JPS6393726A - 虚血性心疾患治療薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は虚血性心疾患治療薬に関する。さらに詳しくは
、単細胞微生物特にヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドデ
ィスムターゼ構造遺伝子を有する組換えＤＮＡで形質転
換された単細胞微生物中で産生されたヒトスーパーオキ
シドディスムターゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有
するポリペプチドを活性成分とする虚血性心疾患治療薬
に関する。

〈従来の抹術〉 スーパーオキシドディスムターゼ（以下ＳＯＤと略す）
は、次式に示す不均化反応により、スーパーオキシド（
・０２−）を消失させる酵素である。

・０２″″十・０２−＋２８＋→０□十Ｈ２０□スーパ
ーオキシドは、生体における酸素毒性の中で最も毒性の
高い分子種で、炎症、未熟児酸素１剥膜症、放射線障害
、ガンなどの疾病を引き起こすと言われている。

ところで、虚血性心疾患の代表的なものとして心筋梗塞
があるが、心筋梗塞においては、冠動脈の狭窄あるいは
田水により冠動脈の支配下にある心）２は血液の供給を
受けることができなくなって、酸素ｆ足の状態となる。

その際電子伝達系から自由電子が放出され活性酸素が作
られることになる。

また、心筋梗塞の治療においては、外科的療法や薬物療
法等によって血流が再開されるが、その際に心臓は急激
に酸素負荷されて、細胞内の酸素分圧（Ｐ　０２）を上
昇させて活性酸素の産生を高める。このことが血流再開
の障害（Ｒｅｐｅｒ［ｕｓｉｏｎ　　ｉｎｊｕｒｇ）の
−要因となっているといわれている。

現在、心筋梗塞の治療法としては、大動脈−冠動脈バイ
パス法、大動脈内バルーンパンピング法の如き外科的療
法あるいは血管拡張薬、抗不整脈剤あるいは抗凝血剤等
を使用する薬物療法が知られているが、いずれも未だ十
分なものではない。

一方、特開昭５７−１４１，２８８号公報には、ヒト細
胞スーパーオキシドディスムターゼの特異抗体結合担体
を用いて、ヒト細胞からスーパーオキシドディスムター
ゼを該担体に結合させて単離する方法が開示されている
。

特開昭５７−１５５，９９１号公報には、ヒト・胎盤の
水抽出液から４０〜５０％飽和硫安沈殿画分を除去した
後の７０〜８０％飽和硫安上清から、硫安分画、陰イオ
ンクロマトグラフィー、デルろ過等によってスーパーオ
キシドディスムターゼを取得する方法が開示されている
。

また、特開昭５９−９１，８８１号公報には、不純な銅
亜鉛スーパーオキシドディスムターゼを含有する溶液を
、非極性ハイポーラスポリマー系樹脂と接触させ、次い
で該樹脂を洗浄し、さらに該樹脂に吸着した銅、亜鉛ス
ーパーオキシドディスムターゼを溶出して精製する方法
が開示されている。

〈発明が解決しようとする問題点〉 本発明の目的は、ヒト・スーパーオキシドディスムター
ゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含有する虚血性心疾患治療薬を提供することにある。

本発明の他の目的は、遺伝子組換え技術によって製造し
た上記構造を持つポリペプチドを含有する虚血性心疾患
治療薬を提供することにある。

本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明
らかとなろう。

く問題点を解決するための手段及び作用〉本発明によれ
ば、本発明の上記目的及び利点はヒトスーパーオキシド
ディスムターゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを活性成分とする虚血性心疾患治療薬によ
って達成される。

上記ポリペプチドは、例えばポジティブレギュレーショ
ンサイトを有する形質発現調節遺伝子の下流にヒト銅、
亜鉛型スーパーオキシドディスムターゼ構造遺伝子を有
する組換えＤＮＡで形質転換された微生物を培養し、培
養物中に蓄積されたヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドデ
ィスムターゼ（以下ｈ　）　Ｃｕｔ　Ｚ　ｎ　　Ｓ　Ｏ
Ｄという）を採取することによって製造される。

上記ヒトＣｕ、Ｚｎ　　ＳＯＤのｃＤＮＡ合成の鋳型と
して用いられるａ＋ＲＮＡは正常なヒ）ｍＷ（肝ｕ１胎
盤、腎蛎など）から分離される。ｍａからのＤＮＡの分
離は、フェノール−クロロホルム法、グアニノニｔムー
熱フェノール法、クアニノニウムー塩化セシウム法など
の公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ。

Ｔ、らｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃ１ｏｎｉＢ、　　１
８７　１９８　＋１９８２５ｃｏｌｄ　　Ｓ　ｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）が利用でき
る。次いでオリゴ（ｄＴ）セルロース、ポリ（Ｕ）セフ
ァロースなどを用いてポリ（Ａ）テイルをもつＩｆｌＲ
ＮＡを分離する。

このようにして得られたｍＲＮＡは、ヒ）Ｃｕ。

Ｚｎ−３ＯＤのｍＲＮＡを含んでいるｍＲＮＡ混合物で
あるが、これをそのままｃＤＮＡ合成に用いる。まず、
逆転写酵素を用いｍＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡ
を合成し、次いで逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ
を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した後、適当なベクター
に組込まれた形でｃＤＮＡを得る。これにはｄＧ−ｄＣ
またはｄＡ−ｄＴホモポリマー結合法（Ｎｅｌｓｏｎ、
Ｔ、Ｓ、、Ｍｅｔｈ。

ｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＋６８＊４１ｔ
１９７９＋Ａｅａｄｅｍｉｃ　　Ｐ　ｒｅｓｓ　　Ｉ　
ｎｃ、　）やＯｋａｙａｍａ　　Ｂ　ｅｒｇ法（Ｏｋａ
ｙａｍａ＋Ｈ０ａｎｄ　　Ｂｅｒｇ＋Ｐ、　ｔ　　Ｍｏ
１．Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｆ、、２，１６１．１９８２）
が利用できる。

この場合のようにｍＲＮＡ混合物中の目的ｍＲＮＡ含量
が低い場合は、効率の高イＯｋａｙａｍａ　　Ｂ　ｅｒ
ｇ法が好ましい、この方法に必要なりＮＡおよび宿主菌
はファルマシアＰ、Ｌ、バイオケミカルズ社カタログＮ
ｏ、２７−４７５０−０１として入手できる。

このようにして得られる組換えＤＮＡをたとえばエシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
Ｘ　１７７６株あるいはＤＨＩ株（ＬｏｔｗｙＢ、　ｔ
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ｓ６０
ｔｌ　６０ｔｌ　９６８；ＭｅｓｅｌｓｏｎｙＭ、　ａ
ｎｄ　　ＹｕａｎｙＲ，ｅＮａｔｕｒｅ、２１７ｗ１１
１０．１９６８；Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ、、Ｊ、　Ｍｏｌ
、Ｂｉｏｌ。

１６６．５５７．１９８３）に導入して形質転換させる
。形質転換法は公知の方法（重定勝哉、ｍ胞工学、Ｖｏ
ｌ、　　２．Ｎｏ、　３，６１６．１９８３）またはそ
れに準する方法で行うことができる。アンピシリン耐性
などの薬剤耐性によりまず形質転換体を選別したのち、
ヒトＣｕ、Ｚｎ　　ＳＯＤ遺伝子に対応すると考えられ
る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成しこ
れを３２Ｐ′″ｃ楳識してプローブとして用い、公知の
コロニーハイブリダイゼーション法（Ｈａｎａｈａｎ、
Ｄ、　　ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、↓−００，３３３．１９８３）によりポジテ
ィブなシグナルを示した形質転換体を選択する。

これらの形質転換体より常法に従ってプラスミドＤＮＡ
を単離し、ｃＤＮＡ部分の塩基配列をＭａｘａｍ−Ｇ１
１ｂｅｒｔ法（ＭａｘａｍｔＡ、　　Ｍ、　　ａｎｄ　
　　Ｇ１１ｂｅｒｔ。

Ｗ、　５Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　
＋７４ｗ５６０ｖ１９７７）またはノブオキシ法（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇｖ　Ｊ　、ら。

Ｎｕａｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　＋９＋３
０９＋１９８１　）によって決定し、ヒトＣｕ、Ｚｎ　
−Ｓ　ＯＤ　ｃＤ　Ｎ　Ａの存在を確認する。確認には
、ヒト赤血球より単離されたＣｕ、Ｚｎ　　ＳＯＤのア
ミノ酸配列（Ｊ　ａｂｕｓｃｈ＊Ｊ、　　Ｒ，、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１　９＊２　３　１　０＊１　９
８０）またはダウン症候群患者に白米する樹立細胞株よ
り分離されたｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡの塩基配列
（Ｓ　ｈｅｒｍａｎ、　Ｌ　、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、　Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、、８０，５４６５．１９８３）
を参考にすることができる。

次に、得られたヒトＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤのｃＤＮＡを適
当な形質発現調節遺伝子の下流に連結する。

これ１こはトリプトファンオペロンプロモーター（ｔｒ
ｐプロモーター）、ラクトースオペロンプロモーター（
ｌａｃプロモーター）、λ７アーシのＰ　プロモーター
、ｔａｃプロモーターなどの公知のプロモーターが利用
できる。

しかし、ここで注目すべきことは、生体内には０□　を
必要とする酵素の存在が知られており（大柳善彦！スー
パーオキサイドと医学、５８，１９８１、共立出版）、
従って、０□　を消去する作用を持つＳＯＤを過剰生産
させることにより宿主菌の生理障害をひき起す可能性が
充分に考えられることである。これを避けるためには、
遺伝子の発現を抑制した状態で細胞を成育させたのち、
適当な条件下にこの抑制を解除させて遺伝子を発現させ
ＳＯＤを多量に産生させることが好ましい。

エシェリヒア・コリから分離されたプラスミドＣｏｔ　
　Ｅｌ　　上に存在するフリシンＥ１遺伝子はコリシン
Ｅ１タンパクの産生を支配している遺伝子であり、通常
の状態においてはリプレッサータンパクがオペレーター
に結合することにより遺伝子の発現は抑制されているが
、ＤＮＡに損傷を与えるような処理、たとえば紫外線照
射、マイトマイシンＣ処理、ナリジキシン酸処理などに
よりこの抑制が解除されて誘発が起り１．コリシンＥ１
タンパクが多量につくられる。これはいわゆる負の制御
と呼ばれる調ＢＲ構である。これに加えて、フリシンＥ
１遺伝子には正の制御ら存在しており（調恒明ら、生化
学、Ｖｏｌ、　　５６．Ｎｏ、　８．１０８２．１９８
４）、ユニークな形質発現調節機構を持つ遺伝子であっ
て、誘発時には正の制御の効果も加わってきわめて多量
のコリシン上１タンパク質が産生される。さらにコリシ
ンＥ１タンパク貿はエシェリヒア・コリに対する抗菌性
を代能とするタンパク質であって、通常時の細胞の成立
には必要ないタンパク質とみなし得るものであり、その
性質上、通常時のフリシンＥ　ｌ　ｉｎｎ壬子発現が厳
密に抑制されていることからも、コリシンＥ１遺伝ｆの
形質発現調節遺伝子の利用は本発明にとってきわめて有
利である。

Ｃｏｌ　　ＥＩ　　ＤＮＡはたとえばファルマシアＰ。

Ｌ、バイオケミカルズ社のカタログＮｏ、２７−４９１
４−０１として入手することが可能である。

また、正の制御に関与する領域、プロモーター・オペレ
ーター領域、リポソーム結合領域からなるフリシンＥ１
遺伝子の形質発現７１４節遺伝子の塩基配列は既に報告
されている（Ｅｂｉｎａ＝Ｙ、ら、　Ｇ　ｅｎｅ＊Ｌ影
、１１９．１９８１）、なお、本発明におけるフリシン
Ｅ１遺伝子の形質発現調節遺伝子とは、第１図の−１４
０から７８番目までの塩基配列の存在を必須とするもの
である。

コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
Ｃｕ、Ｚｎ　　ＳＯＤ　　ｃＤＮＡを連結する際に、い
わゆる融合タンパク質を産生するような形での連結は、
適当な制限酵素の切断部位を利用することにより比較的
容易に行うことができる。しかし、コリシンＥ１タンパ
ク質に由来する部分がある程度以上の長さを持っている
場合、この融合タンパク質を人体に投与した際に免疫原
性（抗原性）を発揮する危険性が充分に考えられる。従
って、フリシンＥ１遺伝子の翻訳開始コドン（Ａ’ｒＧ
）の直後にヒトＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤのＮ末端アミノ酸コ
ドンが連結される形が好ましい、しかし、これを満足さ
せてくれるような適当な制限酵素の切断部位はどちらの
遺伝子にも存在しない。そこで、制限酵素を用いて両方
のＤＮＡ＠片を必要部分が欠失した形で切り出し、欠失
した部分は合成りＮＡ断片により補間する二とができる
。

合成りＮＡ断片は、たとえば固相トリエステル法（Ｍ　
１ｙｏｓｈｉｔ　Ｋ　、ら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　
　Ｒｅｓ、　ｖ８ｅ５５０７．１９８０）によりオリゴ
ヌクレオチドを化学合成し、これらをたとえばＴ４ＤＮ
Ａす〃−ゼでつなぎ合せることにより得られる。合成り
ＮＡ断片は、もとの塩基配列を再現するものである必要
は必ずしもない。アミノ酸コドンには縮重が存在し、か
つ生物の種によってコドンの使用頻度が異なることは良
く知られている。従って、アミノ酸の配列を変えない限
りにおいては、合成りＮＡ断片の作製時にどのようなコ
ドンを選んでも自由であるが、宿主菌中で使用頻度の高
いコドンを選択すると、遺伝子の発現量の増大が期待で
きる。

コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子領域に関して
は、もとの塩基配列を再現する方が好ましいが、結果と
して遺伝子の発現量の増加につながるような塩基配列の
変更は採用できる。

自律複製できるベクターに、コリシンＥ１遺伝子の形質
発現調節遺伝子を含むＤＮＡ断片、合成りＮＡ断片、ヒ
トＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤ構造遺伝子断片を正しく組込むこ
とにより目的の組換えＤＮＡが得られる。これらのＤＮ
Ａ断片は、たとえばＴ４ＤＮＡりが一ゼにより連結する
ことができ、最終的に得られる組換えＤＮＡの構造が目
的とするものである限り、Ｄ　Ｎ　Ａ断片の連結順序に
制限はない。使用するベクターは宿主微生物内で複製可
能なものであれば特に制限はなく、宿主がエシェリヒア
・コリの場合はｐＢＲ３２２が良く用いられている。

得られた組換えＤＮＡをベクターの宿主微生物内に導入
し形質転換させる０本発明では宿主微生物としてエシェ
リヒア・コリを使用しているが、形質発現調節遺伝子、
特にフリシンＥｌｆｉ伝子の形質発現調節遺伝子が８！
能する限りにおいては、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、サツカロミセス・
セレビシ１　（Ｓ　ａｅｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）等の他の微生物も使用できる。エシェリ
ヒア・コリの場合はＷ３１１０株、２Ｏ８Ｏ株、Ｃ６０
０８株などの名前があげられる。特にＷ３１１０株が好
ましい、Ｗ３１１０株はエシェリヒア・コリに１２株の
野性味（λ＋　Ｆ＋）から誘導されたλ−９Ｆ−株であ
り、栄養要求性などその他の点では野性味と同一である
（　Ｂ　ａｃｈｍａｎｎ＋Ｂ、　　Ｊ、　ｗＢａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｒｅｖｉｅｗｓ、３６，５２
５．１９７２）。

テトラサイクリン耐性などによりまず形質転換体を選択
したのち、常法に従いプラ入ミドＤＮＡを分離し、制限
酵素地図の解析により第２次のスクリーニングを行う。

さらに誘発時のヒ）Ｃｕ、Ｚｎ−３ＯＤの産生能によっ
て目的の形質転換体を選択する。

ＳＯＤ活性の測定法としては、千トクロームＣ−キサン
チンーキサンチンオキシグーゼを用いる方法（ＭｃＣｏ
ｒｄ、　Ｊ　０Ｍ、　ａｎｄ　　Ｆ　ｒｉｄｏｖｉｃｈ
、Ｉ　、　。

Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　ＣＩ＋ｅｍ、　、２　４　４．
６０　４　９，１　９６　９）、ニトロブルーテトラゾ
リウム（ＮＢＴ）−リボフラビンを用いる方法（Ｂｅａ
ｕｃｈａｍｐ、Ｃ，ａｎｄ　　Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ、Ｉ
、　、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、４４，２７６
．１９７１）等が利用できる。ＮＢＴ−リボフラビン法
は簡便であり、電気泳動後のタンパクの活性染色にも利
用できるため便利である。エシェリヒア・コリの場合に
ついて言うと、組換えＤＮＡから産生されるヒ）Ｃｕ、
Ｚｎ−６ＯＤに加えて、宿主染色体から産生されるＭｎ
−８ＯＤおよびＦｅ−３゜Ｄが混在している。これらの
ＳＯＤの酵素としての作用は同一であるが、Ｃｕ、Ｚｎ
−８ＯＤは１〜２ｍＭのＣＮ−イオンによって活性が阻
害されるのに討し、Ｍｎ−８ＯＤ％Ｆｅ−８ＯＤは同条
件下での阻害を受けないことから区別できる。また、こ
れら３！１１のＳＯＤは分子量や等電点が互いに異なる
ため、電気泳動、イオン交換またはデル濾過カラムクロ
マトグラフィーによって分離することができる。

このようにして得られた、形質発現調節遺伝子、特には
コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒ）
Ｃｕ、Ｚｎ−８ＯＤ構逍遺伝子を有する組換えＤＮＡで
形質松換された微生物を、その宿主微生物の増殖に適し
た条件下で所定の時間培養し、その後に誘発合成を行わ
せてヒ）Ｃｕ、Ｚｎ−８ＯＤを大量に産生させる。エシ
ェリヒア・コリの場合、たとえばＬ培地、グルコースお
よびカザミノ酸を含むＭ９培地などの公知の培地により
培養を行う、培養は通常１５〜４３°Ｃの温度で２〜２
４時間行）、必要により通気、攪拌を加えることができ
る。対数増殖期にある培養物にマイトマイシンＣ２ナリ
ジキシン酸などの薬剤を添加したり、紫外線を照射する
ことにより誘発合成を打わせることができる。

培養後、公知の方法で菌体を集め破砕したのち、通常知
られているタンパク質の精製法に従ってヒ）　Ｃｕ、Ｚ
ｎ　−Ｓ　ＯＤ活性を持つタンパク質を単離することに
よりヒトＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤが製造できる。精製は、た
とえば熱処理、塩析、濃縮、透析、イオン交換クロマト
グラフィー、デル濾過クロマトグラフィー、クロマトフ
オーカシング、電気泳動、高束液体クロマトグラフィー
、アフイニテイクロマトグラフイーなとの提体を適宜組
合せて行うことができる。

かくして製造されたヒトスーパーオキシドディスムター
ゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド
は、虚血性心疾患の治療薬としての活性を示す。

本発明のポリペプチドは、通常の方法に従って注射剤、
錠剤、軟膏剤、カプセル剤、リポソーム製剤などの製剤
とすることができる。

本発明のポリペプチドは、例えば１〜ＩＯＨの量で好適
に用いられ、あるいは１日０．０１７〜０．１７Ｂ／ｋ
ｇ・体重の投与量で１回〜数回に分けて例えば急性心筋
梗塞の治療を目的として、経口的また非経口的に投与し
得る。

以下に実施例および参考例を示す。

参考例１　ヒトＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤのｃＤＮＡを組込ん
だプラスミドｐｓ　ＯＤ　２の作製：正常分娩によって
得られたヒト胎盤がらグアニジウム−塩化セシウム法に
よってＲＮＡを分離し、ついでオリゴ（ｄＴ）セルロー
スを用いてポリ（Ａ）テイルをもったｍＲＮＡを分離し
た。

得られたａｌＲＮＡより、Ｏｋａｙａｍａ　　Ｂ　ｅｒ
ｖＨ法に従って、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。宿
主菌として大腸菌ＤＨ１株を用いた。

コロニーハイプリグイゼーション法にて、ヒトＣｕ、Ｚ
ｎ　　ＳＯＤのｃＤＮＡが組込まれたプラスミドｐｓＯ
Ｄ２を保持した大腸菌ＤＨＩ（ｐｓＯＤ２）株を得た。

この菌株より常法に従ってプラスミド９ＳＯＤ２を単離
した。

参考例２　ヒトＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤ産生用組換乏ＤＮＡ
の作製： フリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒ）
　Ｃｕ、Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤ構造遺伝子を連結して、ヒ）
　Ｃｕ、Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤを産生させるためのプラスミ
ドは、第３図に示すストラテノーに従って作製した。

（１）　フリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子断片
を組込んだプラスミドｐＡＯＫ１の作製：コリシンＥ　
Ｉ　ＤＮＡをＤ　ｒａ　Ｉで切断し、ついで、Ｓ　ｔｕ
　Ｉで切断した後、５％ポリアクリルアミドデル電気泳
動法で３４０ｂｐの５ｔｕＩ−ＤｒａＩ断片を得た。こ
の断片をプラスミドｐＢＲ３２２のＤｒａＩサイトに挿
入し、プラスミドｐＡＯＫ１を作製した。

（２）　ヒトＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤ構造遺伝子断片の作製
ニ プラスミドｐｓＯＤ２をＡｌｕＩで切断し、ついでＴａ
ｑｌで切断した後、５％ポリアクリル７ミドデル電気泳
動法で４４０ｂｐ断片を得た。

（３）合１＃、ＤＮＡの作ｇ１： コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒ）
　Ｃｕ、Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤ構造遺伝子を連結するために
、コリシンＥｌ　　３４０ｂ９断片および５ＯＤｕ造遺
伝子の４４０ｂｐ断片で欠失している部分８４ｂｐを第
４図に示すように１２＠のオリゴペプチドに分割して合
成した。

（４）　ヒトＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤ産生用組換えＤＮＡの
作製ニ プラスミドｐＡＯＫ１のＤ　ｒａ　Ｉサイトに、８４ｂ
ｐの合成りＮＡと、４４０ｂｐのＳＯＤ横遣遺伝子断片
を挿入し、コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の
下流に、ヒトＣｕ、Ｚｎ　　５ＯＤｖＩ造遺伝子が連結
したヒ）Ｃｕ、Ｚｎ−３ＯＤ産生用組換えＤＮＡｐＵＢ
Ｅ２を得た。

参者例３　ヒトＣｕ、Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤ　Ｔｇ：産生す
る岨換え大腸菌５４５πＨＲ（ｐＵＢＥ２）株の作製： ＳＯＢ培地でＯＤ３．。＝０．５５まで培養した大腸菌
５４５πＨＲ株をＴｆｂｌ、ついで”ｒｒｂｕで処理し
たのち、処１！！液にプラスミドｐｕ　Ｂ　Ｅ　２を加
え、０°Ｃで３０分間、ついで４２℃で９０秒問熱処理
して、プラスミドｐＵ　Ｂ　Ｅ　２を保持する大腸菌５
４５πＨＲ（ｐＵＢＥ２）株を得た。

参考例４　ヒトＣｕ、Ｚｎ　　ＳＯＤと実質上同一のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドの 製造： カザミノｌｌＩ２３００ｇ１　グルツース４００８、テ
トラサイクリン１　ｇ、　ＮａｚＨＰＯ＜６００ｇ、　
ＫＨ２ＰＯ。

３００ｇ％　ＮａＣｌ３０ｇ％　ＮＨ４Ｃｌ１００Ｈ１
ＣｕＣｌ　２・２　）１２００．５ｇ、Ｚｎ５Ｏｎ”　
７　Ｈ２Ｏ０，９ｆ＋を含む培地１００ｇに大腸菌５４
５πＨＲ（ｐＬＪＢＥ２）を接種し、クレット１１６ま
で３７℃で攪拌（２０００ｒｐｍ）培養後、培１！液に
Ｎ１１２８Ｐ０．６００ｇ、ＫＨ２ＰＯ−３００ｇ、Ｎ
ａＣｌ３０ｇ５ＮＨ４Ｃ１１００ｇを合む水２２、グル
ツース４５０ｇを含む水１ｅとマイトマイシンＣ２００
Ｂを含む水５００鎗ジを加えて誘発合成を３７℃、２時
間行わせた。

シャープレス型遠心分ａ磯での遠心（２００Ｏｒｐｍ、
３時間）により３４４８の湿菌体を得た。

集菌した菌体を３２の１０ｍＭ）リエタノールアミン４
ｊＨ１ｊｎ（ｐＨ７、０）に懸濁して、グイノミルで破
砕した。破砕液を遠心（９０００ｒｐａ＋、６０分間）
し、得られた粗抽出液の全量を３．５２とした。粗抽出
液に１ＭＣｕＣＩ２水溶液０．３５ｍ１を加え、−晩攪
拌したのち６０°Ｃで５分間加熱路ｐｉ　Ｌな。生じた
沈殿を９０００　ｒｐｍ、２０分間の遠心により除去し
た。上清から硫安沈殿によって７０〜９５％飽和画分を
回収し、透析後イオン交換セルロースＤＥ５２カラムク
ロマトグラフィーにかけて、２０ｍＭ　　ＮａＣ１７１
ｉ１度（１０ａ＋Ｍ）リエタノールアミンｔｔｃ衝液）
で溶出しＳＯＤ活性画分を得た。この両分から１００％
飽和硫安で分離した硫安沈殿を遠心（１５０００ｒｐｍ
、　１０分）で得、透析後、凍結乾燥してヒ）　Ｃｕ＝
Ｚｎ　−Ｓ　ＯＤと実質上同一のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを得た（９９０ｍｇ）。

実施例１（マウスにおける急性毒性試験）ｄｄＹ系雄系
中マウス重３２±２８）１群８匹を用いて、本物質を生
理食塩液に溶解し、静脈内（ｉ。

ｖ、　）投与した。投与量は３０１１ｇ／　ｋｇ、　　
１００　ｍｇ／ｋｇ、３０　ＯＬＩ１ｇ／　ｋｇの３群
である。投与後２週間中毒症状について観察したが、各
群ともに異常なく生存した。屠殺後の解剖所見において
も、生理食塩液のみを投与したコントロール群と何ら変
わるところがなかった。従って、マウスにおける本物質
の静脈内投与におけるＬＤ、。値は３００　Ｌ６ｇ／　
ｋｇ以上である（第１表参照）。

第１表 実施例２（急性心筋梗塞に対する効果）体重１０−１２
に、の雑種成犬をＣｏｎｔｒｏ１６例、ヒトＣｕ、Ｚｎ
　　ＳＯＤ投与投与側６例１２例を用いた。

実験犬をＧＯＦ麻酔下で胸骨縦切開により開胸した。左
冠動脈回旋枝（Ｌ　ＣＣＡ　”）根部をクレンメにより
完全に閉塞させることにより急性心筋梗塞モデルを作製
した。ヒトＣｕ％Ｚｎ−３ＯＤ（Ｃｏｎｔｒｏ１群では
生理食塩水）は、ＬＣＣＡ閉塞１０分前から血流再開後
３０分まで１０分毎に左心房へ留置したカテーテルより
、ＰＩＳ５図に示したス°ケジュールに従って、総ｊ２
Ｌ６０ｍｇを投与した。

ＬＣＣＡＣＣ時間は９０分とし、その後血流を再開させ
、６時間後に層殺し心臓を摘出し、ＴＴＣ（Ｔ　ｒｉｐ
ｈｅｎｙｌ　　Ｔ　ｅｔｒａｚｏｒｉｕｍ　　Ｃｈｌｏ
ｒｉｄｅ）ｌこより染色し、梗塞率を測定した。

梗塞率は次のようにして求められる。

摘出心標本のＬＣＣＡ根部をクランプする。その状態で
、左冠動脈からＴＴＣ溶液を潅流させ、また右冠動脈及
び左冠動脈前下降技からＥ　ｖａｎｓＢｉｕｅ溶液を潅
流させる。この方法によれば、冠動脈速断により影響を
受けない部分はＥｖａｎｓ　　Ｂｌｕｅによって青く染
まり、該連断により影響を受ける部分はＴＴＣによって
赤く染まるが（生きている部分）あるいは染まらず白の
ままである（梗塞部分）。

染料溶液の潅流が終了したのち、この摘出心から左心房
、右心房を除去して左心室および右心室のみとし、この
部分を横方向に６〜７切片にスライスした。それぞれの
スライスの重量並１に切断して青色部分、赤色部分およ
び白色部分の重量を測定した。

第６図には、摘出心を染料溶液で潅流したのちのスライ
スの俟式図が示されている。第６図の（ａ）および（ｂ
）はそれぞれコントロール、およびヒトＣｕ、Ｚｎ　　
ＳＯＤ投与群についてのものである。

図中斜線部分はＥ　ｖａｎｓ　　Ｂ　ｌｕｅ染色部分、
多数の黒点部分は赤く染色された部分であり、白い部分
は染まらなかった部分である。

スライスの全重量をＬ　ＲＶ　（ｇ）とし、赤く染まっ
た部分と白のままの部分の合せた重量をＲｉｓｋ（ｇ）
とし、そして白のままの部分の重量をＩｎｆ（ｇ＞とす
ると、梗塞率はＩｎｆ／ＬＲＶ、Ｒｉｓｋ／　Ｌ　ＲＶ
およびＩ　ｎｆ／　Ｒｉｓｋの値によって総合的に判断
される。

結果を、第２表およびＰｔｔＪＶ図に示した。

なお、第７図において、斜線を施した柱は、ヒ）Ｃｕ、
Ｚｎ−ＳＯＤ群についてのものであり、他の柱はｃｏｎ
ｔｒｏｌ群についでのものである。

第２表および第７図の結果から、Ｃｏｎｔｒｏ１群に比
較ヒ）Ｃｕ、Ｚｎ　　ＳＯＤ投与群では有意に梗塞範囲
の縮小効果が認められた。

また、実験中、心電図、血圧、心拍数を経時的に測定し
た。心電図を第８図（ヒ）Ｃｕ、Ｚｎ−３ＯＤ投与群）
および第９図（Ｃｏｎｔｒｏ１群）に示した。

第８図及びｔｔＳ９図中、（ａ）はｃｏｎｔｒｏｌ、（
ｂ）はＬＣＣＡ根部閉塞３０分後、（ｃ）は閉塞解除直
後および（ｄ）は閉塞解除型３時間後の心電図を各々示
している。

第８図とｆｊＳＳ図の比較から、Ｃｏｎｔｒｏ１群に比
較し、ヒトＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤ投与群ではＴ波の増高、
心室性期外収縮の出現が少ないことがわかる。

また血圧、心拍数については両群の間に有意な差は認め
られなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図はコリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子領域
の塩基配列を示、したものである、ＰＢはＲＮＡポリメ
ラーゼの結合部位、Ｒ８はＲＮＡポリメラーゼの認ａＳ
位である。太い矢印は転写の開始点と転写方向を示して
いる。破線による下線部はリポソーム結合部位を示し、
Ｍｅｔが翻訳開始コドンの位置を示している。２カ所存
在する実線下線部は正の制御に関与する領域である。ま
た制限酵素Ｄ　ｒａ　Ｉの切断位置を示した。 第２図は胎盤のｍＲＮＡから得られたヒ）Ｃｕ。 Ｚｎ　　ＳＯＤ　　ｅＤＮＡの構造遺伝子９３１域の塩
基配列と、塩基配列から決定されるアミノ酸配列を示し
た。２カ所の下線部はコロニーハイブリダイゼーション
に用いた２種類の合成りＮＡがハイブリダイズする領域
である。 第３図は組換えＤＮＡ　　ｐＵＢＥ２が作製されるまで
の経過の概略を図示したものである。 第４図は合成りＮＡ断片の塩基配列と、化学合成したオ
リゴヌクレオチドの塩基配列を示したものであり、オリ
ゴヌクレオチドを結合して得られる合成りＮＡ断片は、
５′端はＤｒａＩ［ｔ！、３′端はＴａｑＩ切断端とな
っている０本印は第２図の塩基配列を変更した個所で２
カ所存在している。 但しアミノ酸配列は変わっていない。 ｆｊＳ５図は、ヒトＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤ投与のスケジュ
ールである。 第６図は、摘出心を染料溶液（ＴＴＣ溶液とＥ　ｖａｎ
ｓ　　Ｂ　ｌｕｅ溶８りで潅流したのちのスライスの模
式図ある。 第７図は、Ｃｏｎｔｒｏ１群とヒトＣｕ、Ｚｎ−８ＯＤ
投与群とについての心臓の梗塞率の比較を示している。 第８図および第９図は、それぞれヒ）Ｃｕ、Ｚｎ−８Ｏ
Ｄ投与群およびｃｏｎｔｒｏｌ群についての心電図であ
る。 第３図 Ｉｎｆ、／ＬＲＶ　　　　　Ｒ１５ｋ／ＬＲＶ　　　　
　　　Ｉｎｆ、／Ｒｉｓｋ第８図 第９図 （ｄ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトスーパーオキシドディスムターゼと実質的に同
   一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを活性成分とす
   る虚血性心疾患治療薬。 ２、上記ポリペプチドが単細胞微生物中で産生されたも
   のである特許請求の範囲第１項に記載の虚血性心疾患治
   療薬。 ３、上記単細胞微生物がポジティブレギュレーションサ
   イトを有する形質発現調節遺伝子の下流にヒト銅、亜鉛
   型スーパーオキシドディスムターゼ構造遺伝子を有する
   組換えＤＮＡで形質転換されたものである特許請求の範
   囲第２項に記載の虚血性心疾患治療薬。