JP2001501473A - 環状に改変されたグロビンを取り込んだ酸素結合ヘムタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 記載されているのは、少なくとも一つの環状に改変されたグロビン（特に、アルファグロビン）を取り込んだ少なくとも一つのヘモグロビン分子を含む好適な酸素−結合ヘムタンパク質である。本発明のより好適なヘムタンパク質には、高分子量のマルチマーが含まれる。また、本発明のタンパク質をコードしているポリヌクレオチド、およびベクターおよびそれを含んでいる宿主細胞も記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】 環状に改変されたグロビンを取り込んだ酸素結合ヘムタンパク質 本発明は米国国立保健研究所基金第ＰＨＳ ５Ｐ０１ ＨＬ−５１０８４号の 政府援助を用いて行われた。政府は本発明に対してある種の権利を持っている。関連出願 本出願は１９９６年９月２７日に出願された米国仮特許出願番号第６０／０２ ６，８３１号（全文が本明細書において援用される）に対して優先権を請求する 。背景技術 本発明は一般的に酸素結合ヘムタンパク質、特に、少なくとも一つの機能的な 、環状に改変されたグロブリンを取り込んでいる一つまたはそれ以上のヘモグロ ビンテトラマーを組み込んだタンパク質に関している。 さらなる背景として、輸血ができることは、外傷患者に血液損失を補充するこ と、手術患者により少ない危険性でより長い手術を受けさせることおよび救急作 業者が事故犠牲者に供給血液を持っていくことを可能にする。輸血可能な供給血 液には多くの利点があるが、利用可能な血液は人の献血に制限されている。加え て、全血の制限された貯蔵寿命、疾患の伝搬および適合しない血液型分類が完全 に解決されるべき問題である。 例えば、１９８０年代のＨＩＶ混入供給血の存在が、献血された供給血に付随 する問題を回避する必要性に対する意識を高めた。現在ですら、米国保健福祉省 はＨＩＶおよび肝炎を含む、献血に関連した多くの論争を調査するために血液安 全性委員会を創設している。 血漿、白血球、血小板および赤血球を含んでいる移入された血液は、一般的に 、肺から残りの体細胞に酸素を運搬するために使用される。多くの酸素運搬溶液 が 輸血の代替物として研究されてきた。これに関して、有効な血液代用物は三つの 基本的要求を満たさなければならない。第一に、肺から組織へ酸素を運搬しなけ ればならない。第二に、有効であるために十分長くインビボで機能的に残ってい なければならない；および第三に、有害な副作用を惹起してはならない。現在ま でに研究された血液代用物としては、パーフルオルカーボン（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｒ．Ｊ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ（Ｊ．Ｇ ｏｌｄｓｔｅｉｎ編）ｐｐ．１２７−１６２，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉ ｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎ）、期限切れのヒト血液からの化学修飾ヘモグロビ ン（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．（１９９２）Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−ｂａｓｅｄ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、および微生物およ び哺乳類宿主で産生された組換え体ヘモグロビン（Ｓｈｅｎ，Ｔ．−Ｊ．，Ｈｏ ，Ｎ．Ｔ．，Ｓｉｍｐｌａｃｅａｕ，Ｖ．，Ｚｏｉｕ，Ｍ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｂ． Ｎ．，Ｔａｍ，Ｍ．Ｆ．，＆ Ｈｏ，Ｃ．（１９９３），ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９ ０，８１０８−８１１２；Ｒａｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｋ．，Ｃｈ ａｉｔ，Ｂ．Ｔ．，Ｃｈａｏ，Ｔ．Ｌ．Ｋｅｌｌｅｒ，Ｈ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｓ．，Ｍａｎｊｕｌａ，Ｂ．Ｎ．，Ｋｕｍａｒ，Ｒ．， ＆ Ａｃｈａｒｙａ， Ａ．Ｓ．（１９９４）ＡＣＢＳＩＢ ２２，６９５−７００）が挙げられる。 ヘモグロビンについては、各々のヘモグロビン分子は、グロビンとして知られ ている四つのより小さなポリペプチドサブユニットのテトラマーである。鉄−プ ロトポルフィリン錯体であるヘム基は各々のポリペプチドサブユニットに結合さ れており、酸素一分子の可逆的結合に関与している。正常な成人ヘモグロビンは 二つの異なった種類のポリペプチドグロビンから構成されている。アルファグロ ビンとして知られている第一のグロビンは１４１のアミノ酸残基を含んでいる。 ベータグロビンとして知られている第二のものは１４６のアミノ酸残基を含んで いる。正常な成人ヘモグロビンにおいて、各々の種類のグロビンの二つが端を切 り取った四面体の形に配置されており、全体的には楕円の形状である。 全ヘモグロビン分子は６４，４００ｋＤａタンパク質である。Ｘ−線結晶構造 はＨｂＡｏの大きさが約６４Åｘ５５Åｘ５０Åであることを示している（Ｆｅ ｒｍｉ，Ｇ．，Ｐｅｒｕｔｚ，Ｍ．Ｆ．，Ｓｈａａｎａｎ，Ｂ．ａｎｄ Ｆｏｕ ｒｍｅ，Ｂ．（１９８４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ ｌｏｇｙ １７５，１５９）。各々のアルファサブユニットのヘム補欠分子族は Ｌｙｓ Ｅ１０、Ｈｉｓ ＣＤ３、Ｖａｌ Ｅ１１およびＰｈｅ ＣＤ１により サブユニットに非共有結合で結合されている。ベータ鎖においては、Ｈｉｓ Ｃ Ｄ３がＳｅｒ ＣＤ３で置き換えられている。ヘムは近位のヒスチジンと結合さ れたＦｅ⁺⁺を含んでいる。遠位のヒスチジンは鉄の周りをさまよっているが配位 はしていない；しかしながら、このヒスチジンは、Ｏ₂よりもヘムに対して高い 親和性を持つＣＯの結合、ならびにデオキシ状態での鉄への水素結合を、立体的 および／または電気的に妨げることができる。ヘム中の鉄はＦｅ⁺⁺⁺状態へ酸化 することができ、非機能的ヘモグロビンが作り出される（Ｂｕｎｎ，Ｈ．Ｆ．ａ ．Ｆ．，Ｂ．Ｇ．（１９８６）Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｇ ｅｎｅｔｉｃ，ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ （Ｄｙｓｏｎ，Ｊ． 編）ｐｐ．１３−１９，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌ ａｄｅｌｐｈｉａ）。 ヘモグロビンに結合するリガンドにはＣＯ、ＮＯ、ＣＮ−および最も生理的に 関連するリガンド、Ｏ₂がある。酸素の結合はＳ字状パターンで起こり、多リガ ンド結合の協同作用を示している。ヘモグロビンは少なくとも二つの状態、Ｔお よびＲ、で存在できることが示されている。Ｔ状態はヘモグロビンのデオキシ化 状態に関連しており、一方Ｒ状態はリガンド結合ヘモグロビンに関連している。 リガンドが結合したときのＴからＲへのシフトに関して多くのモデルが提唱され ている。二つの初期モデルは状態の変化を、リガンドが結合されるにつれてのＴ からＲへの協奏的変化、またはＴからＲへのサブユニットの逐次的変化と説明し ている。Ｍｏｎｏｄ、ＷｙｎｍａｎおよびＣｈａｎｇｅｕｘにより提出された協 奏的モデルはＴからＲへ変換されている全テトラマーから生じる協奏性を説明し ている（Ｍｏｎｏｄ、Ｊ．，Ｗｙｎｍａｎ，Ｊ．，ａｎｄＣｈａｎｇｅｕｘ，Ｊ ．−Ｐ．（１９６５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ ｇｙ １２，８８−１１８）。誘導適合モデルはＲ状態の結果としての協奏性を 説明しており、リガンド結合サブユニットが隣接するＴ状態サブユニットを誘導 し てＲコンホメーションに変化させる（Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ．，Ｎｅｍｅｔ ｈｙ，Ｇ．ａｎｄ Ｆｉｌｅｒ，Ｄ．（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５，３６５−３８６）。最近、Ａｃｋｅｒｓおよび共同研究者は、ＴからＲへの 遷移における中間体状態に対する証拠を提出するＴからＲへの遷移に対するシン メトリーモデルを提案した（Ａｃｋｅｒｓ，Ｇ．Ｋ．，Ｄｏｙｌｅ，Ｍ．Ｌ．， Ｍｙｅｒｓ，Ｄ．，ａｎｄ Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｍ．Ａ．（１９９２）Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２５５，５４−６３）。八つの中間体結合状態が、リガンドを結合す ることができない金属置換ヘムを用いて研究された。続いてのリガンドが互い違 いのアルファ／ベータダイマーに結合した場合、最も急な自由エネルギー変化が 起こることが示された。 リガンド親和性はまたアロステリックエフェクターの数にも依存している。酸 素親和性を低下させるエフェクターとしてはプロトン（ボーア効果）、２，３− ジホスホグリセラートおよび塩素イオンが含まれる。エフェクターの生理学的関 連性は、ＣＯ₂を産生する代謝的に活性な細胞への酸素送達を促進することであ る。 血液代用物を提供する手段としておよびその他の使用のため、ヒトヘモグロビ ンの修飾が広範囲に調べられてきた。ヘモグロビンは十分に特徴付けられたタン パク質であり、有効で安全な血液代用物の基本的要求にあうように改変すること ができる。化学修飾されたヘモグロビン、およびより最近はヘモグロビンの組換 え型が現在、臨床試験の種々の段階で試験されている。 原核生物および真核生物における組換え体ヘモグロビンの過剰産生によりいく つかの問題が生じている。ヒトにおいては、メチオニンアミノペプチダーゼが小 さな疎水性残基を切断すべき信号として認識する（Ｈｅｒｎａｎ，Ｒ．Ａ．，Ｈ ｕｉ，Ｈ．Ｌ．，Ａｎｄｒａｃｋｉ，Ｍ．Ｅ．，Ｎｏｂｌｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｌｉ ｇａｒ，Ｓ．Ｇ．，Ｗａｌｄｅｒ，Ｊ．Ａ．，＆ Ｗａｌｄｅｒ，Ｒ．Ｙ．（１ ９９２），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１，８６１９−８６２８）。従って、 翻訳後に修飾されたヒトヘモグロビンの最初のアミノ酸はバリンである。しかし ながら、大腸菌におけるヒトヘモグロビンの発現の間、最初のメチオニンは切断 されない。さらに、大腸菌メチオニンペプチダーゼは小さな極性側鎖を認識し、 および大腸菌における発現は本質的にアルファ／ベータ鎖の両方の第一次配列に メチオニンを付加する。この問題点は二つの方法で取り扱われてきた。最初のメ チオニンが切断される酵母発現系が利用された（Ｗａｇｅｎｂａｃｈ，Ｍ．，Ｏ ’Ｒｏｕｅｋｅ，Ｋ．，Ｖｉｔｅｚ，Ｌ．，Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ，Ａ．，Ｈｏｆ ｆｍａｎ，Ｓ．，Ｄｕｒｆｅｅ，Ｓ．，Ｔｅｄｅｓｃｏ，Ｊ．，＆ Ｓｔｅｔｌ ｅｒ，Ｇ．（１９９１）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９，５７−６１）。原 核生物での産生においては、最初のアミノ酸（バリン）のメチオニンによる置換 が、ＨｂＡｏと機能的に同等のタンパク質を産生するためにアルファおよびベー タ鎖の両方で使用された（組換え体ヘモグロビン ｄｅｓ−ｖａｌ）（Ｈｅｒｎ ａｎ，Ｒ．Ａ．，Ｈｕｉ，Ｈ．Ｌ．，Ａｎｄｒａｃｋｉ，Ｍ．Ｅ．，Ｎｏｂｌｅ ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｌｉｇａｒ，Ｓ．Ｇ．，Ｗａｌｄｅｒ，Ｊ．Ａ．，＆ Ｗａｌｄ ｅｒ，Ｒ．Ｙ．（１９９２），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１，８６１９−８ ６２８）。 これらの過剰産生されたヘモグロビンは酵母および大腸菌で誤って組み立てら れることが報告されている（Ｈｅｒｎａｎ，Ｒ．Ａ．，＆ Ｓｌｉｇａｒ，Ｓ． Ｇ．（１９９５）ＪＢＣ，２７０，２６２５７−２６２６４）。誤って組み立て られたテトラマーは最初は野生型ヘモグロビンと同様にリガンドを結合するが、 時間がたつと異なった速度でリガンドを結合する異なったテトラマー基体へドリ フトする。ドリフトは時間および温度に依存するようであり、−７０℃で保存さ れたタンパク質でもドリフト問題が生じる。−７０℃で保存された野生型ヘモグ ロビンはそのような影響を示さなかった。 ヘモグロビン血液代用物は多くの利益と同様に多くの難点があることが示され ている。ヘモグロビンは酸素運搬の強力な道具であるが、これを使用することに より天然の環境から厳密に制御されたタンパク質を除くことになる。ヘモグロビ ンに基づいた血液代用物における一つの重要な問題は、ヘム鉄中の酸素がスーパ ーオキシドイオンとして解離する場合に生じ、ヘモグロビンが第二鉄”ｍｅｔ” 状態に酸化されて残される。この自動酸化はヘモグロビンをリガンドを結合でき ない状態として残すことになる。さらに、Ｆｅ⁺⁺⁺状態は高度の反応性を持つＦ ｅ⁴⁺フェリル状態への経路の中間体であり、ヘムが失われ、脂質の過酸化を起こ すことができる（Ｇｉｕｌｉｖｉ，Ｃ．，ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，Ｋ．Ｊ．Ａ． （１９９４），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２３１，４９０ −４９６；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．，ａｎｄ Ｌａ Ｍａｒ，Ｇ．Ｎ．（１９８ ６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５，５２８８−５２９７；Ｒｅｐｋａ，Ｔ． ，ａｎｄ Ｈｅｂｂｅｌ，Ｒ．Ｐ．（１９９１）Ｂｌｏｏｄ ７８，２７５３− ２７５８）。スーパーオキシドが離れる速度（off-rate）は測定される自動酸化 速度を支配しているようである。 ヘモグロビンに基づいた血液代用物に付随する別の重要な問題は、一酸化窒素 （ＮＯ）に対するヘモグロビンの親和性であり、それはＣＯまたはＯ₂に対する 親和性よりも高い。ＮＯは血管拡張剤であり、ヘムリガンドとしてヘモグロビン により、またはニトロソチオールとしてシステイン上で運搬できる（Ｂｏｎａｖ ｅｎｔｕｒａ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０，２２１−２２６）。臨床試験 の結果は、ヘモグロビンに基づいた血液代用物で処置された患者はしばしば血圧 が高くなることを示している（Ｂｌａｎｔｚ，Ｒ．Ｃ．，Ｅｖａｎ，Ａ．Ｐ．， ａｎｄ Ｇａｂｂａｉ，Ｆ．Ｂ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔ ｅｓ：Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｅｆｆｉｃａｃｙ （Ｗ ｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．，Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ．，ａｎｄ Ｉｎｔａ ｇｌｉｅｔｔａ，Ｍ．，Ｅｄ．）ｐｐ．１３２−１４２，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ ，Ｂｏｓｔｏｎ）。ヘモグロビンの別の問題は、分子が十分に小さいため内皮細 胞内層に血管外遊出してＮＯを結合することである。Ｌ−アルギニン（ＮＯ合成 経路の中間体）またはニトログリセリン（血管拡張剤）で処置されている患者は ヘモグロビン溶液を投与されている間は標準血圧である（Ｂｌａｎｔｚ，Ｒ．Ｃ ．，Ｅｖａｎ，Ａ．Ｐ．，ａｎｄ Ｇａｂｂａｉ，Ｆ．Ｂ．（１９９５）Ｂｌｏ ｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ：Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏ ｆＥｆｆｉｃａｃｙ 、上記文献、を参照されたい）。 多分ヘモグロビン血液代用物の最も著しい欠点は腎臓によるヘモグロビン分子 の急速な濾過である。患者に使用される濃度では、ヘモグロビンは、アルファ／ ベータダイマーへ解離し、これは腎臓濾過されるには十分に小さい。このことは 血液代用物の寿命を著しく減少させるばかりでなく（１時間未満の半減期）、腎 細管に有害な影響を与えて腎毒性を起こしうる（Ｂｌａｎｔｚ，Ｒ．Ｃ．，Ｅｖ ａｎ，Ａ．Ｐ．，ａｎｄ Ｇａｂｂａｉ，Ｆ．Ｂ．（１９９５），Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ：Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｅ ｆｆｉｃａｃｙ 、上記文献、を参照されたい）。 腎毒性を除去する一つの重要な工程はアルファ／ベータダイマーの架橋である 。現在行われている研究として、二つのアルファまたは二つのベータのリジン残 基への共有結合による化学的架橋が挙げられる（Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ ．，＆ Ｌｅ Ｔｅｌｉｅｒ，Ｙ．Ｃ．（１９９４）Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ−Ｃ ｅｌｌｓ−Ｂｌｏｏｄ−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ−ａｎｄ−Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚ ａｔｉｏｎ−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２，９４３−４５５）。加えて、 ヘモグロビンはグリセルアルデヒドを用いて無作為に多量化されている（Ｖａｎ ｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ．，＆ Ｌｅ Ｔｅｌｉｅｒ，Ｙ．Ｃ．（１９９４）Ａ ｒｔｉｆｉｃｉａｌ−Ｃｅｌｌｓ−Ｂｌｏｏｄ−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ−ａｎ ｄ−Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２，４４ ３−４５５）。しかしながら、化学反応の利用は機能的タンパク質の収率を著し く低下させる。 研究者は約２時間の半減期を持つ遺伝子的に架橋されたヘモグロビン分子を生 成させている（Ｌｏｏｋｅｒ，Ｄ．，Ａｂｂｏｔｔ−Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．，Ｃｏｚ ａｒｔ，Ｐ．，Ｄｕｒｆｅｅ，Ｓ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ／，Ｍａｔｈｅｗｓ， Ａ．，Ｍｉｌｌｅｒ−Ｒｏｅｈｒｉｃｈ，Ｊ．，Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｇ．，Ｋ ｏｍｉｙａｍａ，Ｎ．Ｈ．，Ｎａｇａｉ，Ｋ．，＆ Ｓｔｅｔｌｅｒ，Ｇ．Ｌ． （１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５６，２５８−２６０）。Ｘ−線結晶学によると 、一つのアルファ鎖のＣ−末端は第二のアルファ鎖のＮ−末端から２から６Ａの みしか離れていないことを示しており（Ｓｈａａｎａｎ，Ｂ．，（１９８３）Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７１，３１−５ ９）、トリプシン触媒逆加水分解はＣ−末端に結合された追加のアミノ酸は酸素 結合特性を変化させないことを示している。これらの結果を、Ｃ−末端ａｒｇｌ ４１が別のアルファ鎖のｖａｌ１と塩橋を形成できるという知見と結び合わせる と、二つのアルファ鎖の遺伝子的な架橋の可能性を示している。これらの研究者 により大腸菌で発現されたジ−アルファ鎖はアルファ−ｄｅｓ−ｖａｌ，グリシ ンリンカーおよび天然のアルファ鎖配列から構成されている。この構築物は天然 に存在する低酸素親和性ベータ突然変異体のｄｅｓ−ｖａｌ誘導体（ベータプレ スバイテリアン、Ｒ１０８Ｋ）と共発現され、全構築体はｒＨｂ１．１と称され た。 ヘモグロビンに基づいた血液代用物の開発におけるこれらの広範囲な努力にも 関わらず、分子安定性および血漿半減期を増加させ、および腎毒性の危険性を減 少させることができる、より増加した架橋およびより高い分子量を持つ代用物に 対する必要性がいまだに存在している。そのような代用物は望ましくは宿主細胞 において高収量で容易に発現されおよび都合のよい酸素結合能力を持っているで あろう。本発明はこれらの要求を扱っている。発明の要約 従って、本発明の一つの好適な態様は少なくとも一つの環状に改変されたグロ ビンを含んでいる（少なくとも一つの）ヘモグロビン分子を含むヘムタンパク質 を提供する。好適な形では、本発明は隣接したアルファ鎖のＮおよびＣ末端が非 常に近いこと、および一つまたはそれ以上のアミノ酸のリンカーが両方の組の末 端間に挿入されていることを利用している。新末端がタンパク質中の任意の位置 、好適には他の分子との結合のために（例えば、一つまたはそれ以上の他のヘモ グロビン分子と組換え体ヘモグロビン多量体を形成するために）表面に露出され るような位置に形成される。本発明の好適なタンパク質は、二つのアルファおよ び二つのベータグロビンを持つ少なくとも一つの酸素結合ヘモグロビンテトラマ ーを含んでおり、ここで少なくとも一つのグロビンは環状に改変されており、お よび、より好適には表面に露出されたＮ−およびＣ−末端を持っている。さらに より好適には、本発明のタンパク質中のヘモグロビン分子はグロビン間の多架橋 を持っているであろう。 本発明の別の好適な態様は、二つのベータグロビンおよびジ−アルファグロビ ン構築物を含む少なくとも一つのヘモグロビン分子を含んでいるヘムタンパク質 （好適には酸素−結合性）を提供する。ジーアルファグロビン構築物は一般的に は別のアルファグロビンに架橋した環状に改変されたアルファグロビンを含んで いる。従って、好適なジ−アルファグロビン構築物は、本来のＮ−およびＣ−末 端が一つまたはそれ以上のアミノ酸のリンカー配列により各々がお互いに結合さ れたアルファ鎖を持つ単一ポリペプチドの環状の改変に対応するアミノ酸配列を 含んでいるであろう。都合の良い形においては、ジ−アルファ構築物はポリペプ チドリンカーにより別のタンパク質（例えば、別のジ−アルファ構築物）へ共有 結合で結合でき、高分子量のタンパク質（例えば、ヘモグロビンマルチマー）を 形成する。 本発明の別の好適な態様は、二つの遺伝子架橋により別のアルファグロビンへ 共有結合で結合された環状に改変されたアルファグロビンを持つ一つのポリペプ チドをコードしているポリヌクレオチドを提供する。それ故、好適なポリヌクレ オチドは（１）第一の環状に改変されたアルファグロビンの第一の部分；（２） 第一の遺伝子架橋；（３）第二のアルファグロビン；（４）第二の遺伝子架橋； および（５）環状に改変されたアルファグロビンの第二の部分を連続的にコード しているであろうし、ここで第一および第二の部分は一緒になって全環状に改変 されたアルファグロビンを構成している。それ故、好適なポリヌクレオチドは二 つのアルファグロビン、その第一のものは環状に改変されており、およびその第 二のものは環状に改変されておらず、第一のアルファグロビンの本来のＮ−およ びＣ−末端を結合しているポリペプチド中に存在する。 本発明のさらに別の好適な態様は、グロビンの表面露出ループ領域内（即ち、 任意の非らせん表面露出アルファセグメント内）に位置した末端を持っている環 状に改変されたグロビンを提供する。好適な、表面露出末端は溶媒に暴露されて いるであろうし（末端に重なるグロビン構造を持っていない）、隣接するヘモグ ロビンアルファまたはベータサブユニットへの、または別の分子への（例えば、 融合タンパク質を形成する）一つまたは両方の末端の共有結合に有効であろう。 好適な環状に改変されたアルファグロビンは末端アミノ酸として、対応する環状 に改変されていないグロビンの残基４７および４８、４８および４９、４９およ び５０、５０および５１、１１３および１１４、１１４および１１５、１１５お よび１１６または１１６および１１７を持っているであろう。好適な環状に改変 されたベータグロビンは末端アミノ酸として、対応する環状に改変されていない ベータグロビンの残基４６および４７、４７および４８、４８および４９、１１ ８および１１９、１１９および１２０、１２０および１２１、１２１および１２ ２を持っているであろう。 本発明の他の好適な態様は、環状に改変されたグロビンをコードしているポリ ヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクターまたは宿主細胞、お よびそのようなポリヌクレオチドを含んでいるおよび発現している宿主細胞を培 養することを含むヘムタンパク質の製造法を提供する。 本発明はまた、本発明の酸素結合ヘムタンパク質の治療的有効量を患者に投与 することから成る、温血動物患者（例えば、ヒト患者）における組織酸素供給を 増加させる方法にも関している。 本発明はまた、本発明のヘムタンパク質の有効量を患者に投与することから成 る、温血動物患者（例えば、ヒト患者）の血流中のヘモグロビンを置き換える方 法も提供する。 本発明のさらに別の好適な態様は、本発明の酸素結合ヘムタンパク質の有効量 を動物の血流内へ導入することから成る、温血動物（例えば、ヒト患者）の血管 収縮を誘導するための方法を提供する。 本発明の別の好適な態様は、器官または組織と本発明の酸素結合ヘムタンパク 質を接触させる工程を含む、単離された器官または組織（例えば、貯蔵または輸 送の間の）の酸素供給を増加させる方法を提供する。 追加の態様ならびに本発明の目的、特色および利点は以下の説明から明らかに なるであろう。 図面の簡単な説明 図１はｐＳＳ１を発生させるために使用された連結法の図による表現である。 図２はｐＳＳ１の発生に使用されたオリゴヌクレオチドカセットを示している 。 図３はｐＳＳ１に含まれているジ−アルファ遺伝子のＤＮＡ配列を示している 。生じるアミノ酸配列および一次制限部位もまた示されている。 図４はｐＳＬＳ２１およびｐＳＬＳ２２の発生に使用されたオリゴヌクレオチ ドカセット、各々ＣＰ１およびＣＰ２、を示している。 図５はｐＳＬＳ２１を発生させるために使用された連結法の図による表現であ る。 図６はｐＳＬＳ２２を発生させるために使用された連結法の図による表現であ る。 図７はｐＳＬＳ２２に含まれている環状に改変されたジ−アルファ遺伝子のＤ ＮＡ配列を示している。生じるアミノ酸配列および一次制限部位もまた示されて いる。ボールド体で強調した領域はグリシンコドン連結領域である。 図８はｐＳＬＳ２３を発生させるために使用された連結法の図による表現であ る。 図９はｐＳＬＳ２４およびｐＳＬＳ２５の発生に使用されたオリゴヌクレオチ ドカセット、各々ＴＡ１およびＴＡ２、を示している。 図１０はｐＳＬＳ２４を発生させるために使用された連結法の図による表現で ある。 図１１はｐＳＬＳ２５を発生させるために使用された連結法の図による表現で ある。 図１２はｐＳＬＳ２６を発生させるために使用された連結法の図による表現で ある。 図１３はｐＳＬＳ２６に含まれているテトラ−アルファ遺伝子のＤＮＡ配列を 示している。生じるアミノ酸配列および一次制限部位もまた示されている。ボー ルド体で強調した領域は単一グリシンおよびＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ連 結領域である。 図１４はｐＳＬＳ２７を発生させるために使用された連結法の図による表現で ある。修飾テトラ−アルファ遺伝子はわずかに異なった制限部位を含んでいる。 図１５はｐＳＬＳ２８を発生させるために使用された連結法の図による表現で ある。 図１６は図１、５、６、８、１０、１１、１２、１４および１５に示されたプ ラスミドの図のための説明文である。 図１７は天然のヘモグロビン（ＨｂＡ）、環状に改変されたヘモグロビン（Ｃ ＰＨｂ）およびオクタマーヘモグロビン（ＯＨｂ）のための平衡結合曲線を示し ている。 図１８はＨｂＡおよびＣＰＨｂの血漿残存時間測定の結果を示している。好適な態様の説明 本発明の原理の理解を深める目的で、それらの態様が参照され、同一のものを 説明するために特別な言葉が使用されるであろう。しかしながら、それらにより 本発明の範囲が制限されることを意図しているものではなく、そのような変形、 さらなる改変および本明細書で説明されているような本発明の原理の応用は、本 発明に関係する当業者には普通に生じるであろうごとく意図されていることが理 解されるであろう。 以下の定義が本明細書では使用される。 ヌクレオチド−−糖残基（ペントース）、リン酸および窒素性複素環式塩基を 含んでいるＤＮＡまたはＲＮＡの単量体単位。塩基はグリコシド炭素（ペントー スの１’炭素）を通して糖残基に結合されており、塩基および糖の組み合わせは ヌクレオシドと称されている。塩基はヌクレオチドを特徴付ける。四つのＤＮＡ 塩基とはアデニン（”Ａ”）、グアニン（”Ｇ”）、シトシン（”Ｃ”）および チミン（”Ｔ”）である。四つのＲＮＡ塩基とはＡ，Ｇ、Ｃおよびウラシル（” Ｕ”）である。 ポリヌクレオチド−−隣接するペントースの３’および５’炭素間のホスホジ エステル結合によりお互いに連結されたヌクレオチドの直線配列。 ポリペプチド−−隣接するアミノ酸のアルファアミノおよびカルボキシ基間の ペプチド結合によりお互いに連結されたアミノ酸の直線配列。 発現−−構造遺伝子により受ける過程であり、ポリペプチドが産生される。転 写および翻訳の組み合わせである。 プラスミド−−プラスミドが宿主細胞中で複製されるように無傷の”レプリコ ン”から成る非染色体性の二本鎖ＤＮＡ配列。 ベクター−−プラスミド、ウイルスＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列；それは宿主 細胞中で複製でき、一つまたは少数のエンドヌクレアーゼ制限部位により特徴付 けられ（その部位でそのようなＤＮＡは、例えば、複製、コートタンパク質の産 生またはプロモーターまたは結合部位の喪失のようなＤＮＡの必須な生物学的機 能の伴う損失を起こすことのない決定可能な様式で切断されるであろう）、およ び、例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性のような形質転換さ れた細胞の同定に使用するために適したマーカーを含んでいる。 形質転換−−遺伝子発現を可能にするような方法での細胞内へのＤＮＡまたは ＲＮＡの導入。 ストロマフリー調製液−−赤血球細胞および赤血球細胞膜断片を含んでいない 調製液。 架橋ヘモグロビン分子−−一つまたはそれ以上のそのグロビンサブユニット間 の共有結合架橋により修飾されたヘモグロビン分子。 環状に改変されたグロビン−−その天然の末端アミノ酸残基間に共有結合連鎖 を持ち、ポリペプチド鎖の別の位置に新しい末端アミノ酸残基を持つグロビン。 遺伝子架橋−−ヘモグロビンテトラマーの二つのグロビンを共有結合で連結し 、二つのグロビンおよび鎖を単一のポリペプチドとしてコードしているポリヌク レオチドの発現により形成されるアミノ酸またはポリペプチド。 天然末端−−環状改変に先だったグロビンの末端アミノ酸残基。 新末端−−環状改変後のグロビンの末端アミノ酸残基。 グロビン−−好適には高分子量凝集体を形成できるヘム含有の密なタンパク質 。 ヘモグロビン−−四つのグロビンのタンパク質。 環状に改変されたヘモグロビンマルチマー−−各々が少なくとも一つの環状に 改変されたグロビンを持っている二つまたはそれ以上のヘモグロビン分子を含む タンパク質、ここで隣接するヘモグロビン分子の環状に改変されたグロビンは一 つまたはそれ以上のアミノ酸のリンカー鎖によりお互いに共有結合で連結されて いる。 上に開示したように、本発明は少なくとも一つの環状に改変されたグロビンを 含んでいる少なくとも一つのヘモグロビン分子を持つ新規ヘムタンパク質に関し ている。これに関して、環状に改変された（ＣＰ）タンパク質は連結されたその 天然の末端、およびそのポリペプチド鎖中のいくつかの他の位置に新末端を持っ ている。それ故、環状に改変されたタンパク質は、タンパク質の環状一次配列を 作り、続いて別の部位でタンパク質を再切断することにより、または再切断され たタンパク質に対応するアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列を発現させる ことにより製造できる。生じたタンパク質は、出発タンパク質の一次アミノ酸配 列とは著しく異なった一次配列を持つ新規タンパク質である。しかしながら、命 名法を単純にする目的のため、本分野は新タンパク質を環状に改変された”出発 タンパク質”と称する慣例を採用しており、アルファまたはベータグロビンのよ うな既知のグロビンの一次アミノ酸配列の環状改変に対応する一次アミノ酸配列 を持っているペプチドを称する場合、便宜上本明細書では慣例に従うであろう。 同様に、一つまたはそれ以上の環状に改変されたグロビンを取り込んだ本発明の 四量体ヘムタンパク質はヘモグロビンと称されるであろう。 本発明は通常のヒトヘモグロビンおよび広範囲の種々の既知のヘモグロビン突 然変異体に応用できる。これに関して、通常のヒトヘモグロビンのアルファおよ びベータグロビンのアミノ酸配列が表２に提供されており、表１の略号が用いら れている。 ポリペプチド鎖のアミノ酸構造の変化を含む数百の既知のヘモグロビン突然変 異体も存在する。例えば、アルファグロビンの突然変異形（ｄｅｓ−ｖａｌ）が 以下の特別な実験に使用される。このアルファグロビンは鎖のアミノ酸１にバリ ン→メチオニン置換を持っている。他の既知のアルファ突然変異体としてアルフ ァ鎖中のアミノ酸９４アスパラギン酸→アスパラギンのようなもの（Ｈｂ Ｔｉ ｔｕｓｖｉｌｌｅ）が含まれるが、そのような変更に制限されるわけではない。 多くの既知の突然変異体ヘモグロビンはヒトベータグロビン位９０、１０２、 １０８およびそれらの組み合わせの位置にアミノ酸置換を持っている。ベータ突 然変異の特別な例は以下のものであるが、それらに制限されるわけではない： （１）アミノ酸９０グルタミン→リジン（ヘモグロビン アジェノジ） （２）アミノ酸９０グルタミン→グリシン （３）アミノ酸１０８アスパラギン→アスパラギン酸（ヘモグロビン ヨシズ カ） （４）アミノ酸１０２アスパラギン→スレオニン（ヘモグロビン カンサス） （５）アミノ酸１０２アスパラギン→セリン（ヘモグロビン ベス イスラエ ル） （６）アミノ酸９０グルタミン酸→バリン アミノ酸９１ロイシン→メチオニン アミノ酸９３システイン→セリン アミノ酸９４アスパラギン酸→グルタミン酸 Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，Ｖｏｌ１９，Ｎｏ．１−２，ｐｐ．３９−１２４，Ｍ ａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ（１９９５）からとったいくつかの追加の例示的ヘモ グロビン変異体が本明細書に付属する付録Ａ（本明細書の一部である）に示され ている。 既知の突然変異体に加え、タンパク質またはタンパク質マルチマーへ追加の望 ましい特性を加えるために他の突然変異をこれらの環状に改変されたグロビン内 へ遺伝子工学により起こすことができる。例えば、ヘムの電気的環境を変化させ る突然変異が、分子の還元された、生理学的に活性な形を安定化するため、また はリガンド親和性および選択性を変化させるために含まれるであろう。 一般的に言って、本発明においては、グロビンサブユニットの新規末端は酸素 結合、テトラマーヘムタンパク質を形成する他のグロビンとの組立において、グ ロビンの機能を削除しない部位に形成される。従って、得られるタンパク質は野 生型ヘモグロビンの問題とする機能、例えば、あるレベルでの酸素を結合する能 力を保持しているであろう（それは同一レベルかもしれないし、または野生型タ ンパク質と比較して増加または減少したレベルかもしれない）。 一般的に言って、新規末端を形成するために好適な候補位置は、アルファヘリ ックスセグメント内よりもむしろ、グロビン上の表面露出ループ領域内に存在す るであろう。このことは、ループは高度に規則正しいものではないので、タンパ ク質構造の破壊を最小にすることが期待される。アルファグロビン中に新規末端 を導入するためのより好適な領域には、ＣおよびＥヘリックス間のループ領域（ 残基４７−５１）およびＧおよびＨヘリックス間のループ領域（残基１１３−１ １７）が含まれる。ＣおよびＥヘリックス間のループ領域が最も好適である。従 って下記の実験において、新規末端は正常成人ヒトアルファグロビンの本来のセ リン４９（新Ｎ末端）および本来のロイシン４８（新Ｃ末端）に作り出された。 ヒトベータグロビンの環状改変において（例えば、表１参照）、末端はアルフ ァ鎖のように空間的に近接していないので、より長いリンカーが天然の末端の連 結に使用されるであろう。例えば、約３から５の残基のポリペプチドリンカーが 使用されるであろう。ベータ鎖は構造的にアルファ鎖と類似しているので、新規 末端の導入に好適な部位としては、一般的にアルファ鎖で選択されたものと同一 のループ領域が含まれる。これらにはヘリックスＣおよびＤ間のループ領域（残 基４６−４９）およびヘリックスＧおよびＨ間のループ領域（残基１１８−１２ ２）が含まれるが、これらに制限されるわけではない。これらの内、ヘリックス ＣおよびＤ間のループ領域が最も好適である。 本発明の環状に改変されたグロビンの新規末端は好適には、楕円形のテトラマ ーヘモグロビンに組み立てられた時にグロビンの表面に露出されている。新規末 端の選択は、通常のモデル化ソフトウェアー、例えば、アミノ酸の表面露出を確 かにするための分子モデル化ソフトウェアーを用いたＳｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐ ｈｉｃｓ Ｉｍａｇｉｎｇコンピューターによるタンパク質構造のモデル化によ り助けられるであろう。ヘモグロビン分子表面での新規末端の位置づけは、アミ ノ酸またはポリペプチドリンカーを通した他の分子への本分子の共有結合での結 合を容易にする。本発明の一つの好適な実施において、多数のヘモグロビン分子 が各々のヘモグロビン分子の環状に改変されたグロビン間を繋ぐポリペプチドリ ンカーによりお互いに共有結合で連結されているヘモグロビンマルチマーが提供 される。これに関し、このポリペプチドリンカーの長さは特定の応用に合致する ように広範囲に変わりうる；しかしながら、約１から約２０のアミノ酸を持つポ リペプチドリンカーがほとんどの応用に適しているであろうし、より共通には約 １から約１０のアミノ酸を持っている。出願者の好適な作業においては、リンカ ーへコンホメーションの自由を与えるためにポリペプチドリンカーは多くのグリ シン残基を含んでいた。加えて、分子間リンカーは溶媒に暴露されるであろうの で、親水性残基、例えば、ヒドロキシルまたは酸性基を含むアミノ酸残基（例え ば、下記の実験に報告されている特定の作業で使用されたヒドロキシル含有セリ ン）がうまく利用できる。一般的に言って、分子間リンカーでの適したアミノ酸 の選択および使用は当業者の範囲内であろう。 同様に、本発明のヘモグロビンマルチマー中のヘモグロビン分子の数は変化す るであろうが、約百までのおよびそれを超えるヘモグロビン反復単位を持つマル チマーが含まれる。再び、ほとんどの応用において、少数の反復単位、例えば、 ２から約１０の範囲のヘモグロビン反復単位が予期されている。 ヘモグロビン分子のグロビン間に分子内架橋を作り出すためには、１から約７ のアミノ酸、より好適には１から約３のアミノ酸の鎖を使用することが望ましい 。 任意の適したアミノ酸またはアミノ酸の組がこの目的に使用でき、例えば、上記 表１に同定されているアミノ酸から選択される一つまたはそれ以上のアミノ酸が 含まれる。架橋に適したアミノ酸の選択および使用は当業者の範囲内であろう。 上に議論されたようなアミノ酸架橋は遺伝子架橋として都合よく導入される。 分子内および／または分子間架橋を導入する他の様式もまた使用され、例えば、 架橋剤による化学処理が含まれているであろう。そのような架橋剤としては、グ リオキサール、アムロニックジアルデヒド、クエン酸ジアルデヒド、グルタルア ルデヒド、アジピン酸ジアルデヒド、３−メチルグルタルアルデヒド、プロピル アジピン酸ジアルデヒド、フタール酸ジアルデヒド、テレフタールアルデヒドお よびマロン酸ジアルデヒドのようなジアルデヒドが挙げられる。例えば、Ｂｏｎ ｓｅｎら、米国特許第４，００１，２００；４，００１，４０１；および４，０ ５３，５９０号；およびＢｏｎｈａｒｄら、米国特許第４，１３６，０９３およ び４，３３６，２４８号を参照されたい。 好適に架橋されたヘモグロビン分子は、天然の非架橋ヘモグロビンと比較して 高められた分子安定性を示すであろう。この安定性は、例えば、非架橋対応物と 比較すると増加したヘモグロビン分子の熱安定性（例えば、融点）により示され るであろう。 本発明はまたヒトアルファまたはベータグロビンのような環状に改変されたグ ロビンをコードしている単離されたポリヌクレオチド、好適にはＤＮＡ配列、に 関している。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、近い将来のグロビン遺伝 子の環状改変に対応する所望の配列を持っているポリヌクレオチドの化学合成に より作製することができる。本発明のそのようなポリヌクレオチドはまた、問題 とするグロビンコード配列の末端を直接またはアミノ酸リンカーのための塩基配 列コーディングを通して結合し、続いて生じた環化配列を切断して環状に改変さ れた配列を生じることによっても製造できる。環状に改変された配列を作製する ための遺伝子操作が、本発明に従った環状に改変されたグロビンおよびそれらを 含んだ構築物をコードする多くの種類のポリヌクレオチドを形成する過度の実験 を行うことなく応用できる。 本発明の好適な態様は、順に：（ｉ）第一の、環状に改変されたグロビンの第 一の部分；（ｉｉ）第一の遺伝子架橋；（ｉｉｉ）第二の、全グロビン；（ｉｖ ）第二の遺伝子架橋；および（ｖ）環状に改変されたグロビンの第二の部分（こ こで第一および第二の部分は一緒になって全環状に改変されたグロビンを構成す る）、を含んでいる単一のポリペプチドをコードしているＤＮＡまたはＲＮＡ配 列（好適にはＤＮＡ配列）のようなポリヌクレオチドを提供する。コードされた ポリペプチドもまた本発明の一部であり、一般的に言って、第二の環状に改変さ れていないアルファグロビンのアミノ酸配列を含んでいる連結ポリペプチドが結 合した、本来のＮ−およびＣ−末端を持っている第一の環状に改変されたグロビ ンを含んでいる。より好適には、そのような構築物の第一および第二のグロビン はアルファグロビンであり、および第一および第二の遺伝子架橋（環状に改変さ れたグロビンのＮ−およびＣ−末端および環状に改変されていないグロビンのＮ −およびＣ−末端間に存在するペプチド配列）は１から約３のアミノ酸を持って いるであろう。 本発明の実施に使用するためのＤＮＡまたは他のポリヌクレオチドは手作業ま たは自動化装置により合成的に作製される。本発明のポリヌクレオチド配列の合 成的作製手段は当業者には一般的に知られている（特に本明細書に含まれている 教えを考慮して）。ポリヌクレオチド合成のさらなる詳細は、例えば、Ｍａｎｉ ａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ（１９８４）およびＨｏｒｖａｔｈら、Ａｎ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｄｅｏｘｙｎｕｃｒｅｏｓｉｄ ｅ ３’−Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ ｙｍｏｌｏｇｙ １５４：３１３−３２６，１９８７）（両方とも本明細書にお いて援用される）を含む本主題に関する標準的教科書を参照できる。さらには、 本発明のポリヌクレオチド配列は天然に存在するポリヌクレオチドの単離および 修飾により構築されるであろう。例えば、出発グロビンポリヌクレオチドは、ゲ ノムまたはｃＤＮＡライブラリーから単離された制限断片でもよい。出発ポリヌ クレオチドは続いて既知の技術を用いて操作でき、一般的に前に説明したような 環状に改変されたグロビンをコードする本発明のポリヌクレオチドが製造される 。 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現またはクローニング ベクター（例えば、プラスミドベクターおよびウイルスベクターを含む）を提供 する。発現またはクローニングベクターの必須および望まれる成分部分の合成お よび／または単離、およびそれらの組み立ては当業者の能力で可能であり、およ びそれ自体は過度に試行することなく実施できる。 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含み、本ポリヌクレオチドを発現 する宿主細胞にも関している。そのような宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチ ドを運んでいる適したベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター） で細胞を形質転換することにより作製できる。本発明のポリヌクレオチドはまた 、他の既知の技術（例えば、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレー ションなどが含まれる）を用いて細胞内へ導入できる。 宿主細胞は、効率よくヘモグロビンを発現する種々の宿主細胞から選択でき、 例えば、ヒト、マウスまたはブタのような哺乳類細胞、大腸菌、バシラスまたは サルモネラのようなグラム陽性または陰性細菌細胞、サッカロミセス セレビジ エまたはサッカロミセス ポムベのような酵母細胞、または昆虫細胞が含まれる 。 さらに、本発明のポリヌクレオチドを発現する宿主細胞は本発明の環状に改変さ れたグロビンを高収率で産生するように培養できる。グロビンは個々に単離でき 、またはより好適には、環状に改変されたグロビンは宿主細胞において、少なく とも一つの組み立てられたヘモグロビンテトラマーを含む酸素結合ヘムタンパク 質を生成するのに必要な他のグロビンと細胞中で共発現される。従って、例えば 、下記の実験の部において、ジ−アルファまたはテトラ−アルファグロビン構築 物は宿主細胞においてベータグロビンと共発現され、相当する組み立てられたヘ モグロビンテトラマーまたはオクタマーは細胞から高収率で単離された。これに 関し、培養宿主細胞からの本発明のタンパク質の単離および精製は、濾過、遠心 分離およびクロマトグラフィーなどのような通常の技術を用いて達成できる。本 発明のヘムタンパク質の実質的に精製された調製試料がそれらにより製造できる 。 本発明のヘムタンパク質は血液およびヘモグロビン代用物として有用な特性を 示している。例えば、実験の部に開示されているテトラマーのおよびオクタマー のヘムタンパク質は、従来知られているヘモグロビンに基づいた血液代用物と比 較して、熱変性に対して高められた安定性を示している。また、リガンド結合実 験は、これらのタンパク質が野生型ヘモグロビンのリガンド結合特性（酸素結合 、一対の再結合およびＣＯ結合速度を含む）を持っていることを示した。 使用するため、必要に応じてヘムタンパク質は医薬として受容可能な担体内へ 取り込ませることができ、医薬組成物を形成させる。無菌の液体担体（特に水性 担体）、リポソームまたは他のポリマー化およびカプセル化ポリマーが好適であ ろう（例えば、平衡化電解質および緩衝化溶液）。ヘムタンパク質は望ましくは 約１から約２０％の濃度であるが、用いられる正確な濃度は各々の応用に依存す る。ヘモグロビンはまた、コロイド（血漿、アルブミン）またはクリスタロイド （食塩、グルコース、デキストラン、ゼラチン、ヘマゾール^*または乳酸加リン ゲル液）のような既知の血漿増量剤に溶解するか、または天然の赤血球細胞また はリポソームのような人工赤血球細胞に含ませる。 このようにして調製された医薬製剤は続いてヒトまたは他の動物患者に、例え ば、注射またはカテーテル法などにより便利に投与できる。これらの目的に便利 なように、医薬製剤はバイアル、注射器または点滴バックのような無菌の医用容 器中に包含させることができる。 本発明の酸素結合ヘムタンパク質は、ストロマフリーヘモグロビン型血液置換 、または例えば、心筋梗塞、卒中、糖尿病のような細血管疾患を含む組織への危 うくなった酸素送達に付随する疾患状態における酸素供給を改良するために使用 されるであろう。本発明のヘムタンパク質はさらに、組織への酸素供給を増加さ せるためにも使用できる（例えば、腫瘍細胞または物理的または化学的手段によ る損傷のために低酸素性細胞を持つ他の組織、例えば、火傷、化学薬品への暴露 、物理的障害またはイオン化放射線）。一つの特別な応用において、本発明のヘ ムタンパク質は、治療の効率を良くするために、放射線治療にかけられるべき低 酸素性腫瘍細胞への酸素供給を増加させるために使用される（例えば、米国特許 第５，２９５，９４４号を参照されたい）。多くの腫瘍は酸素不均一性（低酸素 の領域を含んでいる）を示し、それはイオン化放射線の細胞毒性作用に対して腫 瘍細胞を保護している。例としては、肉腫、癌腫およびリンパ腫のような充実性 腫瘍、および腫瘍細胞の腫瘤がある分散腫瘍細胞のいくつかの場合（そこから酸 素不均一性の領域を生み出すことができる、例えば、進行白血病）が挙げられる 。そのような場合、腫瘍組織への酸素供給の増加は、組織に対する放射線治療の 効果を促進できる。 腫瘍部位への酸素輸送を増加させるため、本発明のヘム結合タンパク質を含ん でいる製剤が患者へ投与できる（例えば、静脈内に）。次に、化学療法剤が投与 できるが、ヘムタンパク質製剤および化学療法剤投与の間隔は、ヘムタンパク質 が宿主の循環系に完全に取り込まれるのにかかる時間、本製剤の寿命などのよう な因子に依存している。また、患者にイオン化放射線を与えるのに先だっておよ び後に、酸素を濃縮したガスを呼吸させてもよい。このことは、患者に酸素を濃 縮した空気、１００％酸素またはカルボゲン（９５％酸素／５％ＣＯ₂）を吸わ せるか、または患者を高圧酸素条件に曝すことにより実施できる。 抗腫瘍効果を持つ任意の型のイオン化放射線を用いることができ、例としては Ｘ−線、ガンマ線、高エネルギー電子およびプロトン、中性子およびアルファ粒 子のような高ＬＥＴ放射線が挙げられる。そのようなイオン化放射線は当業者に はよく知られた技術を用いて照射することができる。例えば、Ｘ−線およびガン マ線はライナックまたは放射線源から外部的および／または細胞間腔的手段によ り照射される。高エネルギー電子はライナックにより照射できる。高ＬＥＴ放射 線もまたライナックにより照射できるし、また細胞間腔に移植した放射線源から も照射できる。イオン化放射線の線量は一般的には腫瘍の放射線治療処置で通常 用いられる線量であるが、ある場合には、酸素結合ヘムタンパク質の使用がイオ ン化放射線の必要線量を低減するであろう。 別の分野においては、本発明のヘムタンパク質が低用量で血流量の増加が望ま れる場合に使用できる。例えば、出血性、心臓性または敗血性起源のショックの ような異常に低いレベルから血圧を増加させるため、または例えば卒中治療にお けるように、通常レベルから血圧を増加させて改良された血流量を達成するため にヘムタンパク質が投与されるであろう。本発明のヘムタンパク質はまた酸素セ ンサーとしても使用されるであろう。 加えて、本発明のヘムタンパク質はそれから伸びた表面露出末端アミノ酸また はポリペプチドを通して他の分子へ結合され（例えば、共有結合で）、本発明に 従った付加的材料を形成してもよい。例えば、一つの態様において、本発明のヘ ムタンパク質は他の分子と複合体化できて、他の分子と比較して血管保持時間が 増加した活性複合体（conjugate）を形成し、従って、他の分子の血管保持時間 を効果的に調節（増加）する。一つの様式では、本複合体は本発明のヘムタンパ ク質と他の分子を遺伝子的に連結することにより製造できる。従って、ヘムタン パク質および他の分子の両方をコードしているポリヌクレオチドが構築でき、発 現のために適した宿主内へ導入される。ＤＮＡの発現は複合体を提供するであろ う。 表面に露出した末端を持つ本発明のヘムタンパク質はこれらの目的に特に都合が よいであろう。末端は表面に露出され、ヘムタンパク質の構造に組み込まれてい ないため、他の分子との結合がヘムタンパク質の構造を有意に破壊せずにその機 能が保存されるであろうし、また、結合された分子がヘムタンパク質内へ埋め込 まれずに溶液中に残されることを可能にするであろう。本発明のヘムタンパク質 と複合体を形成させた場合に増加した保持時間から恩恵が期待されるであろう現 在使用されている治療ペプチドが多数存在し、例えば、インシュリン、エリスロ ポエチンおよびソマトトロピンのような成長ホルモンが含まれている。例えばエ リスロポエチンの場合、エリスロポエチン（体内において赤血球細胞生成を促進 するホルモン）と遺伝子的に結合された本発明のヘムタンパク質の投与は、血液 代用物が分解されおよび血流により濾過される前に、患者の赤血球細胞供給を補 充するために使用されるであろう。 本発明のヘムタンパク質はまた体外で有機分子およびＤＮＡなどのような非ペ プチドへ結合できる。本発明のヘムタンパク質上のリジンへ架橋剤を作用させて 、他の分子への架橋のためにタンパク質上に独特の反応性部位を提供するような （他の分子は既知の化学を使用して組み入れることができる）、タンパク質上の 特定の化学基へ化合物を共有結合で連結する多くの方法が知られている。実例と なる取り付け化学は、例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８３）”Ｐｒ ｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅ ｒｔｉｅｓ ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＷ．Ｄ．Ｄ ａｎｄｌｉｋｅｒ ａｎｄ Ａ．Ｊ．Ｐｏｒｔｍａｎ（１９７１）”Ｅｘｃｉｔ ｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ ｉｄｓ ”，Ｒ．Ｆ．Ｓｔｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｉ．Ｗｅｉｎｒｙｂ ｅｄｓ．， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１９９−２７６に記載さ れている。 本発明のヘムタンパク質はまた、医薬として活性な化合物へ特異的に１：１の 化学量論で結合させることができ、それはヘムタンパク質の構造的完全さに対し て有害な影響を与えることなく達成できるであろうことが期待される。本発明の タンパク質はまた、抗体のようなターゲッティング試薬に結合されてもよく、ま たはＭＲＩイメージング剤自身としても都合よく使用できるし、または他のイメ ージング（例えば、ＭＲＩまたはＸ−線）または治療剤へも結合できる。 本発明（その原理およびその利点）の理解をさらに深めるため、以下の実験が 提供される。この実験は例示であり、本発明を制限するものではないことを理解 されたい。実験 使用された大腸菌株およびプラスミドベクター 大腸菌株ＤＨ５ａが以下に説明したすべての遺伝子工学実験および遺伝子構築 物のタンパク質発現に使用された。遺伝子構築に使用されたプラスミドｐＨＳ４ ７１およびｐＷＨＳ４８６はＨｅｒｎａｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１ ：８６１９−２８（１９９２））により発生されている。ｐＵＣ１８はＮｅｗＥ ｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから市販品として入手可能なプラスミドである。遺伝子工学のためのＤＮＡカセットの作製 ほとんどの遺伝子操作は、所望のコード化領域を含む一対の相補的オリゴヌク レオチドの発生を伴うカセット突然変異誘発を利用した。すべてのオリゴヌクレ オチドはイリノイ大学の遺伝子工学施設により合成的に製造されおよびそこから 購入された。各々のオリゴヌクレオチドの４００ピコモルが、５０ｍＭトリス− ＨＣｌ、ｐＨ７．６／１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂／５ｍＭ ＤＴＴ／１００μＭＥＤ ＴＡを含んでいる１００μＬの反応液中、３７℃にて６０分、１０単位のＴ４ポ リヌクレオチドキナーゼでリン酸化された。リン酸化後、９５℃で５分間混合お よび加熱し、３−４時間以上かけて室温まで徐々に冷却させることにより相補的 オリゴヌクレオチドをアニール化した。生じた断片は制限部位に対する付着末端 を持っており、遺伝子断片またはプラスミドベクターへの連結を可能にしている 。本明細書の目的のためおよび本分野で一般的に理解されているように、”カセ ット”とは上記のような様式で製造された一対の相補的オリゴヌクレオチドを指 している。プラスミドミニ調製 すべてのプラスミド単離は、問題とするプラスミドを含んでいる大腸菌をＬＢ 培地（リットル当たり１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物、５ｇのＮａＣｌ ）で一夜増殖させた培養物５ｍＬから行われた。市販品として入手可能なＱｉａ ｇｅｎ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット がＤＮＡの精製に使用された。Ｑｉａｇｅｎキットは高収率でＲＮＡを含まな いプラスミドが得られる。ＤＮＡは２５μＬの水に溶出された。制限切断 すべての制限切断は３７℃で実施された。各々の切断に１−１０単位の酵素が 使用され、反応は１０μＬの最終容量で行われた。酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎ ｄ Ｂｉｏ−ＬａｂｓまたはＧＩＢＣＯ ＢＲＬから購入された。使用された緩 衝液系は酵素と一緒に供給された。ＤＮＡ断片単離および精製 続いての結合反応に使用された制限酵素切断ＤＮＡ断片は、１０μｇ／ｍＬの エチジウムブロミドを含む１％アガロースゲル上、１３０Ｖで約１時間分離され た。選択されたＤＮＡバンドをかみそりの刃で切り取り、得られたＤＮＡはＢｉ ｏＬａｂ１０１からのＧｅｎｅＣｌｅａｎ ＩＩキットを用いてゲル断片から単 離された。ＤＮＡ結合 ＧｅｎｅＣｌｅａｎから得られたプラスミド断片およびオリゴヌクレオチドは ２０μＬの最終反応液容量中、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＧＩＢＣＯ Ｂ ＲＬ）で結合された。ベクターと断片／カセット挿入物比は１：３から１：５０ の間で変化した。結合反応は室温で１時間または１６℃で一夜行われた。コンピテント細胞および形質転換 大腸菌ＤＨ５ａはＬＢ培地の５ｍＬ−夜培養で増殖させた。５００μＬの一夜 培養液を５０ｍＬのＬＢへ接種した。細胞は３−４時間増殖させ、５０００ｇで ５分間遠心した。細胞は２５ｍＬの冷０．１Ｍ ＣａＣｌ₂に再懸濁した。氷上 で２０分インキュベートした後、細胞を同一条件で再び遠心した。ペレットは次 に４ｍＬの冷ＣａＣｌ₂に再懸濁した。 コンピテント大腸菌は結合反応が終了したまたはミニ調製ＤＮＡで形質転換さ れた。結合反応混合物または０．５μｇのミニ調製ＤＮＡを２０μＬのコンピ テント細胞と混合し、氷上で２０分間インキュベートした。細胞に３７℃で２分 間の熱ショックを与え、すぐに氷上に５分間置いた。１ｍＬのＬＢ培地を加え、 アンピシリン耐性を生み出すために細胞を３７℃で１時間インキュベートした。 ２０μＬの細胞を、アガロース（１５ｇ／Ｌ）およびアンピシリン（０．２ｇ／ Ｌ）を含むＬＢプレート上に置いた。残りの細胞混合物は遠心分離し、上清の一 部を除去し、ペレット化した細胞は再懸濁して同様にプレートに播いた。ＤＮＡシークエンシング 遺伝子シークエンシングはＰＣＲ増幅を用いるＰｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ Ｄ ＮＡシークエンサーを用いてイリノイ大学ＤＮＡシークエンシング施設で行われ た。シークエンシング反応は蛍光標識ジデオキシヌクレオチドで停止された。ｐ ＵＣシークエンシングのためのユニバーサルおよびリバースプライマーが反応を 開始させた。ジーアルファグロビン遺伝子の構築 アルファｄｅｓ−ｖａｌ遺伝子（ｐＨＳ４７１）が二つのグロビン遺伝子配列 の縦列様式の作製に使用された。ｐＨＳ４７１をＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断 して第一のアルファグロビンの大多数を含んでいるベクターが得られた。次に、 アルファ遺伝子断片をＳａｃＩおよびＰｓｔＩのよるｐＨＳ４７１の切断で発生 させた。この断片は、ＳａｌＩ制限部位で始まる第一のアルファ遺伝子の最後の 部分、グリシンコドンおよびＳａｃＩ制限部位で終わる第二のアルファ遺伝子の 最初の部分をコードしている連結カセットと一緒にベクター内へ結合させてｐＳ Ｓ１を発生させた。この結合方法の図式は図１に示されている。ｐＳＳ１中の連 結カセットおよびジ−アルファ遺伝子のＤＮＡ配列は各々図２および３に示され ている。 構築物の配列は確認された。連結領域はジアルファベクターをＢａｍＨＩによ り切断し、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ部位内へサブクローニングすることによりサ ブ−クローン化された。生じたプラスミドはイリノイ大学シークエンシング施設 で配列決定された。環状に改変されたジーアルファ遺伝子の構築 前記のように作製されたｐＳＳ１は、環状に改変されたジ−アルファグロビン 遺伝子の発生に利用された。合成には二つの結合工程および二つのカセットが必 要であった。カセットＣＰ１およびＣＰ２の配列が図４に示されている。第一の 工程において、カセットＣＰ１およびｐＳＳ１のＭｌｕＩ／ＢａｍＨＩ切断によ り発生した４００塩基対断片を、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＨＳ４ ７１内へ連結させてｐＳＬＳ２１を発生させた（図５）。次に、カセットＣＰ２ およびｐＳＳ１のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ切断により発生した４００塩基対断片を 、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断したｐＳＳ２１内へ連結させてｐＳＬＳ２２ を発生させた（図６）。 ｐＳＳ２１のＤＮＡ配列はイリノイ大学シークエンシング施設での順および逆 方向での両方のシークエンシングにより確認された。対応するアミノ酸とともに 配列が図７に示されている。 単一のｌａｃプロモーター制御下の、環状に改変されたジ−アルファおよびｄ ａｓＶａｌベータグロビン遺伝子両方から成る単一のオペロンが作製された。Ｘ ｂａＩおよびＰｓｔＩでのｐＳＬＳ２２の切断により単離された環状に改変され たジ−アルファグロビン遺伝子、およびＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでのｐＷ ＨＳ４８６の切断により単離されたベータグロビン遺伝子が、ＸｂａＩおよびＨ ｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＵＣ１８内へ連結され、ｐＳＬＳ２３が発生した（ 図８）。テトラ−アルファ遺伝子融合物の構築 二つの環状に改変されたジ−アルファ遺伝子が連結領域で融合されテトラ−ア ルファ遺伝子が作製された。この構築物がベータグロビン遺伝子とともに発現さ れた場合、一つのテトラ−アルファグロビンおよび四つのベータグロビン遺伝子 から成る機能的なオクタマーグロビンが形成される。三つの連結工程および二つ のカセットがテトラ−アルファ、ベータグロビン遺伝子オペロンの作製に必要と された。構築物に使用されたカセットＴＡ１およびＴＡ２は図９に示されている 。 第一に、ｐＳＬＳ２２のＳｔｙＩ／ＢａｍＨＩ断片およびカセットＴＡＩを、ｐ ＳＬＳ２２のＳｔｙＩ部位を破壊するためにＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断さ れたｐＳＬＳ２２内へ結合させて、ｐＳＬＳ２４を発生させた（図１０）。第二 に、ｐＳＬＳ２２の４００塩基対ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片およびカセットＴＡ ２を、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断されたｐＳＬＳ２４内へ結合させてｐＳ ＬＳ２５を発生させた（図１１）。最後に、ｐＳＬＳ２５のＸｂａＩ／ＳｔｙＩ 断片、ｐＳＬＳ２２のＳｔｙＩ／ＰｓｔＩ断片、およびｐＷＨＳ４８６のｐｓｔ Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＵＣ １８内へ結合させてｐＳＬＳ２６を発生させた（図１２）。シークエンシングに より確認されたＤＮＡ配列が図１３に示されている。この構築物の遺伝子産物は 以後オクタマー環状に改変されたヘモグロビンと称される。より高次の環状に改変されたアルファ遺伝子融合物の構築 六つが融合したアルファ鎖遺伝子を発生させるため、二つの連結工程が部分切 断とならんで必要とされる。第一に、ｐＳＬＳ２６をＰｓｔＩで完全に切断する 。生じた直線状ＤＮＡベクターは次に非理想的緩衝液中で１５分、３単位の酵素 を用いたＢａｍＨＩによる部分切断が行われる。この反応からの１３５０ｂ．ｐ ．断片が単離され、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断されたｐＳＬＳ２２内へ連 結されてｐＳＬＳ２７が発生する（図１４）。次にｐＳＬＳ２７をＰｓｔＩで完 全に切断し、前記の部分切断と同様な様式でＳｔｙＩで部分切断する。この反応 からの１５００ｂ．ｐ．断片が、ＳｔｙＩおよびＰｓｔＩで切断されたｐＳＬＳ ２６内へ連結されてｐＳＬＳ２８が発生する（図１５）。同様の方法で、任意の 数の高次アルファ遺伝子融合物が、ｐＳＬＳ２７のＳｔｙＩ部分的およびＰｓｔ Ｉ切断からの環状に改変されたジアルファセグメントの連続的連結により作製で き、次第により大きなアルファ融合構築物となる。遺伝子工学処理された、新規ヘムタンパク質の発現 プラスミドｐＳＬＳ２３およびｐＳＬＳ２６がコンピテント大腸菌ＤＨ５細胞 内へ形質転換された。培養物は、６Ｌの振盪フラスコ中、３７℃にて、２００μ ｇ／ｍＬアンピシリンおよび０．５ｍＭ ｄ−アミノレブリン酸を含んでいる１ Ｌの２ＸＹＴ培地（１６ｇトリプトン、１０ｇ酵母抽出物および５ｇのＮａＣｌ ／Ｌ）で増殖させた。３６−４８時間後、８０００ｇで５分間の遠心分離により 細胞を採取し、細胞ペーストを取り出して−７０℃で凍結保存した。全細胞ＣＯ差スペクトル タンパク質発現をアッセイするため、タンパク質精製の前に大腸菌細胞培養物 の一酸化炭素（ＣＯ）差スペクトルが測定された。細胞は上記タンパク質発現で 説明された条件にて静止期まで増殖させた。３−５ｍＬの培養液に数粒のジチオ ナイトを添加し、ベースラインが記録された。次にＣＯを培養液に吹き込み、Ｃ ａｒｙ１３分光光度計でスペクトルを記録した。タンパク質の単離および精製 細胞ペーストはＣＯ雰囲気下で放置して融解させ、溶菌および精製の間に使用 されるすべての緩衝液はＣＯで飽和させた。融解細胞は５倍の（ｗ／ｖ）１０ｍ Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁した。細胞はＳｔ ａｎｓｔｅｄ ＡＯ−１１６細胞破壊機を通すことにより溶菌させた。細胞溶菌 後、８０単位／ｍＬのＤＮａｓｅおよび８単位／ｍＬのＲＮａｓｅを混合物に加 え、室温で１時間インキュベートした。次に混合物をＢｅｃｋｍａｎ Ｌ８−Ｍ 超遠心機中、１００，０００ｇで遠心分離した。上清を残し、２０ｍＭ ＮａＨ₂ ＰＯ₄で６．０にｐＨを調整した。上清は続いて、１０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐ Ｈ６．０、１ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化したカルボキシメチルセルロースカラム（ Ｗｈａｔｍａｎ）に加えた。カラムを４カラム容量の１０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、 ｐＨ６．０、１ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄し、最終的に２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐ Ｈ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡまでの段階的濃度勾配で溶出させた。タンパク質を 集め、ＰＭ−３０アミコン膜を使用して窒素圧で濃縮した。濃縮タンパク質は液 体窒素中でただちに凍結し、使用するまで−７０℃で保存した。質量分析 精製タンパク質試料は、タンパク質を水中へ交換させるためセファデックスＧ −２５カラムにかけた。イリノイ大学質量分析施設でタンパク質のエレクトロス プレー質量分析が行われた。試料は、実験のために０．１％ギ酸を含んでいる５ ０：５０アセトニトリル：水溶液に１０ｐｍｏｌ／μＬの濃度まで希釈された。 環状に改変されたヘモグロビン（ＣｐＨｂ）およびオクタマーの環状に改変さ れたヘモグロビン（ＯＨｂ）の実験的に測定された質量が計算値と比較された。 各々のタンパク質のベータグロビンは１５９００±２ダルトンであることが測定 された。この値は、１５９０１．４ダルトンの計算値とよく一致している。各々 のタンパク質の環状に改変されたアルファグロビン構築物は以下に掲げられてい る。しかしながら、計算値は最初のメチオニン残基の切断で期待されるある。値 はよく一致しており、本タンパク質が細菌宿主においては、最初のメチオニン切 断を除いて翻訳後修飾されないことを示している。 計算値 測定値 ＣｐＨｂ ジ−α ３０３５１．６Ｄａ ３０３５２．６±３．９Ｄａ ＯＨｂ テトラ−α ６０９４３．６Ｄａ ６０９４０．４±９．２ＤａＵＶ−Ｖｉｓ分光法 タンパク質は数粒のジチオナイトを添加することにより還元され、空気飽和水 へ交換された。酸素結合スペクトルがＨｉｔａｃｈｉ Ｕ−３３００分光光度計 で測定された。次に、試料に数粒のジチオナイトを添加して、デオキシスペクト ルがセプタムで封じたキュベットを用いて測定された。最後に、試料に１５秒間 ＣＯを穏やかに通気することによりＣＯ結合型を発生させ、スペクトルが記録さ れた。 環状に改変されたヘモグロビン（ＣｐＨｂ）およびオクタマーの環状に改変さ れたヘモグロビン（ＯＨｂ）のスペクトルは天然のヘモグロビンのスペクトルと ほぼ同一であった。各々の結合状態の吸収極大が以下に掲げられている（ｎＭ） 。 ＳＩＳ−ＰＡＧＥ 精製タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動が実施された。各々の タンパク質試料は１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ ．５％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノールおよび０．００１％ブロムフェノ ールブルー中で５分間煮沸された。２μＬの試料を１０−１５％濃度勾配ゲル（ Ｐｈａｍａｃｉａ）上に加えた。ゲルはＰｈａｒｍａｃｉａ ＰｈａｓｔＳｙｓ ｔｅｍを使用し、２５０ボルト、１０．０ｍＡ、３．０ワットで総計６０ボルト 時間、１５℃にて泳動された。ゲルはＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ発色チャンバー中 、ファーストクーマシー染色技術を用いて発色された。酸素平衡測定 自家製ヘムオックス分析器（Ｒｏｎ Ｈｅｒｎａｎ、博士論文、Ｕｎｉｖｅｒ ｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ａｔ Ｕｒｂａｎａ Ｃｈａｍｐａｉｇｎ ，１９９４）で測定された酸素平衡測定は図１７に示されている。０．１Ｍ［Ｃ ｌ^-］を含むｐＨ７．４の０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液中で天然のヘモグロ ビン、環状に改変されたヘモグロビン（ＣｐＨｂ）およびオクタマーの環状に改 変されたヘモグロビン（ＯＨｂ）の平衡結合曲線が各々６０μＭ、５μＭおよび ５μＭ［ヘム］で測定された。Ｐ₅₀値およびｎ_max値が各々のタンパク質に対し て計算された。ボーア効果は、０．１Ｍ［Ｃｌ^-］を含む０．０５Ｍビストリス および０．１Ｍ［Ｃｌ^-］を含む０．０５Ｍトリス−ＨＣｌを用いて、各々ｐＨ ６．５および８．５、各々のタンパク質に対するｐ₅₀値を測定することにより決 定された。最 後に、アロステリックエフェクターに対する各々のタンパク質の応答が０．１ｍ Ｍ ＩＨＰを加えて測定された。タンパク質間の比較が下に掲げられており、環 状に改変されたヘモグロビンは協調して酸素を結合すること（ｎ_max＝２）およ びそれらは天然のヘモグロビンと同様の様式でアロステリックエフェクター（プ ロトンおよびＩＨＰ）に応答することを示している。 血漿寿命測定 環状に改変されたヘモグロビンの血管内寿命が測定され、細胞フリーＨｂＡの 寿命と比較された。ＨｂＡは前に記載されているように（Ｒｏｎ Ｈｅｒｎａｎ 、博士論文、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ａｔ Ｕｒｂａ ｎａ Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，１９９４）新しく採血した血液の精製により得られ た。体重が１５０から２００ｇの若い成人Ｓｐａｕｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット が実験に使用された。タンパク質試料はセファデックスＧ−２５カラムを用いて 、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＮａＰＯ₄から成るｐＨ７ ．４の緩衝液内へ交換した。試料は次に約１．５ｍＭヘムまで濃縮した。この溶 液の１ｍＬを濾過滅菌し、手術用に置かれた頚静脈カテーテルを通して各々のラ ットに注入した。ベースラインとして５分に、およびつぎつぎの時間間隔で、同 一のカテーテルから２００μＬの血液試料を抜き取った。遠心分離により赤血球 から血漿を分離し、ヘモグロビン含量がＳｉｇｍａからの血漿ヘモグロビン診断 キットにより決定された。測定値は５分での値へ規格化され、各々のタンパク質 に対し て３匹の異なったラットにおける３回の実験が平均された。データの指数関数適 合が図１８に示されており、ＨｂＡおよび環状に改変されたヘモグロビンに対し て各々３０および９０分であるとＴ_1/2が計算された。 付録 アルファ鎖の改変体 ベータ鎖の改変体 ガンマ鎖の改変体 ^A γ鎖の改変体 ^A γ^T鎖の改変体 その他 デルタ鎖の改変体

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/14 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 少なくとも一つの環状に改変されたグロビンを含んでいるヘモグロビ ンから成るヘムタンパク質。 ２． 酸素結合ヘモグロビンマルチマーである請求項第１項に記載のタンパ ク質。 ３． ヘモグロビンマルチマーは、各々がお互いに約３から約７のアミノ酸 を持つポリペプチドにより共有結合で連結されている架橋ヘモグロビン分子から 成る請求項第２項に記載のタンパク質。 ４． 各々のヘモグロビン分子が架橋されたヘモグロビンである請求項第３ 項に記載のタンパク質。 ５． 架橋されたヘモグロビンが二つの遺伝子的架橋を含んでいる請求項第 ４項に記載のタンパク質。 ６． 二つのヘモグロビン分子を含んでいる請求項第５項に記載のタンパク 質。 ７． 二つのベータグロビンおよびジ−アルファグロビン構築物を含んでい る少なくとも一つのヘモグロビン分子から成る酸素結合ヘムタンパク質であり、 ここで該ジ−アルファグロビン構築物は、二つの遺伝子的架橋により別のアルフ ァグロビンに結合された環状に改変されたアルファグロビンを持っている単一の ポリペプチドを含んでいる、前記タンパク質。 ８． 各々が環状に改変されたアルファグロビンの末端を共有結合で結合し ているポリペプチドリンカーによりお互いに結合されている二つまたはそれ以上 の該ヘモグロビン分子から成る請求項第７項に記載のタンパク質。 ９． ポリペプチドリンカーが約３から約７のアミノ酸を持つ請求項第８項 に記載のタンパク質。 １０． 遺伝子的架橋が１から約７のアミノ酸を持つ請求項第９項に記載のタ ンパク質。 １１． 環状に改変されたアルファグロビンがループ領域に存在する末端を持 つ請求項第７項に記載のタンパク質。 １２． 環状に改変されたグロビンをコードしているポリヌクレオチド。 １３． グロビンがアルファグロビンである請求項第１２項に記載のポリヌク レオチド。 １４． ＤＮＡ配列である請求項第１２項に記載のポリヌクレオチド。 １５． 二つの遺伝子的架橋により別のアルファグロビンに結合されている環 状に改変されたアルファグロビンを持っている単一のポリペプチドをコードして いるＤＮＡ配列である請求項第１４項に記載のポリヌクレオチド。 １６． 第一の、環状に改変されたアルファグロビンの第一の部分； 第一の遺伝子的架橋； 第二のアルファグロビン； 第二の遺伝子的架橋；および 環状に改変されたアルファグロビンの第二の部分、ここで第一および 第二の部分は一緒になって全環状に改変されたアルファグロビンを構築する； を連続的にコードしているＤＮＡ配列を含む請求項第１５項に記載のポリヌクレ オチド。 １７． 別のアルファおよび二つのベータグロビンと一緒に組み立てられて酸 素運搬ヘムタンパク質を形成する、環状に改変されたアルファグロビン。 １８． 請求項第１７項の環状に改変されたアルファグロビンをコードしてい る単離されたＤＮＡ配列。 １９． 請求項第１２または１８項のポリヌクレオチド配列を含むベクター。 ２０． 請求項第１２または１８項のＤＮＡ配列を含んでいるおよび発現する 宿主細胞。 ２１． 請求項第２０項の宿主細胞を培養することを含む、酸素結合ヘムタン パク質の製造法。 ２２． 温血動物に治療的に有効量の、酸素を結合する請求項第１項のヘムタ ンパク質を投与することを含む、温血動物における組織酸素供給を増加させる方 法。 ２３． 温血動物に有効量の、酸素を結合する請求項第１項のヘムタンパク質 を投与することを含む、温血動物における血流中のヘモグロビンを置き換える方 法。 ２４． 温血動物の血流に有効量の、酸素を結合する請求項第１項のヘムタン パク質を導入することを含む、温血動物において血管収縮を誘導する方法。 ２５． 単離された器官または組織を酸素を結合する請求項第１項のヘムタン パク質と接触させることを含む、単離された器官または組織の酸素供給を増加さ せる方法。 ２６． 医薬として受容可能な担体に取り込まれた、酸素を結合する請求項第 １項のヘムタンパク質を含む医薬製剤。