ，、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ−５ｅａ
ｒｃｈ ３９：１１Ｌｌｌ−４９（１９７９）。
ｔｔｎｅｒ、 Ｇ、Ｒ，、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ−５ｅａ
ｒｃｈ ３９：１１Ｌｌｌ−４９（１９７９）。
１１、 Ｈｕｂｅｒ、 Ｗ、 ａｎｄ Ｍｅｎａｎｄ
ｅｒ−Ｈｕｂｅｒ、 Ｋ、Ｂ、、 Ｃ１１ｎｉｃｓ
ｉｎＲｈｅｕｍ、Ｄｉｓ、６：４６５−９８ （１９
８０）。
ｅｒ−Ｈｕｂｅｒ、 Ｋ、Ｂ、、 Ｃ１１ｎｉｃｓ
ｉｎＲｈｅｕｍ、Ｄｉｓ、６：４６５−９８ （１９
８０）。
１２２） ＭｃＣｏｒｄ、Ｊ、Ｍ、ａｎｄ Ｒｏｙ、
Ｒ，Ｓ、、Ｃａ、ｎ、Ｊ、Ｐｈ ａｉｏｌ。
Ｒ，Ｓ、、Ｃａ、ｎ、Ｊ、Ｐｈ ａｉｏｌ。
Ｐｈａｒｍａ、 ６０：１３４６−５２ （１９８
２）。
２）。
１３、 Ａｌｖａｒｅｚ、Ｌ、Ｇ、ａｎｄ ５ｔｏｒ
ｅｙ、Ｂ、Ｔ、、Ｂｉｏｌ、Ｒｅ ｒｏｄ。
ｅｙ、Ｂ、Ｔ、、Ｂｉｏｌ、Ｒｅ ｒｏｄ。
２８：１１２９−３６ （１９８３）−１１Ｊ、 Ｔ
ａ１ｍａｓｏｆ’ｆ、 Ｊ、Ｍ、、 Ｏｎｏ、 Ｔ、
ａｎｄ Ｃｕｔｌｅｒ、 Ｒ，Ｇ、、 Ｐｒｏｃ。
ａ１ｍａｓｏｆ’ｆ、 Ｊ、Ｍ、、 Ｏｎｏ、 Ｔ、
ａｎｄ Ｃｕｔｌｅｒ、 Ｒ，Ｇ、、 Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：
２７７７−８１ （１９８０）。
２７７７−８１ （１９８０）。
１５、 Ｌｏｗｒｙ、Ｏ，Ｈ，、Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇ
ｈ、Ｎ、Ｊ、、Ｆａｒｒ、Ａ、Ｌ、ａｎｄＲａｎｄａｌ
ｌ、 Ｒ，Ｊ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
１９３：２６５−７５ （１９５１）−１６、Ｗｅｓ
ｅｒ、 Ｕ、 ａｎｄ Ｈａｒｔｍａｎｎ、 Ｈ，Ｊ、
、 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １７：７８−８ｏ
（１９７１）。
ｈ、Ｎ、Ｊ、、Ｆａｒｒ、Ａ、Ｌ、ａｎｄＲａｎｄａｌ
ｌ、 Ｒ，Ｊ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
１９３：２６５−７５ （１９５１）−１６、Ｗｅｓ
ｅｒ、 Ｕ、 ａｎｄ Ｈａｒｔｍａｎｎ、 Ｈ，Ｊ、
、 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １７：７８−８ｏ
（１９７１）。
１７、 Ｊｅｗｅｔｔ、Ｓ、ＬＯ，、Ｌａｔｒｅｎｔ
ａ、Ｇ、Ｓ、ａｎｄ Ｂｅａｋ、Ｃ，Ｍ、。
ａ、Ｇ、Ｓ、ａｎｄ Ｂｅａｋ、Ｃ，Ｍ、。
Ａｒｃ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ ｈ ｓ、
２１５：１１６−１２８ （１９８２）。
２１５：１１６−１２８ （１９８２）。
１８、 Ｈａｒｒｉｓ、 Ｊ、工、 ａｎｄ Ｓｔｅ
ｉｎｍａｎ、 Ｈ，Ｍ、、 Ｓｕ ｅｒｏｘｉｄｅ ａ
ｎｄＳｕ ｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ、Ｍｉ
ｃｈｅｌｓｏｎ、Ａ、Ｍ、、Ａｃｃｏｒｄ、Ｊ。
ｉｎｍａｎ、 Ｈ，Ｍ、、 Ｓｕ ｅｒｏｘｉｄｅ ａ
ｎｄＳｕ ｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ、Ｍｉ
ｃｈｅｌｓｏｎ、Ａ、Ｍ、、Ａｃｃｏｒｄ、Ｊ。
Ｍ、ａｎｄ Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ、 工、ｅｄｓ、、
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ。
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ。
ｐｐ、 ２２５−２３０ （１９７７）。
１９、 Ｂａｒｒａ、Ｄ、、５ｃｈｉｎｉｎａ、Ｍ、
Ｅ、、Ｓｉｍｍａｃｏ、Ｍ、、Ｂａｎｎ１ｓ−ｔｅｒ、
Ｊ３．、Ｂａｎｎ１ｓｔｅｒ、Ｗ、Ｈ，、Ｒｏｔｉｌｉ
ｏ、Ｇ、ａｎｄ Ｂｏｓｓａ。
Ｅ、、Ｓｉｍｍａｃｏ、Ｍ、、Ｂａｎｎ１ｓ−ｔｅｒ、
Ｊ３．、Ｂａｎｎ１ｓｔｅｒ、Ｗ、Ｈ，、Ｒｏｔｉｌｉ
ｏ、Ｇ、ａｎｄ Ｂｏｓｓａ。
Ｆ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５９：１２
５９５−６０１ （Ｏｃｔｏｂｅｒ ２５． １９８４
）。
５９５−６０１ （Ｏｃｔｏｂｅｒ ２５． １９８４
）。
２０、 Ｂａｒｅｔ、 Ａ、、 、Ｊａｄｏｔ、 Ｇ
、 ａｎｄ Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ、 Ａ、Ｍ、。
、 ａｎｄ Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ、 Ａ、Ｍ、。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏ２Ｏ
３３：２７５５−６０ （Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ。
３３：２７５５−６０ （Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ。
１、 １９８４）。
２１、 ＭｃＣｏｒｄ、 Ｊ、Ｍ、 ａｎｄ ５ａｌ
ｉｎ、 Ｍ、Ｌ、、 Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｍｅｔａｂ
ｏ−１１ｓｍ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ
Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｊｏｆ Ｐｈａ ｏｃ ｔｅｓ
Ｒｏｓｓ、Ａ、、Ｐａｔｒｉａｒｃａ、Ｐ、Ｌ、、Ｒｏ
ｍｅｏ、Ｄ、（ｅｄｓ）ｐｐ。
ｉｎ、 Ｍ、Ｌ、、 Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｍｅｔａｂ
ｏ−１１ｓｍ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ
Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｊｏｆ Ｐｈａ ｏｃ ｔｅｓ
Ｒｏｓｓ、Ａ、、Ｐａｔｒｉａｒｃａ、Ｐ、Ｌ、、Ｒｏ
ｍｅｏ、Ｄ、（ｅｄｓ）ｐｐ。
２５７−２６４ （１９７７）。
２２２） Ｔｏｕａｔｉ、 Ｄ、、 Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏ２Ｏ １５５：１０７８
−８７（１９８３）。
ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏ２Ｏ １５５：１０７８
−８７（１９８３）。
２３、 ＭｃＣｏｒｄ、 Ｊ、Ｍ、、 Ｂｏｙｌｅ、
Ｊ、Ａ、、 Ｄａｙ、 Ｊｒ、、 Ｅ、Ｄ、。
Ｊ、Ａ、、 Ｄａｙ、 Ｊｒ、、 Ｅ、Ｄ、。
Ｒｌｚｚｏ２Ｏ、Ｌ、Ｊ、ａｎｄ ５ａｌｉｎ、Ｍ、Ｌ
、、Ｓｕ ｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｄＳｕ ｅｒｏｘｉｄ
ｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ、Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ、Ａ、
Ｍ、、ＭｃＣｏｒｄ。
、、Ｓｕ ｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｄＳｕ ｅｒｏｘｉｄ
ｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ、Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ、Ａ、
Ｍ、、ＭｃＣｏｒｄ。
Ｊ、Ｍ、 ａｎｄ Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ、 ■、
（ｅｄｓ） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。
（ｅｄｓ） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。
Ｌｏｒ＋ｄｏｎ ｐｐ、 １２９−１３８ （１９７
７）。
７）。
２４、 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ、 ０１３１８４３ ＡＩ。
ｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ、 ０１３１８４３ ＡＩ。
ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｊａｎｕａｒｙ ２３． １９８
５． ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔ。
５． ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔ。
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆａｔｅｒ；ｔ ＡｐｐＨｉｃａｔ
ｉｏｎ Ｎｏ、 ８４１０７７１７．５． ｆ’１ｌｅ
ｄＪｕｌｙ ３． １９８１１． ｗｈｉｃｈ ｃｌａ
ｉｍｓ ｐｒｉｏｒｉｔｙ ｏｆ Ｕ、Ｓ、 ５ｅｒｉ
ａｌＮｏ、 ５１１４．１８８． ｆｉｌｅｄ Ｊｕｌ
ｙ １５． １９Ｂ３゜２５、 Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ
、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅｓ、 ５．（１９８５）−２６、Ｅｕｒｏｐｅａｎ
Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ０１３８１１
１． ｐｕｂｌｉｓｈｅｄＡｐｒｉｌ ２４． １９８
５． ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｔｏ Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎ ＰａｔｅｎｔＡｐｐＨｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ
、 乙Ｌ１１１１４Ｌ６．８． ｆ’１ｌｅｄ
Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２５゜１９８４、 ｗｈｉｃｈ
ｃｌａｉｍｓ ｐｒｉｏｒｉｔｙ ｏｆＵ、Ｓ、 ５
ｅｒｉａｌ Ｎｏ。
ｉｏｎ Ｎｏ、 ８４１０７７１７．５． ｆ’１ｌｅ
ｄＪｕｌｙ ３． １９８１１． ｗｈｉｃｈ ｃｌａ
ｉｍｓ ｐｒｉｏｒｉｔｙ ｏｆ Ｕ、Ｓ、 ５ｅｒｉ
ａｌＮｏ、 ５１１４．１８８． ｆｉｌｅｄ Ｊｕｌ
ｙ １５． １９Ｂ３゜２５、 Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ
、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅｓ、 ５．（１９８５）−２６、Ｅｕｒｏｐｅａｎ
Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ０１３８１１
１． ｐｕｂｌｉｓｈｅｄＡｐｒｉｌ ２４． １９８
５． ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｔｏ Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎ ＰａｔｅｎｔＡｐｐＨｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ
、 乙Ｌ１１１１４Ｌ６．８． ｆ’１ｌｅｄ
Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２５゜１９８４、 ｗｈｉｃｈ
ｃｌａｉｍｓ ｐｒｉｏｒｉｔｙ ｏｆＵ、Ｓ、 ５
ｅｒｉａｌ Ｎｏ。
５３８．６０７． ｆ’１ｌｅｄ ０ｃｔｏｂｅｒ３．
１９Ｂ３． ａｎｄ Ｕ、Ｓ、 ５ｅｒｉａｌＮｏ、
６０９．１１１２． ｆｉｌｅｄ Ｍａｙ
１１． １９８１１゜２７、 ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａ
ｌ、 Ｖｏｌ、 ４． Ｎｏ、 １． ｐｐ、 ７７−
８４ （Ｊａｎｕａｒｙ１９８５）。
１９Ｂ３． ａｎｄ Ｕ、Ｓ、 ５ｅｒｉａｌＮｏ、
６０９．１１１２． ｆｉｌｅｄ Ｍａｙ
１１． １９８１１゜２７、 ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａ
ｌ、 Ｖｏｌ、 ４． Ｎｏ、 １． ｐｐ、 ７７−
８４ （Ｊａｎｕａｒｙ１９８５）。
２８、 Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｆｏｕｒｔｈ 工ｎｔｅｒｎａ七１ｏｎａｌ Ｃｏ
ｎｆｅｒｅｎｃｅ（以下余白）
Ｆｏｕｒｔｈ 工ｎｔｅｒｎａ七１ｏｎａｌ Ｃｏ
ｎｆｅｒｅｎｃｅ（以下余白）
第１図はヒトＶｎＳＯＤ ｃＤＮＡの配列を示す。第２
図はヒトＭｎ５ＯＤ発現プラスミドｐＭＳＥ−４の構築
を示す。 第３図は大腸菌中で産生されるＳＯＤの活性に及ぼすＭ
ｎ”の濃度の影響を示す。第４図はヒトｈ！ｎ５ＯＤ発
現プラスミドｐＭＳΔＲＢ４の構築を示す。 代理人弁理士 中 村 至 Ｆ工ＧＵＲＥ Ｌ （その２ ★ 會
☆★ ☆嚢
図はヒトＭｎ５ＯＤ発現プラスミドｐＭＳＥ−４の構築
を示す。 第３図は大腸菌中で産生されるＳＯＤの活性に及ぼすＭ
ｎ”の濃度の影響を示す。第４図はヒトｈ！ｎ５ＯＤ発
現プラスミドｐＭＳΔＲＢ４の構築を示す。 代理人弁理士 中 村 至 Ｆ工ＧＵＲＥ Ｌ （その２ ★ 會
☆★ ☆嚢
Claims (77)
- （１）ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポリ
ペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体を
コードする精製ＤＮＡ。 - （２）ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポリ
ペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体を
コードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ分子。 - （３）ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼプレ
−ポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変
異体をコードする二重鎖ＤＮＡ分子であって、その鎖の
１つが第１図のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号４
３から下流にヌクレオチド番号７０８までを実質的に含
む前記二重鎖ＤＮＡ分子。 - （４）ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポリ
ペプチドもしくはその類似体又はそれらの突然変異体を
コードする二重鎖ＤＮＡ分子であつて、その鎖の１つが
第１図のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１１５か
ら下流にヌクレオチド番号７０８までを実質的に含む前
記二重鎖ＤＮＡ分子。 - （５）特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子を含む
クローニングベヒクル。 - （６）特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子を含む
プラスミド。 - （７）第２図の制限地図をもちＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ．
５３２５０で寄託された、大腸菌Ａ４２５５株中のｐＭ
ＳＥ−４と命名された特許請求の範囲第６項に記載のプ
ラスミド。 - （８）第４図の制限地図をもちｐＭＳΔＲＢ４と命名さ
れた特許請求の範囲第６項に記載のプラスミド。 - （９）特許請求の範囲第１項のＤＮＡが導入された細胞
。 - （１０）特許請求の範囲第９項に記載の原核細胞。
- （１１）特許請求の範囲第９項に記載の細菌細胞。
- （１２）ＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ．５３２５０で寄託され
たプラスミドｐＭＳＥ−４を含む特許請求の範囲第１１
項に記載の細胞。 - （１３）プラスミドｐＭＳΔＲＢ４を含む特許請求の範
囲第１１項に記載の細胞。 - （１４）特許請求の範囲第９項に記載の真核細胞。
- （１５）ＤＮＡがヒトマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼポリペプチドもしくはその類似体又はそれらの突
然変異体の発現を指令し、細胞がヒトマンガンスーパー
オキシドジスムターゼポリペプチドもしくはその類似体
又はそれらの突然変異体を発現し、該細胞からヒトマン
ガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドもしく
はその類似体又はそれらの突然変異体を回収するように
特許請求の範囲第９項の細胞を処理することを含むヒト
マンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドも
しくはその類似体又はそれらの突然変異体の産生方法。 - （１６）第１図の配列をもつ２２２個のアミノ酸を含み
、該配列のＮ−末端が第１図のヌクレオチド４３−４５
によってコードされるメチオニンであり、該配列のＣＯ
ＯＨ末端が第１図のヌクレオチド７０６−７０８によっ
てコードされるリジンであることを特徴とする精製ポリ
ペプチド。 - （１７）第１図の配列をもつ２２２個のアミノ酸から主
として構成され、該配列のＮ−末端が第１図のヌクレオ
チド４３−４５によってコードされるメチオニンであり
、該配列のＣＯＯＨ末端が第１図のヌクレオチド７０６
−７０８によってコードされるリジンであることを特徴
とする精製ポリペプチド。 - （１８）第１図のアミノ酸配列の部分をもつ１９８個の
アミノ酸を含み、該配列のＮ−末端が第１図のヌクレオ
チド１１５−１１７でコードされるリジンであり、配列
のＣＯＯＨ末端が第１図のヌクレオチド７０６−７０８
でコードされるリジンであることを特徴とする細菌産生
ポリペプチド。 - （１９）ポリペプチドが第１図のアミノ酸配列の部分を
もつ１９８個のアミノ酸を含み、該配列のＮ−末端が第
１図のヌクレオチド１１５−１１７でコードされるリジ
ンであり、該配列のＣＯＯＨ末端が第１図のヌクレオチ
ド７０６−７０８でコードされるリジンであり、ヒト由
来物質を含まないことを特徴とする細菌産生ポリペプチ
ド。 - （２０）第１図のアミノ酸配列の部分をもつ１９８個の
アミノ酸から主として構成され、ポリペプチドのＮ−末
端が第１図のヌクレオチド１１５−１１７でコードされ
、ポリペプチドのＣＯＯＨ末端が第１図のヌクレオチド
７０６−７０８でコードされるリジンであることを特徴
とする細菌産生ポリペプチド。 - （２１）第１図のアミノ酸配列の部分をもつ１９８個の
アミノ酸から主として構成され、ポリペプチドのＮ−末
端が第１図のヌクレオチド１１５−１１７でコードされ
るリジンであり、ポリペプチドのＣＯＯＨ末端が第１図
のヌクレオチド７０６−７０８でコードされるリジンで
あり、ヒト由来物質を含まないことを特徴とする細菌産
生ポリペプチド。 - （２２）特許請求の範囲第１９項に記載のポリペプチド
を２つ以上含むことを特徴とするヒトマンガンスーパー
オキシドジスムターゼ。 - （２３）ポリペプチドをコードし且つ該ポリペプチドの
発現を指令し得るＤＮＡを含む細胞を処理して細胞にポ
リペプチドを発現させ、このように発現されたポリペプ
チドを細胞から回収することを含むことを特徴とする特
許請求の範囲第１８項に記載のポリペプチドの産生方法
。 - （２４）第１図のヌクレオチド番号１１５から下流にヌ
クレオチド番号７０８までのＤＮＡ配列の細菌内発現に
よって得られたヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼ又はその類似体。 - （２５）（ａ）ヒトマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼＤＮＡによってコードされ、 （ｂ）細菌中で産生可能であり、 （ｃ）反応 ２Ｏ＿２＾■−＋２Ｈ＾＋→Ｈ＿２Ｏ＿２＋Ｏ＿２を触
媒することができるポリペプチド。 - （２６）有効量の特許請求の範囲第２２項に記載のヒト
マンガンスーパーオキシドジスムターゼと適当な担体と
を含む獣医薬組成物。 - （２７）有効量の特許請求の範囲第２２項に記載のヒト
マンガンスーパーオキシドジスムターゼと適当な担体と
を含む医薬組成物。 - （２８）反応 ２Ｏ＿２＾■＋２Ｈ＾＋→Ｈ＿２Ｏ＿２＋Ｏ＿２を触媒
するために、適正条件下で反応体と特許請求の範囲第２
４項に記載のヒトマンガンスーパーオキシドジスムター
ゼ又はその類似体とを接触させる方法。 - （２９）スーパーオキシドラジカルによって生じる細胞
の傷害を低減するために特許請求の範囲第２８項に記載
のスーパーオキシドラジカルの還元を触媒することを特
徴とする方法。 - （３０）虚血後の再潅流のときに生じる患者の傷害を低
減するために有効量の特許請求の範囲第２４項に記載の
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼもしくはそ
の類似体を該患者に投与することを特徴とする方法。 - （３１）摘出単離器官の生存期間を延長させるために、
有効量の特許請求の範囲第２４項に記載のヒトマンガン
スーパーオキシドジスムターゼを潅流媒体に添加するこ
とを特徴とする方法。 - （３２）有効量の特許請求の範囲第２４項に記載のヒト
マンガンスーパーオキシドジスムターゼ又はその類似体
を患者に投与することを特徴とする炎症疾患の患者の治
療方法。 - （３３）スーパーオキシドジスムターゼもしくはその類
似体をコードするＤＮＡ配列を含有し該ＤＮＡ配列を発
現させ得る細菌細胞中で酵素活性ヒトマンガンスーパー
オキシドジスムターゼ又はその類似体を産生するために
、細菌細胞を適当な条件下及び適当な産生培地中に維持
し、該産生培地中のＭｎ＾２＾＋の濃度が約２ｐｐｍよ
り大きくなるように該産生培地に所定量のＭｎ＾２＾＋
を補給することを特徴とする方法。 - （３４）細菌細胞が大腸菌細胞であることを特徴とする
特許請求の範囲第３３項に記載の方法。 - （３５）細菌細胞がプラスミドを含んでおり、該プラス
ミドがマンガンスーパーオキシドジスムターゼ又はその
類似体をコードするＤＮＡ配列を取り込んでいることを
特徴とする特許請求の範囲第３３項に記載の方法。 - （３６）適当な産生培地がカゼイン水解物培地であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第３３項に記載の方法。 - （３７）適当な産生培地がＬＢ培地であることを特徴と
する特許請求の範囲第３３項に記載の方法。 - （３８）Ｍｎ＾２＾＋濃度が約５０〜約１５００ｐｐｍ
であることを特徴とする特許請求の範囲第３３項に記載
の方法。 - （３９）Ｍｎ＾２＾＋濃度が約１５０ｐｐｍであること
を特徴とする特許請求の範囲第３８項に記載の方法。 - （４０）Ｍｎ＾２＾＋濃度が約７５０ｐｐｍであること
を特徴とする特許請求の範囲第３８項に記載の方法。 - （４１）細菌細胞がＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ．５３２５０
で寄託されたプラスミドｐＭＳＥ−４を含む大腸菌Ａ４
２５５株であることを特徴とする特許請求の範囲第３４
項に記載の方法。 - （４２）プラスミドがＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ．５３２５
０で寄託された第２図の制限地図をもつｐＭＳＥ−４で
あることを特徴とする特許請求の範囲第３５項に記載の
方法。 - （４３）細菌細胞が第４図の制限地図をもつプラスミド
ｐＭＳΔＲＢ４を含む大腸菌Ａ４２５５株であることを
特徴とする特許請求の範囲第３４項に記載の方法。 - （４４）プラスミドが、第４図の制限地図をもつｐＭＳ
ΔＲＢ４であることを特徴とする特許請求の範囲第３５
項に記載の方法。 - （４５）細菌産生ヒトマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異体。 - （４６）ヒトスーパーオキシドジスムターゼポリペプチ
ドと実質的に同じアミノ酸配列をもち単細胞微生物中で
調製されたポリペプチド。 - （４７）ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼを
含む細菌細胞からヒトマンガンスーパーオキシドジスム
ターゼもしくはその類似体又はそれらの突然変異体を回
収するために、（ａ）ヒトマンガンスーパーオキシドジ
スムターゼを含む細胞中に存在するタンパク質を含むタ
ンパク質画分を回収すべく細菌細胞を処理し、（ｂ）ヒ
トマンガンスーパーオキシドジスムターゼを回収すべく
該タンパク質画分を処理することを含む方法。 - （４８）（ａ）可溶タンパク質を不溶タンパク質及び細
胞壁破片から分離すべく細胞を処理し、 （ｂ）可溶タンパク質を回収し、 （ｃ）このように回収された可溶タンパク質を処理して
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ又はその類
似体を含む可溶タンパク質画分を分離し、 （ｄ）ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ又は
その類似体を含む可溶タンパク質画分を回収し、 （ｅ）ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ又は
その類似体を分離回収すべくヒトマンガンスーパーオキ
シドジスムターゼを含む可溶タンパク質の画分を処理す
ることを含む特許請求の範囲第４７項に記載の方法。 - （４９）（ａ）細菌細胞を産生培地から単離し、（ｂ）
単離細菌細胞をｐＨ約７．０〜約８．０の適当な溶液に
懸濁させ、 （ｃ）懸濁した細菌細胞を破壊し、 （ｄ）破壊した細菌細胞を遠心し、 （ｅ）得られた上清を温度約５５℃〜約６５℃で約３０
分間〜約１２０分間加熱し、 （ｆ）加熱した上清を約１０℃未満に冷却し、（ｇ）冷
却した上清から沈澱物を完全に除去し、（ｈ）冷却した
上清を適当なバッファに透析し、（ｉ）適当なバッファ
溶液を用いアニオン交換クロマトグラフィーカラムで保
持物を溶出し、 （ｊ）ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼを含
む溶出物の画分を収集してプールし、 （ｋ）プールした画分をｐＨ５．５の約４０ｍＭの酢酸
カリウムに透析し、 （ｌ）透析したプール画分をｐＨ５．５の約４０〜約２
００ｍＭ酢酸カリウムの直線勾配をもつカチオン交換ク
ロマトグラフィーカラムで溶出し、 （ｍ）過酸化物ジスムターゼを含む溶出物のピーク画分
を収集してプールすることを含む特許請求の範囲第４７
項に記載の方法。 - （５０）ステップ（ｅ）で得られた上清を、約５８℃〜
約６２℃で約４５分間〜約７５分間加熱することを特徴
とする特許請求の範囲第４９項に記載の方法。 - （５１）上清を約６０℃で約６０分間加熱することを特
徴とする特許請求の範囲第４９項に記載の方法。 - （５２）ステップ（ｆ）で加熱上清を約４℃に冷却する
ことを特徴とする特許請求の範囲第４９項に記載の方法
。 - （５３）ステップ（ｇ）で沈澱物を遠心によって除去す
ることを特徴とする特許請求の範囲第４９項に記載の方
法。 - （５４）ステップ（ｈ）で冷却上清を３０Ｋより小さい
ろ過膜を使用した限外ろ過によって透析することを特徴
とする特許請求の範囲第４９項に記載の方法。 - （５５）ステップ（ｈ）で適当なバッファがｐＨ約７．
８の２ｍＭの燐酸カリウムバッファであることを特徴と
する特許請求の範囲第４９項に記載の方法。 - （５６）ステップ（ｉ）で、バッファ溶液が少なくとも
２０ｍＭの燐酸カリウムでありｐＨ約７．８であること
を特徴とする特許請求の範囲第４９項に記載の方法。 - （５７）冷却上清の透析後に、透析上清を適当な容量に
濃縮することを特徴とする特許請求の範囲第４９項に記
載の方法。 - （５８）適当な容量が、上清の初期容量の約０．０３で
あることを特徴とする特許請求の範囲第５７項に記載の
方法。 - （５９）更に、プールしたピーク画分を適当な溶液に透
析することを特徴とする特許請求の範囲第４９項に記載
の方法。 - （６０）適当な溶液がＨ＿２Ｏであることを特徴とする
特許請求の範囲第５９項に記載の方法。 - （６１）適当な溶液がｐＨ約７．８の約１０ｍＭの燐酸
カリウムバッファのバッファ溶液であることを特徴とす
る特許請求の範囲第５９項に記載の方法。 - （６２）スーパーオキシドジスムターゼがヒトスーパー
オキシドジスムターゼであることを特徴とする特許請求
の範囲第４９項に記載の方法。 - （６３）スーパーオキシドジスムターゼがヒトマンガン
スーパーオキシドジスムターゼであることを特徴とする
特許請求の範囲第４９項に記載の方法。 - （６４）特許請求の範囲第４７項に記載の方法で精製さ
れたヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼもしく
はその類似体。 - （６５）ヒト由来の他の物質を実質的に含まないヒトマ
ンガンスーパーオキシドジスムターゼ。 - （６６）少なくとも２つのヒトマンガンスーパーオキシ
ドジスムターゼポリペプチドを含むヒトマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼ活性をもつ天然産生でない分子
。 - （６７）１９８個のアミノ酸を含むポリペプチドであり
、そのアミノ酸配列の一部分が第１図の配列をもち、該
配列のＮ−末端が第１図のヌクレオチド１１５−１１７
によってコードされるリジンであり、該配列のＣＯＯＨ
末端が第１図のヌクレオチド７０６−７０８によってコ
ードされるリジンであることを特徴とするヒトマンガン
スーパーオキシドジスムターゼポリペプチド。 - （６８）ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポ
リペプチドを任意の化学的形態のマンガンとの複合体と
して含み、この複合体が天然産生のヒトマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼの酵素活性をもつことを特徴と
するポリペプチドマンガン複合体。 - （６９）少なくとも２つのヒトマンガンスーパーオキシ
ドジスムターゼポリペプチドを任意の化学的形態のマン
ガンとの複合体として含み、天然産生ヒトマンガンスー
パーオキシドジスムターゼの酵素活性をもつことを特徴
とするヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ。 - （７０）ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポ
リペプチドを含みその一端又は両端に１つ以上の付加ア
ミノ酸が結合していることを特徴とするヒトマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼポリペプチド類似体。 - （７１）ポリペプチドマンガン複合体を含み、そのポリ
ペプチド部分が、その一端又は両端に結合した１つ以上
の付加アミノ酸を含むポリペプチドマンガン複合体類似
体。 - （７２）少なくとも２つのポリペプチドを任意の化学的
形態のマンガンとの複合体として含み、該ポリペプチド
の少なくとも一方がヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼ類似体であり、天然産生ヒトマンガンスーパー
オキシドジスムターゼの酵素活性をもつことを特徴とす
るヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体。 - （７３）ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポ
リペプチドの配列と実質的に等しいアミノ酸配列をもつ
が１つ以上のアミノ酸が異なるポリペプチドを含むヒト
マンガンスーパーオキシドジスムターゼポリペプチド突
然変異体。 - （７４）ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼポ
リペプチド突然変異体を任意の化学的形態のマンガンと
の複合体として含みマンガンスーパーオキシドジスムタ
ーゼの酵素活性をもつポリペプチドマンガン複合体突然
変異体。 - （７５）少なくとも２つのポリペプチドを任意の化学的
形態のマンガンとの複合体として含み、該ポリペプチド
の少なくとも１つがヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼポリペプチドであり、天然産生ヒトマンガンス
ーパーオキシドジスムターゼの酵素活性をもつことを特
徴とするヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ突
然変異体。 - （７６）少なくとも２つのポリペプチドを含み、該ポリ
ペプチドの少なくとも１つが第１図のアミノ酸配列を有
しており、該配列のＮ−末端が第１図のヌクレオチド１
１５−１１７でコードされるリジンであり、該配列のＣ
ＯＯＨ末端が第１図のヌクレオチド７０６−７０８でコ
ードされるリジンであり、更にＮ−末端に１つの付加メ
チオニン残基を含むヒトマンガンスーパーオキシドジス
ムターゼ類似体。 - （７７）約３５００単位／ｍｇより高い比活性をもつこ
と−を特徴とする特許請求の範囲第７６項に記載の精製
ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体。
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