JPS61215329A - 血液代用物および血漿増量剤として使用する製剤並びにその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血液代用物および血漿増量剤として使用しう
る優れたヘモグロビン製剤およびその製造方法に関する
。

（従来の技術） 医療分野において、血液代用物や血漿増量剤に対する要
望は極めて高い、これが必要になるのは。

血液銀行における供与血液が不足しているためと、血液
供与銀行が共通にかかえている問題が余りにも多いため
である。例えば、通常、［エイズ」と呼ばれている後天
性免疫不全症候群とか、肝炎という病気に対する感染の
危険を一杯はらんでいる。

また、全血の貯蔵期間は、可成り短かく、普通。

３０日以上長持ちすることはない、そのほか、保存血液
との血液型などに対する不可欠の問題もある。

そのため、大分前から提案されているが、古くなった血
液のヘモグロビンをベースにしてつくられる血液代用品
とか、血漿増量剤に対する要望が、強く叫ばれている。

本発明は、第一義的に、このような要望に応えることを
目的としている。

現在、研究されている血液代用物および血漿増量剤に対
し、２つの実現可能な手段がある。その第１は、フルオ
ロカーボンであり、第２は、変性ヘモグロビンである。

変性ポリヘモグロビンに関しては、米国特許第４，００
１，４０１号明細書に開示されている。フルオロカーボ
ンに関しても、現在、活溌な研究が行なわれている。

しかし、フルオロカーボンを、血液代用物とか、血漿増
量剤として市場へ出すのは無理であると信じられている
。その理由は、フルオロカーボンが、時々、自然免疫系
をブロックすることが知られているからである。それに
、フルオロカーボンを使用できるのは、酸素の高い分圧
を施すことができるような状況に限られている。それら
は、通常の環境条件で使用するのに十分高い酸素結合力
を備えていない。

従って、現在市販されている材料が、血液代用物および
血漿増量剤に対し、医学的な一翼をになっているとはい
え、現状では、大量に生産をし市場へ出して販売しても
何ら問題ないといわれているものはない。

また、人体に使用した時、酸素を完全に釈放しうる有効
酸素担持血液代用物として、腎臓から排出されにくいも
のをつくるという課題が残されている。自然の哺乳類ヘ
モグロビンは、四量体であり、Ｍ炭中でオキシ状を呈し
、分子量がそれぞれ３２．０００の２つのアルファーベ
ータニ量体に分割される傾向がある。これらの二量体は
、腎臓で濾過され、排出されてしまう程小さく、そのた
め、腎障害に対する可能性をはらみ、かつ、脈管内の保
持時間を相当に低下させてしまう。

以上のことから明白なように、酸素と完全に結合するが
１体に使用する際、釈放されない程強固には結合されて
いない、血液代用物および血漿増量剤として使用しうる
治療剤が必要なことと、腎経路により急速に排泄された
り、他の組織における毛細血管床を介して行なわれる循
環によるロスをもたらすようなアルファーベータニ量体
に分割されない組成物をつくることが、長年の要望であ
った。

本発明の第１の目的は、前述の要望を達成しうる組成物
を提供することである。

本発明の第２の目的は、ヘモグロビンを改変し、効果的
な血液代用物および血漿増量剤をつくることである。

本発明の第３の目的は、特に、α鎖の間、即ち、リシン
（以下、Ｌｙｓと略記する）９９α＋とＬｙｓ９９　ａ
　２との間で架橋されたヘモグロビンの誘導体に基づく
血液代用物および血漿増量剤をつくることである。

本発明による組成物は、当初１反応生成物が、理論値の
約１０％乃至１５％という僅かな量でしかなかった。こ
のように、余りに低い収率では、工業的採算がとれず、
この組成物を、血液代用物および血漿増量剤として使用
するべく、妥当な値段で市場へ出すとなれば、収率をも
っと上げなければならない。

本発明の第４の目的は、組成物を高い収率で製造するこ
とである。採算ベースに見合った収率は、理論値の少な
くとも５０％乃至６０％の範囲であるため、α−α架橋
化ヘモグロビンを、血液代用物および血漿増量剤として
市販しうる収率でつくる必要がある。

本発明の第５の目的は、２，３−ジホスホグリセリン酸
、イノシトール六リン酸またはイノシトールヘキサスル
フェートのようなポリアニオンを加えた状態で、血液代
用物および血漿増量剤を製造することである。本願明細
書に記載の脱酸素化ヘモグロビンとの架橋反応を、これ
らポリアニオンのどれか一つの存在の下に行なわせると
、生成物の収率が、１０％乃至１５％から一気に６０％
乃至７０％まで高くなることが分かった。それに応じて
、不要な副生物の生成は減少する。そのため、架橋化ヘ
モグロビンの精製が非常に楽になり、商業ベースに見合
った生産が可能となる。

（発明の要約） 本発明は、新規なヘモグロビン製剤を製造する方法に関
し、このヘモグロビン製剤は、Ｌｙｓ９９α１と１ｙｓ
９９α２との間に、分子内架橋を行なわせ、有利な収率
でつくられる。

この方法によれば、未改変ヘモグロビンを脱酸素化し、
かつ架橋化する。この架橋化は、β鎖同士の間における
２、３−ジホスホグリセリン酸の結合部位のところで、
デオキシヘモグロビンと静電的に結合する付加ポリアニ
オンの存在の下に行なわれる。その際、蛋白質の前記部
位および隣接領域内部での架橋化剤による副反応はブロ
ックされるが、Ｌｙｓ９９α１およびＬｙｓ９９　ａ　
２への接近の方は、ポリアニオンによりブロックされな
いため、所望のＬｙｓ９９α１およびＬｙｓ９９α２に
対する反応確度は非常に高められる。

（発明の詳細な説明） 動物に使用される通常のヘモグロビンは、四量体であり
、普通、　Ｈｂ４と略記される。この四量体は、分子量
が６４　、０００で、かつ、４個のポリペプチド鎖、即
ち、互いに非共有結合された２個ずつのα鎖とβ鎖から
なっている。四量体１１ｂ４は、酸素化状態の下で、２
つのα−α二量体へ容易に解離する。

四量体が２つのα−αおよびβ−β二量体へ、またはα
およびβ単量体へ進行する解離は、生理学的状態の下で
は７重要である程度には起こらない。

ヘモグロビンを、それがβ−β分子内架橋を行ないうる
ように改変する点については、既に発行されている文献
の論文、ウォルダ−（Ｗａｌｄｅｒ）他、「ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｊ（１
９８０年）、１４１巻、】９５頁乃至２１６頁を参照さ
れたい。この引用論文は、四量体のβ鎖でのＬｙｓ８２
β！とＬｙｓ８２β２との間における二価性アシル化剤
による選択的架橋型オキシヘモグロビンと、この改変に
よる謙状赤血球貧血処置への使用可能性に対する問題を
扱っている。架橋化は、脱酸素化状態の鎌状赤血球ヘモ
グロビン（即ち、ヘモグロビンＳ）の溶解度を著しく高
め、ヘモグロビンの固有酸素結合性には殆ど影響を与え
ないため、好都合である。別の報告論文、タイエ（ｔｙ
ｅ）他、（１９８３年）「アドヴアンシーズ・イン・ブ
ラッド・サブスティテユート・リサーチ（Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ　ｉｎ　Ｂｌｏｏｄ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｅ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ）Ｊ　（ボリン、アール・ビー（Ｂｏｌｉ
ｎ、　Ｒ，Ｂ、）、ガイヤー。

ア・−ル°ピー（Ｇａｙｅｒ、　Ｒ，Ｐ、）、ネモ、ジ
ー・ジエイ（Ｎｅｍｏ、　Ｇ、Ｊ、）ｒｉ集〕、４１頁
乃至４９頁、発行人、アラン・アール・ロス（Ａｌａｎ
　Ｒ，Ｌｏｓｓ）、ニューヨークによれば、ウオルダー
の報告にあるものと同じ試薬を用いてβ鎖の間に架橋化
を施した第２の誘導体をつくり、血液代用物として実験
した報告がなされている。

本発明によれば、デオキシヘモグロビンは、四量体のα
鎖の間における新しい部位のところで選択的に架橋され
ていることが分かり、これは、画期的なことである。こ
の架橋化部位は、Ｌｙｓ９９α。

から１ｙｓ９９α２へかけてであることが、Ｘ線結晶分
析で確認された。その結果生じたものは、二量体化され
ない分子であり、かつ、酸素結合特性が改良された分子
であった。つまり、酸素親和性が、天然の未改変ヘモグ
ロビンと比べた場合、低下している。

本発明の重要な点は、ヘモグロビンの誘導体において、
架橋化が、一方のα鎖のＬｙｓ９９から他方のα鎖のＬ
ｙｓ９９へかけて１分子内的に、しかもへモグロビン分
子の特定部位のところで行なわれることである。これは
、でたらめな架橋化とは明らかに異なっており、ボンセ
ン（Ｂｏｎｓｅｎ）による米国特許第４，００１，４０
１号明細書に記載されているように、分子間架橋と分子
内翠橋の両方がでたらめな形で行なわれているのとは反
対に、分子内架橋に特定されている。

ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＩＥｘｐａｒｉｍｅｎｔａｌ　
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、（１９６９年）、　１２９巻、９
０９頁乃至９２４頁に結合されているパン（Ｂｕｎｎ）
等による以前の研究によれば、ヘモグロビンは、α−β
二量体として、腎臓による循環によって濾過されてしま
い、しかも、四量体の解離を防止するべく架橋化された
ヘモグロビン誘導体に、低い濾過速度と長い脈管内保持
時間を持たせ。

血液代用物として使用できるようにしている。そのため
、ボンセン等は、ヘモグロビン分子の４０乃至５０の異
なる多くの部位で、非選択的に、かつ可能性を持たせて
、ヘモグロビンと反応させる多くの公知の非特定架橋化
剤が使用されることを発表している。また、報告による
架橋化ヘモグロビンは、　Ｌｙｓ９９α、からＬｙｓ９
９α２へかけてのヘモグロビン分子の独特の部位のとこ
ろで架橋化された特定誘導体である。血液代用物として
の本発明による製剤の利点を、次に述べる。

架橋化剤が、非選択式にヘモグロビンと反応する場合、
反応生成物からなる混合物は、分子内架橋された誘導体
のほかに、架橋化されていない改変、未改変の可成りの
量のヘモグロビンを含んでおり、また、ヘモグロビン四
量体における分子内架橋により、分子量は更に大きくな
る。

ボンセン等による報告の場合、それ以上分別されること
のないこの全混合物は、生成物の架橋化ヘモグロビン組
成物からなっている。治療的に有用な生成物に対し重要
なことは、腎臓により濾過されるα−β二量体に解離さ
れ、そのため、腎障害の危険を招くような非架橋化ヘモ
グロビンを少なくとも除去することである。この場合、
α−β二量体には、次に示すような複合物を分解して解
離させる必要性が依然として残されているので、分子間
の架橋により高分子量化されたヘモグロビンの集合体が
分離することでさえ１本目的上、好ましいこととはいえ
ない。

本発明によるα−α架橋化ヘモグロビン製剤に関しては
、架橋化が分子内的に行なわれているので、上記のよう
なことは起こり得ない。もし、高分子量化されたヘモグ
ロビン集合体が、臨床的に有用であることが実証されれ
ば、勿論、α−α架橋化ヘモグロビンを、分子間架橋化
のものと代え、基質として使用できる。

反応混合物から、特別な分子量の溜置を分離しようとし
ても、架橋化剤がヘモグロビンと非選択的に反応する場
合、最終生成物は、一般にまだ。

分子の異なる多くの部位のところで改変されたヘモグロ
ビン誘導体の混合物を含んでしまっている。

このランダムに行なわれる改変は、異質の蛋白質に対す
る抗原反応の危険を増大させる。

本発明によるα−α架橋化誘導体のように、改変が特定
の単一部位で行なわれていれば、このような危険は少な
い。このことは、１ｙｓ９９α１とＬｙｓ９９α２との
間で行なわれる架橋部位が、ヘモグロビン四量体の中心
に近い分子の比較的少は入れ難い領域のところであるこ
とから、この場合は特に間違いないといえる。

結局、特定されない架橋化から得られる反応生成物の異
成分があるため、再生可能な組成物の最終生成物を分離
することや、他の赤血球蛋白質からその生成物を精製す
ることが難しくなる。

本発明による好適実施例によれば、心筋梗塞におけるよ
うな虚血に使用する際、α−α架橋化誘導体について更
になされる改変は、β鎖の間における２、３−ジホスホ
グリセリン酸結合部位のところに、陰荷電基を導入しう
る第２試薬によって行なわれ、その結果、酸素釈放能力
が更に向上する。

前述のβ鎖の間で架橋される誘導体において、架橋化部
位は、２，３−ジホスホグリセリン酸結合部位の内部に
位置する。この結合部位は、この領域内部での更なる改
変を阻止する。

架橋化誘導体をつくるために使用される出発材料、即ち
、ストローマのないヘモグロビンを入手する方法は、専
門知識の発達段階を代表している。

ヘモグロビンを、細胞破片およびストローマから殆ど遊
離した状態で分離する方法を含め、ヘモグロビンを細胞
からどのように分離するかは公知である。例えば、本発
明により改変されるヘモグロビンは、捨てられる血液試
料から分離され、かつその保存寿命は、通常安全と見做
されている限界を超えている。

適切な分離技術の詳細については、本明細書において引
用した米国特許第４，００１，４０１号明細書の第４１
［ｌ第４９行目から第５１１４第１３行目を参照された
い。更に、同じく本明細書に引用しているラビナー（Ｒ
ａｂｉｎｅｒ）他による「ジャーナル・オブ・エクスペ
リメンタル・メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＥｘｐ
ｅｒｉ＋ｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）Ｊ（１９６
７年Ｌ　１２６巻、　１１２７頁乃至１１４２頁、およ
びフェオーラ（Ｆｅｏｌａ）他による「サージエリ−・
シネコロジー・アンド・オブステトリクス（Ｓｕｒｇｅ
ｒｙ　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　０ｂｓｔｅｔｒ
ｉｃｓ）Ｊ（１９８３年）、　１５７巻、３９９頁乃至
４０ｇ頁を参照されたい。フェオーラの報告論文に記載
されているように、ヘモグロビン源として、そのほか例
えば、牛とか豚のヘモグロビンを使用できる。

組換え体ＤＮＡ技術を用いヘモグロビンをつくるべく処
理された菌株を、ヘモグロビン源として使うこともでき
る。

分離されたヘモグロビン１１ｂ４　を、本発明による改
変、処理および架橋化を行なうために使用する。

所望のα−α架橋化反応を行なわせるのに重要なことは
、反応に供されるヘモグロビンが脱酸素化されているこ
とである。もし、ヘモグロビンが酸素結合していると、
既に引用した文献にもあるように、架橋化が、β鎖の間
に起きてしまう。

脱酸素化は、架橋化を行なう前に、窒素とがアルゴンの
ような不活性ガスとともにストローマのないヘモグロビ
ンを強力に追い出してやることによって達成される。脱
酸素化は、α鎖のＬｙｓ９９における反応部位を架橋化
剤に近づけることが重要である。オキシヘモグロビンに
おいては１分子のこの領域が全体に接近し難いような配
座になっている。

既に述べたように、反応は、アルゴンとか、窒素とか、
他の不活性ガスによる追い出しにより確実に脱酸素が行
なわれるよう制御される。場合によって、ヘモグロビン
の脱酸素化を、亜ジチオン酸ナトリウムとか、その他、
クエン酸第−鉄のような公知の還元剤と反応させること
によって行なうことができる。

ブランケット状の適当な不活性ガスの下での追い出しに
よる脱酸素化は、約０℃乃至約４０℃の温度で、大気圧
の下に、約１時間乃至約３時間かけて行なわなければな
らない。このような条件の下で、ある一定時間追い出し
処理をすることにより、脱酸素化は、確実に行なわれ、
かつＬｙｇり９α、からＬｙｓ９９α２へかけてのα鎖
同士の間における架橋部位に、接近をもたらすことがで
きる。

追い出し処理が終われば、組成物を架橋化剤と反応させ
る準備ができたことになる。

使用される架橋化剤は、デオキシヘモグロビンにおける
α鎖のＬｙｓ９９に対し、高い特異性をもって反応しな
ければならない。架橋化剤と反応させ安定した共有付加
物を形成させるには、反応は。

Ｌｙｓ残基の側鎖のε−アミノ基のところで行なわれる
。ほかに４２のＬｙｓ残基と、ヘモグロビンの４つのポ
リペプチド鎖の末端がアミノであるアミノ基とがあり、
そこのところで、競争反応が起こる。

使用できる適当な架橋化剤の一般式は、（式中、Ｘは、
環に付加されるあらゆる有機成分を表わす。） で示される。

この好適なものとして、フェニルエステルを挙げる。二
とができ、これらは、効果的な架橋化剤で形成されてい
ることである。この架橋部が、２つのＬｙｓ残基のアミ
ノ基と結合して、次のようになる。

架橋化部の基を置き換えると、改変誘導体の性質や、化
合物の反応性に悪い影響を与えかねない。

周知の如く、Ｒの連鎖の長さはいろいろで１例えばＣ２
１１４，Ｃコ１１６、または不飽和鎖のものもある。一
般に、Ｒは、連鎖の長さが２乃至約８まで変わりうる置
換性または非置換性のあらゆる有機成分である。

Ｒはまた、カルボキシル基のような特定の官能基と置き
換えることができる。その場合、付加されるカルボキシ
ル基は、架橋化部におけるヘモグロビン分子にくっつけ
られるようになる。Ｌｙｓ残基のアミノ基と反応する官
能基には、 λ がある。

そのほか、アミノ基のところで反応しうるちのに。

が含まれる。

これらはすべて、アシル化剤であると考えられチル）と
か、関連のアミジン化剤とか、ハロゲン化スルホニルが
ある。

また、あるジアルデヒドを用い、２個のＬｙｓ９９α残
基を架橋化することもできる。つまり、シッフ塩基を形
成し、このシップ塩基をアミン結合に変えるため、水素
化ホウ素ナトリウムとかシアノ水・素化ホウ素ナトリウ
ムによる還元が行なわれる。

反応式は、次の通りである。

ハロゲン化アルキル、スルホン酸エステルまたは他のア
ルキル化剤も、　Ｌｙｓ残基のアミノ基を架橋化するの
に使用できる。

最も好適な架橋化剤は、ビス（３，５−ジブロモサリチ
ル）フマレートである。それは、次に示すような式によ
り、２個のＬｙｓ９９α残基を効果的に架橋化する。

本発明による優れた方法により、Ｌｙｓ９９α凰とＬｙ
ｓ９９α２との間に分子内架橋が施されたヘモグロビン
を高収率でつくることができる。もし、脱酸素化ヘモグ
ロビンと架橋化剤との間における反応が、好ましくは、
等モル量より多い付加ポリアニオンの存在に下に行なわ
れる場合、　Ｌｙｓ９９α１とＬｙｓ９９α２との間の
部位のところで架橋された所望の分子内架橋化ヘモグロ
ビンの収率は、相当に増大する。

特に、本発明を用いて実施すれば、収率は、理論値によ
る１０乃至１５％から、少なくとも５０乃至６０％八と
一気に向上する。

いろいろ異なる構造を有するポリアニオンは、ヘモグロ
ビン四量体の中央くぼみへの入口のところに位置してい
るβ鎖の一団の正荷電基との静電的相互作用により、デ
オキシヘモグロビンに結合する。これは、２，３−ジホ
スホグリセリン酸に対するヘモグロビンにおける自然結
合部位である。

明らかなように、架橋化剤によって起こる副反応に与か
る大部分は、この部位でのアミノ基と。

領域内部におけるイノシトール六リン酸のようなポリア
ニオンの結合によりブロックされうる蛋白質の隣接部と
の反応によっている。また、デオキシヘモグロビンには
、架橋化剤との副反応の抑制に更に寄与しうるイノシト
ール六リン酸のようなポリアニオンに対し、もっと低い
親和力を有する第２結合部位がある。

驚くべきことに、本発明によれば、２，３−ジホスホグ
リセリン酸結合部位におけるポリアニオンの結合は、ヘ
モグロビン四量体の中央くぼみ内部で分子の殆ど真ん中
に位置している２つのＬｙｓ９９α残基に対する架橋化
剤の接近をブロックしない。多分、架橋化剤は、通常、
α鎖とβ鎖の間における界面近くか、α鎖同士の間にお
いて、デオキシヘモグロビンの中央くぼみへ入って行く
ことになる。

重要なことは、次の精製段階において、ポリアニオンを
除去すると、精製された架橋化ヘモグロビンがあとに残
る。

架橋化のため、、　Ｌｙｓ９９α１をＬｙｓ９９α２へ
接近しうるようにさせながら、デオキシヘモグロビンに
静電結合させるのに適当なポリアニオンには、　２．３
−ジホスホグリセリン酸、イノシトール六リン酸および
イノシトールヘキソスルフェートがある。そのうち、イ
ノシトール六リン酸が好ましい。これらのものは、副反
応が既に述べたようにして起こりうる部位をブロックす
る。

架橋化剤との反応を、以下で説明する。

ポリアニオンの濃度は、ヘモグロビン量と等モルの量か
ら、２０倍程度の過剰量に至る範囲内にしなければなら
ない。ヘモグロビン量のモル量に対し、５倍乃至１０倍
の範囲が好ましい。

架橋化剤の量は、ヘモグロビンの量に対し、約１モル乃
至約３モルの過剰量とするのがよく、とりわけ、ヘモグ
ロビンのモル址に対し、約１．３倍乃至約２倍が好まし
い。

架橋化剤および脱酸素化ヘモグロビンとの反応は、約０
℃乃至約４０℃の温度で行なう。約３５℃乃至約４０℃
の範囲が好ましい。

反応時のｐＨは、約５．５乃至約１０の範囲で行なわれ
る。約６乃至約８が好適である。反応は、塩の水溶液中
、主として、その中でのビス−トリス緩衝剤が０．２モ
ル乃至約１モル程入っているものの中で行なわれる。

架橋化剤のヘモグロビンに対する割合は、約１：１乃至
３：１がよい。好ましくは、１．３：１乃至約２：１で
ある。架橋化を確実に行なわせるため、可成り過剰の架
橋化剤を使用するが、既に述べた狭い範囲で行なうのが
好ましい。

反応時間はまちまちであるが、２時間程度反応させれば
、架橋化を行なわせるには十分である。

イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、その他のク
ロマトグラフィー技術を用いて、架橋化誘導体を、未反
応ヘモグロビン、および別の部位のところで改変された
不純物から分離する。高圧液体クロマトグラフィーを用
いて行なうこともできる。場合によっては、クロマトグ
ラフィー操作によらず、限外濾過により架橋化誘導体を
十分精製することができる。この精製法はまた、改変ヘ
モグロビンからポリアニオンを除去しうる。

このようにして、ヘモグロビンは、Ｌｙｓ９９αＸ−Ｌ
ｙｓ９９α２の位置で架橋化が行なわれ、そのまま、有
効な血液代用物として使用できる。ところが、低い酸素
親和力と適当な酸素釈放力を有していることが分かった
ことと、二量体化しにくいため。

腎循環除去により急速に排出されることが分かった。

非経口的投与に使用できるよう、精製誘導体を、透析か
限外濾過により、　ｐｌ＋　７．４の生理的食塩溶液に
変え、約７％（１００ｍＱに対し７ｇのヘモグロビン）
に濃縮する。材料は、内毒素がなく、かつ無菌状態の下
で包装される。また、ヘモグロビンを、必要に応じ、生
理食塩水を加えて液体状に戻すことができる凍結乾燥粉
末として貯蔵することができる。

既に述べたように、１ｙｓ９９α、とＬｙｓ９９α２と
の間で分子内架橋された架橋化ヘモグロビンを、そのま
ま、血液代用物および血漿増量剤とし、受容可能な担体
を有するとともに、他の血漿代用物および血漿増量剤を
有する製剤として使用できる。

製剤担体として、生理食塩水、食塩とグルコースからな
る混合物、リンゲル液、乳酸加すンゲル液、ロックリン
ゲル液、クレブスリンゲル液、ハートマンバランス食塩
水、およびヘパリンを加えたクエン酸す１〜リウムーク
エン酸−デキストローズ液からなるクリスタロイドを使
用できる。

架橋化ヘモグロビンは、ポリにエチレンオキシド）、ポ
リビニルピロリドン、ポリビニルアルコールおよびエチ
レンオキシド−ポリプロピレングリコール縮金物のよう
な、水に可溶でかつ生理的に受容可能な重合血漿代用物
と混合される。従って、それば、コロイド様血漿代用物
や、デキストラン、アルブミン、他の血漿蛋白質、ペク
チン。

平衡流動ゼラチンおよびヒドロキシエチル澱粉からなる
線状多糖類のような血漿増量剤と混合する。

一般に、製剤は、上記の担体の一つか、またはその混合
物と混ぜ合わされた約１重量％乃至約１０重量％の改変
ヘモグロビンを含有する。治療剤の投与方法は、この分
野において公知の医学的手段に基づいて行なわれる。例
えば、アメリカ合衆国ペンシルバニア州イーストンに所
在するマツ９（Ｍａｃｋ）出版会社の発行になる、タレ
ス（Ｔａｒｅｓ）およびキング（Ｋｉｎｇ）による「レ
ミントンズ・ファーマシュウティカル・サイエンシーズ
（Ｒｅａ＋ｉｎｇｔｏｎ’　５Ｐｈａｒａ＋ａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）Ｊ（１９８０）（オーツ
ル、工（Ｏｓｏｌ、　Ａ、）編集）、１４８８頁乃至１
４９７頁を参照されたい。

既に述べたように、Ｌｙｓ９９α、−Ｌｙｓ９９α２架
橋化ヘモグロビンの別の重要な利点として、２，３−ジ
ホスホグリセリン酸結合部位が、別の試薬とによるほか
の改変に使用しうるようまだ残されていることである。

本発明による分子内架橋化ヘモグロビンを、虚血のよう
な事態に使用する場合、この領域内に、負に帯電した基
を付加してやれば、それが恒常的結合アニオンとして働
き、ヘモグロビンの酸素親和力を抑えるという利点を発
揮する。これは、ヘモグロビンが５組織で使用される酸
素を容易に釈放できることを意味するので、望ましいこ
とである。

付加基により、さまざまな用途に応じた成る範囲の酸素
親和性を有する多くの異なる誘導体をつくることができ
る。

非常に低い酸素親和性を有するヘモグロビン誘導体は１
例えば、心臓発作などのよる虚血の治療に特に有用であ
る。単純な血液交換の時でさえ、α鎖の架橋化だけでつ
くられたものより低い酸素親和性を持ったものを使うほ
うが有利である。

ベネッシュ（Ｂｅｎｅｓｃｈ）等による「バイオケミス
トリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）Ｊ（１９７２年）
、第１１巻、　３５７６頁乃至３５８２頁に記載されて
いるように、従来、　２．３−ジホスホグリセリン酸の
結合部位に、負に帯電した基を導入するため、ピリドキ
サールリン酸やその他のアルデヒド誘導体が使われてき
た。

これらの化合物は、デオキシヘモグロビンと反応するの
で、恒常的共有結合付加を与えるため還元的アルキル化
を行なわなければならない。

そのため１本明細書に記載の化合物は、オキシヘモグロ
ビンと反応するようになっており、従って、試料の脱酸
素化を必要とせず、また、還元性アルキル化のような反
応を行なわなくても、最終的な誘導体を得ることができ
る。

これらの化合物のうち原型であり、かつ最も好適なもの
は、モノ（３，５−ジブロモサリチル）フマレートであ
る。この化合物は、Ｌｙｓ８２βのところで、オキシヘ
モグロビンと選択的に反応し、かつ、２゜３−ジホスホ
グリセリン酸（Ｄ　Ｐ　Ｇと略記する）結合部位内に、
負に荷電したカルボキシレート基を導入させる。

（実施例） 以下、本発明による方法、生成物および医学的技術につ
き好適実施例に基づき詳細に説明する。

但し、これに限定はされない。

夾直孤上 ビス（３，５−ジブロモサリチル）フマレートのデオキ
シヘモグロビンとの反応、およびα鎖間における架橋化
誘導体の分離 ρＩＩが７゜２になっている０、２Ｍのビス−トリス緩
衝液を用い、濃度が２．０ｍＭのヘモグロビン溶液を調
製する。ヘモグロビンは、最初、オキシの状態になって
いる。

アルゴンまたは窒素による追い出しによって。

酸素を除去する。

ヘモグロビンに使用したものと同じ緩衝液を用いて、温
度が２．０ｍＭのビス（３，５−ジブロモサリチル）フ
マレートの溶液を調製し、窒素を用いて脱酸素化する。

ヘモグロビン溶液に、同量のビス（３，５−ジブロモサ
リチル）フマレート溶液を加え、３７℃で２時間かけて
反応させる。ヘモグロビンと化合物の最終濃度が、それ
ぞれ、１．０＋ｏＭとなるようにする。

このような条件で処理することによりＬｙｓ９９α１−
Ｌｙｓ９９α２において　α鎖間に架橋化が生じた誘導
体の収率は、１０乃至１５％である。

反応終了時、残っている架橋化剤を全て消費させ、かつ
、架橋化誘導体を分離する際に生じる恐れのあるヘモグ
ロビンとのそれ以上の反応を防止するため、最終濃度が
１゜開になるまでグリシンを加える。

反応終了後、ＰＨが７．８である０、２Ｍグリシン緩衝
液を通して、ヘモグロビン溶液を透析するか、グリシン
緩衝液を用いないで、ヘモグロビン溶液を限外濾過する
。この段階で、ヘモグロビンは酸素化される。

次に、ジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥと略
記する）によるクロマトグラフィーを用い、未反応ヘモ
グロビン及び別の部位のところで改変が生じている不純
物と、架橋化誘導体とを分離する。コラムは、最初、　
ｐＨが７．８の０．２Ｍグリシン４！［液で平衡にして
おく。ヘモグロビンを加えてから、同じ緩衝液に０．０
３乃至０．０６Ｍ　ＮａＣ１を加えたコラムから試料を
グラジェント溶離させる。

溶離のプロフィルを第１図に示す。目盛（９０）におけ
る第１のピークは、未改変ヘモグロビンである。目盛（
１１０）（１）における第２のピークが、所望のα−α
架橋化誘導体である。目盛（１２ｇ）における第３のピ
ークは、他の部位のところで改変された誘導体の混合物
で、β鎖の間で架橋された誘導体を含んでいる。α−α
架橋化誘導体と一緒に溶離される若干の非架橋化不純物
（５％未満）は、１ＭＭｇＣ１２の存在の下にゲル濾過
によって除去できる。

大規模な大量生産に特に適した第１段階での精製は、架
橋型ＤＥＡＥセファロース（商標名：５ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ）をクロマトグラフィーの媒体として使用し、良好に
達成できる。

第１図示の試料の場合１分離されたα−α架橋化誘導体
の収率は、約１５％であった。残りの材料の殆どは、未
改変ヘモグロビンであるので、α−α架橋化誘導体の収
率を高めるべく望みを託し、単純に、架橋化剤の濃度を
上げるか、反応時間を長くしてみたり、また、もっと高
い温度で反応を完結させてみた。これらの反応条件をい
ろいろ変えて実施してみたが、所望の生成物の収率を高
めることはできなかった。

α−α架橋化誘導体の収率低下は、大部分が。

蛋白質の別の部位で起こっている副反応に起因していた
。特に、　Ｌｙｓ９９α１とＬｙｓ９９α２との間で架
橋される誘導体の収率は、後述する実施例に記載の方法
によってのみ向上するものであることが分かった。つま
り、反応は、蛋白質の他の部位での架橋化剤の競争反応
をブロックさせながら、イノシトール六リン酸のような
ポリアニオンの存在の下に行なわれる。

第２図は、上述したようにしてつくられたα−α架橋化
誘導体の酸素平衡曲線を示す。

この酸素平衡曲線は、結合した酸素部分と、酸素の分圧
の対数値とをプロットして作成されたものである。グラ
フにおいて、黒い丸は、通常の大人のヘモグロビンを表
わし、白い丸は（Ｌｙｓ９９α１−Ｌｙｓ９９α２にお
ける）架橋化誘導体を表わす。条件は、温度２５℃、Ｏ
，１Ｍ　ＮａＣ１を加えた、ρ１１が７．０の０．０５
Ｍビス−トリス緩衝液を使用した。両方の場合における
ヘモグロビンの濃度は、０．２ｍＭであった。

このような条件の下で、天然のヘモグロビンに対するＰ
ｓｏ（ヘモグロビンの半分が飽和状態になる時の酸素の
分圧を示す）は６　、３＋ｉ＋ａｌ１ｇであり、架橋化
誘導体のそれは１５．１ｍｍｍＨｇであった。

α−α架橋化誘導体（即ち、Ｐ６゜が大きいほう）に対
する酸素結合曲線が右に寄っているということは、酸素
親和力の低下を意味する。同様に、酸素分圧の高いとこ
ろでは、酸素釈放力は、未改変ヘモグロビンより架橋化
誘導体の方が大きい。架橋化誘導体の協同性は、殆ど低
下していない。架橋比誘４体に対する試験により決めら
れたヒル係数は、２．２であった。

架橋化誘導体の二次元電気泳動、および分離架橋化ポリ
ペビチド鎖のアミノ酸分析により、架橋化の部位がα鎖
の間であることを確認した。

Ｘ線結晶分析を用い、改変ヘモグロビンの正確な架橋化
部位の決定を行なった。

第３図は、架橋化誘導体と天然デオキシヘモグロビンと
の違いをみるため、元の構造の原子模型に重ね合わせて
つくられた電子密度差等高マツプである。はっきりさせ
るため、負の電子密度差による等高線は省略した０図の
中心近くの２つの強いピークを含む正の電子密度差によ
るバンドは、架橋によって生じたもので、第１の鎖のＬ
ｙｓ９９（９９Ｋ）が第２の鎖のＬｙｓ９９に連結され
ている様子がはっきり分かる。別の低レベルの正の等高
線は、架橋化の結果として生ずる構造中の若干の変化に
よるものである。差マツプにおいて、それ以外の改変部
位は観察されなかった。

ヌ】１１劃 ２．３−ジホスホグリセリン酸結合部位内部の負に帯電
した基に付加される新蛋白質改変剤 本実施例は、モノ（３，５−ジブロモサリチル）フマレ
ートの負ヘモグロビンとの反応について述べる。

この反応は、オキシヘモグロビンと行なわれる。

この場合、化合物は１次の反応式で示すように。

Ｌｙｓ８２βのところで選択的に反応し、２，３−ジホ
スホグリセリン酸結合部位内部へ、負に荷電したカルボ
キシレート基（下線を引いた部分）を導入させる。

反応条件は、ヘモグロビンをオキシの状態に保っておく
以外、実施例１に記載した条件と同じである。この場合
、室内空気の酸素分圧は、通常の状態で十分である。１
．５Ｍの試薬液をヘモグロビンより過剰に用いることに
より、生成物の収率は約２０％であった。

この誘導体を、前の・実施例で述べたＤＥＡＥセルロー
スによるクロマトグラフィーを用いて精製した。改変ヘ
モグロビンを二次元電気泳動にかけたところ、両方のβ
鎖が改変していることが確かめられた。Ｘ線結晶分析の
結果、改変部位は、β鎖のＬｙｓ８２のところであった
。これを、トリプシンペプチドのマツピングによって確
認した。

改変ヘモグロビンの酸素親和性は、約１．６倍に低下Ｌ
　ｔ＝、　ｐＨカフ　、　０　＋７）　５０ｍＭビＸ−
トＵ　スＭｔｕｊ液で処理したところ、Ｐ、。は、天然
ヘモグロビンが７．９ｍｍＨｇであったのに対して、改
変誘導体ではそれが。

１２．９ｍｍ）Ｉｇへと増大した。

酸素化状態の下で、モノ（３，５−ジブロモサリチル）
フマレートと、実施例１で述べたα−α架橋化誘導体と
で行なった反応を、同様に天然のヘモグロビンに行なう
。そこで５第２図に示した要領で酸素結合状態を調べた
ところ、α−α架橋化誘導体の酸素親和性は、２，３−
ジホスホグリセリン酸結合部位内部へ負に荷電したカル
ボキシレート基が付加されることにより、一層低下して
いる。

一般に、モノ（３，５−ジブロモサリチル）フマレート
の類似物を用いα−α架橋化誘導体を改変することによ
り、酸素親和性に幅を持った多くのいろいろな誘導体を
つくることができる。その結果生じる酸素親和性は、２
，３−ジホスホグリセリン酸結合部位内部へ付加される
負に帯電した基によって左右される。

λ で示される一般構造中の基Ｒ−Ｃ−が、蛋白質に対して
共有結合されることになる。この基の内部に結合される
負に帯電した置換基の数および型は、さまざまである６
カルボキシル基のほか、これらには、ホスホネート、ホ
スフェート基、スルホネート基、スルフェート基がある
。一般に、結合基の陰電荷の数が多くなるほど、改変ヘ
モグロビンの酸素親和性は低くなる。

要約すると、各種の分析の結果、説明してきたα−α分
子内架橋化ヘモグロビンは、有効な血液代用物および血
漿増量剤としてのいろいろな性質を備えていることが実
証され、そのため、従来の供血者による試料が使われて
いるところで利用できる。

以下の一連の試料に関し、イノシトール六リン酸を使用
する以外、実施例１および２と殆ど同じ条件の下で反応
を行なった。条件は、α−α架橋化誘導体が最も良い収
率で得られるように設定した。

それぞれ、ビス（３，５−ジブロモサリチル）フマレー
トと反応させてから、改変ヘモグロビンを、ｐＨ６乃至
８のゲル等電点電気泳動を用して分析した。

約２００μｇのＩ（ｂが、各ゲルに濃縮された。

電気泳動は、最初、５００ｖで、１゜５時間かけて行な
い、次にゲルの陰極端のところに亜ジチオン酸ナトリウ
ムを加え、更に、６００ｖで、０８５時間電気泳動を続
行した。最初の１．５時間が経過すると。

各種のヘモグロビン誘導体が、それぞれの等電ｐＨに基
づいてオキシ状態で焦点的に濃縮される。全般に、誘導
体は、改変アミノ基の正荷電のロスにより、天然ヘモグ
ロビンよりも低い等電点を有している。

７５ｍＭ亜ジチオン酸ナトリウム溶液をゲルに加え、ヘ
モグロビンをデオキシ状態に変える。亜ジチオン酸はア
ニオンであり、そのため、陽極め方に向かってゲルの下
方に移行し、Ｈｂに達する。脱酸素化による正電荷の正
味ゲインにより（ボーア（Ｂｏｈｒ）効果、天然Ｈｂに
対しては＋２）、Ｈｂバンドの（陰極方向の）上向き転
移がもたらされる。人間、牛および豚のＨｂに関し、そ
れぞれの場合、ボーア効果は、架橋化誘導体より未改変
ヘモグロビンのほうが大きい。これによって、未改変ヘ
モグロビンとα−α架橋化誘導体と分離度は、ヘモグロ
ビンをオキシ状態にしておくより脱酸素化状態にしてお
くほうが一層大きくなる。

人間、牛および豚の３種類のヘモグロビンに対して実験
を行なった。

先ず最初に、架橋剤を反応緩衝液に溶屏させ。

それを、エステルの自然加水分解を最小にするため、直
ちにヘモグロビン試料へ加える。ジメチルスルホキシド
（以下、ＤＭＳＯと略記する）でつくられた化合物の濃
縮貯蔵溶液を使用した時と同じ結果を得た。反応時のＤ
ＭＳＯの最終濃度は、１．５％であった。デオキシヘモ
グロビンとの反応に際し、ＤＭＳＯ溶液を脱酸素化する
必要はなかった。

失胤匹主 イノシトール六リン酸（以下、ＩＨＰと略記する）の濃
度を変えながら、０．１Ｍビス−トリス緩衝液中での、
デオキシヘモグロビンとビス（３，５−ジブロモサリチ
ル）フマレートとの反応 反応はすべて、ヘモグロビンおよびビス（３，５−ジブ
ロモサリチル）フマレートの濃度を、それぞれ、１．Ｏ
ｎ＋Ｍおよび１　、５ｍＭに、３７℃で、２時間、ｐＨ
が７．２のＯ，］、８Ｍビス−トリス緩衝液で行なった
。Ｎ２による追出しにより、溶液はすべて脱酸素化した
。

ＩＨＰの濃度を、０．１．５ｍＭ、　５ｍＭ、　ｌｏｍ
Ｍおよび２０１にして実験を行なった。

ＩＨＰを欠いた状態では、α−α架橋化誘導体の収率は
僅か５％であった。ヘモグロビンの約１０乃至１５％が
改変されなかった。この残りの材料には、蛋白質の他の
部位での副反応が起きており。

それは、オキシヘモグロビンとの反応時選択的に形成さ
れるＬｙｓ８２−Ｌｙｓ８２のβ−β架橋に関するゲル
等電点電気泳動による位置が重なり合った鈍系列バンド
として現われていた。

１　、５ｍＭのＩＨＰの場合、等電点電気泳動により決
定されたα−α架橋化誘導体の収率は、４０％に増大し
た。５ｍＭのＩＨＰの場合、α−α架橋化誘導体の収率
は、６０乃至６５％であった。但し、蛋白質の別の部位
での副反応による不純物が、６％以下の割合で入ってい
た。ＩＨＰの濃度をこれ以上高くしても、収率は変わら
なかった。

失胤涯土 Ｉ　ＨＰの濃度を変えながら、ｐＨ７８２の０．ＩＨビ
ス・・トリス緩衝液中での、オキシヘモグロビンとビス
（３，５−ジブロモサリチル）フマレートとの反応 オキシヘモグロビンを用い、実施例３と同じ反応を繰り
返し行なった。

検出可能なα−α架橋化誘導体の生成は全くなかった。

ＩＨＰのようなポリアニオンを相当過剰に加えた場合で
さえ、ヘモグロビンは、試薬を、α鎖、即ちＬｙｓ９９
α１とＬｙｓ９９α２との間における架橋化部へと近づ
けるため、デオキシ型になっていなければならない。

失胤板且 ５ｍＭのＩＨＰ存在下での、デオキシヘモグロビンと濃
度が変えられるビス（３，５−ジブロモサリチル）フマ
レートとの反応反応条件は、実施例３の場合と全く同じ
条件で行なった。ビス（３，５−ジブロモサリチル）フ
マレートの濃度を、ＬＯｍＭ、　１．３ｍＭ、　１５ｍ
Ｍ、　２．ＯＩＩＩＭ、　２．５ｍＭおよび３゜ＯｍＭ
と順次変えて行なった。

化合物の濃度が１　、０ｍＭの場合、α−α架橋化誘導
体の収率は４０％であった。１　、３ｍＭおよび１．５
ｍＭの場合、収率は５５％乃至６５％であった。

２゜０１１Ｍ以上の濃・度になると、所望の生成物の収
率は、蛋白質の他の部位での副反応により１次第に低下
した。不純物は、２つの１ｙｓ９９α残基の間で架橋化
されているが、蛋白質の１か所以上の部位でも改変され
ている誘導体を含んでいる筈である。

末凰孤且 ＩＨＰ存在下での、ビス（３，５−ジブロモサリチル）
フマレートと、脱酸素化状態における牛および豚のヘモ
グロビンとの反応 反応条件は、実施例３の場合と全く同じ条件で行なった
。ビス（３，５−ジブロモサリチル）フマレートの濃度
は１　、５ｍＭであった。両方の場合、ＩＨＰ存在下で
のα−α架橋化誘導体の収率の増加−は。

人間のヘモグロビンに関して観察されたものに凹敵した
。牛のヘモグロビンの場合の最高収率は、３５％乃至４
０％であり、豚のヘモグロビンの場合、６０％乃至７０
％であった。後者は１人間のヘモグロビンの場合と全く
同じであった。

本発明の精神と範囲に反することなく、必要に応じ、他
の改変を施すことができるが、以上の説明から分かるよ
うに、ポリアニオン、特に好適なイノシトール六リン酸
（ＩＨＰ）を使用することによって、α−α架橋化誘導
体の収率を１０％乃至１５％の範囲から６０％乃至７０
％程度まで高めることができる。

これまでに提示した実施例は、出発材料として、精製さ
れたヘモグロビンを使用して行なったものであるが、こ
の架橋化処理法では、精製してない溶血物を用いて行な
うこともできる。この場合。

赤血球を溶解し、ヘモグロビン濃度を１鱈と２ｍＭの間
に調整し、イノシトール六リン酸を加え、Ｎ２を用いて
溶液の脱酸素化を行なってから架橋化剤を加えて行く。

架橋化反応は、ストローマ材料が存在していても行なわ
れる。既に説明したように、Ｌｙｓ９９α、とＬｙｓ９
９α２との間で架橋化された所望の生成物を分離する。

この処理は、大量に行なう場合でも、架橋化の前後に行
なうヘモグロビンの精製より簡単である。

従って、本発明により、既に述べた全ての目的を達成で
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、試料溶離のプロフィルを示すチャートである
。 第２図は、α−α架橋化誘導体の酸素平衡曲線を示す。 第３図は、架橋化誘導体と天然デオキシヘモグロビンと
の違いをみるため１元の構造の原子模型に重ね合わせて
つくられた電子密度差等高マツプである。 ）ｌ

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. （１）他の部位で改変されたヘモグロビンが殆どなく、
   水溶液および生理液に可溶であり、かつ酸素と可逆的に
   結合しうる、リシン（Ｌｙｓと略記する）９９α＿１と
   Ｌｙｓ９９α＿２との間で分子内架橋化され、しかもス
   トローマのない治療的有効量のヘモグロビンと、薬学的
   に使用しうる担体とからなることを特徴とする血液代用
   物および血漿増量剤として使用する製剤。
2. （２）α−α架橋化が、アミノ基に特異的な架橋化剤に
   よって行なわれることを特徴とする特許請求の範囲第（
   １）項に記載の血液代用物および血漿増量剤として使用
   する製剤。
3. （３）架橋化剤が、アシル化剤であることを特徴とする
   特許請求の範囲第（２）項に記載の血液代用物および血
   漿増量剤として使用する製剤。
4. （４）架橋化剤が、ジエステル架橋化剤であることを特
   徴とする特許請求の範囲第（３）項に記載の血液代用物
   および血漿増量剤として使用する製剤。
5. （５）架橋化剤が、フェニルエステル架橋化剤であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第（４）項に記載の血液
   代用物および血漿増量剤として使用する製剤。
6. （６）架橋化剤が、ビス（３，５−ジブロモサリチル）
   フマレートであることを特徴とする特許請求の範囲第（
   ５）項に記載の血液代用物および血漿増量剤として使用
   する製剤。
7. （７）担体が、液体であり、かつ、当該製剤が、約１％
   乃至１０％のヘモグロビンを含有していることを特徴と
   する特許請求の範囲第（１）項に記載の血液代用物およ
   び血漿増量剤として使用する製剤。
8. （８）ヘモグロビンが、２，３−ジホスホグリセリン酸
   結合部位のところで陰荷電基を導入しうる第２の試薬に
   よっても改変されることを特徴とする特許請求の範囲第
   （１）項に記載の血液代用物および血漿増量剤として使
   用する製剤。
9. （９）第２の試薬が、モノ（３，５−ジブロモサリチル
   ）フマレートであることを特徴とする特許請求の範囲第
   （８）項に記載の血液代用物および血漿増量剤として使
   用する製剤。
10. （１０）他の部位で改変されたヘモグロビンが殆どなく
    、かつ等張液中で約６４，０００の分子量を有する、Ｌ
    ｙｓ９９α＿１とＬｙｓ９９α＿２との間で分子内架橋
    化され、しかもストローマのないヘモグロビンからなる
    血液増量剤を、血液循環系へ注入する段階からなること
    を特徴とする、循環血液量を置き換えるか若しくはそれ
    を増大させるか、または、人間若しくは動物の組織への
    酸素受渡しを増大させるための方法。
11. （１１）ヘモグロビンが、また、２，３−ジホスホグリ
    セリン酸結合部位で、陰荷電基によって改変されること
    を特徴とする、特許請求の範囲第（１０）項に記載の循
    環血液量を置き換えるか若しくはそれを増大させるか、
    または、人間若しくは動物の組織への酸素受渡しを増大
    させるための方法。
12. （１２）未改変ヘモグロビンを分離するか、未精製赤血
    球溶解質を調製する段階と、 前記ヘモグロビンを脱酸素化する段階と、 前記脱酸素化ヘモグロビンを、２，３−ジホスホグリセ
    リン酸、イノシトール六リン酸、イノシトールヘキサス
    ルフェートからなる群より選ばれた付加ポリアニオンの
    存在下で、Ｌｙｓ９９α＿１とＬｙｓ９９α＿２との間
    で分子内的に架橋化する段階と、 前記α−α架橋化誘導体を精製する段階 とからなることを特徴とする、血液代用物および血漿増
    量剤として機能しうる改変ヘモグロビンを経済的収率で
    製造する方法。
13. （１３）ポリアニオンが、２，３−ジホスホグリセリン
    酸であることを特徴とする特許請求の範囲第（１２）項
    に記載の血液代用物および血漿増量剤として機能しうる
    改変ヘモグロビンを経済的収率で製造する方法。
14. （１４）ポリアニオンが、イノシトールヘキサスルフェ
    ートであることを特徴とする特許請求の範囲第（１２）
    項に記載の血液代用物および血漿増量剤として機能しう
    る改変ヘモグロビンを経済的収率で製造する方法。
15. （１５）ポリアニオンが、イノシトール六リン酸である
    ことを特徴とする特許請求の範囲第（１２）項に記載の
    血液代用物および血漿増量剤として機能しうる改変ヘモ
    グロビンを経済的収率で製造する方法。
16. （１６）反応を、約０℃乃至約４０℃の温度で行なうこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第（１２）項に記載の血
    液代用物および血漿増量剤として機能しうる改変ヘモグ
    ロビンを経済的収率で製造する方法。
17. （１７）反応を、約３５℃乃至約４０℃の温度で行なう
    ことを特徴とする特許請求の範囲第（１６）項に記載の
    血液代用物および血漿増量剤として機能しうる改変ヘモ
    グロビンを経済的収率で製造する方法。
18. （１８）反応を、約３７℃の温度で行なうことを特徴と
    する特許請求の範囲第（１６）項に記載の血液代用物お
    よび血漿増量剤として機能しうる改変ヘモグロビンを経
    済的収率で製造する方法。
19. （１９）Ｌｙｓ９９α＿１とＬｙｓ９９α＿２との間の
    架橋化が、アミノ基に特異的である架橋化剤によって行
    なわれることを特徴とする特許請求の範囲第（１２）項
    に記載の血液代用物および血漿増量剤として機能しうる
    改変ヘモグロビンを経済的収率で製造する方法。
20. （２０）架橋化剤が、フェニルエステル架橋化剤である
    ことを特徴とする特許請求の範囲第（１９）項に記載の
    血液代用物および血漿増量剤として機能しうる改変ヘモ
    グロビンを経済的収率で製造する方法。
21. （２１）架橋化剤が、ビス（３，５−ジブロモサリチル
    ）フマレートであることを特徴とする特許請求の範囲第
    （２０）項に記載の血液代用物および血漿増量剤として
    機能しうる改変ヘモグロビンを経済的収率で製造する方
    法。
22. （２２）使用される架橋化剤の量を、ヘモグロビンのモ
    ル量の３倍あたりまで加えることを特徴とする特許請求
    の範囲第（１９）項に記載の血液代用物および血漿増量
    剤として機能しうる改変ヘモグロビンを経済的収率で製
    造する方法。
23. （２３）架橋化剤の量が、ヘモグロビンのモル量の約１
    ．３倍乃至約２．０倍であることを特徴とする特許請求
    の範囲第（２２）項に記載の血液代用物および血漿増量
    剤として機能しうる改変ヘモグロビンを経済的収率で製
    造する方法。
24. （２４）ポリアニオンの量が、ヘモグロビンのモル量に
    対し等モル量乃至２０倍程度であることを特徴とする特
    許請求の範囲第（２２）項に記載の血液代用物および血
    漿増量剤として機能しうる改変ヘモグロビンを経済的収
    率で製造する方法。
25. （２５）ポリアニオンの量が、ヘモグロビンのモル量の
    約５倍乃至約１０倍であることを特徴とする特許請求の
    範囲第（２４）項に記載の血液代用物および血漿増量剤
    として機能しうる改変ヘモグロビンを経済的収率で製造
    する方法。